MX2013010439A - Tratamientos combinados para neoplasias hematologicas. - Google Patents

Tratamientos combinados para neoplasias hematologicas.

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MX2013010439A
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MX2013010439A
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Michael Gallatin
Roger G Ulrich
Neill A Giese
Brian Lannutti
Albert Yu
Langdon Miller
Thomas M Jahn
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Gilead Calistoga Llc
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Abstract

La invención proporciona métodos relacionados con una novedosa estrategia terapéutica para el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y enfermedades inflamatorias En particular, el método consiste en la administración de un compuesto de fórmula A, donde R es II, halo, o C1-C6 alquilo; R' is C1-C6 alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprendebendamustina, rituximab y ofatumumab.

Description

TRATAMIENTOS COMBINADOS PARA NEOPLASIAS HEM ATOLOGIC AS MALIGNAS Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de las Solicitudes de Patente Provisional de los Estados Unidos Nos. 61/452,034 presentada el 11 de marzo de 2011 y 61/493,317 presentada el 3 de junio de 2011, las cuales se incorporan por referencia en su totalidad a la presente.
Campo de la Invención La presente solicitud está en el campo de terapia y química medicinal. Particularmente, la presente solicitud se refiere al uso de ciertos derivados de quinazolina en combinación con otros tratamientos terapéuticos para tratar neoplasias hematológicas malignas y algunas otras condiciones.
Antecedentes de la Invención La señalización celular a través de 3'-fosforilados fosfoinosítidos ha estado implicada en una variedad de procesos celulares, por ejemplo, transformación maligna, señalización del factor de crecimiento, inflamación e inmunidad. La encima responsable de generar estos productos fosforilados de señalización, fosfatidilinositol 3-quinasa (Pl 3-quinasa; PI3K), fue originalmente identificada como una actividad asociada con proteínas oncogénicas virales y tirosina quinasas de factor de crecimiento que fosforila fosfatidilinositol (Pl) y sus derivados fosforilados en 3'-hidroxilo d e l»a n i 11 o de inositol.
Se cree que la activación de Pl 3-quinasa está involucrada en un agama de respuestas celulares incluyendo células de crecimiento, diferenciación y apoptosis.
La purificación inicial y la clonación molecular de Pl 3-quinasa reveló que era un heterodímero que consiste de subunidades p85 y p 110. Cuatro distintos PI3Ks de Clase I han sido identificados, designados como PI3K a, ß, d, y ?, cada uno con una subunidad catalítica 110 kDa y subunidad regulatoria distinta. Más específicamente, cada una de las tres subunidades catalíticas, es decir, ?110a, p 110ß y ?110d, interactúa con la misma subunidad regulatoria, p85; mientras que p110y interactúa con una subunidad regulatoria distinta, p 101. Los patrones de expresión de cada uno de estos PI3Ks en células humanas y tejidos también son distintos.
La identificación de ?110d isoforma de Pl 3-quinasa se describe en Chantry eí al., J Biol Chem, 272:19236-41 (1997). Se observe que la isoforma humana se expresa en un tejido en forma limitada. Se expresa a altos niveles en linfocitos y tejidos linfoides, lo que sugiere que la proteína podría tener un rol en la señalización mediada por Pl 3-quinasae en el sistema inmune. La isoforma p 110ß de PI3K también podría tener un rol en la señalización mediada por PI3K en ciertos cánceres.
Existe una necesidad de un tratamiento relacionado con trastornos mediados por PI3K relacionados con el cáncer, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes. Específicamente, existe una necesidad de un tratamiento para cánceres que son neoplasias hematológicas malignas, como la leucemia y el linfoma.
Enfoques existentes de quimio-inmunoterapia para leucemia linfocítica crónica (CLL) pueden reducir la proliferación y mejorar la apoptosis de linfocitos malignos; sin embargo, estos efectos beneficiosos pueden limitarse en ganglios linfáticos debido a que los fármacos existentes no penetran efectivamente estos sitios y las células no malignas del estroma prestan apoyo a los linfocitos malignos.
Las quimioterapias o inmunoterapias existentes para la CLL incluyen ciclofosfamida, clorambucil, fludarabina, rituximab, alemtuzumab y ofatumumab. Estas terapias son particularmente efectivas para matar linfocitos malignos en circulación, pero son menos efectivas para reducir la linfoadenopatía maligna. Además, estas terapias no inducen a la redistribución de linfocitos ni causan linfocitosis.
Lo que se necesita en la técnica para tratar a pacientes con CLL es un tratamiento que pueda modular la señalización quimotáctica entre linfocitos y células estromales. Además, lo que se necesita es un tratamiento que pueda reducir dichos resultados de señalización para redistribuir linfocitos malignos desde los ganglios linfáticos a la circulación. Dicha redistribución permitiría que las células sean eliminadas con mayor efectividad por un agentee quimioterapéutico o un agentee inmunoterapéutico.
Breve Descripción de la Invención La presente solicitud cumple con la necesidad que tiene la técnica para proporcionar un método para utilizar estos compuestos en combinación con otras quimioterapias o inmunoterapias para el tratamiento del cáncer. En particular, los cánceres que son neoplasias hematológicas malignas, como la leucemia y el linfoma, son tratados por los métodos aquí descritos.
En un aspecto, se proporciona un método para tratar el cáncer, que consiste en la administración a un sujeto que necesita dicho tratamiento, de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula A, donde R es H, halo, o C1-C6 alquilo; R' es C1-C6 alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales de un grupo que consiste en bendamustina, rituximab y ofatumumab.
En una modalidad, el compuesto es En otra modalidad, el compuesto es En algunas de las modalidades que anteceden, el cáncer es una neoplasia hematológica maligna.
En algunas de las modalidades que anteceden, la neoplasia hematológica maligna es una neoplasia maligna de células B.
En algunas de las modalidades que anteceden, la neoplasia hematológica maligna es leucemia o linfoma.
En algunas de las modalidades que anteceden, el cáncer es leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano (NHL).
En algunas modalidades, el cáncer es un linfoma no Hodgkiniano indoloro (¡NHL).
En otras modalidades el compuesto y cada uno de los agentes terapéuticos se administran al menos una vez durante al menos un ciclo, y donde uno o más agentes terapéuticos se administranal sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente como la administración del compuesto.
En algunas de las modalidades que anteceden, el ciclo es de 7 a 42 días.
En algunas de las modalidades que anteceden, uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto al menos el primer y Segundo día de al menos un ciclo.
En algunas de las modalidades que anteceden, uno o más agentes terapéuticos se administran semanalmente al sujeto durante al menos un ciclo al sujeto durante al menos un ciclo.
En algunas de las modalidades que anteceden, entre 50 mg y 200 mg del compuesto se administra al sujeto dos veces al día.
En algunas de las modalidades que anteceden, entre 50 and 1,500 mg/m2 de uno o más agentes terapéuticos se administra al sujeto.
En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto está presente en una composición farmacéutica que comprende el compuesto, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a los tratamientos estándares de quimioterapia.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto tiene al menos un ganglio linfático agrandado.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto i) es resistente a al menos un tratamiento de quimioterapia, o ii) está en una etapa de recaída luego del tratamiento con quimioterapia, o una combinación del mismo.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar el cáncer, que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula A, donde R es H, halo, o C1-C6 alquilo; R' es C1-C6 alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprende bendamustina, rituximab, ofatumumab y lenalidomida.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar una condición, que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I" o fórmula M", una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprende bendamustina, rituximab y ofatumumab, donde la condición es leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano indoloro(iNHL).
En una modalidad, el sujeto i) es resistente a al menos un tratamiento de quimioterapia, o ii) está en una etapa de recaída después del tratamiento con quimioterapia, o una combinación del mismo.
En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto y uno o más agentes terapéuticos se administran al menos una vez durante al menos un ciclo, y donde uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto.
En algunas de las modalidades que anteceden, el ciclo es 7 a 42 días.
En algunas de las modalidades que anteceden, entre 50 mg y 200 mg del compuesto se administra al sujeto dos veces al día.
En una modalidad, uno o más agentes terapéuticos es bendamustina.
En algunas de las modalidades que anteceden, la bendamustina se administra al sujeto al menos el primer y segundo día de al menos un ciclo.
En algunas de las modalidades que anteceden, la bendamustina se administra por al menos 6 ciclos.
En algunas de las modalidades que anteceden, cada dosis de la bendamustina es entre 50 mg/m2 y 150 mg/m2.
En algunas de las modalidades que anteceden, el método además comprende la administración de rituximab al sujeto.
En algunas de las modalidades que anteceden, ritumixab se administra el primer día de cada ciclo por al menos 6 ciclos.
En otra modalidad, uno o más agentes terapéuticos es rituximab.
En algunas de las modalidades que anteceden, rituximab se administra semanalmente al sujeto durante al menos un ciclo.
En algunas de las modalidades que anteceden, cada dosis de rituximab es entre 300 mg/m2 y 400 mg/m2.
En otra modalidad, uno o más agentes terapéuticos es ofatumumab.
En algunas de las modalidades que anteceden, al menos 12 dosis de ofatumumab se administran por más de 6 ciclos.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar una condición que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I" o fórmula II", una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprende bendamustina, rituximab, ofatumumab y lenalidomida, En una modalidad, uno o más agentes terapéuticos es lenalidomida.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar a un sujeto con un trastorno de células B, que consiste en: identificar un sujeto con neoplasia maligna de células B, donde el sujeto es resistente a o está en una etapa de recaída luego de al menos uno o más tratamientos seleccionados del grupo que comprende bortezomib (Velcade®), carfilzomib (PR-171), PR-047, disulfiram, lactacistina, PS-519, eponemicina, epoxomicina, aclacinomicina, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, inhibidores de vinil sulfona tripeptido, ritonavir, PI-083, ( + /-)-7-metil omuralida, (-)-7-metil omuralida, perifosina, rituximab, citrate de sildenafil (Viagra®), CC-5103, talidomida, epratuzumab (anticuerpos humanizados hl_L2- anti-CD22), simvastatin, enzastaurina, Campath 1 H®, dexametasona, DT PACE, oblimersen, antineoplaston A10, antineoplaston AS2 1, alemtuzumab, beta aletina, ciclofosfamida, clorhidrato de doxorubicina, clorhidrado pegilado liposomal doxorrubicina, prednisona, prednisolona, cladribina, sulfato de vincristina, fludarabina, filgrastim, melfalan, recombinante de interferon alfa, carmustina, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, etoposido, melfalan, dolastatina 10, indium ?? 111 anticuerpo monoclonal MN-14, itrio Y 90 epratuzumab humanizado, globulina anti-timocito, busulfan, ciclosporina, metotrexato, micofenolato mofetilo, linfocitos allogenicos terapéuticos, itrio Y 90 ibritumomab tiuxetan, sirolimus, tacrolimus, carboplatino, tiotepa, paclitaxel, aldesleukin, recombinante de interferon alfa, docetaxel, ifosfamida, mesna, recombinante de la interleucina-12, recombinante de la interleucina-11 , Bcl-2 inhibidor de la proteína de la familia de ABT-263, denileucina diftitox , tanespimicina, everolimus, pegfilgrastim, vorinostat, alvocidib, recombinante ligando FLT3, trombopoyetina humana recombinante, células ciocidas activadas por linfoquina, trihidrato de amifostina, aminocamptotecina, clorhidrato de irinotecan, acetato de caspof ungina, clofarabina, epoetin alfa, nelarabina, pentostatina, sargramostim, ditartrato vinorelbina, WT-1 vacuna de péptido análogo, WT1 126-134 vacuna de péptido, fenretinida, ixabepilona, oxaliplatina, anticuerpos monoclonales CD19, anticuerpos monoclonales CD20, ácidos grasos omega-3, clorhidrato de mitoxantrona, acetato de octreotida, tositumomab con yodo I 131 tositumomab, motexafin gadolinium, trióxido de arsénico, tipifarnib, HSPPC-96 derivado de un tumor humano autólogo, veltuzumab, briostatina 1, anticuerpos monoclonales anti-CD20, clorambucil, pentostatina, lumiliximab, apolizumab, Anti-CD40, ofatumumab, temsirolimus, bendamustina, análogos de purina, lenalidomida, un agentee alquilante, y una terapia con antraciclinas, o una combinación de los mismos; administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, un compuesto de fórmula I" una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprende bendamustina, rituximab, lenalidomida y ofatumumab.
En una modalidad, el sujeto es resistente o se encuentra en una etapa de recaída luego de al menos uno o más tratamientos seleccionados del grupo que comprende rituximab, un agentee alquilante, fludarabina, y una terapia con antraciclinas, y un recombinante de los mismos.
En algunas de las modalidades que anteceden, entre 50 mg y 200 mg del compuesto se administra al sujeto dos veces al día durante al menos uno o más ciclos.
En algunas de las modalidades que anteceden, entre 50 mg/m2 y 1,500 mg/m2 de uno o más agentes terapéuticos adicionales se administra al sujeto al menos una vez durante al menos uno o más ciclos, donde uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar a un sujeto con un trastorno de células B, que consiste en: identificar un sujeto con neoplasia maligna de células B, donde el sujeto es resistente o se encuentra en una etapa de recaída después de al menos uno o más tratamientos seleccionados del grupo que comprende bortezomib (Velcade®), carfilzomib (PR-171), PR-047, disulfiram, lactacistina, PS-519, eponemicina, epoxomicina, aclacinomicina, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, inhibidores de vinil sulfona tripeptido, ritonavir, PI-083, ( + /-)-7-metilomuralide, (-)-7-metilomuralide, perifosina, rituximab, citrato de sildenafil (Viagra®), CC-5103, talidomida, epratuzumab (anticuerpos humanizados hl_L2- anti-CD22), simvastatin, enzastaurin, Campath 1H®, dexametasona, DT PACE, oblimersen, antineoplaston A10, antineoplaston AS2 1, alemtuzumab, beta aletina, ciclofosfamida, clorhidrato de doxorubicina, clorhidrato de doxorubicina liposomal pegilado, prednisona, prednisolona, cladribina, sulfato de vincristina, fludarabina, filgrastim, melfalán, recombinante de interferon alfa, carmustina, cisplatin, ciclofosfamida, citarabina, etopósido, melfalán, dolastatin 10, indium In 111 anticuerpo monoclonal MN-14, itrio Y 90 epratuzumab humanizado, globulina antitimocítica, busulfan, ciclosporina, metotrexato, micofenolato mofetilo, linfocitos alogénicos terapéuticos, Itrio Y 90 ibritumomab tiuxetan, sirolimus, tacrolimus, carboplatino, tiotepa, paclitaxel, aldesleukin, recombinante de interferon alfa, docetaxel, ifosfamida, mesna, recombinante de la interleucina-12, recombinante de la interleucina-11 , Bcl-2 inhibidor de la proteína de la familia de ABT-263, denileucina diftitox , tanespimycin, everolimus, pegfilgrastim, vorinostat, alvocidib, recombinante ligando FLT3, trombopoyetina humana recombinante, células ciocidas activadas por linfoquina, trihidrato de amifostina, aminocamptotecina, clorhidrato de irinotecan , acetato de caspofungina, clofarabina, epoetin alfa, nelarabina, pentostatina, sargramostim, ditartrato vinorelbina, WT-1 vacuna de péptido análogo, WT1 126-134 vacuna de péptido, fenretinida, ixabepilona, oxaliplatina, anticuerpos monoclonales CD19, anticuerpos monoclonales CD20, ácidos grasos omega-3, clorhidrato de mitoxantrona, acetato de octreotida, tositumomab con yodo I 131 tositumomab, motexafin gadolinium, trióxido de arsénico, tipifarnib, HSPPC-96 derivado de un tumor humano autólogo, veltuzumab, briostatina 1, anticuerpos monoclonales anti-CD20, clorambucil, pentostatina, lumiliximab, apolizumab, Anti-CD40, ofatumumab, temsirolimus, bendamustina, análogos de purina, lenalidomida, un agentee alquilante, and una terapia con antraciclinas, o una combinación del mismo; administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, un compuesto de fórmula I" una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprende bendamustina, rituximab, ofatumumab y lenalidomida.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano indoloro(iNHL), que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I", una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y bendamustina.
En una modalidad, el compuesto y bendamustina se administran al menos una vez durante al menos un ciclo, donde la bendamustina se administra al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto, En algunas de las modalidades que anteceden, el ciclo es 7 a 42 días.
En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto se administra al sujeto dos veces al día durante al menos un ciclo, y donde la bendamustina se administra al sujeto al menos el primer y segundo día de al menos un ciclo.
En algunas de las modalidades que anteceden, la bendamustina se administra por al menos 6 ciclos.
En algunas de las modalidades que anteceden, una dosis del compuesto es entre 50 mg y 200 mg, y donde una dosis de bendamustina es entre 50 mg/m2 y 150 mg/m2.
En algunas de las modalidades que anteceden, el método además consiste en administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que comprende rituximab and ofatumumab.
En algunas de las modalidades que anteceden, el método además consiste en administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que comprende rituximab, ofatumumab y lenalidomida.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano indoloro(iNHL), que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I", una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y rituximab.
En una modalidad, el compuesto y rituximab se administran al menos una vez durante un ciclo, y donde rituximab se administra al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto.
En algunas de las modalidades que anteceden, el ciclo es 7 a 42 días.
En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto se administra al sujeto dos veces al día durante al menos un ciclo, y donde rituximab se administra semanalmente al sujeto durante al menos un ciclo.
En algunas de las modalidades que anteceden, una dosis del compuesto es entre 50 mg y 200 mg, y donde una dosis de rituximab es entre 300 mg/m2 y 400 mg/m2.
En algunas de las modalidades que anteceden, el método además consiste en administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que comprende bendamustina y ofatumumab.
En algunas de las modalidades que anteceden, el método además consiste en administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que comprende bendamustina, ofatumumab y lenalidomida.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano indoloro(iNHL), que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula 1", una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y lenalidomida.
En una modalidad, el compuesto y lenalidomida se administran al menos una vez durante un ciclo, y donde lenalidomida se administra al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano indoloro(iNHL), que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I", una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y ofatumumab.
En algunas de las modalidades que anteceden, la dosis del compuesto es entre 50 mg y 200 mg, y la dosis de ofatumumab es entre 200 mg y 1500 mg. En algunas de las modalidades que anteceden, se administra una dosis inicial de ofatumumab que es diferente a la siguiente dosis de ofatumumab.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra un resumen gráfico del crecimiento de células de mieloma múltiple (MM) como una función de concentraciones variables de citocinas IGF-1 y IL-6 en combinación con el compuesto I, utilizando células LB.
La Figura 2 ilustra un resumen gráfico del crecimiento de células de mieloma múltiple (MM) como una función de concentraciones variables del compuesto I y la presencia o ausencia de células estromales de médula ósea (BMSC) después de 48 horas.
La Figura 3 ilustra un resumen gráfico de la apoptosis de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) como una función de concentraciones variables del compuesto de Fórmula I.
La Figura 4 ilustra un cuadro de resumen del efecto del compuesto I sobre la viabilidad celular, reducción de la fosf iliración Akt (Ser473), y la activación de la caspasa 3 en varias diferentes líneas celulares de Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL).
La Figura 5 ilustra un resumen del efecto del compuesto I sobre el ciclo de células de las líneas celulares de la Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL).
La Figura 6 ilustra un resumen del efecto de concentraciones variables del compuesto I sobre el crecimiento celular en las líneas celulares del cáncer de mamas T47D y HS-578T a 48 hs y 72 hs La Figura 7 ilustra un resumen del efecto de concentraciones variables del compuesto I sobre el crecimiento celular de las líneas celulares de los ovarios IGROV-1 y OVCAR-3 a 48 hs y 72 hs.
La Figura 8 ¡lustra un resumen del efecto del compuesto I sobre la fosforilación Akt en varias líneas celulares de leucemia y linfoma.
La Figura 9 ilustra imágenes SDS-PAGE y presenta el Akt y pAkt en varias líneas celulares de cáncer hematopoyético como una función de la presencia o ausencia del compuesto I, mostrando que el compuesto I inhibe la fosforilación Akt.
La Figura 10 ilustra ilustra resúmenes gráficos de poblaciones de células apoteóticas y viables en líneas celulares de cáncer de mamas como una función de concentraciones variables del compuesto de fórmula I, demostrando que el compuesto induce la apoptosis.
La Figura 11 ilustra la concentración del compuesto I en la sangre de un sujeto humano saludable más de 12 horas después de la administración oral de dosis de 50, 100 y 200 mg de dicho compuesto.
La Figura 12 ilustra la comparación de aéreas con lesión en un paciente humano diagnosticado con linfoma de células del manto después de 28 días (1 ciclo) de tratamiento con el compuesto I y las áreas con lesión previas al tratamiento.
La Figura 13 ilustra el ALC (conteo absoluto de linfocitos) en la sangre del paciente por un periodo de más de 4 semanas después de 28 días (1 ciclo) de tratamiento con el compuesto de fórmula I.
La Figura 14 ilustra la concentración del compuesto I en la sangre de pacientes con o sin linfoma de células del manto (MCL) más de 6 horas luego de la administración (50 mg BID) en el día 28, comparado con la concentración en la sangre de un voluntario de salud normal en el día 7 (D7) utilizando el mismo cuadro de dosis o una dosificación de 100 mg BID del Compuesto I.
La Figura 15 ilustra la expresión isoforma PI3K en un panel de líneas celulares de linfoma y leucemia.
La Figura 16A ilustra datos de viabilidad celular y apoptosis en líneas celulares de leucemia expuestas al Compuesto I. En la Figura 16B la coloración de Anexina indica un aumento en la apoptosis en células tratadas.
La Figuras 17A-D ilustra resultados PAGE de diferentes expresiones de la isoforma PI3K en las células de pacientes con CLL.
La Figura 18 ilustra la inducción de la caspasa (A) 3 y la división del (B) PARP en presencia del compuesto I.
La Figura 19 ilustra el aumento de la apoptosis de células de Leucemia linfocítica crónica (CLL) de un pronóstico pobre en pacientes causado por la exposición al compuesto I, demostrando que el compuesto I es efectivo en pacientes resistentes a los fármacos.
La Figura 20 ilustra el aumento de la apoptosis de células de Leucemia linfocítica crónica (CLL) de pacientes resistentes/con recaída causado por la exposición al compuesto de fórmula I.
La Figura 21 ilustra los resultados de la producción Fosfo-Akt en ausencia o presencia de 0.1, 1.0, 10 µ? del compuesto I.
La Figura 22 ilustra resultados de citometría con relación a la señalización P13K en basófilos, demostrando que (B) anti-FCeR1 o (C) fMLP aumenta la expresión CD63 en comparación con ninguna estimulación (A).
La Figura 23 ilustra la inhibición de P13K por el compuesto I en basófilos y demuestra que el Compuesto I es especialmente efectivo en la inhibición de la expresión CD63 inducida por una vía ?110d, pero es también efectivo en concentraciones micromolares para inhibir la expresión inducida por una vía ?110?.
La Figura 24 ilustra datos farmacocinéticos de (A) la administración de una dosis simple del compuesto I en diferentes cantidades de dosis en voluntarios sanos, y (B) un perfil farmacocinético que mantiene una dosificación efectiva por un periodo de más de 12 horas.
La Figura 25 ilustra los efectos de varias dosis del compuesto I en (A) glucosa y (B) niveles de insulina, mostrando poca actividad fuera del objetivo identificado.
La Figura 26A ilustra la expresión de la isoforma PI3K en un panel de líneas celulares DLBCL.
La Figura 26 B ilustra una imagen SDS-PAGE de pAkt en líneas celulares DLBCL en presencia o ausencia del compuesto I.
La Figura 27 ¡lustra los efectos de una concentración de 10 µ? del compuesto I en la fosforilación de Akt y S6 en las líneas celulares de ALL en SDS-PAGE.
La Figura 28 ilustra una reacción dependiente de la dosis de fosforilación de Akt, S6, y GSK-3 después del tratamiento con una serie de diluciones del compuesto.
La Figura 29 ¡lustra efectos dependientes de la dosis del compuesto I en las líneas celulares de ALL en la regulación negativa de cFLIP, división de la Caspasa 3, y división del PARP.
La Figura 30 ilustra la expresión de p 110 delta en A) líneas celulares MM y B) células MM en pacientes; y C) en células MM.1S y LB.
La Figura 31A ilustra la expresión de p 110 delta de células B e INA-6 transfectadas con p 110 delta siRNA (Si) o control siRNA (simulación).
La Figura 31B ilustra un gráfico del crecimiento celular de INA-6 después de la transfección con p 110 delta siRNA (Si) o control siRNA (simulación).
La Figura 31C ilustra el % de células viables cultivadas con o sin el compuesto I por 48 horas.
La Figura 31D ilustra el % de células viables MM después de ser cultivadas con el compuesto I en concentraciones de 0 a 20 µ? por 48 horas.
La Figura 31E ilustra el % de células of células mononucleares de sangre periférica de donantes saludables luego de ser cultivadas con el compuesto I en varias concentraciones por 72 horas.
La Figura 31F ilustra resultados de inmunoblot de Usados de células INA-6 cultivadas con el compuesto I (0-5 µ?) por 120 horas.
La Figura 32 ilustra immunoblot AKT y perfiles de expresión después de cultivar A) células INA-6 con el compuesto I o LY294002 por 12 horas; B) células INA-6 y MM.1 S con el compuesto I a varias concentraciones por 6 horas; C) células LB y INA-6 con el compuesto I por 0-6 horas.
La Figura 33A ilustra imágenes fluorescentes e imágenes de transmisión microscópica de electrones de células INA-6 y LB MM tratadas con el compuesto I por 6 horas y acumulación de LC3; las flechas indican autofagosomas.
La Figura 33B ilustra imágenes microscópicas fluorescentes de células INA-6 tratadas con 5 µ? del compuesto I o privación de suero por 6 horas.
La Figura 33C ilustra inmunoblots of LC3 y niveles de proteína beclin-1 de células INA-6 tratadas con o sin el compuesto I y 3-MA (3-metil-adenina, un conocido inhibidor de autofagia).
La Figura 33D ilustra el % de crecimiento de células LB positivas con p 1 ?d después de ser tratadas con hasta 100 µ? de 3-MA por 24 horas.
La Figura 34 ilustra los niveles de inhibición del crecimiento de A) LB o B) células INA-6 co-cultivadas con 0, 5, y 10 µ? del compuesto I en presencia o ausencia de cantidades variables de IL-6 o IGF-1; Leyenda: medio de control ( I ); compuesto I a 5.0 µ? ( : ) o 10 µ? ( ? ).
Las Figuras 34C y 34D ilustran la inhibición del crecimiento de células MM en presencia de BMSC. Leyenda para 34C solamente: medio de control ( ? ), Compuesto I 2.5 µ? ( ), 5 µ? (¦), y 10 µ? (¦ ).
La Figura 34 E ilustra inmunoblots de IL-6 en sobrenadantes de cultivo de BMSCs cultivadas con el compuesto I o medio de control por 48 horas.
La Figura 34F ilustra inmunoblots de AKT y perfiles de expresión ERK en células INA-6 tratadas con el compuesto I cultivadas con o sin BMSCs.
La Figura 34G ilustra el % de crecimiento de células BMSC en dos diferentes pacientes luego de cultivarlas con el compuesto I por 48 horas.
La Figura 35A ¡lustra imágenes microscópicas de HuVECs (células endoteliales de vena umbilical) cultivadas con 0, 1 y 10 µ? del compuesto I por 8 horas y con la evaluación de la formación de microtúbulos.
La Figura 35B ilustra un cuadro de barra que resume la formación de tubos de células endoteliales en células HuVEC tratadas con el compuesto I.
La Figura 35 C ilustra un gráfico con el % de crecimiento celular de HuVECs como una fución de la creciente concentración de cultivo del compuesto I.
La Figura 35 D ilustra la decreciente expresión de Akt y ERK de células Usadas HuVEC después de haber sido cultivadas con el compuesto I por 7 horas.
La Figura 36A gráfica el volume del tumor en ratas SCID con con xenoinjertos MM tratados con 0, 10 mg/kg o 30 mg/kg del compuesto II como una función de tiempo, mostrando una una fuerte actividad In vivo en el xenoinjerto del tumor humano.
La Figura 36 B ilustra una fotografía que compara el tumor de xenoinjertos humanos MM en una rata tratada con el compuesto II por 12 días a una rata de control.
La Figura 36C ilustra la tasa de supervi encia de ratas SCID con xenoinjertos humanos MM tratados con 0, 10 y 30 mg/kg del compuesto II con el tiempo.
La Figura 36D ilustra imágenes del análisis inmunohistoquimica de tumores obtenidos de una rata tratada con el compuesto II en comparación a la de control; donde las células positivas CD31 y P-AKT son de color marrón oscuro.
La Figura 36E ilustra inmunoblots que detectan niveles de PDK-1 y AKT de tejidos tumorales obtenidos de ratas tratadas con el compuesto II en comparación a la de control.
La Figura 36F ilustra un gráfico de niveles de slL6R medidos en ratas tratadas con 0, 10 mg/kg o 30 mg/kg del compuesto II por un periodo de tiempo de 4 semanas de tratamiento determinado por ELISA.
La Figura 37A ilustra el % de células LB o INA-6 MM viable después del tratamiento con el compuesto I con cantidades variables de bortezomib (B); Leyenda: medio (¦), compuesto I 1.25 µ? (II), 2.5 µ? ( ), o 5.0 µ? (?).
La Figura 37B ilustra inmunoblots que comparan niveles de fosforilazión de AKT en células INA-6 tratadas por 6 horas con el compuesto I y/o bortezomib.
La Figura 38 ilustra (A) la expresión de la ¡soforma PI3K en un panel de líneas celulares de linfoma folicular; (B) la reducción en la expresión de pAkt, Akt, pS6 y S6 después de la exposición al compuesto I; y (C) el aumento de la división de PARP y caspasa-3 después de la exposición al compuesto I en una manera dependiente de la dosis.
La Figura 39 ilustra (A) cantidades de señalización constitutiva PI3K en células primarias MCL en varias cantidades del compuesto I; (B) reducción en la producción de pAkt en líneas celulares MCL que contienen un factor de supervivencia y cantidades variables del compuesto I.
La Figura 40 ilustra una imagen de la tomografía computarizada de la imagen axilar de una linfadenopatía voluminosa en un paciente con CLL (A) antes del tratamiento con el compuesto I y (B) después de 1 ciclo de tratamiento con el compuesto I.
La Figura 41 ilustra que la activación constitutiva de la vía de ??3?d impulsa a la proliferación, supervivencia y tráfico abdominal de la neoplasia maligna de células B en iNHL y CLL.
La Figura 42 ilustra una tabla que resume las características del paciente y la disposición del tratamiento en un estudio que involucra a 20 pacientes con linfoma no Hodgkiniano indoloro (iNHL) y leucemia linfocítica crónica (CLL).
La Figura 43 ilustra una tabla que resume el perfil de seguridad en un estudio donde un compuesto de fórmula I se administró en combinación con (B) o rituximab (R) a pacientes con iNHL o CLL.
La Figura 44 ilustra un resumen gráfico de la efectividad de la administración de un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R) a pacientes con iNHL o CLL.
La Figura 45 ilustra una tabla que resume la tasa de respuestas en pacientes con ¡NHL o CLL luego de administrar un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R).
La Figura 46 ilustra un resumen gráfico del conteo de linfocitos en un studio donde solo un compuesto de fórmula I se administró como agentee simple a pacientes con CLL.
La Figura 47 ilustra un resumen gráfico del conteno de linfocitos en un studio donde un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R) se administró a pacientes con CLL.
La Figura 48A ilustra los trazados de contorno representando la viabilidad de células CLL después del tratamiento con un compuesto de fórmula I, bendamustina, o los dos fármacos combinados. La Figura 48B ¡lustra un gráfico que representa las viabilidades medias de las células CLL tratadas con un compuesto de fórmula I (5 µ?), bendamustina (10 µ?), o la combinación de fármacos (medio ± SEM, n = 4).
La Figura 49A ilustra un resumen gráfico de la actividad enzimática ??3?-d en células como una función de exposición a lenalidomida y cantidades variables de un compuesto de fórmula I.
Las Figuras 49B y 49C ilustran imágenes de ensayos de inmunoblots mostrando los efectos de la lenalidomida y/o un compuesto de fórmula I en la fosforilación en células CD19 + .
Las Figuras 49D y 49 E ilustran imágenes de ensayos de inmunoblots mostrando los efectos de siRNA transfectado o siRNA sin sentido en la expresión de proteína en células CD19 + .
La Figura 50A ilustra un resumen gráfico del efecto de la lenalidomida y/o un compuesto de fórmula I en la expresión de superficie de CD40, CD86 en células CD19+ de pacientes con CLL.
La Figura 50B ilustra un resumen gráfico del efecto de la lenalidomida y/o un compuesto de fórmula I en la expresión de m RNA de CD40, CD86, y CD154 en células CD19+ de pacientes con CLL.
La Figura 50C ilustra un resumen gráfico del efecto de la lenalidomida y/o un compuesto de fórmula I en el CD20 en células CD19+ de pacientes con CLL.
La Figura 50D ilustra un resumen gráfico del efecto de la lenalidomida y/o un compuesto de fórmula I en una concentración Ig en células CD19+ de pacientes con CLL.
La Figuras 50E y 50F ilustran un resumen gráfico del efecto de la lenalidomida y/o un compuesto de fórmula I en la expresión de citocina mRNA en células CD19+ de pacientes con CLL.
La Figura 51 ilustra una tabla que resume las características y disposición del tratamiento en un estudio que involucra 49 pacientes con linfoma no Hodgkiniano indoloro (iNHL) y leucemia linfocítica crónica (CLL).
La Figura 52 ilustra una tabla que resume el perfil de seguridad donde un compuesto de fórmula I se administró en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R) a pacientes con iNHL o CLL.
La Figura 53A ilustra un resumen gráfico de la efectividad en la administración de un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R) a pacientes con iNHL.
La Figura 53B ¡lustra un resumen gráfico de la efectividad en la administración de un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R) a pacientes con CLL.
La Figura 54 ilustra una tabla que resume la tasa de respuestas en pacientes con iNHL o CLL luego de la administración de un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R).
La Figura 55 ilustra un resumen gráfico del conteo de linfocitos en un estudio donde solo un compuesto de fórmula I se administró como agentee simple a pacientes con CLL.
La Figura 56 ilustra un resumen gráfico del conteo de linfocitos en un estudio donde solo un compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina (B) o rituximab (R) se administró a pacientes con CLL.
La Figura 57A ilustra the los trazados de contorno representando la viabilidad de células CLL después de 48 horas seguidas al tratamiento con un compuesto de fórmula I, bendamustina, fludarabina, dexametasona, o los fármacos combinados. La Figura 57B ilustra un diagrama de barra representando las viabilidades relativas medias de células CLL tratadas con un compuesto de fórmula I (5 µ?), bendamustina (10 µ?), fludarabina (10 µ?), dexametasona (10 µ?), o los fármacos combinados (medio + SEM, n = 9).
La Figura 58A ilustra un gráfico cuantificando la despolarización mitochondrial inducida por el péptido BIM BH3 a una concentración final de 0.03 µ? en células CLL de sangre periférica perfiladas como BH3 por FACS (n = 30). La Figura 58B ¡lustra perfiles BH3 de tres pacientes individuales mostrando el patrón predominante de dependencia de BCL2, Mcl-1, y Bcl-XL. La Figura 58C es un gráfico que ilustra la despolarización de BIM en el tratamiento a pacientes na'íve que alcanzaron una respuesta parcial (PR) o completa respuesta (CR) por criterios 2008 IW-CLL comparado con pacientes con enfermedad progresiva (PD) durante o dentro de los seis meses de haber completado la terapia de primera línea de CLL (p = 0.024). La Figura 58D es un gráfico que ¡lustra la despolarización de BIM en pacientes con estado de IGHV no mutado (n = 7) comparado con pacientes con estado de IGHV mutado (n=18) (p = 0.0026). La Figura 58E es un gráfico que ilustra la correlación entre el porcentaje de homología VH y la línea de germanes con nivel de cebado (p = 0.0043).
Las Figuras 59A y 59B ilustran gráficos que representan la adherencia de células CLL cuantif ¡cadas por fluorimetría completa a 24 horas y 1 hora, respectivamente (de un extremo p = 0.045 y 0.032, respectivamente). La Figura 59C ilustra un gráfico que representa la viabilidad de células CLL evaluadas por Anexina V/PI de células CLL derivadas de PB co-cultivadas en presencia o ausencia de StromaNKTert por 24 horas, con tratamientos con fármacos conforme lo representado en el gráfico. La Figura 59D ilustra curvas de respuestas a dosis para células de CLL cultivadas en presencia de ABT-737 por 24 horas con o sin StromaNKTert y con o sin compuesto I. La Figura 59E ¡lustra curvas de respuestas a dosis para células de CLL cultivadas en presencia de ABT-263 con o sin StromaNKTert y con o sin compuesto I.
La Figura 60A ilustra el porcentaje de apoptosis agregado de células CLL medido por Anexina V/PI para las cuatro muestras de pacientes. La Figura 60B ilustra un gráfico que representa la despolarización mitocondrial en células CLL expuestas a estroma tratadas con el compuesto I al ser comparadas con los controles (un extremo p=0.0749). La Figura 60C ilustra un gráfico que representa la despolarización mitocondrial en células CLL expuestas a estroma tratadas con un péptido BAD BH3 y ABT-737 con el compuesto I al ser comparadas con los controles (un extremo p = 0.0462 y 0.0468, respectivamente).
Descripción Detallada de la Invención Salvo definición en contrario, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o termilologías científicas utilizados en la presente tendrán los significados comunmente conocidos por los expertos a quienes concierne la presente invención. En algunos casos, los terminus con significados comúnmente conocidos se definen en la presente para mayor claridad y/o como referencia, y la inclusión de dichas definiciones no necesariamente deben interpretarse como representación de una diferencia substancial con lo que comúnmente significan en la técnica. Varias de las técnicas y procedimientos descritos o mencionados en la presente son entendidos y comunmente empleados utilizando metodología convencional por los expertos en la técnica. Conforme fuera apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits disponibles comercialmente y reactivos se realizan generalmente de conformidad con los protocolos de fabricación y/o parámetros definidos salvo indicación en contrario.
El análisis de los métodos generales aquí presentados es con fines meramente ilustrativos. Otros métodos y modalidades alternativas serán obvias para los expertos en la técnica luego de la revisión de esta divulgación.
Un grupo de elementos vinculados con la conjunction "o" no debe interpretarse como exclusividad mutual en ese grupo, sino también debe interpretarse como "y/o" salvo especificación en contrario. Aunque los artículos, elementos o componentes de la invención pueden describirse o reivindicarse en singular, el plural está contemplado dentro del alcance de la misma salvo que la limitación al singular sea explícitamente indicada.
La invención proporciona métodos relacionados con una novedosa estrategia para el tratamiento del cáncer y enfermedades inflamatorias. En un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto consistente en la administración de un compuesto de fórmula A a dicho sujeto (I ormula A), donde R es -C6 alquilo; una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad particular, halo es F; y R' es metilo, etilo o propilo.
En una modalidad particular, R está adherida a la posición 5 del anillo de quinazolinilo, con la siguiente estructura En una modalidad particular, R está adherida a la posición 6 del anillo de quinazolinilo, con la siguiente estructura El término 'compuesto' se utiliza en la presente, salvo especificación en contrario, como referencia al compuesto de Fórmula A, como el compuesto I, compuesto II, o un enantiómero, como I" o M", o una mezcla enantiomérica.
El "compuesto de Fórmula I" o "compuesto I" se refiere al compuesto químico 5-fluoro-3-fenilo-2-[1 -(9H-purina-6-ilamino)-propilo]-3H-quinazolin-4-uno, estructura de la fórmula I: El enantiómero S del compuesto I se ilustra aquí, designado como I": (G', enantiómero S) El "compuesto de la Fórmula II" o "compuesto M" se refiere al compuesto químico 2-(1 -(9H-purina-6-ilamino)etilo)-6-fluoro-3-fenilquinazolin-4(3H)-uno, estructura de la fórmula II: El enantiómero S del compuesto II se ilustra aquí, designado (II", enantiómero S) En una modalidad, el compuesto de fórmula A es un compuesto de la fórmula I. En otra modalidad, el compuesto de la fórmula A es un compuesto de la fórmula II. En ciertas modalidades, el compuesto es una mezcla racémica de enantiómeros R y S. En ciertas modalidades, el compuesto se utiliza como una mezcla de enantiómeros, y es enriquecido generalmente con el antiómero S. En algunas modalidades el compuesto es predominantemente antiómero S. En algunas modalidades el compuesto de fórmula A, utilizado en los métodos descritos en la presente es al menos 80% enantiómero-S. En ciertas modalidades, el compuesto está principalmente compuesto de enantiómero-S, donde el compuesto comprende al menos 66-95%, o 85-99% del enantiómero-S. En algunas modalidades el compuesto tiene un exceso enantiométrico (e.e.) de al menos 90% o al menos 95% del enantiómero-S. En algunas modalidades el compuesto tiene un exceso enantiométrico (e.e.) de al menos 98% o al menos 99%. En ciertas modalidades, el compuesto comprende al menos 95% del enantiómero-S. En los experimentos celulares y con pacientes proporcionados en la sección ejem plif icadora, la muestra del compuesto I utilizada fue más del 95% del enantiómero-S.
En modalidades específicas, el compuesto de fórmula I o II, utilizado en los métodos aquí descritos es al menos 80% enantiómero-S. En ciertas modalidades, el compuesto de fórmula I o II está compuesto principalmente del enantiómero-S, donde el compuesto comprende al menos 66-95%, o 85-99% del enantiómero-S. En algunas modalidades el compuesto de fórmula I o II tiene un exceso enantiomérico (e.e.) de al menos 90% o al menos 95% de enantiómero-S. En algunas modalidades el compuesto de fórmula I o II tiene un exceso antiométrico-S (e.e.) de al menos 98% o al menos 99%. En ciertas modalidades, el compuesto de fórmula I o II comprende al menos 95% del antiómero-S. En experimentos celulares y con pacientes proporcinados en la sección ejemplificadora, la muestra del compuesto I utilizado fue de más del 95% antiómero-S.
En una modalidad particular, el compuesto selectivamente inhibe PI3K ?110d comparado a otras isoformas PI3K.
En una modalidad particular, el cáncer es a neoplasia hematológica maligna y/o tumor sólido. En otra modalidad particular, la neoplasiahematológ ica maligna es leucemia o linfoma.
En algunas modalidades el linfoma es un neoplasma maduro de células B (periférico). En modalidades específicas, el neoplasma maduro de células B se selecciona del grupo que comprende células B de leucemia linfocítica crónica / linfoma linfocítico pequeño; leucemia de células B prolinfocíticas; linfoma linfoplasmacítico; linfoma de zona marginal, como linfoma esplénico de células B de zona marginal ( + /- linfocitos vellosos), linfoma Nodal de zona marginal (+/- monocitoides de células B), y linfoma Extranodal de células B de zona marginal de tejido tipo linfoide asociado con la mucosa ( ALT); leucemia de células pilosas, mieloma de células plasma/plasmacitoma; linforma folicular, centro folicular; Linfoma de células del manto; linfoma difuso de células B grandes (incluyendo linfoma medianístico grandes de células B, linfoma intravascular grande de células B, y linfoma de efusión primaria); y linfoma de Burkitt/ linfoma/leucemia de células de Burkitt.
En algunas modalidades linfoma se selecciona del grupo que comprende mieloma múltiple (MM) y linfoma no Hodgkiniano (NHL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular, macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) o linfom de células B y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL).
En otra modalidad particular, la leucemia se selecciona del grupo que comprende leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocitica crónica (CLL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL). La leucemia linfocitica aguda también se conoce como Leucemia Linfoblástica Aguda y puede utilizarse indistintamente en la presente. Ambos términos describen un tipo de cáncer que comienza en los glóbulos blancos, infocitos y en la médula ósea.
En algunas modalidades el Linfoma no Hodgkiniano (NHL) cae dentro de un de las dos categorías, NHL agresivo o NHL indoloro. El NHL agresivo crece rápidamente y lleva al paciente a la muerte rápidamente. La supervivencia sin tratamiento puede medirse en meses o semanas. Ejemplos of NHL agresivo incluye neoplasias de células B, linfoma difuso de células B grandes, neoplasmas de células T/NK, linfoma anaplástico de células grandes, linfomas de células T pefiféricas, leucemia linfoblástica de células B precursoras/linfoma, linfoma de Burkitt, linfoma de células T adultas/leucemia (HTLV1+), linfoma primario del sistema nervioso central (CNS), linfoma de células del manto, trastorno linfoproliferativo postrasplante polimórfico, linfomas relacionados con el VIH, linfoma histiocitico , y ninfoma NK blástico. El tipo más común de NHL agresivo es el linfoma difuso de células grandes.
NHL indoloro crece lentamente y no presenta síntomas evidentes en la mayoría de los pacientes hasta que la enfermedad haya progresado hacia una etapa avanzada. La supervivencia sin tratamiento en pacientes con NHL indoloro puede medirse en años. Ejemplos no limitantes incluyen linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeñoo, linfoma de zona marginal (como el linfoma extranodal de zona marginal (también llamado tejido linfoide asociado a las mucosas - linfoma MALT), linfoma nodal de zona marginal de células B (linfoma motocitoide de células B), linfoma esplénico de la zona marginal), y linfoma linfoplasmacítico (macroglobulinemia de Waldentrom).
En algunos casos, la transformación hitológica puede ocurrir, histologic transformation may occur, por ejemplo, el NHL indoloro en pacientes puede convertirse en NHL agresivo.
En algunas modalidades la invención proporciona métodos para tratar pacientes con NHL agresivo or NHL indoloro.
En algunas modalidades la invención proporciona métodos para tratar pacientes con una condición seleccionada del grupo que comprende linfoma de células del manto (MCL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemi mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), y linfoma linfocítico pequeño (SLL), mieloma múltiple (MM), y linfoma de zona marginal.
En algunas modalidades el método de la invención se administra a pacientes con condición de recaída o resistente.
En otra modalidad, el cáncer cáncer de mama, pulmón, colon o próstata.
En una modalidad particular, el cáncer está asociado con una actividad P13K anormal en comparación con una actividad P13K en un sujeto sin cáncer.
En una modalidad particular, el sujeto de preferencia es resistente al tratamiento de quimioterapia, o está en etapa de recaída después del tratamiento con quimioterapia. En una modalidad alternativa, el sujeto es un paciente de novo.
En una modalidad particular, el método comprende reducer niveles de la actividad ??3?d en dicho paciente.
En una modalidad particular, el sujeto es un sujeto humano. Los sujetos que se someten al tratamiento con agentes terapéuticos conocidos pueden experimentar resistencia al tratamiento. Por ejemplo, aunque el bortezomib fue aprobado por la FDA para casos de recaídas/resistentes y nuevos MM diagnosticados, algunos pacientes no responden y otros adquieren resistencia al bortezomib. En algunas modalidades los compuestos de quinazolina descritos en la presente sinégicamente aumentan la efectividad del agentee terapéutico conocido. En algunas modalidades los compuestos descritos en la presente pueden aumentar cualquiera de los agentes terapéuticos descritos en la presente. En modalidades más específicas, los compuestos que se describen en la presente sinégicamente aumentan los inhibidores de proteasoma. En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente al tratamiento de quimiterapia. En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a los inhibidores de proteasoma. En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a bortezomib o carfilzomib. En un ejemplo, los compuestos que se describen en la presente sinérgicamente aumentan la citotoxicidad de MM inducida por bortezomib. Sin limitarse a la teoría, en en algunas modalidades los compuestos mencionados en la presente inhiben la fosfolilación de AKT inducida por bortezomib. En algunas modalidades los métodos que se describen en la presente se utilizan para superar la resistencia al tratamiento inhibidor de proteasoma. En algunas modalidades la invención proporciona un método para tratar a un sujeto resistente o que ha desarrollado resistencia a agentes terapéuticos.
Aún sin limitarse a la teoría, los efectos sinérgicos entre un compuesto de fórmula A y terapias convencionales pueden atribuirse a la habilidad del compuesto de la invención para inducir la movilización de las células tumorales a la circulación periférica. Inducir la circulación periférica de células tumorales aumenta la capacidad de la terapia convencional para acutar sobre el tumor y neutralizarlo con mayor efectividad. Esta sinergia ha sido demostrada en pacientes con CLL.
En consecuencia, el método consiste en administrar además de un compuesto de fórmula A a un paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agentee terapéutico adicional y/o un procedimiento terapéutico seleccionado para tratar dicho cáncer en dicho paciente. "Agentee terapéutico" podría referirse a uno o más compuestos, conforme se utiliza en la presente. El agentee terapéutico puede ser un fármaco de quimioterapia estándar o experimental. El agentee terapéutico puede comprender una combinación de más de un fármaco de quimioterapia. Combinaciones típicas de fármacos de quimioterapia se detallan en a-q. Un agente terapéutico específico puede seleccionarse dependiendo del tipo de enfermedad que está siendo tratada. Ejemplos no limitantes de tratamientos convencionales de quimioterapia para enfermedades hematológicas específicas se describen en secciones más adelante. En una modalidad específica, la invención proporciona un método para tratar un paciente con cáncer hematopoyético, por ejemplo, un paciente con CLL, con bortezomib y un compuesto de fórmula A (por ejemplo, Fórmula I, II, I", o M"), donde la combinación proporciona un efecto sinérgico.
En una modalidad específica, dicho agentee terapéutico se seleccionad del siguiente grupo que comprende bortezomib (Velcade®), carfilzomib (PR-171), PR-047, disulfiram, lactacistina, PS-519, eponemicina, epoxomicina, aclacinomícina, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, inhibidores de vinil sulfona tripeptido, ritonavir, PI-083, (+/-)-7-metilomuralide, (-)-7-metilomuralide, perifosina, rituximab, citrato de sildenafil (Viagra®), CC-5103, talidomida, epratuzumab (anticuerpos humanizados hl_L2- anti-CD22), simvastatin, enzastaurin, Campath-1H®, dexametasona, DT PACE, oblimersen, antineoplaston A10, antineoplaston AS2-1 , alemtuzumab, beta aletina, ciclofosfamida, clorhidrato de doxorubicina, clorhidrato de doxorubicina liposomal pegilado, prednisona, prednisolona, cladribína, sulfato de vincristina, fludarabina, filgrastim, melfalán, recombinante de interferon alfa, carmustina, cisplatin, ciclofosfamida, cítarabina, etopósido, melfalán, dolastatin 10, indium In 111 anticuerpo monoclonal MN-14, itrio Y 90 epratuzumab humanizado, globulina antitimocítica, busulfan, ciclosporina, metotrexato, micofenolato mofetilo, linfocitos alogénicos terapéuticos, Itrio Y 90 ibritumomab tiuxetan, sírolimus, tacrolimus, carboplatino, tiotepa, paclitaxel, aldesleukin, recombinante de interferon alfa, docetaxel, ifosfamida, mesna, recombinante de la interleucina- 12, recombinante de la interleucina-11 , Bcl-2 inhibidor de la proteína de la familia de ABT- 263, denileucina diftitox , tanespimycin, everolimus, pegfilgrastim, vorinostat, alvocidib, recombinante ligando FLT3, trombopoyetina humana recombinante, células ciocidas activadas por linfoquina, trihidrato de amifostina, aminocamptotecina, clorhidrato de irinotecan , acetato de caspofungina, clofarabina, epoetin alfa, nelarabina, pentostatina, sargramostim , ditartrato vinorelbina, WT-1 vacuna de péptido análogo, WT1 126-134 vacuna de péptido, fenretinida, ixabepilona, oxaliplatina, anticuerpos monoclonales CD19, anticuerpos monoclonales CD20, ácidos grasos omega-3, clorhidrato de mitoxantrona, acetato de octreotida, tositumomab con yodo I 131 tositumomab, motexafin gadolinium, trióxido de arsénico, tipifarnib, HSPPC-96 derivado de un tumor humano autólogo, veltuzumab, briostatina 1, anticuerpos monoclonales anti-CD20, clorambucil, pentostatina, lumiliximab, apolizumab, Anti-CD40, and ofatumumab, o una combinación de los mismos. Combinaciones de agentes terapéuticos se utilizan en terapias actuales y experimentales como aquellas combinaciones detalladas en a-q más arriba.
En algunas modalidades el agentee terapéutico es preferably a proteasome inhibitor. En algunas modalidades los métodos comprise administering un compuesto with a proteasome inhibitor. Proteasome inhibitors include natural and synthetic compuestos. Ejemplos no limitantes de inhibidores de proteasoma incluyen bortezomib, ([(1 R)-3-m etilo- 1-({(2S)-3-f en ¡lo-2-[(py razin-2-ylcarbonilo)amino]propanoilo}amino)butilo]ácido borónico), comercializado como 'Velcade por farmacéuticos Millennium; carfilzomib (PR-171) y el análogo por vía oral, PR-047, ambos desarrollados por Proteolix, Inc. Otros ejemplos de inhibidores de proteasoma incluyen disulfiram; lactacistina; compuestos sintéticos como PS-519, eponemicina, epoxomicina, y aclacinomicina; inhibidores de calpaína, como CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341; inhibidores de vinil sulfona tripeptido; ritonavir; PI-083; (+/-)-7-metilomuralide; and (-)-7-metilomuralide. En modalidades especificas, el compuesto de fórmula A se administra en combinación con bortezomib o carfilzomib. En más modalidades específicas, el compuesto de fórmula I se administra en combinación con bortezomib o carfilzomib. En otras modalidades específicas, el compuesto de fórmula II se administra en combinación con bortezomib o carfilzomib. En modalidades específicas, el compuesto de fórmula A se administra en combinación con rituximab o ofatumumab. En más modalidades específicas, el compuesto de fórmula I se administra en combinación con rituximab o ofatumumab. En otras modalidades específicas, el compuesto de fórmula II se administra en combinación con rituximab o ofatumumab.
En algunas modalidades el agentee terapéutico es un agentee alquilante. Ejemplos no limitantes de agentes alquilantes includen, por ejemplo, Busulfan, melfalán, clorambucil, ciclofosfamida, mecloretamina, urastimina, ifosfamida, carmustina, lomustina, streptozocin, tiotepa, y fármacos de quimioterapia a base de platinio, como acisplatin, carboplatino, nedaplatin, oxaliplatina, satraplatin, triplatin tetranitrato.
En otras modalidades cualquier compuesto de la invención puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos activos en una dosificación unitaria para su administración simultánea o secuencial a un paciente. La terapia de combinación puede administrarse como un régimen simultáneo o secuencial. Al administrarse secuencialmente, la combinación puede administrarse en dos o más administraciones.
En una modalidad, la co-administración de un compuesto de la invención con uno o más agentes terapéuticos activos generalmente se refieren a administraciones simultáneas o secuenciales de un compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos activos, tales que cantidades terapéuticamente efectivas del compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos están presentes en el cuerpo del paciente. En una modalidad alternativa, el compuesto y los agentes terapéuticos no necesariamente están presents en el cuerpo del paciente pero el horario específico de dosificación del cumpuesto y de los agentes terapéuticos resultan en efectos sinérgicos.
La co-administración incluye la administración de unidades de dosis de los compuestos de la invención antes o después de administrar las unidades de dosis de uno o más agentes terapéuticos activos; por ejemplo, la administración de los compuestos de la invención en segundos, minutos, horas o días de la administración de uno o más agentes terapéuticos activos. Por ejemplo, una unidad de dosis de un compuesto de la invención puede administrarse primero, seguido en segundos, minutes, hora o días administrando una unidad de dosis de uno o más agentes terapéuticos activos. Alternativamente, una unidad de dosis de uno o más de otros agentes terapéuticos pueden administrarse primero, seguidos de la administración de una unidad de dosis de un compuesto de la invención en segundos, minutos, horas o días. En algunos casos, podría ser adecuado administrar una unidad de dosis de un compuesto de la invención primero, seguida, luego de un periodo de horas (por ejemplo, 1-12 horas), de la administración de una unidad de dosis de uno o más de otros agentes terapéuticos activos. En otros casos, podría ser adecuado aministrar una unidad de dosis de uno o más de otros agentes terapéuticos primero, seguida, luego de un periodo de horas (por ejemplo, 1-12 horas), de la administración de una unidad de dosis de un compuesto de la invención. En algunos casos, podría ser adecuado administrar una unidad de dosis de un compuesto de la invención first, seguida, luego de un periodo de días (por ejemplo, 1-12 días), de la administración de una unidad de dosis de uno o más de otros agentes terapéuticos. En otros casos, podría ser adecuado administrar una unidad de dosis de uno o más agentes terapéuticos activos primero, seguida, luego de un periodo de días (por ejemplo, 1-12 días), de la administración de una unidad de dosis de un compuesto de la invención. En algunas modalidades el régimen de dosificación puede incluir alternar la administración del compuesto y del agentee terapéutico por un periodo de varios días, semanas o meses.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y "efecto sinérgico", es decir el efecto alcanzado cuando ingredientes actives se utilizan conjuntamente es mayor que la suma de los efectos resultants del uso de compuestos en forma separada. Un efecto sinérgico puede alcanzar cuando los ingredientes activos son: (1) co-formulados y administrados simultáneamente en una formulación combinada; (2) administrados por alternancia o paralelamente como formulaciones separadas; o (3) por otro régimen. Al administrarse en una terapia alternativa, se puede alcanzar un efecto sinértico cuando los compuestos se administran secuencialmente, por ejemplo, en tabletas separadas, pastillas o cápsulas, o por diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia de alternancia, una dosificación efectiva de cada ingrediente activo se administra secuencialmente, es decir, en serie.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I: una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y al menos one excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición se enriquece con el enantiómero-S.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula II: una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y al menos one excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición se enriquece con el antiómero-S.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar mieloma múltiple (MM) en un paciente que consiste en administrar una combinación de un compuesto de fórmula A y un agente terapéutico adicional. En algunas modalidades fórmula A es el compuesto I o II. En modalidades específicas, la fórmula A es el compuesto I". En otras modalidades la fórmula A es el compuesto M". En algunas de las modalidades más arriba, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de proteasoma. En modalidades específicas el agente terapéutico adicional es bortezomib. En una modalidad específica, el método para tratar mieloma múltiple en un paciente consiste en administrar el compuesto I" con bortezomib. En una modalidad específica, el método para tratar mieloma múltiple en un paciente consiste en administrar el compuesto II" con bortezomib. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o M" tiene un exceso enantiométrico de al menos 60%. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o M" tiene un exceso enantiométrico de al menos 70%. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o II" tiene un exceso enantiométrico de al menos 80%. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o M" tiene un exceso enantiométrico de al menos 90%. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o II" tiene un exceso enantiométrico de al menos 95%. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o II" tiene un exceso enantiométrico de al menos 98%. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto I" o II" tiene un exceso enantiométrico de al menos 99%.
En una modalidad particular, una combinación de agentes terapéuticos se administra con un compuesto de fórmula A, donde dicha combinación se selecciona del grupo que comprende bendamustina; rituximab; bendamustina y rituximab; ofatumumab; y lenalidomida.
En modalidades alternativas, el compuesto se utiliza en combinación con un procedimiento terapéutico. En una modalidad específica, el procedimiento terapéutico se selecciona del grupo que consiste del transplante sanguíneo de células madre periféricas, transplante de células madre hematopoyéticas autólogas, transplante de médula ósea autóloga, terapia de anticuerpos, terapia biológica, terapia inhibidora de enzimas, irradiación total del cuerpo, infusión de células madre, ablación de médula ósea con ayuda de las células madre, transplante sanguíneo de células madre periféricas tratadas in vitro, transplante sanguíneo de cordón umbilical, técnica inmunoenzimática, método de coloración inmunohistoquímica, estudio farmaológico, terapia de rayos gama de bajo LET cobalto 60, bleomicina, cirugía convencional, terapia de radiación, quimioterapia de alta dosis y transplante de células madre hematopoyético no mieloablativo alogénico.
En una modalidad específica, el método además consiste en obtener una muestra biológica de dicho paciente; y analizar la muestra biológica con un procedimiento analítico seleccionado del grupo que comprende análisis químico de sangre, análisis de translocación cromosómica, biopsia con aguja, hibridación fluorescente in situ, análisis laboratorial de biomarcadores, método de coloración inmunohistoquímica, citometría de flujo o una combinación de los mismos.
Para los propósitos de nomenclatura, los componentes de quinazolina y purinyl del compuesto se enumeran de la siguiente manera: purina quinazolina Conforme se utiliza en la presente, el término "alquilo," incluye cadena lineal, cadena ramificada y radicales hidrocarbilo monovalentes cíclicos, y combinaciones de estos, que contienen solo C y H cuando no son substituidos. Ejemplos incluyen metilo, etilo, isobutilo, ciclohexilo, ciclopentiletilo y similares. El número total de átomos de carbono en cada grupo es en ocasiones descrito en la presente, por ejemplo, cuando el grupo puede contener hasta diez átomos de carbono puede representarse como 1-10C o como C1-C10 o C1-10.
"Halo", conforme se utiliza en la presente, incluye flúor, cloro, bromo e iodo. Generalmente se prefiere flúor y cloro.
El término "inhibidor selectivo de PI3K5" o "inhibidor selectivo de ??3?ß", etc., conforme se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que inhibe la isoenzima ??3?d o ??3?ß, respectivamente, más efectivamente que al menos otra enzima de la familia PI3K. El inhibidor selectivo también puede ser active contra otras isoenzimas de P13K, pero erquire mayores concentraciones para alcanzar el mismo grado de inhibición de otras isoenzimas. "Selectivo" también puede utilizarse para describer un compuesto que inhibe una quinasa-p13 especifica más que un compuesto comparable. Se entiende que un compuesto "inhibidor selectivo de PI3K5" es más selectivo para ??3?d que compuestos convencional y genéricamente designados como inhibidores PI3K, por ejemplo, wortmannin o LY294002. Concomitantemente, wortmannin y LY294002 se consideran "inhibidores no selectivos de PI3K." En ciertas modalidades, compuestos de cualquier tipo que selectivamente regulan negativamente la expresión o actividad PI3K5 pueden utilizarse como inhibidores selectivos de ??3?d en los métodos de la invención. Además, compuestos de cualquier tipo que selectivamente regulan negativamente la expresión o actividad PI3K5 y que posee propiedades farmacológicamente aceptables pueden utilizarse como inhibidores selectivos de PI3K5 en métodos terapéuticos de la invención. Sin limitarse a la teoría, la identificación de la inhibición delta p 110 con un compuesto de la invención proporciona un enfoque novedoso para el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas ya que este método inhibe la señalización constitutiva que resulta en la destrucción directa de las células tumorales. Además, sin limitarse a la teoría, la inhibición delta p 110 reprime las señales microambientales que son cruciales para el albergue, supervivencia y proliferación de células tumorales.
En una modalidad alternativa, compuestos de cualquier tipo que selectivamente regulan negativamente la expresión o actividad ??3?ß pueden utilizarse como inhibidores selectivos de ??3?ß en los métodos de la invención. Además, compuestos de cualquier tipo que selectivamente regulan negativamente la expresión o actividad ??3?ß y que posee propiedades farmacológicamente aceptables pueden utilizarse como inhibidores selectivos de ??3?ße en métodos terapéuticos de la invención.
"Tratar" conforme se utiliza en la presente se refiere a la inhibición de un trastorno, es decir, detener su desarrollo; aliviar el trastorno, es decir, causar su regresión; o aminorar el trastorno, es decir, reducir la severidad de al menos uno de los síntomas asociados con el trastorno. En algunas modalidades "tratar" se refiere a prevenir la manifestación de un trastorno en un animal que puede estar predispuesto al trastorno, pero que no ha sido diagnosticado con el mismo. "Trastorno" pretende abarcar trastornos médicos, enfermedades, condiciones, síndromes y otros similares, sin limitación.
En otro aspecto, la invención incluye un método para reprimir una function de basófilos y/o mastocitos, y de esa manera posibilitar el tratamiento de enfermedades y trastornos caracterizados por la actividad excesiva o indeseada de basófilos y/o mastocidos. De acuerdo con el método, un compuesto de la invención puede utilizarse como inhibidor selectivo de la expresión o actividad de la 3-quinasa delta (??3?d) en los basófilos y/o mastocitos. Preferentemente, el método emplea un inhibidor de ??3?d en una cantidad suficiente para inhibir la liberación de histamina liberada por basófilos y/o mastocitos. En consecuencia, el uso de dichos compuestos y otros inhibidores selectivos de PI3K6 pueden ser valiosos al tratar enfermedades caracterizadas por la liberación de histamina, es decir, trastornos alérgicos, incluyendo trastornos como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, ARDS, enfisema y trastornos relacionados.
El método puede tener utilidad en el tratamiento de sujetos que son o pueden ser objeto de lesión por reperfusión, es decir, lesión resultante de situaciones en las que un tejido u órgano pasa por un periodo de isquemia seguida por reperfusión. El término "isquemia" se refiere a la anemia de tejido localizado debido a la obstrucción del flujo de sangre arterial. La isquemia transitoria seguida por reperfusión característicamente resulta en la activación y transmigración de neutrófilos a través del endotelio de vasos sanguíneos en el área afectada. La acumulación de neutrófilos activados a su vez resulta en la generación de metabolitos reactivos del oxígeno, que dañan los componentes de tejido u órgano afectado. Este fenómeno de "lesión por repercussion" es comunmente asociado con condiciones como derrame cerebrovascular (incluyendo isquemia global o focal), schock hemorrágico, isquemia o infarto al miocardio, transplante de órgano, y vasoespasmo cerebral. A modo ilustrativo, la lesión por reperfusón ocurre al término de los procedimientos de bypass cardiaco o durante el paro cardiaco cuando el corazón, una vez privado de recibir sangre, comienza a reperfundir. Se espera que los inhibidores de la actividad DE LA PI3K5 resulte en cantidades reducidas de la lesión por reperfusión en dichas situaciones.
En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un tumor sólido. En modalidades específicas, el cáncer es de mamas, pulmón, colon, o próstata. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un tumor sólido asociado con una actividad de señalización celular anormal o no deseada mediada por la ??3?ß. En ciertas modalidades, un tumor sólido se selecciona del grupo que comprende cáncer de páncrea; cáncer de vejiga; cáncer colorectal; cáncer de mamas, incluyendo cáncer de mamas con metástasis; cáncer de próstata, incluyendo including cáncer de próstata androgeno-dependiente y androgeno-independiente; cáncer renal, incluyendo, por ejemplo, carcinoma metastásico de células renales; cáncer hepatocelular; cáncer de pulmón, incluyendo, por ejemplo, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma bronquioalveolar (BAC), y adenocarcinoma de pulmón; cáncer de ovarios, incluyendo, por ejemplo, cáncer epitelial progresivo o peritoneal primario; cáncer cervical; cáncer gástrico; cáncer de esófago; cáncer ce cabeza y cuello, incluyendo, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; melanoma; cáncer neuroendócrino, incluyendo tumores metastásicos neuroendócrinos; tumores cerebrales, incluyendo, por ejemplo, glioma, oligodendroglioma anaplástico, glioblastoma multiforme adulto, y astrocitoma anaplástico adulto; cáncer de hueso; y sarcoma de tejidos blandos.
Se ha descubierto que la ablación genetic de p 110d resulta en un fenotipo leve restringido al sistema inmune. Observaciones generales incluyen organismos fértiles sin anormalidades anatómicas o de comportamiento. Un examen histológico reveló que los órganos principales parecen normales. La actividad total de P13K de clase I se redujo 30-50% en células T B. Además, no se observó aumento en la susceptibilidad a las infecciones. Además, el efecto en el sistema hematopoyético incluye el conteo normal de globules periféricos, la presencia de hipoplasia linfoide y la falta de centros germinales en el bazo y ganglios linfáticos, un reducido número de células progenitoras B220 + IgM + B en la médula ósea, un nivel reducido de inmunoglobulina de suero, y el desarrollo normal de células T en el la glándula tímica.
La ablación genetic de 1105 afecta la señalización de mieloide y células B, importante para la oncogénesis. Específicamente, la señalización de la tirosina quinasa, desarrollo, proliferación y supervivencia son afectados en las células mieloides. La función de las células B es la más afectada e incluye la proliferación, diferenciación, apoptosis y la respuesta a los factores de supervivencia de las células B (BCR, CD40, IL-4, quimiocinas). Por lo tanto, la invención incluye métodos para el tratamiento de los estados de la enfermedad en los que una o más de estas funciones de células mieloideas y células B son anormales o no deseadas.
Un inhibidor pan-PI3K que ataca en un nivel molecular de ?110a, ?110ß, ?110d, ?110?, (hvPS34, mTOR, DNA-PK, y otros), a su vez ataca todos los tejidos. La potencial indicación clínica incluye el cáncer pero eventos clínicos adversos incluyen hiperinsulinemia en pacientes con cáncer. La ventaja de un inhibidor selectivo de ?110d que ataca células que sirven de medio de inflamación y células cancerígenas, donde la potencial indicación clínica incluye cáncer, artritis reumatoide, asma, alergias y COPD, es que el tratamiento es bien tolerado, y se evitan efectos secundarios como la hiperinsulinema. Por lo tanto, en un aspecto la invención proporciona un método para tratar pacientes con resistencia a la insulina, o diabetes tipo 2, contra el cáncer, artritis reumatoide, asma, alergias, COPD, u otras condiciones tratables con los compuestos de la invención. Pacientes que necesitan dicho tratamiento, que tienen condiciones de exceso de insulina, los compuestos de la invención son particularmente ventajosos sobre los inhibidores pan-PI3K. En ciertas modalidades, un compuesto de fórmula I o I" se prefiere ya que proporciona beneficios terapéuticos para tratar neoplasias hematológicas malignas sin afectar la señalización de insulina de manera adversa.
En una modalidad, la invención tiene relación con métodos de inhibición de PI3K ?110d. En otra modalidad, la invención tiene relación con métodos de inhibición de PI3K ?110ß o p110y.
En ciertas modalidades, el método que se describe en la presente tiene poca o ninguna actividad desviada. Específicamente, el compuesto de fórmula I utilizado en el método muestra poca actividad contra más de 300 proteínas quinasas incluyendo las resumidas en la Tabla 3 del Ejemplo 16. En ciertas modalidades, el método que se describe en la presente no tiene o tiene mínimos efectos de hiperinsulinemia en pacientes con cáncer en comparación con los métodos que consisten en administrar inhibidores de pan-PI3K. En ciertas modalidades, el método que se describe en la presente es útil para atacar células que median la proliferación de Akt, ya que los compuestos de fórmula A inhiben la proliferación de Akt. Pacientes aptos para el tratamiento con los compuestos de la invención también pueden ser seleccionados, en una modalidad, seleccionando a un paciente que muestra una elevada proliferación de Akt asociada con un cáncer hematopoyético como linfoma, leucemia o mieloma múltiple.
Los métodos en la presente evaden objetos pasivos y se caracterizan por resultados negativos en pantallas de receptores gram, sin inhibición de hERG y sin inhibición significativa de P450.
Otra ventaja del método inventive es la ausencia de efectos adversos del sistema cardiovascular, respiratorio o nevioso central como se demuestra en studios de seguridad farmacológica. Además, un estudio de toxicidad por 28 días en ratas y perros demostró un alto índice terapéutico, por ejemplo, NOAEL (no se observa nivel de efecto adverso) >> 10 µ?. Esta es la dosis experimental más elevada de un químico en la que no existe un aumento estadístico o biológico significativo en la frecuencia o gravedad del efecto toxicológico entre un grupo expuesto y su control adecuado. Los efectos adversos se definen como cualquier efecto que resulta en el deterioro functional y/o lesions patológicas que pueden afectar el desempeño de todo el organism o que reduce la habilidad de un organism para responder a un desafío adicional.
En ciertas modalidades, el método que se describe en la presente reduce marcadamente la linfadenopatía, forzando a los linfocitos a ingresar a la circulación. La redistribución de linfocitos tiene el beneficio potencial de colocar células CLL malignas en un ambiente menos protegido fuera de los ganglios linfáticos. En ciertas modalidades, la coadministración de quimioterapia y/o inmunoterapia con un agente como un compuesto de fórmula A aumenta la eliminación de células CLL mientras reduce la linfocitosis simultáneamente.
En otra modalidad, los métodos inventivos no son genotóxicos en una batería estándar de pruebas.
Otra ventaja de la invención es que la selectividad del compuesto para una o dos isoformas P13K resulta en un perfil de seguridad mejorado sobre compuestos con inhibición pan-PI3K. En otra ventaja, el compuesto I tiene un perfil farmacoquinético favorable con buena cobertura de ataque, y sin efectos adversos sobre los niveles de glucose o insulin, y es bien tolerado en dosis mayores a las dosis terapéticas utilizadas comúnmente por voluntarios sanos. Otra ventaja de la invención incluye la habilidad para tratar una gran variedad de neoplasias hematológicas malignas como se demuestra en los ejemplos mencionados en la presente.
En ciertas modalidades, los métodos de la invención se dirigen hacia el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, el cáncer es una neoplasia hematológica maligna. En modalidades específicas, la neoplasiahematológica maligna se selecciona del grupo que comprende leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), mieloma múltiple (MM), y linfoma no Hodgkiniano indoloro (NHL). En ciertas modalidades, the linfoma no Hodgkiniano indoloro se selecciona del grupo que comprende linfoma difuso de células B grandes (LDBCL), linfoma de células del manto ( CL), Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) y linfoma linfoplasmacítico.
La PI3K está implicada en varias neoplasias hematológicas malignas y se ha establecido el concepto de prueba preclínica relacionado con tratamientos con el compuesto I. La tabla a continuación resume neoplasias hematológicas malignas específicas y el método de acción en las células primarias o linea celular de la enfermedad del paciente.
Indicación Efectos de compuestos de fórmula A Células primarias de pacientes Leucemia linfocítica crónica Induce la apoptosis (CLL) Bloquea factores de supervivencia Células primarias de pacientes Leucemia mieloide aguda Bloquea la señalización de PI3K (AML) Inhibe la proliferación Líneas celulares Leucemia linfocítica aguda Bloquea la señalización de PI3K (ALL) Induce la apoptosis Linfoma no Hodgkiniano Líneas celulares (NHL) Bloquea la señalización de PI3K (MCL, DLBCL, FL) Induce la apoptosis Células primarias de pacientes P110 d sobreexpresado en Mieloma múltiple(MM) 24/24 muestras Induce la apoptosis Los datos proporcionados en la presente demuestran que los compuestos de la invención son útiles para tratar linfomas y leucemias. Linfomas y leucemias generalmente expresan la isoforma delta de p110 selectivamente, por ejemplo, la Figura 15 demuestra que p 1105 es prevalente en la mayoría de las líneas celulares en linfomas, mientras que p110a generalmente no se observa. Además, los datos presentados en la Figura 16A ilustra que los cultivos celulares de seis diferentes líneas celulares de leucemia son sensibles al compuesto I, y fueron fuertemente afectadas por concentraciones micromolares de 5-10 de este compuesto. Las Figuras 8 y 9 apoyan el compuesto I a medida que reduce la producción de Akt(Ser473) en varias líneas celulares,.
CLL, for ejemplo, produce principalmente ?110d y en menor escala ?110? con fines de señalización, por lo tanto se espera que los compuestos que inhiben p 1106 y/o p 110 ? exhiban citotoxicidad selectiva hacia estas células. El Ejemplo 3 ilustra una citotoxicidad dependiente de la dosis para el compuesto I (Figura 3), en células CLL, incluyendo células tomadas de pacientes con prognosis pobre (Figura 19), y células de pacientes que demostraron resistencia a otros tratamientos de CLL (Figura 20). Además, el Ejemplo 13 y la Figura 13 demuestran que el compuesto I administrado a pacientes con CLL a razón de 50 mg BID durante un ciclo de 28 días proporciona un significativo efecto terapéutico. Se observa la disminución del pocentaje de concentración de ALC en linfocitos. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar pacientes con CLL con CLL resistente a los fármacos utilizando compuestos de fórmula A. Por otra parte, el Ejemplo 17 sugiere que una línea celular de fibroblastos basada principalmente en p110a para una señalización no sensitiva al compuesto I. Por lo tanto, en un aspecto, la selección del paciente puede incluir la exclusión de pacientes con cáncer basado principalmente en p110a para la señalización.
Los compuestos de fórmula A también son útiles para tratar linfomas, including linfomas de células B y células T. Los datos en la Figura 4 demuestran que seis diferentes líneas celulares de ALL fueron sensibles al compuesto I, lo que causó una significativa reducción en la viabilidad celular en las seis líneas celulares. La Figura 12 y el Ejemplo 12 demuestran que pacientes con linfoma de células del manto tratados con 50 mg BID del compuesto I por 28 días experimentaron un promedio del 44% en la disminución de la carga tumoral. Además, la Figura 14 demuestra que un paciente con MCL al final del ciclo de 28 días experimentó niveles similares de plasma del compuesto I después de la administración de una dosis de 50 mg comparado a lo observado en un voluntario saludable (NHV); por lo tanto el compuesto no se acumula excesi amente durante un ciclo de tratamiento, ni el paciente se vuelve tolerante por el aumento del metabolismo durante el curso un ciclo de tratamiento.
Además, los compuestos de fórmula A, o fórmula I, son útiles para tratar cánceres hematopoyéticos que constitutivamente expresan actividad de proliferación de Akt. El Ejemplo 8 y las Figuras 8 y 9 detallan líneas de células cancerígenas que demuestran la constitutiva proliferación de Akt, incluyendo linfomas de células B, linfomas de células T, ALL, histiocitosis maligna, DLBCL y AML. La exposición de la célula al compuesto I resulta en la reducción de la proliferación de Akt. Ver también el Ejemplo 19, que ilustra que la constitutiva proliferación Akt fue inhibida por el compuesto I en 13 de las 13 líneas celulares.
En ciertas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. En modalidades específicas, el cáncer es de mamas, ovario, pulmón, colon, o próstata. La Figura 6, por ejemplo, ilustra que el compuesto I reduce la proliferación celular de dos líneas celulares de cáncer de mamas, y la Figura 10 ilustra la citotoxicidad de tres diferentes líneas celulares de cáncer de mamas. Similarmente, la Figura 7 demuestra que el compuesto I es citotóxico a dos líneas celulares de cáncer de ovario.
Para el tratamiento de un tumor sólido, es ventajoso utilizar un compuesto de fórmula A que expresa buena actividad (por ejemplo, IC50 menos que aproximadamente 1 µ? , y preferentemente menos de aproximadamente 250 nM— er Ejemplo 15) contra p 110 ß , ya que tumores sólidos con frecuencia utilizan esta isoenzima en lugar de p 110d o más. Por lo tanto, un compuesto de fórmula A que tiene un IC50 menor a aproximadamente 250 nM se prefiere para el tratamiento de un tumor sólido; compuesto I, I", II, o M" es adecuado para este uso, conforme de demuestra en la presente.
En algunas modalidades el sujeto para tratamientos que se describen en la presente como uno que ha sido diagnosticado con al menos una de las condiciones aquí descritas como tratables con el uso de un compuesto de fórmula A. En algunas modalidades el sujeto ha sido diagnosticado con un cáncer mencionado en la presente, y ha probado ser resistente al tratamiento con al menos uno de los agentes convencionales de quimioterapia. Por ejemplo, pacientes que no han respondido a tratamientos como los inhibidores de proteasoma, transplante de células madre autólogas, regímenes CHOP, rituximab, fludarabina, alemtuzumab, análogos de nucleósidos convencionales anticancerígenos y agentes alquilantes con frecuencia responden a los métodos del tratamiento que se describe en la presente. Por lo tanto, en una modalidad, los tratamientos de la invención se dirigen a pacientes que han recibido uno o más de dichos tratamientos.
En ciertas modalidades, los métodos de la invención se dirigen a enfermedades relacionadas con células B o linfocitos B. Las células B tiene un rol en la patogénesis de enfermedades autoinmunes.
Los compuestos de fórmula A (específicamente fórmulas I, I", II y M") son aptos para el tratamiento de una variedad de sujetos con las condiciones que se describen en la presente, especialmente cánceres hematológicos en humanos. En algunas modalidades el sujeto seleccionado para el tratamiento de una neoplasia hematológica maligna es un sujeto atravesando por una recaída luego de otros tratamientos o es resistente a otros tratamientos. En algunas modalidades el sujeto es seleccionado para el tratamiento de una neoplasia hematológica maligna resistente a otros fármacos contra el cáncer. En algunas modalidades el sujeto sujeto es seleccionado para el tratamiento de una neoplasia hematológica maligna que exhibe un algo nivel de actividad ?110d. En algunas modalidades el sujeto sujeto es seleccionado para el tratamiento de una neoplasia hematológica maligna que exhibe un nivel relativamente bajo de actividad p110a. En algunas modalidades el sujeto sujeto es seleccionado para el tratamiento de una neoplasia hematológica maligna que consitutivamente expresa actividad de fosfolización de Akt.
En una modalidad, el método que se describe en la presente consiste en la administración a un sujeto un compuesto de fórmula A que se describe en la presente, en combinación con una terapia utilizada para trtar el cáncer. "Terapia" o "tratamiento", conforme se utiliza en la presente, es un tratamiento de cáncer por cualquier forma de tratamiento convencional o experimental conocido para tratar el cáncer que no incluye el uso de un compuesto de fórmula A. En ciertas modalidades, la combinación de un compuesto de fórmula A con una terapia convencional o experimental utilizada para tratar el cáncer o una enfermedad autoinmune proporciona resultados beneficiosos y/o deseables superiores a los resultados obtenidos con un tratamiento sin la combinación. En ciertas modalidades, las terapias utilizadas para tratar el cáncer son conocidas por una persona con conocimiento ordinario de la técnica y descritas en la literatura. Las terapias incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia, combinaciones de quimioterapia, terapias biológicas, inmunoteraia, y el uso de anticuerpos monoclonales y vacunas.
En algunas de las modalidades que anteceden, el método de combinación proporciona un compuesto de fórmula A administrado simultáneamente con o durante el periodo de administración de la terapia. En algunas de las modalidades que anteceden, el compuesto de fórmula A se administra simultáneamente con otro tratamiento de quimioterapia. En ciertas modalidades, el método de combinación proporciona un compuesto de fórmula A administrado antes de la administración de la terapia.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos una quimioterapia estándar o experimental. En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos dos quimioterapias estándares o experimentales. En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos tres quimioterapias estándares o experimentales. En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos cuatro quimioterapias estándares o experimentales En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos una quimioterapia estándar o experimental seleccionada del grupo que comprende fludarabina, rituximab, agentes alquilantes, alemtuzumab y tratamientos de quimioterapia a-q más arriba mencionados.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos dos quimioterapias estándares o experimentales seleccionadas del grupo que comprende fludarabina, rituximab, agentes alquilantes, alemtuzumab y tratamientos de quimioterapia a-q más arriba mencionados.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos tres quimioterapias estándares o experimentales seleccionadas del grupo que comprende fludarabina, rituximab, agentes alquilantes, alemtuzumab y tratamientos de quimioterapia a-q más arriba mencionados.
En algunas de las modalidades que anteceden, el sujeto es resistente a al menos cuatro quimioterapias estándares o experimentales seleccionadas del grupo que comprende fludarabina, rituximab, agentes alquilantes, alemtuzumab y tratamientos de quimioterapia a-q más arriba mencionados.
Los detalles exactos con respecto a la administración de la combinación puede determinarse de manera experimental. El refinamiento de la secuencia y el momento de administración de un compuesto de fórmula A con una terapia seleccionada se adaptará al sujeto, a la naturaleza de la condición a ser tratada en el sujeto, y generalmente, al juicio del médico tratante.
Ejemplos no limitantes de terapias experimentales o estándares se describen a continuación. Adeemás, el tratamiento de ciertos linfomas se revisa en Cheson, B.D., Leonard, J.P., "Anticuerpo monoclonal Therapy for B-Cell Non-Hodgkin's Lymphoma" The New England Journal of Medicine 2008, 359(6), p. 613-626; and Wierda, W.G., "Current and I nvestigational Therapies for Patients with CLL" Hematology 2006, p. 285-294. Linfoma incidence patterns in the United States is profiled in Morton, L.M., et al. "Linfoma Incidence Patterns by WHO Subtype in the United States, 1992-2001" Blood 2006, 107(1), p. 265-276.
El tratamiento del linfoma no Hodgkiniano, especialmente originado en células B, incluye, pero no se limita al uso de anticuerpos monoclonales, enfoques de quimioterapia estándar (por ejemplo, CHOP, CVP, FCM, MCP, y similares), radioinmunoterapia, y combinaciones de los mismos, especialmente la integración de una terapia con anticuerpos con la quimioterapia.
Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales no conjugados para el linfoma no Hodgkiniano/cánceres de células B incluyen rituximab, alemtuzumab, anticuerpos humanos o humanizados anti-CD20, lumiliximab, anti-TRAIL, bevacizumab, galiximab, epratuzumab, SGN-40, y anti-CD74. Ejemplos no limitantes de agentes anticuerpos experimentales utilizados en el tratamiento del linfoma no Hodgkiniano/cánceres de células B incluyen ofatumumab, ha20, PR0131921, alemtuzumab, galiximab, SGN-40, CHIR-12.12, epratuzumab, lumiliximab, apolizumab, milatuzumab, y bevacizumab. Cualquiera de los anticuerpos monoclonales pueden combinarse con rituximab, fludarabina, o un agente/régimen de quimioterapia.
Ejemplos no limitantes de regímenes estándares de quimioterapia para el infoma no Hodgkiniano/cánceres de células B incluyen CHOP (ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina, prednisona), FCM (fludarabina, ciclofosfamida, mitoxantrona), CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona), MCP (mitoxantrona, clorambucil, y prednisolona), R-CHOP (rituximab más CHOP), R-FCM (rituximab más FCM), R-CVP (rituximab más CVP), y R-MCP (R-MCP).
Ejemplos no limitantes de radioinmunoterapia para el linfoma no Hodgkiniano/cánceres de células B incluyen tiuxetan ibritumomab marcado con itrio-90, y tositumomab marcado con iodo-131. Estos agentes terapéuticos están aprobados para su uso en sujetos con recaída o folicular resistente o linfoma de bajo grado.
Los tratamientos terapéuticos para el linfoma linfoma de células del manto incluyen la combinación de quimioterapias como CHOP (ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina, prednisona), hiperCVAD (ciclofosfamida hiperfraccionada, vincristina, doxorubicin, dexametasona, metotrexato, citarabina) y FCM (fludarabina, ciclofosfamida, mitoxantrona). Además, estos regímenes pueden complementarse con el anticuerpo monoclonal rituximab (Rituxan) para formar una combinación de terapias R-CHOP, hiperCVAD-R, y R-FCM. Otros enfoque incluyen combinar cualquiera de las terapias más arriba mencionadas con el transplante de células madre o el tratamiento con ICE (ifosfamida, carboplatino y etopósido).
Otro método para tratar el linfoma de células del manto incluye inmunoterapia como el uso de anticuerpos monoclonales como Rituximab (Rituxan). Rituximab también es efectivo contra cánceres de células B indoloros, incluyendo el linfoma de zona marginal, WM, CLL y el linfoma linfocítico pequeñoo. Una combinación de Rituximab y agentes de quimioterapia son especialmente efectivos. Un enfoque modificado es la radioinmunoterapia, donde el anticuerpo monoclonal se combina con una partícula de radioisótopo, como lodo-131 tositumomab (Bexxar®) e ltrío-90 ibritumomab tiuxetan (Zevalin®). En otro ejemplo, Bexxar® se utiliza en un tratamiento secuencial con CHOP. Otro ejemplo de inmunoterapia incluye el uso de vacunas contra el cáncer, a base de la composición genética del tumor de un paciente individual. Un ejemplo de la vacuna contra el linfoma es GTOP-99 ( yVax®).
Otro método para tratar el linfoma de células del manto incluye el transplante autólogo de células madre junto con quimioterapia de alta dosis.
Otro método para tratar el linfoma de células del manto incluye administrar inhibidores de proteasoma, como Velcade® (bortezomib o PS-341), o agentes antiangiogenesis, como talidomida, especialmente en combinación con Rituxan. Otro método del tratamiento consiste en administrar fármacos que llevan a la degradación de la Bcl-2 y aumenta la sensibilidad de células cancerígenas a la quimioterapia, como oblimersen (Genasense) en combinación con otros agentes de quimioterapia. Otro método del tratamiento incluye otros agentes de quimioterapia. Otro método del tratamiento incluye administrar inhibidores de mTOR, que llevan a la inhibición del crecimiento celular y hasta a la muerte de las células; un ejemplo no limitante es Temsirolimus (CCI-779), y Temsirolimus en combinación con Rituxan®, Velcade® u otros agentes de quimioterapia.
Otras terapias recientes para MCL han sido divulgadas (Nature Reviews Jares, P. 2007). Ejemplos no limitantes incluyen Flavopiridol, PD0332991, R-roscovitina (Selicilib, CYC202), sulfonas estirilo, Obatoclax (GX15-070), TRAIL, Anti-TRAIL DR4 y anticuerpos DR5, Temsirolimus (CCI-779), Everolimus (RAD001), BMS-345541 , Curcumin, Vorinostat (SAHA), talidomida, lenalidomida (Revlimid® CC-5013), y Geldanamycin (17-AAG).
Ejemplos no limitantes de otros agentes terapéuticos utilizados para tratar la Macroglobulinemia de Waldenstrom incluyen perifosina, bortezomib (Velcade®), rituximab, citrato de sildenafil (Viagra®), CC-5103, talidomida, epratuzumab (anticuerpos humanizados hl_L2- anti-CD22), simvastatin, enzastaurin, campath-IH, dexametasona, DT PACE, oblimersen, antineoplaston A10, antineoplaston AS2-1, alemtuzumab, beta aletina, ciclofosfamida, clorhidrato de doxorubicina, prednisona, sulfato de vincristina, fludarabina, filgrastim, melfalán, recombinante de interferon alfa, carmustina, cisplatin, ciclofosfamida, citarabina, etopósido, melfalán, dolastatin 10, indium In 111 anticuerpo monoclonal MN-14, itrio Y 90 humanized epratuzumab, globulina antitimocitica, busulfan, ciclosporina, metotrexato, micofenolato mofetilo, linfocitos alogénicos terapéuticos, Itrio Y 90 ibritumomab tiuxetan, sirolimus, tacrolimus, carboplatino, tiotepa, paclitaxel, aldesleukin, recombinante de interferon alfa, docetaxel, ifosfamida, mesna, recombinante de la interleuc¡na-12, recombinante de la interleucina-11 , Bcl-2 inhibidor de la proteína de la familia de ABT-263, denileucina diftitox , tanespimycin, everolimus, pegfilgrastim, vorinostat, alvocidib, recombinante ligando FLT3, trombopoyetina humana recombinante, células ciocidas activadas por linfoquina, trihidrato de amifostina, aminocamptotecina, clorhidrato de irinotecan , acetato de caspofungina, clofarabina, epoetin alfa, nelarabina, pentostatina, sargramostim, ditartrato vinorelbina, WT-1 vacuna de péptido análogo, WT1 126-134 vacuna de péptido, fenretinida, ixabepilona, oxaliplatina, anticuerpos monoclonales CD19, anticuerpos monoclonales CD20, ácidos grasos omega-3, clorhidrato de mitoxantrona, acetato de octreotida, tositumomab and iodine 1-131 tositumomab, motexafin gadolinium, trióxido de arsénico, tipifarnib, HSPPC-96 derivado de un tumor humano autólogo, veltuzumab, briostatina 1, y clorhidrato de doxorubicina liposomal PEGilado, y cualquier combinación de los mismos.
Ejemplos no limitantes de otros agentes terapéuticos utilizados para tratar el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) fármacos terapéuticos (Blood 2005 Abramson, J.) incluyen ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina, prednisona, anticuerpos monoclonales anti-CD20, etopósido, bleomicina, muchos de los agentes detallados por Waldenstrom, y cualquier combinación de los mismos, como ICE y R-ICE.
Ejemplos no limitantes de procedimientos terapéuticos utilizados para tratar la Macroglobulinemia de Waldenstrom incluyen el transplante de células madre periféricas, transplante de células madre hematopoyético, transplante de médula ósea autóloga, terapia con anticuerpos, terapia biolígica, terapia inhibidora de enzimas, irradiación corporal total, infusión de células madre, ablación de médula ósea con el apoyo de células madre, transplante sanguíneo de células madre periféricas tratadas in vitro, transplante sanguíneo de cordón umbilical, técnica inmunoenzímática, estudio farmaológico, terapia de rayos gama de bajo LET cobalto 60, bleomicina, cirugía convencional, terapia de radiación, y transplante de células madre hematopoyético no mieloablativo alogénico.
Ejemplos no limitantes de otros agentes terapéuticos utilizados para tratar la leucemia linfocítica crónica (Spectrum, 2006, Fernandes, D.) incluye Clorambucil (Leukeran), Ciclofosfamida (Cyloxan, Endoxan, Endoxana, Cyclostin), Fludarabina (Fludara), Pentstatin (Nipent), Cladribina (Leustarin), Doxorubicin (Adriamycin®, Adriblastine), Vincristina (Oncovin), Prednisona, Prednisolona, Alemtuzumab (Campath, MabCampath), varios agentes detallados por Waldenstrom , y la combinación de quimioterapia y quimioinmunoerapia, incluyendo el régimen de combinación común: CVP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona); R-CVP (rituximab-CVP); ICE (ifosfamida, carboplatino, etopósido); R-ICE (rituximab-ICE); FCR (fludarabina, ciclofosfamida, rituximab); y FR (fludarabina, rituximab).
En ciertas modalidades, el método consiste en administrar además de un compuesto de I o II al paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente terapéutico y/o procedimiento terapéutico seleccionado para tratar el cáncer en dicho paciente. En ciertas modalidades, el método consiste en administrar además de un compuesto de I o II al paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de agentes terapéuticos seleccionados del grupo que comprende a) bendamustina; b) rituximab; c) bendamustina y rituximab; d) ofatumumab; y e) lenalidomida.
Los compuestos de la invención pueden formularse para ser administrados a un sujeto animal utilizando técnicas de formulación comúnmente conocidas en la técnica. Las formulaciones aptas para modos particulares de administración y para compuestos de fórmula A pueden encontrarse en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los compuestos de la invención pueden prepararse en la forma de profármacos, es decir, formas protegidas que liberan los compuestos de la invención luego de su administración al sujeto. Típicamente, los grupos de protección son hidrolizados en fluidos corporals como en el torrente sanguíneo, liberando por lo tanto el compuesto activo o son oxidados o reducidos In vivo para liberar el compuesto activo. Un debate sobre profármacos se encuentra en Smith and Williams Introduction to the Principies of Drug Design, Smith, H.J.; Wright, 2nd ed., London (1988).
Un compuesto de la presente invención puede administrarse como product químico puro, pero típicamente es preferable administrar el compuesto en la forma de una composición farmacéutica o formulación. En consecuencia, la presente invención también proporciona una composición farmacéuticas que comprende un compuesto de fórmula A y un conductor farmacéutico biocompatible, adyuvante o vehículo. La composición puede incluir el compuesto de fórmula A como la única fracción activa o en combinación con otros agentes, como oligo- o polinucleótidos, oligo- o polipéptidos, fármacos, u hormonas mezcladas con excipientes u otros conductores farmacéuticamente aceptables. Los conductores y otros ingredientes pueden considerarse farmacéuticamente aceptables siempre que sean compatibles con otros ingredientes de la formulación y no sean perjudiciales al receptor de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas son formuladas para contener conductors farmacéuticamente aceptables aptos, y puden opcionalmente comprener excipientes y auxiliaries para facilitar el procesamiento de compuestos activos en preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. La modalidad de administración generalmente determinará la naturaleza del conductor. Por ejemplo, las formulaciones de administración parenteral pueden comprender soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Conductores aptos para administración parenteral puden seleccionarse entre soluciones salinas, solución salina tamponada, dextrosa, agua y otras soluciones fisiológicamente compatibles. Los conductores preferidos para la administración parenteral son búferes fisiológicamente compatibles como la solución de Hank, solución de Ringer o solución salina tamponada fisiológicamente. Para la administración de tejido o cellular, se utilizan en las formulaciones penetrantes adecuados para la barrera específica a ser permeada. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para preparaciones que comprenden protínas, la formulación puede incluir materiales estabilizantes, como polioles (por ejemplo, sucrosa) y/o surfactantes (por ejemplo, surfactantes no iónicos), y similares.
Alternativamente, formulaciones para uso parenteral pueden comprender dispersions o suspensions de compuestos actives preparados como suspensiones aceitosas inyectables apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, y ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como sodio-carboxi metilocellulose, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. Polímeros acuosos que proporcionan solubilización sensible al pH y/o la liberación prolongada del agente activo también pueden utilizarse como coberturas o estructuras matriciales, por ejemplo, polímeros metacrílicos, como las series de Eudragit® disponibles a través de Rohm America Inc. (Piscataway, N.J.). Emulsiones, por ejemplo, dispersiones de aceite en agua y agua en aceite, también pueden utilizarse, opcionalmente estabilizadas por un agente emulsionante o dispersante (materiales activos de superficie; surfactantes). Las suspensiones pueden contener agentes de suspensión como alcoholes isoestearílicos exotilados, polioxietileno sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, hidróxido de aluminio metálico, bentonita, agar-agar, goma de tragacanto y mezclas de los mismos.
Liposomas que contienen un compuesto active de fórmula A también pueden emplearse para la administración parenteral. Los liposomas generalmente derivan de fosfolípidos u otras substancias lípidas. Las composiciones Iso en liposomas también pueden contener otros ingredientes, como estabilizantes, conservantes, excipientes y otros similares. Los lípidos preferidos incluyen fosfolípidos y fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto natural como sintéticas. Los métodos para formar liposomas se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Prescott (Ed.), Methods in Cell Bioloqy, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, New York (1976).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de fórmula A en dosificaciones aptas para la administración por vía oral pueden formularse utilizando conductores farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Las preparaciones formualdas para la administración por vía oral pueden se en forma de tabletas, pildoras, cápsulas, obleas, grageas, pastillas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, elíxires o polvos. En forma ilustrativa, las preparaciones farmaéuticas para la administración por vía oral pueden obtenerse combinando los compuestos actives con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando las mezclas de los gránulos, luego de agregar auxiliares aptos si así se desea, para obtener núcleos de tabletas o grageas. Formulaciones a ser administradas por vía oral pueden emplear conductores líquidos similares a aquellos descritos para su uso parenteral, por ejemplo, soluciones acuosas tamponadas, y otros similares.
Las formulaciones preferidas para su administración por vía oral incluyen tabletas, grageas y cápsulas de gelatina. Estas preparaciones pueden contener uno o más excipientes, que incluyen, sin limitación: diluyentes, como azúcares, incluyendo lactose, dextrose, sucrose, manitol o sorbitol; aglutinantes, como silicato de magnesio y aluminio, almidón de maíz, trigo, arroz, papa, etc.; materials celulosos, como metilocelulosa, celulosa hidroxipropilmetilo, y carboximetil celulosa de sodio, polivinilpirrolidona, gomas, como goma árabe y goma de tragacanto, y proteínas, como gelatina y colágeno; agentes desintegrantes o solubilizantes como polivinilpirrolidona reticulada, almidones, agar, ácido algínico o sales de los mismos, como alginato de sodio, o composiciones efervescentes; lubricantes, como sílice, talco, ácido esteárico o su magnesio o sal de calcio, y polietileno glicol; aromatizantes y edulcorantes; colorantes o pigmentos, por ejemplo, para identificar el product o caracterizar la cantidad (dosificación) del compuesto activo; y otros ingredientes, como conservantes, estabilizantes, agentes de hinchamiento, agentes emulsionantes, promotores de soluciones, sales para regular la presión osmótica y búferes.
En algunas formulaciones preferidas para su administración por vía oral, la compoasición farmacéutica comprende al menos uno de los materiales del grupo (a) más arriba, o al menos uno de los materiales del grupo (b) más arriba, o al menos uno de los materiales del grupo (c) más arriba, o al menos uno de los materiales del grupo (d) más arriba, o al menos uno de los materiales del grupo (e) más arriba. Preferentemente, la composición comprende al menos un material de dos grupo seleccionados de los grupos (a)-(e) más arriba.
Las cápsulas de gelatina incluyen cápsulas duras hechas de gelatin, al igual que cápsulas blandas, selladas hechas de gelatin y recubiertas con glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener ingredientes actives con rellenos, aglutinantes, lubricantes y/o estabilizadores, etc. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en fluidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.
Los núcleos de grageas pueden estar provistos de revestimientos adecuados como soluciones de azúcar concentrada, que también pueden contener goma árabe, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes.
La composición farmacéutica puede estar provista como sal del compuesto activo. Las sales tienen a ser más soluble en solventes acuosos u otros solventes protónicos que el ácido libre corresondiente o las formas de base. Sales farmacéuticamente aceptables son conocidas en la técnica. Los compuestos que contienen restos ácidos pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cationes adecuados. Cationes farmacéuticamente aceptables contienen, por ejemplo, metal alcalino (por ejemplo, sodio o potasio) y cationes alcalinotérreos (por ejemplo, calcio o magnesio).
Compuestos de la estructura de fórmula (A) que contienen residues básicos pueden formar sales con adición de ácidos farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, Berge, et al., describe en detalle sales farmacéuticamente aceptables en J Pharm Sci, 66:1 (1977). Las sales pueden prepararse in situ durante la aislación final y purificación de los compuestos de la invención o por separado por reacción de una función de base libre con un ácido adecuado.
Sales representativas de adición de ácidos incluyen, pero no se limitan a, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforosulfanato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato (isotionato), lactato, maleato, metanosulfonato o sulfato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato o fosfato de hidrógeno, glutamato, bicarbonato, p-toluenosulfonato, y undecanoato. Ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico, y ácido cítrico.
Grupos básicos que contienen nigrógeno pueden cuaternizarse con dichos agentes como haluros de alquilo inferior como metilo, etilo, propilo, butilo cloruros, bromuros y yoduros; dialquil sulfatos como dimetilo, dietilo, dibutilo, y diamil sulfatos; haluros de alquilo de cadena larga como decilo, laurilo, miristilo, y cloruros estearílico, bromuros, y yoduros; haluros de arilalquilo como bencilo y bromuros de fenetilo; y otros. Productos que tienen solubilidad o dispersabilidad modificada se obtienen de esta manera.
Composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado en un conductor farmacéuticamente aceptable puede prepararse, colocado en un contenedor apropiado y etiquetado para el tratamiento de la condición indicada. En consecuencia, también se contempla un artículo de fabricación, como un contenedor que comprende una forma de dosificación de un compuesto de la invención y una etiqueta que contiene instrucciones para el uso del compuesto. Se contemplan también los kits bajo la invención. Por ejemplo, el kit puede comprender una forma de dosificación de una composición farmacéutica y un envoltorio insertado que contiene instrucciones para el uso de la composición en el tratamiento de una condición médica. En cualquiera de los casos, las condiciones indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de trastornos inflamatorios, cáncer, etc.
Métodos de administración Composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula A pueden administrarse al sujeto por cualquier método convencional, incluyendo técnicas parenterales y entérales. Las modalidades de administración parenteral incluyen aquellas en que la composición se administra por una vía que no sea el tracto gastrointestinal, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramedularmente, intramuscular, intraarticular, intratecal, e inyecciones intra ventriculares. Las modalidades de administración enteral incluyen, por ejemplo, la administración por vía oral (incluyendo bucal y sublingual) y rectal. Las modalidades de administración transepitelial incluyen, por ejemplo, la administración transmucosa y transdérmica. La administración transmucosa incluye, por ejemplo, la administración enteral y nasal, inhalación, y la administración pulmonar profunda; administración vaginal; y administración rectal. La administración transdérmica incluye modalidades transdérmicas pasivas o activas o transcutáneas, incluyendo, por ejemplo, parches y dispositivos de iontoforesis, al igual que la aplicación tópica de pastas, pomadas o ungüentos. La administración parenteral también se puede lograr utilizando una técnica de alta presión, por ejemplo, POWDERJECT™.
Técnicas quirúrgicas incluyen la implantación de composiciones de depósito (reservorio), bombas osmóticas y otros similares. Una vía de administración preferida para el tratamiento de la inflamación puede ser la administración local o tópica para trastornos como artritis, o la administración sistémica para trastornos distribuidos, por ejemplo, administración intravenosa para lesiones de reperfusión o para condiciones sistémicas como sepsis. Para otras enfermedades, incluyendo aquellas que involucran el tracto respiratorio, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, y enfisema, la administración se puede lograr por inhalación o administración pulmonar profunda de sprays, aerosoles, polvos y otros similares.
En algunas modalidades que anteceden, el compuesto de fórmula A se administra antes, durante, o después de la quimioterapia, radioterapia y/o cirugía. La formulación y vía de administración elegida se adaptarán al sujeto, a la naturaleza de la condición a ser tratada en el sujeto, y generalmente, al juicio del médico tratante.
El índice terapéutico del compuesto de fórmula A puede aumentar modificando o derivando los compuestos para la administración a células de cáncer identificadas que expresan el marcador que identifica dichas células. Por ejemplo, los compuestos pueden vincularse a un anticuerpo que reconoce un marcador selectivo o específico para células cancerígenas, de modo que los compuestos sean introducidos en la proximidad de las células para ejercer sus efectos localmente, conforme lo descrito previamente (ver por ejemplo, Pietersz, et al., Immunol Rev, 129:57 (1992); Trail, et al., Science, 261:212 (1993); y Rowlinson-Busza, et al., Curr Opin Oncol, 4:1142 (1992)). La administración de estos compuestos dirigida al tumor aumenta el beneficio terapéutico, ínter alia, minimizando potenciales toxicidades no específicas que pueden resultar del tratamiento de radiación o quimioterapia. En otro aspecto, el compuesto de fórmula A y radioisótopos o agentes de quimioterapia pueden conjugarse en el mismo anticuerpo anti-tumoral.
Las características del agente y la formulación del agente pueden influenciar el estado físico, estabilidad, rango de liberación In vivo, y el rango de depuración In vivo del agente administrado. Dicha información farmacocinética y farmacodinamica puede recavarse a través de studios preclínicos in vitro e In vivo, posteriormente confirmados en humanos durante el curso de pruebas clínicas. Por lo tanto, para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, una dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos bioquímicos y/o basados en células. Entonces, la dosificación puede formularse en modelos animáis para alcanzar un rango de concentración circulante deseable que module la expresi'no o actividad de una isoforma P13K espacífica o combinación de isoformas. A medida que se llevan a cabo estudios en humanos, información adicional surgirá con relación a los niveles adecuados de dosificación y duración del tratamiento para varias enfermedades y condiciones.
Aunque los compuestos de la invención son bien tolerados, un ejemplo del límite de la dosificación del tratamiento es la elevación de las pruebas de la función hepática (LFT). LFT incluye pruebas estándar de bioquímica clínica en el suero o plasma de los pacientes para proporcionar información sobre el estado del hígado del paciente. Niveles como alanina aminotransferasa, aspartato transaminasa, fosfatasa alcalina, bilirrubina y transpeptidasa gama glutamil que están fuera del rango normal pueden dar señal de la posible toxicidad hepática. La dosificación del compuesto terapéutico puede ajustarse para evitar o reducir los valores de la elavada prueba de la función hepática y posterior toxicidad hepáticaPor ejemplo, un sujeto puede ser administrado con dosis crecientes de un compuesto. Con una cantidad determinada de la dosis, el sujeto comienza a desarrollar elevados niveles de LFT fuera del rango normal, dando señal de posible toxicidad hepática con esa dosificación. Como respuesta, la dosificación puede reducirse a una cantiad tal que los niveles de LFT sean reducidos a un rango acceptable según el juicio del medico tratante, por ejemplo un nivel que es el rango normal para el sujeto tratado, o dentro de aproximadamente 25% a 50% normal. Por lo tanto, las pruebas de la función hepática pueden utilizarse para dosificar la administración de un compuesto.
La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos componentes pude determinarse por los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales por ejemplo, para determinar LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el "índice terapéutico," que típicamente se expresa como la proporción LD50/ED50. Se preieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos, es decir, la dosis tóxica es substancialmente mayor a la dosis efectiva. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y de estudios animales adicionales pueden utilizarse en la formulación de un rango de dosificación para uso humano. La dosificación de dichos compuestos recae preferentemente dentro de un rango de concentraciones en circulación que incluyen ED50 con poca o ninguna toxicidad.
La dosificación puede limitarse por los síntomas de toxicidad relacionados con el tratamiento. Dichos síntomas, además de elevación de las pruebas de la función hepática, incluye anemia, visión borrosa, diarrea, vómito, fatiga, mucositis, edema mucositis, edema periférico, pirexia, neuropatía periférica, derrame pleural, sudores nocturnos, y ortopnea, o una combinación de los mismos. Con una cierta cantidad de dosis, si el sujeto desarrolla niveles intolerables de dichos síntomas, la dosificación puede reducirse a un nivel aceptable para eliminar el efecto adverso a criterio del médico tratante.
Otra consideración para determinar la dosis adecuada del compuetso para un paciente es la concentración deseada circulante en el plasma sanguíneo. En una modalidad particular, la concentración del compuesto en la sangre es entre 40-3,000 ng/mL por un periodo de 12 horas a partir de la administración. En otra modalidad particular, la concentración del compuesto en la sangre es entre 75-2,000 ng/mL por un periodo de 12 horas a partir de la administración. En otra modalidad particular, la concentración del compuesto en la sangre es entre 500-2,000 ng/mL por un periodo de 12 horas a partir de la administración. En una modalidad preferida, la concentración del compuesto en la sangre es entre 40-3,000 ng/mL por un periodo de 12 horas a partir de la administración, donde el compuesto es una fórmula I, I", II, o II" y es administrada por vía oral en una cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg, 150 mg, o 200 mg. En una modalidad preferida, la concentración del compuesto en la sangre es entre 40-3,000 ng/mL por un periodo de 12 horas a partir de la administración, donde el compuesto es una fórmula I y es administrada por vía oral en una cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg, 150mg, o 200 mg. En una modalidad preferida, la concentración del compuesto en la sangre es entre 40-3,000 ng/mL por un periodo de 12 horas a partir de la administración, donde el compuesto es una fórmula II y es administrada por vía oral en una cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg, 150 mg, o 200 mg. En algunas de las modalidades que anteceden, la máxima concentración en el plasma sanguíneo se logra a las dos horas de la administración.
En ciertas modalidades, la dosificación del compuesto de fórmula I o II se selecciona para producir una concentración de plasma en el fármaco de aproximadamente 10 nM o más por un periodo de 8 a 12 horas, en promedio, y proporcionar un pico de concentración de plasma de aproximadamente 500 nM o más, preferentemente aproximadamente 1O00 nM o más. En ciertas modalidades, la dosificación del compuesto de fórmula I o II se selecciona para producir una concentración de plasma en el fármaco de aproximadamente 100 nM o por un periodo de 8 a 12 horas, en promedio, y proporcionar un pico de concentración de plasma de aproximadamente 500 nM o más, preferentemente aproximadamente 1000 nM o más. En ciertas modalidades, la dosificación del compuesto de fórmula I o II se selecciona para producir una concentración de plasma en el fármaco de aproximadamente 200 nM o más por un periodo de 8 a 12 horas, on average, en promedio, y proporcionar un pico de concentración de plasma de aproximadamente 500 nM o más preferentemente aproximadamente 1000 nM o más.
En ciertas modalidades, la dosificación del compuesto de fórmula I o II se selecciona para producir una concentración de plasma donde la concentración mínima del compuesto está en el rango donde se observa un efecto terapéutico, como la apoptosis de células cancerígenas. En ciertas modalidades, la dosificación del compuesto de fórmula I o II se selecciona para producir una concentración mínima de plasma con una activación de isoforma EC50 PI3K5 igual o mayor a aquella en el plasma sanguíneo. En ciertas modalidades, la dosificación del compuesto de fórmula I o II se selecciona para producir una concentración mínima de sangre por encima del nivel de EC50 para la activación ??3?d y por debajo del nivel de EC50 de activación ??3?? en una célula durante un periodo de al menos 12 horas desde la administración del compuesto. Por ejemplo, si el valor EC50 para la activación del basófilo PI3K d es de 65 nM y el valor EC50 para la activación del basófilo PI3K ? es de 1100 en todo el plasma sanguíneo, entonces la dosificación del compuesto seleccionado proporciona una concentración mínima de plasma del compuesto entre 60 nM y 1100 nM durante un periodo de 8-12 horas desde la administración del compuesto. Similarmente, una dosificación puede seleccionarse para producir una concentración mínima de sangre por encima del nivel EC5o para la activación del basófilo PI3K5 y por debajo del nivel EC50 para la activación del basófilo PI3K -a, -ß o -?. Una persona con conocimiento ordinario de la técnica puede determinar los valores EC50 para la activación de la isoforma PI3K o inhibición In vivo. En modalidades alternativas, el rango superior de la concentración del fármaco puede exceeder y no está limitado por el valor de EC50 de la PI3K -?, -a, o -ß isoforma en el plasma sanguíneo. Además, el rango de concentración en sangre del fármaco está a un nivel que es terapéuticamente beneficioso para tratar la neoplasia hematológica maligna, mientras minimiza los efectos secundarios no deseados.
Por ejemplo, mientras sean selectivos delta, los compuestos pueden exhibir suficiente actividad en p 110 ? clínicamente útil, es decir, efectiva en el cáncer que depende de ?110? para señalizar, ya que el nivel de plasma por encima de la dosificación para la inhibición de p110y puede lograrse mientras sea selectivo con relación a otras isoformas, específicamente la isoforma alfa. Por lo tanto, en algunas modalidades la dosificación del compuesto se selecciona para producir una concentración efectiva de sangre para inhibir selectivamente ?110d y ?110?.
En algunas modalidades la dosificación del compuesto proporciona a la sangre a través de la concentración plásmica entre 65 nM y 1100 nM durante un period de 8 a 12 horas a partir de la administración del compuesto. En algunas de las modalidades que anteceden, el periodo es al menos de 12 horas a partir de la administración del compuesto.
En una modalidad particular, el compuesto se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva.
En una modalidad particular, el compuesto se administra en una dosis de 20-500 mg/día. En una modalidad particular, el compuesto se administra en una dosis de 50-250 mg/día.
En una modalidad particular, el compuesto se administra en una dosis de 25 a 150 mg por dosis, y dos dosis se administran al día (por ejemplo, dosis BID con dosis de 25 a 150 mg). En una modalidad preferida, un sujeto es tratado con 50 mg a 100 mg de un compuesto de fórmula A dos veces al día. En otra modalidad preferida, un sujeto es treated con 150 mg de un compuesto de fórmula A dos veces al día.
En una modalidad particular, el método consiste en administrar al paciente una dosis diaria inicial de 20-500 mg del compuesto y aumentar dicha dosis por incrementos hasta alcanzar la efectividad clínica. Incrementos de aproximadamente 25, 50, 100, o 150 mg pueden utilizarse para aumentar la dosis. La dosificación puede aumentarse diariamente, día de por medio, dos veces por semana, o una vez por semana.
En una modalidad particular, el método consiste en administrar al paciente la misma dosis del compuesto que alcanzó la efectividad clínica o reducir dicha dosis por incrementos a un nivel en que se mantenga la efectividad.
En una modalidad particular, el método consiste en administrar al paciente una dosis inicial de 20-500 mg del compuesto y aumentar dicha dosis a una dosificación total de 50-400 mg al día por más de al menos 6 días. Opcionalmente, la dosificación puede ser además aumentada a aproximadamente 750 mg/día.
En una modalidad particular, el compuesto se administra al menos dos veces al día.
En una modalidad particular, el compuesto se administra por vía oral, intravenosa o por inhalación. Preferentemente, el compuesto se administra por vía oral. En algunas modalidades se administra por vía oral en una dosificación de aproximadamente 50 mg BID, en una dosificación de aproximadamente 100 mg BID, o en una dosis de aproximadamente 150 mg BID.
Para los métodos de la invención, cualquier regiment de administración efectiva regula el tiempo y la secuencia de la dosis que puede utilizarse. La dosis del agente preferentemente incluye unidades de dosificación farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del agente. Conforme se utiliza en la presente, "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad suficiente para modular la expresión o actividad ??3?d y/o derivar un cambio mensurable en un parámetro fisiológico del sujeto a través de la administración de una o más unidades de dosificación farmacéutica. La "cantidad efectiva" también puede referirse a la cantidad requerida para aliviar la enfermedad o trastorno en un sujeto.
Rangos adecuados de dosificación para los compuestos de fórmula A varían de acuerdo con estas consideraciones, pero en general, los compuestos se administran en un rango de 10.0 pg/kg-15 mg/kg del peso corporal; 1.0 g/kg-10 mg/kg del peso corporal, o 0.5 mg/kg-5 mg/kg del peso corporal. Para un sujeto humano típico de 70-kg, por lo tanto, el rango de dosificación es de 700 pg-1050 mg; 70 pg-700 mg; o 35 mg-350 mg por dosis, y dos o más dosis pueden administrase al día. Las dosificaciones pueden ser más elevadas cuando los compuestos se administran por vía oral o transdérmicamente en comparación a, por ejemplo, la administración i.v. La toxicidad reducida de un compuesto de fórmula A, permite la administración terapéutica de dosis relativamente elevadas. En algunas de las modalidades que anteceden, la administración por vía oral de hasta 750 mg/día de un compuesto de la invención es adecuada. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula A se administra en una dosis de 50 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula A se administra en una dosis de 100 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula A se administra en una dosis de 150 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula A se administra en una dosis def 200 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula A se administra en una dosis de 350 mg BID. En modalidades específicas, para el tratamiento de la leucemia, linfomas y mieloma múltiple, una dosificación de aproximadamente 50-350 mg por dosis, administrada por vía oral una vez o preferentemente dos veces al día, es generalmente adecuada.
En algunas de las modalidades que anteceden, la administración por vía oral de hasta 750 mg/día del compuesto I" o II" es adecuada. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula I" o II" se administra en una dosis de 50 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula I" o II" se administra en una dosis de 100 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula I" o II" se administra en una dosis de 150 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula I" o II" se administra en una dosis de 200 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, un compuesto de fórmula I" o II" se administra en una dosis de 350 mg BID. En algunas de las modalidades que anteceden, para el tratamiento de la leucemia, linfomas y mieloma múltiple, una dosificación de aproximadamente 50-350 mg por dosis de un compuesto de fórmula I" o II", administrada por vía oral una o preferentemente dos veces al día, es generalmente adecuada.
Los compuestos pueden administrarse como una dosis simple en bolo, una dosis con el tiempo, como en i.v. o administración transdérmica, o en dosificaciones múltiples.
La dosificación continúa por al menos un ciclo. En algunas modalidades el ciclo es al menos de siete días. En algunas modalidades el ciclo es de aproximadamente 28 días. En algunas modalidades la dosificación continúa por aproximadamente 28 días y es interrumpida posteriormente por al menos 7 días. En algunas modalidades un ciclo completo es es la dosificación continua por 28 días. La evaluación de la respuesta clínica en el paciente puede medirse luego de cada ciclo. Los resultados clínicos pueden utilizarse para tomar una decisión para aumentar, disminuir, interrumpir o mantener la dosificación.
Dependiendo de la vía de administración, una dosis adecuada puede calcularse de acuerdo al peso corporal, área de superficie corporal o tamaño del órgano. El régimen de dosificación final sera determinado por el medico tratante en vista de la buena práctica médica, considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del agente, la identidad y gravedad del estado de la enfermedad, la respuesta del paciente, edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, y la severidad de cualquier infección. Factores adicionales que pueden considerarse incluyen el tiempo y frecuencia de la administración, combinación de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Además, el refinamiento de la dosificación apropiada para el tratamiento que involucra las formulaciones mencionadas en la presente se realiza de manera rutinaria por practicantes experimentados sin experimentación indebida, especialmente en vista de la información de dosificación y ensayos divulgados, al igual que los datos farmacocinéticos observados en pruebas clínicas realizadas en humanos. Dosificaciones adecuadas pueden determinarse a través del uso de ensayos establecidos para determinar la concentración del agente en el fluido corporal u otra muestra junto con los datos de respuestas a las dosis.
La frecuencia en la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del compuesto de fórmula A y la vía de administración. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de residues activos o para mantener el efecto deseado. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una dosis simple, múltiples dosis a discreción, infusión continua, depósitos de liberación prolongada, o combinaciones de las mismas, conforme se requiera para mantener el nivel mínimo deseado del compuesto. Composiciones farmacéuticas de corta acción (es decir, de vida semi corta) pueden administrarse una vez al día o más de una vez al día (por ejemplo, dos, tres o cuatro veces al día). Composiciones farmacéuticas de larga acción podrían administrarse cada 3 o 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas. Las bombas, como las subcutáneas, intraperitoneales o subdurales, pueden preferirse para infusiones continuadas.
Los sujetos que responderán favorablemente al método de la invención incluyen generalmente sujetos médicos y veterinarios, incluyendo pacientes humanos. Entre otros sujetos para quienes los métodos de la invención son útiles se encuentran gatos, perros, animales grandes, aves como pollos y otros similares. En general, cualquier sujeto que se beneficiase de un compuesto de fórmula A es apto para la administración del método de la invención. En algunas de las modalidades que anteceden, el paciente tiene una característica citogénica del(17p) o d e I ( 11 q ) . En algunas de las modalidades que anteceden, el paciente tiene una linfadenopatía. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o II" reduce el tamaño de una linfadenopatía en un paciente. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o M" reduce el tamaño de una linfadenopatía después de un ciclo de tratamiento. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o M" reduce el tamaño de una linfadenopatía en al menos 10 % después de un ciclo de tratamiento. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o II" reduce el tamaño de una linfadenopatía en al menos 25 % después de un ciclo de tratamiento. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o M" reduce el tamaño de una linfadenopatía en al menos 30 % después de un ciclo de tratamiento. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o II" reduce el tamaño de una linfadenopatía en al menos 40 % después de un ciclo de tratamiento. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o M" reduce el tamaño de una linf adenopatía en al menos 50 % después de un ciclo de tratamiento. En algunas de las modalidades que anteceden, el uso del compuesto I, I", II, o II" reduce el tamaño de una linf adenopatía en al menos 75 % después de un ciclo de tratamiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición, que consiste en administar un compuesto de fórmula I, II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más agentes terapéuticos a un sujeto que necesita dicho tratamiento, donde la condición es un cáncer. En una modalidad, uno o más agentes terapéuticos es un inhibidor de proteasoma. Uno o más agentes terapéuticos pueden incluir bendamustina, rituximab, ofatumumab, y/o lenalidomida. En otra modalidad, uno o más agentes terapéuticos incluyen bendamustina, rituximab, o una combinación de estos dos agentes terapéuticos. En otra modalidad, uno o más agentes terapéuticos incluyen ofatumumab. En otra modalidad, uno o más agentes terapéuticos incluyen lenalidomida.
Rangos adecuados de dosificación para uno o más agentes terapéuticos pueden variar, pero en general, uno o más agentes terapéuticos se administran en un rango de 50 mg/m2 y 1,500 mg/m2. En una modalidad, bendamustina se administra en el rango de 50 mg/m2 y 150 mg/m2. En otra modalidad, rituximab se administra en el rango de 300 mg/m2 y 400 mg/m2. En otra modalidad, ofatumumab se administra en el rango de 300 mg/m2 y 1 ,500 mg/m2.
La dosificación de uno o más agentes terapéuticos en combinación con un compuesto de fórmula A puede continuarse por al menos un ciclo. En algunas modalidades la dosificación de uno o más agentes terapéuticos en combinación con un compuesto de fórmula A puede continuarse por al menos siete días. En otras modalidades la dosificación de uno o más agentes terapéuticos en combinación con un compuesto de fórmula A puede continuarse por aproximadamente 28 días. En algunas modalidades un compuesto de fórmula A y uno o más agentes terapéuticos se administran al menos una vez durante al menos un ciclo. Uno o más agentes terapéuticos puede administrarse al sujeto en el mismo ciclo o en ciclos diferentes como la administración del compuesto. En algunas modalidades uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto on al menos en el primer y segundo día de al menos un ciclo. En otras modalidades uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto semanalmente. La evaluación de una respuesta clínica en el paciente puede medirse después de cada ciclo. Los resultados clínicos puden utilizarse para tomar una decisión para aumentar, disminuir, interrumpir o mantener la dosificación.
En algunas de las modalidades que anteceden, la condición es una neoplasia hematológica maligna. En modalidades preferidas, la condición se selecciona del grupo que comprende mieloma múltiple, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica , linfoma de células B, linfoma difuso de células B grandes, ALL de células B, ALL de células T y linfoma de Hodgkin.
En modalidades preferidas, el compuesto está substancialmente compuesto del enantiómero-S. En modalidades específicas, el compuesto comprende al menos 95% del enantiómero-S. En algunas de las modalidades que anteceden, la administración de dicho compuesto y agente terapéutico proporciona un beneficio sinérgico superior a los resultados obtenidos sin la combinación del compuesto y agente terapéutico.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar pero no limitan la invención. En los ejemplos a continuación, las referencias a los 'compuestos de fórmula G o 'compuesto G se refieren al enantiómero-S aquí ilustrado, y muestras utilizadas para estos ejemplos mostraron un 98.2%ee medidos por métodos de HPLC quiral: (enantiómero S) Además, un análisis de este compuesto revela las siguientes características del material: Ejemplo 1 Inhibición del crecimiento cellular en células MM Este ejemplo demuestra el compuesto de fórmula I inhibe los efectos estimulantes del crecimiento celular de citocinas (IGF-1 and IL-6) en células de mieloma múltiple (MM). Las células LB (Línea celular de mieloma mielomonocítica) se cultivaron por 48h con un medio de control; con el compuesto de fórmula I, en presencia o ausencia de IL-6 o IGF-1. El efecto inhibidor del compuesto de fórmula I en el crecimiento de células MM se evaluó midiendo la absorción del colorante 3-(4,5-dimetilotiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrasodico bromuro (MTT; Chemicon International). Las células fueron sometidas a impulses con 10 µ?_ of 5 mg/mL MTT para cada brote por las últimas 4 horas de cultivos de 48 horas, seguidas por 100 µ? isopropanol conteniendo 0.04 N HCI. La absorción se midió a 570/630 nm utilizando un espectrómetro (Dispositivos moleculares). Un resumen de los resultados se ilustra en la Figura 1. La exposición de 0.625 µ?-2.5 µ? del compuesto I inhibe el crecimiento de células MM aún en presencia de estimulantes del crecimiento celular de citocinas.
Ejemplo 2 Efecto de BMSC en la citotoxicidad Este ejemplo demuestra que las células estromales de médula ósea (BMSCs) no protegen contra la citotoxicidad de las células LB inducidas por el compuesto I. Las células LB fueron cultivadas con un medio de control, y con el compuesto de fórmula I por 48 horas, en presencia o ausencia de BMSCs. La proliferación cellular se evaluó utilizando un ensayo de captación [3H]-timidina. Los datos representan el medio (± SD) del experimento triplicado. Un resulmen de estos resultados se ilustra en la Figura 2. El crecimiento de células LB se redujo luego de la exposición a 0.625 µ?-10 µ? del compuesto I aún en presencia de BMSC.
Ejemplo 3 Efecto del compuesto en apoptosis de células de CLL Este ejemplo demuestra que el compuesto de fórmula I induce la apoptosis en céulas de leucemia linfocítica crónica (CLL) en el paciente. La sangre periférica se obtuvo de pacientes con células B a través del CLL Research Consortium from Ohio State University (Consorcio de Investigación de CLL de la Universidad Estatal de Ohio). Células primarias positivas CD19 fueron aisladas utilizando Rosette-Sep (StemCell Technologies). Las células se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen) complementadas con 10% de suero bovino fetal activado con calor, 2 mmol/L L-glutamina, y penicilina (100 units/mL)/streptomicina (100 µg/mL; Invitrogen) a 37°C, 5% C02, y humedad elevada. Luego de la incubación con el compuesto de fórmula I o medio por 96 horas, 5 * 105 células fueron lavadas con PBS y luego resuspendídas en un búfer de unión (10 mmol/L HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mmol/L NaCI 5 mmol/L KCI, 1 mmol/L MgCI2, 1.8 mmol/L CaCI2) conteniendo 2 pL del stock de Anexina V-FITC (BioWhittaker, Inc) y 10 pL de 20 pg/mL Pl (Sigma). Luego de la incubación por 10 minutos a temperature ambiente en un área protegida contra la luz, los especímenes fueron cuantif icados por citometría de flujo en un FACScan™ (Becton Dickinson).
El tratamiento de células de pacientes con CLL con el compuesto I resulta en apoptosis y el resultado aparentemente depende de la ddosis, conforme se ilustra en la Figura 3.
La apoptosis inducida por el compuesto I se observó en las células CLL de pacientes con prognosis pobre, conforme lo indican los datos en la Figura 19.
También se observó que la apoptosis inducida por el compuesto I resultó ser efectiva en células CLL de pacientes resistentes/con recaída conforme se ilustra en la Figura 20.
Ejemplo 4 Efecto del compuesto en líneas celulares de ALL Este ejemplo demuestra el compuesto de fórmula I resulta en una reducción de la fosforilación de Akt y una disminución en la proliferación celular acompañada por la eliminación de células de las líneas celulares de leucemia T-ALL y B-ALL (Leucemia Linfoblástica Aguda). Se realizaron ensayos de viabilidad de las líneas celulares utilizando el ensayo AlamarBIue (Invitrogen). Células (1 x 106 por brote) en un volumen de 100 pL fueron colocadas en 96 brotes en placas planas y el compuesto de fórmula I (100 pL por brote a 2* concentración final) o el medio solo se agregó a las placas. Todo se realizo en cuadruplicado. Las células incubaron por tiempos fijos (48 horas). Luego de la incubación, 10 pL AlamarBIue® se agretó a cada brote. Las células incubaron por 4 horas y la densidad óptica a 530-560 nm se obtuvo utilizando el lector de placa SpectraMax® M5 2001. La viabilidad celular se exprezó como un porcentaje de absorción entre las muetras de células tratadas/de control. Estos resultados se resumen en la tabla ilustrada en la Figura 4. La exposición al compuesto I resulta en la reducción substancial de la viabilidad cellular en una variedad de líneas celulares ALL así como una reducción en la fosforilación de Akt.
Ejemplo 5 Efecto del compuesto en el ciclo celular de ALL Este ejemplo demuestra que el tratamiento de la línea celular CCRF-SB de la Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL) con el compuesto de fórmula I resulta en la detención del ciclo celular G0/G1. Se realizó un análisis representativo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de yoduro de propidio -células CCRF-SB sometidas a coloración bajo condiciones normales de crecimiento, y crecimiento en presencia del compuesto de fórmula I. El porcentaje promedio de células G0-Gi, S y las fases G2-M se calcula en la tabla de histografía más abajo. Los resultados se ilustran en la Figura 5.
Ejemplo 6 Inhibición de la proliferación de células del cáncer de mamas Este ejemplo demuestra que el compuesto de fórmula I inhibe la proliferación de las líneas celulares del cáncer de mamas. Las líneas celulares T47D y HS-578T fueron cultivadas en presencia del suero y concentraciones del compuesto de fórmula I. La proliferación fue medida en placas de 96 brotes triplicados en por ensayo AlamarBIue® (Invitrogen). Los resultados del ensayo de proliferación se expresan en los valores del porcentaje del medio celular en la Figura 6.
Ejemplo 7 Inhibición de la proliferación de las líneas celulares del cáncer de ovarios Este ejemplo demuestra que el compuesto de fórmula I inhibe la proliferación de líneas celulares del cáncer de ovarios. Las líneas celulares IGROV-1 y OVCAR-3 fueron cultivadas en presencia del suero y concentraciones del compuesto de fórmula I. La proliferación fue medida en placas de 96 brotes triplicados en por ensayo AlamarBIue® (Invitrogen). Los resultados del ensayo de proliferación se expresan en los valores del porcentaje del medio celular en la Figura 7.
Ejemplo 8 Reducción de la fosforilación de Akt Este ejemplo demuestra que el compuesto de fórmula I reduce la proliferación constitutiva de Akt en las líneas celulares del tumor hematopoyético que exhibieron proliferación constitutiva de Akt. Un gran panel de líneas celulares de leucemia y linfoma se evaluó para la proliferación constitutiva de Akt. Estas líneas celulares representatn el linfoma-B, linfoma-T, ALL, histiocitosis maligna, DLBCL y AML. Las líneas celulares que demostraron la proliferación de Akt independiente al suero fueron tratadas con el compuesto de fórmula I por 2 horas. Luego, las células fueron Usadas, fraccionadas en tamaño e inmunotransferidas con anticuerpos dirigidos contra el fosfato-Akt (Ser473). Los resultados se ilustran en la Figura 8. La reducción del Akt (Ser473) se logró para todas las líneas celulares luego de la exposición al compuesto I.
Ejemplo 9 El compuesto I efectivo en DLBCL Este ejemplo demuestra que el compuesto I bloquea la señalización PI3K e induce la apoptosis en las células del linfoma difuso de células B grandes. P1105 se expresa en las líneas celulares DLBCL como se ilustra en la Figura 26A. La Figura 26B ¡lustra que la exposición al compuesto I reduce los niveles de pAKT en varias líneas celulares DLBCL.
Ejemplo 10 Inducción de la apoptosis en células del cáncer de mamas Este ejemplo demuestra que el compuesto de fórmula I induce la apoptosis en lineas celulares del cáncer de mamas. Las células HS-578T, T47D, y MCF7 fueron tratadas con el compuesto de fórmula I o concentraciones de DMSO correspondientes por 24h. El porcentaje de las células apoptóticas se determinó por coloración de la Anexina V-FITC/7AAD. Abajo a la izquierda, células viables (Anexina V-FITC/PI negativa); Abajo a la derecha, primeras células apoptóticas (Anexina V-FITC positiva solamente); Arriba a la derecha, células apoptóticas penúltimas (Anexina V-FITC/7AAD doble-positiva); y arriba a la izquierda, últimas células apoptóticas/necróticas (7AAD positiva solamente). Los porcentajes de células en cada cuadrante se indicant con excepción del cuadrante abajo a la izquierda (células viables). Un experimento representativo de los tres experimentos diferentes con resultados similares se ilustra en la Figura 10.
Ejemplo 11 Niveles de estado sanguine estable en el día 7 en voluntarios saludables Este ejemplo proporciona datos relacionados con la concentración del compuesto de fórmula I en la sangre de un sujeto humano saludable en el día 7. La concentración se controó por un periodo de 12 horas, luego de la administración por vía oral de 50, 100, o 200 mg BID del compuesto de fórmula I en el día 7 del estudio. La Figura 11 sigue la concentración de plasma en el fármaco por un periodo de 12 horas desde la administración. La máxima concentración de la droga se logró en dos horas para todas las dosis. La administración de 50, 100 o 200 mg BID de dicho compuesto resulta en un nivel de concentración que excede la concentración de ??3?d EC50 en basófilos por al menos 12 horas.
Además, se realizaron estudios de dosis individuales en los que 17-400 mg del compuesto de fórmula I se administró a voluntarles saludables. La concentración del compuesto en la sangre se midió por 24 horas desde la administración y los resultados se ilustran en la Figura 24A. A aproximadamente 6 horas, la concentración del compuesto I en la sangre para todas las dosis administradas es al menos de 100 nM. A aproximadamente 12 horas, la concentración del compuesto I en la sangre para la dosis de 50 mg y más es de más de 50 nM. La concentración máxima del compuesto I en la sangre se logra a las 2 horas de la administración.
En otro experimento, el compuesto I medio se midió a los 7 días de la dosifcación de 50 mg BID en voluntarios sanos (N=6). La concentración minima media fue mayor que EC50 para PI3K6 y el pico de la concentració media fue más bajo que EC50 para ??3?? conforme lo determinado en el ensayo de activación de basófilos en sangre completa, Figura 24B. Este ejemplo demuestra que el rango de concentración del compuesto I administrado a50 mg BID está a un nivel por encima del nivel de activación de basófilos ED50 PI3K5 pero por debajo del nivel mínimo de activación de basófilos ED50 ??3?? en la sangre completa por al menos 12 horas.
La Tabla 1, más abajo, proporciona una visión general de los sujetos en el estudio, donde ya sea una dosis individual (SD) o dosis múltiples (MD) del compuesto de fórmula I se administra a un sujeto en cantidades variadas. Los valores "n" se refieren a la cantidad de sujetos en cada grupo.
Tabla 1 Cohorte Régimen Compuesto I Placebo 1 (n = 8) SD 17 mg (n = 6) Placebo (n = 2) 2 (n = 8) SD 50 mg (n = 6) Placebo (n = 2) 3 (n = 8) SD 125 mg (n = 6) Placebo (n = 2) 4 (n = 8) SD 250 mg Placebo (n = 2) 5 (n = 8) SD 400 mg Placebo (n = 2) 6 (n = 8) MD 50 mg BID x 7 d Placebo BID x 7 d (n = 6) (n = 2) 7 (n = 8) MD 100 mg BID x 7 d Placebo BID x 7 d (n = 6) (n = 2) 8 (n = 8) MD 200 mg BID x 7 d Placebo BID x 7 d (n = 6) (n = 2) Ejemplo 12 Efecto en lesiones en un paciente con Linfoma de células del manto Este ejemplo proporciona datos relacionados con el área de lesiones de un paciente con linfoma de células del manto luego de 1 ciclo de tratamiento (28 días) con el compuesto de fórmula I. El área de 6 lesiones se midió antes del tratamiento y luego de un ciclo del tratamiento. La respuesta a los 28 días de la administración por vía oral de 50 mg BID del compuesto de fórmula I, resulta en una disminución del área de la lesión en comparación al área antes del tratamiento y representa un 44% de disminución de la carga tumoral. Los resultados se resumen en un gráfico de barras en la Figura 12.
Ejemplo 13 Respuesta de un paciente con CLL al tratamiento Este ejemplo proporciona datos relacionados con la concentración del conteo absoluto de linfocitos (ALC) en la sangre de un paciente con CLL luego de 1 ciclo (28 días) del tratamiento con administración del compuesto de fórmula I por vía oral. La concentración de ALC en la sangre se midió por un periodo de 4 semanas después de haber completado un ciclo del tratamiento. Se observó una disminución del 55% de linfocitos y una dismiución del 38% de la linfadenopatía como resultado del tratamiento. Una marcada disminución de la concentración de ALC se observe entre las semanas 1 y 2, Figura 13.
Ejemplo 14 Comparación de un paciente con linfoma v voluntarios sanos Este ejemplo proporciona datos comparando la concentración del compuesto de fórmula I en un paciente con linfoma y voluntarios sanos. En el día 28 día de la administración por vía oral de 50 mg BID del compuesto a un paciente con linfoma de células del manto, la concentración del compuesto en la sangre se midió por un periodo de 6 horas después de la administración. tasmbién se observó la concentración de 50 y 100 mg administrada por vía oral en voluntarios sanos en el día 7 de la administración. Los resultados se resumen en la Figura 14. Por lo tanto, el compuesto no se acumula en exceso durante el curso de un ciclo del tratamiento, ni el paciente se vuelve tolerante por aumento del metabolism durante el curso del ciclo del tratamiento.
Ejemplo 15 Actividad del compuesto I en varias quinasas Este ejemplo ilustra el perfil IC50 del compuesto I en varias clases de quinasas conforme se resume en la Tabla 2. Aunque especialmente activo en ?110d, el compuesto I también estuvo active en p 110 ? y hasta lo suficientemente activo para ser terapéuticamente útil en dosis no tóxicas contra ?110ß, debido al alto nivel de NOAEL demostrado en el compuesto; al mismo tiempo exhibió poca actividad en quinasas fosfoinositidas de Clase ll-V. Por lo tanto, aún al ser selectivo delta, los compuestos pueden exhibir suficiente actividad en p 110 ? para ser clínicamente útiles, es decir, para ser efectivos en un cáncer que se sustenta en p 110 ? para señalizar, ya que un nivel de plasma por encima de la dosificación efectiva para la inhibición de p 110 ? puede logarse cuando aún es selectivo con relación a otras isoformas, particularmente la isforma alfa.
Tabla 2 Ensayo InvitroGen Adapta *ND = no determinado Ejemplo 16 Ninguna actividad fuera del objetivo identificado del compuesto I in kinome-wide protein kinase screen Este ejemplo demuestra que el compuesto I tiene poca o ninguna actividad fuera del objetivo identificado en a kinome-wide protein kinase screen. Using Ambit Kl NOMEscan™ a genome wide screen of over 350 protein kinases no detectó actividad alguna a 10 µ?. Ejemplos de algunas quinasas in the screen se ilustran en la Tabla 3 más abajo.
Tabla 3 emplos de quinasas relevantes en pantall ABL FGFR1 JAK1 P38MAPK S6K AKT VEGFR1 JAK2 PDGFR SLK ALK FLT3 JNK1 PIM SRC BLK FRK KIT PKA SYK BRAF FYN LCK PKC TAK BTK HCK LYN PLK TIE EGFR IGF1-R MET ROCK YES EPH ITK MLK ROS ZAP70 Ejemplo 17 Selectividad del compuesto I para p110 delta Este ejemplo demuestra que el compuesto I es selectivo para p 110 delta conforme se midió en ensayos a base de células de isoformas específicas.
Fibroblastos Swiss-3T3 y RAW-264 se inocularon en una placa de cultivo de tejido en 96 brotes y se permitió que alcanzaran al menos 90% de confluencia. Las células fueron privadas y tratadas con diluciones del vehículo o serie del compuesto I por 2 hrs y estimuladas con PDGF o C5a respecti amente. La fosforilación de Akt y el total de AKT se detectaron a través de ELISA. Células B purificadas fueron tríadas con diluciones del vehículo o serie del compuesto I por 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar el IgM de cabra antihumano. Los resultados se expresan como incorporación relative de [3H] tiamidina inducida por la reticulación IgM.
Tabla 4 ??3?a PI3K5 PI3Ky EC50 (nM) EC50 (nM) EC50 (nM) Línea cellular de Células B Línea cellular de fibroblastos primarias monocitos PDGF inducido Proliferación C5a inducido pAKT pAKT mediada por BCR >20,000 6 3,894 (n = 12) (n = 6) (n=11) Ejemplo 18 Expresión de p 110 delta en líneas celulares de leucemia y linfoma Este ejemplo demuestra que PI3K p 110 delta se expresa altamente en un amplio rango de líneas celulares de leucemia y linfoma.
PI3K ?110d promueve la proliferación y supervivencia de un amplio rango de líneas celulares de leucemia y linfoma. Entre los tipos de células investigados se encuentran MCL, DLBCL, AML, ALL, and CML.
La expression de PI3K p 110 a, ß, ? y d en un panel de líneas celulares de linfoma y leucemia se demuestra en la Figura 15. Proteínas de células 106 fueron separadas por SDS-PAGE y analizadas por Western blot utilizando anticuerpos específicos para isoformas a, ß, ? y d. Proteínas recombinantes purificadas p 110 se utilizaron como controles. Anticuerpos antí-actin se utilizaron para evaluar muestras de cargas iguales. ?110d se expresó de manera consistente a un nivel elevado mientras que otras isoformas p 110 fueron altamente variables. Se sabe que PI3K p 110d se expresa uniformemente en células de pacientes con AML conforme lo manifestado por Sujobert, eí al., Blood 2005 106(3), 1063-1066.
Ejemplo 19 Efecto inhibitorio del compuesto I en p110 delta El Ejemplo 19 muestra la inhibición del compuesto I del p110 delta que bloquea la señalización P13K en las líneas celulares de leucemia y linfoma con una activación constitutiva de la vía.
La vía PI3K se desregula con frecuencia en las líneas celulares de leucemia y linfoma. Se determinó que 48% de las líneas celulares, o 13 de 27, tienen p-AKT constitutivo. Además, la activación de la vía PI3K depende de ?110d. Se determinó que el compuesto I inhibe la fosforilación constitutive de AKT en 13 de 13 líneas celulares.
Los resultados PAGE en la Figura 9 demuestran que la fosforilación constitutive de AKT se inhibió por la presencia del compuesto I en cada una de las 11 líneas celulares, incluyendo linfomas de células B y células T. Las células incubaron por 2 hs con 10 µ? del compuesto I. Los lizados celulares se realizaron en SDS-PAGE y se transfirieron a la membrana PDVF y se probaron con anticuerpos adecuados. Se determinó que el compuesto I inhibe la fosforilazión constitutiva de AKT en 11 de 11 líneas celulares. Datos adicionales de las líneas celulares para las líneas T-ALL y B-ALL se ilustran en la Figura 27. Una reducción en la fosforilación de Akt y S6 luego de la exposición a un rango de concentraciones del compuesto I (0.1 µ? to 10 µ?), se cuantificó por densimetría, expresada en el cambio de porcentaje, Figura 28.
Ejemplo 20 El compuesto I inhibe la proliferación y apoptosis en las líneas celulares de la laucemia El Ejemplo 20 muestra que el compuesto I inhibe la proliferación e induce apoptosis en células de leucemia. Las Figuras 16A-B muestran que el tratamiento con el compuesto I por 24 horas reduce la viabilidad celular en una manera dependiente de la dosis.
Ensayos de proliferación (AlamarBIue®) en líneas celulares ALL fueron cultivadas en presencia del 10% del suero FBS y las medidas se tomaron a las 24 hs. La proliferación se midió brotes triplicados en placas de 96 brotes. La inhibición de PI3K señalizada por el compuesto I resultó en un bloque de progresión del ciclo celular, y/o la muerte de las células. En cada 6 líneas celulares de leukemia, la variabilidad se redujo 40-50% con 10 concentraciones micromolares del compuesto i, Figura 16A.
Inducción de apoptosis por el compuesto I. Las células fueron tratadas con DMSO (vehículo), 1 µ? o 10 µ? del compuesto I por 24 hrs. El porcentaje de células apoptoticas se determinó por la coloración de la Anexina V-FITC/7AAD. Un experimento representativo de diferentes experimentos con resultados similares se ¡lustra en la Figura 16B.
Ejemplo 21 Expresión de p 110 delta en células CLL Este ejemplo demuestra la expresión de la isoforma PI3K ?110d y p 110 d en pacientes con células CLL.
Vías de señalización mediadas por PI3K se han implicadas en CLL. Estas vías tienen un rol en la proliferación celular, prevención de apoptosis y migración celular. Se realizaron esfuerzos para determinar la expression de la isoforma PI3K en células de pacientes con CLL.
La demografía de pacientes con CLL se resume a continuación en la Tabla 5.
Tabla 5 Demografía de pacientes con CLL (Total (N = 24) I) Anormalidades citogénicas 13q14.3 58% 11q22.3 33% 17p13.1 20% Trisomia 12 12% II) Historial del tratamiento Fludarabina resistente 29% Desconocido 54% II) Estado de IgVH Mutado 33% No mutado 33% Desconocido 33% Las imágenes PAGE de la Figura 17A-D comparan la expression de ?110a, ?110d, p 110 ß , y ?110? en células CLL de los pacientes A-E. p 110d y p 110 ? se expresan en cada paciente comparados a otras isoformas PI3K.
Ejemplo 22 El compuesto I induce a la división de la caspasa 3 v PARP Este ejemplo demuestra que el compuesto I indujo la división de la capasa 3 y PARP. Las Figuras 18A-B ilustran los resultados de la división de la capasa 3 y PARP (Poli(ADP) Ribosa Polimerasa) en presencia de 1, 10 µ? del compuesto I o 25 µ? de LY294002.
Además los experimentos demuestran que el compuesto I induce a la división de la capasa 2 y PARP. Las células fueron cultivadas con el compuesto I o vehículo solo por 24 horas. Por lo tanto, las células fueron Usadas y su tamaño fue fraccionado e inmunotransferidos con anticuerpos dirigidos contra FLIP, Figura 29. Adícionalmente, lisados de células completas se agregaron al MDS (Meso Scale Diagnostics) placas de 96 brotes múltiples recubiertas con el total de capasa-3, capasa-3 dividía, PARP dividido y BSA. Las proteínas se detectaron con anticuerpos marcados y cuantif ¡cados con reactivos SULFO-TAG. Una respuesta dependiente de la dosis en la división de la capasa 3 y PARP se logró luego de la exposición a 5 o 10 µ? del compuesto I.
Ejemplo 23 El compuesto I bloquea la señalización de PI3K Este ejemplo demuestra que el compuesto I bloquea la señalización de PI3 en pacientes con células AML. ??3?d está implicada en la señalización en pacientes con células AML. La Figura 21 ilustra los resultados de la producción de fosfo-Akt en ausencia o presencia de 0.1, 1.0, 10 µ? del compuesto I. Esto demuestra que el compuesto I reduce la producción de fosfo-Akt en pacientes con células AML.
Ejemplo 24 Medición de la señalización de PI3K en basófilos encontrados en sangre completa Este ejemplo demuestra un ensayo de sangre complete para medir la señalización de P13K en basófilos utilizando la citometría de flujo por inducción de la expresión de superficie de CD63.
La inhibición de la señalización de PI3K en basófilos permite que el compuesto I sea un marcador farmacodinámico útil. La señalización de PI3K se monitorea por la expresión de superficie de CD63. Particularmente, ?110d media la señalización de FCER1 y ?110? media la señalización del receptor fMLP. El análisis de la citometría de flujo de PI3K medió la expresión de CD63 en basófilos que comprenden las siguientes etapas secuenciales: Recolectar sangre periférica Estimulación de basófilos (fMLP o Anti-FCeR1 Mab) Marcar los basófilos (Anti-CCR3-FITC y Anti-CD63-PE) Lisar y fijar las células Análisis de la citometría de flujo La Figura 22A-C compara los resultados de A) la no estimulación, B) la estimulación con Anti-FC R1, o C) la estimulación con fMLP.
La Figura 23 ilustra que el compuesto I es especialmente active donde la señalización mediada por ?110d es más importante, pero también es relativamente activo donde se utiliza ?110?: logró una reducción del 50% en la expresión SD63 a << 1 µ? para la prueba p 110 d , y ca. 10 µ? para la prueba p 110 ?. La activación de basófilos se midió en sangre humana complete utilizando el kit Flow2 CAST® kit. Las muestras de sangre complete fueron tratadas con diluciones del vehículo o series del compuesto I antes de la activación de los basófilos ya sea con anti-FceRI mAb o fMLP. Las células fueron sometidas a coloración con la combinación de CD63-FITC anti-humano y CCR3-PE mAbs anti-humano. El porcentaje de células positivas CD63 en la población cerrada de basófilos se determinó en diferentes grupos del tratamiento y normalizó el vehículo de control.
Ejemplo 25 El compuesto I reduce la linfadenopatía en pacientes con CLL Este ejemplo demuestra la reducción del tamaño de una linfadenopatía voluminosa en un paciente con CLL con del[17p]. Un paciente con del(17p) tenía una linfadenopatía axilar, que fue retratada por la tomografía com putarizada (CT) para proporcionar una línea de base para la medida de 5.9 cm x 4.1 cm, Figura 40A. Luego de un ciclo del tratamiento con el compuesto I, la linfadenopatía se redujo a una dimensión de 3.8 x 1.8 cm, Figura 40B. Un ciclo de tratamiento fue de 28 días de continua dosificación por vía oral a 200 mg BID o 350 mg BID del compuesto I.
Ejemplo 26 Efecto limitado del compuesto I en los niveles de glucosa e insulina en un sujeto Este ejemplo demuestra que el tratamiento con el compuesto I tiene poco o ningún efecto en los niveles de glucosa e insulina. El compuesto I se administró en cantidades de 50-200 mg de BID a un sujeto por un periodo de 10 días. Las concentraciones de glucosa e insulina en la sangre se midieron después de un tiempo y fueron comparadas a los resultados del placebo como se ilustra en las Figuras 25A-B.
La concentración de glucosa en la sangre permaneció estable después de 10 días de tratamiento con aún la dosificación más alta del compuesto I. Los niveles de insulina permanecieron dentro del rango normal después de 7 días de tratamiento con el compuesto I. Esto demuestra que el compuesto I tiene poco o ningún efecto en los niveles de glucosa e insulina.
Ejemplo 27 Materiales y métodos Este ejemplo proporciona information sobre materiales y métodos para realizar los experimentos descritos en los Ejemplos 28-35 relacionados al uso del compuesto I en el tratamiento de mieloma múltiple.
Materiales El compuesto inhibidor I y el compuesto inhibidor II de p 110d fueron proporcionados por Calistoga Pharmaceuticals, (Seattle, WA). La muestra del compuesto I y II utilizada fue más del 95% del enentiómero S. El compuesto I se disolvió en sulfóxido de dimetilo a 10 mM y fue almacenado a -20°C para un estudio in vitro. El compuesto II se disolvió en 1% de carboxilmulticelulosa (CMC)/0.5% Tween 80 y fue almacenado a 4°C para un estudio In vivo. Los recombinantes humanos ?110a, ß, ?, y d fueron reconstituidos con agua estéril tamponada con fosfato salino (PBS) conteniendo 0.1% BSA. Bortezomib fue proporcionado por Millennium Pharmaceuticals (Cambridge, MA). 3-Metiloadenina fue comprada de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cultivo celular Líneas celulares MM sensibles a Dex (MM.1S) y resistentes (MM.1R) fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Steven Rosen (Northwestern University, Chicago, IL). Las líneas celulares MM humanas H929, RPMI8226, y U266 fueron obtenidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Líneas celulares resistentes a Melfalán RPMI-LR5 y Doxorubicina (Dox) RPMI-Dox40 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. William Dalton (Lee Moffitt Cáncer Center, Tampa, FL). Células plasmáticas OPM1 de células de leukemia fueron proporcionadas por el Dr. Edward Thompson (University of Texas Medical Branch, Galveston). La línea celular MM INA-6 humana dependiente de IL-6 fue proporcionada por el Dr. Renate Burger (University of Kiel, Kiel, Germany). La línea celular MM LB humana fue establecida en el laboratorio. El análisis fenotípico no reveló anormalidades citogenéticas. El análisis fenotípico se ilustra en la Tabla 6. El perfil de expresión CD de la línea celular LB, se define por el análisis de citometría de flujo.
Tabla 6 LB expression CD marker % expression CD3 5.5 % CD19 61.7% CD20 97.2 % CD38 54.1 % CD40 96.8 % CD49e 5.9 % CD70 98.0 % CD138 96.3 % Todas las líneas celulares de MM fueron cultivadas en un medio RPMI1640. Las células estromales de médula ósea (BMSCs) fueron cultivadas en la modificación de Dulbecco del medio de Eagle (DMEM) (Sigma) conteniendo 15% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina (Life Technologies), 100 U/mL penicilina, y 100 pg/mL estreptomicina (Life Technologies). Las muestras de sangre recolectadas de voluntarios sanos fueron procesadas por la gradiente Ficoll-Paque™ para obtener células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMNC). Células de pacientes con MM y BV se obtuvieron de muestras BM luego del consentimiento obtenido por la Declaració n de Helsinki y la aprobación del Consejo Institucional de Revisión del Insituto del Cáncer Dana-Farber (Boston, MA). Las células BM mononucleares fueron separadas utilizando la densidad de sedimentación Ficoll-Paque™ y las células plasmáticas fueron purificadas (>95% CD138 + ) por selección positiva con microesferas magnéticas de separación de células activadas con anti-CD138 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las células tumorales también fueron purificadas del BM de pacientes con MM utilizando el sistema de selección negativo RosetteSep (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá).
Ensayo de inhibición del crecimiento El efecto inhibitorio del crecimiento del compuesto I sobre el crecimiento de las líneas celulares MM, PBMCs, y BMSCs se evaluó midiendo la absorción de la coloración 3-(4,5-dimetilothiazol-2-yl)-2,5-difenil tetra-sodio bromuro (MTT; Chemicon International, Temecula, CA).
Effecto del compuesto I en el crecimiento celular de paracrina MM en el BM Las células MM (2 x 104 células/brote) se cultivaron por 48hs en placas de 96 brotes recubiertos de BMSC (Costar, Cambridge, MA), en presencia o ausencia del fármaco. La síntesis del AND se midió por absorción de [3H]-timid¡na (Perkin-Elmer, Boston, MA) con [3H]-timidina (0.5 µ Ci/brote) agregada durante las últimas 8 horas de las 48 horas de cultivo. Todos los experimentos se realizaron en cuadruplicados.
Caída transitoria de la expresión de P1105 Las células INA-6 y LB fueron transitoriamente transfectadas con siRNA ON-TARGET más SMART grupo P1105 o dúplex de control no específico (Dharmacon Lafayette.Co) utilizando el Kit Nucleofector de Línea Celular (Amaxa Blosystems Gaitherburg.MD).
Inmunofluo res cencía Células MM viables (2.5 X 104) fueron sedimentadas en laminas de vidrio por centrifugación a 500 rpm por 5 minutos utilizando un sistema de citospina (Thermo Shandon, Pittsburgh, PA). Las células se fijaron en acetone y metano absolutamente fríos por 10 min. Siguiendo la fijación, las células se lavaron en buffer fosfato salino (PBS) y luego se bloquearon por 60 min con 5% FBS en PBS. Las laminas luego fueron incubadas con anticuerpos anti-CD138 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a 4°C por 24hs, lavadas en PBS, incubadas con with goat anti-mouse IgG por 1h a 4°C, y analizadas utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon E800.
Detección y cuantif icación de Orgánulos Vesiculares Ácidos (AVO) con coloración de acridina naranja.
La autofagia se caracterizó por la secuencia de proteínas citoplásmicas y el desarrollo de AVOs. Para detectar y cuantificar los AVOs en el compuesto I o células tratadas con 3MA, se realizó una vital coloración por 15 min con acridina naranja a una concentración final de 1 pg/ml. Las muestras se exminaron bajo un microscopio de fluorescencia.
Ensayo de Angiogenesis La actividad anti-angiogénica del compuesto I se determinó utilizando un Kit de Ensayo de Angiogenesis in vitro (Chemicon, Temecula, CA). HUVEC y el medio de crecimiento endothelial se obtuvieron de Lonza (Walkersville, MD, USA). HUVEC fueron cultivadas con el compuesto I sobre una matriz de gel polimerizado a 37°C. Después de 8hs, la formación del tubo se evaluó utilizando un microscopio Leika DM IL (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) y se analizó con un software IM50 (Leica Microsystems Imaging Solutions, Cambridge, UK). Se observe la migración y redisposición de células HUVEC y se contó la cantidad de puntos ramificados.
Western blotting Las células MM se cultivaron con o sin el compuesto I; recolectadas; lavadas; y Usadas utlizando un búfer de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA), 2 mM Na3V04, 5m M NaF, 1 mM fluoruro de fenilmetilosulfonyl (5 mg/ml). Lisados de células enteras estuvieron sujetos a separación por SDS-PAGE, transferidas a membranas de Nitrocelulosa Pura (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), e inmunotransferidas con anti-AKT, fosfo(p)-AKT (Ser473, Thr 308), ERK1/2 , P-ERK1/2, P-PDK1 , STAT, P-STAT, P-FKRHL, P-70S6K, LC3, y PI3K/p110 a Abs (Cell Signaling Danvers, MA); anti-p110ß, ??3?/?110d, Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), a-tubulin, y actin Abs (Santa Cruz Biotechnology, CA); y anti-p 110 ? Ab (Alexis, San Diego, CA): y anti-LC3 Ab (Abgent, San Diego, CA).
ELISA La secreción de citocinas por BMSCs humanos cocultivadas con células MM se evaluaron por medio de ELISA. Las BMSCs se cultivaron en placas de 96 brotes con concentraciones variadas del compuesto I, con o sin células INA-6. Después de 48 hs, se recolectaron sobrenadantes y fueron almacenados a -80°C. Las citocinas se midieron utilizando Dúo set ELISA Development Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todas las medidas se realizaron en triplicado.
Variedad de citocinas humanas Los niveles de citocina en sobrenadantes cultivados fueron evaluados utilizando el Panel A de Ensayos de Perfil de Anticuerpos (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los sobrenadantes de co-cultivos con BMSCs se incubaron por 4 horas con membranas formadas con Abs contra 37 citocinas, de acuardo con las instrucciones del fabricante.
Modelos de xenoinjertos murinos de MM humano Las ratas CB17 SCID (48-54 días de edad) fueron adquiridas de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Todos los estudios animales fueron conducidos de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Etica Animal del Instituto del Cáncer Dana-Farber. Las ratas fueron inoculadas subcutáneamente en el lado derecho con células LB 3X106 en 100 µ? RPMI-1640. Cuando los tumores fueron palpables, las ratas fueron asignadas a los tratamientos grupales recibiendo gavages de 10 mg/kg o 30 mg/kg dos veces al día; y 7 ratas en el grupo de control recibieron solo el vehículo. Las mediciones de Caliper de los diámetros tumorales perpendiculares más largos se realizaron día de por medio para estimar el volumen utilizando la siguiente fórmula representando el volumen 3D de una elipse: 4/3 X (ancho/ 2)2 X (longitud/2). Los animales fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 2 cm or las ratas se veían moribundas. La supervivencia fue evaluada desde el primer día del tratamiento hasta la muerte. El crecimiento tumoral fue evaluado utilizando medidas de capier desde el primer día del tratamiento hasta el día del primer sacrificio, el cual fue el día 12 para el grupo de control y los días 17 y 19 para los tratamientos grupales. Las imágenes se capturaron con una cámara canon digital IXY 700. El análisis ex vivo de las imágenes tumorales se capturó con un microscopio LEICA DM IL y una cámara LEICA DFC300 FX a 40u/0.60 (Leica, Heidelberg, Germany).
Injertos óseos humanos fueron implantados en ratas CB17 SCID (SCID-hu). Cuatro semanas después de la implantación ósea, células INA 2.5 X 106 fueron inyectadas directamente en la cavidad humana BM en el injerto con un volumen de 100 µ? del medio RPMI-1640. Un aumento en los niveles de del receptor humano soluble IL-6 (shulL-6R) de células INA-6 se utilize como indicador del crecimiento celular MM y carga de la enfermedad en ratas SCID-hu. Las ratas desarrollaron suero medible shulL-6R aproximadamente 4 semanas después de la inyección celular INA-6, y luego recibieron 10 o 30mg/kg de fármaco o vehículo solo diariamente por 7 semanas. Se recolectaron y evaluaron muestras de sangre para niveles shulL-6R utilizando un ensayo de inmunoabsorción ligado a la enzima (ELISA, R&D Systems. Minneapolis MN).
Análisis estadístico La importancia estadística se determina con pruebas de comparación múltiple de Dunn. El nivel mínimo de significancia fue p<0.05. La supervivencia se evaluó utilizando curvas de Kaplan-Meier y análisis de rangos logarítmicos. El efecto combinado del compuesto I y bortezomib se analizó por análisis de isobolograma utilizando el programa CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO)¡ un índice de combinación (Cl) <0.7 indica el efecto sinérgico.
Ejemplo 28 Expresión dep110 delta en células MM Este ejemplo demuestra que p110 delta se expresa en forma elevada en células MM de los pacientes. Para evaluar la expresión PI3K/p110, Abs se utilize contra proteínas recombinantes humanas ??3?/?110a, ß, ?, y d con inmunoreactividad específica contra estas isoformas. Se evaluó la expression de ?110d en 11 líneas celulares MM (MM.1 S, OPM1, OPM2, RPMI8226, DOX40, LR5, MM.1 R, U266, INA-6, H929, y LB), así como 24 muestras de pacientes con MM y los inmunoblots ilustrados en las Figuras 30A y 30B. La Figura 30A ilustra la expresión de ?110-a,-ß, -?, y -d en líneas celulares MM detectadas por inmunoblot utilizando anticuerpos específicos. Anti-a-Tubulin MAb sirvió como control de carga. ?110d en células de pacientes con MM se detectó po inmunoblot utilizando anti-P1106 Ab (Figura 30B).
Anti-GAPDH MAb sirvió como control de carga. Células INA-6 y LB expresaban con fuerza ?110d, mientras que MM.1S, OPM1, MM.1 R, Dox40, U266 o H929 no tenían expresión de ?110d (Figura 30A).
La expresión ?110d en células MM.1S y LB se confirmó con un análisis de inmunofluorescencia (Figura 30C). Proteínas recombinants humanas P110-a,-ß,-?,-d en búferes de muestras de SDS se calentaron por 3 min antes de cargar el gel. (10-20 pg por vía.) Proteínas recombinants humanas P110-a,-ß,-?,-d se detectaron un análisis de inmunoblot. Los niveles de P110 d se midieron en células MM1S y LB utilizando P110 d específico FITC que conjuga anticuerpos secundarios. ?110d se sometió a coloración verde y los ácidos nucleicos (DAPI) se sometieron a coloración azúl.
Western blotting no reveló correlación entre la expresión ?110d y la expresión de otras isoformas (a, ß y ?). Cabe destacar que todos los pacientes con células MM también expresaron p110d, (Figura 30B).
Ejemplo 29 Citotoxicidad del compuesto I en células MM Este ejemplo demuestra que el compuesto I tiene citotoxicidad selectiva contra las células con ?110d. Específicamente, el compuesto I indujo potencialmente la citotoxicidad en p 110 delta positive de células MM como brote en células primarias MM en los pacientes sin citotoxicidad en células sanguíneas mononucleares periféricas de donantes sanos, lo que sugiere un índice terapéutico favorable.
El efecto inhibidor del crecimiento de ?110d decayó en células MM evaluadas. Las células LB y INA-6 fueron transfectadas con P1105 siRNA (Si) o control siRNA (simulacro). Luego de 24hs, la expresión de P110 d se determinó por el análisis western blot analysis, ver Figura 31A. Las células INA-6 fueron transfectadas con ?110d siRNA o control siRNA, y luego cultivadas por 72 horas. El crecimiento celular se evaluó mediante el ensayo MTT, ver Figura 31 B. Los datos indican un medio ± SD de cultivos triplicados, expresados en pliegues de control. La transfección con ?110d siRNA, pero no la simulación siRNA, redujo la regulación de ?110d e inhibió el crecimiento de células MM a 72 hs (Figuras 31A y 31 B). Se evaluó el efecto inhibidor del crecimiento de ?110d de líneas celulares MM específicas inhibidoras de moléculas pequeñas, PBMCs, y células MM en pacientes.
El compuesto I indujo la citotoxicidad contra las células LB y INA-6 MM (p110d-positivo) en forma dependiente de la dosis y tiempo; en contraste, se notó una citotoxicidad mínima en líneas celulares negativas ?110d (Figura 31C). La leyenda para la Figura 31C: células LB (?), INA-6 (?), RPMI 8226(o), OPM2 (O), H929 ( • ), U266 (*),RPMI- LR5 (A) y OPM1 (¦) MM se cultivaron con o sin el compuesto I por 48hs.
Cabe destacar que el compuesto I también indujo la citotoxicidad contra las células en pacientes con MM (Figura 31D), sin citotoxicidad en PBMCs de 4 voluntarios sanos a concentraciones hasta 20 µ? (Figura 31E). Las células MM de los pacientes, aisladas de BM por selección negativa se cultivaron con el compuesto I por 48hs. Las células sanguíneas mononucleares periféricas aisladas de donantes sanos se cultivaron con el compuesto I por 72 hs. Los datos representan la viabilidad del medio ± SD, evaluados mediante el ensayo MTT de cultivos triplicados, expresados como porcentajes de controles no tratados. Estos resultados sugieren significativamente que la sensibilidad al compuesto I está asociada con la expresión ?110d y sugieren una ventana terapéutica favorable.
Para determinar si la citotoxicidad inducida por el compuesto I es vía apoptosis, se examinó la división de capasas y PARP por medio del analysis western blot. Las células INA-6 se cultivaron con el compuesto I (0-5µ?) por 120 hs. El lisado total de células estuvo sujeto a inmunoblotting utilizando anti-capasa-3, -8, -9, PARP, y a-tubulin Abs. FL indica una proteína de longitud completa, y CL indica la proteína dividida. Se observó un aumento significativo de la división de la caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3, y PARP en las células INA-6 MM tratadas con el compuesto I por 120 hs (Figura 31F). Estos resultados indican que la citotoxicidad activada por el compuesto I es mediada, al menos en parte, a través de la apoptosis dependiente de la capasa (intrínseco y extrínseco).
Ejemplo 30 Inhibición de la proliferación de AKT y ERK por el compuesto I Este ejemplo demuestra la inhibición de la fosforilación de AKT y ERK por el compuesto I.
Un importante efecto descendiente de PI3K es la proteína quinasa serina/treonina AKT, activada por la fosforilación de Thr308 en el lazo de activación del dominio de la quinasa y Ser473 en la cola de la terminal C. La fosforilación de ambos sitios require una interacción entre el dominio de homología pleckstrin de la terminal N de AKT y el fosfoinosítido de la membrana generado por PI3K. Se ha demostrado que el compuesto I inhibe ambos dominios, lo que sugiere que P1105 es la isoforma predominante responsibie de la señalización PI3K en las líneas celulares MM.
Se examinó la inhibición de las vías de AKT y ERK en las células INA-6 por el compuesto I. Las células INA-6 se cultivaron con el compuesto I o LY294002 por 12 hs, Figura 32A. Se utilizó Actin Ab como control de carga. Las células INA-6 y MM.1S fueron cultivadas con el compuesto I (0,0.25, 1.0,5.0 µ?) por 6 horas, Figura 32B. Las células LB y INA-6 fueron cultivadas con el compuesto I por 0-6 horas, Figura 32C. Lisados de células completas fueron sometidas a inmunoblotting utilizando anticuerpos AKT, P-AKT (Ser473 y Thr308), ERK1/2, P-ERK1/2, P-PDK1, y P-FKRHL. a-tubulin se utilizó como control de carga.
El compuesto I bloqueó significativamente la fosforilación de AKT y ERK1/2 en ?110d células positivas INA-6 (Figura 32A), pero no afectó la fosforilación de AKT o ERK en células M.1S con baja expresión de P110Ó (La Figura 32B). El compuesto I también inhibió significativamente la fosforilación del aumento de PDK-1 y la reducción de FKHRL en células INA-6 y LB MM de manera dependiente de la dosis y el tiempo (Figura 32C), además confirmó la inhibición de las vías PI3K/AKT y ERK en estas células.
Ejemplo 31 El compuesto I induce al desarrollo v autofagia de AVO Este ejemplo demuestra la capacidad del compuesto I para activar la apoptosis y la autofagia.
AKT regula la autofagia, por lo que la investigación del compuesto I para inducir la autofagia en células LB y INA-6 MM no se realizó.
Las células INA-6 y LB MM fueron tratadas con 5 µ? del compuesto I por 6hs. El tratamiento con el compuesto I indujo a la acumulación de LC3 en células LB y INA-6, demostrado con un microscopio de fluorescencia o un microscopio de transmisión electrónica. La formación de autofagosomas se definió por la acumulación de LC3; las flechas indican los autofagosomas, Figura 33A.
Las células INA-6 fueron tratadas con 5 µ? del compuesto I o privación de suero por 6 horas, sometidas a coloración con 1 g/mL de acridina naranja por 15 min, y analizadas con un microscopio de fluorescencia, Figura 33B.
Los niveles de proteína de LC3 beclin-1 se determinaron por medio de western blotting utilizando anticuerpos de lisados LC3 y beclin-1 de células INA-6 cells tratadas con el compuesto I, con o sin 3-MA, Figura 33C. GAPDH sirvió como control de carga.
El análisis de inmunofluorescencia mostró un marcado aumento de coloración de LC 3 en células INA-6 y LB activada por el tratamiento con el compuesto I (5µ?, 6 h) (Figura 33A). El análisis de microscopía electrónica mostró un aumento de vacuolas autofágicas (flechas) en células MM tratadas con el compuesto I. Ya que la autofagia se caracteriza por el desarrollo de orgánulos vesiculares ácidos (AVO), se realizó la coloración con acridina naranja. Conforme se ilustra en la Figura 33B, la coloración vital con acridina naranja reveló el desarrollo de AVOs en células LB e INA tratadas con el compuesto I. Además, se detectó un marcado aumento de las proteínas LC3-II y en células INA-6 MM después de 6 hs de tratamiento con el compuesto I, bloqueado por el inhibidor autofagico 3-MA (Figura 33C). 3-MA no indujo citotoxicidad en células INA-6 y LB a concentraciones hasta 100 µ?, Figura 33D. P110 d células positivas LB ( ? ) fueron tratadas con 3-MA (0-100 µ?) por 24hs. Los datos representan el medio (±SD) de cultivos triplicados.
Estos resultados indicant que compuesto I induce el desarrollo de VOs y autofagia en más temprano que la división de capasa/PARP.
La autofagia degrade los componentes celulares, recicla constituyentes celulares y responde a varias tensiones celulares.
En este ejemplo, LC3-II, una autofagia característica, es inducida por el tratamiento con el compuesto I en p110 d positivo de líneas celulares MM. Cabe destacar que el tratamiento con el compuesto I resulta en un marcado aumento en la autofagia, demostrado por el porcentaje de vacuolas autofágicas en el citoplasma, formación de AVOs, asociación de la membrana de la proteína asociada con microtúbulos de LC3 con autofagosomas, y una marcada inducción de la proteína LC3-II. El análisis de microscopía electrónica confirmó que el compuesto I indujo autofagosomas. LC3-II se expresó a través de la conversión de LC3-I. Por el contrario, la autofagia inducida por el compuesto I fue suprimida por 3-MA, un inhibidor específico de la autofagia. Estos estudios sugieren que los efectos citotóxitos tempranos del compuesto I están asociados con la autofagia.
Ejemplo 32 El compuesto I inhibe el crecimiento celular en presencia de BMSC Este ejemplo demuestra la capacidad del compuesto I para inhibir el crecimiento celular paracrine MM con BMSCs.
Debido a que IL-6 y IGF-1 inducen al crecimiento y anti-apoptosis en células MM, el compuesto I fue examinado para superar los efectos de estas citocinas en las células INA-6 y LB. Las células LB y INA-6 se cultivaron por 48hs con medio de control ( ¦ ); o con el compuesto I a 5.0 µ? ( ) o 10 µ? ( ? ), en presencia o ausencia de IL-6 (1 y 10 ng/ml), Figura 34A, o IGF-1 (10 y 100 ng/mL), Figura 34B. La síntesis del AND se determine midiendo la incorporación [3H]-timidina durante las últimas 8hs de las 72hs de cultivo. Los datos reprsentan medios (±SD) de cultivos triplicados. Ni IL-6 ni IGF-1 protegieron contra la inhibición del crecimiento inducido por el compuesto I (Figura 34A y 34B).
El microambiente BM confiere prolifereación y resistencia al fármaco en MM, por lo tanto se analizó el efecto inhibidor del crecimiento de células MM del compuesto I en presencia de BMSCs.
Células LB y INA-6 MM se cultivaron por 48hs con el medio de control ( ? ), y con 2.5 µ? ( ), 5 µ? (¾), y 10 µ? (¦ ) del compuesto I, en presencia o ausencia de BMSCs, Figura 34C. La síntesis del AND se determine por la incorporación de [3H]-timidina. Los datos representan medios (±SD) de cultivos triplicados.
IL-6 en cultivos supernadantes de BMSCs tratados con el compuesto I (0-2.5 µ?) se midió por medio de ELISA, Figura 34D. Las barras de error indican SD (±).
BMSCs se cultivaron con 1.0 µ? del compuesto I o medio de control por 48hs; las citocinas en cultivos supernadantes se detectaron utilizando matrices de citocinas, Figura 34E.
Células INA-6 cultivadas con o sin BMSCs fueron tratadas con el compuesto por 48hs. El total de lisados celulares se sometieron a inmunoblotting utilizando los anticuerpos indicados, Figura 34F. La actina se utilize como control de carga.
BMSCs de 2 pacientes diferentes (?, ) se cultivaron el con compuesto I (0-20µ?) por 48hs. La viabilidad celular se evaluó por medio del ensayo MTT, Figura 34G. Los valores representan el medio ± SD de cultivos triplicados.
Cabe destacar que el compuesto I inhibió el crecimiento y la secreción de la citocina (Figura 34C-E), así como la fosforilación de AKT y ERK (Figura 34F), inducidas por BMSCs. Por el contrario, no se notó una inhibición significativa del crecimiento en BMSCs (Figura 34G). Estos resultados indican que el compuesto I bloquea el crecimiento celular de la paracrina MM en el context del microambiente de BM.
Ejemplo 33 El compuesto I inhibe la formación tubular anqiogénica HuVEC Este ejemplo demuestra la capacidad del compuesto I para inhibir la formación tubular HuVEC. Se investigó el rol de PI3K, específicamente de la ¡soforma p 110 , en angiogenesis. Las células endoteliales son un regulador escencial de la angiogenesis para el crecimiento bumoral. Las vías Akt y ERK se asocian con el crecimiento celular endothelial y la regulación de angiogenesis; y cabe destacar que las células endoteliales expresan p1105. Este ejemplo también demuestra que el compuesto I bloquea la formación tubular capilar in vitro, asociada con la regulación negativa de la fosforilación de Akt.
Se investigó el efecto de la inhibición de P110 d sobre la angiogenesis. HuVECs se trataron con 0, 1.0, o 10 µ? del compuesto I por 8 h, y se evaluó la formación tubular por células endoteliales (Figura 35A). Células HuVEC se cultivaron en superficies recubiertas con Matrigel y se permitió la formación de túbulos por 8 hs, en presencia o ausencia del compuesto I. La formación tubular de células endoteliales se midió por análisis microscópico, Figura 35B. *P<0.005.
HuVECs se cultivaron con el compuesto I (0-20µ?) 48hs, y la viabilidad se evaluó por medio del ensayo MTT, Figura 35C. Los datos ilustrados son el medio ± SE de cultivos triplicados de un experimento representative. Por lo tanto, el compuesto I inhibió la formación tubular capilar de manera dependiente de la dosis (p<0.05) (Figura 35B), sin citotoxicidad asociada (Figura 35C).
La fosforilación y expression de AKT y ERK1/2 se redujo marcadamente en células HuVEC con el tratamiento del compuesto I. HuVECs se cultivaron con el compuesto I (0-200µ?) por 8hs, y el Usado ceular se analizó por inmunoblotting utilizando los anticuerpos indicados, Figura 35D. La actina se uitlizó como control de carga.
Estos descubrimientos sugieren que el compuesto I puede inhibir la angiogenesis, asociada con la reducción de la regulación de la actividad de AKT y ERK.
Ejemplo 34 El compuesto II inhibe el crecimiento de células MM In vivo Este ejemplo demuestra la capacidad del compuesto II para inhibir el crecimiento de células MM humanas In vivo.
La eficacia In vivo del inhibidor P 110d se evaluó en un modelo de xenoinjerto en el se inyectaron subcutáneamente células MM humanas a ratas SCID.
Las ratas inyectadas con células LB 5* 106 fueron tratadas oralmente dos veces al día con el vehículo de control ( · ), y el compuesto II 10mg/kg (?) o 30mg/kg ( o ). El volumen medio del tumor se calculó como en los Materiales y Métodos, Figura 36A. Las barras de error representan SD (±).
Imágenes representativas del cuerpo complete de una rata tratada por 12 con el vehículo de control (panel superior) o compuesto II (30mg/kg) (panel inferior), Figura 36B.
Tumores cultivados de una rata tratada con el compuesto II (30mg/kg) (panel derecho) y la rata de control (panel izquierdo) se sometieron a un análisis inmunohistoquímico utilizando CD31 y P-AKT Abs. Las células positivas CD31 y P-AKT son de marrón oscuro, Figura 36D.
Las ratas fueron tratadas con el compuesto II 10mg/kg ( -- ), 30mg/kg (...) o vehículo de control ( - ). La supervivencia se evaluó desde el priimer día del tratamiento hasta el sacrificio de las ratas utilizando las curvas Kaplan-Meier, Figura 36C.
Tejidos tumorales de ratas se cultivaron con el vehículo de control o compuesto II (30mg/kg). Los niveles de proteína de los PDK-1 y AKT (Ser473) forsforilados se determinaron por medio de western blotting de lisados celulares, La Figura 36E. La actina se utilizó como control de carga.
El crecimiento de células INA-6 injertadas en astillas de hueso humano en ratas SCID se monitoreó por medio de medidas seriales del suero de shulL-6R. Las ratas fueron tratadas con el compuesto II 10mg/kg ( ? ), 30mg/kg ( ? ) o vehículo de control ( · ), y los niveles de shull_-6R se determinaron semanalmente por medio de ELISA, Figura 36F. Las barras de error indican SD (±).
El compuesto II (inhibidor de p 110 d) redujo significativamente el crecimiento tumoral MM en el tratamiento grupal (n = 7) en comparación con la rata de control (n = 7). La comparación del volumen de los tumors mostró diferencias estadísticamente significativas entre el control versus el tratamiento grupal (vs 10 mg/kg, P<0.05; vs 30 mg/kg, P<0.01) (Figura 36A). La marcada disminución en el crecimiento tumoral en comparación con los tratados en ratas de control se observó a los 12 días. (Figura 36B) Las curvas Kaplan-Meier y análisis de rangos logarítmicos mostraron un medio de supervivencia general (OS) de 15 días (95% intervalo de confianza, 12-17 días) en ratas de control en comparación a 23 días (95% Cl, 15-34 días) y 32 días (95% Cl, 27-49 días) en los grupos tratados con 10 mg/kg and 30mg/kg del compuesto II, respectivamente. Una prolongación estadísticamente significativa en el medio OS comparado con las ratas de control también se observó en los grupos tratados (vs 10 mg/kg, P = 0.086; vs 30 mg/kg, P=0.056) (Figura 36C). Cabe destacar que el tratamiento con el vehículo o compuesto II no afectó el peso corporal. Además, el análisis inmunohistoquímico (Figura 36D) y el inmunoblot (Figura 36E) confirmó que el tratamiento con el compuesto II (30mg/kg) inhibió significativamente p-Akt y p-PDK-1, e igualmente disminuyó significativamente células positivas CD31 y la densidad de microvasos (p<0.01) (Figura 36D). Esto sugiere que el compuesto II puede inhibir la angiogenesis In vivo a través de la supresión de la vía de Akt.
A fin de examinar la actividad del compuesto II en el crecimiento de células MM en el context del m icroam biente humano BV In vivo, se utilizó un modelo SCID-hu en el que células INA-6 dependientes de IL-6 fueron inyectadas directamente en fragmentos óseos humanos implantados subcutáneamente en ratas SCID. Este modelo recapitula el microambiente humano BM con el crecimiento de células INA-6 MM humanas dependientes de IL- 6/ BMSC. Estas ratas SCID-hu fueron tratadas con el compuesto II o vehículo diariamente por 4 semanas, y monitoreadas con suero shulL-6R como marcador de la carga tumoral. Conforme se ilustra en la Figura 36F, el tratamiento con el compuesto II inhibe significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el vehículo de control. Se observó una significativa inhibición del crecimiento tumoral en este modelo, revelada por los niveles reducidos de suero shulL-6R liberado por las células INA-6, que confirma que la inhibición de ?110d bloquea la actividad promotora del crecimiento MM del microambiente BV In vivo. En conjunto, estos datos demuestran que la inhibición de ?110d por el compuesto II inhibe significativamente el crecimiento MM In vivo u prolonga la supervivencia.
Ejemplo 35 Compuesto I en combinación con bortezomib exhibe citotoxicidad sinérgica Este ejemplo demuestra el efecto del compuesto I en combinación con bortezomib para mediar la citotoxicidad sinérgica MM.
Se investigaron los efectos de combinar el compuesto I con bortezomib para inducir la citotoxicidad sinergística MM. Células LB y INA-6 MM se cultivaron con un medio (¦) y con el compuesto I, 1.25 µ? (?!), 2.5µ? ( ), o 5.0µ? (?), en presencia o ausencia de bortezomib (0-5nM). La citotoxicidad se evaluó por medio del ensayo MTT; los datos representan el medio ±SD de cultivos cuadruplicados, Figura 37A.
Las células INA-6 fueron tratadas con el compuesto I (5µ?) y/o bortezomib (5nM) por 6 hs. La fosforilación de AKT se determine por western blotting de lisados celulares utilizando anticuerpos fosfo-AKT (ser473), Figura 37B. La actina sirvió como control de carga.
El compuesto I aumenta la citotoxicidad de bortezomib. Concentraciones en aumento del compuesto I (1.5-5.0µ?) agregadas al bortezomib (2.5, 5.0 nM) activaron la citotoxicidad sinérgica en células LB y INA-6 MM (Figura 37A y Tabla 7). Cabe destacar que la inducción de fosfo-Akt por el tratamiento de bortezomib se inhibió en presencia del compuesto I (Figura 37B). Tabla 7 Combmation índex (CI) compuesto Bortezomib CAL101 Fa Cl (nM) (íiM¡ 2.5 1.25 0.39 0.67 2.5 2.5 0.52 0.5S 2.5 5 0.57 0.67 5 1,25 0.42 0.88 5 2.5 0.60 0,25 5 6 0.67 0.22 2.5 1.25 0.49 0.31 2.5 2.5 0.58 0.48 INA-6 2.5 5 0.69 0,54 5 1.25 0.56 0.73 6 2.5 0.66 0.42 5 5 0.75 0.31 Ejemplo 36 Compuesto I efectivo en líneas celulares del Linfoma folicular Este ejemplo demuestra que el compuesto I bloquea la señalización de PI3K e induce la apoptosis en células de linfoma folicular. P1105 se expresa en las líneas celulares FL conforme se ilustra en la Figura 38A. Ciertas lineas celulares muestran reducción en la producción de pAkt, Akt, pS6 y S6 cuando las células se exponen al compuesto I, Figura 38B. La división de PARP y caspasa-3 se observa después de la exposición al compuesto I de manera dependiente de la dosis después de 24 horas a 0.1 µ? and 0.5 µ?, Figura 38C.
Ejemplo 37 Compuesto I efectivo en células primarías MCL Este ejemplo demuestra que el compuesto I es efectivo contra MCL. Se determinó que el compuesto I bloquea la señalización constitutiva de PI3K en células primarias MCL de dos pacientes en una manera dependiente de la dosis al exponerse a 0.1 µ? o 1 µ? del compuesto I, Figura 39A. También se observó que el compuesto I inhibe el factor sobreviviente y la señalización que de quimioquinas en las líneas celulares MCL. La Figura 39B ilustra una significativa reducción de pAkt en líneas MCL expuestas a diferentes factores de suprevivencia en presencia del compuesto I.
Ejemplo 38 Efecto del compuesto en combinación con Rituximab v/o Bendamustina en pacientes con Recaída o Neoplasias malignas de células B resistentes.
Este ejemplo demuestra la seguridad y actividad del compuesto de fórmula I en combinación con rituximab y/o bendamustina en pacientes con recaída o neoplasias malignas de células B resistentes.
Al corte de datos, 12 pacientes fueron incluidos en el studio, incluyendo 6 con NHL y 6 con CLL. Los pacientes incluyeron: hombres/mujeres n = 8 (67%)/4 (33%) con un promedio de edad de 65 (Rango: 55-80) años, y con recaída/enfermedad resistente n = 8 (67%)/4 (33%). El número medio de terapias anteriores fue 3 (Rango: 1-11). Todos los pacientes recibieron 100 mg BID del compuesto de fórmula I; 6 pacientes recibieron rituximab y 6 recibieron bendamustina. Un paciente con NHL tuvo una reducción en la dosis de bendamustina debido al hipo y 1 paciente con HNL tuvo una reducción en la dosis del compuesto de fórmula I debido al aumento de ALT/AST; los demás pacientes recibieron el régimen de dosis completa con tolerancia aceptable. Las evaluaciones de respuestas clínicas estuvieron disponibles para 6 pacientes que completaron 2 ciclos de tratamiento combinado y los resultados se ilustran en la Tabla 8 a continuación.
Tabla 8.
Por lo tanto, la administración del compuesto de fórmula I en combinación con rituximab o bendamustina ilustra una actividad clínica segura y prometedora en pacientes con recaída o neoplasias malignas de células B resistentes.
Ejemplo 39 Efecto del compuesto en combinación con Rituximab v/o Bendamustina en pacientes con Recaída o Neoplasias malignas de células B resistentes.
Este ejemplo demuestra la seguridad y actividad del compuesto de fórmula I en combinación con rituximab y/o bendamustina en pacientes con recaída o células B resistentes NHL indoloro y CLL. 20 pacientes fueron incluidos, incluyendo 12 con iNHL y 8 con CLL. Las características de los pacientes se resumen en la Figura 42. Todos los pacientes recibieron el compuesto de fórmula I, 100 mg por vía oral dos veces al día (BID) o 150 mg por vía oral dos veces al día (BID) durante el tiempo que el paciente fuera beneficiado. Loa pacientes recibieron rituximab 375 mg/m2 administrada semanalmente por 8 semanas, a partir del Día 1 del Ciclo 1, o bendamustina 90 mg/m2 administrada en los Días 1 y 2 de cada ciclo por 6 ciclos. La respuesta tumoral se evaluó de acuerdo con criterios estándares.
Conforme se ilustra en la Figura 43, eventos adversos de Grado >3 incluyeron eventos resultantes de enfermedades preexistentes o condiciones relacionadas con el tratamiento o de enfermedades intercurrentes. Para pacientes recibiendo bendamustina y compuesto I, eventos adversos de Grado >3 incluyeron milosupresión B-inducida. Para pacientes recibiendo rituximab y compuesto I, eventos adversos de Grado >3 fueron poco frecuentes y no se relacionaron claramente con el compuesto de fórmula I. Se observaron elevaciones transitorias ALT/AST de iNHL; estos eventos se resolvieron al interrumpir el fármaco y fueron manejados con éxito reiniciando la terapia con un nivel más bajo de la dosis del compuesto de fórmula I. No se observaron toxicidades limitadas por las dosis con relación al compuesto de fórmula I en los cohortes de los pacientes a prueba.
Conforme se ilustra en la Figura 44, casi todos los pacientes con ¡NHL o CLL que han recibido la terapia de combinación de bendamustina y el compuesto I, o rituximab y el compuesto I han experimentado reducciones en el tamaño de los ganglios.
Además, altos niveles de actividad antitumoral se observaron en pacientes con ¡NHL y en pacientes con CLL, que recibieron bendamustina y compuesto I, o rituximab y compuesto I. En el resumen de la tabla de la Figura 45, un paciente con iNHL recibió bendamustina y el compuesto I teniendo una respuesta completa.
Por lo tanto, la administración del compuesto I en combinación con rituximab o bendamustina ilustra una seguridad aceptable y actividad clínica prometedora en pacientes con recaída o células B resistentes NHL indoloro y CLL.
En un estudio previo, una monoterapia que involucró la administración del compuesto de fórmula I causó una redistribución de linfocitos que resultaron en linfocitosis en -2/3 de pacientes con CLL, como se observa en la Figura 46. Por el contrario, como se ilustra en la Figura 47, la terapia de combinación con bendamustina y el compuesto I, o rituximab y el compuesto I resultó en la disminución del conteo de linfocitos malignos en todos los pacientes con CLL.
Por lo tanto, la terapia de combinación más árriba mencionada proporciona sorprendentes efectos y resultados superiores con pocos efectos secundarios en la reducción del tamaño del ganglio y actividad antitumoral en pacientes con ¡NHL y CLL, al igual que una disminución en el conteo de linfocitos malignos en pacientes con CLL.
Ejemplo 40 Efecto del compuesto en combinación con Bendamustina sobre la señalización del receptor de células B (BCR) y las acciones de prosupervivencia de nurse-like ce 11 s (NLC), en leucemia linfocítica crónica Este ejemplo demuestra los efectos del compuesto de fórmula I en combinación con bendamustina en la activación celular CLL derivada de BCR. Se determine que la reticulación BCR con anti-lgM aumentó significativamente la viabilidad cellular de CLL a 121 ± 5 % del control (medio ± SEM, n = 15, *P< 0.05). Este efecto pro-supervivencia fue derogado por el compuesto de fórmula I, que redujo la viabilidad de células CLL a 85 ± 3 % del control a 48 horas (medio ± SEM, n = 15, *P< 0.05). La viabilidad de células CLL en el co-cultivo con NLC también se redujo significativamente por el compuesto de fórmula I a 64 ± 6% de los controles no tratados a 48 horas (medio + SEM, n = 10, *P< 0.05). La reticulación BCR induce la secreción de quimiocinas CCL3 y CCL4 por células CLL, cuantificada en supernadantes CLL por medio de ELISA.
El compuesto de fórmula I reduce significativamente concentraciones de supernadantes CCL3 de 4060 ± 1392 pg/mL a 2901 ± 1220 pg/mL, y niveles CCL4 de 5721 + 1789 pg/mL a 3223 ± 1311 pg/mL (medio ± SEM, n = 6, *P<0.05). En co-cultivos CLL-NLC, el compuesto de fórmula I también inhibió la secreción CCL3/4 de células CLL. Las concentraciones CCL3 se redujeron por el compuesto de fórmula I de 943 + 535 pg/mL a 156 ± 8 pg/mL, y las concentraciones CCL4 de 7433 ± 4463 pg/mL a 316 ± 53 pg/mL (medio + SEM, n = 5, *P<0.05).
Sorprendentemente, el compuesto de fórmula I también redujo los niveles de CXCL13 en co-cultivos CLL-NLC de 151 ± 35 a 70 ± 27 pg/mL (medio ± SEM, n=4, *P = 0.05), indicando que el compuesto de fórmula I tiene acciones farmacológicas en células CLL y el microambiente CLL representado por NLC.
Este ejemplo también demuestra que una combinación del compuesto de fórmula I con bendamustina puede superar la resistencia al fármaco mediada por el estroma en co-cultivos de células CLL con células estromales de médula (MSC). Conforme se ilustra en las Figuras 48a y 48b, la combinación de ambos fármacos indica un aumento en el efecto en la muerte de células CLL.
Además, se utilizó fosfo-flujo para demostrar que el compuesto de fórmula I inhibe la activación de la vía constitutiva P13K e inducida por BCR en muestras obtenidas de pacientes con CLL sometidos al tratamiento con el compuesto de fórmula I. El tratamiento con el compuesto de fórmula I desreguó pAkt(T308) en células periféricas CLL por >90% (n = 12). Muestras de plasma de 14 pacientes con CLL obtenidas antes y después de 28 días de tratamiento diario con el compuesto de fórmula I se analizaron buscando concentraciones de varias citocinas. Interesantemente, estos análisis revelaron disminuciones substanciales de la línéa de base al día 28+ del tratamiento con el compuesto de fórmula I en los niveles medios del plama de CCL3 (de 186 pg/mL a 29 pg/mL), CCL4 (de 303 a 70 pg/mL), CCL22 (1067 a 533 pg/mL), CXCL13 (316 pg/mL a 40 pg/mL), y TNFa (104 a 29 pg/mL), confirmando nuestros datos in vitro relacionados con CCL3/4 y CXCL13.
Colectivamente, los resultados de este ejemplo ilustran que el compuesto de fórmula I efectivamente inhibe la supervivencia y activación in vitro de la célula CLL mediada por BCR y NLC. Igualmente, el compuesto de fórmula I aumenta la actividad de agentes citotóxicos como la bendamustina contra células CLL. Datos in vivo indicant que el compuesto de fórmula I reduce los niveles elevados de CCL3 y CCL4 previos al tratamiento. Sin limitarse a la teoría, estas observaciones sugieren el concepto de que la inhibición de signos derivados de BCR pueden ser un mecanismo clabe de acción del compuesto de fórmula I en CLL.
Ejemplo 41 Efecto del compuesto en combinación con Lenalidomida sobre la activación de la vía de fosfatidilinositol 3-guinasa-d' en CLL Este ejemplo ilustra el efecto del compuesto de fórmula I en combinación con lenalidomida en la activación de vías P 13 k-delta en pacientes con CLL.
Recolección de muestras y condiciones de cultivo: Células mononucleares aisladas fueron células B negativamente seleccionadas y colocadas en el cultivo. El compuesto de fórmula I fue proporcionado por Calistoga Pharmaceuticals (Seattle, WA). La lenalidomida (Revlimid; Celgene) se obtuvo y extrajo.
Ensayos de citometría de flujo: Anticuerpos CD20, CD40, CD80, CD86 o IgG 1 (BD Biosciences, San José CA) fueron sometidos a coloración superficial.
Análisis ¡nmunoblot: Se realizaron inmunoblots. Los anticuerpos incluyeron, Anti-AKT, anti-fosfo-AKT (Ser473), anti-GSK3 ? anti-fosfo-GSK3 (Ser9) (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-p110ó (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y anti-GapdH (Millipore, Billerica, MA).
RT-PCR cuantitativa: Se extrajo ARN utilizanto el reactive TRIzol (Invitrogen) y cDNA se preparó utilizando el SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen). PCR en tiempo real se realizó utilizando Ensayos predeterminados de expresión de genes TaqMan® y un sistema de detección de secuencia ABI Prisma 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Ensayo PI3K: El ensayo PI3K se realize en células lisadas entereas de las células CLL. El ensayo ELISA se realize de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Echelon Biosciences, Salt Lake City, UT).
Transfección: Células CLL fueron transfectadas. ?110d siRNA (Ambion, Austin, Tx) se utilizó al final de la concentración de 50nM.
Detección de inmunoglobulina: Se determine la cuantificación de IgM. Brevemente, células CLL tratadas con lenalidomida o con el vehículo de control, fueron irradiadas y colocadas en el cultivo con el objetivo, células B purificadas, en ausencia o presencia de PWM (5 Mg/mL).
Análisis estadístico: Todas las evaluaciones estadísticas reportadas se realizaron por medio del Centro de Bioestadísticas en OSU con métodos previamente descritos 7. Valores-P a a??.05 para comparaciones individuales o después del ajuste de múltiples comparaciones se consideraon significativos.
Los resultados de este ejemplo ¡lustran que la lenalidomida regula CD154 en células CLL por la activación de la translocación nuclear de AKT, IKK y NF-kB con el aumento de la transcripción y estabilización de mRNA. El tratamiento de células CLL con el inhibidor pan-LY294002 antagonizó esta activación de AKT.
Para primeramente confirmar la especificidad de la activación de PI3-kinasa, se determinó el aumento directo en la actividad enzimática de PI3K después del tratamiento con lenalidomida. Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 9) tratadas con o sin 0.5 µ? lenalidomida se examinaron para confirmer actividad de PI3- kinasa con y sin la adición de 1 o 10 µ? del compuesto de fórmula I a este Usado. Los resultados se calcularon con relación al ng de la proteína. La señalización con lenalidomida a través de la vía de PI3K puede ocurrir a través de cuatro isoformas catalíticas: p110a, ?110a, ???ß, y ????. Además, la inhibición de ??3?-? a través de un pequeño inhibidor molecular, el compuesto de fórmula I, se determinó que previene el aumento en la actividad encimática de PI3K (Figura 49A).
Luego, para determinar si la inhibición de ??3?-? con el compuesto de fórmula I podía prevenir el aumento de la fosforilación de AKT inducida por la lenalidomida, la inhibición de ??3?-? por el compuesto de fórmula I resultó en la prevención de la actividad de PI3K. Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 6) incubaron con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 1 o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. La fosforilación AKT a ser473 se evaluó por inmunoblot. Ver Figura 49B.
Para confirmar estos resultados, se evaluó la fosforilación de GSK3n. Células CD19+ de pacientes con CLL (N=4) incubaron con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 1 o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. La fosforilación de GSK3n a ser9 se evaluó por inmunoblot. Los resultados se muestran en uno a cuatro experimentos. Se determinó que el tratamiento con lenalidomida lleva al aumento en la fosforilación de GSK3n prevenible por el co-tratamiento con el compuesto de fórmula I, nuevamente sugiriendo un vínculo entre la ??3?-? y la actividad de PI3K dependiente de la lenalidomida. Veer Figura 49C.
Para confirmar que estos resultados de hecho se debieron a la inhibición de ??3?-?, ??3?-? células CLL fueron dadas de baja. Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 3) se transfectaron con siRNA dirigidas a ??3?-?, ??3?-? o a un objetivo sin sentido. La expresión de la proteína pHOnnse evaluó por inmunoblot. Los resultados se muestran en uno a tres experimentos. Ver Figura 49D.
La lenalidomida demostró no poder inducer la fosforilación de AKT cuando PI3K-5 reducida. Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 3) se transfectaron con siRNA dirigidas a PI3K-8, ??3?-? o sin sentido, y luego incubadas con o sin 0.5 µ? de lenalidomida por 48 horas. La fosforilación de AKT a ser473 se evaluó por inmunoblot. Los resultados se muestran en uno a tres experimentos. Ver Figura 49E.
Estos descubrimientos respaldan que la activación de PI3K en CLL y los posteriores efectos en NF-?? y CD154 en células CLL por la lenalidomida utiliza una vía dependiente de ??3?-??.
El tratamiento con lenalidomida demostró previamente que resulta en la activación de células CLL. Para extender estos descubrimientos, la inhibición de PI3K-Ó prevenida por la lenalidomida se investigó para ver si inducía la regulación de otras moléculas co-estimulantes importantes para la presentación del antígeno de células B. Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 25) se trataron con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. La expresión superficial de CD40 o CD86 se evaluó por citometría de flujo utilizando un CD40-o anticuerpos CD86-PE e isotipo de control lgG1-PE. El tratamiento con el compuesto de fórmula I pudo prevenir la regulación de CD40 y CD86 inducida por la lenalidomida (p-valor=0.0102 y <0.0001, respectivamente) (Figura 50A).
Similarmente, se determine que la inhibición de PI3K-6 también previene el aumento en mRNA de CD40, CD86, CD154 y CD80 promovido por la lenalidomida (p-valor<0.009 para todos los genes) (Figura 50B). Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 15) se trataron con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. El RNA se extrajo y convirtió en cDNA y el análisis RT-PCR se realizó para determinar las cantidades de CD40, CD86 y CD154 mRNA.
La lenalidomida también demostró inducir la internalización de CD20, el tratamiento concurrente con el compuesto de fórmula I previno este efecto (p-value = 0.0057) (Figura 50C). Células CD19 + de pacientes con CLL (N = 5) se trataron con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. La internalización de CD20 se evaluó cuantificando la expresión de la superficie de CD20 por medio de la citometría de flujo utilizando anticuerpos CD20-PE e isotipo de control lgG1-PE.
Considerando la importancia del eje CD40-CD154 para el tratamiento de células CLL con lenalidomida para promover células B normales para producir inmunoglobulina, el compuesto de fórmula I se evaluó para ver si podría prevenir que esto ocurriera. Células CD19+ de pacientes con CLL (N = 6) fueron tratadas con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. Células CLL fueron irradiadas (20 Gy) y colocadas con células B purificadas, en ausencia o presencia de 5 pg/mL PWM. La cuantif icación de IgM se determinó por medio del análisis de ELISA. Considerando que las células CLL tratadas con lenalidomida previamente 5 y en la presente se ha demostrado que los niveles de IgM aumentaron, se determinó que las células CLL tratadas previamente con el compuesto de fórmula I previenen completamente la producción de IgM (p-valor<0.0001 ) (Figura 50D).
Finalmente, el tratamiento con lenalidomida de células CLL en el cultivo fue probado para determinar si podría promover la producción de células tumorales del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF). Las células CD19+ de pacientes con CLL (N = 15) se trataron con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. Se extrajo RNA y convirtió en cDNA y el análisis RT-PCR se realizó para determinar las cantidades de bFGF. El tratamiento de lenalidomida aumentó la regulación transcripcional de b-FGF en todos los pacientes (p-value = 0.0004) y la co-incubación del compuesto de fórmula I previno esta (p-valor<0.001 ) (Figura 50E).
Similarmente, el tratamiento con lenalidomida aumentó los niveles de transcripción de VEGF en un subset (8 of 13) de pacientes, que fue nuevamente reversible por el tratamiento con el compuesto de fórmula I (p-valor=0.002) (Figura 50F). Células (F) CD19+ de pacientes con CLL (N = 13) fueron tratadas con o sin 0.5 µ? de lenalidomida y/o 10 µ? del compuesto de fórmula I por 48 horas. RNA se extrajo y convirtió en cDNA y el análisis RT-PCR se realizó para determinar las cantidades de VEGF.
Datos proporcionados colectivamente respaldan la vía de PI3K-6 en la activación de células CLL mediada por lenalidomida. La potencial relevancia de estos descubrimientos son varias con relación al uso de la lenalidomida en CLL. La combinación del compuesto de fórmula I, inhibidores de pan-PI3-kinasa y potencialmente otros agentes que antagonizan la reducción de la señalización de PI3-kinasa con lenalidomida posiblemente sean antagonísticos a las propiedades de modulación inmune es este agente. La aplicación de esta terapia de combinación si se desea modulación nimune deberá entonces ser abordada con precaución. Por el contrario, si se desean acciones moduladoras no inmunes, la aplicación de agentes como el compuesto de fórmula I o inhibidores alternativos de PI3-kinasa, en vista de sus sorprendentes efectos, podría ser atractiva para prevenir la activación inmune, reactivación tumoral, y el síndrome de liberación de citocina asociado con este tratamiento. Esto podría ser particularmente cierto con citocinas como VEGF 16-19 y b-FGF 16,20,21 que tienen un efecto protector contr células CLL. De hecho, un estudio de lenalidomida en recaída de CLL que examine niveles seriáis de citocinas durante el tratamiento notó que pacientes que no respondían en comparación a pacientes que respondían tenían niveles persistentemente elevados de citocinas, incluyendo b-FGF 2.
Ejemplo 42 Efecto del compuesto en combinación con Rituximab y/o Bendamustina en pacientes con células B malignas previamente tratadas Este ejemplo demuestra la seguridad y actividad del compuesto de fórmula I en combinación con rituximab y/o bendamustina en pacientes con neoplasias malignas de células B previamente tratados. 49 pacientes se incluyeron en el estudio, incluyendo 27 con ¡NHL y 22 con CLL. Las características del paciente se resumen en la Figura 51. En la línea de base,, pacientes tuvieron características de pronóstico adverso, incluyendo edad avanzada, adenopatía abultada, y enfermedad resistente. Todos los pacientes recibieron >1 previo al régimen de tratamiento y algunos recibieron hasta 9 regímenes previos. El tratamiento previo incluyó rituximab, agentes alquilantes y/o fludarabina; la mayoría de los pacientes con ¡NHL fueron tratados previamente con una terapia con antraciclinas. El seguimiento fue temprano en muchos pacientes, con duraciones de terapia desde 1 a 12 ciclos.
Todos los pacientes recibieron el compuesto de fórmula I, 100 mg por vía oral dos veces al día (BID) o 150 mg por vía oral dos veces al día (BID) durante el tiempo que fueran beneficiados. Los pacientes también recibieron rituximab 375 mg/m2 administrado semanalmente por 8 semanas, a partir del Día 1 del ciclo 1, o bendamustina 90 mg/m2 administrado en los días 1 y 2 de cada ciclo por 6 ciclos. La respuesta tumoral se evaluó de acuerdo con criterios estándares.
Conforme se ilustra en la Figura 52, eventos adversos de Grad =3 en gran medida comprendían eventos resultantes de la enfermedad pre-existente, toxicidad de una terapia previa, o enfermedad intercurrente. Para pacientes recibiendo bendamustina y el compuesto de fórmula I, los eventos adversos de Grado =3 incluyeron mielosupresión inducida B. para pacientes recibiendo rituximab y el compuesto de fórmula I, los eventos adversos de Grado >3 fueron poco frecuentes y no se relacioban claramente con el compuesto de fórmula I. Se observaron elevaciones transitorias ALT/AST de ¡NHL; estos eventos se resolvieron al interrumpir el fármaco y fueron manejados con éxito reiniciando la terapia con un nivel más bajo de la dosis del compuesto de fórmula I. No se observaron toxicidades limitadas por las dosis con relación al compuesto de fórmula I en los cohortes de los pacientes a prueba.
Conforme se ilustra en las Figuras 53A y 53B, casi todos los pacientes con ¡NHL o CLL que recibieron la terapia de combinación de bendamustina y el compuesto de fórmula I, o rituximab y el compuesto de fórmula I experimentaron reducciones en el tamaño de los ganglios.
Además, altos niveles de actividad antitumoral se observaron en pacientes con ¡NHL y en pacientes con CLL, ya sea recibiendo bendamustina y el compuesto de fórmula I, o rituximab y el compuesto de fórmula I. Se resume en la Figura54, que dos pacientes con ¡NHL que recibieron bendamustina y el compuesto de fórmula I tuvieron respuesta completa.
En un estudio previo, una monoterapia monoterapia que implicaba la administración del compuesto de fórmula I causó una redistribución de linfocitos que resultó en una linfocitosis transitoria en pacientes con CLL, como se observa en la Figura 55.
Por el contrario, como se observa en la Figura 56, la terapia de combinación con bendamustina y el compuesto de fórmula I, o rituximab y el compuesto de fórmula I resultó en una reducción más rápida del conteo de linfocitos malignos en pacientes con CLL.
Por lo tanto, la terapia de combinación mencionada más arriba proporciona efectos sorprendentes y resultados superiores con pocos efectos secundarios en la reducción del tamaño de los ganglios y actividad antitumoral en pacientes con iNHL y CLL, al igual que una disminución en el conteo de linfocitos malignos en pacientes con CLL.
Ejemplo 43 Efecto del compuesto en combinación con Dexametasoiria, Bendamustina, v/o Fludarabina en células CLL co-cultivadas con células estromales de médula ósea (MSCs) Este ejemplo demuestra el efecto del compuesto de fórmula I en células CLL donde estas células fueron co-culti adas con MSC en presencia de fármacos citotóxicos para células CLL (por ejemplo, dexametasona, bendamustina, y fludarabina).
Las células CLL se co-cultivaron con MSCs en un medio (control) o en un medio conteniendo las concentraciones indicadas de un compuesto de fórmula I, dexametasona, bendamustina, o fludarabina, u otros fármacos combinados.
La población de células viable se caracterizó por la coloración brillante DiOC6 y la exclusión de Pl, y se cerró en el extremo inferior derecho de cada trazado de contorno. El porcentaje de células viables se presenta por encima de cada uno de estos trazados. Como se ilustra en la Figura 57a, la combinación de un compuesto de fórmula I con dexametasona, bendamustina, o fludarabina indica un efecto mayor sobre la muerte de células CLL.
Las viabilidades de las muestras tratadas con fármacos se normalizaron con las viabilidades de las muestras de control en los puntos de tiempo respectivos (100%). La Figura 57b presenta los medios (±SEM) de 9 diferentes muestras de pacienste, evaluadas después de 24, 48 y 72 horas. La supervivencia de células CLL en presencia de MSCs fue significativamente reducida por la terapia de combinación, con P<.05, indicados por los asterisco^ que describen la comparación de los resultados de cada cultivo tratado con el fármaco a los resultados de los cultivos de control. Por ejemplo, después de 72 horas, la viabilidad de células CLL con relación a controles no tratados fue de 93% (±0.6%) con un compuesto de fórmula I y 60% (±8.7%) con bendamustina, pero se redujo a 42.7% (±11.4%) para la combinación de los 2 fármacos. Resultados comparables se vieron para las combinaciones de un compuesto de fórmula I y fludarabina, o un compuesto de fórmula I y dexametasona.
Por lo tanto, estos resultados indicant que un compuesto de fórmula I sensibilizó las células CLL a los agentes citotóxicos, presumiblemente por interrupción de las señales de resistencia al fármaco derivadas de MSC.
Ejemplo 44 Efecto del compuesto en combinación con Ofatumumab en CLL Este ejemplo resume el estudio de Fase 1-2 de ciclos repetidos (28 días/ciclo) del compuesto I en combinación con ofatumumab para el tratamiento de pacientes previamente tratados por CLL.
El compuesto I (150 mg 2 veces al día [BID]) fue coadministrado con 12 infusiones de ofatumumab por más de 24 semanas. Se administró ofatumumab con una dosis inicial de 300 mg en el día 1 o día 2 (relativa a la primera dosis del compuesto I). Una semana después, se administró ofatumumab a 1,000 mg cada semana en 7 dosis, luego a 1,000 mg cada 4 semanas en 4 dosis. Después de completer el tratamiento con ofatumumab, cada sujeto continuó recibiendo el compuesto I como agente único en una dosis de 150 mg BID durante el tiempo que beneficara al sujeto.
De todo el cohorte de 21 pacientes, los datos de eficacia demográfica y preliminar de 11 pacientes estuvieron disponibles. La edad (rango) promedio fue de 63 [54-76] años. La mayoría (9/11; 82%) de los pacientes tenía adenopatía voluminosa (>1 ganglio linfático midiendo >5 cm en su dimensión más larga). El número promedio [range] de terapias previas fue de 3 [1-6], incluyendo previa exposición a agentes alquilantes (10/11; 90%), rituximab (9/11; 82%), análogos de purina (8/11; 72%), alemtuzumab (3/11; 28%) y/o ofatumumab (2/11; 18%). Al corte de datos, la duración promedio (rango) del tratamiento fue de 5 [0-7] ciclos. Casi todos los sujetos (9/11; 82%) experimentarlo marcadas y rápidas reducciones en la linfadenopatía en los 2 primeros ciclos. Entre 11 pacientes, 10 fueron evaluables para la evaluación de la respuesta al final del ciclo 2 o más adelante. Ocho pacientes (80%) cumplieron con los criterios para una respuesta según el juicio del investigador en base a los criterios publicados en Hallek M, et al. (Normas para el diagnostico y tratamiento de leucemia linfocítica crónica: un informe del Taller Internacional sobre Leucemia linfocítica crónica actualizando las normas del Grupo de Trabajo del Instituto Nacional del Cáncer. Sangre. 2008 Jun 15; 111 (12):5446-56). Un paciente redujo la linfodenopatía cumpliendo con los criterios para la enfermedad estable, y un paciente tuvo progresión de la enfermedad. El aumento transitorio en el conteno periférico de linfocitos esperado con un solo agente inhibidor de PI3K5 se redujo en magnitud y duración. La reducción de la linfocitosis transitoria se indujo por la combinación del compuesto I y oftatumumab.
Datos preliminaries de seguridad muestran que la el tratamiento de combinación tuvo un perfil de seguridad favorable y presentó la ausencia de mielosupresión. Además, los datos farmacodinámicos revelaron que los niveles elevados de la linea de base de cimioquinas y citocinas asociadas con CLL (CCL3, CCL4, CXCL13, y TNFa) se redujeron después de 28 días de tratamiento. Los resultados sugieren que la combinación del compuesto I con ofatumumab proporciona un régimen de tratamiento bien tolerado sin citotoxina en pacientes CLL previamente tratados.
Ejemplo 45 Efecto del compuesto en combinación con antagonistas BCL- 2 en CLL Este ejemplo ilustra el efecto del compuestol en combinación con antagonistas BCL-2 ABT-737 y ABT-263 en células CLL expuestas al estroma.
Purificación de células CLL: La sangre periférica, médula ósea, y ganglios linfáticos se obtuvieron de pacientes que cumplían con los criterios de diagnóstico e inmunofenotípicos para CLL. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de las muestras de sangre y tejido utilizando la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare, Waukesha, Wl). Las muestras fueron analizadas frescas o viablemente congeladas en 10% dimetilo sulfoxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en suero bovino fetal (BD Biosciences, San Diego, CA) y almacenadas en nitrógeno líquido y posteriormente descongeladas para ser analizadas. Suspensiones de células individuáis se prepararon para ser analizadas en una máquina de clasificación de células fluorescentes activas (FACS), células CD19+ CLL generalmente representaron >85% de las células analizadas.
Líneas celulares: La línea cellular Murine CD154+ L se mantuvo en un medio RPMI 1640 complementado con 10% FBS, 2.05mM L-glutamina (HyClone, Logan, UT), y penicilina-estreptomicina (Cellgro, Manassas, VA). La línea celular de estroma humano StromaNKTert se adquirió de Riken cell bank (Tsukuba, Japan) y se mantuvo en alpha-MEM complementada con 1 µg/mL hidrocortisona, 10% FBS, 10% suero humano (Invitrogen, Grand Island, NY), 2.05-mM L-glutamina, y penicilina-estreptomicina. Nurse-like cells (NLCs) se establecieron suspendiendo PBMC en pacientes con CLL en un medio completo RPMI 1640 con 10% FBS y penicillina-estreptomicina-glutamina a una concentración de 107 células/mL (2 mL total). Las células fueron cultivadas por 14 días en placas de 24 brotes (Corning Life Sciences).
Co-cultivos de células CLL y células estromales: Las células CCL se cultivaron bajo condiciones estandarizadas en líneas celulares estromales o primarias NLC. Brevemente, las células estromales se cultivaron un día antes de cada experiment en places de 24 brotes (Corning Life Sciences) a una concentración de 3 x 105 células/mL/brote e incubadas a 37°C en 5% C02. La confluencia de células estromales se confirmó por microscopía de contraste de fase, y las células CLL fueron después agregadas a la capa de células estromales a una concentración de 3 ? 106 células/mL. Los cultivos fueron tratados con compuestos por periodos de tiempo específicos. Las células CLL fueron removidas para ser analizadas por pipeteo suave y fueron después lavadas en PBS antes del análisis. Un punto de tiempo de 24 horas de co-cultivo se utilizó salvo indicación en contrario.
Prueba de viabilidad celular y reactivos: La viabilidad de células CLL se determinó por medio del análisis de Anexina V-FITC (BD Biosciences, San Diego, CA) y yodo propidio (Pl) (Sigma) por FACS. ABT-737, ABT-263, y el compuesto I se almacenó en DMSO a -20°C hasta ser utilizado.
Perfiles BH3: Se analizaron muestras de sangre periférica del paciente con CLL, médula ósea, y ganglios linfáticos por medio de la placa de fluorimetría o por el método FACS. Brevemente, PBMCs de pacientes con CLL patients se elaboraron en suspensions simples y fueron suavemente permeabilizadas utilizando digitonina (0.002%). Para el método a base de fluorimetría, se agregó 100 µ? JC-1 (Invitrogen) y las células fueron cargadas a la placa con 384 brotes, con brotes individuales conteniendo péptidos individuales solo de BH3. Los ensayos JC1-BH3 se realizaron en triplicado en Tecan Safire 2 con Ex 545 +/-20 nM y Em 590 +/- 20 nm con un curso de tiempo de 3 horas. Para el método a base de FACS, suspensions de células individuales de CLL en pacientes con PBMCs se sometieron a coloración utilizando el Fe Block humano (BD Pharmingen) seguido por anti-CD19-V450 (BD Pharmingen) y anti-CXCR4-APC (BD Pharmingen). Las células se lavaron en PBS y agregadas a tubos FACS individuales, cada uno conteniendo solo un péptido individual BH3. Las muestras incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos, se agregó 100 µ? JC-1 a cada tubo, y las muetras incubaron por otros 30 minutos. Las medidas FACS se realizaron en un BD FACS Canto II con lasers a 407, 488, y 633 nm. JC-1 se midió desde 488-nm láser utilizando un filtro de 530/30-nm (FITC) y un filtro de 585/42-nm (PE), y el grado de polarización mitocondrial se calculó utilizando el substituto del cambio en el promedio de señal PE. La polarización mitochondrial reportada en respuesta a cada peptide BH3 se normalize con relación al porcentaje promedio de cambio en la fluorescencia del PE de la coloración JC-1 con control negativo, dimetilo sulfoxido (DMSO) (0%) y un control positivo, el agente mitocondrial de desenganche carbonilo de cianuro 4- (trifluorometoxi)- fenilhidrazona (FCCP) (100%).
Ensayo de adhesión a base de calceína: una monocapa confluyente de células CD154+ L o estromaNKTert se generó colocando en placas 1*104 de 96 células/brotes por 24 horas. Suspensiones de células individuáis de células CLL a 0.5*106 cells/ml fueron marcadas posteriormente con 1 Mg/mL Calceina-AM (Invitrogen) por 1 hora. Las células fueron posteriormente centrifugadas y tratadas con el compuesto o vehículo por 1 a 24 horas. Las células no adherentes se lavaron por aspiración. La adhesión de células CLL se cuantificó por fluorimetría (Ex/Em = 485/520 nm), y se visualizó directamente utilizando el sistema de imagen Nikon TE2000 para inversión de células vivas.
Análisis de datos y estadística: Los resultados se muestran con el error estándar del promedio y el número de réplicas que se describe en cada figura. Se utilizaron pruebas pares o impares de alumnos, prueba Mann-Whitney U, o análisis de regresión lineal para comparaciones estadísticas. Los análisis se realizaron con GraphPad Prisma 5 software para PC (GraphPad Software, San Diego, CA). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando la versión FACS Diva 6.1.1 (BD Pharmingen). La respuesta clínica se evaluó utilizando los criterios 2008 IW-CLL con respondedores definidos como pacientes que lograron una respuesta complete o parcial como major respuesta, y los que no respondieron como pacientes con enfermedad estable, enfermedad resistente o enfermedad progresiva dentro de los 6 meses después de finalizar la terapia. Un valor p < 0.05 de doble cola se consideró como estadísticamente significativo salvo especificación en contrario.
Actualmente, muchos pacientes que reciben terapia de primera línea CLL con frecuencia sufren recaídas y desarrollan resistencia al tratamiento. Debido a que las células CLL expuestas a varios estromas son resistentes al tratamiento con quimioterapia (Kurtova AV et al. Diversas células estromales de medulla protegen células CLL de apoptosis espontánea e inducida por fármacos: desarrollo de un sistema confiable y reproducible para evaluar la resistencia a la adhesión de células estromales mediadas por fármacos. Blood. 2009; 11 (20):4441 -4450) y BH3 miméticos como ABT-737 o ABT-263 (Vogler M et al. Regulación concurrente de BCL-XL y BCL2A1 induce a un pliegue de resistencia de aproximadamente 1000 a ABT-737 en leucemia linfocítica crónica. Blood. 2009; 113(18):4403-4413), Células CLL en el microambiente estromal puede recibir señales proliferativas o anti-apoptoicas del estroma y protegerse de la apoptosis celular. Por lo tanto, agentes que antagonizan las interacciones pueden reducir la resistencia mediada por el estroma en CLL.
El compuesto de fórmula I puede modular el microambiente estromal. En estudios clínicos, la mayoría de los pacientes tratados con el compuesto I y otros agentes que identificaban la vía BCR exhibieron una rápida y transitoria linfocitosis. Sin limitarse a la teoría, el compuesto I puede modular el microambiente estromal inhibiendo la quimiotaxis de células CLL hacia CXCL12/13, reduciendo la migración de células CLL por debajo de células estromales, desregulando la secreción de quimioquinas, o inhibiendo la fosforilación de otros objetivos decrecientes como AKT y ERK. Para caracterizar si el compuesto I modula la interacción CLL-estroma aumentando la apoptosis mitochondrial o prima, se utilizó el perfil BH3 para medir la permeabilización de la mitocondria inducida por péptidos derivados de dominios pro-muerte BH3 de la familia de proteínas pro-muerte BCL-2.
Primero, se examinaron células CLL de la sangre periférica de 30 pacientes. La mayoría de los pacientes no habían sido tratados previamente, y ninguno había recibido terapia recientemente. A una concentración final de 0.03 µ? en el perfil BH3, el peptido BIM BH3 indujo una cantidad significativa de polarización en la mayoría de las muestas de los pacientes, con 22/30 (73.3%) de muestras que tenían >50% de polarización por 1 hora. Como se ilustra en la Figura 58A, las células CLL estaban altamente cebadas para apoptosis. Igualmente, los resultados del perfil BH3 mostraron que la mayoría de las muestras de pacientes con CLL revelaron un relativo aumento de polarización del péptido BAD BH3, sugiriendo dependencia primaria de BCL-2 (n = 23). Como se ilustra en la Figura 58B, se observó que las muestras dependían más de MCL-1 (n = 5), o BCL-XL (n = 2). Como se ilustra en la Figura 58C, se observó que las muestras previas al tratamiento de tratamientos en pacientes na'íve alcanzaron respuesta parcial (PR) o completa (CR) por criterios 2008 IW-CLL siendo más cebadas que las muestras de pacientes con enfermedad progresiva (PD) durante o en 6 meses de haber completado la terapia de primera línea de CLL (p = 0.024). Como se ilustra en la Figura 58D, el perfil BH3 ilustra que los pacientes con estado IGHV no mutado (n = 7) fueron significativamente más cebados que pacientes con estado IGHV mutado (n=18) (p = 0.0026). Como se ilustra en la Figura 58E, se observó que el procentaje de homología VH a la linea germinal era positivamente correlativo con el nivel de cebado (p = 0.0043). Por lo tanto, se observó que las células CLL fueron altamente cebadas para apoptosis, que las células CLL generalmente dependían de BCL-2, y que el aumento de cebado se asoció con la respuesta clínica mejorada e IGHV no mutado.
Luego, se evaluaron los efectos del compuesto I en la adhesión, viabilidad y prima de células CLL expuestas al estroma in vitro. Las Figuras 59A-E generalmente mostraron que el compuesto I liberó las células CLL secuestradas en el estroma para superar la resistencia mediada por el estroma. Las células CLL derivadas de la sangre periférica fueron marcadas con calceína-AM y co-cultivadas en estromaNKTert por 24 horas con o sin el compuesto I (10 µ?), enjuagadas mediante pipeteo suave y visualizadas con un microscopio de amplio campo. Como se ilustra en la Figura 59A, el co-cultivo de las células CLL con el estroaNKTert y tratadas con el compuesto I exhibieron menos adherencia a las 24 horas. Igualmente, la Figura 59B ¡lustró que la adherencia reducida de células CLL se detectó aún después de solo una hora de tratamiento con el compuesto I, lo cual fue previo a la muerte de las células CLL. Además, la Figura 59C ilustra que la desadherencia de células CLL del estroma en respuesta al compuesto I resultó en la mayor eliminación de células CLL. En particular, el porcentaje medio de viabilidad para dos pacientes se representó junto con SE en la Figura 59C, y ambos pacientes demostraron una profunda resistencia mediada por el estroma a ABT-737 a 100 nM o al compuesto I a 10 µ? solo. Se observó que la resistencia se superó con la combinación de los dos compuestos.
Para evitar examinar la eliminación directa de células CLL por el compuesto I, dos muestras de pacientes con CLL resistentes a ABT-737 y al compuesto I fueron tratadas en presencia del estroma. En ambas muestras, el compuesto I reestableción la sensibilidad de las células CLL al ABT-737 en presencia del estroma. Además, células CLL expuestas al estroma tratadas con el compuesto I (10 µ?) en combinación con varias dosis de ABT-737 y su análogo oral ABT-263 mostraron que las células CLL expuestas al estroma exhibieron un aumento en la muerte con dependencia a la dosis con cualqueir BH3 mimético. Específicamente, con referencia a la Figura 59D, resistencia a ABT-737 se observó en presencia de StromaNKTert, pero se puede supercar con bajas concentraciones de ABT-737 de 10 nM. Con referencia a la Figura 59E, ABT-263 tuvo una curva parecida a la respuesta de la dosis.
Para determinar si la inhibición de PI3K aumentó la sensibilidad de las células expuestas al estroma aumentando la primar, se cultivaron células CLL derivadas de PB con o sin células StromaNKTert por 24 horas y se examinaron utilizando perfiles de Anexina -Pl y BH3. Células CLL no tratadas generalmente exhibieron apoptosis en cultivo ex vivo por 24 horas (Collins RJ et al. Spontaneous programmed death (apoptosis) of B-chronic lymphocytic leukaemia cells following their culture in vitro. British journal of haematology. 1989; 71 (3) : 343-350) . Muestras de co-cultivos estromales de cuatro pacientes con CLL llevaron a la protección contra la apoptosis en células no tratadas. Particularmente, con referencia a la Figura 60A, un análisis de dos vías ANOVA, demostró que el estroma sirvió de protección contra la apoptosis en ausencia del compuesto I. En ausencia del estroma, se observó que el compuesto I induce más a la apoptosis que el control. En presencia del estroma, se observó que el compuesto I induce significativamente más a la poptosis que el control. Por lo tanto, no se observó diferencia significativa entre la eliminación por el compuesto I en presencia o ausencia del estroma.
Sin embargo, la resistencia o protección contra la apoptosis se revirtió por el compuesto I. Más del 40% de apoptosis se detectó en células CLL expuestas al estroma tratadas con el compuesto I (10 µ?) en comparación con menos del 10% de apoptosis en células CLL expuestas a estromas no tratados. Igualmente, conforme se ¡lustra en la Figura 60B, la perfilación BH3 mostró que las células CLL expuestas al estroma tratadas con el compuesto I exhibieron un aumento en la prima mitocondrial a las 24 horas en comparación con células no tratadas (p = 0.075). Conforme se ilustra en la Figura 60C, los péptidos BAD BH3 y ABT-737 utilizados como tal indujeron significativamente más despolarización mitocondrial en células CLL tratadas con el compuesto I (p = 0.046 y p = 0.047, respectivamente). Esto sugiere que el tratamiento con el compuesto I resulta en la desadherencia del CLL del estroma, acompañado por el aumento de la prima mitocondrial y el aumento de la sensibilidad al antagonismo del BCL-2.
En general, este ejemplo sugiere que la inibición de PI3K antagoniza la protección de células CLL por parte del stroma, y que el compuesto I fue efectivo al revertir los efectos del estroma en las células CLL: adhesión, adherencia, disminución de la prima mitocondrial, y disminución de la sensibilidad a terapias que inhiben BCL-2. Igualmente, la efectividad del compuesto I puede asociarse con la redistribución de linfocitos en pacientes. Al liberar células CLL del estroma, el compuesto I posiblemente permitió que las células CLL emergieran de medio anti-apoptótico estromal, por lo tanto aumentando su prima mitocondrian y volviéndose susceptible a la apoptosis. Este ejemplo también sugiere que las combinaciones de inhibición de PI3K con la inhibición de BCL-2 aumentan las respuestas a la inhibición de BCL-2 inhibition.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el tratamiento del cáncer, que consiste en administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de formulaA, donde R es ?, halo, o C1-C6 alquilo; R' is C1-C6 alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprendebendamustina, rituximab, lenalidomida y ofatumumab.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto es
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto es
4. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde el cáncer es una neoplasia hematológica maligna.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde la neoplasia hematológica maligna es una neoplasia maligna de células B.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde la neoplasia hematológica maligna es leucemia o linfoma.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde el cáncer es leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkiniano(NHL).
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el cáncer es linfoma no Hodgkiniano indoloro (¡NHL).
9. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde el compuesto y uno o más agentes terapéuticos se administran al menos una vez durante al menos un ciclo, y donde uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde el ciclo es de 7 a 42 días.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto on al menos el primer y segundo día de al menos un ciclo.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde uno o más agentes terapéuticos se administran semanalmente al sujeto durante al menos un ciclo.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde entre 50 mg y 200 mg del compuesto se administra al sujeto dos veces al día.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde entre 50 mg/m2 y 1,500 mg/m2 de uno o más agentes terapéuticos se administra al sujeto.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el compuesto está presente en una composición farmacéutica que comprende el compuesto, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el sujeto es resistente a tratamientos estándares de quimioterapia.
17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el sujeto tiene al menos un ganglio linfático agrandado.
18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el sujeto es i) resistente a al menos un tratamiento de quimioterapia, o ¡i) está en una etapa de recaída después del tratamiento con quimioterapia, o una combinación del mismo.
19. Un método para tratar a un sujeto con un trastorno de células B, que consiste en: a) identificar un sujeto con neoplasia maligna de células B, donde el sujeto es resistente o se encuentra en una etapa de recaída después de al menos uno o más tratamientosseleccionados del grupo que comprende bortezomib (Velcade®), carfilzomib (PR-171), PR-047, disulfiram, lactacistina, PS-519, eponemicina, epoxomicina, aclacinomicina, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, inhibidores de vinil sulfona tripeptido, ritonavir, PI-083, (+/-)-7-metilomuralide, (-)-7-metilomuralide, perifosina, rituximab, citrato de sildenafil (Viagra®), CC-5103, talidomida, epratuzumab (anticuerpos humanizados hl_L2- anti-CD22), simvastatin, enzastaurin, Campath 1H®, dexametasona, DT PACE, oblimersen, antineoplaston A10, antineoplaston AS2 1, alemtuzumab, beta aletina, ciclofosfamida, clorhidrato de doxorubicina, PEGylated liposomal clorhidrato de doxorubicina, prednisona, prednisolona, cladribina, sulfato de vincristina, fludarabina, filgrastim, melfalán, recombinante de interferon alfa, carmustina, cisplatin, ciclofosfamida, citarabina, etopósido, melfalán, dolastatin 10, indium In 111 anticuerpo monoclonal MN-14, itrio Y 90 epratuzumab humanizado, globulina antitimocítica, busulfan, ciclosporina, metotrexato, micofenolato mofetilo, linfocitos alogénicos terapéuticos, Itrio Y 90 ibritumomab tiuxetan, sirolimus, tacrolimus, carboplatino, tiotepa, paclitaxel, aldesleukin, recombinante de inferieron alfa, docetaxel, ifosfamida, mesna, recombinante de la interleucina-12, recombinante de la interleucina-11 , Bcl-2 inhibidor de la proteína de la familia de ABT-263, denileucina diftitox , tanespimycin, everoíimus, pegfilgrastim, vorinostat, alvocidib, recombinante ligando FLT3, trombopoyetina humana recombinante, células ciocidas activadas por linfoquina, trihidrato de amifostina, aminocamptotecina, clorhidrato de irinotecan , acetato de caspofungina, clofarabina, epoetin alfa, nelarabina, pentostatina, sargramostim, ditartrato vinorelbina, WT-1 vacuna de péptido análogo, WT1 126-134 vacuna de péptido, fenretinida, ixabepilona, oxaliplatina, anticuerpos monoclonales CD19, anticuerpos monoclonales CD20, ácidos grasos omega-3, clorhidrato de mitoxantrona, acetato de octreotida, tositumomab con yodo I 131 tositumomab, motexafin gadolinium, trióxido de arsénico, tipifarnib, HSPPC-96 derivado de un tumor humano autólogo, veltuzumab, briostatina 1, anticuerpos monoclonales anti-CD20, clorambucil, pentostatina, lumiliximab, apolizumab, Anti-CD40, ofatumumab, temsirolimus, bendamustina, análogos de purina, lenalidom ida, un agentee alquilante, and una terapia con antraciclinas, o una combinación del mismo; b) administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, un compuesto de fórmula I" una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionalmente seleccionados del grupo que comprendebendamustina, rituximab, lenalidomida y ofatumumab.
20 El método de acuerdo con la reivindicación 0, donde el sujeto es resistente o se encuentra en una etapa de recaída after al menos uno o más tratamientos seleccionados del grupo que comprende rituximab, un agentee alquilante, fludarabina, y una terapia con antraciclinas, y una combinación de los mismos.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, donde entre 50 mg y 200 mg del compuesto se administra al sujeto dos veces al día durante uní menos uno o más ciclos.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 19 o 20, donde entre 50 mg/m2 y 1,500 mg/m2 de uno o más agentes terapéuticos adicionales se administra al sujeto al menos una vez durante al menos uno o más ciclos, donde uno o más agentes terapéuticos se administran al sujeto en el mismo ciclo o en un ciclo diferente al de la administración del compuesto.
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