MXPA06005676A - Interleucina-23 y su receptor; reactivos y metodos relacionados. - Google Patents

Interleucina-23 y su receptor; reactivos y metodos relacionados.

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Abstract

Acidos nucleicos que codifican proteinas receptoras purificadas de mamifero, v.gr., primate, y fragmentos de las mismas; tambien se proveen anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales; se describen metodos para usar las composiciones para utilidad de diagnostico y terapeutica.

Description

INTERLEUCINA-23 Y SU RECEPTOR: REACTIVOS Y MÉTODOS RELACIONADOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta presentación es una continuación en parte de la solicitud comúnmente cedida con número de serie 10/667,290, presentada eí 18 de septiembre de 2003, que es una divisional de número de serie 09/853,180, presentada el 10 de mayo de 2001 , que reclama beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/203,426, presentada el 10 de mayo de 2000, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para ejercer efecto sobre la fisiología de mamíferos, incluyendo la función del sistema inmune. En particular, provee métodos para regular el desarrollo y/o el sistema inmune. También se describen usos de diagnóstico y terapéuticos de estos materiales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tecnología de ADN recombinante se refiere generalmente a técnicas para integrar información genética de una fuente donadora en vectores para procesamiento subsecuente, tal como por medio de la introducción en un hospedero, por lo que la información genética transferida es copiada y/o expresada en el ambiente nuevo. Por lo común, la información genética existe en forma de ADN complementario (ADNc) derivado de ARN mensajero (ARNm) que codifica un producto de proteína deseado. El portador con frecuencia es un plásmido que tiene la capacidad de incorporar ADNc para posterior replicación en un hospedero y, en algunos casos, para controlar realmente la expresión del ADNc y dirigir así la síntesis del producto codificado en el hospedero. Véase, v.gr., Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2a ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY. Por algún tiempo, se ha sabido que la respuesta inmune de los mamíferos se basa en una serie de interacciones celulares complejas llamadas "red inmune". Investigaciones recientes han provisto nuevas perspectivas en los mecanismos de esta red. Aunque sigue siendo claro que gran parte de la respuesta inmune de hecho tiene que ver con las interacciones en forma de red de los linfocitos, macrófagos, granulocitos y otras células, los inmunólogos ahora generalmente sostienen la opinión de que las proteínas solubles, conocidas como linfocinas, citocinas o monocinas, juegan papeles críticos en el control de estas interacciones celulares. De esta manera, hay un interés considerable en el aislamiento, caracterización y mecanismos de acción de factores moduladores de células, cuya comprensión conducirá a avances importantes en el diagnóstico y terapia de muchas anormalidades médicas, v.gr., trastornos del sistema inmune. Las linfocinas aparentemente son mediadoras de actividades celulares en una variedad de formas. Véase, v.gr., Paul (ed. 1996) Fundamental Immunology 3a ed., Reaven Press, New York; y Thomson (ed. 1994) The Cytokine Handbook 2a ed., Academic Press, San Diego. Se ha mostrado que soportan la proliferación, crecimiento, y/o diferenciación de células madre hematopoyéticas pluripotenciales, en un gran número de progenitores que comprenden linajes celulares diversos que constituyen un sistema inmune complejo. Las interacciones apropiadas y equilibradas entre los componentes celulares son necesarias para una respuesta inmune sana. Los linajes celulares diferentes a menudo responden de una manera diferente cuando se administran linfocinas junto con otros agentes. Los linajes de células especialmente importantes para la respuesta inmune incluyen dos clases de llnfocitos: células B, que pueden producir y secretar inmunoglobulinas (proteínas con la capacidad de reconocer y unirse a material extraño para efectuar su remoción), y células T de varios subconjuntos que secretan linfocinas e inducen o suprimen a las células B y algunas otras células (incluyendo otras células T) que constituyen la red inmune. Estos linfocitos ¡nteractúan con muchos otros tipos de células. La investigación para entender mejor y tratar varios trastornos inmunes ha sido impedida por la incapacidad general para mantener células del sistema inmune in vitro. Los inmunólogos han descubierto que el cultivo de muchas de estas células se puede lograr mediante el uso de sobrenadantes de células T y otras células, que contienen varios factores de crecimiento, incluyendo muchas de las linfocinas. Existen algunos factores de crecimiento y reguladores que modulan el desarrollo morfogenético. Se conocen muchos receptores para citocinas. Con frecuencia, existen por lo menos dos subunidades críticas en el receptor funcional. Véase, por ejemplo, Heinrich, et al. (1998) Biochem.J. 334:297-314; Gonda y D'Andrea (1997) Blood 89:355-369; Presky, et al. (1996) Proc. Nati Acad. Sci. E.U.A. 93:14002-14007; Drachman y Kaushansky (1995) Curr, Opin. Hematol. 2:22-28; Theze (1994) Eur. Cytokine Netw. 5:353-368; y Lemmon y Schlessinger (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 459-463. A partir de lo anterior, es evidente que el descubrimiento y desarrollo de nuevos receptores, incluyendo aquellos similares a las linfocinas, deben contribuir a nuevas terapias para una amplia gama de condiciones degenerativas o anormales que involucran directa o indirectamente el desarrollo, diferenciación o función, v.gr., del sistema inmune y/o células hematopoyéticas. En particular, el descubrimiento y entendimiento de nuevos receptores para moléculas similares a las linfocinas que incrementan o potencian las actividades benéficas de otras linfocinas serían altamente ventajosas. La presente invención provee nuevos receptores para ligandos que tienen similitud a composiciones similares a las citocinas y compuestos relacionados, y métodos para su uso.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a nuevos receptores relacionados con receptores de citocina, v.gr., estructuras moleculares similares a receptor de citocina de primates, designadas como subunidades de receptor de citocina DNAX (DCRS), y sus actividades biológicas. En particular, provee la descripción de una subunidad, designadas como DCRS5 (a.k.a. IL-23R). Incluye ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos mismos y métodos para su producción y uso. Los ácidos nucleicos de la invención se caracterizan, en parte, por su homología a secuencias de ADN complementario (ADNc) clonadas que aquí se anexan. Además, la invención provee la igualación del ligando p40/p19 con subunidades receptoras DCRS5 e IL-12Rß1 , dicho par provee perspectiva en indicaciones para el uso de los agonistas y antagonistas basado en reactivos dirigidos a los mismos. La presente invención provee un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende por lo menos diez aminoácidos contiguos de la porción ¡ntracelular de SEQ ID NO:2. En ciertas modalidades, el polipéptido: comprende por lo menos 25 aminoácidos contiguos de la porción intracelular de SEQ ID NO:2; es recombinante, comprendiendo la porción intracelular de SEQ ID NO:2; además comprende por lo menos diez aminoácidos contiguos de la porción no intracelular de SEQ ID NO:2; comprende por lo menos 25 aminoácidos de la porción extracelular de SEQ ID NO:2; comprende la SEQ ID NO:2 madura; o es un polipéptido natural sustancialmente puro. En otras, el polipéptido recombinante: consiste de la secuencia madura de SEQ ID NO:2; es un polipéptido no glicosilado; es de un humano; comprende por lo menos 40 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; presenta por lo menos tres segmentos no traslapables de por lo menos quince aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; es una variante polimórfica natural de SEQ ID NO:2; tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos; presenta por lo menos dos epítopes no traslapables que son específicos para un DCRS5 de primate; tiene un peso molecular de por lo menos 30 kD con glicosilación natural; es un polipéptido sintético; está en una forma estéril; está en una solución acuosa o regulada en su pH; está unida a un sustrato sólido; está conjugada a otra porción química; o está físicamente asociada con un polipéptido de IL-12Rß1. Otras modalidades de la invención proveen: un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende por lo menos doce aminoácidos contiguos de la porción intracelular de SEQ ID NO:2; o un polipéptido de secuencia natural sustancialmente puro que comprende SEQ ID NO:2 madura. En formas particulares, el polipéptido que comprende por lo menos dos segmentos no traslapables distintos de por lo menos seis aminoácidos contiguos de la porción intracelular de SEQ ID NO:2 estará en donde: los segmentos no traslapables distintos incluyen por lo menos doce aminoácidos; incluyen por lo menos uno de siete aminoácidos y un segundo de por lo menos doce aminoácidos; incluyen un tercer segmento distinto de por lo menos seis aminoácidos; o comprende uno de R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587 o N592-606; o el polipéptido además comprende por lo menos dos segmentos no traslapables distintos de por lo menos seis aminoácidos contiguos de la porción extracelular de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, el polipéptido que comprende por lo menos seis aminoácidos contiguos de la porción intracelular de SEQ ID NO: 2 será uno en donde: el segmento de por lo menos doce aminoácidos contiguos comprende uno de R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428- D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587 o N592-606; o el polipéptido además comprende por lo menos dos segmentos no traslapables distintos de por lo menos seis aminoácidos contiguos de la porción extracelular de SEQ ID NO: 2. O bien, el polipéptido de secuencia natural sustancialmente puro que comprende SEQ ID NO: 2 madura puede comprender además un epítope de purificación o detección. Dichos polipéptidos pueden consistir de la secuencia madura de SEQ ID NO: 2; será un polipéptido no glicosilado; será de un humano; comprende por lo menos 40 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2; presenta por lo menos tres segmentos no traslapables de por lo menos quince aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; es una variante polimórfica natural de SEQ ID NO:2; tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos; presenta por lo menos dos epítopes no traslapables que son específicos para un DCRS5 de primate; tiene un peso molecular de por lo menos 30 kD con glicosilación natural; es un polipéptido sintético; está en una forma estéril; está en una solución acuosa o regulada en su pH; está unida a un sustrato sólido; está conjugada a otra porción química; o está físicamente asociada con un polipéptido de IL-12Rß1. Se proveen algunas otras composiciones, v.gr., que comprenden: un polipéptido sustancialmente puro combinado con la proteína IL-12Rß1 ; o dicho polipéptido en un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina y/o regulador de pH; y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. Se proveen equipos que comprenden un polipéptido y un compartimiento que comprende el polipéptido; un compartimiento que comprende un polipéptido IL-12Rß1 ; un compartimiento que comprende un polipéptido p40, p19 o p40/p19; o instrucciones para usar o desechar reactivos en el equipo. Se proveen anticuerpos y otros compuestos de unión, v.gr., que comprenden un sitio de unión de antígeno de un anticuerpo, que se une específicamente a la porción intracelular del DCRS5, en donde el compuesto de unión está en un contenedor; el polipéptido es de un ser humano; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; el compuesto de unión se conjuga a otra porción química; o el anticuerpo es creado contra una secuencia de péptidos de un polipéptido maduro del cuadro 1 ; es creado contra un DCRS5 maduro; es creado para un DCRS5 humano purificado; es inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a un DCRS5 desnaturalizado; presenta un Kd para un antígeno de por lo menos 30 µm; está unido a un sustrato sólido, incluyendo un glóbulo o una membrana de plástico; está en una composición estéril; o está detectablemente marcado, incluyendo un marcador radioactivo o fluorescente. También se proveen equipos que comprenden el compuesto de unión y un compartimiento que comprende el compuesto de unión; un compartimiento que comprende un polipéptido p40; un polipéptido p 9; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12Rß1 ; un compartimiento que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a: un polipéptido p40; un polipéptido p19; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12Rß1 ; o instrucciones para usar o desechar los reactivos en el equipo. También se proveen métodos, v.gr., para producir un complejo antígeno:anticuerpo, que comprende poner en contacto bajo condiciones apropiadas un polipéptido de DCRS5 de primate con un anticuerpo descrito, permitiendo así que se forme el complejo. Dicho método puede ser aquel en donde: el complejo es purificado a partir de otros receptores de citocina; el i complejo es purificado a partir de otro anticuerpo; el contacto es con una muestra que comprende un interferón; el contacto permite la detección cuantitativa del antígeno; el contacto es con una muestra que comprende el antígeno; o el contacto permite la detección cuantitativa del anticuerpo. Se proveen otras composiciones v.gr., una composición que comprende: un compuesto de unión estéril, o el compuesto de unión y un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina y/o regulador de pH; y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. La invención también provee un ácido nucleico incluyen aislado o recombinante que codifica el polipéptido DCRS5, en donde el DCRS5 es de un ser humano; o el ácido nucleico: codifica una secuencia de polipéptido antigénico de SEQ ID NO: 2; codifica una pluralidad de secuencias de péptido antigénico de SEQ ID NO: 2; presenta identidad sobre por lo menos trece nucléotidos a un ADNc natural que codifica el segmento; es un vector de expresión; comprende además un origen de replicación; es de una fuente natural; comprende un marcador detectable; comprende una secuencia de nucléotidos sintética; es menor que 6 kb; preferiblemente menor que 3 kb; es de un primate; comprende una secuencia de codificación de longitud completa natural; es una sonda de hibridación para un gen que codifica el DCRS5; o es un iniciador de PCR, producto de PCR o iniciador de mutagénesis. Se provee células que comprenden el ácido nucleico recombinante, incluyendo en donde la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate o una célula humana. Las modalidades de equipo incluyen aquellas que comprenden el ácido nucleico y un compartimiento que comprende el ácido nucleico; un compartimiento que comprende un ácido nucleico que codifica: un polipéptido p40; un polipéptido p19; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12Rß1 ; un compartimiento que comprende un polipéptido p40; un polipéptido p19; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12Rß1 ; un compartimiento que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a: un polipéptido p40; un polipéptido p19; un polipéptido DCRS5; y/o un polipéptido IL-12Rß1 ; o instrucciones para usar o desechar los reactivos en el equipo. Otras modalidades de ácido nucleico incluyen aquellas que: hibridan bajo condiciones de lavado de 30 minutos a 30°C y menos de 2M de sal a la porción de SEQ ID NO: 1 que codifica la porción ¡ntracelular; o presentan identidad en una extensión de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos a la porción intracelular de DCRS5 de primate. Preferiblemente, dicho ácido nucleico será aquel en donde: las condiciones de lavado son a 45°C y/o 500 mM de sal; a 55°C y/o 150 mM de sal; o la extensión es por lo menos de 55 a 75 nucleótidos. Los usos terapéuticos incluyen métodos de modulación de la fisiología o desarrollo de una célula que comprenden poner en contacto la célula con: un antagonista de p40/p19 que es un complejo que comprende: la porción extracelular de un DCRS5 de primate y/o la porción extracelular de IL-12Rß1 de primate; un antagonista de p40/p19 que es un anticuerpo que se une a un complejo que comprende: DCRS5 de primate y/o IL-12Rß1 de primate; un antagonista de p40/p19 que es un anticuerpo que se une a DCRS5; un antagonista de p40/p19 que es un anticuerpo para IL-12Rß1 ; un antagonista de p40/p19 que es un áicod nucleico de antisentido para DCRS5 o IL-12Rß1 ; o un agonista de p40/p19 que es un anticuerpo se une a un complejo que comprende DCRS5 de primate y/o IL-12Rß1 de primate. En un tipo de método, el contacto es con un antagonista, y el contacto está en combinación con un antagonista de IL-12, IL-18, FNT y/o IFN?; o la célula es de un hospedero que: presenta signos o síntomas de una enfermedad mediada por TH1; presenta signos o síntomas de una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes, psoriasis o sepsia; o recibe un trasplante alogeneico. Por el contrario, el método puede ser poner en contacto con un agonista y el contacto es en combinación con IL-12, IL-18, FNT y/o IFN?; o la célula es de un hospedero que: presenta signos o síntomas de una respuesta a TH2 crónica; quienes padecen de un crecimiento de tumor, viral o micótico; recibe una vacuna; o quienes padecen de una respuesta alérgica. La invención provee un método de tratamiento de un sujeto humano que experimenta un trastorno fisiológico que comprende administrar una cantidad efectiva de un agonista o antagonista de DCRS5 (SEQ ID Nos: 1 ó 2) o de p19 (SEQ ID Nos: 5 ó 6), en donde el trastorno comprende artritis reumatoide; asma o alergia; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); un trastorno pulmonar intersticial, un trastorno intestinal inflamatorio (IBD); o un trastorno de la piel inflamatorio. También se provee el método anterior en donde el trastorno de la piel es psoriasis o dermatitis atópica; en donde el IBD es enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa; en donde el trastorno pulmonar intersticial es fibrosis pulmonar idiopática; granuloma eosinofílico o pneumonitis por hipersensibilidad. En otra modalidad, la invención provee el método anterior en donde el antagonista comprende una composición de unión derivada del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a DCRS5 (SEQ ID NO: 2) o de p19 (SEQ ID NO: 6); o el método anterior en donde la composición de unión comprende un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humanizado; un fragmento Fab, Fv o F(ab')2; o el método anterior en donde el agonista comprende DCRS5 (SEQ ID NO: 2) o de p19 (SEQ ID NO: 6), así como el método anterior en donde el agonista o antagonista comprende un ácido nucleico, o en donde el antagonista comprende un ácido nucleico de antisentido o un ácido nucleico de interferencia de ARN. Otra modalidad más de la presente ¡nvención es un método de diagnóstico de un trastorno fisiológico que comprende poner en contacto una composición de unión que se une específicamente a DCRS5 (SEQ ID NO: 2) o de p19 (SEQ ID NO: 6), a una muestra derivada de un sujeto de prueba que experimenta artritis reumatoide; asma o alergia; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); un trastorno pulmonar intersticial, un trastorno intestinal inflamatorio (IBD); o un trastorno de la piel inflamatorio. También se provee el método anterior, que comprende además poner en contacto la composición de unión con una muestra derivada de un sujeto de control o muestra de control; y comparar la unión encontrada con el sujeto de prueba con la unión encontrada con el sujeto de control o muestra de control. Se provee el método anterior, en donde la composición de unión comprende un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humanizado; un fragmento Fab, Fv o F(ab')2; un ácido nucleico; o un marcador detectable; así como el método anterior en donde el ácido nucleico comprende una sonda o iniciador, o una guía molecular. En otra modalidad, la invención provee el método anterior de diagnóstico, en donde la muestra se deriva de una célula, tejido o fluido biológico humano; un donde el trastorno de la piel es psoriasis o dermatitis atópica; en donde el IBD es enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa; o en donde el trastorno pulmonar intersticial es fibrosis pulmonar idiopática; granuloma eosinofílico o pneumonitis por hipersensibilidad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Como se usa aquí, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una", "el" y la" incluyen sus referencias plurales correspondientes, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Todas las referencias citadas aquí se incorporan por referencia al mismo grado como si cada publicación, solicitud de patente o patente individual fuera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada por referencia.
I. Aspectos generales La presente invención provee la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de moléculas de subunidad similares a receptores de citocina de mamífero, aquí de primate, esta designada como subunidad de receptor de citocina DNAX 5 (DCRS5), que tiene propiedades definidas particulares, tanto estructurales como biológicas. Varios ADNc que codifican estas moléculas se obtuvieron de genotecas de secuencias de ADNc de primate, v.gr., humano. Otras contrapartes de primates u otros mamíferos también serían deseables. Además, la invención provee igualación del ligando de p40/p19 con subunidades de receptor DCRS5 e IL-12Rß1 , par que provee perspectiva en indicaciones para el uso de los agonistas y antagonistas con base en reactivos dirigidos a los mismos. Algunos de los métodos estándares aplicables se describen o se hace referencia a los mismos, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, (2a de.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1 ) y de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 2) de un segmento codificador DCRS5 humano se proveen. La secuencia de señal predicha se indica, pero puede depender del tipo de célula, o puede ser algunos residuos en cualquier dirección. Los sitios de glicosilación N potencial están en los residuos de asparagina 6, 24, 58, 118, 157, 209 y 250 (SEQ ID NO: 2). Los enlaces de disulfuro probablemente se encuendan entre los residuos de cisteína en las posiciones 9 y 78; y un motivo C_CXW conservado se encuentra en las posiciones 110/121/123. El triptofano en 219; y el motivo WxxWS de 281-285 son notorios. El segmento de aproximadamente 1-101 está en el dominio de Ig; de aproximadamente 102-195 es un dominio de unión de citocina 1 ; de aproximadamente 196-297 es un dominio de unión de citocina 2; de aproximadamente 298-330 es un enlazador; de 329-354 es un segmento de trasnmembrana; y de aproximadamente 356-606 es un dominio intracelular. Las características intracelulares incluyen sitios de unión de SH2 putativos en Y374-I377, Y461-Q464 y Y588-Q591; y residuos de tirosina potencialmente importantes en 406, 427, 440 y 453. El marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) contiene una secuencia de señal putativa que se predice que ha de ser digerida en...CHG/GIT... como se mostró anteriormente. Un dominio extracelular predicho de 328 aminoácidos es seguido por un segmento de transmembrana putativo, y finalmente un dominio citoplásmico de aproximadamente 252 aminoácidos. Las funciones de unión a ligando se predice que radican en el dominio extracelular. Las posiciones identificadas de variación están en los nucleótidos 127 y 563 (SEQ ID NO: 1 ). El codón que contiene el nucleótido 127 podría codificar histidina o glutamina, mientras que el codon que contiene el nucleótido 563 podría codificar arginina, glicina o triptofano.
CUADRO 1 Alineación de varias subunidades de receptor de citocina. Proteína de receptor de IL-6 humana gp130 es SEQ ID NO: 3 (GenBank M57230): la subunidad beta2 del receptor de IL-2 humano es SEQ ID NO: 4 (GenBank U64198) huIL-12Rß2 1 lyUffi FRGCSLMTM II WL IKM^ 48 Íiugpl30 1 MLTIÍQTW QALFIFLTTESTGEJLILDPCG YISPESPWQ.I/HSNFT 45 hüDCRSS 1 HHVTIQVTOAVIMi?lLFSÍICKGGITNIlJCS-GHI?rvpePATIFKMGMNIS 49 * * huII.-12Rß2 49 ITCSLKPRQGCFHYSREMiO.ILYKFPRRIH'FHHGHSI.WSQVTGLPJ.G 35 hugpl30 46 95 uDCRS5 50 IYCQAAIKH--CQP RKIOTYKNGI ER-FQITRINKTTARLW ??FL 93 huI -12Rß2 96 --traFVCKLP.ClirSD-EIQICGñEIFVsV?E'EQPQ¡!p.SCIQKGEQGT\i'A 142 hugpl30 36 SLNIQ T^ILTFGQL-BQmrYGITITSGLPPE PIOttSCIVlJ-EG iaiR 14 huDCR?5 94 EPHASMYCTAECPiaiFQETLICGIFISSGYPPmPDEVTCV?YBYSG T 143 Jhu.IL-12Rß2 143 CTWERGEDTH YTEYTLQLSGPI<KI.TWQ QCIÍDIYCDYI_DFGIJíp.TPESP 132 Jaugpl30 144 CEWDGsRETH E NF L]^---EWATHKFAI»C ñKRDTPTSCTVDYS-T,VY 190 huDCRS5 144 CTl?WARKITYID?Yv?HVKSLETEEEQQY TSSYIWISTIlSLQGG 189 huIL-12Rß2 193 ESOTTAKUTAVNSLGSSSSLPSTFTFLDIVRPLPPWDIRIIFQ ASVSRC 242 b.ugpl30 1S1 FWraEVWVEAEKA G VTSDHIKFDPVYKVKPNPPB3!&SVTISrSEELSßII, 240 huDCRSB 190 -Km> WQAAmi.GKri SKQLQ3HM^ 238 * * * *-* huII.-12Rßa 243 285 ??ugpl30 241 KLTWTlTOSIKBVIILKYlíIQ?RTKDASTPíSQIPPEDTASTRSSF VQDLK 290 huDCRSS 239 IIYTTOS--QTTIEK^SCElTOYKATTWQTMVKEFD-TÍSrFTYVQQSEFYI;E 285 IlUl -12Rß2 286 PFTEYEFQISSKLHIÍY GS SDWSES l^QTPEEEPTGlviLD'?YMJffiHID 335 lmgpl30 291 PFTEYVFRIRCMJCEDG GYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSF YKIDPSH 340 111ÍDCRS5 286 PMIK.YVFQ'VRCQ-ETGKRYOQPWSSPFFHK.TPETVP 320 UuIL-12Rß2 336 YS-RQQISLFVKK SVSEARG ILHYQVTLQELTGGKAMTQITITGHTSWT 3B4 ?mgpl3Q 341 TQGYRTv"Q VWKT PPFEAtTG ILDYEVT LTRWKBHSiQ?mTOr TKL 3B7 huDCRSS 321 QVTS AFQBDTWNSG TVASISTG H1TSDI?— GDIG L 357 &UlL~12Rß2 435 DWI VTWQPPRKDPSAVQEYV^ R?LHPG-GDTQVP lilWI.RSRP'i srv'SA 483 Jt gpl30 437 NML VBWTTPRE SVKKYILBWCV S DKAPCITDWQQEDGTVHRT 480 huDGRSS 388 I LLIPKWLYEDIPÍOTIÍNSKVV MIiQEíSr SE 417 lmI -12Rß2 484 LISElíIKSYICYEIRVYALSGDQ-GGCSSILGIJSKHKAP SGPHINAI'rE 532 ?mgpl3Q 481 YLRC^I?ESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYIJKQAPPSKGPTVRTIÍ?V' 530 1?UDCRS5 418 LMN??NSSE QVLYTOP MITSIKEIFIPEH PTD?KKB- 453 h.u? -12Rß2 533 E GSILISVOTSIPVQEQ GCI1I5HYRIYWK15.RDSHSQPQLCEIPYRVSQIÍÍS 582 hugp.130 531 GKKEAVL?WDQ PVDVQNGFIRWYTIFYRTIIG?J ETAVNVDSSHTE 57S httDCRS5 454 - -HTGP ETRDYP QNSJ^ Dim^V IPDLNTG YKEQISKI-- 490 l I -12Rß2 583 HPIHS QPR¥T VLímTALTAftG?SSHGNEREFCLQC3KAN-l¡Wía3?VAPSI 631 ugpl30 577 YTLSS TSDTLYMVRMAAYTDEG-GKDGPEFTFTTP PAQGEIEAIWPV 625 uDCRSd 491 FLPEG 495 uII1-12Rß2 632 CIAIIMVGIFSTHYFQQ VFVL AADRP QWCSREIPDPA 670 ugp!30 626 CLAFLLTTLLGVLFCFl^?RDLIKKHI PlWPDPSKSH?AQ SPHTPPRHN 675 httDCRS5 96 SHJ-,SNH5r-ElTSLTLKP PVDS DSG- 519 huII1-12Rß2 671 NSTCñKKYPlAE?KTQI?PLDRI?IjID- POTEDPE:PLVlS--EVI-HQVTPV 717 h-U9p 30 676 F?SKDQMYSDGNFTDVSVVEIEAlTOKKPFPEü KSIiDLFKK? IRTEGHS 725 hx?DCRS5 520 JMPRLQKHPN-FAFSVSSVNSLSNT 1 FIIGEIISIII 552 httIL-12Rß2 718 FRHPPCSJMP R?KGIQGHQASBKDtMHSASSPPPPRMiQAESSQlj'VD Y 757 hugpl3Ó 726 SGIGGSSCMSSSRP?ISSSDEHESSQNTSSTVQYSTWHeSGYRHQVPSVQ 775 huDCRSS 553 LUQGECS S — PDIQNSVEEETTMId-EHDSP 580 3lUl -12Rß2 768 K LESRGSDPKPBl?P?CPWTVliPAßDLPTHDGY PSISI IDDLPSKEAP 814 t?gpl30 776 VFSRS?STQPLLDeEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQEESS B25 huOCRS5 581 --SETIPEQTLLPDEFVSC^IVEffiELPSINTYFP? ' X ESHFJS5R- - 623 htiH.-12Rjj2 815 L?DS EELEPQHIS S VFPSSSLHPLTFSCG 845 ?mgpl30 826 PDISHFERSKQVSSVNEEDFVR KQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAAD 875 ?1 DCRS5 624 --ISIiLEK 629 * * Ía IL-12Rß2 846 DKLTIDQLKMRCDSIiML 862 hugpl30 876 AFGPGTEGQVERFETVGM?AATDEGMPKSY PQTVRQGGYMPQ 918 uDCRSS 630 629 Los parientes más cercanos del dominio extracelular de "IL-30R" son el transductor de señal de IL-6 gp130 e IL-12Rß2. Parientes un poco menos cercanos son el receptor de GCSF, receptor de leptina, receptor de factor inhibidor de leucemia y receptor de CNTF. Por lo tanto, "IL-30R" es un miembro de la rama de clase I de la superfamilia de receptor de citocina y está estrechamente relacionado con la familia de IL-6R/IL-12R. El cuadro 1 muestra la comparación de las secuencias disponibles de las subunidades de receptor de primate, con el DCRS5 (IL- 30R) de primate, v.gr., humano. El DCRS5 muestra similitud con la subunidad gp130 del receptor de IL-6 (v.gr., subunidad IL-6R) y la subunidad IL-12Rß2. El DCRS5 muestra características estructurales de una subunidad beta, pero la secuencia real de interacciones de proteína y señalización sigue sin resolverse. Tal como se usa aquí, el término DCRS5 se usará para describir una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En muchos casos, un fragmento sustancial de la misma será funcionalmente o estructuralmente equivalente, incluyendo, v.gr, segmentos extracelulares adicionales. La invención también incluye una variación de proteína del alelo de DCRS5 respectivo cuya secuencia se provee, v.gr., una muteína u otra construcción. Típicamente, dichas variantes presentarán menos de aproximadamente 10% de diferencia de secuencia con la región objetivo, y por lo tanto a menudo tendrán sustituciones de entre 1 y 11 veces, por ejemplo, 2, 3, 5, 7 veces y otras. También abarca variantes alélicas y otras variantes, por ejemplo, polimorfismos naturales, de la proteína descrita. Típicamente, se unirá a su ligando biológico correspondiente quizás en un estado dimerizado con una subunidad de receptor alfa, con alta afinidad, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 100 nM, por lo general mejor que aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor que 10 nM, y muy preferiblemente mejor que aproximadamente 3 nM. El término también se usará aquí para referirse a formas que se presentan en forma natural relacionadas, por ejemplo, alelos, variantes polimórficas y variantes metabólicas de la proteína de mamífero. Formas preferidas de los complejos receptores se unirán al ligando apropiado con afinidad y selectividad apropiadas para una interacción del ligando-receptor. Esta invención también comprende combinaciones de proteínas o péptidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 2 y 6. Incluirán variantes de secuencia con relativamente pocas sustituciones, por ejemplo, preferiblemente menos de aproximadamente 3-5. Composiciones de unión específicas para p19 humano se pueden preparar por inmunización con un segmento antigénico o fragmento de p19. Estas composiciones de unión abarcan anticuerpos policlonales; anticuerpos monoclonales; anticuerpos humanizados; fragmentos de anticuerpo, v.gr., fragmento Fab, Fv o F(ab')2; diacuerpos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos bifuncionales y péptidos miméticos de un anticuerpo. Regiones de antigenicidad incrementada de p19 humano incluyen, v.gr., aminoácidos 16-21 ; 57-69; 72-81 ; 136-140; 143-146; 151-154; y 135-164, de SEQ ID NO: 6, de acuerdo con análisis de Parker, et al. (1986) Biochemistry 25:5425-5432 y Welling, et al. (1985) FEBS Lett. 188: 215-218, opcionalmente con el uso de software de Vector Inc., Bethesda, MD).
Un "fragmento" o "segmento" de polipéptido sustancial es una extensión de residuos de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente de por lo menos 10 aminoácidos, muy generalmente de por lo menos 12 aminoácidos, a menudo de por lo menos 14 aminoácidos, muy a menudo de por lo menos 16 aminoácidos, típicamente de por lo menos 18 aminoácidos, muy típicamente de por lo menos 20 aminoácidos, por lo general de por lo menos 22 aminoácidos, muy generalmente de por lo menos 24 aminoácidos, preferiblemente de por lo menos 26 aminoácidos, muy preferiblemente de por lo menos 28 aminoácidos y en modalidades particularmente preferidas, por lo menos aproximadamente 30 o más aminoácidos. Las secuencias de segmentos de diferentes proteínas se pueden comparar unas con otras sobre extensiones de longitud apropiadas. En muchas sustituciones, los fragmentos pueden presentar propiedades funcionales de las subunidades intactas, por ejemplo, el dominio extracelular del receptor de transmembrana puede retener las características de unión del ligando, y se puede usar para preparar el complejo similar a receptor soluble. La homología de secuencia de aminoácidos, o identidad de secuencia, se determina optimizando coincidencias de residuos. En algunas comparaciones se pueden introducir espacios según se requiera; véase, por ejemplo, Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al., (1983) capítulo uno en Time Warps, String Edits, y Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; paquetes de software IntelliGenetics, Mountain View, CA; y the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG; Grupo de Computación en Genética de la Universidad de Wisconsin), Madison, Wl. Esto cambia al considerar sustituciones conservativas como coincidencias. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leuclna; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Se pretende que las secuencias de aminoácidos homologas incluyan variaciones alélicas naturales y de ¡nterespecies en la secuencia de citocina. Las proteínas o péptídos homólogos típicos tendrán una homología de 50 a 100% (si se puede introducir espacios), a una homología de 60 a 100% (si se incluyen sustituciones conservativas) con un segmento de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Las mediciones de homología serán por lo menos de aproximadamente 70%, generalmente por lo menos de 76%, muy generalmente por lo menos de 81%, a menudo por lo menos de 85%, muy a menudo por lo menos de 88%, típicamente por lo menos de 90%, muy típicamente por lo menos de 92%, usualmente por lo menos de 94%, muy usualmente por lo menos de 95%, preferiblemente por lo menos de 96% y muy preferiblemente por lo menos de 97%, y en modalidades particularmente preferidas, por lo menos 98% o más. El grado de homología variará con la longitud de los segmentos comparados. Las proteínas o péptidos homólogos, tales como las variaciones alélicas, compartirán la mayoría de las actividades biológicas con SEQ ID NO: 2, particularmente la porción intracelular. Tal como se usa aquí, el término "actividad biológica" se usa para describir, sin limitación, efectos sobre señalización, respuestas inflamatorias, inmunidad innata y/o desarrollo morfogénico por ligandos similares a citocina. Por ejemplo, estos receptores mediarían las actividades de la fosfatasa o fosforilasa, dichas actividades son fácilmente medidas mediante procedimientos estándares. Véase, por ejemplo, Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991 ) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61 :743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spríng Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738. Los receptores, o porciones de los mismos, pueden ser útiles como enzimas marcadoras de fosfato para marcar sustratos generales o específicos. Las subunidades también pueden ser inmunógenos funcionales para inducir anticuerpos reconocibles o antígenos capaces de unirse a anticuerpos. Los términos ligando, agonista, antagonista y análogo de, por ejemplo, una característica de la proteína DCRS5 de interacciones de receptor de ligando, por ejemplo, en donde el receptor es un receptor natural o un anticuerpo. Las respuestas celulares, probablemente son típicamente mediadas a través de las vías del receptor tirosina cinasa. También, un ligando es una molécula que sirve ya sea como un ligando natural al cual se une dicho receptor o un análogo del mismo o una molécula que es un análogo funcional del ligando natural. El análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula completamente no relacionada que tenga una forma molecular que interactúe con los determinantes de unión del ligando apropiados. Los ligandos pueden servir como agonistas o antagonistas, véase, por ejemplo, Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press. New York. El diseño de fármaco racional se puede basar también en estudios estructurales de las formas moleculares de un receptor o anticuerpo y otros efectores o ligandos. Véase, por ejemplo, Herz, et al. (1997) J. Recept. Signal Transduct. Res. 17:671-776; y Chaiken, et al. (1996) Trends Biotechnol. 14:369-375. Los efectores pueden ser otras proteínas que son mediadoras de otras funciones en respuesta a la unión de ligando, u otras proteínas que normalmente interactúan con el receptor. Un medio para determinar qué sitios ¡nteractúan con otras proteínas específicas es una determinación de estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensionales. Estas proveerán una guía mediante la cual los residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteína, véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York, que se incorpora aquí por referencia.
II. Actividades Las proteínas similares a receptor de citocina tendrán muchas actividades biológicas diferentes, por ejemplo, señalización intracelular, v.gr., a través de STAT4, modulación de la proliferación de células, o en el metabolismo de fosfato, añadiéndose o removiéndose de sustratos específicos, típicamente proteínas. Esto generalmente dará por resultado la modificación de una función inflamatoria, otra respuesta inmune innata o un efecto morfológico. La subunidad probablemente tendrá una baja afinidad específica al ligando. Las DCRS5 tienen motivos característicos de receptores que dan señalización a través de la vía JAK. Véase, v.gr., Ihle et al. (1997) Stem Cells 15 (suplemto 1 ): 105-111 ; Silvennionen et al., (1997) APMIS 105:497-509, Levy (1997) Cytokine Growth Factor Review 8:81-90; Winston y Hunter (1996) Current Biol. 6:668-671 ; Barret (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol 10:1-15; y Briscoe et al. (1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351 :167-171. De particular interés son los motivos de unión a SH2 anteriormente descritos. Las actividades biológicas de las subunidades de receptor de citocina estarán relacionadas con la adición o remoción de porciones de fosfato a los sustratos, típicamente de una manera específica, pero ocasionalmente de una manera no específica. Los sustratos se pueden identificar, o las condiciones para actividad enzimática se pueden probar mediante métodos estándares, por ejemplo, como se describe en Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991 ) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1950) Cell 61 :743-752; Pines, et al. (1991 ) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738. Las subunidades de receptor pueden combinarse para formar complejos funcionales, por ejemplo, que pueden ser útiles para unir ligando o preparar anticuerpo. Estas tendrán usos de diagnósticos sustanciales, incluyendo la detección o cuantificación. El enlace funcional del receptor con el ligando p40/p19 provee perspectivas importantes a las indicaciones clínicas para el que el receptor será útil. Por lo tanto, los antagonistas y agonistas tendrán efectos funcionales predichos. Con la activación, las células cebadas, células T y células NK muestran expresión incrementada de la subunidad p19 de IL-23, mientras que las células dendríticas activadas muestran expresión incrementada de la subunidad p40. Estas células han sido implicadas en las patologías de variois trastornos y condiciones inflamatorias. Las células cebadas juegan un papel en la etiología de asma y alergia, COPD, artritis reumatoide, IBD, v.gr., enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, e inflamación de la piel, v.gr., psoriasis y dermatitis atópica, véase, v.gr., Edwards (2003) Clin. Exp. Allergy 33: 1164- 1165; Grashoff, et al. (1997) Am. J. Pathol. 151 : 1785-1790; Woolley (2003) New Engl. J. Med. 348: 1709-1711 ; Malaviya, et al. (1995) Am. J. Ther. 2: 787-792; Jiang, et al. (2001) Int. J. Dermatol. 40: 699-703.
Las células NK están involucradas en los mecanismos de asma y alergia, artritis reumatoide, y trastornos de la piel, v.gr., psoriasis o dermatitis atópica, véase, v.gr., Korsgren (2002) Curr. Pharm. Des. 8:1871-1876; Cameron, et al. (2003). Br. J. Dermatol. 149: 160-164. Los DCs han sido implicados en asma y alergias, artritis reumatoide, trastornos intestinales inflamatorios (IBDs) tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, y trastornos de la piel, v.gr., psoriasis y dermatitis atópica, véase, v.gr., Upham (2003) Respirology 8:140- 148; Santiago-Schwarz, et al. (2001 ) J. Immunol. 167:1758-1768; Stagg, et al. (2003) Gut 52:1522-1529; Mrowietz, et al. (2001 ) Exp. Dermatol. 10:238-245. La subunidad de p19 de IL-23 muestra expresión incrementada con varios trastornos pulmonares, v.gr., trastornos pulmonares Intersticiales.
La ¡nvención provee un agonista o antagonista de IL-23, v.gr., una composición de unión específica para un polipéptido o ácido nucleico de p19 o DCRS5, para el tratamiento o diagnóstico de un trastorno pulmonar intersticial. Los trastornos pulmonares intersticiales incluyen fibrosis pulmonar idiopática, granuloma pulmonar eosinofílico, y pneumonitis por hipersensibilidad. La fibrosis pulmonar idiopática, que tiene un pronóstico desconsolador, involucra células epiteliales alveolares activados, focos fibroblásticos, y depósito de matriz extracelular. Se presenta inflamación, pero la característica principal es focos fibroblásticos (véase, v.gr., Kamp (2003) Chest 124:1187-1189; White, et al. (2003) J. Patrol. 201 : 343-354). El granuloma pulmonar eosinofílico es { una histiocitosis no maligna localizada. Puede resolver, o progresar a una etapa fibrótica. El trastorno está asociado con fumar (véase, v.gr., Levine y Nickelleit (1994) New J. Med. 330: 347-353; Rajagopol y Mark (2002) New Engl. J. Med. 347:1262-1268; Miadonna et al. (2000) Monaldi Arch Chest Dis. 55:3-5). La pneumonitis por hipersensibilidad (a.k.a. alveolitis alérgica extrínseca), causada por alérgenos inhalados, involucra inflamación en vías aéreas periféricas y tejidos intersticiales circundantes. Los monocitos se acumulan y maduran en macrófagos esponjosos que se desarrollan en granulomas. El trastorno también involucra bronquiolitis, infiltración de linfocitos intersticial, y pueden incluir una fibrosis de "pulmón en forma de panal" (véase, v.gr., Patel, et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108: 661-670; Yi (2002) Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 39: 581-629). La subunidad p19 de IL-23 también muestra expresión incrementada con tratamiento de Ascaris. El tratamiento de Ascaris es un modelo para alergias y asma. El tratamiento de helmintos, v.gr., Ascaris, se usa en modelos animales de trastornos pulmonares, v.gr., hiperreactividad de vías aéreas; asma, eosinofilia pulmonar, y alergias. El tratamiento de Ascaris induce eosinofilia pulmonar, un rasgo característico de asma. Ascaris también induce neutrofilia pulmonar, un rasgo característico de COPD. La exposición a Ascaris ha sido asociada con asma en humanos (véase, v.gr., Billah et al. (2002), J. Pharmacol. Exp. Therapeutics: 302:127-137; Mochizuki, et al. (2001 ) Eur. J. Pharmacol. 430:123-133; Boucher, et al. (1979) J. Allergy Clin. Immunol. 64:197-201 ; Padrid, et al (1995) Am. J, Resp. Crit. Care Med. 151 :184-193; Sengoku et al. (2001) Pharmacol. 63:82-89; Abraham, et al. (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159:1205-1214; Jones, et al. (1998) Can. J. Physiol. Pharmacol. 76: 210-217; Wright, et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 289:1007-1014; D'Brot, et al. (1989) Am. Rev. Respir. Dis. 139: 915-920; Barnes (2000) New Engl. J. Med. 343: 269-280; Palmer, et al. (2002) Am. J. Respir. Crít. Care Med. 165:1489-1493; Lynch, et al. (1997) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156: 50-54). La expresión incrementada de la subunidad p19 de IL-23 y de IL- 23R se presenta, v.gr., en enfermedad de Crohn. Más aún, helmintos, protozoarios y parásitos se han asociado con una incidencia incrementada en inflamación intestinal, v.gr., IBD (véase, v.gr., Sacco, et al. (1998) Am. J. Pathol. 153: 1717-1722; Takeyama, et al. (1997) J. Gastroenterol. Hepatol. 12:204-206; Bundy (1986) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 80:706-718; Tanaka, et al. (1983) Parasitology 86: 291-300; Ustun, et al. (2003) World J. Gastroenterol 9: 1834-1835; Waters, et al. (1999) J. Parásito!. 85:1100-1105; Faussone-Pellegrini, et al. (2002) Neurogastroenterol. Motil. 14: 83-95). La IL-23R de la presente invención incrementa en expresión sobre células Clara de pacientes con COPD. Las células Clara son células epiteliales respiratorias no ciliadas de las vías aéreas que modulan la patología de vías aéreas v.gr., en asma, humo de cigarro, y COPD. Se ha correlacionado a COPD con cambios en la fisiología de células Clara (véase, v.gr., Pilette, et al. (2001 ) Am. J. Respir. Crít. Care Med. 163: 185-194; Kaup, et al. (1990) Equine Vet 22: 349-355; Zhang, et al. (2001) Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi: 524-526). Las células Clara producen un número de moléculas que modulan la respuesta inmune, v.gr., uteroglobulina (a.k.a. proteína secretora de células Clara). En asma y COPD, hay una disminución en células Clara y un incremento en células de la mucosa, en donde el incremento consecuente en producción de moco contribuye a obstrucción de vías aéreas. Las células Clara parecen ser células precursoras de células de la mucosa (véase, v.gr., Jeffrey (1998) Thorax 553: 129-136; Rogers (2002) Clin. Exp. Allergy 32:1124-1127; Watson, et al. (2001 ) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol, 281:L1523-L1530; Reader, et al. (2003) Am. J. Physiol. 162: 2069- 2078; Stripp, et al. (2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol 27: 170-178). La fibrosis es un rasgo de la patología de asma y trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD), véase, v.gr., Barnes (2000) New Engl. J. Med. 343:269-280; Barnes (2000) C/?esM 17:10s-14s Saetta, et al. (2001) Eur. Respir. J. Suppl. 34:18s-23s; Redington (2000) Monadi Arch. Chest Dis. 55: 317-323; Vignola, et al. (2001 ) Curr. Allergy Asthma Rep. 1 :108-115. Las citocinas, el factor de necrosis tumoral (FNT), IL-4, o IL-13, pueden estimular la expresión de IL-23, p19 o DCRS5 (a.k.a. IL-23R). Por el contrario, IL-23 puede estimular la expresión de un número de citocinas, v.gr., IL-6, IL-19, CXCL-1 , y IL-17. FNT contribuye a un número de trastornos inflamatorios, tales como asma, COPD, artritis reumatoide, trastorno intestinal inflamatorio y psoriasis, véase, v.gr., Das, et (2002) Pulm. Pharmacol. Ther. 15: 409-416; Halasz, et al. (2002) Respir. Med. 96:262-267; Barnes (2000) New Engl. J. Med. 343:269-280; Tutuncu, et al. (2002) Clin. Exp. Rheumatol. 20 (6 supl. 28):s146-151. IL-4 juega un papel en asma, alergia y COPD, mientras que IL-13 es parte de los mecanismos de asma y alergia, COPD, artritis reumatoide, IBD, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, y trastornos de la piel, v.gr., psoriasis o dermatitis atópica, véase, v.gr., Steinke, et al. (2001 ) Respir. Res. 2:66-70; Jeffery (2001 ) Novartis Found. Symp. 234:149-161 ; van der Pouw Kraan, et al. (2002) Genes Immunol. 3:436-439; Spadero, et al. (2002) Clin. Exp. Rheumatol. 20: 213-216; Bouma, et al. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:521- 533; Van der Ploeg, et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 109: 526-532. lll. Ácidos nucleicos Esta invención contempla el uso de ácidos nucleicos aislados o fragmentos, v.gr., que codifican estas proteínas o proteínas estrechamente relacionadas, o fragmentos de las mismas, v.gr., para codificar un polipéptido correspondiente, preferiblemente uno que sea biológicamente activo. Además, esta invención cubre ADN aislados o recombinantes que codifican combinaciones de dichas proteínas o polipéptidos que tienen secuencias características, por ejemplo, de las DCRSds (SEQ ID NO: 2) o p19 humana (SEQ ID NO: 6) sola o en combinación con otras tales como la subunidad IL12Rß1 o p40 respectivamente (véase Showe, et al. (1996) Ann. N. Y. Acad. Sci. 795: 413-425; Gately, et al. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521 ; GenBank U03187, NM_005535). Típicamente, el ácido nucleico es capaz de hibridar, bajo condiciones apropiadas, con un segmento de secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1 ó 5, pero preferiblemente no con un segmento correspondiente de otros receptores descritos en el cuadro 1 , es decir, hlL-6R gpl30 o hlL-IRbeta2. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una proteína de longitud completa, o fragmento, y típicamente tendrá un segmento de secuencia de aminoácidos altamente homologa, v.gr., presentando extensiones de identidad significativas, a una mostrada en SEQ ID NO: 2. Además, esta ¡nvención cubre el uso de ácido nucleico aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, que codifica proteínas que tienen fragmentos que son equivalentes a las proteínas DCRS5 v.gr., proteínas intracelulares. Los ácidos nucleicos aislados pueden tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', v.gr., promotores, incrementadores, señales de adición poli-A y otros del gen natural. También se proveen combinaciones, como se describe, que comprenden el DCRS5 con la IL12Rß1 , o sus porciones de unión a ligando extracelulares como antagonistas de ligando. Las utilidades de diagnóstico también son claramente importantes, v.gr., de variantes polimórficas u otras variantes. Un ácido nucleico "aislado", v.gr., ARN, ADN o un polímero mixto, que es sustancialmente puro, v.gr., separado de otros componentes que naturalmente acompañan a una secuencia nativa, tales como ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas flanqueadoras de las especies originadoras. El término abarca una secuencia de ácidos nucleicos que ha sido removida de su ambiente natural e incluye aislados de ADN recombinante o clonado, que son por lo tanto distinguibles de las composiciones que ocurren en forma natural, y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula, ya sea completamente o sustancialmente puras. Un ácido nucleico aislado generalmente será una composición homogénea de moléculas, pero en algunas modalidades obtendrá heterogeneidad, preferiblemente menor. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o porciones no críticas para una función o actividad biológica deseada. Un ácido nucleico "recombinante" se define típicamente ya sea por su método de producción o su estructura. En referencia a su método de producción, v.gr., un producto hecho por un procedimiento, este procedimiento utiliza técnicas de ácido nucleico recombinante, v.gr., implicando la intervención humana en la secuencia de nucleótidos. Típicamente esta intervención implica manipulación in vitro, aunque bajo ciertas circunstancias puede implicar técnicas de reproducción de animales más clásicas. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico hecho generando una secuencia que comprenda la fusión de dos fragmentos que no sean naturalmente contiguos uno a otro, pero pretende excluir productos de la naturaleza, v.gr., mutantes que ocurren en forma natural, como se encuentra en su estado natural. Por lo tanto, v.gr., se contemplan productos hechos transformando células con un vector que ocurre en forma natural, como lo son los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada usando cualquier procedimiento de oligonucleótido sintético. Dicho procedimiento a menudo se hace para reemplazar un codón con un codón redundante que codifique el mismo o un aminoácido conservador, aunque típicamente introduciendo o removiendo un sitio de reconocimiento de secuencia de enzima de restricción o para algún análisis de estructura-función. Alternativamente, el procedimiento se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una entidad genética individual que comprenda una combinación deseada de funciones no encontrada en las formas naturales comúnmente disponibles, v.gr., que codifique una proteína de fusión. Los sitios de reconocimiento de enzima de restricción a menudo son el objetivo de dichas manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos de sitio, v.gr., promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles se pueden incorporar por diseño. Un concepto similar se pretende para un recombinante, v.gr., fusión, polipéptido. Este incluirá una repetición dimérica o fusión del DCRS5 con subunidad IL-12ß1. Se incluyen específicamente ácidos nucleicos sintéticos que, por redundancia del código genético, codifican polipéptidos equivalentes a fragmentos de DCRS5 y fusiones de secuencias de varias moléculas relacionadas diferentes, v.gr., otros miembros de la familia de citocina. Un "fragmento" en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente por lo menos 21 nucleótidos, muy generalmente por lo menos 25 nucleótidos, ordinariamente por lo menos 30 nucleótidos, muy ordinariamente por lo menos 35 nucleótidos, a menudo por lo menos 39 nucleótidos, muy a menudo por lo menos 45 nucleótidos, típicamente por lo menos 50 nucleótidos, muy típicamente por lo menos 55 nucleótidos, usualmente por lo menos 60 nucleótidos, muy usualmente por lo menos 66 nucleótidos, preferiblemente por lo menos 72 nucleótidos, muy preferiblemente por lo menos 79 nucleótidos y en modalidades particularmente preferidas será por lo menos 85 o más nucleótidos incluyendo 90,100, 120,140, 160, 180, 200, etc. Típicamente, los fragmentos de secuencias genéticas diferentes se pueden comparar unos con otros en extensiones de longitud apropiadas, segmentos particularmente definidos tales como los dominios que se describen más adelante. Un ácido nucleico que codifica para DCRS5 o p19 será particularmente útil para identificar genes, especies de ARNm y ADNc que codifican para sí mismas o proteínas estrechamente relacionadas, así como ADNs que codifican para variantes polimórficas, alélicas u otras variantes genéticas, v.gr., a partir de diferentes individuos o especies relacionadas.
Sondas preferidas para dichas selecciones son aquellas regiones del receptor que se conservan entre las diferentes variantes polimórficas o que contienen nucleótidos que carecen de especificidad, y preferiblemente son de longitud completa o casi completa. En otras situaciones, las secuencias específicas de variantes polimórficas serán más útiles. Combinaciones de variantes polimórfica de DCRS5 con variantes de IL-12ß1 también pueden ser diagnosticadas.
La identidad sustancial en el contexto de comparación de secuencia de ácidos nucleicos significa ya sea que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando se alinean en forma óptica, con inserciones o deleciones apropiadas, en por lo menos aproximadamente 60% de los nucleótidos, generalmente por lo menos 66%, ordinariamente por lo menos 71 %, a menudo por lo menos 76%, muy a menudo por lo menos 80%, usualmente por lo menos 84%, muy usualmente por lo menos 88%, típicamente por lo menos 91%, muy típicamente por lo menos aproximadamente 93%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 95%, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 96 a 98% o más, y en modalidades particulares, tan alto como a aproximadamente 99% o más de los nucleótidos, incluyendo, v.gr., segmentos que codifican dominios estructurales o otros segmentos descritos. En forma alternativa, la identidad sustancial existirá cuando los segmentos se hibriden bajo condiciones de hibridación selectiva, a una hebra o su complemento, típicamente usando una secuencia derivada de SEQ ID NOs: 1 ó 5. Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando haya por lo menos 55% de homología sobre una extensión de por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, muy típicamente por lo menos aproximadamente el 65%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 75% y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 90%. Véase, Kanehisa (1984) Nucí. Acids Res. 12:203-213. La longitud de comparación de homología, como se describe, puede ser sobre extensiones más largas y en algunas modalidades será sobre una extensión de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente por lo menos de aproximadamente 20 nucleótidos, ordinariamente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 32 nucleótidos, muy típicamente por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos. Esto incluye, v.gr., 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, etc y otras longitudes. Condiciones astringentes, en referencia a homología en el contexto de hibridación, serán condiciones combinadas astringentes de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros parámetros típicamente controlados en condiciones de hibridación. Las condiciones de temperatura astringentes usualmente incluirán temperaturas en exceso de aproximadamente 30°C, muy usualmente en exceso de aproximadamente 37°C, típicamente en exceso de aproximadamente 45°C, muy típicamente en exceso de aproximadamente 55°C, preferiblemente en exceso de aproximadamente 65°C, y muy preferiblemente en exceso de aproximadamente 70°C. Las condiciones de sal astringentes ordinariamente serán de por lo menos aproximadamente de 500 mM, usualmente por lo menos de aproximadamente 400 mM, muy usualmente por Id menos de aproximadamente 300 mM, típicamente menos de aproximadamente 200 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 100 mM y muy preferiblemente menos de aproximadamente 80 mM, incluso hasta menos de aproximadamente 50 ó 20 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es más importante que la medición de cualquier parámetro individual, véase, v.gr., Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31 :349-370. El ADN aislado se puede modificar fácilmente mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de extensiones de nucleótidos. Estas modificaciones dan por resultado secuencias de ADN novedosas que codifican esta proteína o sus derivados. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir proteínas mutantes (muteínas) o para incrementar la expresión de especies variantes. La expresión incrementada puede implicar amplificación de genes, transcripción incrementada, traducción incrementada y otros mecanismos. Dichos DCRSds mutantes tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la de otras proteínas similares a receptor de citocina como se encuentra en la naturaleza, ya sea a manera de deleción, sustitución o inserción. En particular, el DCRSds mutante específico de sitio" abarca una proteína que tiene una identidad de secuencia sustancial con una proteína de SEQ ID NO: 2, y típicamente comparte la mayoría de las actividades biológicas o efectos de las formas aquí descritas. También se podrán identificar varias secuencias de variantes polimórfica naturales. Aunque los sitios de mutaciones específicos de sitio son predeterminados, los mutantes no necesitan ser específicos de sitio. La mutagénesis de DCRS5 en mamíferos se puede lograr haciendo inserciones o deleciones de aminoácidos en el gen, acopladas con la expresión. Las sustituciones, deleciones, inserciones o muchas combinaciones se pueden generar para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino-terminales o carboxi-terminales. La mutagénesis aleatoria se puede conducir en un codón objetivo y los mutantes de DCRS5 en mamíferos expresados pueden ser seleccionados para la actividad deseada, proveyendo algún aspecto de una relación estructura-actividad. Los métodos para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas en la técnica, v.gr., por mutagénesis de iniciador de M13. Véase también Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos). Las construcciones particularmente útiles serán porciones extracelulares del DCRSd asociado con segmentos de IL.12ß1. Las mutaciones en el ADN normalmente no colocarían secuencias codificadoras fuera de los marcos de lectura y preferiblemente no crearían regiones complementarias que pudieran hibridar para producir estructura de ARNm secundaria tales como bucles o pasadores. El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981 ) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Un fragmento de doble hebra a menudo se obtendrá ya sea sintetizando la hebra complementaria y templando la hebra bajo condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de iniciador apropiada. Las técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) a menudo se pueden aplicar en mutagénesis. Alternativamente, los iniciadores de mutagénesis se usan comúnmente en métodos para generar mutaciones definidas en sitios predeterminados. Véase, v.gr.., Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; y Dieffenbach y Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY. Ciertas de las modalidades de la invención están dirigidas a composiciones de combinación que comprenden secuencias de receptor o ligando descritas. En otras modalidades, porciones funcionales de las secuencias se pueden unir para codificar proteínas de fusión. En otras formas, se pueden utilizar variantes de las secuencias descritas.
IV. Proteínas, péptidos Como se describió anteriormente, la presente invención comprende DCRSd y p19 de primate, v.gr., cuyas secuencias se describen en SEQ ID Nos: 1-2 y d-6, y que se describieron anteriormente. También se contemplan variantes alélicas y otras variantes, v.gr., proteínas de fusión que combinan porciones de dichas secuencias con otras, incluyendo, v.gr., IL.12ß1 , p40, etiquetas de epítope y dominios funcionales. La presente invención también provee proteínas recombinantes, v.gr., proteínas de fusión heterólogas usando segmentos de esas proteínas de primate o roedor. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no están normalmente fusionadas de la misma manera. Por lo tanto, el producto de fusión de una DCRSd con otro receptor de citocina es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, típicamente hecho como un solo producto de traducción y que presenta propiedades, v.gr., secuencia y antigenicidad, derivadas de cada péptido de fuente. Un concepto similar se aplica a secuencias de ácidos nucleicos heterólogas. También se proveen combinaciones de varias proteínas designadas en complejos. Además, se pueden hacer nuevas construcciones combinando dominios funcionales o estructurales similares de otras proteínas relacionadas, v.gr., receptores de citocina o receptores tipo Toll, incluyendo variantes de especie. Por ejemplo, la unión de ligandos u otros segmentos se pueden "intercambiar" entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos, véase, v.gr., Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. Por lo tanto, nuevos polipéptidos quiméricos que presentan nuevas combinaciones de especificidades resultarán de la unión funcional de especificidades de la unión de receptor. Por ejemplo, los dominios de unión de ligando de otras moléculas receptoras relacionadas se pueden añadir o pueden sustituir a otros dominios de estas proteínas o proteínas relacionadas. La proteína resultante a menudo tendrá función y propiedades híbridas. Por ejemplo, una proteína de fusión puede incluir un dominio de dirección a un objetivo que puede servir para proveer el secuestro de la proteína de fusión a un organelo subcelular particular.
Parejas y secuencias de fusión candidatas se pueden seleccionar de varias bases de datos de secuencias, v.gr., GenBank, c/o IntelliGenetlcs, Mountain View, CA; y GCG, University of Wisconsin Biotechnoiogy Computing Group, Madison, Wl. En particular, son particularmente preferidas las combinaciones de secuencias de polipéptido provistas enSEQ ID Nos: 2-4. Formas variantes de las proteínas pueden ser sustituidas en las combinaciones descritas. La presente invención particularmente provee muteínas que se unen al ligando en forma de citocina y/o que son afectadas en la transducción de señal. La alineación estructural de DCRSd humana con otros miembros de la familia de receptor de citocina muestra rasgos/residuos conservados (cuadro 1). La alineación de la secuencia de DCRSd humana con otros miembros de la familia de receptor de citocina indica varias características estructural y funcionalmente compartidas. Véase también Bazan, et al. (1996) Nature 379:691 ; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991 ) Protein Engineering 4:263-269. Se prefieren particularmente sustituciones ya sea con secuencias de ratón o secuencias humanas. Por el contrario, sustituciones conservativas lejanas de las regiones de interacción de unión de ligando probablemente conservarán la mayoría de las actividades de señalización; y sustituciones conservativas lejanas de los dominios intracelulares probablemente conservarán la mayoría de las propiedades de la unión del ligando. "Derivados" del receptor DCRSd de primate incluyen mutantes de secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, derivados metabólicos y conjugados covalentes o agregativos con otras porciones químicas. Los derivados covalentes se pueden preparar por enlace de funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácidos DCRSd o en los grupos N-terminales, v.gr., por medios que son conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, esteres alifáticos o amidas alifáticas del carboxilo terminal, o de residuos que contienen cadenas laterales de carboxilo derivados O-acilo de residuos que contienen grupo hidroxilo, y derivados N-acilo de los residuos que contienen aminoácidos amino terminal o que contienen grupo amino, v.gr., lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de porciones alquilo, incluyendo alquilo normal de C3 a C18, formando así especies alcanoil aroilo. En particular, se incluyen alteraciones de glicosilación, v.gr., hechas al modificar los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en pasos de procesamiento posteriores. Medios particularmente preferidos para lograr esto son exponiendo el polipéptido a enzimas de glicosilación derivadas de células que normalmente proveen dicho procesamiento, v.gr., enzimas de glicosilación en mamíferos. También se contemplan enzimas de desglicosilación. También se incluyen versiones de la misma secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras modificaciones menores, incluyendo residuos de aminoácido fosforilado, v.gr., fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Un grupo importante de derivados son los conjugados covalentes de los receptores o fragmentos de los mismos con otras proteínas de polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en cultivo recombinante, tal como fusiones en N-terminal o C-terminal o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en proteínas de entrelazamiento a través de grupos laterales reactivos. Los sitios de derivación preferidos con agentes de entrelazamiento son en grupos amino libres, porciones carbohidrato y residuos de cisteína. También se proveen polipéptidos de fusión entre los receptores y otras proteínas homologas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre diferentes receptores, dando por resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que presente especificidad de unión para múltiples ligandos de citocina diferentes, o un receptor que pueda tener especificidad ampliada o debilitada de efecto de sustrato. Asimismo, se pueden construir fusiones heterólogas que presenten una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido reportero, v.gr., luciferasa, con un segmento o dominio, de un receptor, un segmento de unión de ligando, por lo que la presencia o ubicación de un ligando deseado puede ser fácilmente determinada, véase, v.gr., Patente de E.U.A. No. 4,869,609, expedida a Dull, et al. Otras parejas de fusión de genes incluyen glutation-S-transferasa (GST), ß-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A,ß-lactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa y factor de coincidencia alfa de levadura, véase, v.gr., Godowski, et al. (1988) Science 241 :812-816. Las proteínas marcadas con frecuencia serán sustituidas en las combinaciones de las proteínas descritas. El método de fosforamidato descrito por Beaucage y Carruthers (1981 ) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Un fragmento de doble cadena a menudo se obtendrá ya sea sintetizando la hebra complementaria y templando la hebra bajo condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria usando ADN pollmerasa con una secuencia de iniciador apropiada. Dichos polipéptidos también pueden tener residuos de aminoácidos que han sido químicamente modificados por fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o remoción de otras porciones, particularmente aquellas que tienen formas moleculares similares a grupos fosfato. En algunas modalidades, las modificaciones serán reactivos marcadores útiles, o sirven como objetivos de purificación, v.gr., ligandos de afinidad. Las proteínas de fusión típicamente se harán ya sea por métodos de ácido nucleico recombinante o por métodos de polipéptido sintético. Técnicas para manipulación y expresión de ácidos nucleicos se describen generalmente, v.gr., en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, y Ausubel, et al. (eds. 1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Las técnicas para síntesis de polipéptidos se describen, v.gr., en Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 86:2149-2166; Merrifield (1986) Science 232:341-347; y Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press. Véase también Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779 para métodos para hacer polipéptidos más grandes. Esta ¡nvención también contempla el curso de derivados de DCRSd distintos a variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación. Dichos derivados pueden implicar asociación covalente o agregativa con porciones químicas. Estos derivados generalmente caen en tres clases: (1 ) sales, (2) modificaciones covalentes de residuos de cadena lateral y terminales, y (3) complejos de adsorción, v.gr. con membranas celulares. Dichos derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación tales como para purificación de afinidad de un receptor u otra molécula de unión, v.gr., un anticuerpo. Por ejemplo, un ligando de citocina puede ser inmovilizado por unión covalente a un soporte sólido tal como Sepharose® activada por bromuro de cianógeno, por métodos que son bien conocidos en la técnica, o adsorbida sobre superficies de poliolefina con o sin entrelazamiento de glutaraldehído, para usarse en la prueba o purificación de un receptor de citocina, anticuerpos u otras moléculas similares. El ligando también se puede marcar con un grupo detectable, v.gr. radioyodado por el procedimiento de cloramina T, covalentemente unida a quelatos de tierras raras o conjugado a otra porción fluorescente para usarse en pruebas de diagnóstico.
Una combinación, v.gr., que incluye DCRSd, de esta invención se puede usar como un inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos, v.gr., capaces de distinguir entre otros miembros de la familia de receptores de citocina, para la combinación descrita. Los complejos pueden usarse para seleccionar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de antígenos preparados por inmunización con varias formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos" también comprende fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos naturales, v.gr., Fab, Fab2, Fv, etc. La DCRSd purificado también se puede usar como un reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados de expresión, o trastornos inmunológicos que conducen a la producción de anticuerpos al receptor endógeno. Además, fragmentos de DCRSd también pueden servir como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente invención, como se describe inmediatamente más adelante. Por ejemplo, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión a o que está siendo generada contra SEQ ID NO: 2, fragmentos de la misma o varios péptidos homólogos. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión a, o que han sido generados contra, fragmentos específicos que se predice que son o que realmente son expuestos, a la superficie exterior de la DCRSd nativa. Complejos de combinaciones de proteínas también serán útiles y se pueden hacer preparaciones de anticuerpos para los mismos.
En algunas otras modalidades, construcciones solubles, v.gr., de los segmentos de unión de ligandos extracelulares de la DCRSd con la IL- 12ß1 pueden ser composiciones de unión para el ligando y pueden ser útiles ya sea como antagonistas de ligando, o como antígenos o para bloquear señalización mediad por ligando. Esto puede ser útil ya sea para diagnóstico, v,gr., para mareaje histológico, o terapéuticamente, v.gr., como antagonistas de ligando. El bloqueo de respuesta fisiológica a los ligandos de receptor puede resultar de la inhibición de la unión del ligando al receptor, probablemente a través de inhibición competitiva. Por lo tanto, las pruebas in vitro de la presente invención con frecuencia usarán anticuerpos o segmentos de unión de antígeno de estos anticuerpos, construcciones de receptor solubles o fragmentos unidos a sustratos de fase sólida. Estas pruebas también permitirán la determinación de diagnóstico de los efectos de mutaciones y modificaciones de región de unión a ligando, u otras mutaciones y modificaciones, v.gr., que afectan la función de señalización o la función enzimática. Esta invención también contempla el uso de pruebas de selección de fármaco competitivas, v.gr., en donde anticuerpos neutralizantes para los complejos o fragmentos de receptor compiten con un compuesto de prueba para unirse a un ligando o a otro anticuerpo. De esta manera, los anticuerpos o fragmentos neutralizantes se pueden usar para detectar la presencia de un polipéptido que comparta uno o más sitios de unión a un receptor y que también se pueda usar para ocupar sitios de unión sobre un receptor que de otra manera pudiera unirse a un ligando. Las construcciones de receptor solubles que combinan los dominios extracelulares o de unión a ligando de la DCRSd o la IL-12ß1 , pueden ser antagonistas útiles para unión competitiva de ligando p40/p19.
V. Producción de ácidos nucleicos y proteínas ADN que codifica a la proteína o fragmentos de la misma se pueden obtener mediante síntesis química, selección de genotecas de ADNc o seleccionando genotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejido. Secuencias naturales se pueden aislar usando métodos estándares y las secuencias que aquí se proveen, v.gr., SEQ ID NO: 2. Otras contrapartes de especie se pueden identificar mediante técnicas de hibridación, o por varias técnicas de PCR, combinadas con o buscando bases de datos de secuencias, v.gr., GenBank (banco de genes). Este ADN se puede expresar en una amplia variedad de células hospedero para la síntesis de un receptor de longitud completa o fragmentos que a su vez, por ejemplo, se pueden usar para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para construcción y expresión de unión de ligando modificada o dominios de cinasa/fosfatasa; y para estudios de estructura/función. Variantes o fragmentos se pueden expresar en células hospedero que son transformadas o transfectadas con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden ser sustancialmente libres de proteína o contaminantes celulares, distintos a aquellos derivados del hospedero recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en las composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. La proteína o porciones de la misma se pueden expresar como fusiones con otras proteínas. Combinaciones de las proteínas descritas, o ácidos nucleicos que las codifican, son de interés particular. Los vectores de expresión son típicamente construcciones de ADN o ARN de autorrepiicación que contienen el gen receptor deseado, sus fragmentos, o genes de combinación, por lo general operablemente enlazados a elementos de control genético adecuados que son reconocidos en una célula hospedero adecuada. Estos elementos de control son capaces de efectuar expresión dentro de un hospedero adecuado. Los genes múltiples se pueden expresar en forma coordinada y pueden estar en un mensaje policistrónico. El tipo específico de elementos de control necesarios para efectuar la expresión dependerá de la célula hospedero final usada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema de promotor procariótico o un sistema de control de expresión de promotor eucariótico, y típicamente incluyen promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, incrementadores de transcripción para elevar el nivel de expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma adecuado, y secuencias que terminan la transcripción y traducción. Los vectores de expresión también contendrán generalmente un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula hospedero. Los vectores de esta invención incluyen aquellos que contienen ADN que codifica una combinación de proteínas, como se describe, o un péptido equivalente biológicamente activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y puede modificar un marcador de selección. Esta ¡nvención contempla además el uso de dichos vectores de expresión, que son capaces de expresar ADNc eucarióticos que codifican para dichas proteínas en un hospedero procariótico o eucariótico, en donde el vector es compatible con el hospedero y en donde los ADNc eucarióticos se insertan en el vector de tal manera que el crecimiento del hospedero que contiene el vector expresa los ADNc en cuestión. Por lo general, los vectores de expresión están diseñados para replicación estable en sus células hospederas o para amplificación para incrementar en gran medida el número total de copias del gen(es) deseable por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula hospedero, v.gr., es posible efectuar expresión transitoria de la proteína y sus alimentos en varios hospederos usando vectores que no contienen un origen de repllcación que es conocido por la célula hospedero. También es posible usar vectores que produzcan integración de las porciones codificadoras de proteína en el ADN del hospedero por recombinación. Tal como se usan aquí, los vectores comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del hospedero. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de genes operablemente enlazados. Los plásmidos son la forma más comúnmente usada de vector pero todas las otras formas de vectores que tienen una función equivalente y que son, o llegan a ser, conocidos en la técnica son adecuados para usarse aquí, véase, v.gr., Pouwels, et al., (1985 y suplementos) Cloning Vectores: A Laboratoty Manual, Elsevier, N.Y., y Rodriguez, et al., (eds 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectores and Their Uses, Butherswoth, Boston. Las células transformadas son células, preferiblemente de mamífero, que han sido transformadas o transfectadas con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Las células hospedero transformadas por lo general expresan las proteínas deseadas, pero para propósitos de clonación, amplificación y manipulación de su ADN, no necesitan expresar las proteínas de la presente invención. Esta invención contempla además el cultivo de células transformadas en un medio de nutrientes, permitiendo así que se acumulen las proteínas. Las proteínas pueden ser recuperadas, ya sea del cultivo o, en algunos casos, del medio de cultivo. Para propósitos de esta invención, las secuencias de ácidos nucleicos están operablemente enlazadas cuando están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor es operablemente enlazado a un polipéptido si se expresa como una proteína o participa en la dirección del polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor es operablemente enlazado a una secuencia codificadora si controla la transcripción de los polipéptidos; un sitio de unión al ribosoma es operablemente enlazado a una secuencia codificadora si está ubicado para permitir la traducción. Por lo general, los medios operablemente enlazados son contiguos y en marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como genes represores no están contiguamente enlazados pero se unen a secuencias de operador que a su vez controlan la expresión. Las células hospedero adecuadas incluyen procariotes, eucariotes inferiores y eucariotes superiores. Los procariotes incluyen organismos gram negativos y gram positivos, v.gr., E. coli y B. subtilis. Los eucariotes inferiores incluyen levaduras, v.gr., S. cerevisiae and Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotes superiores incluyen líneas de células de cultivo de tejido establecidas de células animales, tanto de origen no mamífero, v.gr., células de insectos, y aves, como de origen mamífero, v.gr., humanos, primates y roedores. Los sistemas de vector de hospedero procariótico incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Tal como se usa aquí, E. coli y sus vectores se usarán genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotes. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden usar para expresar el receptor o sus fragmentos incluyen, pero no se limitan a vectores tales como aquellos que contienen el promotor lac (serie pUC); promotor trp (pBR322); promotor Ipp (la serie pIN); promotores lambda- pP o pR (pOTS) o promotores híbridos tales como ptac (pDRd40), véase Brosius, et al. (1988) "Expression Vectores Employing Lambda-, and Ipp- derived Promoters", in Vectors: A. Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds Rodríguez y Denhardt), Buttersworth, Boston, Charter 10, pp. 206-236. Los eucariotes inferiores, v.gr., levaduras y Dictyostelum, se pueden transformar con vectores que contienen secuencia DCRSd. Para los propósitos de la invención, la mayoría de los hospederos eucarióticos más comunes es la levadura para hornear, Saccharomyces cerevisiae. Se usará para representar genéricamente eucariotes inferiores aunque también están disponibles muchas otras cepas y especies. Los vectores de levadura típicamente consisten de un origen de replicaciones (excepto el tipo integrador), un gen de selección, un promotor, ADN que codifica el receptor o sus fragmentos, y secuencias para terminación de traducción, poliadenilación y terminación de transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levadura incluyen los promotores constitutivos tales como 3-fosfogliserato cinasa y algunos otros promotores de gen de enzima glicolítica o promotores inducibles como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o promotor de metalotionina. Vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: J número de copia bajo de auto-replicación (tal como la serie YRp), número de copia alto de auto-replicación (tal como la serie YEp); tipos de integración (tales como la serie Yip); o mini cromosomas (tales como la serie YCp). Las células de cultivo de tejido eucarióticas superiores son normalmente las células hospedero preferidas para expresión de las proteínas receptoras o de interleucina funcionalmente activas. En principio, muchas líneas de células de cultivo de tejido eucariótico superior son útiles, v.gr., sistemas de expresión de baculovirus de insecto, ya sea de una fuente de invertebrados o de vertebrados. Sin embargo, se prefieren las células de mamífero. La transformación o transfección y propagación a dichas células se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células útiles incluyen las células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO), líneas celulares de riñon de rata bebé (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares por lo general incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de traducción, sitios de empalme de ARN (si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de transcripción. Esos vectores también contienen generalmente un gen de selección o gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que portan promotores derivados, v.gr., de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vaccinia o citomegalovirus. Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNAl ; pCD, véase Okayama, et al., (1986) Mol. Cell Biol. 6:1136-1142; pMCI neo PoIyA, véase Thomas, et al., (1987) Cell. 61 :503-512; y un vector de baculovirus tal como paC 373 o paC 610. Para proteínas secretadas y algunas proteínas de membrana, un marco de lectura abierto generalmente codifica un polipéptido que consiste de un producto maduro o secretado covalentemente enlazado en su N-terminal, a un péptldo de señal. Ei péptido de señal es digerido antes de la secreción del polipéptido maduro, o activo. El sitio de digestión se puede predecir con un alto grado de precisión a partir de reglas empíricas, v.gr., von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683-4690 y Nielsen, et al., (1997) Protein Eng. 10: 1-12, y la composición precisa de aminoácidos del péptido de señal a menudo no parece ser crítico para su función, v.gr., Randall et al., (1989) Science 243:1156-1169; Kaiser et al., (1987) Science 235: 312-317. Las proteínas maduras de esta invención se pueden determinar fácilmente usando métodos estándares. Con frecuencia se deseará expresar estos polipéptidos en un sistema que provea un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón usual será aquel provisto naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo el polipéptido, v.gr., una forma no glicosilada, a proteínas glicosilantes apropiadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen receptor puede ser cotransformado con uno o más genes que codifican enzimas glicosilantes de mamífero u otras enzimas glicosilantes. Usando este enfoque, ciertos patrones de glicosilación de mamífero se lograrán en células procarióticas u otras células. La expresión en células procarióticas típicamente conducirá a formas no glicosiladas de proteína. La fuente de DCRSd puede ser un hospedero que eucariótico o procariótico que exprese DCRSd recombinante, tal como se describió antes.
La fuente también puede ser una línea celular, pero otras líneas celulares de mamíferos también se contemplan en esta invención, siendo la línea celular preferida de la especie humana. Los fragmentos de DCRSd de primate, o derivados de los mismos se pueden preparar mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los que se describen en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practise of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York; Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York. Por ejemplo, un procedimiento de azida, un procedimiento de cloruro ácido, un procedimiento de anhídrido ácido, un procedimiento de anhídrido mixto, un procedimiento de éster activo (v.gr., éster p-nitrofenílico, éster de N-hidroxisuccinimida o éster cianometílico), un procedimiento de carbodimidazol, un procedimiento oxidatlvo-reductivo, o un procedimiento de diciclohexl-carbidimida (DCCD) aditivo se pueden usar. La síntesis de fase sólida o de fase de solución son ambas aplicables a los procedimientos anteriores. Se pueden usar técnicas similares con secuencias de DCRS5 parciales.
Las proteínas DCRSd, fragmentos o derivados se preparan adecuadamente de acuerdo con los procedimientos anteriores como se utilizan típicamente en la síntesis de péptidos, generalmente ya sea por un procedimiento denominado por pasos que comprende condensar un aminoácido al aminoácido terminal, uno por uno en secuencia, o por acoplamientos de péptidos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se están usando en la reacción de acoplamiento típicamente deben ser protegidos para evitar el acoplamiento en un sitio incorrecto. Si se adopta una síntesis de fase sólida, el aminoácido C-terminal está unido a un vehículo o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo insoluble no está particularmente limitado mientras tenga una capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Ejemplos de muchos vehículos insolubles incluyen resinas de halogenometilo, tales como resinas de clorometilo o resina de bromometilo, resinas de hidroximetilo, resinas fenólicas, resinas de ter-alquiloxicarbonilohidrazidadas y similares. Un aminoácido protegido con grupo amino se une en secuencia a través de la condensación de su grupo carboxilo activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena previamente formada, para sintetizar el péptido paso por paso. Después de sintetizar la secuencia completa, el péptido es retirado del vehículo ¡nsoluble para producir el péptido, véase, v.gr., Merrifield, et al., (1963) en J. Am. Chem Soc. 8d: 2149-2166. La proteína preparada y fragmentos de la misma se pueden aislar y purificar a partir de la mezcla de reacción por medio de separación de péptidos, v.gr., por extracción, precipitación, electroforesis, varias formas de cromatografía, inmunoafinidad y similares. Los receptores de esta invención se pueden obtener en grados variables de pureza dependiendo de los usos deseados. La purificación se puede lograr mediante el uso de técnicas de purificación de proteína que aquí se describen, o mediante el uso de los anticuerpos que se describen en métodos de cromatografía de afinidad inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbente se lleva a cabo primero enlazando los anticuerpos a un soporte sólido y después poniendo en contacto los anticuerpos enlazados con usados solubilizados de células apropiadas, usados de otras células que expresan el receptor, o usados o sobrenadantes de células que expresan proteína como resultado de técnicas de ADN. En general, la proteína purificada será por lo menos aproximadamente 40% pura, ordinariamente por lo menos aproximadamente 60% pura, usualmente por lo menos aproximadamente 60% pura, típicamente por lo menos aproximadamente 70% pura, muy típicamente por lo menos aproximadamente 80% pura, preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% pura, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 9d% pura, y en modalidades particulares, 97%-99% o más. La pureza será generalmente sobre una base de peso, pero también será sobre una base molar. Se aplicarán diferentes pruebas según sea apropiado. Proteínas individuales pueden ser purificadas y posteriormente combinadas.
VI. Anticuerpos Se pueden generar anticuerpos para los diversos mamíferos, v.gr., proteínas DCRSd de primate y fragmentos de las mismas, tanto en formas nativas que ocurren naturalmente como en sus formas recombinantes, siendo la diferencia que es más probable que los anticuerpos para el receptor activo reconozcan epítopes que están presentes sólo en conformaciones nativas. También se contemplan anticuerpos que reconocen epítopes presentados por la combinación, v.gr., de la DCRSd con la IL-12Rß1. La detección de antigeno desnaturalizado también puede ser útil, v.gr., en análisis de Western. También se contemplan anticuerpos anti-idiotípicos, que serían útiles como agonistas o antagonistas de un receptor natural o un anticuerpo. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones de cadena individuales, contra fragmentos predeterminados de proteína, pueden generarse por inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a través de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden seleccionar uniéndose a proteína normal o defectuosa, o seleccionándose para actividad agonística o antagonística. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se unirán a por lo menos un KD de aproximadamente 1 mM, muy usualmente por lo menos de aproximadamente 300 µM, típicamente por lo menos de aproximadamente 100 µM, muy típicamente por lo menos aproximadamente 30 µM, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10 µM, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 µM, o mejor. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, de esta invención pueden tener un valor de diagnóstico o terapéutico significativo. Pueden ser antagonistas potentes que se unen al receptor e inhiben la unión al ligando o inhiben la capacidad del receptor para inducir una respuesta biológica, v.gr., actúan sobre su sustrato. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden acoplar toxinas o radionúclidos para unirse a células productoras, o células localizadas hacia la fuente de la interleucina. Además, estos anticuerpos se pueden conjugar a fármacos u otros agentes terapéuticos, ya sea en forma directa o indirecta por medio de un enlazador. Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, se pueden unir al receptor sin inhibir unión al ligando o sustrato. Como anticuerpos neutralizantes, pueden ser útiles en pruebas de unión competitivas. También pueden ser útiles para detectar o cuantificar ligando.
Pueden ser útiles como reactivos para análisis de Western blot, o para inmunoprecipitación o inmunopurificación de proteína respectiva. Asimismo, los ácidos nucleicos y proteínas se pueden inmovilizar a sustratos sólidos para métodos de purificación o detección de afinidad. Los sustratos pueden ser, v.gr., glóbulos de resina sólidos o láminas de plástico. Los fragmentos de proteína se pueden unir a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o covalentemente unidos para usarse como inmunógenos. Los receptores de citosina de mamífero y fragmentos de los mismos se pueden fusionar o enlazarse covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa, albúmina de suero de bovino, toxoide tetánico, etc. Se describen métodos para preparar antisueros policlonales, véase Microbiology, Hoeber Medical División, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications New York; y Williams, et al., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol 1 , Academic Press, New York. Un método típico involucra la hiperinmunización de un animal con un antígeno. La sangre del animal se recoge poco después de las inmunizaciones repetidas y se aisla la gamma globulina. En algunos casos, es conveniente preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios hospederos mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de técnicas para la preparación de dichos anticuerpos monoclonales se puede encontrar, v.gr., en Stites et al., (eds.) Basic and Clinical Immunology (4a. ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en el mismo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratiry Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2a. ed.) Academic Press New York y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256: 496-497, que describen un método para generar anticuerpos monoclonales Este método implica la inyección de un ¡nmunógeno a un animal. El animal después es sacrificado y las células se recogen de su bazo, las cuales después de fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas después se selecciona para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una especie de anticuerpo individual al inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpo individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas del animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica. Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a la selección de genotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase Huse, et al. (1989) Science 246:1276-1281 ; y Ward, et al. (1989) Nature 341 : 544-646. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados uniendo, ya sea en forma covalente o no covalente, una sustancia que provee una señal detectable. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de E.U.A. números 3,817,837; 3,860,762; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes o quiméricas, véase Cabilly, patente de E.U.A. no. 4,816,567; o hechas en ratones transgénicos, véase Méndez et al., (1997) Nature Genetics 15:146- 156. Los anticuerpos de esta invención también se pueden usar para cromatografía de afinidad en el aislamiento de proteínas de péptidos DCRSd. Se pueden preparar columnas en donde los anticuerpos se enlacen a un soporte sólido, v.gr., partículas, tales como agarosa, Sephadex®, o similares, en donde un lisado de células se hace pasar a través de la columna, la columna se lava, seguida de concentraciones cada vez mayores de un desnaturalizador ligero, por lo que se liberará la proteína purificada. Alternativamente, la proteína se puede usar para purificar el anticuerpo. Se pueden aplicar agotamientos o absorciones cruzadas apropiadas. Los anticuerpos también se pueden usar para seleccionar genotecas de expresión para productos de expresión particulares. Usualmente, los anticuerpos usados en dicho procedimiento serán marcados con una porción que permita la fácil detección de la presencia del antígeno mediante unión con el anticuerpo. Los anticuerpos generados contra un receptor de citoclna también se usarán para generar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles en la detección o el diagnóstico de varias condiciones inmunológicas relacionadas con la expresión de la proteína o células que expresan la proteína. También serán útiles como agonistas o antagonistas del ligando, que pueden ser inhibidores competitivos o sustitutos para ligandos que ocurren naturalmente. Ciertos anticuerpos para subunidades de receptor o combinaciones pueden servir como anticuerpos activadores, que pueden afectar la señalización sirviendo así, v.gr., como agonistas de ligandos. Una proteína receptora de citocina que se une específicamente a, o que es específicamente inmunorreactiva con un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, se determina típicamente en un inmunoensayo. El inmunoensayo típicamente utiliza un antisuero policlonal que se generó, v.gr., para una proteína de SEQ ID NO: 2. Este antisuero se selecciona para tener reactividad cruzada baja contra otros miembros de la familia de receptores de citocina, v.gr., subunidad de receptor IL-12Rß o subunidad de receptor IL-6 gp 130, preferiblemente de la misma especie, y cualquier reactividad cruzada es removida por la ¡nmunoabsorción antes de usarse en el inmunoensayo. Para producir antisuero para usarse en un inmunoensayo, la proteína, v.gr. de SEQ ID NO: 2, se aisla como se describe aquí. Por ejemplo, la proteína recombinante se puede producir en una línea celular de mamífero. Un hospedero apropiado, v.gr., una cepa endogámica de ratón tal como Balb/c, es inmunizado con la proteína seleccionada, típicamente usando un adyuvante estándar, tal como el adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón estándar (véase Harlow y Lañe, antes citados) Alternativamente, un péptido sintético derivado de las secuencias que aquí se describen y conjugado a una proteína portadora se puede usar como un ¡nmunógeno. Los sueros policlonales se recogen y se titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, v.gr., un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 104 o mayor se seleccionan y se prueban para su reactividad cruzada contra otros miembros de la familia de receptores de citocina usando un inmunoesnsayo de unión competitivo tal como el que se describe en Harlow y Lañe, antes citados, en las páginas 570-673. Preferiblemente por lo menos dos miembros de la familia del receptor de citocina se usan en esta determinación. Estos miembros de la familia del receptor de citocina se pueden producir como proteínas recombinantes y se pueden aislar usando técnicas de biología molecular y química de proteínas estándares como se describe aquí. Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva se pueden usar para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de SEQ ID NO: 2 puede ser inmovilizada a un soporte sólido. Las proteínas añadidas a la prueba compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir \ con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con las otras proteínas, v.gr., de gp130 o IL-Rß2. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores. Aquellos antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas anteriormente listadas se seleccionan y se depositan en un acervo. Los anticuerpos de reacción cruzada son después removidos de los antisueros de acervo por inmunoabsorción con las proteínas anteriormente listadas. Los antisueros inumunoabsorbidos y en acervo se usan después en un inmunoensayo de unión competitiva como se describió anteriormente para comparar una segunda proteína con la proteína de inmunógeno (v.gr., la proteína similar a DCRSd de SEQ ID NO: 2). Para hacer esta comparación, las dos proteínas se probaron cada una en un amplio intervalo de concentraciones y se determinó la cantidad de cada proteína requerida para inhibir 60% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es menor que dos veces la cantidad de la proteína de la proteína o proteínas seleccionadas que requiere, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno. Se entiende que estas proteínas receptoras de citocina son miembros de la familia de proteínas homologas que comprenden muchos genes identificados. Para un producto de gen particular, como DCRSd, el término se refiere no sólo a las secuencias de aminoácidos que aquí se describen, sino también a otras proteínas que son variantes alélicas, no-alélicas o variantes de especies. También se entiende que los términos incluyen mutaciones no naturales introducidas por mutación deliberada usando tecnología recombinante convencional tal como mutación de sitio individual, o cortando secciones cortas de ADN que codifican las proteínas respectivas, o sustituyendo nuevos aminoácidos, o añadiendo nuevos aminoácidos. Dichas alteraciones menores típicamente mantendrán sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula y/o su actividad biológica. Por lo tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con proteína DCRSd que ocurre naturalmente diseñada. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas se pueden determinar expresando la proteína en una línea celular apropiada y midiendo el efecto apropiado, v.gr., en lifocitos transfectados. Las modificaciones de proteína particulares consideradas menores incluirían sustitución conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se describió anteriormente para la familia de receptor de citocina como un todo. Alineando una proteína en forma óptima con la proteína de los receptores de citocina y usando los inmunoensayos convencionales que aquí se describen para determinar la inmunoidentidad, se pueden determinar las composiciones de proteína de la invención. Más aún, los anticuerpos contra las subunidades de receptor pueden servir para bloquear estéricamente la unión de ligando al receptor funcional. Dichos anticuerpos pueden generarse ya sea para subunidad sola, o para la combinación de DCRSd e IL-12Rß1. Se obtendrían los antagonistas de anticuerpo.
VIL Equipos, diagnóstico y cuantificación Tanto las formas que ocurren naturalmente como las recombinantes de las moléculas similares al receptor de citocina de esta invención son útiles en equipos y métodos de prueba. Por ejemplo, estos métodos también se aplicarían a la selección para actividad de unión, v.gr., ligandos para estas proteínas. En años recientes se han desarrollado varios métodos de pruebas automatizadas para permitir la selección de decenas de cientos de compuestos por año, véase, v.gr., BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, California, y Fodor et al., (1991 ) Science 261 : 767-773. Esta última describe medios para probar la unión por una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de pruebas adecuadas para seleccionar un ligando o proteínas homologas agonistas/antagonistas se pueden facilitar en gran medida mediante la disponibilidad de grandes cantidades de receptores de citocina solubles purificados en un estado activo tal como se provee en esta invención. La DCRSd purificada se puede aplicar como revestimiento directamente sobre placas para usarse en las técnicas de selección de ligandos. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes para estas proteínas se pueden usar como anticuerpos de captura para inmovilizar el receptor respectivo sobre la fase sólida útil, v.gr., en usos de diagnóstico. Esta invención también contempla el uso de DCRSd y/o p19, fragmentos del mismo, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de equipos y métodos de diagnóstico para detectar la presencia de la proteína o su ligando. Alternativamente, o adicionalmente, anticuerpos contra las moléculas se pueden incorporar en los equipos y métodos. Típicamente, el equipo tendrá un compartimiento que contenga ya sea un péptido DCRSd y/o p19 o un segmento de gen o un reactivo que reconozca uno o el otro.
Típicamente, los reactivos de reconocimiento, en el caso de péptidos serían un receptor o anticuerpo, o en el caso de un segmento de gen, por lo general serían una sonda de hibridación. Otros compone?tes del equipo pueden incluir otras proteínas o reactivos relacionados con los polipéptidos p40, p19 (a.k.a. IL-B30) o IL-12Rß1 de la pareja ligando/receptor. Un equipo preferido para determinar la concentración de DCRSd en una muestra típicamente comprendería un compuesto marcado, v.gr., ligando o anticuerpo, que tenga afinidad de unión conocida para DCRSd, una fuente de DCRSd que ocurre naturalmente o recombinante, como un control positivo, y un medio para separar la unión del compuesto marcado libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar el DCRSd en la muestra de prueba. Normalmente se proveerán compartimentos que contienen reactivos e instrucciones. También se proveerán equipos que contienen ácidos nucleicos o proteína apropiados. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, específicos para DCRSd de mamífero o un fragmento de péptido, o fragmentos de receptor son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados del ligando y/o sus fragmentos. Las pruebas de diagnóstico pueden ser homogéneas (sin un paso de separación entre reactivo libre y complejo anticuerpo-antígeno) o heterogéneas (con un paso de separación). Existen varias pruebas comerciales tales como radioinmunoensayo (RÍA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicado de enzima (EMIT), inmunoensayo fluorescente marcado con sustrato (SLFIA) y similar. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos no marcados usando un segundo anticuerpo que sea marcado y que reconozca el anticuerpo para un receptor de citocina o para un fragmento particular del mismo, véase, v.gr., Harlow y Lañe (1988) Antibodies A Laboratory Manual, CSH, and Coligan (ed. 1991 y complementos periódicos) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener uso similar para servir como agonistas o antagonistas de receptores de citocina. Estos serían útiles como reactivos bajo circunstancias apropiadas. Frecuentemente, los reactivos para pruebas de diagnóstico son suministrados en equipos, para optimizar la sensibilidad de la prueba. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza de la prueba, el protocolo y el marcador, se provee ya sea anticuerpo marcado o no marcado o ligando marcado. Por lo general, esto es junto con otros aditivos, tales como reguladores de pH, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de señales tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el equipo también contendrá instrucciones para el uso apropiado y desecho de los contenidos después del uso. Típicamente, el equipo tiene compartimentos para cada reactivo útil, y contendrá instrucciones para el uso apropiado y desechos de los reactivos. De manera deseable, los reactivos se proveen como un polvo liofilizado seco, en donde los reactivos se pueden reconstituir en un medio acuoso que tenga concentraciones apropiadas para llevar a cabo la prueba. Los constituyentes antes mencionados de las pruebas de diagnóstico se pueden usar sin modificación o pueden ser modificados en una variedad de formas. Por ejemplo, el mareaje se puede lograr uniendo covalentemente o no covalentemente una porción que provea en forma directa o indirecta una señal detectable. En muchas de estas pruebas, un compuesto de prueba, receptor de citocina, o anticuerpos para el mismo se pueden marcar ya sea en forma directa o indirecta. Las posibilidades para el mareaje directo incluyen grupos de marcadores: radiomarcadores tales como 125l, enzimas (patente de E.U.A. número 3,645,090) tales como preroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de E.U.A. número 3,940,475) capaces de monitorear el cambio en la intensidad de fluorescencia, desplazamiento de longitud de onda o polarización de fluorescencia. Las posibilidades para mareaje indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguido de unión para avidina acoplada a uno de los grupos de mareaje anteriores. También existen muchos métodos de separación de la unión del ligando libre, o alternativamente la unión del compuesto de prueba libre. El receptor de citocina se puede inmovilizar sobre varias matrices seguidas por lavado. Las matrices adecuadas incluyen plástico tal como una placa de ELISA, filtros y glóbulos. Los métodos de inmovilización del receptor a una matriz incluyen, sin limitación, adhesión directa a plástico, uso de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. El último paso en este método implica la precipitación del complejo anticuerpo/antígeno por cualquiera de varios métodos incluyendo aquellos que utilizan, v.gr., un solvente orgánico tal como polietilénglicol o una sal tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partícula magnetizable de anticuerpo de fluoresceína descrito en Rattle et al., (1984) Clin. Chem. 30 (9): 1467-1461 , y la separación de partícula magnética de anticuerpo doble como se describe en la patente de E.U.A. número 4,669,678. Los métodos para enlazar proteína o fragmentos a varios marcadores pueden implicar grupos carboxilo activados ya sea a través del uso de carbodiimida o esteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres por reacción de grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como malelmida, para enlace, o similar. En estas aplicaciones también se usarán proteínas de fusión. Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de un receptor de citocina. Estas secuencias se pueden usar como sondas para detectar niveles del receptor de citocina respectivo en pacientes que se sospecha que tienen un trastorno inmunológico. La preparación de secuencias de nucleótidos tanto de ARN como de ADN, el mareaje de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias es bien conocido en la técnica. Normalmente, una sonda de oligonucleótidos debe tener por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos y las sondas de polinucleótidos pueden ser hasta de varias kilobases. Se pueden utilizar varios marcadores, muy comúnmente radionúclidos, particularmente 32P. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas tales como el uso de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para unirse a la avidina o anticuerpos, que pueden ser marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, fluorescentes, enzimas o similares. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex híbridos de ARN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y la prueba se puede llevar a cabo en donde el dúplex es unido una superficie, de modo que bajo la formación de dúplex sobre la superficie, la presencia de unión de anticuerpo unido a dúplex se puede detectar. El uso de sondas para el ARN de antisentido novedoso se puede llevar a cabo en técnicas convencionales tales como hibridación de ácidos nucleicos, selección de más y menos, sonda de recombinación, traducción liberada de híbrido (HRT) y traducción detenida de híbrido (HART). Esto también incluye técnicas de amplificación tales como reacción de cadena de polimerasa (PCR). También se contemplan equipos de diagnóstico que se utilizan como prueba para la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico puede depender de la combinación de indicaciones múltiples tales como marcadores. Por lo tanto, los equipos pueden probarse para combinación de marcadores, véase, v.gr., Viallet et al., (1989) Progress in Growth Factor Res. 1 :89-87. La detección de variaciones polimórficas, que pueden reflejar diferencias de señalización de receptor funcionales, pueden ser útiles en la determinación de estrategia terapéutica. Variaciones que reflejan mayor o menor respuesta a ligando pueden permitir el subestablecimiento de acervos en pacientes que responden/que no responden. El método de diagnóstico de la presente invención provee una muestra de un sujeto de prueba, v.gr., un paciente que padece de un trastorno inmune, para usarse en la medición de la expresión o actividad de DCRSd o p19. DCRSd tanto en formas que no forman complejo como en formas que forman complejo, v.gr., un DCRSd que forma complejo con IL-12beta1 , se puede medir. P19 tanto en formas que no forman complejo como en formas que forman complejo, v.gr., como p19 que forma complejo con p40, se puede medir. La expresión o actividad se puede comparar con la de un sujeto de control o una muestra de control. Una muestra de control puede ser, v.gr., una muestra de un tejido no afectado o no inflamado en el paciente que padece de un trastorno inmune. La expresión o actividad de un sujeto de control o muetsra de control se puede proveer como un valor predeterminado, v.gr., adquirido de un grupo estadísticamente apropiado de sujetos de control.
VIII. Utilidad terapéutica Esta ¡nvención provee reactivos con valor terapéutico significativo, véase, v.gr., Levitzki (1996) Curr. Opin. Cell. Biol. 8:239-244. Los receptores de citocina que ocurren naturalmente o recombinantes, fragmentos de los mismos, receptores de muteína y anticuerpos, junto con compuestos identificados como que tienen afinidad de unión a los receptores o anticuerpos, deben ser útiles, en el tratamiento de condiciones que presentan expresión anormal de los receptores de sus ligandos. Dicha anormalidad típicamente se manifestará por trastornos inmunológicos, véase v.gr., WO 01/18061. Además, esta invención debe proveer bajo valor terapéutico en varias enfermedades o trastornos asociados con expresión anormal o activación anormal de respuesta al ligando. Por ejemplo, se ha sugerido que el ligando p40/IL-B30 está implicado en el desarrollo de inmunidad mediada por células, v.gr., actividad antitumoral, montaje de inmunidad humoral y celular y efectos antlvirales. En particular, el ligando parece activar las células NK y T. La terapia se puede combinar con IL-18, IL-12, FNT, IFN?, radiación/quimioterapia, adyuvantes o compuestos antitumorales, antivirales o antimicóticos. Por el contrario, antagonistas, que se pueden combinar con antagonistas de FNT, IFNy, IL-18 o IL-12, o con IL-10 o esteroides, se pueden indicar en enfermedades mediadas por Thl crónicas, autoinmunidad, o situaciones de trasplante y/o rechazo, esclerosis múltiple, psoriasis, condiciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, osteoartritis, o enfermedades intestinales inflamatorias. Los antagonistas pueden adoptar la forma de anticuerpos contra las subunidades de receptor, construcciones de receptor solubles, ácidos nucleicos de antisentido, o ácidos nucleicos de interferencia de ARN, para una o más de las subunidades de receptor. Esta coincidencia del ligando p40/pl9 con las subunidades de receptor DCRSd y IL- 12R provee perspectiva hacia indicaciones para el uso de los agonistas y antagonistas. Terapéuticamente, con base en las actividades de p40/p19 descritas, los antagonistas de la citocina pueden ser afectadas, v.gr., por DCRSd soluble, con o sin IL-12Rß1 soluble, o anticuerpos para cualquiera de las subunidades de receptor. Los antagonistas pueden ser útiles como inhibidores para respuestas inmunes o inflamatorias indeseables, a células T de memoria objetivo, o en combinación con antagonistas de IL-12/IL-12R, u otros anti-inflamatorios o inmunosupresores. Las indicaciones clínicas pueden ser inflamación crónica o situaciones de trasplante. Varios polimorfismos pueden incrementar o reducir la función del receptor, y si es dominante, podrían ser útiles como terapéuticos. La identificación de dichas variantes puede permitir el subestablecimiento de acervos para el paciente que responde o que no responde. Los reactivos pueden ser útiles como reactivos de detección o marcadores o reactivos ablativos para células T de memoria y/o células NK. La invención contempla métodos de tratamiento que usan ácidos nucleicos de antisentido o ácidos nucleicos de interferencia de ARN para p19 humana (SEQ ID NO: d) o para DCRSd humana (SEQ ID NO: 1 ), véase, v.gr., Arenz y Schepers (2003) Naturwissenschaften 90:346-369; Sazani y Kole (2003) J. Clin. Invest. 112: 481-486; Pirollo, et al. (2003) Pharmacol. Therapeutics 99: 55-77; Wang, et al. (2003) Antisense NucL Acid Drug Devel. 13:169-189; Haraoui, et al. (2000) Curr. Pharm: Biotechnol. 1: 217-233; Alvarez, et al. (2001 ) Curr. Pharm. Des. 7: 1059-1081 ; Sandbom y Targan (2002) Gastroenterol. 122: 1592-1608. La terapia génica puede hacer que las poblaciones de células deseadas respondan al ligando p40/p19, v.gr., como adyuvantes para inmunoterapia tumoral, para facilitar la activación de linfocitos de infiltración de tumor, células T, o células NK. Se pueden aplicar estrategias de antisetido o interferencia de ARN, v.gr., para evitar respuesta del receptor. Varias condiciones anormales se conocen en tipos de células que se muestra que producen ARNm de IL-12 p40 y/o p19 por análisis de Northern blot. Véase Berkow (ed.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co. , Rahway, N. J.; Thom, et al. Harrison's Principies of Intemal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; y Weatherall, et al. (eds. ), Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Muchas otras condiciones médicas y enfermedades responderán a tratamiento por un agonista o antagonista aquí provisto. Véase, v.gr., Stites y Terr (eds.) (1991 ) Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; y Samter, et al. (eds.) Immunological Diseases Little, Brown and Co. Otras probables indicaciones para el tratamiento incluyen remodelación de hueso, disfunción sexual, prevención de enfermedades neurodegenerativas, demencia, estrés y otros. Estos problemas deben ser susceptibles a prevención o tratamiento usando las composiciones aquí provistas. Los receptores de citocina recombinantes, muteínas, anticuerpos agonistas o antagonistas para los mismos, o anticuerpos se pueden purificar y después administrar a un paciente. Estos reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes activos adicionales, v.gr., en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser estériles, v.gr., se pueden filtrar y colocar en formas de dosis por liofilización en frascos de dosis o almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que no son unión de complemento. La selección del ligando que usa receptor de citocina en fragmentos del mismo se puede realizar para identificar moléculas que tengan afinidad de unión a los receptores. Después se pueden usar pruebas biológicas subsecuentes para determinar si un ligando putativo puede proveer unión competitiva, que pueda bloquear la actividad estimulante intrínseca. Fragmentos de receptor se pueden usar como un bloqueador o antagonista ya que bloquea la actividad del ligando. Asimismo, un compuesto que tiene actividad estimulante intrínseca puede activar el compuesto y por lo tanto es un agonista ya que estimula la actividad del ligando, v.gr., induciendo la señalización. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos para receptores de citocina como antagonistas. Las cantidades de reactivos necesarias para terapia efectiva dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio objetivo, vida fisiológica del reactivo, vida farmacológica, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por lo tanto, las dosis de tratamiento se deben titular para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proveer una guía útil en las cantidades útiles para administración in situ de estos reactivos. La prueba de dosis efectiva en animales para el tratamiento de trastornos particulares proveerá indicación predictiva adicional de dosis humana, véase v.gr., Gilman, et al., (eds. 1990) Goodman and Gilman's: de Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a. Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a. Ed. (1990) Marck Publishing Co., Easton Penn. Los métodos para administración se describen en éstas y más adelante, v.gr., para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otros. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, reguladores de pH y otros compuestos descritos, v.gr., en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Debido a la unión de afinidad probablemente alta, o números de recambio, entre un ligando putativo y sus receptores, se esperaría inicialmente que las dosis bajas de esos reactivos fueran efectivas. Y la vía de señalización sugiere que cantidades extremadamente bajas de ligando puedan tener efecto. Por lo tanto, se esperaría ordinariamente que los intervalos de dosis alcanzaran concentraciones de menos de 1 mM, típicamente de menos de aproximadamente 10 µM, usualmente menos de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menos de 10 pM (picomolar), y muy preferiblemente aún menos de 1 fM (femtomolar), con un vehículo apropiado. Las formulaciones de liberación lenta o un aparato de liberación lenta a menudo se utilizará para administración continua. Los receptores de citocina, fragmentos de los mismos y anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas y agonistas se pueden administrar directamente al hospedero que se va a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser conveniente conjugarlos para portar proteínas tales como ovalbúmina o albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en muchas formulaciones de dosis convencionales. Aunque es posible que el ingrediente activo sea administrado solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden por lo menos un ingrediente activo, como se definió antes, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo debe ser farmacéuticamente y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no dañino para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, v.gr., Gilman et al., (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Farmacological Bases of Therapeutics, 8a. Ed. Pergamon Press; and Remington's Farmaceutical Science, 17a. Ed. (1990), Marck Publishing, Co., Easton Penn.; Avis et al., (eds 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman, et al., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker N.Y., y Lieberman, et al., (eds. 1990). Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N.Y. La terapia de esta invención se puede combinar o usar junto con otros agentes terapéuticos, particularmente agonistas o antagonistas de otros miembros de la familia del receptor de citocina. La invención provee reactivos y métodos para el tratamiento y diagnóstico de asma o alergias. Estos trastornos se asocian con expresión o actividad incrementada de IL-6, IL-19, CXCL1 (a.k.a. GROalpha), IL-17, y GM-CSF, véase, v.gr., Cembrzynska- Nowak, et al. (1998) Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 46:381-386; Hsieh, et al. (1996) J Allergy Clin. Immunol. 98:580-687; Prause, et al. (2003) Eur. J: Pharmacol. 462: 193-198. Molet, et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108: 430-438. Linden (2001 ) Int. Arch. Allergy Immunol. 126: 179-184; Cates, et al. (2003) J. Allergy Clin Immunol. 111: 1076- 1086; Yamashita, et al. (2002) Cell Immunol. 219: 92-97. También se proveen reactivos y métodos para COPD, un trastorno conectado con expresión o actividad incrementada de IL-6, CXCL1, y GM-CSF, véase, v.gr., Chung, et al. (2001) Eur. Respir. J. Suppl. 34:50s-d9s; Través, et al. (2002) Thorax 67:690-696; Profita, et al. (2003) Thorax 68:673-679.
La ¡nvención también provee reactivos y métodos para artritis reumatoide, un trastorno que involucra expresión o actividad incrementada de IL-6, CXCL1 , IL-17, y GM-CSF, véase, v.gr., Gentiletti y Fava (2003) Arthritis Rheum. 48:1471-1474; Nakahara, et al. (2003) Arthritis 48:1521-1529; Konig, et al. (2000) Virchows Arch. 436:449-458; Koch, et al. (1995) J. Immunol. 156:3660-3666; Borzi, et al. (1999) FEBS Lett. 455:238-242; Boiardi, et al. (1999) Clin. Exp. Rheumatol. 17:419-425; Hogan, et al. (1994) Cytokine 6:61- 69; Kehlen, et al. (2002) Clin. Exp. Immunol. 127:539-546; Cook, et al. (2001) Arthritis Res. 3: 293-298. También se proveen reactivos y métodos para el tratamiento y diagnóstico de trastorno intestinal inflamatorio (IBD), un trastorno caracterizado por expresión o actividad incrementada de IL-6, CXCL-1 , IL-17, y GM-CSF, véase, v.gr., Rahbar, et al. (2003) Inflamm. Bowel Dis. 9:154-161 ; Isaacs, et al. (1992) Gastroenterol. 103:1587-1596; Imada, et al. (2001 ) Scand. J. Gastroenterol. 36: 854-864; Brandt, et al. (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:647-653; Fujino, et al. (2003) Gut 52:66-70; Nielsen, et al. (2003) Scand. J Gastroenterol. 38: 180-185; Carlson, et al. (2002) Gut 50:601-606. Además se abarcan reactivos y métodos para el diagnóstico y tratamiento de trastornos inflamatorios de la piel, v.gr., psoriasis, una familia de trastornos asociados con expresión o actividad incrementada de IL-6, CXCL1 , IL-17, y GM-CSF, véase, v.gr., Ishihara y Hirano (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13: 57-368; Gillitzer, et al. (1996) J. Invest. Dermatol. 107: 778-782; Steude, et al. (2002) J. Invest. Dermatol. 119:1254-1260; Albanesi, et al. (2000) J. Invest. Dermatol. 115:81-87; Schon, et al. (2000) J. Invest. Dermatol. 114: 976-983.
IX. Selección La selección de fármacos usando DCRSd o fragmentos del mismo se puede realizar para identificar compuestos que tiene afinidad de unión a la subunidad de receptor, incluyendo aislamiento de compuestos asociados. Entonces pueden usarse pruebas biológicas subsecuentes para determinar si el compuesto tiene actividad estimulante intrínseca y por lo tanto es un bloqueador o antagonista ya que bloquea la actividad del ligando. Más aún, la coincidencia del ligando p40/p19 con el receptor funcional de DCRS3 con IL-12Rß1 , permite selección para antagonistas y agonistas con un control de señalización positivo. Se puede hacer la selección de molécula pequeña o anticuerpo. Un método de selección de fármaco utiliza células hospedero eucarióticas o procarióticas que son establemente transformadas con molécula de ADN recombinante que expresa, v.gr. el DCRSd en combinación con otra subunidad de receptor de citocina, v.gr., IL-12Rß1. Se cree que la señalización usa STAR4. Se pueden aislar células que expresen un receptor en aislamiento de otros receptores funcionales. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, se pueden usar para pruebas de unión estándares de anticuerpo/antígeno o ligando/receptor. Véase también, Parce et al., (1989) Science 246:243-247; y Owicki, et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:4007-4011 , que describe métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Pruebas competitivas son particularmente útiles, en donde las células están en contacto y son incubadas con un receptor marcado o anticuerpo marcado que tiene una afinidad de unión conocida al ligando, tal como 125l-anticuerpo, y una muestra de prueba cuya afinidad de unión a la composición de unión está siendo medida. La unión y las composiciones de unión marcadas libres son después separadas para evaluar el grado de unión del ligando. La cantidad de unión del compuesto de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de unión del receptor marcado a la fuente conocida. Se pueden usar muchas técnicas para separar la unión de ligando libre para evaluar el grado de unión del ligando. Este paso de separación podría implicar típicamente un procedimiento tal como adhesión a filtros seguido de lavado, adhesión a plástico seguido de lavado, o centrifugación de las membranas celulares. Las células viables también podrían usarse para seleccionar los efectos de los fármacos sobre las funciones mediadas por citocina, v.gr., señalización de STAT4 y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de un paso de separación, v.gr., un sistema de detección sensible a proximidad. El amplio alcance de esta ¡nvención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar las invenciones a las modalidades específicas.
EJEMPLOS I. Métodos generales Algunos de los métodos generales se describen o se hace referencia a los mismos, v.gr., en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2a ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Los métodos para purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación de sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, v.gr., Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Coligan, et al. (eds.) (1996 y suplementos periódicos), Current Protocols in Protein Science Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y la literatura del frabricante sobre el uso de productos de purificación de proteínas, v.gr., Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permiten la fusión a segmentos apropiados, v.gr., a una secuencia de FLAG o un equivalente que se puede fusionar mediante una secuencia removible con proteasa. Véase, v.gr., Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al. (1992) OlAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Se realiza análisis de secuencia por computadora, v.gr., usando programas de software disponibles, incluyendo aquellos de fuentes de GCG (U. Wisconsin) y GenBank. Las bases de datos de secuencia únicas también se usaron, v.gr., de GenBank y otros. Muchas técnicas aplicables a receptores de IL-10 se pueden aplicar al DCRSd, como se describe, v.gr., en USSN 08/110,683 (receptor de IL-10).
II. Clonación funcional Se observó que las respuestas bloqueadas por anticuerpo anti-hlL-12Rß1 de células T humanas para p40/pl9, y la p40/p19 unida a IL-12Rß1. Esto sugiere que IL-12Rßl era una subunidad del complejo receptor para p40/p19. Se identificó una población de células T de ratón que respondió a p40/p19 pero no a IL-12, y otra población que respondió a IL-12 pero no a p40/p19. Además, se observó que células Ba/F3 que expresaban mlL-12Rß1 y mlL-12Rß2 recombinante respondieron a IL-12, pero no a p40/p19. Estos resultados indicaron colectivamente que el complejo de receptor para p40/p19 contenía la IL-12Rß1 y por lo menos otra subunldad que no era IL-12Rß2. Por consiguiente, se contempló una estrategia de clonación de expresión para aislar este segundo componente de receptor. Una genoteca de ADNc se preparó a partir de ARNm aislado de células Kit22d, una línea de células T humanas dependientes de IL-2 que responden tanto a IL-12 como a p40/p19. La genoteca de ADNc se hizo usando un vector de expresión retroviral, pMX. Células Ba/F3 que expresaban h IL-12Rß1 recombinante fueron infectadas con esta genoteca de ADNc, que se dejó recuperar durante 3-4 días en IL-3, después se lavó y se colocó en placas a -16,000 células/pozo en placas de 96 pozos en medio que contenía 50 ng/ml de hiper-hp40/hp19. Véase, WO 01/18051. Los cultivos fueron complementados cada 5 días con hiper-hp40/hp19 adicional. Después de aproximadamente dos semanas d-10% de los pozos mostraron crecimiento de células. Las células fueron recuperadas de cada pozo, se expandieron individualmente en cultivos más grandes en hiper-hp40/hp19, y se probaron para dependencia de crecimiento de hiper-hp40/hp19. Células que eran dependientes de p40/p19 para crecimiento se analizaron por PCR para insertos de ADNc retroviral. De más de 40 aislados analizados, todos excepto uno contenían ADNc que codificaban el receptor DCRSd novedoso. Esta ADNc humano candidato se clonó en un vector de expresión y se transfectó a células Ba/F3 que expresaban hlL-12Rß1. Estas células respondieron a p40/p19; por lo tanto, se concluyó que el ADNc novedoso codificó la DCRSd deseada, funcionalmente una subunidad de receptor p19. lll. Rasgos de DCRSd de longitud completa; localización cromosómica El dominio citoplásmico de DCRSd no está estrechamente relacionado en general con otros dominios citoplásmicos de receptor de citocina, una observación común en esta familia de moléculas. El dominio citoplásmico contiene siete residuos tyr, por lo menos tres de los cuales son parte de motivos de unión a SH2 reconocibles: YEDI, YKPQ y YFPQ. El motivo YEDI es similar a sitios de unión identificados para la tirosina fosfatasa shp2. Estos últimos dos motivos son muy similares a secuencias que se sabe que se unen a Statl/Stat3 o Stat3, respectivamente. El motivo YKPQ, junto con secuencias cercanamente flanqueables, también se asemeja hasta cierto grado los motivos en Stat4 y IL-12Rß2 que se sabe que se unen a Statl-3. Esto es consistente con datos preliminares que sugieren que p40/p19, como IL-12, activa a Stat4. Se usan iniciadores de PCR derivados de la secuencia de DCRSd para sondear una genoteca de ADNc humana. Las secuencias se pueden derivar, v.gr., de los SEQ ID NO: 1 , preferiblemente aquellas adyacentes a los extremos de secuencias. Los ADNs de longitud completa para DCRSd de primates, roedores u otras especies se clonan, v.gr., mediante selección de hibridación de ADN del fago ?gtlO. Las reacciones de PCR se conducen usando ADN polimerasa Taqplus® de T. aquaticus (Stratagene, La Jolla, CA) bajo condiciones apropiadas. Se hacen preparaciones de cromosomas. Se realiza hibridación in situ sobre preparaciones de cromosomas obtenidas de linfocitos humanos estimulados con fitohemaglutinina cultivados durante 72 horas. Se añade 5- bromodesoxiuridina durante las siete horas finales de cultivo (60 µg/ml de medio), para asegurar una formación de bandas cromosómicas de posthibridación de buena calidad. Un fragmento de PCR, amplificado con la ayuda de iniciadores, se clona en un vector apropiado. El vector se marca por traducción nick 3H. La sonda radiomarcada se híbrida a preparaciones de metafase a una concentración final de 200 ng/ml de solución de hibridación (Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331 ). Después de revestirse con emulsión de rastreo nuclear (KODAK NTB2), se exponen las preparaciones. Para evitar cualquier deslizamiento de granos de plata durante el procedimiento de formación de bandas, las preparaciones de cromosomas primero se tiñen con solución de Giemsa con su pH regulado y se fotografían en la metafase. La formación de bandas R se realiza después por el método de fluorocromo-fotólisis-Giemsa (FPG) y se vuelven a fotografiar en la metafases antes del análisis. Se usan métodos apropiados similares para otras especies.
IV. Localización de ARNm de DCRSd Tejido múltiple humano (Cat No. 1 , 2) y transferencias de líneas celulares de cáncer (Cat No. 7767-1 ), que contienen aproximadamente 2 µg de ARN de poly(A)+ por franja, se compran de Clontech (Palo Alto, CA). Las sondas se radiomarcan con [a-32p] dATP, v.gr., usando el equipo de mareaje de iniciador aleatorio Amersham Rediprime® (RPN1633). Se realiza prehibridación e hibridaciones, v.gr., a 65°C en Na2HP04 O.d M, SDS al 7%, EDTA O.d M (pH 8.0). Se llevan a cabo lavados de alta astringencia, v.gr., a 6d°C con dos lavados iniciales en 2 x SSC, SDS al 0.1% durante 40 minutos seguido de un lavado subsecuente en 0.1 x SSC, SDS al 0.1% durante 20 minutos. Las membranas después se exponen a -70°C a película de rayos X (Kodak) en presencia de tamices intensificadores. Estudios más detallados realizados por cDNA Library Southems se llevan a cabo con clones de DCRSd humano apropiados para examinar su expresión en subconjuntos de células hemopoyéticas u otras células. En forma alternativa, se seleccionan dos iniciadores apropiados a partir de SEQ ID NO:1. Se usa RT-PCR en una muestra de ARNm apropiada seleccionada para la presencia de mensaje para producir un ADNc, v.gr., una muestra que exprese el gen. Los clones de longitud completa se pueden aislar por hibridación de genotecas de ADNc a partir de tejidos apropiados preseleccionados por señal de PCR. Se pueden realizar Nothern Blots. El mensaje para genes que codifican DCRS se probarán mediante tecnología apropiada, v.gr., PCR, inmunoensayo, hibridación u otras tecnologías. Preparaciones de ADNc de tejidos y órganos están disponibles, v.gr., de Clontech, Mountain View, CA. Es útil la Identificación de fuentes de expresión natural, como se describió. Y la identificación de apareamientos de subunidades de receptor funcional permitirán la predicción de qué células expresan la combinación de subunidades de receptor que darán por resultado una respuesta fisiológica a cada uno de los ligandos de citocina. Para distribución en ratón, v.gr., se puede realizar el análisis de Southern: ADN (d µg) de una genoteca de ADNc amplificado primario se digiere con enzimas de restricción apropiadas para liberar insertos, que se hacen correr en un gel de agarosa al 1% y se transfieren a una membrana de nylon (Schleicher y Schuell, Keene, NY). Muestras para aislado de ARNm de ratón pueden incluir: línea de células L fibrolásticas de ratón en reposo (C200); células transfectadas de Braf:ER (fusión de Braf para receptor de estrógeno), control (C201); células T, polarizadas con TH1 (Mel14 brillante), células CD4+ de bazo, polarizadas durante 7 días con IFN-? y anti IL-4; T200); células T, polarizadas con TH2 (Mel14 brillante, células CD4+ de bazo, polarizadas durante 7 días con IL-4 y anti-IFN-?; T201 ); células T, altamente polarizadas con TH1 (véase Openshaw, et al. (1996) J. Exp. Med. 182:1357-1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 horas en acervo; T202); células T, altamente polarizadas con TH2 (véase Openshaw, et al. (1995) antes citada; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 horas en acervo; T203); células pre T de CD44" CD25+, almacenadas del timo (T204); clon de células T TH1 D1.1 , en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T206); clon de células T TH1 D1.1 , 10 µg/ml de ConA estimulada durante 1d horas (T206); clon de células T TH2 CDC36, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T207); clon de células T TH2 CDC36, 10 µg/ml de ConA estimulada durante 15 horas (T208); Mel14+ células T intactas de bazo, en reposo (T209); Mel14+ células T, polarizadas a TH1 con IFN-?/IL- 12/anti-IL-4 durante 6, 12, 24 horas en acervo (T210); Mel14+ células T, polarizadas a Th2 con IL-4/anti-IFN-? durante 6, 13, 24 horas en acervo (T211 ); línea de células de leucemia de células B maduras estimuladas A20 (B200); línea de células B no estimuladas CH12 (B201); células B grandes no estimuladas de bazo (B202); células B de bazo total, activadas con LPS (B203); células dendríticas enriquecidas con metrizamida de bazo, en reposo (D200); células dendríticas de médula ósea, en reposo (D201 ); línea de células de monocito RAW 264.7 activadas con LPS durante 4 horas (M200); macrófagos de médula ósea derivados con GM y M-CSF (M201 ); línea de células de macrófago J774, en reposo (M202); línea de células. de macrófago J774 + LPS + anti-IL-10 a 0.5, 1 , 3, 6, 12 horas en acervo (M203); línea de células de macrófago J774 + LPS + IL-10 a 0.5, 1 , 3, 5, 12 horas en acervo (M204); tejido pulmonar de ratón tratado con aerosol, iniciadores Th2, OVA tratadas con aerosol 7, 14, 23 horas en acervo, (véase, Garlisi, et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75: 75-83; X206; tejido pulmonar infectado con Nippostrongulus (véase Coffman, et al. (1989) Science 245: 308-310; X200); pulmón de adulto total, normal (0200); pulmón total, rag-1 (véase Schwarz, et al. (1993) Immunodeficiency 4:249-252; 0205); bazo IL-10 K.O. (véase Kuhn, et al. (1991 ) Cell 75:263-274; X201 ); bazo de adulto total, normal (0201 ); bazo total rag-1 (0207); parches de Peyer K.O. IL-10 (0202); parches de Peyer total, normal (0210); nudos linfáticos mesentéricos K.O. de IL-10 (X203); nudos linfáticos mesentéricos total, normal (0211 ); colon K.O. IL- 10 (X203); colon total, normal (0212); páncreas de ratón NOD (véase Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205); timo total, rag-1 (0208); riñon total, rag-1 (0209); corazón total, rag-1 (0202); cerebro total, rag-1 (0203); testículos total, rag-1 (0204); hígado total, rag-1 (0206); tejido de articulación normal de rata (0300); y tejido de articulación artrítica de rata (X300). Muestras para aislamiento de ARNm humano pueden incluir: células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T, células NK, granulocitos, células B), en reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 horas en acervo (T101 ); célula T, clon de THO Mot 72, en reposo (T102); células T, clon de THO Mot 72, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 horas en acervo (T103); célula T, clon de THO Mot 72, anérgico tratado con péptido específico durante 2, 7, 12 horas en acervo (T104); célula T, clon TH1 de HY06, en reposo (T107); célula T, clon TH1 de HY06, activado con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 horas en acervo (T108); célula T, clon TH1 de HY06, anérgico tratado con péptido específico durante 2, 6, 12 horas en acervo (T109); célula T, clon TH2 de HY936, en reposo (T110); célula T, clon TH2 de HY935, activado con anti-CD28 y anti-CD3 durante 2, 7, 12 horas en acervo (T111); células T Cd4+CD4dRO- células T polarizadas 27 días en anti-CD28, IL-4, y anti IFN-?, polarizado con TH2, activado con anti-CD3 y anti-CD28 durante 4 horas (T116); líneas de tumor de célula T Jurkat y Hut78, en reposo (T117); clones de célula T, en acervo AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, en reposo (T118); clones de células T ?d aleatorias de células T, en reposo (T119); esplenocitos, en reposo (B100); esplenocitos, activados con anti-CD40 y IL-4 (B101); líneas de EBV de célula B en acervo WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221 , RM3, HSY, en reposo (B102); línea de células B JY, activadas con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (B103); clones NK 20 en acervo, en reposo (K100); clones NK 20 en acervo, activados con PMA y ionomicina durante 6 horas (K101 ); clon NKL, derivado de sangre periférica de un paciente con leucemia LGL, tratado con IL-2 (K106); clon cítotóxico NK 640-A30-1 , en reposo (K107); línea de precursor hematopoyético TF1 , activado con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (C100); línea premonocítica U937, en reposo (MI 00); línea premonocítica U937, activada con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (M101); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN?, anti-IL-10 durante 1 , 2, 6, 12, 24 horas en acervo (M102); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN?, IL-10 durante 1 , 2, 6, 12, 24 horas en acervo (M103); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN?, IL-10 durante 4, 16 horas en acervo (M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN?, IL-10 durante 4, 16 horas en acervo (M107); monocitos elutriados, activados con LPS durante 1 hora (M108); monocitos elutriados, activados con LPS durante 6 horas (M109); DC 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, FNTa 12 días, en reposo (D101); DC 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, FNTa 12 días, activado con PMA y ionomicina durante 1 hora (D102); DC 70% CD1a+, de CD34+ GM- CSF, FNTa 12 días, activado con PMA y inomicina durante 6 horas (D103); DC 96% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, FNTa 12 días FACS distribuido, activado con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (D104); DC 95% CD14+, ex CD34+ GM-CSF, FNTa 12 días FACS distribuido, activado con PMA y ionomicina 1 , 6 horas en acervo (D105); DC CD1a+ CD86+, de CD34+ GM-CSF, FNTa 12 días FACS distribuido, activado con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (D106); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 durante 5 días (107); DC de monocltos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D108); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, activado con LPS durante 4, 16 horas en acervo (D109); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, FNTa activado, monocito supe durante 4, 16 horas en acervo (D110); tumor benigno L11 de leiomioma (X101); miometrium normal Md (0116); leiomisarcoma maligno GS1 (X103); línea de sarcoma de fibroblasto de pulmón MRC5, activado con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (C101); línea de célula de carcinoma epitelial de riñon CHA, activadas con PMA y ionomicina durante 1 , 6 horas en acervo (C102); riñon fetal de sexo masculino de 28 semanas (0100); pulmón fetal de sexo masculino de 28 semanas (0101 ); hígado fetal de sexo masculino de 28 semanas (0102); corazón fetal de sexo masculino 28 semanas (0103); cerebro fetal de sexo masculino 28 semanas (0104); vesícula biliar fetal sexo masculino de 28 semanas (0106); intestino delgado fetal masculino 28 semanas (0107); tejido adiposo fetal masculino 28 semanas (0108); ovario fetal femenino 25 semanas (0109); útero fetal femenino 25 semanas (0110); testículos fetal masculino 28 semanas (0111 ); bazo fetal masculino 28 semanas (0112); placenta adulta 28 semanas (0113); y amígdalas inflamadas, de 12 años de edad (X100). Muestras similares se pueden aislar en otras especies para evaluación.
V. Clonación de contrapartes de especies de DCRSd Se usan varias estrategias para obtener contrapartes de especies de las DCRSd, preferiblemente de otros primates o roedores. Un método es por hibridación cruzada usando sondas de ADN de especies estrechamente relacionadas. Puede ser útil ir en especies evolutivamente similares como pasos intermediarios. Otro método es mediante el uso de iniciadores de PCR específicos basados en la identificación de bloques de similitud o diferencia entre genes, v.gr., áreas de secuencia de polipéptido o nucleótido altamente conservadas o no conservadas. Las búsquedas en bases de datos pueden identificar secuencias similares y permitir la producción de sondas apropiadas.
VI. Producción de proteína DCRSd de mamífero Una construcción de fusión apropiada, v.gr., glutation-S-transferasa (GST), es manipulada genéticamente para expresión, v.gr., en E. coli. Por ejemplo, un plásmido de 1GIF pGEX® de ratón se construye y se transforma en E. coli. Células recién transformadas se hacen crecer, v.gr., en un medio de LB que contiene 60 µg/ml de ampicilina e inducido con IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Después de inducción durante la noche, las bacterias se cosechan y las pastillas que contienen la proteína apropiada se aislan. Las pastillas se homogenizan, v.gr., en regulador de pH de TE (tris 50 mM-base pH 8.0, EDTA 10 mM y pefabloc 2 mM) en 2 litros. Este material se hace pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics, Newton, MA) tres veces. El sobrenadante fluidizado se hace girar en un rotor Sorvall GS-3 durante 1 hora a 13,000 rpm. El sobrenadante resultante que contiene la proteína receptora de citocina se filtra y se hace pasar sobre una columna de glutation- Sepharose® en Tris 60 mM-base pH 8.0. Las fracciones que contienen la proteína de fusión DCRS5-GST se guardan en acervo y se digieren, v.gr., con trombina (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). El acervo digerido después se hace pasar sobre una columna de Q-Sepharose® equilibrada en Tris 50 mM-base. Fracciones que contienen DCRSd se guardan en acervo y se diluyen en H20 destilada fría, para reducir la conductividad, y se hacen pasar de nuevo sobre una columna de Q-Sepharose® fresca, sola o en sucesión con una columna de anticuerpo inmunoafinidad. Las fracciones que contienen la proteína DCRSd se guardan en acervo, se forman alícuotas con las mismas y se almacenan en un congelador a -70°C. Una comparación del espectro de dicroismo circular con proteína receptora de citocina puede sugerir que la proteína está correctamente doblada, véase Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem. 264:1689-1693.
VII. Preparación de anticuerpos específicos para DCRSd Ratones Balb/c endogámicos son inmunizados intraperitonealmente con formas recombinantes de la proteína, v.gr., DCRSd purificado o células NIH-3T3 transfectadas. Los animales son reforzados en puntos de tiempo apropiados con proteína, con o sin adyuvante adicional, para estimular más la producción de anticuerpo. Se recoge el suero, o hibridomas producidos con bazos cosechados. Alternativamente, ratones Balb/c son inmunizados con células transformadas con el gen o fragmentos del mismo, ya sea células endógenas o exógenas, o con membranas aisladas enriquecidas para expresión del antígeno. El suero es recogido en el tiempo apropiado, típicamente después de varias administraciones adicionales. Pueden ser útiles varias técnicas de terapia de genes, v.gr., en la producción de proteína in situ, para generar una respuesta inmune. El suero o preparaciones de anticuerpo se pueden absorber en forma cruzada o inmunoseleccionada para preparar anticuerpos sustancialmente purificados de especificidad definida y afinidad alta. Se pueden hacer anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, los esplenocitos se fusionan con una pareja apropiada y los hibridomas se seleccionan en el medio de crecimiento mediante procedimientos estándares. Los sobrenadantes de hibridoma se seleccionan para la presencia de anticuerpos que se unen a la DCRSd, v.gr., por ELISA u otra prueba. También se pueden seleccionar o preparar anticuerpos que reconocen específicamente modalidades de DCRSd específicas.
En otro método, péptidos sintéticos o proteína purificada se presentan a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, v.gr., (ed.) (1991 ) Current Protocols in Inmunology Wiley/Greene; y Harlow y Lañe, anteriormente citada. En situaciones apropiadas, el reactivo de unión es ya sea marcado como se describió antes, v.gr., fluorescencia u otro, inmobilizado a un sustrato para métodos panorámicos. Los ácidos nucleicos también se pueden introducir en células en un animal para producir el antígeno, que sirve para inducir una respuesta inmune. Véase, v.gr., Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:4156-4160; Barry, et al. (1994) BioTechniques 16:616-619; y Xiang, et al. (1995) Immunity 2:129-135.
VIII. Producción de proteínas de fusión con DCRSd Varias construcciones de fusión se hacen con, incluyendo modalidades que combinan a ésta con la secuencia de IL-12Rß1. Una porción del gen apropiado se fusiona a una etiqueta de epítope, v.gr., una etiqueta FLAG, o a una construcción de sistema de dos híbridos, véase, v.gr., Fields y Song (1989) Nature 340:245-246. La etiqueta de epítope se puede usar en un procedimiento de clonación de expresión con detección con anticuerpos anti-FLAG para detectar una pareja de unión, v.gr., un ligando para el receptor de citocina respectivo. El sistema de dos híbridos también se puede usar para aislar proteínas que se unen específicamente a DCRSd.
IX. Relación de actividad de estructura Información sobre el carácter crítico de los residuos particulares se determina usando procedimientos y análisis estándares. El análisis de mutagénesis estándar se realiza, v.gr., generando muchas variantes diferentes en posiciones determinadas, v.gr., en las posiciones anteriormente identificadas, y evaluando actividades biológicas de las variantes. Esto se puede realizar al grado de determinar posiciones que modifiquen la actividad, o para enfocarse en posiciones específicas para determinar los residuos que puedan ser sustituidos ya se para retener, bloquear o modular la actividad biológica. Alternativamente, el análisis de variantes naturales puede indicar qué posiciones toleran las mutaciones naturales. Esto puede resultar del análisis poblacional de variación entre individuos o a través de cepas o especies. Las muestras de individuos seleccionados se analizan, v.gr., por análisis de PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de polimorfismos de población.
X. Coexpressión de DCRSd y IL-12RB1 Un vector, o vectores, que codifican el gen respectivo pueden ser transfectados a una célula. Preferiblemente, dicho vector tendrá marcadores de selección para identificar qué células han sido transformadas con éxito. La coexpresión de los dos genes permitirá los productos genéticos para asociar apropiadamente formar complejos de receptor activo. Alternativamente, el uso de los métodos que causan asociación de dímeros funcionales están disponibles, véase, v.gr., O'Shea, et al. (1989) Science 245:646-648; Kostelny, et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553; Patel, et al. (1996) J Biol. Chem. 271 :30386-30391. La expresión de los dominios extracelulares, y asociación física, v.gr., impulados por afinidad de cremallera de leucina Fos/Jun, dará por resultado construcciones de unión a ligando que actuarían como compuestos de unión para usos de diagnóstico y terapéuticos.
XI. Distribución de p19 (a.k.a. IL-B30), p40 y DCRSd (a.k.a. IL-23R) P19, p40 y DCRSd, son expresados por varias células y tejidos, como se determina por pruebas de PCR de tiempo real de Taqman (g) (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), en donde los resultados son relativos a expresión de ubiquitina (cuadro 2). La expresión de ubiquitina se fija a uno. La expresión de pl9 y p40 se encontró que eran elevados en condiciones inflamatorias de la piel, v.gr., psoriasis y dermatitis atópica, y en respuesta a desafío con Ascaris (cuadro 2). La expresión de p19 se evaluó en pneumonitis por hipersensibilidad, fibrosis pulmonar ¡diopática, y en trastorno intestinal inflamatorio (IBD), v.gr., enfermedad de Crohn (cuadro 2). Se encontró que la expresión de IL-23R (a.k.a. DCRSd) se incrementaba, v.gr., en psoriasis y artritis reumatoide (cuadro 2).
CUADRO 2 Expresión de p19, p40 e IL-23R por células v tejidos por Taqman^ XII Histología de receptor de IL-23 (IL-23R) Tejidos humanos fueron sometidos a análisis histológico usando anticuefo anti-IL-23R (24F9) y un anticuefo de control de isotipo (31F11)(cuadro 3). Un subconjunto de linfocitos, macrófagos y células plasmáticas raras, mostró tinción positiva por el anticuerpo IL-23R. Los linfocitos de tinción positiva se localizaron en áreas interfoliculares más que en centros germinales del nodo linfático. Muestras sinoviales de artritis reumatoide (RA) demostró tinción de células inflamatorias, particularmente células plasmáticas, que fue más intensa y más predominante de células inflamatorias, que muestras de controles normales. Las muestras sinoviales normales no contienen infiltrados de células inflamatorias. Muestras de colon e intestino delgado con trastorno intestinal inflamatorio (IBD), es decir, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, reveló una predominancia mayor de linfocitos y células plasmáticas de prueba positiva, que en controles normales. El incremento en predominancia se incrementó en proporción al incremento en números totales de las células inflamatorias en los tejidos. Las muestras de pulmón de trastornos pulmonares obstructivos crónicos (COPD) mostraron células Clara de prueba positiva, mientras que las células Clara de una muestra de paciente normal fueron negativas. La prueba de muestra de la piel de un hombre de 62 años de edad mostró un valor de tinción de linfocitos de 0, mientras que una muestra de piel psoriática de un hombre de 54 años de edad mostró un valor de linfocitos de 2 (raro).
CUADRO 3 Histología de tejidos humanos. Tinción con anticuerpo anti-IL-23R (24F)) en relación con anticuerpo de control de isotipo. El número refleja intensidad de tinción (-) significa no determinado XIII. Administración de IL-23hipercina a ratones v expresión de genes Ratones C67B16/NT fueron tratados con IL-23 hipercina murina o solución salina, seguido por determinación de expresión de 167 genes por análisis de PVR en tiempo real de Taqman®. Cada ratón fue inyectado por vía intradérmica, en el dorso, ya sea con solución salina o con 10 microgramos de IL-23 hipercina. Muestras de tejido se tomaron y extrajeron ya sea a 1 ,3 ó 7 días después de la inyección, en donde las muestras de las tres fechas se guardaron en acervo, y después se usaron para análisis de Taqman®. Se muestra la relación de expresión de genes con y sin tratamiento con IL-23 hipercina (Table 4). IL-23 hipercina provocó un incremento en expresión de 2 veces, o mayor, para 15 de los 157 genes probados (cuadro 4). IL-6, CXCL-1 , IL-17 y GM-CSF, que se incrementó con el tratamiento con IL-23, con citocinas que muestran expresión incrementada o actividad en asma o alergias, COPD, artritis reumatoide, IBD y psoriasis (cuadro 4).
CUADRO 4 Relación de TExpresión de gen con IL-231/I?xpres?ón de gen con solución salina] XIV. IL-23 modula artritis inducida por colágeno (CÍA) Ratones knockout p19 (p19KO) se prepararon (Cua, et al. (2003) Nature 421 :744-748). Los ratones p19KO fueron deficientes en IL-23, una citocina heterodimérica que contiene una subunidad p19 y una subunidad p40, y se encontró que resisten artritis inducida por colágeno (CÍA), un modelo de ratón de artritis reumatoide (cuadro 5) (véase, v.gr., Holmdahl, et al. (2002) AgeingRes. Rev. 1 :136-147; Luross y Williams (2001) Immunology 103:407-416; Durie, et al. (1994) Clin. Immunol. Immunopathol. 73:11-18). Por el contrario, ratones knockout p3d, que eran deficientes en IL-12, una citocina heterodimérica que contenía una subunidad p3d y una subunidad p40, mostraron CÍA exacerbado, en comparación con controles de tipo silvestre (cuadro 5). Los ratones p35KO, p40KO y p19KO se prepararon a partir de la cepa C67BL/6 de ratón.
CUADRO 5 Artritis inducida por colágeno (CÍA) en ratones knockout p!9. p35 y p40 de tipo silvestre. NA significa no aplicable Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Las modalidades específicas que aquí se describen se ofrecen a manera de ejemplo únicamente y la invención estará limitada por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de equivalentes a los cuales califican dichas reivindicaciones; y la invención no debe limitarse por las modalidades específicas que se han presentado aquí a manera de ejemplo.

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- El uso de un agonista o antagonista de DCRSd (SEQ ID NOs: 1 ó 2) o de p19 (SEQ ID NOs: d ó 6), para preparar un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que experimenta un trastorno fisiológico, en donde el trastorno comprende: a) asma o alergia; b) trastorno pulmonar obstructiva crónica (COPD); o c) un trastorno pulmonar intersticial,
2.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el trastorno pulmonar intersticial es: a) fibrosis pulmonar idiopática; b) granuloma eosinofílico; o c) pneumonitis por hipersensibilidad.
3.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el antagonista comprende una composición de unión derivada del sitio de antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a: a) DCRSd (SEQ ID NO: 2); o b) p19 (SEQ ID NO: 6).
4.- El uso que se reclama en la reivindicación 3, en donde la composición de unión comprende: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal; c) un anticuerpo humanizado; o d) un fragmento Fab, Fv, o F(ab')2.
5.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el agonista comprende: a) DCRSd (SEQ ID NO: 2); o b) p19 (SEQ ID NO: 6).
6.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el agonista o antagonista comprende un ácido nucleico.
7.- El uso que se reclama en la reivindicación 6, en donde el antagonista comprende: a) un ácido nucleico de antisentido; o b) un ácido nucleico de interferencia de ARN.
8.- Un método de diagnóstico de un trastorno fisiológico que comprende un trastorno fisiológico que comprende poner en contacto una composición de unión que se une específicamente a DCRSd (SEQ ID NOs: 1 ó 2), o a p19 (SEQ ID NOs: d ó 6), a una muestra derivada de un sujeto de prueba que experimenta: a) asma o alergia; b) trastorno pulmonar obstructiva crónica (COPD); o c) un trastorno pulmonar intersticial.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende: a) poner en contacto la composición de unión a una muetsra derivada de un sujeto de control o una muestra de control y b) comparar la unión encontrada con el sujeto de prueba con la unión encontrada con el sujeto de control o muestra de control.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la composición de unión comprende: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal; c) un anticuerpo humanizado; o d) un fragmento Fab, Fv, o F(ab')2; e) un ácido nucleico; o f) un marcador detectable.
11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el ácido nucleico comprende: a) una sonda o iniciador; o b) una guía molecular.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la muestra se deriva a partir de una célula, tejido o fluido biológico humano.
13.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el trastorno pulmonar intersticial es: a) fibrosis pulmonar idiopática; b) granuloma eosinofílico; o c) pneumonitis por hipersensibilídad.
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