KR20230122278A - 식품첨가물 이산화규소 검출용 조성물, 이의 제조방법, 이를 이용한 이산화규소 검출 및 분리방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이산화규소와 특이적 친화력을 가지고 있는 리간드를 이용하여 이산화규소를 검출하고 분리할 수 있는 이산화규소 검출용 조성물, 이의 제조방법, 이를 이용한 이산화규소 검출방법 및 분리방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 이산화규소와 친화력을 갖는 실리카 결합 펩타이드를 포함하는 리간드를 이용하여 식품에 포함된 이산화규소와 결합하여 검출할 수 있고, 상기 이산화규소가 결합된 복합체는 외부자력을 이용하여 식품 매트릭스로부터 분리하여 분리된 이산화규소의 이화학적 특성변화를 최소화할 수 있다.
또한, 상기 이산화규소가 결합된 복합체를 분리시킨 후 맥아당과 반응시켜 복합체로부터 이산화규소를 분리하여 간단하고 효율적인 방법으로 이산화규소를 고순도로 회수할 수 있다.
또한, 상기 이산화규소가 결합된 복합체를 분리시킨 후 맥아당과 반응시켜 복합체로부터 이산화규소를 분리하여 간단하고 효율적인 방법으로 이산화규소를 고순도로 회수할 수 있다.
Description
본 발명은 리간드를 이용하여 이산화규소를 검출하고 분리할 수 있는 이산화규소 검출용 조성물, 이의 제조방법, 이를 이용한 이산화규소 검출방법 및 분리방법에 관한 것이다.
식품첨가물로 사용이 허가된 이산화규소는 고결방지제의 목적으로 분말 형태의 가공식품(음료 베이스, 시즈닝, 분말 등)에 널리 사용되고 있다. 이산화규소의 상업적 사용이 증가함에 따라 나노입자의 형태를 띠고 있는 이산화규소의 안전성 및 독성에 대한 우려가 커지고 있다. 또한, 연구 결과에 따르면 이산화규소의 입자 크기가 생물학적 조직에의 침투 특성을 결정하는 중요한 매개변수이며 독성도 증가시킬 수 있다고 보고하고 있다. 따라서 식품 중 이산화규소의 입자의 크기, 형태 등 물리화학적 특성을 모니터링 해야 할 필요가 있다. 식품 중에 존재하는 이산화규소 입자를 분리하기 위해서는 지방, 단백질, 탄수화물 등 식품을 구성하고 있는 복잡한 매트릭스를 제거하는 전처리 공정이 중요하다. 현재 원심분리법, 산 가수분해법은 식품 중 유기물을 분해하기 위해 사용되는 대표적인 전처리 방법이다. 특히 산 가수분해 방법은 식품 시료 내의 유기물을 분해하기 위해 널리 사용되고 있으나, 공정 자체가 매우 복잡하며 강산을 이용하기 때문에 전문화된 장비와 인력을 필요로 한다. 또한, 식품 매트릭스 구성에 따라 처리방법을 달리해야 하기 때문에 표준화된 전처리법을 확립하기에 어려움이 있다. 따라서 이러한 기존 방법들은 이산화규소입자 외의 식품을 구성하는 유기물을 효과적으로 제거하는데 부적합하거나 이산화규소 입자의 이화학적 특성에 영향을 줄 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로 이산화규소와 친화력을 갖는 실리카 결합 펩타이드를 리간드로 이용하여 이산화규소를 검출하고 분리해내는 이산화규소 검출용 조성물, 이를 이용한 이산화규소 검출방법 및 분리방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드; 및 자성입자;를 포함하는 복합체를 포함하고, 상기 리간드는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드와 자성입자를 혼합하여 자성입자에 리간드를 결합시켜 복합체를 제조하는 단계를 포함하고, 상기 리간드는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드; 및 자성입자;를 포함하는 복합체를 소비재를 포함하는 현탁액에 첨가하여 이산화규소와 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 리간드는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서술한 이산화규소 검출방법을 통해 형성된 이산화규소가 결합된 복합체에 1 내지 40 mM의 맥아당을 첨가하여 이산화규소를 용출시키는 단계; 및 상기 용출된 이산화규소를 외부자력을 이용하여 분리시키는 단계를 포함하는 이산화규소 분리방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 이산화규소와 친화력을 갖는 실리카 결합 펩타이드를 포함하는 리간드를 이용하여 식품에 포함된 이산화규소와 결합하여 검출할 수 있고, 상기 이산화규소가 결합된 복합체는 외부자력을 이용하여 식품 매트릭스로부터 분리하여 분리된 이산화규소의 이화학적 특성변화를 최소화할 수 있다.
또한, 상기 이산화규소가 결합된 복합체를 분리시킨 후 맥아당과 반응시켜 복합체로부터 이산화규소를 분리하여 간단하고 효율적인 방법으로 이산화규소를 고순도로 회수할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합체의 이산화규소에 대한 특이적 결합력 실험을 진행한 결과이다: (a)는 규조류의 골격을 형성하는 과정에 관여하는 실라핀(Silaffin) 단백질 중 규조류 실리카 골격(biosilica)에 친화력을 가지고 있는 T8 시퀀스를 이용하여 실리카 결합 펩타이드(Silica binding peptide, SBP)를 디자인한 것이고, (b) 본 발명의 복합체에 포함된 융합단백질의 발현에 사용된 재조합 플라스미드의 모식도이고, (c)는 산화아연, 이산화티타늄, 이산화규소와의 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체를 이용하여 식품첨가물 이산화규소를 분리 및 회수하는 실험 결과이다: (a)는 상기 복합체를 이용하여 식품첨가물 이산화규소의 분리 및 회수 과정을 나타낸 모식도이고, (b)는 시험관 내에서 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체에 의해 이산화규소가 농축 및 용출되는 과정을 촬영한 이미지이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 이산화규소 검출방법 및 분리방법을 수행한 결과이다:(a)는 식품 매트릭스(카제인, 설탕)와 섞어 주었던 이산화규소를 자성 분리 후 이산화규소의 이화학적 특성을 주사전자현미경과 입자의 크기 분포도를 통해 분석한 결과이고, (b)는 복합체를 이용하여 분리한 이산화규소 분리율 및 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이산화규소 분리방법에서 복합체를 이용한 자성분리 전/후 이산화규소 입자의 형태와 크기를 분석한 결과이다: (a)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시킨 형태를 촬용한 주사전자현미경 이미지이고, (b)는 3개 유형의 5개 가공식품을 수분산시켜 자성분리 후의 이산화규소를 주사전자현미경으로 촬영한 이미지와 입자크기 분포도이고, (c)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시켜 자성분리 후의 이산화규소를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지와 입자크기 분포도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체를 이용하여 식품첨가물 이산화규소를 분리 및 회수하는 실험 결과이다: (a)는 상기 복합체를 이용하여 식품첨가물 이산화규소의 분리 및 회수 과정을 나타낸 모식도이고, (b)는 시험관 내에서 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체에 의해 이산화규소가 농축 및 용출되는 과정을 촬영한 이미지이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 이산화규소 검출방법 및 분리방법을 수행한 결과이다:(a)는 식품 매트릭스(카제인, 설탕)와 섞어 주었던 이산화규소를 자성 분리 후 이산화규소의 이화학적 특성을 주사전자현미경과 입자의 크기 분포도를 통해 분석한 결과이고, (b)는 복합체를 이용하여 분리한 이산화규소 분리율 및 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이산화규소 분리방법에서 복합체를 이용한 자성분리 전/후 이산화규소 입자의 형태와 크기를 분석한 결과이다: (a)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시킨 형태를 촬용한 주사전자현미경 이미지이고, (b)는 3개 유형의 5개 가공식품을 수분산시켜 자성분리 후의 이산화규소를 주사전자현미경으로 촬영한 이미지와 입자크기 분포도이고, (c)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시켜 자성분리 후의 이산화규소를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지와 입자크기 분포도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 서술한다.
본 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 효율적이고 온전한 형태로 가공식품에 존재하는 식품첨가물 이산화규소를 분리할 수 있는 자성 입자 소재 및 분리 방법을 제시하고자 한다. 해양생물인 규조류에서 발현되는 silaffin 단백질은 이산화규소의 광물화(minerallization)를 유도하고, 이를 통해 규조류의 무기물 골격구조를 형성하는 과정에 관여하고 있는데 이 단백질이 이산화규소와 특이적 결합특성을 가지고 있을 것이라는 가설에서 출발하여 실제 실험을 수행한 결과, silaffin의 T8 도메인이 이산화규소 입자에 특이적으로 결합한다는 사실을 발견하였다. silaffin의 T8 도메인을 전분자성입자 표면에 수식하기 위하여 유전자재조합 기술을 이용하여 전분에 결합특성을 가지고 있는 말토오스 결합단백질(maltose binding protein, MBP)을 붙여 융합단백질을 제작하였고, T8 도메인에 해당하는 부위는 SBP(silica binding peptide)라 칭하였다. 제작된 융합단백질(SBP-MBP)은 전분자성입자 표면에 잘 수식이 되었고 이산화규소와 결합하는 특성도 그대로 유지 되었다. 리간드가 수식된 자성입자는 이산화규소와 더불어 식품첨가물로 널리 사용되는 이산화티타늄과 산화아연에는 낮은 결합특성을 가지고 있어 식품에서 이산화규소만 선택적으로 분리하는 것이 가능하다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드; 및 자성입자;를 포함하는 복합체를 포함하는 이산화규소 검출용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 복합체는 자성입자의 표면에 리간드가 결합된 형태일 수 있다.
상기 리간드는 이산화규소 결합부 및 맥아당 결합부를 포함하는 융합단백질을 포함하고, 상기 맥아당 결합부는 자성입자의 표면에 결합된 형태일 수 있다.
상기 이산화규소 결합부는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이고, 상기 맥아당 결합부는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
상기 이산화규소 결합부는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있고, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 실리카 결합 펩타이드일 수 있다. 또한, 상기 이산화규소 결합부에 포함된 펩타이드는 히스티딘이 태깅된 것일 수 있다. 상기와 같이 히스티딘이 태깅됨으로써 단백질 정제를 수월하게 수행할 수 있다.
상기 맥아당 결합부는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
상기 융합단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 것일 수 있다.
상기 자성입자는 자성나노입자 또는 전분자성입자를 포함할 수 있다.
상기 자성나노입자는 철, 망간, 크롬, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 사마륨, 가돌리늄, 네오디뮴, 유로퓸, 바륨 및 백금의 금속, 합금, 산화물 및 황화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 자성나노입자는 실리카 결합 펩타이드를 수식할 수 있으면 어떠한 형태라면 특별히 제한하지 않으나, 구체적으로, 상기 자성나노입자는 음의 표면전하를 갖는 자성나노입자일 수 있고, 상기 음의 표면전하를 갖는 자성나노입자는 자성나노입자의 표면이 실리카, 카르복시기(carboxyl), 인산염기(phosphate), 또는 황 치환기로 개질된 것을 포함한다.
상기 전분자성입자는 단 사슬 글루칸(SCGs) 매트릭스; 및 상기 매트릭스 내부에 분산된 자성나노입자;를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어, "매트릭스"는 2종 이상의 성분을 포함하는 물(物)에서 연속상을 구성하는 성분을 의미한다. 상기 자성입자는 단 사슬 글루칸(SCGs) 매트릭스 내에 상기 자성입자가 불연속상으로 존재하는 형태일 수 있다.
상기 단 사슬 글루칸(SCGs)은 옥수수 전분(waxy maize starch, WMS) 내 아밀로펙틴(amylopectins)의 효소적 탈분지 반응(enzymatic debranching)에 의해 생성될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드와 자성입자를 혼합하여 자성입자에 리간드를 결합시켜 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 리간드는 이산화규소 결합부 및 맥아당 결합부를 포함하는 융합단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 이용하여 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 융합단백질을 제조하는 단계는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 E. coli.에 도입하여 단백질의 발현을 유도하여 융합단백질을 제조할 수 있다.
상기 이산화규소 결합부는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있고, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 실리카 결합 펩타이드일 수 있다. 또한, 상기 이산화규소 결합부에 포함된 펩타이드는 히스티딘이 태깅된 것일 수 있다.
상기 맥아당 결합부는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
상기 복합체를 제조하는 단계는 상기 리간드 및 자성입자가 분산된 용액을 로테이터에서 10 내지 50 rpm으로 1분 내지 30분 동안 교반시켜 혼합함으로써, 융합단백질과 자성입자가 결합된 복합체를 제조할 수 있다.
구체적으로, 상기 복합체를 제조하는 단계는 상기 리간드가 50 내지 500 μg/mL, 50 내지 300 μg/mL 또는 100 내지 200 μg/mL의 농도로 포함될 수 있고, 자성입자는 0.5 내지 5 mg/mL 또는 0.5 내지 2 mg/mL의 농도로 포함될 수 있다.
상기 자성입자는 자성나노입자 또는 전분자성입자를 포함할 수 있다.
상기 자성나노입자는 철, 망간, 크롬, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 사마륨, 가돌리늄, 네오디뮴, 유로퓸, 바륨 및 백금의 금속, 합금, 산화물 및 황화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 자성나노입자는 실리카 결합 펩타이드를 수식할 수 있으면 어떠한 형태라면 특별히 제한하지 않으나, 구체적으로, 상기 자성나노입자는 음의 표면전하를 갖는 자성나노입자일 수 있고, 상기 음의 표면전하를 갖는 자성나노입자는 자성나노입자의 표면이 실리카, 카르복시기(carboxyl), 인산염기(phosphate), 또는 황 치환기로 개질된 것을 포함한다.
상기 전분자성입자는 단 사슬 글루칸(SCGs) 매트릭스; 및 상기 매트릭스 내부에 분산된 자성나노입자;를 포함한다.
상기 복합체를 제조하는 단계 이전에, 단 사슬 글루칸에 자성입자를 첨가하여 전분자성입자를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 전분자성입자를 제조하는 단계는 (a-1) 탈분지효소 존재 하에서 젤라틴화된 옥수수 전분(WMS)을 반응시키는 단계; (a-2) 상기 (a-1) 단계의 생성물을 원심분리하여 단 사슬 글루칸(SCGs)을 제조하는 단계; 및 (a-3) 상기 (a-2) 단계에서 제조된 단 사슬 글루칸(SCGs)에 자성입자를 첨가하고 자기조립반응(self-assembly process)을 유도하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 탈분지효소는 아소아밀라아제(isoamylase), 풀루라나아제(pullulanase), 대, 벼, 감자 등 식물의 R효소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있고, 예를 들어, 풀루라나아제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어, "자기조립반응"은 무질서하게 존재하는 물질들이 일정한 규칙으로 인하여 제어된 구조체를 형성하거나 물질들이 일정한 양식으로 배치되는 현상을 의미한다. 만약 자기조립하는 물질이 분자(molecule)라면 이를 분자 자기조립(molecular self-assembly)이라 부른다.
분자 자기조립은 작은 분자가 평형 조건 하에서 비공유 상호 작용을 통해 초분자 구조(supramolecular structures)를 형성하도록 구동되는 자발적 과정이다. 이 현상은 마이크로 및 나노미터 크기의 활성 생체재료를 제조하기 위한 강력한 도구로 나타났으며, 이러한 공정에는 유기 용매 및 복잡한 절차가 필요하지 않다. 전분 재결정화(starch recrystallization)는 전형적인 분자 자기조립 공정으로서, 식물에서 최소 부피로 에너지원을 효과적으로 저장하기 위한 전분 분자의 고차 패킹 특성에서 유래된 것이다. 이러한 전분 분자의 자기조립 특성이, 옥수수 전분(WMS) 내 아밀로팩틴의 효소적 탈분지 반응을 통해 수득한 단 사슬 글루칸(SCGs)을 이용하여 구형의 미세구조를 제조하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드; 및 자성입자;를 포함하는 복합체를 소비재를 포함하는 현탁액에 첨가하여 이산화규소와 결합시키는 단계를 포함하는 이산화규소 검출방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 복합체는 자성입자의 표면에 리간드가 결합된 형태일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 복합체는 전분자성입자의 표면에 융합단백질에 포함된 맥아당 결합부가 결합된 형태일 수 있다.
상기 소비재는 농축·임·수산물, 식품, 가공식품, 건강기능식품, 의약품, 의약외품, 위생용품, 화장품으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 예를 들어, 식품 또는 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 이산화규소를 포함하는 소비재를 용매에 현탁시켜 소비재를 포함하는 현탁액을 제조하고, 상기 용매는 물일 수 있다.
상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 소비재를 포함하는 현탁액에 복합체의 농도가 0.1 내지 5 mg/mL, 0.1 내지 3 mg/mL 또는 0.5 내지 2 mg/mL이 되도록 첨가할 수 있다.
또한, 상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 로테이터에서 10 내지 50 rpm으로 5분 내지 60분 또는 10분 내지 40분 동안 교반하여 이산화규소-복합체 결합체를 형성할 수 있다.
예를 들어, 상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 상기 복합체에 포함된 리간드와 이산화규소의 친화력에 의해 복합체에 이산화규소가 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 복합체에 포함된 이산화규소 결합부와 이산화규소의 친화력에 의해 복합체에 이산화규소가 결합될 수 있다.
상기 이산화규소와 결합시키는 단계 이후에, 이산화규소가 결합된 복합체를 외부자력으로 분리하여 상층액을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 상층액을 제거하는 단계는 이산화규소가 결합된 복합체가 포함된 현탁액에 외부자력을 가깝게 배치하여 상기 복합체에 결합된 이산화규소를 일면에 수집하고 이산화규소가 결합되지 않은 상층액을 제거하여 이산화규소-복합체 결합체를 분리해낼 수 있다.
상기 외부자력은 자석 또는 전자석 중 선택된 하나 이상을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 서술한 이산화규소 검출방법을 통해 형성된 이산화규소가 결합된 복합체에 1 내지 40 mM의 맥아당을 첨가하여 이산화규소를 용출시키는 단계; 및 상기 용출된 이산화규소를 외부자력을 이용하여 분리시키는 단계를 포함하는 이산화규소 분리방법을 제공한다.
상기 이산화규소를 용출시키는 단계는 이산화규소 결합된 복합체가 포함된 현탁액에 맥아당을 첨가하고, 초음파를 처리하여 1분 내지 20분 또는 1분 내지 10분 동안 분산시킬 수 있다.
상기 맥아당은 5 내지 40 mM 또는 10 내지 30 mM의 고농도로 첨가하여 상기 복합체의 자성입자가 결합된 융합단백질의 맥아당 결합부에 경쟁적으로 결합하여 이산화규소가 결합된 융합단백질을 자성입자로부터 분리시키는 역할을 한다.
상기 이산화규소를 용출시키는 단계는 맥아당이 상기 복합체의 맥아당 결합부에 결합하여 이산화규소가 결합된 융합단백질이 복합체로부터 분리되면서 이산화규소가 용출될 수 있다.
상기 분리시키는 단계는 상기 용출된 이산화규소가 결합된 융합단백질을 포함하는 현탁액의 일면에 외부자력을 배치하여 자성입자를 일면에 고정시키고, 상층액만을 분리하여 이산화규소를 분리할 수 있다.
상기 외부자력은 자석 또는 전자석 중 선택된 하나 이상을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
소비재에 사용되고 있는 이산화규소에 대한 규제가 강화됨에 따라, 본 발명의 이산화규소 검출방법 및 분리방법은 소비재에 포함된 이산화규소의 이화학적 특성을 정확하게 모니터링하기 위한 효율적인 분리 및 회수 방법으로 적용할 수 있다.
예를 들어, 소비재의 독성 평가를 위해 이산화규소의 소비재 내 첨가 여부를 확인하거나, 소비지 내에 포함된 이산화규소를 회수하기 위한 방법으로 본 발명을 활용할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
1-1. 융합단백질 제조
이산화규소와 친화적으로 결합 가능한 SBP(Silica binding peptide)는 Silaffin의 T8 도메인의 염기서열을 응용하여 도 1과 같이 융합단백질 MBP-SBP 의 아미노산 서열을 디자인하였다. 이를 MBP와 유전자 재조합 기술을 통하여 하나의 융합단백질인 MBP-SBP(Maltose binding protein-tagged Silica binding peptide)로 제작하였다.
1-2. 전분자성입자 제조
비커에 3차 증류수 200 mL와 100 mM Ferrous(Fe3 +), 50 mM Ferric(Fe2 +)을 정량하여 교반하며 분산시켜줬다. 교반 과정 중 70%(v/v) Ammonium Hydroxide를 10 mL 첨가하여 환원을 유도했다. 90℃ 항온수조에서 20분간 분자를 재배열하는 annealing 과정을 거친 뒤, 합성된 산화철 입자를 외부자력을 통해 잔여 Ammonuim Hydroxide로부터 분리 및 농축 후 70% 에탄올과 3차 증류수로 각 3회 세척했다. 외부자력을 이용하여 상층액을 제거한 뒤, 10 mM citrate 30 mL을 첨가하고 초음파 분사기로 (pulse 5s, amp 25% 30sec) 분산시켰다. 이후 자석을 이용하여 3차 증류수로 세척 및 분산시켜 자성입자를 제조하였다.
3%(w/v) 찰옥수수 전분을 sodium acetate buffer(pH 4) 50 mL에 분산시킨 뒤, 전자레인지를 이용하여 1분 30초 동안 호화시켰다. 호화된 전분 용액을 상온에서 37℃로 식힌 뒤, 가수분해 효소(pullulanase, 100 ASP/mL)를 첨가하여 16-24 시간동안 37℃ 인큐베이터에서 분지과정을 수행하였다. 20℃에서 13,000×g로 5분간 원심분리하여 상층액에 존재하는 단 사슬 글루칸(short chain glucan)을 회수하였다. 회수된 단 사슬 글루칸(glucan)과 상기 제조한 자성입자 10 mg/mL를 4℃에서 16-24 시간 동안 반응시켰다. 단 사슬 글루칸의 자가결합을 기반으로 초상자성 특성을 띠는 전분자성입자가 합성됐다. 광학현미경을 통해 입자의 평균 크기(1.3 μm)와 분산 안정성을 확인하고, 4℃에서 보관했다.
1-3. 복합체 제조
코니칼 튜브(conical tube)에 상기 제조한 전분자성입자(1 mg/mL)와 MBP-SBP(150 μg/mL)을 PBS buffer상에서 로테이터 30 rpm으로 30분간 교반했다. 외부 자력으로 이용하여 자성입자를 코니칼 튜브(conical tube) 벽면에 농축하고 잔여 MBP-SBP를 포함하고 있는 상층액을 제거했다. 이후 PBS buffer 10 mL로 3회 세척하여 4℃에서 보관했다.
실시예 2
전처리된 식품시료 10 mL을 20℃에서 13,000×g로 5분간 원심분리하여 침전된 성분만을 남기고 1 mg/mL의 리간드(MBP-SBP)가 수식된 자성입자 첨가하여 로테이터에서 30 rpm으로 30분간 교반했다. 용액 내 이산화규소가 결합된 복합체를 자석으로 벽면에 농축 후, 상층액을 모두 제거했다. 3차 증류수 10 mL을 첨가하여 vortexer로 수분산 시켰다. 상기 과정을 2회 반복했다.
실시예 3
자석을 이용하여 상층액이 제거된 상기 실시예 2에서 이산화규소가 결합된 복합체에 10 mM 맥아당 10 mL를 첨가했다. 맥아당이 첨가된 용액을 배쓰(bath)형 초음파 처리기를 통해 5분간 분산시켰다. 외부 자력을 통해 자성입자가 포함된 복합체를 벽면에 농축 후, 이산화규소가 용출된 상층액 10 mL을 유리 바이알(glass vial)에 옮겨 담아 이화학적 특성 분석에 사용했다.
실험예 1
본 발명의 이산화규소 검출용 조성물에 실라핀(Silaffin) 단백질 중 규조류 실리카 골격에 친화력을 가진 T8 시퀀스를 이용하여 식품첨가물 종류별(이산화규소, 이산화티타늄, 산화아연) 친화력 실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 1에 나타냈다.
도 1은 실시예 1의 복합체의 이산화규소에 대한 특이적 결합력 실험을 진행한 결과이다: (a)는 규조류의 골격을 형성하는 과정에 관여하는 실라핀(Silaffin) 단백질 중 규조류 실리카 골격(biosilica)에 친화력을 가지고 있는 T8 시퀀스를 이용하여 실리카 결합 펩타이드(Silica binding peptide, SBP)를 디자인한 것이고, (b) 본 발명의 복합체에 포함된 융합단백질의 발현에 사용된 재조합 플라스미드의 모식도이고, (c)는 실시예 1의 복합체와 산화아연, 이산화티타늄, 이산화규소와의 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 1을 살펴보면, 실시예 1의 복합체를 이용한 결합력 실험을 통해 본 발명의 복합체는 이산화규소와의 결합효율이 78% 이상인 것을 확인하였고, 비타겟 대조군인 산화아연과 이산화티타늄과는 결합하지 않는 것을 확인하였다.
실험예 2
본 발명의 이산화규소 검출용 조성물을 이용하여 이산화규소를 검출하고 분리하는 방법을 설명하기 위해서 실시예 1의 복합체와 수용액 상에 이산화규소를 반응시켜 결합체를 형성시켜 식품첨가물 이산화규소를 분리 및 회수하는 실험을 하였으며, 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2는 실시예 3과 같이 실시예 1의 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체를 이용하여 식품첨가물 이산화규소를 분리 및 회수하는 실험 결과로, (a)는 상기 복합체를 이용하여 식품첨가물 이산화규소의 분리 및 회수 과정을 나타낸 모식도이고, (b)는 시험관 내에서 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체에 의해 이산화규소가 농축 및 용출되는 과정을 촬영한 이미지이다.
도 2의 (a)를 살펴보면, 복합체에 결합된 이산화규소가 첨가해 준 맥아당(maltose)에 의해 복합체로부터 용출되는 것을 보여주는 모식도로, 맥아당이 융합단백질의 맥아당 결합부에 경쟁적으로 결합하면서 전분자성입자와 융합단백질이 분리되면서 이산화규소가 함께 떨어져 나오는 것이다. 도 2의 (b)를 살펴보면, 복합체를 이용하여 이산화규소를 분리 및 회수하는 과정을 보여주는 것으로, (i)는 이산화규소가 분산된 현탁액이다. (ii)는 융합단백질(MBP-SBP)을 포함하는 복합체를 첨가하여 이산화규소와 결합을 유도하고, 그 결합체를 외부자력을 이용하여 시험관의 오른쪽 벽에 농축시킨 것으로, 수분산 되어있던 이산화규소가 복합체의 자성입자와 결합 후 자석에 끌려 이동을 하여, 상층액이 투명해지는 것을 확인할 수 있다. (iii)는 맥아당을 첨가하면 융합단백질의 MBP가 맥아당으로 포화되어 전분자성입자 표면으로부터 분리되고 이산화규소도 함께 수용액으로 용출되어 상층액이 불투명해지는 것을 알 수 있다. 마지막으로 외부자력을 통해 자성입자를 제거해주고 용출된 이산화규소를 효율적으로 회수할 수 있다.
실험예 3
본 발명의 이산화규소 분리방법을 통해 식품첨가물로부터 분리된 이산화규소 입자의 특성을 확인하기 위해, 식품첨가물에 포함된 이산화규소를 복합체를 이용하여 자성분리 전/후의 이산화규소를 주사전자현미경으로 촬영하였고, 분리된 이산화규소의 입자크기를 측정하였으며, 이산화규소의 분리 및 회수 효율을 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3은 실시예 3의 이산화규소 분리방법에서 융합단백질을 포함하는 복합체를 이용한 자성분리 전/후 이산화규소 입자의 크기를 분석한 결과이다: (a)는 자성분리 전/후의 이산화규소를 주사전자현미경으로 촬영한 이미지와 주사전자현미경 사진에 해당하는 이산화규소 입자의 크기 분포도를 나타낸 그래프이고, (b)는 이산화규소의 분리 및 회수 효율을 나타낸 그래프이다.
도 3을 살펴보면, 자성분리 방법을 사용하여 모사 식품(카제인, 설탕)으로부터 이산화규소를 자성 분리 및 회수함으로써 기술의 적용성을 확인하였다. 도 3의 (a)를 살펴보면, 대표적인 식품 매트릭스인 카제인 또는 설탕과 섞었던 이산화규소를 자성 분리 후 이산화규소의 이화학적 특성을 주사전자현미경과 이산화규소 입자 크기 분포도를 통해 분석한 것으로, 자성 분리를 통해 분리한 이산화규소 입자의 크기는 원래 실험에 사용한 이산화규소(pristine)와 차이를 보이지 않았다. 도 3의 (b)를 살펴보면, 복합체(융합단백질+자성입자)를 이용하여 분리한 이산화규소 분리율 및 회수율로 식품 매트릭스 존재 하에도 식품첨가물 이산화규소를 선택적으로 분리할 수 있으며, 분리과정이 이산화규소의 이화학적 특성에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실험예 4
본 발명의 이산화규소 분리방법을 통해 건강기능식품으로부터 분리된 이산화규소 입자의 특성을 확인하기 위해, 가공식품(분말유가공품류, 커피믹스류 및 복합조미식품류)에 포함된 이산화규소를 실시예 1의 복합체를 이용하여 자성분리 전/후의 이산화규소를 주사전자현미경 및 투과전자현미경으로 촬영하였고, 현미경 사진을 이용하여 이산화규소 입자의 크기 분포도를 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4는 실시예 3의 이산화규소 분리방법에서 복합체를 이용한 자성분리 전/후 이산화규소 입자의 형태와 크기를 분석한 결과이다: (a)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시킨 형태를 촬용한 주사전자현미경 이미지이고, (b)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시켜 자성분리 후의 이산화규소를 주사전자현미경으로 촬영한 이미지와 입자크기 분포도이고, (c)는 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산시켜 자성분리 후의 이산화규소를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지와 입자크기 분포도 이다.
도 4를 살펴보면, 융합단백질(MBP-SBP)이 결합된 자성입자인 복합체를 이용하여 실제 식품으로부터 분리 및 회수한 이산화규소 입자의 형태와 크기를 주사전자현미경과 투과전자현미경을 통해 분석한 것으로, 3개 유형의 6개 가공식품을 수분산 시킨 후, 자성 분리법을 적용하여 분리한 이산화규소의 주사전자현미경 사진 및 입자크기분포도를 보면, 자성 분리 전 사진(a)에서는 이산화규소 입자의 형태와 크기는 식별이 되지 않으나, 자성 분리 후(b, c)에는 식품 매트릭스가 제거되고 이산화규소만 남아있는 것을 확인하였고, 비슷한 입자 크기를 갖는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 이산화규소 분리방법은 식품첨가물로 식품에 들어 있는 이산화규소의 정확한 이화학적 분석이 가능한 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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preparation method thereof, detecting and separating method of
silicon dioxide using the same
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<210> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Silica binding peptide
<400> 1
Lys Gln Gly Lys Thr Glu Met Ser Val Ala Asp Ala Lys Ala Ser Lys
1 5 10 15
Glu Ser Ser Met Pro Ser Ser Lys Ala Ala Lys Ile Phe Lys Gly Lys
20 25 30
Ser Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
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<223> Maltose binding peptide
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Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
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355 360 365
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Maltose binding protein-tagged Silica binding peptide
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435
Claims (22)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드; 및 자성입자;를 포함하는 복합체를 포함하고,
상기 리간드는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 리간드는 이산화규소 결합부 및 맥아당 결합부를 포함하는 융합단백질을 포함하고,
상기 맥아당 결합부는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물. - 제 2 항에 있어서,
상기 이산화규소 결합부는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물. - 제 2 항에 있어서,
상기 맥아당 결합부는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물. - 제 2 항에 있어서,
상기 융합단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 자성입자는 자성나노입자 또는 전분자성입자를 포함하는 이산화규소 검출용 조성물. - 제 6 항에 있어서,
상기 전분자성 입자는 단 사슬 글루칸(SCGs) 매트릭스; 및 상기 매트릭스 내부에 분산된 자성입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물. - 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드와 자성입자를 혼합하여 자성입자에 리간드를 결합시켜 복합체를 제조하는 단계를 포함하고,
상기 리간드는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 리간드는 이산화규소 결합부 및 맥아당 결합부를 포함하는 융합단백질을 포함하고,
상기 맥아당 결합부는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 융합단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 복합체를 제조하는 단계는 상기 리간드 및 자성입자가 분산된 용액을 10 내지 50 rpm으로 1분 내지 30분 동안 교반시키는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 자성입자는 자성나노입자 또는 전분자성입자를 포함하고,
상기 복합체를 제조하는 단계 이전에, 단 사슬 글루칸에 자성입자를 첨가하여 전분자성입자를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 전분자성입자를 제조하는 단계는,
(a-1) 탈분지효소 존재 하에서 젤라틴화된 옥수수 전분(WMS)을 반응시키는 단계; (a-2) 상기 (a-1) 단계의 생성물을 원심분리하여 단 사슬 글루칸(SCGs)을 제조하는 단계; 및 (a-3) 상기 (a-2) 단계에서 제조된 단 사슬 글루칸(SCGs)에 자성입자를 첨가하고 자기조립반응(self-assembly process)을 유도하는 단계;를 포함하는 이산화규소 검출용 조성물의 제조방법. - 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 리간드; 및 자성입자;를 포함하는 복합체를 소비재를 포함하는 현탁액에 첨가하여 이산화규소와 결합시키는 단계를 포함하고,
상기 리간드는 자성입자의 표면에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 복합체의 농도가 0.1 내지 5 mg/mL이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 10 내지 50 rpm으로 5분 내지 60분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 이산화규소와 결합시키는 단계는 상기 복합체에 포함된 리간드와 이산화규소의 친화력에 의해 복합체에 이산화규소가 결합하는 것을 특징으로 하는 이산화규소 검출방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 이산화규소와 결합시키는 단계 이후에, 이산화규소가 결합된 복합체를 외부자력으로 분리하여 상층액을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 이산화규소 검출방법. - 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 이산화규소 검출방법을 통해 형성된 이산화규소가 결합된 복합체에 1 내지 40 mM의 맥아당을 첨가하여 이산화규소를 용출시키는 단계; 및
상기 용출된 이산화규소를 외부자력을 이용하여 분리시키는 단계를 포함하고,
상기 복합체는 이산화규소 결합부 및 맥아당 결합부를 포함하는 융합단백질; 및 자성입자를 포함하는 이산화규소 분리방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 이산화규소를 용출시키는 단계는 이산화규소 결합된 복합체가 포함된 현탁액에 맥아당을 첨가하고, 초음파를 처리하여 1분 내지 20분 동안 분산시키는 것을 특징으로 하는 이산화규소 분리방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 이산화규소를 용출시키는 단계는 맥아당이 상기 복합체의 맥아당 결합부에 결합하여 이산화규소가 결합된 융합단백질이 복합체로부터 분리되면서 이산화규소가 용출되는 것을 특징으로 하는 이산화규소 분리방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 분리시키는 단계는 상기 용출된 이산화규소가 결합된 융합단백질을 포함하는 현탁액의 일면에 외부자력을 배치하여 자성입자를 일면에 고정시키고, 상층액만을 분리하여 이산화규소를 분리하는 것을 특징으로 하는 이산화규소 분리방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020220018749A KR102680766B1 (ko) | 2022-02-14 | 2022-02-14 | 식품첨가물 이산화규소 검출용 조성물, 이의 제조방법, 이를 이용한 이산화규소 검출 및 분리방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020220018749A KR102680766B1 (ko) | 2022-02-14 | 2022-02-14 | 식품첨가물 이산화규소 검출용 조성물, 이의 제조방법, 이를 이용한 이산화규소 검출 및 분리방법 |
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2022
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Patent Citations (2)
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Title |
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Lilin Zhou et al., J. Mater. Chem., 2012, Vol. 22, pp 6813-6818. 1부.* * |
NCBI Reference Sequence: XP_002286917.1, (2017), ‘silaffin protein’ from Thalassiosira pseudonana CCMP1335. 1부.* * |
V. C. Sheppard et al., Applied and environmental microbiology, 2012, Vol. 78, pp 211-218. 1부.* * |
Also Published As
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