KR20220152473A - Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of Bupleurum genus, primer set for discrimination of Bupleurum genus and uses thereof - Google Patents
Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of Bupleurum genus, primer set for discrimination of Bupleurum genus and uses thereof Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은 시호 속 식물 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 5종의 시호 속 식물 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 시호 속 식물 5종의 판별 방법, 및 시호 속 식물의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.The present invention relates to a set of markers and primers for distinguishing between species based on complete translation of chloroplast genome sequences of five species of plants of the genus Shiho, and uses thereof. More specifically, five kinds of SNP molecular markers for discrimination of plants of the genus Shiho, a primer set and probe set for amplifying the SNP molecular markers, a kit including the primer set and probe set, and plants of the genus Shiho using the primer set and probe set It relates to five types of identification methods and a microarray for discrimination of species of plants of the genus Shiho.
시호(Bupleurum falcatum)는 산형화목 미나리과 시호속(genus Bupleurum)에 속한 여러해살이풀로서, 상기 시호속은 약 200여 종의 식물로 구성된다. 시호 뿌리에는 사포닌과 지방유 등이 들어 있어 한방에서 해열·진통·강장제나 호흡기·소화기·순환기 질환에 약재로 쓴다. 한국과 일본 약전은 시호(Bupleurum falcatum)의 뿌리를 한약재 '시호'의 기원식물로 사용한다. 중국은 두메시호(Bupleurum chinense) 및 참시호(Bupleurum scorzonerifolium)의 뿌리를 한약재 '시호'의 기원식물로 사용한다. 이외에 시호속 식물로 등대시호(Bupleurum euphorbioides) 및 섬시호(Bupleurum latissimum)가 있다.Shiho ( Bupleurum falcatum ) is a perennial plant belonging to the genus Bupleurum, which is a umbel, and is composed of about 200 species of plants. Shiho root contains saponin and fatty oil, so it is used as a medicine for fever, pain relief, tonic, respiratory, digestive, and circulatory diseases in oriental medicine. The Korean and Japanese pharmacopeias use the root of Shiho ( Bupleurum falcatum ) as the origin plant of herbal medicine 'Shiho'. In China, the roots of Bupleurum chinense and Chamshiho ( Bupleurum scorzonerifolium ) are used as origin plants for herbal medicine 'Shiho'. Other plants of the genus Shiho include Bupleurum euphorbioides and Seoho Lake ( Bupleurum latissimum ).
시호속에 속하는 상기 식물들의 형태학적 유사성으로 인하여 국내의 경우 한약재 '시호'의 기원식물의 혼동이 발생하고 있는 실정이며, 정식 기원식물인 시호(Bupleurum falcatum)가 아닌 시호속에 속하는 다른 식물이 시호(Bupleurum falcatum)로 둔간하고 있는 실정이다. 이에 시호의 유전체 특성을 파악하여 품종 간의 차이를 확인할 필요가 있고, 더 나아가 유전자원 관리의 효율화와 신품종 개발을 위해 더 효율적이고 객관적인 구별 수단이 필요하다.Due to the morphological similarity of the plants belonging to the genus Shiho, there is confusion in the origin plant of the herbal medicine 'Shiho' in Korea, and other plants belonging to the genus Shiho, other than Bupleurum falcatum falcatum ). Therefore, it is necessary to identify the differences between breeds by identifying the characteristics of Shiho's genome, and furthermore, a more efficient and objective means of discrimination is needed for efficient management of genetic resources and development of new breeds.
일반적으로 절편 형태로 유통되는 약용 식물의 특성상 외형적인 특징으로 기원식물을 구분하기가 매우 어렵기 때문에 위품 또는 다른 종과의 혼용 문제가 일어나고 있다. 이를 해결하기 위해 보다 체계적이고 과학적인 종(species) 판별 기술이 요구되고 있으며, 이에 가장 적합한 방법은 DNA 수준에서 종(species)을 식별할 수 있는 분자마커를 활용하는 것이다.Due to the nature of medicinal plants that are generally distributed in the form of cuts, it is very difficult to distinguish the plant of origin based on external features, so problems with fake products or mixed use with other species are occurring. To solve this problem, a more systematic and scientific species identification technology is required, and the most suitable method for this is to use molecular markers that can identify species at the DNA level.
기존의 분자마커를 이용한 식물 DNA 바코딩의 경우 엽록체 유전체에서 변이가 많다고 알려진 rbcL, matK, trnH-GUG-pabA와 같은 특정 유전자나 유전자간 부위(intergenic region) 서열의 일부만을 대상으로 개발되어 왔다. 그러나 이들 지역을 증폭하기 위해서 사용되는 보편적인 바코딩 프라이머(universal barcoding primer)는 식물 종에 따라 PCR 증폭 효율이 떨어지거나 증폭이 되지 않는 문제점이 있으며, 증폭이 되었다 할지라도 염기서열의 다형성이 존재하지 않을 수 있는 문제점이 있다. 또한 이들 고변이 지역은 식물에 따라서는 동일한 종내에서도 변이가 발견되는 경우가 있어 동일종을 다른 종으로 구분할 수 있는 가능성을 내포하고 있다. In the case of plant DNA barcoding using existing molecular markers, it has been developed targeting only a part of specific genes or intergenic region sequences such as rbcL, matK, and trnH-GUG-pabA, which are known to have a lot of variation in the chloroplast genome. However, universal barcoding primers used to amplify these regions have a problem in that PCR amplification efficiency is reduced or not amplified depending on the plant species, and even if amplified, polymorphism of the base sequence does not exist. There are problems that may not exist. In addition, these highly mutated regions imply the possibility of classifying the same species into different species, as variations may be found even within the same species, depending on the plant.
현재까지 DNA 수준에서 한약재로 널리 사용되고 있는 시호의 기원종을 대상으로 한 판별법은 보고된 바 없다.Until now, there has been no report on the discrimination method for the origin species of Shiho, which is widely used as a herbal medicine at the DNA level.
이에 본 발명자들은 엽록체 유전체의 일부 지역이 아닌 엽록체 전장 유전체 서열을 분석하여 시호 속 식물의 주요 5종간의 다형성이면서 보다 신뢰할 수 있는 변이 지역을 탐색하여 기원종을 구별하는 분자마커를 개발하고, 좀 더 실용적인 시호의 기원종 판별 기법을 개발하고자 하였다.Accordingly, the present inventors analyzed the chloroplast genome sequence, rather than a part of the chloroplast genome, to search for a more reliable mutational region that is a polymorphism among the five main species of the genus Shiho, to develop a molecular marker that distinguishes the species of origin, and to develop a more This study tried to develop a technique for identifying the species of origin of a practical posthumous name.
본 발명의 목적은 시호 속 식물 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide a set of markers and primers for distinguishing between species based on complete translation of chloroplast genome sequences of 5 species of plants of the genus Shiho, and a use thereof.
상세하게는, 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 참시호(Bupleurum scorzonerifolium), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 및 섬시호(Bupleurum latissimum) 5종의 시호 속(genus) 식물의 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 시호 속 5종의 판별 방법, 및 시호 속의 종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.Specifically, Shiho ( Bupleurum falcatum ), Dumeshiho ( Bupleurum chinense ), Chamshiho ( Bupleurum scorzonerifolium ), Lighthouse Shiho ( Bupleurum euphorbioides ), and Seomshiho ( Bupleurum latissimum ) For discrimination of five species of Shiho genus plants SNP molecular marker, a primer set and probe set for amplification of the SNP molecular marker, a kit including the primer set and probe set, a method for discriminating five species of the genus Shiho using the primer set and probe set, and a microcomputer for discriminating species of the genus Shiho. to provide an array.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 시호 속(Bupleurum) 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 참시호(Bupleurum scorzonerifolium), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 및 섬시호(Bupleurum latissimum)를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention contains a polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 8 showing single nucleotide polymorphism between species of Shiho genus ( Bupleurum ) plant, Shiho ( Bupleurum falcatum ) Provides a composition for distinguishing any one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Bupleurum chinense , Bupleurum scorzonerifolium , Bupleurum euphorbioides , and Bupleurum latissimum . .
또한, 본 발명은 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 12 및 13으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 18 및 19로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a primer set represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 12 and 13; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 15 and 16; And a primer set represented by SEQ ID NOs: 18 and 19; a primer set for distinguishing any one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, True Lake, Lighthouse Shiho, and Seomshiho, including; to provide.
또한, 본 발명은 서열번호 11로 표시되는 프로브; 서열번호 14로 표시되는 프로브; 서열번호 17로 표시되는 프로브; 및 서열번호 20으로 표시되는 프로브;를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a probe represented by SEQ ID NO: 11; The probe represented by SEQ ID NO: 14; The probe represented by SEQ ID NO: 17; And a probe represented by SEQ ID NO: 20; to provide a probe set for distinguishing any one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, Chamshi, Lighthouse Shiho, and Seomshi, including Shiho.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 상기 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention is any one from the species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumesiho, Chamshiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho, including the primer set, the probe set, and reagents for performing an amplification reaction. A kit for distinguishing the above species is provided.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for discriminating one or more species from the species of plants of the genus Shiho including Shiho, Dumesiho, Chamsiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho using the primer set and the probe set.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치인 151번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.In addition, in the polymorphic nucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8, the present invention is one or more polymorphic nucleotides selected from polymorphic nucleotides consisting of 10 or more consecutive bases including the 151st base, each SNP position, or its complement Provided is a microarray for discriminating any one or more species from the species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, True Sea, Lighthouse Sea, and Island Sea, including red polymorphic nucleotides.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 한약재 시호의 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하며, 이를 통해 한약재 시호의 유통 및 품질 관리 등에 이용될 수 있다. 즉, 기원 식물의 정확한 판별을 통해 생약제의 혼용 및 오용을 방지할 수 있으며, 한약재 원재료의 품질을 과학적으로 유지 관리할 수 있다.Using the single nucleotide polymorphism marker (SNP marker) according to the present invention, it is possible to determine the plant of origin and origin of the herbal medicinal material Shiho, and through this, it can be used for distribution and quality control of the herbal medicinal material Shiho. In other words, it is possible to prevent the mixed use and misuse of herbal medicines through the accurate identification of the plant of origin, and the quality of herbal medicine raw materials can be scientifically maintained.
도 1은 시호의 완전한 엽록체 유전체를 보여주는 도면이다. 여기에서, 유색 박스는 유전자 산물의 기능에 근거하여 분류된 보존된 엽록체 유전자를 나타낸 것이다. 또한, 원의 안쪽에 위치한 유전자는 반시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸 것이며, 원의 바깥에 위치한 유전자는 시계 방향으로 전사가 이루어지는 유전자들을 나타낸 것이다. 한편, 안쪽 원의 점선 지역은 엽록체 게놈의 GC 함량을 의미한다.
도 2는 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 참시호(Bupleurum scorzonerifolium), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 및 섬시호(Bupleurum latissimum) 5종을 대상으로 FenDEL-qPCR 방법으로 분석한 4개 분자마커 별 증폭곡선 및 +, - 형질 판단 결과를 나타낸 도면이다. 각 마커별 증폭 곡선 중에서 파랑색 선은 내부 대조구의 증폭 결과를 보여주는 것이며, 빨강색 선은 각 마커의 증폭 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, 각 마커별 +, - 형질 판단은 내부 대조구(파랑색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)과 SNP 마커(빨강색) 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하는 것으로서, 이는 즉 SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 참시호(Bupleurum scorzonerifolium), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 및 섬시호(Bupleurum latissimum) 5종에 대한 5개의 SNP 마커의 서열 정보를 나타낸 도면이다.Figure 1 is a diagram showing the complete chloroplast genome of Shiho. Here, colored boxes represent conserved chloroplast genes that are classified based on the function of the gene product. In addition, genes located inside the circle represent genes transcribed in a counterclockwise direction, and genes located outside the circle represent genes transcribed in a clockwise direction. On the other hand, the dotted line area in the inner circle means the GC content of the chloroplast genome.
Figure 2 is Shiho ( Bupleurum falcatum ), Dumeshi Lake ( Bupleurum chinense ), Chamsiho ( Bupleurum scorzonerifolium ), Lighthouse Shiho ( Bupleurum euphorbioides ), and Seomshiho ( Bupleurum latissimum ) 4 analyzed by the FenDEL-qPCR method for five species. It is a diagram showing the amplification curve for each molecular marker and the results of +, - character determination. Among the amplification curves for each marker, the blue line shows the amplification result of the internal control, and the red line shows the amplification result of each marker. Here, +, - traits for each marker are judged by comparing the ΔRn value (y-axis) of the internal control (blue) amplification curve and the ΔRn value (y-axis) of the SNP marker (red) amplification curve, That is, if the ΔRn value (y-axis) of the SNP marker amplification curve is greater than the ΔRn value (y-axis) of the internal control amplification curve, '+' is judged, and if it is smaller, '-' is judged and displayed.
Figure 3 is a sea lake ( Bupleurum falcatum ), dumeshi lake ( Bupleurum chinense ), true sea lake ( Bupleurum scorzonerifolium ), lighthouse sea lake ( Bupleurum euphorbioides ), and island sea lake ( Bupleurum latissimum ) according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing sequence information of dog SNP markers.
본 발명은 5종의 시호 속에 속하는 식물, 즉 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 참시호(Bupleurum scorzonerifolium), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 및 섬시호(Bupleurum latissimum)의 엽록체 유전체 서열을 완전 해독하고, 이를 기반으로 한 종간 판별용 SNP 분자 마커, 상기 SNP 분자 마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 세트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용한 시호 속 식물 5종의 판별 방법, 및 시호 속 식물의 종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.The present invention relates to chloroplast genome sequences of plants belonging to five genus Shiho, namely Bupleurum falcatum , Bupleurum chinense , Bupleurum scorzonerifolium , Bupleurum euphorbioides , and Bupleurum latissimum . completely deciphered, and based on this, SNP molecular markers for discrimination between species, primer sets and probe sets for amplification of the SNP molecular markers, kits including the primer sets and probe sets, plants of the genus Shiho using the primer sets and probe sets It relates to five types of identification methods and a microarray for discrimination of species of plants of the genus Shiho.
하나의 양태로서, 본 발명은 시호 속(Bupleurum) 식물의 종 간에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 보이는 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 참시호(Bupleurum scorzonerifolium), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 및 섬시호(Bupleurum latissimum)를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물을 제공한다.In one aspect, the present invention is a polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8 showing single nucleotide polymorphism between species of plants of the genus Shiho ( Bupleurum ), Bupleurum falcatum , dume A composition for distinguishing one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Bupleurum chinense , Bupleurum scorzonerifolium , Bupleurum euphorbioides , and Bupleurum latissimum .
상기 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드는 각 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 다형성 뉴클레오티드로, 상기 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미한다.The polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8 is a polymorphic nucleotide containing a single nucleotide polymorphism (SNP) located at the 151st base in each nucleotide sequence, and the term "single nucleotide polymorphism (SNP)" )" means that one of the nucleotide sequences consisting of A, T, C, and G on the genome is changed to another nucleotide sequence.
본 발명의 일실시예에 따른 상기 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 대한 SNP 다형성 염기 정보는 도 3에 나타내었다.SNP polymorphic base information for polymorphic nucleotides consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8 according to an embodiment of the present invention is shown in FIG. 3 .
구체적으로, 상기 조성물은 서서열번호 1의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP; 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP;로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함할 수 있다.Specifically, the composition is a single nucleotide polymorphism (SNP) in which the 151st base is A in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; SNP in which the 151st base is T in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A SNP in which the 151st base is G in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; a SNP in which the 151st base is T in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; SNP in which the 151st base is T in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; A SNP in which the 151st base is A in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; a SNP in which the 151st base is G in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; and a SNP in which the 151st base is A in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8;
본 발명의 일실시예에 따른 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 조성물에 있어서, SNP 다형성을 포함하는 서열번호 1, 2, 5, 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 시호 속 식물 5종 중에서 시호(Bupleurum falcatum)를 구별할 수 있고; 서열번호 1, 2, 3, 4, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 시호 속 식물 5종 중에서 두메시호(Bupleurum chinense)를 구별할 수 있으며; 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 시호 속 식물 5종 중에서 참시호(Bupleurum scorzonerifolium)를 구별할 수 있으며; 서열번호 3 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 시호 속 식물 5종 중에서 등대시호(Bupleurum euphorbioides)를 구별할 수 있으며; 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 사용하면, 시호 속 식물 5종 중에서 섬시호(Bupleurum latissimum)를 구별할 수 있다(도 2 및 도 3참조).In the composition for distinguishing one or more species from species of plants of the genus Shiho according to an embodiment of the present invention, a polymorphism consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 7 and 8 including SNP polymorphisms Using nucleotides, it is possible to distinguish Bupleurum falcatum among the five plants of the genus Shiho; Using the polymorphic nucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 7 and 8, it is possible to distinguish Bupleurum chinense among 5 species of plants of the genus Shiho; Using polymorphic nucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8, it is possible to distinguish Bupleurum scorzonerifolium among 5 species of plants of the genus Shiho; Using polymorphic nucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 8, Bupleurum euphorbioides can be distinguished among 5 species of plants of the genus Siho; When polymorphic nucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 are used, among the five species of plants of the genus Shiho, Bupleurum latissimum can be distinguished (see FIGS. 2 and 3).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 12 및 13으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 18 및 19로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a set of primers represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 12 and 13; Primer sets represented by SEQ ID NOs: 15 and 16; And a primer set represented by SEQ ID NOs: 18 and 19; a primer set for distinguishing any one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, True Lake, Lighthouse Shiho, and Seomshiho, including; to provide.
본 발명에서 용어 "구별"은 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 5종의 시호 속 식물 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 품종의 다양성을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '판별'과 혼용하여 사용할 수 있다.In the present invention, the term "distinction" means to distinguish by determining the diversity of varieties by the primer set of the present invention from five species of Shiho genus plant samples including Shiho, Dumeshi, Chamshiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho. It means, and can be used interchangeably with 'discrimination'.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, the term "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and serves as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should permit the synthesis of extension products to begin, and the specific length and sequence of the primers depend on the required complexity of the DNA or RNA target as well as the conditions of use of the primers, such as temperature and ionic strength. something to do.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX이다. 표적 서열의 증폭 시 대립유전자(allele) 특이적인 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.In the present invention, the primer may further include a DNA intercalating material that emits fluorescence, phosphorescence or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance is FAM or HEX. When amplifying a target sequence, PCR is performed by labeling FAM or HEX at the 5'-end of an allele-specific primer, and the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling material.
본 발명에서 용어 "프라이머 세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다.In the present invention, the term "primer set" means a plurality of primers. In addition, the primer set may further include a container for accommodating the primers. A primer is a base sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form base pairs with a complementary template and refers to a short base sequence that functions as a starting point for template strand copying. . Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four nucleosite triphosphates for polymerization at an appropriate buffer solution and temperature. Primers can be oligonucleotides, which can include nucleotide analogs, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates, or peptide nucleic acids, or inserts ( intercalating agent). The primer may be prepared through a chemical synthesis method using a phosphoramidite method, a phosphodiester method, a diethylphosmoramidite method, or the like. In addition, the primer sequence may be modified by means known in the art.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 11로 표시되는 프로브; 서열번호 14로 표시되는 프로브; 서열번호 17로 표시되는 프로브; 및 서열번호 20으로 표시되는 프로브;를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 프로브 세트를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a probe represented by SEQ ID NO: 11; The probe represented by SEQ ID NO: 14; The probe represented by SEQ ID NO: 17; And a probe represented by SEQ ID NO: 20; to provide a probe set for distinguishing any one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, Chamshi, Lighthouse Shiho, and Seomshi, including Shiho.
본 발명에서 용어 "프로브(probe)"란 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.In the present invention, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases to several hundred bases as short as possible to form a specific binding to a gene or mRNA, and oligonucleotide It can be manufactured in the form of a probe, single stranded DNA probe, double stranded DNA probe, RNA probe, etc., and can be labeled for easier detection.
본 발명의 프로브는 DNA 폴리머레이즈의 FEN (Flap endonuclease) 특이도를 이용하는 RT-PCR 기반의 대립유전자 특이 프로브로서, 프로브는 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다.The probe of the present invention is an allele-specific probe based on RT-PCR using FEN (Flap endonuclease) specificity of DNA polymerase. The probe has a polymorphic site in nucleic acid fragments derived from two members of the same species, so that one member It hybridizes to DNA fragments derived from, but not to fragments derived from other members.
전술한 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The above primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phossotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.) or to charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
본 발명에 이용되는 프라이머 또는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10개 이상, 바람직하게는 10-100개의 연속 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.As the primers or probes used in the present invention, a sequence perfectly complementary to the sequence containing the SNP may be used, but a sequence substantially complementary within a range that does not interfere with specific hybridization is used. may also be used. Specifically, the probe used in the present invention comprises a sequence capable of hybridizing to a sequence comprising 10 or more, preferably 10-100 consecutive nucleotide residues comprising the SNP of the present invention. More specifically, the 3'-end or 5'-end of the probe has a base complementary to the SNP base. In general, since the stability of a duplex formed by hybridization tends to be determined by the matching of the sequence at the end, in a probe having a base complementary to the SNP base at the 3'-end or 5'-end, the end If the parts do not hybridize, these duplexes can be disassembled under stringent conditions.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.Suitable conditions for hybridization are Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) and Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Stringent conditions used for hybridization can be determined by controlling the presence of compounds such as temperature, ionic strength (buffer concentration) and organic solvent. These stringent conditions may be determined differently depending on the sequences to be hybridized.
본 발명에서, 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, "실질적으로 상보적인 서열"은 완전히 일치되는 서열 뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.In the present invention, the term "complementary" means that a primer or probe is sufficiently complementary to selectively hybridize to a target nucleic acid sequence under predetermined annealing or hybridization conditions, substantially complementary and completely complementary ( It has a meaning that encompasses all things that are perfectly complementary, and specifically means that it is completely complementary. In this specification, the term "substantially complementary sequence" used in relation to a primer sequence refers not only to a completely identical sequence, but also to a sequence that is partially matched to a sequence to be compared within the range of being able to anneal to a specific sequence and act as a primer. It is meant to include sequences that are inconsistent.
전술한 프라이머 세트 및 프로브 세트 중 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 11로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 1 또는 2 (ID: SNP#1)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) A와 T를, 서열번호 12 및 13으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 14로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 3 또는 4 (ID: SNP#2)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) G와 T를, 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 17로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 5 또는 6 (ID: SNP#6)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) A와 G를, 서열번호 18 및 19로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 20으로 표시되는 프로브 세트는 서열번호 7 또는 8 (ID: SNP#7)의 151번째 염기인 단일염기다형성(SNP) G와 A를 구별하는 것을 특징으로 한다.Among the above-described primer sets and probe sets, the primer set represented by SEQ ID NOs: 9 and 10 and the probe set represented by SEQ ID NO: 11 are single nucleotide polymorphism (SNP), which is the 151st base of SEQ ID NO: 1 or 2 (ID: SNP#1) ) For A and T, the primer set represented by SEQ ID NOs: 12 and 13 and the probe set represented by SEQ ID NO: 14 have a single nucleotide polymorphism (SNP) at the 151st base of SEQ ID NO: 3 or 4 (ID: SNP#2) G and T, the primer set represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 and the probe set represented by SEQ ID NO: 17 are single nucleotide polymorphisms (SNPs) A and G, which are the 151st base of SEQ ID NO: 5 or 6 (ID: SNP#6) The primer set represented by SEQ ID NOs: 18 and 19 and the probe set represented by SEQ ID NO: 20 distinguish single nucleotide polymorphism (SNP) G and A, which are the 151st base of SEQ ID NO: 7 or 8 (ID: SNP#7) It is characterized by doing.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 상기 프로브 세트, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention is a plant of the genus Shiho, including the primer set, the probe set, and reagents for carrying out the amplification reaction, including Shiho, Dumeshiho, Chamshiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho Provided is a kit for distinguishing any one or more species from species of.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.Reagents for performing the amplification reaction in the kit of the present invention may include DNA polymerase, dNTPs, and buffers. The dNTP mixture includes dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, and commercially available thermostable DNA polymerases such as Taq DNA polymerase and Tth DNA polymerase may be used as the thermostable DNA polymerase. In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performance conditions. The guide is a printout explaining how to use the kit, eg, how to prepare the PCR buffer, and the reaction conditions to be presented. The guide includes a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
한편, 본 발명에 따른 키트는 내부 대조구인 rbcL 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 26 및 27로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 28로 표시되는 프로브를 더 포함할 수 있다.Meanwhile, the kit according to the present invention may further include primer sets represented by SEQ ID NOs: 26 and 27 capable of amplifying the rbcL gene as an internal control, and a probe represented by SEQ ID NO: 28.
상기 키트는 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 구별하기 위한 키트로서, 전술한 내부 대조구와 함께 증폭되는 것을 특징으로 하는 한약재 시호 기원 식물 및 원산지 구별용 키트일 수 있다.The kit is a kit for distinguishing any one or more species from the species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshiho, Chamshiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho, and is a herbal medicine characterized in that it is amplified together with the aforementioned internal control. It may be a kit for identifying plants of Shiho origin and country of origin.
상기 키트는 5개의 SNP 마커(SNP#1, SNP#2, SNP#6, SNP#7)를 분석하기 위한 중합효소의 플랩 엔도뉴클레아제(flap endonuclease) 활성 억제 원리가 적용된 대립유전자 특이 실시간중합효소연쇄반응(FenDEL-qPCR)법을 이용하여, 5개의 SNP 마커의 증폭 유무 조합으로 한약재 시호 기원 식물 및 원산지를 판정할 수 있다.The kit is allele-specific real-time polymerization applied with the principle of inhibiting flap endonuclease activity of polymerase to analyze 5 SNP markers (SNP#1,
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시호 속 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상술한 프라이머 세트 및 상술한 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법을 제공한다.As another aspect, the present invention comprises the steps of isolating genomic DNA from a plant sample of the genus Shiho; amplifying polymorphic nucleotides by performing an amplification reaction using the isolated genomic DNA as a template and using the above-described primer set and the above-described probe set; And detecting a product of the amplification step, providing a method for discriminating one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, Chamsiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho.
본 발명의 방법에 있어서, 시호 속 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.In the method of the present invention, the method of isolating genomic DNA from a plant sample of the genus Shiho can be performed through a conventional method known in the art, and the method is a phenol / chloroform extraction method, an SDS extraction method (Tai et al., Plant Mol Biol.Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB separation method (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), or using a commercially available DNA extraction kit. can be done
상기 분리된 시호 속 식물 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 시호 속 식물 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. The target sequence may be amplified by performing an amplification reaction using the genomic DNA of the isolated plant sample of the genus Shiho as a template and using one or more primer sets and probe sets according to an embodiment of the present invention. Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among these, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to the target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used. PCR can be performed using a PCR reaction mixture containing various components known in the art required for PCR reactions. The PCR reaction mixture includes genomic DNA extracted from a plant sample of the genus Shiho to be analyzed, a primer set and a probe set provided in the present invention, as well as appropriate amounts of DNA polymerase, dNTP, PCR buffer, and water. The PCR buffer solution includes Tris-HCl (Tris-HCl), MgCl 2 , KCl and the like.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브 세트는 상기에 기재된 바와 같다.In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. The labeling material may be a material that emits fluorescence, phosphorescence or radioactivity, but is not limited thereto. The labeling material may be FAM or HEX. When the target sequence is amplified, PCR is performed by labeling the 5'-end of the primer with FAM or HEX, and the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling material. In addition, when a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution during PCR, radioactive is incorporated into the amplification product as the amplification product is synthesized, and the amplification product can be radioactively labeled. One or more primer sets and probe sets used to amplify the target sequence are as described above.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치인 151번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.In another aspect, the present invention relates to polymorphic nucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8, wherein at least one polymorphic nucleotide selected from polymorphic nucleotides consisting of 10 or more consecutive bases including the 151st base of each SNP position. Provided is a microarray for discriminating any one or more species from the species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumesi, True Sea, Lighthouse Seaho, and Seoho, including polymorphic nucleotides or their complementary polymorphic nucleotides.
상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.The polymorphic nucleotide may be immobilized on a substrate coated with an active group of amino-silane, poly-L-lysine or aldehyde, but is not limited thereto. The substrate may be a silicon wafer, glass, quartz, metal or plastic, but is not limited thereto. As a method for immobilizing the polymorphic nucleotide on a substrate, a micropipetting method using a piezoelectric method, a method using a pin-type spotter, or the like may be used.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.The microarray according to the present invention can be prepared by a conventional method known to those skilled in the art using the polymorphic nucleotide according to the present invention or its complementary nucleotide, the polypeptide encoded thereby, or its cDNA.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1: 식물 재료 준비Example 1: Plant material preparation
한약재 시호의 기원 식물종 및 원산지 구별 마커를 개발하고자, 식물 재료로서 시호(Bupleurum falcatum), 두메시호(Bupleurum chinense), 등대시호(Bupleurum euphorbioides), 섬시호(Bupleurum latissimum) 각 1점씩을 한국한의약진흥원으로부터 수집하고, 차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing)을 통해 상기 4종의 시호(Bupleurum) 속에 대한 엽록체 유전체의 염기서열을 분석하였다.In order to develop markers for distinguishing the origin plant species and place of origin of herbal medicinal materials Shiho, Korea Institute of Oriental Medicine ( KIMDA ) used 1 point each of Bupleurum falcatum , Bupleurum chinense , Bupleurum euphorbioides , and Seomshiho as plant materials. were collected from, and the chloroplast genome sequences of the four genera of Bupleurum were analyzed through Next Generation Sequencing (NGS).
마커 검증을 위한 검증 시료로서 시호는 3개 집단 32점, 두메시호는 1개 집단 30점, 등대시호는 6개 집단 26점, 성시호는 3개 집단 30점, 참시호는 3개 집단 11점, 총 20개 집단, 113개체를 이용하였다(표 1 참조).As verification samples for marker verification, Shiho has 32 points in 3 groups, Dumesi Lake has 30 points in 1 group, Lighthouse Lake has 26 points in 6 groups, Seongsi Lake has 30 points in 3 groups, and Chamsi Lake has 11 points in 3 groups. , a total of 20 groups and 113 individuals were used (see Table 1).
하기 표 1에 마커 개발에 사용된 시료를 정리하여 나타내었다.Table 1 below summarizes the samples used for marker development.
성상sample
appearance
실시예 2: 게놈 DNA 추출Example 2: Genomic DNA extraction
상기 실시예 1에서 준비된 각 검체의 게놈 DNA는 NucleoSpin Plant Ⅱ(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 게놈 DNA의 양은 Qubit dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen)을 사용하여 측정하였다. 차세대염기서열분석(NGS)용 검체의 DNA 농도는 총 200ng 이상, 마커 검증용 시료는 최소 0.5ng/㎕씩을 준비하였다.Genomic DNA of each sample prepared in Example 1 was extracted using NucleoSpin Plant II (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) according to the manufacturer's instructions. The amount of extracted genomic DNA was measured using the Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen). The total DNA concentration of samples for next-generation sequencing (NGS) was 200 ng or more, and samples for marker verification were prepared at least 0.5 ng/μl.
실시예 3: 차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing)Example 3: Next Generation Sequencing (NGS)
NEBNext Ultra™ Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina (NEBNext-NGS Kit)를 이용하여 상기 실시예 2에서 수득한 각 검체별 게놈 DNA를 대상으로 NGS 분석 라이브러리를 제작하였다. NGS 분석 대상 검체별로 구분되는 색인 어댑터를 사용하였고, 세부적인 라이브러리 제작 과정은 제품 매뉴얼에 따라 수행하였다. 제작된 각 라이브러리는 TapStation HSD5000(Agilent)을 이용하여 상태를 분석하고, NGS 분석 적합성을 판정하였다.An NGS analysis library was prepared using the NEBNext Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEBNext-NGS Kit), targeting the genomic DNA of each sample obtained in Example 2. Index adapters classified by NGS analysis target samples were used, and the detailed library production process was performed according to the product manual. Each prepared library was analyzed using a TapStation HSD5000 (Agilent), and suitability for NGS analysis was determined.
NGS를 이용한 대량의 유전체 염기서열 데이터 생산은 일루미나(Illumina) 플랫폼을 이용하였고, 분석 리드 형태와 길이는 Pair-end, 151 방식으로 분석하였다. 검체 당 1 Gb의 데이터양을 생성하였다.The Illumina platform was used to produce large amounts of genome sequence data using NGS, and the analysis lead type and length were analyzed in the Pair-end, 151 method. A data volume of 1 Gb per sample was generated.
실시예 4: 식물 검체의 엽록체 유전체 염기서열의 조립 및 유전자 예측Example 4: Assembly and gene prediction of chloroplast genome sequences of plant specimens
상기 실시예 2에서 수득한 각 검체별 게놈 DNA를 대상으로 분석된, 각 검체의 엽록체 전체 유전체 염기서열은 ㈜제노텍의 '세포소기관 유전체 염기서열 조립 및 검증 시스템'을 이용하여 완성하였다(도 1 참조). 조립 및 검증이 완료된 각 시료의 엽록체 유전체 염기서열의 길이는 시호는 155,833bp, 두메시호는 155,547bp, 등대시호는 154,871bp, 섬시호는 155,568bp이며(표 2 참조), 각 엽록체 유전체의 유전자 예측 분석 결과 유전자들의 순서와 방향 등이 종간에 매우 잘 보존되어 있음을 확인하였다(도 1 참조). 시호 속 식물의 엽록체 유전체는 82~85개의 단백질을 만드는 유전자(CDS), 30~33개의 tRNA 유전자, 및 4개의 rRNA 유전자로 구성되어 있음을 확인하였으며, 구조상으로 1개의 LSC(large single copy region), 1개의 SSC(small single copy region), 및 2개의 IR(inverted repeat region)을 가지고 있음을 확인하였다.The entire genome sequence of the chloroplast of each sample, analyzed for the genomic DNA of each sample obtained in Example 2, was completed using the 'organelle genome sequence assembly and verification system' of Genotech Co., Ltd. (FIG. 1 Reference). The length of the chloroplast genome sequence of each sample that has been assembled and verified is 155,833 bp for Sea Lake, 155,547 bp for Dume City Lake, 154,871 bp for Lighthouse Sea Lake, and 155,568 bp for Seo Lake (see Table 2). Gene prediction of each chloroplast genome As a result of the analysis, it was confirmed that the order and direction of the genes were very well conserved between species (see FIG. 1). It was confirmed that the chloroplast genome of plants of the genus Shiho consists of 82 to 85 protein-making genes (CDS), 30 to 33 tRNA genes, and 4 rRNA genes, structurally one LSC (large single copy region) , it was confirmed that it has one small single copy region (SSC), and two inverted repeat regions (IRs).
하기 표 2에 각 검체별 엽록체 유전체 염기서열 조립 결과를 정리하여 나타내었다.Table 2 below summarizes the results of assembling the chloroplast genome sequence for each sample.
(Total reads)total lead
(Total reads)
(Aligned reads)aligned leads
(Aligned reads)
(Organelle genome %)Organelle genome %
(Organelle genome %)
(x)Cov.
(x)
실시예 5: 종간의 엽록체 유전체 염기서열 변이 분석 및 후보 유전자 마커 선발Example 5: Chloroplast genome sequence variation analysis between species and selection of candidate gene markers
시호 엽록체(Dioscorea polystachya chloroplast, GenBank DB No. KM207676)의 염기서열 정보를 기준으로, 시호 속 식물 4종의 엽록체 유전체 염기서열을 1:1 비교하여 종 및 원산지 구분 마커로 활용 가능한 단일염기다형성(Single Nucleotide polymorphism; SNP)과 삽입-결실(InDel) 변이를 분석하였다(표 3 참조). Based on the nucleotide sequence information of Shiho chloroplast (Dioscorea polystachya chloroplast, GenBank DB No. KM207676), chloroplast genome sequences of four species of Shiho genus were compared 1:1 to determine single nucleotide polymorphism (Single nucleotide polymorphism) that can be used as a species and place of origin classification marker. Nucleotide polymorphism (SNP) and insertion-deletion (InDel) mutations were analyzed (see Table 3).
하기 표 3에 시호, 두메시호, 등대시호, 및 섬시호의 엽록체 유전체 염기서열 변이를 정리하여 나타내었다.In Table 3 below, the chloroplast genome sequence variations of Shiho, Dumesi, Lighthouse Shiho, and Seomshiho are summarized and shown.
(GenBank #)reference dielectric
(GenBank#)
기준 유전체의 염기서열(GenBank DB No. KM207676)과 비교대상 별 분석 결과를 통합한 후 ㈜제노텍의 'SNP Barcode Generator'를 이용하여 9개의 SNP로 구성된 종 특이 SNP 마커 세트(SNP Barcode marker), 즉 후보 유전자 마커를 선발하였다(표 4 참조).After integrating the base sequence of the reference genome (GenBank DB No. KM207676) and the analysis results for each comparison target, Genotech Co., Ltd.'s 'SNP Barcode Generator' was used to create a species-specific SNP marker set consisting of 9 SNPs (SNP Barcode marker), That is, candidate genetic markers were selected (see Table 4).
하기 표 4에 시호, 두메시호, 등대시호, 및 섬시호 종 특이 SNP 마커 세트를 정리하여 나타내었다.In Table 4 below, the species-specific SNP marker sets of Lake Shiho, Lake Dumeshi, Lake Lighthouse, and Lake Seom are summarized and shown.
(Locus)locus
(Locus)
(Position)location *
(Position)
(위치*: 참조 게놈 엽록체 염기서열 기준 위치)(Position * : Reference genome chloroplast base sequence reference position)
실시예 6: 검증 시료 집단별 후보 유전자 마커 검증 및 최종 SNP 마커 선발 Example 6: Verification of Candidate Gene Markers by Verification Sample Group and Selection of Final SNP Markers
상기 실시예 3에서 수행한 NGS 분석법을 이용하여 마커 검증을 위해 준비된 20개 집단, 113점 시료(시호 33점, 두메시호 31점, 등대시호 7점, 섬시호 31점, 참시호 11점)를 대상으로 각 집단별 9개의 SNP에 대한 유전형을 분석하였으며(표 5 참조), 그 결과를 토대로 4개의 SNP 마커를 한약재 시호의 기원 식물과 원산지를 판별할 수 있는 마커로서 확정하였다(표 6 참조).Using the NGS analysis method performed in Example 3, 20 groups and 113 sample samples prepared for marker verification (Sea Lake 33 points, Dume City Lake 31 points, Lighthouse Sea Lake 7 points, Seom Shi Lake 31 points,
하기 표 5에 검증 시료 집단 별 SNP 마커 유전형 분석 결과를 정리하여 나타내었다. 또한, 하기 표 6에 최종 선발된 SNP 분자마커와 유전형을 정리하여 나타내었다.Table 5 below summarizes the results of genotyping of SNP markers for each group of verification samples. In addition, the finally selected SNP molecular markers and genotypes are summarized in Table 6 below.
실시예 7: FenDEL-qPCR 기반의 한약재 시호의 기원 식물 및 원산지 판별 키트 개발 Example 7: Development of FenDEL-qPCR-based herbal medicinal material Shiho origin plant and country of origin determination kit
FenDEL_qPCR법을 이용하여 각 시료별 SNP 마커 유전형을 분석하고자, 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 프라이머 및 프로브 세트를 이용하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 ㈜제노텍의 올리고뉴클레오티드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다. In order to analyze the genotype of SNP markers for each sample using the FenDEL_qPCR method, primer and probe sets shown in Table 7 were used. Primer and probe sets were prepared using Genotech's oligonucleotide synthesis system.
하기 표 7에 분자마커 분석용 프라이머 및 프로브 세트를 정리하여 나타내었다.Table 7 below summarizes primers and probe sets for molecular marker analysis.
(Marker ID)marker ID
(Marker ID)
(Locus)locus
(Locus)
[Primer/Probe Sequence(5'-3')]Primer/Probe Sequences (5'-3')
[Primer/Probe Sequence (5'-3')]
번호order
number
setSNP markers
set
* 정방향 프라이머: F* Forward Primer: F
* 역방향 프라이머: R* Reverse Primer: R
* 프로브: P* Probe: P
또한, FenDEL-qPCR 반응을 위해 SNP 마커 별로 하기 표 8에 나타낸 바와 같은 조건으로 반응물을 제조하고, 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. PCR은 ABI7500 실시간 PCR 시스템(ABI7500 Real-Time PCR System)을 이용하였다.In addition, for the FenDEL-qPCR reaction, reactants were prepared under the conditions shown in Table 8 below for each SNP marker, and real-time polymerase chain reaction was performed. PCR was performed using ABI7500 Real-Time PCR System.
하기 표 8에 FenDEL-qPCR 분석 반응물 조성 및 반응조건을 정리하여 나타내었다.Table 8 below summarizes the composition and reaction conditions of the FenDEL-qPCR assay.
·40 사이클:
95℃ - 30초
55℃* - 40초 95℃ - 5 minutes
40 cycles:
95℃ - 30 seconds
55℃* - 40 seconds
(10 pmol/㎕) 역방향 프라이머(R primer)
(5 pmol/㎕) 프로브(Probe)(10 pmol/μl) forward primer (F primer)
(10 pmol/μl) reverse primer (R primer)
(5 pmol/μl) Probe
1 ㎕
1 ㎕1 μl
1 μl
1 μl
대조구
(IC)inside
control
(IC)
(5 pmol/㎕) IC 역방향 프라이머(R primer)
(5 pmol/㎕) IC 프로브(Probe)(5 pmol/μl) IC forward primer (F primer)
(5 pmol/μl) IC reverse primer (R primer)
(5 pmol/μl) IC Probe
1 ㎕
1 ㎕1 μl
1 μl
1
(0.5 ng/㎕) gDNA
PCR 등급 정제수(PCR Grade water)2ㅧ FenDEL-qPCR Master Mix
(0.5 ng/μL) gDNA
PCR grade purified water (PCR Grade water)
1 ㎕
3 ㎕10 μl
1 μl
3 μl
실시예 8. SNP 마커 유전형 조합을 이용한 종판별Example 8. Species discrimination using SNP marker genotype combinations
상기 실시예 7에서 FenDEL-qPCR 방법으로 분석된 4개 SNP 마커별 유전형은 내부 대조구(IC)의 ΔRn 값(y축)을 기준으로 '-' 또는 '+'로 판정 후 '시호 기원 식물 판별표(표 9 참조)'와 비교하여 종을 판별하였다. 각 SNP 마커의 +, - 형질은 FenDEL-qPCR 결과 확인되는 'FAM' 형광(빨강색 증폭곡선)의 ΔRn 값(y축)과 'TAMRA' 형광(파랑색 증폭곡선)의 ΔRn 값(y축)을 비교하여 판단하였다(도 2 참조). 즉, SNP 마커 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)이 내부 대조구 증폭곡선의 ΔRn 값(y축)보다 크면 '+', 작으면 '-'로 판단하였다. The genotypes for each of the four SNP markers analyzed by the FenDEL-qPCR method in Example 7 were determined as '-' or '+' based on the ΔRn value (y-axis) of the internal control (IC), and then the 'Shiho Origin Plant Discrimination Table' (See Table 9)' to determine the species. +, - traits of each SNP marker are the ΔRn value (y-axis) of 'FAM' fluorescence (red amplification curve) and the ΔRn value (y-axis) of 'TAMRA' fluorescence (blue amplification curve) confirmed by FenDEL-qPCR It was judged by comparing (see FIG. 2). That is, if the ΔRn value (y-axis) of the SNP marker amplification curve was greater than the ΔRn value (y-axis) of the internal control amplification curve, it was judged as '+', and if it was smaller, it was judged as '-'.
하기 표 9에 시호 기원 식물 판별표를 정리하여 나타내었다.In Table 9 below, the identification table of Shiho origin plants is summarized and shown.
구체적으로, FenDEL-qPCR 방법에 의한 분석에 따르면, 4개의 SNP 마커(SNP1, SNP2, SNP6, SNP7) 중 SNP1, SNP6, SNP7이 증폭되는 경우 시호(Bupleurum falcatum)로 판정되고, SNP1, SNP2, SNP6이 증폭되는 경우 두메시호(Bupleurum chinense)로 판정되었다. 또한, SNP1, SNP2, SNP6, SNP7이 증폭되는 경우 참시호(Bupleurum scorzonerifolium)로 판정되고, SNP2, SNP6, SNP7이 증폭되는 경우 등대시호(Bupleurum euphorbioides)로 판정되었으며, SNP1, SNP2, SNP6이 증폭되는 경우 섬시호(Bupleurum latissimum)로 판정되었다. 이를 통해, 한약재 시호 기원 식물 및 원산지 판별이 가능하다.Specifically, according to the analysis by the FenDEL-qPCR method, when SNP1, SNP6, and SNP7 among the four SNP markers (SNP1, SNP2, SNP6, and SNP7) are amplified, it is determined as Shiho ( Bupleurum falcatum ), and SNP1, SNP2, and SNP6 In the case of amplification, it was determined as Dumeshi Lake ( Bupleurum chinense ). In addition, when SNP1, SNP2, SNP6, and SNP7 are amplified, it is determined as a true tiger ( Bupleurum scorzonerifolium ), and when SNP2, SNP6, and SNP7 are amplified, it is determined as a lighthouse tiger ( Bupleurum euphorbioides ), and SNP1, SNP2, and SNP6 are amplified In this case, it was determined to be Seomshiho ( Bupleurum latissimum ). Through this, it is possible to determine the origin plant and place of origin of the herbal medicinal material Shiho.
<110> National Institute for Korean Medicine Development <120> Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of Bupleurum genus, primer set for discrimination of Bupleurum genus and uses thereof <130> PA-20-0262 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#1_matK_A <400> 1 agcacgtaca gtacttttgt gtttacgagc caaagttcta gcacaagaaa gtcgaagtat 60 atactttatt cgatacaaac tccttttttg tgaggatcca ctataataat gagaaagatt 120 tctgcatata cgaccaaatc ggccaacaat atcagaatct gaaaaatcgg cccaaacagc 180 cttactaata ggatgcccca atacgttaca aaatctcgcc ttagccaatg atccaatcag 240 aggaacaatt ggaacaatag tatcgaactt cttaatagcc ttatcaatta gaaatgcatt 300 300 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#1_matK_T <400> 2 agcacgtaca gtacttttgt gtttacgagc caaagttcta gcacaagaaa gtcgaagtat 60 atactttatt cgatacaaac tccttttttg tgaggatcca ctataataat gagaaagatt 120 tctgcatata cgaccaaatc ggccaacaat ttcagaatct gaaaaatcgg cccaaacagc 180 cttactaata ggatgcccca atacgttaca aaatctcgcc ttagccaatg atccaatcag 240 aggaacaatt ggaacaatag tatcgaactt cttaatagcc ttatcaatta gaaatgcatt 300 300 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#2_rpoC2_G <400> 3 cgatagagat acccgaaaag ggcattagtt cgttctcgca ttcttgaatt gcttggagtg 60 gaataatgaa tctttttctt cgtctctttg ctaataaatc ataattcgcg tggagaatga 120 tcggatatgt gagattagaa cgaaaagttt gattaagttc tgaataatca gggcgttttt 180 tttccttttt accataaaaa cccgaactaa agaaattgtg tctcacttta tcattagtta 240 ctgagaggtt aaaggtagat cttttcttga cagaaaaaga acgagcgttc atttgatctt 300 300 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#2_rpoC2_T <400> 4 cgatagagat acccgaaaag ggcattagtt cgttctcgca ttcttgaatt gcttggagtg 60 gaataatgaa tctttttctt cgtctctttg ctaataaatc ataattcgcg tggagaatga 120 tcggatatgt gagattagaa cgaaaagttt tattaagttc tgaataatca gggcgttttt 180 tttccttttt accataaaaa cccgaactaa agaaattgtg tctcacttta tcattagtta 240 ctgagaggtt aaaggtagat cttttcttga cagaaaaaga acgagcgttc atttgatctt 300 300 <210> 5 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#6_rpl20_T <400> 5 cttcgtttaa attattccgg tggattcttt acaatagact tcttttatga tctcattgga 60 aatcatataa atacaatttt tatttgatat agctaattgt gcaagtattt tacgattaag 120 aagcacctgt ttcttatata ggtcgtgtat taatctacta taactatagg atactcctat 180 ttcacgaatt gccgcgttta ttcgagtaat ccacaaacgt cgaaaatgtc tcttttgcct 240 atccctatcc cgatgagacg aaaccaaagc tcttattctc tgttgagtaa ttgttcgagt 300 300 <210> 6 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#6_rpl20_A <400> 6 cttcgtttaa attattccgg tggattcttt acaatagact tcttttatga tctcattgga 60 aatcatataa atacaatttt tatttgatat agctaattgt gcaagtattt tacgattaag 120 aagcacctgt ttcttatata ggtcgtgtat aaatctacta taactatagg atactcctat 180 ttcacgaatt gccgcgttta ttcgagtaat ccacaaacgt cgaaaatgtc tcttttgcct 240 atccctatcc cgatgagacg aaaccaaagc tcttattctc tgttgagtaa ttgttcgagt 300 300 <210> 7 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#7_petB_G <400> 7 acgtctcgag attcaggcga ttgcggatga tataactagt aaatacgttc ctcctcatgt 60 caacatattt tattgtctag gaggcattac acttacttgt tttttagtac aagtggctac 120 gggatttgcg atgacttttt actatcgtcc gaccgttacg gacgcttttg cttcggttca 180 atacataatg actgaagcta attttggttg gttaatccga tcagttcatc gatggtcggc 240 aagtatgatg gttctaatga tgatcttgca tgtatttcgg gtgtatctca ccggtggatt 300 300 <210> 8 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP#7_petB_A <400> 8 acgtctcgag attcaggcga ttgcggatga tataactagt aaatacgttc ctcctcatgt 60 caacatattt tattgtctag gaggcattac acttacttgt tttttagtac aagtggctac 120 gggatttgcg atgacttttt actatcgtcc aaccgttacg gacgcttttg cttcggttca 180 atacataatg actgaagcta attttggttg gttaatccga tcagttcatc gatggtcggc 240 aagtatgatg gttctaatga tgatcttgca tgtatttcgg gtgtatctca ccggtggatt 300 300 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SNP#1 <400> 9 acgaccaaat cggccaacat ta 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#1 <400> 10 tacgcagtca aatgctagaa aatg 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SNP#1 <400> 11 taggatgccc caatacgtta ca 22 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SNP#2 <400> 12 atgtgagatt agaacgaaaa gtctg 25 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#2 <400> 13 cgctcgttct ttttctgtca ag 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SNP#2 <400> 14 ccgaactaaa gaaattgtgt ctca 24 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SNP#6 <400> 15 ctgtttctta tataggtcgt gtttt 25 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#6 <400> 16 agagctttgg tttcgtctca tc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SNP#6 <400> 17 ctatttcacg aattgccgcg tt 22 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SNP#7 <400> 18 cgatgacttt ttactatcgt cag 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#7 <400> 19 aatccaccgg tgagatacac c 21 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SNP#7 <400> 20 tcaatacata atgactgaag ctaatttt 28 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Internal Control <400> 21 caaatcattg atacaaataa tatccaa 27 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Internal Control <400> 22 caagtttttt ccttgacctt tcc 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Internal Control <400> 23 tacgccttct agataacctt cg 22 <110> National Institute for Korean Medicine Development <120> Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of Bupleurum genus, primer set for discrimination of Bupleurum genus and uses it <130> PA-20-0262 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#1_matK_A <400> 1 agcacgtaca gtacttttgt gtttacgagc caaagttcta gcacaagaaa gtcgaagtat 60 atactattatt cgatacaaac tccttttttg tgaggatcca ctataataat gagaaagatt 120 tctgcatata cgaccaaatc ggccaacaat atcagaatct gaaaaatcgg cccaaacagc 180 cttactaata ggatgcccca atacgttaca aaatctcgcc ttagccaatg atccaatcag 240 aggaacaatt ggaacaatag tatcgaactt cttaatagcc ttatcaatta gaaatgcatt 300 300 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#1_matK_T <400> 2 agcacgtaca gtacttttgt gtttacgagc caaagttcta gcacaagaaa gtcgaagtat 60 atactattatt cgatacaaac tccttttttg tgaggatcca ctataataat gagaaagatt 120 tctgcatata cgaccaaatc ggccaacaat ttcagaatct gaaaaatcgg cccaaacagc 180 cttactaata ggatgcccca atacgttaca aaatctcgcc ttagccaatg atccaatcag 240 aggaacaatt ggaacaatag tatcgaactt cttaatagcc ttatcaatta gaaatgcatt 300 300 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#2_rpoC2_G <400> 3 cgatagagat acccgaaaag ggcattagtt cgttctcgca ttcttgaatt gcttggagtg 60 gaataatgaa tctttttctt cgtctctttg ctaataaatc ataattcgcg tggagaatga 120 tcggatatgt gagattagaa cgaaaagttt gattaagttc tgaataatca gggcgttttt 180 tttccttttt accataaaaa cccgaactaa agaaattgtg tctcacttta tcattagtta 240 ctgagaggtt aaaggtagat cttttcttga cagaaaaaga acgagcgttc atttgatctt 300 300 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#2_rpoC2_T <400> 4 cgatagagat acccgaaaag ggcattagtt cgttctcgca ttcttgaatt gcttggagtg 60 gaataatgaa tctttttctt cgtctctttg ctaataaatc ataattcgcg tggagaatga 120 tcggatatgt gagattagaa cgaaaagttt tattaagttc tgaataatca gggcgttttt 180 tttccttttt accataaaaa cccgaactaa agaaattgtg tctcacttta tcattagtta 240 ctgagaggtt aaaggtagat cttttcttga cagaaaaaga acgagcgttc atttgatctt 300 300 <210> 5 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#6_rpl20_T <400> 5 cttcgtttaa attattccgg tggattcttt acaatagact tcttttatga tctcattgga 60 aatcatataa atacaatttt tatttgatat agctaattgt gcaagtattt tacgattaag 120 aagcacctgt ttcttatata ggtcgtgtat taatctacta taactatagg atactcctat 180 ttcacgaatt gccgcgttta ttcgagtaat ccacaaacgt cgaaaatgtc tcttttgcct 240 atccctatcc cgatgagacg aaaccaaagc tcttattctc tgttgagtaa ttgttcgagt 300 300 <210> 6 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#6_rpl20_A <400> 6 cttcgtttaa attattccgg tggattcttt acaatagact tcttttatga tctcattgga 60 aatcatataa atacaatttt tatttgatat agctaattgt gcaagtattt tacgattaag 120 aagcacctgt ttcttatata ggtcgtgtat aaatctacta taactatagg atactcctat 180 ttcacgaatt gccgcgttta ttcgagtaat ccacaaacgt cgaaaatgtc tcttttgcct 240 atccctatcc cgatgagacg aaaccaaagc tcttattctc tgttgagtaa ttgttcgagt 300 300 <210> 7 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#7_petB_G <400> 7 acgtctcgag attcaggcga ttgcggatga tataactagt aaatacgttc ctcctcatgt 60 caacatattt tattgtctag gaggcattac acttacttgt tttttagtac aagtggctac 120 gggatttgcg atgacttttt actatcgtcc gaccgttacg gacgcttttg cttcggttca 180 atacataatg actgaagcta attttggttg gttaatccga tcagttcatc gatggtcggc 240 aagtatgatg gttctaatga tgatcttgca tgtatttcgg gtgtatctca ccggtggatt 300 300 <210> 8 <211> 300 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SNP#7_petB_A <400> 8 acgtctcgag attcaggcga ttgcggatga tataactagt aaatacgttc ctcctcatgt 60 caacatattt tattgtctag gaggcattac acttacttgt tttttagtac aagtggctac 120 gggatttgcg atgacttttt actatcgtcc aaccgttacg gacgcttttg cttcggttca 180 atacataatg actgaagcta attttggttg gttaatccga tcagttcatc gatggtcggc 240 aagtatgatg gttctaatga tgatcttgca tgtatttcgg gtgtatctca ccggtggatt 300 300 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward primer for SNP#1 <400> 9 acgaccaaat cggccaacat ta 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#1 <400> 10 tacgcagtca aatgctagaa aatg 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Probe for SNP#1 <400> 11 taggatgccc caatacgtta ca 22 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward primer for SNP#2 <400> 12 atgtgagatt agaacgaaaa gtctg 25 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#2 <400> 13 cgctcgttct ttttctgtca ag 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Probe for SNP#2 <400> 14 ccgaactaaa gaaattgtgt ctca 24 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward primer for SNP#6 <400> 15 ctgtttctta tataggtcgt gtttt 25 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#6 <400> 16 agagctttgg tttcgtctca tc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Probe for SNP#6 <400> 17 ctatttcacg aattgccgcg tt 22 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward primer for SNP#7 <400> 18 cgatgacttt ttactatcgt cag 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse primer for SNP#7 <400> 19 aatccaccgg tgagatacac c 21 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Probe for SNP#7 <400> 20 tcaatacata atgactgaag ctaatttt 28 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward primer for Internal Control <400> 21 caaatcattg atacaaataa tatccaa 27 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse primer for internal control <400> 22 caagtttttt ccttgacctt tcc 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Probe for Internal Control <400> 23 tacgccttct agataacctt cg 22
Claims (9)
서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP;
서열번호 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 T인 SNP;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 G인 SNP; 및
서열번호 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에서 151번째 염기가 A인 SNP;로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함하는, 조성물.According to claim 1, wherein the composition is a single nucleotide polymorphism (SNP) in which the 151st base is A in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
SNP in which the 151st base is T in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
A SNP in which the 151st base is G in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
a SNP in which the 151st base is T in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
SNP in which the 151st base is T in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5;
A SNP in which the 151st base is A in the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6;
a SNP in which the 151st base is G in the polymorphic nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; and
A composition comprising any one or more SNPs selected from the group consisting of;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트 및 제4항의 프로브 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종을 판별하는 방법.Separating genomic DNA from plant samples of the genus Shiho;
Amplifying polymorphic nucleotides by performing an amplification reaction using the isolated genomic DNA as a template and using the primer set of claim 3 and the probe set of claim 4; and
A method of discriminating any one or more species from species of plants of the genus Shiho, including Shiho, Dumeshi, Chamsiho, Lighthouse Shiho, and Seomshiho, comprising the step of detecting the product of the amplification step.
각 SNP 위치인 151번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 시호, 두메시호, 참시호, 등대시호, 및 섬시호를 포함하는 시호 속 식물의 종으로부터 어느 하나 이상의 종 판별용 마이크로어레이.In the polymorphic nucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10,
One or more polymorphic nucleotides selected from polymorphic nucleotides consisting of 10 or more consecutive bases including the 151st base, each SNP position, or complementary polymorphic nucleotides thereof, Sea Lake, Dumeshi Lake, True Sea Lake, Lighthouse Sea Lake, and Island A microarray for discriminating one or more species from species of plants of the genus Shiho including Shiho.
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Citations (2)
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- 2021-05-07 KR KR1020210059308A patent/KR102604105B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20130045636A (en) * | 2011-10-26 | 2013-05-06 | 공주대학교 산학협력단 | Ssr primer derived from paeonia lactiflora and use thereof |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 임창건, '한국산 작약속(Paeoia, Paeoniaceae)식물의 유전적 다양성', 대구대학교 대학원 석사논문, 2011. * |
Also Published As
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| KR102604105B1 (en) | 2023-11-22 |
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| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
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