NL8820679A - RECOMBINANT BIRDPox VIRUS. - Google Patents

RECOMBINANT BIRDPox VIRUS. Download PDF

Info

Publication number
NL8820679A
NL8820679A NL8820679A NL8820679A NL8820679A NL 8820679 A NL8820679 A NL 8820679A NL 8820679 A NL8820679 A NL 8820679A NL 8820679 A NL8820679 A NL 8820679A NL 8820679 A NL8820679 A NL 8820679A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
virus
antigen
vertebrate
fowlpox
promoter
Prior art date
Application number
NL8820679A
Other languages
Dutch (nl)
Other versions
NL195051C (en
Original Assignee
Health Research Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27492413&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NL8820679(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Health Research Inc filed Critical Health Research Inc
Publication of NL8820679A publication Critical patent/NL8820679A/en
Application granted granted Critical
Publication of NL195051C publication Critical patent/NL195051C/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/20Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16611Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/24011Poxviridae
    • C12N2710/24041Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011Details
    • C12N2730/10011Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/15011Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/16011Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/18011Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/20011Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/20011Coronaviridae
    • C12N2770/20022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

<* '1' » 8320679 -<* '1' »8320679 -

Recombinant-vogelpokkenvirus.Recombinant fowlpox virus.

Deze aanvrage komt overeen met een gedeeltelijke voortzetting van de Amerikaanse octrooiaanvrage no. 186.054 van 25 april 1988, die op zijn beurt een gedeeltelijke voortzetting van octrooiaanvrage no. 110.335 van 20 oktober 1987 is, die op 5 zijn beurt een gedeeltelijke voortzetting van octrooiaanvrage no.090.711 van 28 augustus 1987 is.This application corresponds to a partial continuation of U.S. Patent Application No. 186,054 of April 25, 1988, which in turn is a partial continuation of Patent Application No. 110,335 of October 20, 1987, which in turn is a partial continuation of Patent Application No. 090,711 dated August 28, 1987.

Deze uitvinding betreft een werkwijze voor het uitlokken van een immunologische respons in gewervelden, waaronder ook andere dan vogels, met behulp van een synthetisch reeombinant-10 vogelpokkenvirus. Meer in het bijzonder betreft de uitvinding een werkwijze voor het uitlokken van een immunologische respons in een gewervelde, in het bijzonder in een zoogdier, op een pathogeen voor gewervelden door die gewervelde te beënten met een synthetisch recombinant-vogelpokkenvirus dat DNA bevat dat voor de antigene 15 determinanten van die pathogeen codeert en ze tot expressie brengt, alsmede vaccins die zo’n gemodificeerd vogelpokkenvirus bevatten.This invention relates to a method for eliciting an immunological response in vertebrates, including non-avian, using a synthetic recombinant bird pox virus. More particularly, the invention relates to a method of eliciting an immunological response in a vertebrate, particularly in a mammal, to a vertebrate pathogen by inoculating that vertebrate with a synthetic recombinant fowlpox virus containing DNA containing the antigenic Encodes and expresses determinants of that pathogen, as well as vaccines containing such a modified fowlpox virus.

Verder betreft de uitvinding gemodificeerd vogelpokkenvirus, werkwijzen voor het maken en gebruiken daarvan, en bepaalde DNA-reek-sen die bij de bereiding van gemodificeerd vogelpokkenvirus als 20 tussenprodukten gevormd worden of een rol spelen, en werkwijzen voor het maken van zulke reeksen.Furthermore, the invention relates to modified fowlpox virus, methods of making and using it, and certain DNA arrays that are formed or involved as intermediates in the preparation of modified fowlpox virus, and methods of making such arrays.

Achtergrond van de uitvinding Vogelpokken of vogelpokkenvirus is een geslacht van nauw verwante pokkenvirussen die pluimvee infecteren. Tot het 25 geslacht vogelpokken behoren de soorten pluimveepokken, kanarie- pokken, junco-pokken, duivenpokken, kwartelpokken, mussenpokken, spreeuwenpokken en kalkoenenpokken. De soort pluimveepokken infecteert kuikens en moet niet verwarmd worden met de menselijke ziekte die ’’waterpokken” genoemd wordt. Het geslacht vogelpokken deelt 30 vele kenmerken met andere pokkenvirussen en is een lid van dezelfde 8820679: t - 2 - · onderfamilie als het koepokvirus namelijk pokkenvirussen van ge-wervelden. Pokkenvirussen, waaronder koepokken en vogelpokken, vermenigvuldigen zich binnen eukaryotische gastheercellen. Deze virussen onderscheiden zich door hun grote afmetingen, ingewikkelde 5 bouw en doordat zij zich in het cytoplasma vermenigvuldigen. MaarBackground of the Invention Bird pox or bird pox virus is a genus of closely related pox viruses that infect poultry. The bird pox genus includes the species of poultry pox, canary pox, junco pox, pigeon pox, quail pox, sparrow pox, starling pox and turkey pox. The poultry pox species infects chicks and should not be heated with the human disease called "chicken pox". The birdpox genus shares many features with other poxviruses and is a member of the same 8820679: t - 2 - subfamily as the cowpox virus, namely vertebrate poxviruses. Smallpox viruses, including cowpox and fowlpox, multiply within eukaryotic host cells. These viruses are distinguished by their large size, complicated construction and in that they multiply in the cytoplasm. But

Vaccinia en vogelpokken zijn verschillende geslachten en zijn ver-schillend in hun molecuulgewichten, hun antigene determinanten en in hun gastheersoorten, zoals vermeld is in Intervirology, deel 17, blz. 42-44, het 4 verslag van de Internationale Commissie 10 over Taxonomie van Virussen (1982).Vaccines and fowlpox are different sexes and differ in their molecular weights, their antigenic determinants and in their host species, as reported in Intervirology, Vol. 17, pp. 42-44, 4 Report of the International Commission 10 on Taxonomy of Viruses (1982).

Andere gèwervelden dan vogels, zoals zoogdieren (waaronder de mens) worden door vogelpokkenvirussen niet produktief geïnfecteerd. Verder vermenigvuldigt vogelpokken zich niet als zoogdier- (waaronder menselijke) celkweken er mee geïnfecteerd 15 worden. In zulke met vogelpokken beënte zoogdier-celkweken zullen de cellen sterven door het cytotoxische effect, maar er is geen blijk van een produktieve Virusinfectie.Vertebrates other than birds, such as mammals (including humans), are not productively infected by bird pox viruses. Furthermore, bird pox does not multiply when infected with mammalian (including human) cell cultures. In such fowlpox-vaccinated mammalian cell cultures, the cells will die from the cytotoxic effect, but there is no evidence of a productive virus infection.

Het beënten van een andere gewervelden dan een vogel, zoals een zoogdier, met levende vogelpokken leidt tot de vorming 20 van schade bij de entplaats die op die van een ^cepnjiir-ent lijkt.Inoculation of a vertebrate other than a bird, such as a mammal, with live fowl pox results in damage to the graft site resembling that of a cepnjiir graft.

Maar er komt geen produktieve virusinfectie uit voort. Desalniettemin is nu gevonden dat een aldus beent zoogdier immunologisch op het vogelpokkenvirus respondeert. Dit is een onverwachte uitkomst.But it does not result in a productive virus infection. Nevertheless, it has now been found that a mammalian bone thus responds immunologically to the fowlpox virus. This is an unexpected outcome.

Uit gedode pathogenen of gezuiverde antigeen-bestand-25 delen van zulke pathogenen bestaande vaccins moeten in grotere hoe veelheden geïnjiceerd worden dan levende virusvaccins om tot een effectieve immuunrespons te komen. Dat komt doordat beënting met levend virus een veel efficiëntere wijze van vaccineren is. Een betrekkelijk kleine ent kan een effectieve immuunrespons geven 30 doordat het van belang zijnde antigeen tijdens de vermenigvuldi ging van het virus versterkt wordt. Uit medisch oogpunt gezien geven levende virusvaccins een immuniteit die doeltreffender is en langer aanhoudt dan het beënten met een gedode pathogeen of een gezuiverd antigeen-vaccin. Uit gedode pathogenen of gezuiver-35 de antigeen-bestanddelen van zulke pathogenen bestaande vaccins vereisen dus de bereiding van grotere hoeveelheden vaccin-mate-riaal dan met levend virus nodig is.Vaccines consisting of killed pathogens or purified antigenic components of such pathogens must be injected in greater amounts than live virus vaccines in order to achieve an effective immune response. This is because vaccination with live virus is a much more efficient method of vaccination. A relatively small graft can produce an effective immune response by enhancing the antigen of interest during virus multiplication. From a medical point of view, live virus vaccines give an immunity that is more effective and lasts longer than inoculation with a killed pathogen or a purified antigen vaccine. Thus, vaccines consisting of killed pathogens or purified antigenic components of such pathogens require the preparation of larger amounts of vaccine material than is required with live virus.

Uit de voorafgaande discussie is duidelijk dat er medische en economische voordelen zijn aan het gebruik van levende 882 067 9,* - 3 - r virusvaccins. Een zo,n levend virusvaccin bevat het koepokvirus.It is clear from the foregoing discussion that there are medical and economic benefits to using live 882 067 9 * 3 r virus vaccines. Such a live virus vaccine contains the cowpox virus.

Dit virus staat al bekend als nuttig om er met recombinant-DNA-methoden DNA in te voegen dat de genetische reeksen vertegenwoordigt van antigenen voor zoogdier-pathogenen.This virus is already known to be useful for inserting DNA using recombinant DNA methods representing the genetic sequences of antigens for mammalian pathogens.

5 Er zijn in de techniek dus al methoden ontwikkeld waarmee recombinant-koepokvirussen geschapen kunnen worden door het inbouwen van DNA van allerlei herkomst (bijv. viraal, pro-karyotisch, eukaryotisch of synthetisch) in een niet-essentieel gebied van het uit koepokvirus-genoom, waaronder DNA-reeksen die 10 voor de antigenen determinanten van een pathogeen organisme code ren. Bepaalde met deze methoden geschapen recombinant-koepokvirussen zijn gebruikt om in zoogdieren specifieke immuniteit uit te lokken tegen een verscheidenheid van zoogdier-pathogenen, alles zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.603.112, 15 waarnaar hier verwezen wordt.Thus, methods have already been developed in the art to create recombinant cowpox viruses by incorporating DNA of all origins (eg, viral, pro-karyotic, eukaryotic or synthetic) into a non-essential region of the cowpox genome including DNA sequences encoding the antigens determinants of a pathogenic organism. Certain recombinant cowpox viruses created by these methods have been used to elicit specific immunity in mammals against a variety of mammalian pathogens, all as described in U.S. Patent 4,603,112, 15 referred to herein.

Het niet gemodificeerde koepokvirus heeft een lange geschiedenis van betrekkelijk veilig en doeltreffend gebruik voor het inenten tegen pokken. Maar voor het uitroeien van pokken, toen niet gemodificeerde koepokvirus op grote schaal toegediend werd, 20 was er een bescheiden maar reeel risico op complicaties in de vorm van een algemene pokkeninfectie, vooral bij hen die aan eczeem of aan onderdrukte immuunrespons leden. Een andere zeldzame maar mogelijke complicatie die het gevolg kan zijn van pokkeninenting is een vaccinatie-encefalitis. De meeste van deze reac-25 ties waren het gevolg van het beënten van individuen met huid ziekten zoals eczeem of met beschadigde immuun-systemen, of van individuen in huishoudens met anderen die eczeem of verminderde immunologische responsen hadden. Vaccinia is een levend virus en is normaliter onschadelijk voor een gezond individu. Maar het kan 30 gedurende meerdere weken na de beënting tussen individuen overge dragen worden. Als een individu met schade aan de normale immuunrespons geïnfecteerd wordt, of door beënting of door besmette-lijke overdracht vanuit een recent beent individu kunnen de gevolgen ernstig zijn.The unmodified cowpox virus has a long history of relatively safe and effective use for vaccination against smallpox. But before the eradication of smallpox, when unmodified cowpox virus was widely administered, 20 there was a modest but real risk of complications in the form of a common smallpox infection, especially in those who suffered from eczema or suppressed immune responses. Another rare but possible complication that can result from smallpox vaccination is vaccination encephalitis. Most of these reactions were due to inoculation of individuals with skin diseases such as eczema or with damaged immune systems, or of individuals in households with others who had eczema or impaired immunological responses. Vaccinia is a living virus and is normally harmless to a healthy individual. But it can be transferred between individuals for several weeks after inoculation. If an individual becomes infected with damage to the normal immune response, or by inoculation or by infectious transmission from a recent boneed individual, the consequences can be serious.

35 Men kan dus inzien dat een werkwijze die de techniek met de voordelen van het beënten met levend virus verrijkt maar de hierboven besproken problemen vermindert of wegneemt een zeer wenselijke voortgang van de huidige stand der techniek zou betekenen. En dit is thans nog belangrijker door de opkomst van de 8820679.1 ·* - 4 - * ziekte die als "verworven immuundeficiëntie-syndroom" (AIDS) bekend staat. Slachtoffers van deze ziekte lijden aan een ernstig immunologisch-niet*functioneren en kunnen gemakkelijk schade oplopen aan een anders veilig levend virus-preparaat als ze met zo'n 5 virus in contact komen, hetzij direct hetzij door contact met een persoon die recent geïmmuniseerd is met een vaccin dat zo'n levend virus bevat.Thus, it can be appreciated that a method that enriches the technique with the benefits of live virus inoculation but reduces or eliminates the problems discussed above would represent a highly desirable advance of the prior art. And this is even more important now with the emergence of the 8820679.1 * * 4 - * disease known as "acquired immune deficiency syndrome" (AIDS). Victims of this disease suffer from severe immunological failure * and can easily be damaged by an otherwise safe live virus preparation if they come into contact with such a virus, either directly or through contact with a person who has recently been immunized with a vaccine containing such a live virus.

Oogmerken van de uitvindingObjects of the invention

Het is een doel van deze uitvinding een vaccin te 10 verschaffen dat gewervelden tegen een pathogeen organisme kan im muniseren, dat de voordelen van een levend virusvaccin heeft maar geen of weinig van de nadelen van zowel een levend virusvaccin als van een gedood virusvaccin, zoals hierboven aangegeven, vooral bij gebruik voor het immuniseren van andere gewervelden dan vogels.It is an object of this invention to provide a vaccine which can immunize vertebrates against a pathogenic organism, which has the advantages of a live virus vaccine but none or little of the disadvantages of both a live virus vaccine and a killed virus vaccine, as above indicated, especially when used to immunize vertebrates other than birds.

15 Het is een ander doel van deze uitvinding in zulke vaccins te gebruiken, synthetische recombinant-vogelpokkenvirussen te verschaffen.It is another object of this invention to use in such vaccines to provide synthetic recombinant fowlpox viruses.

Het is een ander doel van deze uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het uitlokken van een immunologische 20 respons in Vogels en andere gewervelden tegen een antigeen door de gewervelde met een synthetisch recombinant-vogelpokkenvirus te beënten dat, in het geval van andere gewervelden dan vogels, zich niet produktief in het dier kan vermenigvuldigen onder vorming van infectieus virus. In dat geval is het virus zelf beperkend, 25 wat de mogelijkheid van verspreiding op niet gevaccineerde gast heren beperkt.It is another object of this invention to provide a method for eliciting an immunological response in Birds and other vertebrates against an antigen by inoculating the vertebrates with a synthetic recombinant fowlpox virus which, in the case of vertebrates other than birds, cannot proliferate in the animal to form infectious virus. In that case, the virus itself is limiting, limiting the possibility of spread to unvaccinated hosts.

Het is nog een ander doel van de uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het uitlokken van een immunologische respons in een gewervelde tegen een antigeen, welke werkwijze het 30 beënten van de gewervelde met een vaccin inhoudt, met in dat vaccin synthetisch recombinant-vogelpokkenvirus dat de antigene determinant van een pathogeen voor die gewervelde omvat en tot expressie brengt.It is yet another object of the invention to provide a method for eliciting an immunological response in a vertebrate against an antigen, which method involves inoculating the vertebrate with a vaccine comprising synthetic recombinant fowlpox virus in that vaccine. antigenic determinant of a pathogen for that comprising and expressing vertebrate.

Het is een ander doel van de uitvinding een werkwijze 35 te verschaffen voor het tot expressie brengen van een genprodukt in een gewervelde door die gewervelde te beënten met een recombi-nant-virus dat DNA bevat dat voor het genprodukt codeert en dat tot expressie brengt, zonder produktieve vermenigvuldiging van het virus in die gewervelde.It is another object of the invention to provide a method for expressing a vertebrate gene product by inoculating that vertebrate with a recombinant virus containing DNA encoding and expressing the gene product, without productively multiplying the virus in that vertebrate.

882 0 67 9 .i - 5 - *882 0 67 9 .i - 5 - *

Het is nog een ander doel van de uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het uitlokken van een immunologische respons in een gewervelde tegen een antigeen door de gewervelde met een recombinant-virus te beënten dat DNA bevat dat voor het 5 antigeen codeert en dat tot expressie brengt zonder produktieve vermenigvuldiging van het virus in de gewervelde.It is yet another object of the invention to provide a method for eliciting an immunological response in a vertebrate against an antigen by inoculating the vertebrate with a recombinant virus containing DNA encoding and expressing the antigen. without proliferating vertebrate virus.

Omschrijving van de uitvinding Eën aspect van deze uitvinding betreft een werkwijze voor het uitlokken van een immunologische respons in een gewer-10 velde tegen een pathogeen door de gewervelde te beënten met een synthetisch recombinant-vogelpokkenvirus dat gemodificeerd is door de aanwezigheid van DNA, van welke herkomst dan ook, dat voor een antigeen van het pathogeen codeert en dat tot expressie brengt, in een niet-essentieel gebied van het vogelpokken-genoom.Description of the Invention One aspect of this invention relates to a method of eliciting an immunological response in a vertebrate field against a pathogen by inoculating the vertebrate with a synthetic recombinant fowlpox virus that has been modified by the presence of DNA, of which therefore origin, encoding and expressing an antigen of the pathogen, in a non-essential region of the fowlpox genome.

15 In een ander aspect is deze uitvinding gericht op een werkwijze voor het tot expressie brengen van een genprodukt of het uitlokken van een immunologische respons tegen een antigeen in een gewervelde met een recombinant-virus dat in de cellen van de gewervelde zich niet produktief vermenigvuldigt maar wel het gen-20 produkt of het antigeen in die cellen tot expressie brengt.In another aspect, this invention is directed to a method of expressing a gene product or eliciting an immunological response against a vertebrate antigen with a recombinant virus that does not proliferate in vertebrate cells but does express the gene product or antigen in those cells.

In een ander aspect is deze uitvinding gericht op een syntehtisch recombinant-vogelpokkenvirus dat gemodificeerd is door het in een niet-essentieel gebied van het vogelpokken-genoom inbouwen van DNA van welke herkomst dan ook, en vooral van niet-25 vogelpokken-herkomst. Synthetische gemodificeerde vogelpokkenvirus- recombinanten die exogene (d.i. niet-vogelpokken)genen dragen welke voor een antigeen coderen en dat tot expressie brengen, welke recombinanten de vorming van immunologische reeponsen op het antigeen, en daarmee op het exogene pathogeen in een gewervelde 30 gastheer uitlokken, worden volgens de uitvinding gebruikt om nieuwe vaccins te scheppen die de nadelen vermijden van gebruikelijke vaccins die gedode of verzwakte levende organismen gebruiken, vooral bij het beënten van andere gewervelden dan vogels.In another aspect, this invention is directed to a synthetic recombinant fowlpox virus which has been modified by incorporating DNA from any origin, especially non-fowlpox, into a nonessential region of the fowlpox genome. Synthetic modified fowlpox virus recombinants carrying and expressing exogenous (ie non-fowlpox) genes encoding an antigen, which recombinants elicit the formation of immunological responses to the antigen, and thereby to the exogenous pathogen in a vertebrate host, are used according to the invention to create new vaccines that avoid the drawbacks of conventional vaccines using killed or attenuated living organisms, especially when inoculating vertebrates other than birds.

Opnieuw moet opgemerkt worden dat vogelpokkenvirussen 35 zich alleen in vogels of in vogelcellijnen produktief kunnen ver menigvuldigen en aangehouden kunnen worden. De uit vogel-gastheer-cellen geoogste recombinant-vogelpokkenvirussen leiden bij beënten van een niet-vogel-gewervelde zoals een zoogdier, op een wijze analoog aan het beënten van zoogdieren met koepokke.*}, tot beëntings- 8820679.* » - 6 - schade zonder produktieve vermenigvuldiging van het vogelpokken-virus. Ondanks het falen van het vogelpokkenvirus in de produktieve vermenigvuldiging in zo’n beent niet-vogelgewervelde treedt er toch genoeg expressie van het virus op zodat het beënte dier immuno-5 logisch op de antigene determinanten van het recombinant-vogelpokken- virus respondeert en ook op de antigene determinanten die door de exogene genen daarin gecodeerd worden.It should be noted again that fowlpox viruses can proliferate and be productive only in birds or in bird cell lines. The recombinant fowlpox viruses harvested from avian host cells result in inoculation of a non-avian vertebrate such as a mammal, in a manner analogous to inoculation of mammals with cow pox. *}, Inoculation 8820679. * »- 6 - damage without productive multiplication of the fowlpox virus. Despite the failure of the fowlpox virus in the productive multiplication in such a non-avian vertebrate bone, there is still sufficient expression of the virus so that the inoculated animal responds immunologically to the antigenic determinants of the recombinant fowlpox virus and also to the antigenic determinants encoded by the exogenous genes therein.

Als men ze gebruikt om er een vogelsoort mee te be-enten geeft zo'n synthetisch recombinant-vogelpokkenvirus niet 10 alleen een immunologische respons op de door het exogene DNA van iedere herkomst gecodeerde antigenen dat daarin aanwezig kan zijn, maar leidt het ook tot een produktieve vermenigvuldiging van het virus in de gastheer met het oproepen van de verwachte immunologische respons op de vogelp'okken-vector per se.When used to inoculate a bird species, such a synthetic recombinant fowlpox virus not only gives an immunological response to the antigens encoded by the exogenous DNA of any origin, but also leads to an prolific proliferation of the virus in the host by evoking the expected immunological response to the fowlpox vector per se.

15 Meerdere onderzoekers hebben voorgesteld recombinant- vogelpokken te scheppen, en om precies te zijn als veterinaire vaccins voor de bescherming van pluimvee te gebruiken virussen.Several researchers have proposed to create recombinant fowl pox, and viruses to be used more precisely as veterinary vaccines for the protection of poultry.

Boyle en Coupar in J. Gen. Virol. 67_ (1986) 1591-1600 en Binns c.s. in Isr. J. Vet. Med. 42 (1986) 124-127. Noch voorstellen noch 20 feitelijke berichten zijn gevonden betreffende het gebruik van recombinant-vogelpokkenvirussen als werkwijze voor het uitlokken van specifieke immuniteit in zoogdieren.Boyle and Coupar in J. Gen. Virol. 67_ (1986) 1591-1600 and Binns et al. In Isr. J. Vet. Med. 42 (1986) 124-127. Neither proposals nor factual reports have been found regarding the use of recombinant fowlpox viruses as a method for eliciting specific immunity in mammals.

Stickl en Mayer beschrijven in Fortschr. Med. 97(40) (1979) 1781-1788 de injectie van vogelpokken-, om precies te zijn 25 pluimveepokken-virus in mensen. Maar dit onderzoek betrof alleen het gebruik van gewone pluimveepokken voor het versterken van niet-specifieke immuniteit in patiënten die aan de nawerkingen van kanker-chemotherapie leden. Er werden geen recombinant-DNA-technie-ken gebruikt. Er werd niets gezegd over vogelpokken waarin DNA 30 ingebouwd was dat voor antigenen van gewervelde-pathogenen codeert of over een werkwijze voor het uitlokken van specifieke immuniteit in gewervelden. In plaats daarvan was die oudere techniek afhankelijk van een algemeen en niet-specifiek oppepeffect op de menselijke gastheer.Stickl and Mayer describe in Fortschr. Med. 97 (40) (1979) 1781-1788 the injection of fowlpox virus, poultry poxpox virus in humans, to be exact. However, this study only concerned the use of common poultry pox to enhance nonspecific immunity in patients who suffered the after effects of cancer chemotherapy. No recombinant DNA techniques were used. Nothing was said about bird pox incorporating DNA 30 encoding vertebrate pathogen antigens or a method for eliciting specific immunity in vertebrates. Instead, that older technique depended on a general and nonspecific boost effect on the human host.

35 Een vollediger bespreking van de grondslagen van de genetische recombinatie kan bijdragen tot het begrip hoe de gemodificeerde recombinant-virussen volgens deze uitvinding geschapen worden.A more complete discussion of the foundations of genetic recombination may help to understand how the modified recombinant viruses of this invention are created.

Genetische recombinatie is in het algemeen het uit- 8820&79.1 - 7 - * wisselen van homologe stukken deoxyribonucleïnezuur (DNA) tussen twee DNA-strengen. (In bepaalde virussen vervangt ribonucleïnezuur (RNA) het DNA.) Homologe stukken nucleïnezuur zijn stukken nucleïne-zuur (RNA of DNA) met dezelfde reeksen nucleotide-basen.Genetic recombination is generally the exchange of homologous pieces of deoxyribonucleic acid (DNA) between two strands of DNA. (In certain viruses, ribonucleic acid (RNA) replaces the DNA.) Homologous pieces of nucleic acid are pieces of nucleic acid (RNA or DNA) with the same sets of nucleotide bases.

5 Genetische recombinatie kan van nature optreden tij dens de vermenigvuldiging of het maken van nieuwe virus-genomen binnen de geïnfecteerde gastheercel. Zo kan genetische recombinatie tussen virus-genen gebeuren tijdens de virus-vermenigvuldiglngs-cyclus die in de gastheercel die tegelijkertijd met twee of meer 10 verschillende virussen of andere genetische constructies geïnfec teerd is. Een stuk DNA uit een eerste genoom wordt uitwisselbaar gebruikt bij het opbouwen van het stuk van het genoom van een tweede, mede infecterend virus waarvan het DNA homoloog met dat van het eerste virus-genoom is.Genetic recombination can naturally occur during the replication or generation of new virus genomes within the infected host cell. For example, genetic recombination between virus genes can occur during the virus multiplication cycle that is infected in the host cell simultaneously with two or more different viruses or other genetic constructs. A piece of DNA from a first genome is used interchangeably in building the piece of the genome of a second co-infecting virus whose DNA is homologous to that of the first virus genome.

15 Maar fecombinatie kan ook plaats vinden tussen stukken DNA van verschillende genomen die niet volmaakt homoloog zijn.However, combination can also take place between pieces of DNA from different genomes that are not perfectly homologous.

Als één zoTn stuk uit een eerste genoom homoloog met een stuk van een ander genoom is,uitgezonderd de aanwezigheid in het eerste stuk van bijvoorbeeld een genetisch merk of een gen dat voor een 20 antigene determinant codeert, kan recombinatie toch optreden en de produkten daarvan zijn door de aanwezigheid van dat genetische merk of gen aantoonbaar.If one such piece from a first genome is homologous to a piece from another genome, except for the presence in the first piece of, for example, a genetic mark or a gene encoding an antigenic determinant, recombination may still occur and the products thereof demonstrable by the presence of that genetic mark or gene.

Succesvol tot expressie komen van het ingebouwde DNA door het gemodificeerde infectieuze virus vereist twee omstandig-25 heden:Successful expression of the built-in DNA by the modified infectious virus requires two conditions:

Ten eerste moet het inbouwsel in een niet-essentieel gebied van het virus zitten opdat het gemodificeerde virus levensvatbaar blijft. Noch pluimveepokken noch de andere vogelpok-virussen hebben tot nog toe niet-essentiele gebieden getoond 30 analoog aan die die voor het koepokvirus beschreven zijn. Voor onderhavige uitvinding werden dan ook niet-essentiele gebieden van vogelpokken ontdekt door het vogelpokken-genoom in fragmenten te splitsen, deze fragmenten naar grootte te scheiden en deze fragmenten ter vermenigvuldiging in plasmiden in te bouwen (plas-35 miden zijn kleine, kringvormige DNA-moleculen die als extra-chromo- somale elementen in vele bacteriën, waaronder E. coli, gevonden worden). Methoden voor het inbouwen van DNA-reeksen, zoals genen voor antigene determinanten of andere genetische merken, in plasmiden zijn in de techniek goed bekend en zijn in detail beschre- 8820679.First, the insert must be in a non-essential region of the virus for the modified virus to remain viable. Neither poultry pox nor the other fowlpox viruses have hitherto shown non-essential regions analogous to those described for the cowpox virus. Therefore, for the present invention, non-essential regions of fowlpox were discovered by splitting the fowlpox genome into fragments, separating these fragments by size and incorporating these fragments into plasmids for multiplication (plas-35 mids are small, circular DNA- molecules found as extrachromosomal elements in many bacteria, including E. coli). Methods for incorporating DNA arrays, such as genes for antigenic determinants or other genetic markers, into plasmids are well known in the art and have been described in detail. 8820679.

____ *# - 8 - ven door Maniatis c.s. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). Dit werd gevolgd door het in de gekloonde pluimveepokken-fragmenten inbouwen van genetische merken en/of voor antigenen coderende genen. Die frag-5 menten die met succesvollere combinaties gepaard gingen, aangetoond door het met succes terugvinden van het genetische merk of het antigeen, waren die waarin het DNA in een niet-essentieel gebied van het pluimveepokken-genoom ingebouwd was.____ * # - 8 - by Maniatis et al. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). This was followed by incorporating genetic marks and / or genes encoding antigens into the cloned poultry pox fragments. Those fragments associated with more successful combinations, demonstrated by the successful retrieval of the genetic mark or antigen, were those in which the DNA was incorporated into a non-essential region of the poultry pox genome.

De tweede voorwaarde voor de expressie van ingebouwd 10 DNA is de aanwezigheid van een promotor in het juiste verband met het ingebouwde DNA. De promotor moet zodanig geplaatst zijn dat het bovenstrooms van de tot expressie te brengen DNA-reeks ligt. Omdat vogelpokkenvirussen niet goed gekarakteriseerd zijn en vo-gelpokken-promotors in de techniek nog niet geïdentificeerd waren, 15 worden als onderdeel van deze uitvinding promotoren van andere pokkenvirussen met nut bovenstrooms van het tot expressie te brengen DNA ingebouwd. Pluimveepokken-promotoren kunnen ook met succes gebruikt worden om de werkwijze uit te voeren en de produkten volgens de uitvinding te maken. Volgens deze uitvinding blijken pluim-20 veepokken-promotoren, koepok-promotoren en entomopox-promotoren het overschrijven in recombinant-pokkenvirus te bevorderen.The second condition for the expression of built-in DNA is the presence of a promoter in the correct relationship to the built-in DNA. The promoter must be positioned so that it is upstream of the DNA sequence to be expressed. Since fowlpox viruses have not been well characterized and bird pox promoters have not been identified in the art, promoters of other pox viruses are useful as upstream of the DNA to be expressed as part of this invention. Poultry pox promoters can also be successfully used to carry out the method and make the products of the invention. In accordance with this invention, poultry chickenpox promoters, cowpox promoters, and entomopox promoters have been shown to promote transcription into recombinant poxvirus.

Boyle en Coupar hebben in J. Gen. Virol. 6]_ (1986) 1591 gespeculeerd dat vaccinia-promotoren "verondersteld mogen worden in (pluimveepokkenr) virus te werken". De auteurs vonden en 25 kloonden een pluimveepokken-TK-gen (Boyle c.s. in Virology 156 (1987) 355-365 en bouwden het in Jcoêpüli-virus in. Dit TK-gen kwam tot expressie, vermoedelijk dankzij het herkennen van de pluimveepokken-TK-promotor-reeks door de polymerase-functies van vaccinia. Maar, ondanks dit speculeren bouwden de auteurs geen 30 enkele jcodpók-promotor in een pluimveepokkenvirus en namen ze ook geen expressie van een vreemde DNA-reeks in een pluimveepokken-genoom waar. Voorafgaande aan deze uitvinding was het niet bekend dat promotoren van andere pokken-virussen, zoals vaccinia-promotoren, in feite een gen in een vogelpokken-genoom op gang 35 zouden helpen.Boyle and Coupar in J. Gen. Virol. 6] (1986) 1591 speculated that vaccinia promoters "may be believed to act in (poultry pox) virus". The authors found and cloned a poultry pox TK gene (Boyle et al. In Virology 156 (1987) 355-365 and incorporated it into Jcoêpüli virus. This TK gene was expressed, presumably thanks to recognition of the poultry pox TK promoter sequence by the polymerase functions of vaccinia However, despite this speculation, the authors did not build a single jcodpók promoter in a poultry pox virus nor observed an expression of a foreign DNA sequence in a poultry pox genome. In this invention, it was not known that promoters from other smallpox viruses, such as vaccinia promoters, would in fact initiate a gene in a fowlpox genome.

Beschrijving van bepaalde bevoorkeurde uitvoeringsvormenDescription of Certain Preferred Embodiments

Pluimveepokken- en kanariepokken-virussen zijn volgens deze uitvinding vooral gebruikt als bevoorkeurde door recom- 8820679.* - 9 - binatie te modificeren soorten vogelpokken bij het daarin inbouwen van exogeen DNA.According to this invention, poultry pox and canarypox viruses have been used primarily as preferred recombinant species of bird pox in incorporating exogenous DNA therein.

Pluimveepokken is een soort vogelpokken die vooral kuikens infecteert, maar zoogdieren niet. De hier als FP-5 aan-5 geduide pluimveepokken-stam is een uit kuikenembryo afkomstig pluimveepokken-vaccinstam uit de handel, verkrijgbaar bij de American Scientific Laboratories (Afdeling van de Schering Corp.) te Madison, WI, veterinaire ontheffing no. 165 van de Verenigde Staten, serie no. 30321.Poultry pox is a type of bird pox that mainly infects chicks, but not mammals. The poultry pox strain referred to herein as FP-5 to -5 is a commercial chick embryo poultry pox vaccine strain available from the American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) of Madison, WI, Veterinary Waiver No. 165 of the United States, series no. 30321.

10 De hier als FP-1 aangeduide pluimveepokken-stam is een als vaccin voor één dag oude kuikens te gebruiken gemodificeerde Duvette-stam. De stam is een pluimveepokken-vaccinstam met de aanduiding O DCEP 25/CEP67/2309 van oktober 1980, en is verkrijgbaar bij het Instituut Mérieux.The poultry pox strain designated herein as FP-1 is a modified Duvette strain to be used as vaccine for one day old chicks. The strain is a poultry pox vaccine strain with the designation O DCEP 25 / CEP67 / 2309 of October 1980, and is available from the Institute Mérieux.

15 Kanariepokken is een andere soort vogelpokken. Analoog aan pluimveepokken infecteert kanariepokken vooral kanaries, maar niet zoogdieren. De hier als CP aangeduide kanariepokken-stam is een kanariepokken-vaccinstam uit de handel met de aanduiding LF2 CEP 524 24 10 75 en is ook verkrijgbaar bij het Instituut 20 Mérieux.15 Canarypox is another type of bird pox. Analogous to poultry pox, canary pox mainly infects canaries, but not mammals. The canarypox strain referred to here as CP is a commercially available canarypox vaccine strain with the designation LF2 CEP 524 24 10 75 and is also available from the Institute 20 Mérieux.

Tot de in deze vogelpok-virussen door genetische recom-binatie volgens de uitvinding ingebouwde DNA-reeksen behoort ook het Lac-Z-gen van prokaryotische herkomst, het rabies-glycoproteine-Éfeh (bet 0-gen)} een antigeen van een pathogeen voor zoogdieren maar 25 niet voor vogels, het kalkoeneninfluenza-hemagglutinine-gen, het antigeen van een pathogene vogelvirus anders dan het vogelpokken-virus, het gp51,30-gen voor de omhulling van het runderleukemie-virus (een zoogdieren-virus), het gen voor het versmeltingseiwit van het virus van de Newcastle-ziekte (de Texas-stam) (een vogel-30 virus), het gen voor de FeLV-omhulling van het kattenleukemie- virus (een zoogdierenvirus), het RAV-l-gen van de omhulling van het rous-virus dat een vogelvirus is dat pluimvee ziek maakt, het nucleoproteïne-gen van het virus van de Pennsylvanië-kuiken-influenza van 1/83 (een vogelvirus), het matrix-gen en peplomer-35 gen van het infectieuze bronchitisvirus (stam Mass 41) (een vogel virus) en het glycoproteïne-D-gen (gD) van herpes simplex virus (een zoogdierenvirus).The DNA sequences incorporated into these fowlpox viruses by genetic recombination according to the invention also include the Lac-Z gene of prokaryotic origin, the rabies glycoprotein-Éfeh (bet 0 gene)} an antigen of a pathogen for mammals but not for birds, the turkey influenza hemagglutinin gene, the antigen of a pathogenic avian virus other than the fowlpox virus, the gp51,30 gene for the coat of bovine leukemia virus (a mammalian virus), the gene for the Newcastle protein (Texas strain) virus fusion protein (a bird virus), the FeLV envelope gene of the feline leukemia virus (a mammalian virus), the RAV-1 gene of the coat of the rous virus which is a bird virus that makes poultry sick, the nucleoprotein gene of the 1/83 pennies chick influenza virus (a bird virus), the matrix gene and peplomer-35 gene of the infectious bronchitis virus (strain Mass 41) (a bird virus) and the glycoprotein e-D gene (gD) from herpes simplex virus (a mammalian virus).

Het isoleren van het Lac-Z-gen is beschreven door Casadaban c.s. in Methods in Enzymology 100 (1983) 293-308. De 6820679.The isolation of the Lac-Z gene has been described by Casadaban et al. In Methods in Enzymology 100 (1983) 293-308. The 6820679.

- 10 - structuur van het rabies-G-gen is bijvoorbeeld onthuld door Anilionis c.s. in Nature 294 (1981) 275-278.The structure of the rabies G gene has been disclosed, for example, by Anilionis et al. In Nature 294 (1981) 275-278.

Zijn inbouw in koepokvirus en zijn expressie in deze vector zijn ook een door Kieny c.s. in Nature 312 (1984) 163-166, 5 beschreven. Het kalkoenen-influenza-hemagglutinine-gen is beschre ven door Kawaoka c.s. in Virology 158 (1987) 218-227. Het gp51,30-gen voor de omhulling van het runderleukemie-virus is beschreven door Rice c.s. in Virology 138 (1984) 82-93. Het versmeltingsgen voor de Texas-stam van de Newcastle-ziekte is kalfsplasmide pNDV 10 108 verkrijgbaar bij het Institute Mérieux. Het gen voor de om hulling van het kattenleukemie-virus is beschreven door Guilnot c.s. in Virology 161 (1987) 252-258. Het met rous geassocieerde virus type 1 is verkrijgbaar bij het Institute Mérieux als twee klonen, penVRVIPT en mpl9env (190). Het NP-gen van de 15 kuikeninfluenza is als plasmide pNP 33 verkrijgbaar bijIts incorporation into cowpox virus and its expression in this vector has also been described by Kieny et al. In Nature 312 (1984) 163-166, 5. The turkey influenza hemagglutinin gene has been described by Kawaoka et al. In Virology 158 (1987) 218-227. The gp51.30 gene for the envelope of bovine leukemia virus has been described by Rice et al. In Virology 138 (1984) 82-93. The fusion gene for the Texas strain of Newcastle disease is calf plasmid pNDV 10 108 available from the Institute Mérieux. The gene for the coat of feline leukemia virus has been described by Guilnot et al. In Virology 161 (1987) 252-258. The rous-associated virus type 1 is available from the Institute Mérieux as two clones, penVRVIPT and mpl9env (190). The NP gene from the chick influenza is available as a plasmid pNP 33 from

Yoshihiro Kawaoka van het St. Jude Children's Research Hospital. Een cDNA-kloon van het matrix-gen van een infectieus bronchitis-virus Mass 41 en het peplomer-gen zijn als plasmide pIBVM63 verkrijgbaar bij het Institute Mérieux. Het gD-gen van het herpes 20 simplex virus is door Watson c.s. beschreven in Science 218 (1982) 381-384.Yoshihiro Kawaoka of St. Jude Children's Research Hospital. A cDNA clone of the matrix gene of an infectious bronchitis virus Mass 41 and the peplomer gene are available as plasmid pIBVM63 from the Institute Mérieux. The herpes 20 simplex virus gD gene has been described by Watson et al. In Science 218 (1982) 381-384.

In de hierna meer in detail beschreven recombinant-vogelpokkenvirussen zitten één van de volgende drie vaccinia-promotoren. De Pi-promotor uit het Ava I H-gebied van vaccinia is 25 door Wachsman c.s. beschreven in J. Inf. Dis. 155 (1987) 1188- 1197. Meer in het bijzonder is deze promotor afkomstig van het Ava I H(Xho I G)-fragment van de L-variant van de WR-vaccinia-stam, waarin de promotor het afschrijven van rechts naar links regelt. De plaats van de promotor op de kaart is ongeveer 1,3 Kbp 30 (kilo-baseparen) vanaf het linker einde van Ava IH, ongeveer 12,5 Kbp Vanaf het linker uiteinde van het vaccinia-genoom en ongeveer 8,5 Kbp links vanaf de Hind IIl/C/N-samenvoeging. De volgorde van deze promotor is (GGATCCC) -ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-35 AGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG—(AATTC), waarin de symbolen tussen haakjes aanhechtende reeksen voorstellen.The recombinant fowlpox viruses described in more detail below contain one of the following three vaccinia promoters. The Pi promoter from the Ava I H region of vaccinia has been described by Wachsman et al. In J. Inf. Dis. 155 (1987) 1188-1197. More specifically, this promoter is from the Ava I H (Xho I G) fragment of the L variant of the WR vaccinia strain, in which the promoter controls right to left copying. The promoter site on the map is approximately 1.3 Kbp 30 (kilo base pairs) from the left end of Ava IH, approximately 12.5 Kbp from the left end of the vaccinia genome and approximately 8.5 Kbp left from the Hind IIl / C / N aggregation. The order of this promoter is (GGATCCC) -ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-35 AGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG— (AATTC), representing symbols in parentheses.

De Hind III Η-promotor (hier ook "HH" of "H6") werd gedefinieerd met standaard karteringstechnieken door overschrijven.The Hind III Η promoter (here also "HH" or "H6") was defined using standard mapping techniques by overwriting.

0820679^ 4.0820679 ^ 4.

- 11 -- 11 -

Het heeft de volgorde:It has the order:

ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAA

TAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATA-AATTTAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATA-AATT

5 ATTTCATTATCGCGATATCCGT5 ATTTCATTATCGCGATATCCGT

TAAGTTTGTATCGTAATG.TAAGTTTGTATCGTAATG.

Deze reeks is identiek aan die die door Rosel c.s. in J. Virol.This series is identical to that used by Rosel et al. In J. Virol.

60 (1986) 436-449 beschreven werd als bovenstrooms van het open afleesdeel H6.60 (1986) 436-449 was described as upstream of the open reading portion H6.

10 De HK-promotor is als beschreven door Wittek in J. Virol. 49 (1984) 371-378 en door C. Betholet c.s. in Proc.The HK promoter is as described by Wittek in J. Virol. 49 (1984) 371-378 and by C. Betholet et al. In Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 2096-2100.Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 2096-2100.

De recombinant-vogelpokkenvirussen volgens deze uitvinding worden opgebouwd in twee stappen die in de techniek bekend 15 zijn en analoog aan wat genoemd is in het eerder geciteerdeThe recombinant fowlpox viruses of this invention are constructed in two steps known in the art and analogous to what is mentioned in the previously cited

Amerikaanse octrooischrift 4.603.112 voor het scheppen van synthetische recombinanten van het virus vaccinia.U.S. Patent 4,603,112 for scooping synthetic recombinants of the virus vaccinia.

Eerst wordt de in het virus in te bouwen DNA-reeks geplaatst in een plasmide van E. coli waarin DNA dat homoloog is 20 voor een stuk niet-essentieel DNA van het vogelpokkenvirus inge bouwd is. Los daarvan wordt de in te voegen DNA-reeks aan een promotor verbonden. De combinatie van promotor en gen wordt dan in het plasmide ingebouwd, zodanig dat de promotor-gen-combinatie aan beide uiteinden geflankeerd wordt door DNA dat homoloog is 25 met een niet-essentieel gebied van het vogelpokken-DNA. Het aldus geconstrueerde plasmide wordt dan versterkt door groei binnen de bacterie E. coli. (Plasmide-DNA wordt gebruikt om het exogene genetische materiaal te dragen en te versterken, en die methode is in de techniek goed bekend. Bijvoorbeeld zijn deze plasmide-tech-30 nieken door Clewell beschreven in J. Bacteriol. 110 (1972) 667-676.First, the DNA sequence to be incorporated into the virus is placed in a plasmid of E. coli into which DNA which is homologous is partly incorporated non-essential DNA of the fowlpox virus. Separately, the DNA sequence to be inserted is linked to a promoter. The promoter-gene combination is then incorporated into the plasmid such that the promoter-gene combination is flanked at both ends by DNA homologous to a non-essential region of the fowlpox DNA. The plasmid thus constructed is then enhanced by growth within the bacterium E. coli. (Plasmid DNA is used to carry and amplify the exogenous genetic material, and that method is well known in the art. For example, these plasmid techniques are described by Clewell in J. Bacteriol. 110 (1972) 667- 676.

De technieken voor het isoleren van het vermeerderde plasmide uit de gastheer E. coli zijn in de techniek ook bekend en zijn bijvoorbeeld door Clewell c.s. beschreven in Proc. Natl. Acad. Sci.The techniques for isolating the amplified plasmid from the host E. coli are also known in the art and are described, for example, by Clewell et al. In Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 62 (1969) 1159-1166).USA. 62 (1969) 1159-1166).

35 Het na groei binnen E. coli vermeerderde en geïsoleer de plasmide-materiaal wordt dan in de tweede stap gebruikt. Namelijk wordt het plasmide met daarin de in te bouwen DNA-reeks op een celkweek overgebracht, bijv. op kuikenembryo-fibroblasten, samen met het vogelpokkenvirus (zoals pluimveepokken stam FP-1 of FP-5). Recombinatie tussen het homologe pluimveepokken-DNA in het 8820679 7 - 12 - plasmide en het virus-genoom geeft een vogelpokkenvirus die gemodificeerd is door aanwezigheid, in een niet-essentieel gebied van zijn genoom, van DNA-reeksen die niet uit pluimveepokken afkomstig zijn.The plasmid material propagated and isolated within E. coli after growth is then used in the second step. Namely, the plasmid containing the DNA sequence to be incorporated is transferred to a cell culture, e.g., chick embryo fibroblasts, together with the fowlpox virus (such as fowlpox strain FP-1 or FP-5). Recombination between the homologous fowlpox DNA in the 8820679 7-12 plasmid and the virus genome gives a fowlpox virus modified by the presence, in a non-essential region of its genome, of non-poultry pox DNA strings.

5 Een beter begrip van deze uitvinding en de vele voor delen daarvan krijgt men uit de volgende voorbeelden, die slechts ter toelichting dienen.A better understanding of this invention and its many advantages is obtained from the following examples, which are illustrative only.

Voorbeeld 1Example 1

Voorbijgaande expressleproeven die het herkennen van koepok-10 promotoren door overschrijffactoren voor pluimveepokken-RNA laten zienTransient expression tests showing recognition of cowpox 10 promoters by poultry pox RNA transcription factors

Er werd een aantal plasmide geconstrueerd met daarin de reeks die voor het oppervlakte-antigeen van het virus Hepatitis B (HBSAg) codeert verbonden aan promotorreeksen voor het virus 15 Vaccinia. Van beide plasmiden werd 50 jjg overgebracht op CEF- cellen die met 10 pfu per cel aan pluimveevirus of vaccinia geïnfecteerd waren. Men liet de infectie 24 uur voortschrijden en de cellen werden toen door drie opeenvolgende cycli van bevriezen en ontdooien gelyseerd.A number of plasmids were constructed containing the series encoding the surface antigen of the virus Hepatitis B (HBSAg) linked to promoter series for the virus Vaccinia. 50 µg of both plasmids were transferred to CEF cells infected with 10 pfu per cell of poultry virus or vaccinia. The infection was allowed to progress for 24 hours and the cells were then lysed by three successive freeze and thaw cycles.

20 De hoeveelheid HBSAg in het lysaat werd bepaald met 125 de commercieel verkrijgbare AUSRIA II - I kit van de Abbott Laboratories, afdeling Diagnostics. De aan- of afwezigheid van HBSAg komt tot uiting in de verhouding van de netto tellingen (monster minus achtergrond) van het onbekende tot een vooraf door 25 de leverancier bepaalde drempelwaarde. Dit geeft een P/N-verhou- ding (positief/negatief). De uitkomsten staan in tabel I.The amount of HBSAg in the lysate was determined with 125 commercially available AUSRIA II-I kit from Abbott Laboratories, Diagnostics Department. The presence or absence of HBSAg is reflected in the ratio of the net counts (sample minus background) of the unknown to a threshold predetermined by the supplier. This gives a P / N ratio (positive / negative). The results are shown in Table I.

Er werden drie verschillende koepokvirus-promotor-reeksen gebruikt: de Pi-promotor welke vroeg in de koepok-infectie herkend wordt voordat het DNA zich gaat vermeerderen, de 11K 30 promotor die laat in de koepokinfectie herkend wordt na het begin van de DNA-vermeerdering, en de Hind III promotor Η (HH) die in de koepokinfectie zowel vroeg als laat herkend wordt. Deze promotoren zijn hier al eerder beschreven.Three different cowpox virus promoter sequences were used: the Pi promoter which is recognized early in the cowpox infection before the DNA multiplies, the 11K 30 promoter which is recognized late in the cowpox infection after the start of DNA multiplication , and the Hind III promoter Η (HH), which is recognized both early and late in cow infection. These promoters have been previously described here.

De cijfers laten zien dat het in de lysaten van geïnfec-35 teerde cellen gevormde HBSAg het resultaat is van het herkennen van de koepokvirus-promotoren door de vertalingsfactoren van zowel vogelpokken als koepokken.The figures show that the HBSAg formed in the lysates of infected cells results from recognition of the cowpox virus promoters by the translation factors of both fowlpox and cowpox.

8820679.” - 13 - λ8820679. " - 13 - λ

Tabel ITable I

Plasmide Virus Beschrijving p/NPlasmid Virus Description p / N

pMP 131piR2 pluimvee- SAg verbonden aan 1,8 koepok de Pi-promotor 9,1 pMPK 22.13S pluimvee- SAg verbonden aan 14 5 koepok de HK-promotor 2 pPDK 22.5 pluimvee- SAg verbonden aan 92,6 koepok de llK-promotor 5,6 pRW 668 pluimvee- SAg verbonden aan 77 koepok de HH-promotor 51,4 10 (geen plasmide) pluimvee- 1,1 (geen plasmide) koepok 1,3 pMPK 22.13S (geen virus) 1,3pMP 131piR2 poultry SAg linked to 1.8 cow pok the Pi promoter 9.1 pMPK 22.13S poultry SAg linked to 14 5 cow pok the HK promoter 2 pPDK 22.5 poultry SAg linked to 92.6 cow pok the lK promoter 5 .6 pRW 668 poultry SAg associated with 77 cowpox the HH promoter 51.4 10 (no plasmid) poultry 1.1 (no plasmid) cowpox 1.3 pMPK 22.13S (no virus) 1.3

Voorbeeld IIExample II

15 Opbouwen van het recombinant-pluimveepokkenvirus vFP-1 dat het Lac-Z-gen bevat15 Construction of the recombinant poultry pox virus vFP-1 containing the Lac-Z gene

Een fragment in een niet-essentieel gedeelte van het pluimveepokkenvirus werd als volgt gelokaliseerd en geïsoleerd.A fragment in a non-essential part of the poultry pox virus was located and isolated as follows.

Het nuclease Bal 31 werd gebruikt om uit het DNA van 20 FP-5 de enkelstrengige eindstandige haarspeldlussen te verwijderen.The nuclease Bal 31 was used to remove the single stranded hairpin loops from the DNA of FP-5.

Het (grotere) Klenow-fragment van DNA-polymerase I werd gebruikt om de uiteinden stomp te maken. Na verwijderen van de lussen werden er fragmenten gemaakt door vertering met restrictie-endo-nuclease Bgl II. Deze vertering gaf een serieFP-5-fragmenten die 25 door elektroforese over agarose-gel gescheiden werden.The (larger) Klenow fragment of DNA polymerase I was used to blunt the ends. After removing the loops, fragments were made by digestion with restriction endonuclease Bgl II. This digestion gave a series of FP-5 fragments that were separated by electrophoresis over agarose gel.

Zo’n Bgl II-fragment met stomp uiteinde van 8,8 Kbp werd geïsoleerd en ingevoegd in een commercieel verkrijgbaar plasmide, pUC 9, dat met Bam Hl en Sma I opengesplitst was. Het verkregen plasmide werd aangeduid als pRW 698.Such a blunt-ended 8.8 Kbp Bgl II fragment was isolated and inserted into a commercially available plasmid, pUC 9, which had been cleaved with Bam HI and Sma I. The resulting plasmid was designated pRW 698.

30 Om de afmetingen van het pluimveepokken-fragment te verminderen werd dit plasmide met Hind III gesplitst, wat twee andere fragmenten gaf. Een fragment van 6,7 Kbp werd weggedaan en het overgehouden fragment van 4,7 Kbp werd aan zichzelf verbonden, wat een nieuw plasmide gaf, aangeduid als pRW 699.To reduce the size of the poultry pox fragment, this plasmid was cleaved with Hind III to give two other fragments. A 6.7 Kbp fragment was discarded and the leftover 4.7 Kbp fragment bound to itself to give a new plasmid designated pRW 699.

35 Om een door 11K gepromoot Lac-Z-gen in dit plasmide in te bouwen werd pRW 699 met EcoRV opengeknipt, dat dit plasmide op slechts één plaats doorsnijdt. Dit segment van met 11K gepromoot Lac-Z-gen werd toen als een Pstl-Bam HI-fragment met stomp uiteinde ingebouwd, wat een nieuw plasmide gaf, aangeduid 40 als pRW 702. De Lac-Z-kloon is van pMC 1871, zoals door 8820679.' > - 14 -To incorporate an 11K promoted Lac-Z gene into this plasmid, pRW 699 was cleaved with EcoRV, which crosses this plasmid in only one place. This segment of 11K promoted Lac-Z gene was then incorporated as a blunt-ended Pstl-Bam HI fragment, giving a new plasmid, designated 40 as pRW 702. The Lac-Z clone is from pMC 1871, such as by 8820679. ' > - 14 -

Casadaban c.s. beschreven, loc. cit. De llK-promotor werd via een SÜ6Casadaban et al., Loc. cit. The 11K promoter was passed through an SÜ6

Bam HI-verbinding aan het 8 codon van het Lac-Z-gen verbonden.Bam HI compound attached to the 8 codon of the Lac-Z gene.

Met recombinatietechnieken zoals in het Amerikaanse octrooischrift 4.603.112 voor het koepokvirus beschreven werd het 5 plasmide pRW 702 dan gecombineerd met het pluimveevirus FP-5 dat op kuikenembryo-fibroblasten (CEF) groeide, met behulp van de volgende procedure voor het genereren van vFP-1. Van het DNA van pRW 702 werd 50 jig in een eindvolume van 100 p.1 gemengd met 0,5 jxg DNA van compleet pluimveepokken-genoom. Hieraan werden 10 jj 1 10 2,5 M CaC^ en 110 jil 2 x HEBS-buffer (pH = 7) toegevoegd, wat aangemaakt was uit: 40 mM Hepes 300 mM NaCl 1,4 mM NaoHP0, 2 4 15 10 mM KC1 12 mM glucoseUsing recombination techniques such as described in U.S. Patent 4,603,112 for Cowpox virus, the plasmid pRW 702 was then combined with the poultry virus FP-5 which grew on chick embryo fibroblasts (CEF), using the following procedure to generate vFP- 1. Of the DNA of pRW 702, 50 µg in a final volume of 100 µl was mixed with 0.5 µg DNA of complete poultry pox genome. To this were added 10 µl 1 10 2.5 M CaCl 3 and 110 µl 2 x HEBS buffer (pH = 7), which was made up of: 40 mM Hepes 300 mM NaCl 1.4 mM NaoHP0, 2 4 15 10 mM KCl 12 mM glucose

Na 30 minuten op kamertemperatuur werd uit een pluimveepokken-virus-voorraad die tot 5 pfu/cel verdund was 200 jil toegevoegd en met het mengsel werden Petri-schalen van 60 mm met daarin een 20 primaire monolaag CEF beent. Op dat tijdstip werd ook 0,7 ml medium • van Eagles met daarin 2 % foetaal runderserum (FBS) toegevoegd.After 30 minutes at room temperature, 200 µl was added from a poultry pox virus stock diluted to 5 pfu / cell and the mixture was seeded with 60 mm Petri dishes containing a primary monolayer CEF. At that time, 0.7 ml of Eagles medium containing 2% fetal bovine serum (FBS) was also added.

De platen werden 2 uur op 37°C geïncubeerd, waarna nog 3 ml medium van Eagles met 2 % FBS toegevoegd werd en de platen 3 dagen geïncubeerd werden. De cellen werden door drie opeenvolgende cycli 25 van bevriezen en ontdooien gelyseerd en onder de virus-nakomelingen werd toen naar de aanwezigheid van recombinanten gezocht.The plates were incubated at 37 ° C for 2 hours, then 3 ml of Eagles medium containing 2% FBS was added and the plates were incubated for 3 days. The cells were lysed by three consecutive freeze-thaw cycles, and the presence of recombinants was then searched for among the virus progeny.

Een bewijs van een succesvol inbouwen door recombinatie van het met 11K gepromote Lac-Z-gen in het genoom van pluimvee-pokken FP-5 werd verkregen door een proef op de expressie van het 30 Lac-Z-gen. Het Lac-Z-gen codeert voor het enzym B-galactosidase, wat het chromogene substraat 5-broom-4-chloorindolyl-3-$-D-galac-toside (X-gal) splitst, waarbij een blauw indolyl-derivaat vrijkomt. Blauwe plaques werden opgevat als positieve recombinanten.Evidence of successful incorporation by recombination of the 11K promoted Lac-Z gene into the fowlpox FP-5 genome was obtained by a test for the expression of the Lac-Z gene. The Lac-Z gene encodes the enzyme B-galactosidase, which cleaves the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloroindolyl-3 - $ - D-galactoside (X-gal), releasing a blue indolyl derivative. Blue plaques were considered to be positive recombinants.

Het succesvolle inbouwen van Lac-Z in het genoom van 35 pluimveepokken FP-5 en zijn expressie werden ook bevestigd door de immuun-precipitatie van het eiwit β-galactosidase met in de handel verkrijgbare antisera onder toepassing van standaardtechnieken met door vFP-1 geïnfecteerde CEF, BSC (apenier-cel-lijn - ATCC CCL26), VERO (apenier-cellijn - ATCC CCL81) en 40 MRC-5 (menselijke diploide longcellenlijn - ATCC CCL171).The successful incorporation of Lac-Z into the fowlpox FP-5 genome and its expression were also confirmed by the immunoprecipitation of the protein β-galactosidase with commercially available antisera using standard techniques with vFP-1 infected CEF , BSC (monkey cell line - ATCC CCL26), VERO (monkey cell line - ATCC CCL81) and 40 MRC-5 (human diploid lung cell line - ATCC CCL171).

8820 67 9.' - 15 -8820 67 9. ' - 15 -

De expressie in β-galactosidase door het recombinant-virus vFP-1 werd verder in vivo bevestigd door konijnen en muizen met het virus te beënten en daarna een toename in de titer van antilichamen tegen het eiwit β-galactosidase in het serum van de 5 beënte dieren te vinden.The expression in β-galactosidase by the recombinant virus vFP-1 was further confirmed in vivo by inoculating rabbits and mice with the virus and then an increase in the titer of antibodies to the protein β-galactosidase in the inoculated serum. find animals.

In het bijzonder werd het recombinant~vFP-l van gast-heercel-verontreinigingen gezuiverd en intradermaal op twee plaatsen van beide kanten van twee konijnen geënt. Elk konijn kreeg 8 in totaal 10 pfu.In particular, the recombinant vFP-1 was purified from host cell contaminants and seeded intradermally at two sites from both sides of two rabbits. Each rabbit received 8 total 10 pfu.

10 Het tussenpozen van een week werd bloed uit de dieren afgetapt en de sera werden in een ELISA-bepaling gebruikt onder toepassing van een in de handel verkrijgbaar preparaat van gezuiverd β-galactosidase als bron van antigeen.At weekly intervals, blood was drawn from the animals and the sera were used in an ELISA assay using a commercially available purified β-galactosidase preparation as an antigen source.

Zowel de konijnen als de muizen die met het recombi-15 nant-vFP-1 beënt waren gaven een immuunrespons op het β-galacto sidase, zoals de ELISA-proef liet zien. In beide soorten was de respons ëën week na het beënten aantoonbaar.Both the rabbits and the mice inoculated with the recombiant-vFP-1 gave an immune response to the β-galactosidase, as the ELISA test showed. The response was demonstrable one week after inoculation in both species.

Voorbeeld IIIExample III

Vanuit het pluimveepokkenvirus FP-5 opbouwen van het recombinant-20 virus vFP-2 dat het G-gen van rabies en Lac-Z bevatBuilding the recombinant-20 virus vFP-2 containing the rabies G-gene and Lac-Z from the poultry pox virus FP-5

Uit FP-5 werd een pVU II-fragment van 0,9 Kbp verkregen en dat werd met standaardtechnieken tussen de twee Pvu II-plaatsen in pUC 9 ingevoegd. Het verkregen produkt, aangeduid als pRW 688.2, heeft twee Hinc II-plaatsen, met een onderlinge af-25 stand van ongeveer 30 bp, asymmetrisch binnen het Pvu II-fragment en dus met een lange arm en een korte arm van het fragment.From FP-5, a 0.9 Kbp pVU II fragment was obtained and inserted into pUC 9 using standard techniques between the two Pvu II sites. The resulting product, designated pRW 688.2, has two Hinc II sites, spaced approximately 30 bp apart, asymmetrically within the Pvu II fragment and thus with a long arm and a short arm of the fragment.

Met voor het invoeren van Pst I- en Bam HI-plaatsen bekende technieken werden oligonucleotide-aanpassers tussen deze twee Hine II-plaatsen ingevoegd, wat plasmide pRW 694 gaf.Using techniques known to introduce Pst I and Bam HI sites, oligonucleotide modifiers were inserted between these two Hine II sites to give plasmid pRW 694.

30 Dit plasmide werd nu met Pst I en Bam Hl gesplitst en het Lac-Z-gen met daaraan de eerder beschreven vaceinia-promo-tor 11K werd ingevoegd, wat een nieuw plasmide gaf, pRW 700.This plasmid was now cleaved with Pst I and Bam H1 and the Lac-Z gene with the previously described vaceinia promoter 11K was inserted to give a new plasmid, pRW 700.

Om een met Pi-gepromoot rabies-gen G te scheppen werd 35 de Bgl II-plaats die nabij het 5’-einde van het rabies-gen ligt (zie Kieny c.s., loc.cit.) stomp gemaakt en aan de ingevulde Eco RI-plaats van de eerder beschreven Pi-promotor gebonden.To create a Pi-promoted rabies gene G, the Bgl II site located near the 5 'end of the rabies gene (see Kieny et al. Loc.cit.) Was blunted and to the completed Eco RI site of the previously described Pi promoter bound.

Deze constructie werd op de Pst I-plaats van pRW 700 ingevoegd, wat het plasmide pRW 735.1 gaf, met daarin de vreemde gen-reeks Pi-rabies G-11K-Lac Z. Dit invoegsel was binnen het 8820879.' - 16 - plasmide zodanig georiënteerd dat de lange Pvu II-Hinc Il-arm van de FP-5-donorreeks 3' ten opzichte van het Lac Z-gen was.This construction was inserted at the Pst I site of pRW 700 to give the plasmid pRW 735.1 containing the foreign gene series Pi-rabies G-11K-Lac Z. This insert was within 8820879. " - 16 - Plasmid oriented such that the long Pvu II-Hinc Il arm of the FP-5 donor series was 3 'to the Lac Z gene.

De aldus verkregen uiteindelijke constructie werd met de eerder beschreven methoden door infectie en transfectie van 5 kuikenembryo-fibroblasten met pluimveepokken-virus FP-5 gerecombi- neerd wat het recombinant-pluimveepokken-virus vFP-2 gaf. Dit recombinant -virus werd met behulp van X-gal-kleuring gevonden. De juiste invoeging en het tot expressie komen van zowel het merkende Lac Z-gen als het rabies-gen G werden bevestigd met een aantal 10 hierna beschreven methoden.The final construction thus obtained was recombined by the previously described methods by infection and transfection of 5 chick embryo fibroblasts with fowlpox virus FP-5 to give the recombinant fowlpox virus vFP-2. This recombinant virus was found using X-gal staining. Proper insertion and expression of both the labeling Lac Z gene and the rabies gene G were confirmed by a number of methods described below.

Het door immunofluorescentie lokaliseren van het rabies-antigeen met specifieke antilichamen toonde met succes de expressie van het rabies-antigeen aan op het oppervlak van vogelen niet-Vogel-cellen die met virus vFP-2 geïnfecteerd waren. Net 15 als te voren werd de expressie van het rabies-antigeen en het β-galactosidase door met het virus vFP-2 geïnfecteerde vogel- en niet-vogel-cellen bevestigd met de immuunprecipitatie-methode.Immunofluorescence localization of the rabies antigen with specific antibodies successfully demonstrated the expression of the rabies antigen on the surface of bird non-Vogel cells infected with virus vFP-2. As before, the expression of the rabies antigen and the β-galactosidase by avian and non-avian cells infected with the virus vFP-2 was confirmed by the immunoprecipitation method.

Een ander bewijs dat de vFP-2-belichaming van deze uitvinding een succesvol recombinant-virus dat het rabies-gen 20 G en het gen voor β-galactosidase draagt werd verkregen door twee konijnen met vFP-2 te beënten. Beide konijnen werden intradermaal 8 met 1 x 10 pfu aan vFP-2 beent. Beide konijnen gaven de typische pokkenverschijnselen. Elke week werd bloed uit de konijnen afgetapt en de sera werden met ELISA onderzocht op de aanwezigheid 25 van voor het rabies-glycoproteïne en het β-galactosidase specie- fieke antilichaam.Another proof that the vFP-2 embodiment of this invention is a successful recombinant virus carrying the rabies gene 20 G and the β-galactosidase gene was obtained by inoculating two rabbits with vFP-2. Both rabbits were inoculated intradermally with 1 x 10 pfu of vFP-2. Both rabbits gave the typical smallpox symptoms. Each week, blood was drawn from the rabbits and the sera were examined by ELISA for the presence of the rabies glycoprotein and the β-galactosidase specific antibody.

Zoals tabel II hieronder laat zien vertoonde konijn 205 éën week na de beënting met de ELISA-proef aantoonbare gehalten aan antilichaam tegen β-galactosidase. Na 2 weken was dit ge-30 stegen tot een titer van 1 op 4000, welke tot 5 weken na de be- enting aanhield. Met de antigeen invangende ELISA-proef vertoonde serum van konijn 205 gedurende 3 tot 10 weken na de beënting aantoonbare· gehalten aan antilichamen tegen rabies.As shown in Table II below, rabbit 205 showed detectable levels of antibody to β-galactosidase one week after inoculation with the ELISA assay. After 2 weeks, this had risen to a titer of 1 in 4000, which lasted up to 5 weeks after inoculation. The antigen-capturing ELISA assay showed rabbit serum 205 for 3 to 10 weeks after inoculation with detectable levels of antibodies to rabies.

8820673.1 358820673.1 35

- 17 -Tabel II- 17 - Table II

Produktie van antilichaam door konijn 205 tegen rabies-antigeen en tegen g-galaetosidase 5 Tijd Antilichaam-titer (serum-verdunning)Rabbit 205 antibody production against rabies antigen and against g-galetosidase 5 Time Antibody titer (serum dilution)

Voor de bloedaftap tegen 3-galactosidase 0For the blood draw against 3-galactosidase 0

Week 1 1 : 500Week 1 1: 500

Weken 2-5 (elk) 1 : 4000 10 Week 6 1 : 500Weeks 2-5 (each) 1: 4000 10 Week 6 1: 500

Week 9 1 : 250Week 9 1: 250

Voor de bloedaftap tegen rabies 0For the blood draw against rabies 0

Week 3 1 : 200 15 Week 6 1 : 200Week 3 1: 200 15 Week 6 1: 200

Week 10 1 : 100Week 10 1: 100

Voorbeeld IVAExample IVA

Het uit pluimveevirus FP-1 opbouwen van recombinant-vlrus vFP-3 20 dat gepromoot rabiesgen G bevatBuilding recombinant vlrus vFP-3 from poultry virus FP-1 containing promoted rabies gene G

Deze belichaming laat zien dat het rabies-gen G door andere pluimveepokken-stammen dan FP-5 volledig tot expressie komt, vooral door een andere stam van het pluimveevirus, aangeduid als FP-1.This embodiment shows that the rabies gene G is fully expressed by poultry pox strains other than FP-5, especially by another poultry virus strain designated FP-1.

25 Net als in voorbeeld III werd uit FP-1 een Pvu II- fragment van 0,9 Kbp verkregen, onder de aanname dat, net als in FP-5, dit fragment een niet-essentieel gebied zou bevatten.As in Example III, a Pvu II fragment of 0.9 Kbp was obtained from FP-1, assuming that, as in FP-5, this fragment would contain a non-essential region.

Dit fragment werd tussen de twee Pvu II-plaatsen van püC 9 geplaatst, wat een plasmide gaf, aangeduid als pRW 731.15R. 30 Dit plasmide heeft twee Hinc II-plaatsen, ongeveer 30 bp uit elkaar, asymmetrisch binnen het Pvu II-fragment, wat het fragment dus een lange arm en een korte arm geeft.This fragment was placed between the two Pvu II sites of püC 9 to give a plasmid designated pRW 731.15R. This plasmid has two Hinc II sites, about 30 bp apart, asymmetrical within the Pvu II fragment, thus giving the fragment a long arm and a short arm.

Tussen de twee Hinc II-plaatsen werd een commercieel verkrijgbare Pst-verbinding (5’) - CCTGCAGG - (3’) ingevoegd, 35 wat een plasmide pRW 741 gaf.A commercially available Pst compound (5 ") - CCTGCAGG - (3") was inserted between the two Hinc II sites, giving a plasmid pRW 741.

Een met HH gepromoot rabies-gen G werd op de Pst I-plaats in dit plasmide geplaatst, wat het nieuwe plasmide pRW 742B gaf. Door recombinatie van dit plasmide met FP-1, door infectie en transfectie van CEF-eellen, werd virus vFP-3 verkregen.An HH promoted rabies gene G was placed at the Pst I site in this plasmid to give the new plasmid pRW 742B. Virus vFP-3 was obtained by recombination of this plasmid with FP-1, by infection and transfection of CEF cells.

8820679/ - 18 -8820679 / - 18 -

Het begincodon voor het afschrijven van het open af te lezen stel, ATG, werd, aangevuld met de HH-promotor bovenop het begincodon van het rabies-gen G geplaatst met behulp van een synthetisch oligonucleotide dat de EcoRV-plaats in de HH-promotor 5 en de Hind ΙΙΙ-plaats in het rabies-gen G overspande. Het 5’-einde van dit door HH gepromoot rabies-gen werd met bekende technieken gemodificeerd zodat het nu een Pst I-plaats bevatte en het bouwsel werd toen op de Pst I-plaats van pRW 741 ingevoegd waardoor pRW 742B geschapen werd. De oriëntatie van deze constructie in het 10 plasmide was dezelfde als in het eerder in voorbeeld III besproken pRW 735.1.The initial codon for scribing the open reading set, ATG, supplemented with the HH promoter was superimposed on the initial codon of the rabies gene G using a synthetic oligonucleotide that the EcoRV site in the HH promoter. and spanned the Hind plaats position in the rabies gene G. The 5 'end of this HH-promoted rabies gene was modified by known techniques to now contain a Pst I site and the structure was then inserted into the Pst I site of pRW 741 creating pRW 742B. The orientation of this construction in the plasmid was the same as in pRW 735.1 discussed previously in Example III.

Recombinatie werd uitgevoerd als beschreven in voorbeeld II. De verkregen recombinant werd vFP-3 genoemd.Recombination was performed as described in Example II. The resulting recombinant was designated vFP-3.

De expressie van het rabies-antigeen zowel in vogel-15 als in niet-vogel-cellen die met het virus vFP-3 geïnfecteerd wa ren werd bevestigd met de eerder beschreven immuunprecipitatie-en immunofluorescentie-technieken.The expression of the rabies antigen in both avian and non-avian cells infected with the virus vFP-3 was confirmed by the previously described immunoprecipitation and immunofluorescence techniques.

Nog een bewijs dat de uitvoeringsvorm vFP-3 volgens deze uitvinding een succesvol recombinant-virus is dat de genen 20 voor rabies G tot expressie brengt werd verkregen door paren konijnen intradermaal met het recombinant-virus te beënten. Er werden twee konijnen intradermaal met vFP-3 beent, per konijn g 1 X 10 pfu. Deze beide konijnen gaven de typische pokkenverschijnselen, welke 5-6 dagen na de beënting hun maximum bereikten. 25 Met tussenpozen van een week werd er bloed uit de konijnen afgetapt en de sera werden met ELISA onderzocht op de aanwezigheid van voor het rabies-glycoproteïne specifieke antilichamen.Another proof that the embodiment vFP-3 of this invention is a successful recombinant virus expressing the rabies G genes was obtained by inoculating pairs of rabbits intradermally with the recombinant virus. Two rabbits were inoculated intradermally with vFP-3, 1 x 10 pfu per rabbit. Both these rabbits gave the typical smallpox symptoms, which reached their maximum 5-6 days after inoculation. Blood was drawn from the rabbits at weekly intervals and the sera were examined by ELISA for the presence of rabies glycoprotein specific antibodies.

Ook werden vijf ratten elk intradermaal met 5 x 10^ pfu aan vFP-3 beent. Op alle dieren verschenen er pokken.Also, five rats were inoculated intradermally with 5 x 10 ^ pfu of vFP-3. Smallpox appeared on all animals.

30 Zowel de konijnen als de ratten hadden twee Weken na het beënten aantoonbare gehalten aan voor rabies specifieke antilichamen. Twee blanco konijnen die intradermaal met het moeder-virus FP-1 beent waren hadden geen aantoonbare gehalten aan anti-lichaam tegen rabies.Both rabbits and rats had detectable levels of rabies-specific antibodies two weeks after inoculation. Two blank rabbits that were inoculated intradermally with the mother virus FP-1 had no detectable levels of anti-rabies antibody.

35 Om de mogelijkheid uit te sluiten dat de antilichaam- respons toe te schrijven was aan het invoeren van rabies-antigeen dat toevallig met de virusent mee kwam of een deel uitmaakte van het membraan van het recombinat-pluimveevirus, in plaats van aan de veronderstelde de novo synthese van het rabies-antigeen door 40 het recombinant-virus in het dier, werd het virus vFP-3 chemisch 8820 679 ? - 19 - « geïnactiveerd en toen in konijnen geënt.35 To rule out the possibility that the antibody response was due to the introduction of rabies antigen that happened to coincide with the virus graft or was part of the membrane of the recombinat poultry virus, rather than the putative novo synthesis of the rabies antigen by the recombinant virus in the animal, the virus vFP-3 was chemically 8820 679? - 19 - «inactivated and then vaccinated in rabbits.

Het gezuiverde virus werd overnacht bij 4°C met 0,001 % β-propiolacton geïnactiveerd en toen door centrifugeren geconcentreerd. Het virus-sediment werd in met 10 mM tris gebufferde zout-5 oplossing gesuspendeerd, ultrasoon stukgetrild en getitreerd om zeker te stellen dat er geen infectieus virus over gebleven was.The purified virus was inactivated with 0.001% β-propiolactone overnight at 4 ° C and then concentrated by centrifugation. The virus sediment was suspended in 10 mM tris buffered saline, ultrasonically vibrated and titrated to ensure that no infectious virus remained.

Er werden twee konijnen intradermaal met geïnactiveerd vFP-3 beent en twee met een equivalente hoeveelheid onbehandelde recombinant. De afmetingen van de pokkenschade werden opgemeten.Two rabbits were inoculated intradermally with inactivated vFP-3 and two with an equivalent amount of untreated recombinant. The dimensions of the smallpox damage were measured.

10 De beide konijnen die onbehandeld vFP-3 kregen hadden na 5 dagen typische pokken ontwikkeld, geklasseerd als 4-5+. Met geïnactiveerd beënte konijnen ontwikkelden ook huidschade, maar deze werden 5 dagen na het beënten als 2+ geklasseerd.Both rabbits receiving untreated vFP-3 had developed typical smallpox after 5 days, classified as 4-5+. Inactivated inoculated rabbits also developed skin damage, but these were classified as 2+ 5 days after inoculation.

Uit konijnen werd met tussenpozen van een week bloed 15 afgetapt en de sera werden met ELISA beproefd op de aanwezigheid van voor rabies specifieke antilichamen en voor pluimveepokken specifieke antilichamen. De uitkomsten staan in tabel III hierna.Rabbits were bled at weekly intervals and the sera were assayed by ELISA for the presence of rabies specific antibodies and poultry pox specific antibodies. The results are shown in Table III below.

Tabel IIITable III

20 Levend vFP-3_ Geïnactiveerd vFP-3Live vFP-3_ Inactivated vFP-3

Konijn: Nr. 295 Nr, 318 Kr. 303 Nr. 320Rabbit: No. 295 No., 318 Kr. 303 No. 320

Antilichaam Rabies FP Rabies FP Rabies FP Rabies FPAntibody Rabies FP Rabies FP Rabies FP Rabies FP

waarop beproefd werd: 25tested: 25

Week na het enten 0 00000000 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 30 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 5 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000 35 Bij deze proef werd het eindpunt van de bepaling (opgegeven als het omgekeerde van de serumverdunning) arbitrair op 0,2 gesteld nadat de absorptiewaarden van alle sera voor de uitdaging er afgetrokken waren. Zowel konijn 295 als nr. 318, die het levende virus kregen, ontwikkelden een immuunrespons tegen 40 het rabies-glycoproteïne en tegen de pluimveepokken-antigenen.Week after inoculation 0 00000000 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 30 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 5 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000 35 In this test, the end point of the assay (reported as the inverse of the serum dilution) was set arbitrarily at 0.2 after the absorbance values of all sera were subtracted for the challenge. Both rabbit 295 and No. 318, which received the live virus, developed an immune response against the rabies glycoprotein and the poultry pox antigens.

8820679 .1 - 20 -8820679 .1 - 20 -

Konijnen 303 en 320 ontwikkelden ook een immuunrespons tegen pluim-veepokken-antigenen, hoewel de titer lager was. Geen van deze konijnen ontwikkelden een waarneembare respons op het rabies-glyco-proteïne.Rabbits 303 and 320 also developed an immune response to poultry chickenpox antigens, although the titer was lower. Neither of these rabbits developed an observable response to the rabies glycoprotein.

5 Deze uitkomsten betekenen dat de in het konijn opge wekte immuunrespons toe te schrijven is aan een de novo expressie van het rabies-gen voor glycoproteïne dat in het recombinant-virus zat en niet een respons op eventueel toevallig met de ent meegekomen glycoproteïne.These results mean that the immune response elicited in the rabbit is due to a de novo expression of the rabies gene for glycoprotein contained in the recombinant virus and not a response to any glycoprotein accidentally introduced with the graft.

10 Voorbeeld IVBExample IVB

Vanuit pluimveepokkenvirus FP-1 opbouwen van het recombinant-virus vFP-5 dat een niet gepromoot rabies-gen G bevatBuilding up the recombinant virus vFP-5 containing a non-promoted rabies gene G from poultry pox virus FP-1

Expressie van een vreemd gen dat door recombinatie in het pluimveepokken-genoom ingevoegd is vereist de aanwezigheid van 15 een promotor. Dit werd aangetoond door het scheppen van nog een recombinant, vFP-5, die identiek aan vFP-3 was behalve dat de HH-promotor nu weggelaten werd. De aanwezigheid van het rabies-gen in deze recombinant werd bevestigd door nucleïnezuur-hybridisering. Maar in met het virus geïnfecteerde CEF-celkweken werd geen rabies-20 antigeen aangetoond.Expression of a foreign gene inserted into the poultry pox genome by recombination requires the presence of a promoter. This was demonstrated by creating another recombinant, vFP-5, which was identical to vFP-3 except that the HH promoter was now omitted. The presence of the rabies gene in this recombinant was confirmed by nucleic acid hybridization. However, no rabies 20 antigen was detected in CEF cell cultures infected with the virus.

Voorbëeld VExample V

Passageproeven in vitro om vast te stellen of pluimveevirus zich in niet-vogel-cellen vermenigvuldigtIn vitro passage tests to determine whether poultry virus multiplies in non-avian cells

Er werd een proef uitgevoerd waarbij drie celsystemen, 25 een uit vogels en twee niet, beent werden met de moederstam FP-1 of met de recombinant vFP-3. Er werden steeds twee schalen met CEF, MRC-5 of VERO met FP-1 of met vFP-3 beent in een dosis van 10 pfu per cel.An experiment was performed in which three cell systems, one from birds and two not, were seeded with the parent strain FP-1 or with the recombinant vFP-3. Two dishes with CEF, MRC-5 or VERO with FP-1 or with vFP-3 were seeded at a dose of 10 pfu per cell.

Na drie dagen werd één schaal van elk paar geoogst.After three days, one dish from each pair was harvested.

30 Het virus werd er door drie opeenvolgende cycli van bevriezen en ontdooien uit vrijgemaakt en op een verse monolaag van dezelfde cellijn overgeënt. Dit werd zesmaal herhaald, en bij het einde van de proef werden monsters van elke generatie op CEF-monolagen ge-titreerd op infectiviteit.The virus was released by three successive freeze and thaw cycles and seeded onto a fresh monolayer of the same cell line. This was repeated six times, and at the end of the run, samples of each generation on CEF monolayers were titrated for infectivity.

35 De uitkomsten staan in tabel IVA en laten zien dat in CEF-cellen een serie generaties van zowel FP-1 als van vFP-3 mogelijk is, maar niet in de twee niet-vogel-cellijnen. Infectieus virus was maar drie of vier passages op VERO- of MRC-5-cellen niet aantoonbaar.The results are shown in Table IVA and show that a series of generations of both FP-1 and vFP-3 is possible in CEF cells, but not in the two non-bird cell lines. Infectious virus was only detectable for three or four passages on VERO or MRC-5 cells.

8820679.8820679.

- 21 -- 21 -

De tweede schaal werd gebruikt om na te gaan of het niet met directe titratie aantoonbare virus aangetoond kon worden na versterking in toelatende CEF-cellen. Na drie dagen werden de cellen van elke tweede schaal door afschrapen geoogst en een derde 5 van de cellen werd gelyseerd en op een verse CEF-monolaag overge- ent. Toen na 7 dagen het volledige pathologische effect bereikt was werden de cellen gelyseerd en werd de opbrengst van het virus getitreerd. De uitkomsten staan in tabel IVB. Met doorgangn in CEF-cellen ter versterking van eventueel aanwezig virus kon het 10 virus toch na vier of vijf passages niet meer aangetoond worden.The second scale was used to determine whether the virus not detectable with direct titration could be detected after amplification in permissive CEF cells. After three days, the cells from each second dish were harvested by scraping and a third of the cells were lysed and transferred to a fresh CEF monolayer. When the full pathological effect was reached after 7 days, the cells were lysed and the yield of the virus titrated. The results are shown in Table IVB. With passage in CEF cells to amplify any virus present, the virus could no longer be detected after four or five passages.

Pogingen om tot persistent geïnfecteerde cellen te komen faalden.Attempts to arrive at persistently infected cells failed.

Bij nog een poging om aanwijzingen voor een blijvende virus-expressie in niet-vogelcellen te vinden werden de hierboven 15 voor virus-titratie gebruikte monsters in een standaard immunolo gische stippenproef gebruikt, waarbij antilichamen tegen pluimvee-pokken en tegen rabies ingezet werden om de aan- of afwezigheid van de respectievelijke antigenen aan te tonen. De uitkomsten van deze proeven bevestigen de titratie-uitkomsten.In a further attempt to find evidence of persistent virus expression in non-avian cells, the samples used for virus titration above were used in a standard immunological spot test using antibodies against poultry pox and rabies to attack the viruses. - demonstrate the absence of the respective antigens. The results of these tests confirm the titration results.

2020

Tabel IVA Passage-proefTable IVA Passage Test

Beënt met virus FP-1 vFP-3Inoculated with virus FP-1 vFP-3

van het cel-type CEF VERO MRC-5 CEF VEROof the cell type CEF VERO MRC-5 CEF VERO

25 MRC-5MRC-5

Gen. 1 6,6a 4,8 4,9 6,6 5,4 6,2 2 6,7 2,9 3,7 6,5 4,2 5,1 3 6,4 1,4 1,0 6,4 1,7 4,4 4 6,1 N.A.b N.A. 6,2 N.A. 1,0 30 5 6,4 N.A. N.A. 6,3 N.A. N.A.Gene. 1 6.6a 4.8 4.9 6.6 5.4 6.2 2 6.7 2.9 3.7 6.5 4.2 5.1 3 6.4 1.4 1.0 6. 4 1.7 4.4 4 6.1 NAb NA 6.2 N.A. 1.0 30 5 6.4 N.A. AFTER. 6.3 N.A. AFTER.

6 5,7 N.A. N.A. 5,9 N.A. N.A.6 5.7 N.A. AFTER. 5.9 N.A. AFTER.

a - titer van het virus uitgedrukt in de ^log van het aantal pfu per ml.a - titer of the virus expressed in the log of the number of pfu per ml.

35 b - niet aantoonbaar.35 b - not demonstrable.

8820879/ - 22 -8820879 / - 22 -

Tabel IVB VersterkingsproefTable IVB Reinforcement test

Beent met virus FP-1 vFP-3Bones with virus FP-1 vFP-3

van het cel-type CEF VERO MRC-5 CEF VEROof the cell type CEF VERO MRC-5 CEF VERO

5 MRC-55 MRC-5

Gen. 1 6,4a 6,2 6,4 6,5 6,3 6,4 2 7,5 6,3 6,0 6,5 6,3 5,5 3 6,2 6,7 5,3 5,9 6,1 6,3 4 5,6 4,6 3,9 5,7 4,8 5,8 10 5 6,3 4,1 Ν.Δ. 6,1 4,7 4,7 6 6,2 N.A.b N.A. 6,2 N.A. N.A.Gene. 1 6.4a 6.2 6.4 6.5 6.3 6.4 2 7.5 6.3 6.0 6.5 6.3 5.5 3 6.2 6.7 5.3 5. 9 6.1 6.3 4 5.6 4.6 3.9 5.7 4.8 5.8 10 5 6.3 4.1 Ν.Δ. 6.1 4.7 4.7 6 6.2 N.A.b N.A. 6.2 N.A. AFTER.

a - titer van het virus uitgedrukt in de ^log van het aantal pfu per ml.a - titer of the virus expressed in the log of the number of pfu per ml.

15 b - niet aantoonbaar.15 b - not demonstrable.

Voorbeeld VIExample VI

Nog meer recombinanten van pluimveepokken FP-1: vFP-6, vFP-7, vFP-8 en vFP-9 20 Recombinant-virussen vFP-6 en vFP-7 werden met de volgende procedure in elkaar gezet.Additional poultry pox FP-1: vFP-6, vFP-7, vFP-8, and vFP-9 recombinants Recombinant viruses vFP-6 and vFP-7 were assembled using the following procedure.

Een Pvu II-fragment van FP-1 van 5,5 Kbp werd in tussen de twee Pvu—II-plaatsen in pUC 9 ingevoegd, wat plasmide pRW 731.13 gaf. Dit plasmide werd toen op één enkele Hinc II-plaats doorge-25 knipt, en afgestompt, met HH gepromoot rabies-gen G werd ingebouwd, wat plasmiden pRW 748A en -B gaf (met tegengestelde oriënteringen van het invoegsel). Plasmiden pRW 748A en -B werden dan afzonderlijk gebruikt om CEF-cellen samen het virus FP-1 te transfecteren, hetgeen door recombinatie respectievelijk vFP-6 en vFP-7 gaf.A 5.5 Kbp Pvu II fragment of FP-1 was inserted into pUC 9 between the two Pvu-II sites to give plasmid pRW 731.13. This plasmid was then cut at a single Hinc II site, and blunted, HH promoted rabies gene G was built in, giving plasmids pRW 748A and -B (with opposite orientations of the insert). Plasmids pRW 748A and -B were then used separately to transfect CEF cells together transfecting FP-1 virus, yielding vFP-6 and vFP-7 by recombination, respectively.

30 Een Pvu-II-fragment van FP-1 van 10 Kbp werd tussen de twee Pvu II-plaatsen van pUC 9 ingevoegd, wat pRW 731.15 gaf. Dit plasmide werd toen op de ene Bam Hl-plaats doorgeknipt en toen werd er een. door HK gepromoot Lac Z-gen ingebouwd, wat pRW 749A en -B (met tegengestelde oriëntaties van het invoegsel) gaf. Recombi-35 natie van deze donorplasmiden met FP-1 leidde tot respectievelijk vFP-8 en vFP-9. Deze plaats wordt nu aangeduid als "plaats f8".A 10 Kbp Pvu-II fragment of FP-1 was inserted between the two Pvu II sites of pUC 9 to give pRW 731.15. This plasmid was then cut at one Bam Hl site and then one. HK promoted Lac Z gene built in, yielding pRW 749A and -B (with opposite insertion orientations). Recombining these donor plasmids with FP-1 resulted in vFP-8 and vFP-9, respectively. This place is now referred to as "place f8".

vFP-8 en vFP-9 brachten het lac Z-gen tot expressie, zoals met X-gal bleek. vFP-6 en vFP-7 brachten het rabies-gen G tot expressie wat met een voor rabies specifiek antiserum aangetoond werd.vFP-8 and vFP-9 expressed the lac Z gene, as revealed by X-gal. vFP-6 and vFP-7 expressed the rabies gene G, which was demonstrated with a rabies specific antiserum.

8820679/ - 23 -8820679 / - 23 -

Voorbeeld VIIExample VII

Immunisering met vFP-3 ter bescherming van dieren tegen uitdaging door levend rabies-virusImmunization with vFP-3 to protect animals from challenge by live rabies virus

Groepen van 20 vrouwelijke SPF-muizen van 4-6 weken 5 oud werden in hun voetzolen beent met 50 jxl vFP-3 in dosis varië rende van 0,7 tot 6,7 WKID^q per muis (de WKID^q of 50 % weefsel-kweek-infectieuze dosis is die dosis waarbij 50 % der cellen van de weefselkweek een cytopathologisch effect vertonen). Na 14 dagen werden 10 muizen van elke groep opgeofferd en werden er serum-10 monsters gewonnen voor de SFFR-proef. De overblijvende 10 muizen werden uitgedaagd door intracerebrale beënting met 10 LDj.g aan rabies-virus van de CVS-stam, en weer 14 dagen later werd nagegaan hoeveelheid dat overleefden. De uitkomsten staan hieronder in tabel VA.Groups of 20 female SPF mice 4-6 weeks old were boneed in the soles of their feet with 50 µl vFP-3 in dose ranging from 0.7 to 6.7 WKID ^ q per mouse (the WKID ^ q or 50% tissue culture infectious dose is that dose at which 50% of the cells of the tissue culture show a cytopathological effect). After 14 days, 10 mice from each group were sacrificed and serum 10 samples were collected for the SFFR test. The remaining 10 mice were challenged by intracerebral inoculation with 10 LDj.g of rabies virus from the CVS strain, and again 14 days later the amount survived. The results are shown below in table VA.

15 Tabel VA15 Table VA

Dosis vFP-3 Antilichamen tegen Overlevenden 10ina utrrn rabies 10l°ê van de _50 eindverdunning* _ 6.7 1,9 8/10 4.7 1,8 0/10 20 2,7 0,4 0/10 0,7 0,4 0/10 * Gemeten met de SFFR- (snelle Fluorescentie Focus-Remmings)-proef, Laboratory Techniques in Rabies, 3 uitgave van het WHO 25 te Geneve, blz. 354-357.Dose of vFP-3 Antibodies to Survivors 10ina utrrn rabies 10l ° ê of the _50 final dilution * _ 6.7 1.9 8/10 4.7 1.8 0/10 20 2.7 0.4 0/10 0.7 0.4 0 / 10 * Measured using the SFFR (rapid fluorescence focus inhibitions) test, Laboratory Techniques in Rabies, 3 edition of WHO 25 in Geneva, pp. 354-357.

De proef werd herhaald met een uitdaging door 12,5 LD5Q van het rabies-virus. De uitkomsten staan in tabel V hieronder.The experiment was repeated with a challenge by 12.5 LD5Q of the rabies virus. The results are shown in Table V below.

Tabel VBTable VB

30 Dosis vFP-3 Antilichamen tegen Overlevenden 10- rabies 10log van de _50 eindverdunning* _ 6.7 2,8 5/10 4.7 2,1 2/10 2.7 0,6 0/8 35 0,7 0,6 0/830 Dose of vFP-3 Antibodies to Survivors 10 rabies 10log of the _50 final dilution * _ 6.7 2.8 5/10 4.7 2.1 2/10 2.7 0.6 0/8 35 0.7 0.6 0/8

Twee honden en twee katten werden geïmmuniseerd met ëén enkele subcutane beënting met 8 x de WKID^q van de recombinant vFP-3. Bovendien hield men twee honden en vier katten van een- 0820679.Two dogs and two cats were immunized with a single subcutaneous inoculation with 8 x the WKID ^ q of the recombinant vFP-3. In addition, two dogs and four cats were loved from 0820679.

- 24 - « zelfde leeftijd en gewicht aan als niet gevaccineerde blanco's.- 24 - «same age and weight as unvaccinated blanks.

Uit alle dieren werd iedere week bloed afgetapt. Op dag nr. 94 werd elke hond uitgedaagd door beënting in de slaapbeenspier met twee doses 0,5 ml speekselklier-homogenaat van de NY-stam van 5 het rabies-virus, welke bij het Institute Mérieux verkrijgbaar is.Blood was drawn from all animals every week. On day 94, each dog was challenged by inoculation in the temporal bone muscle with two doses of 0.5 ml salivary gland homogenate from the NY strain of the rabies virus, which is available from the Institute Mérieux.

De totale dosis kwam overeen met 1000 x de LD,-q voor een muis bij intracerebrale toediening. De zes katten werden net zo uitgedaagd door beënting in de nekspier met twee doses van 0,5 ml van het zelfde virus. De totale dosis per dier kwam overeen met 40.000 x 10 de muizen-LDj-Q bij intracerebrale toediening. Men bekeek de dieren dagelijks. Alle niet gevaccineerde dieren stierven, op de in tabel VI aangegeven dag, met symptomen van rabies. De gevaccineerde dieren overleefden de uitdaging en mem bleef ze waarnemen tot drie weken na de dood van het laatste blanco dier. De uitkomsten 15 staan bij elkaar in de volgende tabel VI.The total dose corresponded to 1000 x the LD, -q for a mouse when administered intracerebral. The six cats were similarly challenged by inoculation in the neck muscle with two 0.5 ml doses of the same virus. The total dose per animal corresponded to 40,000 x 10 mouse LDj-Q when administered intracerebral. The animals were examined daily. All unvaccinated animals died, on the day indicated in Table VI, with rabies symptoms. The vaccinated animals survived the challenge and mem continued to observe them until three weeks after the death of the last blank animal. The results 15 are summarized in the following table VI.

Tabel VITable VI

Proefdier Gevaccineerd Titer op dagen na de Tijd van met beënting sterven ___ _ 0 14 21 28_94 _ 20 Kat 7015 vFP-3a 0 2,2b 2,4 2,4 1,5 + 7016 vFP-3 0 1,7 1,9 2,0 1,3 + 8271 cC 0 0 0 0 0 d/13d T10 c 0 0 0 0 0 d/12 T41 c 0 0 0 0 0 d/13 25 T42 c 0 0 0 0 0 d/12Experimental animal Vaccinated Titer on days after the inoculation time ___ _ 0 14 21 28_94 _ 20 Cat 7015 vFP-3a 0 2.2b 2.4 2.4 1.5 + 7016 vFP-3 0 1.7 1.9 2.0 1.3 + 8271 cC 0 0 0 0 0 d / 13d T10 c 0 0 0 0 0 d / 12 T41 c 0 0 0 0 0 d / 13 25 T42 c 0 0 0 0 0 d / 12

Hond 426 vFP-3 0 0,8 1,0 1,1 1,2 + 427 vFP-3 0 1,5 2,3 2,2 1,9 + 55 c 0 0 0 0 0 d/15 30 8240 c 0 0 0 0 0 d/16 a - Zowel katten als honden die met vFP-3 gevaccineerd werden kregen subcutaan achtmaal de WKID,.- 10 b - De titer uitgedrukt in de log van de hoogste serumver-35 dunning die het aantal fluorescerende putjes bij de SFFR- proef met meer dan 50 % verminderde, c - Niet gevaccineerde blanco dieren, d - Dood na het aantal gegeven dagen na de uitdaging.Dog 426 vFP-3 0 0.8 1.0 1.1 1.2 + 427 vFP-3 0 1.5 2.3 2.2 1.9 + 55 c 0 0 0 0 0 d / 15 30 8240 c 0 0 0 0 0 d / 16 a - Both cats and dogs vaccinated with vFP-3 received the WKID eight times subcutaneously, .- 10 b - The titer expressed in the log of the highest serum dilution representing the number of fluorescent wells in the SFFR test reduced by more than 50%, c - Unvaccinated blank animals, d - Death after the number of days given after the challenge.

40 Bij nog andere proeven werden de recombinant-virussen 8820679.In still other experiments, the recombinant viruses were 8820679.

- 25 - vFP-2 en vFP-3 langs verschillende wegen op vee overgeënt.- 25 - VFP-2 and vFP-3 inoculated to livestock via different routes.

De beënte dieren werden op dagen nr.'s 6, 14, 21, 28 en 35 op antilichamen tegen rabies onderzocht. Zoals in de volgende tabel VIIA te zien vertoonden alle dieren een serologische 5 respons op het rabies-antigeen.The inoculated animals were tested for antibodies to rabies on days Nos 6, 14, 21, 28 and 35. As shown in the following Table VIIA, all animals showed a serological response to the rabies antigen.

Tabel VIIATable VIIA

Antilichaam-titers in met vFP-3 beënte zoogdieren ftabies neutraliserende antilichamen SFFR-proef ^log van verdunning 10 Dosis Dag nr. 0 6 14 21 28 35 rund nr.Antibody titers in vFP-3 inoculated mammalian phabies neutralizing antibodies SFFR test dilution log 10 Dose Day no. 0 6 14 21 28 35 bovine no.

7.3 x WKID50 1420 (intraderm) neg 0,6 2 1,7 1,8 1,7 15 8 x WKID50 1419 (subcut) neg 1,6 2,2 2,1 2,1 1,9 8 x WKIDcn ou 1421 (intramusc) neg 0,9 2,2 2,2 1,8 1,7 20 7.3 x «ΚΠ>50 1423 (intramusc) neg 0,9 1,1+ 1+ 1+ 1,1+ + niet significant 257.3 x WKID50 1420 (intraderm) ng 0.6 2 1.7 1.8 1.7 15 8 x WKID50 1419 (subcut) ns 1.6 2.2 2.1 2.1 1.9 8 x WKIDcn ou 1421 (intramusc) neg 0.9 2.2 2.2 1.8 1.7 20 7.3 x «ΚΠ> 50 1423 (intramusc) neg 0.9 1.1+ 1+ 1+ 1.1+ + not significant 25

Alle runderen werden op dag nr. 55 na de beënting opnieuw gevaccineerd met 8 x WKID^q en vertoonden een anamnesie-respons op het rabies-antigeen. Bij de opjagende hervaccinering werden alle runderen subcutaan beënt, behalve nr. 1421 die opnieuw 30 intramusculair beënt werd. SFFR-titers werden bepaald op dagen nr.*s 55, 57, 63, 70, 77 en 86. De uitkomsten staan in tabel VUB.All bovines were re-vaccinated with 8 x WKID ^ q on day 55 after inoculation and showed an anamnesis response to the rabies antigen. In the boosting revaccination, all cattle were inoculated subcutaneously, except No. 1421 which was again inoculated intramuscularly. SFFR titers were determined on days # * s 55, 57, 63, 70, 77 and 86. The results are shown in Table VUB.

Tabel VUBTable VUB

Dag nr. 55 57 63 70 77 86Day No. 55 57 63 70 77 86

Rund nr.Cattle no.

35 1419 1,7 1,5 2,9 2,9 2,6 2,9 1420 1,0 0,5 1,9 2,3 2,2 2,0 1421 1,3 1,2 2,9 2,7 2,5 2,5 1423 1,0 0,7 2,4 2,5 2,5 2,235 1419 1.7 1.5 2.9 2.9 2.6 2.9 1420 1.0 0.5 1.9 2.3 2.2 2.0 1421 1.3 1.2 2.9 2 .7 2.5 2.5 1423 1.0 0.7 2.4 2.5 2.5 2.2

Alle gegevens gelden vFP-3, behalve bij rund nr. 1423, waar het 40 voor vFP-2 geldt.All data applies to vFP-3, except for bovine No. 1423, where 40 applies to vFP-2.

8820679.' 3 - 26 -8820679. " 3 - 26 -

Runderen, katten en konijnen werden ook intradermaal beent met bekende hoeveelheden pluimveevirus en na een week werden huidkorsten van de dieren verzameld. Deze werden vermalen, in zout-oplossing gesuspendeerd en getitreerd om er het virus-5 gehalte van te vinden.Cattle, cats and rabbits were also vaccinated intradermally with known amounts of poultry virus and skin scabs of the animals were collected after one week. These were ground, suspended in saline and titrated to find their virus content.

Slechts resten infectieus virus konden teruggevonden worden. Dit laat zien dat in vivo geen produktieve infectie optreedt.Only remnants of infectious virus could be found. This shows that no productive infection occurs in vivo.

Voorbeeld VIIIExample VIII

10 Beenting van kuikens met vFP-310 Biting of chickens with vFP-3

Het recombinant-pluimveepokken-virus vFP-3 werd over-geënt op kuikens om de expressie van vreemd DNA door een recombinant-pluimvee-pokkenvirus te laten zien in een systeem dat produktieve vermenigvuldiging van de vector toelaat.The recombinant poultry poxpox virus vFP-3 was inoculated into chicks to demonstrate the expression of foreign DNA by a recombinant poultry poxpox virus in a system allowing productive multiplication of the vector.

15 Witte leghornkuikens werden intradermaal met 9 x WKID^q aan vFP-3 of onder doorboren van de vleugels met 3 x WKID^^ aan vFP-3 beent. Bloedmonsters werden 21 dagen na de vaccinering genomen voor een SFFR-proef op rabies-antilichamen. Na 21 dagen was de titer in beënte kuikens significant hoger dan in de blanco's.White leghorn chickens were inoculated intradermally with 9 x WKID ^ q on vFP-3 or under wing piercing with 3 x WKID ^ ^ on vFP-3. Blood samples were taken 21 days after vaccination for an SFFR test for rabies antibodies. After 21 days, the titre in inoculated chicks was significantly higher than in the blanks.

20 In de niet beënte blanco's was de gemiddelde titer namelijk 0,6, in de intramusculair beënte vogels was dat 1,9, en in de vogels met doorboorde vleugels was dat 1,2.In the non-inoculated blanks, the mean titer was 0.6, in the intramuscularly inoculated birds it was 1.9, and in the birds with pierced wings it was 1.2.

Voorbeeld IXExample IX

Recombinant-pluimveepokken vFP-11 die kalkoenen-antigeen tegen 25 influenza H5 HA tot expressie brengtRecombinant poultry pox vFP-11 expressing turkey antigen against influenza H5 HA

Vogels kunnen tegen vogelpathogenen geïmmuniseerd worden met de recombinant-vogelpokkenvirussen volgens de uitvinding.Birds can be immunized against avian pathogens with the recombinant avipox viruses of the invention.

Zo werd het nieuwe plasmide pRW 759 (nog te beschrijven) , afgeleid van pluimveepokkenvirus FP-1 en met daarin het 30 door Hind III H gepromote hemagglutinine-gen (H5) van A/kalkoen/For example, the novel plasmid pRW 759 (to be described) was derived from fowlpox virus FP-1 and containing the hemagglutinin gene (H5) of A / turkey / promoted by Hind III H.

Ierland/1378/83 (TYHA) gebruikt om CEF-cellen te besmetten, welke concurrerend met het moedervirus FP-1 geïnfecteerd werden. Recom-binant-pluimveepokken-virus vFP-11 werd met de eerder hierin beschreven technieken verkregen.Ireland / 1378/83 (TYHA) used to infect CEF cells, which competed competitively with the mother virus FP-1. Recombinant poultrypox virus vFP-11 was obtained using the techniques previously described herein.

35 De synthese van een hemagglutinine-molecuul door met vFP-11 geïnfecteerde cellen werd bevestigd door immuunprecipita-tie in lysaten van cellen die eerst door metabolisme radioactief gemerkt waren, onder toepassing van voor H5 specifieke antilicha-men en standaardtechnieken. De specifieke immuunprecipitatie van 8820679.The synthesis of a hemagglutinin molecule by cells infected with vFP-11 was confirmed by immunoprecipitation in lysates of cells previously radiolabelled by metabolism, using H5 specific antibodies and standard techniques. The specific immune precipitation of 8820679.

- 27 - voorloperhemagglutinine met een molecuulgewicht van ong. 63.000 en van twee splitsingsprodukten met molecuulgewichten van 44.000 en 23.000 werd aangetoond. Zulke eiwitten sloegen niet neer uit een lysaat van niet geïnfecteerde CEF-cellen of uit cellen die met het 5 moedervirus FP-1 geïnfecteerd waren.- 27 - precursor hemagglutinin with a molecular weight of about 63,000 and of two cleavage products with molecular weights of 44,000 and 23,000 was detected. Such proteins did not precipitate from a lysate of uninfected CEF cells or from cells infected with the mother virus FP-1.

Om vast te stellen dat het in de met recombinant-pluimveepokken vFP-11 geïnfecteerde cellen gemaakte HA-molecuul op het celoppervlak tot expressie kwam werden immunofluorescen-tieproeven uitgevoerd. Met het recombinant-pluimveepokken-virus 10 vFP-11 geïnfecteerde CEF-cellen vertoonden aan hun oppervlak een sterke fluorescentiekleuring. Aan met het moedervirus FP-1 geïnfecteerde cellen werd geen fluorescentie waargenomen.Immunofluorescence assays were performed to determine that the HA molecule made in the cells infected with recombinant fowlpox vFP-11 was expressed on the cell surface. CEF cells infected with the recombinant poultry pox virus 10 vFP-11 showed a strong fluorescence staining on their surface. No fluorescence was observed on cells infected with the mother virus FP-1.

Plasmide pRW 759 werd als volgt geschapen:Plasmid pRW 759 was created as follows:

Het pRW 742B (zie voorbeeld IV) werd opengeknipt door 15 gedeeltelijke vertering met Pst I en het fragment werd nogeensThe pRW 742B (see Example IV) was cut open by partial digestion with Pst I and the fragment was repeated

geknipt met EcoRV om het rabies-gen G te verwijderen, wat de HH-promotor op het overblijvende fragment van ongeveer 3,4 Kbp achterliet. Dat werd met alkalisch fosfatase behandeld en een synthetisch oligonucleotide werd ingevoegd om de HH-promotor bij ATG met TYHAdigested with EcoRV to remove the rabies gene G, leaving the HH promoter on the remaining fragment of about 3.4 Kbp. That was treated with alkaline phosphatase and a synthetic oligonucleotide was inserted to the HH promoter at ATG with TYHA

20 samen te voegen, wat pRW 744 gaf.20, which gave pRW 744.

Dit plasmide werd opengeknipt door gedeeltelijke vertering met Dra I, het lineaire fragment werd met Sal I geknipt, en het grotere fragment werd opnieuw geïsoleerd en met alkalisch fosfatase behandeld.This plasmid was cut open by partial digestion with Dra I, the linear fragment was cut with Sal I, and the larger fragment was again isolated and treated with alkaline phosphatase.

25 Tenslotte werd pRW 759 gemaakt door het met Sal I enFinally, pRW 759 was made by combining with Sal I and

Dra I geïsoleerde stuk dat voor TYHA codeert en door Kawaoka c.s. in Virology 158 (1987) 218-227 beschreven is, in de vector pRW 744 in te bouwen.To integrate the Dra I isolated piece encoding TYHA and described by Kawaoka et al. In Virology 158 (1987) 218-227 into the vector pRW 744.

Voorbeeld XExample X.

30 Immuniseren met vFP-11 om vogels tegen uitdaging met levend influenzavirus te beschermenImmunize with vFP-11 to protect birds from challenge with living influenza virus

Om de immunogeniteit van recombinant-pluimveepokken-virus vFP-11 te bepalen werden vaccinerings- en uitdagingsproeven in kippen en kalkoenen uitgevoerd.Vaccination and challenge experiments in chickens and turkeys were conducted to determine the immunogenicity of recombinant poultry pox virus vFP-11.

35 Specifiek-pathogeenvrije witte leghornkuikens werden 2 dagen en 5 weken oud gevaccineerd door het vleugelvlies te doorboren met een dubbele naald die ook voor de commerciële vaccinatie van pluimvee tegen pluimveepokken gebruikt wordt. Elke vogel kreeg ongeveer 2 jil met daarin 6 x 10"* pfu aan vFP-11. Uit de oudere 0820679/ t - 28 - vogels werd voor de vaccinatie bloed afgetapt, en 2 weken later uit alle vogels vlak voor de uitdaging.Specific pathogen-free white leghorn chicks were vaccinated 2 days and 5 weeks old by puncturing the peritoneum with a double needle which is also used for the commercial vaccination of poultry against poultry pox. Each bird received approximately 2 µl containing 6 x 10 "* pfu of vFP-11. Blood was drawn from the older 0820679 / t-28 birds before vaccination, and 2 weeks later from all birds just before challenge.

Ter vergelijking werd een tweede groep kuikens gevaccineerd met een gebruikelijk H5-vaccin dat een water-in-olie-5 emulsie van een geïnactiveerde stam H5N2 is.For comparison, a second group of chicks was vaccinated with a conventional H5 vaccine which is a water-in-oil emulsion of an inactivated H5N2 strain.

Geïnactiveerd H5N2-vaccin werd bereid uit A/Mallard/HY/189/82-(H5N2-) influenza-virus dat in kippeneieren met 11 dagen oude embryo’s gekweekt was; de geïnfecteerde allan- tois'—vloeistof met een HA-titer van 800/0,1 ml en een infectivi-8 5 10 teit van 10 ’ /0,1 ml werd met 0,1 % propiolacton geïnactiveerd en in een water-in-olie-emulsie omgezet zoals beschreven door Stone c.s. in Avian Dis. 22 (1978) 666-674 en door Brugh c.s. in Proc. van het Tweede Intern. Symp. over Vogel Influenza, blz.Inactivated H5N2 vaccine was prepared from A / Mallard / HY / 189/82 (H5N2) influenza virus grown in chicken eggs with 11 day old embryos; the infected allergy fluid with an HA titre of 800 / 0.1 ml and an infectivity of 10 / 0.1 ml was inactivated with 0.1% propiolactone and in a water-in oil emulsion converted as described by Stone et al. in Avian Dis. 22 (666-674) (1978) and by Brugh et al. In Proc. of the Second Intern. Symp. on Vogel Influenza, p.

283-292 (1986). Het vaccin werd in 0,2 ml toegediend aan witte 15 SPF leghornkuikens van 2 dagen en 5 weken oud, en wel subcutaan, onder de huid aan de binnenkant van de dijspier.283-292 (1986). The vaccine was administered in 0.2 ml to 2-day, 5-week-old white SPF leghorn chicks subcutaneously under the skin on the inner thigh muscle.

Een derde en vierde groep kuikens kregen respectievelijk het moedervirus FP-1 en geen vaccin.A third and fourth group of chicks received the mother virus FP-1 and no vaccine, respectively.

33

De kuikens werden uitgedaagd met ongeveer 10 LD,_q 20 van het zeer pathogene influenzavirus A/kalkoen/lerland/1378/83 (H5N8) of A/kip/Penn/1370/83 (H5N2) door elke kip 0,1 ml in de naren toe te dienen. Vogels van 2 dagen oud werden 6 weken en vogels van 5 weken oud werden 5 weken na het vaccineren uitgedaagd. De vogels werden dagelijks bekeken op tekenen van de ziekte, 25 zijnde opzwellen en blauwworden van het gezicht en de kam en bloedingen aan de poten (dergelijke kippen konden vaak niet blijven staan), verlamming en de dood. Het.meeste sterven was tussen 4 en 7 dagen na de infectie. Vai de levende kuikens werden 3 dagen na de infectie afstrijkjes uit de luchtpijp en de cloaca genomen en hier-30 in werd op virus gezocht door er eieren met embryo’s mee te beënten.The chicks were challenged with approximately 10 LD, 20 of the highly pathogenic influenza virus A / turkey / Ireland / 1378/83 (H5N8) or A / chicken / Penn / 1370/83 (H5N2) through each chicken 0.1 ml in the to administer. Birds of 2 days old became 6 weeks and birds of 5 weeks old were challenged 5 weeks after vaccination. The birds were observed daily for signs of the disease, being swelling and bluing of the face and crest, and bleeding from the legs (such chickens often could not stand), paralysis and death. The most die was between 4 and 7 days after infection. Live chicks were taken from the trachea and cloaca 3 days after the infection and viruses were searched for by inoculating eggs with embryos.

De met pluimveepokken (zowel van het wilde type als het recombinant-virus) beënte kuikens ontwikkelden typerende huidschade op de linkervleugel. Op de derde dag vormde zich op de plek van elke naaldeprik een pok, zelfinfiltratie volgde met de vorming van huid-35 korsten en herstel na 7 dagen. Er was geen secundaire huidschade en er waren geen tekenen van verspreiding op niet gevaccineerde kuikens die er mee in contact kwamen. De uitkomsten van de uit-dagingsproeven staan in tabel VIII en de daarbij behorende sero-logische vondsten in tabel IX.The chickens inoculated with poultry pox (both of the wild type and the recombinant virus) developed typical skin damage on the left wing. On the third day, smallpox formed on the site of each needlestick, self-infiltration followed with the formation of skin scabs and recovery after 7 days. There was no secondary skin damage and no signs of spreading on unvaccinated chicks that came into contact with it. The results of the challenge tests are shown in Table VIII and the associated serological findings in Table IX.

8820 673.’8820 673. "

- 29 -Tabel VIXI- 29 - Table VIXI

Bescherming van kuikens vla H5 dat in pluimveepokken tot expressie komtProtection of chickens custard H5 expressed in poultry pox

Bescherming Virus inProtection Virus in

Uitdagend Leeftij d virus Vaccin van de ziek/dood/totaal Luchtpijp Cloaca _ _ kuikens _ __ _Challenging Age virus Sick / dead / total Vaccine Cloaca _ _ chicks _ __ _

Ty/Ierland Pv-pokken-H5 2 dagen 0/0/10 0/10 0/10 (H5N8) (vFP-11) 5 weken 0/0/5 0/5 0/5Ty / Ireland PVPox-H5 2 days 0/0/10 0/10 0/10 (H5N8) (vFP-11) 5 weeks 0/0/5 0/5 0/5

Geïnactiveerd 2 dagen 0/0/9 0/9 0/9 5 weken 0/0/5 0/5 0/5Inactivated 2 days 0/0/9 0/9 0/9 5 weeks 0/0/5 0/5 0/5

Pv-pokken 2 dagen 10/9/10 2/6 3/6 blanco 5 wefcen 4/3/5 0/5 4/5PVPox 2 days 10/9/10 2/6 3/6 blank 5 wefcen 4/3/5 0/5 4/5

Niets 2 dagen 10/9/10 2/7 5/7 2 dagen1 2/1/2 2/2 2/2 5 weken 2/2/5 0/5 1/5Nothing 2 days 10/9/10 2/7 5/7 2 days1 2/1/2 2/2 2/2 5 weeks 2/2/5 0/5 1/5

Ck/Penn Pv-pokken-H5 2 dagen 0/0/10 8/10 0/10 (H5N2) (vFP-11) 5 weken 0/0/6 5/6 2/6Ck / Penn Pv-pox-H5 2 days 0/0/10 8/10 0/10 (H5N2) (vFP-11) 5 weeks 0/0/6 5/6 2/6

Geïnactiveerd 2 dagen 0/0/8 2/8 0/8 5 weken 0/0/5 3/5 0/5Inactivated 2 days 0/0/8 2/8 0/8 5 weeks 0/0/5 3/5 0/5

Pv-pokken 2 dagen 10/1/10 10/10 10/10 blanco 5 weken 5/0/5 5/5 5/5Pv pox 2 days 10/1/10 10/10 10/10 blank 5 weeks 5/0/5 5/5 5/5

Niets 2 dagen 9/3/9 9/9 9/9 2 dagen1 2/2/2 2/2 2/2 5 weken 5/2/5 5/5 5/5 8820679 ^Nothing 2 days 9/3/9 9/9 9/9 2 days1 2/2/2 2/2 2/2 5 weeks 5/2/5 5/5 5/5 8820679 ^

Samen met de pluimveepokken-H5-groep van 10 vogels werden er vier niet gevaccineerde kippen in het zelfde hok opgekweekt om op verspreiding van vogelpokken H5 te testen.Together with the poultry pox H5 group of 10 birds, four unvaccinated chickens were raised in the same pen to test for the spread of bird pox H5.

- 30 -- 30 -

CMCM

Ρ .pco oooooomo •pIO HOOO-d'<i'cMt'~ a) pm m m· m PC · · •H G CM t ! > aΡ .pco oooooomo • pIO HOOO-d '<i'cMt' ~ a) pm m m · m PC · · • H G CM t! > a

•H PM• H PM

T3 P HT3 P H

iM ViM V

a) (UUP o o ojipco v v η invvvv > C ο Ήa) (UUP o o ojipco v v η invvvv> C ο Ή

Η -H fMH -H fM

PP

O a cö ΌO a cö Ό

IH CIH C

cu a ✓—. /-s .cu a ✓—. / -s.

Ö0 > 1—! CM »P COÖ0> 1—! CM »P CO

^ ' v c Ö0 CM oooooooo a c ooooooor» cu ·η p m o o m co ο co μ to .... ·^ 'v c Ö0 CM oooooooo a c ooooooor »cu · η p m o o m co ο co μ to .... ·

P (UtiO CM Ο Ή CM OP (UtiO CM Ο Ή CM O

0 co C Ph '—1 —I0 co C Ph '-1 -I

6 ·Η c6 · Η c

i—! i—Ii—! i — I

m cd μ i-ι ο μ a p h p ο o in o !—I a cn r>ovo-d-vvvv h a Pm o i-i cm 1 S H Pmm cd μ i-ι ο μ a p h p ο o in o! —I a cn r> ovo-d-vvvv h a Pm o i-i cm 1 S H Pm

PmP.m

PmP.m

> CM P> CM P

cu p mooooooo oooooooo Ë cn vocMmocMvocMvo oor^ocMMi-om CO CM CO CM i—l 1—I i—i i—icu p mooooooo oooooooo ë cn vocMmocMvocMvo ear ^ ocMMi-om CO CM CO CM i — l 1 — I i — i i — i

bo C PMbo C PM

c cuc cu

•H PM• H PM

PP

C r!»S 1-MC r! »S 1-M

:cu /-s v cu cd p ο ο ο o a ' cn vvcooovvvv vvcmovvvv Ο 1-H /-*s: cu / -s v cu cd p ο ο ο o a 'cn vvcooovvvv vvcmovvvv Ο 1-H / - * s

M PS PM rQM PS PM rQ

0(1) ^0 (1) ^

O Ö0 ✓"*-% /•"-'v /Τ'N \ /"“Ν /"“NO Ö0 ✓ "* -% / •" - 'v / Τ'N \ / "“ Ν / "“ N

H3(U 1—I CM r—i CO VDVDCOH3 (U 1 — I CM r — i CO VDVDCO

*x^ 4J CM s-' ^ v-/ V—* 'w' s—/ H P o ooooooo oooooooo M cn p inooHOvoooooo οοοονοσηοο HO μ cn h <t- ohcm ο o m co m h* x ^ 4J CM s- '^ v- / V— *' w 's— / H P o ooooooo oooooooo M cn p inooHOvoooooo οοοονοσηοο HO μ cn h <t- ohcm ο o m co m h

cu η CU Ο H CM CMcu η CU Ο H CM CM

,η cu P nd Pm, η cu P nd Pm

cd ω ·Η Ccd ω · Η C

HP P cdHP P CD

•Η I Η O• Η I Η O

C C . η μ r-H w •h pd a inooo mooo cno HP Hocoinvvvv hoooovvvv C o . cn I—i co co o cd a oC C. η μ r-H w • h pd a inooo mooo cno HP Hocoinvvvv hoooovvvv C o. cn I — i co co o cd a o

PM > H PMPM> H PM

cn I cu cn μ a μcn I cu cn μ a μ

a V ·Ό cnaaGGGG GG acGGGG-GGa V · na cnaaGGGG GG acGGGG-GG

ΟΙ HCDG CUCUCUCUCUCUCUIU CUOOCUVCUCUCUCD HCDG CUCUCUCUCUCUCUIU CUOOCUVCUCUCU

CO Cd Pflll (0^ MJi M|!< Μιϊ bOJdbO^ibO^ii-bO^ii H cd ip .Maaaaaaaa aaaaa a aaCO Cd Pflll (0 ^ MJi M |! <Μιϊ bOJdbO ^ ibO ^ ii-bO ^ ii H cd ip. Maaaaaaaaa aaaaa a aa

OOG CUfiH’ÖlSO&O&’öS Td&TdlS'GISO ISEYE CUfiH "ÖlSO & O &" OS Td & TdlS'GISO IS

o cu cu cd ao cu cu cd a

Ha H>rMcMincMmcMincM in cMtncM incMmcMinHa H> rMcMincMmcMincM in cMtncM incMmcMin

O HO H

μ ιρ a Ό a G m μ in μ CO <H pc cu pd cu I <u I aμ ιρ a Ό a G m μ in μ CO <H pc cu pd cu I <u I a

G > G G > GG> G G> G

cu H <U ana X P Μ X ρ ,Μcu H <U ana X P Μ X ρ, Μ

G ,Μϋ^Ο AlüAiOG, Ο ^ Ο AlüAiO

η ο a oocn ο a ο υ en ο pm a cm pm a H a. a cm cm a w o I ip ia I a ω i ih a i a a a > a cn > η h > a m > η h > cm o Pd pm .q a pm o pd a m a nd -n a g aη ο a oocn ο a ο υ and ο pm a cm pm a H a. a cm cm awo I ip ia I a ω i ih aiaaa> a cn> η h> am> η h> cm o Pd pm .qa pm o pd ama nd -naga

an Gan G

ω μ ^ Gω μ ^ G

a cn a oo a a a Ha pm ρ μ in •η η a a ^ a ρ> h vp o 8820679 Λ - 31 - (a) Uit de vijf weken oude vogels werd voor het vaccineren bloed afgetapt dat in Hl*en neutraliseringsproeven getest werd; geen daarvan bevatte aantoonbare gehalten aan antilichaam en de uitkomsten zijn hier niet vermeld. Uit de twee dagen oude 5 kuikens werd 6 weken na het vaccineren bloed afgetapt (post 1) en uit de 5 weken oude vogels 5 weken na het vaccineren (post 1); uit beide groepen werd 2 weken na de uitdaging bloed genomen (post 2). De cijfers zijn de gemiddelde antilichaamtiters voor dezelfde groepen kuikens als die in tabel I genoemd zijn.a cn a oo a a a Ha pm ρ μ in • η η a a ^ a ρ> h vp o 8820679 Λ - 31 - (a) Blood was tested from the five-week-old birds before vaccination and tested in Hl * and neutralization tests; none of which contained detectable levels of antibody and the results are not reported here. Blood was drawn from the two day old 5 chicks 6 weeks after vaccination (item 1) and from the 5 week old birds 5 weeks after vaccination (item 1); blood was taken from both groups 2 weeks after the challenge (item 2). The numbers are the mean antibody titers for the same groups of chickens as those listed in Table I.

10 (b) De aantallen tussen haakjes geven aan hoeveel er de uitdaging overleefden < = minder dan 10.10 (b) The numbers in brackets indicate how many survived the challenge <= less than 10.

(c) Hemagglutineringsremmingsproeven (HI-proeven) werden in micro-titerplaten uitgevoerd met sera die met receptorafbrekend 15 enzym behandeld waren, met 4 HA-eenheden Ty/lre-virus en met 0,5 % kippenerythrocyten, zoals beschreven door Palmer c.s. in Immun. Series No. 6, blz. 51-52 (Amerikaans Ministerie van Gezondheid, Opvoeding en Welzijn, 1975). Proeven betreffende 3 de neutralisering van de infectiviteit gebeurden door 10 20 EID^q van het Ty/lre-virus met verdunningen van het serum 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen, waarna eieren met embryo’s met porties daarvan beent werden. Virusgroei werd vastgesteld door hemagglutineringsproeven na 2 dagen incubatie van de eieren bij 33°C.(c) Hemagglutination inhibition tests (HI tests) were performed in microtiter plates with sera treated with receptor-degrading enzyme, with 4 HA units of Ty / lre virus and with 0.5% chicken erythrocytes, as described by Palmer et al in Immun . Series No. 6, pp. 51-52 (United States Department of Health, Education, and Welfare, 1975). Tests on neutralization of infectivity were done by incubating EID1 q of the Ty / l virus with dilutions of the serum at room temperature for 30 minutes, after which eggs were seeded with embryos in portions. Virus growth was assessed by hemagglutination tests after 2 days incubation of the eggs at 33 ° C.

2525

Kuikens die met de vogelpokken-recombinant (vFP-11) of met het geïnactiveerde H5N2 influenza-vaccin in adjuvans beent waren waren beschermd tegen uitdaging met het homologe influenza-virus Ty/Ire (H5N8) en tegen het verwante maar te onderscheiden 30 influenzavirus Ck/Penn (H5N2). In tegenstelling daarmee vertoonde de meerderheid der vogels die met het moeder-FPV beent waren of die geen vaccin kregen klinische tekenen van een zeer pathogene influenza, waaronder zwellen en blauwworden van gezicht en kam, bloedingen aan de poten en verlammingen. De meeste van deze vogels 35 gingen dood, De gevaccineerde vogels scheiden geen aantoonbare hoe veelheden Ty/Ire af maar wel Ck/Penn.Chicks that had been adjuvanted with fowlpox recombinant (vFP-11) or inactivated H5N2 influenza vaccine were protected against challenge with the homologous influenza virus Ty / Ire (H5N8) and against the related but distinguishable influenza virus Ck / Penn (H5N2). In contrast, the majority of birds that had been vaccinated with the mother FPV or who had not received a vaccine showed clinical signs of a highly pathogenic influenza, including swelling and bluing of the face and comb, leg bleeding and paralysis. Most of these birds died. The vaccinated birds do not excrete demonstrable amounts of Ty / Ire, but do Ck / Penn.

Zowel de geïnactiveerde als de recombinant-vaccins lokten Hl en neutraliserende antilichamen tegen Ty/Ire uit, maar de gehalten aan door vogelpokken-recombinant vFP-11 uitgelokte 8820673: - 32 - gehalten aan antilichaam neutraliseerden voor de uitdaging HA niet en neutraliseerden het heterologe Ck/Penn H5 ook niet. Maar ongeacht dat werden de kuikens beschermd tegen uitdaging met zowel Ty/Ire- als Ck/Penn-influenzavirussen.Both the inactivated and the recombinant vaccines elicited H1 and neutralizing antibodies to Ty / Ire, but the levels of fowlpox-recombinant vFP-11 provoked 8820673: - 32 - levels of antibody did not neutralize for challenge HA and neutralized heterologous Ck / Penn H5 neither. But regardless, the chicks were protected from challenge with both Ty / Ire and Ck / Penn influenza viruses.

5 De door vaccineren met vFP-11 uitgelokte immuniteit tegen H5 influenza hield ten minste 4 tot 6 weken aan en vertoonde kruisreacties. Om de duur en de specificiteit van de respons verder te onderzoeken werd een groep van 4 weken oude kuikens in het vleugelvlies met vFP-11 beënt, zoals eerder beschreven, en met 10 tussenpozen van een maand uitgedaagd met het kruisreagerendeThe immunity against H5 influenza evoked by vaccination with vFP-11 persisted for at least 4 to 6 weeks and showed cross-reactions. To further investigate the duration and specificity of the response, a group of 4-week-old chicks were inoculated with vFP-11 in the peritoneum, as previously described, and challenged at 10 monthly intervals with the cross-reactive

Ck/Penn-virus. Opnieuw waren voor de uitdaging geen HI-antilicha-men aan te tonen. Desalniettemin waren de vogels langer dan 4 maanden beschermd.Ck / Penn virus. Again, the challenge was not able to demonstrate HI antibodies. Nevertheless, the birds were protected for more than 4 months.

Het door vFP-11 tot expressie gebrachte H5 lokt ook in 15 kalkoenen een beschermende immuunrespons uit. Uitgeteelde witte kalkoenen werden op een leeftijd van 2 dagen of van 4 weken op de eerder beschreven wijze met prikken in het vleugelvlies gevaccineerd. De uitkomsten hiervan staan in tabel X.The H5 expressed by vFP-11 also elicits a protective immune response in turkeys. Reared white turkeys were vaccinated with a prick in the peritoneum at 2 days or 4 weeks of age. The results of this are shown in Table X.

20 8820679 - 33 - c <u cm _ _ (JO cM VD T) Ό20 8820679 - 33 - c <u cm _ _ (JO cM VD T) Ό

01 0) 4J CO «—1 Ο O01 0) 4J CO «—1 Ο O

T3 +-> ® * * Ο OT3 + -> ® * * Ο O

¢3 O -O’ -Μ" ό Ό 01 β 1¾ u α> οι αι 0 n ra ra βΜ •Η J3 ¢0-- rH Cl X Ρί Π) ιΗ Η -Ί <£>¢ 3 O -O ’-Μ" ό Ό 01 β 1¾ u α> οι αι 0 n ra ra βΜ • Η J3 ¢ 0-- rH Cl X Ρί Π) ιΗ Η -Ί <£>

i-l rH 00 Oi-1 rH 00 O

U ιΗ 0 4-1 « p +J r—1 M 1—! '—f ’ ! ra β O o v v v JZ Cd —< fkU ιΗ 0 4-1 «p + J r — 1 M 1—! "—F"! ra β O o v v v JZ Cd - <fk

CMCM

a ö Cd +J O O "β *β δ cd ra vd <f o oa ö Cd + J O O "β * β δ cd ra vd <f o o

ι> X! O ι-M VD O Oι> X! O ι-M VD O O

£ u PH -β "Ö •h ra ra h s-<£ u PH -β "Ö • h ra ra h s- <

i-l "rt Hi-l "rt H

co 4J — -Ico 4J -I

ra β >> _ _ _ ra cd h u o o o ora β >> _ _ _ ra cd h u o o o o

1. I CO Η Η Η H1. I CO Η Η Η H

o, M O v v V Vo, M O v v V V

X ES Ck ra 0 β o m ό cm cmX ES Ck ra 0 β o m ό cm cm

,_l Ό O CO O CM CM, _ l Ό O CO O CM CM

—I β rH- I rH

1 O U1 O U

Pk oPk o

Eu -UEu -U

> ra oo β β cu •h cd 1-» cd i-i> ra oo β β cu • h cd 1- »cd i-i

I > CUI> CU

ca m +j m vo cm cm frt 3 jü ^ ^ ^ca m + j m vo cm cm frt 3 jü ^ ^ ^

Ui CJ m CM CM CMOnion CJ m CM CM CM

<: ι-ΐβ È2 > Ή in cc X! cd τ—l ·*-! ra > cd β « H ra β C ΰ ra o o oo jj Μ β ^ rH -η ό cd Bo<: ι-ΐβ È2> Ή in cc X! cd τ — l · * -! ra> cd β «H ra β C ΰ ra o o oo jj Μ β ^ rH -η ό cd Bo

Ui o m Ό CM CMUi o m Ό CM CM

ra ts --- --- p Ji ---. r-I r-l CM cm cd u Λ ^ ^ > > rara i—i cm cm cm ra ή oo PQ n β a u ra .£3 _ra ts --- --- p Ji ---. r-I r-l CM cm cd u Λ ^ ^>> rara i — i cm cm cm ra ή oo PQ n β a u ra. £ 3 _

Cl 13 . .Cl 13. .

Μ Ή β β β β « -η β ο) οι ω ω Ρ3 4J 0] 00 ^ 00 Αί hm & cd ω β ω ra h ft t) & ό & ω ω ήΜ Ή β β β β «-η β ο) οι ω ω Ρ3 4J 0] 00 ^ 00 Αί hm & cd ω β ω ra h ft t) & ό & ω ω ή

Ν Μ CM Μ UΝ Μ CM Μ U

β cd β I ra ιΗ +J - Ρ ι-Ι ,β cl Ο •η -I g cd οβ cd β I ra ιΗ + J - Ρ ι-Ι, β cl Ο • η -I g cd ο

Cl ΙΟ w β cl pm ei β cd cd ftu ra oh > > u υ ,α 8820 679 ? - 34 -Cl ΙΟ w β cl pm ei β cd cd ftu ra oh>> u υ, α 8820 679? - 34 -

Een significant overleven van de uitdaging door het homologe virus Ty/Ire werd bij beide leeftijdsgroepen waargenomen. De niet gevaccineerde blanco vogels zaten samen met de gevaccineerde vogels in dezelfde hokken om op verspreiding van het 5 recombinant-virus te testen. Deze vogels overleefden de uitdaging niet.Significant challenge survival by the homologous Ty / Ire virus was observed in both age groups. The unvaccinated blank birds were housed with the vaccinated birds in the same pens to test for spread of the recombinant virus. These birds did not survive the challenge.

Voorbeeld XIExample XI

Opbouw van pluimveepokkenvirus FP-1 recombinant vFP 12 die het gen- voor het nueleoprotelne van kuikeninfluenza tot expressie 10 brengtConstruction of poultry pox virus FP-1 recombinant vFP 12 expressing the gene for chick influenza nueleoprotein

Plasmide pNP 33 bevat een cDNA-kloon van het gen voor het nucleoproteïne (NP) van het influenzavirus kuiken/Pennsylvaniê/ 1/83. Alleen van de 5'- en 3'-einden van dit ongeveer 1,5 Kbp grootte gen is de volgorde vastgesteld. Het NP-gen werd als 5'-Cla 15 I-Xho I 3'-fragment met stompe uiteinden van uit pNP 33 in Sma IPlasmid pNP 33 contains a cDNA clone of the nucleoprotein (NP) gene from the influenza virus chick / Pennsylvania / 1/83. Only the 5 'and 3' ends of this approximately 1.5 Kbp size gene have been sequenced. The NP gene was generated as a blunt-ended 5'-Cla 15 I-Xho I 3 'fragment from pNP 33 in Sma I

overgebracht, met de Eco RI-plaats van het pUC 9 aan het 3'-einde, hetgeen pRW 714 gaf. Het begincodon van het NP-gen voor het vertalen (ATG) bevat de volgende (onderstreepte) Aha II-plaats: ATGGCGTC . De eerder beschreven promotor voor Vaccinia H6 werd met 20 een dubbelstrengig synthetisch oligonucleotide aan het NP-gen gehecht. Het synthetische oligonucleotide omvatte de H6-reeks van de Eco RV-plaats aan zijn ATG en in de voor het NP coderende reeks op de Aha II-plaats. Het oligonucleotide werd gesynthetiseerd met voor Bam Hl en Eco RI aangrijpbare einden zodat het in pUC 9 inge-25 bouwd kon worden, hetgeen pRW 755 gaf. Beginnende met het voortransferred, with the Eco RI site of the pUC 9 at the 3 'end, giving pRW 714. The initial codon of the NP gene for translation (ATG) contains the following (underlined) Aha II site: ATGGCGTC. The previously described promoter for Vaccinia H6 was attached to the NP gene with a double-stranded synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide included the H6 sequence from the Eco RV site at its ATG and in the NP coding sequence at the Aha II site. The oligonucleotide was synthesized with Bam HI and Eco RI-engageable ends so that it could be incorporated into pUC 9 to give pRW 755. Starting with it before

Bam Hl aangrijpbare einde, met het ATG onderstreept, is de volgorde van dit dubbelstrengige oligonucleotide:Bam HI's engageable end, with the ATG underlined, is the sequence of this double-stranded oligonucleotide:

GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCGGATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG

GGTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA 30 Het door Aha II opengeknipte, gedeeltelijk verteerde produkt van pRW 755 werd geïsoleerd en met Eco RI opnieuw bewerkt. Het fragment van pRW 755 dat bij het ATG één enkele Aha II-doorsnijding bevatte en met Eco RI opnieuw bewerkt was, werd geïsoleerd, met fosfatase behandeld en als vector voor het hierna te beschrijven 35 verteringsprodukt van pRW 714 gebruikt.GGTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA The partially digested product of pRW 755 cut open by Aha II was isolated and reprocessed with Eco RI. The fragment of pRW 755 containing a single Aha II cross-section at ATG and reprocessed with Eco RI was isolated, treated with phosphatase and used as a vector for the digest product of pRW 714 to be described below.

Het gedeeltelijk door Aha II verteerde, opengeknipte en geïsoleerde verteringsprodukt van pRW 714 werd met Eco RI opnieuw bewerkt. Een met Aha II en Eco RI verkregen en geïsoleerd fragment van ongeveer 1,5 Kbp, met daarin de voor NP coderende 40 reeks, werd in de bovengenoemde vector pRW 757 ingebouwd, hetgeen 8820673.^ - 35 - pRW 757 gaf. De complete H6-promotor werd gevormd door de reeksen bovenstrooms (5’) van de Eco RV-plaats toe te voegen. Uit het (in voorbeeld IV beschreven) plasmide pRW 742B was de H6-reeks benedenstrooms (3') van de Eco RV-plaats samen met reeksen tot 5 aan de Nde I-plaats van pUC 9 verwijderd. Het met fosfatase be handelde Eco RV-Nde I-fragment van pRW 742B werd als vector voor het hierna te noemen fragment van pRW 757 gebruikt. Het geïsoleerde lineaire produkt van de gedeeltelijke vertering van pRW 757 door Eco RV werd na vertering door Nde I opnieuw geïsoleerd; dit frag-10 ment bevat de H6-promotor vanaf de Eco RV-plaats via het NP-gen tot aan de Nde I-plaats van pUC 9. Het fragment van pRW 757 werd in de vector pRW 742B geplaatst, hetgeen pRW 758 gaf. Het Eco RI-fragment van pRW 758, dat nu het complete door H6 gepromote NP-gen bevatte, werd, nadat zijn uiteinden met het Klenow-fragment van 15 DNA-polymerase I stomp gemaakt worden, in de Hinc II-plaats van pRW 731.13 ingebouwd, wat pRW 760 gaf. De Hinc II-plaats in pRW 731.13 is de plaats in FP-1 die in voorbeeld VI voor het opbouwen van vFP-6 en vFP-7 gebruikt was.The digested product of pRW 714, digested, partially digested by Aha II, was reprocessed with Eco RI. An approximately 1.5 Kbp fragment obtained with Aha II and Eco RI, containing the NP coding 40 series, was incorporated into the above vector pRW 757 to give 8820673. -35-pRW 757. The complete H6 promoter was generated by adding the sequences upstream (5 ') of the Eco RV site. From the plasmid pRW 742B (described in Example IV), the H6 series was removed downstream (3 ') from the Eco RV site along with sequences up to 5 at the Nde I site of pUC 9. The phosphatase-treated Eco RV-Nde I fragment of pRW 742B was used as a vector for the fragment of pRW 757 mentioned below. The isolated linear product of the partial digestion of pRW 757 by Eco RV was isolated again after digestion by Nde I; this fragment contains the H6 promoter from the Eco RV site via the NP gene to the Nde I site of pUC 9. The fragment of pRW 757 was placed in the vector pRW 742B to give pRW 758. The Eco RI fragment of pRW 758, which now contained the complete NP gene promoted by H6, was blunt-ended in the Hinc II site of pRW 731.13 after its ends were blunted with the Klenow fragment of 15 DNA polymerase I. built in, which gave pRW 760. The Hinc II site in pRW 731.13 is the site in FP-1 used in Example VI to build vFP-6 and vFP-7.

Met pluimveepokkenvirus FP-1 als reddend virus werd 20 plasmide pRW 760 in een recombinatieproef in vitro gebruikt. De nakomeling-plaques werden gemeten en in situ door plaque-hybridi-sering gezuiverd. Expressie van het gen werd bevestigd door immuun-precipltatie onderzoek met behulp van een polyklonaal geiten-antiserum tegen NP. De grootte van het eiwit dat specifiek uit een 25 lysaat van met vFP-12 geïnfecteerde CEF-cellen neersloeg was onge veer 55 KD; hetgeen binnen het in de literatuur voor influenza-virus-nucleoproteïnen genoemde traject ligt.Poultry pox virus FP-1 as a rescuing virus, plasmid pRW 760 was used in an in vitro recombination test. The progeny plaques were measured and purified in situ by plaque hybridization. Gene expression was confirmed by immunoprecipitation assay using a goat polyclonal antiserum against NP. The size of the protein which precipitated specifically from a lysate of vFP-12 infected CEF cells was approximately 55 KD; which is within the range stated in the literature for influenza virus nucleoproteins.

Voorbeeld XIIExample XII

Constructie van een dubbele recombinant van het pluimveepokkenvirus 30 vFF-15 dat de genen voor het nucleoproteïne van vogelinfluenza (NP) en voor hemagglutinine (HA) tot expressie brengtConstruction of a double recombinant of the poultry pox virus 30 vFF-15 expressing the genes for the nucleoprotein of avian influenza (NP) and for hemagglutinin (HA)

Het hemagglutinine-gen (HA-gen) uit A/Tyr/Ire/1378/83 werd eerder beschreven in verband met het opbouwe van vFP-11 (voorbeeld IX). Bij het maken van een dubbele recombinant werd het HA-35 gen eerst overgebracht naar plaats f8 die eerder gedefinieerd werd bij de opbouw van vFP-8 met behulp van plasmide pRW 731.15.The hemagglutinin gene (HA gene) from A / Tyr / Ire / 1378/83 was previously described in connection with the build-up of vFP-11 (Example IX). When making a double recombinant, the HA-35 gene was first transferred to site f8 previously defined in the construction of vFP-8 using plasmid pRW 731.15.

Het bij het opbouwen van vFP-11 gebruikte plasmide was pRW 759. Het aan de H6-promotor verbonden hemagglutinine-gen werd door een gedeeltelijke vertering met Pst I uit dit plasmide 8820 679.^ -36- verwijderd. Dit fragment kreeg toen met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I stompe uiteinden en werd in de Bam HI-plaats van pRW 731.15 met stompe uiteinden ingebouwd, wat pRW 771 gaf.The plasmid used to construct vFP-11 was pRW 759. The hemagglutinin gene linked to the H6 promoter was removed from this plasmid 8820 679 by partial digestion with Pst I. This fragment then blunt ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I and was incorporated into the Bam HI site of blunt ended pRW 731.15 to give pRW 771.

Het plasmide pRW 771 werd toen gebruikt in een in vitro 5 recombinatieproef met vFP-12 als reddend virus. Het recombinant- virus vFP-12 bevat dit aan de H6-promotor gebonden gen voor nucleo-proteïne op de in plasmide pRW 731.13 gedefinieerde plaats f7. Recombinant-plaques die nu beide invoegingen bevatten werden geselecteerd en in de plaque gezuiverd door hybridisering in situ 10 en de expressie werd aan het oppervlak bevestigd met een aan eiwitThe plasmid pRW 771 was then used in an in vitro recombination test with vFP-12 as a rescue virus. The recombinant virus vFP-12 contains this nucleoprotein gene bound to the H6 promoter at the f7 site defined in plasmid pRW 731.13. Recombinant plaques now containing both inserts were selected and purified in the plaque by hybridization in situ 10 and the expression was surface-confirmed with a protein

A en β-galactosidase gekoppeld immunoessaai. De expressie van beide genen werd bevestigd door immuunprecipitatie uit lysaten van cellen die met het dubbele recombinant-virus vFP-15 geïnfecteerd waren. Voorbeeld XIIIA and β-galactosidase coupled immune seed. Expression of both genes was confirmed by immunoprecipitation from lysates of cells infected with the double recombinant virus vFP-15. Example XIII

15 Opbouw van recombinant-kanariepokkenvirussen15 Construction of recombinant canarypox viruses

Het volgende voorbeeld toont de identificatie van vier niet-essentiële inbouwplaatsen in het kanariepokken-genoom en het opbouwen van vier recombinant-kanariepokkenvirussen vCP-16, vCP-17, vCP-19 en vCP-20.The following example shows the identification of four non-essential sites of construction in the canarypox genome and the construction of four recombinant canarypox viruses vCP-16, vCP-17, vCP-19 and vCP-20.

20 Het recombinant-kanariepokkenvirus vCP-16 werd als volgt opgebouwd.The recombinant canarypox virus vCP-16 was constructed as follows.

Een Pvu II-fragment van 3,4 Kbp uit het DNA van kanarie-pokken werd in pUC 9 gekloond, wat pRW 764.2 gaf. Binnen dit fragment werd êën enkele Eco Rl-plaats gevonden, asymmetrisch ge-25 plaatst, met een korte arm van 700 bp en een lange arm van 2700 bp.A 3.4 Kbp Pvu II fragment from the DNA of canary pox was cloned into pUC 9 to give pRW 764.2. Within this fragment, a single Eco R1 site was found, placed asymmetrically, with a short arm of 700 bp and a long arm of 2700 bp.

Het plasmide werd met Eco RI verteerd en kreeg met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I stompe uiteinden. Het H6/rabies-gen G met stompe uiteinden werd toen in deze plaats ingevoegd en gebruikt om E. coli te transformeren. Het plasmide pRW 775 dat 30 daarvan het resultaat was werd in een recombinatieproef in vitro gebruikt. Nakomeling-plaques die op een immunoscherm positief waren werden eruit gezocht en in de plaque gezuiverd. De aldus verkregen recombinant kreeg de aanduiding vCP-16 en de invoeg-plaats C3.The plasmid was digested with Eco RI and blunt ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I. The blunt ended H6 / rabies gene G was then inserted into this site and used to transform E. coli. The resulting plasmid pRW 775 was used in an in vitro recombination test. Progeny plaques positive on an immunoscreen were picked and purified into the plaque. The recombinant thus obtained was designated vCP-16 and the insertion site C3.

35 Het voor de opbouw hierboven gebruikte plasmide pRWThe plasmid pRW used for the construction above

764.2 had ook ëën enkele Bgl II-plaats, ongeveer 2,4 Kbp vanaf de Eco RI-plaats. Met dezelfde kloonstrategie werd het H6/rabies-gen G ook op dezelfde plaats in plasmide pRW 764.2 ingebouwd, wat pRW 774 gaf. Dit plasmide werd gebruikt bij het opbouwen van de 40 recombinant vCP-17 met de als C4 aangeduide invoegplaats.764.2 also had a single Bgl II site, approximately 2.4 Kbp from the Eco RI site. With the same cloning strategy, the H6 / rabies gene G was also incorporated into plasmid pRW 764.2 at the same site, giving pRW 774. This plasmid was used to construct the recombinant vCP-17 with the insertion site designated C4.

8820673.’ - 37 -8820673. "- 37 -

Plasmide pRW 764.5 heeft een Pvu II-fragment van het kanariepokken-DNA van 850 bp met in dit fragment één enkele Bgl II-plaats 400 bp vanaf het uiteinde. Met de eerder beschreven kloonstrategie werd werd aan de H6~promotor verbonden rabies-5 gen G op deze plaats ingevoegd, wat pRW 777 gaf. Het verkregen stabiele recombinant-virus kreeg de aanduiding vCP-19 en de invoeg-plaats G5.Plasmid pRW 764.5 has a Pvu II fragment of the 850 bp canarypox DNA with a single Bgl II site 400 bp from the end in this fragment. With the cloning strategy described previously, rabies gene G associated with the H6 promoter was inserted at this site to give pRW 777. The resulting stable recombinant virus was designated vCP-19 and the insertion site G5.

Plasmide pRW 764.7 bevat een Pvu II-fragment van 1,2 Kbp met één enkele Bgl II-plaats 300 basen vanaf het einde.Plasmid pRW 764.7 contains a 1.2 Kbp Pvu II fragment with a single Bgl II site 300 bases from the end.

10 Het plasmide werd met Bgl II verteerd en kreeg met het Klenow- fragment van DNA-polymerase I stompe uiteinden. Het met 11K gepromote Lac Z-gen met stompe uiteinden werd ingevoegd, wat plasmide pRW 778 gaf. Het met dit plasmide opgebouwde stabiele recombinant-virus kreeg de aanduiding vCP-20 en de invoegplaats C6.The plasmid was digested with Bgl II and blunt ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I. The blunt-ended 11K promoted Lac Z gene was inserted to give plasmid pRW 778. The stable recombinant virus built up with this plasmid was designated vCP-20 and the insertion site C6.

15 Voorbeeld XIVExample XIV

Opbouw van een pluimveepokkenvirus-recombinant vFP-29 dat bij expressie het versmeltingseiwit van het virus van de Newcastle-ziekte geeftConstruction of a poultry pox virus recombinant vFP-29 which expresses the Newcastle disease virus fusion protein

Plasmide pNDV 108, de cDNA-kloon van het gen voor het 20 versmeltingseiwit van de Texas-stam van het Newcastleziekte- virus, bestond uit een met Hpa I gemaakt cDNA-fragment van ongeveer 3,3 Kbp dat zowel de reeks bevat die voor het versmeltingseiwit codeert als aanvullende voor de Newcastleziekte coderende reeksen, samen op de Sca I-plaats van pBR 322 gekloond. De stap-25 pen bij de produktie van het invoegplasmide worden hierna be schreven.Plasmid pNDV 108, the cDNA clone of the gene for the fusion protein of the Texas strain of Newcastle disease virus, consisted of an approximately 3.3 Kbp Hpa I-made cDNA fragment containing both the sequence for the fusion protein encodes as additional Newcastle disease coding sequences, cloned together at the Sca I site of pBR 322. The steps in the production of the insertion plasmid are described below.

(1) Het scheppen van plasmide pCE 11(1) Scooping plasmid pCE 11

Een FPV-inbouwvector, pCE 11, werd opgebouwd door meervoudige verbindingsstukken op de Hinc II-plaats van pRW 30 731.13 (aangeduid als "plaats f7") in te voegen. Het pRW 731.13 heeft een Pvu II-fragment uit het DNA van FP-1 van 5,5 Kbp. Een niet-essentiéle plaats werd eerder gedefinieerd op de Hinc II-plaats door opbouw van de eerder in voorbeeld VI beschreven stabiele recombinant vFP-6. De op de Hinc II-plaats ingevoegde meer-35 voudige verbindingsstukken bevatten de volgende aangrijpings punten voor Nru I, Eco RI, Sac I, Κρη I, Sma I, Bam HI, Xba I,An FPV insert vector, pCE 11, was constructed by inserting multiple connectors into the Hinc II site of pRW 30 731.13 (designated "site f7"). The pRW 731.13 has a Pvu II fragment from the FP-1 DNA of 5.5 Kbp. A non-essential site was previously defined at the Hinc II site by constructing the stable recombinant vFP-6 described previously in Example VI. The multi-35-way connectors inserted at the Hinc II site contain the following engagement points for Nru I, Eco RI, Sac I, Κρη I, Sma I, Bam HI, Xba I,

Hinc II, Sal I, Acc I, Pst I, Sph I, Hind III en Hpa I.Hinc II, Sal I, Acc I, Pst I, Sph I, Hind III and Hpa I.

(2) Het scheppen van plasmide pCE 19(2) Scooping plasmid pCE 19

Dit plasmide is een andere modificatie van pCE 11, 40 ' waarin tussen de Sac I en Eco Rl-plaatsen het uit koepokvirus 8820673 / -38-- afkomstige stopsignaal ATTTTTNT (L. Yuen en B. Moss in J. Virology 60 (1986) 320-323) (waar N in dit geval een A is) tussengevoegd was, met dienovereenkomstig verlies van de Eco RI-plaats.This plasmid is another modification of pCE 11, 40 'in which between the Sac I and Eco R1 sites the stop signal ATTTTTNT (L. Yuen and B. Moss in J. Virology 60 (1986)) derived from cow virus 8820673 / -38-- 320-323) (where N is an A in this case) was inserted, with corresponding loss of the Eco RI site.

(3) Invoegen van de voor Newcastleziekte coderende reeksen 5 Een over een gel gezuiverd Bam ΗΙ-fragment van 1,8 Kbp, met daarin alle nucleotiden van het gen voor het versmeltings-eiwit op de 22 laatste van het 5'-einde na, werd op de Bam HI-plaats van pUC 18 ingevoegd, wat pCE 13 gaf. Dit plasmide werd met Sal I verteerd, dat 12 basen bovenstrooms van het 5'-einde 10 van de coderende reeks in de vector knipt. De uiteinden werden met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I opgevuld en het plasmide werd verder verteerd met Hind III dat 18 basen bovenstrooms van de Sal I-plaats doorknipt. Een over een gel gezuiverd Sma I / Hind Ill-fragment van 146 bp, met daarin de eerder voor bevoorkeur-15 de uitvoeringsvormen beschreven koepokvirus-promotor H6 en ook meer voudige verbindingsstukken werd aan de vector verbonden en in E. coli-cellen overgebracht. Het verkregen plasmide werd aangeduid als pCE 16.(3) Insertion of the Newcastle disease coding sequences 5 A 1.8 Kbp gel purified Bam ΗΙ fragment containing all nucleotides of the fusion protein gene after the last 22 of the 5 'end, was inserted at the Bam HI site of pUC 18, giving pCE 13. This plasmid was digested with Sal I, which cuts 12 bases upstream of the 5 'end 10 of the coding sequence into the vector. The ends were filled with the Klenow fragment of DNA polymerase I and the plasmid was further digested with Hind III which cuts 18 bases upstream of the Sal I site. A 146 bp Sma I / Hind III fragment purified from gel containing the cowpox virus promoter H6 previously described for preferred embodiments and also more fold junctions was attached to the vector and transferred into E. coli cells. The resulting plasmid was designated pCE 16.

Om het initiërende codon ATG van het gen voor het ver-20 smeltingseiwit van de Newcastleziekte met het 3'-einde van de promotor H6 op lijn te brengen en de 22 nucleotiden die nabij het 5'-einde (van het Newcastleziekte-virus) in pCE 16 ontbreken te vervangen werden aanvullende synthetische oligonucleotiden ontworpen die op aangrijpingsplaatsen voor Eco RV en Kpn 1 eindigden. De 25 oligonucleotide-reeks was 5’-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3’.To align the initiating codon ATG of the Newcastle disease melting protein gene with the 3 'end of the promoter H6 and the 22 nucleotides located near the 5' end (of the Newcastle disease virus) To replace pCE 16, additional synthetic oligonucleotides were designed that terminated at sites of engagement for Eco RV and Kpn 1. The oligonucleotide sequence was 5'-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3 '.

De constructie pCE 16 werd toen met Eco RV en Kpn I verteerd. De Eco RV-plaats staat in de promotor H6 24 basen boven-30 strooms van het initiërende ATG. De Kpn I-plaats staat in de voor een Newcastleziekte coderende reeks 29 basen benedenstrooms van het ATG.The construction pCE 16 was then digested with Eco RV and Kpn I. The Eco RV site is in the promoter H6 24 bases above-30 current from the initiating ATG. The Kpn I site is in the 29 base coding sequence for Newcastle disease downstream of the ATG.

. De oligonucleotiden werden glad gemaakt, gefosforyleerd en met het opengeknipte plasmide verbonden, en het aldus gemaakte 35 DNA werd gebruikt om cellen van E. coli te transformeren. Dit plasmide werd aangeduid als pCE 18.. The oligonucleotides were smoothed, phosphorylated and linked to the digested plasmid, and the DNA thus made was used to transform E. coli cells. This plasmid was designated pCE 18.

Om de voor Newcastleziekte coderende reeks in een FPV-inbouwvector te voegen werd een over een gel gezuiverd Sma I /To insert the Newcastle disease coding sequence into an FPV build-in vector, a gel-purified Sma I /

Hind Ill-fragment van pCE 18 (opengeknipt in het gebied van de meer-40 voudige verbindingen) van 1,9 Kbp aan het hierboven beschreven 8820673; - 39 -Hind Ill fragment of pCE 18 (cleaved in the region of the multi-40 folds) of 1.9 Kbp to 8820673 described above; - 39 -

Sma I /Hind Ill-fragment van pCE 19 van 7,8 Kbp verbonden. Het stopsignaal voor het overschrijven stond 16 basen benedenstrooms van de Sma I-plaats. Het verkregen plasmide kreeg de aanduiding pCE 20.Connected Sma I / Hind III fragment from pCE 19 of 7.8 Kbp. The stop signal for the overwrite was 16 bases downstream of the Sma I site. The resulting plasmid was designated pCE 20.

Het plasmide pCE 20 werd gebruikt in een in vitro re-5 combinatieproef met pluimveepokkenvirus FP-1 als reddend virus.The plasmid pCE 20 was used in an in vitro re-5 combination test with fowlpox virus FP-1 as a rescue virus.

De verkregen nakomelingen werden op CEF-monolagen uitgeplaat en de plaques ondergingen met behulp van een polyklonaal kuikenserum tegen Newcastleziekte een immunoschermproef met aan 8-galactosi-dase geknoopt eiwit A. Positief kleurende plaques werden eruit ge-10 kozen en ondergingen vier cycli van plaque-zuivering om een homoThe progeny obtained were plated on CEF monolayers and the plaques underwent an immunoscreen test with 8-galactosidase-knotted protein A using a polyclonal chicken serum against Newcastle disease. Positive staining plaques were selected and underwent four plaque cycles. purification to a gay

gene populatie te krijgen. De recombinant kreeg de aanduiding vFP-29. Voorbeeld XVpopulation. The recombinant was designated vFP-29. Example XV

Opbouw van pluimveepokken-recombinanten die het omhullende glyco-protelne van kattenleukemievirus (FeLV) maken 15 Het gen voor de FeLV-omhulling bevat de reeks die voor het polyeiwit p70 + pl5E codeert. Dit gen werd aanvankelijk in het plasmide pSD467vC ingebouwd met de koepokpromotor H6 in 5f-stand ten opzichte van het FeLV-omhullingsgen. Het plasmide pSD467vC was verkregen door eerst een Sal I / Hind Ill-fragment 20 van 1802 bp met daarin het gen voor het koepok-hemagglutinine in de vector pUC18 in te bouwen. De plaats van het hemagglutinine-gen was eerder bepaald (Shida, in Virology 150 (1988) 451-462).Structure of poultry pox recombinants making the envelope of feline leukemia virus (FeLV) glycoprotein The gene for the FeLV envelope contains the sequence encoding the p70 + pl5E polyprotein. This gene was initially incorporated into the plasmid pSD467vC with the cowpox promoter H6 in 5f position relative to the FeLV envelope gene. The plasmid pSD467vC was obtained by first incorporating a 1802 bp Sal I / Hind III fragment containing the cowpox hemagglutinin gene into the vector pUC18. The location of the hemagglutinin gene had been previously determined (Shida, in Virology 150 (1988) 451-462).

Het grootste deel van dit open af te lezen geval dat voor het hemagglutinine codeerde werd weggelaten (nucleotiden 443 tot en 25 met 1311) en een meervoudige kloningsplaats werd ingevoegd die aangrijpingsplaatsen voor de restrictie-enzymen Bgl II, Sma I,Most of this open-to-read case encoding the hemagglutinin was omitted (nucleotides 443 through 1311) and a multiple cloning site was inserted which engages sites for the restriction enzymes Bgl II, Sma I,

Pst I en Eag I bevatte. In het verkregen plasmide pSD467vC was het koepok-gedeelte bovenstrooms van de meervoudige kloningsplaats geflankeerd door een arm van 442 bp en benedenstrooms door een 30 arm van 491 bp. Deze flankerende armen maken het mogelijk het in dit meervoudige kloningsgebied ingevoegde genetische materiaal in het hemagglutinine-gebied van de Kogenhagen-stam van het koe-pokvirus te recombineren. De verkregen recombinant-nakomelingen zijn hemagglutinine-negatief.Pst I and Eag I contained. In the resulting plasmid pSD467vC, the cowpox portion was flanked upstream of the multiple cloning site by a 442 bp arm and downstream by a 491 bp arm. These flanking arms allow the genetic material inserted into this multiple cloning region to recombine into the hemagglutinin region of the Kogenhagen strain of the cowpox virus. The recombinant progeny obtained are hemagglutinin negative.

35 De H6-promotor werd gesynthetiseerd door vier elkaar overlappende oligonucleotiden, die tezamen de complete hierboven in bevoorkeurde uitvoeringsvormen beschreven reeks omvatten, te ontlaten. Het verkregen fragment van 132 bp bevatte aan het 5'-einde een aangrijpingsplaats voor Bgl II en aan het 3'-einde een h;,· - 0820679.The H6 promoter was synthesized by annealing four overlapping oligonucleotides, which together comprise the complete set described above in preferred embodiments. The resulting 132 bp fragment contained an engagement site for Bgl II at the 5 'end and an h; 0820679 at the 3' end.

- 40 - plaats voor Sma I. Dit werd op de Bgl II / Sma I-restrictieplaats in pSD467vC ingevoegd. Het aldus verkregen plasmide kreeg de aanduiding pPT15. Het gen voor de FeLV-omhulling zat op die ene Pst I-plaats van pPT15 welke net benedenstrooms van de promotor H6 5 staat. Het aldus opgebouwde plasmide kreeg de aanduiding pFeLVlA.- 40 - site for Sma I. This was inserted at the Bgl II / Sma I restriction site in pSD467vC. The plasmid thus obtained was designated pPT15. The gene for the FeLV envelope was in that one Pst I site of pPT15 which is just downstream of the promoter H6 5. The plasmid thus constructed was designated pFeLVlA.

Voor de constructie van de recombinant FP-1 werden reeksen van 2,4 Kbp voor de H6/FeLV-omhulling door vertering met Bgl II en gedeeltelijke vertering met Pst I uit pFeLVlA geknipt.For the construction of the recombinant FP-1, 2.4 Kbp arrays for the H6 / FeLV envelope were cut from pFeLVlA by digestion with Bgl II and partial digestion with Pst I.

10 De Bgl II-plaats zit op de 5'-grens van de E6-promotorreeks. De plaats voor Pst I ligt 420 bp benedenstrooms van het stopsignaal voor het omhullings-glycoproteïne in het open af te lezen geval.The Bgl II site is at the 5 'boundary of the E6 promoter series. The site for Pst I is 420 bp downstream of the envelope glycoprotein stop signal in the open reading case.

De reeks van 2,4 Kbp voor H6 en de FeLV-omhulling werd in met Bam Hl en Pst I verteerd pCE 11 ingevoegd. Deze inbouw-15 vector pCE 11 voor FP-1 was afgeleid van pRW 731.13 door inbouw van een meervoudige kloningsplaats op de niet-essentiële Hinc II-plaats. Deze inbouwvector maakt het ontstaan van FP-1 recombinanten mogelijk die vreemde genen op plaats f7 van het FP-l-genoom herbergen. Het inbouwplasmide voor de recombinant FP-l/FeLV kreeg 20 toen de aanduiding pFeLVFI. Met deze constructie is men echter niet zeker van een perfecte vervanging van ATG door ATG.The 2.4 Kbp series for H6 and the FeLV envelope was inserted into pCE 11 digested with Bam HI and Pst I. This build-in vector pCE 11 for FP-1 was derived from pRW 731.13 by incorporating a multiple cloning site at the non-essential Hinc II site. This insertion vector allows for the generation of FP-1 recombinants harboring foreign genes at position f7 of the FP-1 genome. The insertion plasmid for the recombinant FP-1 / FeLV was then designated pFeLVFI. However, this construction does not guarantee a perfect replacement of ATG with ATG.

Om de perfecte ATG:ATG-constructie te bereiken werd een Nru 1/ Sst II-fragment van ongeveer 1,4 Kbp, afgeleid van de koepokvirus-inbouwvector pFeLVlC. De plaats voor Nru I ligt binnen 25 de promotor H6 op een plaats 24 bp bovenstrooms van het ATG. De plaats voor Sst II ligt 1,4 Kbp benedenstrooms van het ATG en 1 Kbp bovenstrooms van het eindsignaal voor de vertaling. Dit Nru I/Sst II-fragment werd verbonden met een fragment van 9,9 Kbp dat door vertering met Sst II en gedeeltelijke vertering met Nru I gevormd was.To achieve the perfect ATG: ATG construction, a Nru 1 / Sst II fragment of approximately 1.4 Kbp was derived from the cowfox virus vector pFeLVlC. The site for Nru I is within the promoter H6 at a site 24 bp upstream of the ATG. The place for Sst II is 1.4 Kbp downstream of the ATG and 1 Kbp upstream of the translation final signal. This Nru I / Sst II fragment was linked to a 9.9 Kbp fragment generated by digestion with Sst II and partial digestion with Nru I.

30 Dit fragment van 9,9 Kbp bevat de FP-1 flankerende armen van 5,530 This 9.9 Kbp fragment contains the FP-1 flanking arms of 5.5

Kbp, de reeksen van de vector pUC, 1,4 Kbp van de FeLV-reeks die met de benedenstroomse gedeelten van het omhullingsgen overeenkomen, en de het verst naar het 5’-einde gelegen 100 bp van de promotor H6. Het verkregen plasmide kreeg de aanduiding pFeFLVF2.Kbp, the sequences of the vector pUC, 1.4 Kbp of the FeLV sequence corresponding to the downstream portions of the envelope gene, and the 100 bp farthest to the 5 'end of the promoter H6. The resulting plasmid was designated pFeFLVF2.

35 De ATG:ATG-constructie werd bevestigd door analyse van de nucleo- tiden-volgorde.The ATG: ATG construction was confirmed by analysis of the nucleotide sequence.

Een andere inbouwvector voor het FP-1, het pFeLVF3, werd uit pFeLVF2 afgeleid door de reeksen voor de FeLV-omhulling, overeenkomende met het beweerde immuniteit onderdrukkende gebied (Cianciolo c.s. in Science 230 (1985) 453-455) (nucleotiden 1548 t/m 8820679.Another incorporation vector for the FP-1, the pFeLVF3, was derived from pFeLVF2 by the FeLV envelope sequences, corresponding to the claimed immunity-suppressing region (Cianciolo et al. In Science 230 (1985) 453-455) (nucleotides 1548 t / m 8820679.

- 41 - 1628 van de coderende reeks). Dit werd bereikt door een Sst II/- 41 - 1628 of the coding series). This was accomplished by an Sst II /

Pst I-fragment (met de hierboven genoemde aangrijpingsplaatsen) van ongeveer 1 Kbp uit de koepokvirus-inbouwvector pFeLVlD te isoleren. Het plasmide pFeLVld komt overeen met pFeLVlC behalve 5 dat de omhullingsreeksen overeenkomende met het immuniteit onder drukkende gebied (nucleotiden 1548 t/m 1628) door op de oligo-nucleotiden gerichte mutagenese weggelaten werden (zie Mandecki in Proc. Natl. Acad. Asci. USA 83 (1987) 7177-7181.) Het Sst II / Pst I-fragment van 1 Kbp dat de nucleotiden 1548 t/m 1628 mistte 10 werd ingebouwd in een Sst II/Pst I-fragment van 10,4 Kbp dat de rest van het uit pFeLVF2 afkomstige gen voor de H6:FeLV-omhul-ling bevatte.Isolate Pst I fragment (with the above sites of engagement) of approximately 1 Kbp from the cowpox virus vector pFeLVlD. The plasmid pFeLVld corresponds to pFeLVlC except that the envelope series corresponding to the immunosuppression region (nucleotides 1548 through 1628) were omitted by mutagenesis targeting the oligo nucleotides (see Mandecki in Proc. Natl. Acad. Asci. USA). 83 (1987) 7177-7181.) The 1 Kbp Sst II / Pst I fragment that lacked nucleotides 1548 through 1628 was incorporated into a 10.4 Kbp Sst II / Pst I fragment containing the remainder of the gene for the H6: FeLV envelope derived from pFeLVF2.

De inbouwplasmiden pFeLVF2 en pFeLVF3 werden in recom-binatieproeven in vitro gebruikt met FP-1 als reddend virus. Na-15 komelingen van de recombinatie werden uitgeplaat op CEF-monolagen en recombinant-virussen werden geselecteerd door plaque-hybridi-sering op CEF-monolagen. Door hybridiseringsanalyse geïdentificeerde recombinant-nakomelingen werden er uit gehaald en ondergingen vier cycli plaque-zuivering om tot homogene populaties te komen.The insertion plasmids pFeLVF2 and pFeLVF3 were used in vitro in combination experiments with FP-1 as a rescue virus. Recipients of the recombination were plated on CEF monolayers and recombinant viruses were selected by plaque hybridization on CEF monolayers. Recombinant progeny identified by hybridization analysis were removed and underwent four cycles of plaque purification to arrive at homogeneous populations.

20 Een FP-1 recombinant die het hele gen voor de FeLV-omhulling her bergde kreeg de aanduiding vFP-25 en een FP-1 recombinant die het hele gen had maar het de immuniteit onderdrukkende gebied miste werd vFP-32 genoemd. Van beide recombinanten is door immuno-precipitatie met polyklonaal runderserum tegen FêLV (van de Anti-25 bodies, Inc. te Davis, Ca.) aangetoond dat ze het geëigende gen- produkt bevatten. Van belang is dat deze FP-1 recombinanten het vreemde gen voor de FeLV-omhulling tot expressie brengen in de CRFK-cellijn (ATCC ?¥CCL94), welke uit de kat afkomstig is.An FP-1 recombinant harboring the whole gene for the FeLV envelope was designated vFP-25 and an FP-1 recombinant harboring the whole gene but lacking the immunosuppressive region was designated vFP-32. Both recombinants have been shown to contain the appropriate gene product by immunoprecipitation with polyclonal bovine serum against FêLV (from the Anti-25 bodies, Inc. of Davis, Ca.). Importantly, these FP-1 recombinants express the foreign gene for the FeLV envelope in the CRFK cell line (ATCC ™ CCL94), which is from the cat.

Voor de. constructie van kanariepokken-recombinanten 30 werd een fragment van 2,2 Kbp met daarin de reeksen voor de H6:FeLV- omhulling door vertering met Sma I en Hpa I uit pFeLVF2 geknipt.For the. construction of canarypox recombinants, a 2.2 Kbp fragment containing the H6: FeLV envelope sequences was cut from pFeLVF2 by digestion with Sma I and Hpa I.

De plaats voor Sma I is bij de 5*-grens van de H6-promotorreeks.The site for Sma I is at the 5 * boundary of the H6 promoter series.

De plaats voor Hpa I ligt 180 bp benedenstrooms van het beëindi-gingssignaal op het open af te lezen geval voor de omhulling.The location for Hpa I is 180 bp downstream of the termination signal on the open case for the enclosure.

35 De reeks van 2,2 Kbp voor de H6/FeLV-omhulling werd op de niet-essentiële Eco RI-plaats van het inbouwplasmide pRW764.2 ingevoegd nadat die uiteinden van de Eco RI-plaats afgestompt waren. Deze inbouwvector maakt het ontstaan van CP-recom-binanten mogelijk die vreemde genen op plaats C4 van het CP-genoomte.The 2.2 Kbp series for the H6 / FeLV enclosure was inserted into the non-essential Eco RI site of the pRW764.2 embedded plasmid after those ends of the Eco RI site were blunted. This insertion vector allows for the generation of CP recombinants carrying foreign genes at position C4 of the CP genome.

8820673." L·.8820673. "L ·.

- 42 - herbergen. Het recombinant-plasmide voor het inbouwen van CP kreeg de aanduiding pFeLVCP2. Deze constructie vertoont een perfecte vervanging van ATG door ATG.- 42 - hostels. The recombinant plasmid for incorporation of CP was designated pFeLVCP2. This construction shows a perfect replacement of ATG by ATG.

Het inbouwplasmide pFeLVCP2 werd in recombinatie-5 proeven in vitro gebruikt met kanariepokken als reddend virus.The build-in plasmid pFeLVCP2 was used in vitro in recombination experiments with canary pox as a rescuing virus.

Nakomelingen van deze recombinatie werden op CEF-monolagen uitge-plaat en de recombinant-virussen werden er in een immunoscherm-proef met aan $-galactosidase geknoopt eiwit A met behulp van een polyklonaal runderserum tegen FeLV uit de handel (Antibodies 10 Inc. te Davis, Ga.) uitgezocht. Positief kleurende plaques werden eruit genomen en ondergingen vier cycli van plaque-zuivering om een homogene populatie te verkrijgen. Een recombinant dat het gehele gen voor de FeLV-omhulling tot uitdrukking bracht kreeg de aanduiding vCP-36.Progeny of this recombination was plated on CEF monolayers and the recombinant viruses were immunoprotected with $ galactosidase-linked protein A using a commercial polyclonal anti-FeLV bovine serum (Antibodies 10 Inc. of Davis , Ga.) Sorted out. Positive staining plaques were taken out and underwent four plaque purification cycles to obtain a homogeneous population. A recombinant expressing the entire gene for the FeLV envelope was designated vCP-36.

15 Voorbeeld XVIExample XVI

Opbouw van pluimveepokkenvirus-recombinant vFP-22 die het gen voor de omhulling van het met rous geassocieerde virus type 1 tot expressie brengtConstruction of poultry pox virus recombinant vFP-22 expressing the gene for enveloping the rous-associated virus type 1

De kloon penvRVIPT van het omhullingsgen RAV-1 bevat 20 1,1 Kbp aan voor RAV-1 coderend DNA, als een Kpn Ι/Sac I-frag- ment in M13mpl8 gekloond. Dit fragment is aan het 5’-einde intact maar mist een deel van het 3'-einde en werd in de volgende manipulaties gebruikt. Een over een gel gezuiverd Eco Rl/Pst I-fragment uit penvRVIPT van 1,1 Kbp werd op de Eco RI- en Pst I-plaatsen 25 van pUC 9 ingebouwd, hetgeen pRW 756 gaf. Dit plasmide werd toen met Kpn I en Hind III verteerd waardoor 59 basen bovenstrooms van het ATG in de vector geknipt werd. Er werd een Kpn I/Hind III-fragment van 146 baseparen, met daarin de eerder beschreven koepok-virus-promotor H6, ingebouwd, hetgeen het plasmide pCE 6 gaf.The penvRVIPT clone of the envelope gene RAV-1 contains 20 1.1 Kbp of RAV-1 encoding DNA, cloned as a Kpn Ι / Sac I fragment in M13mp18. This fragment is intact at the 5 'end but lacks part of the 3' end and was used in the following manipulations. A gel purified Eco R1 / Pst I fragment from 1.1 kbp penvRVIPT was incorporated into the Eco RI and Pst I sites of pUC 9 to give pRW 756. This plasmid was then digested with Kpn I and Hind III, cutting 59 bases upstream of the ATG into the vector. A 146 base pair Kpn I / Hind III fragment containing the previously described cowpox virus promoter H6 was incorporated to give the plasmid pCE 6.

30 Om er zeker van te zijn dat het initiërende ATG van het gen voor de RAV-omhulling nabij het 3'-einde Van de promotor H6 lag, onder weglating van van buitenkomende reeksen, werden nog twee aanvullende synthetische oligonucleotiden opgebouwd met Eco RV- en Ban II-plaatsen aan de uiteinden. Dit oligonucleotide 35 was 5’-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC-3'.To ensure that the initiating ATG of the gene for the RAV envelope was near the 3 'end of the promoter H6, omitting outer sequences, two additional synthetic oligonucleotides were constructed with Eco RV and Ban II places at the ends. This oligonucleotide 35 was 5'-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC-3 '.

Het plasmide pCE 6 werd verteerd met Eco RV, dat 24 basen bovenstrooms van het ATG in de promotor H6 knipt, en met Ban II dat 7 basen benedenstrooms van het ATG in de voor de RAV-omhulling coderende reeks knipt. De DNA-segmenten werden met el- $820679.1 t - 43 - kaar verbonden en gebruikt om E. coli-cellen te transformeren.The plasmid pCE 6 was digested with Eco RV, which cuts 24 bases upstream of the ATG in the promoter H6, and with Ban II, which cuts 7 bases downstream of the ATG in the RAV envelope encoding sequence. The DNA segments were joined to each other and used to transform E. coli cells.

Het plasmide dat daarvan het resultaat was, pCE 7, verschafte promotor H6 en een correcte 5’-reeks voor de uiteindelijke constructie.The resulting plasmid, pCE 7, provided promoter H6 and a correct 5 'sequence for the final construction.

Uit een restrictiekaart bleek de kloon mpl9env (190) 5 het gehele gen voor de RAV-1 omhulling te bevatten. Een Kbn I/Sac I- fragment van mpl9env (190) dat het gehele gen bevatte werd op de Κρη I- en Sac I-plaatsen pUC 18 ingevoegd, wat pCE 3 gaf. Dit plasmide werd met Hpa I verteerd, dat de voor RAV-1 coderende reeks 132 basen benedenstrooms van het initiërende ATG doorknipt, en met 10 Sac I, dat het gen nabij het 3T-einde doorknipt. De eerder be schreven FPV-inbouwvector pCE 11 werd met Sma I en Sac I verteerd, waardoor het plasmide in het gebied van de meervoudige verbindingen doorgeknipt werd. Het Hpa Ι/Sac I-fragment van pCE 3 werd met pCE 11 verbonden, wat pCE 14 gaf.A restriction map revealed the clone mpl9env (190) 5 to contain the entire gene for the RAV-1 envelope. A Kbn I / Sac I fragment of mpl9env (190) containing the whole gene was inserted pUC 18 at the ηρη I and Sac I sites, giving pCE 3. This plasmid was digested with Hpa I, which cuts the RAV-1 coding sequence 132 bases downstream of the initiating ATG, and with 10 Sac I, which cuts the gene near the 3T end. The previously described FPV insert vector pCE 11 was digested with Sma I and Sac I, cutting the plasmid in the region of the multiple junctions. The Hpa Ι / Sac I fragment of pCE 3 was linked to pCE 11 to give pCE 14.

15 Het plasmide pCE 7 werd toen met Xho I en Hind IIIThe plasmid pCE 7 was then digested with Xho I and Hind III

verteerd, wat een fragment van 332 baseparen gaf dat de promotor H6 en de correcte 5'-reeks bevatte. Plasmide pCE 14 werd met Hind III verteerd, dat in het gebied van de meervoudige verbindingen van de vector knipte en met Xho I dat in de coderingsreeks 20- knipte. Dit DNA werd met het uit pCE 7 verkregen Hind ΙΙΙ/Xho I- fragment verbonden, wat pCE 15 gaf, de uiteindelijke genconstructie voor de RAV-1 omhulling.digested, giving a 332 base pair fragment containing the promoter H6 and the correct 5 'sequence. Plasmid pCE 14 was digested with Hind III, which cut in the region of the vector's multiple compounds, and with Xho I, which cut in the coding sequence 20-. This DNA was linked to the Hind ΙΙΙ / Xho I fragment obtained from pCE 7, giving pCE 15, the final gene construction for the RAV-1 envelope.

Dit plasmide werd in een recombinatieproef in vitro gebruikt met pluimveepokken FP-1 als reddend virus. Nakomelingen 25 van de recombinatie werden op CEF-monolagen uitgeplaat en de plaques werden met behulp van een polyklonaal serum tegen PA.V-1 in een immunoschermproef met aan β-galactosidase geknoopt eiwit A uitgezócht. Positief kleurende plaques werden eruit genomen en ondergingen vier cycli van plaque-zuivering om een homogene populatie 30 te verkrijgen. De gemaakte recombinant kreeg de aanduiding vFP-22.This plasmid was used in an in vitro recombination test with fowlpox FP-1 as a rescuing virus. Progeny of the recombination were plated on CEF monolayers and the plaques were selected in an immunoscreen test with β-galactosidase-knotted protein A using a polyclonal serum against PA.V-1. Positive staining plaques were removed and underwent four plaque purification cycles to obtain a homogeneous population. The recombinant made was designated vFP-22.

Immunoprecipitatieproeven met door vFP-22 geïnfecteerde CEF-lysa-ten toonden het specifiek neerslaag van twee eiwitten met schijnbare molecuulgewichten van 76.500 en 30.000, overeenkomende met de twee genprodukten van het omhullingsgen. Er bleek niets van een 35 voorloper.Immunoprecipitation assays with vFP-22 infected CEF lysates showed the specific deposition of two proteins with apparent molecular weights of 76,500 and 30,000 corresponding to the two gene products of the envelope gene. Nothing turned out to be a forerunner.

In voorafgaande proeven vertoonden met vFP-22 beënte kuikens een immuunrespons tegen de RAV-l-omhulling, produkt van dat gen.In previous experiments, chickens inoculated with vFP-22 showed an immune response against the RAV-1 envelope, product of that gene.

Voorbeeld XVIIExample XVII

Opbouw van vogelpokkenvirus-recombinanten die het gen voor de 8820679.Construction of fowlpox virus recombinants carrying the gene for 8820679.

- 44 - GP51,30-omhulling van runderleukemievirus tot expressie brengen (1) Opbouw van pBLVF 1 en pBLVF 2- 44 - Expressing GP51,30 envelope of bovine leukemia virus (1) Construction of pBLVF 1 and pBLVF 2

De plasmiden pBLVF 1 en pBLVF 2 bevatten het gen 5 van runderleukemievirus (BLV) voor de GP51,30-omhulling. In beide plasmiden staat het omhullingsgen onder overschrijfcontrole van koepokvirus-promotor H6 en zit het tussen twee flankerende pluim-veepokken-armen gekloond (plaats f7). De nucleotide-reeksen van beide plasmiden is identiek, behalve op de codon-plaatsen 268 en 10 269. (Het pBLVF 1 codeert voor een eiwit dat op die twee plaatsen de aminozuren Arg en Ser bevat, terwijl pBLVF 2 voor een eiwit codeert dat de aminozuren Gin en Thr bevat.) pBLVF 1 en pBLVF 2 werden met de volgende procedure in elkaar gezet. Plasmide pNS97-l, een plasmide dat het gehele gen 15 voor de BLV-omhulling bevat, werd met Ham Hl en gedeeltelijk metThe plasmids pBLVF 1 and pBLVF 2 contain the bovine leukemia virus (BLV) gene 5 for the GP51.30 envelope. In both plasmids, the envelope gene is under overwriting control of cowpox promoter H6 and cloned between two flanking poultry chickenpox arms (site f7). The nucleotide sequences of both plasmids are identical, except at codon sites 268 and 269. (The pBLVF 1 encodes a protein containing the amino acids Arg and Ser at those two sites, while pBLVF 2 encodes a protein that amino acids Gin and Thr.) pBLVF 1 and pBLVF 2 were assembled using the following procedure. Plasmid pNS97-1, a plasmid containing the entire BLV envelope gene 15, was mixed with Ham HI and partially with

Mst II bewerkt. Het fragment van 2,3 Kbp dat het gehele gp51,30-- gen bevatte werd over een agarose-gel geïsoleerd en de kleverige uiteinden daarvan werden opgevuld met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I uit E. coli. De Pst I-verbindingsstukken werden 20 toen met de uiteinden van het fragment verbonden, dat na vertering met Pst I met de Pst I-plaats van pTP 15 (voorbeeld XV) verbonden werd. Dat zet het BLV-gen naast de koepok-promotor H6. (pTP15 bevat de koepokpromotor H6 op een niet-essentiële plaats in het koepok-genoom gekloond.) Dit plasmide werd toen met Eco RV en ge-25 deeltelijk met Ava II verteerd. Het fragment van 5,2 Kbp werd ge ïsoleerd en de nucleotiden 5’-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG-3' en 5'-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' werden gebruikt om het plasmide weer kringvormig te maken. Dat 30 verwijdert onnodige basen tussen het BLV-gen en de promotor H6.Mst II edited. The 2.3 Kbp fragment containing the entire gp51.30 gene was isolated over an agarose gel and its sticky ends were filled with the Klenow fragment of E. polymer DNA polymerase I. The Pst I junctions were then joined to the ends of the fragment, which after digestion with Pst I was joined to the Pst I site of pTP 15 (Example XV). That puts the BLV gene next to the cowpox promoter H6. (pTP15 contains the cowpox promoter H6 cloned at a non-essential site in the cowpox genome.) This plasmid was then digested with Eco RV and partially digested with Ava II. The 5.2 Kbp fragment was isolated and the nucleotides 5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG-3 'and 5'-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' were used to reshape the plasmid. That removes unnecessary bases between the BLV gene and the promoter H6.

Het verkregen plasmide werd met Pst I en gedeeltelijk met Bgl II bewerkt en het fragment van 1,7 Kbp dat het met H6 gepromote BLVTgen bevatte werd in pCE 11, de eerder beschreven pluim-veepokkenvirus-inbouwvector, op de Bam Hl/Pst I-plaats gekloond, 35 onder toepassing van f7. Dit plaatst het met H6 gepromote BLV-gen tussen flankerende pluimveepokken-armen. Dit plasmide kreeg de aanduiding pBLVF 1.The resulting plasmid was processed with Pst I and partially Bgl II and the 1.7 Kbp fragment containing the H6 promoted BLVT gene was inserted into pCE 11, the previously described poultry chickenpox virus insert vector, on the Bam HI / Pst I- cloned in place, 35 using f7. This places the H6 promoted BLV gene between flanking poultry pox arms. This plasmid was designated pBLVF 1.

Een identieke procedure werd gebruikt om pBLVF 2 op te bouwen, behalve dat aanvullend een mutagenese in vitro uitge-30 voerd werd voordat het met H6 gepromote BLV-gen in pCE 11 inge- β82 0679 : - 45 - voegd werd. Deze mutagenese werd met de volgende procedure uitgevoerd: plasmide pNS97-l werd met Xma I en gedeeltelijk met Stu I verteerd. Het fragment van 5,2 Kbp werd geïsoleerd en de oligo-nucleotiden 5 51-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG-3 * en 5T-CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3’ werden gebruikt om het plasmide weer kringvormig te maken. Dit verandert de nucleotiden van codonen 268 en 269 van CGC-AGT in CAA-ACT.An identical procedure was used to construct pBLVF 2, except that an additional mutagenesis was performed in vitro before the H6 promoted BLV gene was inserted into pCE 11 β82 0679: - 45. This mutagenesis was performed by the following procedure: plasmid pNS97-1 was digested with Xma I and partially with Stu I. The 5.2 Kbp fragment was isolated and the oligonucleotides 51-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG-3 * and 5T-CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3 "were used to re-circle the plasmid. This changes the nucleotides of codons 268 and 269 of CGC-AGT to CAA-ACT.

10 (2) Constructie van de recombinant-virussen(2) Construction of the recombinant viruses

De plasmiden pBLVF 1 en pBLVF 2 werden in een recombi-natieproef in vitro gebruikt met FP-1 als reddend virus. De recom-binant-nakomelingen werden door een plaque-hybridisering in situ uitgezocht en toen de populatie op dit kriterium zuiver geacht 15 werd werden de plaques in een β-galactosidase-eiwit A-immuno- essaai er met een monoklonaal, voor BLV-gp specifiek antilichaam-preparaat uitgezocht. Beide uit plasmiden pBLVF 1 en pBLVF 2 gemaakte recombinanten vFP 23 en vFP 24 vertoonden bij de immuno-schermproef een positieve kleuring, wat aangeeft dat op het geïnfec-20 teerde celoppervlak een immunologisch herkenbaar glycoproteïne gevormd werd.The plasmids pBLVF 1 and pBLVF 2 were used in vitro with FP-1 as a rescue virus in a recombination experiment. The recombinant progeny were selected in situ by plaque hybridization and when the population on this criterion was judged pure, the plaques in a β-galactosidase protein A immunosay were probed with a monoclonal, for BLV-gp specific antibody preparation selected. Both recombinants vFP 23 and vFP 24 made from plasmids pBLVF 1 and pBLVF 2 showed positive staining in the immunoprotection assay, indicating that an immunologically recognizable glycoprotein was formed on the infected cell surface.

De plasmiden pBLVK 4 en pBLVK 6 bevatten het gp51,30-gen voor de BLV-omhulling, respectievelijk met en zonder het splitsingsgen. Beide genen werden op de enige Eco RI-plaats van 25 pRW 764.2 (plaats C3) gekloond (pRW 764.2 is in voorbeeld XIIIThe plasmids pBLVK 4 and pBLVK 6 contain the gp51.30 gene for the BLV envelope, with and without the cleavage gene, respectively. Both genes were cloned at the only Eco RI site of 25 pRW 764.2 (site C3) (pRW 764.2 is in Example XIII

beschreven), en staan onder overschrij fcontrole van de koepok-viruspromotor H6.described), and are under overwriting control of the cowpox virus promoter H6.

De plasmiden werden op de volgende wijze gemaakt: pBLVF 1 en pBLVF 2 werden uitgeknipt met het restrictie-enzym 30 Hind III. Het oligonucleotide BKL 1 (AGCTTGAATTCA) werd op die plaats gekloond, wat een Eco RI-plaats 3’ ten opzichte van het BLV-gen schiep. Daar er ook een Eco RI-plaats 5T ten opzichte van het BLV-gen is werden deze plasmiden (pBLVK 1 en pBLVK 2) met Eco RI uitgeknipt en het fragment met het door H6 gepromote BLV-35 gen werd op de Eco RI-plaats van pRW 764.2 gekloond. De verkregen plasmiden kregen de aanduidingen pBLVK 4, resp. pBLVK 6. De plasmiden werden in een recombinatieproef in vitro gebruikt met kanariepokken als ontvangend virus. De recombinanten werden geselecteerd en gezuiverd op basis van de met een immunoessaai vast- 8820 679 .< - 46 - gestelde oppervlakte-expressie van het glycoproteïne. De recombinanten kregen de aanduidingen vCP 27 en vCP 28» respectievelijk uit plasmiden pBLVK 4 en pBLVK 6.The plasmids were made in the following manner: pBLVF 1 and pBLVF 2 were excised with the restriction enzyme Hind III. The oligonucleotide BKL 1 (AGCTTGAATTCA) was cloned at that site, creating an Eco RI site 3 "relative to the BLV gene. Since there is also an Eco RI site 5T relative to the BLV gene, these plasmids (pBLVK 1 and pBLVK 2) were excised with Eco RI and the fragment containing the H6 promoted BLV-35 gene was located at the Eco RI site cloned from pRW 764.2. The plasmids obtained were designated pBLVK 4, respectively. pBLVK 6. The plasmids were used in vitro in a recombination test using canarypox as the recipient virus. The recombinants were selected and purified based on the immunoassay 8820 679 <- 46 - surface expression of the glycoprotein. The recombinants were designated vCP 27 and vCP 28 »from plasmids pBLVK 4 and pBLVK 6, respectively.

Schapen en runderen kregen langs verschillende wegen 5 de pluimveepokken-recombinanten vFP23 en vFP24. De dieren kregen twee inentingen, de tweede 45 dagen na de eerste. Serum-monsters werden 5 weken na de eerste beënting en 2 weken na de tweede be-enting genomen.Antilichamen tegen gp51 werden in een competitieve ELISA-proef gemeten en de titer werd uitgedrukt in het omgekeerde 10 van de serumverdunning die de competitie met 50 % verminderde.Sheep and cattle received the poultry pox recombinants vFP23 and vFP24 by various routes. The animals received two vaccinations, the second 45 days after the first. Serum samples were taken 5 weeks after the first inoculation and 2 weeks after the second inoculation. Antibodies to gp51 were measured in a competitive ELISA assay and the titer was expressed in inverse of the serum dilution which competed by 50% decreased.

De uitkomsten staan in tabel XI.The results are shown in Table XI.

Na de eerste beënting vertoonde geen der beproefde soorten een aantoonbare immuunrespons. Maar na de tweede beënting vertoonden zowel schapen als runderen een belangrijke verhoging van 15 de antilichamen.After the first inoculation, none of the tested species showed a demonstrable immune response. However, after the second inoculation, both sheep and cattle showed a significant increase in the antibodies.

Tabel XITable XI

Beënting van schapen en runderen met vFP23 en vFP24 Dier Virus Dosis en route ELISA Titer 1° 2° 1° 2° 20Inoculation of sheep and cattle with vFP23 and vFP24 Animal Virus Dose and route ELISA Titer 1 ° 2 ° 1 ° 2 ° 20

Rund B56 FP-1 108+l08a 108+108 0 0 B59 FP-1 ID subcut. 0 0Bovine B56 FP-1 108 + l08a 108 + 108 0 0 B59 FP-1 ID subcut. 0 0

Schaap M89 FP-1 0 0 M91 FP-1 0 0 25Sheep M89 FP-1 0 0 M91 FP-1 0 0 25

Rund B62 vFP-23 108+108 108+108 0 200b B63 vFP-23 ID subcut. 0 80Bovine B62 vFP-23 108 + 108 108 + 108 0 200b B63 vFP-23 ID subcut. 0 80

Schaap M83 vFP-23 0 80 M84 vFP-23 0 500 30 M85 vFP-23 0 100Sheep M83 vFP-23 0 80 M84 vFP-23 0 500 30 M85 vFP-23 0 100

Rund B52 vFP-24 108+108 108+108 0 200 B53 vFP-24 ID subcut. 0 60Bovine B52 vFP-24 108 + 108 108 + 108 0 200 B53 vFP-24 ID subcut. 0 60

Schaap M87 vFP-24 0 200 35 . M92 vFP-24 0 20 M93 vFP-24 0 20 3Sheep M87 vFP-24 0 200 35. M92 vFP-24 0 20 M93 vFP-24 0 20 3

Intradermale injecties op twee punten 8 Titer uitgedrukt als het omgekeerde van de verdunning die 50 % competitie geeft.Intradermal injections at two points 8 Titer expressed as the inverse of the dilution giving 50% competition.

«820679: - 47 -«820679: - 47 -

Voorbeeld XVIIIExample XVIII

Opbouwen van een pluimveepokken-recombinant vFP-26 uit virus FP-1 die het gen voor de matrix van het infectieuze bronchitis-virus Mass 41 tot expressie brengt 5 Plasmide pIBVM63 bevat een cDNA-kloon van het matrix- gen van het infectieuze bronchitis-virus (IBV) van de stam Mass 41. Een Eco Rl-fragment van pIBVM63 dat 8 Kbp groot is bevat boven-strooms van het matrix-gen het peplomer-gen en nog verder boven-strooms is er een aangrijpingsplaats voor Eco RV. Plasmide pRW 715 10 heeft een Eco RI-verbinder die de twee Pvu II-plaatsen van püC 9 met elkaar verbindt. Het Eco Rl-fragment van 8 Kbp uit pIBVM63 werd op de Eco RI-plaats in pRW 715 gebouwd, wat pRW 763 gaf.Construction of a poultry pox-recombinant vFP-26 from virus FP-1 expressing the gene for the matrix of the infectious bronchitis virus Mass 41 5 Plasmid pIBVM63 contains a cDNA clone of the matrix gene of the infectious bronchitis virus (IBV) of the strain Mass 41. An Eco R1 fragment of pIBVM63, which is 8 Kbp in size, contains the peplomer gene upstream of the matrix gene and even further upstream there is a site for Eco RV. Plasmid pRW 715 10 has an Eco RI connector that connects the two Pvu II sites of püC 9. The 8 Kbp Eco R1 fragment from pIBVM63 was built at the Eco RI site in pRW 715 to give pRW 763.

Door uit pRW 763 de Eco RI-plaats aan het 5’-einde te verwijderen werd het plasmide pRW 776 geschapen, met slechts één enkele Eco RI-15 plaats benedenstrooms (3 * ten opzichte van) het matrix-gen. Het ge deeltelijk door Eco RI verteerde, opengeknipte produkt van pRW 763 werd na isoleren nog eens met Eco RV bewerkt. Het grootste fragment werd geïsoleerd, met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I afgestompt en met zichzelf verbonden, wat pRW 776 gaf. De construc-20 tie pRW 776 had het complete IBV-peplomeer en de matrix-genen, gevolgd door ëén enkele aangrijpingsplaats voor Eco RI.By removing the Eco RI site at the 5 'end from pRW 763, the plasmid pRW 776 was created, with only a single Eco RI-15 site downstream (3 * to) the matrix gene. The partially digested product of pRW 763 digested by Eco RI was processed again with Eco RV after isolation. The largest fragment was isolated, blunted with the Klenow fragment of DNA polymerase I, and joined to itself, yielding pRW 776. The construction pRW 776 had the complete IBV peplomer and the matrix genes, followed by a single site of action for Eco RI.

Alleen van de 5*- en 3’-einden van het ongeveer 900 bp grote matrix-gen werden de nucleotiden-volgorden bepaald. Het 5'-stuk van het matrix-gen, bevat, beginnende bij het begincodon voor 25 de vertaling (ATG) de volgende nucleotiden (met de plaats voorNucleotide sequences were determined only from the 5 * and 3 'ends of the approximately 900 bp matrix gene. The 5 'part of the matrix gene, starting from the translation initial codon (ATG) contains the following nucleotides (with the place for

Rsa I onderstreept): ATGTCCAACGAGACAAATTGTAC. De eerder beschreven promotor H6 werd met een synthetisch oligonucleotide aan het matrix-gen gekoppeld. Het synthetische oligonucleotide bevatte de H6-reeks vanaf zijn Eco RV-plaats over het ATG tot in de voor het 30 matrix coderende reeks tot en met de eerste Rsa I-plaats. Het oligonucleotide werd met voor Bam Hl en Eco RI aangrijpbare uiteinden opgebouwd zodat het in püC 9 ingevoegd kon worden, wat pRW 772 gaf. Het Eco Rl-einde is 3' ten opzichte van de Rsa I-plaats. Beginnende bij het voor Bam Hl aangrijpbare einde is de structuur van 35 het dubbelstrengige synthetische oligonucleotide (met ATG onder streept) :Rsa I underlined): ATGTCCAACGAGACAAATTGTAC. The previously described promoter H6 was coupled to the matrix gene with a synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide contained the H6 sequence from its Eco RV site over the ATG into the matrix encoding array through the first Rsa I site. The oligonucleotide was built up with Bam HI and Eco RI-engageable ends so that it could be inserted into püC 9 to give pRW 772. The Eco R1 end is 3 'to the Rsa I position. Starting at the Bam HI engageable end, the structure of the double stranded synthetic oligonucleotide (with ATG underlined) is:

GATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCAACGAGACAAATTGTACGGATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCAACGAGACAAATTGTACG

CGCTATAGGCAATTGAAACATAGCATTACAGGTTGCTCTGTTTAACATGCTTAA Het produkt van de gedeeltelijke vertering van pRW 772 met Rsa I 40 werd geïsoleerd en met Eco RI nogeens bewerkt. Het fragment van 882067 9.' - 48 - pRW 772 dat alleen op de genoemde Rsa I-plaats doorgeknipt en met Eco RI nogeens geknipt was werd geïsoleerd, met fosfatase behandeld en als vector voor het hierna te beschrijven verteringsprodukt van pRW 776 gebruikt.CGCTATAGGCAATTGAAACATAGCATTACAGGTTGCTCTGTTTAACATGCTTAA The product of partial digestion of pRW 772 with Rsa I 40 was isolated and reprocessed with Eco RI. The fragment of 882067 9. ' 48 - pRW 772 cut only at said Rsa I site and cut again with Eco RI was isolated, treated with phosphatase and used as a vector for the digest product of pRW 776 described below.

5 Het lineaire produkt van de gedeeltelijke vertering van pRW 776 door Rsa I werd na isoleren nogeens bewerkt met Eco RI. Eco RI grijpt juist voorbij het 3*-einde van het matrix-gen aan. Een Rsa I / Eco RI-fragment dat de voor het matrix coderende reeks vanaf de genoemde Rsa I-plaats bevatte, werd geïsoleerd en in de genoemde vec-10 tor pRW 772 ingebouwd, wat pRW 783 gaf. De complete promotor H6 werd gevormd door 5'-reeksen aan de Eco RV-plaats toe te voegen. Het 5’-einde van promotor H6 was een Hinf I-plaats die met een stomp uiteinde in de Sal I-plaats van het pUC 9 gewerkt was, wat een Eco RI-plaats gaf; 5' ten opzichte van promotor H6 lag de Hind III-plaats 15 van het pUC 9. Het Hind III /Eco RV-fragment met de 5’-promotor H6 werd tussen de Hind III- en Eco RV-plaatsen van pRW 783 gestoken, wat pRW 786 gaf. Het Eco RI-fragment van pRW 786, met daarin het complete door H6 gepromote matrix-gen werd met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I stomp gemaakt en in de afgestompte Bam Hï-plaats 20 van pRW 731.15 (plek f8) ingebouwd, wat pRW 789 gaf. De Bam HI- plaats van pRW 731.15 is de in voorbeeld VI voor het opbouwen van vFP-8 gebruikte FP-l-plaats.The linear product of the partial digestion of pRW 776 by Rsa I was processed again with Eco RI after isolation. Eco RI acts just beyond the 3 * end of the matrix gene. An Rsa I / Eco RI fragment containing the array coding sequence from said Rsa I site was isolated and built into said vector pRW 772 to give pRW 783. The complete promoter H6 was generated by adding 5 'sequences to the Eco RV site. The 5 'end of promoter H6 was a blunt ended Hinf I site in the Sal I site of the pUC 9 giving an Eco RI site; 5 'to promoter H6 was the Hind III site 15 of the pUC 9. The Hind III / Eco RV fragment containing the 5' promoter H6 was inserted between the Hind III and Eco RV sites of pRW 783, which gave pRW 786. The Eco RI fragment of pRW 786, containing the complete matrix gene promoted by H6, was blunted with the Klenow fragment of DNA polymerase I and incorporated into the blunted Bam HI site 20 of pRW 731.15 (site f8), which gave pRW 789. The Bam HI site of pRW 731.15 is the FP-1 site used in Example VI to build vFP-8.

Plasmide pRW 789 werd gebruikt bij het opbouwen van vFP-26. Recombinant-plaques werden in situ door plaque-hybridisering geselec-25 teerd en verder verwerkt.Plasmid pRW 789 was used in building vFP-26. Recombinant plaques were selected in situ by plaque hybridization and further processed.

Bij primaire proeven werd in met vFP-26 ingeente kuikens een immuunrespons tegen het IBV-matrix-eiwit opgewekt.In primary experiments, an immune response to the IBV matrix protein was elicited in chickens vaccinated with vFP-26.

Voorbeeld XIXExample XIX

Opbouwen van een pluimveepokken-recombinant vFP-31 uit virus FP-1 30 die het peplomeer van het infectieuze bronchitisvirus tot expressie brengtConstruction of a poultry pox-recombinant vFP-31 from virus FP-1 30 expressing the peplomer of the infectious bronchitis virus

In voorbeeld XVIII zijn de cDNA-kloon pIBVM 63 van het infectieuze bronchitisvirus (IBV) Mass 41 en zijn. subkloon pRW 776 voor het opbouwen van vFP-26 beschreven. Subkloon pRW 776 bevat het 35 IBV-peplomeer-gen van 4 Kbp gevolgd door het matrix-gen met aan het 3’-einde één enkele plaats voor Eco RI. Alleen van de 5'- en 3’-einden van het ongeveer 4 Kbp grote IBV-peplomeer-gen werden de nucleotidenvolgorden bepaald. Een enkele Xba I-plaats scheidt de twee genen. Het 5’-einde van het peplomeer-gen bevat, beginnende bij ¢820679 ; - 49 - het begincodon (ATC) van de vertaling de volgende nucleotiden (met de Rsa I-plaats onderstreept): ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC De eerder beschreven promotor H6 werd met een synthetisch oligonucleo-5 tide aan het peplomeer-gen gekoppeld. Het synthetische oligonucleotide bevatte de promotorreeks H6 vanaf zijn Nru I-plaats via het ATG tot in de voor het peplomeer coderende reeks tot aan zijn eerste Rsa I-plaats. Het oligonucleotide werd met voor Bam Hl en Eco RI aangrijp-bare einden gesynthetiseerd zodat het in pUC 9 ingebouwd kon worden,In Example XVIII, the infectious bronchitis virus (IBV) cDNA clone pIBVM 63 are Mass 41 and are. subclone pRW 776 for building vFP-26. Subclone pRW 776 contains the 4 Kbp IBV peplomer gene followed by the matrix gene with a single site for Eco RI at the 3 'end. Nucleotide sequences were determined only from the 5 'and 3' ends of the approximately 4 Kbp IBV peplomer gene. A single Xba I site separates the two genes. The 5 'end of the peplomer gene contains, starting at ¢ 820679; - 49 - the initial codon (ATC) of the translation the following nucleotides (with the Rsa I position underlined): ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC The previously described promoter H6 was coupled to the peplomer gene with a synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide contained the promoter series H6 from its Nru I site through the ATG into the peplomer encoding series up to its first Rsa I site. The oligonucleotide was synthesized with ends engageable for Bam HI and Eco RI so that it could be incorporated into pUC 9,

10 wat pRW 768 gaf. Het uiteinde voor Eco RI was 3' ten opzichte van de plaats voor Rsa I. Beginnende met het voor Bam Hl aangrijpbare einde was de structuur van het dubbelstrengige synthetische oligonucleotide (met het ATG onderstreept): GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGTAACACCTCTT 15 AGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAACCATTGTGGAGAA10 which gave pRW 768. The tip for Eco RI was 3 'to the location for Rsa I. Beginning with the Bam Hl-engageable end, the structure of the double-stranded synthetic oligonucleotide (with the ATG underlined) was: GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGGACCATTACTATT 15 AGCGTCACTATT AGCGTACTATT

TTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACG AATGATCACTGAGAAAACACACATGCTTAATTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACG AATGATCACTGAGAAAACACACATGCTTAA

Het door gedeeltelijke vertering van pRW 768 met Rsa I verkregen produkt werd na isoleren met Eco RI opnieuw bewerkt. Het fragment 20 van pRW 768 dat op de bovengenoemde Rsa I-plaats ëën enkele door snijding had en met Eco RI opnieuw geknipt was werd geïsoleerd, met fosfatase behandeld en als vector voor het hierna te beschrijven verteringsprodukt van pRW 776 gebruikt.The product obtained by partial digestion of pRW 768 with Rsa I was reprocessed after isolation with Eco RI. The fragment 20 of pRW 768 which had single sections at the above Rsa I sites and was cut again with Eco RI was isolated, treated with phosphatase and used as vector for the digest product of pRW 776 to be described below.

• Het door gedeeltelijke vertering met Rsa I opengeknipte 25 produkt van pRW 776 werd opnieuw bewerkt met Eco RI. Het 5 Kbp grote fragment van pRW 776 dat vanaf de bovengenoemde Rsa I-plaats tot aan de Eco RI-plaats liep werd geïsoleerd; dit fragment bevat IBV-reek-sen vanaf de genoemde peplomeer-Rsa I-plaats tot aan de Eco RI-plaats aan het 3’-einde van het matrix-gen. Inbouw van dit fragment 30 van pRW 776 in de genoemde vector pRW 768 deed pRW 788 ontstaan. Het matrix-gen werd vanaf de eerder genoemde Xba I-plaats verwijderd.The product of pRW 776 cut open by partial digestion with Rsa I was reprocessed with Eco RI. The 5 Kbp fragment of pRW 776 that ran from the above Rsa I site to the Eco RI site was isolated; this fragment contains IBV sequences from said peplomer Rsa I site to the Eco RI site at the 3 'end of the matrix gene. Incorporation of this fragment of pRW 776 into said vector pRW 768 gave rise to pRW 788. The matrix gene was removed from the previously mentioned Xba I site.

De 5’-promotor H6 werd bij de Nru I-plaats toegevoegd door het afgestompte, 4 Kbp grote Nrs I/Bxa I-fragment van pRW 788 in de vector pRW 760 met stompe Nru U- en Bam HI-einden gevoegd, wat pRW 790 gaf.The 5 'promoter H6 was added at the Nru I site by the blunted, 4 Kbp large Nrs I / Bxa I fragment of pRW 788 in the vector pRW 760 with blunt Nru U and Bam HI ends, adding pRW 790 gave.

35 De vector pRW 760 is in voorbeeld XI beschreven; kort gezegd is het door koepok-H6 gepromoot influenza-nucleoproteïne dat door de niet-essentiële plaats f7 van FP-1 geflankeerd is. De vector pRW 760 werd gemaakt door aan het 3’-einde de H6 reeksen vanaf de Nru I-plaats tot en met het einde van het nucleoprotexne bij Bam Hl te 40 * verwijderen. pRW 790 is door H6 gepromoot IBV-peplomeer in de 8820679 / - 50 -The vector pRW 760 is described in Example XI; in short, it is influenza nucleoprotein promoted by cowpox-H6 flanked by the non-essential site f7 of FP-1. The vector pRW 760 was made by removing the H6 sequences from the Nru I site to the end of the nucleoprotex at Bam HI at the 3 'end. pRW 790 is H6 promoted IBV peplomer in the 8820679 / - 50 -

Hinc II-plaats van pRW 731.13. Recombinatie van het donorplasmide pRW 790 met: FP-1 gaf vFP-31.Hinc II site of pRW 731.13. Recombination of the donor plasmid pRW 790 with: FP-1 gave vFP-31.

Ittmunoprecipitatieproeven met CEF-lysaten die uit met vFP-31 geïnfecteerde cellen gemaakt waren lieten een specifiek neer-5 slaan van een klein beetje voorlopereiwit met èen molecuulgewicht van ongeveer 180.000 en van splitsingsprodukten met een MG van 90.000 zien.Micro-precipitation experiments with CEF lysates made from cells infected with vFP-31 showed specific precipitation of a small amount of precursor protein with a molecular weight of about 180,000 and of cleavage products with a MG of 90,000.

Voorbeeld XXExample XX

Opbouwen van een pluimveepokken-recombinant vFP-30 uit virus FP-1 10 die het D-gen van herpes simplex-virus tot expressie brengtConstruction of a poultry pox recombinant vFP-30 from virus FP-1 10 expressing the D gene of herpes simplex virus

Het D-gen voor het glycoproteïne van herpes simplex-virus (HSV) type 1 stam KOS werd op de Bam HI-plaats van pUC 9 als een 5’- Bam Hl gekoppeld Hpa II aan 3’-Bam Hl gekoppeld Nru I-fragment gekloond; het 5'-einde ligt naast de Pst I-plaats van het 15 pUC 9. De 5’-reeks van het HSV-gD is, beginnende bij het begincodon voor de vertaling (ATG) (met onderstreept de aangrijpingsplaats voor Nco I): ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTG- GGCCTCCATGG.The D gene for the glycoprotein of herpes simplex virus (HSV) type 1 strain KOS was linked at the Bam HI site of pUC 9 as a 5'-Bam Hl Hpa II to 3'-Bam Hl linked Nru I fragment cloned; the 5 'end is adjacent to the Pst I site of the 15 pUC 9. The 5' sequence of the HSV gD is, starting at the translation start codon (ATG) (with underlining the nco I entry site): ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCCCTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTG- GGCCTCCATGG.

20 De eerder beschreven koepok-promotor H6 werd met een synthetisch oligonucleotide aan het gD gen van HSV gekoppeld. Het synthetische oligonucleotide omvat het 3’-gedeelte van de promotor H6 vanaf Nru I via het ATG tot in de voor gD coderende reeks tot en met de aangrijpingsplaats voor Nco I. Het oligonucleotide werd met een aan-25 grijpingspunt voor Pst I aan het 5’-einde gesynthetiseerd. De gD- kloon in pUC 9 werd met Pst I en Nco I geknipt en de 5f-HSV-reeks werd verwijderd zodat het door het synthetische oligonucleotide vervangen kon worden, wat tot pRW 787 leidde. De structuur van dit dubbelstrengige synthetische oligonucleotide is: 30 GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTCAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC-CAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC GTCGATCTAATCCACGACAATAAAATAAACATCAATATCATCCTGAGGTAC Vertering van pRW 787 met Nru I en Bam Hl leidt tot een fragment 35 van ongeveer 1,3 Kbp dat de 3’-promotor H6 bevat vanaf de Nru I- plaats via de voor gD coderende reeks tot aan de Bam HI-plaats.The previously described cowpox promoter H6 was coupled to the HSV gD gene with a synthetic oligonucleotide. The synthetic oligonucleotide comprises the 3 'portion of the promoter H6 from Nru I via the ATG into the gD coding sequence up to the nco I site of engagement. The oligonucleotide was linked to a Pst I site of action. end synthesized. The gD clone in pUC 9 was digested with Pst I and Nco I and the 5f-HSV series was removed so that it could be replaced by the synthetic oligonucleotide, resulting in pRW 787. The structure of this double-stranded synthetic oligonucleotide is: 30 GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTCAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC-CAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC GTCGATCTAATCCACGACAATAAAATAAACATCAATATCATCCTGAGGTAC Digestion of pRW 787 with Nru I and Bam HI resulting in a fragment 35 of about 1.3 Kbp containing the 3 'H6 promoter from Nru I- place through the gD coding sequence up to the Bam HI site.

De vector pRW 760, met Nru I en Bam Hl bewerkt, is reeds in voorbeeld XI beschreven. Invoegen van het fragment van 1,3 Kbp in de vector pRW 760 gaf pRW 791. De vector pRW 791 bevat het complete 40 door koepok-H6 gepromote gen voor HSV-gD in de niet-essentiële 8820679.’ - 51 - *The vector pRW 760, processed with Nru I and Bam HI, has already been described in Example XI. Insertion of the 1.3 Kbp fragment into the vector pRW 760 gave pRW 791. The vector pRW 791 contains the complete 40 cowpok-H6 promoted gene for HSV gD in the non-essential 8820679. "- 51 - *

Hinc II-plaats van FP-1 in pRW 731.13 (plek f7).Hinc II site of FP-1 in pRW 731.13 (spot f7).

Recombinatie van het donorplasmide pRW 791 met FP-1 leidde tot vFP-30. Oppervlakte-expressie van het glycoprotelne werd in recombinant-plaques vastgesteld in een immunoessaai op 5 basis van aan β-galactosidase gekoppeld eiwit A en voor HSV-1 specifieke sera.Combination of the donor plasmid pRW 791 with FP-1 resulted in vFP-30. Surface expression of the glycoprotein was determined in recombinant plaques in an immune seed based on protein β-galactosidase coupled to HSV-1 specific sera.

Voorbeeld XXIExample XXI

Gebruik van entomopox-promotoren voor het regelen van de expressie van vreemde genen in pokkenvirus-vectoren 10 (a) Achtergrond. Pokkenvirussen van insecten (entomopox) worden tegenwoordig tot de onderfamilie Entomopoxvirinae gerekend, welke verder onderverdeeld wordt in drie geslachten A, B en C overeenkomende met entomopox-virussen die respectievelijk uit de insectenordes Coleoptera, Lepidoptera en Orthoptera geïsoleerd zijn.Use of entomopox promoters to control expression of foreign genes in pox virus vectors 10 (a) Background. Insect poxviruses (entomopox) are today part of the subfamily Entomopoxvirinae, which is further divided into three genera A, B and C corresponding to entomopox viruses isolated from the insect orders Coleoptera, Lepidoptera and Orthoptera, respectively.

10 Entomopox-virussen hebben in de natuur een beperkte keuze aan gast heren en hun vermenigvuldiging in gewervelden is niet bekend.Entomopox viruses have a limited choice of hosts in nature and their multiplication in vertebrates is unknown.

Het bij dit onderzoek gebruikte entomopox-virus was aanvankelijk geïsoleerd uit geïnfecteerde larven van Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) uit India. (Roberts en Granados in 15 J. Intertebr. Pathol. 12^ (1968) 141-143). Het virus, aangeduid als AmEPV, is de type-soort van het geslacht B.The entomopox virus used in this study was initially isolated from infected larvae of Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) from India. (Roberts and Granados in 15 J. Intertebr. Pathol. 12 ^ (1968) 141-143). The virus, referred to as AmEPV, is the type species of the genus B.

AmEPV van het wilde type werd verkregen van Dr. R.Wild type AmEPV was obtained from Dr. R.

Granados (Boyce Thompson Institute van de Cornell University) als infectieuze hemolymfe van geïnfecteerde larven van Estigmene acrea.Granados (Boyce Thompson Institute of Cornell University) as an infectious hemolymph of infected larvae of Estigmene acrea.

20 Het virus bleek zich voort te planten in een ongewervelden-cel- lijn IPLB-LD652Y, afgeleid van ovariumweefsel van Lymantria dispar (de zigeunermot) (beschreven door Goodwin c.s. in In Vitro 14 (1978) 485-494. De cellen werden bij 28°C gekweekt in medium IPL-528 aangevuld met 4 % foetaal kalver- en 4 % kuiken-serum.The virus was found to reproduce in an invertebrate cell line IPLB-LD652Y, derived from ovarian tissue of Lymantria dispar (the gypsy moth) (described by Goodwin et al in In Vitro 14 (1978) 485-494. The cells were tested at 28 ° C grown in medium IPL-528 supplemented with 4% fetal calf and 4% chick serum.

25 Het wilde virus werd door plaquevorming uitgetest op LD652Y-cellen en één plaque, aangeduid als VI, werd er voor de volgende proeven uit genomen. Dit isolaat geeft laat in de infectie-cyclus talrijke insluitingslichamen (Iln) in het cytoplasma van de geïnfecteerde cellen.The wild virus was plaque-tested on LD652Y cells and one plaque, designated VI, was taken for the following experiments. This isolate produces numerous inclusion bodies (ILn) in the cytoplasm of the infected cells late in the infection cycle.

30 (b) Identificatie van de promotor. De identificatie en het karteren van een AmEPV-promotor gebeurde als volgt. Het totale RNA van laat geïnfecteerde LD652Y-cellen (48 uur na de infectie) 32 werd geïsoleerd en gebruikt om er een eerste streng met P gemerkt cDNA uit te maken. Het cDNA werd toen gebruikt om stippen met 35 0820679.(B) Identification of the promoter. The identification and mapping of an AmEPV promoter was done as follows. The total RNA from late infected LD652Y cells (48 hours after infection) 32 was isolated and used to generate a first strand of P-labeled cDNA. The cDNA was then used to spot 0820679.

- 52- res t riet iever ter ingen van het AmEPV-genoom af te tasten. Dit Southern-patroon liet een sterk signaal bij een Cla I-fragment van 2,6 kb zien, hetgeen aangeeft dat het fragment voor een sterk tot expressie komend gen codeert. Dit fragment werd in een plasmide ge-5 kloond en zijn DNA-volgorde werd vastgesteld.- 52- test reed to probe the AmEPV genome. This Southern pattern showed a strong signal at a 2.6 kb Cla I fragment, indicating that the fragment encodes a highly expressed gene. This fragment was cloned into a plasmid and its DNA sequence was determined.

Onderzoek van deze reeks liet een open af te lezen geval zien dat voor een polypeptide van 42 Kd codeert. In vitro vertaling van het totale RNA van 48 uur na de infectie en uiteenrafelen van de produkten met SDS-PAGE gaf een polypeptide van ongeveer 42 Kd 10 te zien.Examination of this series revealed an open-to-read case encoding a 42 Kd polypeptide. In vitro translation of the total RNA at 48 hours post-infection and digestion of the products with SDS-PAGE revealed a polypeptide of approximately 42 Kd 10.

(c) Opbouw van een recombinant-koepokvirus met expressie van een vreemd gen onder controle van de entomopox-promotor(c) Construction of a recombinant cowpox virus expressing a foreign gene under the control of the entomopox promoter

Om na te gaan of een entomopox-promotor in een pokkenvirus-15 systeem van een gewervelde zou functioneren werd het volgende plas mide opgebouwd. Chemisch werd een oligonucleotide gesynthetiseerd dat de 107 basen 5’ ten opzichte van het startsignaal voor vertalen van het 42K-gen af lag (hierna aangeduid als de AmEPV-42K-promotor) aan het 5’-einde geflankeerd door een aangrijpingsplaats voor Bgl II 20 en met de eerste 14 basen van het hepatitis E-virus voorafgaandeThe following plasmid was built up to determine whether an entomopox promoter would function in a vertebrate pox virus system. Chemically, an oligonucleotide was synthesized that was 107 bases 5 'to the 42K gene translation start signal (hereinafter referred to as the AmEPV-42K promoter) flanked at the Bgl II 20 site of engagement. and with the first 14 bases of the hepatitis E virus preceding

aan het voor S2 coderende gebied dat op een Eco RI-plaats eindigt aan het 3’-einde. De AmEPV-42K promotor heeft de volgende structuur: TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA 25 ATATGATAATATTTTGGGATTTGAAAto the S2 coding region that ends in an Eco RI site at the 3 'end. The AmEPV-42K promoter has the following structure: TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA 25 ATATGATAATTTTGGGATTTGAAA

ATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATG

De AmEPV-42K-promotor werd als volgt aan het oppervlakte-antigeen van het hepatitis B-virus (HBVsAg) gekoppeld. Er werd een plasmide pUC opgebouwd dat het oppervlakte-antigeen van hepatitis B-30 virus en een stuk voorafgaande aan het voor S2 coderende gebied be vat (het door Galibert c.s. in Nature 281 (1979) 646-650 beschreven type ayw), geflankeerd door koepokvirus-armen in het niet-essentiële gebied van het koepok-virus-genoom dat voor hemagglutinine (HA) codeert. (De HA-armen zijn in voorbeeld XV beschreven; het HA-gebied 35 door Shida in Virology 150 (1986) 451-462.) Het hierboven beschreven oligonucleotide werd met behulp van de ene plaats voor Eco RI in het voor HBVsAg coderende gebied en met die ene plaats voor Bgl II in de HA-koepokarm in dit plasmide ingebouwd. Het verkregen recombinant-koepokvirus kreeg de aanduiding vP547.The AmEPV-42K promoter was linked to the surface antigen of the hepatitis B virus (HBVsAg) as follows. A plasmid pUC was built containing the surface antigen of hepatitis B-30 virus and a section preceding the S2 coding region (the type ayw described by Galibert et al in Nature 281 (1979) 646-650), flanked by cowpox virus arms in the nonessential region of the cowpox genome encoding hemagglutinin (HA). (The HA arms are described in Example XV; the HA region 35 by Shida in Virology 150 (1986) 451-462.) The oligonucleotide described above was digested using the one site of Eco RI in the HBVsAg coding region and with that one site for Bgl II in the HA cow arm built into this plasmid. The resulting recombinant cowpox virus was designated vP547.

40 Dat de expressie van de voor HBVsAg coderende reeks onder 8820679.’ - 53 - onder controle van de entomopox 42K-promotor stond werd bevestigd met een immunoessaai. Gelijkwaardige kweken van de zoogdier-cellijn BSC-40 werden met het moeder-koepokvirus of met recombinant vP 547 geïnfecteerd; 24 uur na de infectie werden de cellen 5 gelyseerd en werd het lysaat in serie verdunning op een nitro- cellulosemembraan gebracht. Het membraan werd eerst met een 125 geitenserum tegen HBV geïncubeerd en daarna met I-eiwit A.40 That the expression of the HBVsAg coding sequence under 8820679. "- 53" was under the control of the entomopox 42K promoter was confirmed by an immunoassay. Equivalent cultures of the mammalian cell line BSC-40 were infected with the mother cowpox virus or with recombinant vP 547; 24 hours after infection, the cells were lysed and the lysate diluted serially on a nitrocellulose membrane. The membrane was first incubated with a 125 anti-HBV goat serum and then with I protein A.

Na uitwassen werd het membraan op een rontgen-film gelegd. Positieve signalen vond men bij de met vP 547 geïnfecteerde kweken 10 maar niet bij de met het moedervirus geïnfecteerde kweken, wat herkenning van de AmEPV-42K-promotor door het koepokvirus in de zoogdiercellen aangeeft.After washing, the membrane was placed on an X-ray film. Positive signals were found in the vP 547 infected cultures, but not in the mother virus infected cultures, indicating recognition of the AmEPV-42K promoter by the cowpox virus in the mammalian cells.

De bovengenoemde uitkomsten werden bevestigd met een Ausria-proef (zie voorbeeld I voor details) waarmee 15 men HVBsAg in geïnfecteerde zoogdiercellen kan vinden. Koepokvirus- recombinanten die het aan AmEPV-42K of aan de koepokvirus-promo-tor H6 gekoppelde gen voor HBsAg bevatten werden gebruikt om BSC-40-cellen te infecteren en de mate van expressie in het opper-vlakte-antigeen werd met de Ausria-proef vastgesteld. Zoals aan-20 gegeven in tabel XII laten de uitkomsten zien dat bij gebruik van de 42K-promotor de expressie van HBsAg belangrijk was.The above results were confirmed by an Ausria assay (see Example I for details) that allows one to find HVBsAg in infected mammalian cells. Cow virus recombinants containing the gene for HBsAg linked to AmEPV-42K or to the cow virus virus promoter H6 were used to infect BSC-40 cells and the extent of expression in the surface antigen was expressed with the Ausria- test established. As indicated in Table XII, the results show that when using the 42K promoter, expression of HBsAg was important.

Tabel XIITable XII

Expressie van HBVsAg in recombinant-koepokvirus Recombinant-virus Promotor Ausria P/N-verh.Expression of HBVsAg in Recombinant Cowpox Virus Recombinant Virus Promoter Ausria P / N-elev.

25 vP410 Blanco 1,0 vP481 H6 24,3 vP547 42K 44,925 vP410 Blank 1.0 vP481 H6 24.3 vP547 42K 44.9

Er werden nog meer proeven uitgevoerd om de tijdelijke aard van de regeling van de AmEPV-42K-promotor 30 op de achtergrond van een pokkenvirus voor gewervelden zeker te stellen. Gelijkwaardige kweken van BSC-40-cellen werden met vP 547 geïnfecteerd in aan- of afwezigheid van 40 ^g/ml cytosine-arabinoside, een remmer van de DNA-vermeerdering dat de late vertaling van het virus dus blokkeert. De mate van expressie 24 uur 35 na de infectie werd met een Ausria-proef gemeten. De uitkomsten laten zien dat de 42K-promotor in het vermeerderingssysteem van een koepokvirus als vroege promotor herkend werd.Additional tests were conducted to ensure the transient nature of the control of the AmEPV-42K promoter 30 against a vertebrate pox virus. Equivalent cultures of BSC-40 cells were infected with vP 547 in the presence or absence of 40 µg / ml cytosine arabinoside, an inhibitor of DNA proliferation thus blocking the late translation of the virus. The degree of expression 24 hours after the infection was measured with an Ausria test. The results show that the 42K promoter was recognized as an early promoter in the cow virus propagation system.

Merk op dat het gebruik van de AmEPV-42K-promotor voor de expressie van vreemde genen in een zoogdier- 8$ 2 0679.’ - 54 - F - 9 systeem duidelijk verschillend is van het gebruik van de NPV-polyhedrlne-promotor uit Autographa californica voor de expressie van genen in ongeweryelden-systemen (Luekow en Summers in Biotechnology 6 (1988) 47-55). De polyhedrine-promotor wordt niet 5 herkend door het vertalingsapparaat in zoogdiercellen (Tjla c.s.Note that the use of the AmEPV-42K promoter for the expression of foreign genes in a mammalian system is clearly different from the use of the NPV polyhedrine promoter from Autographa. californica for the expression of genes in non-vendor systems (Luekow and Summers in Biotechnology 6 (1988) 47-55). The polyhedrine promoter is not recognized by the translation device in mammalian cells (Tjla et al.

in Virology 125 (1983) 107-117). Het gebruik van de AmEPV-42K-promotor in zoogdiercellen betekent dat voor de eerste keer een promotor van een insectenvirus gebruikt werd voor de expressie van vreemde genen in een niet uit insecten afkomstige virusvec-10 tor in cellen die niet van ongewervelden zijn.in Virology 125 (1983) 107-117). The use of the AmEPV-42K promoter in mammalian cells means that for the first time, an insect virus promoter was used for the expression of foreign genes in a non-insect virus vector in non-invertebrate cells.

Om vast te stellen of vogelpokkenvirussen de 42K-entomopox-promotor ook herkennen werd de volgende proef uitgevoerd. Identieke kweken van CEF-cellen werden beent met 10 pfu per cel aan pluimveepokkenvirus, kanariepokkenvirus of koepok-15 virus, en tegelijkertijd getransfecteerd met 25 jig van één der volgende plasmiden: 1) plasmide 42K.17 dat de reeks voor het óppervlakte-antigeen van het HBV en het stuk voorafgaande aan het voor S2 coderende gebied bevat, of 2) het plasmide pMP15.spsP dat dezelfde voor HBVsAg coderende reeks bevat gekoppeld aan de 20 eerder beschreven koepokvirus-promotor H6. Na 42 uur werden de kweken bevroren, de cellen gelyseerd en het lysaat met een Ausria-proef (zie voorbeeld I) op de aanwezigheid van HBVsAg onderzocht.To determine whether fowlpox viruses also recognize the 42K entomopox promoter, the following test was performed. Identical cultures of CEF cells were seeded at 10 pfu per cell of poultry pox virus, canary pox virus, or cow pox virus, and simultaneously transfected with 25 µg of one of the following plasmids: 1) plasmid 42K.17 containing the surface antigen sequence of the HBV and the stretch prior to the S2 coding region, or 2) the plasmid pMP15.spsP containing the same HBVsAg coding sequence linked to the previously described cowpox virus promoter H6. After 42 hours, the cultures were frozen, the cells lysed and the lysate tested for the presence of HBVsAg with an Ausria assay (see Example I).

De in tabel XIII getoonde resultaten moet men kwalitatief interpreteren. Ze geven aan dat zowel het vertalings-25 apparaat van pluimveepokken als dat van kanariepokken in staat is de 42K-promotor te herkennen en de daaraan gekoppelde reeks die voor HBVsAg codeert mee vertaalt. Hoewel de maten van ex- . pressie lager zijn dan wat men met de koepok-promotor H6 verkrijgt liggen ze duidelijk boven de achtergrondwaarden die men 30 met de negatieve blanco's verkrijgt.The results shown in Table XIII must be interpreted qualitatively. They indicate that both the poultry pox and canary pox translation devices are able to recognize the 42K promoter and co-translate the associated sequence encoding HBVsAg. Although the sizes of ex-. lower than what is obtained with the cowpox promoter H6, they are clearly above the background values obtained with the negative blanks.

Tabel XIIITable XIII

Herkenning van de 42K-entomopox-promotor door pluimveepokkenvirusRecognition of the 42K entomopox promoter by poultry pox virus

Virus Promotor P/N-verh.Virus Promoter P / N Rel.

35 Pluimveepokken 42K 39,1 H6 356,835 Poultry pox 42K 39.1 H6 356.8

Kanariepokken 42K 90,2 H6 222,2Canarypox 42K 90.2 H6 222.2

Koepokken 42K 369,4 H6 366,9Cowpox 42K 369.4 H6 366.9

Niets 42K 7,8Nothing 42K 7.8

Niets H6 7,2 88 2WS1: - 55 -Nothing H6 7.2 88 2WS1: - 55 -

Voorbeeld XXIIExample XXII

Immunisering met VCP-16 om muizen tegen levend rabies-virus te beschermenImmunization with VCP-16 to protect mice against live rabies virus

Groepen van 20 muizen van 4 tot 6 weken oud werden 5 in hun voedsel beënt met 50 tot 100 jil van een reeks verdunningen van één der twee recombinanten: (a) de in voorbeeld VI beschreven pluimveepokken-rabies-recombinant vFP-6, en (b) de in voorbeeld XIII beschreven kanariepokken-rabies-recombinant vCP-16. Na 14 dagen werden 10 muizen van elke groep opgeofferd en werd hun 10 serum opgevangen. De titer van het serum tegen rabies werd be rekend met de eerder in voorbeeld VII beschreven SFFR-proef. De overige 10 muizen van elke groep werden uitgedaagd met een intra-cerebrale beënting met de in voorbeeld VII gebruikte rabies-stam CVS. Elke muis kreeg 30 jil, wat overeenkwam met 16 maal de 15 LD^q voor de muis. Na 28 dagen keek men hoeveel muizen er nog in leven waren en werd de beschermende dosis voor 50 % (BD^q) berekend. De uitkomsten staan in tabel XIV.Groups of 20 mice, 4 to 6 weeks old, were inoculated in their food with 50 to 100 µl of a series of dilutions of one of the two recombinants: (a) the poultry pox rabies recombinant vFP-6 described in Example VI, and ( b) the canarypox rabies recombinant vCP-16 described in Example XIII. After 14 days, 10 mice from each group were sacrificed and their 10 serum collected. The anti-rabies serum titer was calculated in the SFFR assay described previously in Example VII. The remaining 10 mice of each group were challenged with an intra-cerebral inoculation with the rabies strain CVS used in Example VII. Each mouse received 30 µl, which corresponded to 16 times the 15 LD ^ q for the mouse. After 28 days, it was checked how many mice were alive and the protective dose was calculated for 50% (BD ^ q). The results are shown in Table XIV.

De mate van bescherming der muizen bij beënting met vFP-6 bevestigen de in voorbeeld VII besproken uitkomst van het 20 beënten met de pluimveepokken-recombinant vFP-3. De mate van bescherming bij beënting met vCP-16 is aanzienlijk hoger. Op basis van de berekende BD^q is de kanariepokken-rabies-recombinant 100 maal zo sterk in de bescherming tegen rabies als de pluimvee-pofcken-rabies-recombinant.The degree of protection of mice upon inoculation with vFP-6 confirms the outcome of inoculation with the poultry pox-recombinant vFP-3 discussed in Example VII. The degree of protection when inoculated with vCP-16 is significantly higher. Based on the calculated BD ^ q, the canarypox rabies recombinant is 100 times stronger in protection against rabies than the poultry rabies rabies recombinant.

25 Tabel XIVTable XIV

Beschermende immuniteit tegen rabies-virus uitgelokt door twee pluimveepokken-rabies-recombinantenProtective immunity against rabies virus elicited by two poultry rabies rabies recombinants

Pluimveepokken vFP-6 Kanariepokken vCP-16 30 _Poultry pox vFP-6 Canary pox vCP-16 30 _

Beëntings- SFFR- Mate van Beëntings- SFFR- Mate van dosis_titer_overleven_dosis_titer_overleven 7,5a 2,3b 7/10 6,5 2,5 10/10 5.5 1,8 5/10 4,5 1,9 8/10 35 3,5 0,7 0/10 2,5 1,1 1/10 1.5 0,6 0/10 0,5 0,4 0/10 1 PD50 =6,17 1 PD50 = 4,18 40 · 8820679/ ψ - 56 - a Virus-titers opgegeven als ^log van de TCIDsn 10 b Opgegeven is de log van de verste serumverdunning · die bij een SFFR-proef het aantal fluorescerende putjes nog met meer dan 50 % vermindert.Inoculation SFFR- Degree of Inoculation SFFR- Degree of dose_titer_overleven_dose_titer_overleven 7.5a 2.3b 7/10 6.5 2.5 10/10 5.5 1.8 5/10 4.5 1.9 8/10 35 3, 5 0.7 0/10 2.5 1.1 1/10 1.5 0.6 0/10 0.5 0.4 0/10 1 PD50 = 6.17 1 PD50 = 4.18 408820679 / ψ - 56 - a Virus titers reported as ^ log of the TCIDsn 10 b The log of the freshest serum dilution, which reduces the number of fluorescent wells by more than 50% in an SFFR test.

55

Voorbeeld XXIIIExample XXIII

Gebruik van pluimveepokken-promotorelementen bij de expressie van vreemde genen I. Identificatie van het pluimveepokken-gen dat Voor 10 een produkt van 25»8 kilodalton codeert.Use of poultry pox promoter elements in the expression of foreign genes I. Identification of the poultry pox gene encoding a product of 25-8 kilodaltons.

Zichtbaarmaken van eiwitten in lysaten van met pluim- veepokken FP-1 geïnfecteerde CEF-cellen door aankleuren van SDS-polyacrylamide-gelen met Koomassie-brilliant-blauw liet een royaal voorkomende soort met een schijnbaar molecuulgewicht van 15 25,8 KD zien. Dit eiwit was niet aanwezig in lysaten van niet 35 geïnfecteerde cellen. Pulsproeven met S-methionine voor het radioactief merken van op bepaalde tijden na de infectie gesynthetiseerde cellen lieten weer het royale voorkomen van het door FP-1 uitgelokte eiwit zien en toonden aan dat het tussen 6 uur en 20 54 uur na de infectie gesynthetiseerd wordt. In zijn piekuur is dit FP-1 eiwit van 25,8 KD goed voor ongeveer 5 tot 10 % van het totale eiwit van het cellysaat.Visualization of proteins in lysates of poultry pox FP-1 infected CEF cells by staining SDS polyacrylamide gels with Koomassie brilliant blue showed a generous species with an apparent molecular weight of 25.8 KD. This protein was not present in lysates from uninfected cells. Pulse tests with S-methionine for radiolabelling cells synthesized at certain times post-infection again showed the abundance of the FP-1-elicited protein and demonstrated that it is synthesized between 6 hours and 54 hours post-infection. At its peak hour, this 25.8 KD FP-1 protein accounts for about 5 to 10% of the total protein of the cell lysate.

De overvloed aan door FP-1 uitgelokt eiwit van 25.8 KD suggereerde dat het gen dat voor dit eiwit codeert door 25 een sterk promotorelement uit FP-1 geregeld wordt. Om dit pro- motorelement voor later gebruik bij de expressie van vreemde genen in pokkenvirus-recombinanten te lokaliseren werd een poly-soom-preparaat uit met FP-1 geïnfecteerde CEF-cellen 54 uur na de infectie verkregen. Uit dit polysoom-preparaat werd het RNA 30 geïsoleerd en bij in vitro gebruik voor het programmeren van een vertalingssysteem voor konijnen-reticulocyten deed het overwegend het FP-l-eiwit van 25,8 KD ontstaan.The abundance of FP-1 elicited protein of 25.8 KD suggested that the gene encoding this protein is regulated by a strong promoter element from FP-1. To locate this promoter element for later use in the expression of foreign genes in poxvirus recombinants, a polysome preparation was obtained from FP-1 infected CEF cells 54 hours after infection. The RNA 30 was isolated from this polysome preparation and used in vitro to program a rabbit reticulocyte translation system predominantly gave rise to the 25.8 KD FP-1 protein.

Het polysoom-ENA werd ook als matrix gebruikt voor de synthese van een eerste streng cDNA met oligo-dT-12-18 als 35 eerste aangrijpingspunt. Deze eerste cDNA-streng werd als hybri- diseringssonde in een stippenanalyse volgens Southerm met verteringen van FP-1 gebruikt. De uitkomsten van dit hybridiserings-onderzoek geven de suggestie dat het gen dat voor het eiwit van 25.8 KD codeert ineen Hind Ill-fragment van 10,5 Kbp zat. Dit 8820679/ - 57 -The polysome-ENA was also used as a matrix for the synthesis of a first strand cDNA with oligo-dT-12-18 as the first target. This first cDNA strand was used as a hybridization probe in a Southerm spot analysis with digestions of FP-1. The results of this hybridization study suggest that the gene encoding the 25.8 KD protein was in a 10.5 Kbp Hind III fragment. This 8820679 / - 57 -

Hind Ill-fragment van het genoom werd vervolgens geïsoleerd en aan pBS (een vector uit de handel, van Stratagene te La Jolla,Hind III fragment of the genome was then isolated and attached to pBS (a commercial vector from Stratagene at La Jolla,

Ca.) gekoppeld en deze kloon kreeg de aanduiding pFP23k-l.Approx.) And this clone was designated pFP23k-1.

Verder hybridiseringsonderzoek met de eerste streng cDNA bij het 5 aftasten van verteringen van pFP23k-l lokaliseerde het gen voor de 25,8 KD op een Eco RV-subfragment van 3,2 Kbp. Het fragment werd verder in pBS gekloond en kreeg de aanduiding pFP23k-2.Further hybridization studies with the first strand cDNA when scanning for digestions of pFP23k-1 located the gene for the 25.8 KD on a 3.2 Kbp Eco RV subfragment. The fragment was further cloned into pBS and designated pFP23k-2.

In ongeveer 2,4 Kbp van dit Eco RV-fragment van FP-1 werd de volgorde bepaald met de dideoxy-ketenbeëindigings-10 methode van Sanger (Sanger c.s. in Proc. Natl. Acad. Sci. USAIn about 2.4 Kbp of this Eco RV fragment of FP-1, the sequence was determined by Sanger's dideoxy chain termination method (Sanger et al. In Proc. Natl. Acad. Sci. USA).

74 (1977) 5463-5467). Analyse van de volgorde liet een open af te lezen gebied zien dat voor een produkt met een molecuulgewicht van 25,8 KD codeert. Een beslissende vertaling in vitro van dit open afleesbare gebied door het polymerase van bacteriofaag T7 15 (van Stratagene te La Jolla, Ca.) in een vector pBS deed een soort RNA ontstaan dat bij gebruik voor het in vitro programmeren van een vertalingssysteem uit konijnenreticulocyten (van Pramega Biotec te Madison, Wi.) een polypeptide met een schijnbaar molecuulgewicht van 25,8 KD gaf. Dit polypeptide liep over 20 een SDS-polyacrylamide-gel gelijk op met het zo overvloedig in lysaten van met FP-1 geïnfecteerde CEF-cellen voorkomende eiwit van 25,8 KD. Dit resultaat suggereert dat dat het gen was dat voor het overvloedig door FP-I uitgelokte produkt van 25,8 KD codeert.74 (1977) 5463-5467). Sequence analysis revealed an open reading area encoding a product with a molecular weight of 25.8 KD. A decisive in vitro translation of this open readable region by the polymerase of bacteriophage T7 (from Stratagene of La Jolla, Ca.) into a vector pBS gave rise to a type of RNA which, when used for in vitro programming of a rabbit reticulocyte translation system ( from Pramega Biotec of Madison, WI.) gave a polypeptide with an apparent molecular weight of 25.8 KD. This polypeptide co-ran an SDS polyacrylamide gel with the 25.8 KD protein so abundant in lysates of FP-1 infected CEF cells. This result suggests that it was the gene encoding the abundant FP-I lured 25.8 KD product.

25 II. Gebruik van promotor-elementen bovenstrooms van het FP-l-gen voor het 25,8 KD-eiwit om het gen voor de omhulling van kattenleukemievirus (FeLV) in FP-1- en koepokvirus-recombinan-ten tot expressie te brengen25 II. Use of promoter elements upstream of the FP-1 gene for the 25.8 KD protein to express the feline leukemia virus (FeLV) envelope gene in FP-1 and cowpox recombinants

Uit pFP23k-2 werd een Eco RV/Eco RI-fragment van 30 270 bp geïsoleerd dat het gebied van FP-1 omvat dat het gen voor het eiwit van 25,8 KD reguleert (de FP-25,8 KD-promotor) en nog 21 bp van de reeks die voor de 25,8 KD zelf codeert. Hieronder staat de nucleotidenvolgorde van het FP-25,8 KD-promotor-gebied gebruikt om tot pFeLV25.8Fl en pFeLV25.81A te komen. Deze 35 reeks van 270 nucleotiden verschaft 249 nucleotiden van het gebied bovenstrooms van het begincodon (ATG) voor de 25,8 KD en de 21 eerste bp van de coderende reeks zelf.From pFP23k-2, a 270 bp Eco RV / Eco RI fragment was isolated which includes the region of FP-1 that regulates the gene for the 25.8 KD protein (the FP-25.8 KD promoter) and still 21 bp from the series encoding the 25.8 KD itself. Below is the nucleotide sequence of the FP-25.8 KD promoter region used to generate pFeLV25.8F1 and pFeLV25.81A. This 270 nucleotide sequence provides 249 nucleotides from the upstream region of the initial codon (ATG) for the 25.8 KD and the 21 first bp of the coding sequence itself.

8820 679 Γ - 58 - 5'-GATATCCCCATCTCTCCAGAACAGCAGCATAGTGTTAGGACAATCATCTAA- tgcaatatcatatatgaatctcactccgataggatacttaccacagctattata- CCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTAT-ATGATGTCTATATTATAGTGAGTATATTATAAGTATGCGGGAATATCTTTGATT-5 TAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTAAATATAGGCAATGGATAGCATAAATGAA- TTC-3'Γ 8820 679 - 58 - 5'-GATATCCCCATCTCTCCAGAACAGCAGCATAGTGTTAGGACAATCATCTAA- tgcaatatcatatatgaatctcactccgataggatacttaccacagctattata- CCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTAT-ATGATGTCTATATTATAGTGAGTATATTATAAGTATGCGGGAATATCTTTGATT-5 TAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTAAATATAGGCAATGGATAGCATAAATGAA- TTC-3 '

Van dit fragment werden de uiteinden stomp gemaakt en toen werd het ingebouwd in een met Sma I verteerde FP-1-inbouwvector (pFeLVFl, zie voorbeeld XV) die de reeksen voor de 10 omhulling van FeLV bevatte. Deze inbouwvector maakte de recombi- natie op de f7-plaats van het FP-l-genoom mogelijk. Inbouwen van de FP25,8 KD-promotor bovenstrooms (5* ten opzichte van) het gen voor de FeLV-omhulling en de juiste oriëntatie werden door een bepaling van de volgorde bevestigd. Dit inbouwen geeft geen 15 perfecte vervanging van ATG door ATG, door het gen voor de 25,8 KD verschafte ATG staat niet in lijn met het ATG voor de FeLV-omhulling, zodat er geen versmeltingseiwit ontstaat. Het FP-1-inbouwplasmide met daarin de FP-25,8 KD-promotor bovenstrooms van het gen voor de FeLV-omhulling kreeg de aanduiding pFeLV25,88F1. 20 Net zo'n constructie werd gemaakt uit de koepok- virus-inbouwvector pFeLVIA, die het FeLV-gen herbergt (zie voorbeeld XV). De promotor H6 werd door verteren met Bgl II en Sma I uit het pFeLVIA geknipt. Na afstompen van de Bgl Il-re-strictieplaats werd het afgestompte Eco RV/Eco RI-fragment van 25 270 bp, met daarin de FP-25,8 KD promotor zodanig ingevoegd dat het 5' ten opzichte van het gen voor de FeLV-omhulling stond.This fragment was blunt ended and then incorporated into a Sma I digested FP-1 insert vector (pFeLVF1, see Example XV) containing the FeLV envelope sequences. This insertion vector allowed the recombination at the f7 site of the FP-1 genome. Incorporation of the FP25.8 KD promoter upstream (5 * relative to) the FeLV envelope gene and proper orientation were confirmed by sequence determination. This incorporation does not provide a perfect replacement of ATG by ATG, ATG provided by the gene for the 25.8 KD is not in line with the ATG for the FeLV envelope, so that no fusion protein is formed. The FP-1 insertion plasmid containing the FP-25.8 KD promoter upstream of the FeLV envelope gene was designated pFeLV25.88F1. A similar construction was made from the cowpox virus insert vector pFeLVIA, which harbors the FeLV gene (see example XV). The promoter H6 was excised from the pFeLVIA by digestion with Bgl II and Sma I. After blunting the Bgl II restriction site, the blunted 25 270 bp Eco RV / Eco RI fragment containing the FP-25.8 KD promoter was inserted such that it was 5 'to the gene for the FeLV- sheathing.

De constructie werd door bepalen van de volgorde bevestigd.The construction was confirmed by determining the sequence.

Er is ook in deze recombinant geen perfecte vervanging van ATG door ATG, het ATG uit het gen voor 25,8 KD staat niet in lijn 30 met het ATG uit het FeLV-gen. De inbouwvector van het koepok- virus (Köpenhagen-stam) die het bovenstroomse deel van het gen voor de 25,8 KD 5' ten opzichte van het FeLV-gen bevatte kreeg de aanduiding pFeLV25,81A.Also in this recombinant there is no perfect replacement of ATG by ATG, the ATG from the gene for 25.8 KD is not in line with the ATG from the FeLV gene. The cowpox virus (Köpenhagen strain) insertion vector containing the upstream portion of the gene for the 25.8 KD 5 'to the FeLV gene was designated pFeLV25.81A.

De inbouwplasmiden pFeLV25,8Fl en pFeLV25,81A wer-35 den gebruikt voor in vitro recombinatie met FP-1 (pFeLV25,8Fl) en met de Kopenhagen-stam van het koepokvirus (pFeLV25,81A) als opvangende virussen. De nakomelingen van de recombinatie werden op de geëigende monolagen uitgeplaat en recombinant-virussen werden er met een immunoschermproef met aan 8-galactosidase ge- 0820673; - 59 - % koppeld eiwit A en met een runderserum tegen FeLV (van Antibodies, Inc. te Davis, Ca.) uitgehaald. De eerste resultaten wekken de suggestie dat de promotor voor 25,8 KD de expressie van vreemde genen in pokkenvirus-recombinanten kan regelen.The insertion plasmids pFeLV25.8F1 and pFeLV25.81A were used for in vitro recombination with FP-1 (pFeLV25.8Fl) and with the Copenhagen strain of cowpox virus (pFeLV25.81A) as catch viruses. The progeny of the recombination were plated on the appropriate monolayers and recombinant viruses were applied in an immunoscreen test with 8-galactosidase 0820673; 59% coupled protein A and removed with an anti-FeLV bovine serum (from Antibodies, Inc. of Davis, Ca.). Initial results suggest that the 25.8 KD promoter can control expression of foreign genes in poxvirus recombinants.

5 Voorbeeld XXIV5 Example XXIV

Veiligheid en doeltreffendheid van VFP-6 en VCP-16 in pluimvee Kuikenembryo's van 18 dagen oud, kuikens van 1 dag en kuikens van 28 dagen oud werden met de twee vogelpokken-recombinanten vFP-6 en vCP-16 (beschreven in voorbeelden VI en 10 XIII) beent en de respons van de vogels werd op drie kriteria beoordeeld: 1) invloed van de vaccinering op het uitkomen der eieren, op directe reacties en op mortaliteit, 2) de tegen rabies-glycoproteïne uitgelokte immuunrespons, en 3) de tegen pluimvee-pokken-antigenen uitgelokte immuunrespons. De uitgevoerde proe-15 ven worden hieronder beschreven.Safety and efficacy of VFP-6 and VCP-16 in poultry 18-day-old chick embryos, 1-day old chicks and 28-day old chickens were used with the two fowlpox recombinants vFP-6 and vCP-16 (described in Examples VI and 10). XIII) bone and the response of the birds was assessed on three criteria: 1) influence of the vaccination on the hatching of eggs, on direct reactions and on mortality, 2) the immune response elicited against rabies glycoprotein, and 3) the against poultry - smallpox antigens elicited immune response. The tests performed are described below.

A. Veiligheidsproeven. Groepen van 20 embryo*s van 18 dagen oud werden in de allantois·—holte beent met 3,0 of 4,0 x de ^log aan WKID^q van vFP-6 of vCP-16. Na het uitkomen lette men 14 dagen op de kuikens, waarna men er het bloed uit-20 tapte en men de sera verkreeg. De twee in de kuikenembryo*s ge ente recombinanten hadden geen effect op het uitkomen der eieren en de kuikens bleven tijdens de 14 dagen waarneming gezond.A. Safety tests. Groups of 20 18-day-old embryos were seeded in the allantois cavity with 3.0 or 4.0 x log of WKID ^ q of vFP-6 or vCP-16. After hatching, the chicks were watched for 14 days, after which the blood was drained and the sera obtained. The two recombinants inoculated in the chick embryos had no effect on hatching and the chicks remained healthy during the 14 day observation.

Groepen van 10 SPF kuikens van 1 dag oud werden intra-musculair beent met 3,0 x de WKID^q van elk der recombinanten.Groups of 10 1-day-old SPF chicks were boned intramuscularly with 3.0 x the WKID ^ q of each of the recombinants.

25 Men bleef de kuikens 28 dagen bekijken en serum-monsters werden 14 en 28 dagen na het beënten genomen. Met geen der twee recombinanten werd op de beëntingsplaats enige reactie waargenomen en de kuikens bleven tijdens de volle 28 dagen waarneming gezond.The chicks were kept under observation for 28 days and serum samples were taken 14 and 28 days after inoculation. No reaction was observed at the inoculation site with either of the two recombinants and the chicks remained healthy during the full 28 days of observation.

Groepctivan 10 kuikens van 28 dagen oud werden met 30 elk der recombinant-virussen beënt en kregen daarbij of intra- musculair 3,0 x de WKID^q of cutaan (in het vleugelvlies) 3,0 x de WKIDj-q. Men bleef de kuikens 28 dagen waarnemen en op 14 en 28 dagen na de beënting werden monsters genomen. Men geen der twee recombinanten werd na intramusculaire beënting enige reactie 35 gezien. Beënting via de huid leidde tot een heel kleine vaccinale reactie op pluimveepokken met pokken die heel verschillend van grootte waren. Beënting met kanariepokken leidde tot een normale huidschade op de inentingsplaats. Alle pokken waren tegen het einde van de proef teruggelopen.Group activan 10-day-old chicks were inoculated with each of the recombinant viruses and received either intramuscularly 3.0 x the WKIDj-q or cutaneous (in the hymen) 3.0x the WKIDj-q. The chickens were observed for 28 days and samples were taken 14 and 28 days after inoculation. Neither of the two recombinants showed any reaction after intramuscular inoculation. Inoculation through the skin led to a very small vaccine response to poxpox with smallpox that was very different in size. Canarypox inoculation led to normal skin damage at the vaccination site. All smallpox had receded by the end of the trial.

8820679.8820679.

- 60 - B. Immuunrespons- 60 - B. Immune response

De eerder in voorbeeld VII beschreven SFFR-proef werd gebruikt om de gehalten aan antilichamen tegen rabies-gluco-proteïne te bepalen. Bij iedere groep werden de uitkomsten uitge-5 drukt in het meetkundige gemiddelde van de titer van de afzonder lijke sera, met een standaardserum dat 23,4 Internationale Eenheden bevatte tot Internationale Eenheden herleid. Het minimum voor een positieve uitslag werd op ëën eenheid gesteld en dat werd gebruikt om het percentage positief reagerende vogels vast 10 te stellen. Antilichamen tegen het vogelpokkenvirus werden met de ELISA-methode beproefd, met de pluimveepokkenvirus-stam als antigeen. Ieder serum-monster werd 1:20 en 1:80 verdund. Met de positieve en negatieve sera werd een ijklijn opgesteld. Het minimum gehalte voor een positieve uitslag werd berekend en ook 15 het gemiddelde van de verschillende waarden der negatieve sera, met daarbij twee standaard-deviaties.The SFFR assay described previously in Example VII was used to determine the levels of antibodies to rabies gluco protein. For each group, the results were expressed in the geometric mean of the titer of the individual sera, with a standard serum containing 23.4 International Units converted to International Units. The minimum for a positive result was set to one unit which was used to determine the percentage of positive responding birds. Antibodies against the fowlpox virus were tested by the ELISA method, using the poultry poxvirus strain as antigen. Each serum sample was diluted 1:20 and 1:80. A calibration curve was drawn up with the positive and negative sera. The minimum content for a positive result was calculated and also the average of the different values of the negative sera, with two standard deviations.

De uitkomsten van dit serologische overzicht staat voor vFP-6 in tabel XV en voor vCP-16 in tabel XVI.The results of this serological overview represent vFP-6 in Table XV and vCP-16 in Table XVI.

Met embryo’s die met vFP-6 of met vCP-16 tegen zowel 20 rabies- als pluimveepokken-antigenen ingeënt waren werd maar een beperkte serologische respons waargenomen. De pluimveepokken-vector lokte in een groter aantal vogels een serologische respons tegen beide antigenen uit dan de kanariepokken, maar de respons was ook nog heterogeen.Only limited serological response was observed with embryos vaccinated with vFP-6 or with vCP-16 against both 20 rabies and poultry pox antigens. The poultry pox vector elicited a serological response to both antigens in a greater number of birds than the canary pox, but the response was also heterogeneous.

25 Kuikens die ëën dag oud met vFP-6 beent waren hadden een goede serologische respons, alle vogels waren 28 dagen na de beënting seropositief tegen zowel rabies- als tegen pluimveepokken-antigenen. De respons op beënting met vCP-16 was veel lager, 40 % der vogels was na 28 dagen seropositief voor rabies-glyco-30 proteïne en 10 % voor vogelpokken-antigenen.Chicks that were one day old with vFP-6 had a good serological response, all birds were HIV positive 28 days after inoculation against both rabies and poultry pox antigens. The response to inoculation with vCP-16 was much lower, 40% of the birds were seropositive for rabies glyco-30 protein after 28 days and 10% for fowlpox antigens.

Kuikens die 28 dagen oud intramusculair met vFP-6 beënt waren vertoonden 14 dagen later een reactie van 100 %. Hoewel de meerderheid der vogels ook na huidbeënting seropositief was waren de bereikte titers veel lager, zowel met rabies als met 35 vogelpokken. Net als te voren vertoonden kuikens die zowel intra musculair als in de huid met vCP-16 beënt waren een variabele respons, met een maximum van 70 % seropositief voor rabies na intramusculaire beënting. Het lage gehalte aan vogelpokken-antigenen na beënting met kanariepokken kan verband houden met de 40 serologische verwantschap tussen de virussen.Chicks 28 days old intramuscularly inoculated with vFP-6 showed a 100% response 14 days later. Although the majority of the birds were seropositive even after skin grafting, the titers achieved were much lower, both with rabies and with 35 smallpox. As before, chicks vaccinated both intra-muscularly and in-skin with vCP-16 showed a variable response, with a maximum of 70% seropositive for rabies after intramuscular inoculation. The low content of bird pox antigens after canarypox inoculation may be related to the serological relationship between the viruses.

8820679.' - 61 - ♦8820679. " - 61 - ♦

De uitkomsten laten zien dat zowel vFP-6 als vCP-16 veilig zijn om er kuikens met heel uiteenlopende leeftijden mee te beënten. De pluimveepokken-vector vFP-6 schijnt de meer efficiënte te zijn voor het uitlokken van een immuunrespons in 5 kuikens. Van belang is echter dat heide recombinant-vogelpokken- virussen, pluimveepokken en kanariepokken, nuttig bleken te zijn bij immuniseren in ovum.The results show that both vFP-6 and vCP-16 are safe for inoculating chicks of very different ages. The poultry pox vector vFP-6 appears to be the more efficient for eliciting an immune response in 5 chickens. Importantly, however, heather recombinant fowlpox viruses, poultry pox and canary pox proved to be useful in immunization in ovum.

10 8820679.10 8820679.

- 62 - ö cd- 62 - ö cd

Hi 1 f> in οί -4· t-~- co r-tr-t •H (J« MN on HN οίνο d) <| r-4 r-4 CM enen i-li-l ^ ζ/3 ΛΛΛΛ ΛΛ Λ Λ «45 4<ί ·Η H O O O O oo ooHi 1 f> in οί -4 · t- ~ - co r-tr-t • H (J «MN on HN οίνο d) <| r-4 r-4 CM ones i-li-l ^ ζ / 3 ΛΛΛΛ ΛΛ Λ Λ «45 4 <ί · Η H O O O O oo oo

I OPI OP

PM ft 0) WPM ft 0) W

Pm <D pi .Pm <D pi.

> a) α) >t} w % ïh ^2 O) ·Η Ö g> a) α)> t} w% ïh ^ 2 O) · Η Ö g

Ö pl M <UÖ pl M <U

Irl <—I (50 cu ‘ pm t—i &«&·? 6Ό 6-s jj n) p o +j ai ·* vo o o oo oo ft f3 d) in si· o oo oooIrl <—I (50 cu "pm t — i &« & ·? 6Ό 6-s yy n) p o + j ai · * vo o o oo oo ft f3 d) in si · o oo ooo

p, CÖ i“H i—l t—1 i>Hp, CÖ i “H i — l t — 1 i> H

O < 4JO <4J

0 <u >5 . β τ—f ft0 <u> 5. β τ — f ft

(50 (U(50 (U

1 (501 (50

(0 CU(0 CU

CU 4-1CU 4-1

•rl CORl CO

pO P3 HpO P3 H

cd 0) dl Wcd 0) part W.

Ml β (50 HMl β (50H

\ cd O ÈO 6^ &·« 6«S &·? 6Ό ΕΌ\ cd O ÈO 6 ^ & · «6« S & ·? 6Ό ΕΌ

pi rC i> i—Ipi rC i> i — I

<u Ό V Φ LiO O O O oo oo 42 ·η ·η pi Μι /Λ η co 05 ο οο οσι 4^ *rl r-4 ΙΗ 0) '—I’—I’—Ip-4 Ο +j -Η (U Ό 4-> PM MM 4-1 4-> d)<u Ό V Φ LiO OOO oo oo 42 · η · η pi Μι / Λ η co 05 ο οο οσι 4 ^ * rl r-4 ΙΗ 0) '—I' — I'— Ip-4 Ο + j -Η (U Ό 4-> PM MM 4-1 4-> d)

0) CU pj ON E0) CU pj ON E

0) CU <3 Ml0) CU <3 Ml

> H PM> H PM

β : Oβ: O

•rl CU O• rl CU O

P Φ i>p CUP Φ i> p CU

i—I pi i—! *0 Hi — I pi i—! * 0 H

PM CU Ö0 Η HPM CU Ö0 Η H

ft I 01 > tl o 01 ·0 » oo Is- o·ft I 01> tl o 01 · 0 »oo Is- o ·

XcUH d) HU Ml CM CO 00 CM Γ-» r-* Ό iftXcUH d) HU Ml CM CO 00 CM Γ- »r- * Ό ift

Ö(J f3 *t A AAÖ (J f3 * t A AA

rH <U i dl 43 β 4-1 Ο Ο .-M ^ CO CM .-4 OrH <U i dl 43 β 4-1 Ο Ο.-M ^ CO CM.-4 O

d) 4J CU cd CU ·Ηd) 4J CU cd CU · Η

43 4-1 PÜ (50 4J43 4-1 PÜ (50 4J

cd CO I -rl H Pi P) o PM Ö CD Cd CU i> (50cd CO I -rl H Pi P) o PM Ö CD Cd CU i> (50

Ml cd Pi r-NMl cd Pi r-N

CD Pi ·Η Pi MfCD Pi · Pi Mf

d) Pi 4J CU r4 .—Id) Pi 4J CU r4

pPjcu hu pi co <-oo -vt-oo -4roopPjcu hu pi co <-oo -vt-oo -4roo

U4<! ·π 0) cd + + Η N Η Μ H CMU4 <! Π 0) cd + + Η N Η Μ H CM

CD -rl -rl pi HUCD -rl -rl pi HU

•rl pl Η ·Η ^ CO CO• rl pl Η · Η ^ CO CO

M 41 oM 41 o

HH

0 Pi0 Pi

g /-Ng / -N

1 o § .in co ·ί n co co1 o § .in co · ί n co co

H CDQOOO O OH CDQOOO O O

•Η ΗΊ »—1 i-H «—I 1—H i—l co O g p ^ 8820679• Η ΗΊ »—1 i-H« —I 1 — H i — l co O g p ^ 8820679

Ml Ml rHMl Ml rH

•Η ·Η CU• Η · Η CU

HU cd HU cd 'Ö 60HU cd HU cd 'Ö 60

Pl H Pl H PJ PIPl H Pl H PJ PI

O 3 op) O CUO 3 on) O CU

HU O O HHU O O H

MM COPi Pl CD ïU CD Pi> P3 CU -dl CDOPlCOCUftlCO eU CU *rl OÜOPi β ft Μ) β ft (50 4-1 pm 4J >»cd cu oo cd cucdcd cu cd o) coMM COPi Pl CD ïU CD Pi> P3 CU -dl CDOPlCOCUftlCO eU CU * rl OÜOPi β ft Μ) β ft (50 4-1 pm 4J> »cd cu oo cd cucdcd cu cd o) co

d)-H Mi HU AicUPi 44 HU Mi 44 HU 42 CUd) -H Mi HU AicUPi 44 HU Mi 44 HU 42 CU

O CD 43 ·Η HU 4-1 Ή 4-1 ·Η ·Η Μι ο goo ρ) Ρ! Οοορί doopirH Ο PM W -Μ Wr4-H Μ cM "rl Μ Ν ·Η t> - 63 - 3 3 > k σι ffi pi <—i >—* vD UI N 10 CTi 00 r-' \£3 6^ <3 o o o o o o oo rt ζ/5»»ΛΛΛ ΛΛO CD 43 · Η HU 4-1 Ή 4-1 · Η · Η Μι ο goo ρ) Ρ! Doοορί doopirH Ο PM W -Μ Wr4-H Μ cM "rl Μ Ν · Η t> - 63 - 3 3> k σι ffi pi <—i> - * vD UI N 10 CTi 00 r- '\ £ 3 6 ^ <3 oooooo oo rt ζ / 5 »» ΛΛΛ ΛΛ

CU β M O O O O OO OOCU β M O O O O OO OO

^1 Ή i-l^ 1 Ή i-l

AJ WAJ W

O CDO CD

PU 3 fj CU 0) .PU 3 fj CU 0).

•H Ή *rf Μ Ή -jj• H Ή * rf Μ Ή -yy

^ Λ 3>S^ Λ 3> S

vO BvO B

^4 CÖ <U^ 4 CÖ <U

| W r-1 00| W r-1 00

Ö +J 3 6·« 6^5 B-« 6^5 fc'Sfr-S B-S B-SÖ + J 3 6 · «6 ^ 5 B-« 6 ^ 5 fc'Sfr-S B-S B-S

b. CO)b. CO)

w rj 3 <U in m O O OO OOw rj 3 <U in m O O OO OO

S <! CM CM r-l vO PI rtrlS <! CM CM r-l for PI rtrl

<U 00 4J<U 00 4J

β 0) d) M 4-1 8β 0) d) M 4-1 8

CUCU

4J 3 o cu4J 3 o cu

u Bu B

cu cö o .3 0 o co >> Ή Ή ;? r—i cu wcu cö o .3 0 o co >> Ή Ή;? r — i cu w

ÖO tH Ö0 MÖO tH Ö0 M

1 4J O1 4JO

S <j U > ^ 6^ &-ΐ B4! B-S 6-S B-S B-SS <j U> ^ 6 ^ & -ΐ B4! B-S 6-S B-S B-S

2 -o WCU^OOOOO OO OO2 -o WCU ^ OOOOO OO OO

rtn d)O4J -1-3- r^cn <ι·—ι j-i t-f 4-i g) 4-i oh ε c cw ϋrtn d) O4J -1-3- r ^ cn <ι · —ι j-i t-f 4-i g) 4-i oh ε c cw ϋ

(U di PU(U di PU

.M CU O.M CU O

^5 r-1 O^ 5 r-1 O

O ►» <UO ► »<U

O, <1) r-i Ό WO, <1) r-i Ό W

β) Ό ΜΗ H _β) Ό ΜΗ H _

,_i rT ld) ·ί σ 00-4 i—lO" <f H, _i rT ld) · ί σ 00-4 i-10 "<f H

Ki tj *» t—( «—I ·—4 CM vOCM COr-4Ki tj * »t— (« —I · —4 CM vOCM COr-4

w o! p. mu u ·>*·>· * * " _Tw o! p. mu u ·> * ·> · * * "_T

^ ö o -H -ri 0) O O O O OO O O^ ö o -H -ri 0) O O O O OO O O

r-i CO r-i ί S Wr-i CO r-i ί S W

il i C cd <li i-lil i C cd <li i-l

j5 S & oo 4Jj5 S & oo 4J

CO 3 CUCO 3 CU

E-I 41 4JE-I 41 4J

00 Ti dl 3 4-> β co cd oo Ό· sf g > β ·Η "{3 ^ ^ -Cf 00 <hCO <f co00 Ti dl 3 4-> β co cd oo Ό · sf g> β · Η "{3 ^ ^ -Cf 00 <hCO <f co

p, (j 4-101++·—ICM 1—1 CM t—icMp, (j 4-101 ++ · ICM 1—1 CM t — icM

CO 3 ΐ β MCO 3 ΐ β M

ni CU Ή 0) S PI PIni CU Ή 0) S PI PI

Ui Μ ·Η β-ΰ τ4 0) 3 Λ #Onion Μ · Η β-ΰ τ4 0) 3 Λ #

OO

m τ4 oo o i—i r-sm τ4 oo o i — i r-s

o Oo o

C COC CO

β b fl co ·ί co cn en 5 TiMOOO O oβ b fl co · ί co cn and 5 TiMOOO O o

8 ¢0^1-1.-1.-1 r-i >—I8 ¢ 0 ^ 1-1.-1.-1 r-i> —I

H o J2 O Τ' ί-ι 44 r-l Ή *H dlH o J2 O Τ 'ί-ι 44 r-l Ή * H dl

Ό cd 3 β "Ö OOΌ cd 3 β "Ö OO

3 r-i 3 r-i 3 33 r-i 3 r-i 3 3

O 3 0 3 O <UO 3 0 3 O <U

Ό Ü Ü r-i en m3 3co C co 3 > C« -<u woe co cu 3 mcu ω -H oooc 8 3 bp 8 g W « m D,+j >,3 cu oo co ui o o cuemco D -Η 31½ ,£S 3 3 ^33 ,Μ Ό ,3 01 OCQ J2 rio 4J Ti 4-> -Η ·ΗΌ Ü Ü ri and m3 3co C co 3> C «- <u woe co cu 3 mcu ω -H oooc 8 3 bp 8 g W« m D, + j>, 3 cu oo co ui oo cuemco D -Η 31½ , £ S 3 3 ^ 33, Μ Ό, 3 01 OCQ J2 rio 4J Ti 4-> -Η · Η

30 S 00 3 3 3 00 β 3 00 β H30 S 00 3 3 3 00 β 3 00 β H

03. W—c W —I *ri WeMt-i CM *H > 8820673.03. W — c W —I * ri WeMt-1 CM * H> 8820673.

η - 64 -η - 64 -

Voorbeeld XXVExample XXV

Veiligheid en immunogeniteit van het beënten van biggetjes met vFP-6Safety and immunogenicity of piglet inoculation with vFP-6

Twee groepen van drie biggetjes werden met de recom-5 binant vFP-6 beënt met ëén van de twee volgende routes: a) drie dieren kregen intramusculair 8,1 x de WKID^q en b) drie dieren kregen dezelfde dosis oraal.Two groups of three piglets were inoculated with the recombinant vFP-6 in one of the following two routes: a) three animals received 8.1 x the WKID ^ q intramuscularly and b) three animals received the same dose orally.

Uit alle dieren werd om de week bloed afgetapt en ze kregen op dag 35 langs dezelfde weg een opjaagbeënting van de-10 zelfde dosis. Dagelijks werd er bij de biggetjes naar klinische signalen gekeken. De sera werden met een ELISA-proef en in een neutraliseringsproef op antilichamen tegen pluimveepokken getest. Antilichamen tegen rabies werden met een SFFR-proef bepaald .All animals were bled every other week and on day 35 they were given the same dose of inoculation in the same way. The piglets were examined daily for clinical signs. The sera were tested for poultry pox antibodies in an ELISA test and in a neutralization test. Antibodies to rabies were determined by an SFFR test.

15 Alle biggetjes bleven in goede gezondheid en er werd na de beënting geen schade waargenomen. Het verloop van de temperatuur was bij alle normaal zonder verschil tussen wel en niet beënte dieren.All piglets remained in good health and no damage was observed after inoculation. The temperature trend was normal with no difference between inoculated and inoculated animals.

Biggetjes die zowel intramusculair als oraal beënt 20 waren ontwikkelden blijkens de ELISA-proef en de serum-neutrali- sering een serologische respons tegen pluimveepokken. Na de opjaagbeënting was een secundaire respons duidelijk (vijfers niet gegeven). Alle biggetjes ontwikkelden ook een immunologische respons tegen rabies-glycoproteïne zoals bij de SFFR-proef bleek 25 en met beide routes was een opjaageffect duidelijk. Deze uit komsten staan in tabel XVII.Piglets that were inoculated both intramuscularly and orally developed a serological response against poultry pox according to the ELISA test and the serum neutralization. After the inoculation inoculation, a secondary response was evident (5s not given). All pigs also developed an immunological response to rabies glycoprotein as shown in the SFFR test, and a boost effect was evident with both routes. These results are shown in Table XVII.

De uitkomsten laten zien dat beënten met een pluimvee-pokken-rabies-recombinant voor biggetjes onschadelijk is en dat de recombinant een significante immuunrespons tegen rabies-glycopro-30 teïne kan opwekken, zowel bij orale als bij intramusculaire be ent ing.The results show that inoculation with a poultry-pox-rabies recombinant is harmless for piglets and that the recombinant can elicit a significant immune response against rabies glycoprotein 30, both with oral and intramuscular inoculations.

8820679.8820679.

% - 65 -% - 65 -

Tabel XVIITable XVII

Antilichamen tegen rabies-glycoprotexne die In met vFP-6 beente biggetjes gevormd werden_ 5 Vaccinerings- Dier Rabies-antilichamen op dagen (titer volgens SFFR) route_nr._14_21_28_ 35^_42_49_ 984 2j4a 2,2 2,1 2,2 3 3 I.M. 985 2,5 2,7 2,6 2,4 3 3 986 2,2 2,0 2,1 2,3 3 3 10 987 3 2 2,1 2 3 3Antibodies to rabies glycoprotexne formed in piglet-boned piglets with vFP-6. 985 2.5 2.7 2.6 2.4 3 3 986 2.2 2.0 2.1 2.3 3 3 10 987 3 2 2.1 2 3 3

Oraal 988 2,9 2,4 2,2 2,4 2,7 2,5 989 2,8 2 1,7 1,8 2,4 2,5 15 a Opgegeven is de ^log van de verste serumverdunning die in de SFFR-proef nog tot meer dan 50 % vermindering van het aantal fluorescerende putjes leidde, b De dieren kregen op dag nr. 35 een tweede beënting.Oral 988 2.9 2.4 2.2 2.4 2.7 2.5 989 2.8 2 1.7 1.8 2.4 2.5 15 a Specified is the log of the freshest serum dilution the SFFR test still resulted in a more than 50% reduction in the number of fluorescent wells, b The animals received a second inoculation on day No. 35.

20 8820679.20 8820679.

Claims (39)

1. Werkwijze voor het tot expressie brengen van een genprodukt in een gewervelde, waartoe de gewervelde beent 5 wordt met een recombinant-virus dat DNA bevat dat voor het gen produkt codeert en dat tot expressie brengt zonder produktieve vermenigvuldiging van het virus in de gewervelde.1. A method of expressing a vertebrate gene product, for which the vertebrate is blunted with a recombinant virus containing DNA encoding the gene product and expressing it without productively propagating the virus in the vertebrate. 2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij dat virus een pokkenvirus is.The method of claim 1, wherein said virus is a smallpox virus. 3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij dat virus een vogelpokkenvirus is.The method of claim 2, wherein said virus is a fowlpox virus. 4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij dat vogelpokkenvirus gekozen wordt onder het pluimveepokkenvirus en het kanariepokkenvirus.The method of claim 3, wherein said fowlpox virus is selected from among the poultrypox virus and the canarypox virus. 5. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de gewer velde beent wordt door het virus subcutaan, intradermaal, intra-musculair, oraal of in ovum in de gewervelde in te voeren.The method of claim 1, wherein the vertebrate is boneed by introducing the virus into the vertebrate subcutaneously, intradermally, intramuscularly, orally or into ovum. 6. Werkwijze voor het uitlokken van een immunologische repons in een gewervelde tegen een antigeen, waartoe de gewer- 20 velde beent wordt met een recombinant-virus dat DNA bevat dat voor het antigeen codeert en dat tot expressie brengt zonder pro-· duktieve vermenigvuldiging van het virus in de gewervelde.6. A method for eliciting an immunological response in a vertebrate against an antigen, for which the vertebrate is boneed with a recombinant virus containing DNA encoding the antigen and expressing it without productive multiplication of the virus in the vertebrate. 7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij dat virus een pokkenvirus is.The method of claim 6, wherein said virus is a smallpox virus. 8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij dat virus een vogelpokkenvirus is.The method of claim 7, wherein said virus is a fowlpox virus. 9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij dat vogelpokkenvirus gekozen wordt onder het pluimveepokkenvirus en het kanariepokkenvirus.The method of claim 8, wherein said fowlpox virus is selected from among the poultrypox virus and the canarypox virus. 10. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij.de ge wervelde beent wordt door het virus subcutaan, intradermaal, intramusculair, oraal of in ovum in de gewervelde in te voeren.The method of claim 6, wherein the vertebrate is boneed by introducing the virus into the vertebrate subcutaneously, intradermally, intramuscularly, orally or into ovum. 11. Werkwijze voor het uitlokken van een immunologische respons in een gewervelde tegen een pathogeen voor gewervelden, 35 waartoe de gewervelde beent wordt met een recombinant-virus dat DNA bevat dat voor een antigeen tegen de pathogeen codeert en het tot expressie brengt zonder produktieve vermenigvuldiging van het virus in de gewervelde.:11. A method for eliciting an immunological response in a vertebrate against a vertebrate pathogen, for which the vertebrate is vaccinated with a recombinant virus containing DNA encoding and expressing an antigen against the pathogen without productive multiplication of the vertebrate virus .: 12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij dat 8820679." - 2 - (6η) virus een pokkenvirus is.The method of claim 11, wherein said 8820679. "- 2 - (6η) virus is a smallpox virus. 13. Werkwijze volgens conclusie 12, waarbij dat virus een vogelpokkenvirus is.The method of claim 12, wherein said virus is a fowlpox virus. 14. Werkwijze volgens conclusie 13, waarbij dat 5 vogelpokkenvirus gekozen wordt onder het pluimveepokkenvirus en het kanariepokkenvirus.The method of claim 13, wherein said fowlpox virus is selected from among the poultrypox virus and the canarypox virus. 15. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij die gewervelde een zoogdier is en dat gewervelden pathogeen een zoogdierpathogeen is.The method of claim 11, wherein said vertebrate is a mammal and said vertebrate pathogen is a mammalian pathogen. 16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij het antigeen gekozen wordt onder het rabies-antigeen G, het anti-geen voor de omhulling gp51,30 van het runderleukemievirus, het antigeen voor de FeLV-omhulling van kattenleukemievirus en het antigeen voor het glycoproteïne D van herpes simplex-virus.The method of claim 15, wherein the antigen is selected among the rabies antigen G, the bovine leukemia virus envelope gp51.30, the antigen for the feline leukemia virus FeLV envelope, and the antigen for the glycoprotein D of herpes simplex virus. 17. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij het dier gekozen wordt onder de honden, katten, muizen, konijnen, runderen, schapen en varkens.The method of claim 15, wherein the animal is selected from among the dogs, cats, mice, rabbits, cattle, sheep and pigs. 18. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij de gewervelde beënt wordt door het virus subcutaan, intradermaal, 20 intramusculair, oraal of in ovum in de gewervelde in te voeren.The method of claim 11, wherein the vertebrate is inoculated by introducing the virus into the vertebrate subcutaneously, intradermally, intramuscularly, orally or in ovum. 19. Werkwijze voor het uitlokken van een immunologische respons in een gewervelde tegen een gewervelden pathogeen, waartoe de gewervelde beent wordt met een recombinant-vogelpokkenvirus dat DNA bevat dat voor een antigeen van de 25 pathogeen codeert en dat tot expressie brengt.19. A method of eliciting an immunological response in a vertebrate against a vertebrate pathogen, for which the vertebrate is boneed with a recombinant fowlpox virus containing DNA encoding and expressing an antigen of the pathogen. 20. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij die gewervelde een zoogdier en die gewervelden pathogeen een zoogdierpathogeen is.The method of claim 19, wherein said vertebrate mammal and said vertebrate pathogen is a mammalian pathogen. 21. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij die 30 antigeen gekozen wordt onder het rabies-antigeen G, het anti geen voor de gp51,30-omhulling van runderleukemievirus, het antigeen voor de FeLVx-omhulling van kattenleukemievirus en het antigeen voor glycoproteïne D van herpes simplex-virus.21. The method of claim 19, wherein said antigen is selected among the rabies antigen G, the antigen for the bovine leukemia virus gp51,30 envelope, the antigen for the FeLVx coat of feline leukemia virus, and the herpes glycoprotein D antigen. simplex virus. 22. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij die ge- 35 wervelde een vogel en die gewervelde pathogeen een vogelpatho- geen is.The method of claim 19, wherein said vertebrate bird and said vertebrate pathogen is a bird pathogen. 23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij dat antigeen gekozen wordt onder het hemagglutinine-antigeen van vogelinfluenza, een versmeltingseiwit-antigeen van het virus 40 van de Newcastle-ziekte, een antigeen voor de RAV-l-omhulling 8820679. 4 , ' -3v (Cé) van het aan rous geassocieerde virus, een nucleoproteïne-antigeen van het virus vogelinfluenza, een matrix-antigeen van het virus voor infectieuze bronchitis en een peplomeer antigeen van het virus voor infectieuze bronchitis.The method of claim 22, wherein said antigen is selected among the avian influenza hemagglutinin antigen, a fusion protein antigen of Newcastle disease virus 40, an antigen for the RAV-1 envelope 8820679. 4-3v. (Cé) of the virus associated with rous, a nucleoprotein antigen from the avian influenza virus, a matrix antigen from the virus for infectious bronchitis, and a peplomeric antigen from the virus for infectious bronchitis. 24. Recombinant-vogelpokkenvirus dat in een niet- essentieel gebied van het vogelpokken-genoom DNA van andere herkomst dan vogelpokken bevat.24. Recombinant fowlpox virus containing non-fowlpox DNA in a non-essential region of the fowlpox genome. 25. Virus volgens conclusie 24 dat verder een niet van vogelpokken afkomstige promotor voor het tot expressie bren- 10 gen van dat DNA bevat.The virus of claim 24, further comprising a non-fowlpox promoter for expressing said DNA. 26. Virus volgens conclusie 25 waarvan de niet van vogelpokken afkomstige promotor een koepokvirus-promotor is,The virus of claim 25, the non-fowlpox promoter is a cowpox virus promoter, 27. Virus volgens conclusie 26, waarvan de koepokvirus-promotor gekozen wordt onder de groep van HH, 11K en Pi.The virus of claim 26, of which the cowpox virus promoter is selected from the group of HH, 11K and Pi. 28. Virus volgens conclusie 25, waarvan de niet van vogelpokken afkomstige promotor een entomopox-promotor is.The virus of claim 25, the non-fowlpox promoter is an entomopox promoter. 29. Virus volgens conclusie 24, dat bovendien een vogelpokken-promotor heeft om dat DNA tot expressie te brengen.The virus of claim 24, which additionally has a fowlpox promoter to express said DNA. 30. Virus volgens conclusie 24 waarbij dat DNA voor 20 een antigeen van een zoogdierpathogeen codeert.30. The virus of claim 24, wherein said DNA encodes an antigen from a mammalian pathogen. 31. Virus volgens conclusie 30 waarvan het antigeen gekozen is onder de rabies-antigenen, het rabies—antigeen G, het antigeen voor de gp51,3Q-omhulling van runderleukemievirus, het antigeen voor FeLV-omhulling van kattenleukemievirus en het 25 antigeen voor glycoproteïne D van het herpes simplex-virus.31. The virus of claim 30, the antigen of which is selected from the rabies antigens, the rabies antigen G, the antigen for the bovine leukemia virus gp51,3Q coat, the antigen for feline leukemia virus FeLV coat, and the antigen for glycoprotein D of the herpes simplex virus. 32. Virus volgens conclusie 24, waarvan dat DNA voor een antigeen van een vogelpathogeen codeert.The virus of claim 24, said DNA encoding a bird pathogen antigen. 33. Virus volgens conclusie 32 waarvan dat antigeen gekozen wordt onder het hemagglutinine-antigeen van vogel- 30 influenza, het antigeen van het versmeltingseiwit van het virus van de Newcastle-ziekte, het antigeen van een RAV-l-omhulling van het aan rous geassocieerde virus, het nucleoproteïne-antigeen van het virus vogelinfluenza, een matrix-antigeen van het virus van infectieuze bronchitis en een peplomeer-antigeen 35 van het virus van infectieuze bronchitis.33. The virus of claim 32, said antigen of which is selected from the avian influenza hemagglutinin antigen, the antigen from the Newcastle disease virus fusion protein, the antigen from a RAV-1 envelope of the rous-associated virus. virus, the nucleoprotein antigen of the avian influenza virus, a matrix antigen of the virus of infectious bronchitis and a peplomer antigen of the virus of infectious bronchitis. 34. Virus volgens conclusie 24, welk vogelpokken-virus pluimveepokken veroorzaakt.The virus according to claim 24, which fowlpox virus causes poultry pox. 35. Virus volgens conclusie 24, welk vogelpokken-virus kanariepokken veroorzaakt. 8820679. -4- ΛThe virus of claim 24, which fowlpox virus causes canary pox. 8820679. -4- Λ 36. Recombinant-pokkenvirus dat DNA van wat voor herkomst dan ook en een entomopox-promotor voor het tot expressie brengen van dat DNA bevat.36. Recombinant pox virus containing DNA of any origin and an entomopox promoter for expressing that DNA. 37. Virus volgens conclusie 36 welk virus een vogel- 5 pokkenvirus is.37. The virus of claim 36, which virus is a bird pox virus. 38. Virus volgens conclusie 36 welk virus een koepok- virus is.The virus of claim 36, which virus is a cowpox virus. 39. Recombinant-koepok-virus dat DNA van wat voor herkomst dan ook en een vogelpokken-promotor voor het tot 10 expressie brengen van dat DNA bevat. -o-o-o-o-o-o- 8820679 7 ----- Λ39. Recombinant cowpox virus containing DNA of any origin and a fowlpox promoter for expressing that DNA. -o-o-o-o-o-o- 8820679 7 ----- Λ
NL8820679A 1987-08-28 1988-08-24 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus, and method for expressing the DNA in a recombinant pox virus. NL195051C (en)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9071187A 1987-08-28 1987-08-28
US9071187 1987-08-28
US11033587A 1987-10-20 1987-10-20
US11033587 1987-10-20
US18605488A 1988-04-25 1988-04-25
US18605488 1988-04-25
US23439088A 1988-08-23 1988-08-23
US23439088 1988-08-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NL8820679A true NL8820679A (en) 1989-07-03
NL195051C NL195051C (en) 2003-07-01

Family

ID=27492413

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8820679A NL195051C (en) 1987-08-28 1988-08-24 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus, and method for expressing the DNA in a recombinant pox virus.
NL300130C NL300130I2 (en) 1987-08-28 2003-07-09 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus and method of expressing the DNA in a recombinant pox virus.
NL300139C NL300139I1 (en) 1987-08-28 2003-11-25 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus and method of expressing the DNA in a recombinant pox virus.
NL300138C NL300138I2 (en) 1987-08-28 2003-11-25 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus and method of expressing the DNA in a recombinant pox virus.

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL300130C NL300130I2 (en) 1987-08-28 2003-07-09 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus and method of expressing the DNA in a recombinant pox virus.
NL300139C NL300139I1 (en) 1987-08-28 2003-11-25 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus and method of expressing the DNA in a recombinant pox virus.
NL300138C NL300138I2 (en) 1987-08-28 2003-11-25 Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus and method of expressing the DNA in a recombinant pox virus.

Country Status (17)

Country Link
JP (3) JP3348156B2 (en)
KR (1) KR970011149B1 (en)
AR (1) AR241939A1 (en)
AT (1) AT408549B (en)
AU (2) AU2427588A (en)
BE (1) BE1002134A5 (en)
CH (2) CH679933A5 (en)
DE (4) DE10399032I1 (en)
DK (1) DK175904B1 (en)
FR (1) FR2621487B1 (en)
GB (1) GB2217718B (en)
IL (1) IL87581A0 (en)
IT (1) IT1229484B (en)
LU (2) LU90951I2 (en)
NL (4) NL195051C (en)
NZ (1) NZ225970A (en)
WO (1) WO1989003429A1 (en)

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5505941A (en) * 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
DE10399032I1 (en) * 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Recombinant viruses.
US5286639A (en) * 1987-09-16 1994-02-15 Nippon Zeon Co., Ltd. Recombinant avipoxvirus
DE3813093A1 (en) * 1988-04-19 1989-11-09 Immuno Ag RECOMBINANT PLASMIDE, METHOD FOR PRODUCING A RECOMBINANT AVIPOX VIRUS, RECOMBINANT AVIPOX VIRUS, AND USE THEREOF
US5631154A (en) * 1988-06-10 1997-05-20 Therion Biologics, Incorporated Self assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5310671A (en) * 1988-06-24 1994-05-10 British Technology Group Limited Fowlpox virus non-essential regions
US5093258A (en) * 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
CA2001001A1 (en) * 1988-10-21 1990-04-21 Matthew M. Binns Fowlpox virus promoter
US6248333B1 (en) 1990-04-04 2001-06-19 Health Research Inc. Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD)
US5204243A (en) * 1990-02-14 1993-04-20 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus internal cores
US5514375A (en) * 1990-08-15 1996-05-07 Virogenetics Corporation Flavivirus recombinant poxvirus vaccine
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
FR2668064B1 (en) * 1990-10-23 1994-12-16 Transgene Sa PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF MALIGNANT TUMOR.
IE71643B1 (en) * 1990-11-20 1997-02-26 Virogenetics Corp A recombinant poxviral vaccine for canine distemper
US5756102A (en) * 1990-11-20 1998-05-26 Virogenetics Corporation Poxvirus-canine distemper virus (CDV) recombinants and compositions and methods employing the recombinants
US5759841A (en) * 1990-11-20 1998-06-02 Virogenetics Corporation Immunological composition of measles virus utilizing recombinant poxvirus
US5503834A (en) * 1990-11-20 1996-04-02 Virogenetics Corporation Measles virus recombinant poxvirus vaccine
US6309647B1 (en) 1999-07-15 2001-10-30 Aventis Pasteur Poxvirus—canine dispemper virus (CDV) or measles virus recombinants and compositions and methods employing the recombinants
US5338679A (en) * 1991-01-08 1994-08-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By National Research Council Canada And Forestry Canada Vertebrate poxvoris expression vector under the control of entomopoxvirus spheroidin gene promoter
EP0575491B1 (en) * 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US5756101A (en) * 1991-07-01 1998-05-26 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Malaria recombinant poxvirus
US5766598A (en) * 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products
US5863542A (en) * 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
US5766597A (en) * 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Malaria recombinant poxviruses
CA2106464A1 (en) * 1991-03-20 1992-09-21 Enzo Paoletti Malaria recombinant poxvirus vaccine
EP0592546B1 (en) * 1991-06-14 2003-05-28 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
AU670538B2 (en) * 1991-07-26 1996-07-25 Virogenetics Corporation Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine
EP0538496B1 (en) * 1991-08-26 2003-10-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene
US5443831A (en) * 1991-10-29 1995-08-22 University Of Delaware Gene encoding glycoprotein B of Infectious Laryngotracheitis Virus
US6033904A (en) * 1992-01-13 2000-03-07 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US6497882B1 (en) 1992-01-13 2002-12-24 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US6251403B1 (en) 1992-01-13 2001-06-26 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5869312A (en) * 1992-01-13 1999-02-09 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US6328975B1 (en) 1992-01-13 2001-12-11 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
WO1993014219A1 (en) * 1992-01-13 1993-07-22 Virogenetics Corporation Marek's disease virus recombinant poxvirus vaccine
US6127163A (en) * 1992-01-13 2000-10-03 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
CA2142325A1 (en) * 1992-09-21 1994-03-31 William T. L. Lee Recombinant retroviral vector against felv and/or fiv
AU727278B2 (en) * 1993-02-26 2000-12-07 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof II
WO1994019014A1 (en) * 1993-02-26 1994-09-01 Syntro Corporation Recombinant fowlpox virus s-fpv-043 and uses thereof
US5925358A (en) * 1993-02-26 1999-07-20 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US6136318A (en) * 1993-02-26 2000-10-24 Cochran; Mark D. Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US5496731A (en) * 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
US5843742A (en) * 1994-12-16 1998-12-01 Avigen Incorporated Adeno-associated derived vector systems for gene delivery and integration into target cells
EP0753581A1 (en) 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
US5858373A (en) * 1995-12-01 1999-01-12 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus-feline infectious peritionitis virus, compositions thereof and methods for making and using them
EP0954593A1 (en) 1996-07-25 1999-11-10 Therion Biologics Corporation Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
US6106825A (en) * 1997-05-07 2000-08-22 University Of Florida Entomopoxvirus-vertebrate gene delivery vector and method
AU3910097A (en) * 1997-08-05 1999-03-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating vir us
US6248582B1 (en) * 1997-10-08 2001-06-19 Imran Khan Gene deleted recombinant FeLV proviral DNA for production of vaccines against FeLV
JPH11165762A (en) 1997-12-01 1999-06-22 Lintec Corp Cover tape for carrying chip body and sealing structure
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030235557A1 (en) 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
WO2000039302A2 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
ATE482233T1 (en) 1999-06-28 2010-10-15 Oklahoma Med Res Found MEMAPSIN 2 INHIBITORS AND THEIR USE
AU2001256156B2 (en) 2000-02-23 2006-01-05 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Novel compounds
AR029540A1 (en) 2000-06-28 2003-07-02 Corixa Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF CA NCER DE PULMoN
AU2002305914A1 (en) 2001-01-12 2002-10-21 Chiron Corporation Nucleic acid mucosal immunization
AU2002304856B2 (en) * 2001-03-08 2006-08-24 Intervet International B.V. Leporipox-based vector vaccines
JP4499311B2 (en) * 2001-04-27 2010-07-07 シャープ株式会社 Broadcast receiving terminal
JP2005504513A (en) 2001-05-09 2005-02-17 コリクサ コーポレイション Compositions and methods for treatment and diagnosis of prostate cancer
CA2452015C (en) 2001-07-05 2012-07-03 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1409694A4 (en) 2001-07-05 2006-02-08 Chiron Corp Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
ES2405405T3 (en) 2001-12-17 2013-05-31 Corixa Corporation Compositions and procedures for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
JP4838706B2 (en) 2003-01-06 2011-12-14 コリクサ コーポレイション Certain aminoalkyl glucosaminidophosphate compounds and their use
US20070073048A1 (en) 2003-05-15 2007-03-29 Ying Lian Hiv polynucleotides and polypeptides derived from botswana mj4
US7261882B2 (en) 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
EP2305295B1 (en) 2004-09-22 2015-04-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Antibody composition for use in vaccination against staphylococcei
JP5215865B2 (en) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド Norovirus and sapovirus antigens
AU2007239095B2 (en) 2006-01-09 2012-05-03 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory combinations for vaccine adjuvants
BRPI0708912B8 (en) 2006-03-14 2021-07-27 Univ Oregon Health & Science in vitro methods for detecting mycobacterium tuberculosis and cd8 expressing t cells that specifically recognize seq id no: 11 in an individual
JP5596980B2 (en) 2007-02-28 2014-10-01 アメリカ合衆国 Brachyury polypeptides and methods of use
WO2009049350A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 The University Of Queensland Expression system for modulating an immune response
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
BRPI1005670A8 (en) 2009-01-05 2017-12-26 Epitogenesis Inc adjuvant compositions and processes of use.
WO2010099472A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 The U.S.A. Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Spanx-b polypeptides and their use
EP3360566B1 (en) 2009-11-20 2019-12-25 Oregon Health&Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
US20130052221A1 (en) 2010-02-26 2013-02-28 The Govt. of the U.S, as represented by The Sec. of The Dept. of Health and Human Services Dna-protein vaccination protocols
US9795658B2 (en) 2010-04-20 2017-10-24 Admedus Vaccines Pty Ltd Expression system for modulating an immune response
WO2012106281A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The General Hospital Corporation Multimodal trail molecules and uses in cellular therapies
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
US20150030586A1 (en) 2011-06-21 2015-01-29 Sarah Ellen Warren Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
CN103717235A (en) 2011-06-24 2014-04-09 埃皮托吉尼西斯有限公司 Pharmaceutical compositions, comprising a combination of select carriers, vitamins, tannins and flavonoids as antigen-specific immuno-modulators
US20150004144A1 (en) 2011-12-02 2015-01-01 The General Hospital Corporation Differentiation into brown adipocytes
EP2890720B1 (en) 2012-08-30 2019-07-17 The General Hospital Corporation Compositions and methods for treating cancer
WO2014043518A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
SG10201912901YA (en) 2013-04-17 2020-02-27 Genzyme Corp Compositions and methods for treating and preventing macular degeneration
EP3848044A1 (en) 2013-05-21 2021-07-14 President and Fellows of Harvard College Engineered heme-binding compositions and uses thereof
WO2015073707A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of treating heart failure with agonists of hypocretin receptor 2
TWI687225B (en) 2014-02-06 2020-03-11 美商健臻公司 Compositions and methods for treating and preventing macular degeneration
WO2016044707A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating fibrosis
WO2016154010A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Makidon Paul Immunogenic compositions for use in vaccination against bordetella
US20180112006A1 (en) 2015-04-17 2018-04-26 The General Hospital Corporation Agents, systems and methods for treating cancer
CN114366802A (en) 2015-04-22 2022-04-19 西达-赛奈医疗中心 Enterally delivered bitter oligopeptides for the treatment of type 2 diabetes
US20180346520A1 (en) 2015-05-13 2018-12-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Methods and compositions for inducing an immune response using conserved element constructs
WO2016196366A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Extension of replicative lifespan in diseases of premature aging using p53 isoforms
US10550379B2 (en) 2015-06-29 2020-02-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Degron fusion constructs and methods for controlling protein production
CA3006779A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Admedus Vaccines Pty Ltd Immunomodulating composition for treatment
US11285191B2 (en) 2016-07-26 2022-03-29 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Immunostimulatory compositions and uses therefor
US10917454B1 (en) 2019-08-01 2021-02-09 Rohde & Schwarz Gmbh & Co. Kg System and method for ATC voice quality assurance
WO2023070072A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Retroelement-generated transcription factor decoys
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023183627A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Production of reverse transcribed dna (rt-dna) using a retron reverse transcriptase from exogenous rna
WO2023183588A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Methods of assessing engineered retron activity, and uses thereof
WO2023183589A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Rt-dna fidelity and retron genome editing
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024044673A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Dual cut retron editors for genomic insertions and deletions
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK489481A (en) * 1980-11-10 1982-05-11 Searle & Co PLASMID VECTOR AND METHOD OF PRODUCING THEREOF
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
WO1984002077A1 (en) * 1982-11-30 1984-06-07 Us Health Process for producing poxvirus recombinants for expression of foreign genes
FR2563434B1 (en) * 1984-04-25 1986-07-25 Transgene Sa Rabies vaccine and process for its preparation
EP0190254A4 (en) * 1984-07-05 1987-03-09 Genex Corp Cloned gene and method for making and using the same.
DD235669A1 (en) * 1985-03-26 1986-05-14 Akad Wissenschaften Ddr METHOD FOR PRODUCING A BLV-CODED HUEL PROTEIN
US5032520A (en) * 1985-03-29 1991-07-16 National Research Development Corporation DNA sequences encoding infectious bronchitis virus spike protein
EP0213894A3 (en) * 1985-08-23 1987-10-21 Advanced Genetics Research Institute Defective viral particle vaccines and methods for their use
AU607399B2 (en) * 1985-09-09 1991-03-07 Cetus Corporation Infectious recombinant virus vaccine for feline leukemia
NZ217645A (en) * 1985-09-25 1991-11-26 Oncogen Recombinant viruses expressing lav/htlv-iii related epitopes and vaccine formulations
AU602875B2 (en) * 1985-12-18 1990-11-01 British Technology Group Limited Newcastle disease virus gene clones
AU8075787A (en) * 1986-09-22 1988-04-07 Australian National University, The Recombinant poxviruses
WO1988002022A1 (en) * 1986-09-22 1988-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Recombinant poxviruses
EP0261940A3 (en) * 1986-09-23 1989-07-05 Applied Biotechnology, Inc. Pseudorabies vaccines and dna vectors for recombination with pox viruses
EP0284416B1 (en) * 1987-03-27 1995-02-22 Nippon Zeon Co., Ltd. Recombinant avipoxyvirus
DE10399032I1 (en) * 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Recombinant viruses.
GB8724885D0 (en) * 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
FR2632863B2 (en) * 1987-10-29 1990-08-31 Transgene Sa RECOMBINANT FOWLPOX VIRUS AND VACCINES DERIVED FROM SUCH VIRUSES
US5310671A (en) * 1988-06-24 1994-05-10 British Technology Group Limited Fowlpox virus non-essential regions
WO1990010693A1 (en) * 1989-03-08 1990-09-20 Health Research, Inc. Recombinant poxvirus host selection system
CA2091678C (en) * 1990-09-25 2003-04-22 Stephen C. Inglis Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line

Also Published As

Publication number Publication date
IL87581A0 (en) 1989-01-31
DE3890874C2 (en) 2003-03-13
DE10399031I1 (en) 2004-01-29
DK203689A (en) 1989-06-27
DK203689D0 (en) 1989-04-27
AT408549B (en) 2001-12-27
DE3890874C5 (en) 2005-10-20
FR2621487A1 (en) 1989-04-14
KR970011149B1 (en) 1997-07-07
IT1229484B (en) 1991-09-03
DE10399032I1 (en) 2004-01-29
NL300138I2 (en) 2004-03-01
DK175904B1 (en) 2005-06-06
CH679933A5 (en) 1992-05-15
JP3348156B2 (en) 2002-11-20
NL300130I1 (en) 2003-09-01
DE10299049I1 (en) 2004-07-01
AR241939A1 (en) 1993-01-29
JP2002186494A (en) 2002-07-02
NL300139I1 (en) 2004-02-02
NL300130I2 (en) 2005-11-01
KR890701757A (en) 1989-12-21
BE1002134A5 (en) 1990-07-24
GB8908921D0 (en) 1989-08-02
FR2621487B1 (en) 1991-10-18
NZ225970A (en) 1991-01-29
NL195051C (en) 2003-07-01
IT8821772A0 (en) 1988-08-29
WO1989003429A1 (en) 1989-04-20
JP3826055B2 (en) 2006-09-27
JP2002348255A (en) 2002-12-04
LU90951I2 (en) 2003-01-15
AU690210B2 (en) 1998-04-23
JPH02500879A (en) 1990-03-29
AU1628895A (en) 1995-08-17
AU2427588A (en) 1989-05-02
CH679934A5 (en) 1992-05-15
GB2217718B (en) 1992-05-20
GB2217718A (en) 1989-11-01
ATA900788A (en) 1995-05-15
NL300138I1 (en) 2004-02-02
LU91039I2 (en) 2003-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL195051C (en) Recombinant pox viruses, immunological compositions comprising a recombinant pox virus, and method for expressing the DNA in a recombinant pox virus.
US5174993A (en) Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5505941A (en) Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
KR0179994B1 (en) Recombinant herpes virus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
US5093258A (en) Recombinant fowlpox virus and recombination vector
JP2002514885A (en) Poxvirus-canine distemper virus (CDV) recombinants and compositions and methods of using said recombinants
JPH06505874A (en) Genetically engineered vaccine strains
NL9020389A (en) SYSTEM FOR SELECTING RECOMBINANT POUCK VIRUSES IN THE HOST.
JP2007105040A (en) Recombinant poxvirus-feline infectious peritonitis virus, composition thereof and methods for making and using them
US5651972A (en) Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
JPH11511961A (en) Recombinant poxvirus-calicivirus [rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV)] compositions and uses
WO1994024268A1 (en) Recombinant avian adenovirus vector
CN107771216B (en) Recombinant MDV1 and uses thereof
CA2047585A1 (en) Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot and mouth disease virus epitope on the surface of virus-infected cells and on the surface of virus particles, and vaccine against foot and mouth disease containing the same
WO2007115385A2 (en) Transfer plasmidic vector and recombinant canarypox virus
NZ527940A (en) Leporipox-based vector vaccines
AU2002304856A1 (en) Leporipox-based vector vaccines
AU761321B2 (en) Recombinant viruses, vaccines containing them and in vitro cell cultures thereof
AU725985B2 (en) Recombinant virus
DK176165B1 (en) Antigen expression in vertebrates using recombinant virus - contg. specific DNA and incapable of replication, esp. avipox, useful as safe, live vaccines
DK175980B1 (en) Antigen expression in vertebrates using recombinant virus - contg. specific DNA and incapable of replication, esp. avipox, useful as safe, live vaccines
DK176068B1 (en) Antigen expression in vertebrates using recombinant virus - contg. specific DNA and incapable of replication, esp. avipox, useful as safe, live vaccines
CA1341403C (en) Recombinant a vipox virus
IE60309B1 (en) Recombinant viruses, vaccines containing them and in vitro cell cultures thereof
AU676042B2 (en) Recombinant avian adenovirus vector

Legal Events

Date Code Title Description
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
NP1 Patent granted (not automatically)
KC1 Grant of a supplementary protection certificate

Free format text: 300138, 20080824, EXPIRES: 20130823

Spc suppl protection certif: 300138

Filing date: 20080824

Expiry date: 20130823

KC1 Grant of a supplementary protection certificate

Free format text: 300130, 20080824, EXPIRES: 20130823

Spc suppl protection certif: 300130

Filing date: 20080824

Expiry date: 20130823

V4 Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent

Effective date: 20080824

SPCX Expiry of a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: RECOMBINANT KANARIEPOKKENVIRUS-FELV (RECOMBINANT KANARIEPOKKENV IRUS DAT EXOGEEN DNA UIT FELV BEVAT EN TOT EXPRESSIE BRENGT); REGISTRATION NO/DATE: EU/2/00/019/001 - EU/2/00/019/004 20000413

Spc suppl protection certif: C300130

Filing date: 20030709

Expiry date: 20080824

Extension date: 20130823

Free format text: PRODUCT NAME: INFLUENZA A/EQUI-2/KENTUCKY/94 RECOMBINANT KANARIEPOKKENVIRUS EN INFLUENZA A/EQUI-2/NEWMARKET/2/93 RECOMBINANT KANARIEPOKKEN- VIRUS; REGISTRATION NO/DATE: EU/2/03/037/001 - EU/2/03/037/004 20030306

Spc suppl protection certif: C300138

Filing date: 20031125

Expiry date: 20080824

Extension date: 20130823