KR20220114569A - 항암 화합물로서 cullin 3 어댑터 kbtbd4의 모듈레이터 - Google Patents

항암 화합물로서 cullin 3 어댑터 kbtbd4의 모듈레이터 Download PDF

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KR20220114569A
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잘릴라 차그라위
시몽 포티어
시몽 지라르
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유니버시떼 드 몬트리얼
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Abstract

RCOR1/LSD1 및 HDAC2 복합체에 대한 스캐폴딩 단백질로서 통상적으로 작용하는 RCOR1을 분해하는 CULLIN3-RING 유비퀴틴 리가제 복합체를 활성화함으로써 UM171의 존재시 자체 해리되는, 항암 화합물로서 피리미도[4,5-B]인돌 유도체의 용도, 보다 상세하게는 암 치료에 있어 UM171 및 이의 유도체의 용도를 제공한다. 즉, UM171은 분자 글루 분해제와 같이 작용하여, HDAC, RCOR1, CoREST 및 LSD1을 저해하고, 항암 활성을 나타낸다.

Description

항암 화합물로서 CULLIN 3 어댑터 KBTBD4의 모듈레이터
항암 화합물로서 피리미도[4,5-B]인돌 유도체의 용도를 제공한다.
인간은 매우 공격적인 종양으로 사망률이 높은 림프종 및 백혈병 등의 다양한 유형의 암에 걸린다. 사례 대부분에서 현존하는 치료법 (화학요법, 방사선요법, 수술, 특정 항암제 및 골수 이식)은 만족스럽지 못하며, 예를 들어 림프종 및 백혈병 환자들 중 매우 적은 비율만 다년간 생존할 수 있다.
유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS)은 세포 주기 진행, 종양발생 및 게놈 온전성에 핵심적인 조절 역할을 하는 수명이 짧은 단백질의 시기적절한 분해를 촉진한다. UPS의 비정상적인 조절은 단백질 항상성을 파괴하고, 다수의 인간 질환, 특히 암을 유발한다. 보르테조밉 (bortezomib)은 재발성 다발성 골수종 및 맨틀 세포 림프종에 대한 치료제로 승인된 FDA 치료용 프로테아좀 저해제이다. 그래서, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 모듈레이터가 항암의 표적이다. 단백질 분해에 대한 전체적인 저해로 인한, 보르테조밉 (bortezomib)과 관련한 정상적인 세포 독성은, 낮은 특이성으로 인해, 약물 개발 시도를 프로테아좀의 상류 효소를 표적화하는데 초점을 맞추게 촉구한다. E3 유비퀴틴 리가제는, 특히 인간 암에서 활성화되는 것으로 공지된 것으로, 매력적인 선택이 되었다. 여러 가지 구성성분으로 된 Cullin-RING 리가제 (CRL)는 E3 유비퀴틴 리가제의 가장 큰 계열로서, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 분해되는 세포성 단백질의 ~20%에서 유비퀴틴화를 담당한다 (Zhao and Sun, 2013, Curr Pharm Des, 19: 3215-3225).
현재 임상 시험 중인 페보네디스타트 (pevonedistat, MLN4924)는 NEDD8에 대한 선택적인 저해제이다. NEDD8-활성화 효소 (NAE)의 저해는 프로테아좀-매개 단백질 분해 CRL에 결정적인 cullin-RING 리가제 (CRL)의 활성화를 방지한다.
인디술람 (indisulam)은 RBM39 (스플라이싱 인자)와 E3 리가제 DCAF15 간에 상호작용을 매개해 DCAF15에 결합하는 분자 글루 분해제로서 작용함으로써 RBM39 폴리-유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 유발하고, 그래서 RBM39 결합을 강화하는 새로운 리가제 표면을 형성한다 (Bussiere et al., 2019, bioRxiv, 737510).
이에, 암 세포를 선택적으로 죽일 수 있는 새로운 약물 및/또는 치료 대안을 제공할 필요가 여전히 존재한다.
환자에게 하나 이상의 식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 프로드럭을, 선택적으로 하나 이상의 세포 증폭 인자 (cell expanding factor)와 함께 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서,
각각의 Y는 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
m은 0-3의 정수 (또는 Y가 치환기 Z를 포함하는 고리에서 CH일 경우, 0-4의 정수)이고;
Z는 각각 독립적으로 하기로부터 선택되고:
-CN
-C(O)OR1,
-C(O)N(R1)R3,
-C(O)R1, 또는
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된 -헤테로아릴,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된 -아릴,
여기서, (R1)과 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
W는
-CN,
-N(R1)R3,
-C(O)OR1,
-C(O)N(R1)R3,
-NR1C(O)R1,
-NR1C(O)OR1,
-OC(O)N(R1)R3,
-OC(O)R1,
-C(O)R1,
-NR1C(O)N(R1)R3,
-NR1S(O)2R1,
RA 또는 R1 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된 -벤질,
-X-L-(X-L)n - N(R1)R3,
L 및 헤테로아릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로아릴,
L 및 헤테로사이클릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로사이클릴,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n- 아릴,
-X-L-(X-L)n-NR1RA,
-(N(R1)-L)n - N+R1R3R5 R6- 또는
- 할로겐이되,
여기서, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고,
여기서, R1 및 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
각각의 X는 독립적으로 CH2, O, S 및 NR1으로부터 선택되고;
각각의 L은 독립적으로
-C1-6 알킬렌,
-C2-6 알케닐렌,
-C2-6 알키닐렌,
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7사이클로알킬렌, 또는
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7 사이클로알케닐렌이되,
여기서, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌 및 사이클로알케닐렌 기들은 각각 독립적으로 R4 또는 RA 치환기 1 또는 2개로 선택적으로 치환되고;
R1은 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-헤테로사이클릴,
-아릴,
-헤테로아릴, 또는
-벤질이되,
여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R2는
-H,
RA 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -C1-6 알킬,
-C(O)R4,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴,
RA 또는 R4 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴, 또는
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -N(R1)아릴이고,
R3는 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-헤테로사이클릴,
-아릴,
-헤테로아릴,
-벤질, 또는
메틸 2-벤질-9H-피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-7-카르복실레이트-4-일이되,
여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R4는 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C1-6 할로알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-헤테로사이클릴,
-아릴,
-헤테로아릴, 또는
-벤질이되,
여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R5는 각각 독립적으로
-C1-6 알킬,
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알케닐,
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알키닐,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-아릴,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-헤테로아릴,
-C1-6 알킬렌-C(O)O-,
-C1-6 알킬렌-C(O)OR1,
-C1-6 알킬렌-CN,
R1 및 R3가 선택적으로 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하는, -C1-6 알킬렌-C(O)NR1R3; 또는
-C1-6 알킬렌-OH이고;
R6는
-할로겐
-OC(O)CF3 또는
-OC(O)R1이고;
RA는 각각 독립적으로
-할로겐,
-CF3,
-OR1,
-L-OR1,
-OCF3,
-SR1,
-CN,
-NO2,
-NR1R3,
-L-NR1R1,
-C(O)OR1,
-S(O)2R4
-C(O)N(R1)R3,
-NR1C(O)R1,
-NR1C(O)OR1,
-OC(O)N(R1)R3,
-OC(O)R1,
-C(O)R4,
-NHC(O)N(R1)R3,
-NR1C(O)N(R1)R3,
-N3; 또는
-(CH2CH2O)2-CH2CH2OH이되,
여기서, R1과 R3는 선택적으로 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하고;
Rd는 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬
-벤질 또는
-헤테로사이클릴이고;
RB는
-H, 또는
-C1-6 알킬이다.
일 구현예에서, 식 I의 화합물은
Figure pct00002
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
다른 구현예에서, 식 I의 화합물은
Figure pct00003
의 하이드로브로마이드 염이다.
추가적인 구현예에서, 식 I의 화합물은
Figure pct00004
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일 구현예에서, 식 I의 화합물은 본원에 정의된 바와 같으며, 특히 표 3에 정의된 바와 같다.
부가적인 구현예에서, 환자는 인간 또는 동물이다.
추가적인 구현예에서, 동물은 마우스이다.
일 구현예에서, 암은 K27 돌연변이, EZH2 또는 PRC2 돌연변이에 기반한 암이다.
일 구현예에서, 화합물은 경구, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여용으로 제형화된다.
추가적인 구현예에서, 화합물은 LSD1, RCOR1, HDAC2 및 CoREST 중 하나 이상을 분해한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 화합물을 증식 중인 세포를 함유한 배지에 투입하는 것을 포함하며, 화합물이 암성 세포의 증식에 대해 항신생물성인, 생체외 암성 세포의 증식을 저해하는 방법을 제공한다.
또한, 암 치료용 식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 프로드럭을 제공한다:
Figure pct00005
상기 식에서,
각각의 Y는 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
Z는
-CN
-C(O)OR1,
-C(O)N(R1)R3,
-C(O)R1, 또는
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -헤테로아릴이되,
여기서, (R1) 및 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
W는
-CN,
-N(R1)R3,
-C(O)OR1,
-C(O)N(R1)R3,
-NR1C(O)R1,
-NR1C(O)OR1,
-OC(O)N(R1)R3,
-OC(O)R1,
-C(O)R1,
-NR1C(O)N(R1)R3,
-NR1S(O)2R1,
RA 또는 R1 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된, -벤질,
-X-L-(X-L)n - N(R1)R3,
L 및 헤테로아릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로아릴,
L 및 헤테로사이클릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로사이클릴,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n- 아릴,
-X-L-(X-L)n-NR1RA, 또는
-(N(R1)-L)n - N+R1R3R5 R6-이되,
여기서, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고,
여기서, R1 및 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
각각의 X는 독립적으로 C, O, S 및 NR1으로부터 선택되고;
각각의 L은 독립적으로
-C1-6 알킬렌,
-C2-6 알케닐렌,
-C2-6 알키닐렌,
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3- 7사이클로알킬렌, 또는
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7 사이클로알케닐렌이되,
여기서, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌 및 사이클로알케닐렌 기들은 각각 독립적으로 1 또는 2개의 R4 또는 RA 치환기로 선택적으로 치환되고;
R1은 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-헤테로사이클릴,
-아릴,
-헤테로아릴, 또는
-벤질이되,
여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R2는
-H,
RA 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -C1-6 알킬,
-C(O)R4,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴
RA 또는 R4 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴, 또는
RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴이고,
R3는 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-헤테로사이클릴,
-아릴,
-헤테로아릴, 또는
-벤질이되,
여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고,
R4는 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-헤테로사이클릴,
-아릴,
-헤테로아릴, 또는
-벤질이되,
여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R5는 각각 독립적으로
-C1-6 알킬,
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알케닐,
N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알키닐,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-아릴,
RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-헤테로아릴,
-C1-6 알킬렌-C(O)O-,
-C1-6 알킬렌-C(O)OR1,
-C1-6 알킬렌-CN,
R1과 R3가 선택적으로 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하는, -C1-6 알킬렌-C(O)NR1R3, 또는
-C1-6 알킬렌-OH이고;
R6는
-할로겐
-OC(O)CF3, 또는
-OC(O)R1이고;
RA는 각각 독립적으로
-할로겐,
-CF3,
-OR1,
-L-OR1,
-OCF3,
-SR1,
-CN,
-NO2,
-NR1R3,
-L-NR1R1,
-C(O)OR1,
-S(O)2R4
-C(O)N(R1)R3,
-NR1C(O)R1,
-NR1C(O)OR1,
-OC(O)N(R1)R3,
-OC(O)R1,
-C(O)R4,
-NHC(O)N(R1)R3,
-NR1C(O)N(R1)R3, 또는
-N3이고;
Rd는 각각 독립적으로
-H,
-C1-6 알킬,
-C2-6 알케닐,
-C2-6 알키닐,
-C3-7 사이클로알킬,
-C3-7 사이클로알케닐,
-C1-5 과불화 알킬,
-벤질, 또는
-헤테로사이클릴이다.
이제 첨부 도면을 참조한다.
도 1A는 UM171 (250nM 및 800nM)에 8일 및 14일간 노출 또는 비-노출된 OCI-AML5 또는 OCI-AML1 세포주의 전장 게놈 CRISPR/Cas9 스크리닝에 대한 실험 개요를 예시한 것이다.
도 1B는 CRISPR/Cas9 스크린에서 전체 세포 집단 배가 (doubling)(상단 패널) 및 쌍 샘플 연관성 (pairwise sample correlation)(하단 패널)을 예시한 것이다.
도 1C는 OCI-AML1 CRISPR/Cas9 스크린에서 전체 세포 집단 배가 (상단 패널) 및 쌍 샘플 연관성 (하단 패널)을 예시한 것이다.
도 1D는 UM171 (250nM)에 8일 (좌측 패널) 또는 14일 (우측 패널) 간 노출한 CRISPR 넉아웃 OCI-AML5 (y 축) 및 OCI-AML1 (x 축)의 MAGeCK 아웃풋 베타 스코어를 나타낸 산점도를 예시한 것으로, 합성 구제 상호작용 (synthetic rescue interaction) 및 합성 치사 상호작용을 동정하고, KBTBD4 (합성 구제) 및 RCOR1 (합성 치사)를 UM171 용량 또는 노출 시간과 독립적으로 동정한다.
도 2A는 미끼로서 BirA 또는 BirA-KBTBD4 융합 단백질을 이용한 BioID pulldown/MS 실험에서 동정한 단백질 후보물질의 존재 수준 (abundance)을 나타낸 히트맵을 예시한다.
도 2(B)는 표적화된 복합체에서 단백질 상호작용을 예시한 것이다.
도 2(C)는 0.1% DMSO 또는 UM171 (250nM)에 24시간 노출한, shLuc (대조군 루시퍼라제) 또는 shKBTBD4 발현성 OCI-AML1 세포에서 H3K27 아세틸화 (상단 패널) 및 H3K4 다이-메틸화 (하단 패널)에 대한 유세포-측정에 기반한 분석을 예시한 것이다. 데이터는 GFP 음성 (비-감염, 검정색 점) 및 GFP 양성 (감염, 더 연한 점) 서브세트에서 변형된 히스톤의 상대적인 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. 전체 H3 수준을 표준화에 이용하였다. 독립적인 실험 3가지를 나타냄.
도 2(D)는 DMSO, UM171 (250nM), HDAC 저해제 (파노비노스타트, 5nM) 또는 LSD1 저해제 (TCP, 10 μM)에 24시간 노출한, shKBTBD4 (상단 패널) 또는 shRCOR1 (하단 패널) 발현성 OCI-AML1 세포에서, CD201 (좌측) 및 CD86 (우측) 표면 발현에 대한 유세포 측정에 기반한 분석을 예시한 것이다. 독립적인 실험 3가지를 나타냄.
도 2(E)는 대조군, KBTBD4 전장 (wt), BTB 결손 (ΔBTB) 또는 Kelch 도메인 결손 (ΔKelch) 돌연변이 벡터를 발현하도록 조작되고 UM171 (250nM, 24시간)에 노출 또는 비-노출된 sgAAVS1 (좌측 패널) 또는 sgKBTBD4 (우측 패널) 넉아웃 OCI-AML1 세포에서 CD86 및 CD201 표면 발현에 대한 유세포 측정에 기반한 분석을 예시한 것이다.
도 3(A)는 CRISPR 스크린 후보물질 KBTBD4 및 RCOR1에 대한 검증을 예시한 것이다. DMSO 존재 하 또는 UM171 농도 증가 하에 4일간 배양한, shLuc, shKBTBD4 (상단 패널) 또는 shRCOR1 (하단 패널) 발현성 세포의 절대 세포 카운트의 배수 변화.
도 3(B)는 UM171 (250nM 이상) 또는 HDAC 저해제 (파노비노스타트, 5nM)에 대한 반응으로, H3K27 아세틸화에 대한 웨스턴 블롯 (상단 패널) 및 유세포 측정에 기반한 분석 (하단 패널)을 예시한 것이다.
도 3(C)는 DMSO 또는 UM171 (250nM)에 48시간 노출한, shLuc 또는 sh KBTBD4 (shRNA 3종) 발현성 OCI-AML1 세포에서, CD201/GFP (상단 패널) 또는 CD86/GFP (하단 패널) 발현에 대한 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. (GFP+을 GFP- 서브세트와 비교하여) KBTBD4에 대한 shRNA 3종 모두 UM171 활성을 폐기함에 유념한다.
도 3(D)는 DMSO 또는 UM171 (250nM)에 24시간 노출한 shLuc 또는 shKBTBD4 (sh1-3) 발현성 OCI-AML1 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 불석을 예시한 것이다. KBTBD4 및 뉴클레올린 (Nucleolin)(NCL, 로딩 대조군) 수준을 나타낸 대표적인 블롯은 KBTBD4 넉아웃을 검증해준다.
도 3(E)는 shLuc, shKBTBD4 (sh2) 및 shRCOR1을 발현하는 OCI-AML1 세포에서 CD201 및 CD86 발현 및 비-형질도입 GFP 음성 세포 vs 형질도입 GFP 양성 세포에서 그 분포를 나타낸 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. shKBTBD4는 UM171-매개 CD201/CD86 표면 발현을 폐기하는 반면, shRCOR1은 CRISPR 스크린 결과와 일관되게 이의 발현을 강화한다.
도 3(F)는 UM171의 농도 증가 하에 노출한 shLuc, shKBTBD4 (sh2) 발현성 OCI-AML1 세포에서 CD201 및 CD86 표면 발현에 대한 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다.
도 3(G)는 shLuc, shKBTBD4 또는 shRCOR1 발현성 OCI-AML1의 UM171 (250nM) 노출 (24시간)시, CD201 (상단 패널) 및 CD86 (하단 패널)의 상대적인 평균 형광 강도 (MFI)를 예시한 것이다. CD201/CD86 수준은 GFP 음성 (비-감염) 및 GFP 양성 (감염) 세포에서 측정한다. 독립적인 실험 3종을 나타냄.
도 3(H)는 DMSO, UM171 (250nM), HDAC 저해제 (파노비노스타트, 5nM) 또는 LSD1 저해제 (TCP, 5 μM)가 처리된, shLuc, shKBTBD4 또는 shRCOR1 발현성 OCI-AML1에서 CD86/GFP 발현에 대한 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. HDACi 및 LSDi는 shKBTBD4 발현 세포에서 CD86 발현을 유도 (중앙 패널)함에 주목하며, 이는 KBTBD4가 HDAC/LSD1 공동-억제자 복합체 (corepressor complex)의 상류에서 작용함을 시사한다.
도 4(A)는 DMSO와 비교해, UM171 (250nM), HDACi (파노비노스타트, 5nM) 또는 LSD1i (TCP, 10 μM)에 24시간 노출한 OCI-AML5에서 CD201 및 CD86의 상향 조절을 보여주는 대표적인 FACS 분석을 예시한 것이다.
도 4(B)는 DMSO, UM134 (UM171의 비활성 유사체 (250nM)), UM171 (250nM), HDACi (파노비노스타트, 5nM) 또는 LSD1i (TCP, 10 μM)에 24시간 노출한 OCI-AML5에서 H3K27Ac, H3K4me2 및 H3의 상대적인 평균 형광 강도 (MFI)를 예시한 것으로, UM171은 HDACi 및 LSDi와 마찬가지로 OCI-AML5 세포주에서 H3K27Ac 및 H3K4me2 마크를 유도한다.
도 5는 대조군 (빈 벡터), KBTBD4 전장 (wt), BTB 결손 (ΔBTB) 또는 Kelch 도메인 결손 (Kelch) 돌연변이 벡터를 발현하도록 조작된, UM171 (250nM, 24시간)에 노출 또는 비-노출한, sgAAVS1 (상단 패널) 또는 sgKBTBD4 (하단 패널) 넉아웃 OCI-AML1 세포에서 CD86/GFP에 대한 대표적인 FACS 분석을 예시한 것이다. 전장 KBTBD4만 UM171-매개 CD86 상향 조절을 (sgAAVS1에서) 강화하거나 또는 (sgKBTBD4에서) 구제함에 주목한다.
도 6(A)는 DMSO 또는 UM171 (35nM)의 존재 하에 4일간 증폭시킨 정제한 CD34+ 제대혈 세포에서의 히스톤 3 (H3), H3K27ac 및 H3K4me2 에피제네틱 마크 (epigenetic mark)에 대한 유세포 측정에 기반한 분석을 예시한 것이다. 결과는 HSPC-농화된 CD34+ 게이팅 서브세트에서 히스톤 마크의 상대적인 수준을 나타낸다 (상단 패널 참조). 중앙 패널은 히스토그램 오버레이를 나타낸 것이고, 하단 패널은 전체 H3 수준에 대해 표준화한 상대적인 MFI를 나타낸 것이다.
도 6(B)는 DMSO, UM171 (35nM), HDACi (파노비노스타트, 5nM) 또는 LSD1i (TCP, 5 μM)의 존재 하에 7일간 배양한 CD34+ 제대혈 세포의 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. CD34+, CD34+CD45RA-, CD34+CD201+, CD34+CD90+CD201+ 및 CD34+CD86+ 서브세트를 나타낸다.
도 6(C)는 지정된 화합물의 첨가 하에 7일간 배양한 후 HSC-농화된 CD34+CD201+ 세포 서브세트의 절대 카운트를 나타낸 막대 그래프를 예시한 것이다 (평균±SD).
도 6(D)는 표시된 바와 같이 UM171 (35nM)의 존재 또는 부재 하에 7일간 배양한, shLuc (좌측 패널), shRCOR1 (2 shRNA) 또는 shLSD1 (2shRNA) (우측 패널)으로 감염된 CD34+ 제대혈 세포의 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. CD34+ 및 CD34+CD201+ 서브세트를 나타낸다. 또한, UM171 (35nM)의 존재 하에 7일간 배양한 shLuc 또는 shKBTBD4 (2 shRNA) 감염된 CD34+ 제대혈 세포의 대표적인 FACS 프로파일을 도시한다.
도 6(E)는 대조군 벡터 (CT), 전장 KBTBD4 (wt), ΔBTB 또는 ΔKelch 돌연변이로 감염된, DMSO 또는 UM171 (35nM)의 존재 하에 7일간 배양한 CD34+ 제대혈 세포의 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. 데이터는 GFP-형질도입 세포에서 게이팅한 이후를 제시한다.
도 6(F)는 DMSO, UM171 (5nM) 또는 UM171 (35nM)의 존재 하에 7일간 둔 후 지정된 감염 세포 (shRNA (상단 패널), 이소성 발현 (하단 패널))로 개시한 배양물에서의 HSC-농화된 CD34+CD201+ 세포 서브세트의 절대 카운트 (평균±SD)를 나타낸 막대 그래프를 예시한 것이다.
도 7(A)는 지정된 화합물에 노출한 CD34+ 제대혈 세포의 7일 배양 후 수득한 CD34+ 및 CD34+CD201+ HSPC의 %를 예시한 것이다 (중앙값 ± SD).
도 7(B)는 면역약화 NSG 마우스에 이식한, 프레쉬 CD34+ 및 DMSO, UM171 (35nM) 또는 지정된 HDACi에 노출된 7일 배양물을 예시한 것이다 (0일 세포 3000). 인간 CD45 생착 (engraftment)을 이식 후 3주, 8 및 26주 이후에 평가하였다. 인간 CD34 생착을 이식 후 26주에 평가하였다.
도 8(A)는 지정된 화합물을 첨가하여 7일간 배양한 후 총 세포 카운트 (상단 패널) 및 CD34+ 세포 (하단 패널) 서브세트의 절대 카운트를 나타낸 막대 그래프를 예시한 것이다 (평균±SD).
도 8(B)는 지정된 shRNA (상단 패널) 또는 KBTBD4 벡터 (하단 패널)로 형질도입된 제대혈 세포의 7일 배양 후 총 세포 카운트 (좌측 패널) 및 CD34+ 세포 서브세트의 절대 카운트 (우측 패널)를 나타낸 막대 그래프를 예시한 것이다.
도 8(C)는 지정된 농도의 UM171 및/또는 LSD1 저해제 (TCP)와 함께 CD34+ 제대혈 세포를 7일간 배양한 후 CD34+ (좌측 패널), CD34+CD201+CD90+ (중간 패널) 및 CD34+CD86+ (우측 패널) 서브세트의 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것으로, 5nM에서 UM171과 LSD1i의 상승적인 작용을 보여준다.
도 8(D)는 shLuc 또는 shKBTBD4 (2 shRNA)로 감염된 CD34+ 제대혈 세포를 DMSO의 존재 하에 7일간 배양한 후 CD34+ 및 CD34+CD201+ 서브세트의 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다.
도 9는 iBET 브로모도메인 저해제 (50nM 및 100nM)의 부재 (0) 또는 존재 하에 UM171 (35nM)에 노출된 CD34+ 제대혈 세포를 7일간 배양한 후 수득한 CD34+CD201+ 및 CD34+CD86+ 서브세트 (UM171 시그니처)의 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. iBET는 제대혈 세포에서 UM171 활성을 완전히 폐기함에 주목한다.
도 10은 shLuc 또는 shRCOR1 (sh1)으로 형질도입된 sgAAVS1 또는 sgKBTBD4 넉아웃 OCI-AML1 세포주로부터 추출한 세포질 및 염색질 결합된 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 RCOR1 단백질 수준을 예시한 것이다.
도 11(A)는 대조군 벡터 (CT), 전장 KBTBD4 (wt), ΔBTB 또는 ΔKelch 돌연변이를 발현하도록 조작된 sgAAVS1 (OCI-AML1 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다. KBTBD4, RCOR1 및 CUL1 (로딩 대조군) 수준을 나타낸 대표적인 블롯.
도 11(B)는 shLuc 또는 shKBTBD4-형질도입된 OCI-AML1 세포를 DMSO 또는 UM171 (250nM)에 24시간 동안 노출하고 마지막 4시간 동안 MG132 (10 μM)를 처리 또는 비처리한 후 추출한 핵질 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다. KBTBD4, RCOR1, LSD1, HDAC2 및 Nucleolin (NCL, 로딩 대조군) 단백질의 수준을 나타낸 대표적인 블롯 (상단 패널). RCOR1 단백질 수준의 양을 독립적인 실험 3종에서 평가하였다 (하단 패널).
도 11(C)는 shLuc 또는 shKBTBD4 형질도입 OCI-AML1 세포를 DMSO, UM171 (250nM), MLN2494 (100nM), MLN2494/UM171 또는 MG132/UM171에 4시간 동안 노출한 후 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다. CUL3, RCOR1 및 TUBA (로딩 대조군) 단백질 수준을 나타낸 대표적인 블롯 (상단 패널). RCOR1 단백질 수준의 정량을 독립적인 실험 2종에서 평가하였다 (하단 패널).
도 11(D)는 DMSO 또는 UM171 (250nM)에 4시간 동안 노출한 shLuc, shKBTBD4, shNUDCD3 또는 shCAND1으로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다. NUDCD3, CAND1, RCOR1 및 TUBA (로딩 대조군) 단백질 수준을 보여주는 대표적인 블롯 (상단 패널). RCOR1 단백질 수준의 정량은 독립적인 실험 2종에서 평가하였다 (하단 패널).
도 11(E)는 UM171 (250nM)에 24시간 동안 노출한, shLuc, shNUDCD3, shCUL3 또는 shCAND1 발현성 OCI-AML1 세포에서 CD201 및 CD86 표면 발현에 대한 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다. 결과는 형질도입된 세포 (GFP+)만 나타낸다.
도 11(F)는 GFP 음성 (비-감염) 및 GFP 양성 (감염) 서브세트를 각각의 지정된 조건 하에 UM171 (250nM)에 노출시 CD201 (상단 패널) 및 CD86 (하단 패널)의 상대적인 평균 형광 강도 (MFI)를 예시한 것이다.
도 12(A)는 DMSO, UM134 (비활성 UM171 유사체) 또는 UM171 (1 μM)에 4시간 노출한 후 마지막으로 3시간 동안 MG132 (10 μM)를 처리 또는 비처리한 HEK293 세포주로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다.
도 12(B)는 shLuc 또는 shKBTBD4를 발현하며 DMSO 또는 UM171 (1 μM)에 1시간 동안 노출한, HEK293 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다.
도 12(C)는 DMSO 또는 UM171 (1 μM)에 1시간, 6시간 또는 24시간 동안 노출한 U2OS 세포주 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다.
도 12(D)는 대조군 벡터 (CT), 전장 KBTBD4 (wt), ΔBTB 또는 ΔKelch 돌연변이를 발현하도록 조작된 sgKBTBD4 넉아웃 OCI-AML1 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다.
도 13(A)는 sgAAVS1 또는 대조군 또는 KBTBD4 (wt) 벡터를 발현하도록 조작된 sgNUDCD3 넉아웃 OCI-AML1 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정한 KBTBD4 및 RCOR1 단백질 수준을 예시한 것이다. CUL1은 로딩 대조군으로 사용된다. sgRNA 매개 NUDCD3 결손이 내인성 KBTBD4 수준 (첫번째 레인, 우측 패널)을 급격하게 감소시키고, NUDCD3 결손 세포에서 KBTBD4 (wt)의 재-도입이 RCOR1 단백질 수준 (2번째 레인, 우측 패널)을 감소시킴에 주목한다.
도 13(B)는 shLuc 또는 shNUDCD3를 발현하는 OCI-AML1으로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 KBTBD4 및 RCOR1 단백질 수준을 예시한 것이다. TUBA가 로딩 대조군로 사용된다.
도 13(C)는 대조군 (빈 벡터), KBTBD4 전장 (wt), BTB 결손 (ΔBTB) 또는 Kelch 도메인 결손 (ΔKelch) 돌연변이 벡터를 발현하도록 조작되고 UM171 (250nM, 24시간)에 노출 또는 비-노출된, sgAAVS1 (좌측 패널) 또는 sgNUDCD3 (하단 패널) 넉아웃 OCI-AML1 세포에서의 CD86/GFP 발현에 대한 대표적인 FACS 프로파일을 예시한 것이다.
도 13(D)는 대조군, KBTBD4 전장 (wt), ΔBTB 또는 ΔKelch 돌연변이 벡터를 발현하도록 조작되고 UM171 (250nM, 24시간)에 노출 또는 비-노출된, sgAAVS1 또는 sgNUDCD3 넉아웃 OCI-AML1 세포에서 CD201 (좌측 패널) 및 CD86 (우측 패널) 표면 발현 결과를 예시한 것이다.
도 14는 HDAC 저해제 (파노비노스타트, 5nM) (좌측 패널) 또는 LSD1 저해제 (TCP, 10 μM) (우측 패널)에 24시간 동안 노출한, shLuc, shNUDCD3 또는 shCUL3를 발현하는 OCI-AML1 세포에서 CD201 표면 발현에 대한 유세포 측정에 기반한 분석을 예시한 것이다. 그래프는 GFP 음성 또는 GFP 양성 서브세트에서 상대적인 CD201 MFI의 중앙값 ± SD를 보여준다. HDACi 및 LSD1i 둘다 shNUDCD3 및 shCUL3 발현성 세포에서 CD201 상향 조절을 유도함에 주목하며, 이는 KBTBD4에 대해 확인된 바와 같이 UM171 매개 전사 활성화의 상류에 작용함을 시사한다.
도 15A는 DMSO, UM171 (500nM) 또는 UM171/MG132 (5 μM)에 4시간 노출한 d3 증폭된 CD34+ 유래 제대혈 세포로부터 추출한 전체 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다. KBTBD4, RCOR1, LSD1, HDAC2, CUL3 및 로딩 대조군으로서 TUBA를 나타낸 대표적인 블롯.
도 15B는 DMSO 또는 UM171 (250nM)에 24시간 노출한 MG132 (10 μM)로 마지막 4시간 동안 처리 또는 비-처리한 shLuc 또는 shKBTBD4-형질도입 OCI-AML1 세포로부터 추출한 핵질 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시한 것이다. KBTBD4, RCOR1, LSD1, HDAC2 및 Nucleolin (NCL, 로딩 대조군) 단백질 수준을 보여주는 대표적인 블롯. RCOR1 단백질 수준에 대한 정량화를 독립적인 실험 3종에서 평가하였다.
도 16은 마우스에 정맥내 투여된 예시 화합물의 생체이용성을 나타낸 것이다.
도 17A는 마우스에 정맥내 투여된 화합물 UM681의 생체이용성을 나타낸 것이다.
도 17B는 마우스에 경구 투여된 화합물 UM681의 생체이용성을 나타낸 것이다.
피리미도[4,5-B]인돌 유도체, 뿐 아니라 5H-피리도[4,3-b]인돌 유도체 및 피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체를 항암 화합물로서 제공한다.
이러한 피리미도[4,5-B]인돌 유도체에 대한 일 예는 UM171이며 (미국 특허 번호 9,409,906 및 10,336,747 참조, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 병합됨), 이는 원시 세포 (primitive cell)에 대해 활성을 가지며, 화합물이 배양물로부터 워시-아웃되는 경우 신속하게 가역적이다. UM171은 독립적으로 성장인자의 부재시 세포 증식을 촉발하지 않으며; 유사분열을 촉진하지 않고 오히려 세포 분화를 방지한다. 이 분자는 생체외 배양시 장기간 조혈 줄기 세포 (HSC)를 선호적으로 증폭시키는 것으로 발표되었으며, 이러한 증폭은 7일째에 최고 수준이었다. NSG 마우스에서 처음에 나타난 결과들은, 환자 22명에 단일 UM171-증폭된 제대혈 그래프트를 이식하는 임상 실험에서 검증되었다. 이들 환자는 대조군 이식보다 빠르게 호중구를 회복하고, 발열 현상이 적었다. 가장 흥미롭게도, UM171 환자는 만성적인 이식 편대 숙주 질환이 발생하지 않았으며, 이식-관련 사망 및 질환 재발 비율이 매우 낮았다. UM171은 CD201+ (EPCR) 원시 HSC와 더불어 CD86+ 수지상 세포 선조체 및 비만 세포의 중대한 확장을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (WO 2019/161494 참조, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 병합됨). 아울러, 이 분자는 다양한 전-염증성 및 항-염증성 유전자의 발현 및 CD201 및 CD86 등의 수종의 본질적인 줄기 세포 마커 유전자의 발현을 신속하게 유도하는 것으로 또한 입증되었다. 본원에 마찬가지로 고려되는 기타 관련 화합물은 5H-피리도[4,3-b]인돌 유도체 및 피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체로도 언급된다. 이들 화합물은 예를 들어 US 10,647,718 B에 기술되어 있으며, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 병합된다.
이들 결과는 UM171이 광범위한 항암 용도를 가질 수 있는지를 확인하도록 조사를 촉구하였다.
UM171에 노출된 OCI-AML5 등의 조혈 세포주는 6시간 이내에 유전자 400종보다 많은 수가 상향 조절되고 유전자 12종 미만이 억제된다. 유전자 상향 조절에 대한 이러한 거의 독점적인 효과는 잠재적인 전사 억제인자가 이 분자에 의해 표적화됨을 가리킨다. 2종의 세포주를 다양한 UM171 용량들에서 CRISPR 스크리닝한 결과 (도 1), UM171 표현형의 억제인자로서 충분히 특정화되지 않은 Kelch-BTB 도메인 단백질 KBTBD4과 강한 인핸서로서 전사 공동-억제인자 RCOR1 또는 CoREST가 드러났다 (도 1 및 3A).
KBTBD4의 기능은 아직까지 알려지지 않았지만, Kelch BTB 도메인 단백질은 CULLIN3-RING 유비퀴틴 리가제 (CRL3 복합체)를 이의 기질에 연결하여 (Genschik et al., 2013, EMBO J, 32: 2307-2320), 단백질을 단백질 분해로 표적화하는 특이성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 관찰 사실과 일관되게, CRL3 복합체의 수종의 코어 및 핵심 구성성분들, 즉 CULLIN3 자체 및 이의 필연적인 조절인자 Cullin-관련 NEDD8-해리 단백질 1 (CAND1)은 여러가지 CRISPR 스크린에서 UM171의 강한 억제인자였다 (도 1D).
BirA-KBTBD4 인접성 표지에 대한 유도된 질량 분광 측정 분석에서 CRL3의 수종의 구성성분들 또는 관련 단백질, 예를 들어 CULLIN3, CSN4, UBC12 및 KELCH-도메인-지시된 HSP90 어댑터 NUDCD3가 쉽게 동정되었다 (도 2D). 가장 흥미롭게도, RCOR1 및 이와 관련한 라이신 데메틸라제 1A (KDM1A 또는 LSD1) 역시 이들 실험에서 동정되었다 (도 2D). 이들 결과를 토대로, UM171이 프로테오솜 분해를 위해 LSD1-RCOR1 CoREST 억제인자 복합체를 표적화하는 새로운 CLR3KBTBD4 복합체를 활성화하여, 핵심 줄기 세포 유전자의 히스톤 변형 및 상향 조절을 유발하는 것으로 제안된다 (도 2E).
히스톤 3 라이신 27 아세틸화 (H3K27ac) 마크는 UM171에 노출시 빠르게 강화되고 이러한 에피제네틱 마크에 대한 UM171의 빠른 영향에 KBTBD4의 기본적인 역할 제시해준다 (도 2C, 상단 패널 및 도 3B와 도 4). 마찬가지로, UM171 처리에 의해 히스톤 3 라이신 4 다이메틸화 (H3K4me2)가 강화되었으며, KBTBD4에 의존적인 것으로 입증되었다 (도 2C, 하단 패널). 이와 유사하게, UM171에 의해 유도된 CD201 및 CD86 발현은 KBTBD4 의존적이다 (도 2D 상단 좌측 및 우측 패널, 처음 컬럼 4개 및 도 3C-G 비교). RCOR1 복합체의 코어 구성원 2종인 HDAC 및 LSD1의 저해제는 KBTBD4와 독립적으로 CD201 및 CD86의 발현을 유도하는 것으로 제안된다 (도 2D 상단 좌측 및 우측 패널, 마지막 컬럼 4개와 도 3H 비교). RCOR1이 KBTBD4에 하류에 위치한다는 점에 의거하여, CD201 및 CD86 둘다 RCOR1 수준이 실험적으로 감소될 경우 UM171에 의해 강하게 유도되는 것으로 확인된다 (도 2D 하단 패널, 처음 컬럼 4개와 도 3G-H 비교).
아울러, RCOR1 수준에서의 저하는 CD201 및 CD86 발현에 대한 HDAC 또는 LSD 저해제의 영향을 추가로 강화한다 (도 2D 하단 패널, 마지막 컬럼 4개). 이들 마커 2종의 소폭 발현 증가는, 일차 제대혈 세포에서 훨씬 현저하며, 이는 shRCOR1을 이용한 경우에 자발적으로 관찰된다 (도 2D 하단 패널, 처음 컬럼 2종). 이는 처리 세포에서 궁극적으로 CD201 및 CD86의 상향 조절을 유발하는, UM171, KBTBD4 및 RCOR1 간의 상위성 상호작용 (epistatic interaction)을 뒷받침해준다 (도 2B).
이러한 모델에 대한 추가적인 뒷받침으로, UM171에 의한 CD201 및 CD86의 유도는 CRISPR/Cas9에 의해 유전자를 결핍하도록 조작된 OCI-AML1 세포에서 KBTBD4에 엄격하게 의존적이고 (도 2E에서 sgKBTBD4 패널 참조, 대조군 sgAAVS1 패널과 비교, 도 5), BTB도 KELCH 결손 도메인 돌연변이도 이들 표현형을 구제할 수 없는 것으로 확인된다 (도 2E 및 도 5).
이들 결과는, UM171에 노출된 CD34+CD201+ 조혈 줄기/선조 세포 (HSPC)는 H3K27ac 및 H3K4me2 활성화 마커 둘다를 더 높은 수준으로 나타내는 것으로, 일차 CD34+ 인간 제대혈 세포에서 검증되었다 (도 6A). 다른 문헌 (Broxmeyer, 2014, J Clin Invest, 124: 2365-2368)에 발표된 바와 같이, HDAC 또는 LSD1 저해제의 처리는 시험관내 HSPC 증폭, 및 CD34+CD201+를 비롯한 수종의 원시 하위집단들에서 UM171과 공유되는 표현형인 생체내 생착 개선을 유발하였다 (도 6B-C, 도 7A, 도 8A). 따라서, LSD1i 처리 세포에서 UM171에의 감작화가 제공된다 (도 8C). 여러가지 HDAC 저해제를 단기 (3주) 및 장기 (26주)간 생체내 실험에서 처리하였으며, 면역약화 마우스에서 견고한 인간 생착을 제공하는데 UM171와 등가인 것으로 확인되었다 (도 7B). 일관적으로, UM171-매개 CD34+CD201+ HSPC 표현형은 BRD 도메인 단백질과 아세틸화 히스톤 간의 상호작용을 방지하는 화합물인 iBET에 의해 폐기되는데, 이는 HSC 증폭 및 UM171 활성에서의 이들 마커의 중요성을 더욱 부각시켜 준다 (도 9).
LSD1은 LSD1, CoREST 및 HDAC1/2로 구성된 공동-억제인자 복합체의 구성원이다. 이 복합체는 조혈 줄기 및 선조 세포 전사 유전자 시그니처를 아마도 LSD1 (H3K4me1/2 데미틸라제) 및 HDAC1/2 (예, H3K27ac 데아세틸라제) 활성의 커플링에 의해 억제한다. 최근 연구들에서는, CoREST (또는 RCOR1)가 cis 활성화 또는 저해를 위한 대규모의 혼선을 허용하는 형태인 반대쪽 말단에 위치한 효소 2종을 가진 2엽 구조 (lobed structure)를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, LSD1 저해는 어느 정도의 HDAC1/2 저해와 관련 있으며, 그 역도 성립한다. 특히, HDAC 저해제, 구체적으로 발프로익산과 같이 (HDAC1/2 등의) 클래스 I HDAC를 저해하는 저해제는 인간 HSC의 생체외 기능부전을 어느 정도 역전시킬 수 있다.
도 2B에 제시된 가설과 일치하게, RCOR1 또는 LSD1 수준 감소 (도 10)는 원시 CD34+CD201+ HSPC에서 UM171 표현형을 모방하고 (도 6D "-UM171"으로 표시된 중간 패널 및 도 8B), KBTBD4가 UM171-유발성 HSPC 표현형에 필연적인 것으로 (도 6D, "+UM171로 표시된 우측 패널 및 도 8D) 추가적으로 확인되었다. 가장 흥미롭게도, KBTBD4의 과다 발현은 UM171 처리시 확인된 CD34+CD201+ 표현형을 상대적인 및 절대 세포 카운트 측면 둘다에서 강하게 강화한다 (도 6E 및 도 8B). 그러나, 그 자체로, KBTBD4 과다 발현은 저용량 UM171에의 노출을 부분적으로만 모방할 수 있으며 (패널 2 (고 KBTBD4, UM171 비처리)를 패널 5 (5nM UM171) 및 패널 1 (UM171 비처리)과 비교, 도 6E), 이는 잠재적으로 KBTBD4의 완전한 활성화가 UM171 처리의 결과로서 발생할 수 있으며, 이 단백질의 수준이 UM171의 제공되는 용량을 제한함을 시사한다. 이는, 최적화된 수준의 UM171 (35nM)에 노출한 세포와 비교하였을 때 가장 잘 관찰되지만, KBTBD4는 다양한 범위였으며 (패널 10 (고 KBTBD4) 대비 패널 9 (정상 KBTBD4)의 비교, 도 6E), 이는 UM171-처리 HSPC의 CD34+CD201+ 절대 카운트에서도 나타난다 (도 6F, 하단 패널).
요컨대, CD34+CD201+ 절대 세포 카운트에 초점을 맞추어 살펴보면, shRCOR1 또는 shLSD1은 UM171의 영향을 적어도 부분적으로 모방할 수 있으며, shKBTBD4가 UM171-유도된 HSPC 표현형을 완전히 폐기하는 것으로 나타난다 (도 6F, 상단 패널 및 도 8B 상단 패널). 그러나, 오직 더 높은 수준의 KBTBD4만 CD34+CD201+ 절대 세포 카운트를 추가로 개선할 수 있었는데, 이는 UM171에 의해 유도된 HSC 증폭 개선의 제한 인자임을 의미한다.
(CoREST 복합체에서 RCOR1에 대한 파트너) LSD1의 화학적 저해가 KBTBD4와 독립적으로 CD201 및 CD86의 표면 발현을 유도하는 것으로 제시된다.
KBTBD4와 발표된 RCOR1-HDAC1/2-LSD1 복합체 간의 상위성 관계를 추가로 파악하기 위해, 먼저, RCOR1 수준이 KBTBD4를 고 수준으로 발현하도록 조작된 AML1 세포에서 감소되고, Kelch (기질-결합성) 및 BTB (CUL3-결합성) 도메인 둘다 필수적임을 추가로 입증하였다 (도 11A). 아울러, UM171 처리는 KBTBD4-의존적인 방식으로 RCOR1 (도 11B 및 도 12), LSD1 및 HDAC2 단백질 수준의 중대한 감소를 유발하였다 (도 11B, 3번째 및 4번째 레인 및 하단 그래프). 이러한 효과는 프로테아좀 저해제 MG132의 존재시 저하한다 (도 11B, 레인 5-8 및 도 12A). CULLIN3 네딜화 (neddylation)(활성화)는 UM171 처리 세포에서 정상적인 것으로 보임에도 불구하고 (도 11C, 2번째 레인에서 CUL3NEDD8로 표시된 밴드 참조), RCOR1 수준은 UM171 처리 세포에서 네딜화 저해제인 MLN2494에 노출되더라도 정상적이라는 점에 주목할 수 있으며, 이는 CUL3 활성화가 RCOR1 소실에 필요하다는 것을 의미한다 (도 11C, 레인 4). 네딜화-의존적인 교환제 CAND1 및 kelch 공동-샤페론 NUDCD3가 UM171-유도된 RCOR1의 소실에 필연적임을 추가로 입증해준다 (도 11D에서 레인 5 (shLuc)의 RCOR1 수준 대비 레인 6 (shKBTBD4), 레인 7 (shNUDCD3) 및 레인 8 (shCAND1) 비교, 하단 그래프에서 정량화). CRISPR 스크린에서 발견된 CUL3, CAND1 및 NUDCD3는 UM171-유도된 RCOR1 단백질 소실 (도 11D)과 CD201 및 CD86 발현 유도 (도 11E-F)에 실제 필수적이다. NUDCD3 공동-샤페론과 Kelch 도메인 단백질 간의 연관성은 기존에 확립되어 있다 (Taipale et al., 2014, Cell, 158: 434-448). sgRNA 또는 shRNA를 통한 NUDCD3의 소실은 KBTBD4 단백질 수준 저하를 일으키며 (도 13A-B), KBTBD4 기능 획득이 NUDCD3의 부재 하에 UM171-유도된 CD201 및 CD86 발현을 부분적으로 구제하는 (도 13C-D) 것으로 확인되었다. 이와 일관되게, HDAC 및 LSD1 둘다의 저해는 KBTBD4 null 상황에서 관찰되는 바와 마찬가지로 NUDCD3 또는 CULLIN 3를 낮은 수준으로 발현하도록 조작된 세포에서 CD201 발현을 복구하였다 (도 14).
요컨대, UM171 CRISPR에 기반한 스크린 및 BioID-지시된 프로테오믹스를 이용함으로써, 비특정화된 KBTBD4 어댑터를 이용하여 RCOR1 단백질 소실을 유발하는 새로운 CRL3 복합체가 제시되었다. 이는, 염색질-결합된 LSD1-RCOR1-HDAC 에피제네틱 개변제의 하향 조절을 통해 CD201 및 CD86 등의 수종의 HSC 필수 유전자의 상향 조절을 촉진하며 (도 11B), 이는 잠재적으로 UM171 처리와 HDAC 또는 LSD1 저해제에의 노출 간의 연관성을 설명해준다.
정제한 인간 CD34+ 세포를 이용하여, UM171 처리는 4시간 이내에 RCOR1 및 LSD1 수준을 감소시킨다. HDAC2 수준은 이 시점에 이들 세포에서 거의 영향을 받지 않았다 (도 15A). 중요하게도, MG132 공동-처리는 LSD1 및 RCOR1 단백질의 소실을 폐기한다 (도 15A). 아울러, CD34+ 세포를 이용해 수득한 결과와 일관되게, LSD1, RCOR1의 수준 및 이 시점에 HDAC2는 UM171 노출시 빨리 감소하는 것으로 입증되었다 (레인 3 도 15B).
요컨대 이들 결과는 UM171이 KBTBD4를 통해 작용하여 CoREST 구성원의 분해를 빠르게 (4시간 이내) 유도함을 입증해준다.
아래 표 1에 나타낸 바와 같이, UM171 및 변이체 (UM681)를 다양한 암성 세포주에서 세포 증식을 저해하는 능력에 대해 평가하기 위해 검사하였다.
표 1
암성 세포주의 증식에 대한 UM171 및 UM681의 항-신생물 효과
세포주 UM171 UM681
SKNO A C
KBM7 C D
MUTZ-8 C D
UT-7 C D
EOL1 A B
MOLM-13 A B
NB-4 B C
MUTZ-2 B C
AML3 B C
AML4 B B
KG1 C C
KG1a C C
HL-60 C C
MonoMac B C
AML5 B C
KU-812 C C
Z-138 C C
LY-1 C D
A : IC50 < 250 nM
B : IC50 250 nM - 1 μM
C: IC50 1 μM - 10 μM
D: IC50 > 10 μM
UM134 및 UM681은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00006
Figure pct00007
나아가, 표 2에 나타낸 바와 같이, UM171 및 변이체 2종 (UM681 및 UM134)의 항신생물 효과는 환자의 암성 샘플 (급성 골수성 백혈졍 또는 "AML" 샘플)에서도 확인된다.
표 2
환자의 암성 샘플의 세포 증식에 대한 UM171의 항신생물 효과
AML 샘플 UM681 UM171 UM134
13H150 C A C
04H063 C B C
05H094 C B C
05H149 C B C
06H045 C A C
06H088 D B C
06H117 C B C
07H005 C A C
07H038 C B C
07H045 D B C
07H125 C B C
07H135 C B C
07H151 D C C
09H010 C B C
09H079 C B C
09H115 C A C
10H127 C B C
11H002 C B C
11H046 B A C
11H103 C B C
12H045 C B C
12H058 C B C
12H096 D B C
12H106 D C C
12H151 C A C
13H100 C B C
08H018 D C C
09H046 D C C
10H022 B A C
CB C B C
A : IC50 < 250 nM
B : IC50 250 nM - 1 μM
C: IC50 1 μM - 10 μM
D: IC50 > 10 μM
본원에서 입증된 바와 같이, UM171 및 이의 유도체는 CULLIN3-RING 유비퀴틴 리가제 복합체 (본원에 기술된 CRL3 복합체)를 활성화한다. CRL3/KBTBD4 복합체는 RCOR1/LSD1 및 HDAC2 복합체에 대해 스캐폴딩 단백질로서 정상적으로 작용하는 RCOR1을 분해하며, 그 자체는 UM171의 존재시 해리된다.
이에, 본원에 정의된 바와 같은 일반식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 프로드럭을 투여하여 개체에서 암을 치료하는 방법을 포함한다:
Figure pct00008
상기 식에서,
각각의 Y는 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
Z는 -CN; -C(O)OR1; -C(O)N(R1)R3; -C(O)R1; 또는 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된 -헤테로아릴이되, 여기서 (R1)과 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하고, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되며;
W는 -CN; -N(R1)R3; -C(O)OR1; -C(O)N(R1)R3; -NR1C(O)R1; -NR1C(O)OR1; -OC(O)N(R1)R3; -OC(O)R1; -C(O)R1; -NR1C(O)N(R1)R3; -NR1S(O)2R1; RA 또는 R1 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된 -벤질; -X-L-(X-L)n; -N(R1)R3; L 및 헤테로아릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로아릴; L 및 헤테로사이클릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로사이클릴; RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n- 아릴; -X-L-(X-L)n-NR1RA 또는 -(N(R1)-L)n - N+R1R3R5 R6-이되, 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고, 여기서, R1 및 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
각각의 X는 독립적으로 C, O, S 및 NR1으로부터 선택되고;
L은 각각 독립적으로 -C1-6 알킬렌; -C2-6 알케닐렌; -C2-6 알키닐렌; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7 사이클로알킬렌; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7 사이클로알케닐렌이되, 여기서, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌 및 사이클로알케닐렌 기들은 각각 독립적으로 1 또는 2개의 R4 또는 RA 치환기로 선택적으로 치환되고;
R1은 각각 독립적으로 -H; -C1-6 알킬; -C2-6 알케닐; -C2-6 알키닐; -C3-7 사이클로알킬; -C3-7 사이클로알케닐; -C1-5 과불화; -헤테로사이클릴; -아릴; -헤테로아릴; 또는 -벤질이되, 여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R2는 -H; RA 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -C1-6 알킬; -C(O)R4; RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴; RA 또는 R4 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴; 또는 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴이고;
R3는 각각 독립적으로 -H; -C1-6 알킬; -C2-6 알케닐; -C2-6 알키닐; -C3-7 사이클로알킬; -C3-7 사이클로알케닐; -C1-5 과불화; -헤테로사이클릴; -아릴; -헤테로아릴; 또는 -벤질이되, 여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R4는 각각 독립적으로 -H; -C1-6 알킬; -C2-6 알케닐; -C2-6 알키닐; -C3-7 사이클로알킬; -C3-7 사이클로알케닐; -C1-5 과불화; -헤테로사이클릴; -아릴; -헤테로아릴 또는 -벤질이되, 여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
R5는 각각 독립적으로 -C1-6 알킬; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알케닐; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알키닐; RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-아릴; RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-헤테로아릴; -C1-6 알킬렌-C(O)O-; -C1-6 알킬렌-C(O)OR1; -C1-6 알킬렌-CN; R1 및 R3가 선택적으로 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하는, -C1-6 알킬렌-C(O)NR1R3; 또는 -C1-6 알킬렌-OH이고;
R6는 할로겐; -OC(O)CF3; 또는 -OC(O)R1이고;
RA는 각각 독립적으로 -할로겐; -CF3; -OR1; -L-OR1; -OCF3; -SR1; -CN; -NO2; -NR1R3; -L-NR1R1; -C(O)OR1; -S(O)2R4; -C(O)N(R1)R3; -NR1C(O)R1; -NR1C(O)OR1; -OC(O)N(R1)R3; -OC(O)R1; -C(O)R4; -NHC(O)N(R1)R3; -NR1C(O)N(R1)R3; 또는 -N3이고, 및
Rd는 각각 독립적으로 -H; -C1-6 알킬; -C2-6 알케닐; -C2-6 알키닐; -C3-7 사이클로알킬; -C3-7 사이클로알케닐; -C1-5 과불화; -벤질; 또는 -헤테로사이클릴이다.
일 구현예에서, 화합물은 하기 식을 가진다:
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
또는
Figure pct00012
일 구현예에서, 치환기 Z를 포함하는 본원의 임의 식에서, m은 1 또는 2의 정수이다.
일 구현예에서, Z는 -C(O)OR1이거나, 또는 RA 또는 R1 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -헤테로아릴이고; R2는 H, RA 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치화된 -C1-6 알킬, 또는 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된 -L-아릴이고; W는 R1이 RA에 의해 치환된 C3-7 사이클로알킬인 -N(R1)R3이고; R3는 H이다.
일 구현예에서, Z는 -C(O)O-C1-4 알킬이거나, 또는 헤테로아릴이 이종원자 (N 또는 O) 2-4개를 포함하는 5원성 고리 헤테로아릴이고; R2는 H이거나, 또는 할로겐에 의해 선택적으로 치환된　-L-아릴, OR1, RA에 의해 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, C(O)R4, -헤테로사이클릴, C(O)OR4 또는 C2-6 알키닐이고; W는 -N(R1)R3이되, R1은 RA에 의해 치환된 사이클로헥실이이고, R3는 H이다.
다른 구현예에서,
Z는 CO2Me 또는 2-메틸-2H-테트라졸-5-일이고;
R2는 벤질 또는 H이고; 및
W는 NH-L-N(R1)R3이되, 여기서 L은 C2-4 알킬렌 또는 C3-7 사이클로알킬렌이고; R1 및 R3는 C1-4 알킬 또는 H이거나, 또는 R1과 R3는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하며, 선택적으로 고리는 RA 또는 R4 1개 이상에 의해 치환된다.
다른 구현예에서,
Z는 -C(O)O-C1-4 알킬 또는 이종원자 (N 또는 O) 2-4개를 함유한 5원성 고리 헤테로아릴 또는 탄소 원자 6개를 포함하는 아릴이고;
R2는 H이거나, 또는 할로겐에 의해 선택적으로 치환된　-CH2-아릴, OR1, RA에 의해 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, C(O)R4, -헤테로사이클릴, C(O)OR4 또는 C2-6 알키닐이되, 여기서 아릴은 페닐이거나; 또는 R2는 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -C1-6 알킬렌-헤테로아릴 또는 -C1-6 알킬렌-아릴이고; 및
W는 -X-L-(X-L)n-N(R1)R3이되, X= NR1이고, R1은 H 또는 C1-6 알킬 (예, 메틸)이고, n=0이고, (R1) 및 R3는 질소에 부착되어 3-7원성 고리 (예, 피페리디닐 또는 피롤리디닐 고리)를 형성하고, L은 -C1-6 알킬렌 (예, 프로필 또는 에틸 쇄)이거나, 또는 W= -X-L-(X-L)n-NR1RA이되, X=NR1이고, R1은 H 또는 C1-6 알킬 (예, 메틸)이고, n=0이고, R1 및 RA는 각각 -H이거나, 또는 (R1의 경우) -C1-6 알킬이고, RA는 본원에 기술된 바와 같으며, 예를 들어 본원의 표 3에 기술된 바와 같다.
다른 구현예에서,
Z는 COOMe, COOEt, 메틸-테트라졸, 에틸-테트라졸 또는 메틸-옥사다이아졸, 티오페닐, 또는 페닐이고;
R2는 H, -CH3, -CH2N(CH3)2, -CH2-페닐, -CH2CH2-페닐, -CH2-티오페닐, -CH2-피리딜, CH2-사이클로헥실, -NH-페닐, -CH(O벤질)-페닐, -CH(OH)-페닐, -CH(CH3)-페닐,-C(O)-페닐, -CH2 나프틸이되, 선택적으로 RA 또는 R4 치환기 하나 이상으로 치환되고; 및
W는 -X-L-(X-L)n-N(R1)R3이되, X= NR1이고, R1은 H 또는 C1-6 알킬 (예, 메틸)이고, n=0이고, (R1) 및 R3는 질소 원자에 부착되어 3-7원성 고리 (예, 피페리디닐 또는 피롤리디닐 고리)를 형성하고, L은 -C1-6 알킬렌 (예, 프로필 또는 에틸 쇄)이거나, 또는 W= -X-L-(X-L)n-NR1RA이되, X=NR1이고, R1은 H 또는 C1-6 알킬 (예, 메틸)이고, n=0이고, R1 및 RA는 각각 -H 또는 (R1의 경우) -C1-6 알킬이고, RA는 본원에 기술된 바와 같으며 예를 들어 본원에 표 3과 같이 예시되고, 특히 W는
Figure pct00013
또는
Figure pct00014
이다.
일 구현예에서, Z는 -C(O)O-C1-4 알킬이거나, 또는 이종원자 (N 또는 O) 2-4개를 함유한 5원성 고리 헤테로아릴, 또는 탄소 원자 5개를 포함하는 아릴이다.
일 구현예에서, Z는 COOMe, COOEt, 메틸-테트라졸, 에틸-테트라졸 또는 메틸-옥사다이아졸, 티오페닐, 또는 페닐이다.
일 구현예에서, Z는 COOMe, COOEt, 테트라졸 또는 옥사다이아졸이다.
일 구현예에서, R2는 H이거나, 또는 할로겐에 의해 선택적으로 치환된　-CH2-아릴, OR1, RA에 의해 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, C(O)R4, -헤테로사이클릴, C(O)OR4 또는 C2-6 알키닐이되, 여기서 아릴은 페닐이다.
일 구현예에서, R2는 H, -C1-6 알킬렌-헤테로아릴 또는 -C1-6 알킬렌-아릴이되, 선택적으로 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 치환된다.
일 구현예에서, R2는 H, -CH3, -CH2N(CH3)2, -CH2-페닐, -CH2CH2-페닐, -CH2-티오페닐, -CH2-피리딜, CH2-사이클로헥실, -NH-페닐, -CH(O벤질)-페닐, -CH(OH)-페닐, -CH(CH3)-페닐,-C(O)-페닐, -CH2 나프틸이되, 선택적으로 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 치환된다.
다른 구현예에서, W는 -X-L-(X-L)n-N(R1)R3이고, 여기서 X= NR1이고, R1은 H 또는 C1-6 알킬 (예, 메틸)이고, n=0이고, (R1) 및 R3는 질소 원자에 부착되어 3-7원성 고리 (예, 피페리디닐 또는 피롤리디닐 고리)를 형성하고, L은 -C1-6 알킬렌 (예, 프로필 또는 에틸 쇄)이다.
일 구현예에서, W는 -X-L-(X-L)n-NR1RA이되, X=NR1이고, R1은 H 또는 C1-6 알킬 (예, 메틸)이고, n=0이고, R1 및 RA는 각각 -H 또는 (R1의 경우) -C1-6 알킬이고, RA는 본원에 기술된 바와 같으며, 예를 들어 본원에서 표 3에 예시된 바와 같다.
다른 구현예에서, 화합물은 W가
Figure pct00015
또는
Figure pct00016
인 식 I의 화합물이다.
본원에 개시된 (후술한 대표적인 화합물들을 비롯하여) 식 I의 화합물은, 이의 제조 및 특정화를 비롯하여, PCT 공개번호 WO 2013/110198 뿐 아니라 후술한 합성 방법 부분에 기술되어 있으며, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 병합된다.
본원에서, 용어 "알킬"은 지정된 개수의 탄소 원자를 가진 분지쇄 및 직쇄의 포화 지방족 탄화수소 기 모두를 포괄하는 것으로 의도되며, 예를 들어, C1-C6 알킬에서 C1-C6은 선형 또는 분지형의 포화된 배열로 탄소 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 가진 기를 포괄하는 것으로 정의된다. 전술한 바와 같이 정의되는 C1-C6 알킬에 대한 예로는, 비-제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다.
본원에서, 용어 "사이클로알킬"은 지정된 개수의 탄소 원자를 가진 단환식의 포화된 지방족 탄화수소 기를 의미하는 것으로 의도되며, 예를 들어, C3-C7 사이클로알킬에서 C3-C7은 단환식 포화된 배열로 탄소 3, 4, 5, 6 또는 7개를 가진 기를 포괄하는 것으로서 정의된다. 상기에서 정의되는 C3-C7 사이클로알킬에 대한 예로는, 비-제한적으로, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸을 포함한다.
본원에서, 용어, "알케닐"은 지정된 개수의 탄소 원자를 가지며 탄소 원자들 중 적어도 2개가 이중 결합에 의해 서로 결합되고 E 또는 Z 위치화학성 (regiochemistry) 및 이 둘다를 가지는, 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 기를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, C2-C6 알케닐에서 C2-C6은 탄소 2, 3, 4, 5 또는 5개를 선형 또는 분지형 배열로 가지며 탄소 원자들 중 적어도 2개가 서로 이중 결합에 의해 결합된 기들을 포함하는 것으로서 정의된다. C2-C6 알케닐에 대한 예로는, 비-제한적으로, 에테닐 (비닐), 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐 등을 포함한다.
본원에서, 용어 "알키닐"은 지정된 개수의 탄소 원자를 가지며 2개 이상의 탄소 원자가 삼중 결합에 의해 서로 결합된, 불포화된 직쇄 탄화수소 기를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, C2-C4 알키닐은 쇄에 탄소 원자 2, 3 또는 4개를 가지고 2개 이상의 탄소 원자가 삼중 결합에 의해 서로 결합된 기를 포괄하는 것으로 정의된다. 이러한 알키닐에 대한 예로는, 비-제한적으로, 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐 등을 포함한다.
본원에서, 용어 "사이클로알케닐"은 지정된 개수의 탄소 원자를 가진 단환식의 포화된 지방족 탄화수소 기를 의미하는 것으로 의도되며, 예를 들어, C3-C7 사이클로알케닐에서 C3-C7은 탄소 3, 4, 5, 6, 7 또는 7개를 단환식 배열로 가지는 기들을 포괄하는 것으로 정의된다. 상기와 같이 정의되는 C3-C7 사이클로알케닐에 대한 예로는, 비-제한적으로, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 등을 포함한다.
본원에서, 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "할로알킬"은, 각 수소 원자가 할로겐 원자로 성공적으로 치환될 수 있는, 상기와 같이 정의되는 알킬을 의미하는 것으로 의도된다. 할로알킬에 대한 예로는, 비-제한적으로, CH2F, CHF2 및 CF3를 포함한다.
본원에서, 용어 "아릴"은 단독으로 또는 다른 라디칼과 조합하여, 포화 또는 불포화된 방향족일 수 있는 5-6원성의 제2 카보사이클릭 기에 추가로 융합될 수 있는, 탄소 원자 6개를 함유한 카로사이클릭 방향족 단확신 기를 의미한다. 아릴에 대한 예로는, 비-제한적으로, 페닐, 인다닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 테트라하이드로나프틸 등을 포함한다. 아릴은 사이클로알킬 고리 또는 방향족 고리 상의 적절한 위치에서 다른 기에 연결될 수 있다.
본원에서, 용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 고리가 방향족이고 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종원자 1-4개를 함유한, 원자 최대 10개로 이루어진 단환식 또는 이환식 고리를 의미하는 것으로 의도된다. 헤테로아릴은 고리 탄소 원자 또는 이종원자들 중 하나를 통해 서로 부착될 수 있다. 헤테로아릴에 대한 예로는, 비-제한적으로, 티에닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조[b]티에닐, 푸릴, 벤조푸라닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 이소티아졸릴, 이소크로마닐, 크로마닐, 이속사졸릴, 푸라자닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 티아졸로[4,5-b]-피리딘, 테트라졸릴, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 티에닐, 피리미도-인돌릴, 피리도-인돌릴, 피리도-피롤로-피리미디닐, 피롤로-다이피리디닐 및 플루오로세인 유도체를 포함한다.
본원에서, 용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클릴"은 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종원자 1-4개를 함유한 3, 4, 5, 6 또는 7원성의 비-방향족 고리 시스템을 의미하는 것으로 의도된다. 헤테로사이클에 대한 예로는, 비-제한적으로, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 피페리딜, 3,5-다이메틸피페리딜, 피롤리닐, 피페라지닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 테트라하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-2(3H)-온, 디아지리닐 등을 포함하며, 여기서 고리에의 부착은 후술한 바와 같이 고리의 질소 원자 또는 탄소 원자 상에 존재할 수 있다:
Figure pct00017
또는
Figure pct00018
.
본원에서, 용어 "치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된" 또는 이와 등가의 용어 "치환기 적어도 1개로 선택적으로 치환된"은, 이후에 기술된 상황 이벤트가 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있으며, 기술 내용이 이벤트 또는 상황이 발생한 경우와 발생하지 않은 경우를 포괄하는 의미로 의도된다. 이 정의는 치환기 0-5개를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "개체" 또는 "환자"는 영장류, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼, 랫, 마우스 등과 같은 인간이 아닌 포유류 및 인간을 의미하는 것으로 의도된다.
치환기 자체가 본원에 기술된 합성 방법에 적합하지 않다면, 치환기는 이러한 합성에서 이용되는 반응 조건에 안정적인 적절한 보호기 (PG)로 보호할 수 있다. 보호기는 원하는 중간산물 또는 표적 화합물을 제공하기 위해 방법의 반응 순서에서 적절한 지점에서 제거할 수 있다. 적절한 보호기 및 이러한 적절한 보호기를 이용해 여러가지 치환기를 보호 및 탈보호하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지되어 있으며; 그 예는 T. Greene and P. Wuts, "Protecting Groups in Chemical Synthesis" (4th ed.), John Wiley & Sons, NY (2007)에서 찾아 볼 수 있으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전체적으로 사용되는 보호기에 대한 예로는, 비-제한적으로, Fmoc, Bn, Boc, CBz 및 COCF3를 포함한다. 일부 경우에, 치환기는 본원에 기술된 방법에서 이용되는 반응 조건에서 반응성인 것으로 특이적으로 선택할 수 있다. 이러한 상황에서, 반응 조건은 선택 치환기를 본원에 기술된 방법에서 중간산물 화합물에 유용하거나 또는 표적 화합물에서 원하는 치환기인 다른 치환기로 변환한다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 산 부가 염 및 염기 부가 염 둘다를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 산 부가 염"은 유리 염기의 생물학적 효능 및 특성을 유지하고 생물학적으로 또는 달리 부적절하지 않으며 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기 산 및 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 구연산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 같은 유기 산과 형성된, 염을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염"은 유리 산의 생물학적 효능 및 특성을 유지하고 생물학적으로 또는 달리 부적절하지 않은, 염을 의미하는 것으로 의도된다. 이들 염은 무기 염기 또는 유기 염기를 유리 산에 부가함으로써 제조한다. 무기 염기로부터 유래하는 염으로는, 비-제한적으로, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함한다. 유기 염기로부터 유래하는 염으로는, 비-제한적으로, 1차, 2차 및 3차 아민, 자연 생성되는 치환된 아민을 비롯한 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 다이에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지의 염 등을 포함한다.
본원에 포괄되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 하나 이상의 비대칭 센터, 키랄 축 및 키랄 평판을 가질 수 있으며, 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 기타 입체이성질체 형태가 생길 수 있으며, (R)- 또는 (S)- 또는, 아미노산의 경우 (D)- 또는 (L)-과 같은 절대 입체화학 측면에서 정의할 수 있다. 본 발명은 가능한 이러한 이성질체뿐 아니라 이의 라세믹 및 광학적으로 순수한 형태를 모두 포괄하는 것으로 의도된다. 광학 활성 (+) 및 (-), (R)- 및 (S)- 또는 (D)- 및 (L)-이성질체는 키랄 신톤 또는 키랄 시약을 이용해 제조할 수 있거나, 또는 역상 HPLC와 같은 통례적인 기법으로 분리할 수 있다. 라세믹 혼합물을 제조한 다음 개별 광학 이성질체로 분리할 수 있거나, 또는 키랄 합성에 의해 광학 이성질체로 제조할 수 있다. 거울상 이성질체들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법으로, 예를 들어 부분입체이성질체 염을 생성한 다음 결정화, 기체-액체 또는 액체 크로마토그래피, 한가지 거울상이성질체와 거울상이성질체 특이적인 시약의 선택적인 반응에 의해 분리할 수 있다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자라면, 원하는 거울상이성질체를 다른 화학 실체로 분리 기법에 의해 변환하는 경우, 이후 원하는 거울상이성질체 형태를 형성하기 위해 추가적인 단계가 필요하다는 것을 알 것이다. 대안적으로, 특이적인 거울상 이성질체는 광학 활성 시약, 기질, 촉매 또는 용매를 이용한 비대칭 합성에 의해 또는 한가지 거울상이성질체를 다른 이성질체로 비대칭적인 변환에 의해 합성할 수 있다.
본원에 망라되는 일부 화합물들은 에피머 믹스로 존재할 수 있다. 에피머는 해당 화합물에 존재하는 2 이상의 입체발생 센터 (stereogenic center) 중 단 하나에서 반대 배위를 가지는 부분입체이성질체를 의미한다.
본원에 망라되는 화합물은 양성 이온 형태로 존재할 수 있으며, 이들 화합물의 양성 이온 형태 및 이들의 혼합물을 포괄한다.
아울러, 본원에 망라되는 화합물은 수화된 형태 및 무수 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 식의 화합의 수화물도 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 식에 따른 화합물은 일수화물이다. 구현예들에서, 본원에 기술된 화합물은 물을 약 10 중량% 이하, 약 9 중량% 이하, 약 8 중량% 이하, 약 7 중량% 이하, 약 6 중량% 이하, 약 5 중량% 이하, 약 4 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 약 1 중량% 이하, 약 0.5 중량% 이하, 약 0.1 중량% 이하로 포함한다. 다른 구현예들에서, 본원에 기술된 화합물은 물을 약 0.1 중량% 이상, 약 0.5 중량% 이상, 약 1 중량% 이상, 약 2 중량% 이상, 약 3 중량% 이상, 약 4 중량% 이상, 약 5 중량% 이상, 또는 약 6 중량% 이상으로 포함한다.
화합물을 프로드럭 형태로 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 또는 바람직할 수 있다. 이에, 본원에서, 용어 "프로드럭"은, (예를 들어, 생체내) 대사시 원하는 활성 화합물을 생성하는 화합물에 관한 것이다. 전형적으로, 프로드럭은 비활성 상태이거나 또는 원하는 활성 화합물보다 활성이 낮지만, 취급, 투여 또는 대사 특성이 유리할 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, 구체적인 화합물에 대한 언급은 또한 이의 프로드럭을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 회합 (association)하여 제공된다.
다수의 약제학적으로 허용가능한 담체들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 약제학적으로 허용가능한 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이어야 하며 필요한 개체에 허용적이어야 한다. 약학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물의 공지된 제조 방법에 따라 제형화할 수 있다. 담체는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며 쉽게 이용가능한 여러가지 소스들에 기술되어 있다.
각 담체의 비율은 물질(들)의 용해성 및 화학적 성질, 투여 경로 및 표준 약학 실무에 의해 결정된다.
투여 일관성을 보장하기 위해, 일 구현예에서, 약학적 조성물은 단위 용량의 형태일 수 있다.
화합물 또는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유한 정제, 캡슐제 또는 과립제와 같은 고체 경구 조성물/투약 형태로, 도 17B에 예시된 바와 같이, 경구 투여용일 수 있다. 화합물 또는 조성물은 또한 설하 투여용일 수 있다.
고체 경구 조성물/투약 형태는 블렌딩, 충진, 타정 등의 통례적인 방법으로 준비할 수 있다. 반복적인 블렌딩 조작을 이용해, 담체를 이용하는 조성물 전체에 활성 물질(들)을 분산시킬 수 있다. 이러한 조작은 물론 당해 기술 분야에서 통상적이다.
고체 경구 조성물/투약 형태는 일반적인 약학 실무에 잘 알려진 방법에 따라, 특히 장용 코팅으로 코팅할 수 있다.
경구 액체 조제물은 에멀젼, 시럽 또는 엘릭실제의 형태일 수 있거나, 또는 사용전 물 또는 기타 적절한 비히클을 사용해 재구성하기 위한 건조 제품으로서 제공할 수 있다. 이러한 액체 조제물은 통상적인 첨가제를 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
화합물 또는 조성물은 비경구 주사용일 수 있으며; 이는 근육내, 정맥내 (도 16 및 17A에 예시됨) 또는 피하로 투여된다.
비경구 투여의 경우, 화합물 또는 조성물은 선택적으로 용액을 등장성으로 만들기 위해 용질, 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스를 함유한 무균 용액 형태로 이용할 수 있다. 비경구 주사용 화합물 또는 조성물은 화합물 및 무균 비히클을 이용하여 제조할 수 있으며, 화합물은 사용되는 농도에 따라 비히클에 현탁 또는 용해할 수 있다. 화합물이 용액 중에 존재하면, 주입 및 여과 멸균한 다음 적절한 바이얼 또는 앰플에 넣고, 이어 캐리어 또는 저장 패키지에 밀봉할 수 있다.
일 구현예에서, 화합물 또는 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 하나 이상의 부가적인 활성 성분과 조합하여 추가로 이용할 수 있다.
본원에 망라되는 화합물이 경구, 정맥내 또는 피하로 투여되는 것 역시 포함한다.
또한, 증폭 후 수득한 제대혈 이식 후 식 I의 화합물을 이용해 개체에서 암을 치료하는 방법을 또한 포함한다.
특정 구현예에서, 식 I의 화합물은 하기 구조와 같은 UM171이다:
Figure pct00019
일 구현예에서, 식 I의 화합물은
Figure pct00020
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
다른 구현예에서, 식 I의 화합물은
Figure pct00021
의 하이드로브로마이드 염이다.
추가적인 구현예에서, 식 I의 화합물은
Figure pct00022
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
본원에 언급된 화합물 피리미도[4,5-B]인돌 유도체는 미국 특허 9,409,906 및 10,336,747에 따라 준비할 수 있다. 5H-피리도[4,3-b]인돌 유도체 및 피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체는 예를 들어 US 10,647,718 B에 따라 제조할 수 있으며, 이 문헌의 내용은 원용에 의해 본원에 병합된다.
대안적으로, 본원에 개시된 대표적인 화합물은 후술한 화학 실시예에 따라 제조할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 여러가지 출발 물질을 이용해 유사한 조건으로 다른 화합물들을 제조할 수 있음이 자명할 것이다.
화학 실시예
실시예 1
Figure pct00023
메틸 9-메틸-4-(메틸(3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
중간산물 1A
Figure pct00024
메틸 4-클로로-9-메틸-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
100 mL 둥근 바닥형 플라스크에 메틸 4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.1 g, 0.382 mmol) 및 N,N-Di메틸포름아미드 다이메틸 아세탈 (0.297 ml, 2.217 mmol)을 톨루엔 (35 ml) 중에 투입하여, 황갈색 현탁물을 수득하였다. 이를 110℃까지 17시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 20℃로 냉각시켜, 건조물로 농축해, 황갈색 고체로서 94 mg을 수득하였다. 잔사를 ISCO (RediSep 12 g 컬럼, CH2Cl2/EtOAc로 용출)에서 정제하여, 메틸 4-클로로-9-메틸-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (53 mg, 0.192 mmol, 50.3%의 수율)를 백색 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.96 (s, 3 H) 4.03 (s, 3 H) 8.08 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1 H) 8.39 (dd, J=1.6, 0.8 Hz, 1 H) 8.46 (dd, J=8.2, 0.8 Hz, 1 H) 8.93 (s, 1 H). LCMS m/z 276.0 (M + H)+.
실시예 1
Figure pct00025
메틸 9-메틸-4-(메틸(3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
마이크로웨이브 바이얼에 메틸 4-클로로-9-메틸-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.02 g, 0.073 mmol), N-메틸-3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.024 g, 0.109 mmol) 및 트리에틸아민 (0.020 ml, 0.145 mmol)을 메탄올 (0.76 ml) 중에 투입하여, 황갈색 현탁물을 수득하였다. 바이얼을 밀봉하여 마이크로웨이브에서 140℃로 15분간 가열하였다. 반응 혼합물을 건조 농축하여, 적색 오일을 수득하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep 4 g 컬럼, CH2Cl2/MeOH/NH4OH로 용출), 메틸 9-메틸-4-(메틸(3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (21 mg, 0.053 mmol, 73.2%의 수율)를 무색 오일로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.13 - 1.33 (m, 6 H) 1.74 - 1.90 (m, 2 H) 2.00 - 2.25 (m, 6 H) 3.29 (s, 3 H) 3.82 (t, J=6.8 Hz, 2 H) 3.91 (s, 3 H) 3.92 (s, 3 H) 7.91 (dd, J=8.6, 1.6 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.19 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 8.45 (s, 1 H). HRMS m/z 396.2517 (M+H)+.
실시예 2
Figure pct00026
메틸 9-메틸-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
표제 화합물을 실시예 1에 기술된 절차에 따라 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.32 - 1.44 (m, 2 H) 1.45 - 1.57 (m, 4 H) 1.76 - 1.91 (m, 2 H) 2.25 - 2.45 (m, 6 H) 3.61 - 3.70 (m, 2 H) 3.89 (s, 3 H) 3.92 (s, 3 H) 7.49 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 7.90 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1 H) 8.19 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 8.46 (d, J=8.2 Hz, 1 H). HRMS m/z 382.2374 (M+H)+.
실시예 3
Figure pct00027
메틸 4-((4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-일)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
중간산물 3A
Figure pct00028
2-(4-클로로부트-2-yn-1-일)이소인돌린-1,3-다이온
200 mL 둥근 바닥형 플라스크에 포타슘 1,3-다이옥소이소인돌린-2-ide (4.75 g, 25.6 mmol)를 DMF (30.0 ml) 중에 투입하여, 백색 현탁물을 수득하였다. 1,4-다이클로로부트-2-yne (20.06 ml, 205 mmol)을 첨가하였다. 갈색 현탁물을 100℃로 가열하였다. 2시간 후, 20℃로 냉각하였다. 물 (50.0 ml)을 첨가한 다음 건조 농축하여, 갈색 고형물을 수득하였다. 이 고형물을 물 (75 mL)과 CH2Cl2 (50 mL)로 분할하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH2Cl2 (50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 조합해 물 (50 mL)로 헹구었다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조한 다음 여과 및 농축해, 6.8 g을 갈색 고형물로 수득하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep 120 g 컬럼, 헥산/CH2Cl2로 용출), 2-(4-클로로부트-2-yn-1-일)이소인돌린-1,3-다이온 (3.90 g, 16.69 mmol, 65.1%의 수율)을 백색 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 4.44 (t, J=2.0 Hz, 2 H) 4.47 (t, J=2.0 Hz, 2 H) 7.81 - 7.96 (m, 4 H). LCMS m/z 234.0 (M + H)+.
중간산물 3B
Figure pct00029
2-(4-(피페리딘-1-일)부트-2-yn-1-일)이소인돌린-1,3-다이온
100 mL 둥근 바닥형 플라스크에 2-(4-클로로부트-2-yn-1-일)이소인돌린-1,3-다이온 (1 g, 4.28 mmol) 및 피페리딘 (0.932 ml, 9.42 mmol)을 아세토니트릴 (15 ml) 중에 투입하여 노란색 용액을 수득하였다. 이를 80℃로 가열하고, 수득되는 현탁물을 16.5시간 동안 교반하였다. 이를 건조 농축하여, 오렌지색 고형물을 수득하였다. 이 혼합물을 CH2Cl2 (30 mL)와 물 (20 mL)로 분할하였다. 층 분리하였다. 수성 층을 CH2Cl2 (10 mL)로 추출하였다. 유기 층을 조합하여 MgSO4 상에서 건조한 다음 여과 및 농축하여, 1.65 g을 오렌지색 오일로서 수득하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep 40 g 컬럼, CH2Cl2/EtOAc로 용출), 2-(4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-일)이소인돌린-1,3-다이온 (752 mg, 2.66 mmol, 62.2%의 수율)을 백색 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 2 H) 1.46 (quin, J=5.7 Hz, 4 H) 2.33 (s, 3 H) 3.18 (s, 2 H) 4.40 (t, J=2.2 Hz, 2 H) 7.84 - 7.89 (m, 2 H) 7.89 - 7.94 (m, 2 H). LCMS m/z 283.2 (M + H)+.
중간산물 3C
Figure pct00030
4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-아민
50 mL 둥근 바닥형 플라스크에 2-(4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-일)이소인돌린-1,3-다이온 (0.752 g, 2.66 mmol) 및 하이드라진 수화물 (0.152 ml, 2.80 mmol)을 에탄올 (13 ml) 중에 투입하여, 노란색 용액을 수득하였다. 이를 3시간 동안 환류 (ca. 80℃) 가열한 다음 하이드라진 수화물 (0.043 ml, 0.799 mmol)을 첨가하고, 계속 1시간 동안 환류 가열하였다. 이를 20℃로 냉각시켜 16시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각한 후 현탁물을 1시간 동안 교반하였다. 고형물을 부흐너 깔때기로 여과한 다음 고형물을 차가운 에탄올 (2 x 1 mL)로 헹구었다. 여과물을 건조 농축하여, 615 mg을 노란색 고형물로 수득하였다. 고형물을 Et2O (10 mL)에 현탁하여, 부흐너 깔때기로 여과하였다. 고형물을 Et2O (5 mL)로 헹구었다. 이를 rotovap에서 건조 농축하여, 4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-아민 (315 mg, 2.069 mmol, 78%의 수율)을 노란색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.29 - 1.41 (m, 2 H) 1.49 (quin, J=5.6 Hz, 4 H) 2.25 - 2.43 (m, 4 H) 3.16 (t, J=2.1 Hz, 2 H) 3.28 (t, J=2.1 Hz, 2 H). LCMS m/z 153.2 (M + H)+.
실시예 3
Figure pct00031
메틸 4-((4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-일)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
표제 화합물을 메틸 4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 및 4-(피페리딘-1-일)but-2-yn-1-아민을 이용해 실시예 1에 기술된 절차에 따라 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.22 - 1.35 (m, 2 H) 1.44 (quin, J=5.4 Hz, 4 H) 2.28 - 2.40 (m, 4 H) 3.17 (br. s., 2 H) 3.90 (s, 3 H) 4.43 (d, J=5.9 Hz, 2 H) 7.81 - 7.89 (m, 2 H) 8.06 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 8.43 - 8.48 (m, 2 H) 12.24 (s, 1 H). LCMS m/z 378.2 (M + H)+.
실시예 4
Figure pct00032
7-페닐-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민
바이얼에 7-브로모-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 (0.04 g, 0.103 mmol), 페닐보론산 (0.025 g, 0.206 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (0.018 g, 0.015 mmol)을 투입하였다. 바이얼을 밀봉하고, 질소로 배기하였다 (3 사이클 진공 + 질소 재충전). 1,4-다이옥산 (0.52 ml)과 2M 소듐 카보네이트 수용액 (0.309 ml, 0.618 mmol)을 첨가하였다. 바이얼을 질소로 배기하였다 (3 사이클 진공 + 질소 재충전). 2상 혼합물을 85℃로 가열한 다음 18시간 동안 교반하였다. 이를 20℃로 냉각하고, 메탄올 (2 mL)과 CH2Cl2 (2 mL)로 희석하였다. 혼합물을 0.45 ㎛ 필터에서 여과하였다. 바이얼과 필터를 메탄올 (2 x 2 mL) 및 CH2Cl2 (2 x 2 mL)로 헹구었다. 이를 건조 농축하여, 오렌지색 고형물을 수득하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep 12 g 컬럼, CH2Cl2/MeOH/NH4OH로 용출), 7-페닐-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 (33 mg, 0.086 mmol, 83%의 수율)을 백색 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.39 (br. s., 2 H) 1.46 - 1.59 (m, 4 H) 1.77 - 1.91 (m, 2 H) 2.38 (br. s., 6 H) 3.64 (q, J=6.5 Hz, 2 H) 7.24 (t, J=4.9 Hz, 1 H) 7.34 - 7.41 (m, 1 H) 7.50 (t, J=7.6 Hz, 2 H) 7.54 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.66 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 7.74 (d, J=7.4 Hz, 2 H) 8.34 (s, 1 H) 8.38 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 11.93 (s, 1 H). LCMS m/z 386.2 (M + H)+.
실시예 5
Figure pct00033
메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
중간산물 5A
Figure pct00034
메틸 2-(벤질옥시)-2-페닐아세테이트
50 mL 둥근 바닥형 플라스크에 NaH 60%wt. / 미네랄 오일 (0.265 g, 6.62 mmol)을 DMF (10 ml) 중에 투입하여 회색 현탁물을 수득하였다. 이를 0℃로 냉각시켜, 메틸 2-하이드록시-2-페닐아세테이트 (1 g, 6.02 mmol)를 첨가하였다. 형성된 오렌지색 현탁물을 45분간 교반하였다. 벤질 브로마이드 (0.787 ml, 6.62 mmol)를 첨가하였다. 20℃로 승온시켜 30분간 교반하였다. 포화 NH4Cl (40 mL) + 물 (10 mL)을 첨가하여 반응물을 퀀칭하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 50 mL)로 추출하였다. 유기층을 조합하여 물 (2 x 50 mL)과 브린 (35 mL)으로 순차적으로 헹구었다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조한 다음 여과 및 농축하여, 1.72 g을 연노란색 오일로서 수득하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하였다 (RediSep Gold 40 g 컬럼, 헥산/Et2O로 용출). ISCO를 2회 더 반복하여, 메틸 2-(벤질옥시)-2-페닐아세테이트 (508 mg, 1.982 mmol, 32.9%의 수율)를 무색 오일로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.64 (s, 3 H) 4.49 (d, J=11.3 Hz, 1 H) 4.59 (d, J=11.3 Hz, 1 H) 5.11 (s, 1 H) 7.04 - 7.19 (m, 1 H) 7.23 - 7.45 (m, 9 H).
중간산물 5B
Figure pct00035
메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
마이크로웨이브 바이얼에 메틸 2-아미노-3-카바모일-1H-인돌-6-카르복실레이트 (0.185 g, 0.793 mmol), 메틸 2-(벤질옥시)-2-페닐아세테이트 (0.508 g, 1.983 mmol) 및 소듐 메톡사이드 30%wt. / 메탄올 (0.372 ml, 1.983 mmol)을 메탄올 (2 ml) 중에 투입하였다. 바이얼을 밀봉하고, 마이크로웨이브에서 140℃로 1시간 동안 가열하였다. 이를 20℃로 냉각시켜 AcOH (0.118 ml, 2.062 mmol)를 첨가하였다. 형성된 현탁물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 고형물을 부흐너에서 수집하였다. 케이크를 메탄올 (3 x 0.5 mL)로 헹구었다. 산물을 20℃에서 고 진공 하에 무게가 일정해질 때까지 건조하여, 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (238 mg, 0.542 mmol, 68.3%의 수율)를 황갈색 고형물로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.87 (s, 3 H) 4.58 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 4.69 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 5.56 (s, 1 H) 7.27 - 7.46 (m, 8 H) 7.55 - 7.64 (m, 2 H) 7.84 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 8.00 - 8.06 (m, 2 H) 12.49 (br. s., 1 H) 12.60 (br. s., 1 H). LCMS m/z 440.2 (M + H)+.
중간산물 5C
Figure pct00036
메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
15 mL 둥근 바닥형 플라스크에 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.234 g, 0.532 mmol)를 포스포러스 옥시클로라이드 (3.47 ml, 37.3 mmol) 중에 투입한 다음 85℃까지 16.5시간 동안 가열하였다. 이를 건조 농축하였다. 잔사를 포화 NaHCO3 (10 mL)에 현탁하여, 1시간 교반하였다. 고형물을 부흐너에서 수집하였다. 케이크를 물 (3 x 2 mL)로 헹구었다. 산물을 40℃에서 고 진공 하에 무게가 일정해질 때까지 건조하여, 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (228 mg, 0.498 mmol, 94%의 수율)를 황갈색 고형물로서 수득하였다. LCMS m/z 458.2 (M + H)+.
실시예 5
Figure pct00037
메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
마이크로웨이브 바이얼에 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.228 g, 0.498 mmol), 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.158 ml, 0.996 mmol) 및 트리에틸아민 (0.173 ml, 1.245 mmol)을 메탄올 (3.8 ml) 중에 투입하였다. 바이얼을 밀봉하고, 마이크로웨이브에서 140℃까지 30분간 가열하였다. 이를 건조 농축하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하였다 (RediSep Gold 40 g, CH2Cl2/MeOH/NH4OH로 용출). ISCO 정제를 2회 반복하여, 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (172 mg, 0.305 mmol, 61.3%의 수율)를 연노란색 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.29 - 1.42 (m, 2 H) 1.42 - 1.56 (m, 4 H) 1.72 - 1.91 (m, 2 H) 2.18 - 2.47 (m, 6 H) 3.66 (tt, J=13.2, 6.6 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.54 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 4.64 (d, J=12.1 Hz, 1 H) 5.50 (s, 1 H) 7.21 - 7.43 (m, 8 H) 7.51 (t, J=5.9 Hz, 1 H) 7.57 (d, J=7.0 Hz, 2 H) 7.82 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.38 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.22 (s, 1 H). HRMS m/z 564.2979 (M+H)+.
실시예 6
Figure pct00038
메틸 2-벤질-4-((3-(메틸(3-(프로프-2-yn-1-일아미노)프로필)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
10 mL 둥근 바닥형 플라스크에 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)-아미노)-2-벤질-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (25 mg, 0.054 mmol) 및 tert-부틸아민 (8.63 ㎕, 0.081 mmol)을 THF (2.7 ml) 중에 투입하였다. 프로파르길 브로마이드 (7.26 ㎕, 0.065 mmol)를 첨가하고, 20℃에서 69.5시간 동안 교반하였다. 이를 건조 농축하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep 12 g 컬럼, CH2Cl2/MeOH/NH4OH로 용출), 메틸 2-벤질-4-((3-(메틸(3-(프로프-2-yn-1-일아미노)프로필)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (3.2 mg, 6.42 μmol, 11.82%의 수율)를 백색 고형물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.23 (s, 1 H) 1.56 (dt, J=14.1, 7.0 Hz, 2 H) 1.80 (dt, J=13.5, 6.6 Hz, 2 H) 2.20 (s, 3 H) 2.34 - 2.46 (m, 4 H) 2.56 (t, J=7.0 Hz, 2 H) 2.99 (t, J=2.2 Hz, 1 H) 3.25 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 3.58 - 3.70 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.04 (s, 2 H) 7.15 - 7.23 (m, 1 H) 7.28 (t, J=7.6 Hz, 2 H) 7.37 (m, J=7.4 Hz, 2 H) 7.54 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.83 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.27 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.05 (s, 1 H). HRMS m/z 499.2823 (M+H)+.
실시예 7
Figure pct00039
N1-(3-아미노프로필)-N3-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)프로판-1,3-다이아민
마이크로웨이브 바이얼에 2-벤질-4-클로로-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌 (0.100 g, 0.266 mmol) 및 N1-(3-아미노프로필)프로판-1,3-다이아민 (0.375 ml, 2.66 mmol)을 메탄올 (2 ml) 중에 투입하였다. 바이얼을 밀봉하고 마이크로웨이브에서 140℃에서 30분간 가열하였다. 이를 건조 농축하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep 12 g 컬럼, CH2Cl2/MeOH/NH4OH로 용출), N1-(3-아미노프로필)-N3-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)프로판-1,3-다이아민 (112 mg, 0.238 mmol, 89%의 수율)을 연노란색 고형물로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.54 (quin, J=6.85 Hz, 2 H) 1.79 (quin, J=6.26 Hz, 2 H) 2.53 - 2.69 (m, 6 H) 3.68 (q, J=6.26 Hz, 2 H) 4.04 (s, 2 H) 4.43 (s, 3 H) 7.15 - 7.22 (m, 1 H) 7.28 (t, J=7.43 Hz, 2 H) 7.38 (d, J=7.43 Hz, 2 H) 7.57 (t, J=4.89 Hz, 1 H) 7.90 (dd, J=8.22, 1.17 Hz, 1 H) 8.08 (s, 1 H) 8.36 (d, J=8.22 Hz, 1 H). HRMS m/z 471.2737 (M+H)+.
실시예 8
Figure pct00040
N-(3-((3-((2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)아미노)프로필)아미노)프로필)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미드
15 mL 둥근 바닥형 플라스크에 N1-(3-아미노프로필)-N3-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)프로판-1,3-다이아민 (57 mg, 0.121 mmol) 및 트리에틸아민 (25.3 ㎕, 0.182 mmol)을 DMF (2.8 ml) 중에 투입하였다. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노에이트 (44.7 mg, 0.131 mmol)를 첨가한 다음 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 건조 농축하였다. 잔사를 메탄올 (3 mL), 물 (2 mL) 및 Na2CO3 2M / 물 (5방울)에 현탁하였다. 이를 30분간 교반하였다. 고형물을 부흐너에서 수집하였다. 케이크를 물 (2 x 1 mL)로 헹군 다음 메탄올 (1 x 1 mL)로 헹구었다. 산물을 40℃에서 고 진공 하에 무게가 일정해질 때까지 건조하여, N-(3-((3-((2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)아미노)프로필)아미노)프로필)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미드 (78 mg, 0.112 mmol, 92%의 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.28 (m, J=13.79, 13.79, 6.85 Hz, 2 H) 1.36 - 1.52 (m, 3 H) 1.52 - 1.63 (m, 3 H) 1.79 (dt, J=12.23, 5.82 Hz, 2 H) 2.04 (t, J=7.24 Hz, 2 H) 2.52 - 2.58 (m, 3 H) 2.62 (t, J=6.26 Hz, 2 H) 2.78 (dd, J=12.13, 5.09 Hz, 1 H) 2.99 - 3.06 (m, 1 H) 3.06 - 3.13 (m, 2 H) 3.68 (q, J=6.26 Hz, 2 H) 4.04 (s, 2 H) 4.06 - 4.11 (m, 1 H) 4.22 - 4.31 (m, 1 H) 4.43 (s, 3 H) 6.34 (s, 1 H) 6.40 (s, 1 H) 7.14 - 7.23 (m, 1 H) 7.28 (t, J=7.43 Hz, 2 H) 7.34 - 7.41 (m, 2 H) 7.56 (t, J=5.28 Hz, 1 H) 7.77 (t, J=5.48 Hz, 1 H) 7.89 (dd, J=8.20, 1.20 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=1.20 Hz, 1 H) 8.36 (d, J=8.22 Hz, 1 H) 12.00 (br. s., 2 H). HRMS m/z 697.3498 (M+H)+.
실시예 9
Figure pct00041
메틸 2-벤질-4-((3-(메틸아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
중간산물 9A
메틸 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.100 g, 0.284 mmol), Et3N (0.079 ml, 0.569 mmol) 및 tert-부틸 (3-아미노프로필)(메틸)카바메이트 (0.080 g, 0.426 mmol)의 MeOH (1.0 ml) 중의 혼합물을 마이크로웨이브에서 140℃에서 20분간 가열하였다. 반응이 완료되지 않았으며, 시약을 더 첨가하여 다시 140℃에서 20분간 가열하였다. 용매를 제거한 다음, 조산물 잔사를 짧은 SiO2 패드에서 Hx-EA (65-35)를 이용해 정제하여, 메틸 2-벤질-4-((3-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 0.092 g을 수득하였다. LRMS + H+: 504.2.
중간산물 9B
TFA (1.0 ml, 12.9 mmol)를, 상기 중간산물 (0.092 g, 0.18 mmol)의 차가운 (0-5℃) 현탁물에 점적 첨가한 다음 rt로 승온시켰다. 30분 후, 이를 약간의 톨루엔으로 희석하고, 용매를 제거하였다. 잔사를 추가의 톨루엔에서 취한 다음 용매를 제거하였다. 마지막으로, 이를 EA에서 취하고, 용매를 제거하여, 메틸 2-벤질-4-((3-(메틸아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트의 트리플루오로 아세테이트 염 0.085 g을 수득하였다. LRMS + H+: 404.2.
실시예 9
상기한 TFA 염 (0.020g), 소듐 카보네이트 (8.81 mg, 0.083 mmol), 소듐 아이오다이드 (1.4 mg, 9.6 μmol) 및 2-(2-(2-클로로에톡시)에톡시)에탄올 (6.5 ㎕, 0.04 mmol)을 70℃에서 아세톤 (0.2 ml) 중에 밤새 가열하였다. 추가로 2-(2-(2-클로로에톡시)에톡시)에탄올 (6.4 ㎕, 0.04 mmol)을 첨가한 다음 밤새 70℃에서 교반하였다. 이후 이를 EA-물로 희석한 다음 유기 상을 분리해 Na2SO4 상에서 건조 및 여과하였다. 조산물 부가체를 콤비-플래시에서 DCM-MeOH (0-25%)를 이용해 정제하여, 표제 화합물 0.009 g을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.74 - 1.85 (m, 2 H) 2.25 (br. s., 3 H) 2.55 (br. s., 2 H) 3.32 - 3.36 (m, 4 H) 3.39 - 3.46 (m, 6 H) 3.51 (t,J=5.87 Hz, 2 H) 3.64 (q, J=6.52 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.04 (s, 2 H) 4.53 (br. s., 1 H) 7.18 (t, J=7.40 Hz, 1 H) 7.28 (t, J=7.63 Hz, 2 H) 7.37 (d, J=7.04 Hz, 2 H) 7.55 (t, J=5.28 Hz, 1 H) 7.82 (dd, J=8.22, 1.17 Hz, 1 H) 7.99 (s, 1 H) 8.27 (d, J=8.22 Hz, 1 H) 12.05 (s, 1 H). LRMS + H+: 536.3.
실시예 10
Figure pct00042
메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-벤질-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트
마이크로웨이브 바이얼에 메틸 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.050 g, 0.142 mmol) 및 N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-다이아민 (0.12 ml, 0.71 mmol)을 MeOH (2.0 ml, 49.4 mmol) 중에 투입하였다. 바이얼을 마이크로웨이브 하에 놓고, 140℃로 30분간 가열하였다. 30분 후, 이를 건조 농축하였다. 잔사를 ISCO에서 정제하여 (RediSep Gold 컬럼, DCM-MeOH-NH4OH로 용출), 표제 화합물 0.044 g을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.44 (dt, J=13.8, 6.6 Hz, 2 H) 1.72 (dt, J=13.7, 6.8 Hz, 2 H) 2.11 (s, 3 H) 2.24 - 2.30 (m, 2 H) 2.33 (t, J=6.7 Hz, 2 H) 2.47 (br. s., 2 H) 3.51 - 3.61 (m, 2 H) 3.76 - 3.85 (m, 3 H) 3.97 (s, 2 H) 7.08 - 7.15 (m, 1 H) 7.17 - 7.24 (m, 2 H) 7.27 - 7.34 (m, 2 H) 7.50 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 7.76 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1 H) 7.92 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=8.2 Hz, 1 H). LRMS + H+: 461.2.
실시예 11
Figure pct00043
메틸 2-벤질-4-((3-(메틸(3-(펜트-4-yn아미도)프로필)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5- b]인돌-7-카르복실레이트
DMF (0.12 ml) 중의 펜트-4-이노익 산 (2.56 mg, 0.026 mmol), EDC (6.24 mg, 0.033 mmol) 및 트리에틸아민 (4.58 ㎕, 0.033 mmol) 혼합물에 5℃에서 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-벤질-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.010 g, 0.022 mmol)를 첨가하였다. 5분 후, rt로 승온시켜 밤새 교반하였다. 혼합물을 DMSO로 희석한 다음 분취용 HPLC (Zorbax SB-C18 PrepHT 5 ㎛; 21.2x100mm)에서 20% MeOH (0.065% TFA) -> 100 MeOH (0.05% TFA)의 구배를 이용해 직접 정제하고, 에탄올로부터 동결건조하여 표제 화합물 0.006 g을 TFA 염으로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.74 (quin, J=7.20 Hz, 2 H) 2.02 (br. s., 2 H) 2.20 - 2.29 (m, 2 H) 2.31 - 2.38 (m, 2 H) 2.68 - 2.74 (m, 3 H) 2.76 (t, J=2.54 Hz, 1 H) 3.07 - 3.13 (m, 3 H) 3.69 (q, J=6.30 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.08 (s, 2 H) 7.21 (t, J=7.04 Hz, 1 H) 7.30 (t, J=7.63 Hz, 2 H) 7.34 - 7.40 (m, 2 H) 7.51 (t, J=5.48 Hz, 1 H) 7.84 (dd, J=8.22, 1.17 Hz, 1 H) 7.98 - 8.02 (m, 1 H) 8.05 (t, J=5.48 Hz, 1 H) 8.37 (d, J=8.22 Hz, 1 H) 9.18 (br. s., 1 H) 12.15 (s, 1 H). LRMS + H+: 541.3.
실시예 12
Figure pct00044
N1-(3-아미노프로필)-N3-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)-N1-메틸프로판-1,3-다이아민
2-벤질-4-클로로-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌 및 아민으로서 N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-다이아민을 이용해 전술한 절차와 유사한 절차에 따라, 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.52 (quin, J=6.85 Hz, 2 H) 1.80 (quin, J=6.85 Hz, 2 H) 2.18 (s, 3 H) 2.36 (t, J=7.24 Hz, 2 H) 2.41 (t, J=6.65 Hz, 2 H) 2.53 - 2.61 (m, 2 H) 3.64 (q, J=6.52 Hz, 2 H) 4.04 (s, 2 H) 4.43 (s, 3 H) 7.14 - 7.23 (m, 1 H) 7.28 (t, J=7.43 Hz, 2 H) 7.38 (d, J=7.43 Hz, 2 H) 7.49 (t, J=5.09 Hz, 1 H) 7.91 (d, J=8.22 Hz, 1 H) 8.08 (s, 1 H) 8.32 (d, J=8.22 Hz, 1 H). LRMS + H+: 485.4.
실시예 13
Figure pct00045
메틸 2-(나프탈렌-2-일메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-7-카르복실레이트
중간산물 13A
MeOH (1.601 ml) 중의 메틸 2-아미노-3-카바모일-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-6-카르복실레이트 (0.090 g, 0.384 mmol), 메틸 2-(나프탈렌-2-일)아세테이트 (0.269 g, 1.345 mmol) 및 소듐 메톡사이드 5.4M (0.28 ml, 1.53 mmol) 혼합물을 마이크로웨이브에서 75분간 140℃로 가열하였다. 혼합물을 포화 MeOH-NH4Cl로 희석한 다음 여과하였다. 고형물을 MeOH-물로 헹구고, 고 진공 하에 건조하여 조산물 0.120 g으로 메틸 4-하이드록시-2-(나프탈렌-2-일메틸)-9H-피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-7-카르복실레이트를 수득하였다.
중간산물 13B
다이옥산 (0.41 ml)-DCE (0.62 ml)중의 상기 중간산물 (0.060 g)에 POCl3 (0.13 ml, 1.4 mmol)를 첨가하여, 혼합물을 마이크로웨이브에서 10분간 160℃에서 가열하였다. 반응이 완료되지 않아, POCl3 (0.131 ml, 1.405 mmol)를 추가로 첨가하였다. 용매를 제거하였다. 용매 제거한 다음, 잔류물을 포화 NaHCO3 (10 mL)에 현탁하여 1시간 동안 교반하였다. 고형물을 부흐너에서 수집하고, 케이크를 물 (3 x 2 mL)로 헹군 후 40℃에서 고 진공 하에 건조하여, 메틸 4-클로로-2-(나프탈렌-2-일메틸)-9H-피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-7-카르복실레이트 0.040 g을 수득하였다. LRMS + H+: 403.1.
실시예 13
상기한 중간산물과 아민으로서 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민을 이용해 전술한 절차와 유사한 절차에 따라 제조하였으며, 표제 화합물을 분취용 HPLC (Zorbax SB-C18 PrepHT 5 ㎛; 21.2x100mm)에서 20% MeOH (0.065% TFA) -> 100 MeOH (0.05% TFA) 구배를 이용해 정제하여, 표제 화합물 0.012 g을 TFA 염으로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.15 - 1.31 (m, 1 H) 1.43 - 1.72 (m, 5 H) 1.91 - 2.04 (m, 2 H) 2.58 (q, J=11.00 Hz, 2 H) 2.95 (br. s., 2 H) 3.26 (d, J=11.35 Hz, 2 H) 3.72 (q, J=5.50 Hz, 2 H) 3.92 (s, 3 H) 4.27 (s, 2 H) 7.48 (quin, J=6.26 Hz, 2 H) 7.58 (d, J=8.61 Hz, 1 H) 7.64 (t, J=5.09 Hz, 1 H) 7.78 - 7.93 (m, 4 H) 8.22 (s, 1 H) 8.94 (br. s., 1 H) 9.01 (s, 1 H) 12.32 (s, 1 H). LRMS + H+: 509.3.
본원에 망라되는 화합물은 AML3에서 세포 증식 저해 능력에 대해 추가로 검사하였으며, 높은 효능 (IC50 = <500 nM) 내지 낮은 (IC50 = 2000-5000 nM) 효능을 나타낸다. 이에, 괄호 안에 전술한 바와 같이 AML3 세포에서 활성 수준을 가진 하기 화합물들 역시 망라한다 (A: IC50 = <500 nM; B: IC50 = 500-1000 nM; C: IC50 = 1000-2000 nM; D: IC50 = 2000-5000 nM):
표 3
암성 AML3 세포의 세포 증식에 대한 검사 화합물의 항신생물 효과
Figure pct00046
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Figure pct00047
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Figure pct00166
;
Figure pct00167
; 또는
Figure pct00168
.
일 구현예에서, 본원에 기술된 피리미도[4,5-B]인돌 유도체는 암 치료할 수 있게 한다. 본 발명은 유사한 작용 기전 (예, K27 돌연변이, EZH2 또는 PRC2 돌연변이)을 기반으로 하는 임의의 다른 암을 포함한다.
UM171은 본원에 기술된 CRL3 복합체를 활성화함으로써 RCOR1/LSD1 및 HDAC2 복합체에 대한 스캐폴딩 단백질로서 통상 작용하는 RCOR1을 분해하며, 이는 UM171의 존재 하에 자체 해리된다. 따라서, UM171은 HDAC 및 LSD1의 저해하는 항암제로서 분자 글루 분해제와 비슷하게 작용한다.
KBTB4 복합체가 UM171 처리시 CoREST를 분해하도록 표적화하는 것으로 입증되어 있다. UM171 분자는 어댑터/수용체 KBTBD4와 CoREST 간의 상호작용을 강화함으로써, CoREST를 프로테아좀 분해로 명확한 표적화를 유발한다.
생물학적 실시예 I
전장 게놈 CRISPR / Cas9 스크린 및 방법
RefSeq 유전자 19,084종, 추정의 ORF 3,872종 및 대체 스플라이싱되는 이소형 20,852종을 표적화하는 sgRNA 278,754개로 이루어진 연장된 넉아웃 (EKO) 풀링 렌티바이러스 라이브러리를, Bertomeu et al. (2018, Mol Cell Biol, 38(1): e00302-1)에 의해 기존에 언급된 바와 같이, 독시사이클린-유도성 Cas9를 발현하도록 조작된 OCI-AML5 및 OCI-AML1-세포주 클론에 도입하였다. EKO 라이브러리 (sgRNA 당 세포 최소 500종 보유)를 2 ㎍/mL 독시사이클린이 첨가된 10% FBS DMEM에서 7일간 배양하여 넉아웃을 도입하였다. 7일에, 세포 140,000,000개를 1,200 rpm에서 5분간 스핀 다운한 다음 1X PBS로 헹구고, 펠릿화하여 냉동하였다. 라이브러리를 250nM 및 800nM UM171 또는 DMSO 단독 (평균적으로 250 세포/sgRNA)이 첨가한 상태에서 독시사이클린 무첨가 하에 8일 또는 14일 이상 증폭시켰다. 세포 농도를 2일마다 평가하였다. 모든 샘플들에서 QIAamp DNA blood maxi 키트 (Qiagen)로 게놈 DNA를 추출하였다. sgRNA 서열을 회수하고, Bertomeu et al. (2018, Mol Cell Biol, 38(1): e00302-1)에 의해 기존에 기술된 바와 같이 Illumina HiSeq 2000 장치 (IRIC)에서 수행되는 PCR 및 NGS에 의해 Illumina 어댑터를 피팅하였다. MAGeCK-VISPR (Li et al., 2015, Genome Biol, 16: 281)을 이용해 합성 구제/양성 선별 및 합성 치사성/음성 선별 베타 스코어를 구하였다.
마우스 항-인간 항체를 이용해, CD34 (APC 또는 BV421-BD Biosciences), CD45RA (PE-BD Biosciences), CD86 (PerCP-eFluor710- eBioscience), CD90 (PECY7- BioLegend), 및 CD201 (APC-BioLegend)을 검출하였다. Canto II 세포측정기 (BD Biosciences)에서 유세포 측정을 수행하고, FowJo 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR, USA)와 GraphPad Prism 소프트웨어로 데이터를 분석하였다. 죽은 세포는 7AAD 염색을 이용해 제외하였다.
세포내 염색을 위해, 세포를 포스페이트-완충화된 염수에서 헹구고, 펠릿화한 다음 트루 핵 고정 키트 (BioLegend, Cat # 424401)를 사용해 고정하였다. 그런 후, 세포를 마우스 단일클론 항-H3K27Ac (Cell Signaling Technology, Catalog #15562), 토끼 항-H3K4me2 (Abcam, Catalog #7766) 및 토끼 항-H3 (Cell Signaling Technology, #12167S)으로 염색한 다음 BD Biosciences Canto II 세포측정기에서 FACS 분석을 수행하였다.
캐나다 QC 몬트리올의 샤를-레모인 병원에서 윤리학적으로 승인한 프로토콜에 따라 동의한 산모들에서 제대혈 유닛을 수집하였다. 인간 CD34+ 제대혈 (CB) 세포를 EasySep™ 양성 선별 키트 (StemCell Technologies Cat # 18056)를 사용해 단리하였다. 추가적인 단계에서 BD Aria II sorter를 이용해 더 원시 표현형에 대한 분류를 수행하였다.
인간 CD34+ 세포를, 인간 100　ng/ml 줄기 세포 인자 (SCF, R&D Systems), 100　ng/ml FMS-유사 트리신 키나제 3 리간드 (FLT3, R&D Systems), 50　ng/ml 트롬보포이에틴 (TPO, R&D Systems) 및 10 ㎍/ml 저-밀도 지단백질 (StemCell Technologies)이 첨가된 StemSpan SFEM (StemCell Technologies)으로 구성된 HSC 증폭 배지에서 배양하였다.
모든 동물 실험은 몬트리올 대학의 동물 관리 위원회로부터 승인받은 프로토콜에 따라 수행하였다. 신선한 CD34+ CB 세포 또는 자손을 꼬리 정맥 주사를 통해 치사 미만으로 방사선 조사된 (250 cGy, 이식하기 전 <24시간) 8-10주령 암컷 NSG (NOD-Scid IL2Rnull, Jackson Laboratory) 마우스에 이식하였다. 동물을 26주에 희생시켰을 때, 대퇴 흡인에 의해 또는 대퇴골 2개, 경골과 고관절의 수세를 통해 인간 세포 NSG-BM 세포를 수집하였다.
HDAC 저해제 (파노비노스타트 (Adooq Bioscience, #A10518), 발프로익산 (Sigma, #P4543), M344 (Sigma, #M5820), LMK235 (Sigma, #SML1053)를 CD34+ 제대혈 세포에 각각 5,1000, 500 및 500 nM로 사용하였다. LSD1 저해제 (트라닐시프로민 (tranylcypromine, TCP))는 5 및 20 μM로 사용하였다. iBET (Selleckchem, #S7189)는 50 및 100 nM로 CD34+ 제대혈 세포에 사용하였다. NEDD8 E1 활성화 효소 (NAE) 저해제 MLN4924 (Adooq Bioscience, #A11260-5)는 100 nM로 사용하였다. 프로테아좀 저해제 MG132 (Adooq Bioscience, #A11043)는 10 μM로 사용하였다.
Fellmann et al. (2013, Cell Rep, 5: 1704-1713)에 기술된 바와 같이, 적절한 shRNA 서열을 miR-E 서열 및 GFP를 포함하는 MNDU 벡터에 클로닝하여, shRNA (KBTBD4, CUL3, NUDCD3, CAND1, RCOR1, LSD1)를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 대조군 벡터는 레닐라 루시퍼라제를 표적화하는 shRNA (shLuc)를 함유하였다.
적절한 서열 (KBTBD4: GGCTAGCATGGAATCACCAG; 서열번호 1; NUDCD3: GGAGCGCTCCATGGCCACCG; 서열번호 2)을 pLKO5.sg.EFS.tRFP647 렌티바이러스 벡터에 클로닝하여, sgRNA (KBTBD4, NUDCD3)를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 대조군 벡터는 AAVS1 유전자좌를 표적화하는 sgRNA (sgAAVS1)를 함유하였다.
KBTBD4 cDNA (Dharmacon, # MHS6278-202829492)를 MNDU-eGFP 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하였다. BTB 도메인과 처음 3개의 kelch 도메인을 각각 제거하여, BTB 및 Kelch 돌연변이를 구축하였다.
렌티바이러스를 HEK-293 세포에서 생산하고, 일차 CD34+ 세포 또는 AML 세포주에 렌티바이러스를 10 ng/mL 폴리브렌이 첨가된 배지에서 24시간 동안 감염시켰다. GFP 양성 세포의 %로 결정되는 감염 효율을 BD FACSCantoII 유세포 측정기를 이용해 모니터링하였다. 필요에 따라, 감염된 세포를 BD Aria II cell sorter를 사용해 분류하고, 넉다운 효율을 표준 방법을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다.
전체 단백질 추출을 세포용해 완충제 (25 mM tris pH7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 프로테아제 저해제)에서 수행하였다. 염색질-결합 (CB) 및 세포질/핵질 (CN) 분획화를 Mladenov and colleagues (2007, J Cell Physiol, 211: 468-476)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 세포질 분획화를 세포용해 완충제 (10 mM pipes pH6.8, 0.3 M 슈크로스, 0.1 M NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 0.015% 디기토닌 및 프로테아제 저해제) 중에서 수행하였다.
항-인간 항체를 이용해, KBTBD4 (Novus Biologicals, # NBP1-88587), NUDCD3 (Novus Biologicals, #NBP1-82940), CUL3 (Novus Biologicals, #NB100-58788), RCOR1 (Novus Biologicals, #NB600-240), LSD1 (Cell Signaling Technology, #2139S), HDAC2 (Bethyl Laboratories, #A300-705A), H3K27Ac (Cell Signaling Technology, #8173S), CUL1 (Santa Cruz Biotechnology, #sc-17775), NCL (Cell Signaling Technology, #14574S), TUBA (Cell Signaling Technology, #2144) 및 H3 (Millipore, #06-755)를 검출하였다.
BioID 풀다운 실험을 이전에 언급된 바와 같이 수행하였다 (Comartin et al., 2013, Curr Biol, 23: 1360-1366). 간략하게는, 전장 인간 KBTBD4 코딩 서열을 PCR에 의해 증폭하여, pcDNA-FRT/TO-FLAGBirA 발현 벡터에 클로닝하였다. FLAGBirA 또는 FLAGBirA*-KBTBD4를 안정적으로 발현하는 293T 세포를 조작하여, 1 ㎍/ml 테트라사이클린 (Sigma), 50 μM 바이오틴 (BioShop, Burlington, ON, Canada) 및 10 μM MG132가 첨가된 완전 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수집하여 세포용해 완충제에서 세포용해하였다. 단백질 추출물을 스트렙타비딘-세파로스 비드와 함께 인큐베이션하였다.
트라이브리드 융합 질량 분광기 (Thermo Fisher Scientific)와 연결된 Proxeon nanoflow HPLC 시스템을 이용한 LC-MS/MS에 의해 펩타이드를 분석하였다. 각 샘플을 수동으로 패킹한 역상 분석 컬럼 (18 cm 길이, 150mmi.d.) (Jupiter C18,3mm, 300 A °, Phenomenex)에 로딩하여 분리하였다. 106분간 5-30% ACN 수용액 (0.2% FA)의 선형적인 구배로 유속 0.6 mL/min으로 LC 분리를 수행하였다. MS 스펙트럼을 해상도 60,000으로 획득하였다. 고 에너지 해리 (HCD)를 이용한 가장 강한 이온에 대한 데이터 종속 스캔에 "TopSpeed" (5초 윈도우 이내에 시퀀싱 이벤트의 최대값) 방법을 이용하였다. MS 및 MS/MS 스캔에서 AGC 표적 값은 각각 5e5 (최대 충전 시간 200 ms) 및 5e4 (최대 충전 시간 200 ms)이었다. 전구체 단리 윈도우는 m/z 1.6으로 설정하였으며, HCD 표준화된 충돌 에너지는 25이다. 동적 배제 윈도우는 30 s로 설정하였다. MS 데이터는 MaxQuant software version 1.3.0.3으로 분석하였으며, H.Sapiens uniprot 데이터베이스의 SwissProt 서브세트에서 검색하였다.
OCI-AML5 세포 5 x 105주를 6-72시간 동안 UM171 (250 nM)에 노출 또는 비-노출한 다음 TRIzol 시약 (Thermo Fisher Scientific cat # 15596026) 중에 -80℃에서 보존하였다. TruSeq 프로토콜 (Illumina)에 따라 cDNA 라이브러리를 구축하였으며, Illumina HiSeq 2000 장치로 서열분석을 수행하였다.
유전자 발현 통계를 칼리스토/슬러스 분석 파이프라인 및 GRCh38 version 84 주석을 이용해 입수하였다. TPM 값을 R에 대입하였으며, 차별적인 발현을 윌콕손 순위 합 통계를 이용해 검정하였다. 차별적으로 발현된 유전자를 유의성을 토대로 선별하였다 (p ≤0.01, 만-휘트니 검정).
생물학적 실시예 II
경구 및/또는 정맥내 투여된 화합물의 생체이용성을 확인하는 PK 분석
PK 분석을 마우스 (n=3)에서 수행하였다. 화합물을 1 mg/kg (화합물, 도 16: 5% 덱스트로스 및 UM681, 도 17A: 25 mM 구연산:5% 덱스트로스 (1:3))으로 정맥내 투여하고, 투여 후 5분, 15분 및 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간 경과시 혈장 샘플을 수집하였다. 다음과 같은 약동학 파라미터를 계산하였다. 도 16에서 화합물의 반감기 (T1/ 2)는 1.7시간이었으며, 분포 체적 (Vss)은 13.9 L/kg으로 결정되었으며, 소거 (CL)는 141.6 mL/min/kg이었다. UM681의 경우, T1/2는 1.9시간이고, Vss는 14.3 L/kg으로 결정되었으며, CL은 109 mL/min/kg이었다.
화합물을 20 mg/kg으로 경구 투여하고, 투여 후 15분 및 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간 경과시 혈장 샘플을 수집하였다. 다음과 같은 약동학 파라미터를 계산하였다. UM729의 최고 농도 (Cmax)는 0.2 μM이고, 최대 시간 (tmax)은 0.8시간으로 결정되었으며, 곡선 하 면적 (AUC)은 1.2 μM*h, 생체이용성 % (%F)은 19%이었다 (도 17B 참조). UM681의 경우, Cmax는 또한 0.2 μM이고, tmax는 4시간으로 결정되었으며, AUC는 2.45 μM*h, 생체이용성 % (%F)는 31% (남성) 및 39% (여성)이었다.
본 발명의 개시내용은 이에 대한 구체적인 구현예를 들어 기술되었지만, 추가적으로 수정할 수 있으며, 당해 기술 분야에서 공지된 또는 통례적인 실무에서 이루어질 수 있는 바와 같이, 전술한 기본적인 특성에 적용될 수 있는 바와 같이, 첨부된 청구항의 범위에 따른 바와 같이, 본 개시내용으로부터 유래한 내용을 비롯하여, 임의의 변형, 사용 또는 적응을 망라하는 것으로 의도되는 것으로 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Universite de Montreal Guy Sauvageau Jalila Chagraoui Simon Fortier Simon Girard Anne Marinier <120> MODULATORS OF CULLIN 3 ADAPTOR KBTBD4 AS ANTI-CANCER COMPOUNDS <130> 56066102-13PCT <140> US 62/949678 <141> 2019-12-18 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KBTBD4 sequence <400> 1 ggctagcatg gaatcaccag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUDCD3 sequence <400> 2 ggagcgctcc atggccaccg 20

Claims (18)

  1. 식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 프로드럭 하나 이상을, 선택적으로 하나 이상의 세포 증폭 인자 (cell expanding factor)와 함께, 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암 치료 방법:
    Figure pct00169

    상기 식에서,
    각각의 Y는 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
    m은 0-3의 정수 (또는 Y가 치환기 Z를 포함하는 고리에서 CH일 경우에는 0-4의 정수)이고;
    Z는 각각 독립적으로
    -CN
    -C(O)OR1,
    -C(O)N(R1)R3,
    -C(O)R1, 또는
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된 -헤테로아릴,
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된 -아릴로부터 선택되되,
    여기서, (R1)과 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
    W는
    -CN,
    -N(R1)R3,
    -C(O)OR1,
    -C(O)N(R1)R3,
    -NR1C(O)R1,
    -NR1C(O)OR1,
    -OC(O)N(R1)R3,
    -OC(O)R1,
    -C(O)R1,
    -NR1C(O)N(R1)R3,
    -NR1S(O)2R1,
    RA 또는 R1 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된 -벤질,
    -X-L-(X-L)n - N(R1)R3,
    L 및 헤테로아릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로아릴,
    L 및 헤테로사이클릴기 중 하나 또는 둘다에 부착된 RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n - 헤테로사이클릴,
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -X-L-(X-L)n- 아릴,
    -X-L-(X-L)n-NR1RA,
    -(N(R1)-L)n - N+R1R3R5 R6- 또는
    -할로겐이되,
    여기서, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고,
    여기서, R1 및 R3가 질소 원자에 부착된 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하되, 선택적으로 고리는 하나 이상의 RA 또는 R4로 치환되고;
    각각의 X는 독립적으로 CH2, O, S 및 NR1으로부터 선택되고;
    각각의 L은 독립적으로
    -C1-6 알킬렌,
    -C2-6 알케닐렌,
    -C2-6 알키닐렌,
    N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7 사이클로알킬렌, 또는
    N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C3-7 사이클로알케닐렌이되,
    여기서, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌 및 사이클로알케닐렌 기들은 각각 독립적으로 1 또는 2개의 R4 또는 RA 치환기로 선택적으로 치환되고;
    R1은 각각 독립적으로
    -H,
    -C1-6 알킬,
    -C2-6 알케닐,
    -C2-6 알키닐,
    -C3-7 사이클로알킬,
    -C3-7 사이클로알케닐,
    -C1-5 과불화 알킬,
    -헤테로사이클릴,
    -아릴,
    -헤테로아릴, 또는
    -벤질이되,
    여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
    R2는
    -H,
    RA 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -C1-6 알킬,
    -C(O)R4,
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴,
    RA 또는 R4 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴,
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴, 또는
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -N(R1)아릴이고;
    R3는 각각 독립적으로
    -H,
    -C1-6 알킬,
    -C2-6 알케닐,
    -C2-6 알키닐,
    -C3-7 사이클로알킬,
    -C3-7 사이클로알케닐,
    -C1-5 과불화 알킬,
    -헤테로사이클릴,
    -아릴,
    -헤테로아릴,
    -벤질, 또는
    메틸 2-벤질-9H-피리도[2',3':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-7-카르복실레이트-4-일이되,
    여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
    R4는 각각 독립적으로
    -H,
    -C1-6 알킬,
    -C1-6 할로알킬,
    -C2-6 알케닐,
    -C2-6 알키닐,
    -C3-7 사이클로알킬,
    -C3-7 사이클로알케닐,
    -C1-5 과불화 알킬,
    -헤테로사이클릴,
    -아릴,
    -헤테로아릴, 또는
    -벤질이되,
    여기서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 과불화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 RA 또는 Rd 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되고;
    R5는 각각 독립적으로
    -C1-6 알킬,
    N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알케닐,
    N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한, -C1-6 알킬렌-C2-6 알키닐,
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-아릴,
    RA 또는 R4 치환기 1개 이상을 선택적으로 함유한, -L-헤테로아릴,
    -C1-6 알킬렌-C(O)O-,
    -C1-6 알킬렌-C(O)OR1,
    -C1-6 알킬렌-CN,
    R1과 R3가 선택적으로 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하는, -C1-6 알킬렌-C(O)NR1R3, 또는
    -C1-6 알킬렌-OH이고;
    R6는
    -할로겐
    -OC(O)CF3 또는
    -OC(O)R1이고;
    RA는 각각 독립적으로
    -할로겐,
    -CF3,
    -OR1,
    -L-OR1,
    -OCF3,
    -SR1,
    -CN,
    -NO2,
    -NR1R3,
    -L-NR1R1,
    -C(O)OR1,
    -S(O)2R4
    -C(O)N(R1)R3,
    -NR1C(O)R1,
    -NR1C(O)OR1,
    -OC(O)N(R1)R3,
    -OC(O)R1,
    -C(O)R4,
    -NHC(O)N(R1)R3,
    -NR1C(O)N(R1)R3,
    -N3, 또는
    -(CH2CH2O)2-CH2CH2OH이되,
    여기서, R1과 R3는 선택적으로 질소 원자와 함께 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 다른 이종원자를 선택적으로 함유한 3-7원성 고리를 형성하고;
    Rd는 각각 독립적으로
    -H,
    -C1-6 알킬,
    -C2-6 알케닐,
    -C2-6 알키닐,
    -C3-7 사이클로알킬,
    -C3-7 사이클로알케닐,
    -C1-5 과불화 알킬,
    -벤질, 또는
    -헤테로사이클릴이고;
    RB는
    -H, 또는
    -C1-6 알킬임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이
    Figure pct00170
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이
    Figure pct00171
    의 하이드로브로마이드 염인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이
    Figure pct00172
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이 표 3과 같이 본원에 정의된 바와 같이 정의되거나 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가 인간 또는 동물인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 동물이 마우스인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 경구, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여용으로 제형화되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 LSD1, RCOR1, HDAC2 및 CoREST 중 하나 이상을 분해하는, 방법.
  10. 암 치료를 위한 식 I의 화합물, 또는 이의 염 또는 프로드럭:
    Figure pct00173

    상기 식에서, W, Y, Z, R2, RB 및 m은 제1항에서 정의되는 바와 같이 정의됨.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이 UM171
    Figure pct00174
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 화합물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이
    Figure pct00175
    의 하이드로브로마이드 염인, 화합물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이
    Figure pct00176
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 화합물.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 식 I의 화합물이 표 3과 같이 정의되거나 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 화합물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 경구, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여용으로 제형화되는, 화합물.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 LSD1, RCOR1, HDAC2 및 CoREST 중 하나 이상을 분해하는, 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 K27 돌연변이, EZH2 돌연변이 또는 PRC2 돌연변이에 기반한 암인, 방법 또는 화합물.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 증식 중인 세포를 함유한 배지에 투입하는 것을 포함하며,
    상기 화합물이 암성 세포의 증식에 대해 항신생물성인,
    생체외에서 암성 세포의 증식을 저해하는 방법.
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