KR20230054285A

KR20230054285A - 나노몰 농도에서 세포 내 전달 가능한 미토콘드리아 특이적 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230054285A
Application number: KR1020220131798A
Authority: KR
Inventors: 유재훈; 최윤화
Original assignee: (주) 캠프테라퓨틱스
Priority date: 2021-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-04-24
Also published as: EP4417617A1

Abstract

본 발명은 저농도에서 세포 투과 능력과 강력한 미토콘드리아 표적성을 동시에 가지는 펩타이드 및 이의 의약 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 또는 이의 이합체는 미토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction)을 수반하는 질환 및 간 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

Description

나노몰 농도에서 세포 내 전달 가능한 미토콘드리아 특이적 펩타이드 및 이의 용도{Mitochondria-specific peptides capable of intracellular delivery at nanomolar concentration and uses thereof}

본 발명은 세포 투과 능력과 강력한 미토콘드리아 표적성을 동시에 가지는 펩타이드 및 이의 의약 용도에 관한 것이다.

미토콘드리아는 세포 생존에 필수적인 ATP의 대부분을 생성하는 중요한 세포소기관이다. 미토콘드리아의 DNA가 손상되거나 환경적, 외부적 영향 등에 의해 발생하는 미토콘드리아 기능 장애(Mitochondria dysfunction)는 다양한 내재적 미토콘드리아 질환뿐만 아니라 거의 모든 퇴행성 질환을 유발한다. 미토콘드리아 기능 장애의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아의 내막에 높은 밀도(~20%)로 분포하며 다중 불포화 지방산을 함유하는 인지질인 카디오리핀(cardiolipin, CL)의 결핍 또는 산화에 의해 촉진되는 크리스테(cristae) 구조의 고갈이다. 2개의 인산염 그룹을 포함하는 CL은 막의 기능단백질과 다중 전하-전하 상호작용을 제공함으로써 ATP 생산에 필수적인 역할을 한다. 미토콘드리아 내막(inner membrane of mitochondria, IMM)에서 CL 및 기타 인지질에 특이적으로 결합하는 물질은 CL의 산화를 방지할 수 있으며, 따라서 그러한 물질은 크리스테 구조의 파괴로부터 미토콘드리아를 보호하고 정상적인 미토콘드리아 기능을 유지할 수 있도록 한다.

한편, 분자에서 미토콘드리아에 대한 특이성은 소수성을 가지면서 양전하를 갖는 작용기에 의해 나타날 수 있다. 트리페닐포스포늄 양이온(triphenylphosphonium, TPP; Ph3P⁺-R) 등이 대표적인 미토콘드리아 특이적 분자이며, 이들은 내막에 존재하는 인지질의 음전하를 표적으로 한다. 그러나 이러한 물성을 갖는 분자들은 낮은 농도에서 세포 투과 능력에 문제가 있으며 고농도에서만 세포 내 전달이 가능한데, 이들 분자가 고농도로 세포 내에 전달되는 경우 세포 내 다른 분자에도 쉽게 결합하여 독성을 나타낼 가능성이 크다. 또한, 이들 미토콘드리아 특이적 분자들은 내막(IMM)에 존재하는 대표적 인지질인 CL에 대한 결합력이 약하여 CL이 풍부한 내막에 머물지 못하고, 계속해서 막의 안쪽으로 침투한다. 따라서 현재까지 개발된 대부분의 미토콘드리아 표적 분자(펩타이드)들은 미토콘드리아 막 내부에 존재하는 DNA를 표적하여 미토콘드리아를 죽이는 용도로만 이용되어 왔으며, 반대로 미토콘드리아의 활성을 상승시키거나 회복시키는 작용을 하는 분자는 극소수였다.

위 CL에 특이적인 물질의 대표적인 예로서 2개의 친수성 아미노산과 2개의 소수성 아미노산이 교대로 배열되어 구성된 미토콘드리아 특이적 SS(Szeto-Schiller) 펩타이드를 들 수 있다. 이 펩타이드는 2개의 양전하 아민과 2개의 방향족 작용기를 가지며, 이들은 CL의 각 인산염 및 지방산 성분과 친수성 및 소수성 상호작용을 한다. 그러나 CL에 대한 SS 펩타이드의 친화도(affinity)는 상대적으로 약하다(마이크로몰 수준의 농도 요구). 더욱이, 이들 SS 펩타이드의 서열을 6개 아미노산으로 확장하는 경우 미토콘드리아 침투력 및 미토콘드리아에 대한 특이성이 약간 향상되기는 하지만 심각한 독성을 유발하는 문제가 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 펩타이드의 특정 위치에 배열됨으로써 뛰어난 세포 투과능 및 미토콘드리아 표적화 능력을 갖는 펩타이드 또는 이의 이합체를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

본 발명은 상기 펩타이드 또는 이의 이합체의 약학적 용도를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명은 상기 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 또는 이를 이용한 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 미토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 미토콘드리아 기능 이상 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 간 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction)을 수반하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다:

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

상기 식 1에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고; X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고; X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고; X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환의 예방 또는 치료 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체의 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도가 제공된다.

일 구현예에서, 상기 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환은 미토콘드리아 근병증(mitochondrial myopathy), MELAS(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes) 증후군, 샤르코 마리 투스 질환(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 레베르 유전성 시신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 피어슨 증후군(Pearson syndrome), 리 증후군(Leigh syndrome), 프리드리히 운동실조(Friedreich's ataxia) 및 바르트 증후군(Barth syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 질환 예방 또는 치료 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체의 간 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도가 제공된다.

일 구현예에서, 간 질환은 급성 간부전(acute liver failure), 급성 간손상(acute liver injury), 간경변증(liver cirrhosis) 및 간염(hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 구현예에서, 식 1의 X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 식 1의 X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.

일 구현예에서, 식 1의 X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)일 수 있다.

다른 구현예에서, 식 1의 X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)일 수 있다.

일 구현예에서, 식 1의 X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)일 수 있다(단, X₂ 및 X₉가 동시에 루신(L)은 아님).

다른 구현예에서, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)일 수 있다.

일 구현예에서, 이합체는 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 서로 역평행(anti-parallel) 방향으로 연결된 것일 수 있다.

다른 구현예에서, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 또는 페니실아민(Pen)이고, 연결은 이황화 결합에 의할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 식 1로 표시되는 단위체가 서열번호 1 내지 서열번호 19중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 펩타이드 또는 이의 이합체를 나노 몰 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체가 제공된다:

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

상기 식 1에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)이고; X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고; X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고; X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.

일 구현예에서, 식 1의 X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.

다른 구현예에서, 식 1의 X₁, X₄, X₅ 및 X₈ 중 하나 이상은 각각 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.

일 구현예에서, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)일 수 있다(단, X₂ 및 X₉가 동시에 루신(L)은 아님).

다른 구현예에서, 이합체는 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 서로 역평행(anti-parallel) 방향으로 연결된 것일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 펩타이드 또는 이의 이합체는 미토콘드리아 막의 카디오리핀(cardiolipin)과 상호작용하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 19 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 미토콘드리아 기능 회복이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능을 회복시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 양면성 α-나선 구조의 펩타이드 또는 이의 이합체 펩타이드는 낮은 농도에서도 매우 높은 세포 투과 능력 및 손상된 미토콘드리아 표적 능력을 나타내며, 미토콘드리아 내막(IMM)에 함유된 카디오리핀과 특이적으로 강하게 상호작용함으로써 미토콘드리아의 기능을 증진시키거나 미토콘드리아 기능 장애를 예방하거나 정상 기능으로 회복시킬 수 있는 효과가 있다. 이러한 효과에 의해 본원의 펩타이드 또는 이의 이합체는 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환을 예방하거나 치료할 수 있으며, 각종 간 질환 또한 예방하거나 치료할 수 있다.

도 1은 기존의 대표적인 미토콘드리아 표적화 분자의 예시를 나타내는 것으로서, 각각 친유성 양이온(lipophilic cation)인 TPP(triphenylphosphonium) 이온, SS-31 및 켈리 그룹의 MPP(mitochondria penetrating peptide)의 화학 구조를 도시한다.
도 2는 α-나선 구조 및 β-시트 구조를 도시한다. α-나선 구조에는 한 측쇄와 이에 인접한 측쇄 사이의 길이(약 4.5Å), 측쇄를 포함한 나선의 직경(10-12Å)가 표시되어 있고, β-시트 구조에는 한 측쇄와 이에 인접한 측쇄 사이의 길이(약 7Å) 및 시트의 일측면 측쇄와 반대면 측쇄의 거리(약 7-8Å)가 표시되어 있다.
도 3은 생체 막 활성화를 위한 펩타이드 또는 저분자의 역할을 나타낸 모식도이다.
도 4a 내지 도 4c는 일 실시예에 따른 단량체 및 이합체 α-나선 펩타이드의 도식 구조를 나타낸다: 도 4a는 디스커버리 스튜디오 2020(Dassault Systemes BIOVIA, 미국)을 사용하여 도시된 α-나선 펩타이드 모델을 나타낸다. 펩타이드 라이브러리의 단량체는 AcNH-LCRLLRRLCR-C(O)NH2 서열을 기반으로 하였으며, 5번 위치의 루신(L)과 7번 위치의 아르지닌(R)의 측쇄에 존재하는 두 탄소 원자 사이의 거리를 거리 모니터를 사용하여 계산하였다; 도 4b는 단량체 α-나선 펩타이드의 휠 다이어그램을 도시한다. 검은색 원(1, 4, 5 및 8번 아미노산)은 소수성 잔기, 흰색 원(3, 6, 7 및 10번 아미노산)은 친수성 잔기, 흰색 사각형은 결합을 형성하는 아미노산 잔기를 나타낸다; 도 4c는 이합체 번들 펩티드의 휠 다이어그램을 도시한다. 도시된 구조는 역평행으로 결합되어 있다.
도 5는 4종의 Fmoc-아미노산이 동일한 커플링 비율로 펩타이드를 생성하도록 당량을 조절하기 전과 후의 HPLC 피크를 도시한다.
도 6은 16개의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리 중 하나인 L1X 서브-라이브러리에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 붉은색 화살표는 HPLC 크로마토그램의 첫 번째 피크(peak)부터 마지막 피크를 포함하는 연속적인 머무름 시간(Retention Time, RT)의 범위를 표시한다.
도 7a 내지 도 7d는 16개의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리에 대한 ROS 생성 억제 능력을 평가하기 위해 측정된 형광 강도를 비교 도시한 그래프이다: 도 7a는 소수성 모이어티의 1번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다; 도 7b는 소수성 모이어티의 4번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다; 도 7c는 소수성 모이어티의 5번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다; 도 7d는 소수성 모이어티의 8번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 공기 산화(air-oxidation) 또는 보호기를 사용한 공기 산화 방법에 의해 합성된 이합체 펩타이드 결합 방향(평행 또는 역평행)을 확인한 결과를 도시한다: 도 8a는 공기 산화에 의해 수득한 이합체 펩타이드(CMP3013 airoxidation으로 표기) 및 보호기를 사용한 공기 산화 방법에 의해 수득한 이합체 펩타이드(CMP3013 antiparallel으로 표기)의 크로마토그램을 도시한다; 반응 생성물은 파란색으로, 주요 생성물은 밑줄 및 볼드체로 표시하였다; 도 8b는 공기 산화에 의해 이합체화되는 단량체 펩타이드의 구조를 나타내는 모식도(화살표 좌측) 및 상기 방법에 의해 수득한 반응 생성물의 크로마토그램(화살표 우측)을 도시한다. 반응 생성물은 파란색으로, 주요 생성물은 밑줄 및 볼드체로 표시하였다; 도 8c는 보호기를 사용한 공기 산화 방법에 의해 이합체화되는 ACM 보호기가 부착된 펩타이드의 구조를 나타내는 모식도(화살표 좌측) 및 상기 방법에 의해 수득한 반응 생성물의 크로마토그램(화살표 우측)을 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 형광으로 표지된 이합체 번들 펩타이드FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 및 FL-CMP3029 내지 FL-CMP3032 각각의 세포 투과 능력을 도시한다: 도 9a는 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 각각의 농도에 따른 세포 투과율을 그래프로 나타낸 것이다(범례는 펩타이드의 EC₅₀ 값을 오름차순 정렬); 도 9b는 FL-CMP3029 내지 FL-CMP3032 각각의 농도에 따른 세포 투과율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 각각의 세포 투과 능력과 이합체 펩타이드 간의 올리고머화 경향성의 상관관계를 도시한 그래프이다.
도 11은 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 각각의 세포 독성을 비교한 그래프를 도시한다.
도 12는 HeLa 세포에 CMP3013을 농도별로 처리하고 24시간 경과 후 WST-1 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015를 각각 EC₅₀ 농도로 3시간 동안 처리한 HeLa 세포의 분획화 결과를 도시한다. 세포질(Cytosol, C)과 미토콘드리아(Mitochondria, M) 분획의 형광 강도로 표시하였으며, 세포 전체(Total, T)에 대한 값 대비 상대 수치로 나타내었다.
도 14a 및 도 14b는 일 실시예에 따른 이합체 번들 펩타이드의 ROS 생성 억제 능력을 측정한 결과를 도시한다: 도 14a는 HeLa 세포에서 0.5 mM H₂O₂ 처리에 의해 발생된 ROS에 대한 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 펩타이드 각각의 ROS 생성 억제 능력을 도시한다. 각 펩타이드는 EC₅₀ 농도로 3시간 동안 처리되었으며, 0.5 mM의 H₂O₂ 처리 후 공초점 현미경으로 이미징한 후 세포들의 형광 강도를 이미지 분석 프로그램으로 계산하였다. 각각의 점(dot)은 한 장의 이미지로부터 얻은 형광 강도에 대응한다; 도 14b는 HeLa 세포에서 35 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리하여 H₂DCFDA로 염색한 후 500 μM의 H₂O₂를 30분 동안 처리하여 산화 스트레스를 유발한 뒤 얻은 공초점 현미경 이미지이다(Scale bar = 50 μm).
도 15a 내지 도 15e는 FL-CMP3013, FL-CMP3029, FL-CMP3030, FL-CMP3031 및/또는 FL-CMP3032가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 이동하거나 결합하는 효과를 확인한 현미경 이미지를 도시한다: 도 15a는 100 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리하고 마이토트래커로 염색한 후 20 μM의 CCCP를 30분 동안 처리하여 미토콘드리아를 손상시킨 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지이다. 피어슨 r 값은 빨간색(FL-CMP3013)과 녹색(MitoTracker) 형광 신호의 상관관계를 의미한다(Scale bar = 20 μm); 도 15b는 100 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리한 HeLa 세포를 NAO로 염색하여 카디오리핀을 표지하고, 20 μM의 CCCP를 30분 동안 처리하여 미토콘드리아를 손상시킨 뒤 얻은 초고해상도 공초점 현미경 이미지이다(Scale bar = 5 μm). 오른쪽 패널에 도시된 그래프는 이미지에서 화살표로 표시된 부분의 녹색(NAO) 및 빨간색(CMP3013) 형광 신호의 상관관계를 보여준다; 도 15c의 상단 패널은 미토콘드리아의 분열을 유도하기 위해 Drp1-eGFP 플라스미드를 HeLa 세포에 형질도입시키고, 다음날 100 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리하여 촬영한 공초점 현미경 이미지이다(Scale bar = 20 μm). 하단 패널은 동일 조건에서 Drp1(+, Drp1-eGFP 형질도입)의 전위성(ectopic) 발현 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 도시한다; 도 15d는 미토콘드리아의 분열을 유도하기 위해 Drp1-eGFP 플라스미드를 HeLa 세포에 형질도입시키고, 다음날 FL-CMP3013, FL-CMP3029, FL-CMP3030, FL-CMP3031 또는 FL-CMP3032를 각각 처리하여 촬영한 공초점 현미경 이미지이다; 도 15e는 HeLa 세포를 FL-CMP3013(100 nM, 3시간) 및 마이토트래커로 처리하고, 공초점 현미경으로 세포를 이미징하는 동안 20 μM의 CCCP를 처리하여 미토콘드리아 손상을 유도하여 얻은 타임-랩스 이미지이다(Scale bar = 10 μm).
도 16은 20 μM의 CCCP에 의해 사멸이 유도된 HeLa 세포에 FL-CMP3013(붉은색)을 처리하거나 처리하지 않은 세포의 생존율을 비교하여 도시한 현미경 이미지이다(Scale bar = 20 μm).
도 17a 내지 도 17i는 산화 손상 세포에서 FL-CMP3013에 의한 미토콘드리아의 기능 유지/회복 및 미토콘드리아 내막의 크리스테 보호 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다: 도 17a는 FL-CMP3013(10 또는 30 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 0.5 mM의 H₂O₂를 30분 동안 처리한 후 총 ROS(좌측 그래프) 및 미토콘드리아 ROS(우측 그래프)의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 17b는 FL-CMP3013(2.5, 5 또는 10 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 5 μM의 안티마이신 A(antimycin A, AA)를 90분 동안 처리한 후 미토콘드리아 ROS의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 17c는 FL-CMP3013(5, 10 또는 20 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 10 μM의 CCCP를 90분 동안 처리한 후 미토콘드리아 ROS의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 17d는 FL-CMP3013(10 또는 30 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 1 mM의 H₂O₂를 1시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 17e는 FL-CMP3013(10 또는 20 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 1 μM의 안티마이신 A를 3시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 17f는 FL-CMP3013(5, 10 또는 20 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 10 μM의 CCCP를 1시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 17g는 HeLa 세포에 FL-CMP3013(10 또는 30 nM)을 3시간 동안 처리한 다음 1 mM의 H₂O₂로 1시간 동안 처리하여 미토콘드리아 막 전위(ψ)를 측정한 결과를 도시한다; 도 17h는 안티마이신 A에 의해 막 전위 감소가 유도된 SH-SY5Y세포에서 사이클로스포린 A(CsA), FL-CMP3012, FL-CMP3013 또는 FL-CMP3015를 처리한 후 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 JC-1 형광 비율로 측정한 결과를 도시한다; 도 17i는 FL-CMP3013 및 H₂O₂의 처리 조건에 따라 얻은 HeLa 세포의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다. (a) 음성대조군(mock), (b) 0.5 mM H₂O₂ 처리, (c) 50 nM의 CMP3013 또는 (d) 100 nM의 CMP3013을 2시간 동안 처리한 후 0.5 mM H₂O₂를 추가로 2시간 동안 처리(Scale bar = 1 μm). 그래프는 최소 50개의 독립적인 미토콘드리아 이미지로부터 0.5 μm 이상의 크리스테를 계수하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 18a 내지 도 18d는 FL-CMP3013의 세포내 이입 메커니즘과 세포에서의 최종 운명을 확인한 실험 결과를 도시한다: 도 18a는 HeLa 세포를 30분 동안 다양한 억제 조건으로 전처리(4 ℃로 사전 냉각, EIPA[5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride] 처리, MβCD(methyl-β-cyclodextrin) 처리, 염소산나트륨(NaClO₃) 처리 또는 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ) 처리)한 후 100 nM의 FL-CMP3013과 함께 3시간 동안 배양하여 FACS로 분석한 결과를 도시한다; 도 18b는 셀라이트 초기 엔도솜-GFP(CellLight™ early endosomes-GFP) 마커를 발현하는 HeLa 세포를 FL-CMP3013(100 nM, 3시간) 및 라이소트래커(LysoTracker™; 50 nM, 1시간)로 처리한 후 촬영한 공초점 현미경 이미지이다(r, 피어슨 상관계수; Scale bar = 20 μm); 도 18c는 CCCP의 부재(-) 또는 존재(+, 20 μM, 30분)에 따른 FL-CMP3013(100 nM, 3시간)의 카디오리핀 특이적 표적화(100 nM NAO 사용, 1시간)를 확인한 공초첨 현미경 이미지이다(Scale bar = 20 μm); 도 18d는 도 18c의 현미경 이미지에서 피어슨 r 값을 비교한 그래프로서, 좌측 파란색 막대는 CMP3013-라이소트래커의 상관계수를, 우측 녹색 막대는 CMP3013-NAO의 상관계수를 나타낸다. 각 조건당 5개의 독립적인 형광 이미지(배율 63X)를 분석하였다.
도 19a 내지 도 19d는 CMP3013m(단량체 펩타이드)가 리포솜에 의해 제작된 카디오리핀(CL) 함유 막과 강하게 상호작용하는 것을 보여준다: 도 19a는 NBD로 단량체 펩타이드 NBD-CMP3013의 HPLC 크로마토그램을 도시한다(> 95% 순도); 도 19b는 세 가지 유형의 리포솜(POPC:POPE = 2:1, 검정색 그래프; POPC:POPE = 2:1, 10% CL, 파란색 그래프; POPC:POPE = 2:1, 10% DLCL, 붉은색 그래프)을 1 μM의 NBD 표지된 CMP3013 단량체(NBD-CMP3013m)에 첨가하고 형광 강도의 변화(ΔF.I.)를 리포솜의 농도별로 표시한 그래프이다; 도 19c는 1 μM의 NBD-3013m에 리포솜을 첨가한 후, 과량의 CMP3013 단량체(CMP3013m)를 처리하여 CMP3013m의 농도별로 형광 광도를 측정한 그래프이다; 도 19d는 다양한 비율(0 ~ 20%)의 카디오리핀을 함유하는 리포솜을 NBD-CMP3013m 또는 NBD 염료와 함께 배양하여 형광 강도의 변화(ΔF.I.)를 카디오리핀의 함량에 따라 표시한 그래프이다(6-NBD, 6-(7-nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid; n = 3).
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMP3013의 작용 메커니즘을 설명하는 모식도이다.
도 21a 및 도 21b는 CMP3013, SS-31, LR10 및 MMP1a의 세포 투과 능력 및 미토콘드리아 표적화 능력을 도시한다: 도 21a는 CMP3013, SS-31, LR10 및 MMP1a의 농도에 따른 세포 투과율을 그래프로 나타낸 것이다; 도 21b는 CMP3013, SS-31, LR10 및 MMP1a를 각각 EC₅₀ 농도로 처리한 HeLa 세포의 분획화 결과를 도시한다. 세포질(Cytosol, C)과 미토콘드리아(Mitochondria, M) 분획의 형광 강도로 표시하였으며, 세포 전체(Total, T)에 대한 값 대비 상대 수치로 나타내었다(M/C ratio, 세포질 분획의 상대적 형광 강도/미토콘드리아 분획의 상대적 형광 강도).
도 22a 및 도 22b는 NBD-CMP3013m 및 NBD-SS-31이 리포솜에 의해 제작된 카디오리핀(CL) 함유 막과 상호작용하는 능력을 비교한 결과를 도시한다: 도 22a는 표면 플라스몬 공명 기법을 사용하여 센서 칩 상에 생성된 각 내막 모델(POPC:POPE = 2:1; 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀)에 각각 1 μM의 CMP3013 또는 SS-31을 처리하여 반응 단위(RU)를 측정한 결과를 보여준다; 도 22b는 세 가지 유형의 리포솜(POPC:POPE = 2:1; POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀; 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% DLCL)을 1 μM의 NBD-CMP3013m 또는 NBD-SS-31에 첨가하고 형광 강도의 변화(ΔF.I.)를 리포솜의 농도별로 표시한 그래프이다. 각 그래프의 하단에는 펩타이드의 상대적 친화력을 ΔF.I._max/EC₅₀ 값으로 표시하였다.
도 23a 내지 도 23d는 SS-31과 CMP3013의 ROS 생성 억제 능력을 비교한 결과를 도시한다: 도 23a는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 CCCP를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다; 도 23b는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 로테논(Rotenone)을 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다; 도 23c는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 안티마이신 A(Antimycin A)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다; 도 23d는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 과산화수소(H₂O₂)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24a 및 도 24b는 SS-31과 CMP3013의 ATP 생성 촉진 능력을 비교한 결과를 도시한다: 도 24a는 CMP3013(10 또는 30 nM) 또는 SS-31(10 또는 30 nM)을 전처리한 HeLa 세포에 1 μM의 안티마이신 A를 3시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다; 도 24b는 CMP3013(10 또는 30 nM) 또는 SS-31(10 또는 30 nM)을 전처리한 HeLa 세포에 1 mM의 H₂O₂를 1시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다.
도 25는 H₂O₂에 의해 막 전위 감소가 유도된 세포에서 CMP3013(10 또는 30 nM) 또는 SS-31(10 또는 30 nM)를 처리한 후 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 JC-1 형광 비율로 측정한 결과를 도시한다.
도 26은 수컷 C57BL/6 마우스에 시아닌 5.5로 표지된 CMP3013 펩타이드(Cy5.5-3013)를 3 mg/kg의 용량으로 정맥 주사하고 24시간이 경과한 뒤 적출된 장기의 IVIS 이미지로서, CMP3013의 생체 내 분포를 도시한다(LV, 간; KD, 신장; SP, 비장; LN, 폐).
도 27a 내지 도 27f는 CMP3013의 급성 간부전 치료 효과를 확인한 결과를 도시한다: 도 27a 내지 도 27c는 1 mg/kg의 CMP3013을 격일로 3회(Day 0, 2, 4) 정맥 투여한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg의 TAA를 복강내 투여하여 급성 간손상을 유발한 마우스에서 각각 혈중 AST(도 27a), ALT(도 27b) 및 ALP(도 27c)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다; 도 27d 내지 도 27f는 1, 5 또는 10 mg/kg의 CMP3013을 격일로 3회(Day 0, 2, 4) 복강내 투여한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg의 TAA를 복강내 투여하여 급성 간손상을 유발한 마우스에서 각각 혈중 AST(도 27d), ALT(도 27e) 및 ALP(도 27f)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.

정의

본 명세서에서 사용되는 용어 "단위체" 또는 "펩타이드 단위체"는 단량체 펩타이드 또는 이합체 펩타이드를 구성하는 최소 단위를 의미하며, 단위체는 10개의 아미노산으로 이루어진다. 단위체는 단량체 펩타이드의 일부 또는 전부를 구성한다.

용어 "펩타이드"는 아미노산 중합체로서, 천연 아미노산뿐 아니라 비천연 아미노산(예를 들어, β-아미노산, D-아미노산 등의 이성질체)도 구성요소로 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드를 구성하는 소수성 아미노산 중 하나가 루신(L)으로 정의되는 경우, 상기 용어 "루신(L)"은 천연형인 α-아미노산 형태의 L-루신 뿐만 아니라, 이의 위치 이성질체인 β-루신 및 거울상 이성질체인 D-루신을 모두 포함하는 의미로 사용되었다. 본 명세서에 기재된 다른 아미노산들(예를 들어, 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 트립토판(W), 아르지닌(R), 라이신(K), 히스티딘(H) 등)도 위와 마찬가지로 이들의 이성질체를 포함하는 의미로 사용되었다.

용어 "친수성 아미노산"은 극성을 띄는 아미노산을 의미할 수 있으며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력을 가지는, 즉 물과 혼합될 수 있는 아미노산을 포괄하는 의미로 사용되었다.

용어 "소수성 아미노산"은 극성이 없거나 현저히 낮은 아미노산을 의미할 수 있으며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력이 없는 성질, 즉 물과 혼합되지 않는 성질을 가지는 아미노산을 포괄하는 의미로 사용되었다.

용어 "양친매성(amphipathic) 펩타이드"는 "양면성 펩타이드"와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 구조적으로 양면성, 즉 소수성과 친수성을 모두 갖는 펩타이드를 의미한다. 양친매성 펩타이드의 일 측면 또는 모이어티가 친수성을 띄고 타 측면 또는 모이어티가 소수성을 띌 수 있다.

용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질병 및/또는 이러한 질병으로 인한 유해 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.

용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.

용어 "투여"는 개체에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대, 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 물질(예컨대, 본 발명의 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체)을 제공하는 것을 의미한다.

용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 명시된 기능을 향상시키거나, 예컨대, 원하는 및/또는 유익한 기능을 향상 또는 증가시키고, 원하지 않은 기능을 감소 또는 저하시키거나; 증상 중 하나 이상을 호전, 일시적 완화, 약화 및/또는 지연시키는 것과 같이 명시된 질환, 병태 또는 질환을 치료하기에 충분한 화합물, 조성물 또는 약물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환과 관련하여, 유효량은 미토콘드리아 기능 이상을 지연시키거나 회복시키기에 충분한 양을 포함한다.

용어 "개체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용되고, 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환 또는 다른 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어, 영장류(예: 인간), 반려 동물(예: 개, 고양이 등), 가축 동물(예: 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예: 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 개체는 인간이다.

본 명세서 사용되는 용어 "약"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 조건, 조성, 양 등을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로 "약" 이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.

미토콘드리아 특이적 펩타이드 단위체

본 발명은 부분적으로 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 펩타이드의 특정 위치에 배열됨으로써 뛰어난 세포 투과능 및 미토콘드리아 표적화 능력을 가지며, 이를 통해 손상된 미토콘드리아를 회복시킬 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 상기 펩타이드 단위체는 총 10개의 아미노산으로 이루어지고 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산을 적정한 비율, 예컨대 1:1, 구체적으로 각 4개씩 포함할 수 있으며, 각 단위체는 1개 또는 2개의 위치에서 서로 결합을 통해 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드 단위체는 α-나선형의 양친매성(양면성) 이합체 번들 펩타이드를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드 단위체는 증가된 α-나선도를 가져서 세포 내 투과율이 증가되고, 세포 내에서는 α-나선이 제거되어 펩타이드가 가진 독성이 감소될 수 있다. 이합체의 세포 투과 능력은 단일 가닥의 α-나선 펩타이드에 비해 100배 이상 우수하기 때문에, 이합체 번들이 형성되면 나노 몰 농도에서도 쉽게 세포 내로 전달될 수 있다. 나노 몰 농도로 세포 내 전달된 이합체 번들 펩타이드의 이황화 결합은 세포 내 환경에서 쉽게 단량체로 환원되고 미토콘드리아를 표적화할 수 있다. 이렇게 전달된 펩타이드는 비정상적인 미토콘드리아에 특이적으로 결합하여 미토콘드리아가 더 이상 손상되지 않도록 하거나 손상된 미토콘드리아의 기능을 회복시킴이 실험적으로 확인되었다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 제공된다:

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

일 구현예에서, 펩타이드를 구성하는 각각의 아미노산은 양친매성(amphipathic)을 나타내면서 α-나선 구조를 유지할 수 있도록 하는 것이라면 그 종류가 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 소수성 아미노산 또는 친수성 아미노산을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명자들은 이전 연구를 통해 α-나선도가 증가된 펩타이드는 세포내 투과율이 증가되고, 세포 내에서는 알파나선이 제거되어 펩타이드가 가진 독성을 감소시킬 수 있었음을 밝힌 바 있다(WO 2015/057009).

다른 구현예에서, 소수성 아미노산은 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 식에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다. 바람직하게는, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있고, 보다 바람직하게는 루신(L), 페닐알라닌(F) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구현예에 따르면, 식 1에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈ 중 하나 이상(즉, 하나, 둘, 셋 또는 넷)은 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다. 이 때, X₁, X₄, X₅ 및 X₈ 중 나머지는 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 친수성 아미노산은 양전하 측쇄를 갖는 친수성 아미노산일 수 있다. 예컨대, 친수성 아미노산은 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 및 디아미노프로판산(Dap)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 식에서, X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)일 수 있다. 바람직하게는, X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)일 수 있고, 보다 바람직하게는 아르지닌(R), 호모아르지닌(hR) 또는 노르아르지닌(norR)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 구현예에 따르면, 식 1에서, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)일 수 있다(단, X₂ 및 X₉가 동시에 루신(L)은 아님). 바람직하게는, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)일 수 있고, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 시스테인(C) 또는 호모시스테인(Hcy)일 수 있다.

일 구현예에 따르면, 식 1에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)이고; X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고, X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.

다른 구현예에 따르면, 식 1에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)로 이루어진 군에서 선택된 소수성 아미노산이고; X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 및 디아미노프로판산(Dap)으로 이루어진 군에서 선택된 친수성 아미노산이고; X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고; X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.

바람직하게는, X₁, X₄, X₅ 및 X₈ 중 하나 이상은 서로 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)이고, 나머지는 서로 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이 때, X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 바람직하게는 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)일 수 있고, 보다 바람직하게는 아르지닌(R), 호모아르지닌(hR) 또는 노르아르지닌(norR)일 수 있다. 또한, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)일 수 있고, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 시스테인(C) 또는 호모시스테인(Hcy)일 수 있다.

다른 구현예에서, 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드는 Hfa-Cys-Arg-Hfa-Hfa-Arg-Arg-Hfa-Cys-Arg의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Hfa는 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)로 이루어진 군에서 선택된 소수성 아미노산인 펩타이드이거나 이를 포함할 수 있다. 이 때, Hfa 중 하나 이상은 서로 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 식 1로 표시되는 단위체는 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 서열번호 19중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 단위체 펩타이드의 양친매성 및 α-나선 구조가 유지될 수 있는 한 상기 아미노산 서열에 제한되는 것은 아니다.

식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드는 세포 내에 전달되어 미토콘드리아 막, 특히 미토콘드리아 막의 카디오리핀(cardiolipin)과 상호작용할 수 있다. 또한, 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드를 산화 스트레스가 유도된 세포에 처리해 주는 경우 ROS의 생성이 억제된다(실시예 2.2.2 참조).

미토콘드리아 특이적 펩타이드 이합체

본 발명의 다른 태양에 따르면, 상술한 펩타이드를 단위체로 포함하는 이합체 펩타이드가 제공된다. 본 실시 태양의 이합체 펩타이드는 하기 식 1로 표시되는 단위체 펩타이드를 포함한다.

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

식 1에서, X₁ 내지 X₁₀은 상술한 바와 같다.

다른 구현예에서, 식 1로 표시되는 단위체 펩타이드는 Hfa-Cys-Arg-Hfa-Hfa-Arg-Arg-Hfa-Cys-Arg의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Hfa는 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)로 이루어진 군에서 선택된 소수성 아미노산인 펩타이드를 포함할 수 있다. 이 때, Hfa 중 하나 이상은 서로 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이합체 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단위체 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 이합체 펩타이드는 단위체 펩타이드가 서로 결합을 통해 형성될 수 있다. 이 때 결합의 위치는 X₂ 및 X₉ 중 어느 하나 또는 둘 다의 위치일 수 있다. 이에 따라, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단량체 펩타이드가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 임의의 아미노산으로부터 선택될 수 있는데, 예를 들어, X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)이며, 단 X₂ 및 X₉가 동시에 루신(L)은 아닌 것일 수 있다.

각 단량체 펩타이드 사이에 형성되는 결합은 본 발명이 목적하는 특성을 나타내도록 펩타이드 사이를 연결시키는 어떠한 형태의 결합도 포함될 수 있으며, 예를 들어 공유결합을 포함할 수 있다. 상기 공유결합은 펩타이드의 기능을 저해하지 않으면서, α-나선도를 향상시킬 수 있는 형태의 공유결합이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 시스테인 사이의 이황화 결합, 디셀레나이드 결합, 에스테르 결합, 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응(click reaction)에 의한 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결합일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 공유결합은 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen) 사이의 이황화 결합, 셀레노시스테인(U) 사이의 디셀레나이드 결합, 에스테르 결합, 반응에 참여할 수 있는 티올 기능기를 이용한 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합, 및 클릭 반응을 유발할 수 있는 삼중결합이나 아지드 그룹을 가지는 비천연 아미노산을 포함하는 경우 클릭 반응(click reaction)에 의한 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

이합체 펩타이드를 이루는 두 단량체 사이에 이황화 결합(다이설파이드 결합)이 생성되는 경우, 단량체에서 시스테인(C)을 사용할 경우 두 단위체 펩타이드 골격 사이에는 4개의 원자(CSSC; C, 탄소; S, 황)가 존재한다. 이 때 시스테인(C) 대신 호모시스테인(Hcy)을 사용하는 경우, 두 단위체 펩타이드 골격 사이를 5개의 결합 거리(CCSSC 또는 CSSCC) 또는 6개의 결합 거리(CCSSCC)로 조절할 수 있다. 일 구현예에서, 한 개의 시스테인과 한 개의 호모시스테인이 산화작용으로 연결된 이합체를 사용할 수 있다. 또한, 셀레노시스테인(U)이나, 페니실아민(Pen)을 시스테인 대신 사용하여 디셀레나이드(diselenide), 시스테인 또는 페니실아민과의 혼성 또는 에스테르의 다이설파이드 결합을 이룰 수 있다.

일 구현예에서, 이합체 펩타이드는 각 단위체를 포함하는 펩타이드(단량체 펩타이드)가 모두 N-말단에서 C-말단 방향을 유지하며 평행(parallel) 방향으로 연결되거나, 또는 2개의 펩타이드 중 하나는 N-말단에서 C-말단 방향, 다른 하나는 C-말단에서 N-말단 방향으로, 즉, 역평행(antiparallel) 방향으로 연결될 수 있다. 다른 구현예에서, 각 단위체를 포함하는 펩타이드(단량체 펩타이드)는 서로 역평행 방향으로 연결될 수 있다. 이 때, 각 단위체의 서열은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

이합체 펩타이드는 N-말단이 지방산으로 지방화(lipidation)될 수 있다. 구체적으로, 상기 이합체 펩타이드는 X₁의 위치에서 C₆ 내지 C₁₆ 지방산이 결합되어 있을 수 있다. 이러한 지방산 결합을 통해 세포 투과능을 추가로 향상시킬 수 있다.

이합체 펩타이드는 효과가 발휘되는 농도에서 세포 독성 없거나 거의 없으며, 미토콘드리아(특히, 미토콘드리아 내막에 존재하는 카디오리핀)를 특이적으로 표적함으로써 다양한 미토콘드리아 기능 장애를 회복시키는 효과를 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 이합체 펩타이드는 마이크로몰 수준의 농도 이상에서만 세포 독성이 나타나며, 배양된 세포의 50%가 사멸되는 농도는 10 마이크로몰에 이르는 것으로 확인되었다(실시예 6 참조). 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 이합체 펩타이드는 세포에 처리되는 경우 미토콘드리아 분획에 현저하게 높은 비율로 존재하는 것이 확인되었으며, 나아가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 표적화됨을 발견하였다(실시예 7 및 실시예 9 참조). 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 이합체 펩타이드는 손상된 미토콘드리아 내막에서 노출된 카디오리핀에 선택적으로 결합함으로써 미토콘드리아의 기능을 회복시키고 세포의 생존율을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 미토콘드리아 내막의 크리스테(cristae) 구조를 보호하거나 회복시킴으로써 ROS 생성을 억제하고 ATP의 생성을 촉진하며 막 전위를 회복시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 10 내지 실시예 12 참조).

이와 같은 본원 이합체 펩타이드의 효과는 종래 기술과 비교하여 현저하게 향상된 것이다. 구체적으로, 기존에 카디오리핀에 결합한다고 알려진 SS-31 펩타이드와 비교하여 본원의 이합체 펩타이드는 세포 투과 능력, 카디오리핀 결합 능력, ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력, 막 전위 회복 능력 등 모든 면에서 현저하게 향상되는 것으로 확인되었다(비교예 1 내지 5 참조).

이합체 펩타이드는 10개 아미노산으로 구성되는 식 1의 단위체로 이루어진 펩타이드가 서로 연결된 동종 이합체(homodimer)(상이한 서열을 갖는 두 펩타이드의 이합체 포함)일 수 있으나, 본 발명의 특유의 α-나선 구조를 유지하는 한, 식 1의 단위체에 아미노산 길이가 상이하거나 식 1과는 다른 서열상 특징을 갖는 다른 단량체 펩타이드가 연결된 이종 이합체(heterodimer)일 수 있다. 예컨대, 상기 아미노산의 길이가 상이한 다른 단량체 펩타이드는 식 1의 단위체 펩타이드의 어느 한 말단 또는 양 말단에 하나 이상의 아미노산이 추가되어 길이가 더 길어진 단량체 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 이합체 펩타이드는 상호작용에 의한 자가조립에 의해 올리고머를 형성할 수 있다(실시예 5 참조). 이합체 펩타이드가 일정 수준으로 올리고머화되는 경우에는 세포 투과 능력이 더 증대될 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상술한 미토콘드리아 특이적 단량체 펩타이드 또는 이합체 펩타이드가 유효성분으로 포함된 약학 조성물 및 이를 이용한 질병의 치료 방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 본원의 펩타이드는 손상된 미토콘드리아에 표적화되어 노출된 카디오리핀에 특이적으로 결합함으로써 크리스테의 구조를 보존/회복시키고 이에 따라 미토콘드리아의 기능 장애를 회복시키는 효과가 있으며, 이와 같은 기능 장애 회복 능력은 ROS 생성 억제 효과, ATP 생성 촉진 효과, 미토콘드리아 막 전위 회복 효과 등에 의해 입증되었다(실시예 9 내지 실시예 11 참조).

이러한 발견에 기초한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction)을 수반하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다:

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

식 1에서, X₁ 내지 X₁₀은 상기에서 정의된 바와 같다. 그 외에, 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체에 관해서는 상기 "미토콘드리아 특이적 단량체 펩타이드" 및 "미토콘드리아 특이적 이합체 펩타이드" 섹션에 기술된 모든 내용이 동일하게 적용된다.

일 구현예에서, 상기 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환은 미토콘드리아 근병증(mitochondrial myopathy), MELAS(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes) 증후군, 샤르코 마리 투스 질환(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 레베르 유전성 시신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 피어슨 증후군(Pearson syndrome), 리 증후군(Leigh syndrome), 프리드리히 운동실조(Friedreich's ataxia) 및 바르트 증후군(Barth syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "미토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction)을 수반하는 질환"은 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 또는 미토콘드리아 구성요소를 암호화하는 핵 유전자에서 발생하는 유전적 또는 후천적 돌연변이, 약물, 감염 또는 기타 환경적 원인 등에 의한 미토콘드리아의 손상 등에 의한 미토콘드리아의 기능 이상(장애)의 결과 나타나는 질환을 의미하는 것으로서, "미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

다른 실시예에 따르면, 본 발명의 이합체 펩타이드는 급성 간부전(acute liver failure)에 대한 치료 효과가 있다(실시예 14). 특히, 펩타이드의 투여 경로에 관계없이(즉, 정맥 투여된 경우와 복강내 투여된 경우 모두에서) 급성 간부전에 의한 간 손상을 억제하는 효과가 나타났으며, 이러한 치료 효과는 저용량(1 mg/kg)의 펩타이드를 투여한 경우에도 발휘된다는 점에서 고무적이다.

상기 발견에 기초한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다:

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

식 1에서, X₁ 내지 X₁₀에 대한 정의는 상기와 같다.

본 약학 조성물에 포함되는 펩타이드는 상기 "미토콘드리아 특이적 단량체 펩타이드" 및 "미토콘드리아 특이적 이합체 펩타이드" 섹션에 기술된 모든 내용이 동일하게 적용된다.

일 구현예에서, 상기 간 질환은 급성 간부전(acute liver failure), 급성 간손상(acute liver injury), 간경변증(liver cirrhosis) 및 간염(hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 구현예에서, 간 질환은 미토콘드리아 기능 이상을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 이합체 펩타이드는 100 nM 미만의 농도에서도 세포 내로 이동하여 미토콘드리아에 표적화되며, 기존의 미토콘드리아 특이적 펩타이드가 마이크로몰 수준의 농도에서 미토콘드리아 기능 이상의 회복 효과를 나타내는 것과 대조적으로 나노몰 수준의 농도에서도 미토콘드리아 기능 이상의 회복 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4, 비교예 1 내지 5 참조). 따라서, 상기 약학 조성물은 펩타이드를 나노 몰 농도로 포함할 수 있다.

한편, 본 실시 태양의 약학 조성물을 제조하기 위해, 상기 펩타이드는 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 약학 조성물은 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다.

허용되는 담체 및/또는 부형제(안정화제 포함)는 사용되는 용량 및 농도에서 개체에게 무독성이고, 버퍼(예를 들어 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기산); 항산화제(예를 들어 아스코르브산 또는 메티오닌); 방부제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헤사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 이하의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질(예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린); 친수성 중합체(예를 들어 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르지닌, 또는 라이신); 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제(예를 들어 EDTA); 당(예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨); 염 형성 반대 이온(예를 들어 나트륨); 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제(예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 그 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 적합한 형태로 제제화될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "예방적 또는 치료적 유효량" 또는 "유효량"은 개체에서 미토콘드리아 기능 이상과 관련된 질환 또는 다른 질환 등을 예방 또는 치료하는 데 유효한 조성물의 유효 성분의 양으로서, 의학적 처치에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 상기 질환을 예방 또는 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류 및 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 이때, 상기한 요소들을 모두 고려하여 최소한의 부작용 또는 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에서 유효 성분의 유효량은 개체(환자)의 나이, 성별, 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간 등에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니지만, 1일 투여량이 0.001 내지 100 mg/kg, 구체적으로는 0.01 내지 10 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 주입용 펌프 등을 이식하여 장시간 또는 장기간에 걸쳐 투여할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 대상에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데 예를 들면, 비경구 투여일 수 있으며, 비경구 투여는 주사(예컨대, 볼러스 주사) 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여(subcutaneous injection), 정맥내 투여 (intravenous injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 동맥내 투여(intraarterial injection), 복강내 투여(intraperitoneal injection), 뇌내 투여(intracerebral injection), 척추강내 투여(intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)가 포함된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 피하 투여(subcutaneous injection), 정맥내 투여(iv injection) 또는 복강내 투여(intraperitoneal injection)된다.

치료 방법

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 약학 조성물을 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다. 또한, 상기 약학 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 미토콘드리아 기능 회복이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능을 회복시키는 방법이 제공된다:

<식 1>

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀

상기 식 1에서, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고;

X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고; X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고; X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.

미토콘드리아의 CL이 여러 요인에 의해 산화되거나 그 구조에 이상이 발생하는 경우 크리스테의 만곡이 사라지면서 전자전달계의 기능을 담당하는 다양한 종류의 단백질들이 서로 물리적으로 멀어지게 되어 그 기능을 점차 잃게 된다. 상기 펩타이드 또는 이의 이합체는 CL에 결합하여 크리스테의 만곡을 회복시키고 전자전달계의 단백질 복합체가 정상적인 기능을 재개할 수 있도록 만듦으로 미토콘드리아의 기능을 정상화시킬 수 있다.

상기 구성 중 "치료적 유효량", "대상체", "미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환", "간 질환", "펩타이드", "이합체"에 대한 구체적인 설명은 상기 "미토콘드리아 특이적 단량체 펩타이드", "미토콘드리아 특이적 이합체 펩타이드" 및 "약학 조성물" 부분에 기재된 내용 전체를 참조한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

I. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 설계, 합성 및 선택

실시예 1. 미토콘드리아를 표적으로 하는 펩타이드 라이브러리의 설계

기존의 미토콘드리아 특이적 SS-펩타이드는 매우 짧은 아미노산 서열에 양친매성(amphipathic)을 제공하는 β-시트 형태의 2차 구조를 가지고 있다. 그러나 이와 같은 SS-펩타이드는 친수성 모이어티와 소수성 모이어티 사이의 거리가 상대적으로 짧기 때문에(약 7Å; 도 1 및 2), 일단 카디오리핀과 같은 인지질의 인산기와 펩타이드의 친수성 모이어티 사이에서 전하 상호작용이 발생하면 인지질의 지질 모이어티와 소수성 상호작용을 생성하기에 충분하지 않다. 또한, SS-펩타이드의 대표격인 SS-31에는 카디오리핀과 1:1 상호작용에 참여하는 두 개의 하전 부위만 존재할 뿐이다.

본 발명자들은 짧은 길이의 β-시트 구조를 갖는 SS-펩타이드의 카디오리핀 결합과 관련된 단점을 극복하기 위해 10개의 아미노산으로 구성된 α-나선형 펩타이드를 설계하였다. 특히, 본 발명에 따른 펩타이드의 양친매성 α-나선 구조는 친수성과 소수성 아미노산 측쇄 사이에 더 긴 거리(약 11.3Å)를 갖기 때문에 카디오리핀의 지방산 측쇄와 훨씬 더 강한 소수성 상호작용이 일어날 수 있다(도 4a). 또한, α-나선형 펩타이드는 나선 구조에 4개 이상의 양전하 부위를 포함하므로, 복수의 카디오리핀 분자에 대한 결합력을 가진다.

한편, 표적 카디오리핀에서 펩타이드와 지방산 측쇄와의 더 강한 소수성 상호작용을 유도하기 위해 펩타이드의 소수성 모이어티(도 4b의 펩타이드 모식도에서 1, 4, 5 및 8번으로 표시된 위치의 아미노산)의 기준 아미노산인 루신(L)을 다른 여러 종류의 소수성 아미노산으로 치환하여 미토콘드리아 표적화 능력 등을 평가하였다.

실시예 2. 단량체 펩타이드의 합성

실시예 2.1. CMP3001m 내지 CMP3015m의 합성

하기 실험예 1.1에 기술된 바와 같이, 고체상 펩타이드 합성법에 의해 하기 식 2의 아미노산 서열을 갖는 단량체 펩타이드를 합성하였다.

<식 2> X₁-C-R-X₄-X₅-R-R-X₈-C-R

(여기서, C는 시스테인이고, R은 아르지닌이고, X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha, X)이다.)

단량체 펩타이드는 아세틸 캡핑 또는 형광 표지된 형태의 2종을 준비하였다. 아세틸 캡핑된 단량체 펩타이드는 각각 CMP3001m 내지 CMP3015m으로 명명되었다. 이들의 아미노산 서열, 계산된 질량(calculated mass) 및 관찰된 질량(observed mass)을 하기 표 2에 나타내었다. N-말단에 TAMRA로 표지된 단량체 펩타이드 또한 아세틸 캡핑된 단량체 펩타이드와 동일한 방법으로 합성하였으며, 각각 FL-CMP3001m 내지 CMP3015m으로 명명하였다. 이들의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

실시예 2.2. 디콘볼루션 펩타이드 라이브러리의 합성 및 선택

실시예 2.2.1. 16종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리 합성

소수성 모이어티의 기준 아미노산인 루신(L)을 다른 여러 종류의 소수성 아미노산으로 치환하여 미토콘드리아 표적화 능력 등을 평가하기 위해, 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 조합의 디콘볼루션(deconvolution) 펩타이드 라이브러리(16종의 서브 라이브러리)를 합성하였다. 표 4에서, Hdf는 사이클로헥실알라닌(Cha), 페닐알라닌(F), 루신(L) 및/또는 티로신(Y)을 의미하며, 이로써 소수성 아미노산의 다양성을 증가시켰다.

디콘볼루션 펩타이드 라이브러리(16개의 서브-라이브러리)는 실험예 1.1에 기술한 바와 같이 Fmoc 고체상 펩타이드 합성법을 사용하여 합성하였다. 구체적으로, 고체상 수지는 0.51 mmole/g의 링크 아마이드 MBHA 수지(Sigma, 미국)를 사용하였으며, 탈보호는 20% 피페리딘(Sigma)을 사용하였다. 탈보호 후 DMF로 3회, DCM으로 5회, 다시 DMF로 3회 세척하고, Fmoc 보호기가 부착된 아미노산, DIPEA 및 PyBOP을 각각 6당량씩 사용하여 커플링하였다. 반응 용액의 총 부피는 5 ml로 하여 4종의 아미노산(Y, L, F 및 Cha)을 각각 1.5당량씩 사용하여 최초 반응 조건을 탐색하였다. 반응 후 DMF로 3회, DCM으로 3회, 다시 DMF로 3회 세척하였다. 이어서 절단 혼합체(cleavage cocktail; 95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% DW)를 사용하여 2시간 동안 반응시킨 뒤 차가운 에테르로 침전시켰다. 질소 기체를 사용하여 용매를 날려준 후 DMSO에 용해시켜 HPLC를 수행하였다. HPLC 기기(Infinity 1260, Agilent, 미국)에서 고정상으로 Phenomenex C18 컬럼(3 μm, 4.6 × 150 mm)을 사용하였으며, 이동상으로 버퍼 A는 0.1%(v/v) TFA 워터를, 버퍼 B로는 0.1%(v/v) TFA ACN을 사용하였다. 구배 조건은 0분에 0% 버퍼 B를 이후에는 60분까지 100% 버퍼 B를 선형 구배로 변화시켰다. UV 검출기의 파장은 209, 220 nm를 사용하여 확인하였다.

4종의 아미노산을 균등한 비율로 결합시키기 위해, 총 6당량을 유지하면서 커플링이 더 많이 일어난 아미노산의 당량 비율을 줄이고, 커플링이 상대적으로 적게 일어난 아미노산의 당량 비율은 늘리는 방식으로 각 아미노산의 당량을 결정하였다. 구체적으로, 동일한 몰수의 아미노산 4종을 HPLC에 주입하여 몰 흡광 계수 비를 도출한 뒤 반응 산물에 포함된 4종 아미노산의 몰수 비를 HPLC 피크 아래 면적을 이용하여 계산하였다. 최종적으로 찾아낸 Y, L, F 및 Cha의 몰수 비는 각각 1.26, 1.33, 1.48 및 1.93 당량이었으며, 상기 조건에서의 커플링 비율은 Y:L:F:Cha = 1.06:0.97:0.99:0.99로 관찰되었다(도 5).

16개의 서브-라이브러리에 대한 순도(purity)는 HPLC 기기(Infinity 1260, Agilent)를 사용하여 확인하였다. 구체적으로, HPLC의 고정상으로는 Phenomenex C18 컬럼(3 μm, 4.6 × 150 mm)을 사용하였고, 이동상으로 버퍼 A는 0.1%(v/v) TFA 워터를, 버퍼 B로 0.1%(v/v) TFA ACN을 사용하였다. 구배 조건은 5% 버퍼 B를 0-5분까지 유지하였으며, 이후 5-30분 동안 5-70%의 버퍼 B를 선형 구배로 변화시켰으며, 30-40분 동안 70-100%의 버퍼 B로 선형 구배를 적용하였다. UV 검출기의 파장은 220, 280 nm를 사용하여 확인하였다. 합성한 16개의 서브-라이브러리를 HPLC조건에서 정제하고, 각각의 서브-라이브러리에 대한 크로마토그램을 수득하였다.

수득한 크로마토그램 중 L1X 서브-라이브러리에 대한 크로마토그램을 대표예로서 도 6에 나타냈으며, 16개의 모든 서브-라이브러리에 대한 HPLC 크로마토그램 결과는 첫 번째 피크(peak)부터 마지막 피크를 포함하는 연속적인 머무름 시간(Retention Time, RT)의 범위로서 하기 표 5에 제시되어 있다.

16개 서브-라이브러리에 포함된 단량체 펩타이드의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

실시예 2.2.2. 단량체 펩타이드 서브-라이브러리의 ROS 생성 억제 능력 분석

실시예 2.2.1에서 합성한 16개의 펩타이드 서브-라이브러리를 사용하여 소수성 모이어티의 1, 4, 5 및 8번 위치에 어떤 종류의 소수성 아미노산이 위치할 때 ROS(reactive oxygen species)의 생성 억제 능력이 가장 우수한지 평가하였다.

세포의 ROS 수준 분석은 하기 실험예 6에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 구체적으로, HeLa 세포(96-웰 플레이트, 2 × 10⁴ 개 세포/웰)를 1일 동안 배양한 후 100 nM의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 3시간 동안 처리하였다. 펩타이드가 처리된 세포를 PBS로 세척하고 25 μM DCFDA로 30분 동안 염색하였다. 그런 다음 세포를 0.5 mM H₂O₂로 처리하여 산화 스트레스를 유도하였다. ROS의 생성은 37℃에서 30분 동안 마이크로플레이트 리더(TECAN)을 사용하여 형광 강도로 판독하였다.

각 실험을 10회 반복하여 측정 값의 평균을 도 7a 내지 도 7d에 나타내었다. 상기 ROS 생성 억제 효과에 의해 소수성 모이어티의 각 위치에서 가장 선호되는 아미노산이 결정되었고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

4번 아미노산의 경우에는 CMP3013 펩타이드가 이 위치에 루신(L)을 갖기 때문에, 선호하는 아미노산에 대해 사이클로헥실알라닌(Cha) 또는 루신(L)이 선택되었다.

실시예 2.3. CMP3029m 내지 CMP3032m의 합성

실시예 2.2에서 선택된 소수성 아미노산을 조합하여 4종의 단량체 펩타이드를 합성하고, 이를 각각 CMP3029m 내지 CMP3032m으로 명명하였다. 이들 단량체 펩타이드의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 7에 나타내었다. TAMRA로 표지된 단량체 펩타이드 또한 동일한 방법으로 합성하고, 각각 FL-CMP3029m 내지 FL-CMP3032m로 명명하였다. 이들 단량체 펩타이드의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

실시예 3. 이합체 번들 펩타이드의 합성

실시예 3.1. CMP3001 내지 CMP3015의 합성

실시예 2.1에서 합성한 단량체 펩타이드를 이합체 번들로 만들기 위해 공기 산화(air oxidation)를 이용하여 두 단량체 펩타이드 사이에 이황화 결합이 형성되도록 하였다. 먼저, 형광이 표지되지 않은 단량체 펩타이드를 5~10 mg/ml 농도로 0.1 M 중탄산암모늄 버퍼에 용해하고, 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 이합체화를 수행하였다. HPLC로 정제된 이합체 펩타이드는 각각 CMP3001 내지 CMP3015로 명명하고, MALDI-TOF를 사용하여 질량을 분석하였다. 이들 이합체 펩타이드에 대한 아미노산 서열 및 순도 분석, 질량 분석 결과는 하기 표 9에 나타내었다(표 9에서 두 시스테인 사이의 선은 이황화 결합을 나타내며, 이하 표 10 내지 표 12에서 모두 동일함). 형광이 표지된 이합체 번들 펩타이드의 합성은 형광이 표지되지 않은 단량체 펩타이드와 TAMRA로 표지된 단량체 펩타이드를 1:1 비율로 혼합하고 상기 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 이합체화를 수행하였다. 반응물을 HPLC로 정제한 뒤 MALDI-TOF로 질량을 확인하였으며, 각각의 펩타이드는 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015로 명명하였다. 형광이 표지된 이합체 번들 펩타이드 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015의 아미노산 서열, HPLC에 의한 순도 분석 및 질량 분석 결과는 하기 표10에 나타내었다. 정제된 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015은 모두 > 95% 순도를 나타내었다(표 10).

이합체 펩타이드의 수득율은 사이클로헥실알라닌(Cha)의 위치 및 개수에 따라 차이를 나타냈으나, 특별히 합성이 잘 되지 않는 이합체는 없었다. 다만, 4개의 사이클로헥실알라닌(Cha)으로 구성된 펩타이드는 예상된 바와 같이 물에 대한 용해도가 상대적으로 떨어졌다. 그러나, 사이클로헥실알라닌(Cha)을 3개 이하로 포함하는 펩타이드의 경우에는 예상 외로 물에 대한 용해도가 높은 특성을 보여주었다.

실시예 3.2. CMP3029 내지 CMP3032의 합성

실시예 2.3에서 합성한 단량체 펩타이드 CMP3029m 내지 CMP3032m을 사용하여 이합체 번들 펩타이드를 합성하였다. 이합체화는 상기 실시예 3.1에서 사용한 합성 방법과 동일하게 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 수행하였으며, 형광이 표지되지 않은 이합체와 형광이 표지된 이합체 두 종류를 합성하고, 각각 CMP3029 내지 CMP3032 및 FL-CMP3029 내지 FL-CMP3032로 명명하였다. 이들 이합체 펩타이드에 대한 아미노산 서열, HPLC에 의한 순도 분석 결과 및 질량 분석 결과는 하기 표 11 및 표 12에 각각 나타내었다.

실시예 3.3. 이합체 펩타이드에서 각 단위체의 서열 방향성 확인

실험예 1.2에 기재된 공기 산화(air oxidation)에 의한 단량체 펩타이드의 이합체화 방법에 따라 형성된 이합체 펩타이드에서 각 단위체가 평행(parallel) 방향으로 결합하는지, 아니면 역평행(antiparallel) 방향으로 결합하는지 규명하기 위해 단량체에 포함된 2개의 시스테인(C)에 서로 다른 보호기인 Trt(triphenyl methyl) 및 Acm(acetamidomethyl)을 사용한 실험을 수행하였다. Trt 보호기는 산성 조건에서 티올(thiol)로부터 분리되기 때문에 TFA가 포함된 절단 혼합체(cleavage cocktail)를 처리하였을 때 시스테인은 티올 형태로 남아있게 된다. 이에 반해, Acm 보호기는 강한 산화 조건에서만 떨어지기 때문에 TFA가 포함된 절단 혼합제를 처리해 주더라도 보호기는 티올에 그대로 붙어있게 된다.

먼저, CMP3013m에 포함된 2개의 다른 시스테인 위치(X₂, X₉)에 시스테인-Trt 및 시스테인-Acm이 각각 1개씩 들어간 2종의 단량체 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성법에 의해 제조하였다. 이어서, 공기 산화 조건으로 서로 다른 2개의 상기 단량체 펩타이드 사이에 이황화 결합을 형성시킨 뒤 한 개의 이황화 결합만 형성된 이합체 펩타이드를 HPLC로 정제하였다. 이 후 10% 아세트산이 포함된 3차 증류수에 한 개의 이황화 결합만 포함하는 이합체 펩타이드를 용해시키고, 아이오딘(iodine)이 함유된 메탄올 용액을 한 방울씩 첨가함으로써 조성된 강한 산화 조건에서 50분 동안 반응시켜 Acm 보호기가 떨어지는 동시에 새로운 이황화 결합이 생기도록 하였다. 또한, 공기 산화 반응으로 CMP3013 이합체 펩타이드를 합성하고, 위에서 보호기를 사용하여 합성한 CMP3013 역평행 이합체 펩타이드와 HPLC에서 머무름 시간을 측정하였다(도 8a). 펩타이드의 정제는HPLC에 의해 수행되었으며, 고정상은 Zorbax C18 컬럼(3.5 μm, 4.6 × 150 mm)을 사용하였다. 버퍼 A[0.1%(v/v) TFA를 포함하는 3차 증류수] 및 버퍼 B[0.1%(v/v) TFA를 포함하는 ACN]를 이동상으로서 이원 용매 시스템에 사용하였다. 구배 방법은 다음과 같다: 5분 동안 5% 버퍼 B 및 5분에서 30분 동안 5-70% 버퍼 B의 선형 구배; 70-100% 버퍼 B 30-40분. 이동상의 유속은 1.0 ml/min으로 설정하였다.

공기 산화에 의한 이합체 펩타이드(CMP3013 airoxidation)와 역평행 이합체 펩타이드(CMP3013 antiparallel)의 HPLC 크로마토그램은 도 8a에 나타내었으며, 개별적인 반응 생성물(antiparallel dimer)에 대한 크로마토그램은 도 8b 및 도 8c에 각각 나타내었다. 도시된 결과를 통해, 공기 산화에 의해 형성된 CMP3013 이합체 번들 펩타이드는 역평행(anti-parallel)의 구조임을 확인하였다.

Ⅱ. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 특성 및 효능 분석

실시예 4. 세포 투과(Cell-penetrating) 능력 평가

세포 투과 능력은 실시예 3에서 합성한 형광이 표지된 버전의 이합체 번들 펩타이드를 사용하여 평가하였으며, 실험예 3에 기재된 방법에 따라 EC₅₀ 값으로 측정하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 다양한 농도의 TAMRA 표지 이합체 번들 펩타이드를 3시간 동안 처리하여 EC₅₀ 값을 측정하였다. EC₅₀은 세포의 절반이 펩타이드 침투에 의해 형광을 나타낼 때의 해당 펩타이드의 농도이다.

형광 강도의 분석 결과, 모든 이합체 번들 펩타이드는 100 nM 미만의 농도에서 세포 내로 이동함이 확인되었다(하기 표 13 및 도 9a, 도 9b 참조). EC₅₀ 농도가 낮을수록 세포 투과 능력이 높다고 볼 수 있는데, 표 13에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포 투과 능력이 가장 좋지 않다고 평가할 수 있는 펩타이드 조차도 EC₅₀ 농도는 100 나노몰 수준에 불과하였다.

특히, FL-CMP3013은 1, 5 및 8번 위치에서 루신(L) 대신 3개의 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하며, 역평행 구조로 인해 다른 펩타이드들보다 비교적 높은 세포 투과 능력을 나타냈다(EC₅₀ = 35 nM; 표 13 및 도 9a). FL-CMP3029 및 FL-CMP3030 또한 FL-CMP3013과 필적하는 최상의 세포 투과 능력을 보여주었다(EC₅₀ = 34-35 nM; 표 13 및 도 9b).

실시예 5. 올리고머화 경향성(Oligomerization tendency) 평가

본 발명에 따른 이합체 번들 펩타이드가 상호작용에 의한 자가조립(self-association) 특성을 나타내는지 확인하기 위해, 각각의 펩타이드에 대해 HPLC 컬럼에서의 머무름 시간(Retention Time, RT)을 온도의 변화에 따라 관찰하여 위 값의 변화를 통해 자가조립의 경향성을 파악하였다. 구체적으로, 0.2 mM의 각 펩타이드 용액 10 μl를 HPLC에 주입하고 펩타이드가 검출되는 시간(RT)을 40℃와 5℃에서 각각 측정하였다. 이때 HPLC의 고정상 조건 및 이동상 조건은 기존에 잘 알려진 방법을 사용하였다. 통상적으로 올리고머가 잘 형성될수록 상대적으로 더 높은 온도인 40℃에서의 검출시간이 길어지므로 5℃에서 측정한 값의 차이인 ΔΔRT가 커진다. CMP3001 내지 CMP3015에서 측정한 ΔΔRT 값을 하기 표 14에 나타내었다.

결과는 예상된 바와 같이 펩타이드에 사이클로헥실알라닌(Cha)의 개수가 많아질수록 펩타이드 사이의 올리고머화는 증가하는 경향을 보였다. 다만, 이러한 경향성은 단량체를 기준으로 사이클로헥실알라닌(Cha)이 1개 또는 2개를 포함한 펩타이드에서 사이클로헥실알라닌(Cha)의 위치 특이적으로 나타나지는 않았다. 즉, 사이클로헥실알라닌(Cha)이 2개 이하로 존재하는 경우에는 이 아미노산이 1, 4, 5 또는 8번 중 어느 위치에 존재하는지 여부와 관계없이 비슷한 수준의 올리고머화 경향성을 나타냈다. 이와 달리, 사이클로헥실알라닌(Cha)이 3개 이상 포함된 펩타이드에서는 위 아미노산이 1, 4, 5 또는 8번 중 어느 위치에 존재하는지에 따라 올리고머화 경향성에서 차이를 나타냈다. 한편, 4개의 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 펩타이드의 올리고머화도 비교적 잘 일어남을 확인하였다.

올리고머화 경향성과 세포 투과 능력의 관련성을 확인해본 결과, 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하지 않는 이합체 번들 펩타이드의 경우 올리고머화는 세포 투과 능력과 양의 상관관계가 있었지만(데이터 미제시), 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 이합체 번들 펩타이드의 경우에는 이합체 번들 펩타이드 상호간에 어느 정도 올리고머화가 일어나는지와 세포 투과 능력 사이에 큰 상관관계가 보이지 않았다(도 10). 펩타이드가 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 비율에 따라 물에 대한 용해도가 변할 수 있으며, 지나친 올리고머화는 용해도의 감소를 초래할 수 있다. 즉, 일반적으로는 올리고머화에 의해 세포 투과 능력이 증대되기는 하지만, 특정 임계점을 초과하는 올리고머화는 오히려 세포 투과 능력을 감소시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 6. 세포 독성 비교 분석

본 발명에 따른 이합체 번들 펩타이드의 상대적인 세포 독성을 비교 분석하였다. 이를 위해, 1 × 10⁵ 개의 HeLa 세포에 각 펩타이드를 100 nM로 3시간 동안 처리한 후, PBS로 3회 세척하고 다시 PBS를 넣어준 다음 30분 뒤에 광학현미경으로 각각의 시료를 무작위로 5장씩 촬영하여 세포배양접시에 정상적으로 부착되어 있는 세포 수를 측정하였다.

측정 결과는 도 11에 나타내었다. 대체로 단량체(단위체)를 기준으로 비천연 아미노산인 사이클로헥실알라닌(Cha)을 1개만 포함하는 펩타이드보다 2개를 포함하는 펩타이드의 세포 독성이 더 높은 것으로 나타났다. 한편, 세 개의 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 펩타이드(CMP3011 내지 CMP3014)의 경우에는 상기 아미노산에 대한 위치 특이적으로 독성의 차이가 나타났다. 즉, CMP3011은 CMP3012 및 CMP3013과 비교하여 세포 투과 능력이 떨어지면서도 이 둘보다는 더 큰 세포 독성을 보였다. CMP3011 내지 CMP3014의 번들 펩타이드는 사이클로헥실알라닌(Cha)의 위치만 상이한 이성질체임에도 상대적으로 세포 독성이 가장 높은 것(CMP3011)과 가장 낮은 것(CMP3013)이 이들 중에 모두 존재하였다. 이러한 세포 독성의 차이는 세포 투과 능력과는 상관관계가 없었기 때문에, 상대적으로 저독성의 펩타이드를 선별하여 다른 테스트에 우선적으로 사용하였다.

한편, 농도별로 CMP3013의 세포 독성을 관찰한 결과는 도 12에 나타내었다. 세포 독성은 WST-1 분석에 의해 수행되었다. 구체적으로, 1 × 10⁴ 개의 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 경과 후, 도 12에 표기된 여러 농도의 CMP3013 펩타이드를 처리하고 하루 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 새 배양액으로 교체하고 EZ-Cytox(DoGEN, 대한민국)를 웰당 10 μL씩 처리하여 30분 동안 배양한 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, CMP3013의 세포 독성은 마이크로몰 수준의 농도 이상에서만 나타나며, 배양된 세포의 50%가 사멸되는 농도는 10 마이크로몰에 이르는 것을 확인하였다(도 12).

실시예 7. 미토콘드리아 표적화 능력 평가

본 발명에 따른 이합체 번들 펩타이드가 미토콘드리아에 어느 정도의 비율로 표적화되는지 확인하기 위해 실험예 4에 기술된 방법에 따라 미토콘드리아 분획화를 수행하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015를 각각 EC₅₀ 농도(표 13 참조)로 3시간 동안 처리한 후 세포를 수확하여 분획화(fractionation)을 수행하였다.

그 결과, 이합체 번들 펩타이드의 53-80%가 미토콘드리아를 표적으로 하는 것으로 나타났다(도 13). 이들 중 CMP3013이 미토콘드리아 분획에서 가장 높은 비율로 발견되었으며, 이어서 CMP3010 및 CMP3004 순으로 미토콘드리아 분획에 존재하는 비율이 높은 것으로 나타났다. 더욱이, 거의 모든 종류의 펩타이드가 세포질보다는 미토콘드리아에 유의하게 더 많이 분획됨을 확인하였다.

실시예 8. 세포에서 ROS 생성 억제 능력 확인

통상적으로 과산화수소수(H₂O₂)를 처리하면 ROS의 생성이 증가하여 미토콘드리아 기능이 저하된다. 이에, FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 펩타이드의 손상된 미토콘드리아에 대한 기능 회복 능력을 비교하기 위해 각 펩타이드의 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제 능력을 평가하였다. ROS 수준은 실험예 6에 기재된 방법에 따라 세포 수준에서 분석을 수행하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 각각의 펩타이드를 EC₅₀ 농도로 3시간 동안 처리한 후, DCFDA로 세포를 염색하였다. 이어서, 0.5 mM의 H₂O₂를 처리한 후 공초점 현미경으로 형광을 검출하고 이미징하였다. 세포들의 형광 강도는 이미지 분석 프로그램(ZEN blue)으로 계산하였다.

그 결과, 처리된 펩타이드의 종류에 따라 ROS의 생성 억제 능력에 차이가 나타나긴 하였으나, 대체로 모든 종류의 펩타이드에서 ROS 생성 억제 효과가 관찰되었다(도 14a). 특히 EC₅₀ 농도(35 nM)의 FL-CMP3013 펩타이드가 처리된 세포에서 가장 큰 ROS 생성 억제 효과가 나타났으며, H₂O₂에 의해 증가된 녹색 형광이 FL-CMP3013에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 14a 및 도 14b).

한편, 상기 실시예 2.2.1에서 합성된 총 256종의 펩타이드를 포함하는 16개의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리(각 서브-라이브러리는 64종의 펩타이드 포함)에 대한 ROS 생성 억제 능력 분석 결과에서도 모든 서브-라이브러리에서 ROS 생성 억제 효과가 관찰되었으며, 특히 펩타이드에서 1번 위치의 아미노산이 페닐알라닌(F)이고, 4번 및 8번 위치의 아미노산이 사이클로헥실알라닌(Cha) 또는 루신(L)이고, 5번 위치의 아미노산이 사이클로헥실알라닌(Cha)인 펩타이드들의 ROS 생성 억제 능력이 가장 우수한 것으로 나타났다(실시예 2.2.2 및 도 7a 내지 7d 참조).

Ⅲ. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 미토콘드리아 기능 장애 회복 효과

실시예 9. 손상된 미토콘드리아에 대한 우선적 결합 효과 확인

본 발명에 따른 다양한 종류의 펩타이드 중에서 상기 실시예들을 통해 평가된 펩타이드 각각의 세포 투과 능력, 세포 독성 및 ROS 생성 억제 능력 등을 종합적으로 고려하여 CMP3013, CMP3029, CMP3030, CMP3031 및 CMP3032를 치료제 후보로서 선별하였고, 이들 펩타이드 대한 추가적 분석을 실시하였다.

먼저, 실험예 5에 기술된 방법에 따라 100 nM의 FL-CMP3013를 3시간 동안 처리한 HeLa 세포에 마이토트래커(MitoTracker™)를 염색하고 형광 분석을 수행하였다. 미토콘드리아를 손상시키기 위한 CCCP(Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)는 20 μM의 농도로 30분 동안 처리되었다. 분석 결과, FL-CMP3013은 높은 비율로 미토콘드리아에 침투하는 것이 확인되었지만, FL-CMP3013과 마이토트래커의 상관 계수(correlation factor)는 확장된(extended) 형태의 미토콘드리아에서는 예상 밖으로 낮았다(도 15a).

다음으로, 위와 같은 현상을 보다 구체적으로 연구하기 위해 실험예 5에 기술된 방법에 따라 FL-CMP3013와 CCCP를 처리하고 카디오리핀을 표지하기 위해 NAO(nonyl acridine orange)로 염색하여 초고해상도 이미지를 생성하였다. 그 결과는 놀랍게도 FL-CMP3013이 CCCP를 처리하지 않은 확장된 형태의 미토콘드리아보다 CCCP 처리에 의해 손상이 유도된 도넛형(donut-shaped) 또는 벌지형(bulge-shaped) 미토콘드리아와 더 많이 공위치화(co-localization)되는 것이 확인되었다(도 15b). 통상 둥근 모양의 미토콘드리아는 이의 기능에 장애가 발생하여 정상적인 기능을 하지 못할 때 발생하는 동역학적 현상으로 알려져 있음을 고려하면, 관찰된 바와 같은 FL-CMP3013의 특성은 이 펩타이드가 기능 장애 또는 이상이 있는 비정상적인 미토콘드리아에 특이적으로 결합할 수 있으며, 나아가 FL-CMP3013이 미토콘드리아 내막에 존재하는 카디오리핀과 상호작용함을 시사하는 것이다.

이와 같은 흥미로운 결과를 교차 검증하기 위해, 형광이 표지된 분열(fission) 개시 단백질 Drp1(Dynamin-related protein 1)을 발현시키고, 이것이 CMP3013과 함께 위치화(localization)되는지 확인하였다. Drp1-GFP의 발현은 실험예 10에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 상기 관찰된 결과와 일치되게 FL-CMP3013은 Drp1과 완벽하게 공위치화되는 것이 확인되었다(도 15c). CMP3029, CMP3030, CMP3031 및 CMP3032에 대해서도 위 CMP3013과 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 이들 펩타이드 역시 Drp1과 중첩되는 것이 확인되었다(도 15d). 특히, 상기 펩타이드 중 CMP3029가 Drp1과 가장 많이 중첩되었다(도 15d). Drp1은 미토콘드리아가 손상되었을 때 분열을 위해 세포질에서 모집되는 첫 번째 단백질로 알려져 있으며, 따라서 위와 같은 실험 결과는 CMP3013 펩타이드가 분열이 필요한 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 이동(또는 침투)함을 보여준다.

또한, CMP3013이 손상된 미토콘드리아로 이동하는지 관찰하기 위해, HeLa 세포를 FL-CMP3013(100 nM, 3시간) 및 마이토트래커로 처리하고 공초점 현미경으로 세포를 이미징하는 동안 CCCP에 의해 미토콘드리아 손상을 유도하였다. 이를 통해 얻은 타임-랩스(time-lapse) 이미지는 CCCP에 의해 미토콘드리아가 손상된 HeLa 세포에서 CMP3013과 마이토트래커의 상관관계(r 값으로 표시)가 시간이 경과함에 따라 증가함을 보여주며, 따라서 CMP3013이 손상된 미토콘드리아로 이동함을 확인하였다(도 15e).

상기 실험 결과는 CMP3013, CMP3029, CMP3030, CMP3031 및 CMP3032 펩타이드가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 표적화되며, 특히 미토콘드리아 내막의 카디오리핀에 결합함을 보여준다.

실시예 10. CCCP 유도 세포 사멸 방지 효과 확인

실시예 9에서 본 발명에 따른 펩타이드가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 표적화되는 것을 확인하였기 때문에 이러한 본원 펩타이드의 효과가 세포의 생존율에 직접적인 영향을 미치는지 확인해 보기 위해, CCCP에 의해 손상이 유도된 HeLa 세포에 FL-CMP3013을 처리하고 4시간 동안 세포의 생존 여부를 관찰하였다. 그 결과, CCCP 및 FL-CMP3013을 처리한 세포는 4시간 후에도 생존하였지만, CCCP 단독 처리된 세포는 그렇지 않았다(도 16). 즉, FL-CMP3013으로 처리된 세포는 FL-CMP3013을 처리한 세포보다 훨씬 더 높은 세포 생존율을 나타냈다.

본 실험 결과와 더불어 실시예 9의 도 15a 내지 도 15e의 결과를 종합하면, FL-CMP3013은 미토콘드리아 내막에서 카디오리핀에 특이적으로 결합하는데, 정상적인 미토콘드리아에서는 이 카디오리핀이 크리스테 조직화 시스템의 많은 단백질이나 내막의 기능단백질에 의해 보호된다고 알려져 있으므로, 내막 등 미토콘드리아의 손상에 의해 노출된 카디오리핀에 우선적으로 결합하는 것으로 생각된다. 즉, 단백질들이 미토콘드리아 내막의 표면을 완전히 보호하고 있었다면 CMP3013은 카디오리핀에 결합하지 않았을 것이다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드는 손상된 미토콘드리아 내막에서 노출된 카디오리핀에 선택적으로 결합함으로써 미토콘드리아의 기능을 회복시키고 나아가 세포의 생존율을 증가시키는 효과가 나타나는 것으로 볼 수 있다.

실시예 11. 미토콘드리아의 기능 회복 능력 및 크리스테 보호 능력

실시예 11.1. ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력 및 막 전위 회복 능력 확인

미토콘드리아의 기능 회복 능력을 알아보기 위해 세포 기반 분석을 사용하여 미토콘드리아의 ROS, ATP 수준 및 막 전위에 대한 본 발명의 α-나선형 펩타이드의 효과를 시험하였다.

먼저, FL-CMP3013을 3시간 동안 농도별로 전처리한 세포에서 미토콘드리아 손상제로 H₂O₂, 안티마이신 A(antimycin A) 또는 CCCP를 사용하여 다양한 손상 조건을 만들고, ROS의 수준 및 ATP 수준을 실험예 7 및 8에 각각 기재된 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, α-나선형 펩타이드 FL-CMP3013은 미토콘드리아의 손상 조건과 무관하게 펩타이드의 용량 의존적 방식으로 망가진 미토콘드리아의 기능을 회복시키는 것으로 나타났다. 구체적으로, H₂O₂, 안티마이신 A 또는 CCCP에 의해 증가된 ROS의 생성 및 감소된 ATP의 생성이 FL-CMP3013에 의해 각각 ROS는 생성이 억제되고 ATP는 다시 생산이 재개됨을 확인하였다(도 17a 내지 도 17c, ROS 생성 억제 관련; 도 17d 내지 도 17f, ATP 생성 증가 관련).

다음으로, FL-CMP3013을 두 가지 농도(10 또는 30 nM)로 3시간 동안 처리한 다음 1 nM의 H₂O₂로 1시간 동안 처리하고, 실험예 7에 기재된 방법에 따라 미토콘드리아의 막 전위를 측정하였다. 그 결과, H₂O₂에 의해 감소된 미토콘드리아의 막 전위는 FL-CMP3013 처리에 의해 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였다(도 17g).

또한, 다른 종류의 세포와 손상 조건 하에 양성 대조군으로서 사이클로스포린 A(Cyclosporin A, CsA), FL-CMP3012, FL-CMP3013 및 FL-CMP3015를 각각 처리하여 미토콘드리아 막 전위의 회복 능력을 테스트하였다. 구체적으로, 3 × 10⁶ 개의 SH-SY5Y세포를 JC-1 염료로 염색하여 96-웰 플레이트에 각 웰당 1 × 10⁵ 개씩 분주하고, 20 μM의 안티마이신 A를 처리하여 미토콘드리아 막 전위의 감소를 유도하였다. 동시에 미토콘드리아 막 전위 회복을 위해 CsA 또는 본 발명에 따른 펩타이드(1 μM)를 각각의 샘플에 처리하였다. CsA 또는 펩타이드의 존재 하에 JC-1의 형광 비율(red/green)을 측정하였다. 미토콘드리아 막 전위 변화는 안티마이신 A 처리 후 15분이 경과한 시점에서 정상 세포를 1로 하였을 때와 비교한 상대적 막 전위 변화를 측정하였다. 그 결과, 미토콘드리아 막 전위 회복 효과는 FL-CMP3013뿐만 아니라 FL-CMP3012 및 FL-CMP3015에서도 유사한 수준으로 나타났으며, 이러한 효과는 사이클로스포린 A에 필적하였다(도 17h).

실시예 11.2. 크리스테(cristae) 보호 능력 확인

본 발명에 따른 펩타이드의 작용 방식을 확인하기 위해, 미토콘드리아 내 크리스테 숫자의 경감을 H₂O₂ 처리에 의한 미토콘드리아의 기능 저해와 연관해서 살펴보았다. 즉, CMP3013에 의한 정상적인 미토콘드리아 기능의 촉진이 크리스테 구조의 보존과 관련이 있는지 알아보았다. 이러한 보호 효과를 평가하기 위해, 투과전자현미경(TEM) 이미지를 사용하여 CMP3013의 존재 또는 부재 하에 손상된 HeLa 세포에서 크리스테의 모양과 수의 변화를 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 펩타이드가 존재하는 경우에는 길고 확장된 형태의 크리스테가 아무런 처리를 하지 않은 그룹과 일치하는 수로 존재하지만, H₂O₂ 손상 세포에서는 긴 형태의 크리스테가 거의 존재하지 않음을 확인하였다(도 17i의 (b)). 즉, H₂O₂ 처리에 의해 미토콘드리아 내 크리스테 구조가 대부분 파괴되며, 이와 같이 크리스테 구조가 파괴되는 조건에서도 CMP3013 처리에 의해 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 같은 숫자의 정상적인 크리스테 구조가 관찰되었다(도 17i의 (c)와 (d)).

이러한 일련의 실험 결과는 CMP3013을 포함하는 본 발명의 펩타이드를 10 내지 30 nM의 저농도로 처리한 경우에도 거의 모든 미토콘드리아의 기능이 회복됨을 확인한 실시예 11.1의 결과와 일치하는 것이며, 결국 미토콘드리아의 기능 회복은 크리스테의 구조적 보존과 연관성이 있음을 알 수 있었다.

한편, 상기 실시예 6의 세포 독성 실험 결과를 고려하면, 미토콘드리아의 기능 손상을 효율적으로 회복시킬 수 있는 본원의 펩타이드 농도는 10 내지 30 nM 정도이며, 상기 농도 범위에서의 치료지수(Therapeutic index)는 300 내지 1,000 정도로 산출된다. 이와 같은 지표는 CMP3013을 비롯한 본원의 펩타이드들이 인체에 대한 안전성이 매우 높음을 보여준다.

실시예 12. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 작용 메커니즘 확인

실시예 12.1. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 세포 투과 메커니즘

본원의 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 세포 침투 및 최종 운명에 대한 메커니즘 정보를 얻기 위한 연구를 수행하였다.

먼저, 내포작용의 메커니즘을 연구하기 위해, HeLa 세포를 다음과 같이 다양한 억제 조건으로 전처리하였다: 4℃로 냉각(ATP 의존성 경로 억제); EIPA[5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride] 처리(거대음세포작용 억제); MβCD(methyl-β-cyclodextrin) 처리(콜레스테롤 고갈); 염소산나트륨(NaClO₃, 프로테오글리칸 의존성 경로 억제); 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ, 클라트린 매개 내포작용 억제). 그런 다음, 세포를 100 nM의 FL-CMP3013과 함께 3시간 동안 배양한 후 실험예 3에 기재된 방법에 따라 FACS 분석을 수행하였다. 도 18a에 나타난 결과에 따르면, CMP3013은 다양한 내포작용 메커니즘, 특히 콜레스테롤 매개 경로를 사용하여 세포에 침투할 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다.

또한, 실험예 5에 기재된 방법에 따라 엔도솜 마커(CellLight™)를 발현하는 HeLa 세포에 FL-CMP3013 및 라이소트래커로 처리하여 얻은 현미경 이미지를 통해 엔도솜 마커가 20% 미만으로 공위치화(co-localization)되는 것을 확인하였다(도 18b). 이러한 관찰은 세포질 내 대부분의 펩타이드가 엔도솜 탈출(endosomal escape)에 의해 생성됨을 시사한다. 또한, CMP3013의 일부는 리소좀에 위치하고 있으며, 이는 펩타이드 모두가 세포질로 빠져나가는 것이 아님을 시사한다(도 18b).

다음으로, 미토콘드리아 손상이 리소좀에 존재하는 펩타이드의 양에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, CCCP의 존재 또는 부재 하에 NAO를 사용하여 카디오리핀 특이적 표적화를 조사하였다. 그 결과, CCCP의 존재 또는 부재 하에 리소좀에 존재하는 펩타이드의 비율은 동일하게 유지됨을 확인하였다(각각 0.29 및 0.30; 도 18c 및 도 18d). 이러한 관찰은 CMP3013이 그 자체로 기능 장애 미토콘드리아를 제거하는 또 다른 중요한 경로인 미토파지(mitophage)를 촉진하지는 않음을 시사한다.

대조적으로, 세포질에 존재하는 CMP3013의 비율은 CCCP를 처리하지 않은 경우(0.08; 도 18c 및 도 18d)에 비해 CCCP를 처리한 경우(0.43; 도 18c 및 도 18d) 현저하게 증가하는 현상이 확인되었다.

이와 같은 결과들은 CMP3013이 미토콘드리아 손상에 의해 노출된 내막의 카디오리핀을 표적화함을 지지하는 것이다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 내포작용(endocytosis)에 의해 세포 내로 침투하여 엔도솜(endosome)에서 빠져나와 손상된 미토콘드리아로 우선적으로 이동한다는 사실이 입증되었다.

실시예 12.2. 카디오리핀 특이적 결합의 확인

실시예 9에서 확인한 CMP3013의 카디오리핀-풍부 막에 대한 특이성을 추가로 검증하기 위해, 실험예 12에 기재된 방법에 따라 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)를 사용하여 미토콘드리아 내막을 모방하는 두 가지 모델 시스템을 구축하고, NBD가 표지된 CMP3013 단량체(NBD-CMP3013m)를 사용하여 카디오리핀 결합 분석을 수행하였다.

이를 위해, 먼저 NBD가 표지된 CMP3013 단량체 펩타이드를 합성하였으며, 이의 서열 및 질량 분석 데이터는 하기 표 15에, HPLC 크로마토그램은 도 19a에 각각 나타내었다.

표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 기법을 사용하여 리포솜(liposome)에 대한 펩타이드의 결합력을 확인하였다. 구체적으로, Biacore™ T200 SPR 시스템(Cytiva, 미국)에 L1 센서칩을 삽입한 다음 리포솜을 주입하여 센서칩에 리포솜을 결합시켰다. 이후, 1 μM의 NBD-CMP3013m 펩타이드를 주입하여 리포솜과 CMP3013의 결합에 의해 증가하는 신호의 강도를 확인하였다.

센서칩 상에 생성된 내막 모델 시스템에서 본 발명의 펩타이드는 POPC/POPE 막 단독에 비해 10% 카디오리핀을 함유한 POPC/POPE 막에 대하여 약 50% 더 큰 반응 단위(response unit, RU)를 이끌어냈다(도 22a의 상단 그래프 참조). 게다가, 카디오리핀 함유 막으로부터 펩타이드의 해리는 시도된 모든 해리 조건하에서 막 자체가 파괴되었기 때문에 이를 관찰할 수 없었다. 이러한 발견은 카디오리핀에서 본 발명에 따른 펩타이드의 해리가 매우 느리며, 결과적으로 CMP3013은 카디오리핀 함유 막과 상호작용이 매우 강함을 시사한다(데이터 미표시).

또한, 리포솜 기법으로 제작된 다른 내막 모델을 사용한 실험에서 형광 표지된 CMP3013m이 POPC/POPE 리포솜 단독에 비해 10% 카디오리핀(CL) 함유 POPC/POPE 리포솜에 거의 10배 더 빠르게 결합하고, 2배 더 큰 최종 형광 강도를 나타냄을 확인하였다(도 19b). 비표지 펩타이드와의 경쟁 분석을 사용하여 측정한 카디오리핀(CL) 함유 막 표면으로부터 펩타이드의 해리는 카디오리핀이 없는 막에서의 해리보다 약 10배 느린 것으로 관찰되었다. 즉, 내막에 카디오리핀이 존재하면 CMP3013m의 해리 속도는 10배 감소하였다(도 19b 및 도 19c). CMP3013의 양으로 하전된 그룹과 카디오리핀의 음으로 하전된 인산염 모이어티 사이에서 발생하는 상호작용은 빠른 결합에 영향을 미칠 수 있는 반면, 두 물질의 친수성 부분과 지질 부분 간의 소수성 상호작용은 그들의 상호작용을 향상시키는 데 크게 기여할 수 있다(도 19b 및 도 19c).

한편, 병원성 카디오리핀 리모델링(pathogenic cardiolipin remodeling)은 미토콘드리아 내막에서 카디오리핀 함량의 감소 또는 산화된 모노-리소 카디오리핀(mono-lyso cardiolipin, MLCL) 및 산화된 디-리소 카디오리핀(di-lyso cardiolipin, DLCL)의 증가가 발생함을 의미하는데, CMP3013이 병원성으로 변화된 미토콘드리아 내막에 결합할 수 있는지 여부를 관찰하기 위해 두 종류의 추가 인공 막을 제조하였다. 하나는 다양한 비율(0 ~ 20%)로 카디오리핀을 갖는 POPC:POPE(2:1) 리포솜으로 구성되며(도 19d), 다른 하나는 10% DLCL과 함께 동일한 리포솜을 포함한다(도 19b). 실험 결과, CMP3013의 단량체 형태는 20% 카디오리핀 함유 막에 비해 카디오리핀 함량이 5 ~ 10%인 두 리포솜과 10% DLCL을 포함하는 동일한 리포솜에 결합함을 확인하였다(도 19b 및 도 19d). 이러한 결과는 CMP3013m이 카디오리핀-손상 막에 결합하고, 미토콘드리아 내막에서 이러한 병원성 변화를 극복할 수 있음을 시사한다.

미토콘드리아에서 화학적으로 중요한 사건(또는 반응)은 내막에서 발생하며, 여기에서 카디오리핀(CL)은 전자전달계를 구성하는 단백질 등과 같은 기능단백질이 제대로 기능하는데 필요한 곡률을 유발한다. 그러나 병원성 카디오리핀 리모델링은 이러한 내막의 곡률을 파괴하여 미토콘드리아 기능 장애를 일으킨다(도 20). 양친매성 α-나선 펩타이드는 세포에 침투하여 여러 개의 카디오리핀에 결합함으로써 미토콘드리아 내막의 곡률을 재생한다. 요컨대, 본 발명에 따른 펩타이드는 카디오리핀(CL) 또는 병원성 리모델링된 카디오리핀 함유 막에 특이적이며 강력하게 결합하여 미토콘드리아의 기능단백질을 모이게 함으로써 미토콘드리아 기능 장애를 교정하는 것이다(도 20). 이러한 CMP3013의 기능은 실시예 9에서 CMP3013과 CL-특이적 분자인 NAO의 공위치화를 공초점 현미경으로 분석한 결과(도 15b)와 일치하는 것으로서, 손상된 미토콘드리아 내막을 CMP3013(또는 이의 단량체)이 CL이 풍부한 내막에 강력하게 결합하고, 또한 그곳에 머물면서 막 또는 크리스테의 구조를 보호한다는 강력한 증거이다.

상기 실시예 9 내지 12를 통해, 본 발명자들은 CMP3013(또는 이의 환원된 단량체) 펩타이드가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 결합하며, 과산화수소(H₂O₂) 또는 기타 손상제(damaging agent)에 의해 파괴된 크리스테 구조의 회복 및 유지를 촉진할 수 있음을 보여주었다. 특히, CMP3013은 4개 이상의 양전하와 4개의 소수성 부분을 가지고 있기 때문에 미토콘드리아 내막(IMM)의 다른 구성 요소보다 여러 카디오리핀(CL) 분자에 우선적으로 더 단단히 결합한다. 결과적으로, CMP3013은 크리스테의 구조를 보호하여 ROS 억제 능력 및 ATP 생산 능력의 향상, 미토콘드리아 막 전위의 증가를 유도함으로써 정상적인 미토콘드리아 기능을 촉진할 수 있음을 확인하였다.

Ⅳ. 종래 기술과의 비교 분석

SS(Szeto-Schiller) 펩타이드는 미토콘드리아를 표적화함으로써 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 대표적인 펩타이드로서 비교적 소수성인 벤젠 고리를 함유한 아미노산과 양전하를 갖는 아미노산이 교차로 결합되어 β-시트 형태를 나타낸다(도 2). SS 펩타이드로는 두 종류가 잘 알려져 있는데, 그 중 SS-31로 명명된 펩타이드는 카디오리핀에 결합하여 미토콘드리아의 기능을 향상시키는 것으로 보고된바 있다. 또한, SS-31은 미토콘드리아 기능 향상에 의한 치료 효과가 뛰어나 미토콘드리아 기능 이상과 관련된 다양한 종류의 질환을 대상으로 동물실험 및 임상실험이 진행 중이다. 그러나, 3년(2017-2020년) 동안 진행된 SS-31의 미토콘드리아성 근육병증(mitochondrial myopathy)에 대한 임상 3상은 실패하였다. SS-31은 β-시트 형태의 펩타이드로서 세포 투과율이 낮으며, 따라서 치료 효과가 나타나도록 하기 위해서는 고농도의 SS-31 펩타이드를 투여할 필요가 있는데 이 경우 세포 독성이 높아지는 문제가 있다. 따라서 저농도의 펩타이드를 사용하기 위해서는 세포 투과율을 향상시킬 필요가 있으며, 나아가 저농도의 펩타이드로도 치료 효과를 나타내기 위해서는 펩타이드 한 분자당 상호작용하는 카디오리핀의 수를 증가시킬 필요성이 있다.

본 발명은 상술한 바와 같은 기존의 미토콘드리아 표적화 펩타이드들이 직면한 기술적 과제를 해결하기 위해 고안된 것으로서, 세포 투과성을 현저하게 향상시킴으로써 저농도로 사용이 가능하고, 1개의 분자가 카디오리핀과 더 많은 상호작용을 하여 치료 효과를 극대화하였다. 하기 비교예 1 내지 5에서는 종래의 미토콘드리아 표적화 펩타이드 SS-31와 본 발명의 일 실시예에 따른 CMP3013 펩타이드의 세포 투과 능력, 카디오리핀 결합 능력을 비롯하여 미토콘드리아 기능과 관련된 ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력, 막 전위 회복 능력 등을 비교 분석함으로써 본 발명의 펩타이드가 기존 기술 대비 현저한 효과를 가짐을 입증한다.

하기 비교예들에서 사용된 SS-31은 실험예 1.1에 기술된 고체상 펩타이드 합성법과 동일한 방법으로 합성 및 정제하여 사용하였다(SS-31의 화학 구조는 도 1 참조).

비교예 1. SS-31과 CMP3013의 세포 투과 및 미토콘드리아 표적화 능력 비교

세포 투과 능력은 실험예 3에 기술된 방법에 따라 수행하였으며, 미토콘드리아 표적화 능력은 실험예 4에 기술된 방법에 따라 미토콘드리아 분획화에 의해 평가되었다. 종래 펩타이드로서 SS-31 외에 켈리(Kelley) 그룹의 미토콘드리아 투과 펩타이드(MPP1a; 문헌[Horton, Kristin L et al. "Mitochondria-penetrating peptides." Chemistry & biology vol. 15,4 (2008): 375-82.] 참조)를 추가 비교군으로 사용하였다. MPP1a의 아미노산 서열은 다음과 같다: X(dR)XKX(dR)XK (여기서, X는 사이클로헥실알리닌, dR은 D-아르기닌, K는 라이신이다.)

또한, CMP3013 외에 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드로서 L1L, L4L, L5L 및 L8L 서브-라이브러리에 포함되어 있는 LR10을 추가 비교군으로 사용하였다. LR10의 아미노산 서열은 다음과 같다: AcNH-RCRLLRRLCR-C(O)NH₂

먼저, 세포 투과 능력을 비교하여 본 결과 CMP3013 및 LR10은 기존의 SS-31과 비교하여 약 100배 이상 향상된 세포 투과율을 나타냈다(도 21a). CMP3013이 가장 낮은 EC₅₀ 값을 보여주어 세포 투과 능력이 가장 좋은 것으로 평가되었으며, LR10 또한 CMP3013과 유사한 나노몰 수준에서 EC₅₀ 값이 결정되었다. 이에 반해, MPP1a 및 SS-31은 마이크로몰 수준에서 EC50 값이 결정되었으며, CMP3013에 비해 세포 투과 능력이 현저하게 떨어지는 것을 확인하였다(도 21a).

다음으로, 위 4종의 펩타이드가 미토콘드리아에 어느 정도 비율로 표적화되는지 알아보기 위해 세포에 각각의 펩타이드를 위에서 결정된 EC₅₀ 농도로 처리하고, 세포를 분획화하였다. 그 결과, 다른 펩타이드와 비교하여 CMP3013이 가장 높은 미토콘드리아/세포질 존재비(M/C Ratio, 4.1)를 보여주었다(도 21b).

상기 비교 실험 결과를 통해, CMP3013, LR10 등의 본 발명에 따른 펩타이드는 기존의 SS-31, MPP1a 펩타이드와 비교하여 현저하게 향상된 세포 투과 능력 및 미토콘드리아 표적화능을 가지며, 따라서 낮은 농도로도 치료학적으로 유효한 양의 펩타이드가 전달되는 효과를 가질 수 있다.

비교예 2. SS-31과 CMP3013의 카디오리핀 결합 능력 비교

실험예 12에 기재된 방법에 따라 POPC 및 POPE를 사용하여 미토콘드리아 내막을 모방하는 두 종류의 모델 시스템을 구축하고, NBD가 표지된 CMP3013 단량체(NBD-CMP3013m) 및 NBD가 표지된 SS-31(NBD-SS-31)을 사용하여 카디오리핀 결합 능력을 비교 분석하였다.

실시예 12.2에서 기술한 바와 같이, 표면 플라스몬 공명(SPR; Biacore) 기법을 사용하여 센서 칩 상에 생성된 내막 모델 시스템에서 CMP3013m은 POPC/POPE 막 단독(POPC:POPE)에 비해 10% 카디오리핀을 함유한 POPC/POPE 막(POPC:POPE:CL)에 대하여 약 50% 더 큰 반응 단위(RU)를 이끌어냈다(도 22a 상단 그래프). 이에 반해, SS-31은 두 종류의 막에 대해 결합력의 차이를 나타내지 않았다(도 22a 하단 그래프). 더욱이, CMP3013m은 결합력이 매우 강하여 카디오리핀이 함유된 막에서 해리되지 않았다.

또한, 리포솜 기법으로 제작된 다른 내막 모델을 사용한 실험에서도 모든 종류의 막(카디오리핀 또는 디-리소 카디오리핀을 갖는 리포솜)에서 SS-31보다 우수한 결합력을 제공한다(도 22b). SS-31은 카디오리핀 함유 막에 대해 선택적 결합력을 나타내긴 하였지만 이는 CMP3013m과 비교하여 현저하게 약했다.

실시예 12 및 도 20에서 살펴본 바와 같이, 카디오리핀은 미토콘드리아가 정상적으로 기능할 수 있도록 하는 내막의 곡률을 유발한다. CMP3013과 SS-31은 모두 미토콘드리아 내막에 존재하는 카디오리핀에 특이적으로 결합함으로써 내막에 곡률을 제공하고, 이로써 크리스테 구조가 유지될 수 있도록 하는 공통된 작용 메커니즘을 가진다. 본원의 CMP3013은 SS-31에 비해 카디오리핀에 대한 결합력이 약 100배 이상 강하므로, 기존의 SS-31과 같은 미토콘드리아 특이적 펩타이드가 가졌던 저농도에서의 치료 효과가 거의 없다는 문제점을 극복할 수 있을 것으로 기대된다.

비교예 3. SS-31과 CMP3013의 ROS 생성 억제 능력 비교

두 펩타이드의 미토콘드리아의 기능 회복 효과를 비교하기 위해, SS-31과 CMP3013의 ROS 생성 억제 능력을 시험하였다. 실험예 6에 기술된 방법에 따라 세포의 상대적 ROS 수준을 형광 강도에 의해 비교하였으며, 4가지의 서로 다른 미토콘드리아 손상제(200 μM CCCP, 50 μM 로테논, 10 μM 안티마이신 A 또는 50 μM H₂O₂)를 SH-SY5Y 세포에 처리하여 미토콘드리아 손상에 의한 ROS의 생성을 유도하였다.

그 결과, 도 23a 내지 도 23d에 나타난 바와 같이, 나노몰 수준의 SS-31은 모든 손상 조건에서 유의한 ROS 생성 억제 효과를 나타내지 않았다. 이와는 대조적으로 CMP3013은 손상 조건과 관계없이 SS-31 농도의 1/10배 미만의 저농도에서도 SS-31과 동등하거나 더 향상된 ROS의 생성 억제 능력을 나타내었다.

비교예 4. SS-31과 CMP3013의 ATP 생성 촉진 능력 비교

두 펩타이드의 미토콘드리아의 기능 회복 효과를 비교하기 위해, SS-31과 CMP3013의 ATP 생성 촉진 능력을 시험하였다. 실험예 8에 기술된 방법에 따라 세포의 상대적 ATP 수준을 형광 강도에 의해 비교하였으며, 2가지의 서로 다른 미토콘드리아 손상제(1 μM의 안티마이신 A 또는 1 mM의 H₂O₂)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도하였다.

그 결과, 도 24a 및 도 24b에 나타난 바와 같이, SS-31은 모든 손상 조건 및 모든 농도에서 ATP의 생성을 촉진하는데 실패하였다. 이에 반해, 본원의 CMP3013은 10 nM의 저농도로 처리된 경우에도 ATP의 생성을 재개하도록 촉진하는 효과가 나타났다.

비교예 5. SS-31과 CMP3013의 막 전위 회복 능력 비교

두 펩타이드의 미토콘드리아의 기능 회복 효과를 비교하기 위해, 막 전위에 대한 SS-31과 CMP3013의 영향을 시험하였다. 실험예 8에 기술된 방법에 따라 미토콘드리아의 막 전위 변화를 JC-1의 형광 비율로 측정하였으며, 미토콘드리아 손상제로는 1 mM의 H₂O₂를 사용하였다.

그 결과, H₂O₂의 처리에 의해 미토콘드리아가 손상되어 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)가 낮아지며, CMP3013은 10 nM 미만의 농도에서 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)를 증가시키는 반면, SS-31은 30 nM 이상의 농도에서도 미토콘드리아 막 전위 증가 효과를 나타내지 못하였다(도 25).

비교예 3 내지 5의 실험 결과를 통해 본 발명의 α-나선형 펩타이드는 SS-31을 비롯한 기존의 미토콘드리아 표적화 펩타이드들과 비교하여 훨씬 더 낮은 농도에서 현저하게 높은 미토콘드리아 기능 회복 효과를 나타냄을 입증하였다.

Ⅴ. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 질병 치료 효과

실시예 13. 펩타이드의 장기(organ)에서의 분포

본 발명에 따른 α-나선형 펩타이드가 정맥 주사에 의해 전신 투여되는 경우의 생체 내 분포를 파악하기 위해, 시아닌(cyanine) 5.5가 표지된 펩타이드 CMP3013를 정상 수컷 C57BL/6 마우스에 3 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하고 24시간 뒤 장기를 적출하여 IVIS 이미징 분석을 수행하였다. 그 결과, CMP3013은 주로 간, 폐, 비장 및 신장에 분포하는 것으로 확인되었다(도 26).

실시예 14. 급성 간부전(acute hepatic failure)에 대한 치료 효과

실시예 14.1. 정맥 투여 CMP3013의 간 손상 억제 효과 확인

실시예 14.1.1. 급성 간부전 동물 모델의 제조 및 혈액 분석

8주령 암컷 C57BL/6 마우스에 1 mg/kg 용량의 CMP3013을 2일 간격으로 총 3회 정맥 투여(Day 0, 2, 4)한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg 용량의 티오아세트아미드(thioacetamide, TAA; Sartorius, 독일)를 복강내 투여하여 급성 간부전을 유도하였다. 6일째(Day 6)에 심장에서 채취한 혈액으로부터 혈청 샘플을 수득하고, 샘플을 혈액분석기(Hitachi Chemical Industries, Ltd., 일본)를 사용하여 분석하였다. 간 손상 지표로서 혈중 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase) 및 ALP(alkaline phosphatase)를 측정하여 평가하였다.

실시예 14.1.2. 간 손상 관련 지표의 감소 확인

실시예 14.1.1에 기술된 방법에 따라 CMP3013을 사전에 주사한 마우스에서 TAA에 의한 간 손상 억제되는지 여부를 확인하였다.

먼저, 모든 실험 동물에서 CMP3013의 투여 후 이상 증상은 발생하지 않았으며, 사망한 개체 또한 없었다. 또한, TAA 및/또는 CMP3013 투여에 의한 체중 감소도 나타나지 않았다.

간 손상 지표인 혈중 AST, ALT 및 ALP는 모두 CMP3013을 투여한 군에서 현저하게 감소되는 것이 확인되었다(도 27a 내지 도 27c). AST는 정상 대조군에서 73.40 ± 12.05 U/L 수준이었던 것이 TAA 투여에 의해 488.20 ± 174.17 U/L로 치솟았으며, 이는 CMP3013 투여에 의해 316.40 ± 52.65 U/L 수준으로 유의하게 감소하여 TAA만 투여한 군 대비 35% 가량 낮아지는 것을 확인하였다(도 27a). ALT는 정상 대조군에서 29.40 ± 7.02 U/L 수준이었고, TAA 투여에 의해 499.40 ± 242.69 U/L로 급격하게 높아졌으나 CMP3013을 투여한 군에서는 332.60 ± 86.31 U/L로 감소되었다(도 27b). 또한, ALP는 정상 대조군에서 292.40 ± 42.08 U/L, TAA 투여군에서 573.00 ± 117.87 U/L이었으며, CMP3013 투여군에서는 462.00 ±81.10 U/L로 측정되어 TAA 투여군 대비 19% 감소됨을 확인하였다(도 27c).

이러한 결과는 낮은 용량(1.0 mg/kg)의 CMP3013이 간에서 TAA로 인한 간의 손상을 구제하기에 충분한 수준의 효능을 제공할 수 있음을 시사한다.

실시예 14.2. 복강내 투여 CMP3013의 용량 의존적 간 손상 억제 효과 확인

실시예 14.2.1. 급성 간부전 동물 모델의 제조 및 혈액 분석

7주령 암컷 C57BL/6 마우스에 1 mg/kg 용량의 CMP3013을 2일 간격으로 총 3회 복강내 투여(Day 0, 2, 4)한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg 용량의 티오아세트아미드를 복강내 투여하여 급성 간부전을 유도하였다. 7일째(Day 7)에 혈청 샘플을 확보하고, 이를 혈액분석기로 분석하였다. 간 손상 지표로서 혈중 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase) 및 ALP(alkaline phosphatase)를 측정하여 평가하였다.

실시예 14.2.2. 간 손상 관련 지표의 감소 확인

실시예 14.2.1에 기술된 방법에 따라 농도별 CMP3013을 사전에 주사한 마우스에서 TAA에 의해 간 손상이 억제되는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 간 손상 지표인 혈중 AST, ALT 및 ALP는 모두 CMP3013을 투여한 군에서 현저하게 감소되는 것이 확인되었다(도 27d 내지 도 27f). 특히, AST와 ALT는 투여된 CMP3013의 용량 의존적으로 감소되는 경향이 나타났다(도 27d 및 도 27e). 이와 같은 결과는 낮은 용량(1.0 mg/kg)의 CMP3013이 간 손상을 억제하며, 나아가 고용량(10 mg/kg)의 CMP3013은 더욱 향상된 간 손상 억제 효과를 제공할 수 있음을 시사한다.

Ⅵ. 결론 및 고찰

1, 4, 5 및 8번 아미노산을 소수성으로 구성하고, 3, 6, 7 및 10번 아미노산을 친수성으로 구성함으로써 양친매성 특성 및 α-나선형 구조를 갖는 본원의 미토콘드리아 특이적 펩타이드(단량체 또는 이의 이합체)는 치료제로서 높은 사용 가능성을 시사하는 몇 가지 중요한 이점을 가지고 있다. 첫째로, CMP3013, CMP3029를 위시한 본원의 펩타이드는 세포 투과성이 매우 높기 때문에 나노몰 수준의 낮은 농도(EC₅₀ = 35 nM)에서도 세포 내로 쉽게 위치한다. 둘째로, 본원의 펩타이드는 미토콘드리아에 우선적으로 들어가며(약 80%), 이는 부작용을 유발하는 세포질에 존재하는 양이 많지 않음을 의미한다. 셋째로, 본원의 펩타이드는 미토콘드리아 내막의 특정 인지질인 카디오리핀(CL)에 우선적으로 결합하여 크리스테(cristae) 구조를 보호하고, 이로써 기능단백질이 제대로 작동할 수 있도록 하는 견고한 막을 제공한다. 넷째로, 가장 중요하게는 본원의 펩타이드는 여러(또는 복수의) 카디오리핀 분자에 대해 강한 결합력을 가지고 있어 통상적인 1:1 복합체에서 예상되는 것보다 훨씬 더 강한 상호작용을 초래한다. 결과적으로, 카디오리핀 함유 층으로부터 본원 펩타이드의 해리는 매우 느려서 그 효과를 더욱 강력하게 만든다.

또한, 본 발명의 펩타이드가 확장된 형태의 미토콘드리아와 매우 낮은 상관관계를 갖는 반면, 도넛형 또는 벌지형 미토콘드리아와 더 높은 상관관계가 있다는 발견도 치료제로서의 사용 가능성에 있어서 동등하게 중요할 것이다(도 15a). 즉, 위에서 언급한 바와 같이 이러한 발견은 본원의 펩타이드가 보호적 크리스테 조직 시스템(cristae organizing system)이 존재하지 않는 손상된 미토콘드리아에 선택적으로 위치함을 시사한다. 이러한 이유로 손상된 카디오리핀(또는 크리스테)의 형성을 효과적으로 차단하고 기능적 미토콘드리아에 영향을 미치지 않으면서 기능적 크리스테를 유지하기 위해서는 단지 소량의 본원에 따른 펩타이드만이 필요할 것으로 예상된다. 즉, 본원의 펩타이드에 있어서 세포 독성을 최소화하는 데 요구되는 나노몰 수준의 치료적 농도는 ATP 생성 및 미토콘드리아 막 전위 증가를 포함하여 미토콘드리아 기능을 보호하기에 충분해야 한다.

상술한 실시예들에서, 본원의 α-나선형 양친매성 펩타이드인 CMP3013, CMP3029 등은 비정상적이고 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 결합하고, H₂O₂ 또는 기타 손상제의 처리에 의해 파괴된 크리스테 구조의 회복 및/또는 유지를 촉진한다는 것을 보여주었다. 시험관 내 세포 기반 실험과 생체 내 동물 모델 연구 모두에서 치료적 효과가 매우 낮은 농도의 본원 펩타이드에 의해 촉진됨은 매우 고무적인 결과이다. 생합성 및 미토파지를 포함하는 미토콘드리아 항상성은 세포가 기능 장애 미토콘드리아를 손상되지 않은 세포 소기관으로 신속하게 대체할 수 있도록 한다. 따라서 치료제는 결함이 있는 모든 미토콘드리아를 복구할 필요는 없으며, 본원의 펩타이드에 의해 복구된 손상된 미토콘드리아의 일부는 정상적인 조직의 기능을 회복하기에 충분할 것으로 예상된다.

이러한 예상은 본원의 α-나선형 양친매성 펩타이드인 CMP3013이 TAA에 의해 유도된 급성 간부전 동물 모델에서 저용량의 투여로도 간 세포의 손상을 억제하거나 손상된 간 세포를 회복시키는 효과가 나타났다는 사실에 의해서도 뒷받침된다.

Ⅶ. 재료 및 방법

실험예 1. 펩타이드의 제조

실험예 1.1. 펩타이드의 합성, 분리 및 정제

펩타이드는 SPS 마이크로웨이브 펩타이드 합성기(Discover, CEM, 미국)에서 표준 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 고체상 펩타이드 합성(solid-phase peptide synthesis, SPPS) 방법을 사용하여 합성하였다.

구체적으로, 링크 아마이드(rink amide) MBHA 수지는 N,N-디메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide, DMF) 중의 20 %(v/v) 피페리딘을 사용하여 탈보호되었고, Fmoc으로 보호된 아미노산은 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA) 및 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트[(benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, PyBOP]의 존재 하에 커플링되었다. 목적하는 서열의 펩타이드가 합성될 때까지 탈보호 및 커플링을 반복하였다. 마지막 아미노산을 첨가한 후, 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하였다. 아세틸화는 아세트산 무수물 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물(1-hydroxybenzotriazole hydrate, HOBt)을 첨가하여 수행하였다.

형광 표지를 위해, 5-카르복시테트라메틸로다민(5-carboxytetramethylrhodamine, 5-TAMRA)을 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), HOBt 및 DIPEA의 존재 하에 펩타이드에 접합시켰다. 6-(7-니트로벤조푸라잔-4-일아미노)헥산산[6-(7-nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid, C6-NBD]은 PyBOP 및 DIPEA를 사용하여 표지하였다.

수지 상에 합성된 펩타이드는 절단 혼합제[트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)/1,2-에탄디티올(1,2-ethanedithiol, EDT)/증류수/트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS) = 94:2.5/2.5/1, v/v]을 사용하여 절단하였다. 침전을 위해, n-헥산(n-hexane) 및 디에틸에테르(diethyl ether)의 1:1(v/v) 혼합물을 절단된 펩타이드에 첨가하였다. 침전된 펩타이드는 5000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 펩타이드 펠릿을 DMSO에 용해시켰다.

펩타이드의 정제는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.1%(v/v) TFA가 포함된 물과 0.1%(v/v) TFA가 포함된 아세토니트릴(ACN)로 구성되었으며, 고정상은 Zorbax C18 컬럼(3.5 μm, 4.6 × 150 mm)을 사용하였다. 정제된 펩타이드를 동결건조하고 적절한 용매에 용해시켰다. 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF 질량 분석기(Bruker, 미국)를 사용하여 결정하였다.

실험예 1.2. 펩타이드의 이합체화(dimerization)

이합체 펩타이드의 제조를 위해, 동결건조된 펩타이드를 0.1 M 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate)에 용해하였다. 경우에 따라, ACN을 40%(v/v)까지 첨가하여 펩타이드의 용해도를 높였다. 제조된 펩타이드 용액을 셰이커를 이용하여 대기하에서 교반 산화시켰다. 산화 후, 이합체화된 펩타이드를 정제하고 동결건조하였다.

실험예 2. 세포 배양

HeLa 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, 16000-044, 미국) 및 항생제(Gibco, 15240-062, 미국)가 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Cytiva, SH30243.01, 미국)에서 배양하였다. 세포는 37℃의 5% CO₂ 및 가습 인큐베이터에서 배양하였다.

실험예 3. 유세포분석(flow cytometry)

1 × 10⁵ 개의 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 경과 후, 펩타이드를 세포에 첨가하고 3시간 동안 추가 배양하였다. 배양한 세포를 수확하고 PBS로 세척한 다음, PBS에 현탁하여 형광표지세포분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS; BD Accuri, 미국) 분석을 수행하였다. 펩타이드 미처리 세포의 최대 형광 강도를 초과하는 세포는 형광 양성 세포로 분류하였다. EC₅₀(Half maximal effective concentration) 값은 형광으로 표지된 해당 펩타이드 이합체가 배양된 세포의 절반에 들어가는 이합체 펩타이드의 농도로 정의하였다.

실험예 4. 미토콘드리아 분획화(fractionation)

미토콘드리아 분리(isolation) 방법을 사용하여 펩타이드의 세포내 분포를 검출하였다. TAMRA로 표지된 펩타이드를 EC₅₀ 농도로 6 × 10⁶ 개의 HeLa 세포에 첨가하고, 이 세포를 3시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하여 차가운 PBS로 세척한 다음, 차가운 IB(30 mM Tris-HCl, pH 7.4; 225 mM 만니톨; 75 mM 수크로스; 및 0.1 mM EGTA)에 현탁하였다. 미리 냉각된 다운스 균질화기(Dounce homogenizer)를 사용하여 세포의 80 ~ 90%가 파괴될 때까지 균질화를 수행하였다. 용해된 세포는 광학 현미경으로 모니터링하였다. 파쇄액(homogenate)을 e-튜브로 옮기고 4℃, 600 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 수집하고 다시 한번 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 4℃ 7,000g에서 10분간 원심분리하였다. 여기서 얻은 상층액(세포질 분획)은 새로운 e-튜브에 옮겨 담고, 펠릿(미토콘드리아 분획)은 동일한 부피의 차가운 IB에 재현탁하였다. 각 분획의 형광 강도는 마이크로플레이트 리더[TECAN, 스위스; 여기(Ex)/방출(Em) = 510/570 nm]로 측정하였다.

실험예 5. 공초점 현미경 및 초고해상도 현미경 관찰

현미경 관찰을 위해, HeLa 세포는 유리바닥접시(glass-bottom dish)에서 성장시켰다(SPL, 200350, 대한민국). 이어서, 세포를 펩타이드로 3시간 동안 처리하고 마이토트래커(MitoTracker™; Thermo Fisher Scientific, A1372, 미국; 100 nM, 1시간), 노닐 아크리딘 오렌지(nonyl acridine orange, NAO; Thermo Fisher Scientific, A1372; 100 nM, 1시간), hoechst 33342(1 μg/mL, 20분), 셀라이트 초기 엔도솜-GFP(CellLight™ early endosomes-GFP; Thermo fisher Scientific, C10586; 2 μL/10,000개 세포, 16시간) 및/또는 라이소트래커(LysoTracker™, Thermo Fisher Scientific, L7525; 50nM, 30분)로 염색하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 헹구고 HBSS를 첨가하였다. 염색된 세포의 이미지는 현미경(Zeiss LSM 880 및 ELYRA PS.1)을 사용하여 얻었다. 초고해상도 이미지를 생성하기 위해, ZEN 블랙 소프트웨어로 구조적 조명(structured illumination) 프로세스를 수행하였다. 피어슨 r 값은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.

실험예 6. 세포의 ROS 수준 분석

세포내 ROS 수준은 두 가지 방법을 사용하여 측정하였다.

첫 번째 방법은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 유리바닥접시 상에 배양된 세포를 EC₅₀ 농도의 TAMRA 표지된 펩타이드로 3시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 세포를 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescin diacetate, H₂DCFDA; Sigma, 287810, 미국; 25 μM, 30분)로 염색하고 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 HBSS에서 500 μM H₂O₂로 처리하고 10분 동안 추가로 배양하였다. 세포의 DCF 신호는 공초점 현미경으로 검출하였고 이미지를 촬영하였다. ZEN 블루 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 녹색 신호 강도를 계산하였다.

두 번째 방법은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 2 × 10⁴ 개의 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 세포를 펩타이드와 함께 3시간 동안 배양한 다음 H₂DCFDA 염색(25 μM, 30분)을 수행하였다. PBS로 2회 세척한 후, HBSS 중의 세포를 ROS 수준 분석에 사용하였다. 각 웰의 DCF 신호는 37℃에서 마이크로플레이트 리더(TECAN)를 사용하여 수득하였다(Ex/Em = 485/535 nm).

실험예 7. 미토콘드리아 ROS 및 막 전위 측정

2 × 10⁴ 개의 HeLa 세포를 실험 24시간 전 96-웰 플레이트에 접종하였다. 그런 다음, 세포를 마이토삭스(MitoSOX™; Thermo Fisher Scientific, M36008; 5 μM, 10분) 또는 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE; Sigma, 87917; 600 nM, 15분)로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 세포에 HBSS를 첨가하였다. 세포의 형광 신호는 37℃에서 마이크로플레이트 리더(TECAN)로 측정하였다(마이토삭스, Ex/Em = 510/580 nm; TMRE, Ex/Em = 525/575 nm).

실험예 8. ATP 수준 측정

세포 ATP의 수준은 ATP 검출 키트(Abcam, ab113849, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 평가하였다. 형광 발광은 마이크로플레이트 리더(Promega, Glomax 96 microplate luminometer, 미국)로 측정하였다.

실험예 9. 투과전자현미경법(Transmission electron microscopy)

1.8 × 10⁶ 개의HeLa 세포를 변형된 카르노프스키 고정액[modified Karnovsky fixative; 0.05 M 카코딜산나트륨(sodium cacodylate) 버퍼에 용해된 2% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드]으로 4℃에서 3시간 동안 고정하였다. 샘플을 0.05 M 카코딜산나트륨 버퍼(pH 7.2)로 4℃에서 10분간 3회 세척한 후, 다시 0.05 M 카코딜산나트륨 버퍼(pH 7.2)에 용해된 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 4℃에서 2시간 동안 후고정시켰다. 그 다음, 샘플을 증류수로 짧게 2회 세척하였다. 이어서, 표본을 4℃에서 0.5% 아세트산우라닐(uranyl acetate)로 밤새 일괄 염색하였다. 염색된 샘플은 에탄올 농도를 증가시키면서 탈수한 다음(30%, 50%, 70%, 80% 및 90% 에탄올에서 각각 1회 및 100% 에탄올에서 3회, 각 회당 10분씩), 15분 동안 100% 프로필렌옥사이드(propylene oxide)를 2회 처리하는 전환(transition) 단계를 수행하였다. 샘플을 일련의 프로필렌옥사이드와 스퍼 수지(Spurr's resin; 1:1 비율로 1.5시간, 1:2 비율로 1.5시간, 스퍼 수지만 단독으로 밤새 처리 후 다시 한번 4시간 동안 처리)로 침윤시키고 스퍼 수지에 포매하여 밤새 70℃에서 중합시켰다. 완전히 중합된 샘플은 울트라마이크로톰(ultramicrotome; MT-X, RMC, 미국)을 사용하여 절편화하였다. 수득한 절편은 2% 아세트산우라닐 및 레이놀즈 시트르산납(Reynolds' lead citrate)으로 각각 7분 동안 염색하였다. 샘플의 관찰 및 이미징은 JEM-ARM200F TEM을 사용하여 수행하였다.

실험예 10. 플라스미드의 구축 및 형질도입

야생형 Drp1 cDNA(아주대학교 의과대학 정선용 박사 제공)를 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭하여 pcDNA3.1-플라스미드의 eGFP 유전자 N-말단에 삽입하였다. 플라스미드의 형질도입은 리포펙타민™ 3000(Thermo Fisher Scientific, L3000001)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다.

실험예 11. 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅을 위해, 세포를 수확하여 버퍼[50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% IGEPAL CA-630; 0.25% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate); 0.1% SDS; 및 프로테아제 억제제(Gendepot, P3100-001, 미국)]에 현탁시켰다. 음파처리(sonification)에 의해 세포를 파괴하고 20 μg의 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)하여 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막으로 트랜스퍼하였다. 이어서, 5% 무지방 우유로 블로킹한 후 1차 항체 및 2차 항체를 순차적으로 처리하였다. 1차 항체는 각각 항-COX4(Abclonal, A6564), 항-α-튜불린(Abclonal, AC012), 항-글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH; Genetex, GTX100118) 및 항-Drp1(BD biosciences, 611112) 항체를 사용하였다.

실험예 12. 카디오리핀 결합 분석

NBD로 표지된 펩타이드 또는 C6-NBD[6-(7-Nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid]와 리포솜(liposome)의 상호작용을 검출하기 위해 NBD의 형광 강도의 변화를 측정하였다.

결합 실험을 위해, PBS에 용해한 1 μM의 NBD 표지 펩타이드를 검은색 96-웰 플레이트에 준비하였다. 원하는 농도가 달성될 때까지 리포솜(POPC:POPE = 2:1 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀을 함유)을 펩타이드에 첨가하였다. NBD-펩타이드와 리포솜의 혼합물을 피펫팅에 의해 잘 섞어준 후 샘플의 형광 방출을 모니터링하였다(λ_ex = 467 nm, λ_em = 536 nm).

카디오리핀 비율에 따른 결합 실험을 위해, PBS에 용해한 1 μM의 NBD 표지 펩타이드 또는 C6-NBD를 검은색 96-웰 플레이트에 준비하였다. 원하는 농도(5 μM)가 달성될 때까지 리포솜(POPC:POPE = 2:1, 0 ~ 20% 카디오리핀 함유)을 펩타이드에 첨가하였다. 이 혼합물을 피펫팅에 의해 잘 섞어준 후 샘플의 형광 방출을 모니터링하였다(λ_ex = 467 nm, λ_em = 536 nm).

해리 실험에서는 PBS에 용해한 1 μM의 NBD 표지 펩타이드를 검은색 96-웰 플레이트에 준비하였다. 원하는 농도(100 μM)가 달성될 때까지 리포솜(POPC:POPE = 2:1 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀을 함유)을 펩타이드에 첨가하였다. NBD-펩타이드와 리포솜의 혼합물을 피펫팅에 의해 잘 섞어준 후 혼합물의 형광 강도를 측정하였다(λ_ex = 467 nm, λ_em = 536 nm). 이어서, 표지되지 않은 펩타이드(아세틸화 펩타이드)를 혼합물에 첨가하고 피펫팅으로 잘 섞어주었다. 암실에서 10분 동안 배양한 후 형광 강도의 변화를 모니터링하였다. 아세틸화 펩타이드의 농도가 40 μM에 도달할 때까지 펩타이드의 첨가 및 형광 측정을 반복하였다.

실험예 13. 동물 실험

모든 동물 실험은 사전에 오리엔트바이오 동물실험윤리위원회의 심의 및 승인(동물실험 승인번호: ORIENT-IACUC-21158)을 하에 전미연구평의회(U.S.)의 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침에 따라 수행되었다.

실험예 14. 통계 분석

모든 unpaired Student's t-test는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 데이터는 평균을 나타내고 에러바는 표준 편차를 나타낸다. 통계적 유의성은 0.05 미만의 p 값(ns, p ≥ 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001)으로 평가되었다.

실시예 14에서의 통계 분석은 통계 분석 프로그램(SPSS Statistics 22 for Analysis, IBM, 미국)을 사용하여 실시하였다. 평가항목은 평균과 표준편차로 나타냈으며, 각 평가항목의 평균값은 One-way ANOVA 및 Dunnett's multiple comparison tests에 의해 비교되었으며, 0.05 미만의 p값(*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001)을 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

Claims

하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 이상(mitochondrial dysfunction)을 수반하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<식 1>
X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀
상기 식 1에서,
X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고,
X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고,
X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고,
X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.
제1항에 있어서,
상기 미토콘드리아 기능 이상을 수반하는 질환은 미토콘드리아 근병증(mitochondrial myopathy), MELAS(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes) 증후군, 샤르코 마리 투스 질환(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 레베르 유전성 시신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 피어슨 증후군(Pearson syndrome), 리 증후군(Leigh syndrome), 프리드리히 운동실조(Friedreich's ataxia) 및 바르트 증후군(Barth syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는
약학 조성물.
하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<식 1>
X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀
상기 식 1에서,
X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고,
X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고,
X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고,
X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.
제3항에 있어서
상기 간 질환은 급성 간부전(acute liver failure), 급성 간손상(acute liver injury), 간경변증(liver cirrhosis) 및 간염(hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는
약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)인
약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)인
약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 X₁, X₄, X₅ 및 X₈ 중 하나 이상은 각각 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)인
약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)인
약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)인
약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)이며, 단 X₂ 및 X₉가 동시에 루신(L)은 아닌
약학 조성물.
제10항에 있어서,
상기 X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)인
약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이합체는 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 서로 역평행(anti-parallel) 방향으로 연결된 것인
약학 조성물.
제12항에 있어서,
상기 X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)이고, 연결은 이황화 결합에 의한 것인
약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식 1로 표시되는 단위체가 서열번호 1 내지 서열번호 19중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인
약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 펩타이드 또는 이의 이합체를 나노 몰 농도로 포함하는
약학 조성물.
하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체:
<식 1>
X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀
상기 식 1에서,
X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)이고,
X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고,
X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고,
X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.
제16항에 있어서,
상기 X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)인
펩타이드 또는 이의 이합체.
제17항에 있어서,
상기X₁, X₄, X₅ 및 X₈ 중 하나 이상은 각각 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)인
펩타이드 또는 이의 이합체.
제16항에 있어서,
상기 X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)인
펩타이드 또는 이의 이합체.
제19항에 있어서,
상기 X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)인
펩타이드 또는 이의 이합체.
제16항에 있어서,
상기 X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)이며, 단 X₂ 및 X₉가 동시에 루신(L)은 아닌
펩타이드 또는 이의 이합체.
제16항에 있어서,
상기 이합체는 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 서로 역평행(anti-parallel) 방향으로 연결된 것인
펩타이드 또는 이의 이합체.
제16항에 있어서,
상기 펩타이드 또는 이의 이합체는 미토콘드리아 막의 카디오리핀(cardiolipin)과 상호작용하는 것인
펩타이드 또는 이의 이합체.
서열번호 1 내지 서열번호 19 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체.
하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 미토콘드리아 기능 회복이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능을 회복시키는 방법:
<식 1>
X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀
상기 식 1에서,
X₁, X₄, X₅ 및 X₈은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고,
X₃, X₆, X₇ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고,
X₂ 및 X₉는 각각 독립적으로 각 단위체가 X₂ 및 X₉ 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고,
X₁은 N-말단이고 X₁₀은 C-말단이다.