KR20230110825A - 항-met 항체, met에 결합하는 이중특이적 항원 결합분자, 및 그 사용 방법 - Google Patents

항-met 항체, met에 결합하는 이중특이적 항원 결합분자, 및 그 사용 방법 Download PDF

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KR20230110825A
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met
amino acid
binding
acid sequence
seq
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로버트 밥
강 첸
크리스토퍼 달리
존 다실바
더글라스 맥도날드
토마스 니톨리
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

MET에 결합하는 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자 및 그 사용 방법이 본원에서 제공된다. 이중특이적 항원-결합 분자는 제1 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는데, 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 인간 MET의 세포외 도메인의 2개의 상이한 (바람직하게는 비-중첩) 에피토프에 결합한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 인간 MET와 그 리간드 HGF 간의 상호작용을 차단할 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자는, 예를 들어, 원치않는 MET 아고니스트 활성을 나타내는 성향이 있는 이중특이적 분자의 항원-결합 도메인 중 단 하나를 포함하는 1가 항원-결합 분자와 비교하여 최소한의 MET 아고니스트 활성을 나타내거나 MET 아고니스트 활성을 나타내지 않을 수 있다. 또한 세포독성제, 방사성 핵종, 또는 다른 모이어티에 결합된 본원에서 제공된 항체 또는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC), 뿐만 아니라 대상체에게 이중특이적 항원-결합 분자 또는 이것의 ADC를 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 포함된다.

Description

항-MET 항체, MET에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자, 및 그 사용 방법{ANTI-MET ANTIBODIES, BISPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULES THAT BIND MET, AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 항체, 이중특이적 항체, 및 이것의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 간세포 성장 인자 수용체 (c-Met 또는 MET)에 특이적으로 결합하여, MET 신호 변환을 조절하는 이러한 항체의 항체-약물 컨쥬게이트, 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
서열 목록
서열 목록의 공식 사본은 10316WO01_Sequence_Listing_ST25_2017_11_06.TXT의 파일명, 2017년 11월 6일의 생성일, 및 약 136 킬로바이트의 크기를 가진 ASCII 포맷화된 서열로서 EFS-Web을 통해 명세서와 동시에 전자적으로 제출된다. 이 ASCII 포맷화된 문서에 함유된 서열 목록은 명세서의 일부이며 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
간세포 성장 인자 (HGF) (산란 인자 [SF]라고 알려져 있음)는 HGF 수용체 (HGFR)와 상호작용하여 활성을 나타내는 헤테로다이머 파라크린 성장 인자이다. HGFR은 c-Met 종양 유전자의 생성물이고 MET로도 알려져 있다. MET는 이황화 브릿지를 통해 세포외 알파 사슬에 결합된 막관통 베타 사슬로 이루어진 수용체 티로신 키나아제이다. MET로의 HGF의 결합은 키나아제 MET의 키나아제 촉매 활성을 활성화시켜 베타 사슬의 Tyr 1234 및 Tyr 1235의 인산화 및 다운스트림 신호 전달 경로의 후속 활성화를 일으킨다.
MET 및/또는 HGF 과발현, 활성화, 또는 증폭은 비-소세포 폐 암종 (non-small cell lung carcinoma; NSCLC), 위, 난소, 췌장, 갑상선, 유방, 두경부, 결장 및 신장 암종과 관련이 있는 것으로 나타났다 (Sierra and Tsao, Ther. Adv. Med. Oncol., 3(1 Suppl): S21-S35, 2011). MET 증폭은 NSCLC 및 식도 위 악성 종양(oesophagogastric malignancy)에서 종양 형성의 핵심 동인인 것으로 생각된다. 이에 더하여, MET의 엑손 14 결실을 유도하는 돌연변이는 NSCLC의 서브세트에서 종양 형성의 동인으로 기술되어 있다. MET 유전자 증폭을 가진 종양 세포주는 성장 및 생존에 대하여 MET에 매우 의존적이다. 전임상 데이터는 MET 신호 전달이 다수의 종양 유형, 예컨대 NSCLC, 결장직장암, 및 두경부 편평 세포 암종 (head and neck squamous-cell carcinoma; HNSCC)에서 표적화된 요법에 대한 저항성과 관련이 있음을 나타낸다.
전임상 및 최근 임상 결과는 모두 이들 유전적 변화를 숨기고 있는 종양들이 MET 억제자에 반응한다는 것을 나타내며, 암의 동인으로서 MET를 입증한다. 다양한 1가 MET 차단 항체가 다양한 암의 치료를 위해 임상 개발 중에 있다 (미국 특허 번호 5,686,292; 5,646,036; 6,099,841; 7,476,724; 9,260,531; 및 9,328,173; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0349310 및 2005/0233960). 상기 항체들은 오나르투쥬맙 (MetMab) 및 에미베투쥬맙을 포함한다 (Xiang et al., Clin. Cancer Res. 19(18): 5068-78, 2013, 및 Rosen et al., Clin. Cancer Res., Published October 10, 2016, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1418). 이들 항체 중 일부는 리간드-의존적 MET 신호 전달을 차단하지만, 리간드-독립적 MET 활성화를 차단하는데에서는 효과적이지 않다.
리간드-의존적 및 리간드-독립적 MET 신호 전달 둘 다를 강력하게 차단하는 향상된 항암제에 대하여 중요한 충족되지 않은 의학적 필요성이 여전히 존재한다.
항체, 항체의 항원-결합 단편, 2가 단일특이적 항체의 조합, 및 인간 c-Met 수용체 단백질에 결합하는 이중특이적 항체 (MET x MET)가 본원에서 제공된다. 항체는, 그 중에서도, MET를 발현하는 종양 세포를 표적화하는데 유용하다. 항-MET 항체, 및 이것의 항원-결합 부분은 변형되지 않은 형태로 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 항체-약물 컨쥬게이트 또는 이중특이적 항체의 일부로서 포함될 수도 있다.
다른 구체예는 다음의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1은 본원에서 개시된 272개의 예시의 MET x MET 이중특이적 항체의 구성요소를 설명하는 매트릭스이다. 매트릭스의 각각의 넘버링된 세포는 "D1" 항원 결합 도메인 및 "D2" 항원 결합 도메인을 포함하는 독특한 이중특이적 항체를 식별하며, D1 항원 결합 도메인은 Y-축을 따라 나열된 상응하는 항-MET 항체의 면역글로불린 가변 도메인 (HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍) 또는 CDR을 포함하고, D2 항원 결합 도메인은 X-축을 따라 나열된 상응하는 항-MET 항체의 면역글로불린 가변 도메인 (HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍) 또는 CDR을 포함한다.
도 2는 SRE-루시퍼라아제 리포터 유전자 구조체를 함유하는 HEK293T 세포에서 항체-유도된 MET 경로 활성화, 또는 HGF-유도된 경로 활성화의 항체 차단을 평가하는데 사용된 루시퍼라아제-기반 리포터 검정의 개략도이다.
도 3(A-B)는 리터 당 로그 몰 단위의 항체 농도의 함수로서 SRE-루시퍼라아제 발현을 나타내는 상대적 발광 단위 (RLU)를 도시하는 선 그래프이다. 충전 사각형 (■)은 모체 2가 단일특이적 항체 H4H13306P2를 나타내고, 충전 피라미드 (▲)는 모체 2가 단일특이적 항체 H4H13312P2를 나타내고, 충전 원 (●)은 1가 항체를 나타내고, 충전 다이아몬드 (◆)는 아이소타입 대조군을 나타내고, 충전 역피라미드 (▼)는 리간드가 없음을 나타낸다. 도 3A는 HGF 리간드가 없는 항체 단독을 도시한다. 도 3B는 항체 플러스 HGF 리간드를 도시한다.
도 4(A-B)는 리터 당 로그 몰 단위의 항체 농도의 함수로서 SRE-루시퍼라아제 발현을 나타내는 상대적 발광 단위 (RLU)를 도시하는 선 그래프이다. 충전 사각형 (■)은 항-MET 1가 항체를 나타내고, 충전 원 (●)은 MET x MET 이중특이적 항체를 나타내고, 충전 다이아몬드 (◆)는 모체 항체 H4H13312P2를 나타낸다. 도 4A는 HGF 리간드가 없는 항체 단독을 도시한다. 도 4B는 항체 플러스 HGF 리간드를 도시한다.
도 5는 인간 2가 단일특이적 항-MET 항체 1-18, 대조군 항체 및 항-MET 1가 항체로의 처리의 함수로서 MET-증폭된 위암 SNU5 세포의 상대적인 세포 성장을 도시하는 막대 그래프이다. 비교의 목적으로, 항체 8 (가로 좌표)은 모체 항체 H4H13306P2이고, 항체 11 (가로 좌표)은 모체 항체 H4H13312P2이다.
도 6(A-B)는 MET x MET 이중특이적 항체, 대조군 항체 및 항-MET 1가 항체로의 처리의 함수로서 MET-증폭된 세포의 상대적인 세포 성장을 도시하는 막대 그래프를 포함한다. 도 6A는 대조군 항체, 0.1, 1 및 10 μg/mL의 1가 항체, 및 0.1, 1 및 10 μg/mL의 MET x MET 이중특이적 항체로의 처리의 함수로서 SNU5 세포의 상대적 성장을 도시한다. 도 6B는 대조군 항체 및 0.1 및 1 μg/mL의 MET x MET 이중특이적 항체로의 처리의 함수로서 EBC-1 세포의 상대적 성장을 도시한다.
도 7(A-B)는 대조군 항체 및 MET x MET 이중특이적 항체로 처리 후 Hs746T 세포로부터 추출된 pMET (인산화된 MET), MET, pErk (인산화된 Erk), 및 튜불린 (로딩 대조군)의 면역 블롯 (도 7A), 및 0, 2 및 6시간 동안 MET x MET 이중특이적 항체로 처리 후 Hs746T 세포에서 MET (및 로딩 대조군으로서 튜불린)의 발현 (도 7B)을 도시한다.
도 8은 대조군 항체, MET x MET 이중특이적 항체, 항-MET 단일특이적 2가 모체 항체 1, 항-MET 단일특이적 2가 모체 항체 2, 및 모체 항체 1과 2의 조합으로 처리 후 Hs746T 세포로부터 추출된 pMET, MET, pErk, 및 튜불린 (로딩 대조군)의 면역 블롯을 도시한다.
도 9는 2, 6 및 18시간 동안 대조군 항체 및 MET x MET 이중특이적 항체로 처리 후 Hs746T 세포에서 MET (및 로딩 대조군으로서 튜불린)의 발현의 면역 블롯을 도시한다.
도 10(A-B)는 대조군 항체 및 MET x MET 이중특이적 항체로 처리 후 SNU5 세포로부터 추출된 pMET, MET, pErk, 및 튜불린 (로딩 대조군)의 면역 블롯 (도 10A); 및 대조군 항체 및 항-MET 1가 항체로 처리 후 SNU5 세포에서 MET (및 로딩 대조군으로서 튜불린)의 발현 (도 10B)을 도시한다.
도 11은 대조군 항체 및 MET x MET 이중특이적 항체로 처리 후 EBC-1 세포로부터 추출된 pMET, MET, pErk, 및 튜불린 (로딩 대조군)의 면역 블롯을 도시한다.
도 12는 대조군 항체 (충전 사각형 ■), MET 1가 항체 (충전 원 ●), 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (충전 다이아몬드 ◆)로 처리된 동물에서 EBC-1 세포의 이식 후 일 단위의 시간의 함수로서 입방 밀리미터 단위의 EBC-1 종양 부피의 변화를 도시하는 선 그래프이다.
도 13(A-B)는 MET x MET 이중특이적 항체, 대조군 항체 및 항-MET 1가 항체로의 처리의 함수로서 MET-증폭된 세포의 상대적인 세포 성장을 도시하는 막대 그래프를 포함한다. 도 13A는 대조군 항체, MET x MET 이중특이적 항체, MET x MET 모체 단일특이적 항체 1, MET x MET 모체 단일특이적 항체 2, 및 모체 항체 1과 2의 조합으로 처리의 함수로서 Hs746T 세포의 상대적인 성장을 도시한다. 도 13B는 대조군 항체, 1, 10 및 25 μg/mL의 1가 항체, 및 1, 10 및 25 μg/mL의 MET x MET 이중특이적 항체로의 처리의 함수로서 Hs746T 세포의 상대적인 성장을 도시한다.
도 14는 대조군 항체 (C), MET x MET 이중특이적 항체 (MM), MET x MET 모체 단일특이적 항체 1 (M1), MET x MET 모체 단일특이적 항체 2 (M2), 모체 항체 1과 2의 조합 (M1M2), 및 MET-아고니스트 간세포 성장 인자 (HGF)로 처리의 함수로서 NCI-H596 세포의 상대적인 세포 성장을 도시하는 막대 그래프이다.
도 15는 대조군 항체 (충전 사각형 ■), MET 1가 항체 (충전 원 ●), 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (충전 다이아몬드 ◆)로 처리된 동물에서 Hs746T 세포의 이식 후 일 단위의 시간의 함수로서 입방 밀리미터 단위의 Hs746T 종양의 변화를 도시하는 선 그래프이다.
도 16A는 대조군 항체 (충전 사각형 ■), 1 mg/mL의 MET 1가 항체 (충전 원 ●), 10 mg/mL의 MET 1가 항체 (개방 원 ○), 1 mg/mL의 MET x MET 이중특이적 항체 (충전 다이아몬드 ◆), 또는 10 mg/mL의 MET x MET 이중특이적 항체 (개방 다이아몬드 ◇)로 처리된 동물에서 SNU5 세포의 이식 후 일 단위의 시간의 함수로서 입방 밀리미터 단위의 SNU5 종양 부피의 변화를 도시하는 선 그래프이다.
도 16B는 대조군 항체, 10 mg/kg의 항-MET 1가 항체, 및 10 mg/kg의 MET x MET 이중특이적 항체로 처리 후 마우스 이종이식 모델로부터 제거된 SNU5 종양으로부터 추출된 pMET, MET, 및 튜불린 (로딩 대조군)의 면역 블롯이다.
도 17은 대조군 항체 (충전 사각형 ■), MET 1가 항체 (충전 원 ●), 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (충전 다이아몬드 ◆)로 처리된 동물에서 U87-MG 세포의 이식 후 일 단위의 시간의 함수로서 입방 밀리미터 단위의 U87-MG 종양 부피의 변화를 도시하는 선 그래프이다.
도 18는 대조군 항체 (충전 사각형 ■), MET 1가 항체 (충전 원 ●), 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (개방 다이아몬드 ◇)로 처리된 동물에서 U118-MG 세포의 이식 후 일 단위의 시간의 함수로서 입방 밀리미터 단위의 U118-MG 종양 부피의 변화를 도시하는 선 그래프이다.
도 19는 메이탄시노이드 6의 합성을 설명하는 개략도이다.
도 20은 메이탄시노이드 중간물 1의 합성을 설명하는 계략도이다.
본 발명이 기술되기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되는 것이 아니며, 이러한 방법 및 조건은 달라질 수도 있기 때문이라는 것을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도는 없는 것으로 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 나열된 특정 수치에 관하여 사용될 때, 그 값이 나열된 값과 1% 이하만큼 다를 수도 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101 및 그 사이의 모든 값 (예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 등)을 포함한다.
본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 이 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
MET 단백질
표현 "MET", "c-Met", 등은, 본원에서 사용된 바와 같이, (1) 아이소폼 "a"의 미처리 프리프로단백질을 나타내는, 서열 번호:145에서 제시된 아미노산 서열, 및/또는 NCBI 등록 번호 NM_001127500.2에 제시된 아미노산 서열, (2) 아이소폼 "b"의 미처리 프리프로단백질을 나타내는, 서열 번호:146에서 제시된 아미노산 서열, 및/또는 NCBI 등록 번호 NM_000236.2에 제시된 아미노산 서열, (3) 아이소폼 "c"의 미처리 프리프로단백질을 나타내는, 서열 번호:147에서 제시된 아미노산 서열, 및/또는 NCBI 등록 번호 NM_001311330.1에 제시된 아미노산 서열, 및/또는 (3) 3개의 아이소폼 모두에 의해 공유되는 세포질 알파 서브유닛 (서열 번호:148) 및 막관통 베타 서브유닛 (각각 아이소폼 a, b 및 c의 서열 번호:149, 150, 또는 151)을 포함하는 성숙한 단백질을 포함하는, 인간 막 신장 수용체 티로신 키나아제를 말한다. 표현 "MET"는 모노머 및 멀티머 MET 분자 둘 다를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "모노머 인간 MET"는 임의의 멀티머화 도메인을 함유하거나 소유하지 않고 정상 조건 하에서 또 다른 MET 분자로의 직접적인 물리적 연결 없이 단일 MET 분자로서 존재하는 MET 단백질 또는 그 일부를 의미한다. 예시의 모노머 MET 분자는 서열 번호:152의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 "hMET.mmh"라고 불리는 분자이다 (예를 들어, 본원의 실시예 3 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "다이머 인간 MET"는 링커, 공유 결합, 비-공유 결합을 통해, 또는 멀티머화 도메인, 예컨대 항체 Fc 도메인을 통해 서로 연결된 두 개의 MET 분자를 포함하는 구조체를 의미한다. 예시의 다이머 MET 분자는 서열 번호:153의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 "hMET.mFc"라고 불리는 분자이다 (예를 들어, 본원의 실시예 3 참조).
본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 지시대상은 비-인간 종으로부터 유래된 것으로 명확하게 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버젼을 나타내는 것으로 의도된다. 따라서, 표현 "MET"는 비-인간 종, 예를 들어, "마우스 MET", "원숭이 MET", 등으로부터 유래된 것으로 명시되지 않는 한 인간 MET를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "세포 표면-발현된 MET"는 MET 단백질의 적어도 일부가 세포막의 세포외 측면에 노출되고 항체의 항원-결합 부분에 접근 가능하도록 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 표면 상에서 발현되는 하나 이상의 MET 단백질(들), 또는 이것의 세포외 도메인을 의미한다. "세포 표면-발현된 MET"는 일반적으로 MET 단백질을 발현하는 세포의 표면 상에서 발현된 MET 단백질을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 대안으로, "세포 표면-발현된 MET"는 일반적으로는 그 표면 상에서 인간 MET를 발현하지 않지만 그 표면 상에서 MET를 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면 상에서 발현된 MET 단백질을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
항-MET 항체 및 이것의 항원-결합 단편
한 양태에 따르면, 항-MET 항체 (예를 들어, 단일특이적 항-MET 항체)가 제공된다. 이 양태에 따르는 예시의 항-MET 항체는 본원의 표 1 및 2에서 나열된다. 표 1은 본원에서 개시된 이중특이적 항원-결합 분자 (본원에서 이중특이적 항원-결합 단백질과 교체 가능하게 사용됨)가 유래될 수도 있는 예시의 항-MET 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR), 경쇄 가변 영역 (LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 2는 예시의 항-MET 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 제시한다.
또한 MET에 특이적으로 결합하여 세포에서 MET 신호 전달 경로를 촉진하는 (예를 들어, 활성화시키는) 항체 또는 이것의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 MET 신호 전달의 활성화가 유익하거나 치료적으로 유용한 치료 설정에서 이러한 항체의 사용이 본원에서 제공된다. 이러한 아고니스트 항-MET 항체의 비-제한적 예는 본원에서 "H4H14636D"라고 불리는 항체, 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄 CDR (서열 번호: 28, 30, 32, 140, 142, 144) 및/또는 이것들의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (서열 번호: 26/138)을 포함하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에서 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함한다.
본원에서 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본원에서 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성한, 표 1에서 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 특정 구체예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 2/138, 10/138, 18/138, 26/138, 34/138, 42/138, 50/138, 58/138, 66/138, 74/138, 82/138, 90/138, 98/138, 106/138, 114/138, 122/138 및 130/138로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함한다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함한다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함한다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성한 표 1에서 나열된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCDR1 및 LCDR1 아미노산 서열 쌍 (HCDR1/LCDR1)을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 특정 구체예에서, HCDR1/LCDR1 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 4/140, 12/140, 20/140, 28/140, 36/140, 44/140, 52/140, 60/140, 68/140, 76/140, 84/140, 92/140, 100/140, 108/140, 116/140, 124/140 및 132/140으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)을 포함한다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성한 표 1에서 나열된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCDR2 및 LCDR2 아미노산 서열 쌍 (HCDR2/LCDR2)을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCDR2/LCDR2 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 특정 구체예에서, HCDR2/LCDR2 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 6/142, 14/142, 22/142, 30/142, 38/142, 46/142, 54/142, 62/142, 70/142, 78/142, 86/142, 94/142, 102/142, 110/142, 118/142, 126/142, 및 134/142로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함한다.
또한 본원에서 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성한 표 1에서 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 특정 구체예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 8/144, 16/144, 24/144, 32/144, 40/144, 48/144, 56/144, 64/144, 72/144, 80/144, 88/144, 96/144, 104/144, 112/144, 120/144, 128/144 및 136/144로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 본원에서 MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함한다. 특정 구체예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열 번호: 4-6-8-140-142-144, 12-14-16-140-142-144, 20-22-24-140-142-144, 28-30-32-140-142-144, 36-38-40-140-142-144, 44-44-48-140-142-144, 52-54-56-140-142-144, 60-62-64-140-142-144, 68-70-72-140-142-144, 76-78-80-140-142-144, 84-86-88-140-142-144, 92-94-96-140-142-144, 100-102-104-140-142-144, 108-110-112-140-142-144, 116-118-120-140-142-144, 124-126-128-140-142-144 및 132-134-136-140-142-144로 구성된 군으로부터 선택된다.
관련된 구체예에서, MET에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것에 의해 정의된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함한다. 예를 들어, MET에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호: 4-6-8-140-142-144, 12-14-16-140-142-144, 20-22-24-140-142-144, 28-30-32-140-142-144, 36-38-40-140-142-144, 44-44-48-140-142-144, 52-54-56-140-142-144, 60-62-64-140-142-144, 68-70-72-140-142-144, 76-78-80-140-142-144, 84-86-88-140-142-144, 92-94-96-140-142-144, 100-102-104-140-142-144, 108-110-112-140-142-144, 116-118-120-140-142-144, 124-126-128-140-142-144 및 132-134-136-140-142-144로 구성된 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함한다.
HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기술은 해당 분야에 널리 공지되어 있고 본원에서 개시된, 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하는데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하는데 사용될 수 있는 예시의 관례는, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적으로, Kabat 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하고, AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 접근법 사이의 협의안이다. 예를 들어, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989) 참조. 공용 데이터베이스가 또한 항체 내의 CDR 서열을 확인하는데 이용 가능하다.
또한 항-MET 항체 또는 그 일부를 암호화하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에서 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCVR 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
표 1에서 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCVR 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCDR1 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCDR2 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자가 제공되며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한 HCVR을 암호화하는 핵산 분자가 제공되는데, HCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것에 의해 정의된 바와 같다.
또한 LCVR을 암호화하는 핵산 분자가 제공되는데, LCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것에 의해 정의된 바와 같다.
또한 HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자가 제공되는데, HCVR은 표 1에서 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에서 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCVR 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 표 2에서 나열된 LCVR 핵산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이 양태에 따르는 특정 구체예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하며, HCVR 및 LCVR은 둘 다 표 1에서 나열된 동일한 항-MET 항체로부터 유래된다.
또한 항-MET 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 본원에서 제공된다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 상기 언급된 핵산 분자 중 어느 것, 즉, 표 1에서 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또한 이러한 벡터들이 도입되는 숙주 세포, 뿐만 아니라 항체 또는 항체 단편의 생산을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고, 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 그 일부를 생산하는 방법이 본 개시물의 범위 내에 포함된다.
변형된 글리코실화 패턴을 가진 항-MET 항체가 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 원치 않는 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형, 또는, 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성 (ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 없는 항체가 유용할 수도 있다 (Shield et al. (2002) JBC 277:26733 참조). 다른 용도로, 보체 의존적 세포 독성 (CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.
MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자
본 발명자는 MET로의 HGF 결합을 차단하는 특정 단일특이적 항-MET 항원 결합 분자가 MET 신호 전달 (치료 분자에 대하여 원치 않는 결과)을 강력하게 활성화시키는 성향이 있다는 것을 관찰하였다. 하지만, 본 발명자는 놀랍게도 MET 단백질 세포외 도메인 상의 2개의 별도의 에포트프에 동시에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자가 MET로의 리간드 결합을 차단하는데 효과적이지만 MET 신호 전달의 아고니즘을 거의 유발하지 않는다는 것을 발견하였다.
따라서, 제1 항원-결합 도메인 (본원에서 "D1"으로도 불림), 및 제2 항원-결합 도메인 (본원에서 "D2"로도 불림)을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 본원에서 제공된다. 이중특이적 항원-결합 분자에 의한 2개의 별도의 MET 에피토프의 동시 결합은 MET 신호 전달의 최소 활성화로 효과적으로 리간드를 차단한다.
인간 MET의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 (D1) 및 인간 MET의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인 (D2)를 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자는 본원에서 "MET x MET 이중특이적 항체", "MET x MET", 또는 다른 관련된 용어로 불릴 수도 있다. 일부 구체예에서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하고; 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함한다.
특정 구체예에서, MET x MET 이중특이적 항체의 D1 및 D2 도메인은 서로 비-경쟁적이다. MET로의 결합에 대한 D1과 D2 간의 비-경쟁은 D1과 D2가 유래되지 않은 각각의 단일특이적 항원 결합 단백질이 인간 MET로의 결합에 대하여 서로 경쟁하지 않는다는 것을 의미한다. 예시의 항원-결합 단백질 경쟁 검정은 해당 분야에 공지되어 있으며, 이것의 비-제한적 예는 본원의 다른 곳에서 기술되어 있다.
특정 구체예에서, D1 및 D2는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, MET 상의 상이한 (예를 들어, 비-중첩, 또는 부분적 중첩) 에피토프에 결합한다.
2개의 별도의 단일특이적 항-MET 항체의 항원-결합 도메인을 사용하여 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 구성될 수도 있다. 예를 들어, 단클론성 단일특이적 항-MET 항체의 컬렉션은 해당 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 생산될 수도 있다. 그렇게 생산된 개개의 항체는 MET 단백질로의 교차-경쟁에 대하여 서로에 대하여 쌍별로 테스트될 수도 있다. 2개의 상이한 항-MET 항체가 MET에 동시에 결합할 수 있으면 (즉, 서로 경쟁하지 않으면), 제1 항-MET 항체의 항원-결합 도메인 및 제2, 비-경쟁적 항-MET 항체의 항원-결합 도메인은 본 개시물에 따르는 단일 MET x MET 이중특이적 항체로 조작될 수 있다.
본 개시물에 따르면, 이중특이적 항원-결합 분자는 단일 다기능적 폴리펩타이드일 수 있거나, 또는 서로 공유 또는 비-공유 회합된 둘 이상의 폴리펩타이드의 멀티머 복합체일 수 있다. 본 개시물에 의해 명백해진 것처럼, MET 분자의 2개의 별도의 동일하지 않은 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 능력을 가진 임의의 항원 결합 구조체는 이중특이적 항원-결합 분자로 간주된다. 본원에서 기술된 이중특이적 항원-결합 분자 중 어느 것, 또는 그 변이체는 당업자에게 공지되어 있는 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술)을 사용하여 구성될 수도 있다.
항원-결합 도메인
본 개시물의 이중특이적 항원-결합 분자는 2개의 별도의 항원-결합 도메인 (D1 및 D2)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "항원-결합 도메인"은 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 스캐폴드-유형 분자, 펩타이드 디스플레이 분자, 또는 관심있는 특정 항원 (예를 들어, 인간 MET)에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드-함유 구조체를 포함한다. 용어 "~에 특이적으로 결합하는", 등은 본원에서 사용된 바와 같이 보통의 테스트 조건 하에서 항원-결합 도메인이 500 pM 이하의 해리 상수 (KD)를 특징으로 하는 특정 항원과 복합체를 형성하고, 다른 무관한 항원에는 결합하지 않는다는 것을 의미한다. "무관한 항원"은 서로 95% 미만의 아미노산 동일성을 갖는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.
본 개시물의 맥락에서 사용될 수 있는 항원-결합 도메인의 예시의 범주는 항체, 항체의 항원-결합 부분, 특정 항원과 특이적으로 상호작용하는 펩타이드 (예를 들어, 펩티바디), 특정 항원과 특이적으로 상호작용하는 수용체 분자, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 수용체의 리간드-결합 부분을 포함하는 단백질, 항원-결합 스캐폴드 (예를 들어, DARPins, HEAT 반복 단백질, ARM 반복 단백질, 테트라트라이코펩타이드(tetrarticopeptide) 반복 단백질, 및 자연 발생 반복 단백질, 등을 기반으로 하는 다른 스캐폴드 [예를 들어, Boersma and Pluckthun, 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857, 및 그 안에서 인용된 참고문헌 참조]), 및 이것들의 압타머 또는 일부를 포함한다.
2개의 분자가 서로 특이적으로 결합하는지를 결정하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명, 등을 포함한다. 예를 들어, 항원-결합 도메인은, 본 개시물의 맥락에서 사용된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정된 바와 같이 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 90 pM 미만, 약 80 pM 미만, 약 70 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5 pM 미만, 약 4 pM 미만, 약 2 pM 미만, 약 1 pM 미만, 약 0.5 pM 미만, 약 0.2 pM 미만, 약 0.1 pM 미만, 또는 약 0.05 pM 미만의 KD로 특정 항원 (예를 들어, 표적 분자 [T] 또는 내재화 효과기 단백질 [E]) 또는 그 일부에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다.
용어 "표면 플라스몬 공명"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, BIAcore™ 시스템 (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도 변화의 검출에 의한 실시간 상호작용의 분석을 허용하는 광학적 현상을 말한다.
용어 "KD"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 단백질-단백질 상호작용 (예를 들어, 항체-항원 상호작용)의 평형 해리 상수를 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 개시된 KD 값은 25℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 결정된 KD 값을 말한다.
상기 지시된 바와 같이, "항원-결합 도메인" (D1 및/또는 D2)은 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어질 수도 있다. 용어 "항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 항원 (예를 들어, 인간 MET)에 특이적으로 결합하거나 이것과 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이것의 멀티머 (예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불리는, 더 보존되는 영역이 산재하는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 다음 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상이한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체 (또는 이것의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수도 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수도 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석을 기초로 정의될 수도 있다.
본원에서 제공된 이중특이적 항원-결합 분자의 D1 및/또는 D2 구성요소는 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편", 등은 본원에서 사용된 바와 같이 임의의 자연 발생, 효소에 의해 획득 가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현과 관련된 단백질 가수분해 또는 재조합 유전자 조작 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수도 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고 및/또는, 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 이용 가능하거나, 또는 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성형태로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형시키거나, 추가하거나 또는 결실시키는 등을 위해 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 시퀀싱 및 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일-사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 유닛. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예를 들어 1가 나노바디, 2가 나노바디, 등), 소형 모듈 면역 약제 (SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인이 또한 본원에서 개시된 바와 같이 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수도 있고 일반적으로는 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이것들과 함께 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다.
VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 가진 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 서로에 관하여 임의의 적합한 배열로 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 다이머일 수도 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 다이머를 함유할 수도 있다. 대안으로, 항체의 항원-결합 단편은 모노머 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수도 있다.
특정 구체예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수도 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비-제한적인 예시의 구성형태는 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 상기 나열된 예시의 구성형태 중 임의의 것을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성형태에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 결합될 수도 있거나 또는 전체 또는 부분적 힌지 또는 링커 영역에 의해 결합될 수도 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이의 플렉시블(flexible) 또는 세미-플렉시블(semi-flexible) 결합을 발생시키는 적어도 2개 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수도 있다. 더욱이, 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 모노머 VH 또는 VL 도메인과의 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의한) 비-공유 회합에서 상기 나열된 가변 및 불변 도메인 구성형태 중 어느 것의 호모다이머 또는 헤테로다이머 (또는 다른 멀티머)를 포함할 수도 있다.
본원에서 제공된 이중특이적 항원-결합 분자는 인간 항체 및/또는 재조합 인간 항체, 또는 이것들의 단편을 포함하거나 이것들로 이루어질 수도 있다. 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가진 항체를 포함한다. 그럼에도 인간 항체는, 예를 들어, CDR 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 하지만, 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
본 개시물의 이중특이적 항원-결합 분자는 재조합 인간 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어질 수도 있다. 용어 "재조합 인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체 (하기 더 기술됨), 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 (하기 더 기술됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대하여 트랜스제닉인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 (예를 들어, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체를 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 하지만, 특정 구체예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대하여 트랜스제닉인 동물이 사용될 때, 생체 내 체세포 돌연변이 유발)을 거치고 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이것과 관련이 있지만, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있고 본원에서 개시된 이중특이적 항원-결합 분자를 구성하는데 사용될 수도 있다. 본 개시물의 맥락에서 사용될 수 있는 예시의 이중특이적 포맷은, 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄 (예를 들어, 놉-인투-홀, 등을 갖는 공통 경쇄), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷을 포함한다 (상기 언급된 포맷의 검토를 위해, 예를 들어, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 및 그 안에서 인용된 참고문헌 참조).
본원에서 제공되는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 예시의 항원-결합 도메인 (D1 및 D2)은 본원에서 개시된 항-MET 항체 중 어느 것으로부터 유래된 항원-결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 본 개시물은 표 1에서 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다.
또한 표 1에서 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것, 또는 그것들에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 본원에서 제공된다.
표 1에서 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성한 표 1에서 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 본원에서 제공된다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다.
또한 표 1에서 나열된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 본원에서 제공된다.
또한 표 1에서 나열된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
또한 표 1에서 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그것들의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
또한 표 1에서 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성한 표 1에서 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다. 특정 구체예에 따르면, 본 개시물은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
관련된 구체예에서, 본 개시물은 표 1에서 나열된 예시의 항-MET 항체 중 어느 것에 의해 정의된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 D1 또는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다.
본원에서 제공된 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 표 1의 항-MET 항체 중 어느 것으로부터 유래된 D1 항원-결합 도메인, 및 표 1의 임의의 다른 항-MET 항체로부터 유래된 D2 항원-결합 도메인을 포함할 수도 있다. 본 개시물의 MET x MET 이중특이적 항체의 비-제한적 예는 도 1에서 도시되어 있다. 도 1은 272개의 예시의 MET x MET 이중특이적 항체의 구성요소를 예시하는 매트릭스이다. 매트릭스의 각각의 넘버링된 세포 (1 내지 272로 넘버링됨)는 Y-축을 따라 나열된 상응하는 항-MET 항체의 면역글로불린 가변 도메인 (HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍) 또는 CDR을 포함하는 "D1" 항원 결합 도메인 및 X-축을 따라 나열된 상응하는 항-MET 항체의 면역글로불린 가변 도메인 (HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍) 또는 CDR을 포함하는 "D2" 항원 결합 도메인을 포함하는 독특한 이중특이적 항체를 확인한다. 따라서, 예를 들어, 매트릭스에서 나타난 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자 "번호 10"은 예시의 항-MET 항체 H4H13290P2의 HCVR/LCVR 쌍, 또는 6-CDR 세트를 포함하는 D1 항원-결합 도메인, 및 예시의 항-MET 항체 H4H13321P2의 HCVR/LCVR 쌍, 또는 6-CDR 세트를 포함하는 D2 항원-결합 도메인을 포함한다. 본원에서 제공된 MET x MET 이중특이적 항체의 추가적인 예는 본원의 실시예 4에서 기술되어 있다.
비-제한적인 예시의 예에서, 본 개시물은 서열 번호: 58/138의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍, 또는 서열 번호: 60-62-64-140-142-144를 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR의 세트 (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 D1 항원-결합 도메인 및 서열 번호: 82/138의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍, 또는 서열 번호: 84-86-88-140-142-144를 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR의 세트 (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 이들 서열 특성을 가진 예시의 MET x MET 이중특이적 항체는 이중특이적 항체 번호 122라고도 불리는, H4H14639D라고 지정된 이중특이적 항체이며, 이것은 H4H13306P2로부터 유래된 D1 및 H4H13312P2로부터 유래된 D2를 포함한다 (본원에서 실시예 4, 표 5 참조).
추가의 비-제한적인 예시의 예로서, 본 개시물은 서열 번호: 18/138의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍, 또는 서열 번호: 20-22-24-140-142-144를 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR의 세트 (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 D1 항원-결합 도메인 및 서열 번호: 82/138의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍, 또는 서열 번호: 84-86-88-140-142-144를 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR의 세트 (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 D2 항원-결합 도메인을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 이들 서열 특성을 가진 예시의 MET x MET 이중특이적 항체는 이중특이적 항체 번호 42라고도 불리는, H4H14635D로 지정된 이중특이적 항체이며, 이것은 H4H13295P2로부터 유래된 D1 및 H4H13312P2로부터 유래된 D2를 포함한다 (본원에서 실시예 4, 표 5 참조).
멀티머화 구성요소
특정 구체예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항원-결합 분자는 또한 하나 이상의 멀티머화 구성요소(들)를 포함할 수도 있다. 멀티머화 구성요소는 항원-결합 도메인 (D1 및 D2) 사이의 회합을 유지하는 기능을 할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "멀티머화 구성요소"는 동일한 또는 유사한 구조 또는 구성의 제2 멀티머화 구성요소와 회합할 수 있는 능력을 가진 임의의 거대 분자, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 아미노산이다. 예를 들어, 멀티머화 구성요소는 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드일 수도 있다. 멀티머화 구성요소의 비-제한적 예는 면역글로불린의 Fc 부분, 예를 들어, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 뿐만 아니라 각각의 아이소타입 군 내의 임의의 알로타입(allotype)으로부터 선택된 IgG의 Fc 도메인이다. 특정 구체예에서, 멀티머화 구성요소는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는, 길이가 1 내지 약 200개의 아미노산인 Fc 단편 또는 아미노산 서열이다. 다른 구체예에서, 멀티머화 구성요소는 시스테인 잔기, 또는 짧은 시스테인-함유 펩타이드이다. 다른 멀티머화 도메인은 류신 지퍼, 헬릭스-루프(helix-loop) 모티프, 또는 코일드-코일(coiled-coil) 모티프를 포함하거나 이것들로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항원-결합 분자는 2개의 멀티머화 도메인, M1 및 M2를 포함하는데, D1은 M1에 부착되고 D2는 M2에 부착되며, M1과 M2의 회합은 단일 이중특이적 항원-결합 분자에서 D1과 D2의 서로 간의 물리적 결합을 용이하게 한다. 특정 구체예에서, M1 및 M2는 서로 동일하다. 예를 들어, M1은 특정 아미노산 서열을 가진 Fc 도메인일 수 있고, M2는 M1과 동일한 아미노산 서열을 가진 Fc 도메인이다. 대안으로, M1 및 M2는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서로 상이할 수도 있다. 예를 들어, M1은 제1 면역글로불린 (Ig) CH3 도메인을 포함할 수도 있고 M2는 제2 Ig CH3 도메인을 포함할 수도 있으며, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 서로 적어도 하나의 아미노산만큼 다르고, 적어도 하나의 아미노산의 차이는 동일한 M1 및 M2 서열을 가진 참조 구조체와 비교하여 단백질에 대한 표적화 구조체의 결합을 감소시킨다. 한 구체예에서, M1의 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고 M2의 Ig CH3 도메인은 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링에 의해; EU 넘버링에 의해서는 H435R)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이를 함유한다. M2의 CH3은 Y96F 변형 (IMGT에 의해; EU에 의해서는 Y436F)을 더 포함할 수도 있다. M2의 CH3 내에서 발견될 수도 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 Fc 도메인의 경우에는 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 Fc 도메인의 경우에는 N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 Fc 도메인의 경우에는 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I).
본 개시물의 이중특이적 항원-결합 분자는 "단리될" 수도 있다. "단리된 이중특이적 항원-결합 분자"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 천연 환경의 적어도 하나의 구성요소로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 이중특이적 항원-결합 분자를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 구성요소, 또는 항체가 생산되는 조직 또는 세포로부터 분리 또는 제거된 이중특이적 항체가 본 개시물의 목적을 위한 "단리된 이중특이적 항체"이다. 단리된 이중특이적 항원-결합 분자는 또한 재조합 세포 내 제자리(in situ)의 분자를 포함한다. 단리된 이중특이적 항원-결합 분자는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 분자이다. 특정 구체예에 따르면, 단리된 이중특이적 항원-결합 분자는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수도 있다.
본원에서 개시된 이중특이적 항원-결합 분자, 또는 이것의 항원-결합 도메인 (D1 및/또는 D2)은 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 도메인이 유래된 상응하는 생식계열 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수도 있다. 이러한 돌연변이는 본원에서 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공용 항체 서열 데이터베이스로부터 이용 가능한 생식계열 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 개시물은 본원에서 개시된 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 유래된 본원에서 개시된 이중특이적 항원-결합 분자, 또는 이것의 항원-결합 도메인 (D1 및/또는 D2)을 포함하며, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에서 하나 이상의 아미노산이 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (이러한 서열 변화는 본원에서 통틀어서 "생식계열 돌연변이"라고 불린다).
당업자는, 본원에서 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 이상의 개개의 생식계열 돌연변이 또는 이것들의 조합을 포함하는 많은 이중특이적 항원-결합 분자, 또는 이것의 항원-결합 도메인 (D1 및/또는 D2)을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구체예에서, VH 및/또는 VL 도메인 내 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유래된 원래의 생식계열 서열에서 발견된 잔기로 역돌연변이된다. 다른 구체예에서, 단지 특정한 잔기만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 내 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기만이, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식계열 서열로 역돌연변이된다. 다른 구체예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식계열 서열 (즉, 항체가 원래 유래된 생식계열 서열과 상이한 생식계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다.
또한, 본 개시물의 이중특이적 항원-결합 분자, 또는 이것의 항원-결합 도메인 (D1 및/또는 D2)은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에서 둘 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수도 있으며, 예를 들어, 특정한 개개의 잔기는 특정한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 원래의 생식계열 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 얻어지면, 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 이중특이적 항원-결합 분자, 또는 이것의 항원-결합 도메인 (D1 및/또는 D2)은 하나 이상의 원하는 성질, 예컨대 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선된 또는 향상된 길항적 또는 작용적 생물학적 성질 (경우에 따라), 감소된 면역원성, 등에 대하여 쉽게 테스트될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 얻어진 이중특이적 항원-결합 분자, 또는 이것의 항원-결합 도메인 (D1 및/또는 D2)이 본 개시물 내에 포함된다.
변이체
본 개시물은 본원에서 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것의 변이체를 포함하는 항-MET 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 이 양태 내에 포함되는 예시의 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 가진 본원에서 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 본 개시물은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것에 관하여, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 등의 보존적 아미노산 치환을 가진 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 가진 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다.
본 개시물의 이 양태 내에 포함된 예시의 변이체는 또한 본원에서 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것에 대하여 실질적인 서열 동일성을 가진 변이체를 포함한다. 아미노산 서열의 맥락에서 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 예컨대 기본 갭(gap) 중량을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 2개의 아미노산 서열이 적어도 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 다르다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가진 측쇄 (R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 서로 보존적 치환만큼 다른 경우에, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질에 대하여 보정하기 위해 상향 조정될 수도 있다. 이러한 조정을 이루는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 참조 (본원에 참조로 포함됨). 유사한 화학적 성질을 가진 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존적 대체는 Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445 (본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당히 보존적인" 대체는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 비음의 값을 갖는 임의의 변화이다.
2개의 상이한 아미노산 서열 간 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 서열 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다른 변형에 할당된 유사성의 측정값을 사용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련된 폴리펩타이드, 예컨대 상이한 종의 유기체의 상동성 폴리펩타이드 사이에서, 또는 야생형 단백질 및 이것의 돌연변이 단백질 사이에서 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 기본 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit와 같은 프로그램을 함유한다. 예를 들어, GCG Version 6.1 참조. 폴리펩타이드 서열은 또한 기본 또는 권장 파라미터를 사용하는 FASTA, GCG Version 6.1의 프로그램을 사용하여 비교될 수 있다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 문제 서열 및 검색 서열 간의 최선의 중첩의 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다 (Pearson (2000) supra). 본원에서 제공된 서열을 상이한 유기체의 많은 서열을 함유하는 데이터베이스에 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 기본 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 참조 (각각 본원에 참조로 포함됨).
Fc 변이체를 포함하는 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자
본원에서 제공된 특정 구체예에 따르면, 예를 들어, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 FcRn 수용체로의 항체 결합을 향상시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원 결합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 본 개시물은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원 결합 단백질을 포함하며, 돌연변이(들)는 산성 환경에서 (예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위에 있는 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여될 때 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수도 있다. 이러한 Fc 변형의 비-제한적 예는, 예를 들어, 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F); 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T), 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308 (예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들어, 본 개시물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원 결합 단백질을 포함한다: 250Q 및 248L (예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예를 들어, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F (예를 들어, H433K 및 N434F). 상기 언급된 Fc 돌연변이의 모든 가능한 조합, 및 본원에서 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이는 본 개시물의 범위 내에서 고려된다.
본원에서 제공된 항원-결합 분자의 생물학적 특성
높은 친화도로 모노머 인간 MET에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본 개시물은 25℃ 또는 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 약 230 nM 미만의 KD로인간 MET (예를 들어, hMET.mmh)에 결합하는 항-MET 항체를 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 230 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 또는 약 3 nM 미만의 KD로 모노머 인간 MET에 결합하는 항-MET 항체가 제공된다.
본 개시물은 또한 25℃ 또는 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 1분 초과의 해리성 반감기 (t½)를 갖는 모노머 인간 MET (예를 들어, hMET.mmh)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 1분 초과, 약 2분 초과, 약 4분 초과, 약 6분 초과, 약 8분 초과, 약 10분 초과, 약 12분 초과, 약 14분 초과, 약 16분 초과, 약 18분 초과, 또는 약 20분 초과, 또는 그 이상의 t½을 갖는 모노머 인간 MET에 결합하는 항-MET 항체가 제공된다.
높은 친화도로 다이머 인간 MET (예를 들어, hMET.mFc)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본 개시물은 25℃ 또는 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 3 nM 미만의 KD로 다이머 인간 MET에 결합하는 항-MET 항체를 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 0.9 nM 미만, 약 0.8 nM 미만, 약 0.7 nM 미만, 약 0.6 nM 미만, 약 0.5 nM 미만, 약 0.4 nM 미만, 약 0.3 nM 미만, 또는 약 0.25 nM 미만의 KD로 다이머 인간 MET에 결합하는 항-MET 항체가 제공된다.
또한 25℃ 또는 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 4분 초과의 해리성 반감기 (t½)를 갖는 다이머 인간 MET (예를 들어, hMET.mFc)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 특정 구체예에 따르면, 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 4분 초과, 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 105분 초과, 또는 그 이상의 t½을 갖는 다이머 인간 MET에 결합하는 항-MET 항체가 제공된다.
또한 25℃ 또는 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 5에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 10분 초과의 해리성 반감기 (t½)를 갖는 다이머 인간 MET (예를 들어, hMET.mFc)에 결합하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이 본원에서 제공된다. 특정 구체예에 따르면, 37℃에서, 예를 들어, 본원의 실시예 5에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 200분 초과, 약 300분 초과, 약 400분 초과, 약 500분 초과, 약 600분 초과, 약 700분 초과, 약 800분 초과, 약 900분 초과, 약 1000분 초과, 약 1100분 초과, 또는 그 이상의 t½을 갖는 다이머 인간 MET에 결합하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이 제공된다.
또한, 예를 들어, 시험관 내 리간드-결합 검정에서 HGF 및 MET 사이의 상호작용을 차단하는 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공된 특정 구체예에 따르면, 인간 MET를 발현하는 세포로의 HGF를 차단하고 HGF 신호 전달의 부재 하에 최소한의 MET 활성화를 유도하거나 MET 활성화를 유도하지 않는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 본 개시물은 D1 또는 D2 단독을 포함하는 단일특이적 항체를 사용하는 동등 활성 리포터 검정에서 관찰된 MET 아고니스트 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만인, 세포-기반 MET 활성 리포터 검정에서 MET 아고니스트 활성의 정도를 나타내는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 제공한다.
본 개시물의 항체 및 항원-결합 단백질은 상기 언급된 생물학적 특성 중 하나 이상, 또는 이것들의 임의의 조합을 소유할 수도 있다. 항체의 생물학적 특성의 상기 언급된 목록이 완전한 것은 아니다. 본원에서 제공된 항체의 다른 생물학적 특성들은 본원의 작동예를 포함한 본 개시물의 검토로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)
세포독성제, 화학치료제, 또는 방사성 동위원소와 같은 치료적 모이어티에 컨쥬게이션된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)가 본원에서 제공된다.
세포독성제는 세포의 성장, 생존 또는 증식에 해로운 임의의 작용제를 포함하며, 제한되는 것은 아니지만, 튜불린-상호작용제 및 DNA-손상제를 포함한다. 본 개시물의 이 양태에 따라 항-MET 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는, 예를 들어, 1-(2클로로에틸)-1,2-다이메탄설포닐 히드라지드, 1,8-다이하이드록시-바이사이클로[7.3.1]트라이데카-4,9-디엔-2,6-디인-13-온, 1-데하이드로테스토스테론, 5-플루오로유라실, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 9-아미노 캄프토테신, 액티노마이신 D, 아마니틴, 아미노프테린, 안구이딘, 안트라사이클린, 안트라마이신 (AMC), 아우리스타틴, 블레오마이신, 부설판, 부티르산, 칼리케아미신 (예를 들어, 칼리케아미신 γ1), 캄프토테신, 카르미노마이신, 카르무스틴, 세마도틴, 시스플라틴, 콜치신, 콤브레타스타틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 사이토칼라신 B, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데카르바진, 다이아세톡시펜틸독소루비신, 디브로모만니톨, 다이하이드록시 안트라신 디온, 디소라졸, 돌라스타틴 (예를 들어, 돌라스타틴 10), 독소루비신, 듀오카르마이신, 에치노마이신, 엘레우테로빈, 에메틴, 에포틸론, 에스페라미신, 에스트라무스틴, 에티듐 브로마이드, 에토포시드, 플루오로유라실, 겔다나마이신, 그라미시딘 D, 글루코코르티코이드, 이리노테칸, 키네신 스핀들 단백질 (KSP) 억제자, 렙토마이신, 류로신, 리도카인, 로머스틴 (CCNU), 메이탄시노이드, 메클로르에타민, 멜팔란, 메르카토퓨린, 메토프테린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, N8-아세틸 스페르미딘, 포도필로톡신, 프로카인, 프로프라놀롤, 프테리딘, 퓨로마이신, 피롤로벤조디아제핀 (PBDs), 리족신, 스트렙토조토신, 탈리소마이신, 탁솔, 테노포시드, 테트라카인, 티오에파 클로람부실, 토마이마이신, 토포테칸, 튜불리신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈오렐빈, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 유도체를 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 항-MET 항체에 컨쥬게이션된 세포독성제는 메이탄시노이드, 예컨대 DM1 또는 DM4, 토마이마이신 유도체, 또는 돌라스타틴 유도체이다. 특정 구체예에 따르면, 항-MET 항체에 컨쥬게이션된 세포독성제는 아우리스타틴, 예컨대 MMAE, MMAF, 또는 이것들의 유도체이다. 해당 분야에 공지된 다른 세포독성제는 본 개시물의 범위 내에서 고려되며, 예를 들어, 단백질 독소, 예컨대 리신, 클로스트리듐 디피실레(C. difficile) 독소, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 리신, 디프테리아 독소, 보툴리늄 독소, 브리오딘, 사포린, 포크위드(pokeweed) 독소 (즉, 피토라카톡신 및 피토라시게닌), 등, 예컨대 Sapra et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138:452-469에 제시된 것들을 포함한다.
특정 구체예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신의 유도체이다. 적합한 메이탄시노이드는 DM1, DM4, 또는 이것들의 유도체, 입체이성질체, 또는 동위원소를 포함한다. 적합한 메이탄시노이드는 또한 WO 2014/145090A1, WO 2015/031396A1, US 2016/0375147A1, 및 US 2017/0209591A1 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음 구조를 갖는다:
상기 식에서 A는 선택적으로 치환된 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이다.
일부 구체예에서, 메이탄시노이드 다음 구조를 갖는다:
상기 식에서 A는 선택적으로 치환된 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이다.
일부 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음 구조를 갖는다:
상기 식에서 n은 1-12의 정수이고 R1은 알킬이다.
일부 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
일부 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
일부 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
또한 하나 이상의 방사성 핵종에 컨쥬게이션된 항-MET 항체를 포함하는 항체-방사성 핵종 컨쥬게이트 (ARC)가 본원에서 제공된다. 본 개시물의 이 양태의 맥락에서 사용될 수 있는 예시의 방사성 핵종은, 예를 들어, 225Ac, 212Bi, 213Bi, 131I, 186Re, 227Th, 222Rn, 223Ra, 224Ra, 및 90Y를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 제공된 특정 구체예에서, 링커 분자를 통해 세포독성제 (예를 들어, 상기 개시된 세포독성제 중 어느 것)에 컨쥬게이션된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 포함하는 ADC가 제공된다. 링커는 본원에서 기술된 항체 또는 항원-결합 단백질을 치료적 모이어티, 예를 들어, 세포독성제와 결합, 연결, 또는 결합시키는 임의의 기 또는 모이어티이다. 적합한 링커는, 예를 들어, Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins; Phillips, G. L., Ed.; Springer Verlag: New York, 2013; Antibody-Drug Conjugates; Ducry, L., Ed.; Humana Press, 2013; Antibody-Drug Conjugates; Wang, J., Shen, W.-C., and Zaro, J. L., Eds.; Springer International Publishing, 2015 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 발견될 수도 있다. 일반적으로, 본원에서 기술된 항체 컨쥬게이트에 적합한 결합제 링커는 항체의 순환 반감기를 이용하기에 충분히 안정하고, 동시에, 컨쥬게이트의 항원-매개된 내재화 이후 그것의 페이로드(payload)를 방출할 수 있는 것들이다. 링커는 분열 가능하거나 분열 가능하지 않을 수 있다. 분열 가능한 링커는 내재화 이후 세포내 대사, 예를 들어, 가수분해, 환원, 또는 효소 반응을 통한 분열에 의해 분열되는 링커를 포함한다. 분열 불가능한 링커는 내재화 이후 항체의 리소솜 분해를 통해 부착된 페이로드를 방출하는 링커를 포함한다. 적합한 링커는 산-불안정 링커, 가수분해-불안정 링커, 효소적으로 분열 가능한 링커, 환원 불안정 링커, 자기-희생 링커, 및 비-분열 가능한 링커를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 링커는 또한 펩타이드, 글루쿠로니드, 숙신이미드-티오에테르, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유닛, 히드라존, 말-카프로일 유닛, 다이펩타이드 유닛, 발린-시트룰린 유닛, 및 파라-아미노벤질 (PAB) 유닛이거나 이것들을 포함하는 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
해당 분야에 공지된 임의의 링커 분자 또는 링커 기술은 본 개시물의 ADC를 생성하거나 구성하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 링커는 분열 가능한 링커이다. 다른 구체예에 따르면, 링커는 비-분열 가능한 링커이다. 본 개시물의 맥락에서 사용될 수 있는 예시의 링커는, 예를 들어, MC (6-말레이미도카프로일), MP (말레이미도프로파노일), val-cit (발린-시트룰린), val-ala (발린-알라닌), 프로테아제-분열 가능한 링커에서 다이펩타이드 부위, ala-phe (알라닌-페닐알라닌), 프로테아제-분열 가능한 링커에서 다이펩타이드 부위, PAB (p-아미노벤질옥시카르보닐), SPP (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트), SMCC (N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트), SIAB (N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트), 및 이것들의 변이체 및 조합을 포함하거나 이것들로 이루어진 링커를 포함한다. 본 개시물의 맥락에서 사용될 수 있는 링커의 추가적인 예는, 예를 들어, US 7,754,681 및 Ducry, Bio컨쥬게이트 Chem., 2010, 21:5-13, 및 그 안에서 인용된 참고문헌 (이것들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제공된다.
특정 구체예에서, 링커는 생리학적 조건에서 안정하다. 특정 구체예에서, 링커는 분열 가능하며, 예를 들어, 효소의 존재 하에 또는 특정한 pH 범위 또는 값에서 적어도 페이로드 부분을 방출할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 효소-분열 가능한 모이어티를 포함한다. 예시의 효소-분열 가능한 모이어티는 펩타이드 결합, 에스터 결합, 히드라존, 및 이황화 결합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 링커는 카텝신-분열 가능한 링커를 포함한다.
일부 구체예에서, 링커는 비-분열 가능한 모이어티를 포함한다.
적합한 링커는 또한 단일 결합제, 예를 들어, 항체의 2개의 시스테인 잔기에 화학적으로 결합된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 링커는 컨쥬게이션 과정의 결과로서 붕괴된 항체의 이황화 결합을 모방하는 역할을 할 수 있다.
일부 구체예에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 적합한 아미노산은 천연, 비-천연, 표준, 비-표준, 단백질 생성, 비-단백질 생성, 및 L- 또는 D-α-아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 알라닌, 발린, 글리신, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 또는 시트룰린, 이것들의 유도체, 또는 이것들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 아미노산의 하나 이상의 측쇄는 측쇄 기에 결합되며, 하기 기술되어 있다. 일부 구체예에서, 링커는 발린 및 시트룰린을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 리신, 발린, 및 시트룰린을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 리신, 발린, 및 알라닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 발린 및 알라닌을 포함한다.
일부 구체예에서, 링커는 자기-희생 기를 포함한다. 자기-희생 기는 당업자에게 공지된 임의의 이러한 기일 수 있다. 특정 구체예에서, 자기-희생 기는 p-아미노벤질 (PAB), 또는 이것의 유도체이다. 유용한 유도체는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PABC)을 포함한다. 당업자는 자기-희생 기가 페이로드로부터 링커의 남아있는 원자를 방출하는 화학 반응을 수행할 수 있다는 것을 인정할 것이다.
일부 구체예에서, 링커는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체 또는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고 (예를 들어, 리신 잔기를 통해) 는 세포독성제 (예를 들어, DM1)에 대한 결합이다. 일부 구체예에서, 링커는 다음과 같다:
상기 식에서 항체 또는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고 (예를 들어, 리신 잔기를 통해) 는 세포독성제 (예를 들어, DM1)에 대한 결합이다. 특정 구체예에서, 링커는 다음과 같다:
특정 구체예에서, 링커는 다음과 같다:
일부 구체예에서, 링커는 말레이미딜메틸-4-트랜스-사이클로헥산카르복시숙시네이트로부터 유래된다:
일부 구체예에서, 링커는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체 또는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고 (예를 들어, 리신 잔기를 통해) 는 세포독성제 (예를 들어, 다음 화학식을 가진 화합물)에 대한 결합이다:
본 개시물은 링커가 항체 또는 항원-결합 분자 내 특정 아미노산에서의 부착을 통해 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 약물 또는 세포 독소에 연결시키는 ADC를 포함한다. 이 양태의 맥락에서 사용될 수 있는 예시의 아미노산 부착, 예를 들어, 리신 (예를 들어, US 5,208,020; US 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; US 5,714,586; US 2013/0101546; 및 US 2012/0585592 참조), 시스테인 (예를 들어, US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; 및 US 7,750,116 참조), 셀레노시스테인 (예를 들어, WO 2008/122039; 및 Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456 참조), 포르밀 글리신 (예를 들어, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, 및 Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067 참조), 비-천연 아미노산 (예를 들어, WO 2013/068874, 및 WO 2012/166559 참조), 및 산성 아미노산 (예를 들어, WO 2012/05982 참조). 링커는 또한 탄수화물에 대한 부착 (예를 들어, US 2008/0305497, WO 2014/065661, 및 Ryan et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127-130 참조) 및 이황화 링커 (예를 들어, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, 및 Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313)를 통해 항원-결합 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 부위 특이적 컨쥬게이션 기술은 또한 항체 또는 항원 결합 단백질의 특정 잔기에 대한 직접적인 컨쥬게이션에 이용될 수 있다 (예를 들어, Schumacher et al. J Clin Immunol (2016) 36(Suppl 1): 100 참조). 부위 특이적 컨쥬게이션 기술은 트랜스글루타미나아제를 통한 글루타민 컨쥬게이션을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다 (예를 들어, Schibli, Angew Chemie Inter Ed. 2010, 49,9995 참조).
특정 구체예에 따르면, 본 개시물은 ADC를 제공하는데, 본원에서 기술된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질은 국제 특허 공보 WO2014/145090 (이것의 개시물은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제시된 링커-약물 조성물 (예를 들어, 본원에서 "M0026"으로도 불리고 하기 도시된 화합물 "7")에 컨쥬게이션된다:
또한 본원에서 개시된 단일특이적 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항체를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트가 본원에서 제공되는데, 상기 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항체는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 특정 구체예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드이다. 특정 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음 화학식을 가진 화합물이다:
상기 식에서 n은 1-12의 정수이고 R1은 알킬이다. 특정 구체예에서, 메이탄시노이드는 다음과 같다:
특정 구체예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드이고, 메이탄시노이드는 비-분열 가능한 링커를 통해 항체에 공유 부착된다. 특정 구체예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드이고, 메이탄시노이드는 분열 가능한 링커를 통해 항체에 공유 부착된다.
한 구체예에서, 항체는 다음에 컨쥬게이션된다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
한 구체예에서, 항체는 다음에 컨쥬게이션된다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
한 구체예에서, 항체는 다음에 컨쥬게이션된다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
한 구체예에서, 항체는 다음에 컨쥬게이션된다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 본원에서 기술된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L은 링커이고;
Pay는 세포독성제이고;
n은 1-10의 정수이다.
일부 구체예에서, Ab는 서열 번호: 82/138의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내의 CDR을 포함하는 항-MET 항체이다. 일부 구체예에서, Ab는 서열 번호: 82의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 항-MET 항체이다.
일부 구체예에서, Ab는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이다. 일부 양태에서, MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질은 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 더 포함한다. 일부 구체예에서, Ab는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이다. 일부 양태에서, MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질는 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열을 더 포함한다.
일부 구체예에서, Ab는 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이다. 일부 양태에서, MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질은 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 더 포함한다. 일부 구체예에서, Ab는 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이다.
일부 구체예에서, L은 분열 가능한 링커이다. 일부 구체예에서, L은 비-분열 가능한 링커이다. 일부 구체예에서, L은 다이펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, L은 PAB 모이어티를 포함한다.
일부 구체예에서, L은 다음 구조를 가진 모이어티를 포함한다:
일부 구체예에서, L은 다음 구조를 가진 모이어티를 포함한다:
일부 구체예에서, L은 다음 구조를 가진 모이어티를 포함한다:
일부 구체예에서, L은 다음 구조를 가진 모이어티를 포함한다:
일부 구체예에서, Pay는 메이탄시노이드이다.
일부 구체예에서, Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 R1은 알킬이다.
일부 구체예에서, Pay는 다음과 같다:
일부 구체예에서, Pay는 다음과 같다:
일부 구체예에서, n은 2 내지 5의 정수이다.
일부 구체예에서, -L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
일부 구체예에서, -L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
일부 구체예에서, -L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
일부 구체예에서, -L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 82의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 항-MET 항체이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 82의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 항-MET 항체이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 82의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 항-MET 항체이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 82의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 138의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 항-MET 항체이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항체에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원 결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Ab-[L-Pay]n
상기 식에서:
Ab는 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질이고;
L-Pay는 다음과 같다:
상기 식에서 는 항원-결합 단백질에 대한 결합이고; n은 2-5의 정수이다.
본원에서 기술된 항체 약물 컨쥬게이트는 당업자에게 공지된 컨쥬게이션 조건을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, Doronina et al. Nature Biotechnology 2003, 21, 7, 778 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 구체예에서 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질 항체 약물 컨쥬게이트는 본원에서 기술된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 원하는 링커 및 세포독성제를 포함하는 화합물과 접촉시킴으로써 제조되며, 상기 링커는, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단백질의 원하는 잔기에서 항체 또는 항원-결합 단백질과 반응성인 모이어티를 가지고 있다.
일부 구체예에서, 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하는 공정이 본원에서 제공되는데, 본원에서 기술된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 다음 화학식 A1을 갖는 화합물 및 수성 희석제와 접촉시키는 단계를 포함한다:
일부 구체예에서, 화학식 A1의 화합물은 화학량론적 초과량으로 존재한다. 일부 구체예에서, 화학식 A1의 화합물은 5-6배 화학량론적 초과량으로 존재한다. 일부 구체예에서, 수성 희석제는 HEPES를 포함한다. 일부 구체예에서, 수성 희석제는 DMA를 포함한다.
일부 구체예에서, 화학식 A1의 화합물은 화학식 A2 또는 A3의 화합물이다:
일부 구체예에서, 화합식 A2의 화합물은 입체이성질체적으로 순수한 A3이다. 일부 구체예에서, 화학식 A1의 화합물은 화학식 A1 또는 A2의 화합물을 포함하며, A1 또는 A2의 화합물은 50% 초과의 부분입체이성질체적 초과량으로 존재한다. 특정 구체예에서, 부분입체이성질체적 초과량은 70% 초과이다. 특정 구체예에서, 부분입체이성질체적 초과량은 90% 초과이다. 특정 구체예에서, 부분입체이성질체적 초과량은 95% 초과이다.
용어 "부분입체이성질체적 초과량"은 조성물에 남아있는 부분입체이성질체와 비교하여 원하는 단일 부분입체이성질체의 몰 분율 간의 차이를 물한다. 부분입체이성질체적 초과량은 다음과 같이 계산된다: (단일 부분입체이성질체의 양)-(다른 부분입체이성질체의 양)/1. 예를 들어, 1을 90% 및 2, 3, 4, 또는 이것들의 혼합물을 10% 함유하는 조성물은 80% [(90-10)/1]의 부분입체이성질체적 초과량을 갖는다. 1을 95% 및 2, 3, 4, 또는 이것들의 혼합물을 5% 함유하는 조성물은 90% [(95-5)/1]의 부분입체이성질체적 초과량을 갖는다. 1을 99% 및 2, 3, 4, 또는 이것들의 혼합물을 1% 함유하는 조성물은 98% [(99-1)/1]의 부분입체이성질체적 초과량을 갖는다. 부분입체이성질체적 초과량은 1, 2, 3, 또는 4 중 어느 하나에 대하여 유사하게 계산될 수 있다.
일부 구체예에서, 화학식 A1의 화합물은 실리카 겔 및 희석제의 존재 하에 화학식 (a)의 화합물
을 화학식 (b)의 화합물
.
과 접촉시킴으로써 제조된다. 일부 구체예에서, 희석제는 유기 용매 및 물을 포함한다.
다음의 공정에 의해 제조된 생성물이 또한 본원에서 제공된다:
(i) 실리카 겔 및 희석제의 존재 하에 화학식 (a)의 화합물
을 화학식 (b)의 화합물
과 접촉시켜 중간물을 합성하는 단계; 및
(ii) 본원에서 기술된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 중간물 및 수성 희석제와 접촉시키는 단계.
일부 구체예에서,
항체-약물 컨쥬게이트를 제조하는 공정이 본원에서 제공되는데, 본원에서 기술된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 다음 화학식 B
를 갖는 화합물 및 수성 희석제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 식에서 LG는 이탈기이다.
일부 구체예에서, 화학식 B의 화합물은 화학량론적 초과량으로 존재한다. 일부 구체예에서, 화학식 B의 화합물은 5-6배 화학량론적 초과량으로 존재한다. 일부 구체예에서, 수성 희석제는 HEPES를 포함한다. 일부 구체예에서, 수성 희석제는 DMA를 포함한다. 일부 구체예에서, -C(O)-LG는 에스터, 예를 들어, NHS 또는 트라이플루오로페닐 에스터이다.
일부 구체예에서, 화학식 B의 화합물은 화학식 B1의 화합물이다:
일부 구체예에서, 화학식 B1의 화합물은 화학식 C의 화합물
을 N-하이드록시숙신이미드 (NHS), 펩타이드 커플링 시약, 및 유기 희석제와 접촉시킴으로써 제조된다. 적합한 펩타이드 커플링 시약은 친핵체와의 반응을 위해 카르복실산 모이어티를 활성화시키는, 즉, 반응성으로 만드는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 펩타이드 커플링 시약은 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보다이이미드 하이드로클로라이드 (EDC)이다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 다이클로로메탄이다.
일부 구체예에서, 화학식 C의 화합물은 화학식 D의 화합물
을 아디프산, 펩타이드 커플링제, 및 유기 용매와 접촉시킴으로써 제조된다. 특정 구체예에서, 펩타이드 커플링제는 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-다이하이드로퀴놀린 (EEDQ)이다. 특정 구체예에서, 유기 용매는 다이클로로메탄을 포함한다. 화합물 D는 WO2014/145090에서와 같이 제조될 수 있다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
항체 및 항원-결합 도메인이 결합하는 에피토프는 MET 단백질의 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상)의 아미노산의 단일 인접 서열로 이루어질 수도 있다. 대안으로, 적절한 에피토프는 MET의 복수의 비-인접 아미노산 (또는 아미노산 서열)로 이루어질 수도 있다. 일부 구체예에서, 에피토프는 MET의 리간드-결합 도메인에 또는 그 근처에 위치한다. 다른 구체예에서, 에피토프는 MET의 리간드-결합 도메인 외부에, 예를 들어, 이러한 에피토프에 결합될 때, 항체가 MET로의 HGF 결합을 방해하지 않는 MET의 표면 상의 위치에 위치한다.
본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 개개의 항원 결합 도메인 (D1 및 D2)은 서로에 관하여 별개의, 또는 비-중첩, 또는 부분적 중첩 에피토프에 결합할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "부분적 중첩 에피토프"는 제1 및 제2 에피토프가 해당 분야에 공지된 임의의 에피토프 맵핑 방법 (예를 들어, X-선 결정학, 알라닌-스캔 돌연변이 유발, 수소/중수소 교환 [HDX], 도메인 스와핑(swapping), 등)에 의해 결정된 바와 같이 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 단 1개의 공통 아미노산을 공유한다는 것을 의미한다. D1 및 D2 도메인은 서로 비-경쟁적일 수도 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, MET 상의 에피토프로의 특정 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 D1 도메인의 결합은 MET 상의 에피토프로의 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 D2 도메인의 결합을 억제하지 않는다 (또는 단지 최소한으로만 억제한다). D1 및 D2 구성요소의 각각의 에피토프의 비-중첩 (또는 최소한 부분적 중첩) 성질로 인해, MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 세포 표면 상의 단일 MET 분자에 결합할 수 있다.
당업자에게 알려져 있는 다양한 기술은 본 개시물의 항체 및 항원-결합 도메인이 상호작용하는 MET 상의 에피토프를 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 항체 또는 항원-결합 도메인의 에피토프 또는 결합 도메인을 결정하는데 사용될 수 있는 예시의 기술은, 예를 들어, 점 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발, 아르기닌 스캐닝 돌연변이 유발, 등), 펩타이드 블롯 분석 (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), 프로테아제 보호, 및 펩타이드 분열 분석을 포함한다. 이에 더하여, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 이용될 수 있다 (Tomer, 2000, 단백질 Science 9:487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출된 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심있는 단백질을 중수소-라벨링한 후 이어서, 중수소-라벨링된 단백질에 항체를 결합시키는 단계를 수반한다. 그 다음에, 단백질/항체 복합체는 물로 옮겨져서 항체 (중수소-라벨링된 채로 남아있음)에 의해 보호되는 잔기를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환을 일으킨다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 분열 및 질량 분석되며, 이로 인해 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-라벨링된 잔기를 나타낸다. 예를 들어, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A 참조. X-선 결정 구조 분석이 또한 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 특이적인 예시의 항체 또는 항원-결합 도메인 중 어느 것 (예를 들어, 본원의 표 1에서 제시된 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 항체)과 동일한 에피토프에 결합하는 항-MET 항체 (이중특이적 항체 포함)가 본원에서 더 제공된다. 또한, 유사하게, 본원에서 기술된 특이적인 예시의 항체 중 어느 것 (예를 들어, 본원의 표 1에서 제시된 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 항체)과 MET로의 결합에 대하여 경쟁하는 항-MET 항체가 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 항-MET 항체가 결합하는 인간 MET 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204, 아미노산 305-315, 및/또는 아미노산 421-455를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하고; 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함한다.
해당 분야에 공지되고 본원에서 예시된 일상적인 방법을 사용하여 항체가 참조 항-MET 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합에 대하여 경쟁하는지를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 테스트 항체가 본원에서 제공된 참조 항-MET 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 MET 단백질에 결합하는 것이 허용된다. 그 다음에, 테스트 항체가 MET 분자에 결합할 수 있는 능력이 평가된다. 테스트 항체가 참조 항-MET 항체와의 포화 결합 이후 MET에 결합할 수 있으면, 테스트 항체가 참조 항-MET 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론 내릴 수 있다. 다른 한편으로, 테스트 항체가 참조 항-MET 항체와의 포화 결합 이후 MET 분자에 결합할 수 없으면, 테스트 항체는 참조 항-MET 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수도 있다. 이어서 관찰된 테스트 항체 결합의 부족이 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프로의 결합으로 인한 것인지 또는 입체적 차단 (또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 부족의 원인인지를 확인하기 위해 추가의 일상적인 실험 (예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 이 종류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유동 세포 분석법 또는 해당 분야에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 예를 들어, 한 항체의 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 초과량이 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 적어도 50% 하지만 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어는 99%만큼 다른 것의 결합을 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일한 (또는 중첩) 에피토프에 결합한다 (예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502 참조). 대안으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 2개의 항체는 "중첩 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
항체가 참조 항-MET 항체와 결합에 대하여 경쟁 (또는 결합에 대하여 교차-경쟁)하는지를 결정하기 위해서, 상기 기술된 결합 방법은 2가지 방향으로 수행된다: 첫 번째 방향에서, 참조 항체는 포화 조건 하에 MET 단백질에 결합된 후 이어서 MET 분자로의 테스트 항체의 결합이 평가된다. 두 번째 방향에서, 테스트 항체는 포화 조건 하에 MET 분자에 결합된 후 이어서 MET 분자로의 참조 항체의 결합이 평가된다. 두 방향 모두에서, 단지 제1 (포화) 항체만이 MET 분자에 결합할 수 있으면, 테스트 항체 및 참조 항체는 MET로의 결합에 대하여 경쟁하는 것으로 결론 내려진다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대하여 경쟁하는 항체가 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수도 있지만 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수도 있다.
인간 항체의 제조
본원에서 제공된 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항체는 완전한 인간 항체일 수 있다. 완전한 인간 단클론성 항체를 포함한, 단클론성 항체를 생성하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지된 방법은 본 개시물의 맥락에서 인간 MET에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, VELOCIMMUNE™ 기술, 또는 완전한 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 임의의 다른 유사한 공지된 방법을 사용하여, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 가진, MET에 대한 고 친화도 키메라 항체가 처음 단리된다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 항체는 특성화되고, 친화도, 리간드 차단 활성, 선택성, 에피토프, 등을 포함하여 바람직한 특성에 대하여 선택된다. 필요한 경우, 마우스 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4과 대체되어 완전한 인간 항-MET 항체를 생성한다. 선택된 불변 영역이 특정 용도에 따라 달라질 수도 있지만, 고 친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 있다. 어떤 경우에, 완전한 인간 항-MET 항체는 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리된다.
생물학적 동등물
본원에서 개시된 발명의 항-MET 항체 및 항체 단편은 기술된 항체와 다른 아미노산 서열을 갖지만 인간 MET에 결합하는 능력을 보유한 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 모체 서열과 비교할 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 유사하게, 본 개시물의 항-MET 항체-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본 개시물의 항-MET 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항-MET 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 상기 논의된다.
두 개의 항원-결합 단백질, 또는 항체는, 예를 들어, 그것들이 약학적 동등물 또는 단일 용량이든 다회수 용량이든, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 용량으로 투여될 때 흡수 속도 및 정도가 유의한 차이를 나타내지 않는 약학적 대안인 경우 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체는 그것들이 흡수 속도는 아니지만 흡수의 정도에서 동등한 경우 동등물 또는 약학적 대안으로 간주될 것이며 흡수 속도의 이러한 차이가 의도적이고 라벨링에 반영되고, 예를 들어, 만성 사용시 효과적인 체내 약물 농도의 달성에 필수적이지 않으며, 연구된 특정 약품에 대하여 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문에 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수도 있다.
한 구체예에서, 두 개의 항원-결합 단백질은 안전성, 순도, 및 효능에 있어서 임상적으로 유의한 차이가 없는 경우 생물학적 동등물이다.
한 구체예에서, 두 개의 항원-결합 단백질은 환자가 참조 생성물과 생물학적 생성물 사이의 전환이 없는 지속적인 요법과 비교하여 면역원성의 임상적으로 유의한 변화, 또는 감소된 효과를 포함하는 부작용의 위험의 예상된 증가 없이 참조 생성물과 생물학적 생성물 사이에서 1회 이상 전환될 수 있으면 생물학적 동등물이다.
한 구체예에서, 두 개의 항원-결합 단백질은 그것들이 모두 사용 조건 또는 조건들에 대한 작용의 공통 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해 이러한 메커니즘이 공지된 정도로 작용하는 경우 생물학적 동등물이다.
생물학적 동등성은 생체 내 및 시험관 내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정은, 예를 들어, (a) 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청, 또는 생물학적 유동체에서 항체의 농도 또는 대사산물의 농도가 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체 내 테스트; (b) 인간 생체 내 생물학적 이용 가능성 데이터와 연관성이 있고 이것을 합리적으로 예측하는 시험관 내 테스트; (c) 항체 (또는 그 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체 내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생물학적 이용 가능성 또는 생물학적 동등성을 입증하는 잘 제어된 임상 시험을 포함한다.
본원에서 제공된 항-MET 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 제조하거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구성될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 재생시 불필요하거나 부정확한 분자간 이황화 브릿지의 형성을 방지하기 위해 결실되거나 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 동등한 항체는 항체의 글리코실화 특성을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들어, 글리코실화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 포함하는 항-MET 항체 변이체를 포함할 수도 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
본 개시물은, 특정 구체예에 따르면, 인간 MET에 결합하지만 다른 종의 MET에 결합하지 않는 항-MET 항체 (및 항-MET 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자)를 제공한다. 본 개시물은 또한 인간 MET 및 하나 이상의 비-인간 종의 MET에 결합하는 항-MET 항체 (및 항-MET 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자)를 포함한다. 예를 들어, 항-MET 항체 및 항원-결합 분자는 인간 MET에 결합할 수도 있고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 져빌, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 게먹이 원숭이, 마모셋, 붉은 털 원숭이 또는 침팬지 MET 중 하나 이상에 결합하거나 또는 결합하지 않을 수도 있다. 본 발명의 특정한 예시적인 구체예에 따르면, 인간 MET 및 게먹이 원숭이 (cynomolgus monkey, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(마카카 파시쿨라리스)) MET에 특이적으로 결합하는 항-MET 항체 및 항원-결합 분자가 제공된다. 본 발명의 다른 항-MET 항체는 인간 MET에 결합하지만, 게먹이 원숭이 MET에 결합하지 않거나, 약하게만 결합한다.
다중특이적 항체
본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 본 개시물은 2개의 상이한 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하는데, 제1 항원-결합 도메인 (D1)은 MET 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제2 항원-결합 도메인 (D2)은 MET 상의 제2 에피토프에 결합한다. 특정 구체예에서, D1 및 D2 도메인이 결합하는 MET 상의 제1 및 제2 에피토프는 별개이거나, 또는 비-중첩, 또는 부분적 중첩된다. 이 양태에 따르면, D1 도메인은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것을 포함할 수 있고, D2 도메인은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 다른 것을 포함할 수 있다 (D1 도메인의 결합 특이성이 D2 도메인의 결합 특이성과 상이하고, 및/또는 D1이 얻어진 항원-결합 단백질이 MET로의 결합에 대하여 D2가 얻어진 항원-결합 단백질과 경쟁하지 않는 한). 일부 구체예에서, 항-MET 항체가 결합하는 인간 MET 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204, 아미노산 305-315, 및/또는 아미노산 421-455를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하고; 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함한다.
본 개시물의 별도의 양태에 따르면, 이중특이적 항체의 한 아암은 인간 MET 상의 에피토프에 결합하고, 이중특이적 항체의 다른 아암은 MET 이외의 제2 항원에 결합하는 통상적인 이중특이적 항체가 또한 제공된다. MET-결합 아암은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, MET-결합 아암은 인간 MET에 결합하여 MET로의 HGF 결합을 차단한다. 다른 구체예에서, MET-결합 아암은 인간 MET에 결합하지만 MET로의 HGF 결합을 차단하지 않는다.
본 개시물의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린 (Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인의 사용을 수반하며, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 서로 적어도 하나의 아미노산이 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중-특이적 항체와 비교하여 단백질 A로의 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 구체예에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링(numbering)에 의해; EU 넘버링에 의해서는 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형 (IMGT에 의해; EU에 의해서는 Y436F)을 더 포함할 수도 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수도 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I). 상기 기술된 이중특이적 항체 포맷에 대한 변화는 본 개시물의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 개시물의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 포맷은, 제한 없이, 예를 들어, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀, 공통 경쇄 (예를 들어, 놉-인투-홀, 등을 가진 공통 경쇄), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷 (상기 언급된 포맷의 검토를 위해서, 예를 들어, Klein et al. (2012) mAbs 4:6, 1-11 및 그 안에 나열된 참고문헌들 참조)을 포함한다. 이중특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 컨쥬게이션을 사용하여 구성될 수 있으며, 예를 들어, 직교 화학 반응성을 가진 비천연 아미노산은 한정된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 가진 멀티머 복합체로 자가-조립되는 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 생성하는데 사용된다 (예를 들어, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012] 참조).
치료적 제제 및 투여
본 발명의 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 약학적 조성물이 본원에서 제공된다. 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 수송, 전달, 내성, 등을 제공하는 다른 작용제로 제제화될 수도 있다.
항체의 치료적 사용
필요로 하는 대상체에게 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 어느 것을 포함하는 항-MET, 또는 본원의 표 5에서 제시된 D1 및 D2 구성요소 중 어느 것을 포함하는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자)를 포함하는 치료적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 치료적 조성물은 본원에서 개시된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자 중 어느 것, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는, 그 중에서도, MET 발현, 신호 전달 또는 활성과 관련이 있거나 이것들에 의해 매개되거나, 또는 MET와 HGF 간의 상호작용을 차단하거나, 또는 그렇지 않으면 MET 활성을 억제하고 및/또는 신호 전달, 및/또는 수용체 내재화를 촉진하고 및/또는 세포 표면 수용체 수를 감소시킴으로써 치료 가능한 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 호전에 유용하다.
예를 들어, 본 개시물의 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 MET를 발현하는 (또는 과발현하는) 종양의 치료에 유용하다. 예를 들어, 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 뇌 및 뇌막, 인두, 폐 및 기관지 나무, 위장관, 수컷 및 암컷 생식관, 근육, 뼈, 피부 및 부속기관, 결합조직, 비장, 면역계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 특별한 감각 기관, 예컨대 눈에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료하는데 사용될 수도 있다. 특정 구체예에서, 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 암 중 하나 이상을 치료하는데 사용된다: 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 성인 T-세포 백혈병(adult T-cell leukemia), 성상세포종(astrocytoma), 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종(cholangiocarcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 결장직장암, 자궁체부암, 식도암, 위암 (예를 들어, MET 증폭된 위암), 교아세포종(glioblastoma), 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 [head and neck squamous cell carcinoma; HNSCC]), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장암, 평활근육종(leiomyosarcoma), 간암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 [non-small cell lung cancer; NSCLC]), 림프종, 악성 신경교종(malignant glioma), 악성 중피종(malignant mesothelioma), 흑색종(melanoma), 중피종, MFH/섬유육종(fibrosarcoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 횡문근육종, 소세포 폐암, 활막육종(synovial sarcoma), 갑상선암, 및 윌름 종양(Wilms' tumor).
본원에서 기술된 치료 방법의 맥락에서, 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 단일 요법으로서 (즉, 유일한 치료제로서) 또는 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 (이것의 예는 본원의 다른 곳에서 기술됨) 투여될 수도 있다.
조합 요법 및 제제
하나 이상의 추가의 치료적 활성 구성요소와 조합하여 본원에서 기술된 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자 중 어느 것을 포함하는 조성물 및 치료적 제제, 및 필요로 하는 대상체에게 이러한 조합을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 본원에서 제공된다.
항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료적 활성 구성요소(들)과 함께 동시-제제화되고 및/또는 이것들과 조합하여 투여될 수도 있다: MET 안타고니스트 (예를 들어, 항-MET 항체 [예를 들어, 오나르투쥬맙, 에미베투쥬맙, 및 H4H14639D] 또는 MET의 소분자 억제자), EGFR 안타고니스트 (예를 들어, 항-EGFR 항체 [예를 들어, 세툭시맙 또는 파니투무맙] 또는 EGFR의 소분자 억제자 [예를 들어, 게피티닙 또는 엘로티닙]), 또 다른 EGFR 패밀리 구성원, 예컨대 Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4의 안타고니스트 (예를 들어, 항-ErbB2 [예를 들어, 트라스투쥬맙 또는 T-DM1 {KADCYLA®}], 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소분자 억제자), EGFRvIII의 안타고니스트 (예를 들어, 항-EGFRvIII 항체), IGF1R 안타고니스트 (예를 들어, 항-IGF1R 항체), B-raf 억제자 (예를 들어, 베무라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α 억제자 (예를 들어, 항-PDGFR-α 항체), PDGFR-β 억제자 (예를 들어, 항-PDGFR-β 항체 또는 소분자 키나아제 억제자, 예를 들어, 이마티닙 메실레이트 또는 수니티닙 말레이트), PDGF 리간드 억제자 (예를 들어, 항-PDGF-A, -B, -C, 또는 -D 항체, 압타머, siRNA, 등), VEGF 안타고니스트 (예를 들어, VEGF-Trap, 예컨대 아플리버셉트, 예를 들어, US 7,087,411 참조 (본원에서 "VEGF-억제 융합 단백질"이라고도 불림), 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시쥬맙), VEGF 수용체의 소분자 키나아제 억제자 (예를 들어, 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙)), DLL4 안타고니스트 (예를 들어, US 2009/0142354에 개시된 항-DLL4 항체, 예컨대 REGN421), Ang2 안타고니스트 (예를 들어, US 2011/0027286에서 개시된 항-Ang2 항체, 예컨대 H1H685P), FOLH1 안타고니스트 (예를 들어, 항-FOLH1 항체), STEAP1 또는 STEAP2 안타고니스트 (예를 들어, 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP2 항체), TMPRSS2 안타고니스트 (예를 들어, 항-TMPRSS2 항체), MSLN 안타고니스트 (예를 들어, 항-MSLN 항체), CA9 안타고니스트 (예를 들어, 항-CA9 항체), 유로플라킨 안타고니스트 (예를 들어, 항-유로플라킨 [예를 들어, 항-UPK3A] 항체), MUC16 안타고니스트 (예를 들어, 항-MUC16 항체), Tn 항원 안타고니스트 (예를 들어, 항-Tn 항체), CLEC12A 안타고니스트 (예를 들어, 항- CLEC12A 항체), TNFRSF17 안타고니스트 (예를 들어, 항-TNFRSF17 항체), LGR5 안타고니스트 (예를 들어, 항-LGR5 항체), 1가 CD20 안타고니스트 (예를 들어, 1가 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙), CD20 x CD3 이중특이적 항체, PD-1 차단제 (예를 들어, 항-PD-1 항체, 예컨대 펨볼리쥬맙 또는 니볼루맙), 등. 본원에서 제공된 항체와 조합하여 유익하게 투여될 수도 있는 다른 작용제는, 예를 들어, 타목시펜, 아로마타아제 억제자, 및 소분자 사이토카인 억제자 및 사이토카인, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, 또는 각각의 수용체에 결합하는 항체를 포함하는, 사이토카인 억제자를 포함한다.
예시적으로, PD-1 억제자, 예컨대 항-PD-1 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 항-Met 항체-약물 컨쥬게이트와 조합될 수 있다. 표적 환자 집단은 구체적으로 c-Met 돌연변이를 과발현하는 종양을 가진 상기 환자, 예컨대 c-Met-발현 비-소세포 폐암에 걸린 환자를 포함한다.
하나 이상의 화학치료제와 조합하여 본원에서 기술된 항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자 중 어느 것을 포함하는 조성물 및 치료적 제제가 본원에서 제공된다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드 (Cytoxan™); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보큐원, 메튜레도파, 및 유레도파; 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아미드, 트라이에틸렌티오포스파오르아미드, 및 트라이메틸올로메탈멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜아민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 유라실 머스타드; 니트로요소, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로머스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리체아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사 길항 물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지큐원; 엘포르니틴; 엘리프티니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK™; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지큐원; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (Taxotere™; Aventis Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라아제 억제자 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 항-에스트로겐제, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (Fareston); 및 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체와 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 이 정의에 포함된다.
항-MET 항체 및 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 또한 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 항산화제, COX 억제자, 심장 보호제, 금속 킬레이터, IFN-감마, 및/또는 NSAID와 조합하여 투여되고 및/또는 동시-제제화될 수도 있다.
추가적인 치료적 활성 구성요소(들), 예를 들어, 상기 나열된 작용제 중 어느 것 또는 이것들의 유도체는 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 투여 직전에, 동시에, 또는 직후에 투여될 수도 있다; (본 개시물의 목적을 위해, 이러한 투여 양생법은 추가적인 치료적 활성 구성요소와 "조합된" 항체의 투여로 간주된다. 본 개시물은 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자가 추가의 치료적 활성 구성요소(들) 중 하나 이상과 동시-제제화된 약학적 조성물을 포함한다.
투여 양생법
특정 구체예에 따르면, 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자 (또는 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자와 본원에서 언급된 추가적인 치료적 활성제 중 어느 것의 조합을 포함하는 약학적 조성물)의 다회수 용량이 한정된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수도 있다. 이 양태에 따르는 방법은 대상체에게 본원에서 제공된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 다회수 용량을 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "순차적으로 투여하는 것"은 항-MET 항체의 각각의 용량이 상이한 시점에, 예를 들어, 미리 결정된 간격 (예를 들어, 시간, 일, 주 또는 월)으로 분리된 상이한 날에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 본 개시물은 환자에게 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 단일 처음 용량에 이어서, 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 1회 이상의 2차 용량, 이어서 선택적으로 항-MET 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 1회 이상의 3차 용량을 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "처음 용량", "2차 용량", 및 "3차 용량"은 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자의 투여의 시간적인 순서이다. 따라서, "처음 용량"은 치료 요법의 시작시 투여되는 용량 ("기저 용량"으로도 불림)이고; "2차 용량"은 처음 용량 이후에 투여되는 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 이후에 투여되는 용량이다. 처음, 2차, 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자를 함유할 수도 있지만, 일반적으로 투여 빈도에 관하여 서로 다를 수도 있다. 하지만, 특정 구체예에서, 처음, 2차 및/또는 3차 용량에 함유된 항-MET 항체의 처리의 과정 동안에 양은 서로 달라진다 (예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조정됨). 특정 구체예에서, 2회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5회)의 용량이 치료 양생법의 시작시 "로딩 용량"에 이어서, 덜 빈번하게 투여되는 후속 용량 (예를 들어, "유지 용량")이 투여된다.
항체의 진단적 용도
본 개시물의 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 또한, 예를 들어, 진단 목적을 위해, 샘플에서 MET, 또는 MET-발현 세포를 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 항-MET 항체, 또는 이것의 단편은 MET의 비정상적인 발현 (예를 들어, 과다발현, 과소발현, 발현 부족, 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수도 있다. MET에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어, 환자로부터 얻은 샘플을 검출 가능한 라벨 또는 리포터 분자로 라벨링된 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수도 있다. 대안으로, 라벨링되지 않은 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 분자는 자체로 검출 가능하게 라벨링된 2차 항체와 조합하여 진단 용도로 사용될 수 있다. 검출 가능한 라벨 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학발광 모이어티, 예컨대 플루오레세인, 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 또는 루시퍼라아제일 수 있다. 샘플에서 MET을 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있는 특이적이고 예시적인 검정은 효소-결합된 면역 흡착 검정 (ELISA), 방사선 면역 검정 (RIA), 면역-PET (예를 들어, 89Zr, 64Cu, 등), 및 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함한다.
본 개시물에 따른 MET 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플은 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 유동체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자 (예를 들어, 비정상적인 MET 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 병태에 영향을 받지 않는 환자)로부터 얻어진 특정 샘플에서 MET의 수준은 처음에 MET의 베이스라인, 또는 기준 수준을 확립하기 위해 측정될 것이다. MET의 이 베이스라인 수준은 MET-관련 질환 또는 병태에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 얻어진 샘플에서 측정된 MET의 수준과 비교될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본원에서 제시된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 기술내용을 당업자에게 제공하기 위해서 제시되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험적 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1. 항-MET 항체의 생성
인간 Fc (R&D Systems, Catalog # 358-MT, Minneapolis, MN)에 융합된 재조합 인간 MET 세포외 도메인을 포함하는 면역원으로 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전적으로 조작된 마우스를 면역화하여 항-MET 항체를 얻었다. 면역화에 사용된 마우스는 "보편적 경쇄"를 발현한다. 즉, 이 마우스에서 생산된 항체는 상이한 중쇄 가변 영역을 갖지만 본질적으로 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
항체 면역 반응을 MET-특이적 면역 검정에 의해 모니터링하였다. 원하는 면역 반응이 달성될 때, 비장 세포를 수확하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. MET-특이적 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하였다. 이 기술을 사용하여 여러 항-MET 키메라 항체 (즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 가지고 있는 항체)를 얻었다. 이에 더하여, US 2007/0280945A1에서 기술된 바와 같이 여러 완전한 인간 항-MET 항체를 골수종 세포에 융합시키지 않고 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리시켰다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시의 항-MET 항체, 및 그것들로부터 구성된 이중특이적 항체의 특정 생물학적 성질은 하기 제시된 실시예에서 상세히 기술된다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열
표 1은 본원에서 기술된 선택된 항-MET 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다 (상기 언급된 바와 같이, 실시예 1에서 생성된 모든 항체는 동일한 가변 영역을 가지고 있으며, 따라서 동일한 경쇄 CDR 서열을 또한 가지고 있다). 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에서 제시된다.
아미노산 서열 식별자
서열 번호:
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H4H13290P2 2 4 6 8 138 140 142 144
H4H13291P2 10 12 14 16 138 140 142 144
H4H13295P2 18 20 22 24 138 140 142 144
H4H13299P2 26 28 30 32 138 140 142 144
H4H13300P2 34 36 38 40 138 140 142 144
H4H13301P2 42 44 46 48 138 140 142 144
H4H13302P2 50 52 54 56 138 140 142 144
H4H13306P2 58 60 62 64 138 140 142 144
H4H13309P2 66 68 70 72 138 140 142 144
H4H13311P2 74 76 78 80 138 140 142 144
H4H13312P2 82 84 86 88 138 140 142 144
H4H13313P2 90 92 94 96 138 140 142 144
H4H13316P2 98 100 102 104 138 140 142 144
H4H13318P2 106 108 110 112 138 140 142 144
H4H13319P2 114 116 118 120 138 140 142 144
H4H13325P2 122 124 126 128 138 140 142 144
H4H13331P2 130 132 134 136 138 140 142 144
핵산 서열 식별자
서열 번호:
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H4H13290P2 1 3 5 7 137 139 141 143
H4H13291P2 9 11 13 15 137 139 141 143
H4H13295P2 17 19 21 23 137 139 141 143
H4H13299P2 25 27 29 31 137 139 141 143
H4H13300P2 33 35 37 39 137 139 141 143
H4H13301P2 41 43 45 47 137 139 141 143
H4H13302P2 49 51 53 55 137 139 141 143
H4H13306P2 57 59 61 63 137 139 141 143
H4H13309P2 65 67 69 71 137 139 141 143
H4H13311P2 73 75 77 79 137 139 141 143
H4H13312P2 81 83 85 87 137 139 141 143
H4H13313P2 89 91 93 95 137 139 141 143
H4H13316P2 97 99 101 103 137 139 141 143
H4H13318P2 105 107 109 111 137 139 141 143
H4H13319P2 113 115 117 119 137 139 141 143
H4H13325P2 121 123 125 127 137 139 141 143
H4H13331P2 129 131 133 135 137 139 141 143
항체는 전형적으로 본원에서 다음 명명법에 따라 불린다: 표 1 및 2에서 나타난 바와 같이, Fc 접두사 (예를 들어 "H4H"), 이어서, 수치 식별자 (예를 들어 "13290", "13291", "13295", 등), 이어서 "P2" 접미사. 따라서, 이 명명법에 따라, 항체는 본원에서, 예를 들어, "H4H13290P2", "H4H13291P2", "H4H13295P2", 등으로 불릴 수도 있다. 본원에서 사용된 항체 명칭에 대한 접두사는 항체의 특정 Fc 영역 아이소타입을 나타낸다. 특히, "H4H" 항체는 인간 IgG4 Fc를 갖는다 (모든 가변 영역은 항체 명칭에서 처음 'H'로 나타난 바와 같이 완전한 인간이다). 당업자에게 인정되는 것처럼, 특정 Fc 아이소타입을 가진 항체는 상이한 Fc 아이소타입을 가진 항체로 전환될 수 있지만 (예를 들어, 마우스 IgG4 Fc를 가진 항체는 인간 IgG1, 등을 가진 항체로 전환될 수 있지만), 어떤 경우에도, 가변 도메인 (CDR 포함) - 표 1 및 2에서 나타난 수치 식별자로 표시됨 - 동일한 것을 유지할 것이고, 결합 성질은 Fc 도메인의 성질에 관계없이 동일하거나 또는 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.
실시예 3. 인간 단클론성 항-MET (단일특이적) 항체의 표면 플라스몬 공명 유래된 결합 친화도 및 동역학 상수
인간 항-MET 항체의 결합 친화도 및 동역학 상수를 37℃에서 표면 플라스몬 공명 (Biacore 4000 또는 T-200)에 의해 결정하였다. 이 실시예에서 테스트된 항-Met 항체는 MET의 2가 단일특이적 바인더였다. 인간 IgG4로 표현되는 항체 ("H4H"로 지정됨)를 단클론성 마우스 항-인간 Fc 항체 (GE, BR-1008-39)와의 아민 커플링을 통해 유도체화된 CM4 또는 CM5 Biacore 센서 표면으로 캡쳐하였다. 다양한 농도의 가용성 모노머 (인간 (h) Met.mmh; 서열 번호: 152; 마카카 파시쿨라리스 (macaca fascicularis; mf) Met.mmh; 서열 번호: 154) 또는 다이머 (hMet.mFc; 서열 번호: 153) Met 단백질을 30 또는 50 μL/분의 유속으로 항-MET-항체 캡쳐된 표면 위에 주사하였다. 캡쳐된 단클론성 항체로의 hMET.mmh 또는 hMET.mFc의 회합을 4 또는 5분 동안 모니터링하였고 HBS-ET (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20) 또는 PBS-P (0.01M 나트륨 포스페이트 pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% v/v 계면활성제 P20) 러닝 버퍼 중에서 hMET.mmh 또는 hMET.mFc의 해리를 10분 동안 모니터링하였다.
Scrubber 2.0c 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 실시간 센서그램을 1:1 결합 모델에 맞춤으로써 동역학 결합 속도 상수 (k a) 및 해리 속도 상수 (k d)를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t½)를 동역학 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다:
, 및
모노머 및 다이머 Met 단백질에 대한 단일특이적 항-Met 항체의 결합 동역학 파라미터는 하기 표 3에서 나타나있다.
37℃에서 단일특이적 항-MET mAb의 Biacore 결합 친화도
37℃에서 결합 / 항체-캡쳐 포맷
항체 피분석물 ka (Ms -1 ) kd (s -1 ) K D (몰) T½ (분)
H4H13290P2 hMet.mmh 2.53E+05 8.03E-04 3.17E-09 14.4
hMET.mFc 6.15E+05 3.15E-04 5.13E-10 36.6
mfMet.mmh 1.23E+05 6.33E-04 5.16E-09 18.2
H4H13291P2 hMet.mmh 2.55E+04 2.38E-03 9.34E-08 4.8
hMET.mFc 3.33E+05 3.39E-04 1.02E-09 34
mfMet.mmh 3.70E+04 1.39E-03 3.76E-08 8.3
H4H13295P2 hMet.mmh 1.67E+04 5.40E-04 3.24E-08 21.4
hMET.mFc 2.28E+05 2.64E-04 1.16E-09 43.8
mfMet.mmh 1.65E+04 9.79E-04 5.93E-08 11.8
H4H13299P2 hMet.mmh 9.10E+04 7.80E-04 8.57E-09 14.8
hMET.mFc 3.57E+05 3.14E-04 8.78E-10 36.8
mfMet.mmh 1.13E+05 8.84E-04 7.86E-09 13.1
H4H13300P2 hMet.mmh 3.35E+04 2.43E-03 7.25E-08 4.8
hMET.mFc 2.65E+05 2.95E-04 1.12E-09 39.1
mfMet.mmh 5.13E+04 1.94E-03 3.77E-08 6.0
H4H13301P2 hMet.mmh 7.57E+04 6.22E-03 8.22E-08 1.9
hMET.mFc 7.05E+05 1.14E-03 1.62E-09 10.1
mfMet.mmh 6.85E+04 5.30E-03 7.74E-08 2.2
H4H13302P2 hMet.mmh 5.24E+04 2.46E-03 4.70E-08 4.7
hMET.mFc 2.51E+05 5.84E-04 2.33E-09 19.8
mfMet.mmh 3.56E+04 2.92E-03 8.20E-08 4.0
H4H13306P2 hMet.mmh 1.52E+05 1.66E-02 1.09E-07 0.7
hMET.mFc 1.21E+06 2.60E-03 2.15E-09 4.4
mfMet.mmh 1.21E+06 3.11E-02 2.58E-08 0.4
H4H13309P2 hMet.mmh 9.20E+04 5.87E-04 6.38E-09 19.7
hMET.mFc 4.06E+05 2.67E-04 6.57E-10 43.3
mfMet.mmh 1.23E+05 6.33E-04 5.16E-09 18.2
H4H13311P2 hMet.mmh 4.48E+04 5.19E-03 1.16E-07 2.2
hMET.mFc 3.02E+05 4.68E-04 1.55E-09 24.7
mfMet.mmh 7.61E+04 6.04E-03 7.94E-08 1.9
H4H13312P2 hMet.mmh 7.19E+04 1.63E-02 2.27E-07 0.7
hMET.mFc 6.14E+05 1.71E-03 2.79E-09 6.7
mfMet.mmh 1.47E+05 7.72E-03 5.24E-08 1.5
H4H13313P2 hMet.mmh 8.78E+04 5.70E-03 6.49E-08 2
hMET.mFc 7.50E+05 8.93E-04 1.19E-09 12.9
mfMet.mmh 5.10E+04 4.08E-03 8.00E-08 2.8
H4H13316P2 hMet.mmh 7.82E+04 1.51E-03 1.93E-08 7.6
hMET.mFc 2.93E+05 1.08E-04 3.67E-10 107.4
mfMet.mmh NB NB NB NB
H4H13318P2 hMet.mmh 3.30E+04 2.92E-03 8.83E-08 4
hMET.mFc 3.52E+05 1.65E-04 4.67E-10 70.2
mfMet.mmh NB NB NB NB
H4H13319P2 hMet.mmh 3.11E+04 2.38E-03 7.65E-08 4.9
hMET.mFc 3.82E+05 5.42E-04 1.42E-09 21.3
mfMet.mmh 2.66E+04 1.15E-03 4.33E-08 10.0
H4H13325P2 hMet.mmh 9.53E+04 2.36E-03 2.48E-08 4.9
hMET.mFc 3.06E+05 1.85E-04 6.05E-10 62.4
mfMet.mmh NB NB NB NB
H4H13331P2 hMet.mmh 2.61E+05 8.73E-04 3.35E-09 13.2
hMET.mFc 6.39E+05 1.56E-04 2.44E-10 74.1
mfMet.mmh 1.61E+05 1.04E-03 6.47E-09 11.1
NB= 사용된 조건 하에 관찰된 결합 없음
표 3에서 나타난 바와 같이, 여러 항체가 인간 및 원숭이 MET 단백질로의 고 친화도 결합을 나타냈다.
실시예 4. 항-Met 항체는 Met 수용체 상에서 별개의 에피토프에 결합한다
2개의 항-Met 항체가 MET 상에서 각각의 에피토프에 대하여 서로 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위해서, OCTET® HTX 바이오센서 (ForteBio Corp., Menlo Park, CA)에서 실시간 무 라벨링 바이오층 간섭법 (bio-layer interferometry; BLI)을 사용하여 결합 경쟁 검정을 실행하였다.
간략히 말하면, 항-펜타-His 항체 코팅된 OCTET® 바이오센서 (ForteBio Corp., # 18-5079)를 hMET.mmh의 20 μg/mL 용액을 함유하는 웰에 5분 동안 담금으로써 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그 (hMet.mmh)와 함께 발현된 대략 0.25 nM의 인간 MET 세포외 도메인을 먼저 항-펜타-His 항체 코팅된 OCTET® 바이오센서 (ForteBio Corp., # 18-5079)로 캡쳐하였다. 이어서 항원-캡쳐된 바이오센서를 5분 동안 50 μg/mL의 mAb-1 용액을 함유하는 웰에 함침시킴으로써 제1 항-MET 단클론성 항체 (이후 mAb-1로 불림)로 포화시켰다. 이어서 바이오센서를 50 μg/mL 제2 항-MET 단클론성 항체 (이후 mAb-2로 불림) 용액을 함유하는 웰에 3분 동안 담갔다. 모든 바이오센서를 실험의 각 단계 사이에 OCTET® HEPES-완충된 식염수-EDTA 폴리소르베이트 20 (HBS-EP) 버퍼에서 세척하였다. 실시간 결합 반응을 실험 과정 동안에 모니터링하였고 각 단계가 끝날 때 결합 반응을 기록하였다.
mAb-1과 사전 복합체 형성된 항-MET에 결합하는 mAb-2의 반응을 비교하였고 상이한 항-MET 단클론성 항체의 경쟁적/비-경쟁적 행동을 50% 억제 임계치를 사용하여 결정하였다. 표 4는 결합의 순서에 관계없이 두 방향으로 경쟁하는 항체의 관계를 정의한다.
hMET.mmh로의 결합에 대한 항-MET 항체의 교차-경쟁
항-펜타-His Octet 바이오센서를 사용하여 캡쳐된 제1 mAb (mAb-1) mAb-1과 경쟁하는 mAb-2 항체 항-펜타-His Octet 바이오센서를 사용하여 캡쳐된 제1 mAb (mAb- mAb-1과 경쟁하는 mAb-2 항체
H4H13301P2 H4H13302P2 H4H13300P2 H4H13291P2
H4H13302P2 H4H13301P2 H4H13295P2
H4H13290P2 H4H13306P2 H4H13311P2
H4H13316P2 H4H13318P2
H4H13306P2 H4H13290P2 H4H13319P2
H4H13316P2 H4H13311P2 H4H13291P2
H4H13316P2 H4H13290P2 H4H13295P2
H4H13306P2 H4H13300P2
H4H13325P2 H4H13318P2
H4H13331P2 H4H13319P2
H4H13325P2 H4H13316P2 H4H13318P2 H4H13291P2
H4H13331P2 H4H13295P2
H4H13312P2 H4H13331P2 H4H13300P2
H4H13291P2 H4H13295P2 H4H13311P2
H4H13300P2 H4H13319P2
H4H13311P2 H4H13319P2 H4H13291P2
H4H13318P2 H4H13295P2
H4H13319P2 H4H13300P2
H4H13295P2 H4H13291P2 H4H13311P2
H4H13300P2 H4H13318P2
H4H13311P2 H4H13331P2 H4H13316P2
H4H13318P2 H4H13325P2
H4H13319P2 H4H13312P2
실시예 5. MET의 상이한 에피토프에 특이적인 2개의 상이한 항원-결합 도메인을 가진 이중특이적 항체의 구성
이 실시예는 2개의 상이한 항원-결합 도메인 (D1 및 D2)을 포함하는 이중특이적 항체의 구성을 기술하는데, D1 및 D2는 상이한 항-MET 항체로부터 유래되고, 결론적으로, MET 세포외 도메인 상의 별도의 에피토프에 결합한다.
이 실시예의 이중특이적 항체를 구성하는데 사용된 개개의 항-MET 항원-결합 도메인은 본원에서 실시예 1 내지 3에서 기술된 다양한 2가, 단일특이적 항-MET 항체로부터 유래되었다. 본원에서 기술된 모든 항-MET 항체는 동일한 ("공통") 경쇄 (서열 번호:138의 경쇄 가변 영역 [LCVR] 아미노산 서열, 및 서열 번호: 140, 142 및 144의 경쇄 CDR [LCDR1, LCDR2 및 LCDR3] 아미노산 서열 포함)를 포함한다. 이에 더하여, 이 실시예에서 예시된 모든 이중특이적 항체는 예시의 항-MET 항체 H4H13312P2로부터 유래된 "D2" 아암을 함유한다. 따라서, 이 실시예에서 기술된 이중특이적 항체 모두의 항원-결합 도메인 (D1 및 D2)은 이 공통 경쇄 가변 영역을 포함하고, 모든 D2 결합 아암은 H4H13312P2의 중쇄 가변 영역을 포함하지만; 이중특이적 항체는 D1 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 중쇄 CDR (HCDR)에 관하여 서로 상이하다. 이 실시예의 이중특이적 항체의 구성요소는 표 5에서 요약된다.
MET x MET 이중특이적 항체 구성요소 요약
서열 번호: (아미노산 서열)
이중특이적 항체 제1 항원-결합 도메인 (D1) 제2 항원-결합 도메인 (D2)
D1-HCVR D1-HCDR1 D1-HCDR2 D1-HCDR3 D2-HCVR D2-HCDR1 D2-HCDR2 D2-HCDR3
H4H14634D
(번호 10)		 H4H13290P2 H4H13312P2
2 4 6 8 82 84 86 88
H4H14635D
(번호 42)		 H4H13295P2 H4H13312P2
18 20 22 24 82 84 86 88
H4H14636D
(번호 74)		 H4H13299P2 H4H13312P2
26 28 30 32 82 84 86 88
H4H14637D
(번호 90)		 H4H13301P2 H4H13312P2
42 44 46 48 82 84 86 88
H4H14638D
(번호 106)		 H4H13302P2 H4H13312P2
50 52 54 56 82 84 86 88
H4H14639D
(번호 122)		 H4H13306P2 H4H13312P2
58 60 62 64 82 84 86 88
H4H14640D
(번호 138)		 H4H13309P2 H4H13312P2
66 68 70 72 82 84 86 88
H4H14641D
(번호 187)		 H4H13313P2 H4H13312P2
90 92 94 96 82 84 86 88
H4H16445D
(번호 26)		 H4H13291P2 H4H13312P2
10 12 14 16 82 84 86 88
H4H16446D
(번호 58)		 H4H13300P2 H4H13312P2
34 36 38 40 82 84 86 88
H4H16447D
(번호 154)		 H4H13311P2 H4H13312P2
74 76 78 80 82 84 86 88
H4H16448D
(번호 219)		 H4H13318P2 H4H13312P2
106 108 110 112 82 84 86 88
H4H16449D
(번호 235)		 H4H13319P2 H4H13312P2
114 116 118 120 82 84 86 88
* 이중특이적 항체 식별자 아래에 괄호 안의 번호 지정 (예를 들어, "번호 10")은 도 1의 MET x MET 이중특이적 항체 매트릭스에 도시된 이중특이적 항체 번호를 나타낸다.
실시예 6. MET x MET 인간 이중특이적 단클론성 항체의 표면 플라스몬 공명 유래된 결합 친화도 및 동역학 상수
본원의 실시예 4에 따라 구성된 MET x MET 이중특이적 항체의 결합 친화도 및 동역학 상수를 37℃에서 표면 플라스몬 공명 (Biacore 4000 또는 T-200)으로 결정하였다. 인간 IgG4로서 발현된 이중특이적 항체 ("H4H"로 지정됨)를 단클론성 마우스 항-인간 Fc 항체 (GE, BR-1008-39)와의 아민 커플링을 통해 유도체화된 CM4 또는 CM5 Biacore 센서 표면으로 캡쳐하였다. 다양한 농도의 가용성 모노머 MET 단백질 (hMet.mmh, 서열 번호: 152)을 30 또는 50 μL/분의 유속으로 항-MET x MET 이중특이적 항체-캡쳐된 표면 위에 주사하였다. 캡쳐된 이중특이적 항체로의 피분석물의 회합을 4 또는 5분 동안 모니터링하였고 HBS-ET (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20) 또는 PBS-P (0.01M 나트륨 포스페이트 pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% v/v 계면활성제 P20) 러닝 버퍼 중에서 피분석물의 해리를 10분 동안 모니터링하였다.
동역학 결합 속도 상수 (k a) 및 해리 속도 상수 (k d)를 실시예 3에서 기술된 바와 같이 결정하였다.
모노머 Met 단백질 (hMET.mmh)에 대한 이중특이적 항-Met 항체의 결합 동역학 파라미터는 하기 표 6에서 나타나있다.
37℃에서 결합 / 항체-캡쳐 포맷
37℃에서의 결합 / 항체-캡쳐 포맷
이중특이적 항체 피분석물 ka (Ms -1 ) kd (s -1 ) K D (몰) T½ (분)
H4H14634D hMet.mmh N/A ≤ 1E-5 N/A ≥ 1155
H4H14635D hMet.mmh N/A 8.21E-05 N/A 140.6
H4H14636D hMet.mmh N/A ≤ 1E-5 N/A ≥ 1155
H4H14637D hMet.mmh N/A 3.26E-04 N/A 35.4
H4H14638D hMet.mmh N/A 1.65E-04 N/A 70.2
H4H14639D hMet.mmh N/A 1.63E-04 N/A 70.8
H4H14640D hMet.mmh N/A ≤ 1E-5 N/A ≥ 1155
H4H14641D hMet.mmh N/A 3.27E-04 N/A 35.3
H4H16445D hMet.mmh N/A 3.93E-04 N/A 29.4
H4H16446D hMet.mmh N/A 1.03E-04 N/A 111.8
H4H16447D hMet.mmh N/A 8.48E-04 N/A 13.6
H4H16448D hMet.mmh N/A 5.92E-04 N/A 19.5
H4H16449D hMet.mmh N/A 2.94E-04 N/A 39.3
표 6에서 나타난 바와 같이, 본원에서 기술된 이중특이적 "MET x MET" 항체는 1155분 초과의 T½ 값을 나타냈다.
도 7에서 나타난 바와 같이, 이중특이적 항체 H4H14639D에 대한 해리 속도는 모체 항체, H4H13306P2 및 H4H13312P2 각각의 해리 속도보다 훨씬 더 낮다.
37℃에서 이중특이적 항-MET mAb 및 단일특이적 모체의 Biacore 결합 친화도
37℃에서의 결합 / 항체-캡쳐 포맷
항체 피분석물 kd (s -1 ) T½ (분)
H4H13306P2 hMet.mmh 1.66E-02 0.7
H4H13312P2 hMet.mmh 8.40E-03 1.4
H4H14639D hMet.mmh 1.63E-04 70.8
실시예 7. 항-Met 항체는 SRE-루시퍼라아제 리포터 생물 검정에서 HFG-매개된 Met 활성화를 차단한다
항-MET 항체가 간세포 성장 인자 (HGF)-매개된 MET 활성화를 차단할 수 있는 능력을 루시퍼라아제-기반 리포터 검정에서 검사하였다. 성장 인자 HGF는 수용체 c-Met (MET)의 세포외 도메인에 결합하여, 빠른 호모다이머화를 촉발시키고 여러 다운스트림 신호 저달 캐스케이드를 활성화시킨다. 이 실시예에서 테스트된 항-MET 항체는 MET의 2가 단일특이적 바인더, 또는 항-MET "이중특이적"이며, 이중특이적 항체의 각각의 아암은 MET 상의 상이하고 별개의 에피토프에 결합하였다.
조작된 세포-기반 루시퍼라아제 리포터 검정 (도 2)을 사용하여 MET 신호 전달을 활성화시키고 (도 3, 패널 A; 표 8, 컬럼 3 및 4) MET의 리간드-매개된 활성화를 차단하는 (도 3, 패널 B; 표 8, 컬럼 1 및 2) 항-MET 항체의 능력을 결정하였다. 간략히 말하면, CIGNAL™ Lenti SRE Reporter (luc) Kit (SABiosciences, Hilden, DE)를 사용하여 HEK293/SRE-Luc 세포를 생성하였다. HEK293 (인간 배아 신장) 세포가 내인성으로 c-Met를 발현하기 때문에 이것을 선택하였다. HEK293/SRE-Luc 세포는 (SRE)-의존적 루시퍼라아제 (Luc) 리포터를 안정하게 포함하였다 (Dinter et al., PLoS ONE 10(2): e0117774, 2015 참조). HEK293/SRE-Luc 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 및 1 μg/ml 퓨로마이신으로 보충된 DMEM에서 배양하였다.
그 다음에, 2.0 x 105 HEK293/SRE-Luc 세포를 96웰 플레이트 내 루시퍼라아제 검정 배지에 분주하였고 5% CO2에서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 단계 희석된 HGF (0.01 pM 내지 1.0 nM)를 세포에 추가하고 항체의 부재 하에 4 내지 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후 루시퍼라아제 신호를 기록함으로써 간세포 성장 인자 (HGF) 용량 반응 곡선을 생성하였다. 항체 억제 곡선을 생성하기 위해, 세포를 단계 희석된 항-인간 MET 항체 (1.1 pM 내지 200 nM)와 함께 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서 신호를 기록하기 전 추가의 4 내지 6시간 동안 73 pM 또는 100 pM 농도의 HGF를 추가하였다. 별도로, 리간드의 부재 하에 항체가 c-Met를 활성화시키는 능력을 또한 평가하였다.
루시퍼라아제 활성을 ONE-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI)을 사용하여 검출하였고, 방출된 광을 Victor 또는 Envision 광도계 (Perkin Elmer, Shelton, CT)에서 측정하였고 상대적 광 유닛 (RLU)으로 표현하였다. EC50/IC50 값을 GRAPHPAD PRISM®을 사용하여 12-점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 결정하였다. 퍼센트 HGF 차단 및 배수 MET 활성화 (mAbs 단독)를 가장 높은 항체 용량에 대하여 보고하였다. 결과는 표 8에서 나타나있다.
NT = 테스트되지 않음; ND = 비-에스자 곡선 또는 불완전 차단으로 인해 EC50/IC50은 결정되지 않음
표 8에서 요약된 바와 같이, 대부분의 항체는 SRE 리포터의 활성화를 억제하였으며, IC50 값은 < 2.0 pM 내지 약 1.0 nM의 범위에 있다. 여러 예시의 단일특이적 2가 항-MET 항체, 예컨대 H4H13306P2 및 H4H13309P2는 SRE-luc 활성화의 강력한 억제자였으며, 퍼센트 억제 값은 각각 67% 및 77%였다. 항-MET 이중특이적 항체 (MET x MET)는 전체적으로 SRE-luc 활성화의 더 큰 억제를 나타냈다. 예를 들어, MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D는 95 퍼센트 억제를 나타냈다. 추가적으로, 여러 차단 항체는 리간드의 부재 하에 약하게 활성화하였으며, 배수 활성화 반응은 베이스라인 수준에 대하여 0.8 내지 14.4의 범위에 있다.
또한 도 3에서 나타난 바와 같이, 2가 단일특이적 항체 H41413306P2 및 H4H13312P2는 각각 HGF 리간드의 부재 하에 Met 경로를 활성화시키고 (패널 A) 또한 Met의 HGF 활성화를 차단한다 (패널 B).
HGF-의존적 및 HGF-독립적 MET 활성화에 대한 이중특이적 MET x MET 항체 (예를 들어, H4H14639D)의 효과를 또한 HEK293/SRE-Luc 시스템을 사용하여 평가하였다. SRE-구동된 루시퍼라아제 활성을 HGF-독립적 MET 아고니즘의 수준을 확인하기 위해 다양한 농도로 MET 항체 H4H14639D (MET x MET 이중특이적 항체), 1가 항-MET 항체, 및 H4H14639D 모체 항체 H4H13312P2가 처리된 HEK293T 세포에서 측정하였다. 모체 항-MET 단일특이적 2가 항체는 MET 아고니스트 활성을 나타내는 한편, 1가 및 MET x MET 이중특이적 항체는 MET 아고니스트 활성을 나타내지 않았다 (도 4, 패널 A).
SRE-구동된 루시퍼라아제 활성을 다양한 농도로 MET 항체 H4H14639D (MET x MET 이중특이적 항체), 1가 항-MET 항체, 및 H4H14639D 모체 항체 H4H13312P2가 처리된 HEK293T 세포에서 측정하여 HGF-의존적 MET 아고니즘의 억제 또는 차단의 수준을 확인하였다. 모체 항-MET 단일특이적 2가 항체가 약간의 HGF 차단 활성을 나타냈지만, 1가 및 MET x MET 이중특이적 항체 둘 다는 더 큰 HGF 차단을 나타냈다 (도 4, 패널 B).
MET x MET 이중특이적 항체는 HGF 신호 전달을 차단하고 낮은 MET 아고니스트 활성을 나타낸다.
실시예 8. 항-Met 항체는 Met-증폭된 세포의 성장을 억제한다
그 다음에, 선택된 항-Met 항체를 MET-증폭된 SNU5 세포의 성장을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다. 간략히 말하면, 2.5 x 103 인간 위 암종 (SNU5) 세포를 1.5 pM 내지 100 nM의 범위의 농도로 항-MET 항체의 존재 하에 완전 성장 배지에 분주하였다. SNU5 완전 성장 배지는 Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 10% FBS, 및 페니실린/스트렙토마이신/글루타민을 함유하였다. 세포를 5일 동안 인큐베이션하였고 살아있는 세포의 수를 제조사의 지시에 따라 CELLTITER-GLO® Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega, Madison, WI)를 사용하여 결정하였다.
표 9에서 요약된 바와 같이, 여러 항-MET 항체, 예컨대 H4H13312P2 및 H4H13325P2는 SNU5 성장을 50% 초과만큼 차단하였으며, 전체적인 IC50은 44 pM 내지 780 pM의 범위에 있다.
도 5는 다양한 항-MET 2가 단일특이적 항체 (즉, 통상적인 항체)로 처리된 SNU5 세포의 상대적인 세포 성장을 도시한다. 통상적인 MET 항체의 서브세트는 SNU5 MET-증폭된 위암 세포의 성장을 억제한다 (도 5). 96웰 플레이트의 SNU5 세포를 10 μg/ml의 각각의 항체로 처리하였고 alamarBlue® 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)의 감소에 의해 5일 후 세포 성장을 결정하였다. 미국 특허 7,892,550 B2 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제시된 바와 같이 MetMab의 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 사용하여 1가 MET 항체 (컬럼 2, 도 5)를 생성하였다. 통상적인 항체 8은 H4H13306P2이고, 및 통상적인 항체 11은 H4H13312P2이며, 이것들을 MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D를 구성하는데 사용하였다.
별도의 성장 검정에서, MET x MET 이중특이적 항체 (즉, H4H14639D)의 차단 활성을 SNU5 및 증폭된 Met 유전자를 나타내고 MET를 과발현하는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 EBC-1 둘 다에서 평가하였다 (Lutterbach et al., Cancer Res. 67(5): 2081-2088, 2007). EBC-1 세포에 대한 완전 성장 배지는 MEM Earle's Salts, 10% 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 및 MEM에 대한 비-필수 아미노산을 함유하였다. H4H14369D는 SRE-루시퍼라아제 판독에 따라 MET 활성의 가장 큰 퍼센트 억제를 나타냈다. 현재의 실험에서, 15 pM 내지 100 nM의 범위의 농도로 H4H14639D의 존재 하에 3.0 x 103 SNU5 또는 EBC-1 세포를 완전 성장 배지에 분주하였다. 세포를 5% CO2에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 세포를 4% 포름알데하이드에서 고정하고 3 μg/ml Hoechst 33342로 염색하여 핵을 라벨링하였다. IMAGEXPRESS® Micro XL (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 이미지를 획득하였고 핵의 개수를 METAXPRESS® Image Analysis 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 통해 결정하였다. 40 nM 디기토닌로 처리된 세포의 배경 핵 개수를 모든 웰에서 빼고 생존력을 미처리 대조군의 퍼센트로 표현하였다. 10-지점 반응 곡선 (GRAPHPAD PRISM®)에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 IC50 값을 결정하였다. IC50 값 및 퍼센트 세포 살해는 표 9에서 나타나있다.
SNU5 성장의 항-MET 항체 차단
항체 % 성장 억제 IC 50 (M) 항체 % 성장 억제 IC 50 (M)
H4H13312P2 69 7.8E-10 H4H13291P2 24 ND
H4H13325P2 57 4.4E-11 H4H13319P2 23 1.0E-10
H4H13316P2 53 1.0E-10 H4H13309P2 22 1.0E-10
H4H13302P2 40 1.1E-10 H4H13318P2 18 5.1E-11
H4H13313P2 34 4.4E-11 H4H13300P2 16 ND
H4H13301P2 33 7.4E-11 H4H13290P2 12 ND
H1H13301P2 33 1.0E-10 H4H13311P2 8 ND
H1H13316P2 30 2.0E-10 H4H13331P2 5 ND
H4H13295P2 30 ND H4H13299P2 -8 ND
H4H13306P2 28 7.1E-11
ND = 비-에스자 곡선 또는 불완전 차단으로 인해 IC50이 결정되지 않음
하기 표 10에서 요약된 바와 같이, MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D는 EBC-1 및 SNU5 세포의 성장을 37 및 40 퍼센트까지 억제하였으며, IC50은 각각 0.82 nM 및 0.3 nM이다.
항-Met 이중특이적 항체는 EBC-1 및 SNU5 성장을 차단한다
mAb IC 50 (nM) % 성장 억제
EBC-1 SNU5 EBC-1 SNU5
H4H14639D 0.82 0.30 37 40
96웰 플레이트 내 SNU5 세포 (위)를 0.1 μg/mL, 1 μg/mL, 또는 10 μg/mL의 대조군 항체, 1가 MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항체로 처리하였다. 5일 후 ALAMARBLUE® 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)의 환원에 의해 세포 성장을 결정하였다. MET x MET 이중특이적 항체는 대조군 및 1가 항체와 비교하여 SNU5 세포의 상대적인 세포 성장을 크게 감소시켰다 (도 6, 패널 A).
유사하게, EBC-1 세포 성장에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 평가하였다. 2,500 EBC-1 세포를 96웰 플레이트에 분주하고 10% FBS로 보충된 Dulbecco's Media에서 배양하였다. 세포를 0.1 μg/mL 또는 1 μg/mL의 대조군 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항체로 처리하였고, 그 이후 37℃에서 5% CO2로 인큐베이션하였다. 5일 후, Spectramax® M3 플레이트 판독기 (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA)에서 고도로 형광성 형태로의 지표 염료 ALAMARBLUE®의 환원을 측정하여 상대적인 세포 성장을 결정하였다. 결과는 표 11 및 도 6, 패널 B에서 나타나있다. MET x MET 이중특이적 항체 (H4H14639D)는 대조군 항체와 비교하여 EBC-1 세포의 상대적인 세포 성장을 크게 감소시켰다 (도 6, 패널 B).
여러 항-MET 항체, 2가 단일특이적 및 MET x MET 2가는 둘 다 SRE-Luc 활성화의 강력한 억제자이고 Met-증폭된 및 MET-과발현 세포주의 성장을 억제한다.
항-Met 이중특이적 항체는 EBC-1 세포 성장을 차단한다
상대적 세포 성장 (n=3) 표준 편차
대조군 1.000 0.045
0.1 μg/mL H4H14639D 0.397 0.032
1 μg/mL H4H14639D 0.462 0.028
실시예 9. MET x MET 이중특이적 항체는 NCI-H596 NSCLC 세포에서 적당한 및 일시적인 MET 경로 활성을 유도한다.
인간 폐 선편평세포 암종(lung adenosquamous carcinoma) 세포에서 MET 경로에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 시험관 내에서 평가하였다.
250,000개의 NCI-H596 세포를 12웰 플레이트에 분주하였고 10 % FBS로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 50 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF)또는 10 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D로 2배수로 처리하였다. 그 이후에 세포를 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 0, 2, 6 또는 18시간 후, 세포 용해물을 제조하였고, 단백질 함량을 표준화하고 면역블롯 분석을 수행하였다. MET 인산화 및ERK 인산화를 ImageJ 이미지 가공 프로그램으로 정량화하였다 (T. Collins, BioTechniques 43: S25-S30, 2007). 인산화 수준을 튜불린 로딩 대조군에 대하여 표준화하였고 대조군 처리에 관하영 배수 변화로 표현한다. 결과는 표 12에서 요약된다.
MET 및 ERK의 인산화
처리 (시간) 포스포-MET (평균 ± SD) 포스포-ERK (평균 ± SD)
대조군 (hFc) (18) 1.0 ± 0.5 1.0 ± 0.3
HGF (2) 202.3 ± 38.7 16.7 ± 1.6
HGF (6) 38.9 ± 4.9 12.4 ± 3.9
HGF (18) 59.2 ± 24.4 12.4 ± 0.9
H4H14639D (2) 69.7 ± 7.0 2.2 ± 0.9
H4H14639D (6) 9.9 ± 7.4 0.3 ± 0.4
H4H14639D (18) 1.4 ± 0.1 0.1 ± 0.1
NCI-H596 세포의 HGF 처리는 2시간에 피크인 MET 및 ERK의 강력한 활성화를 유도하였고 18시간 후 유지되었다. 적당한 MET 및 ERK 인산화를 H4H14636D 이중특이적 항체 처리로 검출하였으며, 이것은 각각 18 또는 6시간까지 베이스라인 수준으로 되돌아갔다.
실시예 10. MET x MET 이중특이적 항체는 Hs746T 위암 세포에서 단일특이적 항체보다 더 강력하게 MET 분해를 유도하고 경로 활성을 억제한다
인간 위 암종 세포의 MET 활성에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 시험관 내에서 평가하였다. 250,000개의 Hs746T 인간 위 암종 세포 (H. Smith, J. Nat'l. Cancer Inst. 62(2): 225-230, 1979)를 12-웰 플레이트에 분주하였고 10% FBS로 보충된 Modified Dulbecco's Media에서 배양하였다. 세포를 (1) 5 μg/ml의 hFc 대조군 분자, (2) 5 μg/ml의 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체 H4H13306P2, (3) 5 μg/ml의 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체 H4H13312P2, (4) 2.5 μg/mL의 H4H13306P2 및 2.5 μg/mL의 H4H13312P2의 조합, 또는 (5) 5 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D로 처리하였다. 그 이후 세포를 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 18시간 후, 세포 용해물을 제조하였고, 단백질 함유량을 표준화하였고 면역블롯 분석을 수행하였다. MET 발현, MET 인산화, 및 ERK 인산화를 ImageJ 이미지 가공 프로그램으로 정량화하였다 (T. Collins, BioTechniques 43: S25-S30, 2007). 결과는 표 13 및 도 7, 패널 A에서 요약되며, 미가공 면역블롯 데이터를 도시한다. 도 7의 패널 B는 0, 2 또는 6 hrs 동안 10 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체로 처리된 세포에서 MET 단백질 발현을 도시한다. Hs747T 세포에서 전체 MET 수준은 MET x MET 이중특이적 항체로 처리시 시간이 흐름에 따라 감소하였다. MET 증폭된 인간 유두양 선암종(papillary adenocarcinoma) NCI-H820 세포주에 대하여 유사한 결과를 얻었다 (Bean et al., "MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to getfitnib or erlotinib," Proc. Natl. Acad. Sci. 2007 Dec 26, 104(52): 20932-20937).
MET 단백질의 상대적인 수준 및 MET/ERK 경로 활성화
분자 상대적 수준 MET 단백질 (평균 ± SD) 상대적 수준 포스포-MET
(평균 ± SD) 		상대적 수준 포스포-ERK
(평균 ± SD)
대조군 (hFc) 1.00 ± 0.06 1.00 ± 0.06 1.00 ± 0.03
H4H13306P2 0.61 ± 0.09 0.57 ± 0.02 0.41 ± 0.03
H4H13312P2 1.15 ± 0.19 0.93 ± 0.04 0.39 ± 0.11
H4H13306P2+H4H13312P2 1.06 ± 0.02 1.07 ± 0.10 1.04 ± 0.23
H4H14639D 0.41 ± 0.02 0.20 ± 0.01 0.04 ± 0.01
이중특이적 항체, H4H14639D는 그것의 통상적인 모체 항체보다 더 강력하게 MET 분해를 유도하였다. MET 및 ERK 인산화를 모체 항체 또는 모체 항체의 조합보다 H4H14636D로의 처리에 의해 더 효과적으로 억제하였다.
Hs746T 위암 세포를 18시간 동안 대조군 항체, MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D, 항-MET 모체 항체 H4H13306P2, 항-MET 모체 항체 H4H13312P2, 및 모체 항체 1과 2의 조합으로 처리하였으며, 각각의 항체는 10 μg/ml이거나 또는 모체 항체의 조합은 각각 5 μg/ml였다. MET 발현 (MET) 및 경로 활성화 (pMET 및 pErk)를 표시된 항체로 면역블롯팅하여 결정하였다 (도 8). MET x MET 이중특이적 항체는 Hs746T 위암 세포에서 그것의 모체 항체보다 더 효과적으로 MET 경로 활성화를 억제한다.
실시예 11. MET x MET 이중특이적 항체는 NCI-H596 폐암 세포에서 단일특이적 항체보다 더 강력하게 MET 분해를 유도한다
인간 폐 선편평세포 암종 세포에서 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR 또는 MET)의 발현 수준에 대한 MET x MET 이중특이적 항체 및 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체의 효과를 평가하였다. 250,000개의 NCI-H596 인간 폐 선편평세포 암종 세포를 12-웰 플레이트에 분주하였고 10% FBS로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 (1) 5 μg/ml의 hFc 대조군 분자, (2) 5 μg/ml의 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체 H4H13306P2, (3) 5 μg/ml의 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체 H4H13312P2, (4) 2.5 μg/mL의 H4H13306P2 및 2.5 μg/mL의 H4H13312P2의 조합, 또는 (5) 5 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D로 처리하였다. 그 이후 세포를 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 18시간 후, 세포 용해물을 제조하고, 단백질 함유량을 표준화하고 면역 블롯 분석을 수행하였다. MET 발현을 ImageJ 이미지 가공 프로그램으로 정량화하였다 (T. Collins, BioTechniques 43: S25-S30, 2007). 결과는 표 14에서 요약된다.
MET 단백질의 상대적인 수준
분자 상대적인 MET 수준
대조군 (hFc) 1 ± 0.03
H4H13306P2 0.50 ± 0.01
H4H13312P2 0.35 ± 0.04
H4H13306P2+H4H13312P2 0.61 ± 0.04
H4H14639D 0.24 ± 0.01
NCI-H596 (MET 엑손14 스킵(skip) 돌연변이) 폐암 세포를 또한 대조군 또는 10 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체로 2, 6 또는 18 hrs 동안 처리하였다. MET 발현을 면역 블롯팅으로 결정하였으며 (도 9), 이것은 처리 시간이 증가함에 따른 MET의 MET x MET 이중특이적 항체-유도된 분해를 나타낸다.
이중특이적 항체, H4H14636D는 NCI-H596 폐암 세포에서 그것의 통상적인 모체 항체보다 더 강력하게 MET 분해를 유도한다.
실시예 12. MET x MET 이중특이적 항체는 SNU5 위암 세포에서 단일특이적 항체보다 더 강력하게 MET 분해를 유도하고 경로 활성을 억제한다
위 암종 세포에서 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR 또는 MET)의 발현 수준에 대한 2가 단일특이적 항-MET 항체 및 여러 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 평가하였다. 인간 위 암종 SNU5 세포를 20% FBS 플러스 펜-스트렙--글루타민을 함유하는 Iscove's 배지에서 평판배양하였다. 분주 24시간 후, 세포를 대조군 hFc, 항-MET 모체 2가 단일특이적 항체 H4H13312P2, 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (H4H14634D, H4H14635D, H4H14636D, H4H14637D, H4H14638D, H4H14639D, H4H14640D, H4H14641D)로 18 hrs 동안 처리하였다. 이어서 세포 용해물을 제조하고 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 면역 블롯을 MET 및 튜불린에 대하여 탐침하였다. MET 단백질 발현 수준을 정량화하고 튜불린 로딩 대조군에 관하여 표준화하였다. 결과는 표 15 및 도 10, 패널 B에서 제공된다.
MET 단백질의 상대적인 수준
분자 상대적인 MET 수준 분자 상대적인 MET 수준
대조군 (hFc) 1 H4H14637D 0.49
H4H13312P2 0.62 H4H14638D 0.35
H4H14634D 0.45 H4H14639D 0.27
H4H14635D 0.27 H4H14640D 0.18
H4H14636D 0.50 H4H14641D 0.31
SNU5 암 세포를 상기 기술된 바와 같이 대조군 항체 또는 10 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체 또는 1가 MET 항체로 18 hrs 동안 처리하였다. MET 발현 (도 10, 패널 A 및 B), 및 경로 활성화 (즉, pMET 및 pERK; 패널 A)를 표시된 항체로 면역 블롯팅하여 결정하였다. 면역 블롯은 도 10에서 나타나있다.
MET x MET 이중특이적 항체로의 SNU5 세포의 처리는 2가 단일특이적 항-MET 항체 (H4H13312P2) (도 10, 패널 B), 1가 MET 항체 또는 대조군 hFc로의 처리보다 더 강력한 MET의 분해를 유도하였다. MET x MET 이중특이적 항체로의 SNU5 세포의 처리는 MET 경로의 다운스트림 효과기를 억제하였다. MET 증폭된 비-소세포 폐암 선암종 세포주 NCI-H1993에 대해서 유사한 결과를 얻었다 (Kubo et al., "MET gene amplification or EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR tyrosine kinase inhibitors," Int. J. Cancer 2009 Apr 15; 124(8): 1778-1784).
실시예 13. MET x MET 이중특이적 항체는 EBC-1 세포에서 단일특이적 항체보다 더 강력하게 MET 분해를 유도하고, 경로 활성을 억제하고, 종양 성장을 억제한다.
MET-증폭된 인간 폐 편평 세포 암종 EBC-1 세포 (Lutterbach et al., "Lung cancer cell lines harboring MET gene amplification are dependent on Met for growth and survival," Cancer Res. 2007 Mar 1;67(5):2081-8)를 상기 기술된 바와 같이 대조군 항체 또는 10 μg/ml의 MET x MET 이중특이적 항체로 18 hrs 동안 처리하였다. pMET 및 pErk 발현에 의해 확인된 MET 발현 및 MET 경로 활성화를 표시된 항체로 면역 블롯팅하여 결정하였다. 면역 블롯은 도 11에서 나타나있다.
MET x MET 이중특이적 항체로의, MET 유전자 증폭을 숨기고 있는 EBC-1 세포의 처리는 대조군 항체로의 처리보다 더 강력한 MET의 분해를 유도하였다. MET x MET 이중특이적 항체로의 EBC-1 세포의 처리는 MET 경로의 다운스트림 효과기를 억제하였다.
또 다른 실험에서, 5백만 개의 EBC-1 세포를 C.B.-17 SCID 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다. 종양 부피가 대략 150 mm3에 도달하면, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 25 mg/kg의 대조군 항체 또는 25 mg/kg의 MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D로 주 2회 처리하였다. 종양 성장을 이식 후 30일 동안 모니터링하였고 종양 부피 (mm3)를 시간이 흐름에 따라 각 실험군에 대하여 측정하였다. 결과는 표 16 및 도 12에서 도시되며, 이것은 MET x MET 이중특이적 항체가 EBC-1 종양의 성장을 크게 억제한다는 것을 나타낸다.
상대적인 EBC-1 종양 성장
처리 처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm3)
(평균 ± SEM)
25 mg/kg 대조군 1394 ± 226
25 mg/kg H4H14639D 89 ± 47
실시예 14. MET x MET 이중특이적 항체는 단일특이적 항체보다 더 강력하게 Hs746T 위암 세포의 시험관 내 성장을 억제한다
인간 위 암종 세포의 성장에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 시험관 내에서 평가하였다. 2,500개의 Hs746T 인간 위 암종 세포 (H. Smith, J. Nat'l. Cancer Inst. 62(2): 225-230, 1979)를 96웰 플레이트에서 분주하였고 10% FBS로 보충된 Modified Dulbecco's Media에서 배양하였다. 세포를 (1) 5 μg/ml의 개개의 2가 단일특이적 항-MET 항체 (H4H13306P2 또는 H4H13312P2), (2) 각각 2.5 μg/ml의 2개의 2가 단일특이적 항-MET 모체 항체 (H4H13306P2 및 H4H13312P2)의 조합, 또는 (3) 5 μg/ml의, H4H13306P2의 한 결합 아암 및 H4H13312P2의 다른 결합 아암을 함유하는 이중특이적 항체 (H4H14639D)로 처리하였다. 그 이후 세포를 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후, Spectramax® M3 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 고도로 형광성 형태로의 지표 염료, Alamar blue® (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA)의 환원을 측정하여 상대적인 세포 성장을 결정하였다. 형광의 증가는 세포 성장과 연관성이 있다. 표 17은 대조군 (미처리) Hs746T 세포 성장에 대하여 표준화된 각각의 항체 처리에 대한 상대적인 Hs746T 세포 성장을 도시한다. 이중특이적 항체, H4H14639D는 개별적으로 또는 조합으로 단일특이적 모체 항체보다 더 강력하게 Hs746T 세포의 증식을 억제한다.
표준화된 Hs746T 세포 성장
상대적인 세포 성장
(n=3) 		표준 편차
대조군 1 0.133497801
H4H14639D 0.647408139 0.019090432
H4H13306P2 1.623312821 0.189647479
H4H13312P2 0.852680493 0.01728527
H4H13306P2+H4H13312P2 1.767720125 0.077445717
Hs746T 위암 세포를 각각 2 μg/ml의 대조군 항체, MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D, 항-MET 모체 항체 H4H13306P2, 항-MET 모체 항체 H4H13312P2, 및 모체 항체 1과 2의 조합으로 처리하였다. 세포 성장을 5일 후 ALAMAR BLUE® 시약의 환원에 의해 결정하였다 (도 13, 패널 A). MET x MET 이중특이적 항체는 단독 또는 조합된 모체 항체에 관하여 세포 성장을 억제하였고, Hs746T 위암 세포에서 그것의 모체 항체보다 더 효과적으로 MET 경로 활성화를 억제하였다.
96웰 플레이트 내 Hs746T 위암 세포를 25 μg/mL 대조군 항체, 1 μg/mL, 10 μg/mL 또는 25 μg/mL 1가 MET 항체, 또는 1 μg/mL, 10 μg/mL 또는 25 μg/mL MET x MET 이중특이적 항체로 처리하였다. Hs746T 위암 세포 성장을 5일 후 alamarBlue® 시약의 환원에 의해 결정하였다 (도 13, 패널 B). MET x MET 이중특이적 항체는 MET-증폭된 세포의 성장을 강력하게 억제한다.
실시예 15. MET x MET 이중특이적 항체는 시험관 내에서 NCI-H596 폐암 세포의 성장을 유도하지 않는다
인간 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포 (NCI-H596)의 성장에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 시험관 내에서 평가하였다. 10,000개의 NCI-H596 폐 선편평세포 암종 세포 (Nair et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 86(5): 378-383, 1994)를 96웰 플레이트에서 1% 소 태아 혈청 (FBS)로 보충된 배지 중 0.66% 한천(agar)의 층에 분주하였다. 세포를 0.3 % 아가로스와 함께 1 % FBS로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 (1) 5 μg/ml의 개개의 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체 (H4H13306P2 또는 H4H13312P2), (2) 각각 2.5 μg/ml의 2개의 모체 2가 단일특이적 항-MET 항체의 조합 (H4H13306P2 및 H4H13312P2), (3) 5 μg/ml의, H4H13306P2의 한 결합 아암 및 H4H13312P2의 다른 결합 아암을 함유하는 이중특이적 항체 (H4H14639D), 또는 (4) 100 ng/mL의 간세포 성장 인자 (HGF)로 처리하였다. 그 이후 세포를 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 2주 후, 상대적인 세포 성장을 Spectramax® M3 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 고도로 형광성 형태로의 지표 염료, Alamar blue® (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA)의 환원을 측정하여 결정하였다. 형광의 증가는 세포 성장과 연관성이 있다. 표 18 및 도 14는 대조군 (미처리) NCI-H596 세포 성장에 대하여 표준화된 각각의 항체 처리에 대한 상대적인 NCI-H596 세포 성장을 도시한다. HGF로의 NCI-H596 폐암 세포의 처리는 연한천에서 성장을 강력하게 유도하였다. MET x MET (도 14에서 MM) 이중특이적 항체 H4H14639D는 대조군 처리된 세포에 비해 성장을 크게 변화시키지 않았다. 세포 성장의 적당한 유도를 각각의 모체 2가 단일특이적 항체 H4H13306P2 (M1) 또는 H4H13312P2 (M2) 개별적으로, 또는 조합된 (H4H13306P2 및 H4H13312P2) (M1M2)로 관찰하였다.
NCI-H596 세포 성장
상대적인 세포 성장 (n=3) 표준 편차
대조군 1 0.030074808
H4H14639D 1.070339237 0.075103746
H4H13306P2 2.9593578 0.337877264
H4H13312P2 1.686580346 0.145670753
H4H13306P2+H4H13312P2 1.693724668 0.168651046
HGF 7.87655937 0.46057617
실시예 16. MET x MET 이중특이적 항체는 SNU5 위암 세포의 시험관 내 성장을 단일특이적 항체보다 더 강력하게 억제한다
인간 위 암종 세포의 성장에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 억제를 시험관 내에서 평가하였다. 2,500개의 SNU5 인간 위 암종 세포 (Ku and Park, Cancer Res. Treat. 37(1): 1-19, 2005)를 96웰 플레이트에 분주하였고 20% FBS로 보충된 Iscove's Modified Dulbecco's Medium에서 배양하였다. 세포를 (1) 5 μg/ml의 개개의 2가 단일특이적 항-MET 항체 (H4H13306P2 또는 H4H13312P2), (2) 각각 2.5 μg/ml의 2개의 2가 단일특이적 항-MET 항체 (H4H13306P2 및 H4H13312P2)의 조합, 또는 (3) 5 μg/ml의, H4H13306P2의 한 결합 아암 및 H4H13312P2의 다른 결합 아암을 함유하는 이중특이적 항체 (H4H14639D)로 처리하였다. 그 이후 세포를 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후, 상대적인 세포 성장을 Spectramax® M3 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 고도로 형광성 형태로의 지표 염료, Alamar blue® (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA)의 환원을 측정하여 결정하였다. 형광의 증가는 세포 성장과 연관성이 있다. 표 19는 대조군 (미처리) SNU5 세포 성장에 대하여 표준화된 각 항체 처리에 대한 상대적인 SNU5 세포 성장을 도시한다. 이중특이적 항체, H4H14639D는 단일특이적 모체 항체보다 더 강력하게 SNU5 세포의 증식을 억제한다.
표준화된 SNU5 세포 성장
상대적인 세포 성장 (n=3) 표준 편차
대조군 1 0.070814765
H4H14639D 0.271100069 0.01324024
H4H13306P2 0.766317547 0.061930288
H4H13312P2 0.431990234 0.033183065
H4H13306P2+H4H13312P2 0.331287005 0.012042949
실시예 17. MET x MET 이중특이적 항체는 Hs746T 종양 이종 이식의 퇴화를 유도한다
면역 손상된 마우스 모델에서 인간 위 암종 종양에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 평가하였다. 3백만 개의 Hs746T 인간 위 암종 세포를 CB-17 SCID 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다 (Bancroft et al., J. Immunol. 137(1): 4-9, 1986). 종양 부피가 대략 200 mm3에 도달하면, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 25 mg/kg의 대조군 항체 또는 25 mg/kg의 MET x MET 이중특이적 항체 H4H14639D로 주 2회 처리하였다. 종양 성장을 이식 후 30일 동안 모니터링하였고 종양 부피 (mm3)를 시간이 흐름에 따라 각 실험군에 대하여 측정하였다. 결과는 표 16 및 도 12에서 도시되며, 이것은 MET x MET 이중특이적 항체가 EBC-1 종양의 성장을 크게 억제한다는 것을 나타낸다. 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 25 mg/kg의 대조군 항체 또는 25 mg/kg의 MET x MET 이중특이적 항체 (H4H14639D)로 주 2회 처리하였다. 대조군-처리된 종양이 프로토콜 크기 제한에 도달했을 때, 대조군에 대하여 이식 후 16일 동안 종양 성장을 모니터링하였다. H4H14639-처리군에 대하여 이식 후 30일 동안 종양 성장을 모니터링하였다.
MET x MET 이중특이적 항체로의 종양의 처리는 21일 동안 처리 시작에 비해 종양 크기의 퇴화를 유도하였다. 대조군-처리된 종양은 성장 16일 동안 평균 약 12-배의 부피의 증가를 나타냈다 (표 20). 시간이 흐름에 따른 종양 부피는 MET x MET 이중특이적 항체로 인해 Hs746T 종양 퇴화를 나타내며, 도 15에서 나타나있다.
Hs746T 위 종양 성장
항체
(mg/kg) 		처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm 3 )
(평균 ± SEM)
대조군 (10) 1164 ± 138
H4H14639D (25) -215 ± 8.3
실시예 18. MET x MET 이중특이적 항체는 SNU5 종양 이종 이식의 퇴화를 유도한다
면역 손상된 마우스 모델에서 인간 위 암종 종양에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 평가하였다. 천만 개의 SNU5 인간 위 암종 세포를 CB-17 SCID 마우스의 옆구리에 피하로 이식하였다. 종양 부피가 대략 500 mm3에 도달하면, 마우스를 5개의 군으로 무작위로 분류하고 10 mg/kg의 대조군 항체 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 MET x MET 이중특이적 항체 (H4H14639D)로 주 2회 처리하였다. 대조군-처리된 종양이 프로토콜 크기 제한에 도달했을 때인 종양 성장을 이식 후 81일 동안 모니터링하였다.
1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 MET x MET 항체로 처리된 마우스의 종양은 각각 평균 약 95% 또는 98%의 크기의 감소를 입증하였다. 대조군-처리된 종양은 처리 시작부터 평균 약 12-배의 부피의 증가를 나타냈다 (표 21).
SNU5 위 종양 성장
항체
(mg/kg) 		처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm 3 )
(평균 ± SEM)
대조군 (10) 1123 ± 194
H4H14639D (1) -477 ± 43
H4H14639D (10) -492 ± 18
피하로 이식된 SNU5 종양을 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 대조군 항체, 1가 MET 항체, 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 MET x MET 이중특이적 항체로 주 2회 처리하였다. MET-증폭된 SNU5 종양의 강력하고 지속적인 퇴화 (즉, 종양 부피의 감소)를 MET x MET 이중특이적 항체로 처리된 상기 마우스에서 시간이 흐름에 따라 관찰하였다 (도 16, 패널 A). 단백질을 연구가 끝난 종양으로부터 추출하였고 MET 인산화 (pMET 발현)에 의해 표시된 바와 같이 MET 발현 및 경로 활성화를 면역 블롯팅에 의해 결정하였다. MET x MET 처리된 마우스 (종양)는 대조군에 비해 MET 및 pMET 발현의 감소를 나타냈다 (도 16, 패널 B). MET x MET 이중특이적 항체는 MET 증폭을 숨기고 있는 종양의 강력한 억제자이다.
실시예 19. MET x MET 이중특이적 항체는 U87-MG 종양 이종 이식의 퇴화를 유도한다
면역 손상된 마우스 모델에서 인간 교아세포종 종양에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 평가하였다. 5백만 개의 U87-MG 인간 교아세포종 세포 (Vordermark and Brown, Int. J. Radiation Biol. 56(4): 1184-1193, 2003)를 CB-17 SCID 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다. U87-MG 교아세포종 이종이식 모델은 자가 분비 HGF 신호 전달에 의해 구동된다. 종양 부피가 대략 100 mm3에 도달할 때, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 대조군 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (H4H14639D)로 처리하였다. 25 mg/kg의 항체 (대조군 또는 MET x MET)를 각각의 마우스에 주 2회 투여하였다. 종양 성장을 대조군-처리된 종양이 프로토콜 크기 제한에 도달할 때 이식 후 29일 동안 모니터링하였다.
MET x MET 항체로 처리된 마우스의 종양은 평균 약 38%의 크기 감소를 입증하는 반면에, 대조군-처리된 종양은 성장 29일 동안 평균 약 19-배의 부피 증가를 나타냈다 (표 22). 시간이 흐름에 따른 종양 부피는, MET x MET 이중특이적 항체로 인해 U87-MG 종양 퇴화를 나타내며, 도 17에 나타나있다.
교아세포종 종양 성장
항체
(mg/kg) 		처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm 3 )
(평균 ± SEM)
대조군 (25) 1777 ± 98
H4H14639D (25) -38 ± 18
실시예 20. MET x MET 이중특이적 항체는 U118-MG 종양 이종 이식의 성장을 억제한다
면역 손상된 마우스 모델에서 인간 교아세포종 종양에 대한 MET x MET 이중특이적 항체의 효과를 평가하였다. U118-MG 교아세포종 이종이식 모델은 자가 분비 HGF 신호 전달에 의해 구동된다. 5백만 개의 U118-MG 인간 교아세포종 세포 (Olopade et al., Cancer Research 52: 2523-2529, 1992)를 CB-17 SCID 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다. 종양 부피가 대략 100 mm3에 도달할 때, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 대조군 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항체 (H4H14639D)로 처리하였다. 25 mg/kg의 항체 (대조군 또는 MET x MET)를 각 마우스에 주 2회 투여하였다. 종양 성장을 이식 후 72시간 동안 모니터링하였다.
MET 항체는 72일 기간 동안 종양 성장을 99%까지 억제하였다 (표 23).
교아세포종 종양 성장
항체
(mg/kg) 		처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm 3 )
(평균 ± SEM) 		대조군에 비해 종양 성장의 % 감소
대조군 (25) 1228 ± 123 -
H4H14639D (25) 11 ± 18 99.1
또 다른 실험에서, 마우스에서 피하로 이식된 U118-MG 교아세포종 종양을 25 mg/kg 대조군 항체, 1가 MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항체로 주 2회 투여하였다. 시간이 흐름에 따라 각 실험군에 대한 종양 부피 (mm3)를 측정하였다. 결과는 도 18에서 도시되며, 이것은 MET x MET 이중특이적 항체가 U118-MG 종양의 성장을 억제한다는 것을 나타낸다.
실시예 21: 메이탄시노이드 합성
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌-카르바밀-(p-아미노)벤질-시트룰린-발린-아디포일-숙시네이트 (도 20의 화합물 1)를 하기 기술된 바와 같이 화합물 2 (도 19)로부터 합성하였다.
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-Fmoc-N-Me-베타-알라닌 (화합물 3, 도 19). Des-아세틸-메이탄신 (화합물 2, 도 19, 0.433 g, 0.666 mmol), Fmoc-N-Me-베타-Ala (0.434 g, 1.33 mmol), 및 HATU (0.757 g, 1.99 mmol)를 건조 플라스크로 칭량하고, 무수 DMF (9 mL)에 용해시키고, 4-메틸모르폴린 (0.300 mL, 2.73 mmol)으로 처리하였다. 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 반응물을 주위 온도에서 교반하였다. 3일 후 혼합물을 오일로 증발시키고, 아세토니트릴 및 물에 용해시키고 275g C18 실리카 컬럼 (20분 동안 수중 30 - 90% 아세토니트릴, 두 개의 상 중 0.05% 아세트산)에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 분획의 동결건조는 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다. 미정제물을 80g 실리카 겔 컬럼 (17분 동안 EtOAc - 5:5:1 EtOAc:DCM:MeOH)에서 정제하였다. 순수한 분획을 조합하고, 증발시키고, 진공에서 밤새도록 건조시켜 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.424 g, 66%). MS (ESI, pos.): C51H61ClN4O12에 대한 계산치, 956.4; 측정치 956.9 (M+H), 979.0 (M+Na), 939.0 (M-H2O+H).
N-tert-부톡시카르보닐-N-메틸-베타-알라닌 숙시네이트 에스터 (화합물 4, 도 19) . 표제 화합물을 해당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 상업적 Boc-N-Me-베타-Ala-OH로부터 제조하였다 (cf.- Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4401). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.62 (bm, 2H), 2.88 (m, 9H), 1.47 (s, 9H).
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-Boc-N-Me-베타-알라닌 (화합물 5, 도 19). 방법 A: 이전 단계의 생성물 (화합물 4, 도 19, 0.453 g, 1.51 mmol) 및 des-아세틸-메이탄신 (화합물 2, 도 19, 0.304 g, 0.468 mmol)을 3:1 아세토니트릴:물 (8 mL)에 용해시키고, 1M 수성 NaHCO3 (0.5 mL)로 처리하고, 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC에 의해 결정된 것처럼 완료되면, 소금물과 함께 10분 동안 교반하고 에틸 아세테이트 (EtOAc)로 3회 추출하였다.조합된 유기층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 진공에서 20g 실리카 겔 카트리지 (15분 동안 EtOAc 중 0 - 10% MeOH) 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 금색 시럽으로 농축시키고 건조하여 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.084 g, 43%). MS (ESI, pos.): C41H59ClN4O12에 대한 계산치, 834.4; 측정치 835.2 (M+H), 857.2 (M+Na), 817.4 (M-H2O+H).
방법 B : Boc-N-Me-베타-Ala-OH (0.294 g, 1.45 mmol)를 무수 DMF (5 mL)에 용해시키고, 펜타플루오로페닐 다이페닐포스피네이트 (FDPP, 0.555 g, 1.44 mmol)로 처리하고, 반응물을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 무수 DMF (7 mL) 중 des-아세틸-메이탄신 (화합물 2, 도 19, 0.462 g, 0.711 mmol) 및 디아이소프로필에틸아민 (DIEA, 0.250 mL, 1.44 mmol)의 혼합물을 함유하는 더 큰 플라스크로 옮기고, 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 반응물을 주위 온도에서 다시 교반하였다. 24시간 후 반응물을 진공에서 오일로 농축하고, 에틸 아세테이트 (EtOAc, 2 mL)에 용해시키고, 40g 실리카 겔 카트리지 (15분 동안 EtOAc - 5:5:1 EtOAc/DCM/MeOH) 상에서 정제하여, 연노란색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.468 g, 79%). MS (ESI, pos.): C41H59ClN4O12에 대한 계산치, 834.4; 측정치 857.2 (M+Na), 817.2 (M-H2O+H).
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌 (화합물 6, 도 19) . 방법 A: 메이탄신-N-Me-L-Ala-Boc-N-Me-베타-Ala (화합물 5, 도 19, 0.464 g, 0.555 mmol)를 아세토니트릴/물/트라이플루오로아세트산의 3:1:1 혼합물 (7 mL)에 용해시키고, 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 반응물을 24시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음, 뚜껑을 덮고 -20 ℃에서 3일 동안 저장하였다. 미정제 반응 혼합물을 2시간 동안 주위 온도로 가온하고, 진공에서 간략히 농축시키고, 100g C18 RediSep Gold 컬럼 (25분 동안 수중 20 - 80% 아세토니트릴, 두 용매 중의 0.1% TFA)에서 정제하고, 조합된 순수한 분획을 주위 온도에서 부분적으로 증발시키고, 드라이아이스 수조에서 냉동시키고 동결건조하여 연노란색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.295 g, 63%). MS (ESI, pos.): C36H51ClN4O10에 대한 계산치, 734.3; 측정치 735.7 (M+H), 1471.3 (2M+H).
방법 B: 메이탄신-N-Me-L-Ala-Fmoc-베타-Ala (화합물 3, 도 19, 0.422 g, 0.441 mmol)를 DMF (6.00 mL, 3.04 mmol) 중의 5% 피페리딘에서 용해시키고, 반응 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 3시간 후 반응을 LCMS에 의해 완료시키고, 진공에서 농축하고, 밀봉하고, -20 ℃에서 밤새도록 저장하였다. 미정제 생성물을 주위 온도로 가온하고, 아세토니트릴 및 10% aq. 아세트산 (각각 3 mL)로 처리하고, 275g C18 실리카 컬럼 (20분 동안 수중 10 - 90% 아세토니트릴, 두 용매 중의 0.05% 아세트산)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 분획의 동결건조는 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다. 고체를 건조 다이에틸 에테르로 3회 저작하고, 여과하고, 고체를 DCM으로 프릿으로부터 씻어내고, 여과물을 증발시키고 진공에서 건조하여 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.311 g, 89%). MS (ESI, pos.): C36H51ClN4O10에 대한 계산치, 734.3; 측정치 735.0 (M+H).
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌-카르바밀-(p-아미노)벤질-시트룰린-발린-Fmoc (화합물 7, 도 20) . 단계 1: 이전 단계의 생성물 (화합물 6, 도 19, 0.310 g, 0.390 mmol), 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸 (HOAT, 0.164 g, 1.20 mmol), 나트륨 바이카보네이트 (0.138 g, 1.64 mmol), 및 Fmoc-발린-시트룰린-(p-아미노)벤질-(p-니트로페닐)카보네이트 (0.595 g, 0.776 mmol, 해당 분야에 공지된 방법으로 제조됨, cf.- Gangwar et al., 미국 특허 7,714,016 B2)을 무수 DMF (10 mL)에 용해시키고, 반응 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 24시간 후 반응물을 진공에서 대략 2-3 mL로 일부 증발시키고, 10% aq. 아세트산 및 물 (각각 대략 1 mL)로 처리하고, 아세토니트릴 (대략 6 mL)에 용해시키고, 275g C18 실리카 컬럼 (20분 동안 수중 30 - 90% 아세토니트릴, 두 용매에서 0.05% 아세트산)에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 부분적 증발, 냉동, 및 동결건조로 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.362 g, 68%). MS (ESI, pos.): C70H88ClN9O17에 대한 계산치, 1361.6; 측정치 1362.1 (M+H), 1384.1 (M+Na), 1344.1 (M-H2O+H).
단계 2:
이전 단계의 생성물 (0.360 g, 0.264 mmol)을 DMF (7 mL) 중의 5% 피페리딘에 용해시키고, 반응 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 3시간 후 반응물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 10% aq. 아세트산 (2 mL)으로 처리하고, 아세토니트릴 (4 mL)에 용해시키고, 275g C18 실리카 컬럼 (20분 동안 수중 10 - 70% 아세토니트릴, 두 용매에서 0.05% 아세트산)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 조합하고, -20 ℃에서 밤새도록 저장하고, 진공에서 25 - 30 ℃에서 부분적으로 증발시키고, 드라이아이스 위에서 냉동시키고, 6일 동안 동결건조하여 연노란색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.303 g, 95%). MS (ESI, pos.): C15H78ClN9O15에 대한 계산치, 1139.5; 측정치 1140.1 (M+H), 1162.0 (M+Na).
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌-카르바밀-(p-아미노)벤질-시트룰린-발린-아디프산 (화합물 8, 도 20) . 이전 단계의 생성물 (화합물 7, 도 20, 0.205 g, 0.171 mmol), 아디프산 (0.258 g, 1.77 mmol), 및 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-다이하이드로퀴놀린 (EEDQ, 0.215 g, 0.869 mmol)을 건조 DCM (10 mL) 및 무수 메탄올 (5 mL)에 용해시키고, 반응 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 21시간 후 반응물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 아세토니트릴/물 몇 mL에 용해시키고, 150g C18 실리카 컬럼 (17분 동안 수중 20 - 80% 아세토니트릴, 두 용매 중의 0.05% 아세트산)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 18시간 동안 순수한 분획의 부분적 증발, 냉동, 및 동결건조는 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.140 g, 65%). MS (ESI, pos.): C61H86ClN9O18에 대한 계산치, 1267.6; 측정치 1268.9 (M+H), 1290.9 (M+Na).
메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌-카르바밀-(p-아미노)벤질-시트룰린-발린-아디포일-숙시네이트 (화합물 1, 도 20) . 이전 단계의 생성물 (화합물 8, 도 20, 0.061 g, 0.048 mmol), N-하이드록시숙신이미드 (0.063 g, 0.55 mmol), 및 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보다이이미드 하이드로클로라이드 (EDC-HCl, 0.071 g, 0.37 mmol)을 건조 DCM (7 mL)에 용해시키고, 반응 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고, 아르곤으로 세정하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 5일 후 반응물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 아세토니트릴/물 몇 mL에 용해시키고, 100g C18 실리카 컬럼 (15분 동안 수중 30 - 90% 아세토니트릴, 두 용매 중의 0.05% 아세트산)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 18시간 동안 가장 깨끗한 생성물 분획의 부분적 증발, 냉동, 및 동결건조는 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (0.044 g, 67%). MS (ESI, pos.): C65H89ClN10O20에 대한 계산치, 1364.6; 측정치 1365.7 (M+H), 1387.7 (M+Na), 1347.7 (M-H2O+H). 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 7.56 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.71 (m, 1H), 6.62 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 15.1, 11.3 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 15.3, 9.1 Hz, 1H), 5.38-5.32 (m, 1H), 5.03 (t, J = 15.1 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.61 (dd, J = 9.1, 3.6 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.17 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.61 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.27 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 3.17-3.07 (m, 5H), 2.97 (dd, J = 16.6, 9.9 Hz, 1H), 2.88 (d, J = 11.7 Hz, 3H), 2.84 (s, 4H), 2.77 (s, 2H), 2.66 (s, 2H), 2.62 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.56 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 2.32 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.15 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.10 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 1.92 (s, 4H), 1.75 (m, 5H), 1.61 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.27 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.22 (dt, J = 12.7, 6.3 Hz, 6H), 0.95 (t, J = 5.9 Hz, 7H), 0.78 (s, 3H).
DM1을 WO 2015/031396 (예를 들어, 실시예 2, 문단 [00106]) (그 전문이 참조로 포함됨)에서 기술된 과정에 기초하여 단일 부분입체이성질체로서 합성하였다.
실시예 22. 항체 컨쥬게이션 및 컨쥬게이트의 특성화
항체 컨쥬게이션
50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 8.0, 및 10-15% (v/v) DMA 중의 항체 (H4H14639D, H4H13312P, H4H14635D, 및 아이소타입 대조군; 10-20 mg/ml)를 실시예 21에서 기술된 바와 같이 제조된 SMCC-DM1 부분입체이성질체 (메이탄시노이드 A) 또는 메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌-카르바밀-(p-아미노)벤질-시트룰린-발린-아디포일-숙시네이트 (화합물 1, 도 20) (메이탄시노이드 B)의 5-6 배 초과량과 주위 온도에서 2시간 동안 컨쥬게이션시켰다. 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 또는 광범위 한외여과에 의해 정제하고 멸균 여과하였다. 단백질 농도를 UV 스펙트럼 분석에 의해 결정하였다. 크기 배제 HPLC는 사용된 모든 컨쥬게이트가 >90% 모노머인 것을 입증하였고, RP-HPLC는 <1% 컨쥬게이션되지 않은 링커 페이로드가 존재한다는 것을 입증하였다. 모든 컨쥬게이션된 항체를 Hamblett et al. (American Association for Cancer Research. 2004 Oct 15;10(20):7063-70)에 따른 링커 페이로드 로딩값에 대하여 UV에 의해 및/또는 컨쥬게이션된 것에 대한 고유한 것의 질량 차이에 의해 분석하였다. 항체에 대한 페이로드의 비율은 표 24에서 보고되어 있다.
각각의 항체 약물 컨쥬게이트에 대한 퍼센트 수율 및 항체에 대한 페이로드 비율
항체 수율 (%) DAR (MS) DAR (UV)
H4H14639D-메이탄시노이드 A 60 3.8 3.7
H4H14639D- 메이탄시노이드 B 50 2.4 2.4
H4H13312P-메이탄시노이드 A 60 4.1 4.1
H4H13312P-메이탄시노이드 B 50 2.3 2.5
아이소타입 대조군
REGN1945-메이탄시노이드 B		 70 2.3 2.5
아이소타입 대조군
REGN1945-메이탄시노이드 A		 80 3.7 3.7
액체 크로마토그래피-질량 분석법에 의한 컨쥬게이트의 특성화
항체에서 링커-페이로드의 로딩량을 결정하기 위해서, 컨쥬게이트를 탈글리코실화하고, LC-MS로 분석하였다.
검정을 위해, 50 μg의 컨쥬게이트를 milli-Q 물로 1 mg/mL의 최종 농도로 희석하였다. 10 μL의 PNGase F 용액 [PNGase F 용액은 PNGase F 스톡 (New England Biolabs, Cat#P0704L) 150 μL 및 milli-Q 물 850 μL를 추가하여 제조되고 잘 혼합하였다]을 희석된 컨쥬게이트 용액에 추가한 다음 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 샘플 5 μL를 LC-MS (Waters Synat G2-Si)에 주사하고 25분 동안 0.1 mL/분의 구배 이동상 20-40%로 용출하였다 (이동상 A: H2O 중의 0.1%v/v FA; 이동상 B: 아세토니트릴 중의 0.1% v/v FA). LC 분리를 80 ℃에서 Waters Acquity BEH C4 컬럼 (1.0 X 50 mM, 1.7 μM)에서 달성하였다.
질량 분석 스펙트럼을 Masslynx 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션하였고(deconvulated) 항체에 대한 약물 비율 (DAR)을 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:
1. 분포 피크 강도 (PI)에 의한 약물 (Dn)의 상대적 퍼센트 (%):
(n= 0,1,2,3,.,i)
2. 평균 DAR 계산:
실시예 23. 컨쥬게이션된 인간 단클론성 항-MET (단일특이적 및 이중특이적) 항체의 표면 플라스몬 공명 유래된 결합 친화도 및 동역학 상수
MCC-DM1 부분입체이성질체 (메이탄시노이드 A) 또는 메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌-N-Me-베타-알라닌-카르바밀-(p-아미노)벤질-시트룰린-발린-아디포일-숙시네이트 (화합물 1, 도 20) (메이탄시노이드 B)와 컨쥬게이션된 항-MET 항체에 결합하는 MET에 대한 평형 해리 상수 (K D 값)을 Biacore 2000 기구에서 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 결정하였다. Biacore 센서 표면을 단클론성 마우스 항-인간 Fc 항체 (GE Healthcare, #BR-1008-39)와의 아민 커플링에 의해 유도체화하여 항-MET ADC 및 인간 불변 영역과 함께 발현되는 모체 미변형 항체를 캡쳐하였다. Biacore 결합 연구를 HEPES 완충된 식염수 (HBS)-EP 러닝 버퍼 (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20)에서 수행하였다. C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그를 발현하는 인간 MET (hMET-mmh)를 사내에서(in-house) 제조하였다. HBS-EP 러닝 버퍼에서 제조된 상이한 농도 (3-배 희석)의 hMET-mmh (30nM 내지 1.1nM의 범위)를 항-MET ADC 또는 항체 캡쳐된 표면 위로 40μL/분의 유속으로 주사하였다. 캡쳐된 ADC 및 단클론성 항체 각각으로의 hMET-mmh의 회합을 4분 동안 모니터링하였다. 그 이후, HBS-EP 러닝 버퍼에서 hMET-mmh 해리를 6분 동안 모니터링하였다. 20mM H3PO4의 간략한 주사에 의해 항-인간 Fc 표면을 재생시켰다. 모든 결합 동역학 실험을 25℃에서 수행하였다.
Scrubber 2.0c 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 실시간 센서그램을 1:1 결합 모델에 맞춤으로써 동역학 회합 (k a) 및 해리 (k d) 속도 상수를 결정하였다. 상응하는 피분석물 센서그램에서 버퍼 주사 센서그램 신호를 빼서, 캡쳐 표면으로부터의 항체의 해리에 의해 유발된 인공물을 제거함으로써 모든 센서그램을 이중 참조하였다. 결합 해리 평형 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t½)를 동역학 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다:
, 및
메이탄시노이드 A 또는 메이탄시노이드 B 컨쥬게이tus된 항-Met 단일특이적 및 이중특이적 항체에 대한 결합 동역학 파라미터는 하기 표 25에 나타나 있으며, 일부 실험을 2배수로 실행하였다.
25℃에서 컨쥬게이션된 단일- 및 이중-특이적 단클론성 항-MET 항체의 Biacore 결합 친화도
항체 캡쳐된 mAb (RU) 결합된 항원 (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) K D (M) t½ (분)
H4H13312P2 148.1±1.2 12.3 2.59E+05 5.35E-03 2.07E-08 2.2
H4H13312P2 142.7±0.3 12.1 1.87E+05 4.85E-03 2.59E-08 2.4
H4H13312P2-
메이탄시노이드 A 		232.6±0.5 11.9 1.82E+05 7.18E-03 3.94E-08 1.6
H4H13312P2-
메이탄시노이드 B 		263.0±2.6 10.9 1.80E+05 6.32E-03 3.51E-08 1.8
H4H14639D 283.6±4.4 82.8 5.90E+05 1.56E-03 2.64E-09 7.4
H4H14639D-
메이탄시노이드 A 		207.7±0.8 55.8 4.95E+05 1.81E-03 3.65E-09 6.4
H4H14639D-
메이탄시노이드 B 		227.5±0.4 55.4 4.83E+05 1.87E-03 3.86E-09 6.2
H4H14639D-
메이탄시노이드 A 		284.0±1.1 62.8 4.70E+05 1.76E-03 3.74E-09 6.6
H4H14639D-
메이탄시노이드 B 		268.7±0.7 72.8 4.91E+05 1.45E-03 2.95E-09 8.0
실시예 24: 항-MET 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)의 시험관 내 효능
본원에서 기술된 항-MET 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)의 상대적 세포-살해 효능을 결정하기 위해서, 세포-살해 검정을 다양한 수준의 내인성 MET를 발현하는 다수의 세포주에서 실행하였다. EBC-1 (Riken Cell Bank; # RBRC-RCB1965), MKN-45 (JCRB; # JCRB0254), NCI-H1993 (ATCC; # CRL-5909), 및 J.RT3 (ATCC; # TIB-153) 세포주를 RPMI + 10% FBS + 1X 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 (P/S/G)에서 유지하였고, SNU-5 (ATCC; # CRL-5973)를 Iscove's + 10% FBS + 1X P/S/G에서 유지하였고, Hs746t (ATCC; # HTB-135) 및 HEK293 (ATCC; # 003041)을 DME + 10% FBS + 1X P/S/G에서 유지하였고, MDA-MB-231 (ATCC; # HTB-26)을 CO2 없이 Liebowitz's L-15 + 10% FBS + 1X P/S/G + 1X 비필수 아미노산 (NEAA)에서 유지하였고, U87MG (ATCC; # HTB-14)를 MEM Earle's Salts + 15% FBS + 1X P/S/G + 1X NEAA에서 유지하였고, T47D (ATCC; # HTB-133)를 RPM1 1640 + 10% FBS + 1X P/S/G + 10mM HEPES + 1mM 나트륨 피루베이트 + 10 ug/ml 소 인슐린에서 유지하였고, A549 (ATCC; # CCL-185)를 Kaighn's Nutrient Mixture F-12 (HAM's F-12K) + 10% FBS + 1X P/S/G에서 유지하였다.
처음에, 항-MET 항체의 상대적인 결합을 유동 세포 분석법을 통해 세포주의 전체 패널에 걸쳐 컨쥬게이션되지 않은 H4H14635D, H4H14639D 및 H4H13312P2 항체로 평가하였다. 간략히 말하면, 1x106 세포를 PBS + 2% FBS (FACS 버퍼)에서 얼음 위에서 30분 동안 10 μg/ml의 H4H14635D, H4H14639D, H4H13312P2 또는 아이소타입 대조군 항체 (REGN1945)와 함께 인큐베이션하였다. FACS 버퍼로 1회 세척 후, 세포를 10 μg/ml의 Alexa647 컨쥬게이션된 항-인간 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, # 109-606-170)와 함께 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. FACS 버퍼로 1회 추가 세척 후, 샘플을 Cytofix (BD Biosciences, # 554655)로 고정하고, FACS 버퍼로 여과하고 iQue 유동 세포 분석기 (Intelicyte)에서 실행하였다. 평균 형광 강도 (MFI) 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo LLC)를 사용하여 결정하였다. FACS 결합은 아이소타입 대조군 수준에 대한 배수 MFI 결합으로 표현되고, 결과는 표 26에서 요약되어 있다. 3개의 항-Met 항체의 상대적인 결합은 각 세포주에서 비슷하였고 아이소타입 대조군에 대하여 447-배 내지 7-배의 범위에 있다. 테스트된 3개의 항-MET 항체 중 어느 것의 검출 가능한 결합이 T47D, HEK293, 또는 J.RT3 세포에서 관찰되지 않았다.
항-MET ADC의 시험관 내 세포 독성을 측정하기 위해, ADC로의 3 또는 6일 처리 후 핵 수를 평가하였다. 간략히 말하면, 세포를 완전 성장 배지에서 750 - 3000개 세포 / 웰로 96 웰 콜라겐 코팅된 플레이트 (Greiner, VWR; # 82050-812)에 분주하였고 37℃, 5%CO2에서 밤새도록 키웠다. 세포 생존력 곡선에 대하여, 단계 희석된 ADC, 컨쥬게이션되지 않은 항체, 또는 유리 페이로드를 100 nM 내지 0.01 nM의 범위의 최종 농도 (독소 농도 기준)로 세포에 추가하였고 37℃에서 5% CO2에서 3 또는 6일 동안 인큐베이션하였다. 그 이후 세포를 3 ug/ml Hoechst 33342 핵 염색 (Invitrogen, # H3570)으로 처리하는 한편 4% 포름알데하이드로 고정하였다. ImageXpress micro XL (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 이미지를 획득하였고 MetaXpress 이미지 분석 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 통해 핵 수를 결정하였다. 40 nM 디기토닌으로 처리된 세포의 백그라운드 핵 수를 모든 웰에서 빼고 생존력을 미처리 대조군의 퍼센트로 표현하였다. IC50 값을 10-지점 반응 곡선 (GraphPad Prism)에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 결정하였다. 각 용량-반응 곡선에 대한 미처리 조건을 또한 분석에 포함시키고 최저 용량으로 나타낸다. IC50 값 및 퍼센트 세포 살해는 표 27 및 28에 나타나있다.
표 27에서 요약된 바와 같이, 항-MET 항체-약물 컨쥬게이트 H4H14639D-메이탄시노이드 A는 Met 증폭된 EBC-1, SNU-5, MKN-45, NCI-H1993, 및 Hs746t 세포 백그라운드에서 세포 생존력을 특이적으로 감소시켰으며 IC50 값은 0.35 nM 내지 0.96 nM의 범위에 있다. 살해된 세포의 퍼센트 (최대 % 살해)는 73% 내지 100%의 범위에 있다. H4H14639D-메이탄시노이드 A는 또한 13.91 nM의 IC50 값으로 A549 세포의 84%를 특이적으로 살해하였다. H4H14639D-메이탄시노이드 A IC50 값은 저 발현 (MDA-MB-231 및 U87MG) 및 비-발현 (T47D, HEK293, 및 J.RT3) 세포주에서 37 nM보다 크다. 유사하게 컨쥬게이션된 아이소타입 대조군 항체는 35 nM보다 큰 IC50 값으로 모든 세포주를 살해하였다. DM1의 메틸 이황화 버젼 (MeS-DM1)은 모든 테스트된 세포주를 살해하였으며 IC50 값은 0.07nM 내지 2.86 nM의 범위에 있다.
별도의 실험에서, 3개의 항-Met 항체 (H4H14639D, H4H14635D, 및 H4H13312P2)를 메이탄시노이드 A 또는 메이탄시노이드 B 메이탄시노이드 페이로드에 컨쥬게이션시키고, 시험관 내 세포 독성을 6일 처리 후 EBC-1, Hs746t, A549, 및 T47D 세포에서 평가하였다. 표 28에서 요약된 바와 같이, 모든 항-Met 항체-약물 컨쥬게이트는 Met 양성 세포에서 세포 생존력을 강력하고 특이적으로 감소시켰으며, IC50 값은 EBC-1 세포에서 10 pM, Hs746t 세포에서 0.82 nM, A549 세포에서 3.5 nM만큼 낮았다. 살해된 세포의 퍼센트는 EBC-1 세포에서 95%보다 크고, Hs746t 세포에서 86%보다 크고, A549 세포에서 72%보다 크다. T47D 세포 (Met 음성)는 항-Met ADC에 의해 특이적으로 살해되지 않았다. 유사하게 컨쥬게이션된 아이소타입 대조군 항체는 테스트된 세포주 모두에서 세포 생존력을 감소시켰으며 IC50 값은 EBC-1 세포에서 5 nM보다 크고, Hs746t 세포에서 33 nM보다 크고, A549 및 T47D 세포에서 90 nM보다 크다. 컨쥬게이션되지 않은 H4H14639D는 EBC-1, Hs746t, 및 A549 세포에서 세포 생존력을 감소시켰지만 컨쥬게이션되지 않은 항체보다 낮은 퍼센트로 감소시켰다. 컨쥬게이션되지 않은 H4H14635D 및 H4H13312P2는 테스트된 세포주 중 어느 것에서도 생존력에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않았다. DM1의 메틸 이황화 버젼 (MeS-DM1)은 모든 테스트된 세포주를 살해하였으며 IC50 값은 0.12nM 내지 1.39 nM의 범위에 있다. 그에 반해, M24 (메이탄시노이드 B로부터 방출된 페이로드)는 >100nM의 IC50으로 세포를 살해하였다.
종양 세포주로의 컨쥬게이션되지 않은 MET 항체의 FACS 결합


세포주 		FACS 결합 (아이소타입 대조군에 대한 MFI 배수)

염색되지 않음 		2차 단독 REGN1945
(아이소타입 대조군)
H4H14635D
H4H14639D
H4H13312P2
EBC-1 0.7 0.6 1 263 252 147
SNU-5 1 1.2 1 477 454 235
MKN-45 1 0.8 1 183 156 94
NCI-H1993* 1 2 ND ND 188 188
Hs746t 0.8 1.1 1 39 34 27
MDA-MB-231 3 5.6 1 11 12 7
U87MG 1.6 1.7 1 18 18 10
T47D 1 0.9 1 1.3 1 1.4
A549 0.7 0.5 1 12 10 7
HEK293 0.2 0.2 1 1.8 1.8 1.2
J.RT3 0.8 1 1 1.6 1.4 1.1
*NCI-H1993에 대하여 염색되지 않은 것에 대한 배수로 표현됨
6일 시험관 내 세포 독성 검정에서 항-MET ADC의 IC 50 및 최대 % 살해.
항체-약물 컨쥬게이트 EBC-1 Hs746t T47D A549
IC 50 (nM) 최대 % 살해 IC 50 (nM) 최대 % 살해 IC 50 (nM) 최대 % 살해 IC 50 (nM) 최대 % 살해
DM1 (MeS-DM1) 0.12 62 1.39 88 0.24 96 0.49 90
M24 (메이탄시노이드 B 방출 페이로드) >100 32 >100 10 >100 0 >100 10
H4H14639D 0.37 66 0.44 35 >100 0 0.17 29
H4H14639D-메이탄시노이드 A 0.27 97 0.82 87 >100 3 6.01 86
H4H14639D-메이탄시노이드 B 0.01 96 0.86 90 >100 0 3.54 80
H4H13312P2 >100 30 >100 0 >100 0 >100 7
H4H13312P2-메이탄시노이드 A 0.39 95 1.59 87 >100 6 18.30 89
H4H13312P2-메이탄시노이드 B 0.07 95 0.89 90 >100 3 27.10 85
H4H14635D >100 11 >100 7 >100 7 >100 0
H4H14635D-메이탄시노이드 A 0.76 96 1.76 86 >100 92 6.78 91
H4H14635D-메이탄시노이드 B 0.26 96 2.32 89 >100 2 21.40 72
REGN1945 >100 0 >100 0 >100 0 >100 1
REGN1945-메이탄시노이드 A 28.08 93 33.06 76 >100 14 93.40 49
REGN1945-메이탄시노이드 B 5.01 97 >100 0 >100 1 >100 15
실시예 25: 위암 세포에 대한 생체 내 효능
3백만 개의 Hs746T 위암 세포를 C.B.-17 SCID 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다. 종양 부피가 대략 150 mm3에 도달하면, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 10 mg/kg의 대조군 항체 REGN1945-메이탄시노이드 B 또는 REGN1945-메이탄시노이드 A 또는 3 또는 10 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 A 또는 H4H14639D-메이탄시노이드 B로 처리하였다. 모든 항체를 주 1회의 빈도로 3회 투여하였다. 종양 성장을 이식 후 37일 동안 모니터링하였다.
면역 손상된 마우스에서 인간 종양 이종이식의 성장에 대한 H4H14639D-메이탄시노이드 A 또는 H4H14639D-메이탄시노이드 B의 효과를 평가하였고, 결과는 표 29에서 나타나있다. 대조군 항체, REGN1945-메이탄시노이드 B 또는 REGN1945-메이탄시노이드 A로 처리된 종양을 20일 내에 프로토콜 크기 제한에 도달하도록 키웠다. 3 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 A로 처리된 종양을 27일 내에 프로토콜 크기 제한에 도달하도록 키웠다. 3 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 B로 처리된 종양의 성장은 실험 기간 동안 억제되었다. 10 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 A 또는 H4H14639D-메이탄시노이드 B로의 종양의 처리는 처리 초기에 비해 종양 크기의 퇴화를 유도하였다.
항-Met-C 항체 컨쥬게이트로 처리된 SCID 마우스에서 종양 성장
항체 (mg/kg) 처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm3) (평균 ± SD)
REGN1945-메이탄시노이드 A
10 mg/kg		 1244 ± 199
REGN1945-메이탄시노이드 B
10 mg/kg		 1345 ± 121
H4H14639D-메이탄시노이드 A
3 mg/kg		 832 ± 15
H4H14639D-메이탄시노이드 A
10 mg/kg		 -148 ± 0.17
H4H14639D-메이탄시노이드 B
3 mg/kg		 19 ± 147
H4H14639D -메이탄시노이드 B
10 mg/kg		 -137 ± 0
실시예 26: 폐암 세포에 대한 생체 내 효능
5백만 개의 EBC1 폐암 세포를 C.B.-17 SCID 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다. 종양 부피가 대략 170 mm3에 도달하면, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 15 mg/kg의 대조군 항체 REGN1945-메이탄시노이드 B 또는 2.5, 5, 10 또는 15 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 B로 처리하였다. 항체를 주 1회의 빈도로 2회 투여하였다. 종양 성장을 이식 후 73일 동안 모니터링하였다.
면역 손상된 마우스에서 인간 종양 이종이식의 성장에 대한 H4H14639D의 효과를 평가하였다. 대조군 항체, REGN1945-메이탄시노이드 B로 처리된 종양을 24일 내에 프로토콜 크기 제한에 도달하도록 키웠다 (IACUC 프로토콜은 직경이 2 cm를 초과하는 종양을 숨기고 있는 동물의 희생을 필요로 하고, 대략 1500 mm3이다). 2.5, 5, 10 또는 15 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 B로의 종양의 처리는 처리 초기에 비해 종양 크기의 퇴화를 유도하였다. 결과는 표 30에 나타나있다.
항-Met-C 항체 컨쥬게이트로 처리된 SCID 마우스에서 종양 성장
항체 (mg/kg) 처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm3) (평균 ± SD)
REGN1945-메이탄시노이드 B
15 mg/kg		 1106 ± 165
H4H14639D-메이탄시노이드 B
2.5 mg/kg		 -142 ± 24
H4H14639D-메이탄시노이드 B
5 mg/kg		 -163 ± 0
H4H14639D-메이탄시노이드 B
10 mg/kg		 -173 ± 0
H4H14639D-메이탄시노이드 B
15 mg/kg		 -179 ± 0
실시예 26: 환자-유래된 NSCLC 종양에 대한 생체 내 효능
Met-발현 NSCLC CTG-0165 환자-유래된 종양을 nu/nu 누드(Nude) 마우스의 옆구리로 피하로 이식하였다. 종양 부피가 대략 150 mm3에 도달하면, 마우스를 6개의 군으로 무작위로 분류하고 10 mg/kg의 대조군 항체 REGN1945-메이탄시노이드 B 또는 REGN1945-메이탄시노이드 A 또는 3 또는 10 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 A 또는 H4H14639D-메이탄시노이드 B로 처리하였다. 모든 항체를 주 1회의 빈도로 3회 투여하였다. 종양 성장을 이식 후 61일 동안 모니터링하였다.
면역 손상된 마우스에서 인간 종양 이종이식의 성장에 대한 H4H14639D-메이탄시노이드 A 또는 H4H14639D-메이탄시노이드 B의 효과를 평가하였다. 대조군 항체 REGN1945-메이탄시노이드 A 또는 REGN1945-메이탄시노이드 B로 처리된 종양을 27일 내에 프로토콜 크기 제한에 도달하도록 키웠다. 10 mg/kg의 H4H14639D-메이탄시노이드 A 또는 H4H14639D-메이탄시노이드 B로의 종양의 처리는 처리 초기에 비해 종양 크기의 퇴화를 유도하였다. 결과는 표 31에서 제공된다.
항-Met-C 항체 컨쥬게이트로 처리된 누드 마우스에서 종양 성장
항체 (mg/kg) 처리 시작으로부터의 종양 성장 (mm 3 ) (평균 ± SD)
REGN1945-메이탄시노이드 A
10mg/kg		 967± 136
REGN1945-메이탄시노이드 B
10mg/kg		 1537 ± 373
H4H14639D-메이탄시노이드 A
3mg/kg		 154 ± 227
H4H14639D-메이탄시노이드 A
10mg/kg		 "-141 ± 2.3
H4H14639D-메이탄시노이드 B
3mg/kg		 517 ± 362
H4H14639D-메이탄시노이드 B
10mg/kg		 "-145 ± 2
실시예 27: 인간 MET에 결합하는 항-Met 항체 H4H13312P2, H4H13306P2 및 H4H14639D의 수소/ 중수소 (H/D) 교환 기반 에피토프 맵핑
항-Met 항체 H4H13312P2, H4H13306P2 및 H4H14639D가 상호작용하는 인간 간세포 성장 인자 수용체 엑토도메인 (서열 번호:155: myc-myc-hexa히스티딘(.mmh) 태그와 함께 발현되는 인간 Met 아이소폼 1 (Uniprot ID: P08581); 이후 hMet라고 불림)의 특이적 영역을 결정하기 위한 실험을 실행하였다. H4H13312P2 및 H4H13306P2는 2가-단일특이적 항-Met 항체이고; H4H14639D는 각각 H4H13312P2 및 H4H13306P2의 Met 상의 별개의 에피토프에 결합하는 2개의 중쇄, 및 보편적 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체이다 (실시예 5 참조).
질량 분석법 (HDX-MS)과 함께 수소/중수소 (H/D) 교환 에피토프 맵핑을 이용하여 상기 언급된 항체의 결합 에피토프를 결정하였다. HDX 방법의 일반적인 설명은, 예를 들어, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; 및 Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A에서 제시되어 있다.
실험 절차
HDX를 통해 hMET 상의 항-Met 항체 H4H13312P2, H4H13306P2 및 H4H14639D의 결합 에피토프(들)를 맵핑하기 위해, 개개의 항체를 NHS-활성화된 Sepharose 4 Fast Flow 비드 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA)에 별도로 공유 부착시켰다. 하기 기술된 바와 같이 2가지 방법 "On-Antigen" 및 "On-Complex"를 이용하여 항-Met 항체의 결합 에피토프를 확인하였다.
'On-Antigen' 실험 조건 하에서, hMET를 D2O로 제조된 PBS 버퍼에서 5.0분 또는 10.0분 동안 중수소화하였다. 중수소화된 항원은 짧은 인큐베이션을 통해 H4H13312P2 또는 H4H13306P2 항체 비드에 결합된 다음, 매우 차가운 저 pH 퀸치(quench) 버퍼를 이용하여 비드로부터 용출된다. 용출된 샘플을 통합 온라인 펩타이드 분해, 트래핑(trapping), 9.0분 Liquid Chromatography (LC) 분리, 및 Synapt G2-Si MS 데이터 수집으로 이루어진 Waters H/DX-MS 시스템에 수동으로 로딩하였다.
'On-Complex' 실험 조건 하에서, hMET를 먼저 H4H13312P2 또는 H4H13306P2 비드에 결합시킨 다음 D2O로 제조된 PBS 버퍼에서 인큐베이션하여 5.0분 또는 10.0분 동안 중수소화하였다. 중수소화된 hMET를 융출시키고 상기 언급된 Waters H/DX-MS 시스템으로 분석하였다.
hMET로부터 펩신 펩타이드의 확인을 위해, 중수소화되지 않은 샘플의 LC-MSE 데이터를 Waters ProteinLynx Global Server (PLGS) 소프트웨어를 사용하여 인간 MET에 대하여 처리하고 검색하였다. 확인된 펩타이드를 DynamX 3.0 소프트웨어로 가져와서 다음 2개의 기준에 따라 필터링하였다: 1) 아미노산 당 최소 생성물은 0.3이다; 2) 복제 파일 임계치는 3.0이다. 그 이후 DynamX 3.0 소프트웨어는 5분 및 10분 중수소화 시점 둘 다에 걸쳐 'On-Antigen' 및 'On-Complex" 사이에서 확인된 각각의 펩타이드의 중수소 흡수 차이를 자동적으로 계산하였다. 중수소 흡수 계산의 정확도를 보장하기 위해서 중심값 계산을 위한 DynamX 소프트웨어에 의해 얻어진 각각의 펩타이드의 개개의 동위원소 피크를 또한 수동으로 검사하였다.
일반적으로, 0.2보다 높은 중수소화에 대한 델타 값을 특이적 결합 에피토프를 결정하기 위한 컷-오프(cut-off) 지점으로 사용하였다.
결과
9.0분 LC-MSE 데이터 수집과 결합된 Waters Enzymate™ BEH Pepsin Column (2.1 x 30 mm, 5 μm)을 통한 온라인 펩신 분해를 사용하여, H4H13312P2 항체 비드가 사용될 때 인간 MET로부터 총 162개의 펩신 펩타이드를 'On-Antigen' 및 'On-Complex' 실험 둘 다 동안에 추적 가능한 중수소 흡수로 재현 가능하게 확인하였다. 이들 펩타이드는 55.7% 서열 커버리지(coverage)를 나타낸다. 이들 모든 펩타이드 중에서, 단지 5개만이 항원 단독의 중수소화 ('On-Antigen')와 비교하여 H4H13312P2에 결합시 ('On-Complex') 크게 감소된 중수소화 흡수를 갖는 것으로 발견되었다. 두 실험 조건 하에서 이들 5개의 펩타이드의 중심값은 표 32에 예시되어 있다. 이들 5개의 펩타이드로 커버되는 잔기 192-204에 상응하는 영역을 HDX 데이터에 기초하여 항체 H4H13312P2에 대한 결합 에피토프로서 정의하였다.
H4H13312P2에 결합시 중수소 흡수가 감소된 hMET 펩신 펩타이드
hMET의 잔기 5분 중수소화 10분 중수소화
On-Complex
중심 MH+ 		On-Antigen
중심 MH+ 		△ On-Complex
중심 MH+ 		On-Antigen
중심 MH+ 		△
192-202 1351.25 1351.83 -0.58 1351.39 1352.27 -0.88
192-203 1482.34 1482.94 -0.60 1482.50 1483.40 -0.90
192-204 1629.84 1630.71 -0.87 1630.01 1631.10 -1.09
193-202 1252.07 1252.79 -0.72 1252.25 1253.08 -0.83
193-203 1383.22 1383.79 -0.57 1383.40 1384.17 -0.77
H4H13306P2 항체 비드를 사용하여 수행된 HDX 실험에 대하여, hMET로부터 총 98개의 펩신 펩타이드를 'On-Antigen' 및 'On-Complex' 실험 둘 다 동안에 추적 가능한 중수소 흡수로 재현 가능하게 확인하였다. 이들 98개의 펩타이드는 52.1% 서열 커버리지를 나타낸다. 이들 모든 펩타이드 중에서, 12개가 항원 단독의 중수소화 ('On-Antigen')와 비교하여 H4H13306P2에 결합시 ('On-Complex') 크게 감소된 중수소화 흡수를 갖는 것으로 발견되었다. 두 실험 조건 하에서 이들 12개의 펩타이드의 중심값은 표 33에 예시되어 있다. 이들 펩타이드로 커버되는 잔기 305-315 및 잔기 421-455에 상응하는 영역을 HDX 데이터에 기초하여 항체 H4H13306P2에 대한 결합 에피토프로서 정의하였다.
H4H13306P2에 결합시 중수소 흡수가 감소된 hMET 펩신 펩타이드
hMET의 잔기 5분 중수소화 10분 중수소화
On-Complex
중심 MH+		 On-Antigen
중심 MH+		 △ On-Complex
중심 MH+		 On-Antigen
중심 MH+		 △
305-312 818.20 818.83 -0.63 818.31 819.13 -0.82
305-315 1161.50 1162.58 -1.08 1161.80 1162.95 -1.15
306-313 818.48 818.97 -0.49 818.71 819.28 -0.57
421-431 1206.24 1206.75 -0.51 1206.28 1206.95 -0.67
421-435 1581.28 1581.84 -0.56 1581.41 1582.09 -0.68
421-438 1941.58 1942.15 -0.57 1941.71 1942.39 -0.68
422-438 1794.58 1795.04 -0.46 1794.72 1795.34 -0.62
439-447 963.90 964.83 -0.93 963.97 965.24 -1.27
439-455 1846.58 1847.79 -1.21 1847.24 1847.85 -0.61
439-456 1960.24 1961.32 -1.08 1960.83 1961.42 -0.59
441-455 1586.30 1587.71 -1.41 1587.33 1587.79 -0.46
442-455 1487.50 1488.50 -1.00 1487.92 1488.54 -0.62
상기 나타난 바와 같은 방법을 사용하여 이중특이적 항-Met 항체 H4H14639D에 대한 결합 에피토프를 결정하는데 사용하였다. 이 방법론에 의해 결정된, hMET 상의 H4H14639D 결합 에피토프는 모체 항체에 대하여 결정된 에피토프에 상응한다.
항-Met 항체 H4H13312P2의 결합 에피토프: AA 192-204: 서열 번호: 155의 VRRLKETKDGFMF (서열 번호: 156).
항-Met 항체 H4H13306P2의 결합 에피토프: AA 305-315: 서열 번호: 155의 LARQIGASLND (서열 번호: 157) 및 AA 421-455: 서열 번호: 155의 FIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNF (서열 번호: 158).
본 발명은 본원에서 기술된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 사실, 본원에서 기술된 것 외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기 언급된 기술내용 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Babb, Robert Chen, Gang Daly, Christopher DaSilva, John MacDonald, Douglas <120> ANTI-MET ANTIBODIES, BISPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULES THAT BIND MET, AND METHODS OF USE THEREOF <130> 10316WO01 <140> TBD <141> 2017-11-03 <150> 62/423,068 <151> 2016-11-16 <150> 62/479,516 <151> 2017-03-31 <160> 158 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccatcagt agttactatt ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca gggggggcac cacctacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagttgaggt ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag gggagacgat 300 cttttagtgg tgacaagtgt ctactggtac atcgatctct ggggccgtgg caccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Phe Tyr Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Asp Leu Leu Val Val Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Ile Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggtgactcca tcagtagtta ctat 24 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atcttttaca gggggggcac c 21 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Phe Tyr Arg Gly Gly Thr 1 5 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcgaggggag acgatctttt agtggtgaca agtgtctact ggtacatcga tctc 54 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Arg Gly Asp Asp Leu Leu Val Val Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Ile 1 5 10 15 Asp Leu <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtccggatt caccttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgattactat 180 ccagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gcgagatgcg 300 tgggacctac tacgttcctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Trp Asp Leu Leu Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggattcacct tcagtggcta tggc 24 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly 1 5 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atatggtatg atggaagtaa tgat 24 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp 1 5 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gcgcgagatg cgtgggacct actacgttcc tttgactac 39 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Arg Asp Ala Trp Asp Leu Leu Arg Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagagtc 60 tcttgtgtag tgtctggatt caccttcagc agctttggca tgcattgggt ccgccaggct 120 ccagacaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgattactat 180 tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ctacaaatga accgcctgag agccgaagac acggctgttt attactgtgc gcgagctaat 300 aactggaacc gttttgatgc ctttgatctc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tca 363 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Asn Trp Asn Arg Phe Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggattcacct tcagcagctt tggc 24 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly 1 5 <210> 21 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Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Asn Met Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Trp Leu Thr Tyr Tyr Val Met Val 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ggattcatct tcagtaatta tgaa 24 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Glu 1 5 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 attactagta gtggtaatat gaaa 24 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ile Thr Ser Ser Gly Asn Met Lys 1 5 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gtgagaggag ggcgattttt ggagtggttg acctactacg ttatggtcgt c 51 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Val Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Trp Leu Thr Tyr Tyr Val Met Val 1 5 10 15 Val <210> 33 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaaat atttggtatg atggaactaa tgattactat 180 ccatactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacactatat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gagagaggac 300 ttcattaact accggtcttt tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Tyr Pro Tyr Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Phe Ile Asn Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ggattcacct tcagtagcta tggc 24 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atttggtatg atggaactaa tgat 24 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Asp 1 5 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gcgagagagg acttcattaa ctaccggtct tttgactat 39 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Arg Glu Asp Phe Ile Asn Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc cagggacgtc cctgagactc 60 tcctgtgtcg cgtctggatt caccttcaga aattttggaa tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaaat atatggtttg acggaagtaa tgagaactat 180 gtcgagtcca ttcagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgaat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac tcggctgtct attactgtgt gagagaggga 300 atcctaggaa ctactaatcc ttatgatgct tttgatgtct ggggccaagg gacaatggtc 360 accgtctctt ca 372 <210> 42 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Val Glu Ser Ile 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Ala Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 ggattcacct tcagaaattt tgga 24 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe Gly 1 5 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 atatggtttg acggaagtaa tgag 24 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu 1 5 <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gtgagagagg gaatcctagg aactactaat ccttatgatg cttttgatgt c 51 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Ala Phe Asp 1 5 10 15 Val <210> 49 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt cacctttagt aactttggaa tgcactgggt ccgccaggcg 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggcaggt atatggtttg atggaagtaa taaaaactat 180 atagactccg tgaagggccg attcaccatc tcaagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggc 300 tatgattcgg ggactgatta tatcccctat gatatttttg atatttgggg ccaagggaca 360 atggtcaccg tctcttca 378 <210> 50 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Asn Tyr Ile Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Ser Gly Thr Asp Tyr Ile Pro Tyr Asp Ile 100 105 110 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 ggattcacct ttagtaactt tgga 24 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly 1 5 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 atatggtttg atggaagtaa taaa 24 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 55 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gcgagagagg gctatgattc ggggactgat tatatcccct atgatatttt tgatatt 57 <210> 56 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Ser Gly Thr Asp Tyr Ile Pro Tyr Asp Ile 1 5 10 15 Phe Asp Ile <210> 57 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcacgtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attacttgga atagttataa catagactat 180 gctgactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatgat 300 gactacagta actacgttta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Trp Asn Ser Tyr Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Asp Asp Tyr Ser Asn Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 attacttgga atagttataa cata 24 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ile Thr Trp Asn Ser Tyr Asn Ile 1 5 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 gcaaaagatg atgactacag taactacgtt tactttgact ac 42 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ala Lys Asp Asp Asp Tyr Ser Asn Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 caggttcagc tggtgcagtc cggaactgag gtgaaggagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgtaagg cctctggtta ctcctttacc acctatggta tcagctggct gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaatggtga cacaatctct 180 gcacagatgc tccaggacag agtcaccctg accgcagaca catccacgcg cacagcctac 240 atggaactga gaagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggtcat 300 gagtatgata gtcttgttta ttcttactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Ile Ser Ala Gln Met Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly His Glu Tyr Asp Ser Leu Val Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 ggttactcct ttaccaccta tggt 24 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Gly 1 5 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 atcagcactt acaatggtga caca 24 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gcgagaggtc atgagtatga tagtcttgtt tattcttac 39 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ala Arg Gly His Glu Tyr Asp Ser Leu Val Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaggg ggctggagtg ggtggcggtt atatggcatg atggagatgt tgaatactat 180 gtagactccg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca attccaagag cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaagat acggctttat attattgtgc gagagaggcg 300 tgggacctac tacgtccctt tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp His Asp Gly Asp Val Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Trp Asp Leu Leu Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 ggattcacct tcagtagtta tgcc 24 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 atatggcatg atggagatgt tgaa 24 <210> 78 <211> 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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gggttcatcg tcaccaccaa ctac 24 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Gly Phe Ile Val Thr Thr Asn Tyr 1 5 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 atttatagca gtggtcacac a 21 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ile Tyr Ser Ser Gly His Thr 1 5 <210> 87 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 gcgagtgctt tcgcagcgga tgtttttgat atc 33 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ala Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 89 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgttcag cgtctggatt ctccttcagt cactttggca tgcactgggt ccgccaggtt 120 ccaggcgggg gcctggagtg ggtgacaagt atatggtttg atggaagtaa tagatattat 180 gcagactcct tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa tactctgtat 240 ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt gagagagggg 300 atactgggaa ctactaatcc ttatgatgtt tttgatgtct ggggtcaggg gacaatggtc 360 accgtctctt ca 372 <210> 90 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gly Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Ser Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Val Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 ggattctcct tcagtcactt tggc 24 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gly Phe Ser Phe Ser His Phe Gly 1 5 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 atatggtttg atggaagtaa taga 24 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Arg 1 5 <210> 95 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gtgagagagg ggatactggg aactactaat ccttatgatg tttttgatgt c 51 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Val Phe Asp 1 5 10 15 Val <210> 97 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaga agctatgtca tgagctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagga atgagtggga gtggtggaag cacatcctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attcaaagaa tacgctgtat 240 ctgctaatga acagcctgag aaccgaggac acggccgtat attattgtgc gaaagaaaac 300 ggggctaact ggaactacgg ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 98 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Met Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Asn Gly Ala Asn Trp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 ggattcacct ttagaagcta tgtc 24 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Val 1 5 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 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Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Trp Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 ggattcacct tcagtagctt tgcc 24 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala 1 5 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 atatggtatg atggaagtaa tgat 24 <210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp 1 5 <210> 119 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gcgagagata actggaatta ctgggggggt atggacgtc 39 <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Trp Gly Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 121 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tgggtgcagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgcctttagt aattatgcca tgaactgggt ccgccagact 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attagtagta gtggtggaaa cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcgccatc tccagagaca attccaggga tacgctgcat 240 ctgcaaatga acagactgag agtcgaggac acggccgtct attactgtgc gaaagaaata 300 cgtccgtatt acgatctttc ctactattac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 122 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu His 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Ile Arg Pro Tyr Tyr Asp Leu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 ggattcgcct ttagtaatta tgcc 24 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> 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Val Pro Asn 595 600 605 Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala 610 615 620 Met Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val 625 630 635 640 Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile 645 650 655 Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val 660 665 670 Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 675 680 685 Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu 690 695 700 Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala 705 710 715 720 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro 725 730 735 Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys 740 745 750 Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr 755 760 765 Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr 770 775 780 Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu 785 790 795 800 Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe 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Asn Phe Leu Leu Asp Ser 165 170 175 His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Pro Leu Asn Gln Asn 180 185 190 Gly Tyr Thr Leu Val Val Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu 195 200 205 Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser 210 215 220 Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg 225 230 235 240 Ser Glu Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro 245 250 255 Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr 260 265 270 Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys 275 280 285 Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr 290 295 300 Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly 305 310 315 320 Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly 325 330 335 His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Ile Ile 340 345 350 Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu 355 360 365 Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser 370 375 380 Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu 385 390 395 400 Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys 405 410 415 Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg 420 425 430 Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser 435 440 445 Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu His Ser Val Ser 450 455 460 Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr 465 470 475 480 Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr 485 490 495 Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala 500 505 510 Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr 515 520 525 Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser 530 535 540 Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro 545 550 555 560 Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu 565 570 575 Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp 580 585 590 Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile 595 600 605 Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe 610 615 620 Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Ile Ala Leu Leu Leu 625 630 635 640 Leu Leu Gly Leu Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp 645 650 655 Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro His 660 665 670 Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met 675 680 685 Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln 690 695 700 Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro 705 710 715 720 Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser 725 730 735 Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn 740 745 750 Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser 755 760 765 Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys 770 775 780 Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys 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Leu Tyr Glu Val 995 1000 1005 Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe 1010 1015 1020 Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile 1025 1030 1035 Gly Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1040 1045 1050 Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala 1055 1060 1065 Asp Asp Glu Val Asp Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 1070 1075 1080 Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His 1085 1090 1095 His His 1100 <210> 155 <211> 936 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys 1 5 10 15 Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile 20 25 30 Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val 35 40 45 Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro 50 55 60 Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys 65 70 75 80 Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu 85 90 95 Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val 100 105 110 Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala 115 120 125 Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu 130 135 140 Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val 145 150 155 160 Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr 165 170 175 Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val 180 185 190 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln 195 200 205 Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys 210 215 220 Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val 225 230 235 240 Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg 245 250 255 Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu 260 265 270 Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu 275 280 285 Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln 290 295 300 Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly 305 310 315 320 Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser 325 330 335 Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys 340 345 350 Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro 355 360 365 Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly 370 375 380 Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu 385 390 395 400 Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr 405 410 415 Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly 420 425 430 Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro 435 440 445 Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro 450 455 460 Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val 465 470 475 480 Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys 485 490 495 Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val 500 505 510 Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu 515 520 525 Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val 530 535 540 Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys 545 550 555 560 Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys 565 570 575 Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu 580 585 590 Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys 595 600 605 His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln 610 615 620 Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro 625 630 635 640 Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn 645 650 655 Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr 660 665 670 Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro 675 680 685 Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu 690 695 700 Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val 705 710 715 720 Tyr Glu 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Claims (62)

  1. 제1 항원-결합 도메인 (D1); 및
    제2 항원-결합 도메인 (D2)
    을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자로서,
    D1은 인간 MET의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    D2는 인간 MET의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  2. 제1 항에 있어서, D1 및 D2는 인간 MET로의 결합에 대하여 서로 경쟁하지 않는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 인간 MET 및 HGF 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  4. 제3 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 세포-기반 MET 활성 리포터 검정에서 최소한의 아고니스트 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  5. 제3 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 세포-기반 MET 활성 리포터 검정에서 MET 아고니스트 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  6. 제4 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 세포-기반 MET 활성 리포터 검정에서 D1 또는 D2 단독을 포함하는 1가 항원-결합 분자의 MET 아고니스트 활성의 10% 미만인 MET 아고니스트 활성의 정도를 나타내는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 세포 표면-발현된 MET의 분해를 촉진하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 MET 유전자 변화를 숨기고 있는 종양의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  9. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 MET 유전자 변화를 숨기고 있는 종양의 퇴화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 성장이 자가 분비 HGF 신호 전달에 의해 구동되는 종양의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  11. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 성장이 자가 분비 HGF 신호 전달에 의해 구동되는 종양의 종양 퇴화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, D1은 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에서 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 서열 번호:138의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에서 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  13. 제12 항에 있어서, HCDR1은 서열 번호:60의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호:62의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호:64의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호:140의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호:142의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및 LCDR3은 서열 번호:144의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  14. 제13 항에 있어서, HCDR1은 서열 번호:60의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호:62의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호:64의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호:140의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호:142의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호:144의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  15. 제13 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호:58의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열 번호:138의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  16. 제15 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열 번호:138의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  17. 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, D2는 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에서 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 서열 번호:138의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에서 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  18. 제17 항에 있어서, HCDR1은 서열 번호:84의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호:86의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호:88의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호:140의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호:142의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및 LCDR3은 서열 번호:144의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  19. 제18 항에 있어서, HCDR1은 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호:86의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호:88의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호:140의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2은 서열 번호:142의 아미노산 서열을 포함하고; 및 LCDR3은 서열 번호:144의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  20. 제18 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호:82의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열 번호:138의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  21. 제20 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열 번호:138의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  22. 제1 항에 있어서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  23. 제1 항에 있어서, 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  24. 제1 항에 있어서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하고; 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  25. 제1 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 세포 독소에 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  26. 제25 항에 있어서, 세포 독소는 생물 독소, 화학치료제, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  27. 제25 항에 있어서, 세포 독소는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 듀오카르마이신, 225Ac, 227Th, 및 이것들의 임의의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  28. 제1 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 링커를 통해 세포독성제에 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  29. 제28 항에 있어서, 세포독성제는 메이탄시노이드인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  30. 제29 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호: 18 또는 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  31. 제30 항에 있어서, 메이탄시노이드는

    이고, 상기 식에서 는 링커로의 결합인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  32. 제31 항에 있어서, 링커는
    또는
    이고, 상기 식에서 로 표시된 결합은 이중특이적 항원-결합 분자로의 결합을 나타내고 로 표시된 결합은 메이탄시노이드로의 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  33. 제29 항에 있어서, 메이탄시노이드는

    이고, 상기 식에서 는 링커로의 결합인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  34. 제33 항에 있어서, 링커는

    이고, 상기 식에서 로 표시된 결합은 이중특이적 항원-결합 분자로의 결합을 나타내고 로 표시된 결합은 메이탄시노이드로의 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  35. 제1 항의 이중특이적 항원-결합 분자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  36. MET 유전적 변화를 숨기고 있는 종양 및/또는 성장이 자가 분비 HGF 신호 전달에 의해 구동되는 종양으로 고통받고 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 제1 항 내지 제34 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 암은 비-소세포 폐암 (NSCLC), 위암, 결장직장암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제36 항에 있어서, 대상체에게 제2 항암 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 대상체에서 암을 치료하고, 종양 성장을 감소시키고, 및/또는 종양 퇴화를 유발하는 방법으로서, 방법은 필요로 하는 대상체에게 이중특이적 항원-결합 분자 및 세포 독소를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 투여하는 단계를 포함하는데, 이중특이적 항원-결합 분자는
    제1 항원-결합 도메인 (D1); 및
    제2 항원-결합 도메인 (D2)
    을 포함하며, D1은 인간 MET의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    D2는 인간 MET의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는, 방법.
  40. 제39 항에 있어서, D1은 서열 번호: 18 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에서 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 서열 번호:138의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에서 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39 항에 있어서, D2는 서열 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에서 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 서열 번호:138의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에서 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제39 항에 있어서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  43. 제39 항에 있어서, 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  44. 제39 항에 있어서, 인간 MET의 제1 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 192-204를 포함하고; 인간 MET의 제2 에피토프는 서열 번호:155의 아미노산 305-315 및 421-455를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  45. 제39 항에 있어서, 세포 독소는 생물 독소, 화학치료제, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제39 항에 있어서, 세포 독소는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 토마이마이신, 듀오카르마이신, 225Ac, 227Th, 및 이것들의 임의의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제39 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제46 항에 있어서, 세포 독소는 링커를 통해 이중특이적 항원-결합 분자에 컨쥬게이션되고, 세포 독소는

    이고, 상기 식에서 는 링커로의 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48 항에 있어서, 링커는
    또는
    이고, 상기 식에서 로 표시된 결합은 이중특이적 항원-결합 분자로의 결합을 나타내고 로 표시된 결합은 메이탄시노이드로의 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제42 항에 있어서, 세포 독소는 링커를 통해 이중특이적 항원-결합 분자에 컨쥬게이션되고, 세포 독소는

    이고, 상기 식에서 는 링커로의 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제42 항에 있어서, 링커는

    이고, 상기 식에서 로 표시된 결합은 이중특이적 항원-결합 분자로의 결합을 나타내고 로 표시된 결합은 메이탄시노이드로의 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 다음 화학식 A1을 갖는 화합물 및 수성 희석제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    .
  53. 제52 항에 있어서, 항-MET 항체는 서열 번호: 82/138의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제52 항에 있어서, MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질은 서열 번호: 58의 D1-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제52 항에 있어서, MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질은 서열 번호: 18의 D1-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR 및 서열 번호: 82의 D2-HCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제52 항에 있어서, 화학식 A1의 화합물은 화학량론적 초과량으로 존재하는것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제52 항에 있어서, 화학식 A1의 화합물은 화학식 A2 또는 A3의 화합물, 또는 이것들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

  58. 제52 항에 있어서, 화학식 A2의 화합물은 용적 측정적으로(stereometrically) 순수한 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제52 항에 있어서, 화학식 A3의 화합물은 용적 측정적으로 순수한 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제52 항에 있어서, A1 또는 A2의 화합물은 50% 초과, 70% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 부분입체이성질체적 초과량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제52 항에 있어서, 화학식 A1의 화합물은 실리카 겔 및 희석제의 존재 하에 화학식 (a)의 화합물

    을 화학식 (b)의 화합물

    와 접촉시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. (i) 실리카 겔 및 희석제의 존재 하에 화학식 (a)의 화합물

    을 화학식 (b)의 화합물

    와 접촉시켜 중간물을 합성하는 단계; 및
    (ii) 항-MET 항체 또는 MET x MET 이중특이적 항원-결합 단백질을 중간물 및 수성 희석제와 접촉시키는 단계
    에 의해 제조되는 항체-약물 컨쥬게이트.
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