KR20230127524A - 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법 - Google Patents

고순도 고분자 콜라겐의 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 어피로부터 추출한 콜라겐을 한외여과막을 이용하여 정제함으로써 의료용으로 활용이 가능한 고순도 및 고분자의 콜라겐을 추출하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

고순도 고분자 콜라겐의 추출방법{method for extracting collagen of high purity and high molecule}
본 발명은 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 어피로부터 추출한 콜라겐을 한외여과막을 이용하여 정제함으로써 의료용으로 활용이 가능한 고순도 및 고분자의 콜라겐을 추출하기 위한 방법에 관한 것이다.
콜라겐(collagen)은 동물 체내에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로서 체단백질의 약 30% 이상을 차지하며, 최소 19종류(TypeⅠ-ⅩⅨ) 이상인 것으로 밝혀져 있다(Nakamura, YN et al, Relationship among collagen amount, distribution and architecture in the M Longissimus thoracis and M pectoralis profundus from pigs Meat Science, 64, pp 43-50, 2003) 또한, 콜라겐은 동물의 결합조직의 주요 단백질이며, 조직이나 장기를 지탱하게 하고 체표를 둘러싸고 있어 체형을 유지시키는 역할을 한다. 특히 생체에서 피부, 연골, 뼈 등의 결합조직의 주요한 구성성분으로 40%는 피부, 20%는 뼈와 연골, 그 외 혈관과 내장 등 전신에 넓게 분포되어 있다.
콜라겐은 이중 나선구조를 하고 있는 근원섬유 단백질과는 달리 삼중 나선구조로, 그 직경이 약 14~15nm, 길이는 280~300nm이다. 콜라겐은 (Gly-X-Y)n과 같은 규칙적인 형태의 아미노산 배열을 가지며 섬유상 단백질의 기본단위 분자인 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 내 또는 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 간의 공유결합성 교차결합(crosslinking)에 의해 물리적, 생물학적으로 안정한 구조를 형성하고 있다(McClain, PE et al, Amino acid composition and cross-linking characteristics of collagen intramuscular connective tissue of striated muscle(Bostaurus) International Journal of Biochemistry, 2(7), pp 121-124, 1971)
콜라겐은 식품, 의약, 의약품, 화장품 등에 널리 사용되며 최근에는 새로운 산업 분야에 다양하게 응용함으로써 그 사용량이 증가하고 있다. 콜라겐은 알부민 및 젤라틴과 같은 다른 생물 유래 고분자에 비해 뛰어난 생분해성, 약한 항원성 및 우수한 생체 적합성을 나타낸다. 특히 콜라겐 섬유는 신축성이 좋으며 높은 기계적 강도를 제공하여 신체의 다양한 기관 사이에 유연성을 제공한다. 이러한 콜라겐 섬유는 최근에 의료용 소재로 개발되고 있다.
지금까지의 콜라겐은 주로 소, 돼지 등 축산물로부터 추출하였으나, 해면상 뇌증(BSE), 전염성 해면상 뇌병증(TSE), 구제역(FMD) 발병으로 인해 육상 동물 콜라겐 및 육상 동물 유래 콜라겐 유래 제품의 사용에 대한 우려가 커지고 있다. 또한, 소가죽에서 추출한 콜라겐은 시크교도와 힌두교도에게 금지되어 있으며 돼지 콜라겐은 이슬람교도와 유대교도가 섭취할 수 없다. 따라서, 민물과 해양 어류 및 연체동물을 포함한 수생 동물이 대체 콜라겐 공급원으로 주목을 받고 있다. 특히 생선의 가공 후 발생하는 생선 껍질인 어피를 이용한 콜라겐 제조가 포유류 콜라겐의 대응물로 사용되고 있다.
어류에서 추출한 콜라겐은 육상동물로부터 추출한 콜라겐에 비해 안전하여 의료용 소재로 적합하다. 피부 친화적인 콜라겐 소재를 피부보호 및 피부관리에 응용하려는 연구가 지속되고 있으며 더불어 상처를 보호하고 오염을 방지하며 지혈 속도가 탁월하여 의료업계에서는 고부가가치의 지혈창상피복제, 봉합사 등으로 활용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 하지만, 콜라겐은 고순도로 정제되지 않으면 섬유화가 되지 않으며 섬유화가 될지라도 강도 및 섬도와 같은 물리적 성격이 매우 낮아 의료용으로 제품화하는 데 어려움이 있다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0065935호에는 마린 콜라겐의 대량생산을 위한 고순도 정제방법이 개시되어 있다.
상기 추출방법은 추출된 콜라겐을 고순도로 정제하기 위해서 크로마토그래피를 사용하고 있으나, 크로마토그래피는 고가의 장비이면서 취급과 사용이 매우 복잡하고 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 최종적으로 정제된 콜라겐은 10만Da 이하의 저분자량의 콜라겐이다. 이러한 저분자량의 콜라겐은 식품이나 화장품 분야에 사용하는 데 문제는 없지만 의료용 소재, 특히 의료용 섬유로 사용하기에 적합하지 않다. 저분자량의 콜라겐은 점성과 강도가 낮아 의료용 섬유로 제조가 어렵고, 제조된 의료용 섬유의 물리적 특성이 낮다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0065935호: 마린 콜라겐의 대량생산을 위한 고순도 정제방법
본 발명은 상기의 문제점을 개선하기 위해 창출된 것으로서, 어피로부터 콜라겐을 추출하여 조작이 간단한 한외여과 방식으로 정제함으로써 안전하면서도 의료용 소재로도 활용할 수 있는 순도 99% 이상의 고순도 및 분자량 200kDa 이상의 고분자의 콜라겐의 추출방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법은 어피를 물로 세척하고 잘게 절단하는 손질단계와; 상기 손질단계에서 손질된 어피에 용매를 가하여 불순물을 제거하는 전처리단계와; 상기 전처리단계에서 수득한 전처리된 어피를 초산용액에 침지하여 콜라겐 추출액을 수득하는 추출단계와; 상기 콜라겐 추출액에 염화나트륨을 가하여 콜라겐을 침전시킨 후 콜라겐 침전물을 분리하는 분리단계와; 상기 콜라겐 침전물 중의 염화나트륨을 제거하기 위해 탈염처리하는 탈염단계와; 상기 탈염단계에서 탈염처리된 콜라겐 침전물에 잔존하는 불순물 및 저분자 콜라겐을 제거하기 위해 상기 콜라겐 침전물을 한외여과하여 정제하는 정제단계;를 포함한다.
상기 전처리단계는 a)상기 손질된 어피를 수산화나트륨 용액에 침지하여 비콜라겐성 단백질을 제거하는 단계와, b)상기 비콜라겐성 단백질이 제거된 어피를 에탄올에 침지하여 지방 및 지용성 색소를 제거하는 단계를 구비한다.
상기 정제단계는 a)상기 탈염처리된 콜라겐 침전물을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 1차로 정제하는 단계와, b)상기 1차 정제를 통해 수득한 1차정제콜라겐을 에탄올에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 2차로 정제하는 단계와, c)상기 2차 정체를 통해 수득한 2차정제콜라겐을 수산화나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 3차로 정제하는 단계와, d)상기 3차 정제를 통해 수득한 3차정제콜라겐을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 4차로 정제하는 단계를 구비한다.
상기 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐 중의 색소를 추가로 제거하기 위해 상기 정제단계는 상기 4차정제콜라겐을 과산화수소 용액 또는 아황산나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 구비한다.
상기 정제단계는 상기 5차 정제를 통해 수득한 5차정제콜라겐을 아스코빅산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 6차로 정제하는 단계를 더 구비한다.
상기 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐의 표면에 흡착되어 있는 흡착지방을 제거하기 위해 상기 정제단계는 상기 4차정제콜라겐을 흡착지방제거용매에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 구비하고, 상기 흡착지방제거용매는 부탄올에 부틸히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 또는 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 첨가한다.
상기 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐 중의 미네랄을 추가로 제거하기 위해 상기 정제단계는 상기 4차정제콜라겐을 EDTA-2Na 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 구비한다.
상기 정제단계는 상기 5차 정제를 통해 수득한 5차정제콜라겐을 옥살산 용액 또는 시트릭산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 6차로 정제하는 단계를 더 구비한다.
상기 어피는 틸라피아, 참돔, 넙치 중에서 선택된 어느 하나의 껍질이다.
상기 정제단계는 상기 콜라겐 침전물을 용매와 혼합하여 한외여과기에 투입하여 정제하며, 상기 한외여과기는 상하부가 개방된 원통형의 용기와, 상기 용기의 상부에 결합되는 상부캡과, 상기 용기의 하부에 결합되는 하부캡과, 상기 상부캡 및 상기 하부캡을 상기 용기에 고정시키기 위한 고정수단과, 상기 상부캡에 설치되는 모터와, 상기 모터의 회전축과 연결되어 상기 용기의 내부에 설치되는 교반봉과, 상기 하부캡의 내측에 설치되며 다수의 타공홀들이 형성된 원판형의 지지플레이트와, 상기 지지플레이트의 상부에 설치되어 상기 교반봉의 하방에 위치하는 한외여과막을 구비한다.
상술한 바와 같이 본 발명은 어피로부터 콜라겐을 추출한 후 한외여과 방식으로 정제함으로써 비콜라겐성 단백질, 지질, 색소, 미네랄 등의 불순물을 효과적으로 제거하여 99% 이상의 고순도 콜라겐을 추출할 수 있다.
또한, 한외여과 방식의 정제과정에서 저분자량의 콜라겐을 제거함으로써 평균 분자량 200kDa 이상의 고분자의 콜라겐을 추출할 수 있다.
이와 같이 본 발명은 고순도 고분자 콜라겐을 제공함으로써 식품용, 화장품용으로 뿐만 아니라 의료용 소재로도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 추출방법에 적용되는 한외여과기의 구성을 나타낸 단면도이고,
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 추출방법으로 추출된 콜라겐의 SDS-PAGE 분석결과이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법에 대하여 설명한다.
본 발명의 일 예에 따른 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법은 어피를 물로 세척하고 잘게 절단하는 손질단계와, 손질단계에서 손질된 어피에 용매를 가하여 불순물을 제거하는 전처리단계와, 전처리단계에서 수득한 전처리된 어피를 초산용액에 침지하여 콜라겐 추출액을 수득하는 추출단계와, 콜라겐 추출액에 염화나트륨을 가하여 콜라겐을 침전시킨 후 콜라겐 침전물을 분리하는 분리단계와, 콜라겐 침전물 중의 염화나트륨을 제거하기 위해 탈염처리하는 탈염단계와, 탈염단계에서 탈염처리된 콜라겐 침전물에 잔존하는 불순물 및 저분자 콜라겐을 제거하기 위해 상기 콜라겐 침전물을 한외여과하여 정제하는 정제단계를 포함한다. 각 단계별로 구체적으로 살펴본다.
1. 손질단계
어피를 물로 세척하고 잘게 절단한다.
어피는 어류의 껍질이다. 여기서 '어류'는 척추동물문의 연골어강, 경골어강, 먹장어강, 두갑강, 조기강을 통틀어 이르는 의미이다. 그리고 '껍질'은 어류의 몸의 겉을 싸고 있는 외피를 뜻하며, 피부와 동일한 의미이다. 따라서 껍질은 어류의 상피(epithelium), 진피(corium) 조직을 포함하며, 표피가 변형된 비늘 등을 포함한다.
어피는 지질, 회분 및 색소 등이 일부 함유되어 있으나, 콜라겐을 주성분으로 한다. 어피는 모든 어류의 껍질을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 틸라피아, 참돔, 넙치 중 어느 하나의 껍질을 이용할 수 있다. 틸라피아, 참돔, 넙치는 소비가 많아 상대적으로 어피의 공급이 용이하다.
어피는 어류에서 직접 분리하거나, 생선 가공공정에서 발생된 부산물로부터 수거하여 이용할 수 있다.
준비한 어피는 표면에 묻은 각종 이물질이나 혈분 등을 제거하기 위해 깨끗한 물로 2 내지 3회 정도 세척한다. 그리고 어피에 붙어 있는 지느러미, 비늘, 잔육 등을 제거한 후 잘게 절단한다. 가령, 10×10mm 크기 이하로 잘게 절단한다.
2. 전처리단계
다음으로, 손질된 어피에 용매를 가하여 불순물을 제거하는 전처리단계를 수행한다.
어피에는 콜라겐 외에도 비콜라겐성 단백질, 지질, 회분, 색소, 미네랄 등의 불순물이 함유되어 있다. 따라서 이러한 불순물을 전처리단계에서 최대한 제거하여야 후술할 정제과정에서 정제효율을 높일 수 있다.
전처리단계는 일 예로, a)손질된 어피를 수산화나트륨 용액에 침지하여 비콜라겐성 단백질을 제거하는 단계와, b)비콜라겐성 단백질이 제거된 어피를 에탄올에 침지하여 지방 및 지용성 색소를 제거하는 단계로 이루어질 수 있다.
먼저, 손질된 어피를 수산화나트륨 용액에 침지하여 비콜라겐성 단백질을 제거한다. 이 과정을 알칼리 처리과정으로 부를 수 있다. 수산화나트륨 용액을 이용한 어피의 알칼리 처리를 통해 비콜라겐성 단백질, 지질, 색소 등을 제거할 수 있으나, 주 목적은 비콜라겐성 단백질의 제거이다.
0.1M의 수산화나트륨(NaOH) 용액에 어피를 침지시킨다. 이때 수산화나트륨 용액은 어피의 5 내지 15배의 부피비를 이용한다. 수산화나트륨 용액에 어피를 침지시킨 후 100rpm 속도로 12 내지 36시간 교반하여 알칼리 처리를 한다. 수산화나트륨 용액으로 어피를 알칼리 처리하는 시간이 길면 길수록 알칼리에 용해되는 비콜라겐성 단백질, 지질, 색소 물질의 제거율이 높아지지만, 콜라겐의 변성을 초래할 수 있다. 따라서 0.1M의 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 12 내지 36시간 교반하여 알칼리 처리하는 것이 바람직하다. 수산화나트륨 용액으로 알칼리 처리 후 어피를 4℃의 수돗물로 중성이 될 때까지 세척하고 탈수한다.
그리고 알칼리 처리에 의해 비콜라겐성 단백질이 제거된 어피를 에탄올에 침지하여 지방 및 지용성 색소를 제거한다. 이 과정을 탈리처리 과정으로 부를 수 있다.
어피의 지방을 제거하기 위해서는 일반적으로 극성 유기용매를 사용하지만, 본 발명에서는 안전성을 고려하여 농도 50%(w/w)의 에탄올(ethanol) 용액을 사용한다. 이때 에탄올 용액은 어피의 5 내지 15배의 부피비를 이용한다. 12시간마다 에탄올 용액을 전액 교체하면서 36 내지 60시간 동안 에탄올 용액에 침지하여 탈지처리하였다. 처리시간이 증가하면 지방 제거율도 높아진다. 정제 콜라겐의 주요 불순물이 지방으로 알려져 있어 본 발명에서는 지방의 제거율을 높이기 위해 36 내지 60시간 동안 탈지처리한다. 탈지처리 후 잔존하는 에탄올을 제거하기 위해 어피를 4℃의 수돗물로 3회 세척하고 탈수한다.
이와 같이 알칼리 처리와 탈지 처리를 통해 어피에 함유된 비콜라겐성 단백질과 지질을 1차로 제거한다. 또한, 회분과 색소 등도 1차로 제거된다.
3. 추출단계
다음으로, 전처리된 어피를 초산 용액에 침지하여 콜라겐 추출액을 수득한다.
전처리된 어피를 0.5M의 초산 용액에 침지하여 교반하면서 24 내지 72시간 동안 추출한다. 이때 초산 용액은 어피의 5 내지 15배의 부피비를 이용한다.
어피를 초산 용액에 침지시키면 어피 중의 산가용성 콜라겐이 초산에 녹으면서 추출된다. 추출 시간을 증가시키면 콜라겐의 추출수율을 증가시킬 수 있으나 고분자 콜라겐의 수율이 감소할 수 있으므로 추출시간은 72시간 이하가 적절하다. 바람직하게는 48시간 동안 추출한다.
추출 후 여과포를 이용해 여과하면 어피가 제거된 여과액, 즉 콜라겐 추출액을 얻는다.
4. 분리단계
다음으로, 콜라겐 추출액에 녹아 있는 콜라겐을 분리하기 위해 콜라겐 추출액에 염을 가하여 콜라겐을 침전시킨다.
염으로 염화나트륨(NaCl)을 이용할 수 있다. 콜라겐 추출액에 염화나트륨을 첨가하여 콜라겐 추출액의 염화나트륨의 농도를 2.6M로 맞춘다. 그리고 콜라겐이 침전될 수 있도록 12 내지 36시간 동안 방치시킨다. 방치 후 여과포를 이용하여 여과하면 침전된 콜라겐, 즉 콜라겐 침전물을 분리할 수 있다.
5. 탈염단계
다음으로, 콜라겐 침전물 중의 염화나트륨을 제거하기 위해 탈염처리한다.
상술한 분리단계에서 염화나트륨을 이용하여 콜라겐을 침전시키므로 콜라겐 침전물에는 염화나트륨이 존재한다. 따라서 콜라겐 침전물 중에 존재하여 염화나트륨을 제거하기 위해 탈염처리가 필요하다.
탈염처리는 통상적인 투석방법으로 가능하다. 가령, 콜라겐 침전물에 증류수를 첨가하여 분산시킨 후, 셀룰로오스 한외여과막(Cellu sep, 분자량 3,500)에 충진시킨 후, 48시간 이상 증류수로 투석하여 염을 제거할 수 있다.
이와 같이 탈염처리된 콜라겐 침전물은 순도 90% 이하의 정제도를 갖는다. 이러한 순도는 화장품이나 식품의 용도로 사용하기에 문제가 없으나 의료용, 특히 의료 섬유용으로는 부적합하다. 또한, 탈염처리된 콜라겐 침전물에 함유된 콜라겐은 분자량 200kDa 미만의 저분자량 콜라겐이 다량으로 함유되어 있어서 의료용으로 부적합하다.
통상적인 한외여과 정제를 더 거치면 콜라겐의 순도를 약 97%까지는 높일 수 있으나 그 이상의 순도로 높이기는 어렵다. 순도 97%인 콜라겐 역시 미량의 불순물이 혼입되어 있으므로 의료용 콜라겐으로 사용하는데도 제한이 따르며 순수한 콜라겐 섬유를 제조할 수 없다. 미량의 다른 성분이 혼입되면 콜라겐 섬유는 쉽게 끊어짐이 발생하여 실을 만들기가 불가능하기 때문이다.
따라서 본 발명은 순도 99% 이상의 콜라겐과 분자량 200kDa 이상의 고분자량 콜라겐을 얻기 위해 하기의 정제단계를 추가로 수행한다.
6. 정제단계
한외여과를 통해 탈염처리된 콜라겐 침전물에 잔존하는 불순물 및 저분자 콜라겐을 제거한다.
구체적으로, 정제단계는 a)탈염처리된 콜라겐 침전물을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 1차로 정제하는 단계와, b)1차 정제를 통해 수득한 1차정제콜라겐을 에탄올에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 2차로 정제하는 단계와, c)2차 정체를 통해 수득한 2차정제콜라겐을 수산화나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 3차로 정제하는 단계와, d)3차 정제를 통해 수득한 3차정제콜라겐을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 4차로 정제하는 단계를 구비한다.
정제단계를 수행하기 위한 한외여과기를 도 1에 도시하고 있다.
도 1을 참조하면, 한외여과기(1)는 원통형의 용기(10)와, 용기(10)의 상부에 결합되는 상부캡(11)과, 용기(10)의 하부에 결합되는 하부캡(13)과, 상부캡(11) 및 하부캡(13)을 용기(10)에 고정시키기 위한 고정수단과, 상부캡(11)에 설치되는 모터(20)와, 모터(20)의 회전축(21)과 연결되어 용기(10) 내부에 수용된 내용물을 교반하는 교반봉(23)과, 하부캡(13)의 내측에 설치되며 다수의 타공홀들이 형성된 원판형의 지지플레이트(30)와, 지지플레이트(30)의 상부에 설치되어 교반봉(23)의 하방에 위치하는 한외여과막(35)을 구비한다.
용기(10)는 상부와 하부가 개방된 원통형 구조로 이루어진다. 용기(10)는 내부가 들여다 보이도록 투명한 재질로 형성되는 것이 바람직하다. 용기(10)의 내부로 콜라겐 침전물과 용매를 혼합한 혼합물이 수용된다.
상부캡(11)은 용기(10)의 상부에 결합된다. 상부캡(11)에는 용기(10)의 내부로 시료주입관(15)이 설치된다. 시료주입관(15)을 통해 콜라겐 침전물과 용매를 혼합한 혼합물이 용기(10) 내부로 주입된다. 그리고 질소가스를 용기(10)의 내부로 주입할 수 있도록 가스주입관(16)이 상부캡(11)에 설치된다. 또한, 가스를 용기(10)의 내부에서 외부로 배출하기 위한 가스배출관(17)이 상부캡(11)에 설치된다. 가스주입관(15)과 가스배출관(17)에는 밸브가 설치됨은 물론이다. 또한, 상부캡(11)에는 용기(10) 내부의 압력을 측정하기 위한 압력계(18)가 설치된다.
하부캡(13)은 용기(10)의 하부에 결합된다. 하부캡(13)의 중앙에는 여과액이 배출될 수 있도록 여과액배출관(14)이 연결된다. 하부캡(13)의 바닥면은 중앙으로 갈수록 점차 낮아지도록 경사지게 형성된다.
상부캡(11)과 하부캡(13)은 고정수단에 의해 용기(10)에 결합된다. 도시된 고정수단은 용기(10)의 바깥에 일정 간격으로 배치되어 상부캡(11)과 하부캡(13)을 관통하는 고정봉(41)과, 고정봉(41)의 상부에 나사결합되어 상부캡(11)을 용기(10)의 상부에 고정시키는 상부고정볼트(43)와, 고정봉(41)의 하부에 나사결합되어 하부캡(13)을 용기(10)의 하부에 고정시키는 하부고정볼트(45)를 구비한다.
상부캡(11)과 용기(10)의 상단, 하부캡(13)과 용기(10)의 하단 사이에는 틈새가 발생되지 않도록 오링이나 가스켓 등의 실링수단이 마련됨은 물론이다.
교반봉(23)은 모터(20)에 의해 회전하면서 용기(10) 내부의 내용물을 교반하는 역할을 한다.
지지플레이트(30)는 원판형으로 형성된다. 지지플레이트(30)는 다수의 타공홀들이 형성되어 여과액이 통과할 수 있도록 한다.
한외여과막(35)으로 평판형을 이용할 수 있다. 이러한 한외여과막(35)으로 셀룰로오스 또는 폴리머 소재를 이용할 수 있다. 한외여과막은 100~200kDa까지 투과할 수 있는 기공을 가져 저분자량 콜라겐을 제거할 수 있도록 한다.
상술한 한외여과기를 이용한 정제단계를 살펴본다.
먼저, 탈염처리된 콜라겐 침전물을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 1차로 정제한다.
콜라겐 침전물을 0.5M 초산 용액에 혼합한 후 시료주입관(15)을 통해 용기(10) 내부로 주입한 후 가스주입관(16)를 통해 용기(10)의 내부로 질소를 주입한다. 질소를 주입하여 용기(10) 내부의 압력을 20 내지 80psi로 유지시킨 후 모터(20)를 작동하여 교반봉(23)을 회전시켜 교반한다. 교반속도 100 내지 200rpm으로 24시간 동안 여과할 수 있다. 한외여과막(35)의 기공보다 더 작은 불순물은 한외여과막(35)을 통과하여 여과액배출관(14)으로 배출된다.
24시간 여과 후 용기(10) 내의 내용물이 졸 또는 겔 상태로 농축이 되면 가스배출관(17)을 개방시켜 용기(10) 내의 압력을 제거한다. 압력이 제거되면 용기 내부에 남아있는 졸 또는 겔 상태의 내용물, 즉 1차정제콜라겐을 분리한다. 분리된 1차정체콜라겐은 증류수로 세척한다.
다음으로, 1차정제콜라겐을 에탄올에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 2차로 정제한다.
1차정제콜라겐을 농도 50%(w/w)의 에탄올(ethanol) 용액에 혼합한 후 시료주입구를 통해 용기 내부로 주입하여 상술한 1차정제와 동일한 방법으로 2차정제를 실시한다. 2차정제를 통해 용기 내부에서 분리된 2차정제콜라겐은 증류수로 세척한다.
다음으로, 2차정제콜라겐을 수산화나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 3차로 정제한다.
2차정제콜라겐은 대부분의 불순물이 상당히 제거된 상태이나 미량의 멜라닌 등 색소 물질이 여전이 함유되어 있다. 이러한 물질은 고분자 물질로 물과 유기용매에 용해가 되지 않고 미세입자 형태로 콜라겐 표면에 흡착되어 콜라겐의 오염물질 중 하나로 콜라겐의 물리적 성격을 저해한다. 고분자 색소는 정제 용매에 용해가 어려우며 한외여과막을 투과하기 어려워 정제하는 데 한계가 있다.
2차정제콜라겐을 0.5M의 수산화나트륨 용액에 혼합한 후 바로 용기 내부로 투입하여 3차 정제하기보다는 24 내지 48시간 동안 방치하면 멜라닌 색소가 저분자로 분해되어 정제 효율을 높일 수 있다. 따라서 2차정제콜라겐을 0.5M의 수산화나트륨 용액에 혼합한 후 24 내지 48시간 동안 방치한 다음 시료주입구를 통해 용기 내부로 주입하여 상술한 1차정제와 동일한 방법으로 3차정제를 실시한다. 3차정제를 통해 용기 내부에서 분리된 3차정제콜라겐은 증류수로 세척한다.
다음으로, 3차정제콜라겐을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 4차로 정제한다.
3차정제콜라겐을 0.5M 초산 용액에 혼합한 후 시료주입구를 통해 용기 내부로 주입하여 상술한 1차정제와 동일한 방법으로 4차정제를 실시한다. 4차정제를 통해 용기 내부에서 분리된 4차정제콜라겐은 증류수로 세척한 후 동결건조하여 최종적으로 고순도 고분자 콜라겐을 얻는다.
이와 같이 얻어진 콜라겐은 순도 99% 이상의 고순도이고, 평균 분자량이 200kDa 이상인 고분자이다.
한편, 본 발명의 다른 예로 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐 중의 색소를 추가로 제거하기 위해 5차 정제를 더 수행할 수 있다.
5차 정제는 4차정제콜라겐을 과산화수소 용액 또는 아황산나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 수행한다.
과산화수소 용액은 농도 0.1 내지 1.0%(w/w)를 이용할 수 있다. 그리고 아황산나트륨 용액은 농도 0.01%(w/w)를 이용할 수 있다. 그리고 필요에 따라 과산화수소 용액과 아황산나트륨 용액은 수산화나트륨 용액과 혼합하여 이용할 수 있다.
과산화수소는 강력한 산화력을 띠고 있어 색소 물질을 산화하여 저분자 물질로 분해시키고, 한외여과 과정에서 분해된 색소 물질을 콜라겐으로부터 제거할 수 있다. 또한 과산화수소 용액은 0.1M NaOH에 녹지 않는 일부 비 콜라겐성 단백질을 제거할 수 있어 정제 순도를 높일 수 있다.
아황산나트륨(Na2SO3)의 강한 환원력에 의해 색소가 저분자 물질로 분해되어 콜라겐에 흡착된 색소 물질을 효율적으로 제거할 수 있다.
이와 같이 과산화수소 또는 아황산나트륨에 의한 5차 정제를 통해 색소를 추가로 제거할 수 있다.
색소 제거를 더욱 높이기 위해 본 발명은 5차 정제를 통해 수득한 5차정제콜라겐을 아스코빅산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 6차로 정제할 수 있다.
과산화수소 또는 아황산나트륨에 의한 5차 정제 후 농도 1%(w/w)의 아르코빅산(ascorbic acid) 용액으로 6차 정제를 할 경우 5차 정제에도 제거되지 않은 색소를 제거할 수 있다.
한편, 본 발명은 또 다른 예로 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐의 표면에 흡착되어 있는 흡착지방을 제거하기 위해 4차정제콜라겐을 흡착지방제거용매에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 수행할 수 있다.
흡착지방제거용매는 부탄올에 부틸히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 또는 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 첨가한 것을 이용할 수 있다.
어피의 전처리단계에서 NaOH에 의해 일부 지방이 제거되지만, 미량의 지방은 추출 및 침전과정에 콜라겐의 표면에 흡착하여 오염물질로 남아 있다. 흡착 지방을 제거하기 위해서 10% butanol 용액에 butylated hydroxyanisole(BHA)나 butylated hydroxytoluene(BHT)를 녹인 용액을 이용하여 4차정제콜라겐을 한외여과한다. BHA나 BHT는 지방의 제거에 효과가 있을 뿐만 아니라 색소의 제거에도 중요한 역할을 한다.
한편, 본 발명은 또 다른 예로 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐 중의 미네랄을 추가로 제거하기 위해 4차정제콜라겐을 EDTA-2Na 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 수행할 수 있다.
정제과정을 거친 콜라겐에는 Na, Fe, Zn, K, Ca 등 다양한 미네랄이 미량 함유될 수 있다. 이러한 미네랄은 콜라겐의 점도, 용해도 등 물리적 성격에 다양한 영향을 미치고 있어 이러한 미네랄을 제거하는 것이 바람직하다.
EDTA-2Na 용액은 0.05M의 acetic acid 용액에 농도 0.5%(w/w)의 EDTA-2Na (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt; Disodium EDTA)를 첨가하여 얻을 수 있다.
그리고 EDTA-2Na 용액에 의한 5차 정제 후 추가로 6차 정제를 수행할 수 있다. 이 경우 6차 정제는 5차정제콜라겐을 옥살산(oxalic acid) 용액 또는 시트릭산(citric acid) 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 정제할 수 있다.
옥살산(oxalic acid) 용액 또는 시트릭산(citric acid) 용액에 의한 5차 정제를 통해 미네랄 제거 효과를 더 높일 수 있다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니다.
(실시예)
3종류의 어류(틸라피아, 참돔, 넙치)에서 분리한 어피를 손질하여 약 5×5mm 크기로 잘게 절단하여 어피를 준비하였다.
각 준비된 어피를 0.1M의 수산화나트륨(NaOH) 용액에 침지시킨 후 100rpm 속도로 24시간 교반하여 알칼리 처리를 한 다음 수돗물로 세척하고 탈수하였다. 그리고 알칼리 처리한 어피를 농도 50%(w/w)의 에탄올(ethanol) 용액에 침지시킨 후 12시간마다 에탄올 용액을 전액 교체하면서 48시간 동안 에탄올 용액에 침지하여 탈지처리하였다. 탈지처리 후 수돗물로 세척하고 탈수하였다.
탈치저리된 어피를 0.5M의 초산 용액에 침지하여 교반하면서 48시간 동안 콜라겐을 추출한 후 여과포로 여과하여 콜라겐 추출액을 얻었다. 콜라겐 추출액에 염화나트륨을 첨가하여 염화나트륨의 농도를 2.6M로 맞춘 후 24시간 동안 방치시킨 다음 여과포로 여과하면 콜라겐 침전물을 분리하였다. 콜라겐 침전물을 증류수에 분산시킨 후 셀룰로오스 한외여과막에 충진시킨 후 48시간 동안 증류수로 투석하여 염을 제거하였다.
탈염처리된 콜라겐 침전물을 0.5M 초산용액에 혼합하여 도 1에 도시된 구조의 한외여과기의 용기의 내부에 주입한 후 질소를 주입하여 50psi로 유지시킨 후 150rpm으로 24시간 동안 교반하면서 여과하여 1차정제콜라겐을 분리하였다. 그리고 1차정제콜라겐을 농도 50%(w/w)의 에탄올에 혼합한 후 위와 동일한 여과조건으로 2차정제콜라겐을 분리하였다. 그리고 2차정제콜라겐을 0.5M의 수산화나트륨 용액과 혼합한 후 위와 동일한 여과조건으로 3차정제콜라겐을 분리하였다. 그리고 3차정제콜라겐을 0.5M의 초산 용액과 혼합한 후 위와 동일한 여과조건으로 4차정제콜라겐을 분리하였다. 4차정제콜라겐은 동결건조시켜 고순도 고분자 콜라겐을 수득하였다.
정제에 사용한 한외여과막은 PEEK(Poly Ether Ether Ketone) 소재이고, 기공 사이즈가 0.05㎛이었다.
(비교예 1)
상기 실시예의 탈염처리된 콜라겐 침전물을 동결건조시킨 것을 비교예 1의 시료로 이용하였다.
(비교예 2)
상기 실시예의 탈염처리된 콜라겐 침전물을 통상적인 한외여과법(Chen 방법)으로 정제한 후 동결건조시킨 것을 비교예 2의 시료로 이용하였다.
(Chen 방법: Chen, S, Chen, H, Xie, Q, Hong, B, Chen, J, Hua, F et al. Rapid isolation of high purity pepsin-soluble type I collagen from scales of red drum fish (Sciaenops ocellatus). Food Hydrocolloids. 2016. 52. 468-477.)
<콜라겐 순도 분석>
실시예, 비교예 1 및 2의 콜라겐에 대하여 단백질, 중성지질, 미네랄, 탄수화물을 분석하여 함량(%)를 하기 표 1 내지 도 3에 나타내었다.
-단백질 분석
분석의 정확도를 높이기 위해 아미노산을 분석하여 단백질로 전환하였다. 아미노산 분석은 시료 0.1g을 테플론-실리콘 라이닝 된 스크루 캡의 유리 시험관에 약 6N HCl을 가하여 질소가스 치환 후 110℃로 24시간 동안 가열하여 가수분해하였다. 전량을 50mL 용량플라스크에 넣은 후 증류수로 정용하여 0.45μm PTFE Syringe filter로 여과한 것을 분석용 시료로 사용하였다. Shimadzu 아미노산 자동분석기(Shimadzu Co, Ltd. Kyoto, Japan)를 사용하여 형광 검출기를 이용하는 OPA (O-phthalaldehyde)법으로 측정하였다. 컬럼은 유리아미노산 분석용 Shim-pack AMINO-Li (6.0×100mm), buffer flow rate는 0.6mL/min, OPA reagent flow rate는 0.3mL로 설정하여 분석하였으며 형광검출기의 excitation 파장은 350nm와 emission 파장은 450nm를 사용하였다.
2. 중성지방 분석
지방산을 분석하여 지방산을 AOCS 방법으로 중성지방으로 전환하였다. FAME(Fatty Acid Methyl Ester)는 Griffiths의 수정된 방법에 따라 제조되었다. 즉, 각 시료를 테플론-실리콘 라이닝 된 스크루 캡이 있는 유리 시험관에 약 0.1g을 넣고 0.2mg C17 내부표준물질을 함유하는 500μL toluene에 용해하고 100μL의 2,2-dimethoxypropane (water scavenger)과 0.5N sodium methoxide 1mL을 넣고 혼합하여 80℃ waterbath에서 20분 동안 교반하였다. 5분동안 실온에서 냉각시키고 1mL BF3 methanol을 첨가하여 80℃ waterbath에서 20분 동안 교반한 후 실온에서 냉각하고 400μL hexane과 400μL 포화식염수를 첨가하여 3,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상부 hexane-toluene층 2 mL을 vial로 옮겨 GC 분석용 시료로 사용하였다. FAME의 정량분석은 GC(Shimadzu GC-2010, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였으며 FID 검출기 온도는 280℃로 설정하였다. Column 온도는 160℃에서 5분간 머문 후 220℃까지 1℃/min 온도를 상승시킨 후 40분간 머물렀다. Injector 온도는 250℃, split ratio는 1:50, carrier gas는 N2(35 mL/min)를 사용하였다. GC 내부 표준물질(C17)을 포함하는 FAME 추출물(1μL)을 SP-2560 capaillary column(Supelco Inc. Bellefonte, USA)에 자동시료주입장치(Shimadzu AOC-20i)를 이용하여 주입하였다. FAME 표준물질(37 mix FAME, Sigma-Adrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 검량선을 작성하고 시료의 지방산을 정량하였다. 지방산을 중성지질로 환산은 AOCS Official Method Ce 1h-05(American Oil Chemists’Society, Champaign, Illinois, USA)에 의하여 전환하였다.
3. 탄수화물 분석
구성당을 분석하여 탄수화물로 전환하였다. 시료 100mg을 15mL 시험관에 넣고 여기에 2M HCl을 5.0mL 가한 후 혼합하였다. 시험관 내부의 공기를 질소(N2) gas로 치환하고 마개를 하여 100℃로 가온된 가열 블록에서 5시간 가열하여 가수분해하였다. 가수분해된 시료를 냉각하고 2N NaOH를 5.0mL 가하여 시료를 중화한 후 6000rpm으로 30분간 원심분리하고, 상등액 3mL를 취하여 0.45μm membrane filter로 여과하고 구성당의 분석 시료로 사용하였다. 콜라겐의 구성당 분석은 Shimadzu 환원당 자동 분석기를 이용하여 분석하였다. 환원당 분석기의 구성은 Shimadzu LC-20AD pump, CTO-20AC oven, Sil-20AC auto-sampler, RF-10Axl fluorescence detector, CBR-6A chemical reaction box, CBM-20A system controller, LC Workstation software(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)를 이용하였다. 환원당 분리는 ion exchange Shim-pack ISA-07(4.0×250mm) 분석 column과 Shim-pack ISA guard column(4.0×50.0mm)을 사용하였다. 이동상은 A용액으로 potassium borate(pH 8)와 B용액으로 potassium borate(pH 9)를 사용하였는데 B 용매를 0분에서 0%로 시작하여 50분에 100%로 증가하여 15분간 100%로 유지하다가 65분 이후에 0%로 감소하여 총 90분의 분석 시간으로 하였다. 이동상 유속은 0.6 mL/min과 반응시약 유속은 0.5 mL/min으로 설정하였고, 시료는 10μL을 주입하였다. Post-column 방법을 이용하여 환원당을 유도체화 한 후 형광 검출기(Ex=320, Em=430)를 사용하여 분석하였다. 반응시약으로 1% arginine과 3% boric acid를 함유하는 용액을 사용하였고, CBR-6A chemical reaction box를 이용하여 150℃로 반응시켜 유도체화 하였다(Shin 등, 2011). 환원당 표준물질을 탈 이온화 증류수에 용해시켜 0.1~20 μg/mL범위의 표준용액을 조제하여 HPLC 분석을 시행하고, peak area로부터 검량선을 작성하여 구성당을 정량하였다.
4. 미네랄 분석
원소분석은 Ca, K, Mg, Na, Cu, Fe, Mn, Ni, Zn을 분석하였다. 시료 약 0.5g을 microwave teflon 용기에 넣고 65% 질산 7mL과 과산화수소 2mL을 가한 후 microwave(MARSX-Press, CEM Corporation, Matthews, NC, USA)를 이용하여 30분 동안 분해하였다. 분해액은 1% 질산 용액을 이용하여 적절하게 표준액의 농도 범위로 희석하고 ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrophotometry, NexION 300 ICP-MS PerkinElmer, Inc, Waltham, MA, USA)로 미네랄을 분석하였다.
하기 표 1은 실시예의 분석 결과이다.
구분 단백질 중성지질 미네랄 탄수화물
틸라피아 어피 99.58±4.62 0.15±0.01 0.06±0.00 0.18±0.01
참돔 어피 99.31±4.15 0.23±0.01 0.09±0.00 0.17±0.01
넙치 어피 99.48±6.24 0.12±0.01 0.14±0.01 0.15±0.01
상기 표 1의 결과를 참조하면, 중성지질과 미네랄 함량은 아주 낮고, 단백질의 함량은 99.3% 이상인 고순도 콜라겐으로 확인되었다.
하기 표 2는 비교예 1의 분석 결과이다.
구분 단백질 중성지질 미네랄 탄수화물
틸라피아 어피 77.54±5.31 12.8±1.54 5.27±0.52 1.45±0.08
참돔 어피 90.25±6.58 6.5±0.98 1.54±0.14 1.23±0.09
넙치 어피 85.39±4.63 8.5±1.16 3.15±0.36 2.39±0.17
하기 표 2를 참조하면, 한외여과로 정제하지 않은 콜라겐은 어종에 따라 차이가 컸지만 단백질 함량은 약 90% 이하인 것으로 나타났다. 이러한 순도는 화장품이나 식품의 용도로는 문제가 없으나 의료용이나 섬유용으로는 부적합하다.
하기 표 3은 비교예 2의 분석결과이다.
구분 단백질 중성지질 미네랄 탄수화물
틸라피아 어피 96.22±3.64 0.62±0.02 0.97±0.30 0.25±0.02
참돔 어피 96.61±3.47 0.88±0.07 0.25±0.10 0.21±0.01
넙치 어피 95.63±5.34 0.52±0.04 1.54±0.85 0.28±0.01
상기 표 3의 결과를 참조하면, 통상적인 한외여과 방식에 의해 정제된 콜라겐은 표 2의 결과와 비교하여 단백질의 함량이 높아진 것을 알 수 있었다. 하지만, 콜라겐의 단백질 순도는 약 97% 미만으로서, 불순물이 미량 함유되어 있다. 이러한 순도는 의료용 콜라겐으로 사용하는데 제한이 따르며 순수 콜라겐 섬유를 제조하기는 어렵다. 미량의 다른 성분이 혼입되면 콜라겐 섬유는 쉽게 끊어짐이 발생하여 실을 만들기 불가능하다.
<분자량 분석>
단백질 분자량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electorphoresis)를 Laemmli(1970)의 방법에 따라 실시 하였다.
실시예의 시료를 Sample buffer(50mM Tris-HCL, pH 75; 50% glycerin, 1% SDS, 002% bromophenol blue, BPB)에 1㎎/㎖ 농도로 조제하여 vortex시킨 후, 95℃에서 5분간 가열하여 열 변성시킨 후 10분간 실온에서 방냉시켜 시료 를 준비하였다. 준비된 시료는 3% stacking gel과 75% separate gel로 구성된 40% polyacrylamide을 이용하여 75% gel을 제조하였으며, 전기영동장치는 Bio-RAD Power Pac Basic(USA)을 사용하여 200V, 35mA/gel의 조건으로 실시하였다. 단백질 band의 염색은 Fairbanks et al,(1971)에 따라 Coomassie brilliant blue(CBB)와 2-propanol, 초산을 단계적으로 섞은 염색액을 총 4단계로 준비해, 1단계는 30분, 2~4단계는 각각 2시간씩 실시하였다. 이때 시료의 분자량을 확인하기 위해 사용된 Marker는 SDS-PAGE Molecular Weight Stadards(Bio-rad Laboratirories, High range, USA)를 이용하였다.
도 2를 참조하면, 100kDa 이하 분자량에서는 단백질 밴드를 확인할 수 없었으며, 100kDa 이상에서는 약 110kDa인 α1와 α2는 희미한 단백질 밴드가 나타났다. 그리고 220kDa인 β와 330kDa인 γ 밴드가 진하게 나타나 고분자로 형성된 콜라겐임을 확인할 수 있다. 통상적인 콜라겐의 경우 α1와 α2 밴드가 진하게 나타나며 100kDa 이하에서도 희미한 밴드가 확인되는 것이 일반적이다.
이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 등록청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.
10: 용기 11: 상부캡
13: 하부캡 20: 모터
23: 교반봉 30: 지지플레이트
35: 한외여과막

Claims (10)

  1. 어피를 물로 세척하고 잘게 절단하는 손질단계와;
    상기 손질단계에서 손질된 어피에 용매를 가하여 불순물을 제거하는 전처리단계와;
    상기 전처리단계에서 수득한 전처리된 어피를 초산용액에 침지하여 콜라겐 추출액을 수득하는 추출단계와;
    상기 콜라겐 추출액에 염화나트륨을 가하여 콜라겐을 침전시킨 후 콜라겐 침전물을 분리하는 분리단계와;
    상기 콜라겐 침전물 중의 염화나트륨을 제거하기 위해 탈염처리하는 탈염단계와;
    상기 탈염단계에서 탈염처리된 콜라겐 침전물에 잔존하는 불순물 및 저분자 콜라겐을 제거하기 위해 상기 콜라겐 침전물을 한외여과하여 정제하는 정제단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 전처리단계는 a)상기 손질된 어피를 수산화나트륨 용액에 침지하여 비콜라겐성 단백질을 제거하는 단계와, b)상기 비콜라겐성 단백질이 제거된 어피를 에탄올에 침지하여 지방 및 지용성 색소를 제거하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 정제단계는 a)상기 탈염처리된 콜라겐 침전물을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 1차로 정제하는 단계와, b)상기 1차 정제를 통해 수득한 1차정제콜라겐을 에탄올에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 2차로 정제하는 단계와, c)상기 2차 정체를 통해 수득한 2차정제콜라겐을 수산화나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 3차로 정제하는 단계와, d)상기 3차 정제를 통해 수득한 3차정제콜라겐을 초산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 4차로 정제하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐 중의 색소를 추가로 제거하기 위해 상기 정제단계는 상기 4차정제콜라겐을 과산화수소 용액 또는 아황산나트륨 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 정제단계는 상기 5차 정제를 통해 수득한 5차정제콜라겐을 아스코빅산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 6차로 정제하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐의 표면에 흡착되어 있는 흡착지방을 제거하기 위해 상기 정제단계는 상기 4차정제콜라겐을 흡착지방제거용매에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 구비하고,
    상기 흡착지방제거용매는 부탄올에 부틸히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 또는 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 첨가한 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 4차 정제를 통해 수득한 4차정제콜라겐 중의 미네랄을 추가로 제거하기 위해 상기 정제단계는 상기 4차정제콜라겐을 EDTA-2Na 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 5차로 정제하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 정제단계는 상기 5차 정제를 통해 수득한 5차정제콜라겐을 옥살산 용액 또는 시트릭산 용액에 혼합한 후 한외여과기에 투입하여 6차로 정제하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 어피는 틸라피아, 참돔, 넙치 중에서 선택된 어느 하나의 껍질인 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 정제단계는 상기 콜라겐 침전물을 용매와 혼합하여 한외여과기에 투입하여 정제하며,
    상기 한외여과기는 상하부가 개방된 원통형의 용기와, 상기 용기의 상부에 결합되는 상부캡과, 상기 용기의 하부에 결합되는 하부캡과, 상기 상부캡 및 상기 하부캡을 상기 용기에 고정시키기 위한 고정수단과, 상기 상부캡에 설치되는 모터와, 상기 모터의 회전축과 연결되어 상기 용기의 내부에 설치되는 교반봉과, 상기 하부캡의 내측에 설치되며 다수의 타공홀들이 형성된 원판형의 지지플레이트와, 상기 지지플레이트의 상부에 설치되어 상기 교반봉의 하방에 위치하는 한외여과막을 구비하는 것을 특징으로 하는 고순도 고분자 콜라겐의 추출방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003327599A (ja) * 2002-03-08 2003-11-19 Nitta Gelatin Inc 魚由来コラーゲン、その製造方法およびその用途
CN104338175A (zh) * 2013-08-01 2015-02-11 上海华睿生物科技有限公司 一种医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法
CN105755078A (zh) * 2014-12-19 2016-07-13 山东国际生物科技园发展有限公司 一种医用级鱼皮胶原的制备方法及其应用
CN205495355U (zh) * 2016-04-13 2016-08-24 吉林大学 一种自动控制连续进料多级过滤的超滤装置
KR20190065935A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 주식회사 마린테크노 마린 콜라겐의 대량생산을 위한 고순도 정제방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003327599A (ja) * 2002-03-08 2003-11-19 Nitta Gelatin Inc 魚由来コラーゲン、その製造方法およびその用途
CN104338175A (zh) * 2013-08-01 2015-02-11 上海华睿生物科技有限公司 一种医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法
CN105755078A (zh) * 2014-12-19 2016-07-13 山东国际生物科技园发展有限公司 一种医用级鱼皮胶原的制备方法及其应用
CN205495355U (zh) * 2016-04-13 2016-08-24 吉林大学 一种自动控制连续进料多级过滤的超滤装置
KR20190065935A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 주식회사 마린테크노 마린 콜라겐의 대량생산을 위한 고순도 정제방법

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