KR20220158231A - 무세포 뉴클레오솜 수준을 사용한 분류 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감염에 대한 NETosis 관련 유해 반응의 발병의 위험에 있는 환자를 식별하기 위한 무세포 뉴클레오솜 수준의 사용에 관한 것이다. 방법은 감염을 앓고 있는 환자에서 질환의 진행을 모니터링하고 유해한 결과의 위험을 지정하기 위해 사용된다.

Description

무세포 뉴클레오솜 수준을 사용한 분류 방법
본 발명은, 특히 감염에 대한 NETosis 관련 유해 반응의 높은 발병 위험에 있는 환자를 식별하기 위한, 감염이 있는 환자에 대한 체액 샘플 중의 바이오마커로서의 무세포(cell free) 뉴클레오솜의 용도에 관한 것이다. 이는 또한 NETosis 관련 병태의 치료를 위한 치료적 항체로서의 항-뉴클레오솜 항체의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자는 매년 발생하여 전 세계적으로 확산되어, 약 300 내지 500만 건의 중병 및 약 290,000 내지 650,000명의 사망을 발생시킨다. 보다 최근에는, 새로운 감염인 COVID-19의 출현 및 급속한 진행이 팬데믹 상태로 확대되었다. 일부 감염은 급성 호흡기 증후군 (ARS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 또는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)으로 이어지며, 이는 잠재적으로 의학적 치료를 필요로 하는 치명적 질환 진행이다. 감염 발생 및 팬데믹은 국제 의료 서비스에 심각한 부담을 주고, 따라서 병원 개입을 필요로 할 가능성이 가장 높은 환자를 식별하기 위해 환자를 분류하는 방법은 의료 제공자가 환자를 우선순위화하고 생명을 구하며 의료 서비스에 대한 더 높은 수요를 보다 효과적으로 관리하도록 돕는 데 있어 중요하다.
COVID-19, 인플루엔자 및 다른 감염은 심각할 수 있고 치명적일 수 있는 NETosis 관련 합병증의 수반으로 진행될 가능성을 갖는다. 이러한 합병증은 감염에 대한 합병증으로서 발생할 수 있는 생명-위협 장기 기능장애인 패혈증을 포함한다. 부적절한 NETosis를 치료하고, NETosis 관련 합병증의 높은 위험에 있는 개체를 식별하고, 이러한 치료를 필요로 하는 그러한 합병증의 진행을 모니터링하고, 치료의 효능을 모니터링하고, 이러한 질환의 진행을 모니터링하는 방법은 현재 부족하다.
Holdenrieder et al., Int. J. Cancer (2001) 95: 114-120은 이전에 양성 및 악성 질환이 있는 환자의 혈청 샘플에서 뉴클레오솜의 수준을 검출하는 것을 기재하였다. 히스톤 변형, 히스톤 변이체, DNA 변형 및 부가물 함량 측면에서 순환 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 조성이 또한 암의 혈액 기반 바이오마커로서 조사되었으며, 하기를 참조한다: WO 2005/019826, WO 2013/030577, WO 2013/030579 및 WO 2013/084002.
NETosis 관련 병태에 대한 효과적인 치료를 제공하는 것 뿐만 아니라 감염시 나쁜 예후와 함께 NETosis 관련 합병증을 발병시킬 가능성이 있는 개체를 식별하고 우선순위화하고 질환의 치료 및 진행을 모니터링하기 위한 간단하고 비용-효율적인 방법에 대한 필요성이 당업계에서 여전히 남아 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. 2명의 건강한 지원자로부터 채취된 EDTA 혈장 및 헤파린 혈장 샘플에서의 호중구 세포외 트랩 (NET) 유래 뉴클레오솜에 대한 면역검정의 결과. EDTA 샘플은 낮은 수준의 NET 유래 뉴클레오솜 물질을 함유한다. 반면, 헤파린은 NET 형성을 유도하고, 헤파린 혈장 샘플은 높은 수준의 유도 NET 유래 뉴클레오솜을 함유한다.
도 2. 2명의 건강한 지원자로부터 채취된 EDTA 혈장 및 헤파린 혈장 샘플에서의 NET 유래 뉴클레오솜에 대한 생물분석기 전기영동 결과. EDTA 샘플은 모노뉴클레오솜 및 NET 유래 뉴클레오솜 물질 둘 다 낮은 수준으로 함유한다. 반면, 헤파린은 NET 형성을 유도하고, 헤파린 혈장 샘플은 낮은 수준의 모노뉴클레오솜 (대략 60초에서 피크), 그러나 높은 수준의 유도 NET 유래 뉴클레오솜 (대략 110초에서 넓은 피크)을 함유한다. 대략 43초 및 대략 110초에서의 좁은 피크는 참조 목적으로 첨가된 DNA 샘플을 나타낸다.
도 3. PCR에 의해 COVID-19 감염에 대해 양성으로 시험된 34명의 유증상 환자 및 PCR에 의해 음성으로 시험된 16명의 유증상 환자를 포함한 COVID-19 감염의 증상으로 병원에 입원한 50명의 환자, 뿐만 아니라 질환의 증상을 나타내지 않는 50명의 정상 대상체에서 측정된 히스톤 이소형(isoform) H3.1을 함유하는 뉴클레오솜의 수준.
도 4. 외래환자 병원 예약에 참석하거나 병원 응급실 (ER)에 제시된 환자로부터 수집된 5개의 샘플; 일반 병동에 입원한 3명의 환자; 호흡기 지원을 필요로 하고 생존한 중환자실 (ICU)에 입원한 2명의 환자; 및 호흡기 지원을 필요로 하고 사망한 ICU에 입원한 4명의 환자를 포함한, PCR 확인된 COVID-19 감염이 있는 15명의 환자에서 측정된 히스톤 이소형 H3.1을 함유하는 뉴클레오솜의 수준.
도 5. 외래환자 병원 예약에 참석하거나 병원 ER에 제시된 환자로부터 수집된 5개의 샘플; 일반 병동에 입원한 3명의 환자; 호흡기 지원을 필요로 하고 생존한 ICU에 입원한 2명의 환자; 및 호흡기 지원을 필요로 하고 사망한 ICU에 입원한 4명의 환자를 포함한, PCR 확인된 COVID-19 감염을 갖는 15명의 환자에서 측정된 히스톤 변형 H3R8Cit을 함유하는 뉴클레오솜의 수준.
도 6. 혈장분리교환술(plasmapheresis)에 배치된 패혈증으로 유도된 16마리의 돼지에서 측정된 히스톤 이소형 H3.1을 함유하는 뉴클레오솜의 평균 수준을 보여주는 실시예 12에 기재된 실험으로부터의 결과. 9마리의 돼지에서는 혈장이 NET 결합제를 함유하는 카트리지를 통과하였고 (치료된, 폐쇄 막대), 7마리의 돼지에서는 혈장이 NET 결합제를 함유하지 않은 대조군 카트리지를 통과하였다 (대조군, 개방 막대).
도 7. 개별 시험 대상체에서의 수준에 대한, 실시예 12에 기재되고 도 6에 나타낸 실험으로부터의 결과.
도 8. 패혈증으로 진단된 인간 대상체 및 건강한 인간 대상체에서 측정된 H3.1-뉴클레오솜 수준.
발명의 요약
제1 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 단계 (i)을 1회 이상 반복하는 단계; 및
(iii) 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준에서의 임의의 변화를 사용하여 대상체에서의 감염의 진행을 모니터링하는 단계
를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 상기 대상체에서 의학적 합병증이 발생하거나 진행될 가능성을 지정하는 단계
를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에서 의학적 합병증의 발병 또는 진행의 위험을 지정하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 상기 대상체에게 유해한 결과의 가능성을 지정하는 단계
를 포함하며, 여기서 유해한 결과의 가능성이 높은 것으로 식별된 대상체에 의학적 개입이 지정되는 것인, 감염을 앓고 있는 대상체에게 유해한 결과의 위험을 지정하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 상기 대상체에서 치료를 필요로 하는 의학적 합병증의 존재, 진행 또는 발병을 나타내는 단계
를 포함하는, 감염의 의학적 합병증에 대한 의학적 치료를 필요로 하는, 감염을 앓고 있는 대상체를 선택하는 방법이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 감염은 호흡기 인플루엔자 또는 코로나바이러스 감염이고, 의학적 합병증은 ARS, ARDS 또는 SARS 또는 폐렴이다. 따라서, 하나의 구현예에서,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 대상체가 폐렴, ARS, ARDS 또는 SARS에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
를 포함하는, 폐렴, ARS, ARDS 또는 SARS에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 감염은 호흡기 인플루엔자 또는 코로나바이러스 감염이고, 의학적 합병증은 ARS, ARDS, SARS 또는 폐렴이다.
다른 바람직한 구현예에서, 감염은 패혈증이다. 따라서, 하나의 구현예에서,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 대상체가 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
를 포함하는, 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 대상체로부터 얻은 체액 중의 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계;
(iii) 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준에서의 임의의 변화를 사용하여 대상체에서의 감염의 진행을 모니터링하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 감염을 모니터링하는 방법이 제공된다.
뉴클레오솜은 세포 사멸시 염색질의 단편화에 따라 순환계로 방출된다. 바이러스 감염 등의 많은 감염은 다양한 메커니즘 (세포 결합 및 진입, 엔도솜 TLR3 활성화 및 유전자 발현)을 통해 세포 사멸을 개시함으로써 혈액 내 순환 뉴클레오솜의 수를 증가시킨다 (Danthi et al., Annu. Rev. Virol. (2016) 3: 533-53). 추가로, 감염은 NETosis에 의해 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화 또는 과시트룰린화와 같은 번역-후 히스톤 변형을 유도하고 (Wang Y et al., J. Cell Biol. (2009) 184(2): 205-213), 감염에 대한 제1 라인 반응으로서 함께 순환계로 방출되는 염색질의 탈축합을 촉진할 수 있다. 그러나, 세포외 뉴클레오솜 및 호중구 세포외 트랩 (NET)은 신속하게 제거되지 않으면 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 예를 들어, 사구체막에 결합하는 뉴클레오솜은 루푸스에서의 신장 손상과 관련되며 (Kalaaji et al., Kidney Int. (2007) 71(7): 665-672), NET는 바이러스성 폐렴 동안 폐 손상을 심화시키는 것으로 나타났다 (Ashar et al., Am. J. Pathol. (2018) 188(1): 135-148). 실로, 숙주 지향 NET 독성은 호흡 곤란, 좁은 기도의 폐색, 내피 및 상피 세포 손상, 염증 반응 및 혈전 형성 및 기타 병리와 관련된다 (Marcos et al., Nat. Med. (2010) 16: 1018-23; Hoeksema et al., Future Microbiol. (2016) 11: 441-53).
인플루엔자 또는 코로나바이러스로 감염된 대부분의 대상체는 경증의 병을 경험한다. 그러나, 60세 초과의 고령자 및 당뇨병, 만성 폐 질환, 또한 특히 만성 심장 질환과 같은 의학적 기저 질환을 갖는 사람을 포함한 일부 집단 하위그룹은, ARS, SARS, 폐렴 및 사망을 포함한 심각한 영향의 위험에 있다. 인플루엔자 또는 코로나바이러스 감염을 폐렴을 포함한 합병증에 이르게 하는 정확한 메커니즘은 명백하지 않지만, 과도한 NET가 폐의 급성 손상에 기여하여 폐렴 및 최악의 경우 사망에 이르게 하는 바이러스 감염에 대한 과면역 반응에 의해 유발되는 것으로 생각된다.
본 발명은 NET를 포함한 무세포 뉴클레오솜의 상승된 수준을 활용하여 질환의 중증도 및 감염성 질환에서의 결과를 예측한다.
따라서, 하나의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 상기 대상체에게 유해한 결과의 가능성을 지정하는 단계를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에게 유해한 결과의 위험을 지정하는 방법이 제공된다. 방법은 유해한 결과의 가능성이 높은 것으로 식별된 대상체에 의학적 개입이 지정되는 데 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 호중구 세포외 트랩 물질 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 호중구 세포외 트랩 물질의 수준을 사용하여 상기 대상체에게 유해한 결과의 가능성을 지정하는 단계
를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에게 유해한 결과의 위험을 지정하는 방법이 제공된다.
뉴클레오솜은 염색질 구조의 기본 단위이며, 8개의 고도로 보존된 코어 히스톤 (히스톤 H2A, H2B, H3, 및 H4 각각의 쌍을 포함함)의 단백질 복합체로 이루어진다. 이 복합체 주위에는 DNA의 대략 146개의 염기 쌍이 랩핑되어 있다. 또 다른 히스톤, H1 또는 H5는 링커 역할을 하며 염색질 압밀에 관여한다. DNA는 종종 "스트링 상의 비드"와 유사한 것으로 언급되는 구조 내의 연속적인 뉴클레오솜 주위에 감겨 있으며, 이는 개방 또는 진염색질(euchromatin)의 기본 구조를 형성한다. 압밀된 또는 헤테로염색질에서 이 스트링은 코일링되어 있고 닫힌 복잡한 구조로 고차 코일링(super coiling)되어 있다 (Herranz and Esteller, Methods Mol. Biol. (2007) 361: 25-62).
"뉴클레오솜"의 언급은 체액 샘플에서 검출시 "무세포 뉴클레오솜"을 지칭할 수 있다. 용어 무세포 뉴클레오솜은 본원 전반에 걸쳐 하나 이상의 뉴클레오솜을 포함하는 임의의 무세포 염색질 단편을 포함하도록 의도됨을 인지할 것이다.
무세포 뉴클레오솜은 이들의 구성요소에 결합함으로써 검출될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "이들의 구성요소"는 뉴클레오솜의 부분을 지칭하며, 즉, 전체 뉴클레오솜이 검출될 필요가 없다. 무세포 뉴클레오솜의 구성요소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 히스톤 단백질 (즉, 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 또는 H4), 히스톤 번역-후 변형, 히스톤 변이체 또는 이소형, 뉴클레오솜에 결합된 단백질 (즉, 뉴클레오솜-단백질 부가생성물), 뉴클레오솜과 관련된 DNA 단편 및/또는 뉴클레오솜과 관련된 변형된 뉴클레오티드. 예를 들어, 이들의 구성요소는 히스톤 (이소형) H3.1 또는 히스톤 H1 또는 DNA일 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 (무세포) 뉴클레오솜 자체의 수준을 측정할 수 있다. "뉴클레오솜 자체"의 언급은, 뉴클레오솜이 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 임의의 후성유전적 특징과 관계 없이, 샘플 중에 존재하는 총 뉴클레오솜 수준 또는 농도를 지칭한다. 총 뉴클레오솜 수준의 측정은 전형적으로, 히스톤 H4 등의 모든 뉴클레오솜에 공통적인 히스톤 단백질의 검출을 수반한다. 따라서, 뉴클레오솜 자체는 히스톤 H4 등의 코어 히스톤 단백질을 검출함으로써 측정될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 히스톤 단백질은 진핵 세포에서 DNA 패키징에 사용되는 뉴클레오솜으로서 공지된 구조 단위를 형성한다.
성인 인간에서의 정상 세포 턴오버(turnover)는 매일 엄청난 수의 세포 분열에 의한 생성 및 주로 아팝토시스(apoptosis)에 의한 유사한 수의 사멸을 수반한다. 아팝토시스의 과정 동안 염색질은 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜으로 분해되고, 이는 세포로부터 방출된다. 정상 조건 하에, 건강한 대상체에서 나타나는 순환 뉴클레오솜의 수준은 낮은 것으로 보고되어 있다. 많은 암, 자가-면역 질환, 염증성 병태, 뇌졸중 및 심근경색을 포함한 다양한 병태를 갖는 대상체에서는 상승된 수준이 나타난다 (Holdenreider & Stieber, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. (2009) 46(1): 1-24).
이전의 뉴클레오솜 ELISA 방법은, 통상적으로 아팝토시스를 검출하기 위한 방법으로서, 세포 배양에서 주로 사용되었지만 (Salgame et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25(3): 680-681; Holdenrieder et al. (2001) supra; van Nieuwenhuijze et al., Ann. Rheum. Dis. (2003) 62: 10-14), 이는 또한 혈청 및 혈장에서의 순환 무세포 뉴클레오솜의 측정에 사용된다 (Holdenrieder et al. (2001)). 죽어가는 세포에 의해 순환계로 방출되는 무세포 혈청 및 혈장 뉴클레오솜 수준은 잠재적인 바이오마커로서의 이들의 사용을 평가하기 위해 많은 상이한 암 연구에서 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
무세포 뉴클레오솜은 모노뉴클레오솜, 올리고뉴클레오솜, 보다 큰 염색질 단편의 구성성분 부분 또는 NET의 구성성분 부분 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜은 효소-결합 면역흡착 검정(Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay; ELISA)에 의해 검출될 수 있으며, 여러 방법이 보고되었다 (예: Salgame et al.(1997); Holdenrieder et al.(2001); van Nieuwenhuijze et al.(2003)). 이들 검정은 전형적으로 항-히스톤 (예를 들어 항-H2B, 항-H3 또는 항-H1, H2A, H2B, H3 및 H4)를 포획 항체로서, 또한 항-DNA 또는 항-H2A-H2B-DNA 복합체 항체를 검출 항체로서 사용한다.
순환 뉴클레오솜은 단백질-핵산 복합체의 동종 그룹이 아니다. 그보다는, 이들은 세포 사멸시 염색질의 소화로부터 유래되는 염색질 단편의 이종 그룹이고, 특정 히스톤 이소형 (또는 변이체), 번역-후 히스톤 변형, 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드, 및 단백질 부가생성물을 포함한 매우 다양한 후성유전적 구조를 포함한다. 뉴클레오솜 수준 상승은, 특정 히스톤 이소형 (또는 변이체)을 포함하는, 특정 번역-후 히스톤 변형을 포함하는, 특정 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 또한 특정 단백질 부가생성물을 포함하는, 특정 후성유전적 신호 포함 뉴클레오솜을 함유하는 일부 순환 뉴클레오솜 서브세트 상승과 관련될 것임이 당엄자에게 명백할 것이다. 이들 유형의 염색질 단편의 검정은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, WO 2005/019826, WO 2013/030579, WO 2013/030578, WO 2013/084002를 참조하며, 이들은 본원에 참조로 포함됨).
뉴클레오솜에 직접적으로 또는 간접적으로 부가되는 많은 단백질이 NET에서 나타난다. 이들 단백질은, 비-제한적으로, 미엘로퍼옥시다제 (MPO), 호중구 엘라스타제 (NE), 락토트랜스페린, 아주로시딘, 카텝신 G, 백혈구 프로테이나제 3, 리소자임 C, 호중구 데펜신 1, 호중구 데펜신 3, 골수 세포 핵 분화 항원, S100 칼슘-결합 단백질 A8, S100 칼슘-결합 단백질 A9, S100 칼슘-결합 단백질 A12, 액틴 β, 액틴 γ, 알파-액틴, 플라스틴-2, 시토케라틴-10, 카탈라제, 알파-에놀라제 및 트랜스케톨라제 (Urban et al., PLOS Pathogens. (2009) 10: e1000639)를 포함한다. NET에서 나타나는 임의의 뉴클레오솜-단백질 부가생성물은 본 발명의 방법에서 NET의 상승 수준의 검출을 위한 유용한 부가생성물이다. C-반응성 단백질 (CRP)은 또한 NET에서 뉴클레오솜에 부가될 수 있고, 따라서 뉴클레오솜-CRP 부가생성물은 본 발명의 방법에서 NET의 상승 수준의 검출을 위한 유용한 부가생성물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 사용되는 부가생성물은 MPO-뉴클레오솜 부가생성물 또는 NE-뉴클레오솜 부가생성물이다.
하나의 구현예에서, 무세포 뉴클레오솜의 구성요소는 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 바이오마커는 무세포 뉴클레오솜 자체 및/또는 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징의 수준일 수 있다. 용어 "후성유전적 신호 구조" 및 "후성유전적 특징"은 본원에서 상호교환가능하게 사용됨을 이해할 것이다. 이들은 검출될 수 있는 뉴클레오솜의 특정 특징을 지칭한다. 하나의 구현예에서, 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 번역-후 히스톤 변형, 히스톤 이소형, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오솜-단백질 부가생성물에서 뉴클레오솜에 결합된 단백질.
하나의 구현예에서, 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 하나 이상의 히스톤 변이체 또는 이소형을 포함한다. 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 히스톤 이소형, 예컨대 코어 뉴클레오솜의 히스톤 이소형, 특히 히스톤 H3 이소형일 수 있다. 용어 "히스톤 변이체" 및 "히스톤 이소형"은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 뉴클레오솜의 구조는 또한, 상이한 유전자 또는 스플라이스 생성물이고 상이한 아미노산 서열을 갖는 대안적 히스톤 이소형 또는 변이체의 포함에 의해 달라질 수 있다. 많은 히스톤 이소형이 당업계에 공지되어 있다. 히스톤 변이체는 많은 패밀리로 분류될 수 있고, 이들은 개개의 유형으로 세분된다. 다수의 히스톤 변이체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있고, 예를 들어 국립 인간 게놈 연구소 NHGRI 히스톤 데이터베이스(National Human Genome Research Institute NHGRI Histone Database) (Mari
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o-Ramirez et al. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011. 및 http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), GenBank (NIH 유전자 서열) 데이터베이스, EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 및 일본의 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)에서 공개적으로 이용가능하다. 예를 들어, 히스톤 H2의 변이체는 H2A1, H2A2, mH2A1, mH2A2, H2AX 및 H2AZ를 포함한다. 또 다른 예에서, H3의 히스톤 이소형은 H3.1, H3.2, H3.3 및 H3t를 포함한다.
하나의 구현예에서, 히스톤 이소형은 H3.1이다.
뉴클레오솜의 구조는 히스톤 단백질의 번역-후 변형 (PTM)에 의해 달라질 수 있다. 히스톤 단백질의 PTM은 전형적으로 코어 히스톤의 테일 상에서 나타나고, 통상적 변형은 리신 잔기의 아세틸화, 메틸화 또는 유비퀴틴화 뿐만 아니라 아르기닌 잔기의 메틸화 또는 시트룰린화 및 세린 잔기의 인산화 및 많은 다른 것들을 포함한다. 많은 히스톤 변형이 당업계에 공지되어 있고, 새로운 변형이 식별됨에 따라 그 수가 증가하고 있다 (Zhao and Garcia (2015) Cold Spring Harb Perspect Biol, 7: a025064). 따라서, 하나의 구현예에서, 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 히스톤 번역-후 변형 (PTM)일 수 있다. 히스톤 PTM은 코어 뉴클레오솜, 예를 들어 H3, H2A, H2B 또는 H4, 특히 H3, H2A 또는 H2B의 히스톤 PTM일 수 있다. 특히, 히스톤 PTM은 히스톤 H3 PTM이다. 이러한 PTM의 예가 WO 2005/019826에 기재되어 있다.
예를 들어, 번역-후 변형은 아세틸화, 모노-, 디- 또는 트리-메틸화일 수 있는 메틸화, 인산화, 리보실화, 시트룰린화, 유비퀴틴화, 히드록실화, 글리코실화, 니트로실화, 글루타민화 및/또는 이성질체화일 수 있다 (하기 참조: Ausio (2001) Biochem Cell Bio 79: 693). 하나의 구현예에서, 히스톤 PTM은 시트룰린화 또는 리보실화로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 히스톤 PTM은 H3 시트룰린 (H3cit) 또는 H4 시트룰린 (H4cit)이다. 또한 추가의 구현예에서, 히스톤 PTM은 H3cit이다.
하나의 구현예에서, 히스톤 PTM은 리보실화이고, 이는 또한 ADP-리보실화로서 언급된다. 대식세포에서 염증 반응 마커의 프로모터를 차지하는 뉴클레오솜의 번역-후 히스톤 ADP-리보실화는 상승된 전사로 이어지는 지질다당류에 대한 노출에 의해 자극되고, 이는 항바이러스 특성을 가질 수 있다. 또한, 코로나바이러스 패밀리의 모든 구성원은 단백질 표적으로부터 공유 부착된 ADP-리보스의 효소적 제거에 의해 번역-후 ADP-리보실화를 조절하는 비-구조적 단백질 3 (nsp3) 내의 고도로 보존된 거대도메인을 함유한다. 감소된 nsp3 탈-ADP-리보실화 활성을 갖는 돌연변이된 거대도메인을 함유하는 재조합 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV) 균주는 덜 감염성이고 조기에 향상된 인터페론 (IFN), 인터페론-자극 유전자 (ISG), 및 전-염증성 시토카인 반응을 유발한다. 따라서, 대식세포로부터 방출된 순환 ADP-리보실화 뉴클레오솜의 변경된 수준이 본 발명의 방법에서 유용할 것으로 예상된다.
(단일 변형보다는) 관련 히스톤 번역-후 변형의 그룹 또는 부류가 또한 검출될 수 있다. 전형적 예는, 비-제한적으로, 뉴클레오솜에 결합하도록 지시된 하나의 항체 또는 다른 선택적 결합제 및 해당 히스톤 변형의 그룹에 결합하도록 지시된 하나의 항체 또는 다른 선택적 결합제를 이용하는 2-부위 면역검정을 수반한다. 히스톤 변형의 그룹에 결합하도록 지시된 이러한 항체의 예는, 예시적 목적으로, 비-제한적으로, 항-pan-아세틸화 항체 (예: Pan-아세틸 H4 항체 [H4panAc]), 항-시트룰린화 항체 또는 항-유비퀴틴 항체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 하나 이상의 DNA 변형을 포함한다. 뉴클레오솜 히스톤 이소형 및 PTM 조성물에 의해 매개되는 후성유전적 신호화에 추가로, 뉴클레오솜은 또한 그의 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드 조성물에서 상이하다. 일부 뉴클레오솜은 다른 뉴클레오솜보다 더 많은 5-메틸시토신 잔기 (또는 5-히드록시메틸시토신 잔기 또는 다른 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, DNA 변형은 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 하나 이상의 단백질-뉴클레오솜 부가생성물 또는 복합체를 포함한다. 순환 뉴클레오솜 서브세트의 추가의 유형은 뉴클레오솜 단백질 부가생성물이다. 염색질은 그의 구성성분 DNA 및/또는 히스톤에 결합된 다수의 비-히스톤 단백질을 포함함이 수년 동안 공지되어 왔다. 이들 염색질 관련 단백질은 폭넓게 다양한 유형을 갖고, 전사 인자, 전사 향상 인자, 전사 저지 인자, 히스톤 변형 효소, DNA 손상 복구 단백질 등을 포함한 다양한 기능을 갖는다. 뉴클레오솜 및 다른 비-히스톤 염색질 단백질 또는 DNA를 포함한 이들 염색질 단편 및 다른 비-히스톤 염색질 단백질은 당업계에서 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 뉴클레오솜에 부가되는 단백질 (또한 그에 따라 이는 바이오마커로서 사용될 수 있음)은 하기로부터 선택된다: 전사 인자, 고 이동성 그룹 단백질 또는 염색질 변형 효소. "전사 인자"의 언급은, DNA에 결합하고 전사를 촉진 (즉, 활성화제) 또는 저지 (즉, 저지제)함으로써 유전자 발현을 조절하는 단백질을 지칭한다. 전사 인자는, 그들이 조절하는 유전자에 인접한 DNA의 특정 서열에 부착하는 하나 이상의 DNA-결합 도메인 (DBD)을 함유한다. 본원에 기재된 순환 뉴클레오솜 및 뉴클레오솜 모이어티, 유형 또는 하위그룹 모두가 본 발명에서 유용할 수 있다.
무세포 뉴클레오솜의 하나 초과의 후성유전적 특징이 본 발명의 방법 및 사용에서 검출될 수 있음이 이해될 것이다. 다중 바이오마커가 조합 바이오마커로서 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 사용은 조합된 바이오마커로서의 무세포 뉴클레오솜의 하나 초과의 후성유전적 특징을 포함한다. 후성유전적 특징은 동일한 유형 (예: PTM, 히스톤 이소형, 뉴클레오티드 또는 단백질 부가생성물) 또는 상이한 유형 (예: 히스톤 이소형과 조합된 PTM)일 수 있다. 예를 들어, 번역-후 히스톤 변형 및 히스톤 변이체가 검출될 수 있다 (즉, 하나 초과의 유형의 후성유전적 특징이 검출됨). 대안적으로, 또는 추가로, 하나 초과의 유형의 번역-후 히스톤 변형이 검출되거나, 또는 하나 초과의 유형의 히스톤 이소형이 검출된다. 하나의 양태에서, 사용은, 감염의 진단, 검출, 치료 선택, 예견 또는 모니터링을 위해, 샘플 중의 조합된 바이오마커로서 번역-후 히스톤 변형 및 히스톤 이소형을 포함한다. 하나의 구현예에서, 조합된 바이오마커는 H3.1 및 H3cit이다. 대안적 구현예에서, 조합된 바이오마커는 H3.1 및 H4cit이다.
용어 "바이오마커"는 과정, 이벤트, 또는 상태에 대한 독특한 생물학적 또는 생물학적으로 유래된 지표를 의미한다. 바이오마커는 진단, 예를 들어 임상적 스크리닝, 및 예후 평가의 방법에서, 또한 치료법의 결과 모니터링, 특정 치료적 처리에 대해 가장 잘 반응할 가능성이 있는 환자의 식별, 약물 스크리닝 및 개발에서 사용될 수 있다. 바이오마커 및 그의 사용은 새로운 약물 치료의 식별 및 약물 치료를 위한 새로운 표적의 발견을 위해 가치가 있다.
바이오마커는 또한 특정 치료법에 의한 치료에 적합한 환자를 선택하기 위한 동반 진단 생성물로서 유용하다. 본 발명자들은, 순환 뉴클레오솜 수준, 또는 특정 후성유전적 신호 또는 구조를 함유하는 뉴클레오솜 수준의 시험이 NET 또는 NETosis 관련 질환의 치료법에 대한 유용한 동반 생성물임을 입증하였다.
본 발명의 방법은 유해한 결과의 위험을 갖는 환자를 지정하는 것에 관한 것이다. 유해한 결과는 사망 및/또는 즉각적인 의학적 관리, 예를 들어, 입원 (즉, 병원 치료) 및/또는 수술을 필요로 하는 급성 이벤트를 포함한다. 많은 환자의 경우, 감염은 의학적 개입을 필요로 하지 않으면서 그들 자체의 면역 시스템에 의해 극복된다. 그러나, 다수의 환자에서, 감염은 면역 시스템에 의해 극복되지 않으면서 진행되거나 중증도가 증가할 수 있거나, 또는 감염에 대한 환자 자신의 면역 반응이 유해한 결과로 이어질 수 있다. 예를 들어, 유해한 결과는 급성 관상 동맥 또는 심장 이벤트 (예컨대 심근경색 및/또는 뇌졸중), 급성 다기관 또는 단일-기관 부전 (예컨대 신부전, 간부전 및/또는 심부전), 약화 급성 병태 및/또는 급성 호흡기 병태 (예컨대 폐렴, 호흡곤란/호흡완만, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 세기관지염 및/또는 기관지염)의 개시를 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 급성 호흡기 병태의 발병 위험을 갖는 환자 또는 대상체를 지정한다. 추가의 구현예에서, 급성 호흡기 병태는 폐렴이다. 추가의 구현예에서, 급성 호흡기 병태는 호흡저하/호흡완만이다. 또한 추가의 구현예에서, 급성 호흡기 병태는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및/또는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)이다.
유해한 결과의 위험을 갖는 환자의 지정은 근기간 또는 단기간 위험을 지정할 수 있거나 중기간 위험을 지정할 수 있다. 근기간 또는 단기간 위험은, 환자가 증상의 제시 또는 양성 진단 30일 내, 예컨대 2주 또는 14일 내, 1주 또는 7일 내 또는 5일 또는 그 미만 내에 유해한 결과를 발병시킬 수 있는 것을 포함한다. 이러한 근기간 또는 단기간 위험은 또한, 환자가 본원에 기재된 방법의 수행 30일 내, 예컨대 2주 또는 14일 내, 1주 또는 7일 내 또는 5일 또는 그 미만 내에 유해한 결과를 발병시킬 수 있는 것을 포함한다. 단기간 위험의 일례는 병원 치료를 필요로 하는 COVID 감염에 대한 NET 관련 합병증의 발병을 포함한다. 중기간 위험은, 환자가 증상의 제시, 양성 진단 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 방법의 수행 30일 초과 후에 유해한 결과를 발병시킬 수 있는 것을 포함한다. 중기간 위험의 일례는, COVID 감염의 영향이 수개월 동안 계속될 수 있는 소위 장기-COVID의 발병을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 증상의 제시 또는 양성 진단 2주, 또는 14일 내에 유해한 결과를 발병시킬 위험을 갖는 환자 또는 대상체를 지정한다. 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 증상의 제시 또는 양성 진단 1주, 또는 7일 내에 유해한 결과를 발병시킬 위험을 지정한다. 또한 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 증상의 제시 또는 양성 진단 5일 내에 유해한 결과를 발병시킬 위험을 지정한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서는,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 대상체가 치료를 위해 병원에 입원해야 하는지를 결정하는 단계
를 포함하는, 병원 치료를 필요로 하는 감염을 갖는 대상체를 식별하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 또한 병원 치료를 필요로 하지 않는 환자를 식별하기 위해 사용될 수 있고, 즉, 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 대상체가 치료를 위해 병원에 입원해야 하지 않는지를 결정함이 이해될 것이다. 본 발명의 이러한 방식은 이미 병원에 입원한 경우 조기 퇴원할 수 있는 환자를 식별하는 데 도움이 될 것이다.
본원에 기재된 방법 및 사용은 체액 샘플, 특히 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에서 시험될 수 있다. 바람직하게는, 혈장 샘플이 사용된다. 혈장 샘플은 하나 이상의 항응고제, 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 헤파린, 또는 시트르산나트륨, 특히 EDTA를 함유하는 수집 튜브에서 수집될 수 있다.
감염
본 발명의 방법은 특히 감염성 발생을 관리하는 데 사용된다. 감염은 상이한 병원체 및 환경 인자에 의해 유발될 수 있다. 하나의 구현예에서, 감염은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 미생물 감염이다. 박테리아 감염은 마이코박테리아, 폐렴구균 및 인플루엔자 감염, 예컨대 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 대장균(Escherichia coli), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의해 유발되는 감염 (예: 폐렴)을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 감염은 바이러스 감염이다. 바이러스 감염은 호흡기 융합체 바이러스 (RSV), A형 인플루엔자, B형 인플루엔자 및 코로나바이러스 (예: COVID-19)에 의해 유발되는 감염을 포함할 수 있다.
감염은 질환에 의해 영향 받은 조직에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, 질환은 심장, 뇌, 신장, 간, 췌장, 폐 및/또는 혈액에 영향을 줄 수 있고, 감염은 이러한 조직 또는 장기에 통상적으로 영향을 주는 것으로 공지된 박테리아, 바이러스, 진균 또는 미생물 감염일 수 있다. 하나의 구현예에서, 감염은 기도 감염이다. 이 구현예에 따라, 감염은 폐, 상기도 및/또는 하기도에 영향을 준다.
질환에 의해 영향 받을 수 있는 다른 조직은 팔다리, 손 및 발과 같은 말초 조직을 포함하고, 감염은 박테리아 감염 (예: 괴저)일 수 있다. 하나의 구현예에서, 감염 및/또는 질환은 다수의 조직 또는 장기에 동시에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 감염은 팔다리, 손 또는 발의 박테리아 감염일 수 있고, 질환은 또한 혈액에 영향을 줄 수 있다 (예: 패혈증). 하나의 구현예에서, 감염은 패혈증이다. 또 다른 예에서, 질환은 심장 또는 관상 동맥 부전일 수 있고, 질환에 의해 영향 받는 다른 조직 또는 장기는 신장 및 신장 시스템 및/또는 뇌를 포함할 수 있다 (예: 뇌졸중). 또한 추가의 예에서, 질환은 폐에 영향을 줄 수 있거나, 또는 감염은 기도 감염일 수 있고, 영향 받는 다른 조직 또는 장기는 심장, 관상 동맥 시스템 및/또는 뇌를 포함할 수 있다 (예: 심부전, 심근경색 및/또는 뇌졸중).
하나의 구현예에서는, 감염을 앓고 있는 대상체로부터 채취된 샘플에서 순환 뉴클레오솜 수준을 측정하여 질환의 예후를 결정한다. 또 다른 구현예에서는, 감염을 앓고 있는 대상체로부터 간격을 두고 채취된 다수의 샘플에서 순환 뉴클레오솜 수준을 측정하여 질환의 진행을 모니터링하고/거나 치료의 효능을 평가한다.
추가의 구현예에서는, 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 대상체로부터 채취된 샘플에서 순환 뉴클레오솜 수준을 측정하여, 특히 질환의 예후를 평가한다. 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 대상체로부터 간격을 두고 채취된 다수의 샘플에 대한 추가의 측정을 수행하여 질환의 진행을 모니터링하고/거나 치료의 효능을 평가할 수 있다.
하나의 구현예에서, 기도 감염은 하기로부터 선택된다: 인플루엔자, 폐렴 및 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS). SARS는 SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV)에 의해 유발되는 호흡기 감염이고, 다른 관련 코로나바이러스가 공지되어 있다 (예: COVID-19 (또한 SARS-CoV-2로서, 또한 이전에는 2019-nCoV로서 공지됨)). 이는 발열 감기-유사 증상, 기침 및 혼수를 유발하는 것으로 공지되어 있고, 폐렴 (예: 직접 바이러스성 폐렴 또는 2차 세균성 폐렴)으로 이어질 수 있다.
COVID-19의 출현 및 팬데믹 상태로의 급속한 진행은 국제 의료 서비스에 심각한 부담을 준다. 감염성은 전국 인구의 70~80%에 이를 것으로 예측된다. 대부분의 사람들은 경증을 경험하지만, 감염된 사람들의 두 자릿수 백분율이 심각하게 영향 받는 것으로 보인다.
중증 반응 또는 폐렴을 포함한 합병증의 높은 위험에 있는 COVID-19 양성 개체를 식별하는 것은, 집단 면역이 확립될 때까지 중증 치료 병상 및 인공호흡기를 포함한 강화된 의료 자원의 분류를 허용하고 배분을 촉진하여, 향후 광범위한 발병으로부터 커뮤니티를 보호할 것이다. 따라서, 바람직한 구현예에서,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 대상체가 의학적 치료를 필요로 하는지를 결정하는 단계
를 포함하는, 의학적 치료를 필요로 하는 인플루엔자 또는 코로나바이러스 감염으로 감염된 대상체를 식별하는 방법이 제공된다.
진단 및 모니터링 방법
추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 대상체로부터 얻은 체액 중의 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계;
(iii) 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준에서의 임의의 변화를 사용하여 대상체에서의 감염의 진행을 모니터링하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 감염의 중증도를 모니터링하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 상기 대상체로부터 채취된 보다 조기의 샘플과 비교하여 감염의 진행을 모니터링하는 단계
를 포함하는, 감염이 있거나 감염이 있을 것으로 의심되는, 또는 감염에 대한 나쁜 예후의 성향이 있는 대상체에서 감염의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 단계 (i)을 1회 이상 반복하는 단계; 및
(iii) 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준에서의 임의의 변화를 사용하여 대상체에서의 감염의 진행을 모니터링하는 단계
를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다.
대상체가 감염을 갖지 않는 것으로 또는 경증 감염을 갖는 것으로 결정되는 경우, 본 발명은 또한 의학적 합병증의 추가 발병에 대한 질환 진행을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법이 경증 감염을 갖는 것으로 결정된 대상체로부터의 샘플을 포함하는 경우, 바이오마커 수준이 변화되었는지를 확립하기 위해 바이오마커 수준 측정을 또 다른 시점에 반복할 수 있다.
검출 및/또는 정량화는, 직접적으로 정제된 또는 풍부화된 뉴클레오솜 샘플에 대해, 또는 간접적으로 그로부터의 추출물에 대해, 또는 그의 희석액에 대해 수행될 수 있다. 샘플 중에 존재하는 바이오마커의 양의 정량화는 샘플 중에 존재하는 바이오마커의 농도 결정을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 본 발명에 따른 검출, 모니터링 및 진단의 사용 및 방법은, 질환의 존재를 확인하거나, 개시 및 진행을 평가함으로써 질환의 발병을 모니터링하거나, 또는 질환의 개량 또는 퇴행을 평가하기에 유용하다. 검출, 모니터링 및 진단의 사용 및 방법은 또한 임상적 스크리닝의 평가, 예후, 치료법의 선택, 치료적 이익의 평가, 즉, 약물 스크리닝 및 약물 개발을 위한 방법에서 유용하다.
하나의 구현예에서, 질환은 높은 수준의 NET 또는 NETosis를 갖는 병리학적 임상적 합병증을 수반하는 병태이다.
검출 또는 측정은 면역검정, 면역화학, 질량 분광법, 크로마토그래피, 염색질 면역침전 또는 바이오센서 방법을 포함할 수 있다. 특히, 검출 및/또는 측정은 뉴클레오솜 모이어티에 대한 2-부위 면역검정 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 2개의 항-뉴클레오솜 결합제 또는 항-히스톤 변형 또는 항-히스톤 변이체 또는 항-DNA 변형 또는 항-부가 단백질 검출 결합제와 조합된 항-뉴클레오솜 결합제를 사용하는 계내 뉴클레오솜 도입 후성유전적 특징 또는 뉴클레오솜의 측정을 위해 바람직하다. 또한, 검출 및/또는 측정은, 예를 들어 라벨링된 또는 부동화된: 항-뉴클레오솜, 항-히스톤 변형, 항-히스톤 변이체/이소형, 항-DNA 변형 또는 항-부가 단백질 결합제의 조합을 사용하는, 2-부위 면역검정을 포함할 수 있다.
본원에서 본 발명자들은, 히스톤 H3.1 단백질의 아미노산 30-33 주위의 에피토프에 결합하여 클리핑된 및 비-클리핑된 뉴클레오솜을 포획하도록 지시된 부동화된 항-히스톤 H3.1 항체를, 온전한(intact) 뉴클레오솜 중에 존재하지만 단리된 (유리) 히스톤 또는 DNA 뉴클레오솜 구성요소 상에는 존재하지 않는 에피토프에 결합하도록 지시된 라벨링된 항-뉴클레오솜 항체와 함께 사용하는 H3.1-뉴클레오솜에 대한 2-부위 면역검정을 사용하였다. 이러한 유형의 에피토프는, 이것이 표적 뉴클레오솜의 네이티브 3차원 구성이 온전할 것을 요구하기 때문에, 본원에서 "형태적 뉴클레오솜 에피토프"로서 언급될 수 있다.
본원에 기재된 H3R8Cit 뉴클레오솜 측정은, 히스톤 H3의 아르기닌 8에서 시트룰린화된 뉴클레오솜에 결합하도록 지시된 부동화된 항체를, 형태적 뉴클레오솜 에피토프에 결합하도록 지시된 동일한 라벨링된 항-뉴클레오솜 항체와 함께 사용하는 2-부위 면역검정을 사용하여 수행되었다.
하나의 구현예에서, 검출 또는 측정 방법은, 체액 샘플을 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소를 검출하는 결합제를 포함하는 고체 상과 접촉시키고, 상기 결합제에 대한 결합을 검출하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 검출 또는 측정 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 샘플을 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 제1 결합제에 의해 결합된 샘플을 무세포 뉴클레오솜에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 샘플에서 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량화하는 단계.
또 다른 구현예에서, 검출 또는 측정 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 샘플을 무세포 뉴클레오솜에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 제1 결합제에 의해 결합된 샘플을 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 샘플에서 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량화하는 단계.
바이오마커(들)의 수준의 검출 또는 측정은 하나 이상의 시약, 예컨대 적합한 결합제를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 결합제는 요망되는 바이오마커, 예를 들어 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소 부분, 뉴클레오솜의 후성유전적 특징, 뉴클레오솜의 구조/형상 모방체 또는 그의 구성요소 부분에 대해 특이적인 리간드 또는 결합제를, 임의로 하나 이상의 인터류킨과 조합하여 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체", "결합제" 또는 "리간드"는, 제한적인 것이 아니라, 특정 분자 또는 엔티티(entity)에 결합할 수 있는 임의의 결합제를 포함하도록 의도됨이, 또한 임의의 적합한 결합제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 용어 "뉴클레오솜"은 모노뉴클레오솜, 올리고뉴클레오솜, NET 및 유체 매질 중에서 분석될 수 있는 임의의 단백질-DNA 염색질 단편을 포함하도록 의도됨이 명백할 것이다.
바이오마커의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있다. 시약은, 요망되는 표적에 대한 특이적 결합이 가능한 하나 이상의 리간드 또는 결합제, 예를 들어, 자연 발생 또는 화학 합성 화합물을 포함할 수 있다. 리간드 또는 결합제는, 요망되는 표적에 대한 특이적 결합이 가능한 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 또는 합성 리간드, 예컨대 플라스틱 항체, 또는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 항체는 모노클로날 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, (본 발명에 따라) 바이오마커가 검출될 수 있도록 이는 바이오마커에 결합하는 능력을 보유함을 이해할 것이다. 리간드/결합제는 검출가능한 마커, 예컨대 발광, 형광, 효소 또는 방사성 마커로 라벨링될 수 있고; 대안적으로 또는 추가로 본 발명에 따른 리간드는 친화성 택, 예를 들어 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 His (예: 헥사-His) 택으로 라벨링될 수 있다. 대안적으로, 리간드 결합은 무라벨 기술, 예를 들어 ForteBio Inc.의 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "검출" 또는 "진단"은 질환 상태의 식별, 확인, 및/또는 특성화를 포함한다. 본 발명에 따른 검출, 모니터링 및 진단 방법은 질환의 존재를 확인하거나, 개시 및 진행을 평가함으로써 질환의 발병을 모니터링하거나, 또는 질환의 개량 또는 퇴행을 평가하기에 유용하다. 검출, 모니터링 및 진단 방법은 또한 임상적 스크리닝의 평가, 예후, 치료법의 선택, 치료적 이익의 평가, 즉, 약물 스크리닝 및 약물 개발을 위한 방법에서 유용하다.
본 발명의 방법은 마커 수준의 정규화를 수반할 수 있다. 예를 들어, 특정 후성유전적 특징을 함유하는 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 그 특징을 함유하는 뉴클레오솜의 비율로서 수준을 나타내도록 뉴클레오솜 자체 (또는 일부 다른 유형의 뉴클레오솜 또는 파라미터)의 수준에 대하여 정규화할 수 있다. 예를 들어, 시트룰린화된 뉴클레오솜의 비율로서 시트룰린화된 뉴클레오솜의 수준을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 다수회 반복된다. 이 구현예는 검출 결과가 일정 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있게 하는 이점을 제공한다. 이러한 배열은 질환 상태의 치료 효능을 모니터링하거나 평가하는 이익을 제공할 것이다. 본 발명의 이러한 모니터링 방법은 개시, 진행, 안정화, 개량, 재발 및/또는 차도를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
모니터링 방법에서, 시험 샘플은 2회 이상 채취될 수 있다. 방법은 시험 샘플 중에 존재하는 바이오마커(들)의 수준을 하나 이상의 대조군(들)과 및/또는 보다 조기에, 예를 들어 치료법의 시작 전에 동일한 시험 대상체로부터, 및/또는 치료법의 보다 조기 단계에 동일한 시험 대상체로부터 채취된 하나 이상의 이전 시험 샘플(들)과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 상이한 때에 채취된 시험 샘플 중의 바이오마커(들)의 성질 또는 양의 변화를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
동일한 시험 대상체로부터 보다 조기에 채취된 이전 시험 샘플 중의 수준에 대한 시험 샘플 중의 바이오마커의 수준의 변화는 장애 또는 의심 장애에 대한 상기 치료법의 유익한 효과, 예를 들어, 안정화 또는 개선을 나타낼 수 있다. 또한, 치료가 완료되면, 본 발명의 방법을 주기적으로 반복하여 질환의 재발을 모니터링할 수 있다.
치료법의 효능을 모니터링하는 방법을 사용하여 인간 대상체 및 비-인간 동물 (예: 동물 모델)에서의 기존 치료법 및 새로운 치료법의 치료적 효과를 모니터링할 수 있다. 이들 모니터링 방법은 새로운 약물 물질 및 물질의 조합에 대한 스크린에 도입될 수 있다.
추가의 구현예에서는, 신속 작용 치료법으로 인한 보다 빠른 변화의 모니터링이 수시간 또는 수일의 보다 짧은 간격으로 수행될 수 있다.
진단 또는 모니터링 키트 (또는 패널)가 본 발명의 방법의 수행을 위해 제공된다. 이러한 키트는 본 발명에 따른 바이오마커의 검출 및/또는 정량화를 위한 하나 이상의 리간드, 및/또는 바이오센서, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 어레이를, 임의로 키트의 사용을 위한 지시와 함께 적합하게 포함할 것이다.
본 발명의 추가의 양태는, 본원에 정의된 바와 같은 바이오마커 중 하나 이상을 검출하고/거나 정량화할 수 있는 바이오센서를 포함하는, 감염의 존재를 검출하기 위한 키트이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이오센서"는 바이오마커의 존재를 검출할 수 있는 임의의 것을 의미한다. 바이오센서의 예는 본원에 기재되어 있다. 바이오센서는, 바이오마커에 대한 특이적 결합이 가능한, 본원에 기재된 바와 같은 리간드 결합제 또는 리간드를 포함할 수 있다. 이러한 바이오센서는 본 발명의 바이오마커를 검출하고/거나 정량화하기에 유용하다.
적합하게, 하나 이상의 바이오마커의 검출을 위한 바이오센서는, 생분자 인식을, 샘플 중의 바이오마커의 존재, 또는 정량화의 검출을 신호로 전환하는 적절한 수단과 조합한다. 바이오센서는, 예를 들어, 병동, 외부대상체의 부문, 수술실, 가정, 현장 및 직장에서, "대체 부위" 진단 시험에 대해 적합화될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 바이오마커를 검출하기 위한 바이오센서는 음향, 플라즈몬 공명, 홀로그래픽, 바이오층 간섭계 (BLI) 및 미세공학 센서를 포함한다. 각인된 인식 요소, 박막 트랜지스터 기술, 자기 음향 공진기 장치 및 다른 신규한 음향-전기 시스템이 하나 이상의 바이오마커의 검출을 위한 바이오센서에 사용될 수 있다.
질환의 존재를 검출하기 위한 바이오마커는 장애의 진행을 지체시키거나 멈추게 하는 신규한 표적 및 약물 분자의 발견을 위한 필수적 표적이다. 바이오마커의 수준이 장애 및 약물 반응을 나타냄에 따라, 바이오마커는 시험관내 및/또는 생체내 검정에서 신규한 치료적 화합물의 식별을 위해 유용하다. 본원에 기재된 바이오마커는 바이오마커의 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태에서, 바이오마커의 생성을 촉진 및/또는 저지할 수 있는 물질을 식별하기 위한, 본 발명에 따른 바이오센서, 또는 어레이, 또는 키트의 용도; 또는 본 발명에 따른 바이오마커로 지시되는 펩티드, 항체 또는 그의 단편 또는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있는, 기재된 바와 같은 결합제 또는 리간드의 용도가 제공된다.
본원에 기재된 면역검정은 본원에서 정의된 바이오마커에 결합하도록 지시된 하나 이상의 항체 또는 다른 특이적 결합제를 사용하는 임의의 방법을 포함한다. 면역검정은 효소 검출 방법 (예를 들어 ELISA)을 사용하는 2-부위 면역검정 또는 면역계측 검정, 형광 라벨링 면역계측 검정, 시간-분해 형광 라벨링 면역계측 검정, 화학발광 면역계측 검정, 면역탁도계측 검정, 미립자 라벨링 면역계측 검정 및 면역방사계측 검정 뿐만 아니라 단일-부위 면역검정, 시약 제한 면역검정, 방사성, 효소, 형광, 시간-분해 형광 및 미립자 라벨을 포함한 다양한 라벨 유형을 사용한 라벨링된 항원 및 라벨링된 항체 단일 항체 면역검정 방법을 포함한 경쟁 면역검정 방법을 포함한다. 상기 면역검정 방법 모두 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Salgame et al. (1997) 및 van Nieuwenhuijze et al. (2003).
식별, 검출 및/또는 정량화는 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플의 정제 또는 추출물 또는 그의 희석액 중의 특정 단백질의 존재 및/또는 양을 식별하기에 적합한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 특히, 정량화는 샘플 또는 샘플들 중의 표적의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서 시험될 수 있는 생물학적 샘플은 상기에서 정의된 바와 같은 것들을 포함한다. 샘플은 제조되고, 예를 들어 적절한 경우 희석 또는 농축되고, 통상적 방식으로 저장될 수 있다. 본 발명은 대상체로부터 얻어질 수 있는 혈장 샘플에서의 특정 용도를 갖는다.
바이오마커의 식별, 검출 및/또는 정량화는 바이오마커 또는 그의 단편, 예를 들어 C-말단 절단을 갖는, 또는 N-말단 절단을 갖는 단편의 검출에 의해 수행될 수 있다. 단편은 적합하게는 4개 초과의 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 길이를 갖는다. 히스톤 테일의 것과 동일한 또는 그에 관련된 서열의 펩티드가 히스톤 단백질의 특히 유용한 단편임을 특히 인지한다.
예를 들어, 검출 및/또는 정량화는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법(들)에 의해 수행될 수 있다: 면역검정, 면역크로마토그래피, SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), 1-D 겔-기반 분석, 2-D 겔-기반 분석, 질량 분광계측 (MS), 역상 (RP) LC, 크기 침투 (겔 여과), 이온 교환, 친화도, HPLC, UPLC 및 다른 LC 또는 LC MS-기반 기술. 적절한 LC MS 기술은 ICAT® (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주), 또는 iTRAQ® (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주)을 포함한다. 액체 크로마토그래피 (예: 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 저압 액체 크로마토그래피 (LPLC)), 박층 크로마토그래피, NMR (핵 자기 공명) 분광법이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 바이오마커의 검출 및/또는 정량화를 수반하는 방법은 벤치-탑 기기 상에서 수행될 수 있거나, 예를 들어 비-실험실 환경, 예를 들어 의사의 사무실에서 또는 대상체의 침대 옆에서 사용될 수 있는 일회용, 진단 또는 모니터링 플랫폼 상으로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하기 위해 적합한 바이오센서는 광학 또는 음향 판독기를 갖는 "신용" 카드를 포함한다. 바이오센서는 수집된 데이터가 해석을 위해 의사에게 전자적으로 전송되는 것을 가능하게 하도록 구성될 수 있고, 그에 따라 전자의료에 대한 기반을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 바이오마커의 측정을 위한 근거리 환자 또는 현장 진료 면역검정 방법의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 근거리 환자 면역검정 방법은 현장 진료 면역검정 기기 (예: Abbott i-STAT 또는 LightDeck Diagnostics 현장 진료 면역검정 기기)를 포함한다. 하나의 구현예에서, 근거리 환자 면역검정 방법은 측방 유동 시험을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 바이오마커는 뉴클레오솜 또는 후성유전적 특징을 함유하는 뉴클레오솜이다.
질환 상태에 대한 바이오마커의 식별은 진단 절차 및 치료 체제의 통합을 가능하게 한다. 바이오마커는 치료적 반응, 반응 실패, 불리한 부작용 프로파일, 의약 순응도 및 적절한 혈청 약물 수준의 달성을 나타내는 수단을 제공한다. 바이오마커를 사용하여 불리한 약물 반응의 경고를 제공할 수 있다. 바이오마커는, 반응의 평가가 투여량을 미세-조율하고, 처방 의약의 수를 최소화하고, 효과적 치료법 달성에서의 지연을 감소시키고, 불리한 약물 반응을 피하기 위해 사용될 수 있음에 따라, 개인맞춤형 치료법의 개발에서 유용하다. 그에 따라, 본 발명의 바이오마커를 모니터링함으로써, 대상체 관리가 대상체의 약리학적 프로파일 및 장애에 의해 결정된 필요에 정확히 매칭되도록 맞춤화될 수 있고, 그에 따라 바이오마커를 사용하여 최적 용량을 적정하고, 긍정적 치료 반응을 예측하고, 심각한 부작용의 높은 위험에 있는 대상체를 식별할 수 있다.
바이오마커-기반 시험은 '새로운' 대상체의 제1 라인 평가를 제공하고, 현재 측정을 사용하여 달성가능하기 않은, 정확하고 빠른 진단에 대한 객관적인 측정을 제공한다.
바이오마커 모니터링 방법, 바이오센서, 현장 진료 시험, 측방 유동 시험 및 키트는 또한, 재발이 장애의 악화에 기인하는 것인지의 여부를 의사가 결정할 수 있도록 하는 대상체 모니터링 도구로서 중요하다. 약리학적 치료가 부적절한 것으로 평가되는 경우, 치료법을 재개하거나 증가시킬 수 있고; 적절한 경우 치료법 변화가 제공될 수 있다. 바이오마커가 장애의 상태에 민감함에 따라, 이들은 약물 치료법의 영향의 지시를 제공한다.
"대상체" 또는 "환자"의 언급은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 대상체는 인간 또는 동물 대상체일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 대상체는 (비-인간) 동물이다. 본원에 기재된 패널 및 방법은 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
검출 및/또는 정량화는 컷-오프 수준과 비교될 수 있다. 컷-오프 값은, 다수의 환자 및 대조군으로부터의 결과를 분석하고, 질환을 갖는 또는 갖지 않는 것으로 대상체를 분류하기에 적합한 값을 결정함으로써 미리 결정될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커의 수준이 질환을 앓고 있는 환자에서 더 높은 질환의 경우, 검출된 수준이 컷-오프보다 더 높다면, 환자는 질환을 앓고 있는 것으로 나타난다. 대안적으로, 바이오마커의 수준이 질환을 앓고 있는 환자에서 더 낮은 질환의 경우, 검출된 수준이 컷-오프보다 더 낮다면, 환자는 질환을 앓고 있는 것으로 나타난다. 단순한 컷-오프 값을 사용하는 것의 이점은 임상의가 시험을 이해할 수 있는 용이성 및 시험 결과의 해석에서의 소프트웨어 또는 다른 보조물에 대한 임의의 필요성의 제거를 포함한다. 컷-오프 수준은 당업계에서의 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
검출 및/또는 정량화는 또한 대조군과 비교될 수 있다. 대조군 대상체는, 예를 들어, 질환을 갖지 않는 것으로 알려진 대상체를 포함할 수 있거나 (예를 들어, 감별 진단의 조사에 대하여) 상이한 질환을 갖는 대상체일 수 있는 다양한 기준에 따라 선택될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. "대조군"은 건강한 대상체, 비-질환 대상체 및/또는 감염을 갖지 않는 대상체를 포함할 수 있다. 대조군은 또한, 증상을 나타내지 않거나 경증을 나타내는 감염이 있는 대상체, 예컨대 증상을 나타내지 않거나 경증을 나타내는 호흡기 바이러스로 감염된 대상체일 수 있다. 경증은 병원 개입 및/또는 집중적 의학 치료를 필요로 하지 않는 관리가능한 증상을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 양성으로 시험된 대상체는 바이러스 질환으로 감염될 수 있고, 추가로 추가의 의학적 합병증을 앓고 있거나 계속해서 앓고 있다. 반면, 대조군 대상체 또한 바이러스 질환으로 감염될 수 있지만 의학적 합병증을 앓고 있지 않거나 계속해서 앓고 있지 않다. 대조군과의 비교는 진단 분야에서 널리 공지되어 있다. 대조군 그룹에서 나타나는 값의 범위는, 시험 대상체에서 나타나는 값이 그에 대해 비교될 수 있는 정상인 또는 건강한 또는 참조 범위로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 참조 범위가 <10 단위인 경우, 5 단위의 시험 값은 정상이거나 치료를 필요로 하지 않는 것으로 고려되지만, 11 단위의 값은 비정상이고 치료의 필요를 나타내는 것으로 고려된다.
따라서, 하나의 구현예에서, 방법은 대상체의 체액 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 하나 이상의 대조군과 비교하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 방법은 대상체로부터 얻은 샘플 중에 존재하는 무세포 뉴클레오솜의 수준을 정상 대상체로부터 얻은 샘플 중에 존재하는 무세포 뉴클레오솜의 수준과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 대조군은 건강한 대상체일 수 있다.
하나의 구현예에서, 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준은 대조군에 비해 상승된다.
모든 경우에 비교 목적으로 대조군 수준을 측정할 필요는 없음이 이해될 것이다. 예를 들어, 건강한/비-질환 대조군의 경우, '정상 범위'가 일단 확립되면, 이것이 모든 후속 시험에 대한 벤치마크로서 사용될 수 있다. 정상 범위는, 감염이 없는 다수의 대조군 대상체로부터 샘플을 얻고 바이오마커의 수준에 대해 시험함으로써 확립될 수 있다. 이어서 감염이 있을 것으로 의심되는 대상체에 대한 결과 (즉, 바이오마커 수준)를 검사하여 이들이 각각의 정상 범위 내에 포함되는지 그로부터 벗어나는지를 알 수 있다. '정상 범위'의 사용은 질환의 검출을 위한 표준 관행이다.
하나의 구현예에서, 방법은 환자에 대한 적어도 하나의 임상적 파라미터를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 이 파라미터가 결과 해석에 사용될 수 있다. 임상적 파라미터는 임의의 관련 임상 정보, 예를 들어, 비-제한적으로, 체온, 성별, 체중, 체질량지수 (BMI), 흡연 상태 및 식습관을 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 임상적 파라미터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 체온, 연령, 성별 및 체질량지수 (BMI).
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 감염에 대한 심각한 반응이 발생할 높은 위험에 있는, 또한 그에 따라 의학적 개입을 필요로 하는 대상체를 식별하기 위해 수행된다. 이러한 의학적 개입은 본원에 기재된 바와 같은 치료법 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 상기 대상체에게 유해한 결과의 가능성을 지정하는 단계
를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에게 유해한 결과의 위험을 지정하는 방법에 사용하기 위한 키트의 제조에서 결합제의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 대상체가 폐렴, 급성 호흡기 증후군 (ARS) 또는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
를 포함하는, 폐렴, ARS 또는 SARS에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트의 제조에서 결합제의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 대상체가 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
를 포함하는, 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트의 제조에서 결합제의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 대상체가 폐렴, 급성 호흡기 증후군 (ARS) 또는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
를 포함하는, 폐렴, ARS 또는 SARS에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라,
(i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을, 대상체가 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
를 포함하는, 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법이 제공된다.
추가의 바이오마커
무세포 뉴클레오솜의 수준은 측정의 패널 중 하나로서 검출되거나 측정될 수 있다. 패널은 상기에 기재된 바와 같은 뉴클레오솜의 후성유전적 특징 (예: 히스톤 이소형 및 PTM)을 포함할 수 있다. 의학적 개입을 필요로 하는 중증 호흡기 감염의 검출을 위한 패널 시험에서 유용한 바이오마커는, 비-제한적으로, 시토카인 모이어티 (특히 인터류킨), C-반응성 단백질, 미엘로퍼옥시다제, D-이량체, 인자 VII-활성화 프로테아제 (FSAP), 피브리노겐 및 피브린/피브리노겐 분해 생성물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 패널은 C-반응성 단백질을 포함한다. 하나의 구현예에서, 패널은 하나 이상의 시토카인, 예컨대 하나 이상의 인터류킨을 포함한다.
인터류킨 (IL)은 단일 분자로서 작용하는, 통상적으로 백혈구에 의해 분비되는 시토카인의 그룹이다. 이들은 면역 반응 및 염증을 자극하는 데 있어 중요한 역할을 한다. 이들은 1970년대에 최초로 확인되었고, 보다 많은 인터류킨 유형이 발견됨에 따라 숫자로 지정되었다. 인터류킨의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 및 IL-15.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 인터류킨은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 인터류킨-6 (IL-6) 및 인터류킨-12 (IL-12).
인터류킨은 IL-6일 수 있다. 인터류킨-6 (IL-6)은 폭넓게 다양한 생물학적 기능을 갖는 시토카인이다. 이는 열 및 급성기 반응의 강력한 유도제이다. 인간 IL-6의 서열은 당업계에 공지되어 있고 UniProt 수탁 번호 P05231에 기재되어 있다. 하나의 특정 구현예에서, 인터류킨은 IL-6일 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 인터류킨은 IL-12일 수 있다. 인터류킨-12 (IL-12)는 T 세포의 성장 및 기능을 자극하기 때문에, 이는 T 세포 자극 인자이다. 이는 IL-12A 및 IL-12B로 구성된 이종이량체 시토카인이다. 인간 IL-12A의 서열은 당업계에 공지되어 있고 UniProt 수탁 번호 P29459에 기재되어 있으며, 인간 IL-12B의 서열 또한 공지되어 있고 UniProt 수탁 번호 P29460에 기재되어 있다. 하나의 특정 구현예에서, 인터류킨은 IL-12일 수 있다.
하나의 구현예에서, 패널은 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 후성유전적 특징 및 인터류킨을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 패널은 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징 및 2개의 인터류킨을 포함한다. 예를 들어, 무세포 뉴클레오솜 측정이 하나 초과의 인터류킨 측정, 예컨대 IL-6 및 IL-12와 조합될 수 있다. 추가의 구현예에서, 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징은 히스톤 이소형, 예컨대 H3.1, 및 번역-후 변형된 히스톤, 예컨대 H3cit로부터 선택된다. 또한 추가의 구현예에서, 측정의 패널은 H3.1, H3cit, H4cit 및 IL-6이다.
하나의 구현예에서, 패널은 C-반응성 단백질 (CRP)을 포함한다. CRP는 혈장에서 나타나는 오량체 단백질이고, CRP의 수준 (뉴클레오솜에 부가되든 아니든)은, 박테리아, 바이러스, 진균 및 미생물 감염에서와 같은 염증에 대한 반응으로 혈장에서 증가한다. CRP 수준은 대식세포에 의해 IL-6 분비에 따라 증가하고, T 세포 및 그의 생리학적 역할은 C1q를 통한 상보 시스템을 활성화하기 위해 죽은 또는 죽어가는 세포의 표면 상에서 발현되는 리소포스파티딜콜린에 결합하는 것이다. 이는 또한 일부 박테리아의 표면 상의 포스포콜린에 결합하고 식균작용을 향상시킨다. CRP 수준의 측정은 질환의 진행 및 치료의 효과를 결정하기에 유용하고, 상승된 CRP 수준은 당뇨병, 고혈압 및 심혈관 질환의 증가된 위험을 갖는 환자에서 나타났다. 증가된 CRP 수준은 또한 신부전 및 염증성 장 질환 (IBD, 크론병 및 궤양성 대장염)을 갖는 환자에서 나타났고, 상승된 CRP가 심장 질환과 직접 관련되지 않음에 따라 이것이 특이적 예후 마커가 아님에도 불구하고 이는 관상 동맥 심장 질환과 대략적으로 상관된다. CRP는 염증 동안 증가되기 때문에, 바이러스 감염, 예컨대 SARS 또는 코로나바이러스 (예: COVID-19) 또한 혈장에서 CRP 수준을 증가시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 패널은 미엘로퍼옥시다제 (MPO)를 포함한다. MPO는 호중구 과립구에서 발현되고 차아할로겐산을 생성하여 그의 항미생물 활성을 수행한다. 이는 아주르친화성 과립 내에 저장되고 탈과립화 동안 세포외 공간으로 방출된다. MPO의 수준은 심근경색에 대한 유용한 예측인자인 것으로 나타났고, 환자에서 심근경색 위험을 예측하는 데 있어 증가된 정확도를 위해 CRP의 측정과 조합되었다. 하나의 구현예에서, 패널은 호중구 엘라스타제 (NE)를 포함한다.
본 발명의 바이오마커를 사용하여 모델이 유도될 수 있다. 모델 또는 알고리즘의 유도 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 적합한 소프트웨어 패키지가 이용가능하다. 이를 위한 전형적인 소프트웨어 도구는 SPSS (사회 과학 통계 패키지) 및 "R"을 포함한다. 이들 소프트웨어 패키지는 임상 데이터의 선형 및 비-선형 데이터 모델링을 제공한다.
본원에 개시된 바이오마커의 임의의 조합이 감염에 대한 합병증의 검출 또는 예측을 위한 패널 및 알고리즘에서 사용될 수 있음이, 또한 추가의 마커가 이들 마커를 포함한 패널에 첨가될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 양태에 따라, 환자에서 감염에 대한 합병증을 검출하거나 예측하기 위한, 환자로부터 얻은 샘플에서 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소 및 하나 이상의 인터류킨의 측정을 검출하기 위한 시약을 포함하는 패널 시험의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 합병증은 NET 관련 합병증이다. 하나의 구현예에서, 합병증은 ARDS, ARS, SARS 또는 색전증 또는 혈전증 합병증이다.
치료 방법
추가의 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 대상체에서의 감염 치료 방법이 제공된다:
(i) 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 측정된 수준을, 대상체에서 상기 감염의 존재 및/또는 중증도 및/또는 의학적 합병증의 지표로서 사용하는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 대상체가 중증 감염 또는 의학적 합병증을 갖는 것으로 결정되는 경우 치료법을 투여하는 단계.
추가의 양태에 따라, 대조군 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 수준과 비교할 때, 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 상이한 수준을 갖는 것으로 식별된 상기 대상체에게 치료법 (예: 치료적 작용제)을 투여하는 단계를 포함하는, 감염 치료를 필요로 하는 대상체에서의 감염 치료 방법이 제공된다. 치료법은, 비-제한적으로, 약물 (예: 항-염증성 약물, 혈액 희박화 또는 응고 억제제 약물, 치료적 항-NET 항체 약물, DNase 약물, NETosis 억제제 약물, 항-박테리아 약물 또는 항-바이러스 약물), 성분채집 치료, 인공호흡기 지원, 수액 지원 등을 포함하는, 병태에 대한 하나 이상의 적합한 치료를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 치료는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 항생제 치료 (예: 페니실린, 세팔로스포린, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 마크롤라이드, 클린다마이신, 술폰아미드, 트리메토프림, 메트로니다졸, 티니다졸, 퀴놀론 및/또는 니트로푸란토인), 항-미생물 치료 (예: 에탐부톨, 이소니아지드, 피라진아미드, 리팜피신, 아미노글리코시드 (아미카신, 카나마이신), 폴리펩티드 (카프레오마이신, 비오마이신, 엔비오마이신), 플루오로퀴놀론 (시프로플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신), 티오아미드 (에티온아미드, 프로티온아미드), 시클로세린 (클로세린), 테리지돈, 리파부틴, 마크롤라이드 (클라리트로마이신), 리네졸리드, 티오아세타존, 티오리다진, 아르기닌, 비타민 D 및/또는 R207910), 항-바이러스 COVID 치료 (예: 렘데시비르), 항-바이러스 인플루엔자 치료 (예: 아만타딘, 우미페노비르, 모록시딘, 리만타딘, 우미페노비르, 자나미비르 및 뉴라미니다제 억제제, 캡-의존성 엔도뉴클레아제 억제제, 아다만탄, 페라미비르, 자나미비르, 오셀타미비르 포스페이트 및 발록사비르 마르복실) 뿐만 아니라 높은 수준의 NETosis로 이어질 수 있는 다른 바이러스 질환에 대한 항-바이러스 치료 및 항-진균 치료 (예: 클로트리마졸, 에코나졸, 미코나졸, 테르비나핀, 플루코나졸, 케토코나졸 및 암포테리신).
하나의 구현예에서, 치료는 항-염증성 약물이다. 많은 스테로이드 및 비-스테로이드 항-염증성 약물이 당업계에 공지되어 있다. 스테로이드 항-염증성 약물의 일부 예는 비-제한적으로, 덱사메타손, 히드로코르티손, 코르티손, 베타메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 트리암시놀론 및 메틸프레드니솔론을 포함한다. 비-스테로이드 항-염증성 약물의 일부 예는 비-제한적으로, 아스피린, 셀레콕시브, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 이부프로펜, 인도메타신, CD24Fc (면역글로불린 G의 Fc 영역에 부착된 CD24 단백질) 및 EXO-CD24 (CD24-엑소좀)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 치료는 과량의 NET를 소화시키기 위한 DNase 치료 또는 NETosis의 억제제, 예컨대 안트라사이클린 약물이다. 추가의 구현예에서, 안트라사이클린 약물은 하기로부터 선택된다: 에피루비신, 다우노루비신, 독소루비신 및 이다루비신.
하나의 구현예에서, 치료는, 비제한적으로, 뉴클레오솜에, 또는 뉴클레오솜의 임의의 구성요소 부분에 결합하도록 지시된 치료적 항체를 포함한, NET에 또는 NET의 구성요소 부분에 결합하도록 지시된 치료적 항체 약물이다. 예는 히스톤 이소형 H3.1, 시트룰린화된 히스톤, 미엘로퍼옥시다제, 호중구 엘라스타제 또는 C-반응성 단백질을 함유하는 뉴클레오솜에 결합하도록 지시된 치료적 항체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 치료는 순환으로부터 또는 신체로부터 핵산을 흡착하고/거나 제거하는 핵산 스캐빈저, 예를 들어 DNA 스캐빈저 폴리아미도아민이다.
NETosis를 억제하는 치료는 사용된 바 없거나, 또는 저자의 지식에 따르면, 지금까지 인간에서의 사용을 위해 시험된 바 없다. 여기에는 많은 이유가 있다. 첫번째로, 상기에 기재된 바와 같이, NETosis는 면역 시스템의 중요한 구성요소이다. 이는 감염성 작용제에 대한 항체 반응을 아직 생성하지 않았을 수 있고 NETosis 과정이 식균작용과 함께 감염과 싸우고 그의 확산을 방지하는 주요 모드일 수 있는 환자에서 특히 중요할 것이다. 또한, NETosis 억제제 치료법의 경우, 이는 NETosis의 생성물 (이는 대체될 수 있음)을 제거하기보다는 면역 과정 자체가 무력화되어 NET의 추가 생성을 방지하기 때문에 더욱 더 중요하다. 두번째로, 정맥내 투여된 DNase의 반감기는 3-4시간인 것으로 보고되어 있지만, 안트라사이클린의 반감기는 40시간 초과이고 안트라사이클린은 적어도 수일 동안 순환에서 지속된다. 중증 감염이 있는 환자에서 수일 동안의 면역 시스템의 무력화는 질환의 심각한 악화를 위해 충분한 시간일 것이다. 세번째로, 안트라사이클린은 암 세포를 죽임으로써 암을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 세포독성 약물이다. 면역 시스템의 작용의 중요한 모드 중 하나를 무력화하고 또한 수명이 길고 세포독성인 작용제는 질환이 NETosis 관련 질환이 아니고 이러한 치료를 필요로 하지 않는 병든 대상체에게 투여되지 않아야 함이 명백하다. 따라서, NETosis를 억제하는 약물을 사용한 정상 또는 낮은 NET를 갖는 환자의 치료는 부적절하고 잠재적으로 위험하다. 따라서, 이러한 치료법의 투여는 본원에 기재된 방법을 사용한 치료를 필요로 하는 높은 NET 수준을 갖는 환자의 주의 깊은 선택을 필요로 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, NETosis 관련 질환의 치료를 위한 약물 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함하는 조합 생성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조합 생성물은 하나 초과의 약물 (예를 들어 NETosis 억제제 및 심장보호 작용제 및/또는 항생제) 및/또는 하나 초과의 동반 시험 (예를 들어 무세포 뉴클레오솜에 대한 시험 및 시토카인 모이어티에 대한 시험)을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조합 생성물은 DNase 약물 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조합 생성물은 NET를 소화시키는 약물, 예를 들어 뉴클레오솜의 보다 긴 사슬로 구성된 NET를 올리고뉴클레오솜 또는 모노뉴클레오솜의 보다 짧은 사슬을 포함하는 보다 작은 단편으로 소화시키는 DNase 약물 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조합 생성물은 핵산 스캐빈저 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조합 생성물은 NET, NET의 구성요소 부분, MPO, NE 또는 CRP에 결합하도록 지시된 치료적 항체 약물 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조합 생성물은 호중구 세포에 의한 NET 형성을 억제하거나 방지하는 약물 치료법 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함한다. NET 형성을 억제하거나 방지하는 이러한 약물은 NETosis 관련 질환을 치료하기 위해 현재 사용되고 있지 않다. 안트라사이클린 약물이 마우스에서 유도된 패혈증의 치료에서 효과적이었음이 Figueiredo et al., Immunity (2013) 39: 874-884에 의해 보고되었다. 맹장 결찰 및 천자에 의해 마우스에서 치명적 용량의 패혈증을 유도하였고, 이는 72시간 내에 100%의 마우스의 사망을 초래하였다. 안트라사이클린 약물 에피루비신으로의 치료는 다양한 순환 염증성 바이오마커에 의해 측정시 75% 생존율 및 염증 감소를 제공하였다. 그러나, 이러한 효과를 달성함에 있어 안트라사이클린의 작용 메커니즘은 결정될 수 없었고, 피귀레도(Figueiredo)는 NET 또는 NETosis에 대해 언급하지 않았다. 이후에 Khan et al., Cancers (2019) 11: 1328은 세포 배양에서 호중구 세포에 대한 시험관내 안트라사이클린 약물의 효과를 조사하였고, 이들은 NETosis를 억제함을 보고하였다. 칸(Khan)은 안트라사이클린 및 다른 DNA 킬레이팅 약물이 NET-관련 질환에서 원치않는 NETosis를 저지하기 위한 잠재적 치료적 약물로서 고려될 수 있다고 결론지었다. 그러나, 안트라사이클린 약물의 주요 독성 부작용이 심장독성임에 따라, 칸은 안트라사이클린 약물이, NETosis 또는 NETosis를 저지하는 안트라사이클린의 능력에 영향을 주지 않는, 안트라사이클린의 부작용을 제한하기 위해 사용되는 심장보호 작용제인 덱스라족산과 조합되어 투여될 수 있음을 제안하였다.
안트라사이클린 약물은 암의 치료를 위해 매우 효과적인 화학독성 작용제이다. 그러나, 이들은 탈모, 피부 발진, 메스꺼움 및 구토, 권태감, 발열, 말초 신경독성, 2차 백혈병 및 심장독성을 포함한 많은 부작용을 갖는다. 심근 독성은 이것이 치료법 동안 또는 치료법 후 수개월 내지 수년 동안 잠재적으로 치명적 울혈성 심부전 (CHF)을 초래할 수 있기 때문에 용량 제한적이다. 예를 들어, 징후, 증상, 및 좌심실 박출률 감소의 조합 지수에 기초한 손상된 심근 기능의 발병 확률은 반복된 치료 사이클에 걸쳐 300 mg/m2의 독소루비신의 총 누적 용량에서 1 내지 2%, 400 mg/m2의 용량에서 3 내지 5%, 450 mg/m2에서 5 내지 8% 및 500 mg/m2에서 6 내지 20%로 추정된다. CHF의 발병 위험은 400 mg/m2 초과의 독소루비신의 총 누적 용량 증가에 따라 급속히 증가한다. 화학요법을 위해 사용되는 전형적인 용량은 치료 사이클 당 60-75 mg/m2이다.
패혈증의 마우스 모델의 치료에서 유용한 것으로 관찰된 안트라사이클린의 용량은 0.6 μg/g이었고 (Figueiredo et al.), 본 발명자들이 결정한 80 kg 인간 남성에서의 25 mg/m2과 대략 동등하다. 따라서, 단일 정맥내 용량은 1 내지 2% 심근 독성을 유발하는 용량의 1/10 미만이다. 시험관내에서 호중구 세포의 NETosis의 거의 완전한 억제를 위해 필요한 안트라사이클린 약물의 농도는 5 μM이었고 (Khan et al.), 이는 3 μg/ml와 대략 동등하다. 독소루비신의 약동학 특성의 조사는, 단일 25 mg/m2 볼루스 정맥내 용량은 10 μg/ml 혈청의 혈청 농도를 제공함을 보여준다. 또한, 순환에서 독소루비신의 반감기는 대략 41시간이고, 혈청 수준은 약 4일 동안 3 μg/ml 초과로 남아 있다. 따라서, 단일 25 mg/m2 볼루스 용량은 수일 동안 NETosis를 억제하고 패혈증 또는 다른 NETosis 관련 질환에 대한 치료로서 사용될 수 있다. 25 mg/m2 미만의 단일 볼루스 용량 수준, 또는 반복 누적 용량 수준이 또한 효과적일 수 있다.
나노입자 안트라사이클린 약물 제제는, 활성 약물이 단지 활성화된 호중구에서 방출되고 따라서 추가의 감염에 반응하는 남아 있는 호중구의 NETosis 능력을 또한 유지하면서 부작용을 피하는 표적화된 NETosis 억제제 접근을 제공하는 것으로 보고되었다 (Zhang et al., Science Advances 2019;5: eaax7964). 따라서, 하나의 구현예에서, NETosis 관련 질환의 치료를 위한 나노입자 안트라사이클린 약물 제제 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함하는 조합 생성물이 제공된다.
제약 독성 부작용을 피하는 NETosis 치료를 제공하는 혈장분리교환술에 의해 순환으로부터 NET 및 NET 분해 생성물의 제거를 수반하는 치료법이 보고되었다 (WO2019053243). 따라서, 하나의 구현예에서, NETosis 관련 질환의 치료를 위한 혈장분리교환술 치료법 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함하는 조합 생성물이 제공된다.
CD24 단백질을 기반으로 한 COVID-19를 앓고 있는 대상체에 대한 항-염증성 약물 치료가 보고되었다. 일례는 수일 내에 30개의 중등도/중증 COVID 사례 중 29개를 치유하는 것으로 보고된 CD24-엑소좀 (Times of Israel 5 Feb 2021 and ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04747574)이고, 이는 엑소좀에서의 CD24의 전달을 수반한다. 또 다른 이러한 치료, CD24Fc는, 인간 IgG1의 단편 결정화가능 영역 (Fc) 영역에 부착된 CD24의 비-다형성(polymorphic) 영역을 포함한다 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04317040). 따라서, 하나의 구현예에서, NETosis 관련 질환의 치료를 위한 혈장분리교환술 치료법 및 무세포 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 동반 진단 시험을 포함하는 조합 생성물이 제공된다.
NET 또는 NETosis 관련 질환은 감염성 질환, 예컨대 패혈증, 폐렴, COVID 및 인플루엔자 뿐만 아니라, 비-제한적으로, 임의의 원인의 폐렴, SARS 또는 ARDS, 혈전증 또는 미세-혈전증 병태, 많은 염증성 질환 병태 및 절단을 포함한 다른 질환의 NETosis 관련 합병증 및 당뇨병의 혈전증 합병증 및 암 및 많은 다른 질환의 혈전증 합병증을 포함한 NET 생성에서의 병리학적 상승을 수반하는 다른 질환을 포함한다.
방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(i) 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 수준을 (임의로 하나 이상의 인터류킨의 수준과 조합하여) 측정하는 단계;
(ii) 대조군에 비해 더 높은 수준의 무세포 뉴클레오솜에 기초하여 대상체가 치료를 필요로 하는 NETosis 관련 질환 (예컨대 감염)을 앓고 있는 것으로 식별하는 단계; 및
(iii) 대상체에게 치료를 투여하는 단계.
바람직한 구현예에서, 치료는 과량의 NET를 소화시키는 DNase 치료, 항-뉴클레오솜 또는 항-NET 치료적 항체 치료, 과량의 NET를 제거하는 성분채집 또는 혈장분리교환술 치료 또는 본원에 기재된 바와 같은 NETosis의 억제제이다.
하나의 구현예에서, 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 의학적 합병증을 갖는 또는 그의 발병 위험에 있는 감염을 앓고 있는 대상체를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 수준을 (임의로 하나 이상의 인터류킨의 수준과 조합하여) 측정하는 단계;
(ii) 대조군에 비해 더 높은 수준의 무세포 뉴클레오솜에 기초하여 대상체가 치료를 필요로 하는 감염을 앓고 있는 것으로 식별하는 단계; 및
(iii) 대상체에게 치료를 투여하는 단계.
하나의 구현예에서, 감염은 패혈증 또는 패혈성 쇼크이다.
바람직한 구현예에서, 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 의학적 합병증을 갖는 또는 그의 발병 위험에 있는 호흡기 바이러스에 의해 감염된 대상체를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 수준을 (임의로 하나 이상의 인터류킨의 수준과 조합하여) 측정하는 단계;
(ii) 대조군에 비해 더 높은 수준의 무세포 뉴클레오솜에 기초하여 대상체가 의학적 합병증의 발병 위험에 있는 것으로 식별하는 단계; 및
(iii) 대상체에게 치료를 투여하는 단계.
바람직한 구현예에서. 호흡기 감염은 인플루엔자 또는 코로나바이러스이고, 의학적 합병증은 폐렴이다. 적합한 치료는, 비-제한적으로, 체외 산소공급을 사용한 호흡기 지원, 도움 없이 신체적으로 충분히 호흡할 수 없는 환자의 폐 안팎으로의 공기의 기계적 환기를 제공하도록 디자인된 의학적 인공호흡기를 사용한 호흡기 지원 및/또는 산소의 제공 및/또는 항바이러스, 항박테리아 또는 항-염증성 약물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 패널 시험을 사용하여 감염에 대한 치료를 필요로 하는 환자를 식별하고, 상기 치료를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 패널 시험은 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 측정을 검출하기 위한 시약을 포함하는 것인, 상기 감염의 치료 방법이 제공된다. 감염이 있는 환자는 대조군에 비해 더 높은 수준의 무세포 뉴클레오솜을 가질 것으로 예상된다.
치료적 항체
치료적 항체는 대상체에서 손상 또는 질환을 유발하는 모이어티를 중화시키기 위해 정맥내 투여된다. 치료적 항체, 및 다른 유사한 또는 유래된 치료적 결합제, 예컨대 Fab 및 Fv 단편은, 그의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 성질상 통상적으로 인간이거나 인간화된다. 치료적 항체 및 그의 개발 및 생성 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태에서, 폐렴을 포함한, 중증 과면역 반응의 치료를 위한 항-뉴클레오솜 항체가 제공된다.
따라서, 추가의 구현예에서, 하기 단계를 포함하는, 의학적 합병증을 갖는 호흡기 바이러스에 의해 감염된 대상체의 치료 방법이 제공된다:
(i) 대상체로부터 얻은 샘플 중의 무세포 뉴클레오솜의 수준을 (임의로 하나 이상의 인터류킨의 수준과 조합하여) 측정하는 단계;
(ii) 대조군에 비해 더 높은 수준의 무세포 뉴클레오솜에 기초하여 대상체가 의학적 합병증을 갖는 것으로 식별하는 단계; 및
(iii) 대상체에게 치료적 항-뉴클레오솜 항체를 투여하는 단계.
NETosis 억제제로의 치료를 통한 NETosis의 방지 또는 억제는 부적절하게 높은 수준의 NET를 수반하는 병태를 앓고 있는 대상체의 순환 및/또는 조직에서 NET 및 뉴클레오솜의 수준을 감소시킨다. 이는 NETosis 관련 질환 병태, 예컨대 패혈증 또는 뇌졸중을 앓고 있는 대상체에 대한 개선된 임상적 결과를 제공하는 것으로 나타났다 (Figueiredo et al., Immunity (2013) 39: 874-884 및 Zhang et al., Science Advances (2019) 5: eaax7964). 유사하게, NETosis 관련 질환 병태를 앓고 있는 대상체의 순환 및/또는 조직으로부터의 NET 및 뉴클레오솜의 제거는 개선된 임상적 결과를 제공한다.
H3.1-뉴클레오솜, 시트룰린화된 뉴클레오솜, MPO 및 NE의 측정을 위한 본원에 기재된 면역검정은 뉴클레오솜 및 NET에 대한 결합에 대하여 높은 결합력(avidity) 및 특이성의 모노클로날 항체를 사용한다. 이들 항체는 NET, NET 대사물 및 뉴클레오솜에 강하게, 또한 특이적으로 결합한다. 따라서, 이들 항체는 NET를 중화시키고, 예를 들어 식균작용에 의해, 신체로부터 이들의 클리어런스(clearance)를 용이하게 하도록 생체내에서 NET에 결합하기 위한 치료적 항체로서 사용될 수 있다 (Weiskopf and Weissman, Mabs (2015) 7:303-10).
CRP는 NETosis를 추가로 유도할 수 있는 NET와 물리적으로 관련되는 것으로 공지된 급성기 단백질이다. 따라서, CRP에 대한 항체는 NET를 중화시키고 클리어링할 수 있고, 또한 CRP의 중화 및 클리어런스를 통해 NETosis의 유도를 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소, DNA, 미엘로퍼옥시다제, 호중구 엘라스타제 또는 C-반응성 단백질에 결합하도록 지시된 치료적 항체의 투여를 포함하는, NETosis 관련 질환의 치료 방법이 제공된다. 치료적 항체는 질환을 앓고 있는 대상체로부터 NET를 중화시키거나 그의 클리어런스를 촉진할 수 있다. 치료적 항체의 투여 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 과량의 또는 부적절한 NETosis를 수반하는 병태 (즉, NETosis 관련 질환)의 치료에서의 사용을 위한, 항-뉴클레오솜, 항-DNA, 항-미엘로퍼옥시다제, 항-호중구 엘라스타제 또는 항-C-반응성 단백질 치료적 항체가 제공된다.
본원에 기재된 뉴클레오솜의 검정을 위한 본 발명자들에 의해 사용된 항-히스톤 H3.1 항체, 항-뉴클레오솜 항체 및 항-시트룰린화된 H3 항체는, 높은 결합력을 갖고 고도로 특이적인 항체로서 선택되었고, 따라서 특히 치료적 항체로서 유용하다.
특히, 항-히스톤 H3.1 항체는 고도로 특이적일 수 있다. 뉴클레오솜은 히스톤 테일이 조절된 단백질분해 또는 클리핑에 의해 물리적으로 비가역적으로 제거되는 클리핑의 대상이 된다. 또한, 히스톤 분해가 NET의 형성에 관여하는 것으로 나타났다 (Papayannopoulos et al. (2010) J. Cell Biol. 191(3): 677-691 참조). 히스톤 H3에서, 클리핑은 아미노산 위치 21 주위에서 일어나는 것으로 보고되어 있다 (Yi and Kim (2018) BMB Reports, 51(5): 211-218). 위치 27-36에서의 히스톤 H3.1의 아미노산 서열은 KSAPATGGVK이다 (서열 번호: 1). 위치 29-35에서의 아미노산 서열은 임의의 공통 번역-후 변형 아미노산 (예를 들어 리신, 세린 또는 아르기닌)을 포함하지 않는다. 따라서, 이 에피토프 (즉, 아미노산 위치 29-35)에 결합하도록 지시된 항체는, 뉴클레오솜의 번역-후 변형 상태에 의해 영향 받지 않거나, 최소로 영향 받고, PTM 구조에 관계 없이, 히스톤 H3.1을 함유하는 모든 또는 대부분의 뉴클레오솜에 결합할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 면역검정을 위해 본 발명자들에 의해 사용을 위해 선택된 고체 상 포획 항체는, 온전한 및 클리핑된 뉴클레오솜 둘 다 그의 PTM 상태와 관계 없이 항체에 의해 포획되도록, 아미노산 위치 30-33에 가까운 히스톤의 코어 내에 위치한 에피토프에 결합하도록 지시된 항-히스톤 H3.1 항체이다. 이는 H3.1-뉴클레오솜의 포획을 최대화하고, 이 접근의 효능은 도 6에서 명백하다. 히스톤 H3.1의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 UniProt 수탁 번호 P68431에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 치료적 항체는 아미노산 위치 21보다 더 높게 위치한 아미노산 에피토프에서 히스톤 H3.1의 코어 히스톤 에피토프에 결합하도록 지시된다. 바람직한 구현예에서, 항-히스톤 H3.1 치료적 항체는 아미노산 위치 29-35에서 또는 그 근처에서, 특히 아미노산 위치 30-33에서 또는 그 근처에서, 히스톤 H3의 코어 내에 위치한 에피토프에 결합하도록 지시된다.
면역검정을 위해 본원에서 본 발명자들에 의해 사용된 라벨링된 항체는 DNA와 복합체화된 히스톤 팔량체 코어를 함유하는 온전한 뉴클레오솜에 존재하는 형태적 뉴클레오솜 에피토프에 결합하도록 지시된 항-뉴클레오솜 항체였다. 항체는 유리 히스톤 팔량체 복합체, 유리 히스톤 (즉, DNA가 없음), 유리 DNA 또는 유리 히스톤에 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합함). 또한, 항체는 결합되는 뉴클레오솜의 히스톤 PTM 조성물에 의해 비교적 영향 받지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 치료적 항체는 DNA와 복합체화된 히스톤 팔량체 코어를 함유하는 온전한 뉴클레오솜에 존재하는 형태적 뉴클레오솜 에피토프에 결합하도록 지시된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 치료적 항체는, 예를 들어 하나 이상의 히스톤 테일이 제거된 클리핑된 뉴클레오솜에 존재하는 에피토프에 대한 결합에 의해, 클리핑된 뉴클레오솜에 선택적으로 결합하도록 지시된다. 이 구현예에서, 에피토프는 완전한 히스톤 테일의 존재에 의해 온전한 뉴클레오솜에서 이전에 마스킹되었을 수 있다 (그에 따라 항체 결합을 방지함). 따라서, 클리핑된 뉴클레오솜에 대해 선택된 항체에 의해 결합된 에피토프는 온전한 (즉, 완전한 또는 클리핑되지 않은) 뉴클레오솜에서 접근가능하지 않은 에피토프일 수 있다. 하나의 구현예에서, 클리핑된 뉴클레오솜은 히스톤 테일이 제거된 히스톤 H3, H2A 및/또는 H4 단백질을 포함한다.
하나의 구현예에서, 2개 이상의 치료적 항체의 혼합물이 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 온전한 뉴클레오솜에 존재하는 뉴클레오솜 에피토프에 결합하도록 지시된 하나의 항체와 함께 히스톤 H3.1의 코어 히스톤 에피토프에 결합하도록 지시된 또 다른 항체의 혼합물.
면역검정을 위해 본 발명자들에 의해 사용되는 항체는 마우스 모노클로날 항체이다. 이들 마우스 모노클로날 항체는 마우스에서 유용한 치료적 항체이다. 인간 또는 다른 동물에서의 사용은 항원성 면역 반응 및 항-마우스 면역글로불린 항체의 생성으로 이어질 수 있다 (모노클로날 항체는 외래 단백질이기 때문). 항원성 반응을 피하기 위해, 비-인간 모노클로날 항체는 인간화될 수 있다. 인간화된 항체는 단백질 조성이 자연 발생 인간 항체의 것과 유사하도록 변형된 비-인간 항체이고 당업계에 널리 공지되어 있다. 항체는 항체에 고유하고 항체의 에피토프 결합 특이성 및 결합력을 결정하는 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한 가변 도메인, 및 종 특이적인 불변 도메인으로 이루어진다. 인간화의 하나의 방법은 인간 불변 도메인을 코딩하는 DNA와 비-인간 항체의 가변 CDR을 코딩하는 DNA의 융합을 수반한다. 이 방법을 사용하여, 원래의 비-인간 모노클로날 항체의 결합 특이성 및 결합력을 갖고 인간 대상체에서 항원성이 아닌 대부분 인간 항체를 코딩하는 DNA 벡터를 생성할 수 있다. 생성된 DNA 벡터를 사용하여 인간화된 항체가 대규모로 제조될 수 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 치료적 항체는 인간화된 항체이다.
본원에 기재된 구현예는 본 발명의 모든 양태에 적용될 수 있으며, 즉, 용도에 대해 기재된 구현예가 청구된 방법 등에 동등하게 적용될 수 있음이 이해될 것이다.
이제, 본 발명을 하기 비-제한적 실시예를 참조로 하여 예시할 것이다.
실시예 1
본 발명자들은 헤파린 첨가에 의해 신선한 건강한 전혈 샘플 중의 백혈구에서 NET 형성을 유도하였고, 이어서 혈장에서 생성된 NET 물질의 검출을 입증하였다 (Lelliott et al, International Immunology (2019) pii: dxz084). 본 발명자들은, 낮은 수준의 순환 NET 물질이 예상되는 2명의 건강한 지원자로부터의 전혈 샘플을, EDTA 혈장 혈액 수집 튜브 내에, 또한 헤파린 혈장 혈액 수집 튜브 내에 수집하였다. 2개의 EDTA 혈장 혈액 수집 튜브를 즉시 원심분리하여 세포 및 혈장 분획을 분리하여 큰 염색질 (NET 물질 포함)에 의한 오염을 최소화하였고, 혈장을 저온튜브(cryotube)로 옮기고 동결시켰다. 2개의 헤파린 혈장 혈액 수집 튜브를 튜브의 온화한 회전과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 튜브를 원심분리하고, 혈장을 저온튜브로 옮기고 동결시켰다.
샘플을 이중으로 ELISA 절차를 사용하여 히스톤 이소형 H3.1을 함유하는 뉴클레오솜 (H3.1-뉴클레오솜)에 대해 검정하였다. 간단히, 20 μl의 샘플을 항-히스톤 H3.1 항체로 예비코팅된 자성 입자를 함유하는 미세적정 웰에 첨가하였다. 샘플을 인큐베이션하고, 자성 입자를 단리하고 세척하였다. 홀스 래디시 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 형태적 뉴클레오솜 에피토프에 결합하도록 지시된 항-뉴클레오솜 항체를 자성 입자에 첨가하였다. 입자를 인큐베이션하고, 이어서 단리하고 세척하였다. 결합된 항-뉴클레오솜 항체를 착색 기질 반응을 사용하여 측정하였다. 결과를 도 1에 나타내었고, 이는 NET 물질 수준이 헤파린 튜브에서는 높았지만 EDTA 튜브에서는 낮았음을 보여준다. 이는 순환 NET 물질의 상승된 수준이 단일 저가 면역검정 시험에서 검출될 수 있음을 명백히 보여준다.
실시예 2
실시예 1에 기재된 2개의 헤파린 및 혈장 샘플로부터 DNA를 추출하고, 칩-기반 모세관 전기영동 기기 (Agilent Bioanalyzer)에 적용하여 단편 크기에 의해 DNA를 분석하였다. 모노뉴클레오솜에 상응하는 대략 150bp 크기의 DNA 단편은 대략 60초의 체류 시간을 갖는다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 관찰된 모노뉴클레오솜 관련 DNA의 수준은 낮았다 (건강한 지원자에 대해 예상된 바와 같음). NET 물질에 상응하는 DNA 단편 크기는 대략 110초의 보다 긴 체류 시간을 갖는다. 도 2에 나타낸 바와 같이, NET 물질의 수준은 EDTA 혈장에서 낮았지만 (건강한 지원자에 대해 예상된 바와 같음), 헤파린으로의 노출에 의해 NET 형성이 자극된 헤파린 혈장 튜브에서는 높았다. 이 결과는, 상기 실시예 1에서 헤파린 혈장에서 관찰된 상승된 뉴클레오솜 수준이 모노뉴클레오솜이 아닌 NET 유래의 것이었음을 확인시켜준다.
실시예 3
코로나바이러스 감염에 대해 모두 양성으로 시험된, 경증을 갖는 50명의 대조군 대상체 및 호흡기 합병증을 갖고 인공호흡기 지원을 필요로 하는 50명의 시험 대상체를 포함한 100명의 대상체로부터 EDTA 혈장 샘플을 수집한다. 실시예 1에 기재된 바와 같은 뉴클레오솜 면역검정 방법을 사용하여 순환 NET 물질을 측정한다. 50명의 대조군 대상체는 낮은 NET 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 수준을 사용하여 대조군 범위를 확립한다. 50명의 시험 대상체는 보다 높은 NET 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 높은 수준을, 바이러스 감염에 추가로, 대상체가 치료를 필요로 하는 호흡기 합병증을 갖는다는 지표로서 사용한다.
실시예 4
실시예 3에서 수행된 실험을 반복하되 수행된 면역검정은 시트룰린화된 뉴클레오솜을 측정한다. 50명의 대조군 대상체는 낮은 시트룰린화된 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 수준을 사용하여 대조군 범위를 확립한다. 50명의 시험 대상체는 보다 높은 시트룰린화된 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 높은 수준을, 바이러스 감염에 추가로, 대상체가 치료를 필요로 하는 호흡기 합병증을 갖는다는 지표로서 사용한다.
실시예 5
실시예 3에서 수행된 실험을 반복하되 수행된 면역검정은 미엘로퍼옥시다제-뉴클레오솜 부가생성물 수준을 측정한다. 50명의 대조군 대상체는 낮은 미엘로퍼옥시다제-뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 수준을 사용하여 대조군 범위를 확립한다. 50명의 시험 대상체는 보다 높은 미엘로퍼옥시다제-뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 높은 수준을, 바이러스 감염에 추가로, 대상체가 치료를 필요로 하는 호흡기 합병증을 갖는다는 지표로서 사용한다.
실시예 6
실시예 3에서 수행된 실험을 반복하되 수행된 면역검정은 호중구 엘라스타제-뉴클레오솜 부가생성물 수준을 측정한다. 50명의 대조군 대상체는 낮은 호중구 엘라스타제-뉴클레오솜 부가생성물 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 수준을 사용하여 대조군 범위를 확립한다. 50명의 시험 대상체는 보다 높은 호중구 엘라스타제-뉴클레오솜 부가생성물 수준을 갖는 것으로 나타나고, 이들 높은 수준을, 바이러스 감염에 추가로, 대상체가 치료를 필요로 하는 호흡기 합병증을 갖는다는 지표로서 사용한다.
실시예 7
실시예 5에서 수행된 실험을 반복하되, 추가로, CRP 및 IL6의 수준을 동일한 대상체로부터 EDTA 혈장 샘플에서 또는 혈청 샘플에서 또한 측정한다. 결과의 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 알고리즘을 개발하여 시험 대상체의 식별을 위해 임상적 민감도 및 특이성을 최대화한다.
실시예 8
EDTA 혈장 샘플을 COVID-19 발생 전 2019년에 50명의 건강한 대상체로부터, 또한 COVID-19 감염 의심 증상으로 병원에 입원한 50명의 대상체로부터 수집하였다. COVID-19 감염 증상으로 입원한 50명의 대상체 중, 34명은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 시험 사용시 COVID-19 감염에 대해 양성으로 시험되었고, 16명은 PCR 시험 사용시 COVID-19 감염에 대해 음성으로 시험되었다.
유증상 환자를 질환의 중증 형태 및 질환의 보다 경증 형태를 경험한 환자 모두를 포함하도록 선택하였다. ICU에 입원한 5명의 대상체를 포함한 40명의 대상체가 입원하였고, 이들 중 2명의 대상체는 각각 9 및 10일 동안 기계적 환기를 받았다. COVID-19에 대해 PCR 음성으로 시험된 입원한 대상체는 그럼에도 불구하고 호흡기 감염 증상에 대해 치료되었다.
H3.1-뉴클레오솜 수준을 혈장 샘플에서 측정하였고, 결과가 도 3에 나타나 있다. 모든 PCR 양성 COVID-19 환자는 혈장 H3.1-뉴클레오솜의 상승된 수준을 가졌고, 이에 기초하여 PCR 양성 COVID-19 환자의 100%가 94%의 특이도 (50명의 대조군 대상체 중 3명의 위양성) 및 98.7%의 AUC로 정상 대조군과 구별되었다.
PCR 양성 COVID-19 환자는 그의 H3.1-뉴클레오솜 수준에 기초하여 2개 그룹으로 분할될 수 있다. 34명의 대상체 중 15명을 포함하는 제1 그룹은 600 ng/ml 미만의 H3.1-뉴클레오솜 수준을 가졌다. 34명의 대상체 중 19명을 포함하는 제2 그룹은 검정의 상한 범위보다 높은 H3.1-뉴클레오솜 수준을 가졌다 (>700 ng/ml).
유사한 패턴이 COVID-19 증상을 앓고 있는 16명의 환자에 대해 관찰되었지만 PCR에 의해 음성으로 시험되었고, 이들 중 6명은 600 ng/ml 미만의 H3.1-뉴클레오솜 수준을 가졌고, 10명은 >700 ng/ml의 H3.1-뉴클레오솜 수준을 가졌다.
실시예 9
순환 H3.1-뉴클레오솜 수준이 COVID-19 질환 중증도를 예측하는지의 여부를 결정하기 위해, EDTA 혈장 샘플을 양성 PCR COVID-19 바이러스 시험 결과에 의해 COVID-19 감염으로 진단된 14명의 대상체로부터 수집하였다. 이들 중, 외래환자 병원 예약에 참석하거나 병원 응급실 (ER)에 제시된 대상체로부터 5개의 샘플을 수집하였고, 일반 종속 병동 (즉, 중환자실이 아님)에 입원한 환자로부터 3개의 샘플을 수집하였고, 높은 수준의 호흡기 및 기계적 환기 및 체외막 산소를 포함한 다른 임상적 지원을 위해 3차 병원 센터의 중환자실 (ICU)로 이송된 매우 중증의 질환을 갖는 환자 (여기서 환자는 캐뉼러삽입되고, 환자의 폐 기능이 인공 산소공급을 통해 혈액을 펌핑함으로써 대체됨)로부터 6개의 샘플을 수집하였다. 이들 대상체의 사망률은 6명 중 4명 사망이었다.
순환 H3.1-뉴클레오솜 수준을 혈장 샘플에서 측정하였고, 결과가 도 4에 나타나 있다. 외래환자/ER에서 시험된 대상체와 일반 병동에 COVID-19 감염으로 입원한 대상체 사이에 명백한 수준 증가가 있었다. 이 구별에 대한 곡선 하 면적 (AUC)은 100%였다. 또한, ICU에 입원한 대상체에 비해 일반 병동에 COVID-19 감염으로 입원한 대상체 사이에 명백한 수준 증가가 있었다. 이 구별에 대한 AUC 또한 100%였다. 또한, 사망한 4명의 환자는 가장 높은 4개의 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 나타났다. 사망률 예측에 대한 AUC 또한 100%였다.
결과는, 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준이 질환 중증도 및 사망률을 예측하고, 예후적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 따라서, 본 발명의 방법은, 임상적 지원의 수준 및/또는 필요한 치료의 성질을 결정하기 위해 호흡기 감염으로의 제시시 또는 후기 단계를 포함한 임상적 과정의 다양한 단계에서 환자 또는 대상체에 대해 필요한 관리 수준을 예측하기 위해 사용될 수 있다.
유사하게, 결과는, 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준을 사용하여, 향후 치료 및 임상적 지원 체제에 대한 임상적 결정을 알리기 위해 수준이 상승 또는 하락하고 있는지의 여부를 결정하도록 일련의 샘플링에 의해 환자를 모니터링할 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 하락하고 있는 수준은, 집중적 호흡기 지원이 더 이상 필수적이 아니라는 및/또는 사용되는 치료가 효과적이라는 결정을 알릴 수 있다.
역으로 상승하고 있는 수준은 집중적 호흡기 지원이 요구되고/거나 사용되는 현재의 치료가 효과적이지 않고 추가의 또는 대안적 치료가 고려되어야 한다는 결정을 알릴 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어, 또한 비-제한적으로, NETosis 억제제 약물, 성분채집 또는 혈장분리교환술에 의한 NET를 제거하는 치료 또는 항-염증성 치료, 예컨대 CD24 치료 (예: EXO-CD24 또는 CD24Fc)를 포함한 NETosis 관련 병태에 대한 치료를 필요로 하는 환자를 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 NETosis를 수반하는 질환에 대한 약물 및 치료에 동반 진단 생성물로서 사용될 수 있다.
유사한 맥락에서, 이는 또한 본 발명의 방법이 호흡기 질환 병태를 치료하기 위한 조사용 약물의 효과를 평가하는 데 사용하기에 적합할 수 있음을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준은 단독으로 또는 다른 파라미터와 조합되어 약물 시험에서 대리(surrogate) 종점으로서 사용될 수 있다.
실시예 10
본 발명의 방법이 다른 뉴클레오솜 모이어티에 대해 효과적인지를 결정하기 위해, 실시예 9에 기재된 동일한 대상체를 또한, 히스톤 H3의 위치 8에서 아르기닌 잔기의 시트룰린화의 히스톤 변형을 함유하는 순환 뉴클레오솜 (H3R8Cit-뉴클레오솜)의 수준에 대해 시험하였다. NET 염색질이 시트룰린화된 것으로 공지되어 있기 때문에 이 뉴클레오솜 모이어티가 선택되었다. 결과가 도 5에 나타나 있고, 이는 본 발명의 방법이 시트룰린화된 뉴클레오솜 측정 사용시, 또한 보다 일반적으로 임의의 순환 뉴클레오솜 모이어티 또는 MPO, NE 또는 다른 NET 구성요소 모이어티를 포함한 NET 모이어티의 측정 사용시 효과적임을 확인시켜준다.
결과는, 순환 H3R8Cit-뉴클레오솜 수준이 질환 중증도 및 사망률을 예측하고, 예후적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 유사하게, H3R8Cit-뉴클레오솜 수준을 사용하여, 임상적 과정의 다양한 단계에서 환자 또는 대상체에 대해 필요한 관리 수준을 예측하고 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대해 실시예 9에서 상기에 기재된 바와 같은 일련의 샘플링에 의해 환자를 모니터링할 수 있다.
실시예 11
NETosis 관련 질환을 앓고 있는 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하고, 이를 대상체에 의한 NET의 과잉 생성 또는 과생성의 지표로서 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오솜에 대해 검정하였다. 측정된 NET의 수준이 역치 컷-오프 값 미만인 경우, 환자는 안트라사이클린 치료법 등의 NETosis 억제 치료법을 받지 않는다. 측정된 NET의 수준이 역치 컷-오프 값 초과인 경우, 환자는 안트라사이클린 치료법 등의 NETosis 억제 치료법을 받는다. 추가의 혈액 샘플을 적절한 간격으로 (예를 들어, 4시간마다 또는 매일) 채취하여 대상체의 순환에서 NET 수준의 하락을 모니터링하여 치료 효과를 결정한다. 이 방식으로 사용하면, 본 발명의 방법은 NETosis 억제제 치료법, 및 환자 선택 및 NETosis 치료법 (예: 항-바이러스 또는 항박테리아 약물, 항-염증성 약물, 혈액 희박화 또는 응고 억제제 약물, NETosis 억제제 약물, DNase 약물, 항-뉴클레오솜 치료적 항체 약물, 항-MPO 치료적 항체 약물, 및 항-NE 치료적 항체 약물 또는 순환으로부터 NET를 제거하는 성분채집 또는 혈장분리교환술 치료)을 필요로 하는 병리학적 NET 수준을 갖는 환자의 모니터링을 위한 동반 진단을 포함하는 조합 생성물을 제공한다.
실시예 12
3시간 (0-3시간, 도 6 및 도 7)에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여된 대장균 (E. coli) 박테리아로의 감염에 의해 16마리의 돼지에서 패혈증을 유도하였다. 패혈증 돼지를 WO2019053243에 기재된 바와 같이 혈류로부터 NET를 제거하기 위해 혈장분리교환술 방법에 의해 치료하였다. 간단히, 돼지의 신체로부터 튜브를 통해 혈장분리교환술 장치 내로 전혈을 제거하고, 전혈을 세포 분획 및 혈장 분획으로 분리하고, 혈장을 NET의 결합제를 함유하는 혈장분리교환술 카트리지로 통과시켜 혈장으로부터 NET를 제거하고, 이어서 혈장을 혈구와 다시 합치고 돼지의 신체로 복귀시켰다. 혈장분리교환술 치료를 5시간 (2-7시간, 도 6 및 7)에 걸쳐 수행하였다. 9마리의 돼지에 사용된 혈장분리교환술 카트리지는 NET 결합제를 함유하였고 (치료된 돼지), 다른 7마리의 돼지에 사용된 카트리지는 결합제를 함유하지 않았다 (대조군 돼지).
각각의 돼지로부터의 감염 시작 후 0-7시간 시점에 매시간 8개의 혈장 샘플을 수집하였다. 본 발명의 방법이 (i) 감염 과정에 대한 모니터로서 효과적인지, 또한 (ii) 치료 효능에 대한 모니터로서 효과적인지의 여부를 확인하기 위해 순환 뉴클레오솜을 측정하였다.
추가로, 혈장 샘플을 혈장분리교환술 장치로부터, 카트리지의 상류 (NET 결합제 카트리지로 들어가는 혈장 샘플에 대하여), 또한 카트리지의 하류 (NET 결합제 카트리지에서 나오는 혈장 샘플에 대하여) 둘 다에서 수집하여, 카트리지 내의 NET 결합제에 의한 혈장의 고갈 정도가 본 발명의 방법에 의해 모니터링될 수 있는지의 여부를 확인하였다. 5개의 상류 및 5개의 하류 샘플을 감염 시작 후 3-7시간 시점에 (3-7시간, 도 6 및 7) 매시간 채취하였다.
혈장 샘플을 히스톤 이소형 H3.1을 함유하는 뉴클레오솜 (H3.1-뉴클레오솜) 수준에 대해 검정하였다. 검정 측정을 자동화된 면역검정 기기를 사용한 면역검정에 의해 수행하였다. 간단히, 보정제 또는 샘플 (50 μl)을 아크리디늄 에스테르 라벨링된 항-뉴클레오솜 항체 (50 μl) 및 검정 완충제 (100 μl)와 1800초 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 항-히스톤 H3.1 항체로 코팅된 자성 비드 (20 μl)를 첨가하고, 혼합물을 추가의 900초 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 자성 비드를 단리시키고, 3회 세척하고, 자성 결합 아크리디늄 에스테르를 7000 밀리초에 걸쳐 발광 출력에 의해 결정하였다.
대조군 돼지 및 치료된 돼지에서의 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대한 평균 결과가 도 6a에 나타나 있다. 대조군 돼지 (패혈증을 유도하도록 감염되었으나 치료되지 않음)는 하기 시간에 걸쳐 패혈증을 나타내었고, 이는 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준의 상승 관찰에 반영되었다. 평균 H3.1-뉴클레오솜 수준의 상승은 1시간 (감염 시작 후)에 명백하였고, NETosis 과정의 시간 경과와 일치하는 3시간 후에 가속화되었다. H3.1-뉴클레오솜 수준은 계속 상승하여 7시간에 361 ng/ml에 도달하였다. 평균 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준에서의 유사한 초기 상승이 치료된 돼지에서 0-2시간에 관찰되었다. 2시간에 혈장분리교환술 치료의 개시는 뉴클레오솜 수준 증가를 둔화시켰고, 7시간에 관찰된 평균 수준은 150 ng/ml였다. 이는 대조군 돼지에서 관찰된 평균 수준에 비해 상당히 더 낮은 것이고, 이는 혈장분리교환술 방법의 효과를 입증하며, H3.1 뉴클레오솜의 수준이 패혈증 질환의 과정 및 정도에 대한 효과적인 모니터 및 치료 가이드 및 생체내 NETosis 과정에 대한 효과적인 모니터임을 보여준다.
작업 동안 카트리지로부터 상류에서 혈장분리교환술 장치 내에서 채취된 샘플에서 측정된 혈장 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대한 평균 결과가 도 6b에 나타나 있다. 이들 결과는 도 6a에 나타낸 측정된 평균 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준에서 관찰된 것들과 유사하다.
작업 동안 카트리지로부터 하류에서 혈장분리교환술 장치 내에서 채취된 샘플에서 측정된 혈장 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대한 평균 결과가 도 6c에 나타나 있다. 대조군 돼지에 대하여, 도 6c의 결과는 도 6b (및 6a)에서의 것들과 유사하며, 이는 NET의 결합제를 함유하지 않는 카트리지를 통한 혈장의 통과는 관찰된 H3.1-뉴클레오솜 수준에 유의하게 영향을 주지 않았음을 보여준다. 이는, 혈장에서의 NET의 수준이 NET의 결합제를 함유하지 않는 카트리지를 통한 통과에 의해 영향 받지 않는다는 예상 결과와 일치한다. 치료된 돼지에 대하여, 도 6c의 결과는 모두 낮다. 이는, NET의 결합제를 함유하는 카트리지를 통한 혈장의 통과가 혈장으로부터의 대부분의 또는 모든 NET의 제거를 제공한다는 예상 결과와 일치한다. 또한, 결과는, 카트리지 내의 NET 결합제가 7시간에 NET로 포화되지 않았고, 장치로 들어가는 혈장에 존재하는 모든 또는 대부분의 NET에 계속 결합하였음을 보여준다. 따라서, H3.1-뉴클레오솜의 수준 측정은, 언제 카트리지 내의 결합 물질이 포화되고 그에 따라 NET의 제거를 위한 도구로서 더 이상 유용하지 않고 신선한 카트리지로 교환되어야 하는지를 결정하기에 유용하다.
따라서, 도 6b 및 6c의 조합된 결과는, H3.1-뉴클레오솜의 수준 측정이 NETosis 및 패혈증의 치료에 대한 모니터 및 가이드로서 유용함을 보여준다.
모든 16마리의 돼지로부터 채취된 샘플에서 측정된 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대한 결과가 도 7a에 개별적으로 나타나 있다. 7시간에 대조군 돼지에서 관찰된 평균 H3.1-뉴클레오솜 수준은 361 ng/ml였고, 수준은 모든 대조군 돼지에서 120 ng/ml 초과였다 (범위 123-743 ng/ml). 반면, 7시간에 치료된 돼지에서 관찰된 평균 H3.1-뉴클레오솜 수준은 150 ng/ml였고, 수준은 대부분의 치료된 돼지 (9마리 중 7마리)에서 120 ng/ml 미만이었다 (범위 27-111 ng/ml). 결과는 혈장분리교환술 치료 방법의 효과를 입증한다. 결과는 또한, H3.1 뉴클레오솜의 수준이 패혈증 질환의 과정 및 정도에 대한 효과적인 모니터 및 치료 가이드 및 생체내 과량의 NETosis에 대한 치료 가이드임을 보여준다. 또한, 도 7a에서의 결과는, 순환 H3.1-뉴클레오솜 수준의 측정이, NET 또는 NETosis의 수준 감소를 위한 치료에 대한 적합한 후보물로서 NET의 상승된 수준을 갖는 개체를 식별하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
7마리의 대조군 돼지는 상승된 뉴클레오솜 수준을 가졌고, 또한 임상적 스트레스의 상승된 지표를 가졌으며, 보다 낮은 뉴클레오솜 수준을 갖는 7마리의 치료된 돼지에 비해 더 집중적인 의학적 지원을 필요로 하였다. 또한, 120 ng/ml 초과의 H3.1-뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 관찰된 2마리의 치료된 돼지 또한 임상적 스트레스의 상승된 지표를 가졌으며, 보다 집중적인 의학적 지원을 필요로 하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 NETosis 치료의 효능의 모니터링을 위한 성공적인 방법이다.
작업 동안 카트리지로부터 상류에서 혈장분리교환술 장치 내에서 채취된 샘플에서 측정된 혈장 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대한 결과가 도 7b에 모든 16마리의 돼지에 대해 개별적으로 나타나 있다. 도 6에 대해 상기에 기재된 바와 같이, 도 7b에 나타낸 결과는 도 7a에서의 것들과 유사하다. 7시간에 대조군 돼지에서 관찰된 평균 H3.1-뉴클레오솜 수준은 368 ng/ml (범위 121-629 ng/ml)였다. 반면, 7시간에 치료된 돼지에서 관찰된 H3.1-뉴클레오솜 수준은 143 ng/ml의 평균 결과를 가지며 보다 낮았다 (모든 치료된 9마리의 돼지에 대해). 7마리의 반응자 돼지에 대해, 7시간에서의 결과 범위는 34-127 ng/ml였다.
작업 동안 카트리지로부터 하류에서 혈장분리교환술 장치 내에서 채취된 샘플에서 측정된 혈장 H3.1-뉴클레오솜 수준에 대한 결과가 도 7c에 모든 16마리의 돼지에 대해 개별적으로 나타나 있다. 7시간에 대조군 돼지에 대해 측정된 H3.1-뉴클레오솜의 평균 수준은 378 ng/ml (범위 147-617 ng/ml)였다. 반면, 치료된 돼지에 대하여 7시간에 카트리지의 하류에서 혈장에서 관찰된 H3.1-뉴클레오솜의 평균 수준은 2.4 ng/ml (범위 0.7-6.5 ng/ml)였고, 모든 9마리의 치료된 돼지에 대해 모든 시점에 7 ng/ml 미만이었다.
도 7b 및 7c의 조합된 결과는, H3.1-뉴클레오솜의 수준 측정이 NETosis 및 패혈증의 치료에 대한 모니터 및 가이드로서 유용함을 보여준다.
조합하면, 도 7에 나타낸 결과는, 혈장분리교환술 치료 체제가 모든 9마리의 치료된 돼지의 순환으로부터 NET를 제거하는 데 있어 성공적이었음을, 또한 9마리 중 7마리의 돼지는 그 치료에 잘 반응하였지만 2마리는 비-반응자였음을 나타낸다. 이들 뉴클레오솜 결과는 돼지의 임상적 관찰과 매우 잘 상관되었다.
또한, 7마리의 치료 반응자 돼지는 관찰된 뉴클레오솜 결과에 기초하여 치료 비-반응자 돼지 및 치료되지 않은 돼지와 명백히 구별될 수 있다.
실시예 13
패혈증으로 진단된 20명의 인간 대상체 및 10명의 건강한 인간 대상체로부터 혈장 샘플을 얻었다. 혈장 샘플을 실시예 12에 기재된 바와 같은 자동화된 면역검정 기기를 사용하여 히스톤 이소형 H3.1을 함유하는 뉴클레오솜 (H3.1-뉴클레오솜) 수준에 대하여 검정하였다. 건강한 대상체에 비해 패혈증 샘플에서 상승된 수준이 관찰되었고, 이는 이 질환의 다양한 단계에서의 NETosis의 영향에 기인하는 것 같다 (도 8).
SEQUENCE LISTING <110> BELGIAN VOLITION SPRL <120> TRIAGING METHOD USING CELL FREE NUCLEOSOME LEVELS <130> VOL-C-P2776PCT <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Val Lys 1 5 10

Claims (35)

  1. (i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
    (ii) 단계 (i)을 1회 이상 반복하는 단계; 및
    (iii) 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준에서의 임의의 변화를 사용하여 대상체에서의 감염의 진행을 모니터링하는 단계
    를 포함하는, 감염을 앓고 있는 대상체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법.
  2. (i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
    (ii) 검출된 무세포 뉴클레오솜의 수준을 사용하여 상기 대상체에게 유해한 결과의 가능성을 지정하는 단계
    를 포함하며, 여기서 유해한 결과의 가능성이 높은 것으로 식별된 대상체에 의학적 개입이 지정되는 것인, 감염을 앓고 있는 대상체에게 유해한 결과의 위험을 지정하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 감염이 바이러스, 박테리아, 진균 또는 미생물 감염인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 감염이 기도 감염인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 기도 감염이 인플루엔자, 폐렴 및 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 체액 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 무세포 뉴클레오솜이 호중구 세포외 트랩의 부분이거나 그로부터 유래된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 무세포 뉴클레오솜의 구성요소가 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 후성유전적 특징이 히스톤 이소형, 예컨대 코어 뉴클레오솜의 히스톤 이소형, 특히 히스톤 H3 이소형인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 히스톤 이소형이 H3.1인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 후성유전적 특징이 히스톤 번역-후 변형 (PTM), 예컨대 코어 뉴클레오솜의 히스톤 PTM, 특히 히스톤 H3 또는 H4 PTM인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 히스톤 PTM이 시트룰린화 또는 리보실화로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을, 면역검정, 면역화학, 질량 분광법, 크로마토그래피, 염색질 면역침전 또는 바이오센서 방법을 사용하여 검출하거나 측정하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 또는 측정 방법이 체액 샘플을 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소를 검출하는 결합제를 포함하는 고체 상과 접촉시키고, 상기 결합제에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 또는 측정 방법이, (i) 샘플을 무세포 뉴클레오솜의 후성유전적 특징에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 제1 결합제에 의해 결합된 샘플을 무세포 뉴클레오솜에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 샘플에서 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 또는 동물 대상체인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 체액 샘플 중 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 하나 이상의 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 대조군이 건강한 대상체인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 대조군이 무증상 또는 경증을 나타내는 감염이 있는 대상체인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준이 대조군에 비해 상승된 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 무세포 뉴클레오솜의 수준을 측정의 패널 중 하나로서 검출하거나 측정하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 패널이 하나 이상의 인터류킨을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 인터류킨이 IL-6 및 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 패널이 C 반응성 단백질 (CRP), 미엘로퍼옥시다제 (MPO), D-이량체 및/또는 인자 VII-활성화 프로테아제 (FSAP)를 포함하는 것인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 패널이 MPO를 포함하는 것인 방법.
  27. (i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
    (ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을 대상체가 폐렴, 급성 호흡기 증후군 (ARS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 또는 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
    를 포함하는, 폐렴, ARS, ARDS 또는 SARS에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법.
  28. (i) 대상체로부터 얻은 체액 샘플을 결합제와 접촉시켜 무세포 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
    (ii) 무세포 뉴클레오솜의 수준을 대상체가 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 한다는 지표로서 사용하는 단계
    를 포함하는, 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 의학적 치료를 필요로 하는 대상체를 검출하는 방법.
  29. 뉴클레오솜 또는 그의 구성요소, 미엘로퍼옥시다제, 호중구 엘라스타제 또는 C-반응성 단백질에 결합하도록 지시된 치료적 항체의 투여를 포함하는, NETosis 관련 질환의 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, NETosis 관련 질환이 높은 수준의 호중구 세포외 트랩을 수반하는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, NETosis 관련 질환이 바이러스 또는 박테리아 감염인 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 항체가 온전한 뉴클레오솜에 존재하는 에피토프에 결합하도록 지시되는 방법.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 항체가 클리핑된 뉴클레오솜에 존재하는 에피토프에 결합하도록 지시되는 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 항체가 히스톤 H3.1 또는 시트룰린화된 히스톤인 뉴클레오솜의 구성요소에 결합하도록 지시되는 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 항체가 히스톤 H3.1의 아미노산 서열에서 아미노산 위치 30-33에 위치한 히스톤 H3.1 에피토프에 결합하도록 지시되는 방법.
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