NL8301324A

NL8301324A - Farmaceutisch preparaat dat een nh2-(ch2)3-c(po3h2)oh-verbinding bevat.

Info

Publication number: NL8301324A
Application number: NL8301324A
Authority: NL
Original assignee: Gentili Ist Spa
Priority date: 1982-04-15
Filing date: 1983-04-15
Publication date: 1983-11-01
Also published as: IT8220781A0; CH661437A5; NL980004I1; BE896453A; NL970038I2; NL192562C; IT1201087B; SE463239B; JPS58189193A; GB2118042A; JPH0213645B2; LU88714I2; SE8302130L; NL192562B; SE8302130D0; FR2525223A1; NL980005I1; LU84746A1; NL980010I1; FR2525223B1

Description

ί- - 4 VO 4715

Titel: Farmacologisch aktieve bifosfonaten, werkwijze voor hun berei ding en farmaceutica met deze stoffen daarin.

De uitvinding betreft een bereiding van bifosfonzuur en hun zouten. De uitvinding betreft tevens farmaceutica die geschikt zijn voor het behandelen van urolithiasis en in staat zijn botreabsorptie te remmen.

Het is bekend, dat gecondenseerde fosfaten in lage concentraties 5 de afzetting van calciumcarbonaat uit oplossing verhinderen; daarnaast zijn gecondenseerde fosfaten en onder deze de pyrofosfaten in staat het neerslaan van calciumfosfaat te remmen, wanneer zij zelfs in lage concentraties aan calciumfosfaatoplossingen worden toegevoegd. Dit remmend effect treedt zowel op bij aan- als afwezigheid van kristallen van 10 apatiet.

Bovendien vertragen gecondenseerde fosfaten de omzetting van calciumfosfaat uit de amorfe fase in de kristallijne fase zonder evenwel de vorming van de amorfe fase te beïnvloeden. Hetdiidelijke effect in vitro van pyrofosfaat (PP) op calciumfosfaat in concentraties nabij de 15 concentraties van biologische vloeistoffen heeft aanleiding gegeven tot het idee, dat pyrofosfaat zachte weefsels tegen mineralisatie kan beschermen. In botten zou pyrofosfaat tevens de voortschrijding van de calcificatie kunnen reguleren en daardoor de omzetting van calcium en fosfaat kunnen beïnvloeden. Het PP in bot, dat reeds gemineraliseerd 20 is beïnvloedt de beweging van calcium en fosfaat naar binnen en naar buiten in het bot. Ondanks al deze kennis die in verband met PP is opgedaan, is deze verbinding niet in de therapie toegepast in verband met de snelle hydrolyse die deze stof ondergaat zowel bij orale toediening als bij systemische toediening.

25 In verband met het grote belang verbonden met PP zijn onderzoe kingen uitgevoerd met het doel verbindingen te bereiden met een overeenkomstige activiteit maar die resistent zijn tegen hydrolyse. Dit doel is gedeeltelijk bereikt met de synthese van bifosfonaten, dat zijn stoffen die de groep P-C-P bevatten in plaats van de groep P-O-P. De 30 invloed van bisfosfonaten op calciumzouten is overeenkomstig die van PP; zelfs bij lage concentraties vertonen ze de volgende activiteiten: 8301324 * '4 - 2 - zij remmen de afzetting van calciumfosfaat uit oplossingen; zij blokkeren de omzetting van amorf calciumfosfaat in kristallijn zonder evenwel de vorming van de initiële fase te remmen; zij blokkeren de aggregatie van kristallen hydroxyapatiet; 5 zij vertragen de mate van het in oplossing gaan van kristallen hydroxy-_ apatiet nadat de laatste de bifosfonaten uit de oplossing hebben opgenomen.

Diverse farmacologische en clinische artikelen in de wetenschappelijke literatuur demonstreren evenwel, dat ondanks bepaalde 10 analogieën in activiteit de diverse bifosfonaten die tot dusver bij de behandeling van osteopatieën zijn gebruikt, sommige ernstige nadelen hebben wat betreft hun giftigheid jegens dieren, hun verdraagbaarheid of het veroorzaken van ongunstige neveneffecten bij de mens.

Er werd nu verrassenderwijze gevonden, dat enige bisfosfonzuren 15 met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R fluor of een lineaire of vertakte alkylgroep met 1 tot 5 koolstof atomen, al of niet gesubstitueerd door aminogroepen en/of fluoratomen, en R‘ hydroxyl of fluor voorstellen, en hun zouten met alkalimetalen, organische basen en basische aminozuren bijzonder geschikt zijn voor het behandelen van 20 urolithiasis en als remstoffen voor de botreabsorptie omdat ze een hoge activiteit ontplooien die niet gepaard gaat met de bovengenoemde neveneffecten van pyrofosfaat.

Diverse bifosfonzuren zijn reeds in de literatuur beschreven. In het bijzonder bifosfonzuren met de formule 1, waarin R een ongesubsti-25 tueerde alkylgroep en R' hydroxyl is, kunnen worden bereid door een omzetting van een acylhalogenide of een anhydride van een zuur met fosforigzuur of fosfortrichloride. Deze procedure levert weliswaar goede opbrengsten indien R is ethyl voorstelt, maar is minder bruikbaar voor het bereiden van de analoga met alkylgroepen met een hoger mole-30 cuulgewicht, en praktisch niet toepasbaar wanneer groep R een met functionele groepen gesubstitueerde alkylgroep voorstelt.

Bovendien is deze procedure kennelijk niet bruikbaar voor het bereiden van verbindingen met de formule 1, waarin R en/of R' fluor-atomen zijn. Er werd nu gevonden, dat het mogelijk is verbindingen met 35 de formule 1, waarin R een aminoalkylgroep en R' hydroxyl voorstellen 8301324 « * - 3 - in voortreffelijke opbrengsten en in een zeer zuivere vorm te bereiden, wanneer men een aminozuur met fosforigzuur laat reageren om de reactieve aminogroep te blokkeren en vervolgens met fosfortrichloride omzet.

Het tussenprodukt wordt vervolgens gehydrolyseerd en het gewenste 5 produkt op een passende wijze geïsoleerd.

In plaats van een mengsel van fosforigzuur en fosfortrichloride is het ook mogelijk alleen fosfortrichloride toe te passen en een stoechiometrische hoeveelheid water toe te voegen om het overeenkomstige fosforigzuur te vormen.

10 Indien mogelijk kan het aminozuur worden vervangen door een voorloper die het aminozuur door hydrolyse kan vormen, zoals valerolac-tam of het overeenkomstige polyamide in geval van 5-aminovaleriaanzuur of pyrrolidon in geval van 4-aminoboterzuur. De reactie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij aanwezigheid van een aprotisch organisch oplosmiddel, 15 zoals een alifatische of aromatische koolwaterstof of een overeenkomstige gechloreerde koolwaterstof, maar hij kan ook worden uitgevoerd bij afwezigheid van een oplosmiddel.

Tijdens de reactie wordt een pastavormig vast materiaal gevormd, dat niet nauwkeurig kan worden gedefinieerd, waaruit het gewenste 20 aminobifosfonzuur kan worden verkregen door een hydrolyse met water of waterig zoutzuur.

De bovenbeschreven procedure kan gemakkelijk worden aangepast aan een industriële produktie voor de zuren met de formule 1. De bereiding van de bifosfonzuren met de formule 1, waarin R en R' beide 25 fluoratomen voorstellen, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en hoge opbrengsten opleveren bij een hydrolyse van de overeenkomstige esters met de algemene formule 2, f2cLpo(or'*)2] (2) waarbij R" een rechte of vertakte alkylgroep met 1-4 koolstofatomen 30 voorstelt. Deze esters met de formule 2 kunnen worden verkregen door omzetting van de overeenkomstige ester van broomtrifluormethaanfosfon-zuur (verkregen uit dibroomdifluormethaan en een trialkylfosfiet) met een dialkylfosfiet of een alkalimetaal zoals natrium volgens onderstaand schema.

8301324 it « - 4 - CF2Br2 + P(OR")3-V Br-CF2-PO(OR")2->

NaPO(OR")2 2

De hydrolyse van de ester met de formule 2 tot het overeenkomstige bifosfonzuur wordt uitgevoerd met water en een anorganisch zuur.

5 De voorkeursverbindingen die volgens de uitvinding kunnen worden verkregen zijn: 5-amino-l-hydroxypentaan-l,1-bifosfonzuur, 4-amino-1-hydroxybutaan-1,1-bifosfonzuur, difluor-methaanbifosfonzuur 10 en hun natrium, aniline en lysinezouten.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

VOORBEELD I

Een mengsel van 117 gram (1,0 mol) 5-aminovaleriaanzuur, 123 gram (1,5 mol) fosforigzuur en 500 cm^ watervrij chloorbenzeen 15 werd bereid. Dit .mengsel werd met een kokend waterbad verhit op 100°C tot het vaste materiaal nagenoeg in oplossing was gegaan. Onder handhaven van de temperatuur op 100°C en goed roeren, werd langzaam 206 gram (1,5 mol) fosfortrichloride toegevoegd. Circa 30 minuten na afloop van deze toevoeging begint de vorming van een dichte fase die de neiging 20 had toe te nemen en te harden met de tijd. Het mengsel werd nog 3 uren op 100°C gehouden, waarna men het vervolgens onder roeren liet afkoelen. Op deze wijze breekt het vaste materiaal uiteen in kleine stukken, zodat het kan worden gefiltreerd en gewassen met chloorbenzeen. Het aldus verkregen vaste hydroscopische materiaal werd vervolgens opgelost 3 25 in 500 cm water en 1 uur onder terugvloeikoelen verhit. Na afkoelen werd deze oplossing behandeld met actieve kool en daarna gefiltreerd.

Het onzuivere zuur slaat neer bij toevoeging van een overmaat warme methanol en werd na afscheiding gekristalliseerd uit 1 liter water van 100°C.

30 De opbrengst bedroeg 165 gram (63% van de theoretische) van 5-amino-l-hydroxypentaan-l,1-bifosfonzuur in de vorm van een wit kristallijn poeder met een smeltpunt van 235°C.

8301324 « * - 5 -

Elementair-analyse

Gevonden: C = 22,69; H = 5,71; N = 5,14; P = 23,70

Ber. voor C5H15N07P2: C = 22,82; H = 5,75; N = 5,32; P = 23,54

Infrarood-Spectrum 5 Absorptie banden bij 3220, 1660 en 1510 cm ^

Spectrum ^H-N.M.R. (TMS als standaard) S = 1,8 ppm (6h); δ - 3,0 ppm (2H)

VOORBEELD II

Aan een glazen reactor van 150 liter werden 9,4 kg 5-aminovale-10 riaanzuur, 9,9 kg fosforigzuur en 40 liter watervrij chloorbenzeen toegevoegd. Dit mengsel werd onder roeren verwarmd op 90-100°C waarna in de loop van 30 minuten 16,5 kg fosfortrichloride werd toegevoegd.

Het reactiemengsel werd 3 uren bij 110°C bewaard, daarna afgekoeld op 80°C en vervolgens 50 liter water toegevoegd om al het vaste materiaal 15 op te lossen. De organische fase werd afgekoeld en van de waterfase gescheiden. Na behandeling van de waterfase met actieve kool en filtreren werd een overmaat methanol onder roeren toegevoegd om het onzuivere aminobifosfonzuur neer te slaan. Het mengsel werd gefiltreerd en het produkt herkristalliseerd uit 60 liter kokend water. Het produkt was 20 12,4 kg kristallijn en zuiver 5-amino-l-hydroxypentaan-l,1-bifosfonzuur:

VOORBEELD III

Een mengsel van 1 mol 4-aminoboterzuur, 1,5 mol fosforigzuur en 500 cm^ watervrij chloorbenzeen werd langzaam op 100°C verwarmd. Bij deze temperatuur werd 1,5 mol fosfortrichloride toegevoegd onder goed 25 r.oeren. Het mengsel werd vervolgens 3½ uur bij 10Q°C geroerd tot de dichte fase volledig was gevormd, en daarna afgekoeld. Het vaste * materiaal werd afgefiltreerd, met een kleine hoeveelheid chloorbenzeen gewassen en in water opgelost. Deze oplossing werd 1 uur op het kookpunt verhit, daarna afgekoeld en ontkleurd met actieve kool. Het mate-30 riaal werd gefiltreerd en het produkt neergeslagen met een overmaat methanol. Het aldus verkregen onzuivere materiaal werd 8 uren in 20% zoutzuur onder terugvloeikoelen verhit. Dit zoutzuur werd vervolgens 8301324 * * - 6 - afgedestilleerd en het residu uit water herkristalliseerd. Het produkt was 4-amino-l-hydroxybutaan-l,1-bifosfonzuur in de vorm van een wit kristallijn poeder met de formule 3 van het formuleblad en de hieronder weergegeven eigenschappen.

5 Elementair-analyse C% H% N% P%

Gevonden: 17,88 5,62 4,93 23,94

Ber. voor ABDP: 19,28 5,26 5,64 24,86

Ber. voor ABDP.H20: 17,98 5,66 5,24 23,19 10 Bepaling van het vochtgehalte

Een monster/onderzocht volgens de Karl-Fischer methode,had een watergehalte van ca. 3,9 gew.%.

Potentiometrische titratie

De kromme van de potentiometrische titratie werd verkregen door 15 toevoeging van 0,1 N natronloog aan een oplossing van 203 mg van een monster opgelost in 75 cm^ water. Het profiel van deze kromme wordt gekenmerkt door 2 duidelijke eindpunten bij pH 4,4 en 9 overeenkomend 3 met een toevoeging van 7,5 en 15,2 cm reagens. Uit de weergegeven cijfers kan een equivalentie-gewicht van 270 worden berekend voor de 20 eerste neutralisatie en van 264 voor de tweede neutralisatie en een gemiddeld equivalent gewicht van 276. Het molecuulgewicht van ABDP.H20 bedraagt 267,114.

Complexometrische titratie

Deze complexometrische titratie werd uitgevoerd met thoriumnitraat 25 met 41,47 mg van de verbinding. Waargenomen werd een kleursverandering 3 na een toevoeging van 5,4 cm reagens. Uit dit cijfer kan men concluderen dat de onderzochte stof een equivalentiegewicht bezit van 1,34, hetgeen overeenkomt met de aanwezigheid van twee fosfongroepen in het molecuul van het monohydraat.

30 Infrarood absorptie

Het waargenomen infraroodspectrum op een tablet KBr vertoont karak-terieke banden bij: 8301324 4 * - 7 - 3600 - 2500 cm * : een complexe band door het overlappen van de in vloed van de zure en alcoholische OH-groepen, groepen NH* en alifatische CH; 1650,1605/1500 ï banden veroorzaakt door de deformatie van de groep 5 NH^ gedeeltelijk in de zoutvorm door de aanwezig heid van de fosfongroepen; 1160 : invloed van de P-0 binding; 1040 : invloed van de C-0 binding; 960, 930 : invloed van de P-0 binding; 10 600-400 : skeletbanden voornamelijk veroorzaakt door het stuk van het molecuul dat fosforatomen bevat.

Kernmagnetische resonantie op het proton (^H-NMR)

Het1H-NMR spectrum berekend in D20/D2S04 vertoont twee vergrote signalen bij 52,6 ppm (CH2~6 en CH2~y door de NH2 groep) en 3,5 ppm 15 (CH2-a door de NH2 groep) voor een relatieve intensiteit 2:1.

Kernmagnetische resonantie op koolstof (^C-NMR) _______________

Het ^C-NMR spectrum bepaald in D2°^D2S04 vertoont signalen bij 520 ppm (CH2~6 door de NH2 groep), 28 pon (CH2~Y door de NH2 groep) 39 ppm (CH2~a door de NH2 groep) en een centraal triplet bij 72 ppm 20 (C-5 door de NH2 groep, 156 Hz).

Kernmagnetische resonantie op fosfor (^P-NMR) 31

Het P-NMR spectrum bepaald in D20/D2S04 vertoont een enkelvoudig signaal bij 9 ppm dat aangeeft dat twee fosforatomen chemisch en magnetisch equivalent zijn.

25 VOORBEELD IV

Natriumdiisopropylfosfiet en diisopropylbroomdifluormethaanfosfonaat werden omgezet volgens gebruikelijke methoden in de tetraisopropvlester van difluormethaanbifosfonzuur, welke in de vorm van een kleurloze en geurloze vloeistof met een kookpunt van 117°C bij 0,2 mm kwik werd ver-30 kregen.

19

Spectrum F-N.M.R.: = 21,6 (triplet, CF9, J = 86,67)

31 F P

Spectrum P-N.M.R.: = 16,1 (triplet, „ = 14,6);

Γ ”P

Η^Ρ04 85% als externe standaard.

8301324 9 - 8 -

De aldus verkregen ester werd tot difluormethaanbifosfonzuur gehydrolyseerd, dat in kristallijne vorm werd verkregen en in een vacuumexsiccator boven P_0._ werd gedroogd. Deze stof is een bijzonder 2 o hygroscopisch vast materiaal met een..smeltpunt van 90 C.

5 De zuur-base titratie, levert twee duidelijke eindpunten bij pH 3,9 en 10,1 respectievelijk corresponderend met het binatrium en het tetranatriumzout en een enkel eindpunt bij pH 6,8 , corresponderend met het trinatriumzout. Het molecuulgewicht corresponderend met deze titratiecijfers bedraagt 210,3 (theoretisch 211,99).

10 VOORBEELD V

Aan een suspensie van 263 gram 5-amino-l-hydroxypentaan- 1,1- bifosfonzuur in een liter water werd onder koelen een oplossing uit " 3 40 gram natriumhydroxyde in 500 cm water toegevoegd. Verkregen werd · een heldere oplossing, die na ontkleuren met kool, filtreren en concen-15 treren gedurende 3 dagen onder zacht roeren in de kou werd bewaard.

Het aldus verkregen kristallijne materiaal werd afgefiltreerd, met een kleine hoeveelheid koud water en daarna met methanol gewassen. Na drogen bij 110°C werd 199 gram van het mononatriumzout van 5-amino-1 -hydroxy-pentaan-1,1-bisfosfonzuur verkregen.

20 VOORBEELD VI

Uit difluormethaanbifosfonzuur werd volgens gebruikelijke methoden het trinatriumdifluormethaanbisfosfonaat als een kristallijn wit poeder verkregen, dat oplosbaar is in water. Het molecuulgewicht bepaald door een zuur-base titratie bedraagt 274,0 (theoretisch 277,9). Een 0,1 mol 25 waterige oplossing hiervan heeft een pH van 6,8.,

Elementair analyse

Gevonden: C = 4,30; H = 0,52; P = 23,01; F = 12,90.

Berekend voor CHF^a^gP^ C - 4,32; H = 0,36; P = 22,29; F = 13,67.

VOORBEELD VII

30 Uit difluormethaanbifosfonzuur werd volgens gebruikelijke methoden het anilinedifluormethaanbifosfonaat verkregen. Deze stof smelt na her-kristalliseren uit ethanol bij 163-165°C.

8301324 * '-(Τ - 9 -

Elementair analyse

Gevonden: C = 50,88; H = 6,02; N = 9,19; P * 9,90

Berekend voor C25fi32F2N4°6P2‘H2° ^tetra-anilinezout als monohydraat): C = 50,80; H = 5,57; N = 9,11; P = 10,08.

5 ÜV spectrum (in een waterige oplossing)

Absorptie maximum bij 279 nm; ε i 3241.

VOORBEELD VIII

Uit difluormethaanbifosfonzuur werd volgens de methode van voorbeeld VII het lysinedifluormethaanbifosfonaat verkregen. Dit lysine-10 zout, dat uit water neerslaat werd verkregen in de vorm van een wit amorf poeder dat bijzonder goed in water oplosbaar is en zeer hydroscopisch is. Een 0,1 M oplossing daarvan heeft een pH van 4,0.

Elementair analyse

Gevonden: C = 30,03; H = 6,42; N = IQ,87; P = 13,01 15 Berekend voor c13H32F2N4°ioP2: C = 30'96; H = 6'39»* N = P = 12,28.

Toxycologisch onderzoek

Dit onderzoek werd uitgevoerd met de volgende onderhavige verbindingen: 4-amino-l-hydroxybutaan-l,1-bisfosfonzuur (AHB^BP); 5-amino-l- hydroxypentaan-1,1-bifosfonzuur (ΑΗΡ BP); difluormethaanbifosfonzuur

E

20 in de vorm van het natriumzout (F2MBP).

Bij wijze van vergelijking werden de volgende stoffen toegepast: 6-amino-l-hydroxyhexaan-l,1-bifosfonzuur (AHE BP) bereid volgens de

X

Italiaanse octrooiaanvrage 19673 A/81 en dichloormethaanbifosfonzuur als het natriumzout (CljMBP) (bekend).

25 Acute giftigheid

Voor dit onderzoek werden Swiss muizen, zowel mannetjes als vrouwtjes,gebruikt: tijdens het experiment werden de dieren gevoed volgens de methode met Altromin in de vorm van tabletten. Voor de orale en intraperitoniale toediening werden 5%'s arabische gom oplossingen toe-30 gepast, terwijl fysiologische zoutoplossingen met pH 4 werden toegepast voor de intraveneuze injecties.

De voorlopige DL^ waarden werden berekend volgens een grafische 8301324 - 10 - methode. Tabel A geeft de cijfers weer voor de LD^q bij Swiss muizen in mg/kg.

TABEL A - LD5q bi3 Swiss muizen in mg/kg os i.p. i.v.

AHB^BP >2,000 - 85 5 AHP BP 1,500 75 85

E

AHE BP > 2,000 125 75 Λ F2MBP > 2,000 450 70 C12MBP > 2,000 750 130

Na de orale toediening, ook bij hoge doseringen, werd geen wijzi-10 ging in het gedrag van het dier waargenomen, geen dood genoteerd en als enig symptoom een zekere verzachting van de uitwerpselen waargenomen. Een autopsie van het gedode proefdier toont slechts een lichte verandering aan bij de nieren, die licht en anemisch van kleur waren.

Na de intraveneuze injecties overlijden de dieren onmiddellijk 15 bij de hoge dosering met convulsies en dyspnoe. Bij een dosering lager dan de lethale dosis zijn de convulsies minder duidelijk en duren ca.

2 uren; na terugkeer tot het normale vertonen de dieren in enkele gevallen toch een overlijden na twee tot vier dagen onder dyspnoe, haar-opzetten en vermindering van de motorische activiteit. Autopsie ver-20 toont nieren met een roze tot geelachtige kleur en bloedingsplaatsen.

De vrouwelijke dieren vertonen hypertrofe en hyperemische ovariën.

De conclusie is, dat de nieuwe bifosfonaten een zekere acute giftigheid en een matige chronische giftigheid vertonen.

Remming van de vorming van kristallen 25 Een model-systeem werd toegepast ter bepaling van het vermogen van de fosfonaten om de vorming van kristallen - in anorganische oplossingen te remmen. Drie oplossingen werden bereid volgens Fleisch.

8301324 - 11 - 1) 0,0107 M KH2P04? 0,117 Μ KCl; 0,01 Μ barbituurzuur 2) 0,0056 Μ cacl2; 0,138 Μ KCl; 0,01 Μ barbituurzuur 3) 0,155 Μ KCl? 0,01 Μ barbituurzuur.

De pH werd met kaliumhydroxyde op 7,4 gebracht. De concentratie 5 aan Ca bedroeg 6,7 mg%, een niveau dat overeenkomt met calcium in bloed dat is geultrafiltreerd en de concentratie van anorganisch fos- -f— faat Pa levert een produkt Ca x Pa « 80. De oplossing werd geana- ++ 3 lyseerd op Ca en Pa en werd verdeeld in Erlenmeyer kolven 12 cm elk.

De kolven werden als volgt in groepen verdeeld: a) Controle

b) ΑΗΕχΒΡ 0.05/aM

c) ΑΗΕχΒΡ 0.25 pli d) ΑΗΕχΒΡ 0.5 /324 •e) ΑΗΕχΒΡ 2.5 /324

f) ΑΗΕχΒΡ 5.0 /oM

g) C12HBP 0.5 /324 h) C12MBP 2.5 /324 i) Cl2MBP 5.0 jaM .

1) F2MBP 0.5/324 ra) F224BP 2.5 /324 n) F2MBP 5.0 /324

o) AHPeBP 0.05 /iM

p) AHPgBP 0.25 /324 q) ΑΗΡ BP 0.5/324

r} AKPeBP 2.5 jaM

s) ΑΗΡ ΒΡ 5.0 jali

t) AHB^BP 0.5 /iM

u) AH3nBP 2.5 /324

V) AHBTTBP 5.0 jaM

8301324 ^ - 12 - en vervolgens onder roeren twee dagen bij 37°C geincubeerd.

Na afloop van deze incubatie werden de oplossingen door millipore filters geleid om de tijdens de incubatie gevormde kristallen op te j·^· vangen; vervólgens werd het filtraat opnieuw op Ca en Pa geanalyseerd. 5 De resultaten zijn in tabel B weergegeven als het produkt van Ca x Pa in de oplossing bij het einde van het experiment.

De cijfers tonen aan, dat de onderhavige bifosfonaten de vorming en de groei van apatietkristallen duidelijk remmen volgens een patroon dat afhankelijk is van de dosis.

8301324

- 13 -TABEL B

' ................. II l l II ------ - _____|_

— I

Waarden voor Ret produkt Ca x Pa in oplossing ί stof - ”

Conc. vóór na pSA . incubatie incubatie ____ i

Controls. 0.0 114.7 29

Cl^BP 0.5 " 44.0 C12MBP 2.5 " 60.4 C12MBP 5.0 " 73.6 ?2&BP 0.5 " 44.6 F2MBP -2.5 " 58.5 F2MBP 5.0 " 72.0 AHS^BP 0.05 " 30.0 AHE^BP 0.25 " 37.5 AHE^BP 0.5 ” 59.6 ΑΗΕχ3Ρ 2.5 " 92.6 ΑΗΕχΒΡ 5.0 " 95.3 AH?_BP 0.05 " 36.7 't ΑΗΡ^,ΒΡ 0.25 " 37.1 ΑΗΡ BP 0.5 ” ' 68.6 Σλ AHP BP 2.5 " 94.0

E

ΑΗΡ 3P 5.0 " 97.5 «C* AKBLrBP 0.5 " 53.2 AHB..3? 2.5 " 83.6 u AHB BP 5.0 " 93.5 ü i _ 8301324 - 14 -

Farmacologische proeven

Het doel van dit onderzoek is het effect na te gaan van een reeks nieuwe bifosfonaten op een cultuur van schedelcellen en op de botreab-sorptie en de mineralisatie in vivo.

5 Toegepaste methoden 1. Experimenten op schedelcellen

Celcultuur: de cellen werden gekweekt volgens de methode van Fast et al (biochem. J. 172, 97-107) (1978)). Samengevat: schedels van één dag oude Wistar ratten werden met collagenase behandeld. 10 De vrijgestelde cellen werden op een plaat aangebracht in een concentratie van 200.000 cellen per cc medium in schijfclusters die geschikt zijn voor deze cultuur waarbij de platen 24 schotelvormige uitsparingen hadden van 1,6 cm diameter waarin 0,5 cm^ medium lag. De cellen werden gekweekt in het essentiële minimum medium met daarin 10% foetaal kalver-15 serum in een atmosfeer van 5% CO2 bij 37°C tot de achtste dag. De bifosfonaten werden op de eerste dag tot het eind van het experiment toegevoegd. Het medium werd vervangen op de eerste, de vierde en de zevende’ dag.

Celtelling 20 De cellen werden, geteld met een Coulter teller nadat zij waren vrijgesteld uit de schijven door een digereren met een mengsel van collagenase en trypsine.

Lactaatbepaling

Op de zevende dag werd het medium gewijzigd en de cellen 16 uren 25 gelncubeerd. Het in deze periode geproduceerde lactaat werd gemeten in een extract in HC104 van het medium onder toepassing van lactatodehydro-genase.

2. Experimenten op de botreabsorptie en in vivo calcificatie

Groepen van vijf Wistar ratten van 180-200 gram werden behandeld 30 gedurende zeven dagen met respectievelijk 0,1, 1,0 en 10 mg P/kg van de volgende bifosfonzuren: difluormethaanbifosfonzuur ^MBP) (in de vorm van het natriumzout) ; 4-amino-l-hydroxybutaanbifosfonzuur (AHB^BP).

8301324 -15- « 5- amino-l-hydroxypentaanbifosf onzuur (ΑΗΡ BP);

E

6- amino-l-hydroxyhexaanbifosfonzuur (AHE BP); Λ dichloormethaanbifosfonzuur (Cl2MBP) (in de vorm van het natriumzout) (1 mg P/kg).

5 De dieren die als blanco's werden genomen werden slechts ingespoten met oplosmiddel en daarin NaCl. Alle behandelingen werden uitgevoerd langs de subcutane weg. De verbindingen werden opgelost in NaCl houdend water bij de twee laagste concentraties en in zuiver water voor de hogere concentratie en werden toegediend in een volume van 0,2 cm^ per 10 100 gram. De dieren werden gevoederd met Altromine 1314 met daarin 1,1 g per 100 g P en 250 IE/100 gram vitamine D^. Op de achtste dag werden de dieren gedood en de tibia verwijderd en gefixeerd in 50%'s ethanol. De tibiae werden vervolgens gedehydrateerd in toenemende concentraties ethanol en geïmpregneerd in methylmethacrylaat na een toe-15 voeging van Plastoid N. De frontale secties werden verwijderd en gesneden tot een dikte van 70-80 ji waarna deze secties geraicroradiogra-feerd werden. Deze procedure maakt het mogelijk de dichtheid van het mineraal in de trabeculaire methaphyse volgens de methode van Shenk et al., te bepalen (Calc. Tiss. Res. 11, 196-214,(1973)).

20 Resultaten 1. Experimenten met schedelcellen.

Als weergegeven in tabel C veroorzaakt Cl2MBP een verlaging in het aantal cellen. Anderzijds heeft F2MBP geen effect of een zeer gering effect in dit verband. De aminoderivaten vertonen een verschil 25 omdat de verbindingen met een oneven aantal koolstofatomen het aantal cellen veel sterker verlagen dan de verbindingen met een even aantal koolstofatomen.

8301324 te ) - 16 - * * * * * * * CM ΙΟ ΙΟ Ο

Η Η Η CN

σι ο γί . ö η· • · ► (U ·

Η CM Τ ^ CO

Ο +| +1 +1 0 +1 in cm in cn cm <u o V.

Γ) _ •M» CT> 'T ,* Γ*· _

in cn Γ" co C

tt) w

H

•p 0 2

3 ' M «-> W

us cn

• 5 rI

s o —' * * +i • m * * -X i m Μ φ -H * * * ' * cn* ^ +J — — —

5 CN CN .<“* IQ «—« 'T

+ 1 § £ Η· Γ> H 03 S

>C w ^ «— >— — Μ φ ,3 dP υ ιΗ Ο ΙΟ r-i CN £ H g ..... ° g 3 CM Η H in CM o _i vri +i +i +i +i 4-1 +i (0 CN U, 4J «? -<3* O ID CN .p, C · · . # · 2 VO CN rH CN in ’ Λ co cn o -s* σ\ ?n +j H * m 2 id Q, * **

0 * CD

jj * j. ^ Π — + in φ -CM Λ Λ 1/1 (]¾ 'T i—i CD CD 03 ' IW www»-.»— α

W

. p» -sr \o co o a) J _j • * · · · ^ O in O r-i rH CN n g

ri CM* -H 4*1 4-1 4-1 +1 C

CQ S

< o H m r·* co u £-i .....

m co o cm cn <i—{ o co ο ο σι Λ Η Η H - c 0)

rH

, rH

V

a I—1

It)

+J

c <e < O'

C

d CU Pj Οι c* 2 a (¾ a ca a •h s ea a w :*? • Λ CN s o CU (3 ft H CN 53 S3 S3 . § u ch <i c <; 8301324 < - 17 -

Wat betreft de produktie van lactaat, deze wordt door Cl^MBP verminderd, zoals wel bekend is. Anderzijds heeft F2MBP hierop geen effect. De aminoderivaten vertonen een toename in de produktie van het lactaat, een feit dat sterker is bij de verbindingen met een oneven 5 aantal koolstofatomen. De cijfers zijn weergegeven in Tabel D.

8301324 - 18 - : c : <u

-9C * * +J

: j i : g«

CN CO Ή O MM

rH H — CN CU 0)

w w - W ft P

: . o 5 X cn I vo <U ¢) [Li CN r» · P» iö ö I ; « ^ H 0 ^ ‘d § w ' <d Λ : +i +» +< r§ +' y h g ^ *"* 00 r§ r> "d0 W +J co σ\ cn * : * $ c? M §* Hcni> * ® _ ~ + 1 u H H : 0 £? 2

1 m u Μ P W

3 -8¾ —--1 ï S " <β c % * : 0 g + ' c3 O * * : 0 S , * O > C * * * m + £

*2 o * * •'OM

H «» U Λ ,-* * v£> ΌφΛ fi ’ CN CN —. <H —> · 5¾¾ Ιΰ ιΗΗΓ>'-'00.®^ί£, > w w w _ w ! " cn

m · . Γ* . . «» fi O

h co σ> H . in . cm <u th P •·*Γ'*·;''£ΐ~ X CNn-^CN^ iJj^0 r§ , , . I <u +i o +1 -H + 1 +1 +1 I c Ό M Ifl <U Ö ft CN H <N co H cn ; g ® 0) · * **^Γ! <υ>Γ-{

1¾ Γ* CO (T> «Τ CO ; ÜCUCU

VO O Γ-* tf) O O' U

g* H " H ί » Cfl , +1 Φ o

Jj £ *H rH

0 -L-· - 1 1 ........... "' — ItJ P \ m <Ü <0 i—(

cm Μ M O

s * * * t! £ 3, m CN --V —* Λ 0) ^ 1 rr »h cn co ca on w ^ cncco Q Ö 0 - j θ'3·ιηοο °ϋΓη pq »··«« ίϋΦ*· § «λ ^ ^ ^ « λ S a ** CN +| +J +1 +1 +! p Q p £ · u

Lrt H o ^ CU dP (0

..... fjj cn rM

r-> cn co ca <n Mwc oo r-\ co a\ o a a rH iH ft P cö X ·Μ

CU Ό CU

- L L - - ...........-.......! « . ·ι-| £ o> p 'CU CU x f-.- '<U o o S' Μ Ό jd ft .(llftft -hIum ^ tQftfflöa ca p ft

.5 s ft D W X

P CN S CQ ft H

M H CN S a B - + ® . Ü ft C c< ^ 8301324 η - 19 -

Experimenten op de botreabsorptie en calcificatie in vivo

Een dier per groep werd bekeken. De cijfers zijn weergegeven in Tabel E- tobet, π - Effect op de botreabsorptie en de mineralisatie van botten.

-Verbinding Dosis Reabsorptie Mineralizatie (mg) F2MBP 10 0.1 AHByBP 10 +++ -/+ 1 ++/++T — 0.1 + _ __ . · Dit experiment werd afgebroken vanwege de ’ • AH-ebp 10 acute giftigheid 1 +++ « 0.1 +++ — ΑΗΞχΒΡ 10 * +++ 1 ++ - 0.1 ci2mbp 1 +/++ * . . I . .» .

. - = geen remming van de reabsorptie of de mineralisatie Tussen + en +++ = toename in de remming van de reabsorptie of de mineralisatie = effect kon niet worden vastgesteld door remming van de mineralisatie.

8301324 ay ii - 20 -

Uit deze tabel blijkt, dat AHP BP het meest actief is bij het remmen van de botreabsorptie. Er werd evenwel een duidelijke giftigheid waargenomen bij de hoogste dosering. De stoffen AHP^P en ΑΗΕχΒΡ zijn eveneens actief op de reabsorptie met een resultaat dat enigszins beter 5 is dan dat van C^MBP. Een duidelijk verschil is er wat betreft de mineralisatie, omdat AHE BP een sterke remming van de mineralisatie in een Λ dosis van 10 mg aan P/kg veroorzaakt, terwijl AHB^BP hierop slechts een betrekkelijk gering effect heeft.

Deze resultaten tonen aan, dat de aminoverbindingen met een oneven 10 aantal koolstof atomen enigszins giftig zijn, maar : aktiever bij het remmen van de botreabsorptie. De verbindingen met een even aantal kool-stofatomen hebben een activiteit die enigszins beter is dan die van Cl9MBP. Een ander significant feit is, dat AHB BP geen of slechts een geringe remming van de mineralisatie veroorzaakt bij een hoge dosering, 15 terwijl AHE BP een sterke remming veroorzaakt. AHB BP blijkt dus meer

Λ U

geschikt bij ziekten met een toegenomen botreabsorptie bij mensen. Tenslotte is het van belang op te merken, dat F2MBP geen effect heeft op de botreabsorptie noch op de botmineralisatie en in verband met het feit, dat deze stof de groei in vitro van de apatietkristallen remt, 20 kan het met succes worden gebruikt bij urolithiasis.

Bifosfonaten die de groei van kristallen kunnen remmen zonder het bot zelf aan te tasten zijn dus uitgebreid onderzocht. Daaruit kan worden geconcludeerd, dat de twee stoffen AHB^BP en ΑΗΡ^,ΒΡ goede geneesmiddelen kunnen vormen voor het remmen van de botreabsorptie en dat F2MBP bruik-25 baar is voor de behandeling van urolithiasis.

De onderhavige farmaceutica kunnen worden bereid voor toepassing in de vorm van capsules of tabletten of als oplossingen voor orale toediening of systemische toediening. Deze preparaten worden liefst tezamen met inerte dragers, zoals suikers (saccharose, glucose en lactose), 30 zetmeel en derivaten daarvan, cellulose en derivaten daarvan, gommen, vetzuren en hun zouten, polyalcoholen, talk en aromatische esters bereid.

De farmaceutische preparaten kunnen oraal worden toegediend in doses van 25 tot 3200 mg per dag of langs parenterale weg in doses van 15 tot 300 mg per dag. De behandeling wordt meestal uitgevoerd gedurende 35 zeven dagen of gedurende perioden van drie maanden, alnaargelang de behoeften.

8301324

Claims

1. Farmaceutisch preparaat, bruikbaar voor de behandeling van urolythiasis en voor het remmen van de botreabsorptie met daarin als actieve stof een bifosfonzuur met de formule 1 van het formuleblad, waarin R een fluoratoom of een rechte of vertakte alkylgroep met 1-5 kool- 5 stofatomen, welke alkylgroep al of niet gesubstitueerd is door een of meer aminogroepen en/of fluoratomen, en R' hydroxyl of fluor voorstellen, alsmede zouten daarvan met een alkalimetaal of een organische base dan wel een basisch aminozuur.

2. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1, toepasbaar voor 10 orale toediening.

3. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1, toepasbaar voor systemische toediening.

4. Werkwijze voor het bereiden van een bifosfonzuur met de formule 1 volgens conclusie 1, waarbij R een aminoalkylgroep en R' hydroxyl 15 voorstellen, met het kenmerk, dat men een aminozuur of een voorloper daarvan laat reageren met fosforigzuur en fosfortrichloride in een inert oplosmiddel, het reactieprodukt hydrolyseert en het gevormde bifosfonzuur uit het reactiemengsel isoleert.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het aminozuur, 20 het fosforigzuur en het fosfortrichloride met elkaar worden omgezet in de verhouding 1:1,5:1,5.

6. De verbinding 5-amino-l-hydroxypentaan-l,1-bifosfonzuur.

7. De verbinding 4-amino-l-hvdroxybutaan-l,1-bifosfonzuur.

8. De verbinding difluormethaanbifosfonzuur. 8301324 1 :f°3H2 E-C-ït' Ε°3Η2 '2 p2c^ëo(or")2_7 3 (ch2)3nh2 h2°3P-c-bo3h2 OH 83 0 1 32 4 Istituto Gentili S.p.A.