KR20230169940A - 진균 감염의 진단 및 치료 방법 - Google Patents
진균 감염의 진단 및 치료 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대상체가 칸디다증과 같은 진균 감염을 앓고 있는지 또는 발병 위험이 있는지 여부를 결정하는 방법과, 그 결정에 따라 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 결정은 진균, 바이러스 및 박테리아와 같은 하나 또는 여러 병원체 클래스를 한번에 신속하게 검출하는 것을 포함할 수 있다. 또한 이에 유용한 시스템도 제공된다.
Description
본 발명은 진균 감염의 진단 및 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명은 2021년 2월 5일에 출원된 미국 임시 특허 출원 일련번호 63/146,212에 우선권(benefit)을 주장하며, 그 공개는 본 명세서상에 전체적으로 참조로 통합되어 있다.
칸디다증(Candidemia)은 미국에서 가장 흔한 병원 내 혈류 감염(bloodstream infections) 중 하나이며 입원 환자에게 심각한 이환율(morbidity)과 사망률(mortality)을 유발한다. 입원 환자의 다른 열성 질환 원인과 칸디다증을 감별할 수 있는 개선된 신속 진단이 무엇보다 중요하다. 순환 백혈구(circulating leukocytes)에서 숙주 유전자 발현 패턴에 초점을 맞춘 진단과 같은 병원체 클래스별 바이오마커 기반 진단이 유망한 대안이 될 수 있다.
US 2016/0194715는 말초 혈액 샘플의 단백질체 분석으로 칸디다증과 같은 진균 감염을 식별하는 방법에 대해 설명한다.
요약은 아래 상세 설명에 자세히 설명되어 있는 일부 개념을 소개하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구된 주제의 핵심 또는 필수적인 특징을 식별하기 위한 것이 아니며, 청구된 주제의 범위를 제한하기 위한 보조 자료로 사용하기 위한 것이 아니다.
여기에 일 측면에 따라 제공되는 대상체(subject) 분류 방법은 다음을 포함한다: (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (b) 플랫폼(platform)에서 생물학적 샘플의 진균 감염(fungal infection), 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염, 건강 및/또는 비감염성 질환 중 하나 이상을 나타내는 시그니처(signature indicative)를 측정(measuring)하되, 상기 시그니처는 미리 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 수준을 포함하는 단계; (c) 유전자 발현 수준을 진균 분류기(classifiers), 및 선택적으로 박테리아 감염 분류기, 바이러스 분류기 및 대조군 분류기(건강 및/또는 비감염성 질환) 중에서 선택된 하나 이상의 추가 분류기에 입력하되, 상기 분류기는 플랫폼에 대해 미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 포함하는 단계; 및 (d) 상기 유전자 발현 수준 및 분류기에 따라 대상체를 진균 감염 및/또는 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 대조군으로 분류하는 단계.
일 양태에 있어서, 방법은 유전자 발현 수준을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계를 포함하고, 입력은 상기 정규화된 유전자 발현 값을 분류기에 입력하는 단계를 포함하며; 및 분류는 정규화된 유전자 발현 값 및 분류기에 기초하여 진균 감염 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 대조군에 대한 확률을 계산하는 것을 포함한다.
일 양태에 있어서, 방법은 대상체에게 진균 감염 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염, 건강 및/또는 비감염성 질환의 확률을 나타내는 점수를 할당하는 보고서를 생성(generating)하는 것을 추가로 포함한다.
일 양태에 있어서, 방법은 다음을 추가로 포함한다: (e) 분류에 따라 대상체에게 적절한 치료법을 부여하는 단계.
일 양태에 있어서, 미리 정의된 유전자 세트는 1, 5, 10, 15 또는 20 내지 30, 40, 50, 60 또는 70개의 유전자로 구성된 세트이다. 일 양태에 있어서, 미리 정의된 유전자 세트는 표 1 내지 5에 열거된 1, 5, 10, 15 또는 20에서 30, 40, 50, 60 또는 70개의 유전자로 구성된 세트이다. 일 양태에 있어서, 미리 정의된 유전자 세트는 표 6 내지 10에 열거된 1, 5 또는 10부터 15, 20, 25, 30 또는 33개의 유전자(예를 들어, 표 6 내지 10에 굵은 글씨로 열거된 유전자 중에서 선택됨)로 구성된 세트이다.
일 양태에 있어서, 대상체는 감염증상(예를 들어, 발열)이 있다. 일 양태에 있어서, 대상체는 패혈증 증상이다.
일 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액(peripheral blood), 가래(sputum), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 소변(urine), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 세척액(nasopharyngeal wash), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 기관 내 흡인물(endotracheal aspirate) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액, 샘플을 포함한다. 일 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 기관지 폐포 세척액을 포함한다.
일 양태에 있어서, 측정(measuring)은 다음 중 하나 이상의 단계를 포함하거나 선행(preceding)한다: 샘플에서 세포를 정제하는 단계, 샘플의 세포를 분해하는 단계, 및 샘플에서 RNA를 분리하는 단계.
일 양태에 있어서, 측정은 PCR 증폭(PCR amplification), 등온 증폭(isothermal amplification), 시퀀싱(sequencing) 및/또는 핵산 프로브 혼성화(nucleic acid probe hybridization)를 포함한다. 일 양태에 있어서, 플랫폼은 어레이 플랫폼 (array platform), 열 사이클러 플랫폼(thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼), 핵산 질량 분석 플랫폼(nucleic acid mass spectrometry platform), 핵산 시퀀싱 플랫폼(nucleic acid sequencing platform), 등온 증폭 플랫폼(isothermal amplification platform) 또는 이의 조합이다.
일 양태에 있어서, 진균 감염은 효모로서 칸디다 (Candida), 트리코스포론 (Trichosporon), 또는 크립토코커스 (Cryprococcus)을 포함한다.
일 양태에 있어서, 진균 분류기는 다음과 같은 단계를 통해 생산된/되었다: (i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 입원하지 않은 복수의 건강한 대조군 및/또는 비감염성 질환을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 각 샘플에서 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) 정규화된 유전자 발현 값을 생성하기 위해 (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하는 단계; 그리고 (f) 진균 분류기를 생성하는 단계.
일 양태에 있어서, 진균 분류기는 다음을 포함하는 단계에 의해 생산된/되었다: (i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 박테리아 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 샘플 각각에 있는 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) 정규화된 유전자 발현 값을 생성하기 위해 (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하는 단계; 그리고 (f) 진균 분류기를 생성하는 단계.
일 양태에 있어서, 진균 분류기는 다음을 포함하는 단계에 의해 생산된/되었다: (i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 바이러스 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 샘플 각각에 있는 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계; 및 (f) 진균 분류기를 생성하는 단계.
일 양태에 있어서, 상기 생성은 다음의 반복적으로 이루어지는 단계를 포함한다: (i) 정규화된 각 유전자 발현 값에 가중치를 할당하고, 각 유전자에 대한 가중치 및 발현 값을 분류기(예를 들어, 선형 회귀 분류기(linear regression classifier)) 방정식에 입력하고 복수의 대상체 각각에 대한 결과에 대한 점수를 결정하는 단계, 그리고 (ii) 복수의 대상체에 걸쳐 각 결과에 대한 분류 정확도를 결정하는 단계, 그리고 (iii) 분류 정확도가 최적화될 때까지 가중치를 조정하여 플랫폼에 상기 진균 분류기, 박테리아 분류기, 바이러스 분류기 및/또는 대조군 분류기를 제공하고, 가중치가 0이 아닌 유전자가 각 분류기에 포함되며, 선택적으로 하나 이상의 데이터베이스에 각 분류기의 구성 요소(유전자, 가중치 및/또는 원인 역치)를 업로드하는 단계.
또한 다음과 같은 일 측면에 따라 제공되는 것은 다음을 포함하는 대상체의 진균 감염을 검출하는 방법이다: 대상체의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및 플랫폼 상에서 미리 정의된 유전자 세트의 차등 발현을 측정하는 단계를 포함하되, 상기 미리 정의된 유전자 세트는, 표 1 내지 5에 열거된 유전자들 중 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 50, 60, 70, 80, 90 또는 94개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 1에 열거된 유전자들 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25 또는 29개 모두; 및 선택적으로, 표 2에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 모두; 표 3에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 표 4에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 및/또는 표 5에 열거된 유전자 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 모두를 포함하고, 또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 표 6 내지 10에 열거된 유전자 중 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 33개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 6에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 모두; 및 선택적으로, 표 7에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두; 표 8에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두; 표 9에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두; 및/또는 표 10에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함하고, 또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 ITGA2B, MKI67, 및 AZU1; 및 선택적으로 HDAC4, DCAF15, SDHC, SAP30L, DNASE1, 및 DCAF15; PIGT, HERC6, 및 LY6E; SLC35E1, WIPI2, RELL1, MAP1LC3B, CASZ1 및 GABBR1; 및/또는 RPS24 및 CTSB를 포함하고, 상기 미리 정의된 유전자 세트의 차등 발현은 대상체의 진균 감염 유무를 나타낸다.
일 양태에 있어서, 측정은 다음의 하나 이상의 단계를 포함하거나 선행한다: 샘플에서 세포를 정제하는 단계, 샘플의 세포를 분해하는 단계, 및 샘플에서 RNA를 분리하는 단계.
일 양태에 있어서, 측정은 반정량적 PCR(semi-quantitative PCR), 등온 증폭(isothermal amplification), 및/또는 핵산 프로브 혼성화(nucleic acid probe hybridization)를 포함한다. 일 양태에 있어서, 플랫폼은 어레이 플랫폼 (array platform), 열 사이클러 플랫폼(thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼), 등온 증폭 플랫폼(isothermal amplification platform), 혼성화(hybridization) 및 다중 신호 코딩(예를 들어, 형광) 검출기 플랫폼, 핵산 질량 분석 플랫폼, 핵산 시퀀싱 플랫폼 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 양태에 있어서, 대상체가 감염 증상(예를 들어, 발열)을 앓고 있는 경우이다. 일 양태에 있어서, 대상체는 패혈증(sepsis) 증상을 겪고 있는 것이다.
일 양태에 있어서, 방법은 진균 감염의 존재가 감지될 때 상기 대상체를 감염에 대해 치료하는 것을 추가로 포함한다.
추가적으로 제공되는 일 측면은 대상체의 진균 감염 치료 방법은 여기에 기술된 방법에 따라 대상체가 진균 감염이 있는 것으로 판단될 때 해당 대상체에게 적절한 치료 요법을 투여하는 것을 포함한다. 또한 대상체의 진균 감염 치료 방법을 위한 적절한 치료 요법의 사용도 제공되며, 해당 대상체가 여기에 기술된 방법에 따라 진균 감염이 있는 것으로 판단되는 경우 해당 방법을 사용한다.
일 양태에 있어서, 적절한 치료 요법은 항진균 항생제(antifungal antibiotic) 투여이다. 일 양태에 있어서, 적절한 치료 요법은 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택한 치료제를 투여하는 것으로 구성된다: 에키노칸딘 (echinocandins)(예를 들어, 카스포풍진(caspofungin), 미카풍진(micafungin), 아니둘라풍진(anidulafungin)), 아졸계 항진균제(azole antifungals)(예를 들어, 플루코나졸(fluconazole), 보리코나졸(voriconazole), 이사부코나졸 (isavuconazole), 포사코나졸 (Posaconazole)), 폴리엔계(polyenes)(예를 들어, 암포테리신 B(amphotericin B)), 피리미딘 유사체 (pyrimidine analogues)(예를 들어, 5-플루오로사이토신(예를 들어, 5-fluorocytosine)(5-FC 또는 플루시토신 (flucytosine))), APX001(포스마노게픽스), APX879, 벤조티오우레아(benzothioureas), 클로파지민(clofazimine), 히드라진(hydrazycines)(예를 들어, BHBM 및 B0), 이보마이신(ibomycin), 모노클로날 항체 18B7(monoclonal antibody 18B7), 리소실레이트 아미노프라졸(resorcylate aminopyrazoles)(예를 들어, 화합물 112(예를 들어, Compound 112)), 세르트랄린(sertraline), 타목시펜(tamoxifen), VT-1598 및 이들의 조합을 포함한 그 밖의 약품.
일 양태에 있어서, 여기에 기술된 방법에 따른 방법은 진균 감염을 감지하는 방법을 사용하여 적절한 치료 요법의 효능에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
일 측면에 있어서 추가로 제공되는 대상체의 진균 감염을 감지하기 위한 시스템은 다음을 포함한다: 하나 이상의 프로세서(processor); 대상체로부터 생물학적 샘플을 받도록 구성된 샘플 입력 회로; 하나 이상의 프로세서에 결합되고, 진균 감염을 나타내는 미리 결정된 유전자 세트의 생물학적 샘플의 유전자 발현 수준을 결정하도록 구성된 샘플 분석 회로; 하나 이상의 프로세서에 결합된 입력/출력 회로 (input/output circuit); 하나 이상의 프로세서에 결합되고 데이터, 파라미터 및/또는 유전자 세트(들)를 저장하도록 구성된 저장 회로; 및 프로세서에 결합되고, 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때 하나 이상의 프로세서가 다음을 포함하는 연산을 수행하도록 하는 메모리에 구현된 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드를 포함하는 메모리: 상기 생물학적 샘플에서 미리 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 레벨의 샘플 분석 회로를 통한 측정을 제어/수행하는 단계; 유전자 발현 레벨을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계; 미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 저장 회로로부터 검색하는 단계; 정규화된 유전자 발현 값의 가중치 값에 기초하여 진균 감염의 가능성을 계산하는 단계; 및 진균 감염의 존재 또는 부재에 대한 결정의 입력/출력 회로를 통해 출력을 제어하는 단계.
일 양태에 있어서, 미리 정의된 유전자 세트는, 표 1 내지 5에 열거된 유전자들 중 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 50, 60, 70, 80, 90 또는 94개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 1에 열거된 유전자들 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25 또는 29개 모두; 및 선택적으로, 표 2에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 모두; 표 3에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 표 4에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 및/또는 표 5에 열거된 유전자 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 모두를 포함하고, 또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 표 6 내지 10에 열거된 유전자 중 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 33개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 6에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 모두; 및 선택적으로, 표 7에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두; 표 8에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두; 표 9에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두; 및/또는 표 10에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함하고, 또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 ITGA2B, MKI67, 및 AZU1; 및 선택적으로 HDAC4, DCAF15, SDHC, SAP30L, DNASE1, 및 DCAF15; PIGT, HERC6, 및 LY6E; SLC35E1, WIPI2, RELL1, MAP1LC3B, CASZ1 및 GABBR1; 및/또는 RPS24 및 CTSB를 포함한다.
일 양태에 있어서, 시스템은 유전자 발현의 정량적 또는 반정량적 검출을 진균 감염의 누적 점수 또는 확률로 변환하는 컴퓨터 판독 가능 코드를 포함한다.
일 양태에 있어서, 시스템은 어레이 플랫폼(array platform), 열 사이클러 플랫폼(thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼), 등온 증폭 플랫폼(isothermal amplification platform), 혼성화(hybridization) 및 다중 신호 코딩(예를 들어, 형광) 검출기 플랫폼, 핵산 질량 분석 플랫폼, 핵산 시퀀싱 플랫폼 또는 이들의 조합을 포함한다.
여기에 인용된 모든 특허 참조의 공개는 여기에 명시된 공개와 일치하는 범위 내에서 참조에 의해 통합된다.
본 발명에 개시된 원리에 대한 이해를 증진시키기 위해, 이제 바람직한 일 양태를 참조하고 이를 설명하기 위해 특정 언어가 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 개시된 범위의 제한은 의도된 것이 아니며, 여기에 예시된 바와 같은 개시의 변경 및 추가 수정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 통상적으로 발생할 수 있는 것으로 고려되는 것으로 이해될 것이다.
관사 "a", "an" 및 "the"는 본 발명에 있어서 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, "요소"는 적어도 하나의 요소를 의미하며 둘 이상의 요소를 포함할 수 있다.
"약"은 원하는 결과에 영향을 주지 않으면서 주어진 값이 말단 값보다 약간 높거나 약간 낮을 수(예를 들어, 2 %, 5 %, 10 % 또는 15 %) 있음을 제공하여 숫자 범위 말단 값에 유연성을 제공하는 데 사용된다.
여기에 "포함(including)," "구성(comprising)," 또는 "갖는(having)" 용어 및 그 변형의 사용은 그 뒤에 열거된 요소와 그에 상응하는 요소 및 추가 요소를 포괄하기 위한 것이다. 여기에 사용되는 "및/또는"은 하나 이상의 관련 나열된 항목의 가능한 모든 조합을 의미하며, 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 부재를 포함하지 않는다.
여기에 사용된 “본질적으로 구성하는”(및 문법적 변형)의 연결구(transitional phrase)는 청구된 발명의 "기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는" 인용된 자료 또는 단계를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 여기에 사용된 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"이라는 용어는 "포함하는(comprising)"과 동등한 것으로 해석되어서는 안 된다.
또한, 여기에 개시된 일 양태에 있어서, 여기에 기재된 특징 또는 특징의 조합이 제외되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 본 명세서(the specification)에서 복합체가 구성 요소 A, B 및 C를 포함한다고 명시하는 경우, A, B 또는 C 중 어느 하나 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략 및 제외(omitted and disclaimed )될 수 있다는 것이 구체적으로 의도되었다.
여기에 값의 범위를 열거하는 것은 여기에 달리 명시되지 않는 한, 그 범위에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하기 위한 약식 방법일 뿐이며, 각각의 개별 값은 여기에 개별적으로 열거되는 것처럼 본 명세서에 삽입된다. 예를 들어, 농도 범위가 1 % 내지 50 %로 명시된 경우, 2 % 내지 40 %, 10 % 내지 30 % 또는 1 % 내지 3 % 등의 값이 본 명세서에 명시적으로 열거되는 것을 의도한다. 이는 구체적으로 의도된 것의 예시일 뿐이며, 열거된 최저값과 최고값 사이의 모든 가능한 숫자 값 조합은 본 개시에 명시적으로 언급된 것으로 간주되어야 한다.
여기에 사용된 용어 “시그니처(signature)”는 특정 조합이 특정 생물학적 상태의 유무를 나타내는 생물학적 분석물질 세트 및 해당 분석물질의 측정 가능한 수량을 의미한다. 이러한 시그니처는 알려진 상태(예를 들어, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 또는 대조군(건강 및/또는 비감염성 질환)을 가진 복수의 대상체에서 발견되며, 하나 이상의 관심 범주 또는 결과를 (개별적으로 또는 공동으로) 판별할 수 있다. 생물학적 마커라고도 하는 이러한 측정 가능한 분석물은 유전자 발현 수준, 단백질 또는 펩타이드 수준 또는 대사물질 수준일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. US 2015/0227681(Courchesne 외), US 2016/0153993(Eden 외)를 참조하라.
여기에 개시된 일 양태에 있어서, “시그니처”는 여기에 따른 분류기에 통합될 때 발현 수준이 진균 감염과 같은 상태를 판별하는 특정 유전자 조합을 의미한다. 예를 들어, 하기에 제공된 예시를 참조하라. 하지만 시그니처는 US 2015/0227681(Courchesne 등) 및 US 2016/0153993(Eden 등)에 언급된 것과 같이 다른 방식으로 처리/해석될 수 있다. 비제한적인 일 예로써, 미국 특허 제10,533,224호(카트리 외)는 바이오마커 수준을 감염되지 않은 대조 대상의 기준값 범위(예: 시간 일치 기준값 범위)와 비교하고 바이오마커에 대한 대조 기준값과 비교한 바이오마커 발현 수준의 기하학적 평균을 사용하여 상태 또는 생물학적 상태를 판별하는 것에 대해 설명한다.
여기에 사용된, 용어 “분류기(classifier)” 및 “예측기(predictor)”는 상호 교환적으로 사용되며 시그니처 값(예를 들어, 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 수준)과 각 시그니처 구성 요소에 대해 미리 결정된 계수(또는 가중치)를 사용하여 범주에 할당할 목적으로 주어진 관찰 또는 개별 환자의 점수를 생성하는 수학적 함수를 나타낸다. 분류기는 선형 및/또는 확률적일 수 있다. 점수가 계수 집합에 의해 가중치가 부여된 시그니처 값의 합산 함수인 경우 분류기는 선형 분류기이다. 또한, 시그니처 값의 함수가 각각 대상 또는 관찰이 특정 범주에 속하거나 특정 결과를 가져올 가능성을 정량화하는 0에서 1.0 사이의 값(또는 0에서 100% 사이의 값)인 확률을 생성하는 경우 분류기는 확률론적 분류기이다. 프로비트 회귀와 로지스틱 회귀(Probit regression and logistic regression)는 각각 프로비트와 로지스틱 링크 함수를 사용하여 확률을 생성하는 확률적 선형 분류기의 예이다.
여기에 설명하는 분류기는 “트레이닝(training)”이라는 절차를 통해 얻을 수 있으며, 이 절차는 알려진 범주(예를 들어, 진균, 바이러스, 박테리아, 대조군 등)에 속하는 관찰을 포함하는 데이터 집합을 사용한다. 구체적으로 트레이닝은 주어진 시그니처의 각 구성요소(예를 들어, 유전자 발현 수준 구성 요소)에 대한 최적의 계수(즉, 가중치)와 최적의 시그니처를 찾고자 하며, 최적의 결과는 달성 가능한 가장 높은 분류 정확도에 의해 결정된다.
여기에 사용되는 “분류기” 또는 “분류(classification)”는 감염(예를 들어, 진균 감염)과 같은 생물학적 상태를 앓고 있거나 그러한 위험에 처한 대상체를 하나 이상의 범주 또는 결과(예를 들어, 환자가 병원체에 감염되었거나 감염되지 않음)에 할당하는 방법을 의미한다. 결과 또는 카테고리는 분류기가 제공한 점수 값에 의해 결정되며, 이는 컷오프 또는 임계값, 신뢰 수준 또는 한계와 비교될 수 있다. 다른 시나리오에서는 특정 카테고리에 속할 확률(예를 들어, 분류기가 확률을 보고하는 경우)이 주어질 수 있다.
여기에 사용되는, 유전자 발현 수준과 함께 사용되는 "지시적(indicative)"이라는 용어는 유전자 발현 수준이 대체 생물학적 상태 또는 대조군의 발현 수준과 비교하여 상향 조절되거나 하향 조절되거나 변경되거나 변경되었음을 의미한다. 단백질 수치와 함께 사용될 때 "지시적"이라는 용어는 단백질 수치가 표준 단백질 수치 또는 다른 생물학적 상태의 수치와 비교하여 높거나 낮거나, 증가하거나 감소하거나, 변경되거나, 변경되었음을 의미한다.
일 양태에 있어서, 분류기/분류는 진균 감염, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 SIRS와 같은 일반적인 생물학적 상태를 나타내지만 상태의 원인(예를 들어, 감염을 일으키는 특정 진균 또는 박테리아)으로서 특정 유기체(속 및 선택적으로 종)를 나타내지는 않는다는 점에서 "불가지론적(agnostic)"이다.
여기에 사용되는, "바이오마커(biomarker)" 또는 "생물학적 마커(biological markers)" 용어는 같은 의미로 사용되며 진균 감염과 같은 질병 또는 상태의 위험이나 발생을 예측하는 데 유용한 다양한 농도로 대상체에게 존재하는 자연 발생 생물학적 분자를 의미한다. 예를 들어, 바이오마커는 칸디다증과 같은 진균 감염의 위험에 처해 있거나 진균 감염을 앓고 있는 대상체에게 더 많거나 적은 양으로 존재하는 단백질 또는 유전자 발현일 수 있다. 바이오마커는 핵산, 리보핵산 또는 대상체의 생물학적 상태에 대한 지표 또는 마커로 사용되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일 양태에 있어서, 바이오마커는 RNA로 구성된다. 다른 일 양태에 있어서, 바이오마커는 DNA를 포함한다. 또 다른 일 양태에 있어서, 바이오마커는 단백질을 포함한다. 바이오마커는 또한 칸디다증과 같은 진균 감염의 위험 또는 발생을 예측하는 데 유용한 대상체에 존재하는 자연적 또는 비자연적으로 발생하는 다형성(예를 들어, 단일염기다형성(SNP)) 또는 유전자 변이를 포함할 수도 있다.
여기에 사용되는, "치료하는(treating)", "치료(treatment)", "요법(therapy)" 및/또는 "치료 요법(therapy regimen)"은 환자에게 나타나거나 환자가 취약할 수 있는 질병, 장애, 생리적 상태 또는 생물학적 상태(예를 들어, 진균 감염)에 대응하여 이루어지는 임상적 개입을 의미한다. 치료의 목적에는 증상의 완화 또는 예방/감소, 질병, 장애 또는 상태의 진행 또는 악화를 늦추거나 멈추는 것 및/또는 감염과 같은 질병, 장애 또는 상태의 완화를 포함한다. 여기에 사용되는, "예방(prevent)", "예방하는(preventing)", "예방(prevention)", "예방적 치료(prophylactic treatment)" 등의 용어는 질병, 장애 또는 상태(예를 들어, 칸디다증과 같은 진균 감염)가 없으나 질병, 장애 또는 상태가 발생할 위험이 있거나 취약한 대상체의 질병, 장애 또는 상태 발생 가능성을 감소시키는 것을 의미한다. "유효량(effective amount)" 또는 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"이라는 용어는 유익하거나 바람직한 생물학적 및/또는 임상적 결과에 영향을 미치기에 충분한 양을 의미한다.
여기에 사용되는, 동물 또는 세포에 치료제(therapeutic agent)와 같은 약제를 "투여(administering)"한다는 용어는 의도된 표적에 물질(예를 들어, 약물, 치료법 등)을 조제, 전달 또는 적용하는 것을 의미하며, 이는 동물 또는 세포에 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 치료제와 관련하여, "투여"라는 용어는 비경구(parenteral) 또는 경구(oral) 경로, 근육 주사(intramuscular injection), 피하/피내 주사(subcutaneous/intradermal injection), 정맥 주사(intravenous injection), 척수강 내 투여(intrathecal administration), 협측 투여(buccal administration), 경피 전달(transdermal delivery), 국소 투여(topical administration) 및 비강(intranasal) 또는 호흡기(respiratory) 경로를 통한 투여를 포함하여 동물의 원하는 위치에 치료제를 전달하기 위한 적절한 경로를 통해 대상체에게 치료제를 접촉 또는 조제, 전달 또는 도포하는 것을 지칭하기 위한 것이다.
"적절한 치료 요법" 또는 "적절한 치료"라는 용어는 특정 질병 또는 장애를 치료하는 데 필요한 표준 치료를 의미한다. 이러한 요법에 종종 질병 상태에서 치료 효과를 낼 수 있는 치료제를 대상체에게 투여하는 행위가 필요하다. 예를 들어, 진균 감염(예를 들어, 칸디다증, 크립포코쿠스 감염 등)을 가진 대상체를 치료하기 위한 치료제는 예를 들어 항진균 항생제를 포함할 수 있다. 진균 감염을 갖는 대상체를 치료하기 위한 특정 치료제는 예를 들어, 에키노칸딘(echinocandin)(예를 들어, 카스포풍진(caspofungin), 미카풍진(micafungin), 아니둘라풍진(anidulafungin)), 아졸계 항진균제(azole antifungals)(예를 들어, 플루코나졸(fluconazole), 보리코나졸(voriconazole), 이사부코나졸(isavuconazole), 포사코나졸(Posaconazole)), 폴리엔(polyenes)(예를 들어, 암포테리신 B(amphotericin B)), 피리미딘 유사체(예:, 5-플루오로사이토신(5-FC 또는 플루시토신)), APX001(포스마노게픽스(fosmanogepix)), APX879, 벤조티오우레아(benzothioureas), 클로파지민(clofazimine), 히드라진(hydrazycines)(예를 들어, BHBM 및 B0), 이보마이신(ibomycin), 모노클로날 항체 18B7(monoclonal antibody 18B7), 리소실레이트 아미노프라졸(resorcylate aminopyrazoles)(예를 들어, 화합물 112), 세르트랄린(sertraline), 타목시펜(tamoxifen), VT-1598, 및 이들의 조합을 포함하는 약물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Iyer et al., "Treatment strategies for crypococcal infection: challenges, advances and future outlook," Nature Reviews Microbiology 19, 454-466 (2021)를 참조하라.
박테리아 감염 치료제는 페니실린(penicillins), 세팔로스포린(cephalosporins), 플루로퀴놀론(fluroquinolones), 테트라사이클린(tetracyclines), 마크로라이드(macrolides) 및 아미노글리코사이드(aminoglycosides)를 포함하나 이에 한정되지 않는 항생제를 포함할 수 있다. 바이러스 감염을 갖는 대상체를 치료하기 위한 치료제는 오셀타미비르(oseltamivir), RNAi 항바이러스제(RNAi antivirals), 흡입 리바비린(inhaled ribavirin), 단일클론 항체 레스피감(monoclonal antibody respigam), 자나미비르(zanamivir) 및 뉴라미니다제 차단제(neuraminidase blocking agents)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 개시는 아직 이용 가능하지 않은 항진균제, 항바이러스제 또는 항생제를 이용한 치료법을 결정하기 위해 여기에 설명하는 방법의 사용을 고려한다.
이러한 요법(regimens)은 또한 질병 또는 생물학적 상태와 관련된 증상을 감소시킬 수 있는 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료제의 예로는 비스테로이드성 소염진통제(NSAIDS), 아세트아미노펜(acetaminophen), 항히스타민제(anti-histamines), 베타 작용제(beta-agonists), 진해제(anti-tussives) 또는 질병 또는 감염 과정과 관련된 증상을 감소시키는 기타 약물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용되는 “생물학적 샘플"이라는 용어는 대상체로부터 분리된 조직, 세포 및/또는 생물학적 체액이 포함된 샘플이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 검체의 예로는 조직(tissues), 세포(cells), 생검(biopsies), 혈액(예를 들어, 말초 혈액(peripheral blood)), 림프(lymph), 혈청(serum), 혈장(plasma), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 소변(urine), 타액(saliva), 점액(mucus), 눈물(tears), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 세척액(nasopharyngeal wash), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 기관 내 흡인액(endotracheal aspirate) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 양태에 있어서, 생물학적 샘플은 말초 혈액을 포함한다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 직접(예를 들어, 혈액 또는 조직 샘플링에 의해) 또는 제3자로부터(예를 들어, 의료 제공자 또는 실험실 기술자와 같은 중개자로부터) 획득될 수 있다.
"유전 물질(genetic material)"이란 유기체 세포의 핵 또는 미토콘드리아에 유전 정보를 저장하는 데 사용되는 물질에 해당하는 물질을 의미한다. 유전 물질의 예로는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, cDNA, RNA, mRNA 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용되는, "대상체"와 "환자"라는 용어는 같은 의미로 사용되며 인간 및 비인간 동물을 모두 지칭한다. 개시된 “비인간 동물”이라는 용어는 포유류 및 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 모든 척추동물을 포함한다. 여기에 개시된 방법 및 조성물은 시험관 내 시료(예를 들어, 분리된 세포 또는 조직) 또는 대상체(예를 들어, 환자와 같은 살아있는 유기체)의 생체 내 시료에 사용할 수 있다. 일 양태에 있어서, 대상체는 칸디다증과 같은 진균 감염을 앓고 있거나 앓을 위험에 처한 인간을 포함한다. 일 양태에 있어서, 대상체는 감염 증상(예를 들어, 발열)을 갖는다. 일 양태에 있어서, 대상체는 패혈증 증상을 갖는다.
여기에 사용되는 “패혈증(sepsis)”은 감염에 대한 숙주의 반응 조절 장애로 인한 장기 기능 장애를 의미한다. Singer, M. et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 315, 801 (2016)를 참조하라. 장기 기능 장애(Organ dysfunction)는 예를 들어 순차적 장기 부전 평가(패혈증 관련 장기 부전 평가 또는 SOFA라고도 함) 점수가 기준선보다 2점 이상 증가하면 판단할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술적인 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시의 일 측면은 다양한 숙주에서 진균, 바이러스 및/또는 박테리아 감염을 높은 정확도로 식별 및 구별할 수 있는 플랫폼을 위한 병원체 클래스별 분류기를 생성하는 방법을 제공하며, 본질적으로 다음을 포함, 구성 또는 이루는 방법이다: (i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 입원하지 않은 복수의 건강한 대조군으로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 각 샘플에서 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) 선택적으로, 정규화된 유전자 발현 값을 생성하기 위해 (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하는 단계; 그리고 (f) 다양한 숙주에서 진균 감염을 높은 정확도로 식별 및 감별할 수 있는 하나 이상의 진균 분류기를 생성하는 단계.
일 양태에 있어서, 방법은 생성 단계에서 사용하기 위해 바이러스 및/또는 박테리아 감염 및/또는 비감염성 질환(SIRS)을 앓고 있는 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 추가로 획득하는 것을 제공한다.
일 양태에 있어서, 측정은 시료에서 세포를 정제하고, 시료의 세포를 분해하고, 시료에서 RNA를 분리하는 하나 이상의 단계를 포함하거나 선행한다.
일 양태에 있어서, 측정은 PCR, 역전사(mRNA에서 cDNA로의 역전사), 등온 증폭 및/또는 핵산 프로브 혼성화를 포함한다.
여기에 사용된 “진균 감염”은 병원성 진균(예를 들어, 효모, 진균, 담마진균)에 의한 숙주 대상의 감염(예를 들어, 혈액 감염, 폐 감염 등)을 의미한다. 진균은 칸디다 속(칸디다혈증(candidemia) 및 칸디다증(candidiasis)을 유발), 크립토코커스 속(예를 들어, 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)), 아스퍼질러스 속(genus Aspergillus), 히스토플라즈마 속(예를 들어, 히스토플라즈마 캡슐라티움(Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 속(genus Pneumocystis), 코시디오이데스 속(예를 들어, 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis)), 파라코시디오이데스 속(예를 들어, 파라코시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)), 스포로트릭스 속(예를 들어, 스포로트릭스 쉔키(Sporothrix schenckii)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 양태에 있어서, 진균은 칸디다(Candida), 트리코스포론(Trichosporon) 또는 크립토코커스(Cryptococcus)와 같은 효모이다. 칸디다의 대표적인 종으로는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 루시타나에(Candida lusitanae), 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 제일라노이데스(Candida zeylanoides) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 트리코스포론의 대표적인 종에는 트리코스포론 진균증이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 크립토코쿠스의 대표적인 종으로는 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코쿠스 가티(Cryptococcus gattii) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용된, "플랫폼" 또는 "기술"이라는 용어는 본 개시에 따라 시그니처(예를 들어, 유전자 발현 수준)를 측정하는데 사용될 수 있는 장치(예를 들어, 기기 및 관련 부품, 컴퓨터, 여기에 개시된 하나 이상의 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체, 시약 등)를 지칭한다. 플랫폼의 예로는 어레이 플랫폼(array platform), 열 사이클러 플랫폼(thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼(multiplexed and/or real-time PCR platform), 핵산 시퀀싱 플랫폼(nucleic acid sequencing platform), 등온 증폭 플랫폼(isothermal amplification platform)(예를 들어, 루프 매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP, RT-LAMP), 혼성화 및/또는 다중 신호 코딩된(hybridization and/or multi-signal coded)(예를 들어, 형광) 검출기 플랫폼(detector platform) 등, 핵산 질량 분석 플랫폼(nucleic acid mass spectrometry platform), 자기 공명 플랫폼(magnetic resonance platform), 노던 블로팅(northern blotting) 및 이들의 조합(예를 들어, PCR과 등온 증폭의 조합)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Varlamov et al., "Combinations of PCR and Isothermal Amplification Techniques Are Suitable for Fast and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Viral RNA," Front. Bioeng. Biotechnol., 2020)를 참조하라.
일 양태에 있어서, 플랫폼은 유전자 발현 수준을 반정량적으로 측정하도록 구성되어 있다. 즉, 불연속적 또는 절대적 발현으로 측정하는 대신, 발현 수준을 추정치 및/또는 서로 또는 지정된 마커(예를 들어, 다른 "표준" 또는 "참조" 유전자의 발현)에 대한 상대적인 것으로 측정한다.
일 양태에 있어서, 반정량적 측정(semi-quantitative measuring)에는 지정된 mRNA를 나타내는 신호가 검출될 때까지 PCR 사이클을 수행하고, 검출까지 필요한 PCR 사이클 수를 사용하여 시그니처 내 유전자의 추정 또는 상대적 발현 수준을 제공하는 '실시간 PCR(real-time PCR)'이 포함된다.
예를 들어, 실시간 PCR 플랫폼에는 샘플이 다중 역전사를 거친 후 실시간 PCR이 수행되는 웰 컬렉션이 있는 어레이 카드에서 실시간 PCR이 수행되는 TaqMan® 저밀도 어레이(TLDA)가 포함된다. Kodani et al. 2011, J. Clin. Microbial. 49(6):2175-2182를 참조하라. 실시간 PCR 플랫폼에는 예를 들어 세포를 용해하고, DNA/RNA를 추출하고, 실시간 PCR을 수행하고, 결과를 검출하는 Biocartis IdyllaTM 샘플-결과 기술도 포함된다.
예를 들어, 자기공명 플랫폼에는 정제할 필요 없이 생물학적 샘플에서 분자 표적을 식별할 수 있는 T2 Biosystems® T2 자기공명(T2MR®) 기술이 포함된다.
'어레이', '마이크로어레이', '마이크로어레이'라는 용어는 서로 바꿔 사용할 수 있으며 기판 위에 제시된 뉴클레오티드 서열의 배열을 의미한다. 여기에 제공된 방법에서는 모든 유형의 어레이를 활용할 수 있다. 예를 들어, 어레이는 유리 슬라이드와 같은 고체 기판(고상 어레이) 또는 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인과 같은 반고체 기판 위에 있을 수 있다. 어레이는 비드, 즉 비드 어레이 위에 표시할 수도 있다. 이러한 비드는 일반적으로 미세하며 예를 들어 폴리스티렌(polystyrene)으로 만들어질 수 있다. 어레이는 또한 나노 입자 위에 표시될 수 있으며, 특히 금뿐만 아니라 은, 팔라듐(palladium) 또는 백금(platinum)으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 금 나노입자 프로브 기술을 사용하는 나노스피어 베리진® 시스템을 참조해라. 자성 나노 입자도 사용할 수 있다. 다른 예로는 핵 자기 공명 마이크로코일(nuclear magnetic resonance microcoils)이 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA 또는 이들의 임의의 치환(permutations)(예를 들어, 잠금 핵산(LNA) 등과 같은 뉴클레오티드 유사체)일 수 있다. 일 양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 엑손/인트론 경계를 가로지르며 게놈 DNA가 아닌 스플라이스된 또는 성숙한 RNA 종의 유전자 발현을 검출한다. 뉴클레오티드 서열은 유전자의 일부 서열, 프라이머, 전체 유전자 서열, 비코딩 서열, 코딩 서열, 공개된 서열, 공지된 서열 또는 새로운 서열일 수도 있다. 어레이는 단백질 또는 대사산물에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 단백질, 조직, 세포, 화학물질, 탄수화물 등과 같은 다른 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
여기에 설명하는 숙주 유래 바이오마커 접근법은 한 번에 하나 또는 여러 병원체 클래스의 신속한(심지어 현장 진료 시점) 검출을 포함하여 중요한 진단 틈새를 메울 수 있는 잠재력을 제공한다. 일 양태에 있어서, 검출은 플랫폼에 의해 48시간, 36시간 또는 24시간 이내에 수행될 수 있다. 일 양태에 있어서, 검출은 플랫폼에 의해 22시간, 20시간 또는 16시간 이내에 수행될 수 있다. 일 양태에 있어서, 검출은 12시간, 10시간, 또는 8시간 이내에 플랫폼에 의해 수행될 수 있다. 일 양태에 있어서, 검출은 6시간, 4시간 또는 2시간 이내에 플랫폼에 의해 수행될 수 있다. 일 양태에 있어서, 탐지는 플랫폼에 의해 60분, 45분, 또는 30분 이내에 수행될 수 있다. 이러한 플랫폼의 구체적인 예로는 PCR 기반 플랫폼이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 양태에 있어서, 분류기 생성은 다음의 반복적으로 이루어지는 단계를 포함한다: (i) 정규화된 각 유전자 발현 값에 가중치를 할당하고, 각 유전자에 대한 가중치 및 발현 값을 분류기(예를 들어, 선형 회귀 분류기(linear regression classifier)) 방정식에 입력하고 복수의 대상체 각각에 대한 결과에 대한 점수를 결정하는 단계, 그리고 (ii) 복수의 대상체에 걸쳐 각 결과에 대한 분류 정확도를 결정하는 단계, 그리고 (iii) 분류 정확도가 최적화될 때까지 가중치를 조정하여 플랫폼에 상기 진균 분류기, 박테리아 분류기, 바이러스 분류기 및/또는 대조군 분류기를 제공하고, 가중치가 0이 아닌 유전자가 각 분류기에 포함되며, 선택적으로 하나 이상의 데이터베이스에 각 분류기의 구성 요소(유전자, 가중치 및/또는 원인 역치)를 업로드하는 단계.
다른 일 양태에 있어서, 분류기는 선형 회귀 분류기로 구성되며, 생성은 분류기의 점수를 확률로 변환하는 것을 포함한다.
다른 일 양태에 있어서, 이 방법은 적어도 두 가지의 관련 임상개입(clinical attributes)을 포함하도록 알려진 데이터 세트에 대해 분류기를 검증하는 것을 더 포함한다.
본 개시의 또 다른 측면은 본 개시의 방법에 따라 제조된 진균, 바이러스, 박테리아 및/또는 제어 분류기를 제공하며, 분류기(들)는 표 1 내지 5에 열거된 15, 20, 25 또는 30~50, 60, 70, 80, 90 또는 94개 모두의 유전자 발현 수준(예를 들어, 해당 유전자와 상동하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 측정 가능)을 포함한다. (표 1과 3의 진균 및 바이러스 분류기에는 각각 하나의 유전자(TMEM199)가 나타나지만, 진균 분류기에서는 음의 계수(가중치)를, 바이러스 분류기에서는 양의 계수(가중치)를 가짐에 유의한다.) 게놈 참조: 호모 사피엔스 GRCh38, 릴리스 96, 2019-06-15에서 다운로드: ftp.ensembl.org/pub/release-96/fasta/homo_sapiens/dna/. 전사물 참조: 호모 사피엔스 GRCh38, 릴리스 96, 여기에서 다운로드: ftp.ensembl.org/pub/release-96/gtf/homo_sapiens/. 예를 들어, 분류기는 표 1에서 5에 나열된 유전자 중 1, 5, 10, 15 또는 20에서 30, 40, 50, 60 또는 70 유전자의 발현 수준을 포함할 수 있다.
예를 들어, 진균 분류기는 표 1에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25 또는 29개 모두를 포함할 수 있고, 박테리아 분류기는 표 2에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 모두를 포함할 수 있고; 바이러스 분류기는 표 3에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두를 포함할 수 있고; SIRS 분류기는 표 4에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 및/또는 건강한 분류기는 표 5에 열거된 유전자 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 모두를 포함할 수 있다.
이러한 분류기 중 하나 이상은 본 개시에 의해 개시된 방법을 수행하는데 포함될 수 있으며, 진균 분류기; 진균 분류기 및 박테리아 분류기; 진균 분류기 및 바이러스 분류기; 진균, 박테리아 및 바이러스 분류기; 진균 및 비감염성 질환(SIRS) 분류기; 진균 및 건강 분류기; 진균, 비감염성 질환(SIRS) 및 건강 분류기; 진균, 박테리아, 바이러스 및 SIRS 분류기; 진균, 박테리아, 바이러스 및 건강한 분류기; 및 진균, 박테리아, 바이러스, SIRS 및 건강한 분류기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 방법은 진균 및 박테리아 감염의 유무를 결정하기 위해 진균 분류기 및 박테리아 분류기를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 일 예로서, 방법은 진균 감염 및 비감염성 질환의 부재를 결정하기 위해 진균 분류기 및 SIRS 분류기의 사용을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 방법은 대상체에 진균 감염, 박테리아 감염 및 비감염성 질환의 부재를 결정하기 위해 진균 분류기, 박테리아 분류기 및 SIRS 분류기를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 개시의 또 다른 측면은 본 개시의 방법에 따라 제조된 진균, 바이러스, 박테리아 및/또는 대조군 분류기를 제공하며, 분류기(들)는 표 6 내지 10에 열거된 유전자(예를 들어, 상기 유전자에 상동하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 측정 가능한)의 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 33개 유전자 모두의 발현 수준을 포함한다. 표 1 내지 5의 분류기 예시와 겹치는 유전자는 굵은 글씨로 강조 표시되어 있다.
본 개시의 또 다른 측면은 본 개시의 방법에 따라 제조된 진균, 바이러스, 박테리아 및/또는 대조군 분류기를 제공하며, 여기서 분류기(들)는 표 6 내지 10에 기재된 굵은 글씨로 된 유전자의 발현 레벨을 포함한다. 즉, 진균 분류기는 ITGA2B, MKI67 및 AZU1(각각 양수 계수)를 포함하고; 박테리아 분류기는 HDAC4, DCAF15, SDHC, SAP30L, DNASE1(각각 양수 계수), DCAF15(음수 계수)를 포함하고; 바이러스 분류기는 PIGT, HERC6, LY6E(각각 양수 계수)를 포함하고; SIRS 분류기는 SLC35E1, WIPI2, RELL1, MAP1LC3B2(각각 양수 계수), CASZ1, GABBR1(각각 음수 계수)를 포함하고; 건강한 분류기는 RPS24(양수 계수) 및 CTSB(음수 계수)를 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 개시에서 설명하는 방법을 수행함에 있어서, 하나 이상의 분류기가 포함될 수 있으며, 여기에는 진균 분류기; 진균 분류기 및 박테리아 분류기; 진균 분류기 및 바이러스 분류기; 진균, 박테리아 및 바이러스 분류기; 진균 및 비감염성 질환(SIRS) 분류기; 진균 및 건강한 분류기; 진균, 박테리아, 바이러스 및 건강한 분류기; 진균, 박테리아, 바이러스 및 건강한 분류기; 진균, 박테리아, 바이러스 및 건강한 분류기; 및 진균, 박테리아, 바이러스, SIRS 및 건강한 분류기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 진균 감염 및 박테리아 감염의 유무를 판단하기 위해 진균 분류기 및 박테리아 분류기를 사용하는 방법이 포함될 수 있다. 또 다른 예로서, 방법은 진균 감염 및 비감염성 질환의 부재를 결정하기 위해 진균 분류기 및 SIRS 분류기의 사용을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 방법은 대상체에 진균 감염, 박테리아 감염 및 비감염성 질환의 부재를 결정하기 위해 진균 분류기, 박테리아 분류기 및 SIRS 분류기를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
일 양태에 있어서, 이러한 시그니처를 사용하면 여러 가지 다른 질병 원인(칸디다증과 같은 진균 감염, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 비감염성 질환("SIRS") 및/또는 건강)을 한 번에 높은 정확도로 식별할 수 있다. 예를 들어, 일 양태에 있어서, 병인(etiology)은 대상체가 정확하게 할당된 병인을 가질 확률인 수신기 작동 특성(receiver operating characteristic, auROC 또는 ROC)하에 영역이 적어도 0.90, 예를 들어, 적어도 0.91, 적어도 0.92, 적어도 0.93, 적어도 0.94, 적어도 0.95, 적어도 0.96, 적어도 0.97, 적어도 0.98 또는 적어도 0.99; 또는 적어도 0.80, 적어도 0.81, 적어도 0.82, 적어도 0.83, 적어도 0.84, 적어도 0.85, 적어도 0.86, 적어도 0.87, 적어도 0.88, 적어도 0.89이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 0.80의 auROC는 80 %의 시간 동안 올바른 할당이 이루어짐을 의미하며, 0.80 이상의 auROC는 분류기의 성능이 우수한 것으로 간주된다.
본 발명의 일 측면에 있어서 대상체 분류 방법은 다음을 포함한다: (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (b) 플랫폼(platform)에서 생물학적 샘플의 진균 감염(fungal infection), 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염, 건강 및/또는 비감염성 질환 중 하나 이상을 나타내는 시그니처(signature indicative)를 측정(measuring)하되, 상기 시그니처는 미리 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 수준을 포함하는 단계; (c) 유전자 발현 수준을 진균 분류기(classifiers), 및 선택적으로 박테리아 감염 분류기, 바이러스 분류기 및 대조군 분류기(건강 및/또는 비감염성 질환) 중에서 선택된 하나 이상의 추가 분류기에 입력하되, 상기 분류기는 플랫폼에 대해 미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 포함하는 단계; 및 (d) 상기 유전자 발현 수준 및 분류기에 따라 대상체를 진균 감염 및/또는 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 대조군으로 분류하는 단계. 일 양태에 있어서, 방법은 유전자 발현 수준을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계를 포함하고, 입력은 상기 정규화된 유전자 발현 값을 분류기에 입력하는 단계를 포함하며; 및 분류는 상기 정규화된 유전자 발현 값 및 상기 분류기에 기초하여 진균 감염 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 대조군에 대한 확률을 계산하는 것을 포함한다. 일 양태에 있어서, 방법은, 대상체에게 진균 감염 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염, 건강 및/또는 비감염성 질환의 확률을 나타내는 점수를 할당하는 보고서를 생성(generating)하는 것을 추가로 포함한다. 일 양태에 있어서, 방법은 다음을 추가로 포함한다: (e) 분류에 따라 대상체에게 적절한 치료법을 부여하는 단계.
본 개시의 또 다른 측면은, 칸디다증과 같은 진균 감염을 앓고 있거나 그러한 위험에 처한 대상체에서 진균 감염을 진단 및/또는 치료하는 방법으로, 다음을 포함하거나, 필수적으로 포함하거나, 포함하는 것을 제공한다: (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (b) 플랫폼(platform)에서 생물학적 샘플의 미리 정의된 유전자 세트(즉, 시그니처)의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 유전자 발현 수준을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계; (d) 정규화된 유전자 발현 값을 박테리아 감염 분류기, 바이러스 분류기, 곰팡이 분류기 및/또는 대조군 분류기 중에서 선택된 하나 이상의 분류기에 입력하는 단계, 상기 분류기는 플랫폼에 대해 미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 포함하며, 선택적으로 상기 분류기(들)은 하나 이상의 데이터베이스에서 검색되는 단계; (e) 정규화된 유전자 발현 값을 박테리아 감염 분류기, 바이러스 분류기, 진균 분류기 및/또는 대조군 분류기 중에서 선택된 하나 이상의 분류기에 입력하는 단계, 상기 분류기(들)는 플랫폼에 대해 미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 포함하며, 선택적으로 상기 분류기(들)는 하나 이상의 데이터베이스에서 검색되는 단계; 및 (f) 선택적으로, 적절한 치료법을 부여하는 단계.
일 양태에 있어서, 방법은, 대상체에게 칸디다증과 같은 진균 감염의 가능성을 나타내는 점수를 할당하는 보고서를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에 있어서, 미리 정의된 유전자 세트는 표 1 내지 5에 열거된 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 50, 60, 70, 80, 90 또는 94개 모두 유전자의 발현 수준을 포함한다. 예를 들어, 분류기(들)은 표 1 내지 5에 열거된 유전자 중 1, 5, 10, 15 또는 20 내지 30, 40, 50, 60 또는 70개의 유전자의 발현 수준을 포함할 수 있다.
예를 들어, 미리 정의된 세트는 표 1에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25 또는 29개 모두; 및 선택적으로 표 2에 나열된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 모두; 표 3에 나열된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 표 4에 나열된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 유전자 모두; 및/또는 표 5에 나열된 유전자 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 유전자 모두, 어떤 조합이든 가능하게 포함할 수 있다.
다른 예로서, 미리 정의된 유전자 목록은 표 6 내지 10에 열거된 유전자 중 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 33개 모두 유전자의 발현 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 미리 정의된 유전자 목록은 표 6 내지 10에 열거된 굵은 글씨로 열거된 유전자의 발현 수준을 포함할 수 있다.
일 양태에 있어서, 생물학적 검체는 말초 혈액(peripheral blood), 가래(sputum), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 세척액(nasopharyngeal wash), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 기관 내 흡인물(endotracheal aspirate), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 소변(urine), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
분류 시스템
도 5를 참조하여, 분류 시스템 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품(1100)은 여기에 설명된 다양한 일 양태에 따라, 플랫폼 내에서 또는 플랫폼에 의해 사용될 수 있다. 분류 시스템 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품(1100)은 소프트웨어, 펌웨어 및/또는 하드웨어의 임의의 적절한 조합을 사용하여 데이터를 수신, 전송, 처리 및 저장할 수 있고, 인터넷으로 알려진 글로벌 통신 네트워크의 전부 또는 일부를 포함하는 종래의, 공용 및/또는 개인, 실제 및/또는 가상, 유선 및/또는 무선 네트워크에 의해 독립적으로 및/또는 상호 연결될 수 있는 하나 이상의 기업, 애플리케이션, 퍼베이시브 및/또는 내장 컴퓨터 시스템으로서 구현될 수 있고, 다양한 유형의 유형적이고 비이동적인 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함할 수 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 분류 시스템(1100)은 하나 이상의 운영 체제 및/또는 하나 이상의 애플리케이션이 실행되는 하나 이상의 중앙 처리 장치(Central Processing Units, CPU)를 포함하는 프로세서 서브시스템(1140)을 포함할 수 있다. 하나의 프로세서(1140)가 도시되어 있지만, 복수의 프로세서(1140)가 존재할 수 있고, 이는 전기적으로 상호 연결되거나 분리될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 프로세서(들)(1140)는 메모리(1150)와 같은 메모리 디바이스로부터 컴퓨터 프로그램 코드를 실행하고, 본 명세서에 설명된 연산 및 방법 중 적어도 일부를 수행하도록 구성되며, 디지털 신호 프로세서(DSP), 필드 프로그래머블 게이트 어레이(programmable gate array, FPGA), 애플리케이션 특정 집적 회로(application specific integrated circuit, ASIC) 및 멀티코어 프로세서(multi-core processors)를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 통상적 또는 특수 목적 프로세서일 수 있다.
메모리 서브시스템(1150)은 랜덤 액세스 메모리(RAM), 읽기 전용 메모리(ROM), 지울 수 있는 프로그램 가능 읽기 전용 메모리(EPROM) 또는 플래시 메모리 및/또는 다른 솔리드 스테이트 메모리 디바이스와 같은 메모리 디바이스의 계층을 포함할 수 있다. 저장 회로(1170)도 제공될 수 있는데, 예를 들어, 휴대용 컴퓨터 디스켓, 하드 디스크, 휴대용 컴팩트 디스크 읽기 전용 메모리(CDROM), 광학 저장 장치, 자기 저장 장치 및/또는 임의의 다른 종류의 디스크 또는 테이프 기반 저장 서브시스템을 포함할 수 있다. 저장 회로(1170)는 분류 시스템(1100)을 위한 데이터/파라미터/분류기의 비휘발성 저장소를 제공할 수 있다. 저장 회로(1170)는 디스크 드라이브 및/또는 네트워크 저장소 구성요소를 포함할 수 있다. 저장 회로(1170)는 실행될 코드 및/또는 프로세서(1140)에 의해 액세스될 데이터를 저장하는 데 사용될 수 있다. 일 양태에 있어서, 저장 회로(1170)는 시그니처, 가중치, 임계치 등과 같은 분류 시스템(1110)에 사용되는 데이터/파라미터/분류기에 대한 액세스를 제공하는 데이터베이스를 저장할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 미디어의 임의의 조합이 저장 회로(1170)에 의해 활용될 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 컴퓨터 판독 가능 신호 매체 또는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체일 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 저장 매체는 예를 들어 전자, 자기, 광학, 전자기, 적외선 또는 반도체 시스템, 장치 또는 장치 또는 전술한 것들의 적절한 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 컴퓨터에서 읽을 수 있는 저장 매체의 보다 구체적인 예(전체 목록이 아님)는 다음과 같다: 휴대용 컴퓨터 디스켓(portable computer diskette), 하드 디스크(hard disk), 랜덤 액세스 메모리(random access memory, RAM), 읽기 전용 메모리(read-only memory, ROM), 지울 수 있는 프로그램 가능 읽기 전용 메모리(erasable programmable read-only memory, EPROM 또는 플래시 메모리), 휴대용 컴팩트 디스크 읽기 전용 메모리(portable compact disc read-only memory, CD-ROM), 광 저장 장치, 자기 저장 장치 또는 전술한 사항의 적절한 조합. 여기에 사용되는, 컴퓨터 판독 가능 저장 매체는 명령 실행 시스템, 장치 또는 장치에 의해 또는 이와 관련하여 사용하기 위한 프로그램을 포함하거나 저장할 수 있는 모든 유형의 매체일 수 있다.
입력/출력 회로(1160)는 디스플레이 및/또는 키보드, 터치 스크린 및/또는 포인팅 디바이스와 같은 사용자 입력 디바이스를 포함할 수 있다. 입력/출력 회로(1160)에 부착된 디바이스는 분류 시스템(1100)의 사용자에 의해 프로세서(1140)에 정보를 제공하는 데 사용될 수 있다. 입력/출력 회로(1160)에 부착된 디바이스는 네트워킹 또는 통신 컨트롤러, 입력 디바이스(키보드, 마우스, 터치 스크린 등) 및 출력 디바이스(프린터 또는 디스플레이)를 포함할 수 있다. 또한, 입출력 회로(1160)는 분류 시스템(1100)의 동작 결과가 분류 시스템(1100)의 사용자에게 제공되도록 통신될 수 있는 디스플레이 및/또는 프린터와 같은 장치에 대한 인터페이스를 제공할 수도 있다.
선택적 업데이트 회로(1180)는 분류 시스템(1100)에 업데이트를 제공하기 위한 인터페이스로서 포함될 수 있다. 업데이트는 메모리(1150) 및/또는 저장 회로(1170)에 저장되는 프로세서(1140)에 의해 실행되는 코드에 대한 업데이트를 포함할 수 있다. 업데이트 회로(1180)를 통해 제공되는 업데이트는 또한 시그니처, 가중치, 임계값 등과 같은 분류 시스템(1100)에 대한 정보를 유지하는 데이터베이스 및/또는 다른 데이터 저장 포맷과 관련된 저장 회로(1170)의 일부에 대한 업데이트를 포함할 수 있다.
분류 시스템(1100)의 샘플 입력 회로(1110)는 분석될 생물학적 샘플을 수신하기 위해 전술한 바와 같이 플랫폼에 대한 인터페이스를 제공할 수 있다. 샘플 입력 회로(1110)는 기계적 요소뿐만 아니라 전기적 요소를 포함할 수 있으며, 이는 분류 시스템(1100)으로 사용자에 의해 제공된 생물학적 샘플을 수신하고 분류 시스템(1100) 및/또는 플랫폼 내에서 처리될 생물학적 샘플을 이송할 수 있다. 샘플 입력 회로(1110)는 샘플 및/또는 테스트 주문 양식의 식별을 위해 바코드화된 용기를 식별하는 바코드 판독기를 포함할 수 있다. 샘플 처리 회로(1120)는 분류 시스템(1100) 및/또는 플랫폼 내에서 생물학적 샘플을 추가로 처리하여 자동화된 분석을 위해 생물학적 샘플을 준비할 수 있다. 샘플 분석 회로(1130)는 처리된 생물학적 샘플을 자동으로 분석할 수 있다. 샘플 분석 회로(1130)는 예를 들어, 분류 시스템(1100)에 제공된 생물학적 샘플로 미리 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 레벨을 측정하는 데 사용될 수 있다. 샘플 분석 회로(1130)는 또한 유전자 발현 레벨을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성할 수도 있다. 샘플 분석 회로(1130)는 저장 회로(1170)로부터 진균 감염 분류기를 검색할 수 있으며, 선택적으로 바이러스 감염 분류기, 세균 감염 분류기, 비감염성 질환 분류기 및 건강한 대상체 분류기 중 하나 이상을 검색할 수도 있다. 샘플 분석 회로(1130)는 정규화된 유전자 발현 값을 분류기(들)에 입력할 수 있다. 샘플 분석 회로(1130)는 상기 분류기(들)에 기초하여 진균 감염에 대한 원인 확률 또는 가능성을 계산할 수 있고, 선택적으로 입/출력 회로(1160)를 통해 바이러스 감염, 세균 감염, 비감염성 질환 및 건강한 대상체 중 하나 이상의 원인 확률 또는 가능성을 계산할 수도 있다.
샘플 입력 회로(1110), 샘플 처리 회로(1120), 샘플 분석 회로(1130), 입/출력 회로(1160), 저장 회로(1170) 및/또는 업데이트 회로(1180)는 분류 시스템(1100)의 하나 이상의 프로세서(1140)의 제어하에 적어도 부분적으로 실행될 수 있다. 여기에 사용된, 프로세서(1140)의 "제어하에" 실행된다는 것은 샘플 입력 회로(1110), 샘플 처리 회로(1120), 샘플 분석 회로(1130), 입/출력 회로(1160), 저장 회로(1170) 및/또는 업데이트 회로(1180)에 의해 수행되는 동작이 적어도 부분적으로 프로세서(1140)에 의해 실행 및/또는 지시될 수 있지만, 이러한 구성요소들의 동작의 적어도 일부가 별도로 전기적 또는 기계적으로 자동화된 것을 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 프로세서(1140)는 컴퓨터 프로그램 코드의 실행을 통해, 여기에 설명된 바와 같이, 분류 시스템(1100)의 동작을 제어할 수 있다.
본 개시의 양상에 대한 동작을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램 코드는 자바, 스칼라, 스몰토크, 에펠, 제이드, 에메랄드, C++, C#, VB.NET, 파이썬 등과 같은 객체 지향 프로그래밍 언어, "C" 프로그래밍 언어, 비주얼 베이직, 포트란 2003, 펄, 코볼 2002, PHP, ABAP, 파이썬, 루비 및 그루비와 같은 동적 프로그래밍 언어 또는 기타 프로그래밍 언어를 포함하는 하나 이상의 프로그래밍 언어의 임의의 조합으로 작성될 수 있다. 프로그램 코드는 분류 시스템(1100)에서 전적으로, 분류 시스템(1100)에서 부분적으로, 독립형 소프트웨어 패키지로서, 분류 시스템(1100)에서 부분적으로, 원격 컴퓨터에서 부분적으로, 또는 원격 컴퓨터 또는 서버에서 전적으로 실행될 수 있다. 후자의 시나리오에서, 원격 컴퓨터는 근거리 통신망(LAN) 또는 광역 통신망(WAN)을 포함하는 임의의 유형의 네트워크를 통해 분류 시스템(1100)에 연결될 수 있거나, 외부 컴퓨터(예를 들어, 인터넷 서비스 제공자를 사용하는 인터넷을 통해) 또는 클라우드 컴퓨터 환경에서 연결되거나 서비스로서의 소프트웨어(SaaS)와 같은 서비스로서 제공될 수 있다.
일 양태에 있어서, 시스템은 유전자 발현의 정량적 또는 반정량적 검출을 진균 감염의 원인에 대한 누적 점수 또는 확률로 변환할 수 있는 컴퓨터 판독 가능 코드를 포함하며, 선택적으로 바이러스 감염, 세균 감염, 비감염성 질환 및 건강한 대상체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 양태에 있어서, 시스템은 사용자가 검사할 생물학적 샘플을 간단히 삽입하고 일정 시간 후(예를 들어, 최대 30분 또는 45분, 최대 1시간, 2시간 또는 3시간, 최대 8시간, 12시간, 24시간 또는 48시간 등 짧은 시간이 바람직함) 시스템에서 결과 출력을 받을 수 있도록 구성 요소가 통합된 샘플-결과 시스템이다.
본 개시의 또 다른 측면은 여기에 설명 및 예시된 모든 것을 제공한다.
다음 예시는 예시를 제공하기 위한 것이며 제한하는 것이 아니다.
첨부된 도면 및 실시예는 예시로서 제공된 것이지, 이를 한정하기 위한 것이 아니다. 전술한 일 측면 및 본 개시의 다른 특징들은 하나 이상의 실시예와 관련된 첨부된 실시예 도면(이하 "도.")과 관련하여 다음 설명에서 설명될 것이며, 여기서, 하나 이상의 실시예는 다음과 같다:
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 감염 표현형(infection phenotype)에 따른 발견 및 검증 코호트의 분류를 위한 실험 설계를 보여주는 개략도이다.
도 2a는 다양한 감염 표현형에 반응하여 차별적으로 발현되는 유전자(adj P <0.05)를 보여준다. 모든 유전자, 감염 표현형과 다른 모든 유전자 비교.
도 2b는 다양한 감염 표현형에 반응하여 차별적으로 발현되는 유전자(adj P <0.05)를 보여준다. 모든 유전자, 칸디다를 서로 다른 표현형과 비교.
도 3은 본 발명의 일 양태에 따른 다항분포 유전자 발현 분류기(multinomial gene expression classifiers)를 나타내는 그래프를 보여주는 도이다. 패널 A. 발견 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC. 패널 B. 발견 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 분류기의 예측 확률을 보여주는 박스 플롯. 패널 C. 검증 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC. 패널 D. 검증 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 분류기의 예측 확률을 보여주는 박스 플롯.
도 4는 본 발명의 일 양태에 따른 검증 코호트를 나타내는 그래프를 나타낸다. Tsalik 등 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC(패널 A) 및 박스 플롯(패널 B). Ramilo 등 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC(패널 C) 및 박스 플롯(패널 D). 체외 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항식 분류기 성능의 ROC(패널 E) 및 박스 플롯(패널 F). 분류기에 의해 설정된 감염 등급은 대상체당 예측 확률이 가장 높은 표현형에 의해 결정되었다.
도 5는 본 발명에 따른 플랫폼에서 사용될 수 있는 분류 시스템 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품의 블록도(block diagram)이다. 분류 시스템 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품(1100)은 하나 이상의 운영 체제 및/또는 하나 이상의 애플리케이션이 실행되는 하나 이상의 중앙 처리 장치(CPU)를 포함하는 프로세서 서브시스템(1140)을 포함할 수 있다. 하나의 프로세서(1140)가 도시되어 있지만, 복수의 프로세서(1140)가 존재할 수 있고, 이는 전기적으로 상호 연결되거나 분리될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 프로세서(들)(1140)는 메모리(1150)와 같은 메모리 디바이스로부터 컴퓨터 프로그램 코드를 실행하여, 본 발명에 있어서 설명된 연산 및 방법 중 적어도 일부를 수행하도록 구성된다. 저장 회로(1170)는 시그니처, 가중치, 임계값 등과 같이 분류 시스템(1110)에 의해 사용되는 데이터/파라미터/분류기에 대한 액세스를 제공하는 데이터베이스를 저장할 수 있다. 입력/출력 회로(1160)는 디스플레이 및/또는 키보드, 터치 스크린 및/또는 포인팅 디바이스와 같은 사용자 입력 디바이스를 포함할 수 있다. 입력/출력 회로(1160)에 부착된 장치는 분류 시스템(1100)의 사용자에 의해 프로세서(1140)에 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 입력/출력 회로(1160)에 부착된 디바이스는 네트워킹 또는 통신 컨트롤러, 입력 디바이스(키보드, 마우스, 터치 스크린 등) 및 출력 디바이스(프린터 또는 디스플레이)를 포함할 수 있다. 선택적 업데이트 회로(1180)는 메모리 1150 및/또는 저장 회로(1170)에 저장된 프로세서(1140)에 의해 실행되는 코드에 대한 업데이트와 같은 분류 시스템(1100)에 대한 업데이트를 제공하기 위한 인터페이스로서 포함될 수 있다. 업데이트 회로(1180)를 통해 제공되는 업데이트는 또한 시그니처, 가중치, 임계값 등과 같은 분류 시스템(1100)에 대한 정보를 유지하는 데이터베이스 및/또는 다른 데이터 저장 포맷과 관련된 저장 회로(1170)의 일부에 대한 업데이트를 포함할 수 있다. 샘플 입력 회로(1110)는 분류 시스템(1100)이 분석될 생물학적 샘플을 수신하기 위한 인터페이스를 제공한다. 샘플 처리 회로(1120)는 자동화된 분석을 위해 생물학적 샘플을 준비하기 위해 분류 시스템(1100) 내에서 생물학적 샘플을 추가로 처리할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 감염 표현형(infection phenotype)에 따른 발견 및 검증 코호트의 분류를 위한 실험 설계를 보여주는 개략도이다.
도 2a는 다양한 감염 표현형에 반응하여 차별적으로 발현되는 유전자(adj P <0.05)를 보여준다. 모든 유전자, 감염 표현형과 다른 모든 유전자 비교.
도 2b는 다양한 감염 표현형에 반응하여 차별적으로 발현되는 유전자(adj P <0.05)를 보여준다. 모든 유전자, 칸디다를 서로 다른 표현형과 비교.
도 3은 본 발명의 일 양태에 따른 다항분포 유전자 발현 분류기(multinomial gene expression classifiers)를 나타내는 그래프를 보여주는 도이다. 패널 A. 발견 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC. 패널 B. 발견 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 분류기의 예측 확률을 보여주는 박스 플롯. 패널 C. 검증 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC. 패널 D. 검증 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 분류기의 예측 확률을 보여주는 박스 플롯.
도 4는 본 발명의 일 양태에 따른 검증 코호트를 나타내는 그래프를 나타낸다. Tsalik 등 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC(패널 A) 및 박스 플롯(패널 B). Ramilo 등 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항분포 분류기 성능의 ROC(패널 C) 및 박스 플롯(패널 D). 체외 코호트에서 각 감염 표현형에 대한 다항식 분류기 성능의 ROC(패널 E) 및 박스 플롯(패널 F). 분류기에 의해 설정된 감염 등급은 대상체당 예측 확률이 가장 높은 표현형에 의해 결정되었다.
도 5는 본 발명에 따른 플랫폼에서 사용될 수 있는 분류 시스템 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품의 블록도(block diagram)이다. 분류 시스템 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품(1100)은 하나 이상의 운영 체제 및/또는 하나 이상의 애플리케이션이 실행되는 하나 이상의 중앙 처리 장치(CPU)를 포함하는 프로세서 서브시스템(1140)을 포함할 수 있다. 하나의 프로세서(1140)가 도시되어 있지만, 복수의 프로세서(1140)가 존재할 수 있고, 이는 전기적으로 상호 연결되거나 분리될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 프로세서(들)(1140)는 메모리(1150)와 같은 메모리 디바이스로부터 컴퓨터 프로그램 코드를 실행하여, 본 발명에 있어서 설명된 연산 및 방법 중 적어도 일부를 수행하도록 구성된다. 저장 회로(1170)는 시그니처, 가중치, 임계값 등과 같이 분류 시스템(1110)에 의해 사용되는 데이터/파라미터/분류기에 대한 액세스를 제공하는 데이터베이스를 저장할 수 있다. 입력/출력 회로(1160)는 디스플레이 및/또는 키보드, 터치 스크린 및/또는 포인팅 디바이스와 같은 사용자 입력 디바이스를 포함할 수 있다. 입력/출력 회로(1160)에 부착된 장치는 분류 시스템(1100)의 사용자에 의해 프로세서(1140)에 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 입력/출력 회로(1160)에 부착된 디바이스는 네트워킹 또는 통신 컨트롤러, 입력 디바이스(키보드, 마우스, 터치 스크린 등) 및 출력 디바이스(프린터 또는 디스플레이)를 포함할 수 있다. 선택적 업데이트 회로(1180)는 메모리 1150 및/또는 저장 회로(1170)에 저장된 프로세서(1140)에 의해 실행되는 코드에 대한 업데이트와 같은 분류 시스템(1100)에 대한 업데이트를 제공하기 위한 인터페이스로서 포함될 수 있다. 업데이트 회로(1180)를 통해 제공되는 업데이트는 또한 시그니처, 가중치, 임계값 등과 같은 분류 시스템(1100)에 대한 정보를 유지하는 데이터베이스 및/또는 다른 데이터 저장 포맷과 관련된 저장 회로(1170)의 일부에 대한 업데이트를 포함할 수 있다. 샘플 입력 회로(1110)는 분류 시스템(1100)이 분석될 생물학적 샘플을 수신하기 위한 인터페이스를 제공한다. 샘플 처리 회로(1120)는 자동화된 분석을 위해 생물학적 샘플을 준비하기 위해 분류 시스템(1100) 내에서 생물학적 샘플을 추가로 처리할 수 있다.
실시예 1.
캔디다증에 대한 숙주 전사 반응은 호중구 활성화와 헴 생합성에 의해 지배되며 새로운 진단 접근법을 제공한다
A. 방법
대상체 등록: 모든 연구 환자(patient)는 듀크대학교 의료센터(DUMC)에서 사전 동의 후 등록되었다. 이 연구는 DUMC의 기관검토위원회(IRB)의 승인(Pro00083484)을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 칸디다균에 대한 첫 혈액 배양 양성이 확인된 시점에 듀크대학교(노스캐롤라이나주 더럼)의 감염병 데이터 및 검체 저장소 프로그램을 통해 48명의 칸디다혈증 입원 환자(hospitalized patient)가 등록되었다. 이들 대상체로부터 전혈을 채취하여 PAXGene 튜브에 담아 RNA 시퀀싱을 진행했으며, 추가 분석을 위해 각 대상체로부터 혈청을 채취했다. 칸디다증이 있는 각 대상체는 연구 기간 동안 최소 1개에서 최대 14개의 샘플을 수집했다. 바이러스, 박테리아 또는 비감염성 질환으로 응급실에 내원한 이전에 등록된 대상체(DUMC, 더럼 VA 의료 시스템, UNC 의료 시스템, 헨리 포드 병원)의 RNA 시퀀싱 데이터도 캔디다증 샘플과 함께 실행되었다. 말초 혈액, 입원을 하지 않은 건강한 대조군 집단에서도 유사하게 샘플을 채취했다. 임상적 판단은 등록 후 유전자 발현 측정 전에 수행된 참조 표준으로 사용되었다. 여기에 사용된 판정 프로세스는 이전에 설명하였다. 비감염성 대상체는 감염의 증거 없이 최소 두 가지 SIRS 기준(체온 36 ℃ 미만 또는 38 ℃이상, 빈맥 분당 90회 이상, 빈호흡 분당 20회 이상 또는 PaCO2 <32 mmHg, 백혈구 수 4,000세포/mm^3 미만 또는 12,000세포/mm^3 이상 또는 호중구 밴드 형태 10 % 이상)에 의해 정의되는 전신 염증 반응 증후군(SIRS) 표현형으로 분류하였다.
RNA 추출, 라이브러리 준비 및 시퀀싱: 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen PAXgene 혈액 miRNA 키트를 사용하여 보존된 인간 혈액에서 총 RNA를 추출하고 PAXgene 혈액 RNA 튜브에 보관하였다. 나노드롭 2000 분광광도계(Thermo Scientific)와 애질런트 2100 바이오애널라이저를 사용하여 RNA 양과 품질을 각각 평가하였다. RNA 시퀀싱 라이브러리는 AnyDeplete Globin(NuGEN Technologies, 캘리포니아주 레드우드 시티)이 포함된 NuGEN Universal mRNA-seq 키트를 사용하여 생성하고, S2 플로우 셀과 50 bp 쌍단 판독(Duke 시퀀싱 및 게놈 기술 코어를 통해 수행)을 갖춘 Illumina NovaSeq 6000 기기에서 시퀀싱하였다.
RNA 시퀀싱 데이터 처리: 발견 및 검증 데이터 세트 모두에 대해, RNA 서열을 인간 게놈(hg)에 매핑하고 STAR를 사용하여 파라미터와 함께 유전자 발현을 정량화 하였다: quantMode: 'GeneCounts'; outSAMtype: 'None'; outSAMmode: 'None'; readFilesCommand: 'zcat' 및 ENSEMBL 유전자 참조 호모 사피엔스 GRCh38 DNA, 릴리즈 96, 다운로드: ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-96/fasta/homo_sapiens/dna/(유전자 정량화용). 다른 모든 매개변수는 STAR 버전 2.7.1a의 기본값을 그대로 유지하였다. 매핑된 읽기 수가 적거나(1,200만 건 미만) 평균 쌍 간 상관관계가 낮은(0.70 미만) 샘플은 분석에서 제외되었다. 발견 코호트에서는 샘플의 50 % 이상에서 개수가 0이거나 개수/백만 <2인 유전자가 제외되었다. 검증 코호트는 발견 코호트에서 품질 관리를 통과한 유전자 집합으로 축소되었다. 나머지 유전자 수는 각 코호트 내에서 TMM을 사용하여 정규화하였다.
통계 분석
미분 표현식: 발견 및 검증 데이터 세트 모두에 대해, 각 결과 그룹의 평균 발현을 추정하기 위해 R 바이오컨덕터 패키지 림마(R Bioconductor package limma)를 사용하였다: 연령, 성별, 인종을 조정하고, 붐(voom) 가중치가 있는 경험적 베이지안(Bayesian) 선형 모델링을 사용하여 칸디다증, 박테리아, 바이러스, SIRS, 건강 등 각 결과 그룹의 평균 발현을 추정하였다. 일반화된 선형 가설 검정(즉, 대조)을 사용하여 특정 감염 유형 그룹(예를 들어, 칸디다증 대 건강) 간의 차별적 발현을 테스트하였다. 각 비교에 대한 통계적 유의성을 결정하기 위해 5% 미만의 오탐률을 사용하였다. 발견 코호트와 검증 코호트의 차등 발현 결과는 R 패키지 메타에서 구현된 대로 코호트 무작위 효과와 함께 로그2 배율 변화(fold changes)에 대한 역변량 가중 메타 분석을 사용하여 결합하였다.
진단 분류기 개발 및 검증: 감염 유형의 다중 유전자 시그니처를 식별하기 위해 R package glmnet에서 구현된 정규화된 다항식 로지스틱 회귀(lasso)를 사용하였다. 모델을 구축하기 전에 세 가지 다른 편향되지 않은 특징을 선택하였다: 1) 가장 변이가 많은 상위 1000개 유전자, 2) 가장 변이가 많은 상위 2000개 유전자, 3) 품질 관리를 통과한 전체 내지 11,100개 유전자. 다항식 모델 성능은 다음과 같이 중첩된 한 샘플 제외 교차 검증(LOOCV)을 사용하여 추정하였다. 각 샘플에 대해 한 샘플을 제외하고 나머지 샘플을 사용하여 모델을 추정하는 방식이다. (N-1) 샘플 내에서 10배 교차 검증을 사용하여 희소성 매개변수를 최적화하였다. 그런 다음 최적의 희소성 파라미터를 사용하여 N-1 샘플에서 모델을 추정하였다. 결과 모델은 홀드아웃 샘플에서 예측된 클래스 확률을 추정하는데 사용되었다. LOOCV를 완료한 후, 홀드아웃 샘플에서 예측된 클래스 확률을 사용하여 훈련 성능 지표인 클래스당 auROC, 혼동 행렬, 전체 민감도, 전체 특이도를 평가하였다. 전체 모델은 발견 데이터 세트의 10배 교차 검증을 통해 최적화된 희소성 파라미터를 사용하여 모든 데이터를 사용하여 추정되었다. 이 전체 모델은 다른 데이터 세트의 다른 시퀀싱 샘플에서 감염 유형 확률을 예측하는 데 사용되었다. 모델 테스트 성능 지표에는 수신기 작동 특성 곡선(auROC)과 혼동 행렬에 따른 클래스별 영역이 포함되었다.
추가 유효성 검사: 두 개의 인간 마이크로어레이 유전자 발현 데이터 세트를 사용하여 독립적인 외부 검증을 수행하였다. 라밀로 데이터셋(Ramilo dataset)의 경우, GEO(GSE6269-GPL96)에서 Affymetrix CEL 파일과 샘플 특성을 다운로드 하였다. CEL 파일은 R Bioconductor 패키지 readAffy를 사용하여 가져와서 처리했다. 표현식 값은 gcrma를 사용하여 정규화하였다. 발현 값은 gcrma를 사용하여 정규화되었다. 4개 미만의 샘플에서 검출된 프로브와 Affymetrix 대조 프로브는 제외되었다. Tsalik 데이터 세트의 경우, 앞서 설명한 대로 Affymetrix 마이크로어레이 유전자 발현을 이전에 처리하고 정규화하였다. Ramilo 및 Tsalik 데이터 세트 모두에서 마이크로어레이 프로브는 앙상블 유전자(ensemble gene) 식별자에 매핑되고 분류자 유전자 목록에 매핑된 프로브의 하위 집합으로 축소되었다. 결과 표현식 값을 로그2로 변환하고 검색 분석에 사용된 것과 동일한 정규화된 다항식 모델링, 교차 검증 절차 및 성능 메트릭을 사용하여 분석하여 모델 가중치를 다시 추정하였다.
건강한 인간 PBMC의 바이러스(인플루엔자), 박테리아(대장균(Escherichia coli) 및 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)), 진균(칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 및 가티(gattii)) 감염으로 구성된 체외 PBMC 마이크로어레이 데이터 세트를 사용하여 추가 검증을 수행하였다. Ramilo 및 Tsalik 데이터 세트와 유사하게, .CEL 파일은 R 바이오컨덕터 패키지 readAffy를 사용하여 가져와서 처리하고, gcrma를 사용하여 정규화했으며, 4개 미만의 샘플에서 검출된 것으로 정의된 저 발현 프로브와 대조 프로브는 제외하였다. 마이크로어레이 프로브 식별자는 앙상블 유전자에 매핑되었고, 데이터는 분류기 유전자 목록에 매핑된 프로브의 하위 집합으로 축소되었으며, 로그2로 변환되었다. 발견 분석에 사용된 것과 동일한 정규화된 다항식 모델링, 교차 검증 절차, 성능 메트릭이 다른 유전자 발현 플랫폼에서 분류기 모델을 추정하기 위해 여기에 적용되었다.
생물학적 경로 분석: 주석, 시각화 및 통합 발견을 위한 데이터베이스(DAVID, www.david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 유전자 목록을 분석하여 상당히 강화된 경로를 식별하였다. 또한 발견 데이터 세트(즉, 136개 샘플의 11,131개 유전자)에 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석(WGCNA)을 적용하였다. 파워 파라미터 = 6, UPGMA 클러스터링, 동적 트리 절단(method = "hyprid", deepSplit = 2, minclustersize = 30)을 사용하여 41개의 클러스터(또는 "모듈")를 식별하였다. 모듈에 할당된 모든 유전자의 총 발현은 PCA를 사용하여 요약할 수 있으며, 여기서 첫 번째 주성분(eigengene)은 모듈 유전자 발현의 요약 측정값으로 사용된다. 각 모듈 고유 유전자는 해당 모듈에 있는 모든 유전자의 총 발현량으로 생각할 수 있으므로 고유 유전자 값을 사용하여 감염 유형과의 연관성을 테스트할 수 있다. 각 모듈 고유 유전자는 선형 회귀를 사용하여 칸디다증 감염과의 연관성을 테스트하였다. 매개변수 추정치가 벤자민-호크버그(Benjamini-Hochburg) 조정 p-값이 5% 미만인 모듈은 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 또한, 각 모듈은 R 바이오컨덕터 패키지 림마에서 사용할 수 있는 함수 goana 및 kegga를 사용하여 KEGG 및 GO 경로의 농축 여부를 평가하였다. 앙상블 유전자 식별자를 엔트레즈 유전자 식별자에 매핑하고 품질 관리를 통과하고 엔트레즈 유전자에 매핑된 모든 유전자와 비교하여 모듈 내의 유전자 세트에 대한 농축을 평가하였다.
베타-D-글루칸 테스트: 칸디다증이 있는 모든 대상체, 건강한 대상체 5명, 바이러스 감염이 있는 대상체 20명의 혈청 샘플을 BDG 검사(Viracor Eurofins)를 실시하였다(범위 <31 ~ >500). 500을 초과하는 값은 501로 처리하고 31 미만의 값은 앞서 설명한 대로 처리하였다. 발견 코호트와 검증 코호트에 대해 BDG 검사 값과 유전자 발현 시그니처의 칸디다증 구성 요소에 대한 AuROC를 별도로 계산했으며, BDG 검사와 유전자 발현이 모두 있는 대상체의 하위 집합으로 제한하였다. BDG와 유전자 발현 auROC는 DeLong 테스트를 사용하여 비교하였다. BDG와 유전자 발현 데이터는 스피어만 상관관계로 비교하였다. 평균 비교에는 맨-위트니 테스트(Mann-Whitney test)가 사용되었다.
B. 결과
i. 연구 모집단
2011년부터 2014년까지 듀크대학교 메디컬 센터에서 칸디다균에 대한 최초 혈액 배양 양성 반응이 나온 시점(최초 혈액 배양 채취 후 최소 2일 후)에 48명의 입원 성인 환자를 등록하고 일부 환자에 대한 연속 샘플링을 실시하였다. 또한 임상적 배경은 비슷하지만 급성 호흡기 바이러스 감염, 급성 박테리아(폐렴 또는 균혈증) 감염 또는 임상적으로 비감염성 질환으로 판정된 환자 및 감염되지 않은 건강한 대상체도 등록하였다(n=151, 도 1). 이 연구에는 고형 장기 이식(solid organ transplants), 줄기세포 이식(stem cell transplants), 혈액 악성 종양(hematologic malignancies), 중심 정맥 카테터를 삽입한 중환자실(ICU) 환자 등 다양한 임상 배경을 가진 환자가 포함되었다. 총 7종의 칸디다균이 확인되었는데, 가장 흔한 칸디다균은 C.알비칸스(C. albicans)와 C. 글라브라타(C. glabrata)다.
*두 명의 대상체는 두 가지 이상의 칸디다 종에 동시에 감염되었다.
**9명의 대상체는 의료 기록이 제한적이었으며 체온은 기록되지 않았다.
ii. 발견 및 검증 코호트
대상체와 대조군은 초기 분석을 위해 발견 코호트와 검증 코호트로 무작위로 나뉘었다. 발견 코호트와 검증 코호트에는 각각 138명의 대상체와 61명의 대상체가 포함되었다 (도 1). 발견 코호트에서는 다른 유형의 감염이 없는 상태에서 23명의 대상체가 칸디다균에 의한 혈류 감염이 있는 것으로 판정되었다. 박테리아 감염이 확인된 35명의 대상체와 바이러스 감염이 확인된 48명의 대상체(모두 단핵구균)를 대조군으로 포함하였다. 또한 환자에게 급성 비감염성 질환이 임상적으로 나타날 수 있으므로, 17명의 대상체는 전신 염증 반응 증후군(SIRS)으로 분류된 급성 비감염성 질환에 포함되었다. 검증 코호트에는 칸디다증을 앓고 있는 25명의 대상체와 함께 박테리아 감염이 확인된 10명의 대상체, 바이러스 감염이 확인된 11명의 대상체(모두 단핵구균)가 포함되었다. 각 코호트에는 대조군으로 15명의 건강한 대상체도 포함되었는데, 건강한 대조군의 평균 연령은 발견 데이터 세트에서 20.9세, 검증 데이터 세트에서 33.5세였다. 발견 코호트에서는 65 %, 검증 코호트에서는 80 %의 칸디다증 피험자가 초기 샘플링 시점에 항진균 치료를 받고 있었다.
iii. 칸디다증에 대한 전사 반응은 강력하며 항진균 방어 메커니즘을 보여준다.
칸디다증은 건강한 대조군과 비교하여 1,641개의 유전자가 차별적으로 상향 조절된 인간 숙주에서 강력한 전사체 반응을 유발하였다. 이러한 상향 조절된 유전자는 선천성 면역 반응, 진균에 대한 방어 반응, 백혈구 이동, 효모에 대한 반응 등 진균 감염에 대한 숙주 면역 반응의 알려진 구성 요소에 해당한다. 기타 스트레스 관련 경로에는 사이토카인에 대한 반응, 염증 반응, 산화 스트레스에 대한 세포 반응, 헴 합성과 철 대사에 대한 숙주 조절이 포함되었다. 적응 면역 반응, 면역 반응 조절, B 세포 증식, 체액성 면역 반응, 면역 글로불린 생산, T 세포 공동 자극과 같은 면역 과정에 2,316개의 하향 조절 유전자가 군집되어 있었다. 전사체 반응이 숙주에서 활성 생물학적 경로를 정의하는 방법을 더 명확히 밝히기 위해 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석(WGCNA)을 수행하여 건강한 대조군과 비교하여 칸디다증과 관련된 상관 유전자 클러스터를 식별하였다. 칸디다증에서 유의하게 상향 조절되는 클러스터에는 선천성 면역 반응과 호중구 활성화, 이동 및 탈과립화를 포함한 면역 활성화 및 염증 경로가 포함되었다.
iv. 칸디다증에 대한 전사 반응은 다른 감염성 유발 요인에 비해 독특하다.
건강한 대조군과 더불어 칸디다증과 급성 세균 및 바이러스 감염, 비감염성 SIRS에 대한 전사체 반응 간의 단변량 비교(univariate comparisons)도 수행하였다. 감염 표현형 전반에서 관찰된 숙주 반응의 일부 보존된 구성 요소도 있었지만, 칸디다증에서 다른 모든 감염과 비교하여 고유하게 차별적으로 발현되는 유전자도 342개(12 %) 있었다. 다른 임상 표현형과 비교하여 칸디다에 대한 유전자의 차별적 발현을 조사했을 때 칸디다증과 박테리아 감염(고유 유전자 2,407개)이 가장 큰 차이를 보였으며, 바이러스 감염과 SIRS(각각 740개와 149개)가 그 뒤를 이었다(도 2A 및 2B). 이는 칸디다증에 대한 전사체 반응이 다른 종류의 감염과 비교하여 독특한 특징을 가지고 있음을 강조한다. 흥미롭게도 칸디다증에 대한 전사체 반응을 다른 병원체 계열과 비교했을 때 칸디다증에서 상향 조절되는 상위 유전자는 호중구 활성화와 헴 생합성에 가중치를 둔 경로로 다시 모여 진균 감염 시 이러한 반응의 강도를 더욱 강조하였다.
v. 다항 유전자 발현 분류기는 칸디다증을 바이러스 또는 박테리아 감염과 구별한다.
다음으로 정규화된 다항 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 감염된 각 대상체 그룹의 샘플에서 가장 일관되게 공동 조절되는 유전자 세트("시그니처")를 결정하였다. 칸디다 감염의 경우, 마우스 모델을 대상으로 한 이전 연구에서 유전자 발현 시그니처가 초기 및 후기 침습성 칸디다증(late invasive candidiasis)을 구분하고 시간이 지남에 따라 신호 강도가 감소한다는 것이 입증되었다. 따라서, 진단 분류기 개발을 위해 초기 혈액 배양 양성(중앙값 5일, 범위 2 내지 23일) 후 각 칸디다 대상체에 대해 얻은 첫 번째 RNA 샘플만 활용하였다. 다른 모든 급성 감염 표현형은 각 감염이 처음 발현된 시점에 채취한 피험자당 하나의 RNA 샘플만 사용하였다.
모델 성능은 모든 감염 등급에 대한 auROC와 혼동 행렬(confusion matrices )을 사용하여 평가하였다. 모든 성능 측정값은 교차 검증을 거쳤다. 칸디다증, 박테리아, 바이러스, SIRS 및 건강한 표현형을 정확하게 구분할 수 있는 94개 유전자 분류기가 확인되었다. (도 3) AuROC는 칸디다증의 경우 0.98(95 %CI 0.96-1), 박테리아 및 바이러스 감염 모두에서 0.99(95 %CI 0.98-1), SIRS의 경우 0.99(95 %CI 0.97-1), 건강한 대상체 (도 4, 보충 표 7)의 경우 0.99(95 %CI 0.96-1)이었다. 그런 다음 발견 코호트에서 도출된 시그니처를 사용하여 검증 데이터 세트에서 감염 클래스를 예측하였다. 클래스별 auROC와 혼동 행렬이 계산되었다. 검증 코호트의 성능은 똑같이 우수하였다. auROC는 칸디다증의 경우 0.97(95 %CI 0.90-1), 박테리아 감염(95 %CI 1-1), 바이러스 감염(95 %CI 1-1), 건강한 대상체(95 %CI 0.99-1)의 경우 1이었다.
vi. 칸디다증의 혈액 기반 유전자 발현 시그니처는 질병이 최고조에 달할 때 최대로 발현되고 시간이 지남에 따라 강도가 감소한다.
칸디다 특이 진단 시그니처가 확인되면 초기 질환과 후기 질환을 구분하고 치료에 대한 반응을 정의하는 것이 환자의 임상 관리, 치료 옵션 및 예후에 영향을 미칠 수 있으므로 시간에 따른 신호 강도를 조사하고자 하였다. 총 28명의 칸디다증 대상체가 배양 양성 판정 후 한 번 이상의 날짜에 샘플을 채취했으며, 대상체당 2 내지 14개의 샘플을 채취하였다. 샘플은 최초 배양 후 2일에서 80일 사이에 채취되었다. 이들 대상체의 시그니처에서 유전자 발현의 정량적 수준을 비교했을 때, 분리 칸디다증이 있는 대상체에서 신호 강도의 전반적인 추세가 처음에서 마지막 시점으로 갈수록 감소하는 것을 발견하였다. 그러나 대상체 간에는 정량적 신호 강도와 해상도까지 걸리는 시간에서 현저한 변동성이 있었다. 정량적 유전자 발현과 혈액 배양 양성일수 사이에는 예상되는 역상관 관계가 있었다 (= -0.441, p=.0009). 적절한 샘플을 사용할 수 있었던 몇몇 피험자에서 시그니처를 통해 예측된 칸디다증 확률은 치료가 진행되면서 시간이 지남에 따라 감소했으며, 결국 해당 피험자는 칸디다증이 해결된 후 건강한 것으로 모델에 의해 예측되었다.
이 데이터 세트의 고유성과 후보성 대상체에 대한 공개 유전자 발현 데이터의 부족을 고려하여, 검증을 위해 급성 세균 및 바이러스 질환을 앓고 있는 인간 대상체의 두 가지 독립적인 유전자 발현 데이터 세트에 분류기를 적용하였다(Ramilo 등, 및 Tsalik 등)(도 4). Ramilo 등 데이터 세트에 적용했을 때, 이 새로운 분류기는 auROC 0.97(0.95%CI 0.94-1)로 우수한 성능을 보였다. Tsalik 등 데이터 세트에 적용했을 때 auROC는 박테리아 감염의 경우 0.87(95 %CI 0.80-0.93), 바이러스 감염의 경우 0.88(95 %CI 0.82-0.92), 비감염성 질환의 경우 0.89(95 %CI 0.84-0.94)였다.
다음으로, 건강한 사람의 말초 혈액(말초혈액), 단핵구(PBMC)를 분리한 다음 여러 종류의 병원균에 노출시키는 체외 자극 분석의 유전자 발현 데이터와 칸디다증 결과를 비교하였다. 이 모델에서는 실험 바이러스(인플루엔자), 박테리아(스트렙토코커스 뉴모니아 또는 대장균), 진균(칸디다 알비칸스 또는 크립토코커스 네오포만스 또는 가티) 감염 동안 전사체 반응을 분석하기 위해 노출 후 24시간에 세포를 채취하였다. 그런 다음 인간 칸디다증 분류기를 이 데이터에 적용하여 관련 병원체 노출을 정확하게 식별한 결과, 진균 감염 0.94(95 %CI 0.88-0.99), 박테리아 0.96(95 %CI 0.89-1), 바이러스 감염 0.90(95 %CI 0.69-1), 건강한 대조군 세포 0.94(95 %CI 0.86-0.99)의 auROC를 나타내었다(도 4).
vii. BDG와 비교
다음으로 혈청 BDG 수치와 새로운 전사체 바이오마커 시그니처의 진단 정확도를 비교하고자 했다. 칸디다증에 대한 첫 혈액 배양 양성 반응 시점의 BDG 평균 수치는 246 pg/mL ± 192 (범위 <31 에서(to) >500)로, 마지막 BDG 평균인 235 pg/mL ± 189 (범위 <31 에서(to) >500, p=0.85)보다 크게 높지 않았다. 연속 BDG 측정에 따르면 대상자의 43 % (13/30)만 치료에 반응하여 BDG 값이 감소했으며 감소 비율은 매우 다양하였다. 전체 BDG auROC는 0.90(95 %CI 0.80-.97)이었다. 발견 코호트와 검증 코호트로 분류했을 때, 유전자 발현 분류기의 칸디다증 구성 요소는 BDG보다 높은 성능 특성을 보였지만 이 결과는 통계적으로 유의미하지는 않았다. 유전자 발현에 대한 발견 auROC는 1(95 %CI 1-1)로 BDG의 0.98(95 %CI 0.94-1) 대비 0.39(p=0.39)였고, 유효성 검증 auROC는 유전자 발현의 0.94(95 %CI 0.81-1)로 BDG의 0.83(95 %CI 0.63-0.97) 대비 0.35(p=0.35)로 나타났다. BDG 수치는 혈액 배양 양성일과 중간 정도의 반비례 상관관계(= -0.29, p=0.05)를 보였으며, 정량적 유전자 발현과는 약한 상관관계(= 0.258, p=0.084가 있는 것으로 나타났다.
C. 고찰
현재 여러 병원체 기반 칸디다증 진단 기법을 사용할 수 있지만, 결과 도출 시간이 지연되거나 민감도 및 특이도가 최적화되지 않는 경우가 많다. 숙주 유래 바이오마커 접근 방식은 여러 병원체 클래스를 한 번에 신속하게(심지어 현장 진료 시에도) 탐지하고, 병리학적 숙주 반응을 식별하여 특이성을 개선하는 등 중요한 진단 틈새를 메울 수 있는 잠재력을 제공한다. 이 연구에서 우리는 순환 백혈구의 전사체 렌즈를 통해 칸디다증에 대한 숙주 반응을 처음으로 정의하였다. 이를 통해 급성 진균 감염을 위험에 처한 숙주에서 유사한 급성 질환을 일으킬 수 있는 바이러스, 박테리아 및 SIRS 표현형과 구별할 수 있는 숙주 시그니처를 개발할 수 있게 되었다.
칸디다 감염에 대한 숙주 반응은 다른 병원체군과 비교하여 공통된 특징과 고유한 특징을 모두 가지고 있으며, 이는 말초 혈액의 전사 수준에서 나타난다. 건강한 대조군과 비교하여 칸디다증이 있는 경우 1,600개 이상의 차별적으로 발현되는 유전자(DEG)가 발견되었다. 이러한 DEG의 대부분은 진균 감염 또는 중증 질환에 대한 면역 반응의 알려진 구성 요소를 반영하는 동시에 사이토카인 신호, 염증 반응 및 산화 스트레스에 대한 세포 반응을 반영한다. 호중구 활성화 및 이동과 같은 일부는 항진균 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 이러한 반응의 강도는 급성 박테리아 감염이 있는 비슷한 병에 걸린 대상체와 비교했을 때에도 놀라웠으며 칸디다균을 제거하는데 이러한 경로가 매우 중요하다는 것을 강조하였다. 다른 강화된 경로는 헴 합성 조절의 변화와 같은 칸디다 감염에 대한 잠재적으로 새로운 숙주 반응 메커니즘을 확인한다. 철분은 시험관 내에서 칸디다와 같은 진균 병원균에 중요한 것으로 알려져 있지만, 이번 연구 결과는 인간 숙주가 진균 감염에 대한 반응의 일부로 이 시스템을 조작할 수 있음을 시사한다.
다항 로지스틱 회귀 분석(multinomial logistic regression analyses)을 통해 여러 가지 질병 원인에 대한 숙주 반응을 높은 정확도로 한 번에 모델링할 수 있는 통합 시그니처를 확인하였다(칸디다증의 경우 auROC 0.98). 이 분류기의 칸디다증 구성 요소는 표준 치료 진단 BDG 테스트보다 더 나은 성능을 보였다. 중요한 점은 초기 검사 당시 코호트의 70 % 이상이 경험적 항진균 치료를 받고 있었음에도 불구하고 칸디다증 시그니처가 강력한 성능을 보였으며, 이는 혈액 배양과 같은 많은 기존 병원체 검출 전략을 손상시키는 일반적인 임상 접근 방식이다. 또한, 이 분류기는 호중구 감소증 및 여러 유형의 면역 억제뿐만 아니라 7가지 다른 칸디다 종을 포함한 광범위한 일반적인 임상 배경에 걸쳐 우수한 성능을 발휘한다. 여기에 제시된 다항식 접근법의 또 다른 장점은 단일 검사로 여러 상태(예를 들어, 진균, 박테리아, 바이러스, SIRS, 건강)를 동시에 진단할 수 있다는 점이다.
이 연구의 한 가지 한계는 인실리코(in silico) 및 시험관 내 검증 데이터가 일반화 가능성을 뒷받침하지만, 단일 센터 연구이므로 추가 코호트/데이터셋이 확보되면 다른 후보 집단에 대한 검증이 필요하다는 점이다. 코호트는 다양하지만 상대적으로 작은 칸디다증 샘플 크기로 인해 하위 그룹 분석에 한계가 있으며, 호중구 감소증 및 기타 유형의 면역 저하 환자(immunocompromised patient) 그룹을 대상으로 한 추가 연구가 필요하다. 또한, 연구 설계상 피험자들은 혈액 배양 결과가 양성으로 바뀐 후에야 등록되었기 때문에 치료가 가장 효과적일 수 있는 칸디다 감염 초기의 검사 성능을 파악하는 데 한계가 있다. 이 연구는 칸디다증 진단을 위한 전사체 시그니처의 성능을 정의하지만, 침습성 곰팡이 감염과 같은 다른 곰팡이 질환에서 이러한 시그니처가 어떻게 작동하는지 또는 그 영향을 받는지는 알려지지 않았다. 마지막으로, 이 연구는 칸디다증이 없는 침습성 칸디다증(식도, 복부 등)의 경우 시그니처의 성능을 직접 평가하지 않았으므로 이러한 감염에서의 신호 강도 및 효능은 공식적으로 조사해야 한다.
D. 결론
입원한 성인의 칸디다증에 대한 숙주 반응은 고도로 보존되어 있으며 급성 바이러스 및 박테리아 감염에 대한 전사체 반응과는 구별된다. 여기에 설명한 크기의 PCR 기반 시그니처를 운영할 수 있는 클리닉용 플랫폼이 이미 존재하며, 이러한 결과를 임상적으로 적용할 수 있는 근접 경로를 제공한다. 이러한 병원체 클래스별 반응을 활용하면 인간 숙주에서 진균 감염의 면역 병인을 더 잘 이해할 수 있으며, 급성 질환 환자의 여러 유형의 임상 질환을 동시에 감별할 수 있는 숙주 유전자 발현 기반 분석법 개발에 대한 가능성을 보여준다.
실시예 2. 크립토코커스 감염에 대한 진균 분류기의 성능
위의 실시예 1에서 언급했듯이, 건강한 사람으로부터 말초 혈액, 단핵 세포(PBMC)를 분리한 다음 여러 종류의 병원균에 노출시킨 체외 자극 분석의 유전자 발현 데이터와 칸디다증 결과를 비교하였다. 이 모델에서는 실험 바이러스(인플루엔자), 박테리아(스트렙토코커스 뉴모니아 또는 대장균), 진균(칸디다 알비칸스 또는 크립토코커스 네오포만스 또는 가티) 감염 동안 전사체 반응을 분석하기 위해 노출 후 24시간에 세포를 채취하였다. 그런 다음 이 데이터에 인간 칸디다증 분류기를 적용한 결과, 진균 감염의 경우 0.94(95 %CI 0.88-0.99), 박테리아 0.96(95 %CI 0.89-1), 바이러스 감염 0.90(95 %CI 0.69-1), 건강한 대조군 세포 0.94(95 %CI 0.86-0.99)로 관련 병원체 노출 여부를 정확하게 식별하였다 (도 4).
캔디다와 크립토코커스 간의 시그니처 성능 차이를 더욱 명확히 하기 위해 작용제 수준에서 예측 확률과 혼동 행렬을 조사하였다. 그 결과 칸디다와 크립토코커스 간에 통계적으로 유의미한 차이가 없는 것으로 나타났다(ANOVA F 테스트 p값 = 0.2866).
따라서 칸디다 감염 샘플로 훈련된 진균 분류기는 크립토코커스 감염과 같은 다른 진균 감염도 식별할 수 있어 진균 감염을 보다 일반적으로 식별하는데 사용할 수 있다.
실시예 3. 분류기의 추가적인 일 예
위의 실시예 1에서 설명한 전체 모델을 생성하는데 사용된 것과 동일한 올가미 로지스틱 회귀와 중첩 교차 검증 절차를 사용하여 축소된 크기의 유전자 발현 시그니처를 생성했으며, 한 가지 수정 사항은 모델의 최대 특징 또는 유전자 수가 40개가 되도록 올가미 모델을 지정한 것다. 결과 분류기는 표 12에 나타내었다.
위에서 언급했듯이, 축소된 크기의 유전자 시그니처는 실시예 1에서 보고된 것과 동일한 프로세스를 사용하여 새로 생성되었지만 관련된 유전자 수에 제한이 있다. 이로 인해 시그니처 간 유전자에 약간의 차이가 발생할 수 있다. 따라서 일부 유전자가 두 시그니처 모두에 나타나지만 원래 시그니처의 하위 집합이 아니다.
당업자는 본 개시가 목적들을 수행하고 언급된 목적 및 이점들, 그리고 그 안에 내재된 이점들을 얻기 위해 잘 적응되어 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 여기에 설명된 본 개시는 바람직한 일 양태를 대표하며, 이는 예시적인 것으로서, 본 개시의 범위를 한정하는 것이 아니다. 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 개시의 정신에 포함되는 당업자에게는 본 개시의 변경 및 기타 용도가 발생할 것이다.
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전술한 내용은 본 발명을 예시적으로 설명한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 다음의 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위에 포함되는 청구범위와 균등한 청구범위가 이에 포함될 것이다.
Claims (37)
- 다음을 포함하는 대상체(subject) 분류 방법:
(a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계;
(b) 플랫폼(platform)에서 생물학적 샘플의 진균 감염(fungal infection), 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염, 건강 및/또는 비감염성 질환 중 하나 이상을 나타내는 시그니처(signature indicative)를 측정(measuring)하되,
상기 시그니처는 미리 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 수준을 포함하는 단계;
(c) 유전자 발현 수준을 진균 분류기(classifiers), 및 선택적으로 박테리아 감염 분류기, 바이러스 분류기 및 대조군 분류기(건강 및/또는 비감염성 질환) 중에서 선택된 하나 이상의 추가 분류기에 입력하되,
상기 분류기는 플랫폼에 대해 미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 포함하는 단계; 및
(d) 상기 유전자 발현 수준 및 분류기에 따라 대상체를 진균 감염 및/또는 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 대조군으로 분류하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 유전자 발현 수준을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계를 포함하고,
상기 입력은 상기 정규화된 유전자 발현 값을 분류기에 입력하는 단계를 포함하며; 및
상기 분류는 상기 정규화된 유전자 발현 값 및 상기 분류기에 기초하여 진균 감염 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 대조군에 대한 확률을 계산하는 것을 포함하는 대상체 분류 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 방법은, 대상체에게 진균 감염 및 선택적으로 박테리아 감염, 바이러스 감염, 건강 및/또는 비감염성 질환의 확률을 나타내는 점수를 할당하는 보고서를 생성(generating)하는 것을 추가로 포함하는 대상체 분류 방법.
- 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 추가로 포함하는 대상체 분류 방법:
(e) 분류에 따라 대상체에게 적절한 치료법을 부여하는 단계.
- 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미리 정의된 유전자 세트는 1, 5, 10, 15 또는 20 내지 30, 40, 50, 60 또는 70개의 유전자로 구성된 세트인 대상체 분류 방법.
- 제1 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미리 정의된 유전자 세트는 표 1 내지 5에 열거된 1, 5, 10, 15 또는 20에서 30, 40, 50, 60 또는 70개의 유전자 로 구성된 세트인 대상체 분류 방법.
- 제1 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미리 정의된 유전자 세트는 표 6 내지 10에 열거된 1, 5 또는 10부터 15, 20, 25, 30 또는 33개의 유전자 (예를 들어, 표 6 내지 10에 굵은 글씨로 열거된 유전자 중에서 선택됨)로 구성된 세트인 대상체 분류 방법.
- 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 감염증상 (예를 들어, 발열)이 있는 것인 대상체 분류 방법.
- 제1 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 패혈증(sepsis) 증상이 있는 것인 대상체 분류방법.
- 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 말초 혈액(peripheral blood), 가래(sputum), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 소변(urine), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 세척액(nasopharyngeal wash), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 기관 내 흡인물(endotracheal aspirate) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 대상체 분류방법.
- 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플을 포함하는 대상체 분류방법.
- 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage)을 포함하는 대상체 분류방법.
- 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정(measuring)은 다음 중 하나 이상의 단계를 포함하거나 선행(preceding)하는 대상체 분류방법:
샘플에서 세포를 정제하는 단계,
샘플의 세포를 분해하는 단계, 및
샘플에서 RNA를 분리하는 단계.
- 제1 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정은 PCR 증폭(PCR amplification), 등온 증폭(isothermal amplification), 시퀀싱(sequencing) 및/또는 핵산 프로브 혼성화(nucleic acid probe hybridization)를 포함하는 대상체 분류방법.
- 제1 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼은 어레이 플랫폼 (array platform), 열 사이클러 플랫폼(thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼), 핵산 질량 분석 플랫폼(nucleic acid mass spectrometry platform), 핵산 시퀀싱 플랫폼(nucleic acid sequencing platform), 등온 증폭 플랫폼(isothermal amplification platform) 또는 이의 조합인 대상체 분류방법.
- 제1 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진균 감염은 효모로서 칸디다(Candida), 트리코스포론(Trichosporon), 또는 크립토코커스(Cryprococcus)을 포함하는 대상체 분류방법.
- 제1 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진균 분류기는 다음과 같은 단계를 통해 생산되는 것인 대상체 분류방법:
(i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 입원하지 않은 복수의 건강한 대조군 및/또는 비감염성 질환을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 각 샘플에서 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) 정규화된 유전자 발현 값을 생성하기 위해 (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하는 단계; 그리고 (f) 진균 분류기를 생성하는 단계.
- 제1 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진균 분류기는 다음을 포함하는 단계에 의해 생산되는 것인 대상체 분류방법:
(i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 박테리아 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 샘플 각각에 있는 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) 정규화된 유전자 발현 값을 생성하기 위해 (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하는 단계; 그리고 (f) 진균 분류기를 생성하는 단계.
- 제1 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진균 분류기는 다음을 포함하는 단계에 의해 생산되는 것인 대상체 분류방법:
(i) 진균 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (ii) 바이러스 감염을 앓고 있는 것으로 알려진 복수의 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계; (iii) 플랫폼 상에서 (i) 및 (ii) 단계의 샘플 각각에 있는 복수의 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; (iv) (iii) 단계에서 얻은 유전자 발현 수준을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계; 및 (f) 진균 분류기를 생성하는 단계.
- 제17 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성은 다음의 반복적으로 이루어지는 단계를 포함하는 대상체 분류방법:
(i) 정규화된 각 유전자 발현 값에 가중치를 할당하고, 각 유전자에 대한 가중치 및 발현 값을 분류기(예를 들어, 선형 회귀 분류기(linear regression classifier)) 방정식에 입력하고 복수의 대상체 각각에 대한 결과에 대한 점수를 결정하는 단계, 그리고 (ii) 복수의 대상체에 걸쳐 각 결과에 대한 분류 정확도를 결정하는 단계, 그리고 (iii) 분류 정확도가 최적화될 때까지 가중치를 조정하여 플랫폼에 상기 진균 분류기, 박테리아 분류기, 바이러스 분류기 및/또는 대조군 분류기를 제공하고, 가중치가 0이 아닌 유전자가 각 분류기에 포함되며, 선택적으로 하나 이상의 데이터베이스에 각 분류기의 구성 요소(유전자, 가중치 및/또는 원인 역치)를 업로드하는 단계.
- 대상체의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
플랫폼 상에서 미리 정의된 유전자 세트의 차등 발현을 측정하는 단계를 포함하되,
상기 미리 정의된 유전자 세트는, 표 1 내지 5에 열거된 유전자들 중 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 50, 60, 70, 80, 90 또는 94개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 1에 열거된 유전자들 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25 또는 29개 모두; 및 선택적으로, 표 2에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 모두; 표 3에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 표 4에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 및/또는 표 5에 열거된 유전자 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 모두를 포함하고,
또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 표 6 내지 10에 열거된 유전자 중 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 33개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 6에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 모두; 및 선택적으로, 표 7에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두; 표 8에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두; 표 9에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두; 및/또는 표 10에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함하고,
또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 ITGA2B, MKI67, 및 AZU1; 및 선택적으로 HDAC4, DCAF15, SDHC, SAP30L, DNASE1, 및 DCAF15; PIGT, HERC6, 및 LY6E; SLC35E1, WIPI2, RELL1, MAP1LC3B, CASZ1 및 GABBR1; 및/또는 RPS24 및 CTSB를 포함하고,
상기 미리 정의된 유전자 세트의 차등 발현은 대상체의 진균 감염 유무를 나타내는 것인, 대상체의 진균 감염 감지 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 측정은 다음의 하나 이상의 단계를 포함하거나 선행하는 진균 감염 감지방법:
상기 샘플에서 세포를 정제하는 단계,
상기 샘플의 세포를 분해하는 단계, 및
상기 샘플에서 RNA를 분리하는 단계.
- 제21항 및 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정은 반정량적 PCR(semi-quantitative PCR), 등온 증폭(isothermal amplification), 및/또는 핵산 프로브 혼성화(nucleic acid probe hybridization)를 포함하는 진균 감염 감지방법.
- 제21항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼은 어레이 플랫폼 (array platform), 열 사이클러 플랫폼(thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼), 등온 증폭 플랫폼(isothermal amplification platform), 혼성화(hybridization) 및 다중 신호 코딩(예를 들어, 형광) 검출기 플랫폼, 핵산 질량 분석 플랫폼, 핵산 시퀀싱 플랫폼 또는 이들의 조합을 포함하는 진균 감염 감지방법.
- 제21항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 감염 증상(예를 들어, 발열)을 앓고 있는 경우인 진균 감염 감지방법.
- 제21 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 패혈증(sepsis) 증상을 겪고 있는 것인 진균 감염 감지방법.
- 제21 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 진균 감염의 존재가 감지될 때 상기 대상체를 감염에 대해 치료하는 것을 추가로 포함하는 진균 감염 감지방법.
- 제21 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 진균 감염 치료 방법은 대상체가 진균 감염이 있는 것으로 판단될 때 해당 대상체에게 적절한 치료 요법을 투여하는 것을 포함하는 진균 감염 감지방법.
- 제28항에 있어서, 상기 적절한 치료 요법은 항진균 항생제(antifungal antibiotic) 투여인 것인 진균 감염 감지방법.
- 제28항에 있어서, 상기 적절한 치료 요법은 에키노칸딘(echinocandins)(예를 들어, 카스포풍진(caspofungin), 미카풍진(micafungin), 아니둘라풍진 (anidulafungin)), 아졸계 항진균제(azole antifungals)(예를 들어, 플루코나졸(fluconazole), 보리코나졸(voriconazole), 이사부코나졸(isavuconazole), 포사코나졸(Posaconazole)), 폴리엔계(polyenes)(예를 들어, 암포테리신 B(amphotericin B)), 피리미딘 유사체 (pyrimidine analogues)(예를 들어, 5-플루오로사이토신(5-fluorocytosine)(5-FC 또는 플루시토신(flucytosine))), APX001(포스마노게픽스), APX879, 벤조티오우레아(benzothioureas), 클로파지민(clofazimine), 히드라진(hydrazycines)(예를 들어, BHBM 및 B0), 이보마이신(ibomycin), 모노클로날 항체 18B7(monoclonal antibody 18B7), 리소실레이트 아미노프라졸(resorcylate aminopyrazoles)(예를 들어, 화합물 112(Compound 112)), 세르트랄린(sertraline), 타목시펜(tamoxifen), VT-1598 및 이들의 조합을 포함한 그 밖의 약품인 진균 감염 감지방법.
- 제28항 내지 30항에 있어서, 상기 방법은 청구항 21 내지 26항 중 어느 한 항에 해당하는 방법에 의해 적절한 치료 요법의 효능에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 진균 감염 감지방법.
- 다음을 포함하는 대상체의 진균 감염을 감지하는 시스템:
하나 이상의 프로세서(processor);
대상체로부터 생물학적 샘플을 받도록 구성된 샘플 입력 회로;
하나 이상의 프로세서에 결합되고, 진균 감염을 나타내는 미리 결정된 유전자 세트의 생물학적 샘플의 유전자 발현 수준을 결정하도록 구성된 샘플 분석 회로;
하나 이상의 프로세서에 결합된 입력/출력 회로(input/output circuit);
하나 이상의 프로세서에 결합되고 데이터, 파라미터 및/또는 유전자 세트(들)를 저장하도록 구성된 저장 회로; 및
프로세서에 결합되고, 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때 하나 이상의 프로세서가 다음을 포함하는 연산을 수행하도록 하는 메모리에 구현된 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드를 포함하는 메모리:
상기 생물학적 샘플에서 미리 정의된 유전자 세트의 유전자 발현 레벨의 샘플 분석 회로를 통한 측정을 제어/수행하는 단계;
유전자 발현 레벨을 정규화하여 정규화된 유전자 발현 값을 생성하는 단계;
미리 정의된 유전자 세트의 각 유전자에 대해 미리 정의된 가중치(즉, 계수)를 저장 회로로부터 검색하는 단계;
정규화된 유전자 발현 값의 가중치 값에 기초하여 진균 감염의 가능성을 계산하는 단계; 및
진균 감염의 존재 또는 부재에 대한 결정의 입력/출력 회로를 통해 출력을 제어하는 단계.
- 제32항에 있어서, 상기 미리 정의된 유전자 세트는, 표 1 내지 5에 열거된 유전자들 중 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 50, 60, 70, 80, 90 또는 94개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 1에 열거된 유전자들 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25 또는 29개 모두; 및 선택적으로, 표 2에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 모두; 표 3에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 표 4에 열거된 유전자 중 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 19개 모두; 및/또는 표 5에 열거된 유전자 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 모두를 포함하고,
또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 표 6 내지 10에 열거된 유전자 중 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 33개 모두를 포함하고; 예를 들어, 표 6에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 모두; 및 선택적으로, 표 7에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 모두; 표 8에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두; 표 9에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두; 및/또는 표 10에 열거된 유전자 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함하고,
또는 상기 미리 정의된 유전자 세트는 ITGA2B, MKI67, 및 AZU1; 및 선택적으로 HDAC4, DCAF15, SDHC, SAP30L, DNASE1, 및 DCAF15; PIGT, HERC6, 및 LY6E; SLC35E1, WIPI2, RELL1, MAP1LC3B, CASZ1 및 GABBR1; 및/또는 RPS24 및 CTSB를 포함하는 시스템.
- 제32항 및 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 유전자 발현의 정량적 또는 반정량적 검출을 진균 감염의 누적 점수 또는 확률로 변환하는 컴퓨터 판독 가능 코드를 포함하는 시스템.
- 제32항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 어레이 플랫폼 (array platform), 열 사이클러 플랫폼 (thermal cycler platform)(예를 들어, 다중 및/또는 실시간 PCR 플랫폼), 등온 증폭 플랫폼 (isothermal amplification platform), 혼성화 (hybridization) 및 다중 신호 코딩(예를 들어, 형광) 검출기 플랫폼, 핵산 질량 분석 플랫폼, 핵산 시퀀싱 플랫폼 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템.
- 이 모든 내용은 여기에 설명 및 예시되어 있다.
- 당업자에게 명백하거나 이해될 수 있는 특징을 포함하되 이에 국한되지 않는, 여기에 제공된 정보에 명시적으로 또는 암시적으로 표시 및/또는 설명된 모든 방법, 프로세스, 장치, 시스템, 장치, 키트, 제품, 재료, 구성 및/또는 용도는 당업자에게는 명백하거나 이해될 수 있다.
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