KR20240024963A - 티아졸-락탐-스피로헤테로사이클릭 화합물 및 이의 적용 - Google Patents
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Abstract
티아졸-락탐-스피로헤테로사이클릭 화합물 및 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에서 이의 적용. 구체적으로, 화학식 I로 표시되는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염이 개시된다:
화학식 I
.
화학식 I
.
Description
이 출원은 다음의 우선권을 주장한다:
2021년 6월 28일에 출원된 CN202110722003.6;
2021년 12월 31일에 출원된 CN202111673614.2;
2022년 6월 17일에 출원된 CN202210693548.3.
발명 분야
본 개시내용은 티아졸로락타모스피로헤테로사이클릭 화합물의 부류 및 관련 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 화학식 I로 표시되는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
Ras/Raf/MEK/ERK 경로는 대Ras/Raf/MEK/ERK 경로는 고전적인 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK) 신호전달 캐스케이드 경로이고, 활성화 후 다양한 성장 인자, 사이토카인, 미토겐 및 호르몬 수용체의 신호전달에 관여하며, 세포 성장, 분화 및 생존을 조절하기 위한 가장 중요한 신호전달 경로 중 하나이다.
연구에 따르면, 돌연변이 또는 증폭으로 인한 Ras/Raf/MEK/ERK 경로의 비정상적인 활성화가 다양한 암(cancer)의 결정 요인이다. 인간 종양에서, RAS 돌연변이의 발생률은 약 22%이고, BRAF 돌연변이의 발생률은 약 7%이고, MEK 돌연변이의 발생률은 약 1%이다. 따라서, 이 경로의 핵심 노드 단백질은 암 치료의 중요한 표적이 되었다(Cancer Discov. 2019, 9, 329-341). 현재, 다수의 BRAF 억제제와 MEK1/2 억제제 뿐만 아니라 이들의 병용 섭생이 흑색종(melanoma), BRAFV600E 돌연변이체 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 및 기타 암의 치료를 위해 미국 FDA의 승인을 받았다. 그러나, 이러한 업스트림 노드에 BRAF 및 MEK 억제제의 사용은 돌연변이 또는 경로 재활성화로 인한 약물 내성의 문제를 빠르게 유도하여 이들의 임상 적용을 크게 제한할 수 있다.
세포외 조절 단백질 키나제(ERK)(특히 ERK1 및 ERK2 키나제)는 Ras/Raf/MEK/ERK 경로의 주요 플레이어(player)이고 다운스트림 핵심 노드이며, 이들의 과잉 활성화가 많은 인간 암에서 발견될 수 있다. 이 경로의 말단 신호전달 키나제로서 ERK는 아직 약물 내성을 유도하는 돌연변이를 갖는 것으로 발견되지 않았다. 따라서, ERK 키나제를 표적으로 하는 약물은 업스트림 표적 억제제에 의한 치료에 의해 유발된 약물 내성 문제를 극복하고, 더욱 잠재적인 치료 전략이 될 것으로 기대된다. 그러나, 지금까지 ERK 억제제에 대한 연구는 아직 임상 단계에 있으며, 약물로 시판 허가를 받은 ERK 억제제는 없었다.
요약하면, 종양 치료의 필요성을 충족하기 위해 안전하고 효과적인 ERK 억제제를 개발하는 것이 시급히 필요하다.
본 개시내용은 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, 여기서 C1-3 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Ra로 치환되고;
R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, 여기서 C1-3 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rc로 치환되고;
n은 0 또는 1이고;
m은 1 또는 2이고;
환 A는 피라졸릴 및 테트라하이드로피라닐로부터 선택되며, 여기서 피라졸릴 및 테트라하이드로피라닐은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되고;
Ra 및 Rc는 각각 독립적으로 D, F, Cl, Br 및 I로부터 선택되고;
Rd는 F, Cl, Br, I, C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시로부터 선택되며, 여기서 C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시는 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환되고;
R은 F, Cl, Br 및 I로부터 선택된다.
본 개시내용은 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
화학식 I
상기 화학식 I에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, 여기서 C1-3 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Ra로 치환되고;
R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, 여기서 C1-3 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rc로 치환되고;
n은 0 또는 1이고;
m은 1 또는 2이고;
환 A는 피라졸릴 및 테트라하이드로피라닐로부터 선택되며, 여기서 피라졸릴 및 테트라하이드로피라닐은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되고;
Ra 및 Rc는 각각 독립적으로 D, F, Cl, Br 및 I로부터 선택되고;
Rd는 F, Cl, Br, I, C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시로부터 선택되며, 여기서 C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시는 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환되고;
R은 F, Cl 및 Br로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CH3 및 CH2CH3으로부터 선택되며, 여기서 CH3 및 CH2CH3은 임의로 1, 2 또는 3개의 Ra로 치환되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CH3, CHF2, CD3 및 CH2CH3으로부터 선택되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 CH3으로부터 선택되며, 여기서 CH3은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rc로 치환되고, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 CH3으로부터 선택되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 Rd는 F, Cl, Br, I, CH3 및 OCH3으로부터 선택되며, 여기서 CH3 및 OCH3은 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 Rd는 CH3 및 OCH3으로부터 선택되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 환 A는 , 및 로부터 선택되며, 여기서 , 및 는 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 환 A는 , 및 로부터 선택되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 구조적 모이어티(structural moiety) 는 로부터 선택되며, 다른 변수들은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용은 또한 임의의 상기 언급된 변수를 조합함으로써 수득되는 일부 구현예를 포함한다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 개시되며, 여기서 상기 화합물은 화학식 I-1 및 I-2로부터 선택된다:
[화학식 I-1]
[화학식 I-2]
상기 화학식 I-1 및 I-2에서,
R2, R6 및 R7은 본 개시내용에 정의된 바와 같다.
본 개시내용은 또한 다음 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
.
본 개시내용은 또한 고형 종양(solid tumor)을 치료하기 위한 의약의 제조에서 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 10.2080±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크(characteristic diffraction peak)를 갖는 X-선 분말 회절 패턴(X-ray powder diffraction pattern)을 특징으로 하는 WX001의 결정 형태(crystal form) A를 제공한다:
.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 2θ 각도로 표현된 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 10.2080±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 및 25.4797±0.2000°로부터 선택된 적어도 4개 또는 5개의 회절 피크를 포함한다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다: 10.2080±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 25.4797±0.2000°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 2θ 각도로 표현된 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음으로부터 선택된 적어도 6, 7 또는 8개의 회절 피크를 포함한다: 10.2080±0.2000°, 15.2687±0.2000°, 17.6747±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 21.0531±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 및 25.4797±0.2000°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다: 10.2080±0.2000°, 15.2687±0.2000°, 17.6747±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 21.0531±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 25.4797±0.2000°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 2θ 각도로 표현된 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음으로부터 선택된 적어도 9, 10, 11 또는 12개의 회절 피크를 포함한다: 10.2080±0.2000°, 14.4684±0.2000°, 15.2687±0.2000°, 17.6747±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 21.0531±0.2000°, 21.5713±0.2000°, 22.0420±0.2000°, 22.4540±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 및 25.4797±0.2000°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다: 10.2080±0.2000°, 14.4684±0.2000°, 15.2687±0.2000°, 17.6747±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 21.0531±0.2000°, 21.5713±0.2000°, 22.0420±0.2000°, 22.4540±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 25.4797±0.2000°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다: 10.2080±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 및/또는 20.6217±0.2000°, 및/또는 9.4003±0.2000°, 및/또는 10.4856±0.2000°, 및/또는 14.4684±0.2000°, 및/또는 15.0133±0.2000°, 및/또는 15.2687±0.2000°, 및/또는 15.6003±0.2000°, 및/또는 15.9518±0.2000°, 및/또는 16.6214±0.2000°, 및/또는 17.6747±0.2000°, 및/또는 17.9514±0.2000°, 및/또는 18.4703±0.2000°, 및/또는 19.1531±0.2000°, 및/또는 19.6571±0.2000°, 및/또는 21.0531±0.2000°, 및/또는 21.2894±0.2000°, 및/또는 21.5713±0.2000°, 및/또는 22.0420±0.2000°, 및/또는 22.4540±0.2000°, 및/또는 23.1098±0.2000°, 및/또는 24.5027±0.2000°, 및/또는 25.0767±0.2000°, 및/또는 25.4797±0.2000°, 및/또는 25.8919±0.2000°, 및/또는 26.3255±0.2000°, 및/또는 26.9544±0.2000°, 및/또는 28.3997±0.2000°, 및/또는 29.0345±0.2000°, 및/또는 29.3507±0.2000°, 및/또는 33.5390±0.2000°, 및/또는 34.2457±0.2000°, 및/또는 37.9776±0.2000°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 X-선 분말 회절 패턴은 다음의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다: 10.2080°, 10.4856°, 14.4684°, 15.0133°, 15.2687°, 15.9518°, 16.6214°, 17.6747°, 17.9514°, 18.4703°, 18.8429°, 19.1531°, 20.6217°, 21.0531°, 21.2894°, 21.5713°, 22.0420°, 22.4540°, 25.0767°, 25.4797°, 26.3255°, 26.9544°.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 XRPD 패턴은 실질적으로 도 1에 도시된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 XRPD 패턴의 분석 데이터는 표 1에 제시된 바와 같다:
[표 1]
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A는 241.0±3.0℃에서 흡열 피크의 개시를 갖는 시차 주사 열량계 곡선((differential scanning calorimetry curve)을 갖는다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 DSC 곡선은 도 2에 도시된 바와 같다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A는 150.0±3.0℃에서 최대 0.83%의 중량 감소(weight loss)를 갖는 열중량 분석 곡선(thermogravimetric analysis curve)을 갖는다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 상기 언급된 결정 형태 A의 TGA 곡선은 도 3에 도시된 바와 같다.
본 개시내용은 또한 고형 종양의 치료를 위한 의약의 제조에서 상기 언급된 결정 형태 A의 용도를 제공한다.
기술적 효과
본 개시내용의 화합물은 ERK1 및 ERK2 효소에 대해 우수한 억제 활성을 나타내고; 본 개시내용의 화합물은 HT29 세포 증식에 대해 우수한 억제 활성을 나타내며; 본 개시내용의 화합물은 상이한 pH 조건 하에서 우수한 용해도를 갖고; 본 개시내용의 화합물은 우수한 약동학적 특성 및 종양 억제 효과를 갖는다.
정의 및 용어
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 다음 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다. 특정 용어 또는 문구는 특별한 정의의 부재하에 불명확하거나 불분명한 것으로 간주되어서는 안 되며, 통상적인 의미로 이해되어야 한다. 상표명이 본원에 나타날 때, 이는 그의 상응하는 상품 또는 이의 활성 성분을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이, 신뢰할 수 있는 의학적 판단 범위 내에서 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태의 관점에서 본원에 사용된다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본원에 개시된 특정 치환체를 갖는 화합물을 비교적 무독성 산 또는 염기와 반응시킴으로써 제조되는 본원에 개시된 화합물의 염을 의미한다. 본원에 개시된 화합물이 비교적 산성 작용성 그룹을 함유하는 경우, 화합물을 순수한 용액 또는 적절한 불활성 용매에서 충분한 양의 염기와 접촉시킴으로써 염기 부가 염이 수득될 수 있다. 본원에 개시된 화합물이 비교적 염기성 작용성 그룹을 함유하는 경우, 화합물을 순수한 용액 또는 적절한 불활성 용매에서 충분한 양의 산과 접촉시킴으로써 산 부가 염이 수득될 수 있다. 본원에 개시된 일부 특이적 화합물은 염기성 및 산성 작용성 그룹을 모두 함유하며, 임의의 염기 또는 산 부가 염으로 전환될 수 있다.
본원에 개시된 약제학적으로 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 산성 또는 염기성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물 중의 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "이성체"는 기하 이성체, 시스 이성체 또는 트랜스 이성체, 입체이성체, 거울상 이성체, 광학 이성체, 부분입체이성체 및 토오토머를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 개시된 화합물은 특정 기하 또는 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 본 개시내용은 시스 및 트랜스 이성체, (-)- 및 (+)-거울상 이성체, (R)- 및 (S)-거울상 이성체, 부분입체이성체, (D)-이성체, (L)-이성체 및 라세미 혼합물 및 기타 혼합물, 예를 들어, 거울상 이성체 또는 부분입체이성체가 농축된 혼합물을 포함한 모든 이러한 화합물을 고려하며, 이들 모두 본원에 개시된 범위 내에 포함된다. 알킬과 같은 치환체는 추가의 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있다. 이들 이성체 및 이의 혼합물 모두 본원에 개시된 범위 내에 포함된다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "거울상 이성체" 또는 "광학 이성체"는 서로 미러링 관계(mirrored relationship)에 있는 입체이성체를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "시스-트랜스 이성체" 또는 "기하 이성체"는 환 형성 탄소 원자 사이의 이중 결합 또는 단일 결합이 자유롭게 회전할 수 없음에 의해 생성된다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "부분입체이성체"는 두 개 이상의 키랄 중심이 분자 내에 함유되어 있고 분자 간 비미러링 관계(non-mirrored relationship)에 있는 입체이성체를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, "(+)"는 우선성이성체(dextroisomer)를 의미하고, "(-)"는 좌선성이성체(levoisomer)를 의미하고, "(±)"는 라세미체를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 쐐기형 실선 결합( ) 및 쐐기형 점선 결합( )은 입체중심의 절대 구성을 나타내고; 직선형 실선 결합( ) 및 직선형 점선 결합( )은 입체중심의 상대적 구성을 나타내며; 물결선( )은 쐐기형 실선 결합( ) 또는 쐐기형 점선 결합( )을 나타내거나; 물결선( )은 직선형 실선 결합( ) 및 직선형 점선 결합( )을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "토오토머" 또는 "토오토며 형태"는 이성체 중 상이한 작용성 그룹은 동적 평형 상태에 있으며, 실온에서 서로 빠르게 전환될 수 있음을 의미한다. 토오토머가 가능하다면(용액에서와 같이), 토오토머의 화학적 평형이 달성될 수 있다. 예를 들어, 양성자 토오토머(프로토트로픽 토오토머로서 공지되기도 함)는 케토-에놀 이성체화 및 이민-엔아민 이성체화와 같은 양성자 전달에 의한 상호 변환을 포함한다. 원자가 토오토머는 일부 결합 전자의 재조합에 의한 상호 변환을 포함한다. 케토-에놀 토오토머화의 특정 예는 두 토오토머 펜탄-2,4-디온과 4-하이드록시펜트-3-엔-2-온 사이의 상호 변환이다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "하나의 이성체가 농축된", "이성체 농축된", "하나의 거울상 이성체가 농축된" 또는 "거울상 이성체 농축된"은 하나의 이성체 또는 거울상 이성체의 함량이 100% 미만이고, 이성체 또는 거울상 이성체의 함량이 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 96% 이상, 또는 97% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 99.5% 이상, 또는 99.6% 이상, 또는 99.7% 이상, 또는 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상임을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "이성체 과잉" 또는 "거울상 이성체 과잉"은 두 이성체 또는 두 거울상 이성체의 상대적 백분율 간의 차이를 의미한다. 예를 들어, 하나의 이성체 또는 거울상 이성체가 90%의 양으로 존재하고, 다른 이성체 또는 거울상 이성체가 10%의 양으로 존재하는 경우, 이성체 또는 거울상 이성체 과잉(ee 값)은 80%이다.
광학 활성 (R)- 및 (S)-이성체, 또는 D 및 L 이성체는 키랄 합성 또는 키랄 시약 또는 다른 통상적인 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 개시된 특정 화합물의 한 종류의 거울상 이성체가 수득되는 경우, 순수한 목적하는 거울상 이성체는 키랄 보조체의 비대칭 합성 또는 유도체 작용에 이어서 생성된 부분입체이성체 혼합물을 분리하고 보조 그룹을 절단함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 분자가 염기성 작용성 그룹(예: 아미노) 또는 산성 작용성 그룹(예: 카르복실)을 함유하는 경우, 화합물은 적절한 광학 활성 산 또는 염기와 반응하여 부분입체이성체성 이성체의 염을 형성한 다음, 당업자의 통상적인 방법을 통해 부분입체이성체 분해에 적용하여 순수한 거울상 이성체를 수득한다. 또한, 거울상 이성체 및 부분입체이성체는 일반적으로 키랄 고정상을 사용하고 임의로 화학적 유도체 방법(예: 아민으로부터 생성된 카바메이트)과 결합하는 크로마토그래피를 통해 단리된다.
본원에 개시된 화합물은 화합물을 구성하는 원자 중 하나 이상에 부자연스러운 비율의 원자 동위원소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 예를 들어, 삼중수소(3H), 요오드-125(125I) 또는 C-14(14C)로 표지될 수 있다. 또 다른 예로, 수소는 중수소로 교체되어 중수소화 약물을 형성할 수 있다. 중수소와 탄소 사이의 결합은 일반 수소와 탄소 사이의 결합보다 더 강하다. 중수소화되지 않은 약물에 비해, 중수소화 약물은 독성 부작용 감소, 약물 안정성 증가, 효능 향상 및 약물의 생물학적 반감기 연장이라는 장점을 갖는다. 방사능에 관계없이, 본원에 개시된 화합물의 동위원소 조성의 모든 변화는 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
용어 "임의의" 또는 "임의로"는 후속 이벤트 또는 상태가 발생할 수 있지만 필수는 아니며, 이벤트 또는 상태가 발생하는 경우와 이벤트 또는 상태가 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "치환된"은 특정 원자의 원자가가 정상이고 치환된 화합물이 안정한 한, 특정 원자 상의 하나 또는 하나 이상의 수소 원자(들)가 중수소 및 수소 변이체를 포함한 치환체에 의해 치환된다는 것을 의미한다. 치환체가 옥소(즉, =O)인 경우, 두 개의 수소 원자가 치환된다는 것을 의미한다. 방향족 환상의 위치는 옥소로 치환될 수 없다. 용어 "임의로 치환된"은 원자가 치환체로 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있고, 달리 명시되지 않는 한, 치환체의 종 및 수는 화학적으로 달성 가능한 한 임의적일 수 있다.
임의의 변수(예: R)가 화합물의 구성 또는 구조에서 한 번 이상 발생하는 경우, 각 발생시 변수의 정의는 독립적이다. 따라서, 예를 들어, 한 그룹이 0 내지 2개의 R로 치환된 경우, 그룹은 최대 2개의 R로 임의로 치환될 수 있으며, 여기서 각 발생시 R의 정의는 독립적이다. 또한, 치환체 및/또는 이의 변이체의 조합은 그 조합이 안정한 화합물을 초래하는 경우에만 허용된다.
-(CRR)0-과 같이 연결 그룹의 수가 0인 경우, 연결 그룹이 단일 결합임을 의미한다.
치환체의 수가 0이면, 치환체가 존재하지 않음을 의미한다. 예를 들어, -A-(R)0은 구조가 실제로 -A임을 의미한다.
치환체가 비어 있으며, 치환체가 존재하지 않음을 의미한다. 예를 들어, X가 A-X에서 비어 있으면, A-X의 구조는 실제로 A이다.
변수 중 하나가 단일 결합인 경우, 단일 결합으로 연결된 두 그룹이 직접 연결되어 있음을 의미한다. 예를 들어, A-L-Z에서 L이 단일 결합을 나타내는 경우, A-L-Z의 구조는 실제로 A-Z이다.
치환체의 결합이 환상의 두 개 이상의 원자에 가교 결합될 수 있는 경우, 이러한 치환체는 환상의 임의의 원자에 결합될 수 있다. 예를 들어, 구조적 모이어티 또는 는 이의 치환체 R이 사이클로헥실 또는 사이클로헥사디엔 상의 임의의 부위에서 치환될 수 있음을 나타낸다. 열거된 치환체가 치환된 그룹에 어느 원자를 통해 연결되는지를 나타내지 않는 경우, 이러한 치환체는 임의의 원자를 통해 결합될 수 있다. 예를 들어, 치환체로서 피리딜 그룹은 피리딘 환상의 탄소 원자 중 어느 하나를 통해 치환된 그룹에 연결될 수 있다.
열거된 연결 그룹이 그의 연결 방향을 표시하지 않는 경우, 그의 연결 방향은 임의적이다. 예를 들어,에서 연결 그룹 L이 -M-W-인 경우, -M-W-는 왼쪽에서 오른쪽으로 읽는 순서와 동일한 방향으로 환 A 및 환 B에 연결되어 를 구성하거나, 왼쪽에서 오른쪽으로 읽는 순서와 반대 방향으로 환 A 및 환 B에 연결되어 를 구성할 수 있다. 연결 그룹, 치환체 및/또는 이의 변이체의 조합은 그러한 조합이 안정한 화합물을 초래할 수 있는 경우에만 허용된다.
달리 명시되지 않는 한, 그룹이 하나 이상의 연결 가능한 부위를 갖는 경우, 그룹의 임의의 하나 이상의 부위는 화학적 결합을 통해 다른 그룹에 연결될 수 있다. 화학적 결합의 연결 위치가 가변적이고 연결 가능한 부위(들)에 H 원자(들)가 있는 경우, H 원자(들)를 갖는 연결 가능한 부위(들)가 화학적 결합에 연결되면,이 부위의 H 원자(들)의 수는 연결된 화학적 결합의 수가 증가함에 따라 상응하게 감소하고, 그룹은 상응하는 원자가의 그룹이 될 것이다. 부위와 다른 그룹 사이의 화학적 결합은 직선형 실선 결합(), 직선형 점선 결합() 또는 물결선( )으로 나타낼 수 있다. 예를 들어, -OCH3에서 직선형 실선 결합은 그룹이 그룹 중 산소 원자를 통해 다른 그룹에 연결되어 있음을 나타내고; 에서 직선형 점선 결합은 그룹이 그 그룹 중 질소 원자의 두 말단을 통해 다른 그룹에 연결되어 있음을 나타내고; 에서 물결선은 그룹이 페닐 그룹 중 1-탄소 및 2-탄소 원자를 통해 다른 그룹에 연결되어 있음을 나타내고; 는 피페리디닐 그룹 상의 임의의 연결 가능한 부위가 적어도 4개의 연결 방식, , , 및 를 포함하는 하나의 화학적 결합을 통해 다른 그룹에 연결될 수 있음을 나타내며; H 원자가 -N-에 그려지는 경우에도, 은 의 연결 방식을 여전히 포함하고; 다만 하나의 화학적 결합이 연결되는 경우, 이 부위의 H가 하나 감소될 것이며, 그룹은 상응하는 1가 피페리디닐 그룹이 될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 환 상의 원자 수는 일반적으로 환 구성원의 수로 정의되며, 예를 들어, "5 내지 7원 환"은 원주 방향으로 배열된 5 내지 7개 원자의 "환"을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "C1-3 알킬"은 1 내지 3개의 탄소 원자로 이루어진 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 그룹을 나타내는 데 사용된다. C1 -3 알킬 그룹은 C1-2 및 C2-3 알킬 그룹 등을 포함한다. 이는 1가(예: 메틸), 2가(예: 메틸렌) 또는 다가(예: 메테닐)일 수 있다. C1 -3 알킬 그룹의 예는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(n-프로필 및 이소프로필 포함) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "C1-3 알콕시"는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유하고 산소 원자에 의해 분자의 나머지에 부착된 알킬 그룹을 지칭한다. C1 -3 알콕시 그룹은 C1-2, C2-3, C3 및 C2 알콕시 그룹 등을 포함한다. C1 -3 알콕시 그룹의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시(n-프로폭시 및 이소프로폭시 포함) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 화합물은 하기 열거된 구현예, 다른 화학적 합성 방법과 함께 하기 열거된 구현예에 의해 형성된 구현예 및 당업자에게 익히 공지된 등가의 교체를 포함하는 당업자에게 익히 공지된 다양한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적인 구현예는 본원에 개시된 실시예를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "구현예" 또는 "구현예들" 또는 "또 다른 구현예에서" 또는 "일부 구현예에서"에 대한 참조는 그 구현예와 관련하여 기재된 구체적으로 참조된 요소, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 나타나는 문구 "하나의 구현예에서" 또는 "한 구현예에서" 또는 "또 다른 구현예에서" 또는 "일부 구현예에서"는 반드시 모두 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정 요소, 구조 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
본 개시내용에서, DSC 곡선의 Exo Up은 상향 발열을 나타낸다.
본원에 개시된 화합물의 구조는 당업자에게 익히 공지된 통상적인 방법에 의해 확인될 수 있다. 본 개시내용이 화합물의 절대 구성에 관한 것이면, 절대 구성은 단일 결정 X-선 회절(SXRD)과 같은 당업계의 통상적인 기술에 의해 확인될 수 있다. 단일 결정 X-선 회절(SXRD)에서, 배양된 단일 결정의 회절 강도 데이터를 스캔의 스캐닝 모드에서 CuKα 방사선의 광원이 있는 브루커(Bruker) D8 벤처 회절계를 사용하여 수집하고; 관련 데이터를 수집한 후, 결정 구조를 직접 방법(Shelxs97)으로 추가로 분석하여 절대 구성을 확인한다.
본 개시내용은 아래의 실시예를 통해 상세히 기재될 것이다. 이러한 실시예는 본 개시내용에 대한 임의의 제한을 의미하지 않는다.
본 개시내용에 사용된 모든 용매는 상업적으로 이용 가능하며, 추가 정제 없이 사용될 수 있다.
본 개시내용에 사용된 용매는 상업적으로 이용 가능하다.
다음과 같은 약어가 본 개시내용에 사용된다: aq는 수성을 나타내고; eq는 당량 또는 등가를 나타내고; DCM은 디클로로메탄을 나타내고; PE는 석유 에테르를 나타내고; DMSO는 디메틸 설폭사이드를 나타내고; EtOAc는 에틸 아세테이트를 나타내고; EtOH는 에탄올을 나타내고; MeOH는 메탄올을 나타내고; BOC는 아민 보호 그룹인 3급-부톡시카보닐을 나타내고; r.t.는 실온을 나타내고; O/N은 밤새를 나타내고; THF는 테트라하이드로푸란을 나타내고; Boc2O는 디-3급-부틸 디카보네이트를 나타내고; TFA는 트리플루오로아세트산을 나타내고; DIPEA는 디이소프로필에틸아민을 나타내고; iPrOH는 2-프로판올을 나타내고; mp는 융점을 나타낸다.
화합물은 당업계의 일반적인 명명 원칙에 따라 또는 ChemDraw® 소프트웨어에 의해 명명되며, 상업적으로 이용 가능한 화합물은 공급업체 디렉토리 명칭으로 명명된다.
본 개시내용에 사용된 X-선 분말
회절계
(
XRPD
) 방법
기기 모델: PANalytical의 X'Pert3 X-선 회절계
테스트 방법: 약 10mg의 샘플을 XRPD 검출에 사용했다.
[표 1]
본 개시내용에서 사용된 시차 주사 열량계(
DSC
) 방법
기기 모델: TA 2500 시차 주사 열량계
[표 3]
본 개시내용에서 사용된 열 중량 분석기(
TGA
) 방법
기기 모델: TA 5500 열중량 분석기
[표 4]
본 개시내용에서 사용된 동적 증기 흡착(
DVS
) 방법
동적 증기 흡착(DVS) 곡선은 표면 측정 시스템(SMS) 회사의 DVS 내장 플러스에서 수집했다. 25℃에서의 상대 습도는 LiCl, Mg(NO3)2 및 KCl의 조해성 포인트(dseliquescent point)를 사용하여 보정했다.
[표 5]
[표 6]
참고: △W%는 25 ± 1℃ 및 80 ± 2% RH에서 수분 흡수에 의한 테스트 샘플의 중량 증가를 나타낸다.
도 1: Cu-Kα 방사선을 사용한 WX001의 결정 형태 A의 XRPD 패턴;
도 2: WX001의 결정 형태 A의 DSC 곡선;
도 3: WX001의 결정 형태 A의 TGA 곡선;
도 4: WX001의 결정 형태 A의 DVS 패턴;
도 5: 각각 용매 및 WX001 투여 후 모델 동물에서 인간 흑색종 A375의 종양 성장 곡선;
도 6: 투여 동안 인간 흑색종 A375 모델 동물의 체중 변화율.
도 2: WX001의 결정 형태 A의 DSC 곡선;
도 3: WX001의 결정 형태 A의 TGA 곡선;
도 4: WX001의 결정 형태 A의 DVS 패턴;
도 5: 각각 용매 및 WX001 투여 후 모델 동물에서 인간 흑색종 A375의 종양 성장 곡선;
도 6: 투여 동안 인간 흑색종 A375 모델 동물의 체중 변화율.
본 개시내용은 실시예에 의해 아래에 상세히 기재된다. 그러나, 이러한 실시예들이 본 개시내용에 대한 임의의 불리한 제한을 갖는다는 것을 의도하지 않는다. 본 개시내용은 본원에 상세히 기재되어 있으며, 구현예들도 또한 본원에 개시되어 있다. 본원에 개시된 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 구현예에 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
참조 실시예
1
단계 1: 화합물 A-1-2의 합성.
반응 플라스크에 A-1-1(150g, 635.36mmol, 1eq), 염화칼슘(70.51g, 635.36mmol, 1eq), 테트라하이드로푸란(500mL) 및 에탄올(1000mL)을 첨가했다. 수소화붕소나트륨(48.07g, 1.27mol, 2eq)을 질소하에 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압하에 농축시켰다. 농축액을 15% 시트르산 수용액(4000mL)으로 희석시키고, 에틸 아세테이트(4000mL x 3)로 추출했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(2000mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축 건조시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 A-1-2를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 7.47 (s, 1H), 5.58 (br s, 1H), 4.52 (s, 2H).
단계 2: 화합물 A-1-4의 합성.
반응 플라스크에 A-1-2(102g, 525.64mmol, 1eq)와 2-메틸테트라하이드로푸란(1000mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 혼합물을 -70℃로 냉각시키고, 리튬 디이소프로필아미드(2M, 525.64mL, 2.0eq)를 천천히 적가했다. 혼합물을 -70℃에서 30분 동안 교반했다. 그런 다음, 2-메틸테트라하이드로푸란(400mL) 중 A-1-3(138.18g, 788.46mmol, 1.5eq)의 용액을 천천히 적가하고, 혼합물을 -70℃에서 1시간 동안 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 포화 염화암모늄 수용액(2000mL)으로 급냉시키고, 에틸 아세테이트(2000mL x 4)로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(1000mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축 건조시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 먼저 컬럼으로 정제한 다음, 메틸 3급-부틸 에테르로 슬러리화하여 정제하여 A-1-4를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 6.41 (s, 1H), 5.43 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.00 - 4.84 (m, 4H), 4.38 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.12 (s, 9H).
단계 3: 화합물 A-1-5의 합성.
반응 플라스크에 A-1-4(50g, 135.39mmol, 1eq), 아조디카르복실산 디피페리디드(40.99g, 162.47mmol, 1.2eq) 및 테트라하이드로푸란(500mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 테트라하이드로푸란(100mL) 중 트리부틸포스핀(32.87g, 162.47mmol, 40.09mL, 1.2eq)의 용액을 천천히 적가했다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 물(500mL) 및 포화 염수(500mL)를 순차적으로 반응 용액에 첨가했다. 혼합물을 에틸 아세테이트(500mL x 2)로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(300mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축 건조시켜 조 생성물을 수득했다. 이 조 생성물을 메틸 3급-부틸 에테르 500mL로 슬러리화하고 여과했다. 여과액을 수집하고, 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 50mL의 n-헥산으로 슬러리화하고 여과했다. 필터 케이크를 수집하고 건조시켜 A-1-5를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 5.29 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.88 - 4.75 (m, 3H), 4.60 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 1.26 (s, 9H).
단계 4: 화합물 A-1-6의 합성.
반응 플라스크에 A-1-5(29g, 82.55mmol, 1eq), 테트라하이드로푸란(250mL) 및 물(50mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 요오드(2.10g, 8.26mmol, 1.66mL, 0.1eq)를 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 추가 요오드(2.10g, 8.26mmol, 1.66mL, 0.1eq)를 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 6시간 동안 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 조 A-1-6의 용액을 수득하고 다음 단계에서 직접 사용했다.
단계 5: 화합물 A-1-7의 합성.
조 A-1-6을 함유하는 용액에 탄산나트륨(17.50g, 165.11mmol, 2eq)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 디-3급-부틸 카보네이트(27.03g, 123.83mmol, 28.45mL, 1.5eq)를 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물(200mL)에 붓고, 이어서 에틸 아세테이트(300mL x 3) 로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(300mL x 3)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 A-1-7을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 5.46 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 1.53 (s, 9H).
단계 6: 화합물 A-1-8의 합성.
반응 플라스크에 A-1-7(26.5g, 76.32mmol, 1eq), 빙초산(1.37g, 22.90mmol, 1.31mL, 0.3eq) 및 아세토니트릴(260mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 혼합물을 50℃로 가열하고, 물(70mL) 중 아염소산나트륨(32.48g, 305.28mmol, 85% 순도, 4eq)의 용액을 적가했다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 50℃에서 12시간 동안 더 반응시켰다. 그런 다음, 추가의 아염소산나트륨(8.97g, 99.21mmol, 1.3eq)과 빙초산(458.31mg, 7.63mmol, 436.49μL, 0.1eq)을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 6시간 동안 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 포화 아황산나트륨 수용액(150mL)으로 급냉시키고, 물(90mL)을 첨가했다. 혼합물을 정치시키고, 유기 상을 분리했다. 수성 상은 에틸 아세테이트(90mL)로 추출했다. 결합된 유기 상을 포화 염수(90mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 에틸 아세테이트:n-헥산(1:5, 120mL)으로 교반하면서 슬러리화하고 여과했다. 필터 케이크를 수집하고, 건조시켜 A-1-8을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 5.61 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 4.76 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 1.66 (s, 9H).
단계 7: 화합물 A-1의 합성.
건조된 반응 플라스크에 A-1-8(10g, 27.68mmol, 1eq)과 디클로로메탄(100mL)을 첨가했다. 트리플루오로아세트산(41.04g, 359.90mmol, 26.65mL, 13eq)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 포화 중탄산나트륨 수용액(1000mL)에 천천히 붓고, pH 7 내지 8로 조정했다. 혼합물을 디클로로메탄(1000mL x 3)으로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 A-1을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 9.59 (s, 1H), 4.99-4.78 (m, 4H).
참조 실시예 2
단계 1: 화합물 B-1-2의 합성.
반응 플라스크에 수산화나트륨(590.8g, 14.8mol, 1.05eq), 빙수(20L), B-1-1(2000.00g, 14.07mol, 1eq)을 첨가했다. 그런 다음, 메틸 요오디드(2495.80g, 17.59mol, 1.25eq)를 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 6N 빙하 염산 수용액을 반응 플라스크에 천천히 첨가하여 pH를 6 내지 7로 조정했다. 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 수집했다. 아세토니트릴(500mL)을 필터 케이크에 첨가했다. 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 수집하고, 베이킹하여 건조시켜 B-1-2를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 12.69 (br s, 1H), 7.74 (br s, 1H), 2.45 (s, 3H), 1.86 (s, 3H).
단계 2: 화합물 B-1-3의 합성.
반응 플라스크에 아세토니트릴(15L)과 B-1-2(1500.00g, 9.60mol, 1eq)를 25℃에서 첨가했다. 그런 다음, 옥시염화인(1840.00g, 12.0mol, 1.25eq)을 첨가했다. 혼합물을 62℃로 천천히 가열하고, 62℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 물(10.5L)에 붓고, 고체 중탄산나트륨을 첨가하여 pH를 6 내지 7로 조정했다. 혼합물을 에틸 아세테이트(10.5L)로 추출하고, 층을 분리하여 유기 상을 수득했다. 유기 상을 포화 염수(7.5L)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 B-1-3을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 8.54 (s, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.22 (s, 3H).
단계 3: 화합물 B-1의 합성.
반응 플라스크에 B-1-3(100g, 572.57mmol, 1eq), 물(24.76g, 1.37mol, 24.76mL, 2.4eq) 및 아세토니트릴(1000mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 요오드화나트륨(571.59g, 3.81mol, 6.66eq)과 트리메틸클로로실란(186.61g, 1.72mol, 218.00mL, 3eq)을 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 디클로로메탄(800mL)과 물(1200mL)을 순차적으로 반응 용액에 첨가했다. 그런 다음, 고체 중탄산나트륨을 첨가하여 pH를 6-7로 조정했다. 층을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄(500mL)으로 한 번 추출했다. 유기 상을 결합하고, 포화 아황산나트륨 수용액(500mL)과 포화 염수(500mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. n-헵탄(0.5L)을 조 생성물에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하여 B-1을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm) = 8.34 (s, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.21 (s, 3H).
실시예
1
합성 경로:
단계 1: WX001-2의 합성
반응 플라스크에 A-1(500mg, 1.92mmol, 1eq), WX001-1(427.54mg, 2.30mmol, 1.2eq) 및 N'N-디메틸포름아미드(3mL)를 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 탄산세슘(935.92mg, 2.87mmol, 1.5eq)을 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물(20mL)에 붓고, 혼합물을 에틸 아세테이트(30mL x 3)로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(30mL x 3)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피로 정제하여 WX001-2를 수득했다. LCMS (m/z): 366, 368 [M+H]+.
단계 2: WX001-3의 합성
사전 건조된 반응 플라스크에서, 대기를 질소로 교체하고, 탄소 상 습식 팔라듐(0.1g, 819.15μmol, 순도 10%, 1eq) 및 에탄올(20mL)을 첨가했다. 그런 다음, WX001-2(300mg, 819.15μmol, 1eq)를 첨가했다. 대기를 질소로 세 번 교체하고, 혼합물을 교반하여 50℃ 및 50Psi에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피로 정제하여 WX001-3을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 8.96 (s, 1H), 7.58 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 5.14 (s, 2H), 4.80 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H).
단계 3: WX001-4의 합성
건조된 반응 플라스크에 WX001-3(60mg, 208.81μmol, 1eq), 테트라하이드로푸란(1mL) 및 염화아연 용액(0.7M, 298.31μL, 1eq)을 첨가했다. 혼합물을 -78℃로 냉각시키고, 리튬 헥사메틸디실라지드(1M, 417.63μL, 2eq)를 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 반응시켜 반응 용액 1을 수득했다.
N'N-디메틸아세트아미드(1mL) 중 B-1(55.57mg, 208.81μmol, 1eq)과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(7.24mg, 6.26μmol, 0.03eq)의 혼합물을 질소하에 50℃로 가열한 다음, 반응 용액 1을 적가했다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물(5mL)에 부은 다음, 디클로로메탄(30mL x 3)으로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(30mL x 3)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피로 정제하여 WX001-4를 수득했다. LCMS (m/z): 426.0 [M+H]+.
단계 4: WX001-5의 합성
반응 플라스크에 WX001-4(100mg, 235.00μmol, 1eq), 아세토니트릴(1mL) 및 물(0.5mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 세 번 교체하고, 일과황산칼륨(288.95mg, 470.01μmol, 2eq)을 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 포화 티오황산나트륨 수용액(5mL)에 붓고, 혼합물을 디클로로메탄(30mL x 3)으로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 중탄산나트륨 수용액(20mL)과 포화 염수(30mL x 3)로 연속적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피로 정제하여 WX001-5를 수득했다. LCMS (m/z): 458.0 [M+H]+.
단계 5: WX001의 합성
건조된 반응 플라스크에 WX001-5(40mg, 87.43μmol, 1eq), C-1(16.98mg, 174.85μmol, 2eq) 및 테트라하이드로푸란(0.5mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 리튬 헥사메틸디실라지드(1M, 166.11μL, 1.9eq)를 적가했다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물(5mL)에 붓고, 혼합물을 디클로로메탄(30mL x 3)으로 추출했다. 층을 분리했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(30mL x 3)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물은 예비 고성능 액체 상 크로마토그래피(컬럼: Waters Xbridge BEH C18 100*25mm*5μm; 이동상: [물(10mM 중탄산암모늄 )-아세토니트릴]; B(아세토니트릴)%: 20%-50%, 10분)로 정제하여 WX001을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 9.67 (br s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.64 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 2.9, 7.7 Hz, 2H), 6.37 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.12 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.85 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.57 (s, 3H), 2.42 (s, 3H); LCMS (m/z): 475.0 [M+H]+ .
실시예
2: WX001의 결정 형태 A의 제조
단계 1: 화합물 I-1-3의 합성.
테트라하이드로푸란(12L)과 I-1-1(1200g, 5.69mol)을 반응 케틀에 첨가했다. 테트라메틸에틸렌디아민(661.59g, 5.69mol)을 반응 케틀에 천천히 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 혼합물을 -70℃(내부 온도)로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드(2M, 6.83L)를 천천히 적가하고, 혼합물을 -70℃에서 0.5시간 동안 교반했다. 테트라하이드로푸란(4.8L) 중의 I-1-2(1.76kg, 9.39mol)의 용액을 천천히 적가하고(1.5시간), 혼합물을 -70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 물(6L)을 반응 용액에 적가하여 반응 혼합물을 급냉시켰다. 반응 병을 물(2.4L)로 세척했다. 혼합물을 결합하고, 교반했다. 혼합물을 최대 10℃로 예열시켰다. 층을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(6L)로 추출했다. 잔류하는 수성 상을 중황산칼륨 수용액(15.6L)으로 pH 3 내지 4로 조정한 다음, 에틸 아세테이트(6L)로 3회 추출했다. 유기 상을 결합하고, 포화 염수(6L)로 세척했다. 유기 상을 1200g의 무수 황산나트륨(m/m=1:1)으로 건조시키고, 45℃에서 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득했다. 디클로로메탄(2.4L)과 이소프로필 에테르(7.2L)를 조 생성물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반했다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하여 I-1-3을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 13.18 (br s, 1H), 6.20 (br s, 1H), 4.93 - 4.82 (m, 4H), 1.09 (s, 9H).
단계 2: 화합물 I-1-4의 합성.
디클로로메탄(1330mL), I-1-3(1330g, 1.99mol, 조 생성물) 및 4-디메틸아미노피리딘(41.37g, 338.61mmol)을 순차적으로 반응 케틀에 첨가했다. N,N'-카보닐디이미다졸(419.86g, 2.59mol)을 배치로 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 36시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 2N 염산 수용액(5.32L)을 반응 용액에 첨가하여 pH를 3-4로 조정했다. 혼합물을 0.5시간 동안 교반한 후, 물(5.32L)을 첨가했다. 혼합물을 농축시켜 유기 용매를 제거했다. 잔류물을 여과하여 필터 케이크를 수득했다. 필터 케이크를 중탄산나트륨 수용액(5.32L)으로 0.5시간 동안 교반한 후, 여과하고 물(2.66L)로 세척했다. 필터 케이크를 수집했다. 무수 에탄올(10.64L)을 조 생성물에 첨가했다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 무수 에탄올(1.3L)로 세척했다. 필터 케이크를 수집하고 건조시켜 I-1-4를 수득했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ = 9.58 (br s, 1H), 4.94 - 4.84 (m, 4H).
단계 3: 화합물 I-1-6의 합성.
반응 플라스크에 I-1-4(283g, 1.03mol), 탄산세슘(505.36g, 1.55mol) 및 N,N'-디메틸포름아미드(2800mL)를 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. I -1-5(221.24g, 1.19mol)를 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 빙수(14L)에 천천히 부었다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 수집했다. 메틸 3급-부틸 에테르(5L)를 조 생성물에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 수집하고, 건조시켜 I-1-6을 제공했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 7.63 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.13 (dd, J = 2.8, 7.7 Hz, 2H), 5.04 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 4.98 (s, 2H), 4.86 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 2.41 (s, 3H).
단계 4: 화합물 I-1의 합성.
세 가지 반응을 병렬로 수행했다. 반응 플라스크에 I-1-6(183g, 468.60mmol)과 테트라하이드로푸란(2745mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 디이소프로필에틸아민(181.69g, 1.41mol)과 디에틸 포스파이트(194.14g, 1.41mol)를 20℃에서 천천히 적가하고, 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 물(915mL)로 희석시키고, 혼합물을 디클로로메탄(1830mL*3)으로 추출했다. 유기 상을 포화 염수(915mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과했다. 여과액을 45℃에서 농축시키고, 건조시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 메틸 3급-부틸 에테르 및 n-헥산의 혼합 용매(총 1098mL, 용적 비율 1:5)에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고 건조시켰다. 필터 케이크를 물(5400mL)에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 수집하고, 건조시켜 I-1을 제공했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 9.32 (s, 1H), 7.64 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 5.10 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 4.99 (s, 2H), 4.81 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H)를 수득했다.
단계 5: 화합물 I-3의 합성.
두 개의 반응 플라스크에 각각 테트라하이드로푸란(1200mL) 중의 I-1(120g, 403.05mmol)과 염화아연(0.7M, 575.79mL)의 용액을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 리튬 헥사메틸디실라지드(1M, 806.11mL)를 천천히 적가했다. 혼합물을 최대 20℃로 예열시킨 다음, 1시간 동안 교반하여 반응 용액 1을 수득했다. 또 다른 반응 플라스크에 B-1(107.25g, 403.05mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(13.97g, 12.09mmol) 및 N,N'-디메틸포름아미드(600mL)를 첨가하고, 반응 용액을 50℃로 가열하여 반응 용액 2를 수득했다. 반응 용액 1을 반응 용액 2에 천천히 적가하고, 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 0.1M 에틸렌디아민 테트라아세트산 이나트륨 염(10800mL)으로 급냉시키고, 30분 동안 교반하였다. n-헵탄(4800mL)을 첨가하고, 혼합물을 0.5시간 동안 교반했다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고, 건조시켜 조 생성물을 수득했다. 조 생성물을 20℃에서 2시간 동안 에탄올(7200mL)로 슬러리화하고, 여과했다. 필터 케이크를 수집하고, 건조시켜 I-3을 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.54 (s, 1H), 7.54 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.29 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 2.52 (s, 3H).
단계 6: 화합물 I-4의 합성.
반응 플라스크에 I-3(120g, 282.00mmol), 아세토니트릴(110mL) 및 물(550mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 일과황산칼륨(329.40g, 535.81mmol)을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 얼음-물 혼합물 200mL를 반응 용액에 첨가했다. 그런 다음, 포화 중탄산나트륨 수용액과 포화 티오황산나트륨 수용액을 첨가한 다음(각각 600mL), 600mL의 물을 첨가했다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고 건조시켜 조 생성물을 수득했다. 600mL의 무수 에탄올을 조 생성물에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하여 I-4를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.90 (s, 1H), 7.55 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 5.31 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 2.92 (s, 3H), 2.50 (s, 3H).
단계 7: WX001의 결정 형태 A의 합성
반응 플라스크에 I-4(47g, 102.73mmol), C-1(25.94g, 267.09mmol), 디클로로메탄(470mL) 및 테트라하이드로푸란(470mL)을 첨가했다. 대기를 질소 가스로 교체했다. 리튬 헥사메틸디실라지드(1M, 246.54mL, 2.4eq)를 -5℃(내부 온도는 -5 내지 3℃로 제어함)에서 적가하고, 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 탈이온수(470mL)로 급냉시켰다. 혼합물을 농축시켜 유기 용매를 제거하고 여과했다. 필터 케이크를 수집했다. 필터 케이크를 탈이온수(1000mL)와 함께 실온에서 30분 동안 교반한 후 여과했다. 필터 케이크를 수집했다. 필터 케이크를 아세토니트릴(1000mL)과 함께 실온에서 30분 동안 교반하고 여과했다. 필터 케이크를 수집하여 WX001의 결정 형태 A를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.44 (s, 1H), 7.60 - 7.50 (m, 2H), 7.18 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.42 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.85 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 2.52 (s, 3H). WX001의 결정 형태 A의 XRPD 패턴은 도 1에 제시되어 있고; WX001의 결정 형태 A의 DSC 곡선은 도 2에 제시되어 있으며; WX001의 결정 형태 A의 TGA 곡선은 도 3에 제시되어 있다.
실시예
3: WX001의
다형체
스크리닝
1. 기체-고체 침투
각 부분에서 WX001의 결정 형태 A 약 20mg을 3mL 바이알에 칭량하고, 용매 약 4mL를 20mL 바이알에 첨가했다. 3mL(개방형) 바이알을 20mL 바이알에 넣고, 20mL 바이알을 밀봉했다. 샘플은 용매를 흡착하고, 부분적으로 용해시키거나 실온에서 7일 동안 정치시킨 다음, 고체를 수집하고 XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 7에 제시되어 있다.
[표 7]
2. 기체-액체 확산
각 부분에서 WX001의 결정 형태 A 약 20mg을 3mL 바이알에 칭량하고, 1.2 내지 1.8mL의 용매에 용해시켰다. 약 4mL의 항-용매를 20mL 바이알에 첨가했다. 투명한 용액을 함유하는 3mL(개방형) 바이알을 20mL 바이알에 넣은 다음, 20mL 바이알을 밀봉하고, 실온에서 정치시켰다. 생성된 고체를 수집하고, XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 8에 제시되어 있다.
[표 8]
3. 느린 휘발
WX001의 결정 형태 A 15 내지 20mg을 3mL 바이알에 칭량하고, 1.0 내지 3.0mL의 용매에 용해시켰다. 바이알을 밀봉 필름으로 밀봉하고, 밀봉 필름에 4개의 핀홀을 천공시켰다. 용액을 실온에서 정치시켜 천천히 휘발시켰다. 생성된 고체를 수집하고 XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 9에 제시되어 있다.
[표 9]
4. 느린 냉각
각 부분에서 WX001의 결정 형태 A 15 내지 35mg을 3mL 바이알에 칭량하고, 1.0 내지 3.0mL의 용매에 용해시켰다. 용액을 교반하고, 약 3.5시간 동안 50℃에서 평형화한 후 여과했다. 상청액을 수집했다. 생성된 상청액을 생화학적 인큐베이터에 넣고, 0.1℃/분으로 50℃에서 5℃로 냉각시킨 다음, 5℃의 일정한 온도로 유지시켰다. 침전된 고체를 수집하고, XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 10에 제시되어 있다.
[표 10]
5. 온도 주기로
교반
각 부분에서 WX001의 결정 형태 A 약 25mg을 HPLC 바이알에 칭량하였고, 각각 0.5mL의 용매를 첨가했다. 생성된 현탁액을 온도 주기 프로그램(샘플을 50℃로 가열한 다음, 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각시킨 다음, 이 주기를 반복하고, 마지막으로 샘플을 5℃로 유지시킴)에 자기 교반하면서(1000rpm) 적용했다. 고체를 원심분리로 수집하고, XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 11에 제시되어 있다.
[표 11]
6. 실온에서 현탁액의
교반
각 부분에서 WX001의 결정 형태 A 약 25mg을 HPLC 바이알에 칭량하고, 각각 0.5mL의 용매를 첨가했다. 수득된 탁한 액체를 실온에서 3일 동안 자기적으로 교반했다(1000rpm). 고체를 원심분리로 수집하고, XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 12에 제시되어 있다.
[표 12]
7. 50℃에서 현탁액의
교반
각 부분에서 WX001의 결정 형태 A 약 25mg을 HPLC 바이알에 칭량하고, 각각 0.5mL의 용매를 첨가했다. 수득된 현탁액을 50℃에서 3일 동안 자기적으로 교반했다(1000rpm). 고체를 원심분리로 수집하고, XRPD로 테스트했다. 테스트 결과는 표 13에 제시되어 있다.
[표 13]
8. 항-용매의 첨가
WX001의 결정 형태 A 약 15mg을 각각 20mL 바이알에 칭량하고, 0.7 내지 1.0mL의 용매를 첨가하여 고체를 완전히 용해시켰다. 고체가 침전될 때까지 또는 항-용매의 총 용적이 10mL에 도달할 때까지 항-용매를 교반하면서(1000rpm) 투명한 용액에 적가했다. 고체가 침전될 때까지 고체 침전이 없는 샘플을 5℃에서 교반했다. 그런 다음, 투명한 샘플을 고체가 침전될 때까지 -20℃에서 교반했다. 그런 다음, 여전히 투명한 샘플을 실온에서 휘발시켰다. 침전된 고체를 분리하고, XRPD로 테스트했다. 결과는 표 14에 제시되어 있다.
[표 14]
실시예
4: WX001의 결정 형태 A의
흡습성에 대한 연구
검정 재료:
SMS DVS 이점 동적 증기 흡착 장치
검정 방법:
WX001의 결정 형태 A 10 내지 30mg을 칭량하고, 테스트를 위해 DVS 샘플 팬에 넣었다.
검정 결과:
WX001의 결정 형태 A의 DVS 패턴은 도 4, △W= 0.1134%에 제시되어 있다.
검정 결론:
25℃ 및 80% RH에서 수분 흡수에 의한 WX001의 결정 형태 A의 중량 증가는 0.1134%였으며, 이는 WX001의 결정 형태 A가 거의 흡습성이 없음을 나타낸다.
실시예
5: WX001의 결정 형태 A의 안정성 테스트
WX001의 결정 형태 A의 샘플 12개 부분을 병렬로 칭량하고, 각 부분은 약 5mg이었다. 샘플은 박층을 형성하기 위해 HPLC 바이알의 바닥에 놓았다. 샘플을 60℃/75% RH 조건의 일정한 온도 및 습도의 챔버 및 92.5% RH 건조기에 넣었다. 병은 밀봉 필름으로 밀봉했다. 샘플이 주변 공기와 완전히 접촉되었음을 보장하기 위해 밀봉 필름에 일부 작은 구멍을 천공시켰다. 샘플 병의 뚜껑을 60℃에서 빛과 광-차폐 조건하(광-차폐 조건하의 샘플은 주석 호일로 감쌌음)에 조였다. 테스트 결과는 아래 표 15에 제시되어 있다:
[표 15]
결론: WX001의 결정 형태 A는 우수한 안정성을 갖는다.
검정 실시예 1. 시험관내 키나제 활성의 검정
1. 검정 목적:
ERK1 및 ERK2 키나제 활성을 억제하는 화합물의 능력을 측정했다.
2. 검정 완충제:
20mM Hepes(pH 7.5), 10mM MgCl2, 1mM 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산(EGTA), 0.02% Brij35, 0.02mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 0.1mM Na3VO4, 2mM 디티오트레이톨(DTT), 1% DMSO.
3. 화합물의 처리:
검정 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 특정 농도의 스톡 용액을 제조했다. 화합물을 Integra Viaflo Assist 스마트 피펫을 사용하여 DMSO 용액에서 연속적으로 희석했다.
4. 검정 방법:
1) 기질 MBP를 새로 제조된 반응 완충제에서 제조했다;
2) ERK1(또는 ERK2) 키나제를 상기 언급된 MBP 용액에 첨가하고, 부드럽게 혼합했다;
3) 100% DMSO에 용해된 화합물을 초음파 기술(Echo550; 나노리터 범위)을 사용하여 키나제 반응 시스템에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양했다;
4) 33P-ATP(특정 농도 10μCi/μL)를 반응 시스템에 첨가하고, 이때 반응을 개시했다;
5) 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양했다;
6) 방사능의 양은 필터 결합 방법으로 검출했다;
7) ERK1(또는 ERK2) 키나제 활성은 검정 샘플 중 잔류하는 키나제 활성 대 대조군(DMSO로 처리됨)의 키나제 활성의 비율로 계산했다. 곡선은 Prism(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 적합화하고, IC50 값을 계산했다.
5. 검정 결과는 표 16 및 표 17에 제시되어 있다:
[표 16]
결론: 본 개시내용의 화합물은 ERK1 키나제에 대한 우수한 억제 활성을 나타낸다.
[표 17]
결론: 본 개시내용의 화합물은 ERK2 키나제에 대한 우수한 억제 활성을 나타낸다.
검정 실시예 2. 시험관내 세포 증식 억제의 검정
1. 검정 목적:
HT29 종양 세포의 증식을 억제하는 화합물의 능력을 측정했다.
2. 화합물 처리:
검정 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 10mM 스톡 용액을 제조했다.
3. 검정 방법 및 단계:
1) 생물학적 안전 캐빈의 자외선을 켜고, 30분 카운트다운했다;
2) 37℃ 수욕에서, RPMI1640 배지와 트립신을 예열했다;
3) 자외선 조사 완료 후, 생물학적 안전 캐빈을 개방시켰다. 예열된 배지, 트립신 및 인산염 완충 식염수(PBS) 등을 알코올로 닦고, 생물학적 안전 캐빈에 넣었다;
4) HT29 세포를 인큐베이터로부터 제거하고, 오래된 배지를 생물학적 안전 캐빈에서 제거했다. 10ml의 PBS를 첨가했다. 혼합물을 부드럽게 진탕시킨 다음 PBS를 제거했다;
5) 예열된 0.25% 트립신 1.5ml를 첨가했다. 배양 용기를 수평으로 진탕시켜 트립신이 바닥의 세포를 균일하게 덮도록 하고, 인큐베이터에 2분 동안 놓았다;
6) 세포 소화는 완전한 배지로 중단하고, 세포 현탁액을 균질성으로 피펫팅하고 계수했다;
7) 세포 계수 결과에 따라, 세포 현탁액의 밀도를 웰당 1500개 세포로 조정하고, 세포 현탁액을 웰당 50μl로 시딩했다;
8) 화합물의 스톡 용액을 DMSO 용액에서 순차적으로 희석하고, 화합물을 Tecan을 사용하여 세포 플레이트에 첨가했다;
9) 화합물 첨가된 세포 플레이트와 CellTiterGlo를 실온에서 평형화시킨 다음, 25마이크로리터의 CellTiterGlo를 각 웰에 첨가했다. 세포 플레이트를 1 내지 2분 동안 진탕시킨 다음, 10분 동안 방치시켰다. 그런 다음, 신호 값을 검출시켰다. 데이터를 XL-Fit을 사용하여 분석하고, 각 화합물의 IC50을 계산했다.
4. 검정 결과는 표 18에 제시되어 있다:
[표 18]
결론: 본 개시내용의 화합물은 HT29 세포 증식에 대한 우수한 억제 활성을 나타낸다.
검정 실시예
3. 마우스에서 생체내 PK 연구
1. 검정 목적:
암컷 BALB/c 마우스를 검정 동물로 사용하여 화합물의 혈중 농도를 측정하고, 단일 투여 후 약동학적 거동을 평가했다.
2. 검정 절차:
4마리의 건강한 성체 암컷 BALB/c 마우스를 선택하고, 여기서 2마리 마우스는 정맥내 주사 그룹에, 2마리 마우스는 경구 그룹에 배치했다. 정맥내 주사 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 정맥내 주사를 위한 비히클의 적정량과 혼합하고, 와동시키고 초음파 처리하여 0.5mg/mL의 투명한 용액을 제조했다. 투명한 용액을 미세다공성 멤브레인으로 여과한 후, 사용할 준비가 되었다. 경구 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 비히클과 혼합하고, 와동시키고 초음파 처리하여 0.3mg/mL의 용액을 제조했다. 마우스에 1mg/kg을 정맥내로 또는 3mg/kg을 경구 투여한 후, 전혈을 특정 기간 동안 수거했다. 혈장을 제조했다. 약물 농도는 LC-MS/MS 방법으로 분석하고, 약동학적 매개 변수는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)로 계산했다.
참고: DMSO: 디메틸 설폭사이드; HP-β-CD: 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린.
3. 검정 결과는 표 19에 제시되어 있다:
[표 19]
참고: Cmax는 최대 농도이고; F%는 경구 생체이용률이며; DNAUC는 AUCPO/Dose이고, AUCPO는 경구 노출이고, Dose는 약물 용량이고; Vdss는 분포 용적이고; Cl은 클리어런스율이며; T1/2는 반감기이고; NA는 이용 가능하지 않다.
결론: 본 개시내용의 화합물은 우수한 경구 노출 및 생체이용률을 나타낸다.
검정 실시예
4. 용해도 연구
1. 검정 목적:
화합물의 용해도를 결정하여 화합물의 용해도 특성을 평가했다.
2. 검정 용액:
1) 완충제 A(pH 2.0): 50mM 인산염 완충제, pH 2.0; 완충제 B(pH 6.5): 50mM 인산염 완충제, pH 6.5; 완충제 C(pH 7.4): 50mM 인산염 완충제, pH 7.4;
2) 표준 용액의 제조:
a) 50% 아세토니트릴 용액과 50% 완충제 용액을 혼합하여 희석제를 수득했다;
b) 10mM(10μL/화합물) 화합물 스톡 용액을 희석액(490μL/화합물)에 첨가하여 200μM 검출 표준 용액을 수득했다;
c) 200μM UV 검출 표준 용액을 10배 및 200배 용적의 희석제로 희석하여 각각 20μM 및 1μM UV 표준 용액을 수득했다;
d) 1μM, 20μM 및 200μM의 UV 표준 용액을 용해도 검정을 위한 표준 용액으로 사용했다.
3. 검정 방법:
1) 화합물을 DMSO에 용해시켜 10mM 스톡 용액을 제조했다. 아미오다론 하이드로클로라이드, 카바마제핀 및 클로람페니콜을 용해도 검정에서 대조군으로 사용했다;
2) 검정 화합물 및 대조군(각각 10μL)의 스톡 용액을 96웰 플레이트에 넣고, 490μL의 세 가지 상이한 용해 배지(완충제 A, B, C)를 각각 첨가했다. 상응하는 용해도 용액의 pH는 각각 2.0, 6.5 및 7.4였다. 검정 화합물의 이론적 최대 농도는 2% DMSO를 갖는 200μM이다;
3) 플레이트를 실온(25±2℃)에서 600rpm으로 24시간 동안 진탕기에서 진탕시켰다;
4) 200μL의 용액을 96웰 플레이트로부터 피펫팅하고, 진공 흡인 여과 장치로 흡인 여과하고, 검정 샘플로서 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다;
5) 화합물 농도는 HPLC-UV를 사용하여 결정했다. HPLC 조건은 표 20에 제시되어 있다:
[표 20]
6) 저농도부터 고농도까지 세 가지 UV 표준 용액(1μM, 20μM, 200μM)을 HPLC에 주입한 다음, 검정할 화합물의 검정 샘플을 주입했다;
7) UV 크로마토그래피 피크를 통합하고, 샘플의 용해도를 계산했다.
4. 검정 결과는 표 21에 제시되어 있다:
[표 21]
결론: 본 개시내용의 화합물은 상이한 pH 조건하에 우수한 용해도를 갖는다.
검정 실시예 5. 인간 흑색종 A375의 마우스 모델에서 생체내 효능 검정:
1. 검정 목적:
WX001의 항종양 효과를 누드 마우스에서 인간 흑색종 A375 세포의 피하 이종 이식 종양 모델을 사용하여 평가했다.
2. 검정 동물:
종: 마우스
균주: BALB/c 누드 마우스
연령: 6 내지 8주령
성별: 암컷
체중: 18-22g
공급업체: Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
3. 사육 환경:
동물을 20 내지 26℃의 온도 및 40 내지 70%의 습도에서 SPF 등급의 동물실에서 IVC(독립 공기 공급 시스템, 및 일정한 온도 및 습도) 케이지(케이지당 3마리)에서 사육했다;
케이지: 케이지는 폴리카보네이트로 만들어졌고, 375mm x 215mm x 180mm의 용적을 가졌다. 베딩 재료는 옥수수 속대였으며, 이는 일주일에 한 번 교체했다;
먹이: 검정 동물은 검정 기간에 걸쳐 먹이(방사선 조사로 멸균된 건조 펠릿화 먹이)에 자유롭게 접근할 수 있었다;
식수: 검정 동물은 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었다;
케이지 식별: 각 케이지의 동물 정보 카드에는 케이지 내 동물의 수, 성별, 균주, 수령 날짜, 투여 일정의 검정 번호, 그룹 및 검정 개시 날짜가 표시되어야 한다;
동물 식별: 검정 동물은 귀 태그로 식별했다.
4. 검정 절차:
1) 검정 세포 및 배양: 인간 흑색종 A375 세포를 시험관내에서 단층으로 배양했다. 배양 조건은 DMEM 배지와 10% 태아 소 혈청, 37℃ 5% CO2 인큐베이터였다. 트립신-EDTA를 사용한 일상적인 소화를 통과를 위해 일주일에 두 번 수행하였다. 세포 포화도가 80%-90%이고 양이 요구 사항에 도달하면, 세포를 수거하고, 계수하고 접종했다;
2) 종양 조직 접종 및 그룹화: 0.1mL(5Х105)의 A375 세포를 각 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 피하 접종했다. 평균 종양 용적이 170mm3에 도달하면, 동물을 무작위로 4개 그룹으로 나누고 투여를 시작했다. 검정의 그룹화 및 투여 일정은 표 22에 제시되어 있다.
[표 22]
3) 검정 동물의 매일 관찰: 본 검정 프로토콜의 개발 및 임의의 변형은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 평가하고 승인을 받았다. 검정 동물의 사용 및 복지는 실험 동물 관리 평가 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)의 규정에 따라 수행하였다. 동물을 건강 및 사망에 대해 매일 모니터링했다. 일상적인 검사에는 종양 성장의 관찰과 동물의 매일 거동, 예를 들어, 거동적 활동, 먹이 및 물 섭취(육안 검사만), 체중 변화(주 2회 체중 측정), 외모 징후 또는 기타 이상 징후에 대한 약물 치료의 효과가 포함되었다. 각 그룹에서 동물 사망 및 부작용은 각 그룹의 동물 수를 기준으로 기록했다.
4) 검정 화합물의 제형화
a) 비히클 그룹: 5% DMSO + 95%(20% HP-β-CD).
b) 검정 화합물 그룹: 검정 화합물의 정량적 양을 제형화 병에 칭량했다. 상응하는 용적의 DMSO를 첨가한 후, 혼합물을 와동시켜 투명한 용액을 수득했다. 상응하는 용적의 20% HP-β-CD를 첨가한 다음, 혼합물을 와동시켜 균일한 현탁액을 수득했다.
5) 종양 측정 및 검정 지표:
a) 종양 직경은 버니어 캘리퍼스로 일주일에 두 번 측정했다. 종양 용적의 계산 식은 다음과 같다: TV= 1/2 x a x b2, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다;
b) 화합물의 종양 억제 효능은 TGI(%)로 평가했다. TGI(%)는 종양 성장의 억제율을 반영했다. TGI(%)는 다음과 같이 계산되었다: TGI(%) = {[1-(치료군의 투여 종료시 평균 종양 용적 - 이 치료군의 투여 개시시 평균 종양 용적)]/(용매 대조군의 치료 종료시 평균 종양 용적 - 용매 대조군의 치료 개시시 평균 종양 용적)}x100%.
5. 검정 결과:
1) 표 23 및 도 5에 제시된 바와 같이, 누드 마우스에서 인간 흑색종 A375 세포의 피하 이종이식 종양 모델에서, WX001은 각각 45%, 58% 및 102%의 TGI로, 12.5mg/kg, 25mg/kg 및 50mg/kg의 세 가지 용량으로 경구 투여 후 21일까지 용량 의존적 방식으로 종양 성장을 억제할 수 있었다.
2) 검정 동물의 체중은 약물 독성의 간접적 결정을 위한 참조 지표로 사용하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 21일째까지 투여되었을 때, 용매 대조군 및 WX001 그룹의 모든 동물의 체중은 유의하게 감소하지 않았으며, 내성은 우수했다.
[표 23]
결론: WX001은 12.5mg/kg, 25mg/kg 및 50mg/kg의 세 가지 용량에서 용량 의존적 방식으로 종양 성장을 억제할 수 있다. 투여 동안, 동물의 체중은 유의하게 감소하지 않는 것으로 관찰되며, 내성은 우수하다.
검정 실시예
6. SD 래트에서 생체내 PK 연구
1. 검정 목적:
수컷 SD 래트를 실험 동물로 사용했다. 단일 투여 후, 화합물의 혈장 농도를 측정하고 약동학적 거동을 평가했다.
2. 검정 절차:
6마리의 건강한 성체 수컷 SD 래트를 선택하고, 여기서 3마리 래트는 정맥내 주사 그룹에, 3마리 래트는 경구 그룹에 배치했다. 정맥내 주사 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 정맥내 주사를 위한 비히클의 적정량과 혼합하고, 와동시키고 초음파 처리하여 0.2mg/mL의 투명한 용액을 제조했다. 투명한 용액을 미세다공성 멤브레인으로 여과한 후, 사용할 준비가 되었다. 경구 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 비히클과 혼합하고, 와동시키고 초음파 처리하여 1mg/mL의 용액을 제조했다. SD 래트에 1mg/kg을 정맥내 또는 10mg/kg을 경구 투여한 후, 전혈을 특정 기간 동안 수집했다. 혈장을 제조했다. 약물 농도는 LC-MS/MS 방법으로 분석하였고, 약동학적 매개 변수는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)로 계산했다.
참고: DMSO: 디메틸 설폭사이드, HP-β-CD: 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린.
3. 검정 결과는 표 24에 제시되어 있다:
[표 24]
참고: Cmax는 최대 농도이고; F%는 경구 생체이용률이고; DNAUC는 AUCPO/Dose이고, AUCPO는 경구 노출이고, Dose는 약물 용량이고; Vdss는 분포 용적이고; Cl은 클리어런스율이고; T1/2은 반감기이다.
결론: 본 개시내용의 화합물은 우수한 경구 노출 및 생체이용률을 나타낸다.
검정 실시예
7. 시노몰구스 원숭이에서 생체내 PK 연구
1. 검정 목적:
수컷 시노몰구스 원숭이를 검정 동물로 사용했다. 단일 투여 후, 화합물의 혈장 농도를 측정하고, 약동학적 거동을 평가했다.
2. 검정 절차:
5마리의 건강한 성체 수컷 시노몰구스 원숭이를 선택하고, 여기서 2마리 동물은 정맥내 주사 그룹에, 3마리 동물은 경구 그룹에 배치했다. 정맥내 주사 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 정맥내 주사를 위한 비히클의 적정량과 혼합하고, 교반하면서 용해시켜 0.4mg/mL의 투명한 용액을 제조했다. 투명한 용액을 미세다공성 멤브레인으로 여과한 후, 사용할 준비가 되었다. 경구 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 비히클과 혼합하고, 교반하면서 용해시켜 0.3mg/mL의 용액을 제조했다. 시노몰구스 원숭이에게 1mg/kg을 정맥내 또는 3mg/kg을 경구 투여한 후, 전혈을 특정 기간 동안 수집했다. 혈장을 제조했다. 약물 농도는 LC-MS/MS 방법으로 분석하고, 약동학적 매개 변수는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)로 계산했다.
참고: DMSO: 디메틸 설폭사이드, HP-β-CD: 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린.
3. 검정 결과는 표 25에 제시되어 있다:
[표 25]
참고: Cmax는 최대 농도이고; F%는 경구 생체이용률이며; DNAUC는 AUCPO/Dose이고, AUCPO는 경구 노출이며, Dose는 약물 용량이고, Vdss는 분포 용적이고; Cl은 클리어런스율이고; T1/2은 반감기이다.
결론: 본 개시내용의 화합물은 우수한 경구 노출 및 생체이용률을 나타낸다.
검정 실시예 8. 비글견에서 생체내 PK 연구
1. 검정 목적:
수컷 비글견을 검정 동물로 사용했다. 단일 투여 후, 화합물의 혈장 농도를 측정하고, 약동학적 거동을 평가했다.
2. 검정 절차:
5마리의 건강한 성체 수컷 비글견을 선택하고, 이중 2마리는 정맥내 주사 그룹에, 3마리는 경구 그룹에 배치했다. 정맥내 주사 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 정맥내 주사를 위한 비히클의 적정량과 혼합하고, 교반하면서 용해시켜 0.4mg/mL의 투명한 용액을 제조했다. 투명한 용액을 미세다공성 멤브레인으로 여과한 후, 사용할 준비가 되었다. 경구 그룹의 비히클은 5% DMSO+95%(20% HP-β-CD)였다. 검정할 화합물을 비히클과 혼합하고, 교반하면서 용해시켜 0.3mg/mL의 용액을 제조했다. 시노몰구스 원숭이에게 1mg/kg을 정맥내 또는 3mg/kg을 경구 투여한 후, 전혈을 특정 기간 동안 수집했다. 혈장을 제조했다. 약물 농도는 LC-MS/MS 방법으로 분석하고, 약동학적 매개 변수는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)로 계산했다.
참고: DMSO: 디메틸 설폭사이드, HP-β-CD: 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린.
3. 검정 결과는 표 26에 제시되어 있다:
[표 26]
참고: Cmax는 최대 농도이고; F%는 경구 생체이용률이며; DNAUC는 AUCPO/Dose이고, AUCPO는 경구 노출이고; Dose는 약물 용량이고; VDss는 분포 용적이며; Cl은 클리어런스율이고; T1/2은 반감기이다.
결론: 본 개시내용의 화합물은 우수한 경구 노출 및 생체이용률을 나타낸다.
검정 실시예 9. hERG 분석
1. 검정 목적:
완전 자동화된 패치 클램프 방법을 사용하여 hERG 칼륨 채널(인간 에테르-a-go-go 관련 유전자 칼륨 채널) 전류에 대한 화합물의 효과를 검정했다.
2. 검정 방법:
2.1 세포 제조
CHO-hERG 세포를 175cm2 배양 플라스크에서 배양했다. 세포가 60 내지 80%의 밀도로 성장하면, 배양 배지를 제거했다. 세포를 7mL의 PBS(인산염 완충 식염수)로 한 번 세척한 다음, 3mL의 데타친을 소화를 위해 첨가했다. 소화가 완료된 후, 7mL의 배양 배지를 중화를 위해 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리했다. 상청액을 흡인한 다음, 5mL의 배양 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 세포 밀도가 2 내지 5x106/mL이었음을 보장한다.
2.2 용액 제조
세포외 용액 제형(mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1.25 MgCl2, 10 HEPES 및 10 글루코스; 제형은 NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조정했다.
세포내 용액 제형(mM): 140 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 EGTA 및 10 HEPES; 제형은 KOH를 사용하여 pH 7.2로 조정했다.
2.3 전기생리학적 기록 과정
단일 세포 고임피던스 밀봉 및 전체 세포 패턴 형성 프로세스는 모두 Qpatch 기기에 의해 자동으로 수행되었다. 전체 세포 기록 모드를 수득한 후, 세포를 -80mV에서 클램핑했다. 세포에 50밀리초 동안 -50mV의 사전전압과 5초 동안 +40mV의 탈분극 자극을 연속적으로 인가한 다음, 5초 동안 -50mV로 재분극화한 다음, 다시 -80mV로 재분극화했다. 이 전압 자극을 15초마다 적용하고 2분 동안 기록했다. 그런 다음, 세포외 용액을 투여하고 5분 동안 기록했다. 그런 다음, 약물 투여 과정을 개시했다. 화합물 농도는 가장 낮은 검정 농도부터 시작하였고, 각 검정 농도를 2.5분 동안 투여했다. 모든 농도를 연속적으로 투여한 후, 양성 대조군 화합물인 3M 시사프리드를 투여했다. 각 농도에 대해 적어도 3개의 세포를 검정했다(n ≥ 3).
2.4 화합물 제조
화합물의 20.00mM 모액을 DMSO로 희석했다. 화합물의 모액 10μL를 20μL의 DMSO 용액에 첨가하고, 6개의 DMSO 농도로 3배 연속 희석하였다. 6개 DMSO 농도를 갖는 화합물 4μL를 각각 396μL의 세포외 용액에 첨가하고, 6개의 중간 농도로 100배 연속 희석하였다. 6개의 중간 농도를 갖는 화합물 80μL를 각각 세포외 용액 320μL에 첨가하고, 검정할 최종 농도로 5배 연속 희석하였다. 가장 높은 검정 농도는 40μM이었고, 총 6개의 농도: 각각 40, 13.3, 4.4, 1.48, 0.494 및 0.165μM이 있었다. 최종 검정 농도의 DMSO 함량은 0.2%를 초과하지 않았다. 이 농도의 DMSO는 hERG 칼륨 채널에 영향을 미치지 않았다. 화합물 제조에서 모든 희석은 Brovo 기기로 수행했다.
2.5 데이터 분석
검정 데이터는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어로 분석했다.
2.6 품질 관리
환경: 습도 20 내지 50%, 온도 22 내지 25℃
시약: 사용된 검정 시약은 >98%의 순도로 시그마에서 구입했다.
보고서의 검정 데이터는 다음 표준을 충족해야 한다:
전체 세포 밀봉 임피던스 > 100MΩ
테일 전류 진폭 > 300pA
약리학적 매개 변수:
양성 대조군으로서 hERG 채널에 미치는 여러 농도의 시사프리드의 억제 효과를 측정했다.
3. 검정 결과는 표 27에 제시되어 있다:
[표 27]
결론: 본 개시내용의 화합물은 hERG 칼륨 채널 전류에 대한 약한 억제 효과를 가져 심장 독성 위험을 낮추고 안전성을 향상시킨다.
검정 실시예
10. 혈장 단백질 결합(PPB) 검정
1. 검정 목적:
사람/마우스/래트/개과/원숭이 혈장 알부민에 대한 검정 화합물의 결합 정도를 연구했다.
2. 검정 절차:
1) 매트릭스 제조: 검정 당일에, 혈장을 냉수로 해동하고, 3220rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 모든 혈전을 제거했다. 생성되는 혈장의 pH를 측정하고, 필요에 따라 1% 인산 또는 1N 수산화나트륨을 사용하여 7.4 ± 0.1로 조정했다.
2) 검정 화합물의 희석 절차: 검정 화합물을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 각각 10mM 및 2mM 농도의 스톡 용액을 제조했다. 40μM 작업 용액은 2μL의 스톡 용액(2mM)을 98μL의 DMSO로 희석시켜 제조했다. 대조군 화합물의 400μM 작업 용액은 10μL의 스톡 용액을 240μL의 DMSO로 희석시켜 제조했다. 화합물의 작업 용액(5μL)을 블랭크 매트릭스(995μL)와 1:200의 비율로 잘 혼합하여 로딩 매트릭스를 제조했다.
3) 분석 단계:
a) 잔류물 측정을 위한 시간 0(T0) 샘플을 제조하기 위해, 동일 용적의 30μL 로딩 매트릭스(n=2)를 샘플 수집 플레이트로 옮겼다. 샘플을 즉시 상응하는 블랭크 완충제와 최종 용적 60μL로 일치시켰고, 각 웰 중 혈장 대 완충제의 용적 비율은 1:1이었다. 그런 다음, H2O 중 4% H3PO4 60μL와 내부 표준을 함유하는 480μL의 정지 용액을 검정 화합물의 T0 샘플에 첨가했다. 그런 다음, 이들을 추가 처리를 위해 다른 샘플과 함께 2 내지 8℃에서 저장했다.
b) 나머지 혈장 샘플을 37 ± 1℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 30분 동안 사전 배양했다. 무단백질 샘플(F 샘플) 및 매트릭스(230μL)가 로딩된 샘플을 모두 폴리카보네이트 튜브(n = 2)로 옮기고, 37℃, 155,000 x g(35,000rpm)에서 4시간 동안 초원심분리했다.
c) T 샘플(검정 샘플)을 제조하기 위해, 추가 매트릭스 함유 샘플을 별도의 96웰 플레이트(샘플 배양 플레이트)로 옮기고, 37℃에서 4시간 동안 배양했다.
d) 원심분리 종료시, 30μL의 무단백질 샘플 및 30μL의 T 샘플을 상청액의 두 번째 층(상단 층 아래)으로부터 새로운 샘플 수집 플레이트로 옮겼다. 각 샘플을 상응하는 블랭크 완충제 또는 매트릭스와 매트릭스:완충제 용적 비율 1:1로 최종 용적 60μL로 혼합하였다. 60μL의 4% H3PO4 수용액 및 480μL의 정지 용액(내부 표준 포함)을 모든 샘플에 첨가했다. 혼합물을 4000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 각 샘플로부터 100μL의 상청액을 LC-MS/MS로 분석했다.
3. 검정 결과는 표 28에 제시되어 있다:
[표 28]
결론: 본 개시내용의 화합물은 중등도 혈장 단백질 결합을 갖는다.
Claims (23)
- 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
화학식 I
상기 화학식 I에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 C1-3 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Ra로 치환되고;
R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 C1-3 알킬은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rc로 치환되고;
n은 0 또는 1이고;
m은 1 또는 2이고;
환 A는 피라졸릴 및 테트라하이드로피라닐로부터 선택되며, 여기서 상기 피라졸릴 및 테트라하이드로피라닐은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되고;
Ra 및 Rc는 각각 독립적으로 D, F, Cl, Br 및 I로부터 선택되고;
Rd는 F, Cl, Br, I, C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시로부터 선택되며, 여기서 상기 C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시는 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환되고;
R은 F, Cl, Br 및 I로부터 선택된다. - 제1항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 H, CH3 및 CH2CH3으로부터 선택되고, 여기서 상기 CH3 및 CH2CH3은 임의로 1, 2 또는 3개의 Ra로 치환되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제2항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 H, CH3, CHF2, CD3 및 CH2CH3으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제1항에 있어서, R4, R5, R6 및 R7이 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 CH3으로부터 선택되고, 여기서 상기 CH3은 임의로 1, 2 또는 3개의 Rc로 치환되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제4항에 있어서, R4, R5, R6 및 R7이 각각 독립적으로 H, F, Cl, Br, I 및 CH3으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제1항에 있어서, Rd가 F, Cl, Br, I, CH3 및 OCH3으로부터 선택되며, 여기서 상기 CH3 및 OCH3은 임의로 1, 2 또는 3개의 R로 치환되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제6항에 있어서, Rd가 CH3 및 OCH3으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제1항에 있어서, 환 A가 , 및 로부터 선택되며, 여기서 상기 , 및 는 임의로 1, 2 또는 3개의 Rd로 치환되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제8항에 있어서, 환 A가 , 및 로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제1항에 있어서, 상기 구조적 모이어티(structural moiety) 가 로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 I-1 및 I-2로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
화학식 I-1
화학식 I-2
상기 화학식 I-1 및 I-2에서,
R2는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고,
R6 및 R7은 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다. - 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 상기 화합물이
인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염. - 10.2080±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크(characteristic diffraction peak)를 갖는 X-선 분말 회절 패턴(X-ray powder diffraction pattern)을 특징으로 하는, WX001의 결정 형태(crystal form) A:
. - 제13항에 있어서, 상기 X-선 분말 회절 패턴이 10.2080±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 25.4797±0.2000°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제14항에 있어서, 상기 X-선 분말 회절 패턴이 10.2080±0.2000°, 15.2687±0.2000°, 17.6747±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 21.0531±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 25.4797±0.2000°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제15항에 있어서, 상기 X-선 분말 회절 패턴이 10.2080±0.2000°, 14.4684±0.2000°, 15.2687±0.2000°, 17.6747±0.2000°, 18.8429±0.2000°, 20.6217±0.2000°, 21.0531±0.2000°, 21.5713±0.2000°, 22.0420±0.2000°, 22.4540±0.2000°, 25.0767±0.2000°, 25.4797±0.2000°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제16항에 있어서, 상기 X-선 분말 회절 패턴이 10.2080°, 10.4856°, 14.4684°, 15.0133°, 15.2687°, 15.9518°, 16.6214°, 17.6747°, 17.9514°, 18.4703°, 18.8429°, 19.1531°, 20.6217°, 21.0531°, 21.2894°, 21.5713°, 22.0420°, 22.4540°, 25.0767°, 25.4797°, 26.3255°, 26.9544°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제17항에 있어서, 실질적으로 도 1에 도시된 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 241.0±3.0℃에서 흡열 피크의 개시를 갖는 시차 주사 열량계 곡선(differential scanning calorimetry curve)을 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제19항에 있어서, 도 2에 도시된 바와 같은 DSC 곡선을 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 150.0±3.0℃에서 최대 0.83%의 중량 감소(weight loss)를 갖는 열중량 분석 곡선(thermogravimetric analysis curve)을 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 제21항에 있어서, 도 3에 도시된 바와 같은 TGA 곡선을 갖는, WX001의 결정 형태 A.
- 고형 종양(solid tumor)의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른, WX001의 결정 형태 A의 용도.
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