MXPA01002673A - Combinaciones antivirales de lamivudina y adefovir - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las combinaciones terapéuticas que comprenden la (2R, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)- pirimidin-2-ona (lamivudina) y un segundo agente terapéutico seleccionado de la (9-[(R)-2- (fosfonometoxi)etil]adenina, (PMEA o adefovir) y bis(pivaloiloximetil) (9-[(R)- 2- (fosfonometoxi)etil]adenina, (el profármaco oral de PMEA, adefovir ipivoxilo), las cuales tienen la actividad del virus anti-hepatitis B (VHB). La presente invención también estárelacionada con las composiciones farmacéuticas que contienen las combinaciones y su uso en el tratamiento de las infección provocada por el VHB que incluyen las infecciones con los mutantes de VHB que llevan una resistencia a los inhibidores de los nucleósidos y/o los no nucleósidos.

Description

COMBINACIONES ANTIVIRALES DE LAMIVUDINA Y ADEFOVIR Campo de la Invención La presente invención se refiere a combinaciones terapéuticas que comprenden la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-1, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona (lamivudina) y un segundo agente terapéutico seleccionado de la (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina, (PMEA o adefovir) y bis (pivaloiloximetil) (9- [ (R) -2- ( fosfonometoxi) etil] adenina, [el profármaco oral del PMEA, adefovir dipivoxilo] . La presente invención también está relacionada con las composiciones farmacéuticas que contienen dichas combinaciones y con su uso en el tratamiento de las infecciones provocadas por el VHB que incluyen las infecciones con los mutantes de VHB que llevan una resistencia a los inhibidores del nucleósido y/o del no nucleósido, de la replicación del virus de la hepatitis B. La hepatitis B es una enfermedad viral transmitida oral o parenteralmente por el material contaminado tal como la sangre o los productos de la sangre, agujas contaminadas, por contacto sexual, y vertical o directamente de las madres infectadas o Ref.127939 portadoras con respecto a su descendencia. En aquellas áreas del mundo en donde la enfermedad es común, la transmisión vertical en una edad temprana conduce a una proporción elevada de individuos infectados que llegan a ser portadores crónicos de la hepatitis B. Un estimado de 350 millones de personas en todo el mundo están infectadas con la hepatitis B y tantas como 150 millones de personas pueden morir de una enfermedad del higado en la ausencia de una intervención. Actualmente, el único enfoque establecido para el tratamiento de la hepatitis B son las inyecciones repetidas de interferona, lo cual puede estar asociado con efectos laterales desagradables, y produce una respuesta de largo plazo solamente en una tercera parte o menos de aquellas personas tratadas. La interferona es un modulador inmune diseñado para estimular o reforzar la capacidad de pelea contra la enfermedad, del sistema inmune. La lamivudina se ha reportado que va a ser efectiva contra el VHB en un estudio de dos años, que muestra que la mayoría de los pacientes mostraron niveles substancialmente reducidos de la replicación viral con 52% que mantienen niveles indetectables del virus hasta el final del segundo año. El adefovir se ha reportado que posee actividad anti-VHB in vitro, y el profármaco oral del adefovir, el adefovir dipivoxilo, se ha mostrado que va a ser activo contra la replicación del VHB in vivo y está actualmente en loe estudios clínicos de la fase II con los pacientes quienes tienen la infección viral de la hepatitis B crónica. Existe un reporte de que hay una falta de resistencia cruzada al PMEA para la polimerasa del ADN de la hepatitis B humana la cual expresa los codones de lamivudina, X. Xiong y colaboradores (Hepatology Vol. 26, No. 4, Pt. 2, 1997, Abstract No. 1211). El uso de las combinaciones de la invención puede ocasionar un efecto antiviral equivalente con una toxicidad reducida, o un incremento en la eficacia del fármaco a causa de que ocurre la sinergia entre los compuestos. Las dosis del fármaco totales, inferiores, también reducirán posiblemente la frecuencia de presentación de las variantes resistentes a los fármacos del VHB. Ahora se ha encontrado que la lamivudina exhibe ventajas inesperadas cuando se utiliza en combinación con el adefovir. En particular las combinaciones muestran un efecto anti-VHB sinergistico estadísticamente significativo. Los resultados iniciales han mostrado que la combinación de lamivudina y adefovir dipivoxilo también exhibe un efecto anti-VHB sinergistico. Es una característica de esta invención que el uso de estas combinaciones de los fármacos proporcionará efectos antivirales sinergisticos, una supresión viral más completa, periodos más prolongados sobre la supresión viral, limitará la salida de los mutantes de VHB resistentes a los fármacos y permitirá un mejor manejo de las toxicidades relacionadas con el fármaco. El uso de estas combinaciones de fármacos también puede conducir a una reducción del número de, por ejemplo, las tabletas administradas en un dia, por lo tanto se puede aumentar el confort del paciente. Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, las referencias aqui al tratamiento se extienden a la profilaxis asi como al tratamiento de las infecciones y los síntomas establecidos. Las sales aceptables farmacéuticamente de la lamivudina, el adefovir, o el adefovir dipivoxilo incluyen aquellas derivadas de los ácidos orgánicos o inorgánicos aceptables farmacéuticamente. Los ejemplos de los ácidos adecuados incluyen los ácidos clorhídrico, bramhidrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maléico, fosfórico, glicólico, láctico, salicilico, succinico, toluen-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metansulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftalen-2-sulfónico y bencensulfónico. Otros ácidos tales como el ácido oxálico, aunque no aceptables por si mismos farmacéuticamente, pueden ser útiles en la preparación de sales útiles como compuestos intermedios en la obtención de los compuestos de la invención y sus sales de adición acida aceptables farmacéuticamente . Las sales derivadas de las bases apropiadas incluyen las sales de un metal alcalino (por ejemplo el sodio) , un metal alcalinotérreo (por ejemplo el magnesio) , el amonio y el NR+ (en donde R es alquilo con C?_4) . Los esteres preferidos de lamivudina, adefovir o adefovir dipivoxilo son seleccionados independiente del siguiente grupo: (1) los esteres del ácido carboxilico en los cuales la porción diferente del carbonilo de la parte del ácido carboxilico de la agrupación del éster se selecciona de alquilo de cadena recta o ramificada (por ejemplo, metilo, n-propilo, t-butilo, o n-butilo) , cicloalquilo, alcoxialquilo (por ejemplo, metoximetilo) , aralquilo (por ejemplo, bencilo) , ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo) , arilo (por ejemplo, fenilo substituido opcionalmente por ejemplo, por halógeno, alquilo con C?_4, o alcoxi con C?_4), o amino; (2) esteres de sulfonato, tales como alquil- o aralquilsulfonilo (por ejemplo, metansulfonilo); (3) esteres de aminoácidos (por ejemplo, L-valilo o L-isoleucilo) ; y (4) esteres de fosfonato. En tales esteres, a menos que se especifique de otra manera, cualquier porción de alquilo presente contiene ventajosamente desde 1 hasta 18 átomos de carbono, particularmente desde 1 hasta 6 átomos de carbono, más partipularmente desde 1 hasta 4 átomos de carbono. Cualquier porción de cicloalquilo presente en tales esteres contiene ventajosamente desde 3 hasta 6 átomos de carbono. Cualquier porción de arilo presente en tales esteres ventajosamente comprende un grupo fenoxi. Cualquier referencia a cualquiera de los compuestos anteriores también incluye una referencia a una sal aceptable fisiológicamente de los mismos. Los esteres preferidos particularmente son los esteres de mono, di, y trifosfato de lamivudina (los cuales pueden estar bloqueados opcionalmente), o cualquier otro compuesto el cual durante la administración a un sujeto humano sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) dicho éster de mono, di, o trifosfato. Por consiguiente de acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una combinación que comprende la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y un segundo agente terapéutico seleccionado de la (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y bis (pivaloiloximetil) (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente.

Preferentemente el segundo agente terapéutico es la bis (pivaloiloximetil) (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] -adenina o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma. Las combinaciones como se describieron anteriormente pueden ser referidas aqui posteriormente como las combinaciones de acuerdo con la invención. Cuando se utilice aqui "derivado aceptable farmacéuticamente" incluye cualquier sal, éster o sal de tal éster, aceptable farmacéuticamente, de la lamivudina, el adefovir o el adefovir dipivoxilo o cualquier otro compuesto el cual, durante la administración al receptor, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) tal compuesto o un metabolito o residuo del mismo activo antiviralmente. La presente invención proporciona además combinaciones de acuerdo con la invención para su uso en terapia, particularmente en el tratamiento de una infección de VHB que incluye las infecciones resistentes a los inhibidores de los nucleósidos y los no nucleósidos de la replicación del virus de la hepatitis B. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un mamífero, incluyendo un ser humano, que padece de una infección de VHB, que comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una combinación de acuerdo con la invención. Se apreciará que los compuestos de la combinación pueden ser administrados simultáneamente, ya sea en la misma composición farmacéutica o en una diferente, o secuencialmente. Si existe una administración secuencial, el retardo en la administración del segundo ingrediente activo no debe ser tal que se pierda el beneficio de un efecto terapéutico sinergistico de la combinación de los ingredientes activos. También se debe sobreentender que la lamivudina, el adefovir dipivoxilo, o los derivados de los mismos aceptables farmacéuticamente o el adefovir o los derivados del mismo aceptables farmacéuticamente, ya sea presentados simultánea o secuencialmente, pueden ser administrados individualmente o en cualquier combinación de los mismos. La lamivudina, y el adefovir dipivoxilo o el adefovir son administrados preferentemente de manera simultánea o consecutiva en formulaciones farmacéuticas separadas, más preferentemente de manera consecutiva. Preferentemente la combinación de acuerdo con la invención es administrada como una formulación combinada única. La presente invención también provee el uso de la lamivudina en la fabricación de un medicamento para la administración simultánea o consecutivamente con el adefovir o el adefovir dipivoxilo para el tratamiento de las infecciones del VHB. Se apreciará que la lamivudina, el adefovir dipivoxilo, o el adefovir o cualquier combinación de los mismos (excluyendo el adefovir o el adefovir dipivoxilo) , pueden ser utilizados en la fabricación del medicamento anterior. Un aspecto adicional de la invención es una combinación de acuerdo con la invención en donde la lamivudina y el adefovir dipivoxilo o el adefovir están presentes en una relación sinergistica. Los efectos sinergisticos de la combinación de lamivudina y el adefovir dipivoxilo o el adefovir y los derivados aceptables farmacéuticamente de los mismos son observados sobre una relación, por ejemplo, de 40:1 hasta 1:1 (en peso), preferentemente 25:1 hasta 15:1 (en peso). Cada compuesto convenientemente será empleado en la combinación en una cantidad en la cual el mismo exhibe la actividad anti-VHB cuando se utilice solo. La cantidad de una combinación de lamivudina, adefovir o adefovir dipivoxilo que se requiere que sea efectiva como un agente anti-VHB variará por supuesto, y por último queda a discreción del practicante médico. Los factores que van a ser considerados incluyen la ruta de administración y la naturaleza de la formulación, el peso del cuerpo del animal, la edad y la condición general y la naturaleza y la severidad de la enfermedad que va a ser tratada. En general para la lamivudina una dosis diaria adecuada estará en el intervalo desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por dia, preferentemente en el intervalo de 0.5 hasta 20 mg por kilogramo de peso corporal por dia, más preferentemente en el intervalo de 0.5 a 2 mg por kilogramo de peso corporal por dia. El compuesto es administrado convenientemente a un nivel de aproximadamente 100 mg por dia. Para el adefovir dipivoxilo una dosis diaria adecuada estará en el intervalo desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por dia, preferentemente en el intervalo de 0.01 hasta 1 mg por kilogramo de peso corporal por dia, más preferentemente en el intervalo de 0.01 hasta 0.05 mg por kilogramo de peso corporal por dia. Convenientemente, el adefovir dipivoxilo es administrado a un nivel de aproximadamente 10 mg por dia. Para el adefovir, una dosis diaria adecuada estará en el intervalo desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por dia, preferentemente en el intervalo de 0.01 hasta 1 mg por kilogramo de peso corporal por dia, más preferentemente en el intervalo de 0.01 hasta 0.05 mg por kilogramo de peso corporal por dia. Convenientemente, el adefovir es administrado a un nivel de aproximadamente 10 mg por dia. A menos que se indique de otra manera, todos los pesos de los ingredientes activos son calculados en términos del fármaco per se. En el caso de los derivados aceptables farmacéuticamente de la lamivudina, el adefovir dipivoxilo o el adefovir, o un solvato de cualquiera de los mismos, las Figuras podrían ser incrementadas proporcionalmente. La dosis deseada es presentada preferentemente como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas a intervalos apropiados en todo el dia. Estas subdosis pueden ser administradas en las formas de dosificación unitaria, por ejemplo, conteniendo desde 1 hasta 1500 mg, preferentemente desde 5 hasta 1000 mg, más preferentemente desde 5 hasta 500 mg del ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Alternativamente, si la condición del receptor asi lo requiere, la dosis puede ser administrada como una infusión continua. Los componentes de la combinación los cuales pueden ser referidos como los ingredientes activos pueden ser administrados para la terapia a un animal, por ejemplo un mamífero incluyendo un ser humano, de una manera convencional .

Aunque es posible para los ingredientes activos de la combinación que sean administrados como las substancias químicas de partida o materias primas, es preferible presentarlas como una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden una combinación de acuerdo con la invención en asociación con uno o más portadores o excipientes aceptables farmacéuticamente y opcionalmente otros agentes terapéuticos. El (los) portador (es) debe(n) ser aceptable (s) en el sentido de que son compatibles con los otros ingredientes de la fórmula y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Cuando los componentes individuales de la combinación son administrados separadamente, los mismos son presentados cada uno generalmente como una composición farmacéutica. Las referencias aqui posteriormente a las composiciones, se refieren a menos que se indique de otra manera a las composiciones que contienen ya sea la combinación o un componente de la misma. Una combinación de la lamivudina y el adefovir dipivoxilo o adefovir o los derivados de los mismos aceptables farmacéuticamente, puede ser presentada convenientemente como una composición farmacéutica con uno o más portadores de la misma aceptables farmacéuticamente en una forma de dosificación unitaria. Una formulación de dosificación unitaria conveniente contiene los ingredientes activos en cantidades desde 1 mg hasta 2 g cada uno, por ejemplo, 2 mg hasta 200 mg tales como 25 a 150 mg de lamivudina y 5 a 60 mg del adefovir o el adefovir dipivoxilo. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser prescritas al paciente en "empaques o paquetes para el paciente" que contienen el curso completo de tratamiento en un empaque sencillo, usualmente un paquete o empaque de ampollas. Los paquetes para el paciente tienen una ventaja sobre las prescripciones tradicionales, en donde los farmaceutas dividen un suministro de pacientes de un farmacéutico de un suministro volumétrico, en que el paciente siempre tiene acceso al inserto del paquete o empaque contenido en el paquete o empaque del paciente, normalmente omitiendo las prescripciones tradicionales. La inclusión de un inserto del paquete o empaque se ha mostrado que mejora el confort del paciente con las instrucciones de los médicos. Se sobreentenderá que la administración de la combinación de la invención por medio de un paquete o empaque para el paciente único, o los paquetes de pacientes de cada composición, dentro de un inserto del paquete que enfoca al paciente al uso correcto de la invención, es una característica adicional deseable de esta invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un paquete o empaque para el paciente que comprende al menos un ingrediente activo de la combinación de acuerdo con la invención y un inserto de la información que contiene las instrucciones sobre el uso de la combinación de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un paquete o empaque doble que comprende en asociación para la administración separada, la lamivudina y el adefovir dipivoxilo o el adefovir o los derivados de los mismos aceptables farmacéuticamente. Las composiciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) . Las composiciones pueden ser presentadas convenientemente en la forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas por cualquier método bien conocido en el arte de la farmacia. Tales métodos representan una característica adicional de la presente invención e incluyen el paso de llevar en asociación los ingredientes activos con el portador el cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son preparadas llevando de manera uniforme e intima y en asociación, los ingredientes activos con los portadores líquidos o los portadores sólidos divididos finamente o ambos, y luego si es necesario conformar el producto. "Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden ser presentadas como unidades discretas tales como cápsulas, saquitos o tabletas conteniendo cada una cantidad predeterminada de los ingredientes activos; como un polvo o granulos; como una solución o una suspensión en un liquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión liquida de aceite en agua o una emulsión liquida de agua en aceite. El ingrediente activo también puede ser presentado como un bolo, electuario o pasta. Una tableta se puede hacer por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas comprimiendo en una máquina adecuada los ingredientes activos en una forma que fluye libremente tal como un polvo o granulos, mezclada opcionalmente con un aglutinante (por ejemplo povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulosa), lubricante, diluyente inerte, preservativo, un desintegrante (por ejemplo glicolato de fécula y sodio, povidona reticulada, carboximetil celulosa de sodio reticulada) activo superficialmente, o un agente de dispersión. Las tabletas moldeadas se pueden hacer moldeando una mezcla del compuesto pulverizado humedecida con un diluyente liquido inerte en una máquina adecuada. Las tabletas pueden ser recubiertas o ranuradas opcionalmente y pueden ser formuladas para proporcionar una liberación lenta o controlada de los ingredientes activos en las mismas utilizando, por ejemplo, la hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variables para proveer el perfil de liberación deseado. Las tabletas pueden ser provistas opcionalmente con un recubrimiento entérico, para proporcionar la liberación en las partes de los intestinos a diferencia de en el estómago. Preferentemente, las combinaciones de acuerdo con la invención son administradas oralmente. Las composiciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen las pastillas que comprenden los ingredientes activos en una base condimentada, usualmente con sucrosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o la sucrosa y la acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador liquido adecuado. Las composiciones para la administración rectal pueden ser presentadas como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, la manteca de cacao o un salicilato. La administración tópica también puede ser por medio de un dispositivo iontoforético transdérmico.

Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden ser presentadas como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones para rociado que contienen además del ingrediente activo los portadores tales como los que son conocidos en la técnica, que van a ser apropiados. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal en donde el portador es un sólido, son presentadas como supositorios de dosis unitaria. Los portadores adecuados incluyen la manteca de cacao y otros materiales utilizados comúnmente en la técnica. Los supositorios pueden ser formados convenientemente por la mezcla de la combinación activa con el (los) portador(es) ablandados o fundidos seguido por enfriamiento y conformación en moldes. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril, isotónicas, acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antióxidantes, amortiguadores, bacteriostatos y solutos los cuales hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes; y liposomas u otros sistemas de microparticulas los cuales están diseñados para ubicar como blanco el compuesto con respecto a los componentes de la sangre o uno o más órganos . Las formulaciones pueden ser presentadas en recipientes sellados de una sola dosis o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y ampolletas, y pueden ser almacenados en una condición deshidratada por aspersión (liofilizada) que requiere solamente la adición del portador liquido estéril, por ejemplo el agua para inyección, inmediatamente previo a su uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea pueden ser preparadas a partir de polvos estériles, granulos y tabletas de la clave descrita previamente . Las formulaciones de dosificación unitaria preferida son aquellas que contienen una dosis diaria o subdosis diarias de los ingredientes activos, como se indicó aqui anteriormente, o una fracción apropiada de los mismos. Se debe sobreentender que además de los ingredientes mencionados particularmente arriba, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica con referencia al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados para la administración oral pueden incluir agentes adicionales tales como agentes endulzantes, espesadores y saborizantes.

Los compuestos de la combinación de la presente invención pueden ser obtenidos de una manera convencional. Los métodos para la preparación de lamivudina se describen en las Solicitudes de Patentes Internacionales Números W091/17159, y WO 95/29174 incorporadas aqui para referencia. Los métodos para la preparación del adefovir se describen en la Patente Europea No. 206459, incorporada aqui para referencia. Los métodos para la preparación del adefovir dipivoxilo se describen en la patente Europea No. 481214 incorporada aqui para referencia. Los siguientes ejemplos están propuestos solamente para ilustración y no están propuestos para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. "Ingrediente activo" denota la lamivudina, el adefovir dipivoxilo o el adefovir o varios de los mismos o un derivado funcional fisiológicamente o cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente.

Ejemplo 1: Formulación de Tableta Las siguientes formulaciones A, B y C son preparadas por la granulación en fase húmeda de los ingredientes con una solución de povidona, seguido por la adición de estearato de magnesio y compresión.

Formulación A mg/tableta Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 Lactosa B.P. 105 Povidona B.P. 7 Glicolato de Fécula y Sodio 10 Estearato de Magnesio 3 255 Formulación B mg/tableta Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 Lactosa B.P. 75 Avicel PH 101 30 Povidona B.P. 7 Glicolato de Fécula y Sodio 10 Estearato de Magnesio 3 255 Formulación C mg/tableta Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 5 Lactosa B.P. 100 Fécula 25 Povidona B.P. 2 Estearato de Magnesio 2 234 Las siguientes formulaciones, D y E, son preparadas por la compresión directa de los ingredientes mezclados. La lactosa en la formulación E es del tipo de compresión directa (Dairy Crest - "Zeparox") .

Formulación D mg/tableta Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 Fécula Pregelatinizada NF15 75 Formulación E mg/tableta Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 5 Lactosa B.P. 70 Avicel 50 225 Formulación F (Formulación de Liberación Controlada) La formulación es preparada por la granulación en fase húmeda de los ingredientes con una solución de povidona seguido por la adición de estearato de magnesio y compresión. mg/tableta Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 Hidroxipropilmetilcelulosa 28 (Methocel K4M Premium) Lactosa B.P. 13 Povidona B.P. 7 Estearato de Magnesio 2 180 La liberación del fármaco se llevó a cabo durante un periodo de aproximadamente 6-8 horas y se complementa después de 12 horas.

Ejemplo 2: Formulaciones de la Cápsula Formulación A Una formulación de cápsula es preparada mezclando los ingredientes de la Formulación D en el Ejemplo 1 anterior y llenándola en una cápsula de gelatina dura de dos partes. La Formulación B (infra) es preparada de una manera similar.

Formulación B mg/cápsula Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 5 Lactosa B.P. 70 Glicolato de Fécula y Sodio 10 Estearato de Magnesio 1 186 Formulación C mg/cápsula Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 Macrogel 4000 B.P. 170 300 Las cápsulas de la formulación C son preparadas fundiendo el Macrogel 4000 B.P., dispersando el ingrediente activo en el material fundido y llenando el material fundido en una cápsula de gelatina dura de dos partes.

Formulación D mg/cápsula Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 5 Lecitina 50 Aceite de Cacahuete 50 205 Las cápsulas de la formulación D son preparadas dispersando el ingrediente activo en la lecitina y el aceite de cacahuete y llenando la dispersión en cápsulas de gelatina blanda, elásticas.

Formulación E (Cápsula de Liberación Controlada) La siguiente formulación de cápsula de liberación controlada es preparada extruyendo los ingredientes a, b, y c utilizando un extrusor, seguido por la conversión en esferas del material extruido y secado. Las microesferas secadas son recubiertas entonces con la membrana (d) para el control de la liberación y se rellenan en una cápsula de gelatina dura, de dos piezas. mg/cápsula (a) Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 (b) Celulosa Microcristalina 60 (c) Lactosa B.P. 60 (d) Etil Celulosa 6 256 Ejemplo 3: Formulación Inyectable Formulación A mg Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 5 Solución de Acido Clorhídrico 0.1 M o Solución de Hidróxido de Sodio 0.1 M c.s. hasta pH 4.0 a 7.0 Agua estéril c.s. hasta 10 ml El ingrediente activo es disuelto en la mayoría del agua (35°-40°C) y el pH se ajusta a entre 4.0 y 7.0 con el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio cuando sea apropiado. El lote se compone entonces hasta el volumen indicado con el agua y se filtra a través de un filtro micropore estéril en una ampolleta de vidrio de color ámbar de 10 ml estéril (tipo 1) y se sella con cierres estériles y se sobresella.

Formulación B Ingrediente Activo A 125 mg Solución Amortiguadora de Fosfato, Estéril, Libre de pirógenos, de pH 7, c.s. hasta 25 ml Ejemplo 4: Inyección intramuscular Ingrediente Activo A 100 mg Ingrediente Activo B 30 mg Alcohol Bencílico 0.067 g Glicofurol 75 0.94 g Agua para inyección, c.s. hasta 3.00 ml El ingrediente activo es disuelto en glicofurol. El alcohol bencílico es agregado y disuelto entonces, y se agrega agua hasta 3 ml. La mezcla se filtra entonces a través de un filtro micropore estéril y se sella en ampolletas de vidrio de color ámbar de 3 ml estériles (tipo 1) .

Ejemplo 5 : Jarabe Ingrediente Activo A 100 mg Ingrediente Activo B 5 mg Solución de Sorbitol 0.6 g Glicerol 0.85 g Benzoato de Sodio 0.0025 g Sabor, Durazno 17.42.3169 0.0125 ml Agua Purificada c.s. hasta 5.00 ml El ingrediente activo es disuelto en una mezcla del glicerol y la mayoría del agua purificada. Una solución acuosa del benzoato de sodio es agregada entonces a la solución, seguido por la adición de la solución de sorbitol y finalmente el sabor. El volumen es compuesto con el agua purificada y se mezcla bien.

Ejemplo 6: Supositorio mg/cápsula supositorio Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 30 Grasa Dura, B.P. 1770 1900 Una quinta parte del Witepsol H15 es fundida en una cacerola o recipiente con una chaqueta de vapor a 45 °C máximo. El ingrediente activo es tamizado a través de un tamiz de 200 µM y se agrega a la base del material fundido con mezclado, utilizando un Silverson equipado con una cabeza cortante, hasta que se logra una dispersión suave. Manteniendo la mezcla a 45 °C, el Witepsol H15 restante es agregado a la suspensión y se agita para asegurar una mezcla homogénea. La suspensión completa se hace pasar a través de una malla de acero inoxidable de 250 µm y, con agitación continua, se permite que se enfrie a 40 °C. A una temperatura de 38 °C a 40 °C, 2.02 g de la mezcla se rellenan en moldes de plástico de 2 ml, adecuados. A los supositorios se les permite enfriarse a temperatura ambiente.

Ejemplo 7. Pesarios mg/pesario Ingrediente Activo A 100 Ingrediente Activo B 5 Dextrosa Anhidra 160 Fécula de Papa 150 Estearato de Magnesio 3 418 Los ingredientes anteriores son mezclados directamente y los pesarios son preparados por compresión directa de la mezcla resultante.

Datos Biológicos Ejemplo 8.

La linea celular del hepatoblastoma humano (Hep- G2-2.2-2.15) la cual produce constitutivamente el VHB infeccioso se sembró en placas de microtitulación de 96 cavidades a una densidad de 5 x 103 células por cavidad. Estas células fueron tratadas con una combinación de lamivudina y PMEA sobre placas triplicadas. El medio de cultivo que contiene los fármacos se rellenó un dia tras otro durante 9 dias, tiempo en el cual los sobrenadantes fueron colectados y analizados para verificar el contenido de VHB. La combinación de lamivudina/PMEA se probó dos veces por triplicado de un modo matricial. El experimento 1 utilizó un intervalo o rango de lamivudina de 100 nM hasta 0.14 nM (diluciones 3 veces en columnas), y PMEA, 9-[(R)-2- (fosfonometoxi) etil] adenina (adefovir), a concentraciones de 1 µM hasta 10 nM (diluciones 3.16 veces en hileras). El experimento 2 se efectuó con las diluciones de Lamivudina que varian desde 100 nM hasta 0.045 nM (en diluciones de 3 veces en columnas) , y un rango o intervalo de PMEA de 5 µM hasta 0.16 nM (diluciones de 3.16 veces en hileras). Ambos fármacos fueron diluidos en una placa de microtitulación de 96 cavidades separada, y subsiguientemente es transferida sobre las placas que contienen las monocapas celulares. Las células se hicieron crecer en 150 µl de RPMI 1640 suplementado con 2 mM de L-Glutamina y 10 % de suero de bovino fetal. Previo a la transferencia del fármaco, 120 µl del medio fueron removidos de las células, dejando 30 µl sobre las monocapas para prevenir el secado. 90 µl del medio fresco sin el fármaco son agregados, seguido por la adición de 30 µl de las diluciones 5X del fármaco. La lamivudina y el PMEA fueron probados cada uno sobre sus placas respectivas individualmente a las mismas concentraciones. Los datos fueron normalizados a los valores obtenidos con las células tratadas sin fármacos, y se expresaron como un porcentaje de control para el análisis. El método utilizado para la detección del VHB ha sido descrito previamente (Jansen RW, Johnson LC, Averett, DR. High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay. Antimicrob Agents Chem 1993; 37 (3) : 441-447) . Brevemente, la detección del VHB fue efectuada por la "captura" del virus a partir de los sobrenadantes sobre las placas recubiertas con Anti-BHsAg, lavado, desnaturalización para liberar el ADN del VHB, llevar a cabo la PCR con los cebadores biotinilados, la captura con estreptavidina de los productos de PCR biotinilados con la hibridización de la sonda concomitante, adición del substrato, y lectura de las densidades ópticas de la reacción colorimétrica. Las diluciones de un sobrenadante que contiene VHB estandarizado fueron incluidas en cada placa, y las concentraciones del ADN del VHB de las cavidades de prueba fueron calculadas a partir de esta curva estándar de VHB. El intervalo útil de la detección es de al menos 0.045 a 45 fg del ADN del VHB, en donde 30 copias del genoma pueden ser detectados confiablemente. Las muestras fueron probadas en conjunción con los controles tanto positivo (0.448 fg/ul del ADN del plásmido) como negativo (medio RPMI suplementado con 2 mM de L-Glutamina y 10% de suero de bovino fetal) . El IC50 promedio y el error estándar de los IC50s para las placas por triplicado fueron calculados utilizando la regresión no lineal de SAS para ajustar los datos a la ecuación de Hill para cada curva de respuesta de la concentración. Cuando solamente una determinación única de un IC50 para una combinación de la dosis particular se pudo hacer, el promedio de los errores estándares de las concentraciones adyacentes se utilizó para estimar el error estándar. Las concentraciones inhibidoras fraccionarias (FIC50) fueron calculadas para cada combinación y graficadas utilizando la representación del isobolograma (Berenbaum, M.C. (1985) The Expected Effect of a Combination of Agents: the General Solution. J. Theor. Biol. 114, 413-431) . Para evaluar la significancia estadística de la sinergia o el antagonismo, se utilizó una prueba t sin pareja para comparar cada suma de los valores de FIC50 por parejas con el valor teórico de 1. Los valores de P menores que 0.05 fueron considerados significativos estadísticamente. La comparación de los valores P entre los experimentos debe ser interpretada con mucho cuidado, porque los experimentos utilizaron diferentes intervalos de concentración de la prueba (o los intervalos que se pueden utilizar por el método del isobolograma) . En algunos casos, no todas las concentraciones probadas pudieron soportar el cálculo de un IC50, puesto que la respuesta fue inhibida a una extensión más grande que el 50 por ciento del control para todas las dosis. La Figura 1 muestra un solo isobolograma, producido combinando los datos de ambos experimentos, que muestran un sinergismo estadísticamente significativo.

Ejemplo 9 El IC50 para el PMEA fue determinado contra el tipo silvestre (WT) y el VHB resistente a la lamivudina expresado temporalmente en un sistema de cultivo celular como se describe posteriormente. Las células de HepG2 fueron transfectadas temporalmente con el plásmido que contiene el genoma de VHB que tiene la secuencia del tipo silvestre o que contuvo las siguientes mutaciones resistentes a la lamivudina en el gen de la transcriptasa inversa: M552I, M552V, L528M, L528MM552V. Se determinó previamente que solo las mutaciones de M5521 y L528MM552V fueron observadas en los pacientes infectados con el VHB que desarrollaron una resistencia a la terapia de lamivudina aunque las mutaciones de M552V y L528M individuales contribuyeron parcialmente a la pérdida en la sensibilidad de la lamivudina contra la replicación del VHB in vitro (Alien MI, Deslauriers M, Andrews CW, Tipples GA, Walters KA, Tyrrell DLJ, Brown N for the Lamivudine Clinical Investigation Group, y Condreay LD. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine, HEPATOLOGY 1998; 27:1670-1677). Las células de HepG2 fueron sembradas en placas Costar de 96 cavidades a 6300 células por cavidad en 150 µl del medio de HepG2 (Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), que contiene 10% de suero de bovino fetal) y fueron incubadas toda la noche a 37 °C. Para cada cavidad transfectada, 75 ng del ADN del plásmido y 0.5 µl de la lipofectamina (Gibco) fueron incubados conjuntamente durante 30 minutos a temperatura ambiente en 12.5 µl de OptiMem (Gibco) previo a la adición de la mezcla de ADN/lipofectamina a las células. Cada cavidad fue enjuagada con 150 µl del DMEM no suplementado. La mezcla de ADN/lipofectamina fue agregada a cada cavidad en un volumen total de 150 µl del medio OptiMem. Las células fueron incubadas con la solución de ADN/lipofectamina durante 5 horas a 37 °C. Después de la incubación, 150 µl de DMEM que contiene 20% de suero fueron agregados a cada cavidad y las placas fueron incubadas toda la noche a 37 °C. El medio fue reemplazado con 150 µl del medio de HepG2 solamente o el medio que contiene el PMEA. Las células 2.2.15 fueron sembradas en placas Costar de 96 cavidades a 2250 células por cavidad en 150 µl del medio completo (medio de RPMI que contiene 10% de suero de bovino fetal) y fueron incubadas toda la noche a 37 °C. El medio se reemplazó con 150 µl del medio completp solamente o el medio que contiene la concentración deseada del PMEA. Las células transfectadas, asi como las células productoras de VHB estables 2.2.15, fueron tratadas con el medio libre del fármaco, de control, o el medio que contiene el PMEA cada uno de los otros dias (dias 1, 3, y 5) . Las concentraciones finales del PMEA para el tratamiento de la célula fueron utilizadas a 25, 5, 1, 0.2, 0.04 µM (para los cultivos transfectados con el plásmido de WT y las células 2.2.15 de control) o 125, 25, 5, 1, 0.2 µM (para todos los cultivos transfectados con el plásmido mutante) . Los niveles del ADN del VHB fueron cuantificados del medio colectado de las células el dia 7 utilizando los métodos descritos en Jansen RW, Johnson LC, Averett, DR. High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay. Antimicrob Agents Chem 1993; 37 (3) : 441-447. Los detalles adicionales se dan en el Ejemplo 8. La citotoxicidad debida al tratamiento de los fármacos se determinó utilizando la Bisbencimida para el teñido del ADN (H33342 3HC1 4H20; Calbiochem Company, La Jolla CA) . Después que el medio fue colectado, las células fueron fijadas con 70% de etanol durante 30 minutos. Las células fueron enjuagadas una vez con el medio libre del suero y se incubaron con la Bisbencimida para el teñido del ADN (H33342 3HC1 4H20; Calbiochem Company, La Jolla CA) a 33 µg/ml durante 1 hora a 37 °C en el medio libre del suero. Los valores fluorescentes por cavidad fueron determinados con el lector de la placa fluorescente Millipore Cytofluor 2350 (excitación, 355 nm; emisión, 460 nm; unidades arbitrarias) . Los valores de CC50 de cada compuesto (concentración del compuesto que es citotóxico para el 50% de las células) fueron determinados de la toxicidad porcentual de cada concentración del compuesto comparado con las células no tratadas (sin fármaco) utilizando el método descrito posteriormente. Las curvas de la respuesta de la concentración generadas de cada construcción en el experimento de transfección temporal se ajustaron a la ecuación de Hill (y = Vmax * (1- (xAn/(k?n + x?n) ) ) utilizando la regresión no lineal para estimar la IC50 (concentración del fármaco la cual inhibió la producción del ADN de VHB en 50%, comparado con los cultivos libres del fármaco, paralelos) y el CC50 de PMEA. El IC50 calculado para cada construcción es mostrado con los limites de confianza del 95% para las medias geométricas para n replicados. El programa JMP (SAS, Cary NC) fue utilizado para efectuar la evaluación de la prueba t de student de los datos para determinar estadísticamente las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. El IC50 del PMEA obtenido contra WT VHB producido por las células 2.2.15 (0.43 uM) también fue comparable con el valor de IC50 (0.7 uM) utilizando la misma linea celular (Heijtink RA, De Wilde GA, Kruining J, Berk L, Balzarini J, De Clercq E, Holy A, Schalam SW. Inhibitory Effect of 9-(phosphonylmethoxiethyl) -adenine (PMEA) on Human and Duck Hepatitis B Virus Infection. Antiviral Research 1993; 21 (2): 141-153).

Tabla 1. Comparación de los IC50s de PMEA entre WT VHB y VHB que contiene las mutaciones asociadas resistentes a la lamivudina in vitro.

* IC50S estadísticamente diferentes del compuesto entre el VHB del mutante y el WT VHB, p < 0.05. + IC50S son estadísticamente diferentes entre si, p < 0.05. Para las células HepG2, el IC50 citotóxico para PMPA fue mayor que 125 uM, el IC50 citotóxico para el PMEA se hizo variar entre 25 a 40 uM.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación, caracterizada porque comprende la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -?irimidin-2-ona o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y un segundo agente terapéutico, la bis (pivaloiloxi etil) (9- [ (R) -2-(fosfonometoxi) etil] denina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente en donde la (2R, cis) -4-amino-l-(2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona . y el segundo agente terapéutico están presentes en el intervalo de 40:1 hasta 1:1 en peso.

2. Una combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la relación está en el intervalo de 25:1 hasta 15:1 en peso de los ingredientes activos .

3. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en medicina.

4. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en asociación con uno o más portadores aceptables farmacéuticamente para la misma .

5. Una formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento del VHB, caracterizada porque comprende la (2R, cis) -4-amino-1- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y un segundo agente terapéutico seleccionado de la (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente, y la bis (pivaloiloxi etil) (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente, en donde la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona y el segundo agente terapéutico están presentes en el intervalo de 40:1 hasta 1:1 en peso.

6. Una formulación de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque está en la forma de una dosificación unitaria.

7. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizada porque es adecuada para la administración oral.

8. Una formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende entre 25 y 150 mg de lamivudina y 5 a 60 mg de adefovir dipivoxilo.

9. Una formulación de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende 100 mg de lamivudina y 10 mg de adefovir dipivoxilo.

10. Un método para el tratamiento de un mamífero, incluyendo un ser humano, con una infección provocada por el VHB, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una combinación que comprende la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-1, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y un segundo agente terapéutico seleccionado de la (9-[(R)-2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente, y la bis (pivaloiloximetil) (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente.

11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la combinación es co o se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, caracterizado porque la combinación es administrada simultáneamente.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, caracterizado porque la combinación es administrada consecutivamente.

14. Un método de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, caracterizado porque la combinación es administrada como una formulación combinada única.

15. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento de la infección provocada por el VHB resistente a los inhibidores de los nucleósidos y/o los no nucleósidos de la replicación del virus de la hepatitis B.

16. El uso de la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-1, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona en la fabricación de un medicamento para la administración ya sea simultánea o secuencialmente con la bis (pivaloiloximetil) (9- [2- (fosfonometoxi) etil] adenina, para el tratamiento de una infección provocada por el VHB.

17. El uso de la bis (pivaloiloximetil) (9- [2-( fosfonometoxi) etil] adenina en la fabricación de un medicamento para la administración ya sea simultánea o secuencialmente con la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-1, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona para el tratamiento de una infección provocada por el VHB.

18. El uso de una combinación que comprende la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y un segundo agente terapéutico de bis (pivaloiloximetil) (9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente para el tratamiento de una infección provocada por el VHB.

19. El uso de una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el tratamiento de una infección provocada por el VHB.

20. El uso de una combinación que comprende la (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente y un segundo agente terapéutico seleccionado de ya sea la (9-[(R)-2- ( fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente, o la bis (pivaloiloximetil) ( 9- [ (R) -2- (fosfonometoxi) etil] adenina o un derivado de la misma aceptable farmacéuticamente en donde la (2R,cis)-4-amino-1- (2-hidroximetil-l, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona y el segundo agente terapéutico están presentes en el intervalo de 40:1 hasta 1:1 en peso, para el tratamiento de una infección de VHB resistente al inhibidor del nucleósido y/o del no nucleósido.

21. El uso de una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el tratamiento de una infección de VHB resistente al inhibidor del nucleósido y/o del no nucleósido de la replicación del virus de la hepatitis B.

22. Un paquete o empaque para un paciente, caracterizado porque comprende al menos un ingrediente activo seleccionado de la (2R,cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-1, 3-oxatiolan-5-il) -pirimidin-2-ona, y la bis (pivaloiloximetil) (9- [2- (fosfonometoxi) etil] adenina y un inserto de información que contiene las instrucciones de uso de ambos ingredientes activos combinados conjuntamente.