KR20240086759A - RCD1 gene derived from maize controlling plant drought stress resistance and uses thereof - Google Patents

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KR20240086759A
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박경철
최익영
박남일
류시환
한정헌
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성을 조절하는 옥수수 유래 RCD1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 식물체에 건조 저항성을 부여할 수 있는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 옥수수 RCD1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the corn-derived RCD1 gene that regulates the drying stress resistance of plants and its use. More specifically, to the corn RCD1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 that can confer drying resistance to plants and its use. It's about.

Description

식물체의 건조 스트레스 저항성을 조절하는 옥수수 유래 RCD1 유전자 및 이의 용도{RCD1 gene derived from maize controlling plant drought stress resistance and uses thereof}RCD1 gene derived from maize that controls drought stress resistance of plants and uses thereof {RCD1 gene derived from maize controlling plant drought stress resistance and uses thereof}

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성을 조절하는 옥수수(Zea mays L.) 유래 RCD1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the RCD1 gene derived from corn ( Zea mays L.), which regulates drought stress resistance in plants, and its use.

옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 작물 중 하나이며, 생육기간 동안 다양한 생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스 요인들로 인해 생산 및 수량에 영향을 받고 있다. 특히 가뭄은 옥수수 생산에 있어 가장 중요한 환경적 저해 요소이며, 전 세계적으로 가뭄에 의해 옥수수 수량이 15% 정도 감소하는 것으로 보고되었다. 일반적으로 옥수수는 가뭄 스트레스를 받으면 유묘기 형성, 영양 생장, 뿌리 발달, 광합성, 개화기, ASI, 종실 형성, 수량 등에 심각한 영향을 미치게 된다. 특히 영양생장에서 생식생장으로 전환되는 단계에 한발 스트레스를 받으면 수꽃 및 화분 방출이 늦어지고, 출사기 및 옥수수 수염 발생도 늦어져 ASI (anthesis-silking interval)가 증가하여 수정이 불가능 하거나 수정이 되더라도 배 발생 억제 및 방해를 받아 수량 감소의 큰 원인이 된다. 따라서, 건조 스트레스에 내성을 부여하는 유전인자들의 개발은 경제적 및 사회적 가치가 매우 크다.Corn ( Zea mays L.) is one of the world's three largest crops, and its production and yield are affected by various biotic and/or abiotic stress factors during the growing season. In particular, drought is the most important environmental obstacle to corn production, and it has been reported that corn yields decrease by about 15% worldwide due to drought. In general, when corn is subjected to drought stress, seedling formation, vegetative growth, root development, photosynthesis, flowering, ASI, seed formation, and yield are seriously affected. In particular, if drought stress occurs during the transition from vegetative growth to reproductive growth, the release of male flowers and pollen is delayed, the budding period and the development of corn silk are delayed, and the ASI (anthesis-silking interval) increases, making fertilization impossible or embryo generation even if fertilization occurs. It is suppressed and obstructed, which is a major cause of water quantity reduction. Therefore, the development of genetic factors that provide tolerance to drying stress has great economic and social value.

한편, 한국등록특허 제2019041호에는 '옥수수 한발 내성 판별방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0071821호에는 '건조 스트레스 저항성 관련 유전자 및 형질전환 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물체의 건조 스트레스 저항성을 조절하는 옥수수 유래 RCD1 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 2019041 discloses 'a method for determining drought tolerance in corn', and Korean Patent Publication No. 2011-0071821 discloses 'genes and transgenic plants related to drought stress resistance', but the 'drying stress resistance-related genes and transgenic plants' of the present invention are disclosed. There has been no description of the corn-derived RCD1 gene that regulates the drought stress resistance of plants and its uses.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 옥수수의 건조 저항성 부여 유전인자들을 찾고자, Illumina사에서 제공하는 SNP 칩을 사용하여 다양한 옥수수 계통들에 대한 유전자형 분석을 수행하여, 옥수수 RCD1 유전자 내부에 위치한 특정 SNP를 동정할 수 있었으며, 상기 SNP 위치의 염기서열 종류에 따라 아미노산 잔기의 변이 및 건조 저항성의 강화 또는 약화를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was developed in response to the above-mentioned needs. In order to find genes that confer drying resistance in corn, the present inventors performed genotyping on various corn lines using a SNP chip provided by Illumina, and performed corn RCD1 The present invention was completed by identifying a specific SNP located inside the gene, and confirming the mutation of amino acid residues and the strengthening or weakening of drying resistance depending on the type of base sequence at the SNP position.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a corn-derived RCD1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

또한, 본 발명은 상기 RCD1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.Additionally, the present invention provides a gene encoding the RCD1 protein.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.Additionally, the present invention provides a recombinant vector containing the above gene.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.Additionally, the present invention provides host cells transformed with the above recombinant vector.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 건조 스트레스 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of transforming a plant cell with a recombinant vector containing a corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and redifferentiating the transformed plant from the transformed plant cells.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 건조 스트레스 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.Additionally, the present invention provides transgenic plants with controlled drought stress resistance prepared by the production method of the present invention and their transformed seeds.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides drought stress resistance in plants, comprising the step of transforming plant cells with a recombinant vector containing the corn-derived RCD1 protein-encoding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to regulate the expression of the RCD1 protein-encoding gene. Provides a method to control .

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스 저항성 조절용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for regulating drought stress resistance in plants, comprising the corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.

본 발명은 식물체에 건조 저항성을 부여할 수 있는 기능의 옥수수 RCD1 유전자 서열 및 건조 저항성에 대한 기능 강화를 위한 RCD1 유전자 관련 SNP 정보를 확보하였으므로, 상기 정보를 작물 품종 개발에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 최근 개발된 유전체교정 기술을 적용하여 건조 저항성이 부여된 우수한 옥수수 종자를 개발해 낼 수 있을 것으로 판단된다.Since the present invention has secured the corn RCD1 gene sequence, which has the function of imparting drought resistance to plants, and the SNP information related to the RCD1 gene to enhance the function of drought resistance, it is expected that the information can be usefully used in the development of crop varieties. do. In particular, it is believed that excellent corn seeds with desiccation resistance can be developed by applying recently developed genome editing technology.

도 1은 건조 저항성 또는 감수성 옥수수 계통들의 건조 스트레스 처리 후 표현형을 확인한 결과이다.
도 2는 가뭄 스트레스 관련 특히 SNP 선발 과정을 보여주는 것으로, 그룹 내에서는 동일하고 그룹간에는 다른 특징을 보이는 동형의(homozygous) SNP들만 최종 선발하였다. 최종 선발된 SNP는 도면 내 노란 줄로 표시하였다.
도 3은 SNP 유전자형 분석 결과로, 최종 선발된 건조 스트레스 저항성 또는 감수성 형질 연관 133개 SNP 정보를 보여준다.
도 4는 선발된 133개 SNPs에 대한 상세 정보 분석 결과이다.
도 5는 옥수수 건조 스트레스 저항성 관련 유전자들의 구조 분석 도면이다.
도 6은 건조 스트레스 저항성 옥수수 계통의 RCD1 유전자와 감수성 옥수수 계통의 rcd1 유전자의 염기서열 비교 결과이다.
도 7은 건조 스트레스 저항성 옥수수 계통의 RDC1 유전자(서열번호 1, T) 또는 감수성 옥수수 계통의 rcd1 유전자(서열번호 3, S)가 도입된 애기장대 식물체들의 건조 스트레스 저항성 시험 결과이다.
Figure 1 shows the results of confirming the phenotype of drought-resistant or susceptible maize lines after treatment with drought stress.
Figure 2 shows the SNP selection process specifically related to drought stress, and only homozygous SNPs that were identical within a group and showed different characteristics between groups were finally selected. The final selected SNP is indicated by a yellow line in the figure.
Figure 3 shows the results of SNP genotyping analysis, showing information on the 133 SNPs associated with finally selected drought stress resistance or susceptibility traits.
Figure 4 shows the detailed information analysis results for the selected 133 SNPs.
Figure 5 is a structural analysis diagram of genes related to corn drying stress resistance.
Figure 6 shows the base sequence comparison results of the RCD1 gene of a dry stress-resistant maize line and the rcd1 gene of a susceptible maize line.
Figure 7 shows the results of a dry stress resistance test of Arabidopsis plants into which the RDC1 gene (SEQ ID NO: 1, T) of a dry stress-resistant maize line or the rcd1 gene (SEQ ID NO: 3, S) of a susceptible maize line was introduced.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a corn-derived RCD1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

또한, 본 발명은 상기 옥수수 유래 RCD1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 옥수수 유래 RCD1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Additionally, the present invention provides a gene encoding the corn-derived RCD1 protein. The corn-derived RCD1 gene of the present invention may be composed of the base sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 RCD1 유전자는 가뭄 저항성 옥수수 계통으로 분리된 것으로, 야생형(wild type)의 옥수수 RCD1 유전자(Genbank accession number: XM_008646096.3의 550 내지 2,292 nt)와 일부 염기에 차이가 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열에서 745번째, 755번째, 982번째, 1,433번째 및 1,606번째 염기는 각각 A, A, T, A 및 G이지만, 야생형 옥수수 RCD1 유전자는 해당 위치 염기가 각각 G, G, C, G 및 A인 점에서 차이가 있다. 특히, 상기 염기의 변이는 모두 non-synonymous 변이로, 옥수수 RCD1 단백질의 아미노산 잔기가 치환되는 변이인 것이 특징이다. The RCD1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention was isolated from a drought-resistant corn line, and is composed of the wild type corn RCD1 gene (550 to 2,292 nt of Genbank accession number: XM_008646096.3) and some bases. There is a difference. Specifically, in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention, the 745th, 755th, 982nd, 1,433rd, and 1,606th bases are A, A, T, A, and G, respectively, but the wild-type corn RCD1 gene has the bases at the corresponding positions. The difference is that are G, G, C, G, and A, respectively. In particular, all of the above base mutations are non-synonymous mutations, and are characterized by mutations in which amino acid residues of the corn RCD1 protein are substituted.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector containing the corn-derived RCD1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term “recombinant” refers to a cell that replicates a heterologous nucleic acid, expresses a heterologous nucleic acid, or expresses a peptide, heterologous peptide, or protein encoded by a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments that are not found in the natural form of the cell, either in sense or antisense form. Additionally, recombinant cells can express genes found in cells in their natural state, but the genes have been modified and reintroduced into the cells by artificial means.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.The term “vector” is used to refer to a DNA fragment(s) or nucleic acid molecule that is delivered into a cell. Vectors replicate DNA and can reproduce independently in host cells. The term “vector” is often used interchangeably with “vector”. The term “expression vector” refers to a recombinant DNA molecule containing the coding sequence of interest and the appropriate nucleic acid sequence necessary to express the operably linked coding sequence in a particular host organism.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. Additionally, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of advancing transcription (e.g., pLλ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.), It typically includes a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/translation termination sequence. When Escherichia coli is used as a host cell, the promoter and operator regions of the E. coli tryptophan biosynthesis pathway and the left-handed promoter of phage λ (pLλ promoter) can be used as control regions.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.Meanwhile, vectors that can be used in the present invention include plasmids often used in the art (e.g., pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), phages (e.g., λgt4·λB) , λ-Charon, λΔz1, and M13, etc.) or viruses (e.g., SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and uses a eukaryotic cell as a host, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (e.g., metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (e.g., adenovirus) Viral late promoters, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and typically have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.The recombinant vector of the present invention is preferably a plant expression vector.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of a plant expression vector is the Ti-plasmid vector, which is capable of transferring part of itself, the so-called T-region, into plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens . Other types of Ti-plasmid vectors (see EP 0 116 718 B1) are currently used to transfer hybrid DNA sequences into plant cells or protoplasts from which new plants can be produced that properly integrate the hybrid DNA into the plant's genome. there is. A particularly preferred form of Ti-plasmid vectors are the so-called binary vectors as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce genes according to the invention into plant hosts include viral vectors such as those that may be derived from double-stranded plant viruses (e.g., CaMV) and single-stranded viruses, geminiviruses, etc. For example, it may be selected from non-intact plant virus vectors. The use of such vectors can be particularly advantageous when it is difficult to properly transform plant hosts.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector preferably contains one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence that has characteristics that can be generally selected by chemical methods, and includes all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. There is a resistance gene, but it is not limited to this.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 SRPP(small rubber particle-associated protein), CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In the plant expression vector according to the present invention, the promoter may be a small rubber particle-associated protein (SRPP), CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS, or histone promoter, but is not limited thereto. The term "promoter" refers to the region of DNA upstream from a structural gene and refers to the DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. A “plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental states or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of transformants can be accomplished at various stages and by various tissues. Therefore, constitutive promoters do not limit selection possibilities.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린합성효소(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the plant expression vector according to the present invention, the terminator can be a conventional terminator, examples of which include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, and Agrobacterium terminator. These include, but are not limited to, the terminator of the Octopine gene of Rhium tumefaciens.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides host cells transformed with the above recombinant vector.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention can be any host cell known in the art, including microalgae, microorganisms, etc., such as E. coli JM109, E. coli BL21, Bacillus genus strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B , E. coli and Enterobacteriaceae strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, and various Pseudomonas species.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포이다.In addition, when the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, yeast (e.g., Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7) are used as host cells. , 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells can be used, preferably plant cells.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.Methods for transporting the vector of the present invention into a host cell include, when the host cell is a prokaryotic cell, the CaCl 2 method and the Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)) and electroporation methods. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, the vector can be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene bombardment. You can.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 건조 스트레스 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.The present invention also includes the steps of transforming a plant cell with a recombinant vector containing a corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and redifferentiating the transformed plant from the transformed plant cells.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily require a regeneration and/or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species including both monocots as well as dicots. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Methods include the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts, electroporation of protoplasts, microinjection into plant elements, particle bombardment (DNA or RNA-coated) of various plant elements, invasion of plants or characterization of mature pollen or spores. It can be appropriately selected from Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer by conversion, infection by (non-complete) virus, etc. A preferred method according to the invention involves Agrobacterium mediated DNA transfer. Particular preference is given to using the so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.

본 발명의 방법은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.The method of the present invention includes the step of transforming a plant cell with a recombinant vector containing the corn-derived RCD1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the transformation is carried out in Agrobacterium tumefaciens ( A. tumefaciens ). can be mediated by Additionally, the method of the present invention includes the step of redifferentiating a transformed plant from the transformed plant cell. A method for redifferentiating a transgenic plant from a transgenic plant cell can use any method known in the art.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.The “plant cell” used for plant transformation can be any plant cell. The plant cells may be any form of cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs and more preferably cultured cells. “Plant tissue” refers to differentiated or undifferentiated plant tissues, such as, but not limited to, fruits, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used in culture, such as single cells and protoplasts. (protoplast), shoot and callus tissue. Plant tissue may be in planta or in organ culture, tissue culture, or cell culture.

본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물 세포에서 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시키면 비형질전환 식물체에 비해 건조 스트레스 저항성이 증가되는 형질전환 식물체를 제조할 수 있다.In the method for producing a transgenic plant according to an embodiment of the present invention, increasing the expression of the corn-derived RCD1 protein coding gene in the transformed plant cell results in a transgenic plant having increased drought stress resistance compared to a non-transgenic plant. can be manufactured.

본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 건조 스트레스 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.The present invention also provides transgenic plants with controlled drought stress resistance prepared by the production method of the present invention and their transformed seeds.

전술한 것과 같이, 본 발명의 형질전환 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가된 경우에는 건조 스트레스 저항성이 증가되는 것을 특징으로 한다.As described above, the transgenic plant of the present invention is characterized by increased drought stress resistance when the expression of the corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is increased.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 옥수수, 벼, 보리, 밀, 호밀, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the plant is a monocot plant such as corn, rice, barley, wheat, rye, sugarcane, oats, and onion, or Arabidopsis thaliana, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato, burdock, mugwort, It may be dicotyledonous plants such as lettuce, bellflower root, spinach, Swiss chard, sweet potato, celery, carrot, water parsley, parsley, Chinese cabbage, cabbage, mustard radish, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, and pea. , but is not limited to this.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.The present invention also provides drought stress resistance in plants, comprising the step of transforming plant cells with a recombinant vector containing the corn-derived RCD1 protein-coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to regulate the expression of the RCD1 protein-coding gene. Provides a method to control .

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 가뭄 스트레스 저항성 조절 방법에 있어서, 상기 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가된 경우에는 건조 스트레스 저항성이 증가될 수 있다.In the method for controlling drought stress resistance in plants according to an embodiment of the present invention, when the expression of the corn-derived RCD1 protein coding gene is increased, drought stress resistance may be increased.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시킴으로써, 식물체의 건조 스트레스 저항성을 조절할 수 있다.The present invention also provides a composition for controlling drought stress resistance in plants, comprising the corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient. The composition of the present invention contains the corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO. 2 as an active ingredient, and transforms plant cells with the gene or a recombinant vector containing the gene, thereby increasing the plant's resistance to drying stress. It can be adjusted.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. 건조 저항성 옥수수 식물체의 선발Example 1. Selection of drought-resistant corn plants

강원도농업기술원 옥수수연구소에서 분양받은 국내 육성 옥수수 계통들을 대상으로 유묘기 건조 저항성 시험을 수행하였다. 간단하게, 유묘기 내건성 검정 시험을 위해 계통 당 30개의 종자를 대조구와 실험구로 나누어 15개의 50구 규격 육묘용 포트에 원예용 상토를 흙으로 이용하여 파종하였다. 발아 직후 식물체 중 활력이 좋지 않은 개체들을 솎아주어 최종적으로 계통 당 40개체씩을 시험에 이용하였다. 포트 안에서 개체들의 주간 거리는 5.5cm, 조간 거리는 11cm로 유지하였으며 강원도농업기술원 옥수수연구소 DH 시설하우스에서 실험을 진행하였다. 하우스 내부의 고온과 같은 건조 이외의 스트레스를 최소화하기 위해 낮에는 측창을 열어 공기를 순환시켰으며 차광막을 설치하여 직사광선에 노출되지 않도록 하였다. 수분공급은 대조구와 실험구의 상토가 마르지 않도록 하루 2회 수분을 공급하였다. 건조 처리는 개체들의 50% 이상이 3엽기가 되었을 무렵 처리하였다. 대조구는 지속적으로 수분을 공급하였으며 실험구는 모든 개체가 고사 할 때까지 수분공급을 중단하였다. 단수 이후 생존율을 조사하였으며 생존율이 같은 경우 대조구와 비교하여 쓰러짐이 덜 한 계통을 유묘기 내건성에 더 우수한 계통으로 평가하였다.A seedling-stage drying resistance test was conducted on domestically grown corn lines distributed from the Corn Research Institute of the Gangwon Provincial Agricultural Research and Extension Services. Briefly, for the seedling season drought tolerance test, 30 seeds per line were divided into control and experimental groups and sown in 15 50-hole standard seedling pots using horticultural topsoil as soil. Immediately after germination, plants with poor vitality were thinned out and ultimately 40 plants per line were used for testing. The inter-day distance of the individuals within the pot was maintained at 5.5 cm and the inter-day distance at 11 cm, and the experiment was conducted at the DH facility house of the Corn Research Institute of the Gangwon Provincial Agricultural Research and Extension Services. To minimize stress other than drying, such as the high temperature inside the house, the side windows were opened during the day to circulate air, and a light shield was installed to prevent exposure to direct sunlight. Water was supplied twice a day to prevent the topsoil of the control and experimental groups from drying out. Drying treatment was performed when more than 50% of the individuals reached the third leaf stage. The control group continued to provide moisture, and the experimental group stopped supplying water until all the animals died. The survival rate after cutting was investigated, and if the survival rate was the same, the line with less collapse compared to the control was evaluated as the line with better drought tolerance in the seedling stage.

건조 저항성 수치 정보를 기반으로 건조 스트레스에 매우 강한 계통 5점(표 1의 No. 6 내지 10)과 매우 약한 계통 5점(표 1의 No. 1 내지 5)을 각각 최종 선발하였다(도 1 및 표 1).Based on the drying resistance numerical information, 5 lines (No. 6 to 10 in Table 1) that were very resistant to drying stress and 5 lines (No. 1 to 5 in Table 1) that were very weak to drying stress were finally selected (Figures 1 and 1). Table 1).

건조 저항성 시험을 통해 선발된 옥수수 10계통 정보Information on 10 corn lines selected through drying resistance tests No.No. 계통명System name 생존율(%)Survival rate (%) No.No. 계통명System name 생존율(%)Survival rate (%) 1One 06S813006S8130 2525 66 07S804507S8045 9090 22 06S814006S8140 1515 77 04S807704S8077 6565 33 hf17hf17 1010 88 04S809304S8093 6565 44 hf19hf19 1010 99 05S1003205S10032 6060 55 02S807202S8072 55 1010 B84B84 5050

실시예 2. 50K 옥수수 SNP 칩을 활용한 genome-wide SNP 유전자형 분석Example 2. Genome-wide SNP genotyping using a 50K corn SNP chip

Illumina사의 MaizeSNP50 BeadChip은 종실용 옥수수 B73의 참조 서열(reference)을 기반으로 제작되었으며 B73은 건조 저항성이 매우 약한 계통으로 보고되어졌다. MaizeSNP50 BeadChip은 전체 56,110개의 SNPs 분자마커를 포함하고 있으며, 옥수수 게놈 1 megabase(Mb)당 평균 25개 이상의 마커를 검정할 수 있다. 본 발명자는 상기 SNP chip을 사용하여, 상기 실시예 1에서 선발한 건조 스트레스에 매우 강한 계통 5점과 매우 약한 계통 5점을 대상으로 genome-wide SNP 유전자형 분석을 수행하였다. 그 결과 총 42,863개의 SNPs의 유전자형 분석이 가능하였으며 이 정보를 기반하여 저항성/감수성 SNPs를 선발하였다.Illumina's MaizeSNP50 BeadChip was manufactured based on the reference sequence of seed corn B73, and B73 was reported to be a strain with very weak drought resistance. MaizeSNP50 BeadChip contains a total of 56,110 SNPs molecular markers, and can test an average of more than 25 markers per megabase (Mb) of the corn genome. Using the SNP chip, the present inventors performed genome-wide SNP genotyping analysis on 5 lines that were very resistant to drying stress and 5 lines that were very weak to drying stress selected in Example 1. As a result, genotyping of a total of 42,863 SNPs was possible, and resistance/susceptibility SNPs were selected based on this information.

실시예 3. 연관 분석을 통한 건조 저항성 관련 SNPs 선발Example 3. Selection of SNPs related to desiccation resistance through linkage analysis

집단 또는 개체 특이 SNP들의 선발은 먼저 형질 및 특성에 따라 비교군을 설정하고 그룹간 상반되어지는 SNP를 선발하는 방식을 사용하였다. 특히, 상반되는 SNP들 중 이형성의(heterozygous) 형태로 존재하는 SNP들은 제외하였으며 동형의(homozygous) SNP들만 최종 선발하였다(도 2).Selection of group- or individual-specific SNPs was done by first setting a comparison group according to traits and characteristics and then selecting SNPs that were conflicting between groups. In particular, among the conflicting SNPs, SNPs that exist in heterozygous form were excluded, and only homozygous SNPs were finally selected (Figure 2).

앞서 기술한 방법론을 토대로 건조 저항성 또는 감수성 계통군을 비교군으로 설정하고 그룹 내에서는 동일하지만 두 그룹 간 상반되는 SNP locus를 선발하는 방식으로 진행하였다. 그 결과 133개의 가뭄 저항성 또는 감수성 연관 SNP 분자마커들을 선발할 수 있었다(도 3).Based on the methodology described above, a desiccation-resistant or susceptible clade was set as the comparison group, and SNP locus that were identical within the group but conflicting between the two groups were selected. As a result, 133 SNP molecular markers associated with drought resistance or susceptibility were selected (Figure 3).

실시예 4. 옥수수 건조 스트레스 저항성/감수성 연관 133개 SNPs의 게놈내 위치 정보 분석Example 4. Analysis of location information in the genome of 133 SNPs associated with corn drying stress resistance/susceptibility

생물정보학적 기술(NCBI에서 제공하는 BlastN, BlastX 프로그램과 SMS(The Sequence Manipulation Suite, https://bioinformatics.org/sms/)에서 제공하는 in vitro translation 프로그램)을 사용하여 133개의 SNPs에 대한 상세 위치 정보 분석을 수행하였다. 그 결과 51개의 SNPs는 유전자가 아닌 지역에, 12개의 SNPs는 정보가 알려지지 않은 유전자의 엑손(exon) 서열에, 20개의 SNPs는 유전자의 인트론(intron) 서열에, 37개의 SNPs는 기능이 확인된 유전자의 단백질 암호화 지역인 엑손에, 그리고 12개의 SNPs는 유전자의 UTR (untranslated region) 지역에 존재하고 있는 것이 확인되었다. 이들 중 기능이 확인된 유전자에 위치하는 37개의 SNPs를 대상으로 아미노산 변이를 유도하는 SNPs를 조사하였으며, 그 결과 19개의 SNPs는 아미노산 변이를 일으키지 않는 반면 18개의 SNPs는 DNA 변이에 따라 아미노산의 변이를 유도하고 있는 것을 확인하였다. 이들 기능이 확인된 유전자의 엑손 서열에 존재하며 아미노산 변이를 유도하는 18개의 SNPs를 옥수수 건조 스트레스 관련 유전인자로 최종 선발하였다(도 4).Detailed location of 133 SNPs using bioinformatic techniques (BlastN and BlastX programs provided by NCBI and in vitro translation programs provided by SMS (The Sequence Manipulation Suite, https://bioinformatics.org/sms/)). Information analysis was performed. As a result, 51 SNPs were located in non-gene regions, 12 SNPs were located in exon sequences of genes for which information was unknown, 20 SNPs were located in intron sequences of genes, and 37 SNPs were located in regions with confirmed functions. It was confirmed that 12 SNPs were present in the exon, the protein coding region of the gene, and in the UTR (untranslated region) region of the gene. Among these, 37 SNPs located in genes with confirmed functions were investigated for SNPs that induce amino acid mutations. As a result, 19 SNPs did not cause amino acid mutations, while 18 SNPs caused amino acid mutations depending on DNA mutation. It was confirmed that it was being induced. Eighteen SNPs that exist in the exon sequences of genes with confirmed functions and induce amino acid mutations were finally selected as genetic factors related to corn drying stress (Figure 4).

최종 선발된 18개의 SNPs가 위치하는 유전자들에 대한 in-sillico 기능 분석과 선행 연구논문 결과를 토대로 건조 스트레스 저항성에 밀접하게 관련되어있는 것으로 예상되는 6개의 유전자들을 선발하였으며 그 정보는 표 2와 같다.Based on the in-silico functional analysis of the genes where the 18 finally selected SNPs are located and the results of previous research papers, 6 genes expected to be closely related to drying stress resistance were selected, and the information is shown in Table 2. .

옥수수 건조 스트레스 저항성 관련 유전자들의 상세 정보Detailed information on genes related to corn drying stress resistance SNPSNP Gene activityGene activity SusceptibleSusceptible TolerantTolerant PZE-101189877PZE-101189877 Glutamine synthaseGlutamine synthase AAAA CCCC PZA02367.1PZA02367.1 RCD1RCD1 GGGG AAAA SYN24806SYN24806 Early flowering proteinEarly flowering proteins CCCC AAAA SYN2723SYN2723 Ring finger proteinRing finger protein AAAA GGGG SYN4187SYN4187 ARFARF CCCC AAAA PZE-108030790PZE-108030790 MYB transcription factorMYB transcription factor AAAA GGGG

실시예 5. 옥수수 건조 스트레스 저항성 관련 유전자들의 구조 분석Example 5. Structural analysis of genes related to corn drying stress resistance

선발된 옥수수 건조 스트레스 관련 유전자 6개에 대한 유전자 구조 분석을 수행하였다(도 5). 이와 더불어 건조 스트레스 저항성 및 감수성 계통들로부터 해당 유전자들의 cDNA 염기서열을 확보하고 비교함으로써 구조 및 SNP 여부를 재차 검증하였다. 일부 선택적 전사물이 발견되기는 하였지만 6개 모두 유전자의 구조 및 SNP의 존재를 재차 확인하였다.Gene structure analysis was performed on six selected corn drying stress-related genes (Figure 5). In addition, the structure and SNP were verified again by securing and comparing the cDNA sequences of the genes from the drought stress-resistant and susceptible lines. Although some selective transcripts were discovered, the structure of all six genes and the presence of SNPs were confirmed again.

실시예 6. 옥수수 건조 스트레스 저항성 관련 유전자들의 기능 검증Example 6. Functional verification of genes related to corn drying stress resistance

선발된 6개의 후보 SNP 중 하나는 옥수수 inactive poly [ADP-ribose] polymerase RCD1 유전자의 745번째로, 상기 유전자의 첫 번째 엑손에 위치하며 아스파트산(Aspartic Acid, D)/아스파라긴(Asparagine, N) 변이를 만드는 것이 확인되었다(도 6). 또한, 건조 스트레스에 대한 저항성 또는 감수성 계통의 옥수수의 RCD1 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 상기 SNP 외에도 아미노산 치환을 유도하는 염기 변이가 확인되었다(도 6). RCD1 유전자는 비생물적 스트레스(abiotic stress) 반응에 반드시 필요하며 여러 가지 스트레스 반응 유전자를 조절할 수 있음이 보고되어 졌다.One of the six selected candidate SNPs is the 745th of the corn inactive poly [ADP-ribose] polymerase RCD1 gene, located in the first exon of the gene, and contains Aspartic Acid (D)/Asparagine (N) It was confirmed that mutations were created (Figure 6). In addition, as a result of analyzing the base sequence of the RCD1 gene of corn from lines resistant or sensitive to drying stress, base mutations leading to amino acid substitutions were confirmed in addition to the above SNPs (FIG. 6). It has been reported that the RCD1 gene is essential for abiotic stress response and can regulate various stress response genes.

본 발명자는 건조 스트레스 저항성 및 감수성 계통으로부터 각각 전사체(RCD1rcd1)를 별도 분리하여 식물 발현 벡터를 제작하였으며, 애기장대 식물체에 도입하여 그 기능을 검증하였다. 식물 발현 벡터 제작을 위해, 스트레스 저항성 또는 감수성 계통으로부터 옥수수 RCD1 유전자(Genbank accession number: XM_008646096.3)의 전장 서열은 게이트웨이 클로닝 방법(Karimi et al. 2002)을 따라 유전자 특이적 프라이머 세트(forward-attB1: 5'-AAAAAGCAGGCTTGATGGAACAGAGGAATGTTCTGGCA-3' (서열번호 4) 및 reverse-attB2: 5'-AGAAAGCTGGGTATTACTCGGCTACTCCCCCTCCCTCTT-3' (서열번호 5))를 이용하여 증폭하였다. 어댑터 프라이머 세트(attB1-adapter: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' (서열번호 6) 및 attB2-adapter: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3' (서열번호 7))를 이용한 PCR의 두 번째 라운드 후, 증폭된 산물을 BP clonase Ⅱ (Invitrogen, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 pDONOR221 벡터로 서브클로닝하였다. 재조합 벡터는 대장균 TOP10 세포(Invitrogen)에 형질전환하고, 카나마이신 저항성을 통해 형질전환체를 선발한 후 분리된 플라스미드는 시퀀싱 분석을 통해 확인하였다. Gateway LR Clonase Ⅱ Plus Enzyme Mix (Invitrogen)를 이용하여 pDONOR221 벡터 내 유전자 구축물을 pB7FWG2 binary destination 벡터로 삽입하였다. 상기 클론을 대장균 TOP10 세포에 형질전환하고, 스펙티노마이신을 사용하여 형질전환체를 선발하여, 최종 발현 벡터(pB7FWG2 harboring ZmRCD1)를 준비하였다. 상기 벡터 컨스트럭트는 CaMV 35S 프로모터에 의해 ZmRCD1 유전자의 발현이 조절되고, 선발 마커로 bar 유전자를 포함하고 있다. 상기 재조합 벡터는 애기장대 식물체에 아그로박테리움 매개 형질전환 방법을 통해 도입하였고, 실시예 1에 개시된 방법과 동일한 방법으로 형질전환 식물체의 건조 스트레스 저항성 여부를 확인하였다.The present inventors separately isolated transcripts ( RCD1 and rcd1 ) from drought stress-resistant and sensitive lines, respectively, to construct plant expression vectors, and to verify their function by introducing them into Arabidopsis plants. For the construction of plant expression vectors, the full-length sequence of the maize RCD1 gene (Genbank accession number: : 5'-AAAAAAGCAGGCTTGATGGAACAGAGGAATGTTCTGGCA-3' (SEQ ID NO: 4) and reverse-attB2: 5'-AGAAAGCTGGGGTATTACTCGGCTACTCCCCCTCCTCTT-3' (SEQ ID NO: 5). After the second round of PCR using an adapter primer set (attB1-adapter: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' (SEQ ID NO. 6) and attB2-adapter: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3' (SEQ ID NO. 7)), the amplified product was subcloned into the pDONOR221 vector using BP clonase II (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's instructions. The recombinant vector was transformed into E. coli TOP10 cells (Invitrogen), transformants were selected through kanamycin resistance, and the isolated plasmid was confirmed through sequencing analysis. The gene construct in the pDONOR221 vector was inserted into the pB7FWG2 binary destination vector using Gateway LR Clonase II Plus Enzyme Mix (Invitrogen). The clone was transformed into E. coli TOP10 cells, transformants were selected using spectinomycin, and the final expression vector (pB7FWG2 harboring ZmRCD1 ) was prepared. The vector construct regulates the expression of the ZmRCD1 gene by the CaMV 35S promoter and contains the bar gene as a selection marker. The recombinant vector was introduced into Arabidopsis plants through an Agrobacterium-mediated transformation method, and the drought stress resistance of the transformed plants was confirmed using the same method as disclosed in Example 1.

그 결과, 건조 저항성 계통에서 발현되는 ZmRCD1 유전자(서열번호 1)가 도입된 애기장대 식물체에서 건조 스트레스 환경에서 저항성을 가지는 것을 확인 할 수 있었다(도 7). 이상의 결과를 통해 건조 스트레스 저항성 계통 유래의 ZmRCD1 유전자를 옥수수 건조 스트레스 저항성 신품종 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대되었다.As a result, it was confirmed that Arabidopsis plants into which the ZmRCD1 gene (SEQ ID NO: 1) expressed in a drought-resistant line was introduced had resistance in a dry stress environment (FIG. 7). Based on the above results, it was expected that the ZmRCD1 gene derived from the dry stress resistant line could be used to develop new corn dry stress resistant varieties.

또한, 본 발명자는 ZmRCD1 유전자의 745번째에 위치하는 SNP를 확인할 수 있는 분자마커를 개발하였으며, 상기 분자마커를 이용하여 건조 스트레스 저항성 및 감수성 옥수수 자원 판별 마커로, 신품종 개발에 활용하고자 한다.In addition, the present inventor has developed a molecular marker that can identify the SNP located at position 745 of the ZmRCD1 gene, and plans to use the molecular marker to develop new varieties as a marker for determining drought stress resistance and susceptible corn resources.

서열목록 전자파일 첨부Sequence list electronic file attached

Claims (12)

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질.Corn-derived RCD1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 제1항의 RCD1 단백질을 코딩하는 유전자.A gene encoding the RCD1 protein of claim 1. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.The gene according to claim 2, wherein the gene consists of the base sequence of SEQ ID NO: 1. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector containing the gene of claim 2. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.A host cell transformed with the recombinant vector of claim 4. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물인 것을 특징으로 하는 숙주세포.The host cell according to claim 5, wherein the host cell is a plant. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 건조 스트레스 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
Transforming a plant cell with a recombinant vector containing the corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and
A method for producing a transformed plant with controlled drought stress resistance, comprising the step of redifferentiating the transformed plant from the transformed plant cell.
제7항에 있어서, 상기 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시켜 비형질전환 식물체에 비해 건조 스트레스 저항성이 증가시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조 방법.The method of claim 7, wherein drying stress resistance is increased compared to non-transgenic plants by increasing the expression of the corn-derived RCD1 protein coding gene. 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 건조 스트레스 저항성이 조절된 형질전환 식물체.A transgenic plant with controlled drought stress resistance prepared by the method of claim 7 or 8. 제9항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.A transformed seed of the plant according to claim 9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 RCD1 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스 저항성을 조절하는 방법.A method for controlling drought stress resistance of a plant, comprising transforming a plant cell with a recombinant vector containing the corn-derived RCD1 protein-coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and controlling the expression of the RCD1 protein-coding gene. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 옥수수 유래 RCD1 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 스트레스 저항성 조절용 조성물.A composition for controlling drought stress resistance in plants, comprising as an active ingredient the corn-derived RCD1 protein coding gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
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