NO117418B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for utvinning av Cephalosporin C.

Det er tidligere vist i britisk patent nr. 810 196 at antibiotikumet Cephalosporin C kan isoleres i ren form fra rå konsentrater av antibiotikumet både ved forskjellige ppplbsningsmiddelfraksjoneringsmetoder og forskjellig ioneutvekslingskromatografiteknikk, og nærværende oppfinnelse vedrdrer forbedringer med hensyn til utvinning av Cephalosporin C- som åpenbart i nevnte patent og har til hensikt å fremskaffe en fremgangsmåte som vil eliminere ulempene ved tidligere foreslåtte prosesser hvilke omfattet anvendelsen av aktiv kull for adsorbsjon av aktivt materiale fra fermentéringsmediet.

Ved tidligere fremgangsmåter ble det fermenterte medium (i det fol-gende betegnet som "mediet") klaret ved filtrering eller ved sentri fuge ring pg ble bragt i kontakt med trekull fra hvilket det aktive materiale derefter ble eluert og gjen-adsorbert på en kolonne av aluminium-oxyd eller en kolonne av en anioneutvekslerharpiks fra hvilken det igjen ble eluert og derpå utsatt for en opplosningsmiddelekstraksjons-behandling, hvorved Cephalosporin C ble skilt fra det samtidig tilstedeværende Cephalosporin N. Alternativt ble Cephalosporin N i eluatene fra kullkolonnen eller i eluatene fra ioneutveksleren eller en aluminium-oxydkolonne enten omdannet til sin penillinsyre ved å utsette oppløsnin-gen for slike betingelser med hensyn til u temperatur og surhet ved hvilke Cephalosporin N ble omdannet til sin penillinsyre^men ved hvilke Cephalosporin C ble i det vesentlige upåvirket, eller Cephalosporin N ble odelagt ved innvirkningen av enzymet penicillinase, under betingelser som efterlot Cephalosporin C upåvirket. Cephalosporin C ble derpå skilt fra enten Cephalosporin N peniUinsyren eller fra spaltningsproduktene av Cephalosporin N ved innvirkning av penicillinase ved å anvende opp-lbsningsmiddelfraksjonering eller ioneutvekslerkromatografiteknikk slik som beskrevet i det nevnte britiske patent nr. 810 196.

Utvinningsprosessen var noe komplisert og forsOk er blitt gjort for å adsorbere Cephalosporin C fra det syrebehandiéde medium direkte med et anioneutvekslingsmateriale, men denne direkte adsorbsjon fra mediet lider under ulempen at meget store mengder anioneutvekslerharpiks var nodvendig på grunn av nærværet i mediet av anioner forskjellige fra Cephalosporin C, mens i tillegg kloridionet ble lapende eluert og ga vanskeligheter ved de ytterligere trinn for utvinning av Cephalosporin C, idet ved de ytterligere utvinningstrinn var der et elueringstrinn ved pyridinacetat som forte til nærværet av pyridinhydroklorid i eluatet som under konsentrering av opplesningen ga en pH-verdi som var slik at Cephalosporin C bdelegges og ytterligere forhindret bunnfellingen av dette fra vandig opplosning ved tilsetning av aceton. Fjerningen av kloridionet fra oppløsningen kunne ha vært utfort ved bunnfelling ved hjelp av sblvforbindelse, men denne prosess ville ha vært udkonomisk.

Det er nu blitt funnet at en enkel og helt ut tilfredsstillende prosess kan utfores ved anvendelsen av en sterk kationutvekslerharpiks for å senke pH for trinnet spaltning av Cephalosporin N, fulgt av behandling av opplosningen med en sterk anioneutvekslerharpiks for å fjerne,.klorid- «*> ioner, hvoreftef Cephalosporin C kan adsorberes på en anioneutveksler harpiks som den kan elueres fra og konsentreres uten ulemper som stammer fra det forannevnte nærvær av pyridinhydroklorid.

Ifolge nærværende oppfinnelse utvinnes Cephalosporin C fra et klaret medium som inneholder dette stoff og samtidig Cephalosporin N, ved hvilken fremgangsmåte mediet gjores surt hvorved Cephalosporin N i det minste delvis omdannes til sin penillinsyre og Cephalosporin C

skilles fra det således behandlede medium. Mediets pH-verdi senkes ved behandling med et kationutvekslermateriale som inneholder sterkt sure grupper i hydrogenform til 2,8 til 4, fortrinnsvis ca. 3,0, hvorefter kationutvekslermaterialet skilles fra det surgjorte medium, og det surgjorte medium ledes gjennom et sterkt anionutvekslermateriale i form av et salt av en svak flyktig enbasisk organisk syre for å fjerne praktisk talt alt klorid og andre uorganiske anioner fra dette for Cephalosporin C skilles fra mediet. Cephalosporin C kan skilles fra

det sure medium ved fraksjonering med opplosningsmiddel eller ved videre absorbsjon til aluminium», men skilles fortrinnsvis vad at det sure medium bringes i kontakt med et anionutvekslermateriale i form av et salt av en svak flyktig enbasisk organisk syre, fortrinnsvis eddiksyre, for å adsorbere Cephalosporin C på dette, hvorpå anionutvekslermaterialet yaskes med vann, hvorefter det adsorberte Cephalosporin C elueres fra anionutvekslermaterialet med eddiksyre

eller maursyre som i tilfellet av visse svake anionutvekslermaterialer eventuelt må være puffret ved tilsetning av en svak base, fortrinnsvis pyridin eller ammoniakk.

Cephalosporin C-oppløsningen eluert fra anioneutvekslermaterialet konsentreres fortrinnsvis ved destillasjon i vakuum i tilfeller hvor pyridin-puffer er blitt brukt. I tilfeller hvor ammoniumpuffret væske er blitt anvendt, kan materialet konsentreres ved destillasjon i vakuum fulgt av fjerning av ethvert tilstedeværende flyktig ammoniumsalt ved sublimering i hoyvakuum, eller alternativt kan ammoniakk erstattes av pyridin ved å fore konsentratet gjennom et sterkt. kationeutvekslermateriale i pyridinform og pyridinpufferen derpå fjernes ved enkel destillasjon.

I hvert tilfelle, bunnfelles det aktive materiale ved tilsetning av aceton,

og det bunnfelte faste stoff opploses derpå og hvis ikke fritt for Cephalosporin N inkuberes oppløsningen ved en pH på ca. 3 for å omdanne gjenværende Ceph hv N til sin peniHilnsyre, hvorefter Cephalosporin

C med mindre belastning enn ved den forste kolonne overfores til et finfordelt anioneutvekslermateriale (hensiktsmessig "Amberlite resins IRA-400", "IR-4B" eller "XE-58") fra hvilket det kromatograferes ved elueringsutvikling med eddik- eller maur syre, som kan puff res som foran beskrevet. Anionekonsentrasjonen utvelges for å gi den hurtigste utvikling overensstemmende med god adskillelse av Cephalosporin C

fra tilstedeværende forurensninger, og opplosningen konsentreres derefter fortrinnsvis ved destillasjon i vakuum i tilfeller hvor pyridin-puffer er blitt brukt eller i tilfeller hvor ammoniumpuffer er blitt brukt anvendes destillasjon i vakuum fulgt av fjerning av gjenværende ammoniumsalter ved sublimering i hoyvakuum eller ved å erstatte ammonium saltene med pyridin som tidligere beskrevet og de aktive materialer gjenutfelles ved tilsetning av aceton. Deri forste anione-utvekslerkolonne nevnt foran,i hvilken en konsentreringseffekt oppnåes, kan utelates i hvilket tilfelle Cephalosporin C oppnådd her er en mere fortynnet opplosning. Cephalosporin C kan derefter gjenopploses og omdannes til hovedsakelig dets natriumsalt ved tilsetningen av natrium-hydroxyd for å bringe opplosningen til en pH-verdi på ca. 6, og pro-sessen fullendes ved at opplosningen fores gjennom et sterkt kationeutvekslermateriale (hensiktsmessig "Dowex resin 50 x 8") i natriumform, og Cephalosporin C-natrium saltet konsentreres derpå og krystalliseres fra opplosningen. Salter forskjellig fra natrium saltet kan fremstilles ved en for en fagmann selvfølgelig modifikasjon av forannevnte fremgangsmåte.

Det vil sees at foran beskrevne prosess som kan utfores bare ved anvendelse av ioneutvekslermaterialer således gjor mulig fremstillingen av den endelig opplosning i det vesentlige fri for andre ioner enn de den endelige elueringsopplosning, f. eks. eddiksyre eller et salt av denne, som pyridinacetat og selvfolgelig Cephalosporin C.

Det er blitt funnet at når opplosningen perkoleres gjennom et sterkt anioneutvekslermateriale for å fjerne kloridionene et det ofte et gjennombrudd av kloridion for alt Cephalosporin C er blitt perkolert, og det er et foretrukket trekk ved oppfinnelsen at det sterke anioneutvekslermateriale ("Amberlite resin IRA-400") anvendes i et antall seksjoner som brukes suksessivt og opplosningen fores fra en seksjon til en efterfolgende seksjon når kloridioner oppdages i perkQlatet. Ved å arbeide på denne måte kan det sikres at anioneutvekslermaterialet er mettet med kloridion og gjor det således mulig å sikre at alt Cephalosporin C i opplosningen tilfort til anioneutvekslermaterialet i virkeligheten passerer gjennom og således unngåes tap av aktive materialer på dette trinn. Ved å arbeide på denne måte inneholder den perkolerte Cephalosporin C opplosning samlet fra de efterfolgende seksjoner av anioneutveksleren^ ingen erkjennbare mengder klorid-, sulfat- eller fosfationer og inneholder også alt Cephalosporin C i det opprinnelige surgjorte medium tilfort til anioneutveksleren.

Det fblgende er en beskrivelse av de forskjellige ioneutvekslermaterialer henvist til foran. 1) De sterke kationeutvekslermaterialer anvendt for justeringen av pH-verdien er ioneutvekslermaterialer som inneholder sterkb sure grupper, som sulfonat- eller fosfatradikaler, som ikke merkbart adsorberer Cephalosporin C ved pH_verdier over 2,5 og typisk egnete kationeutvekslermaterialer er harpiksene solgt under varenavnene "Amberlite IR-120" eller "Dowex 50 x 8". 2) De sterke anioneutvekslermaterialer anvendt for fjerningen av klorid og andre anioner fra opplosningen er materialer fra hvilke Cephalosporin C meget lett kan erstattes av kloridioner, og typisk egnete anioneutvekslermaterialer er harpiksene solgt under varenavnene "Amberlite IRA-400", "Dowex 1" eller "Deacidite-FF". 3) De anioneutvekslermaterialer anvendt for adsorbsjonen av Cephalosporin C kan være svake anioneutvekslermaterialer som har stor kapasitet for Cephalosporin C når de er i acetatform og når opplosningen foreligger ved en pH på ca. 3, og har egenskapen å kunne avgi Cephalosporin C ved pH på 6 til 1,0 M pyridinacetat, og typisk egnete svake anioneutvekslermaterialer er harpiksene solgt under varenavnene "Amberlite IR-4B" og "Deacidite E". Alternativt kan sterke anioneutvekslermaterialer, slik som harpiksene solgt under varenavnene "Amberlite IRA-400", "Dowex 1", "Dowex 2"<p>g "Deacidite FF", fra hvilke Cephalosporin C elueres av n eddiksyre, brukes. 4) De sterke kationeutvekslermateriale anvendt for trinnet for om-dannelse av renset Cephalosporin C til dets natriumsalt kan være ethvert sterkt kationeutvekslermateriale i natriumform og et typisk anvendelig kationeutveksler-materiale er harpiksen "Dowex 50 x 8".

Det fblgende eksempel vil nærmere vise den måte på hvilken oppfinnelsen kan utfores.

Den hele kultur justeres til pH 5,5 ved tilsetning av iseddik under om-roring. Suspensjonen fores gjennom et egnet filterapparat for å gi et klart filtrat. Tilsetningen av et kieselguhr-preparat, slik som "Celite Hy-flo Super-Cel", kan med fordel anvendes ved noen typer filter-apparater og er ikke skadelige.

Det klare filtrat justeres til pH 2^8 til 3,0 ved tilsetning av "Amberlite Resin IR-120" i hydrogenform under omrbring. Når den onskete pH er oppnådd filtreres suspensjonen, oppvarmes til 37°C og holdes der i 3 timer. Den kjoles derpå til så lav temperatur som mulig, fortrinnsvis til 0°C.

Uorganiske anioner, som klorid, kan gripe inn under rensningsprosessen, f. eks. kappes de med Cephalosporin C for absorbsjon på harpiksen.

De må derfor fjernes ved dette trinn. Det er blitt funnet at harpiks-ioneutvekslermateriale "Amberlite IRA-400" i acetatform, hvor det anvendes i en kolonne, adsorberer både Cephalosporin C og sterke anioner, men at hvis ladningen fortsettes inntil gjennombrudd av klorid opptrer, elueres Cephalosporin C totalt. En rekke "IRA-400" kolonner "maskestdrrelse ca. 30 i acetatform) settes opp og det kjolte filtrat (ved pH 3,0) fores gjennom en av disse inntil gjennombrudd av klorid opptrer. Når dette hender overfores filtratstrommen umiddelbart til en annen kolonne og slik fortsettes det inntil den hele sats er blitt behandlet. Væskestrommene proves på klorid med solvnitrat/salpeter-syre på vanlig måte. Det er hensiktsmessig å sette opp en stor kolonne som i overensstemmelse med målestokken for den tilsiktede behandling er stor nok til å bli mettet med klorid med mesteparten

av satsen, og efterlater en. liten mengde som behandles"'med serier av små kolonner. På denne måte minskes tapene av Cephalosporin C

som kan bli efterlatt adsorbert på den siste kolonne.

Det er funnet at det totale nodvendige volum harpiks (avsatt i kolonnene) er ca. 0,75 % av volumet av filtratet som behandles. Den anvendte strbmningshastighet er omtrent 0,3 harpikslag-volum pr. minutt, og dybden av kolonnene er ca. 50 cm.

Filtratet er nu i det vesentlige fritt for uorganiske anioner.

Antibiotikummet kan lett adsorberes på "Amberlite resin Ir 4B" i acetatform og elueres fra .denne med, pyridinacetatpuffer.

Harpiksen (Standard Grade, ca. 30 mesh), inneholdt i en kolonne med ca. 60 cm's dybde, mettes tilnærmet 80 % med Cephalosporin C ved å fore det behandlete filtrat gjennom den med omtrent O, 1 lag-volum pr. minutt. Det er nodvendig å anvende ca. 2 volum % harpiks av volumet av mediet for å oppnå dette metningsnivå. Den eluerte væske skal selvfblgelig være fri for Cephalosporin C.

Kolonnen vaskes nu med destillert vann med en hastighet på O.l lag-volum pr. minutt inntil væskestrbmmen ikke gir noen ninhydrinreaksjon. Dette fblges av en vaskning med normal eddiksyre som fjerner et pig-mentbånd som gir en ninhydrinreaksjon men som ikke inneholder noe Cephalosporin C. Dette bånd absorberer også sterkt ultrafiolett lys ved 260 mp og det er vanlig å fortsette vaskningen inntil absorbsjonen faller til E - 3 eller mindre (l cm celle). Eluering. begynnes nu med normal eddiksyre bragt til pH 5, 5 ved tilsetningen av pyridin. Denne opplbsning skal fortrinnsvis kjbles til 0°C for anvendelse og eluat-fraksjonene holdes så koldt som mulig efter oppsamling. pH for den eluerte væske stiger fra 2,4 til 5, 5 og når pH er konstant ved 5, 5 kan strommen stoppes. Cephalosporin C begynner å elueres når pH for væskestrbmmen har bket til ca. 4 og er vanligvis fullstendig eluert når pH for væskestrbmmen har bket til 5,2. Strbmningshastig-heten er ca. 0,07 lag-volum pr: minutt og den eluerte væske samles i fraksjoner, f. eks. hver fraksjon = 0,16 lagrvolum. Det er funnet at biologiske forsbk er den mest pålidelige metode for å bestemme til-stedeværelsen av Cephalosporin C skjbnt ninhydrinreaksjonen kan brukes.

De aktive fraksjoner forenes og fordampes i vakuum ved ikke mere

enn 25°C til en sirup. Jo lavere fordampningstemperatur det er mulig å "holde, dess mindre destruering av Cephalosporin C inntrer. Det er å tilråde å kontrollere at intet klorid er tilstede for fordampningen, da nærværet av dette gir en lav pH som odelegger Cephalosporin C og

-det hindrer'også den efterfolgende acetonbunnfelling. Hvis klorid

finnes å være tilstede skal det fjernes ved bestemmelse av klorid og tilsetning av O, 95 ekvivalenter solvacetatopplosning. Det bunn-

felte solvklorid fjernes ved filtrering.

Siruppen bunnfelles ved tilsetning av minst 50 volum absolutt aceton og det resulterende pulver males i aceton. Pulveret kan fjernes ved sentrifuge ring og vaskes omhyggelig i absolutt aceton for å fjerne eddiksyre. Pulveret som inneholder den rå frie syre av Cephalosporin C, torkes i vakuum. På dette trinn har det vanligvis en aktivitet på

ca. 1 enhet pr. mg. Pulveret opploses i litt vann og dets pH som skal være ca. 3, justeres til 5 ved forsiktig tilsetning av natrium-hydroxyd.

Da rå natriumsalt av Cephalosporin C tilfares til en kolonne med finfordelt form av "Amberlite resin IR 4B" kjent som "XE58" i acetatform. Materialet kromatograferes derpå ved langsom eluering med fortynnet pyridinacetat. Cephalosporin C er delvis befridd for for-urensning og det efterfalgende natriumsalt kan lett krystalliseres.

Harpiksen (150-200 mesh) er inneholdt i en kolonne som er tilnærmet 50 cm dyp. Det nadvendige volum av harpiksen er ca. 0,0055 ganger

volumet av det opprinnelige kulturfiltrat. Kolonnen holdes fortrinnsvis i et kjolerom ved ca. 4°C og en automatisk f raks jonsoppsamle r anvendes for å fraksjonere væskestrommen. Den irrigerende væske (0,3 M eddiksyre bragt til pH 5,0 med pyridin) tilfares til toppen av kolonnen og stramningshastigheten kontrolleres ved en egnet anordning. Det har vært anvendt en konstant hydrostatisk anordning eller en peristaltisk pumpe, men i den målestokk det nu arbeides er det funnet at et reservoir som inneholder den irrigerende væske over hvilken et konstant lufttrykk opprettholdes gir de mest pålidelige resultater.

Opplosningen med rått natrium Cephalosporin C tillates å dryppe inn på toppen av harpiksen hvorefter toppen av apparatet forsiktig fylles med irrigerende væske. Stromningen reguleres til ca. Ofl lag-volum pr. time. Fraksjoner på 0,018 lag-volum samles opp, men disse kan være meget storre enn dette hvis hensiktsmessig.

Det anvendes biologiske proveforsbk for å bestemme posisjonen av Cephalosporin C, men ninhydrinreaksjonen kan brukes. Cephalosporin C opptrer ca. 36-48 timer efter starting av kolonnen (den hoyeste konsentrasjon i fraksjoner 8O-I6O uten påvisning i fraksjoner efter 220).

De aktive fraksjoner kombineres og fordampes til en sirup i vakuum ved så lav temperatur som mulig. Siruppen bunnfelles ved tilsetningen av minst 98 volum absolutt aceton. Det resulterende pulver vaskes flere ganger med absolutt aceton og torkes. Den frie syre ved dette trinn har en aktivitet på ca. 5-6 enheter pr. mg (50-60 % ren).

Den frie syre Cephalosporin C opploses i litt vann i hvilket det skal ha pH = 3. Natriumhydroxydopplosningen tilsettes varsomt under konstant omrbring inntil pH = 6, 5. Da opplosningen stadig kan inne-holde noe pyridin eller andre baser er det fordelaktig å fore opplosningen gjennom en liten kolonne av'Dowex resin 50 x 8" i natriumform. Kolonnen irrigeres derpå med vann inntil væskestrbmmen ikke lenger gir en ninhydridreaksjon. Opplosningen konsentreres derpå i vakuum ved så lav en temperatur som mulig til en sirup.

Krystallisasjon opptrer spontant i den konsentrerte sirup. Siruppen får henstå ved romtemperatur i 24 timer. Det er ingen fordel å oppnå ved kjbling, da krystallisasjon opptrer bedre ved romtemperatur og noe ubnsket gummimateriale bunnfelles ved lave temperaturer.

Den gummiaktige suspensjon av mikro-krystaller omrbres med en opplosning av ethanol (70 volum%) i vann og krystaller fjernes ved filtrering eller ved sentrifuge. De vaskes med 70 % ethanolopplbsning inntil ingen ytterligere farve lenger fjernes og torkes i vakuum over fosforpentoxyd. Urenhetene er meget mere opploselige i 70 % ethanol ved 25°C enn antibiotikummet. Vaskevannet samles og kan .fordampes til sirup, gjenbunnfelles med aceton og det resulterende pulver opploses i vann og fordampes til en sirup hvorved en annen, mindre ren mengde krystaller kan oppnåes.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for utvinning av Cephalosporin C fra et klaret medium, som inneholder dette stoff og samtidig Cephalosporin N, ved hvilken fremgangsmåte mediet gjflres surt, hvorved Cephalosporin N i det minste delvis omdannes til sin penillinsyre, og Cephalosporin C skilles fra- det således" behandlede medium, karakterisert ved at mediets pH-verdi ved behandling med et kationutvekslermateriale inneholdende sterkt sure grupper i hydrogenform, senkes til 2,8-4,0 fortrinnsvis ca. 3, hvorpå kationutvekslermaterialet ski lles fra det surgjorte medium, og det surgjorte medium ledes gjennom et sterkt anionutvekslermateriale i form av et salt av en svak, flyktig, enbasisk organisk syre for praktisk talt å fjerne-alt klorid-og andre uorganiske, anioner derfra for Cephalosporin C's adski Helse fra substratet.

2. Fremgangsmåte efter krav 1, karakterisert ved at fjerningen av klorid og andre uorganiske anioner tilveiebringes ved anvendelse av flere seksjoner av det nevnte sterke anionutvekslermateriale, idet strommen av surgjort medium til den forste seksjon avledes til en annen seksjon ved gjennombrudd av kloridion i den forste seksjon og videre avledes til en efterfolgende ny seksjon ved gjennombrudd av kloridion.