KR20220007041A - Btn2에 대한 특이성을 갖는 항체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 BTN2A에 대한 특이성을 갖는 항체 및 이의 용도, 특히 암 치료에 관한 것이다.
Description
본 발명은 BTN2A1에 결합하고, 대식세포 집단을 항-종양 M1 대식세포로 이동시키며 NK 세포뿐만 아니라 암세포에 대해 세포독성을 직접적으로 활성화시키는 항-BTN2A1 활성화 항체에 관한 것이다. 대안으로 또는 조합하여, 상기 항체는 Vγ9/Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있다. 그러한 항체들은 특히 암의 치료에 특히 유용하다.
대식세포는 고전적으로 활성화된 M1에서 다른 M2 유형까지 다양한 표현형을 나타낸다. M1 대식세포는 이동 후 단핵세포로부터 빠르게 분화하며, LPS(지질다당류)와 같은 박테리아 유래 산물, 그리고 IFNγ와 같은 감염과 관련된 신호에 의해 활성화된다. 그들은 높은 식세포 및 살균 잠재력을 갖는 고염증성이다. 그들은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12와 같은 중요한 전염증성 사이토카인뿐만 아니라 활성산소종을 분비한다. 대조적으로, M2 대식세포는 육아조직(granulation tissue) 형성이 일어날 때 치유 과정의 후반부에 존재한다; 그들은 염증 반응을 길항하여 치유의 시작을 허용한다. 이 항염증 세포는 섬유아세포를 모집하고 활성화하여 내피 전구 세포를 모집하고 주요 항염증성 사이토카인 IL-4, IL-10 및 IL-13의 분비를 통해 발생하는 과정인 새로운 혈관을 형성할 수 있는 혈관신생촉진 인자(pro-angiogenic factor)를 방출하는 근섬유아세포로 분화하며, 또한 ROS, 산화질소(NO) 및 TNFα의 생산 감소와 관련이 있다.
종양 미세환경(TME)은 특히 암 치료에서 회복되는 종양의 경우에 대식세포를 M2 유사 표현형으로 강하게 분극화시킨다. 이 분극화는 고도로 혈관신생을 촉진할 뿐만 아니라 면역억제 작용을 한다. 따라서 대부분의 고형암에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 침윤 증가는 오랫동안 환자의 나쁜 예후와 관련이 있어 암의 잠재적 진단 및 예후 바이오마커로서의 가치를 강조한다.
따라서, M2 대식세포의 리프로그래밍 및 선택적 살해는 유망한 치료 전략으로 제안되었다(Zhu Y et al. Cancer Res 2014).
또한, 자연 살해(NK) 세포는 선천적 면역 세포로서 암 면역 감시에서 중추적인 기능을 한다. NK 세포는 다양한 비정상 세포나 스트레스를 받은 세포를 사전 감작없이 제거할 수 있으며, 심지어 줄기유사세포나 암줄기세포를 우선적으로 죽일 수도 있다. 표적 세포와 면역 시냅스를 형성하면 NK 세포는 세포 용해를 유도하는 기능을 하는 퍼포린 및 그랜자임을 포함하는 미리 형성된 세포용해 과립을 방출한다.
이 가정에 기초하여 여러 연구에서 다양한 종양, 특히 혈액암에 대한 NK 세포의 입양 전달을 성공적으로 활용하였다. 그러나 암은 다양한 전술을 사용하여 항종양 면역을 지연, 변경 또는 중지하여 종양 성장을 제어하지 못하게 한다. NK 세포의 항종양 반응 역시 많은 한계에 직면해 있다. 특히, 종양 미세환경(TME)은 NK 세포 및 특히 입양 전달된 NK 세포의 효과에 대한 주요 장벽으로 남아 있다. 예를 들어, 수지상 세포(DC), 억제성 또는 관용성 대식세포 및 조절 T(Treg) 세포와 같은 종양 침윤성 면역 세포와 세포외 기질에 내장된 암 관련 섬유아세포는 면역억제성 사이토카인의 분비를 통해 또는 수용체 발현을 방해함으로써 NK 세포 활성화에 간섭할 수 있다. 예를 들어, TME에서 TGF-β(특히 M2 분극화된 대식세포에 의해 분비됨)는 NK 세포의 수와 항전이 기능을 제한하는 NK 세포의 주요 억제 사이토카인으로 인식된다.
따라서 i) 종양 환경의 면역억제 효과를 억제하고 ii) NK 세포 활성화 및 매개된 세포독성을 직접적으로 유발함으로써 항종양 활성을 자극할 수 있는 도구를 갖는 것이 치료적 관점에서 매우 가치가 있을 것이다.
부티로필린은 부티로필린(BTN), BTN-유사(BTNL) 및 SKINT(selection and upkeep intraepithelial T cell) 단백질을 포함하는 막횡단 단백질의 패밀리를 구성한다(Arnett and Viney, Nat Rev Immunol 2014). 그들의 세포외 모이어티에는 B7 보조자극 분자의 상응하는 도메인과 상동성을 나타내는 IgV-유사 및 IgC-유사 도메인이 포함되며(Arnett and Viney, 2014), 따라서 부티로필린은 확장된 B7 또는 Ig 슈퍼패밀리의 구성원으로 간주된다.
부티로필린(BTN) 유전자 패밀리는 인간에서 13개의 유전자로 구성되며 8개의 별개 그룹을 형성한다(Abeler-Dorner et al. Trends Immunol 2012; Afrache et al. Immunogenetics 2012). 7개의 인간 BTN 유전자는 6번 염색체의 MHC 클래스 I 영역에 모여있으며 계통발생학적으로 연관된 그룹을 형성하는 3개의 서브패밀리(BTN1, BTN2 및 BTN3)로 나뉜다. BTN1 서브패밀리는 단지 프로토타입의 단일 카피 BTN1A1 유전자를 포함하는 반면, BTN2 및 BTN3 서브패밀리는 각각 3개의 유전자 BTN2A1, BTN2A2 및 BTN2A3(이는 유사유전자임), BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3을 포함한다. 고혈압, 만성 신부전, 봉입체 근염, 1형 및 2형 당뇨병 또는 HCV 감염을 비롯한 다양한 질환과 관련된 BTN 유전자 패밀리 구성원에 대해 여러 유전자 다형성이 설명되었다(Chen et al. Int J Clin Exp Pathol, 2015, Horibe et al. Am J Hypertens, 2011 및 2014, Milman et al. Clin Respir, 2011, Murakata et al. Biomed Rep, 2014, Oguri et al. J Med Genet, 2013, Pacheco et al. Orphanet J Ra , 2016). 단일 뉴클레오티드 변이체는 BTNL2, BTN2A1, BTN3A2 및 BTN3A3 뿐만 아니라 BTNL3 및 BTNL8과 관련된 유해한 카피 수 변이에 대해 설명되었다(Aigner et al. BMC Genet, 2013).
확인된 최초의 부티로필린인 BTN1A1은 유지방 소구체의 형성, 분비 및 안정화에 필요하다(Ogg et al. Proc Natl Acad Sci, 2004). 그런 다음, B7 유전자와 MHC 클래스 I 및 II 유전자는 공통 조상 유전자를 가질 수 있고 T 세포 활성화와 같은 유사한 기능에 관여하는 단백질을 암호화할 수 있다고 제안되었다(Rhodes et al. Genomics , 2001; Harly C et al. Blood 2012). BTN2A1 및 BTN2A2 단백질 이소폼은 BTN3A1 및 BTN3A3과 유사하지만 BTN3A2가 아닌 IgV 및 IgC 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 특징적인 세포내 B30.2 도메인을 보여준다. 마우스에서 BTN2A2는 단일 카피 유전자이며 인간 BTN2A2 유전자의 오르토로그이다. 재조합 인간 BTN2A1-Fc 단백질은 BTN2A1의 특정 글리코폼이 수지상 세포(DC)에서 발견되는 렉틴 분자인 DC-SIGN에 결합한다는 것을 밝혀냈다. DC-SIGN에 대한 BTN2A1의 결합은 종양 세포에 의해 발현될 때 단백질의 고-만노스 글리코실화에 의존적이다(Malcherek et al. J Immunol, 2007).
이후 부티로필린이 면역계에서 다양한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있다. Genotype-Tissue Expression Project(The GTEx Consortium, 2013)의 53개 인간 조직 샘플의 RNA-seq는 정상 조직에서 어디에서나 볼 수 있는 BTN2A1 전사체 발현을 보여준다. Gene Expression Profiling Interactive Analysis(Tang, Z. et al. Nucleic Acids Res, 2017)를 사용하여 GTEx의 RNA-Seq 데이터와 The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터베이스의 데이터를 비교하면 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁경부 선암종, 폐소세포 암종, 난소 암종, 췌장암 및 자궁내막 암종을 포함한 여러 암에서 BTN2A1 전사체 발현의 조절이 나타난다.
BTN2A의 두 이소폼을 모두 인식하는 항체는 이전에 보고되었지만(WO2019057933), 상기 항체는 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 IFN-γ 및/또는 TNF-α의 생성을 억제하며, 및/또는 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 억제하고, 및/또는 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식을 억제한다.
Vγ9/Vδ2 T 세포는 면역 방어의 중요한 효과기이다. 그들은 병원체에 감염되거나 비정상적인 세포를 직접적으로 용해한다. 또한 수지상 세포(DC) 성숙과 이소타입 스위칭 및 면역글로불린 생산을 유도하여 면역 반응을 조절한다. 면역계의 이 중요한 세포 플랫폼은 표면 수용체, 케모카인 및 사이토카인에 의해 엄격하게 조절된다. Vγ9/Vδ2 T 세포는 인산작용제(PAg)라고 하는 비펩타이드성 인산화된 이소프레노이드 경로 대사산물에 의해 활성화된다.
BTN2A1을 표적으로 하는 항체의 개발 및 활성화 면역 세포, 특히 대식세포, NK 및/또는 γδT 세포, 특히 Vγ9/Vδ2 T 세포와 같은 하나 이상의 면역 세포 구획은 암 요법 및 감염성 질환의 치료와 특히 연관될 수 있다.
본 개시내용은 다음의 특성 중 적어도 하나를 나타내는 BTN2A에 결합하는(특히 BTN2A1 이소폼-예를 들어, 인간 BTN2A1 폴리펩타이드에 결합) 최초 항체를 제공한다:
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. NK 세포 활성화를 직접적으로 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다.
특히, 본 개시내용의 항체는 특성 i) 및 ii) 중 적어도 하나를 나타내고, 특성 iii) 및 iv) 중 적어도 하나를 나타내고, 보다 구체적으로 본 개시내용의 항체는 특성 i) 내지 iv)를 나타낸다.
따라서, 본 개시내용에 따른 이러한 항체는
- 대식세포 표현형과 기능을 전염증성 M1 대식세포 쪽으로 이동시켜 항종양 미세환경을 선호하여 전염증성 사이토카인의 분비를 유도하고, 및/또는
- NK 세포 활성화를 직접적으로 유발하여 세포용해 활성을 더욱 강화한다.
따라서, 본 개시내용에 따른 이러한 항체는 암 요법을 위한 다양한 전략에서 사용될 수 있는 강력한 도구를 나타낸다.
특정 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 BTN2A에 대한 결합에 대해 다음 중 어느 하나와 경쟁한다:
- (i) SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (ii) SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 레퍼런스 쥐(murine) 항체 mAb 101G5, 또는
- (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 레퍼런스 쥐 항체 mAb 107G3.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항 BTN2A 항체는 다음에 위치하는 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다:
- SEQ ID NO: 17의 위치 65, 68, 69, 72, 78, 84, 85, 95, 97, 100에서, 또는
- SEQ ID NO: 17의 위치 212, 213, 218, 220, 224, 229에서.
특정 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 다음을 포함한다:
- SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
- SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 SEQ ID NO: 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
특정 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 다음을 포함한다:
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
- SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 20 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 다음의 특성 중 적어도 하나를 추가로 나타낸다:
- Vγ9Vδ2 T 세포에서 세포용해 분자의 분비를 활성화하고,
- Vγ9Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하며, 및/또는
- Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 활성화한다.
가장 특히, 이러한 구체예에 따른 항-BTN2A 항체는 일반적으로 (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 레퍼런스 쥐 항체 mAb 107G3과 BTN2A에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다. .
보다 구체적으로, 이러한 항-BTN2A 항체는
- SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 BTN2A1에 대한 특이성을 갖는다.
특정 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 인간, 키메라 또는 인간화 항체이다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같은 항-BTN2A 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
본 개시내용은 또한 특히 상기 기재된 바와 같은 항-BTN2A 항체 중 어느 하나의 제조에 사용하기 위한, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 특히 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 요법(therapy)에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 항-BTN2A에 관한 것이다.
전형적으로, 본 개시내용에 따른 암은 혈액암, 및 편평 세포 암종 및 자궁경부 선암종과 같은 자궁경부 암종, 난소 암종, 편평 세포 암종 및 흑색종을 포함한 피부암, 폐소세포 암종을 포함한 폐암, 전립선암, 대장암, 췌장암 및 자궁내막 암종, 및 보다 구체적으로 편평 세포 암종 및 자궁내막 선암종, 편평 세포 암종, 난소 암종, 폐소세포 암종, 전립선암, 대장암, 췌장암 및 자궁내막 암종을 포함하는 고형암을 포함한다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같은 항-BTN2A 항체 및 적어도 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용은 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 항-BTN2A를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법을 추가로 제공한다.
도 1. 항-BTN2A1 107G3 mAb의 식별. A. mAb 시퀀싱에 대한 마우스 면역화로부터 항-BTN2A1 mAb의 스크리닝 캐스케이드. B. 막대 차트는 1차 히트 선택 동안 Luminex에서 측정된 친화도(KD) 범위당 클론 수를 보여준다. C. 누적 막대 차트는 1차(1차 라운드) 및 2차(2차 라운드) 히트 스크리닝 동안 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 IFN-γ 생산을 조절하는 능력에 따라 중성(회색), 길항제(흰색) 또는 작용제(검정색)로 분류된 클론의 수를 보여준다.
도 2. 항-BTN2A1 107G3 mAb는 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 향상시킨다. Vγ9/Vδ2 T 세포는 3명의 건강한 공여자의 PBMC에서 확장되었고(재료 및 방법 참조) 항-CD107a/b 항체 및 Golgi stop의 존재에서, 표시된 항체의 유무에 따라 표적 세포와 함께 1:1의 효과기:표적(E:T) 비율을 사용하여 37℃에서 공배양되었다. 4시간 후, 세포를 수집, 고정하고 유세포 분석에서 분석하였다. A에서는 항-BTN2A1 107G3 상등액 또는 대조군 하이브리도마 배양 배지의 유무에 따라 Daudi(Burkitt 림프종), Jurkat(급성 T 세포 백혈병), L-IPC(췌장 선암종) 및 MDA-MB-134(유방 암종)를 포함한 다양한 표적 세포주가 사용되었다. 막대 차트는 Vγ9/Vδ2 T 세포의 탈과립을 나타내는 CD107+ 세포의 백분율을 보여준다. B에서 Daudi 세포는 이소타입 대조군으로서 표시된 농도의 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb 또는 관련 없는 마우스 IgG1의 존재 하에서 표적 세포로 사용되었다. 그래프는 EC50 계산을 허용하는 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 3. 항-BTN2A1 107G3 mAb는 BTN2A1을 인식하지만 BTN3은 인식하지 못한다. HEK-293T BTN2 KO 세포에 BTN2A1-CFP 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 일시적으로 형질감염시켰다. A. 히스토그램은 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb(상단, 검정색 선), 항-BTN3 103.2 mAb(하단, 검정색 선), 또는 mIgG1 또는 IgG2a(점선) 대조군으로 염색된 표시된 세포 및 세포 형질감염체의 오버레이를 보여준다. 형질감염된 세포의 경우, CFP+ 세포에 대한 게이팅 후 염색을 보여준다. B. 그래프는 BTN2A1-CFP를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포에 대한 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb 결합에 대한 용량-반응 곡선을 보여준다. 모든 염색은 CFP+ 세포에 대한 게이팅 후 분석되었다.
도 4: NK 세포 및 단핵세포 BTN2A 발현 및 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb의 M2 대식세포 분극화에 대한 단핵세포에 대한 영향. (A) 유세포 분석에 의해 평가된 NK 세포 및 자극되지 않은 HD-PBMC 유래의 단핵세포에서의 BTN2A1 및 BTN2A2 발현(흰색) 대 대조군 이소타입(회색)에 대한 대표적인 히스토그램. (B) 대표적인 CD14/CD163 도트 플롯은 M-CSF의 존재 하에 유도된 시험관내 M1/M2 대식세포 또는 대식세포 101G5 및 107G3 mAb의 프로파일을 나타낸다. 분화 5일 후, CD14 및 CD163 도트 플롯이 유세포 분석에 의해 생성된다.
도 5: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 용량 의존적 방식으로 M2 대식세포 분극화를 억제한다. M1, M2, GM-CSF 및 IFNγ로 복귀된 M2, 및 상이한 농도의 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이의 이소타입 대조군)의 존재 하에서 M-CSF-유도된 대식세포는 5일 동안 분극화되었고, 추가 2일 동안 LPS의 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B), PDL1(C) 및 CD86(D)의 발현은 비자극 세포(A-C) 또는 LPS 자극 세포(D)에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(E) 및 TNFα(F)는 ELISA에 의해 LPS 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 6: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 단핵세포로부터의 "M2+IL-4"-유도된 분극화를 억제한다. M1, M2, "M2+IL4", GM-CSF 및 IFNγ로 복귀된 M2, 및 10㎍/mL의 M-CSF+IL-4 및 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이들의 이소타입 대조군)로 유도된 대식세포는 5일 동안 생성되었고, 추가 2일 동안 LPS의 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B), PDL1(C), DC-SIGN(D) 및 CD86(E)의 발현은 비자극 세포(AD) 또는 LPS 자극 세포(E)에 대한 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(F) 및 TNFα(G)는 ELISA에 의해 LPS로 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 7: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 암세포-유도된 M2 분극화를 억제한다. M1, M2, PANC-1 컨디션드 배지-유도된 M2, GM-CSF 및 IFNγ로 복귀된 M2, 및 PANC-1 컨디션드 배지 및 10 ㎍/mL의 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이들의 이소타입 대조군)로 유도된 대식세포는 5일 동안 생성되었고, 추가 2일 동안 LPS의 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B)의 발현은 자극되지 않은 세포에 대한 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(C) 및 TNFα(D)는 ELISA에 의해 LPS로 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 8: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 M2 대식세포를 전염증성 M1 대식세포로 복귀시킨다: 표현형 및 사이토카인 분비. M1, M2는 5일 동안 단핵세포로부터 생성되었다. 5일 후, 10 ㎍/mL의 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이소형 대조군) 또는 IFNγ를 M2 대식세포에 2일 동안 첨가하고, 추가 2일 동안 LPS 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B), PDL1(C) 및 CD86(D)의 발현은 비자극 세포(A-C) 또는 LPS 자극 세포(D)에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(E) 및 TNFα(F)는 ELISA에 의해 LPS로 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 9: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 T 세포 증식 및 IFNγ 분비의 M2-매개 억제를 나타낸다. 분화된 M1, M2 또는 101G5 및 107G3 mAb(또는 이들의 이소타입 대조군)의 존재 하에서 유도된 대식세포를 5일 동안 동종의 OKT3-활성화된 CTV-표지된 CD3+ T 세포와 공배양하였다. 공배양 후, 세포는 5시간 동안 PMA/이오노마이신 및 GolgiStop 단백질 억제제로 자극되고, CD3+ T 세포의 수(A 및 B), 세포내 IFNγ 생산(CF) 및 증식(CellTrace Violet, CTV dim)(G-J)은 유세포 분석에 의해 정량화되었다. 증식은 CTV 염료의 희석에 의해 정량화되었다(0일째의 CTV 신호를 기준선으로 함). 결과는 CountBright 절대 계수 비드(B, E, F, I 및 J)에서 보정된 CD3+ T 세포의 절대 수 또는 CD3+ T 세포의 백분율(C, D, G 및 H)로 표시된다.
도 10: 정제된 NK 세포의 활성화 및 세포독성에 대한 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb의 효과. (A-B) 정제된 NK 세포는 IL-2 또는 IL-2/IL-15 자극으로 5일 동안 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)와 함께 배양되었다. NK 세포 활성화는 표시된 mAb 또는 대조군 이소타입의 존재 하에서 비자극 및 IL-2/IL-15-자극된 NK 세포 내에서 CD69(A) 및 CD25(B) 발현(MFI)을 이용하여 평가되었다. (C-D) 정제된 NK 세포를 IL-2/IL-15 자극의 유무에 따라 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)와 함께 밤새 사전 인큐베이션한 다음, 4시간 동안 인간 종양세포주와 공배양되었다. NK 세포의 탈과립은 표시된 mAb 또는 대조군 이소타입의 존재 하에서 각 종양 세포주에 대한 비자극(C) 및 IL-2/IL-15-자극된 NK 세포(D) 내의 CD107αβ의 백분율로서 유세포 분석에 의해 평가되었다. (E) 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)가 4시간의 공배양 이전에 NK 세포 또는 표적 세포에서 사전 인큐베이션된 경우 A549 세포주에 대한 NK 세포의 탈과립은 사전-인큐베이션 없이 공배양에 첨가된 mAb와 비교되었다.
도 11: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 NK 세포의 탈과립 및 선암종 세포주에 대한 살해를 향상시킨다. (A) 정제된 NK 세포를 IL-2/IL-15 자극의 유무에 따라 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)와 함께 밤새 사전 인큐베이션한 다음 DU-145 세포주와 4시간 동안 공배양하였다. NK 세포의 탈과립은 CD107αβ+ 세포의 백분율로서 유세포 분석에 의해 평가되었다. NK 세포의 탈과립 향상의 EC50은 Prism 소프트웨어에서 4개 매개변수 용량-반응 곡선을 사용하여 표시된 mAb에 대해 계산되었다. (B) 정제된 NK 세포를 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입 또는 IL-2/IL-15 자극)와 함께 밤새 사전 인큐베이션한 다음 4시간 동안 HL-60 및 A549 세포주와 공배양하였다. NK 세포- 매개된 암 세포 죽음은 표시된 mAb 또는 대조군 이소타입의 존재 하에서 카스파제 3/7+ 세포의 백분율을 이용하여 평가되었다.
도 12: BTN2A1에 대한 레퍼런스 항-BTN2A1 101G5 및 107G3 mAb의 비닝(Binning) 실험. 비닝 실험은 BLI(Bio-layer interferometry) 기술 기반 시스템인 Octet Red96 플랫폼에서 수행되었다. 107G3 및 101G5는 rhBTN2A1-His 단백질에 대해 쌍의 조합 방식으로 검사되었다. A. 107G3은 포화 상태이고 101G5는 경쟁자이다. B: 101G5는 포화 상태이고 107G3은 경쟁자이다. C: mAb의 결합 및 자가-차단 쌍의 임의 단위에서 측정.
도 13: BTN2A1의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써모리신 펩타이드. 서열의 96.37%가 확인된 펩타이드를 포함한다.
도 14: 레퍼런스 mAb 107G3 및 101G5와 인간 BTN2A1 간의 상호작용. A. 107G3/BTN2A1. B. 101G5/BTN2A1.
도 15: BTN2A1/107G3의 상호작용. BTN2A1 PDB 구조 4F9P는 에피토프 부위에서 회색으로 채색되었다. 파란색으로 표시된 BTN2A1 아미노산은 제공된 BTN2A1 서열의 65-78(RWFRSQFSPAVFVY) 및 84-100(RTEEQMEEYRGRTTFVS)에 해당한다. A, B, C, D, E: 정면도의 리본/표면 묘사(A); 후면도(B), 측면도 1(C), 측면도 2(D) 및 평면도(E). F, G, H, I, J: 정면도의 리본 묘사(F); 후면도(G), 측면도 1(H), 측면도 2(I) 및 평면도(J).
도 16: BTN2A1/101G5의 상호작용. BTN2A1 PDB 구조 4F9P는 에피토프 부위에서 회색으로 채색되었다. 파란색으로 표시된 BTN2A1 아미노산은 제공된 BTN2A1 서열의 212-229(KSVRNMSCSINNTLLGQK)에 해당한다. A, B, C, D, E: 정면도의 리본/표면 묘사(A); 후면도(B), 측면도 1(C), 측면도 2(D) 및 평면도(E). F, G, H, I, J: 정면도의 리본 묘사(F); 후면도(G), 측면도 1(H), 측면도 2(I) 및 평면도(J).
도 17: 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그에 대한 레퍼런스 항-BTN2A1 101G5 및 107G3 mAb의 교차-반응성 평가. ELISA 플레이트에 코팅된 재조합 인간 BTN2A1-Fc 융합 단백질 또는 재조합 시노몰구스 BTN2A1-Fc 융합 단백질에 대한 107G3 및 101G5 결합의 ELISA 기반 측정. 그래프는 가변 기울기 모델을 사용하여 비선형 회귀에 의한 EC50 계산을 허용하는 용량-반응 곡선을 나타낸다.
도 2. 항-BTN2A1 107G3 mAb는 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 향상시킨다. Vγ9/Vδ2 T 세포는 3명의 건강한 공여자의 PBMC에서 확장되었고(재료 및 방법 참조) 항-CD107a/b 항체 및 Golgi stop의 존재에서, 표시된 항체의 유무에 따라 표적 세포와 함께 1:1의 효과기:표적(E:T) 비율을 사용하여 37℃에서 공배양되었다. 4시간 후, 세포를 수집, 고정하고 유세포 분석에서 분석하였다. A에서는 항-BTN2A1 107G3 상등액 또는 대조군 하이브리도마 배양 배지의 유무에 따라 Daudi(Burkitt 림프종), Jurkat(급성 T 세포 백혈병), L-IPC(췌장 선암종) 및 MDA-MB-134(유방 암종)를 포함한 다양한 표적 세포주가 사용되었다. 막대 차트는 Vγ9/Vδ2 T 세포의 탈과립을 나타내는 CD107+ 세포의 백분율을 보여준다. B에서 Daudi 세포는 이소타입 대조군으로서 표시된 농도의 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb 또는 관련 없는 마우스 IgG1의 존재 하에서 표적 세포로 사용되었다. 그래프는 EC50 계산을 허용하는 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 3. 항-BTN2A1 107G3 mAb는 BTN2A1을 인식하지만 BTN3은 인식하지 못한다. HEK-293T BTN2 KO 세포에 BTN2A1-CFP 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 일시적으로 형질감염시켰다. A. 히스토그램은 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb(상단, 검정색 선), 항-BTN3 103.2 mAb(하단, 검정색 선), 또는 mIgG1 또는 IgG2a(점선) 대조군으로 염색된 표시된 세포 및 세포 형질감염체의 오버레이를 보여준다. 형질감염된 세포의 경우, CFP+ 세포에 대한 게이팅 후 염색을 보여준다. B. 그래프는 BTN2A1-CFP를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포에 대한 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb 결합에 대한 용량-반응 곡선을 보여준다. 모든 염색은 CFP+ 세포에 대한 게이팅 후 분석되었다.
도 4: NK 세포 및 단핵세포 BTN2A 발현 및 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb의 M2 대식세포 분극화에 대한 단핵세포에 대한 영향. (A) 유세포 분석에 의해 평가된 NK 세포 및 자극되지 않은 HD-PBMC 유래의 단핵세포에서의 BTN2A1 및 BTN2A2 발현(흰색) 대 대조군 이소타입(회색)에 대한 대표적인 히스토그램. (B) 대표적인 CD14/CD163 도트 플롯은 M-CSF의 존재 하에 유도된 시험관내 M1/M2 대식세포 또는 대식세포 101G5 및 107G3 mAb의 프로파일을 나타낸다. 분화 5일 후, CD14 및 CD163 도트 플롯이 유세포 분석에 의해 생성된다.
도 5: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 용량 의존적 방식으로 M2 대식세포 분극화를 억제한다. M1, M2, GM-CSF 및 IFNγ로 복귀된 M2, 및 상이한 농도의 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이의 이소타입 대조군)의 존재 하에서 M-CSF-유도된 대식세포는 5일 동안 분극화되었고, 추가 2일 동안 LPS의 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B), PDL1(C) 및 CD86(D)의 발현은 비자극 세포(A-C) 또는 LPS 자극 세포(D)에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(E) 및 TNFα(F)는 ELISA에 의해 LPS 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 6: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 단핵세포로부터의 "M2+IL-4"-유도된 분극화를 억제한다. M1, M2, "M2+IL4", GM-CSF 및 IFNγ로 복귀된 M2, 및 10㎍/mL의 M-CSF+IL-4 및 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이들의 이소타입 대조군)로 유도된 대식세포는 5일 동안 생성되었고, 추가 2일 동안 LPS의 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B), PDL1(C), DC-SIGN(D) 및 CD86(E)의 발현은 비자극 세포(AD) 또는 LPS 자극 세포(E)에 대한 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(F) 및 TNFα(G)는 ELISA에 의해 LPS로 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 7: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 암세포-유도된 M2 분극화를 억제한다. M1, M2, PANC-1 컨디션드 배지-유도된 M2, GM-CSF 및 IFNγ로 복귀된 M2, 및 PANC-1 컨디션드 배지 및 10 ㎍/mL의 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이들의 이소타입 대조군)로 유도된 대식세포는 5일 동안 생성되었고, 추가 2일 동안 LPS의 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B)의 발현은 자극되지 않은 세포에 대한 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(C) 및 TNFα(D)는 ELISA에 의해 LPS로 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 8: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 M2 대식세포를 전염증성 M1 대식세포로 복귀시킨다: 표현형 및 사이토카인 분비. M1, M2는 5일 동안 단핵세포로부터 생성되었다. 5일 후, 10 ㎍/mL의 101G5 또는 107G3 mAb(또는 이소형 대조군) 또는 IFNγ를 M2 대식세포에 2일 동안 첨가하고, 추가 2일 동안 LPS 유무에 따라 자극되었다. CD14(A), CD163(B), PDL1(C) 및 CD86(D)의 발현은 비자극 세포(A-C) 또는 LPS 자극 세포(D)에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 상응하는 이소타입 대조군에서 뺀 중앙 형광 강도 값(MFI)으로 표시된다. IL-10(E) 및 TNFα(F)는 ELISA에 의해 LPS로 자극된 대식세포 상등액에서 정량화되었다. 결과는 pg/mL로 표시된다.
도 9: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 T 세포 증식 및 IFNγ 분비의 M2-매개 억제를 나타낸다. 분화된 M1, M2 또는 101G5 및 107G3 mAb(또는 이들의 이소타입 대조군)의 존재 하에서 유도된 대식세포를 5일 동안 동종의 OKT3-활성화된 CTV-표지된 CD3+ T 세포와 공배양하였다. 공배양 후, 세포는 5시간 동안 PMA/이오노마이신 및 GolgiStop 단백질 억제제로 자극되고, CD3+ T 세포의 수(A 및 B), 세포내 IFNγ 생산(CF) 및 증식(CellTrace Violet, CTV dim)(G-J)은 유세포 분석에 의해 정량화되었다. 증식은 CTV 염료의 희석에 의해 정량화되었다(0일째의 CTV 신호를 기준선으로 함). 결과는 CountBright 절대 계수 비드(B, E, F, I 및 J)에서 보정된 CD3+ T 세포의 절대 수 또는 CD3+ T 세포의 백분율(C, D, G 및 H)로 표시된다.
도 10: 정제된 NK 세포의 활성화 및 세포독성에 대한 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb의 효과. (A-B) 정제된 NK 세포는 IL-2 또는 IL-2/IL-15 자극으로 5일 동안 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)와 함께 배양되었다. NK 세포 활성화는 표시된 mAb 또는 대조군 이소타입의 존재 하에서 비자극 및 IL-2/IL-15-자극된 NK 세포 내에서 CD69(A) 및 CD25(B) 발현(MFI)을 이용하여 평가되었다. (C-D) 정제된 NK 세포를 IL-2/IL-15 자극의 유무에 따라 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)와 함께 밤새 사전 인큐베이션한 다음, 4시간 동안 인간 종양세포주와 공배양되었다. NK 세포의 탈과립은 표시된 mAb 또는 대조군 이소타입의 존재 하에서 각 종양 세포주에 대한 비자극(C) 및 IL-2/IL-15-자극된 NK 세포(D) 내의 CD107αβ의 백분율로서 유세포 분석에 의해 평가되었다. (E) 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)가 4시간의 공배양 이전에 NK 세포 또는 표적 세포에서 사전 인큐베이션된 경우 A549 세포주에 대한 NK 세포의 탈과립은 사전-인큐베이션 없이 공배양에 첨가된 mAb와 비교되었다.
도 11: 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 NK 세포의 탈과립 및 선암종 세포주에 대한 살해를 향상시킨다. (A) 정제된 NK 세포를 IL-2/IL-15 자극의 유무에 따라 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입)와 함께 밤새 사전 인큐베이션한 다음 DU-145 세포주와 4시간 동안 공배양하였다. NK 세포의 탈과립은 CD107αβ+ 세포의 백분율로서 유세포 분석에 의해 평가되었다. NK 세포의 탈과립 향상의 EC50은 Prism 소프트웨어에서 4개 매개변수 용량-반응 곡선을 사용하여 표시된 mAb에 대해 계산되었다. (B) 정제된 NK 세포를 레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb(또는 대조군 이소타입 또는 IL-2/IL-15 자극)와 함께 밤새 사전 인큐베이션한 다음 4시간 동안 HL-60 및 A549 세포주와 공배양하였다. NK 세포- 매개된 암 세포 죽음은 표시된 mAb 또는 대조군 이소타입의 존재 하에서 카스파제 3/7+ 세포의 백분율을 이용하여 평가되었다.
도 12: BTN2A1에 대한 레퍼런스 항-BTN2A1 101G5 및 107G3 mAb의 비닝(Binning) 실험. 비닝 실험은 BLI(Bio-layer interferometry) 기술 기반 시스템인 Octet Red96 플랫폼에서 수행되었다. 107G3 및 101G5는 rhBTN2A1-His 단백질에 대해 쌍의 조합 방식으로 검사되었다. A. 107G3은 포화 상태이고 101G5는 경쟁자이다. B: 101G5는 포화 상태이고 107G3은 경쟁자이다. C: mAb의 결합 및 자가-차단 쌍의 임의 단위에서 측정.
도 13: BTN2A1의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써모리신 펩타이드. 서열의 96.37%가 확인된 펩타이드를 포함한다.
도 14: 레퍼런스 mAb 107G3 및 101G5와 인간 BTN2A1 간의 상호작용. A. 107G3/BTN2A1. B. 101G5/BTN2A1.
도 15: BTN2A1/107G3의 상호작용. BTN2A1 PDB 구조 4F9P는 에피토프 부위에서 회색으로 채색되었다. 파란색으로 표시된 BTN2A1 아미노산은 제공된 BTN2A1 서열의 65-78(RWFRSQFSPAVFVY) 및 84-100(RTEEQMEEYRGRTTFVS)에 해당한다. A, B, C, D, E: 정면도의 리본/표면 묘사(A); 후면도(B), 측면도 1(C), 측면도 2(D) 및 평면도(E). F, G, H, I, J: 정면도의 리본 묘사(F); 후면도(G), 측면도 1(H), 측면도 2(I) 및 평면도(J).
도 16: BTN2A1/101G5의 상호작용. BTN2A1 PDB 구조 4F9P는 에피토프 부위에서 회색으로 채색되었다. 파란색으로 표시된 BTN2A1 아미노산은 제공된 BTN2A1 서열의 212-229(KSVRNMSCSINNTLLGQK)에 해당한다. A, B, C, D, E: 정면도의 리본/표면 묘사(A); 후면도(B), 측면도 1(C), 측면도 2(D) 및 평면도(E). F, G, H, I, J: 정면도의 리본 묘사(F); 후면도(G), 측면도 1(H), 측면도 2(I) 및 평면도(J).
도 17: 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그에 대한 레퍼런스 항-BTN2A1 101G5 및 107G3 mAb의 교차-반응성 평가. ELISA 플레이트에 코팅된 재조합 인간 BTN2A1-Fc 융합 단백질 또는 재조합 시노몰구스 BTN2A1-Fc 융합 단백질에 대한 107G3 및 101G5 결합의 ELISA 기반 측정. 그래프는 가변 기울기 모델을 사용하여 비선형 회귀에 의한 EC50 계산을 허용하는 용량-반응 곡선을 나타낸다.
정의
본원에 사용된 용어 "BTN2"는 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 가지며 SEQ ID NO: 17의 BTN2A1 또는 SEQ ID NO: 18의 BTN2A2를 포함하는 인간 BTN2 폴리펩타이드를 지칭한다.
SEQ ID NO: 17: BTN2A isofom 1 precursor (Homo sapiens):
MESAAALHFSRPASLLLLLLSLCALVSAQFIVVGPTDPILATVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALVIHNITAQENGTYRCYFQEGRSYDEAILHLVVAGLGSKPLISMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRDPYGGVAPALKEVSMPDADGLFMVTTAVIIRDKSVRNMSCSINNTLLGQKKESVIFIPESFMPSVSPCAVALPIIVVILMIPIAVCIYWINKLQKEKKILSGEKEFERETREIALKELEKERVQKEEELQVKEKLQEELRWRRTFLHAVDVVLDPDTAHPDLFLSEDRRSVRRCPFRHLGESVPDNPERFDSQPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKGEVLLIPQNGFWTLEMHKGQYRAVSSPDRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAFSVPVRPFFRLGCEDSPIFICPALTGANGVTVPEEGLTLHRVGTHQSL
SEQ ID NO: 18: BTN2A isofom 2 precursor (Homo sapiens):
MEPAAALHFSLPASLLLLLLLLLLSLCALVSAQFTVVGPANPILAMVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRITFVSKDINRGSVALVIHNVTAQENGIYRCYFQEGRSYDEAILRLVVAGLGSKPLIEIKAQEDGSIWLECISGGWYPEPLTVWRDPYGEVVPALKEVSIADADGLFMVTTAVIIRDKYVRNVSCSVNNTLLGQEKETVIFIPESFMPSASPWMVALAVILTASPWMVSMTVILAVFIIFMAVSICCIKKLQREKKILSGEKKVEQEEKEIAQQLQEELRWRRTFLHAADVVLDPDTAHPELFLSEDRRSVRRGPYRQRVPDNPERFDSQPCVLGWESFASGKHYWEVEVENVMVWTVGVCRHSVERKGEVLLIPQNGFWTLEMFGNQYRALSSPERILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAFTVPVRPFFRLGSDDSPIFICPALTGASGVMVPEEGLKLHRVGTHQSL
본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 동일한 의미를 가지며, 본 명세서에서도 동일하게 사용될 것이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 항체 단편 및 항체 및 항체 단편의 변이체(유도체 포함)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 또한 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 포함한다. 항체는 유도체화되거나 또는 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 항체는 실제로 2개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중-특이적 분자를 생성하기 위해 유도체화되거나 또는 1개 이상의 다른 기능적 분자에 연결될 수 있다; 이러한 다중-특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자가 생성되도록 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체와 같은 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로(예를 들어, 화학적 결합, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의해) 연결될 수 있다. 또한, 이중특이적 분자가 다중특이적인 구체예인 경우, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 외에 제3의 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 하나의 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 유니바디 또는 단일쇄 Fv를 비롯한 이의 항체 단편을 포함한다. 항체는 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 Ladner et al. 미국 특허 번호 4,946,778에 기술된 바와 같이 Fv 또는 단일쇄 구조물과 같은 이의 임의의 최소 단편일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메라 및 인간화 단클론 항체(mAb)이다.
본 개시내용의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이성을 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 각각은 서로 결합되어 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 공유 접합을 위해 다양한 커플링 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜- 3-(2 피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다(Karpovsky et al., 1984; Liu et al., 1985). 다른 방법으로는 Brennan et al., 1985; Glennie et al., 1987; Paulus, 1985에 기술된 것들을 포함한다. 대안으로, 두 결합 특이성은 동일한 벡터에서 인코딩되고 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 개시내용의 이중특이적 분자는 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자의 특정 표적에 대한 결합은 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(REA), FACS 분석, 생물분석(예: 성장 억제 및 세포사멸), 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인할 수 있다. 이러한 각각의 분석은 일반적으로 목적 복합체에 특이적인 표지된 시약(예: 항체)을 사용하여 특정의 목적 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
천연 항체에서, 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있고 각 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결되어 있다. 경쇄에는 람다(λ)와 카파(κ)의 두 가지 유형이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 클래스(또는 이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각 사슬은 별개의 서열 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)의 2개의 도메인을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 일괄하여 CH라고 함)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(CL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬 결합, 분비, 태반을 경유한(trans-placental) 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다.
Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 가변 부분으로 구성된다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정기 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 초가변성 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기로 구성된다. 때때로, 비초가변 또는 프레임워크 영역(FR)의 잔기는 항체 결합 부위에 참여하거나 전체 도메인 구조에 영향을 미치므로 결합 부위에 영향을 미칠 수 있다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄에는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 지정된 3개의 CDR이 있다. 따라서, 항원-결합 부위는 전형적으로 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터 설정된 CDR을 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 프레임워크 영역(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열을 지칭한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 전형적으로 다음의 서열 4개의 프레임워크 영역 및 3개의 CDR을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
항체 가변 도메인의 잔기는 Kabat et al.에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적으로 번호가 매겨진다. 이 시스템은 Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이하 "Kabat et al.")에 설명되어 있다. 이 넘버링 시스템은 본 명세서에서 사용된다. Kabat 잔기 지정은 SEQ ID 서열에서 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 상응하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)에 관계없이 구조적 성분의 단축 또는 삽입에 상응하는 엄격한 Kabat 넘버링에서보다 더 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열에서 상동성의 잔기를 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35(H-CDR1), 잔기 50-65(H-CDR2) 및 잔기 95-102(H-CDR3)에 위치한다. 경쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34(L-CDR1), 잔기 50-56(L-CDR2) 및 잔기 89-97(L-CDR3)에 위치한다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편, 보다 구체적으로 본원에 개시된 바와 같은 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 단백질이다. 항체 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다(예를 들어, BTN2A1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 BTN2A 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나 BTN2에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 관련 BTN2 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
항체 친화도는 항체가 이의 항원 결합 부위(파라토프)를 통해 본 개시내용에서 BTN2A1과 같은 항원에 제시된 에피토프에 결합하는 강도를 지칭한다. 친화도는 Kd 값의 평가를 기반으로 하여 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 평형 해리 상수를 나타내는 것으로 의도되며, 이는 koff 대 kon의 비(즉, koff/kon)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현된다. KD 값은 항체의 농도(특정 실험에 필요한 항체의 양)와 관련이 있으므로 KD 값이 낮을수록(낮은 농도) 항체의 친화도가 높아진다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. mAb의 KD 값을 결정하기 위한 바람직한 방법은 Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., 1992, 1993, and Muller, Meth Enzymol 1983에서 찾을 수 있으며, 참고문헌들은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 Biacore® 또는 Octet® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다(친화도 평가에 관한 자세한 정보는 Rich RL, Day YS, Morton TA, Myszka DG. High-resolution and high-throughput protocols for measuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE®. Anal Biochem. 2001를 참조할 것). Octet® 플랫폼은 BLI(bio-layer interferometry) 기술을 기반으로 한다. BLI 기술의 원리는 고정된 단백질 층과 내부 레퍼런스 층의 두 표면에서 반사된 백색광의 광학 간섭 패턴을 기반으로 한다. 바이오센서 팁 표면에 고정된 리간드와 용액 내 분석물질 사이의 결합은 바이오센서 팁에서 광학 두께를 증가시켜 나노미터 단위로 측정된 간섭 패턴의 이동을 초래한다. 파장 이동(Δλ)은 생물층의 광학 두께 변화를 직접 측정한 것으로, 이 이동이 일정 기간에 걸쳐 측정되고 그 크기가 시간의 함수로 표시될 때 고전적인 연관/해리 곡선이 얻어진다. 이 상호작용은 실시간으로 측정되어 결합 특이성, 결합 속도 및 해리 속도 및 농도를 모니터링할 수 있다(Abdiche et al. 2008 및 결과의 세부 사항 참조). 친화도 측정은 일반적으로 25℃에서 수행된다.
본원에 사용된 용어 "kassoc" 또는 "ka", 또는 "kon"은 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도(association rate)를 나타내는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "kdis" 또는 "kd", 또는 koff는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "특이성"은 본 개시내용에서 BTN2A 이소폼(BTN2A1 및 BTN2A2 포함)과 같은 항원에 제시된 에피토프에 검출가능하게 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 이는 전형적으로 10 nM 이하, 5 nM, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하의 KD로 인간 BTN2A, 특히 BTN2A1에 결합하는 항체 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 전형적으로, KD는 10-3 pM 내지 10 nM, 특히 0.1 pM 내지 10 nM, 특히 0.1 pM 내지 5 nM, 또는 1 pM 내지 10 nM, 특히 1 pM 내지 5 nM 또는 10 pM 내지 5 nM로 이루어진다. 전형적으로, 본 개시내용의 항체는 BTN2A1 또는 BTN2A1 및 BTN2A2 둘 모두에 대해 특이적이며, 상기 정의된 바와 같은 KD를 갖는다. 특이성은 또한 세포주(예를 들어, HEK-293T 세포주)에서 BTN2A1을 발현시키고, 본원에 개시된 바와 같은 정제된 항-BTN2A1 mAb의 농도를 증가시키면서(예를 들어, 5 ng/mL 내지 75 ㎍/mL 범위), 또는 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 함께 또는 음성 대조군으로 형질감염된 세포를 염색함으로써 일부 구체예에서 평가될 수 있다. 평균 형광 강도 데이터의 비선형 회귀 분석을 통해 EC50을 최대 형광의 50%가 관찰되는 mAb의 농도로 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용에 따라 BTN2A1에 특이적인 항체는 50 ㎍/mL 미만, 특히 40 ㎍/mL 미만, 특히 0.1 ㎍/mL 내지 50 ㎍/mL, 또는 0.5 ㎍/mL 내지 20 ㎍/mL의 EC50으로 BTN2A1에 결합한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대한 특이성을 갖는 항체"라는 문구는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"선택적 결합"은 일반적으로 항체가 다른 표적에 대한 결합과 비교하여 특이적인 표적, 예컨대 에피토프에 더 강하게 결합함을 의미한다. 항체는 첫 번째 표적에 대한 친화도가 두 번째 표적에 대한 친화도보다 높으면 두 번째 표적에 비해 첫 번째 표적에 더 강하게 결합한다. 일반적으로 항체는 상기에서 언급한 바와 같이 평형 해리 상수(KD) 또는 EC50으로, 즉 두 번째 표적에 대한 평형 해리 상수 또는 EC50 보다 낮게 첫 번째 표적에 결합하는 경우, 두 번째 표적에 비해 첫 번째 표적에 더 강하게 결합한다. 가장 구체적으로 제제는 관련 범위까지 두 번째 표적에 전혀 결합하지 않는다. 본 출원의 일부 구체예에서, 항체는 BTN2A 및 가장 구체적으로 BTN2A1에 대해 선택적이다. 선택성은 또한 예를 들어, 특이 항원에 대한 결합 대 다른 관련 없는 분자에 대한 비-특이적 결합에서 친화도의 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 또는 그 초과의 비에 의해 추가로 나타날 수 있다(예를 들어, 특정 항원은 BTN2A 폴리펩타이드, 특히 BTN2A1이고 다른 "관련 없는 분자"는 예를 들어 BTN3 이소폼일 수 있음).
본원에 개시된 항체의 선택성은 의도된 표적 단백질(BTN2A 이소폼)과 비교하여 밀접하게 관련된 다른 단백질(예를 들면, BTN3 이소폼)에 대한 교차-반응성 분석을 사용하여 검사될 수 있다. 이러한 교차-반응성이 검출될 수 없는 경우, 동시에 동일한 항체 희석에서 의도된 표적의 강한 신호를 제공하는 동안, 항체는 일반적으로 선택적인 것으로 간주된다(도 3에 해당하는 실시예에 자세히 설명된 결과 참조). "항원과 교차-반응하는" 항체는 10 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 100 pM 이하의 KD로 그 항원에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. "특정 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 100 nM 이상의 KD, 1 μM 이상의 KD, 또는 10 μM 이상의 KD로 해당 항원에 결합하는 항체를 의미한다. 특정 구체예에서, 항원과 교차-반응하지 않는 이러한 항체는 표준 결합 분석에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출 불가능한 결합을 나타낸다(전형적으로 표 3 또는 도 3A 참조).
특정 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체는 하기에 정의된 SEQ ID NO: 35의 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그(cynoBTN2A1; NCBI 참조 번호 XP_015304392.1)와 교차-반응한다:
MQRQFSKASRPCLPWVLMEPAAALHFSLPASLILLLLLLRLCALVSAQFTVVGPTDPILAMVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALIIHNVTAQENGTYRCYFQEGRSYDEAILHLMVAGLGSKPLVEMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRDPYGRVVPALKEVFPPDTDGLFMVTTAVIIRDKSMRNMSCSISDTLLGQKKESVIFIPESFMPSVSPCVVALPIIVVFLMIIIAVCIYWINRLQKETKILSGEKESERKTREIAVKELKKERVQKEKELQVKEQLQEELRWRRTVLHAVDVVLDPDTAHPDLLLSEDRRSVRRCPLGHLGESVPDNPERFNSEPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKEEVLLRPRNGFWTLEMCKGQYRALSSPKRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRLAFSVPVRPFFRIGSDDSPIFICPALTGASGITVPEEGLILHRVGTNQSLMPVGTRCYGHGMRPTGFIRMREERGIHRTTREEREPDMQNFDLGAHWSNNLPSARSREFLNSDLVPDHSLESPVTPGLANKTGEPQAEVTCLCFSLPSSELRAFPSTATNHNHKATALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITDPFFRNAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATKQEISLRGGEKSLAYHGTHISYLAAPERWEMAVFPNSGLPRCLLTLILLQLPKLDSAPFDVIGPPEPILAVVGEDAELPCRLSPNASAEHLELRWFRKKVSPAVLVHRDGREQEAEQMPEYRGRATLVQDGIAEGRVALRIRGVRVSDDGEYTCFFREDGSYEEALVHLKVAALGSDPHISMQVQENGEIWLECTSVGWYPEPQVQWRTSKGEKFPSTSESRNPDEEGLFTVAASVIIRDTSVKNVSCYIQNLLLGQEKEVEIFIPG.
이들 구체예 중 일부에서, 본원에 개시된 바와 같은 항체는 huBTN2A1에서 얻은 상응하는 EC50에 필적하는(대략 10%) EC50으로 cynoBTN2A1 엑토도메인에 결합한다.
"동일성"이라는 용어는 2개의 폴리펩타이드 분자 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 두 비교 서열의 위치가 동일한 염기 또는 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 각각의 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 두 서열이 공유하는 일치하는 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 값에 해당한다. 일반적으로 두 서열이 최대 동일성을 제공하도록 정렬될 때 비교가 이루어진다. 동일성은 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램, 또는 BLAST, FASTA 또는 CLUSTALW와 같은 임의의 서열 비교 알고리즘을 사용하여 정렬함으로써 계산될 수 있다.
본 개시내용에 따른 레퍼런스 분자의 기능적 변이체는 레퍼런스 분자(예: 107G3 mAb)의 상응하는 기능적 특성과 실질적으로 동일하거나 더 우수한 기능적 특성을 나타낸다. 실질적으로 동일하게, 상기 기능적 변이체는 레퍼런스 분자의 상응하는 기능적 특성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하는 것으로 본원에서 의도된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 상기 정의된 바와 같은 BTN2A1에 대한 특이성을 갖는 항체에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 항체는 상기 정의된 바와 같이 10 nM 이하의 KD로 인간 BTN2A1에 결합하는 것을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 BTN3 이소폼과 교차-반응하지 않는다.
본 발명에 따른 BTN2A, 특히 BTN2A1에 대한 특이성을 갖는 항체는 또한 전형적으로 다음의 특성 중 적어도 하나를 가짐을 추가로 특징으로 한다:
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. NK 세포 활성화를 직접적으로 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다.
바람직하게는 본 개시내용의 항체는 특성 i 및 ii 중 적어도 하나 및 특성 iii 및 iv 중 적어도 하나를 나타내며, 가장 바람직하게는 특성 i 내지 iv를 나타낸다.
이러한 유리한 특성을 갖는 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 예를 들어 실시예 섹션에 상세히 기재된 바와 같은 분석을 사용하여 항-BTN2A 항체 중에서 스크리닝될 수 있다. 상기 분석 및 이들의 구현은 아래에 간략하게 설명되어 있다.
대식세포 분극화 분석에서, M2 대식세포는 현장에서 전통적으로 수행되는 대식세포로부터 생성되며, 항-BTN2A 항체, 특히 이전에 정의된 항-BTN2A1 항체의 존재 또는 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군의 존재 하에 생성된다. GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및 IFN-γ는 M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor)-유도 M2 분극화 동안 단핵세포에 첨가될 수 있으며, 이는 M2 분화 억제를 위한 대조군으로 사용된다. 반대로, GM-CSF의 존재 하에서 분극화된 M1 대식세포는 또한 일반적으로 표현형 대조군으로 사용될 수 있다. 분극화 후, 세포막에서 M1 및 M2 관련 마커의 발현은 생성된 대식세포에서 유세포 분석에 의해 평가될 수 있다.
본 개시내용에 따라 편리하게 검출될 수 있는 M1 마커는 비제한적으로 PDL1, CD86, CD40, CD80 및/또는 SOCS3을 포함한다. PDL1 및/또는 CD86이 일반적으로 검출된다. 본 개시내용에 따라 편리하게 검출될 수 있는 M2 마커는 비제한적으로 CD14, CD163, CD206 및 CD209를 포함하고, CD14 및/또는 CD163이 일반적으로 검출된다.
전형적으로, 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화 억제는 다음과 같은 경우에 본 개시내용의 항-BTN2A에 의해 유도된다:
- 본 개시내용의 항-BTN2A 항체의 존재 하에서 M2 대식세포가 생성될 때, 이의 대조군 이소타입과 비교하여 적어도 하나의 M1 마커의 상당한 증가가 관찰되고; 및/또는
- 항-BTN2A 항체의 존재 하에서 M2 대식세포가 생성될 때, 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 비교하여 적어도 하나의 M2 마커의 현저한 감소가 관찰된다.
또한, M1과 M2 대식세포 사이의 특징적인 구별 기능인 사이토카인 분비 프로파일(특히 M2 관련 항염증성 IL-10 사이토카인 및 전염증성 M1 관련 TNFα 사이토카인 포함)은 적절한 상용 키트(예: ELISA 유사 키트)를 사용하여 배양 상등액에서 정량화될 수 있다. M1 또는 M2 대식세포 표현형을 특성화하기 위해 쉽게 검출될 수 있는 추가 사이토카인에는 M1-관련 사이토카인으로 IL-1, IL-6, IL-12 및 IL-23 및 M2-관련 사이토카인으로 TGFβ 및 IL-10이 포함된다.
따라서, 일부 구체예에서, 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화 억제는 또한 다음과 같은 경우에 본 개시내용의 항-BTN2A 항체의 작용으로부터 기인하는 것으로 간주될 수 있다:
- M2 대식세포가 본 개시내용의 항-BTN2A 항체의 존재 하에서 배양될 때, 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 비교하여 적어도 하나의 M2-관련 사이토카인 분비의 현저한 감소가 관찰되고, 및/또는
- M2 대식세포가 본 개시내용의 항-BTN2A 항체의 존재 하에서 배양될 때, 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 비교하여 적어도 하나의 M1 관련 사이토카인 분비의 유의한 증가가 관찰된다.
일반적으로, 본 개시내용에 따른 항-BTN2A 항체는 M2-관련 마커(예: CD14 및/또는 CD163)의 감소된 발현 및/또는 M2-관련 사이토카인(예: IL-10)의 감소된 분비에 의해 평가되는 바와 같이 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 용량 의존적으로 억제할 수 있다. 상기 적어도 하나의 M2-관련 사이토카인의 분비 또는 상기 적어도 하나의 M2-관련 마커의 발현에 관한 이러한 항체의 절반 최대 억제 농도(IC50)는 실시예 섹션에서 상세히 기재된 바와 같은 용량-반응 곡선에서 측정될 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 항-BTN2A 항체는 다음을 나타낸다:
- 0.05 ㎍/mL, 특히 0.1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 특히 50 ㎍/mL 범위의 M2-관련 마커 발현(전형적으로 CD14 및/또는 CD163)에 대한 IC50, 및/또는
- 0.01 ㎍/mL, 특히 0.05 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 특히 50 ㎍/mL, 가장 구체적으로 0.1 내지 20 ㎍/mL 범위의 M2 관련된 사이토카인 분비(전형적으로 IL-10)에 대한 IC50.
추가로 또는 대안으로, 본 개시내용에 따른 항-BTN2A 항체는 M1 관련된 마커(예: CD86 및/또는 PDL1)의 증가된 발현 및/또는 M2-관련 사이토카인(예: IL-10)의 분비 감소에 의해 평가되는 바와 같이, M2-촉진 자극에도 불구하고 단핵세포의 M1 대식세포로의 분극화를 용량 의존적으로 왜곡할 수 있다. 상기 적어도 하나의 M1-관련 사이토카인의 분비 또는 상기 적어도 하나의 M1-관련 마커의 발현과 관련하여 이러한 항체의 절반 최대 유효 농도(EC50)는 실시예 섹션에서 구체적으로 기재된 바와 같이 용량-반응 곡선으로 측정될 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 항-BTN2A 항체는 다음을 나타낸다:
- 0.01 ㎍/mL, 특히 0.1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 특히 50 ㎍/mL, 가장 구체적으로 1 내지 50 ㎍/mL 범위의 M1-관련 마커 발현(전형적으로 CD86 및/또는 PDL1)에 대한 EC50 및/또는
- 0.01 ㎍/mL, 특히 0.05 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 특히 50 ㎍/mL, 가장 구체적으로 0.1 내지 10 ㎍/mL 범위의 M1-관련 사이토카인 분비(전형적으로 TNFα)에 대한 EC50.
M2 대식세포의 복귀 분석에서, M-CSF의 존재 하에서 단핵세포로부터 전형적으로 생성된 M2 대식세포는 항-BTN2A 항체(가장 구체적으로는, 이전에 정의된 바와 같은 항-BTN2A1 항체)의 존재 하에서 또는 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 함께 지질다당류(LPS)의 유무에 따라 배양될 수 있다. GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및 IFNγ는 M2 복귀의 양성 대조군으로서 M2 배양물에 추가될 수 있다. GM-CSF의 존재하에서 분극화된 M1 대식세포는 일반적으로 표현형 대조군으로 사용될 수 있다. 복귀 실험 후, LPS의 부재 하에 복귀된 대식세포는 위에서 설명한 바와 같이 M1- 또는 M2-관련 마커의 발현에 대해 유세포 분석에 의해 분석될 수 있다. 사이토카인 분비도 상기에서 설명한 대로 정량화할 수 있다.
전형적으로, M2 대식세포의 M1 대식세포의 복귀는 다음과 같은 경우에 본 개시내용의 항-BTN2A 항체에 의해 유도된다:
- M2 대식세포가 상기 항-BTN2A 항체의 존재 하에서 배양될 때, 이의 대조군 이소타입과 비교하여 M1 마커의 유의한 증가가 관찰되고, 및/또는
- M2 대식세포가 상기 항-BTN2A 항체의 존재 하에서 배양될 때, 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 비교하여 M2 마커의 현저한 감소가 관찰된다.
자연 살해(NK) 세포 활성화는 IL-2 및/또는 IL-15의 첨가 유무에 따라, 본원에 정의된 항-BTN2A 항체 또는 음성 대조군을 위한 대조군 이소타입과 함께 NK 세포(일반적으로 건강한 공여자로부터)를 배양함으로써 평가할 수 있다. 적어도 48시간 후, 특히 적어도 4일 후, NK 세포는 CD69 및/또는 CD25와 같은 활성화 마커에 대해 세포외로 표현될 수 있다. 전형적으로 NK 세포 활성화는 이의 이소타입 대조군과 같은 음성 대조군과 비교하여 CD69 및/또는 CD25와 같은 NK 세포 활성화 마커의 상당한 증가가 상기 항-BTN2A의 존재 하에 관찰될 때(IL-2 및/또는 IL-15를 사용한 추가의 활성화의 유무에 따라), 본 개시내용의 항-BTN2A 항체에 의해 유도된 것으로 간주된다. 본원에 제공된 결과는 본 발명의 항체가 NK 세포의 직접적인 활성화를 유발한다는 것을 분명히 입증한다.
NK 세포의 세포독성 증진은 NK 세포의 탈과립을 평가함으로써 시험관내에서 추가로 평가될 수 있다. 이러한 기능적 분석에서, 백혈병 세포주(골수성 백혈병) 또는 암종(예를 들어, 대장 암종, 유방 또는 폐 선암종) 세포주와 같은 암 세포주는 전술한 NK 세포(앞서 설명한 항-BTN2A 항체 또는 이의 음성 대조군으로 이전에 활성화됨) 및 IL-2 및/또는 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 공배양된다. NK 세포의 탈과립은 CD107 양성 NK 세포(IL-2 및/또는 IL-15의 존재 또는 부재 하에서)의 백분율로서 유세포 분석에 의해 전형적으로 평가될 수 있다.
전형적으로, NK 세포의 세포독성은 NK 세포의 탈과립(예를 들어, CD107 양성 NK 세포의 백분율)이 이의 대조군 이소타입과 같은 음성 대조군과 비교하여 상기 항-BTN2A 항체로 NK 세포 활성화 후 유의하게 증가될 때 항-BTN2A 항체에 의해 유도된 것으로 간주된다. 전형적으로 또한, 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 용량-의존적으로 NK 세포의 탈과립을 유도한다(특히 이전에 기재된 바와 같은 다양한 암 세포주에 대해). NK 세포의 탈과립과 관련된 이러한 항체의 절반 유효 농도(EC50)는 실시예 섹션에 상세히 설명된 바와 같이 용량-반응 곡선에서 결정될 수 있다.
레퍼런스 항체 101G5 및/또는 107G3은 상기에서 설명한 기능 분석에서 양성 대조군으로 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A 항체는 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고, M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며, 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고 및/또는 다음에 완전히 기술된 바와 같이 레퍼런스 항체 mAb 101G5 또는 mAb 107G3과 실질적으로 동일하거나 더 우수한 수준으로 NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다. "단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고, 항종양 M1 대식세포로의 M2 대식세포의 복귀를 유도하며, 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고, 및/또는 레퍼런스 항체와 실질적으로 동일하거나 우수한 수준으로 NK 세포-매개 세포독성을 향상"시킨다는 것은, 본원에서 레퍼런스 mAb 107G3 또는 101G5 중 어느 하나와 비교하여 시험된 기능적 활성의 20% 미만, 특히 15% 미만, 특히 10% 미만 및 전형적으로 5% 미만의 변화가 시험된 항-BTN2A1 항체로 관찰되는 것으로 의도된다.
본 개시내용은 또한 다음의 항체를 포함한다:
1) 앞서 정의한 바와 같이 BTN2A, 특히 BTN2A1에 대한 특이성을 가지며, 특히 다음의 특성 중 적어도 하나를 갖는 항체:
- 세포주, 예를 들어 실시예에 기술된 바와 같이 인간 BTN2A1을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포주에서 전형적으로 발현되는 바와 같이 인간 BTN2A1에 결합하며, 보다 구체적으로는 50 ㎍/mL 미만, 더욱 구체적으로는 40 ㎍/mL 미만의 EC50으로 또는 10 nM 이하의 KD로 BTN2A1에 결합하고 및/또는 BTN2A1와의 결합 대 비특이적 결합에서 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 이상의 친화도 비율을 가지며;
- BTN3와 교차-반응하지 않는다; 및
2) 추가로 또는 대안으로 하나 이상의 기능적 특성을 나타내는 항체:
- Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 세포용해 분자(특히 IFN-γ)의 생산을 활성화하고, 및/또는
- Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하며, 및/또는
- Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식을 활성화한다.
증식, 세포용해 기능 및 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 세포용해 분자(특히 IFN-γ)의 생산은 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의해 달성되며, 이는 일반적으로 본원에 개시된 바와 같은 항체에 의해 달성된다는 것이 주목된다.
이러한 유리한 특성을 갖는 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 세포 분석을 사용하고 특히 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 IFNγ 분비의 ELISA-기반 평가 및/또는 Daudi 세포주, Jurkat 세포주, L-IPC 세포주 또는 MDA-MB-134 세포주와 같은 다양한 암 세포주에 대한 CD107 탈과립 분석에 의해 항-BTN2A1 항체 중에서 스크리닝될 수 있다.
본 개시내용에 따른 세포용해 분자는 전형적으로 IFNγ 또는 TNFα 사이토카인으로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포용해 분자의 생산 활성화"(전형적으로 IFNγ/또는 TNFα)는 대조군으로 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포(대조군으로서 IgG1 또는 하이브리도마 배양 배지 사용)와 비교하여 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 적어도 IFNγ 또는 TNFα 생산의 상당한 증가가 관찰됨을 의미하며, 상기 Vγ9/Vδ2 T 세포는 표적 세포주(Daudi, Jurkat, L-IPC 또는 MDA-MB-134 세포주)와의 공배양에 의해 또는 인산항원(pAg)에 의해 활성화된다. 일반적으로, 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 IFNγ 또는 TNFα 생산의 활성화는 유세포 분석에서 평가된 IFNγ 또는 TNFα에 대한 항체를 사용한 세포내 표지화에 의한 세포 분석 또는 그들의 배양 배지에서 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의해 분비된 IFNγ 또는 TNFα의 ELISA 기반 용량에 의해 측정될 수 있다. 이러한 분석은 아래의 실시예(재료 및 방법 섹션 참조)에 자세히 설명되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능 활성화"는 대조군으로 활성화된 인간 Vγ9/Vδ2 T 세포(대조군으로서 IgG1 또는 하이브리도마 배양 배지 사용)과 비교하여 활성화된 인간 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 현저한 증가가 관찰됨을 의미하며, 상기 인간 Vγ9/Vδ2 T 세포는 표적 세포주(Daudi, Jurkat, L-IPC 또는 MDA-MB-134 세포주) 또는 인산항원(pAg)과의 공배양에 의해 활성화된다. 통상적으로, 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 활성화는 양성의 탈과립된 Vγ9/Vδ2 T 세포를 검출하기 위한 탈과립 마커로서 CD107a 및 CD107b를 공동으로 사용하여 표준 세포주에 대한 Vγ9/Vδ2 T 세포의 탈과립 유도 활성화의 측정에 따라 측정될 수 있다. Vγ9/Vδ2 T 세포의 이오노마이신 처리와 함께 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)는 일반적으로 Vγ9/Vδ2 T 세포 활성화에 대한 양성 대조군으로 사용할 수 있다. 이러한 분석은 아래의 실시예에서 더 자세히 설명된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "활성화된 Vγ9/Vδ2 T세포의 증식 활성화"는 대조군으로서 IgG1으로 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포를 이용한 증식과 비교하여 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식의 현저한 증가가 관찰됨을 의미한다. 상기 Vγ9/Vδ2 T 세포는 표적 세포주(예: Daudi, Jurkat, L-IPC 또는 MDA-MB-134 세포주)와의 공배양에 의해 또는 인산항원(pAg)에 의해 활성화된다. 일반적으로, 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식은 말초혈액으로부터 정제된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 CFSE 또는 Cell Trace 바이올렛 염색 및 유세포 분석에 의한 세포 분석 또는 자극의 유무에 따라 말초 혈액 단핵세포내 Vγ9/Vδ2 T 세포 구획의 확장을 모니터링하여 측정할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체는 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 다음에 기재된 바와 같은 레퍼런스 항체 mAb 107G3과 실질적으로 동일하거나 더 우수한 수준으로 활성화시킨다. "레퍼런스 항체와 실질적으로 동일한 수준으로 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 활성화"는, 본원에서 레퍼런스 mAb 107G3과 비교하여 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 15% 미만, 특히 10% 미만 및 전형적으로 5% 미만의 변이가 시험된 항-BTN2A1 항체로 관찰되는 것으로 의도된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체는 아래에 설명된 대로 레퍼런스 항체 mAb 107G3과 실질적으로 동일하거나 우수한 수준으로 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 세포용해 분자(즉, 적어도 IFNγ 또는 TNFα)의 생산을 활성화한다. "레퍼런스 항체와 실질적으로 동일한 수준으로 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 적어도 IFNγ 또는 TNFα의 생산을 활성화"는, 본원에서 레퍼런스 mAb 107G3과 비교하여 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 분자 생산의 15% 미만, 특히 10% 미만 및 전형적으로 5% 미만이 시험된 항-BTN2A1 항체로 관찰되는 것으로 의도된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체는 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 다음에 기재된 바와 같은 레퍼런스 항체 mAb 107G3과 실질적으로 동일하거나 더 우수한 수준으로 활성화시킨다. "레퍼런스 항체와 실질적으로 동일한 수준으로 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화"는, 본원에서 레퍼런스 mAb 107G3과 비교하여 활성화된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 15% 미만, 특히 10% 미만 및 전형적으로 5% 미만의 변이가 시험된 항-BTN2A1 항체로 관찰되는 것으로 의도된다.
레퍼런스 항체 mAbs 101G5, 107G3 및 이들의 변이체
본원에 개시된 항체는 각각 SEQ ID NO: 19 및 20에 정의된 바와 같은 각각의 VH 및 VL 영역을 포함하는 레퍼런스 단클론 항체 mAb 101G5, 및 SEQ ID NO: 1 및 2 각각에 정의된 바와 같은 각각의 VH 및 VL 영역을 포함하는 mAb 107G3을 포함한다.
본 개시내용의 다른 항체는 SEQ ID NO: 1 및 2에 각각 정의되거나 또는 SEQ ID NO: 19 및 20에서 각각 정의된 바와 같은 VH 및 VL 영역과 적어도 90%, 특히 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 것들을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항-BTN2A 항체, 전형적으로 인간화 항-BTN2A1은 SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 본원에 개시된 항체의 특정 구체예에서, 6개의 CDR 영역은 SEQ ID NO: 3-8에 정의된 레퍼런스 mAb 107G3의 6개 CDR 영역과 100% 동일하다.
다른 특정 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항-BTN2A1 항체, 전형적으로 인간화 항-BTN2A1은 SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
본원에 개시된 항체의 특정 구체예에서, 6개의 CDR 영역은 SEQ ID NO: 21-26에 정의된 레퍼런스 mAb 101G5의 6개 CDR 영역과 100% 동일하다. 본원에 개시된 바와 같은 다른 항체는 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 아미노산을 갖는 항체를 포함하지만, 레퍼런스 mAb 101G5의 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는다. 일반적으로, 본 개시내용에 따라, 항체는 SEQ ID NO: 21-26에 정의된 레퍼런스 항체 mAb 107G3의 CDR 서열과 비교하여 하나 이상의 CDR에서 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 변이(결실, 삽입 또는 치환 포함)를 가질 수 있다.
본원에 개시된 항체의 다른 특정 구체예에서, 6개의 CDR 영역은 SEQ ID NO: 3-8에 정의된 레퍼런스 mAb 107G3의 6개 CDR 영역과 100% 동일하다. 본원에 개시된 바와 같은 다른 항체는 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 아미노산을 갖는 항체를 포함하지만, 레퍼런스 mAb 107G3의 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는다. 일반적으로 본 개시내용에 따라, 항체는 SEQ ID NO: 3-8에 정의된 레퍼런스 항체 mAb 107G3의 CDR 서열과 비교하여 하나 이상의 CDR에서 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 변이(결실, 삽입 또는 치환 포함)를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 참조 mAb 101G5 또는 107G3의 상응하는 6개 CDR 영역과 각각 100% 동일한 6개의 CDR 영역을 갖는 mAb 101G5 또는 mAb 107G3의 돌연변이 변이체이고, 여기서 상기 돌연변이 변이체 항체는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 상응하는 레퍼런스 항체의 상응하는 프레임워크 영역과 비교하여 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역에서 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
기능적 변이체 항체
실시예에서 제공된 실험 데이터에 의해 나타난 바와 같이, 레퍼런스 mAb 107G3은 인간 BTN2A1의 위치 65, 68, 69, 72, 78, 84, 85, 95, 97, 100에 있는 잔기들과 결합한다. 따라서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 17의 위치 60 내지 100에 위치한 아미노산 잔기를 포함하는 형태적 에피토프 및 가장 구체적으로, SEQ ID NO: 17의 위치 65, 68, 69, 72, 78, 84, 85, 95, 97, 100에 있는 아미노산 잔기를 포함하는 형태적 에피토프에 결합하고, 그리고 이전에 정의되고 아래에 추가로 상기되는 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는, 특히 레퍼런스 mAb 107G3의 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 mAb를 포함한다.
또한 실시예에서 제공된 실험 데이터에 의해 나타난 바와 같이, 레퍼런스 mAb 101G5는 BTN2A1의 위치 212, 213, 218, 220, 224, 229에 있는 잔기에 결합한다. 따라서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 17의 위치 210 내지 230에 위치한 아미노산 잔기를 포함하는 형태적 에피토프, 및 가장 구체적으로 SEQ ID NO: 17 및 이전에 정의되고 다음에 추가로 상기되는 바와 같은 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는, 특히 레퍼런스 mAb 101G5의 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 mAb를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용의 기능적 변이체 항체는 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 가지며; 또는 가변 영역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 또는 상기 기재된 레퍼런스 항체 mAb 101G5 또는 mAB 107G3 중 어느 하나의 상응하는 아미노산 서열과 상동이거나 보다 구체적으로 동일한 6개의 CDR 영역 아미노산 서열 모두를 포함하고, 여기서 이러한 기능적 변이체 항체는 상기 레퍼런스 항체의 원하는 기능적 특성을 유지한다.
레퍼런스 mAb 101G5 항체 또는 레퍼런스 항체 mAb 107G3의 기능적 변이체, 특히 본 개시내용의 단클론 항체의 맥락에서 사용되는 VL, VH 또는 CDR의 기능적 변이체는 여전히 항체가 모 항체(예: mAb 101G5 또는 107G3)의 친화도(일반적으로 표면 플라즈몬 공명(SPR) 또는 일반적으로 25℃에서 수행되는 생물층 간섭계(BLI) 기술에 기반한 Octet® 플랫폼에 의해 측정된 KD에 의해 평가됨) 및/또는 선택성의 상당한 비율(적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%)을 유지하도록 하며, 일부 경우에 본 개시내용의 이러한 단클론 항체는 모 Ab(예: mAb 101G5 또는 107G3)보다 더 큰 친화도, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다.
레퍼런스 mAb 101G5 또는 107G3 또는 본원에 개시된 상기 레퍼런스 항체의 변이체의 원하는 기능적 특성은 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다:
i. BTN2A1에 대한 특이성, 특히 세포주, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 인간 BTN2A1을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포에서 발현되는 인간 BTN2A1에 대한 보다 구체적으로 50 ㎍/mL 미만, 보다 구체적으로 40 ㎍/mL 미만의 EC50, 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR)(일반적으로 25℃에서), 또는 Luminex 분석(실시예에 예시됨) 또는 Octet®(Abdiche et al. 2008)에서 측정된 바와 같이 10 nM 이하의 KD, 및/또는 BTN2A1 결합 대 비특이적 결합에서의 친화도 비율이 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 이상인 결합 특성; 및/또는
ii. 실시예 섹션에 전형적으로 예시된 바와 같이 평가된, 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화의 억제, 및/또는
iii. 실시예 섹션에 전형적으로 예시된 바와 같이 평가된, M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀 유도; 및/또는
iv. 실시예 섹션에 일반적으로 예시된 바와 같이 평가된, NK 세포 활성화의 직접적인 유발; 및/또는
v. 실시예 섹션에 전형적으로 예시된 바와 같이 평가된, NK 세포-매개 세포독성의 향상.
일부 보다 구체적인 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 레퍼런스 mAb 107G3 또는 상기 레퍼런스 항체의 변이체의 원하는 기능적 특성은 추가로 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다:
vi. 일반적으로 실시예에 예시된 바와 같이 평가된, Vγ9/Vδ2 T 세포로부터의 세포용해 분자(예: IFNγ 또는 TNFα) 생산의 활성화,
vii. 전형적으로 실시예에 예시된 바와 같이 평가된, Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 활성화; 및/또는
viii. 일반적으로 실시예에 예시된 바와 같이 평가된, Vγ9/Vδ2 T 세포 증식의 활성화.
전형적으로, 레퍼런스 mAb 101G5 또는 107G3의 기능적 변이체의 상기 항목 (ii) 내지 (v)에 따른 기능적 특성은 상기 기재된 바와 같은 상응하는 레퍼런스 항체 mAb 101G5 또는 107G3의 상응하는 기능적 특성과 실질적으로 동일하거나 더 우수하다. 실질적으로 동일하게 본원에서 기능적 변이체는 레퍼런스 mAb 107G3의 상응하는 기능적 특성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 보유하는 것으로 의도된다.
전형적으로, 레퍼런스 mAb 107G3의 기능적 변이체의 상기 항목 (vi) 내지 (viii)에 따른 기능적 특성은 상기 기재된 바와 같은 레퍼런스 항체 mAb 107G3의 상응하는 기능적 특성과 실질적으로 동일하거나 더 우수하다. 실질적으로 동일하게 본원에서 기능적 변이체는 레퍼런스 mAb 107G3의 상응하는 기능적 특성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 보유하는 것으로 의도된다.
예를 들어, 본 개시내용은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열을 포함하는 레퍼런스 mAb 101G5의 기능적 변이체 항체에 관한 것으로, 여기서 CDR 서열, 즉, 6개의 CDR 영역; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3은 SEQ ID NO: 21-26에 정의된 바와 같은 mAb 101G5 레퍼런스 항체의 상응하는 CDR 서열에 대해 적어도 60, 70, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 상기 기능적 변이체 항체는 BTN2A에 특이적으로 결합하고, 항체는 다음의 기능적 특성 i) 내지 iv) 중 적어도 하나를 나타낸다:
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다.
바람직하게는 특성 i) 및 ii) 중 적어도 하나 및 특성 iii 및 iv) 중 적어도 하나를 나타내고, 가장 바람직하게는 특성 i)-iv)를 나타낸다.
본 개시내용은 또한 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열을 포함하는 레퍼런스 mAb 107G3의 기능적 변이체 항체에 관한 것이며, 여기서 CDR 서열, 즉, 6개의 CDR 영역; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3은 SEQ ID NO: 3-8에 정의된 바와 같은 mAb 107G3 레퍼런스 항체의 상응하는 CDR 서열에 대해 적어도 60, 70, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 공유하며, 여기서 상기 기능적 변이체 항체는 BTN2A1에 특이적으로 결합하고, 항체는 다음의 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다:
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시키며,
v. Vγ9/Vδ2 T 세포의 IFNγ 또는 TNFα의 생산을 활성화하고,
vi. Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하며,
vii. Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식을 활성화한다.
바람직하게는 상기 기능적 변이체는 기능적 활성 i) 내지 iv)(바람직하게는 적어도 활성 i 및/또는 ii, 및 iii 및/또는 iv) 및 기능적 활성 v) 내지 vii) 중 적어도 하나를 나타낸다.
이는 추가로 SEQ ID NO: 19 및 20에 각각 정의된 바와 같은 상기 mAb 101G5 레퍼런스 항체의 상응하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 80%, 90%, 또는 적어도 95, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 mAb 101G5 레퍼런스 항체의 기능적 변이체 항체에 관한 것이다; 기능적 변이체 항체는 BTN2에 특이적으로 결합하고 다음의 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다:
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다.
바람직하게는 특성 i) 및 ii) 중 적어도 하나 및 특성 iii 및 iv) 중 적어도 하나를 나타내고, 가장 바람직하게는 특성 i)-iv)를 나타낸다.
이는 추가로 SEQ ID NO: 1 및 2에 각각 정의된 바와 같은 상기 mAb 107G3 레퍼런스 항체의 상응하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 80%, 90%, 또는 적어도 95, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 mAb 107G3 레퍼런스 항체의 기능적 변이체 항체에 관한 것이다; 기능적 변이체 항체는 BTN2A에 특이적으로 결합하고 다음의 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다.
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시키며,
v. Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 세포용해 분자(IFNγ 또는 TNFα)의 생산을 활성화하고,
vi. Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하며, 및/또는,
vii. Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식을 활성화한다.
일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 기능적 활성 i) 내지 iv)(특히 적어도 활성 i 및/또는 ii, 및 iii 및/또는 iv) 및 기능적 활성 v) 내지 vii) 중 적어도 하나를 나타낸다.
일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 기능적 활성 i 내지 iv 중 하나 이상 또는 기능적 활성 v 내지 vii 중 하나 이상을 나타낸다.
전형적으로, 레퍼런스 mAb 101G5 또는 107G3의 기능적 변이체의 상기 항목 (i) 내지 (iv)에 따른 기능적 특성은 상기 기재된 상응하는 레퍼런스 항체 mAb 101G5 또는 107G3의 상응하는 기능적 특성과 실질적으로 동일하거나 더 우수하다. 실질적으로 동일하게 본원에서 기능적 변이체는 레퍼런스 mAb 107G3의 상응하는 기능적 특성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 보유하는 것으로 의도된다. .
다양한 구체예에서, 항체는 상기 논의된 원하는 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.
항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 전형적으로, 항체 또는 단백질은 인간화 항체, 보다 구체적으로 인간화 침묵 항체이다.
본원에 사용된 용어 "침묵" 항체는 표적 세포의 세포용해를 측정하는 시험관내 ADCC 활성 분석에서 측정된 바와 같이 ADCC 활성이 없거나 낮은 항체를 지칭한다.
일 구체예에서, 용어 "ADCC 활성이 없거나 낮은"은 침묵 항체가 상응하는 야생형(비침묵)에서 관찰되는 ADCC 활성의 50% 미만, 예를 들어 10% 미만의 ADCC 활성을 나타내는 것을 의미한다. 항체, 예를 들어 야생형 인간 IgG1 항체는 전형적으로, 대조군 Fab 항체와 비교하여 침묵 항체를 사용한 시험관내 ADCC 활성 분석에서는 검출가능한 ADCC 활성이 관찰되지 않는다.
침묵 효과기 기능은 항체의 Fc 불변 부분에서의 돌연변이에 의해 얻어질 수 있고 문헌에 기술되어 있다(Strohl 2009(LALA & N297A); Baudino 2008, D265A(Baudino et al., J.Immunol. 2008, Strohl, CO Biotechnology 20 2009). 침묵 IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열(EU 넘버링)의 위치 234, 235 및/또는 331에서 ADCC를 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 N297A 돌연변이를 포함하며, 이는 글리코실화 또는 비-글리코실화 항체를 생성한다.
CDR 변이체의 서열은 대부분 보존적 치환을 통해 모 항체 서열의 CDR 서열과 상이할 수 있으며; 예를 들어, 변이체에서 적어도 10개, 예를 들어 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환은 보존적 아미노산 잔기 치환이다. 본 개시내용의 맥락에서, 보존적 치환은 다음과 같이 반영된 아미노산의 클래스 내 치환에 의해 정의될 수 있다:
지방족 잔기 I, L, V 및 M
시클로알케닐 관련 잔기 F, H, W 및 Y
소수성 잔기 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y
음전하를 띤 잔기 D 및 E
극성 잔기 C, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T
양전하를 띤 잔기 H, K 및 R
작은 잔기 A, C, D, G, N, P, S, T 및 V
매우 작은 잔기 A, G 및 S
A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P 및 구조 T 순으로 관련된 잔기
유연한 잔기 Q, T, K, S, G, P, D, E 및 R
보다 보존적인 치환 그룹에는 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 포함된다. 수성/친수성 특성 및 잔기 중량/크기의 관점에서 보존은 또한 mAb 1-6 중 어느 하나의 CDR과 비교하여 변이체 CDR에서 실질적으로 유지된다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다. 아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 차례로 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등등과의 상호작용을 정의한다. 각 아미노산은 소수성 및 전하 특성을 기준으로 소수성 지수가 지정되었다: 이소루신(+4.5); 발린(+4.2); 루신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 유사한 잔기의 보유는 BLAST 프로그램(예: 표준 설정 BLOSUM62, Open Gap= ll 및 Extended Gap= 1을 사용하여 NCBI를 통해 사용 가능한 BLAST 2.2.8)을 사용하여 결정된 유사성 점수에 의해 측정될 수도 있거나 다르게 측정될 수 있다. 적합한 변이체는 전형적으로 모 펩타이드에 대해 적어도 약 80% 동일성을 나타낸다. 본 개시내용에 따르면, 제2 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열은 제1 서열이 제2 아미노산 서열과 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 또는 100% 동일성을 갖는다는 의미이다. 본 개시내용에 따르면, 제2 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열은 제1 서열이 제2 아미노산 서열과 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 또는 100% 동일성을 갖는다는 의미이다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 키메라 항체, 전형적으로 키메라 마우스/인간 항체이다. 용어 "키메라 항체"는 비인간 동물 유래 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인, 인간 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 단클론 항체를 의미한다. 비인간 동물로서는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 등의 동물이면 된다. 특히, 상기 마우스/인간 키메라 항체는 mAb 101G5 또는 mAb 107G3 레퍼런스 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 인간화 항체이다. 특정 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 mAb 101G5 또는 mAb 107G3 레퍼런스 항체 중 어느 하나의 6개의 CDR을 포함하는 인간화 항체이다. 본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 프레임워크 영역(FR)이 모 면역글로불린(예를 들어, 쥐 CDR)과 비교하여 상이한 종(예를 들어, 인간 종)의 공여자 면역글로불린으로부터의 FR을 포함하도록 프레임워크 영역(FR)이 변형된 항체를 지칭한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 Fab, F(ab')2, Fab' 및 scFv로 구성된 군에서 선택된다. 본 명세서에서 "Fab"이라는 용어는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미하며, 이때 H 쇄의 N-말단 측의 절반 정도와 L 쇄 전체는 프로테아제, 파파인을 IgG에 처리하여 얻은 단편들 중 이황화 결합을 통해 함께 결합된다. "F(ab')2"라는 용어는 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭하며, 프로테아제, 펩신을 IgG에 처리하여 얻은 단편 중 힌지 영역의 이황화 결합을 통해 결합된 Fab 보다 약간 더 크다. "Fab'"이라는 용어는 F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합을 절단하여 얻어지는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭한다. 단일 쇄 Fv("scFv") 폴리펩타이드는 공유결합된 VH:VL 이종이량체이며, 이는 일반적으로 펩타이드 인코딩 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 인코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현된다. 본 개시내용의 인간 scFv 단편은 전형적으로 유전자 재조합 기술을 사용함으로써 적절한 형태로 유지되는 CDR을 포함한다.
돌연변이 아미노산 서열을 갖는 기능적 변이체 항체는 코딩 핵산 분자의 돌연변이유발(예를 들어, 부위 지향적 또는 PCR 매개 돌연변이유발)에 의해 수득될 수 있고, 이어서 본원에 기술된 기능적 분석을 사용하여 유지된 기능(즉, 상기에서 제시된 기능)에 대해 코딩된 변경된 항체를 검사할 수 있다.
레퍼런스 101G5 또는 107G3 mAbs와 교차-경쟁하는 항체
본원에 개시된 바와 같은 레퍼런스 mAb 101G5 또는 레퍼런스 mAb 107G3의 유사한 유리한 특성을 갖는 추가 항체는 통계적으로 유의한 방식으로, 표준 BTN2A1 결합 분석에서 상기 기재된 바와 같은 상기 레퍼런스mAb 107G3와 교차-경쟁하는(예를 들어, 이들의 결합을 경쟁적으로 억제하는) 이들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다.
시험 항체는 예를 들어 파지 디스플레이 기술을 사용하는 인간 재조합 항체 라이브러리에서 또는 실시예에서 일반적으로 평가된 바와 같이 BTN2A1 항원으로 면역화된 인간 가변 영역 항체를 발현하는 형질전환 마우스로부터 BTN2A1에 대한 결합 친화도에 대해 먼저 스크리닝할 수 있다(재료 및 방법 섹션 참조).
또 다른 구체예에서, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같이 적어도 레퍼런스 mAb 107G3 또는 레퍼런스 mAb 101G5와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 실시예 섹션에서 예시된 바와 같이, 레퍼런스 mAb 101G5 및 107G3은 BTN2A1의 동일한 에피토프에 결합하지 않는다.
인간 BTN2A1에 대한 본 개시내용의 항체와 교차-경쟁하거나 그의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 인간 BTN2A1에 대한 결합에 대해 그 항체와 경쟁할 수 있음을 입증한다; 이러한 항체는 비제한적인 이론에 따라 그것이 경쟁하는 항체와 동일하거나 관련된(예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 인간 BTN2A1 에피토프에 결합할 수 있다.
예를 들어, 다음 시험은 mAb 107G3 레퍼런스 항체와 교차-경쟁하는 능력에 대해 항-BTN2A1 항체를 스크리닝하고 및/또는 상기 레퍼런스 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 능력에 대해 항-BTN2A1 항체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있다: 인간 BTN2A1(전형적으로 실시예에 기재된 바와 같은 HEK293T)로 형질감염된 BTN2KO 세포는 레퍼런스 항체 mAb 107G3의 포화 농도(예를 들어, 10 ㎍/mL)로 염색될 수 있다. 그런 다음 시험 항-BTN2A1 mAb의 상이한 용량들이 mAb 107G3 레퍼런스 항체와의 경쟁 가능성에 대해 검사될 수 있다. 레퍼런스 항체와 경쟁하는 mAb는 이러한 레퍼런스 항체의 존재 하에서 BTN2A1을 인식할 수 없다. 데이터는 평균 형광 강도로 표현될 수 있다. 대안으로, 경쟁 분석은 실시예 섹션에서 기술된 바와 같이 비닝 분석에서 수행될 수 있다. 일반적으로 비닝 실험은 재조합 인간 BTN2A1을 바이오센서에 고정하고 레퍼런스 항체와 경쟁 항체를 차례로 제시하여 수행할 수 있다.
선택된 항체는 특히 이전에 설명된 바와 같이 mAb 101G5 또는 mAb 107G3의 유리한 특성에 대해 추가로 검사될 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 개시내용은 BTN2A1에 대한 결합으로부터 레퍼런스 mAb 101G5 또는 레퍼런스 mAb 107G3에 대한 결합에 대해 경쟁하는 분리된 항체를 제공하되, 상기 항체는,
i. BTN2A1에 대해 특이성을 가지며, 특히 이는 세포주, 예를 들어 실시예에서 기재된 바와 같이 인간 BTN2A1로 형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포에서 발현된 인간 BTN2A1에 보다 구체적으로 50 ㎍/mL 미만 및 보다 구체적으로 40 ㎍/mL 미만의 EC50로, 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 또는 Luminex 분석(실시예에 예시됨) 또는 Octet® 분석에 의해 측정된 KD가 10 nM 이하로 결합하고, 및/또는 BTN2A1 결합 친화도 대 비특이적 결합의 약 10 :1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 또는 그 이상의 비율을 가지며(보다 자세한 사항은 상기 참조); 및/또는
ii. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
iii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iv. 직접적인 NK 세포 활성화를 유발하고,
v. NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다.
대안으로, 또는 추가로, 상기 항체는
vi. 일반적으로 실시예에 예시된 바와 같이 평가된 Vγ9/Vδ2 T 세포에 의한 세포용해 분자(예: IFNγ 또는 TNFα)의 생산을 활성화하고; 및/또는
vii. 일반적으로 실시예에 예시된 바와 같이 평가된, Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하며; 및/또는
보다 구체적으로 이러한 구체예에서, 상기 항체는 BTN3과 교차-반응하지 않는다.
일반적으로, 레퍼런스 mAb 101G5 또는 107G3과 BTN2A1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체의 상기 (iii) 내지 (v)에 따른 기능적 특성은 상술한 바와 같이 다음과 같은 레퍼런스 항체 mAb 101G5 또는 107G3의 상응하는 기능적 특성과 실질적으로 동일하거나 더 우수하다. 실질적으로 동등하게 본원에서 기능적 변이체는 레퍼런스 mAb 101G5 또는 mAb 107G3의 상응하는 기능적 특성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 유지하는 것으로 의도된다.
전형적으로, 본 개시내용에 따른 레퍼런스 mAb 107G3과 BTN2A1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체는 여전히 적어도 상당한 비율(적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%)의 레퍼런스 항체(예: mAb 107G3)의 친화도 및/또는 선택성을 보유하며, 일부 경우에 레퍼런스 항체(예: mAb 107G3)보다 더 큰 친화도, 선택성 및/또는 특이성과 관련될 수 있다.
특정 구체예에서, 레퍼런스 mAb 101G5 또는 107G3과 BTN2A1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 교차-차단 항체 또는 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 재조합 항체이다.
단클론 항체를 생산하는 형질감염종의 생성
본 개시내용의 항체는 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기술과 같은 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 단독으로 또는 조합하여 생산된다. 전형적으로, 원하는 서열의 아미노산 서열을 알면, 당업자는 폴리펩타이드 생산을 위한 표준 기술에 의해 상기 항체를 용이하게 생산할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 펩타이드 합성 장치(예: Applied Biosystems, Foster City, California)를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 잘 알려진 고체상 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 대안으로, 본 개시내용의 항체는 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 항체를 인코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터에 통합하고 이러한 벡터를 원하는 항체를 발현할 적절한 진핵 또는 원핵 숙주에 도입한 후 항체를 DNA 발현 산물로 얻을 수 있으며, 이 숙주로부터 나중에 잘 알려진 기술을 사용하여 분리할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 추가의 목적은 본원에 개시된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로 핵산 분자는 본 개시내용의 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 보다 구체적으로, 핵산 분자는 레퍼런스 항체 mAb 107G3 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역(VH 영역) 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 코딩하는 상응하는 핵산에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 VH 또는 VL 코딩 영역을 포함한다.
전형적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다. 본원에 사용된 용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 DNA 또는 RNA 서열(예: 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입되어 숙주를 형질전환하고 도입된 서열의 (예를 들어, 전사 및 번역) 발현을 촉진할 수 있는 비히클을 의미한다. 따라서, 본 개시내용의 추가의 목적은 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 포함하여 대상체에 투여시 상기 항체의 발현을 유발하거나 지시할 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서, 면역글로불린 H 쇄의 프로모터 및 인핸서 등을 포함한다. 인간 항체 C 영역을 코딩하는 유전자가 삽입되어 발현될 수 있는 한, 동물 세포에 대한 어떠한 발현 벡터도 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 베타 d2-4 등을 포함한다. 플라스미드의 다른 예는 복제 기점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 예를 들어 pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 통합 플라스미드를 포함한다. 바이러스 벡터의 다른 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 패키징 세포를 형질감염시키거나 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 사용한 일시적 형질감염과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 생산할 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 대표적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등이 있다. 이러한 복제-결함 재조합 바이러스를 생성하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어 WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 84/1947에서 찾을 수 있다.
본 개시내용의 추가의 목적은 상기 기재된 바와 같은 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 "외래"(즉, 외부 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 일반적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생성하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다.
본 명세서에 개시된 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 개시내용의 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. "발현 시스템"이라는 용어는 예를 들어 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현에 적당한 조건 하에서 숙주세포 및 호환되는 벡터를 의미한다. 일반적인 발현 시스템에는 대장균 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 배큘로바이러스 벡터, 포유동물 숙주 세포 및 벡터가 포함된다. 숙주 세포의 다른 예는 제한 없이 원핵 세포(예: 박테리아) 및 진핵 세포(예: 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함한다. 특정 예에는 대장균, 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예: HEK-293 세포, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등) 및 1차 또는 확립된 포유동물 세포 배양물(예: 림프모세포, 섬유아세포, 배아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포 등에서 생산)이 포함된다. 예로는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(이하 "DHFR 유전자"라 함)가 결손된 CHO 세포(Urlaub G et al; 1980), 랫트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 이하 "YB2/0 세포"라 함) 등이 포함된다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 시험관내 또는 생체외에서 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 또는 벡터를 컴피턴트 숙주 세포로 도입하는 단계: (ii) 수득된 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하는 단계, (iii) 선택적으로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 이러한 재조합 숙주 세포를 사용하여 본 개시내용의 항체를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 인간 키메라 항체는 앞서 기재된 바와 같이 VL 및 VH 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 그들을 삽입하여 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 및 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 코딩 서열을 발현시켜 생성될 수 있다. 인간 키메라 항체의 CH 도메인은 인간 면역글로불린에 속하는 임의의 영역일 수 있으나, IgG 클래스의 것이 적합하고, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 IgG 클래스에 속하는 서브클래스 중 임의의 하나가 사용될 수 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL은 Ig에 속하는 임의의 영역일 수 있으며, 카파(kappa) 클래스 또는 람다(lambda) 클래스의 것을 사용할 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 통상적인 재조합 DNA를 포함하며, 유전자 형질감염 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Morrison SL. et al.(1984) 및 특허 문헌 US 5,202,238; 및 US 5,204,244 참조).
본 개시내용의 인간화 항체는 앞서 기술한 바와 같이 CDR 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, (i) 인간 항체와 동일한 중쇄 불변 영역 및 중쇄 가변 프레임워크 영역 및 (ii) 인간 항체와 동일한 경쇄 불변 영역 및 경쇄 가변 프레임워크 영역을 코딩하는 유전자를 갖는 발현 벡터에 그들을 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 발현 벡터를 적절한 세포주에 도입하여 유전자를 발현시켜 생성될 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터는 항체 중쇄를 코딩하는 유전자와 항체 경쇄를 코딩하는 유전자가 별도의 벡터에 존재하는 유형 또는 두 유전자가 동일한 벡터 상에 존재하는 유형(탠덤형)일 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 세포주 내로의 도입 용이성, 세포주 내 항체 H 및 L 쇄의 발현량의 균형의 관점에서, 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터가 바람직하다. 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터의 예는 pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18 등을 포함한다.
통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술에 기초한 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985 참조). 항체는 예를 들어 CDR-그래프팅(EP 239,400; PCT 공개 WO91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), (EP 239,400; PCT 공개 WO91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 축성 또는 재포장(EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA(1991); Studnicka GM et al.(1994); Roguska MA. et al.(1994)), 및 체인 셔플링(미국 특허 번호 5,565,332)을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 이러한 항체의 제조를 위한 일반적인 재조합 DNA 기술도 알려져 있다(유럽 특허 출원 EP 125023 및 국제 특허 출원 WO 96/02576 참조).
본 발명의 Fab는 AMH와 특이적으로 반응하는 항체에 프로테아제인 파파인을 처리하여 얻을 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵생물 발현 시스템용 벡터 또는 진핵생물 발현 시스템용 벡터에 삽입하고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물(적절한 경우)에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 본 발명의 F(ab')2는 AMH와 특이적으로 반응하는 항체에 프로테아제인 펩신을 처리하여 얻을 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 후술하는 Fab'를 결합함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 Fab'는 AMH와 특이적으로 반응하는 F(ab')2에 환원제인 디티오트레이톨을 처리하여 얻을 수 있다. 또한, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물(적절한 경우)에 도입하여 발현함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 scFv는 전술한 바와 같이 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 cDNA를 수득하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현벡터 또는 진핵생물용 발현벡터에 삽입하여 scFv를 코딩하는 DNA를 구축한 후, 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물(적절한 경우)에 도입하여 scFv를 발현시켜 생산될 수 있다.
인간화 scFv 단편을 생성하기 위해, 공여자 scFv 단편으로부터 상보적 결정 영역(CDR)을 선택하고, 이를 공지된 3차원 구조의 인간 scFv 단편 프레임워크에 이식하는 것을 포함하는 CDR 이식이라고 하는 잘 알려진 기술을 사용할 수 있다(예를 들어, WO 98/45322, WO 87/02671, US5,859,205, US5,585,089, US4,816,567, EP0173494 참조).
본 개시내용의 조작된 항체는 예를 들어, 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것을 추가로 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그들의 생식계열 구성으로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 생식계열 서열로 "역돌연변이"될 수 있다. 이러한 "역돌연변이된" 항체는 또한 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도된다. 또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이 접근법은 "탈면역화"라고도 하며 Carr 등의 미국 특허 공개 번호 20030153043에 더 자세히 설명되어 있다.
Fc 공학
본원에 개시된 바와 같은 항체는 상기 기재된 측면의 기능적 또는 구조적 특징 중 하나 이상, 또는 선택된 기능적 및 구조적 특징의 임의의 조합을 특징으로 할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 임의의 이소타입일 수 있다. 이소타입의 선택은 일반적으로 ADCC 침묵과 같은 원하는 효과기 기능에 따라 결정된다. 예시적인 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다 중 하나를 사용할 수 있다. 원하는 경우, 본 개시내용의 항체의 클래스는 공지된 방법에 의해 전환될 수 있다. 전형적인 클래스 스위칭 기술은 하나의 IgG 서브클래스를 다른 서브클래스로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 변환하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 효과기 기능은 다양한 치료 용도를 위한 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로의 이소타입 전환에 의해 변경될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 전장 항체는 IgG1 항체이다. 일부 구체예에서, 전장 항체는 IgG4 항체이다. 일부 구체예에서, BTN2A 특이적 IgG4 항체는 안정화된 IgG4 항체이다. 적합한 안정화된 IgG4 항체의 예는 상기 Kabat 등에서와 같이 EU 지수에 표시된 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역에서 위치 409에 있는 아르기닌이 리신, 트레오닌, 메티오닌 또는 루신, 일반적으로 리신(WO2006033386에 기술됨)으로 치환되고, 및/또는 힌지 영역은 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다. 다른 적합한 안정화된 IgG4 항체는 WO2008145142에 개시되어 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 유도하는 Fc 부분을 포함하지 않는다. 용어 "Fc 도메인", "Fc 부분" 및 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 C-말단 단편, 예를 들어 인간 감마 중쇄의 약 아미노산 (aa) 230 내지 약 aa 450 또는 다른 유형의 항체 중쇄의 대응 서열(예: 인간 항체의 경우 α, δ, ε 및 μ), 또는 이의 자연 발생 알로타입을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 면역글로불린에 대해 일반적으로 허용되는 Kabat 아미노산 넘버링이 본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된다(Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD 참조). 일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 FcgRIIIA(CD16) 폴리펩타이드에 실질적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 Fc 도메인이 결여되거나(예를 들어, CH2 및/또는 CH3 도메인이 결핍됨), 또는 IgG2 또는 IgG4 이소타입의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 디아바디, 단일쇄 항체 단편, 또는 다수의 상이한 항체 단편을 포함하는 다중특이적 항체로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 독성 모이어티에 연결되지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 항체가 변경된 C2q 결합 및/또는 감소 또는 폐지된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551에 더 자세히 설명되어 있다.
본원에서 고려되는 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는 예를 들어 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해 항체 또는 이의 단편은 일반적으로 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응한다. 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 임의의 PEG 형태를 포함하는 것으로 의도된다. . 일부 구체예에서, 페길화될 항체는 비-글리코실화 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어 Nishimura et al.의 EP 0154 316 및 EP 0 401 384(Ishikawa et al.)을 참조할 것.
본원에서 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성된 분자의 반감기를 증가시키기 위한 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편에 대한 본 개시내용의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 컨쥬게이트 또는 단백질 융합체이다.
일부 구체예에서, 본 개시내용은 또한 다중특이적 항체를 제공한다. 본 개시내용의 다중특이적 항체 분자에 대한 예시적인 포맷은 (i) 화학적 헤테로컨쥬게이션에 의해 가교결합된 2개의 항체, 즉 하나는 BTN2A에 대한 특이성을 갖고 다른 하나는 제2 항원에 대한 특이성을 갖는 것; (ii) 2개의 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 단일 항체; (iii) 2개의 상이한 항원-결합 영역, 예를 들어 추가 펩타이드 링커에 의해 탠덤으로 연결된 2개의 scFv를 포함하는 단일쇄 항체; (iv) 이원 가변 도메인 항체(DVD-Ig), 여기서 각 경쇄 및 중쇄는 짧은 펩타이드 연결을 통해 나란히 두 개의 가변 도메인을 포함한다(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg 2010); (v) 화학적으로 연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (vi) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일쇄 디아바디의 융합인 Tandab; (vii) scFv와 디아바디의 조합으로 다가 분자를 생성하는 플렉시바디(flexibody); (viii) 단백질 키나제 A의 "이량체화 및 도킹 도메인"을 기반으로 하는 소위 "도킹 및 잠금" 분자로, Fab에 적용될 때, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가의 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있다; (ix) 예를 들어 인간 Fab-암(arm)의 양쪽 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온 분자; 및 (x) 디아바디. 이중특이성 항체에 대한 또 다른 예시적인 포맷은 이종이량체화를 강제하는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자이다. 이러한 분자는 공지된 기술, 예를 들어 Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knob-into-Hole(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기 정합(Amgen), LUZ-Y(Genentech), Strand Exchange Engineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono), Biclonic(Merus) 및 DuoBody(Genmab A/S) 기술로 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 전형적으로 듀오바디 기술을 사용하여 제어된 Fab-암 교환을 통해 수득되거나 수득가능하다. 제어된 Fab-암 교환에 의해 이중특이적 항체를 생산하는 시험관내 방법은 WO2008119353 및 WO 2011131746(둘 모두 Genmab A/S에 의해)에 기술되어 있다. WO 2008119353에 기재된 하나의 예시적인 방법에서, 이중특이적 항체는 환원 조건에서 배양 시 둘 다 IgG4-유사 CH3 영역을 포함하는 2개의 단일특이적 항체 사이의 "Fab-암" 또는 "반분자" 교환(중쇄 및 부착된 경쇄의 교환)에 의해 형성된다. 생성된 산물은 상이한 서열을 포함할 수 있는 2개의 Fab 암을 갖는 이중특이적 항체이다. WO 2011131746에 기재된 다른 예시적인 방법에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기서 제1 및 제2 항체 중 적어도 하나는 본 개시내용의 항체이다: a) 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 제1 항체를 제공하되, 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 단계; b) 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계; 여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용 각각보다 더 강하도록 하고; c) 환원 조건 하에 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 d) 상기 이중특이적 항체를 수득하는 단계로서, 여기서 제1 항체는 본 개시내용의 항체이고 제2 항체는 상이한 결합 특이성을 가지며, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 환원 조건은, 예를 들어 환원제, 예를 들어, 2-메르캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로부터 선택된 환원제를 첨가함으로써 제공될 수 있다. 단계 d)는 예를 들어 환원제의 제거, 예를 들어 탈염에 의해 비환원 또는 덜 환원이 되도록 조건을 복원하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며, 소수의 상당히 보수적인 비대칭 돌연변이만을 포함하여, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용 각각보다 더 강하도록 한다. 이들 상호작용 및 이들이 달성될 수 있는 방법에 대한 더 자세한 내용은 WO 2011131746에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 다음은 이러한 비대칭 돌연변이의 조합의 예시적인 구체예이며, 선택적으로 하나 또는 둘 모두의 Fc-영역은 IgG1 이소타입의 것이다.
따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 항-BTN2A 항체를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체(또한 이중특이적 또는 다중특이적 분자로도 명명됨)를 제안한다. 따라서, 본 개시내용은 BTN2A에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 항체의 하나의 항원-결합 부분 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 이중특이적 분자는 적어도 다음을 포함하는 하나의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
- SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO:25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO:26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
일 구체예에서, 이중특이적 분자는 BTN3에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 보다 구체적으로 이중특이적 분자는 BTN3A에 특이적으로 결합하고 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하는 항-BTN3A 활성화 항체의 항원 결합 부분을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 이중특이적 분자가 다중특이적인 구체예의 경우, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 외에 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 하나의 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 유니바디 또는 단일쇄 Fv를 비롯한 이의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Ladner et al. 미국 특허 번호 4,946,778에 기술된 바와 같은 Fv 또는 단일쇄 구조물과 같은 임의의 최소 단편일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메라 및 인간화 단클론 항체이다.
약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화된, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 상기 기재된 바와 같은 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체 중 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 약학 조성물은 또한 병용 요법으로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 전형적으로 적어도 하나의 항바이러스제, 항염증제 또는 다른 항증식제와 조합될 수 있다. 병용 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예는 다음의 본 개시내용의 항체의 용도에 관한 섹션에서 보다 상세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 양립가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예: 주사 또는 주입)에 적합해야 한다. 일 구체예에서, 담체는 피하 경로에 적합해야 한다.
투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 섭생은 자연적으로 치료할 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 다르다.
본 개시내용의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제제화될 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 개시내용의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이러한 분자는 예컨대, 다양한 장애를 치료, 예방 또는 진단하기 위해 시험관내, 생체외 또는 생체내에서, 또는 대상체에서, 예를 들어 생체내에서 배양된 세포에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 항체는 표현형, 사이토카인 분비 및/또는 T-세포 억제 특성의 관점에서 단핵세포의 전-종양 M2 대식세포로의 분화를 억제하는 항-BTN2A1 항체이다.
대안으로 또는 바람직하게는 추가로, 본 개시내용의 항체는 NK 세포의 세포막에서 BTN2A(특히 BTN2A1)에 직접 결합하고 암세포에 대한 이들의 활성화 및 세포독성을 유발한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능, 사이토카인 생성 및 증식을 추가로 활성화할 수 있다.
이에 의해 현재 개시된 항체는 암 환자 및 만성 감염 동안 관찰되는 면역억제 기전을 극복하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체는 종양 환경의 면역억제 효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 항-BTN2A 항체는 또한 종양 미세환경(M1 분극화 및/또는 M2 억제를 통해) 및 NK 세포 구획에 직접 작용함으로써 NK 및/또는 Th1 세포 둘 모두의 세포독성 효과를 강화할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 107G3 항체 및 그의 변이체)는 세포용해 기능, 사이토카인 생성 및 Vγ9/Vδ2 T 세포의 증식을 추가로 활성화시킨다. 따라서 이러한 항체는 면역의 3가지 세포 구획인 NK 세포, 대식세포 및 γδT 세포와 함께 작용할 가능성이 있으므로 암 치료, 특히 고형 종양 치료를 위한 강력한 도구를 나타낸다.
전임상 연구는 NK 세포가 골수 계통의 백혈병 세포를 죽일 수 있다는 것을 확고하게 입증하였다. 그러나 예를 들어 CML에서 NK 세포는 질병 진행에 따라 수가 감소하고 자극에 덜 반응하며 감소된 세포용해 활성을 나타낸다. AML에서 NK 세포의 더 높은 세포용해 활성은 진단과 관해 모두에서 환자의 더 나은 장기적 결과를 예측한다(Carlsten M, Jaras M. Natural Killer Cells in Myeloid Malignancies: Immune Surveillance, NK Cell Dysfunction, and Pharmacological Opportunities to Bolster the Endogenous NK Cells Front Immunol. 2019). 따라서, 일부 구체예에서, NK 세포 활성화 특성을 나타내는 본 발명의 항체는 NK 세포 기능을 회복하고및/또는 그의 세포독성을 유발하거나 개선하기 위해 입양 전달된 NK 세포 요법과 같은 NK 세포 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 특히, 본 출원의 항체는 일반적으로 NK 세포 살해에 내성이 있는 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "암", "과증식성" 및 "신생물"은 자율적 성장 능력을 갖는 세포, 즉 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 조건을 지칭한다. 과증식성 및 신생물성 질환 상태는 병리적, 즉 질환 상태를 특징짓거나 구성하는 것으로 분류될 수 있거나, 또는 비-병리적, 즉 정상으로부터의 편차이지만 질환 상태와 관련되지 않은 것으로 분류될 수 있다. 이 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다.
"암" 또는 "신생물"이라는 용어에는 폐, 유방, 갑상선, 림프계, 위장관 및 비뇨 생식기 기관에 영향을 미치는 것과 같은 다양한 기관계의 악성 종양 뿐만 아니라 대부분의 대장암, 폐, 피부 또는 질의 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 전립선 암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포 암종, 폐의 소세포 암종, 자궁내막 암종, 난소 암종, 자궁경부 선암종, 췌장암, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암종, 보다 보다 일반적으로 상기 암을 앓고 있는 대상체에서 γδT 세포의 활성화 및/또는 증식의 생체내 자극에 의해 치료될 수 있는 임의의 암이 포함된다.
암의 예에는 혈액 악성종양, 예를 들어 B-세포 림프성 신생물, T-세포 림프성 신생물, 비호지킨 림프종(NHL), B-NHL, T-NHL, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 외투 세포 림프종(MCL), NK-세포 림프성 신생물 및 급성 골수성 백혈병을 포함한 골수성 세포 계통 신생물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
비-혈액암의 예에는 대장암, 유방암, 폐암, 난소암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 방광암, 결장직장암, 골암, 자궁경부암, 간암, 구강암, 식도암, 갑상선암, 신장암, 위암, 고환암 및 피부암이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
만성 감염의 예에는 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균 감염, 예를 들어 만성 간염, 폐 감염, 하기도 감염, 기관지염, 인플루엔자, 폐렴 및 성병이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 개시된 장애 중 하나를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 개시된 바와 같은 항-BTN2A1 항체의 치료적 유효량을 포함한다.
상기에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 항체는 단독 유효성분으로서 또는 예컨대 보조제로서 또는 조합하여 다른 약물, 예를 들어 사이토카인, 항바이러스제, 항염증제 또는 세포독성제, 항증식제, 화학요법 또는 항종양제, 예를 들어, 상기에서 언급한 질환의 치료 또는 예방을 위한 세포 치료제(예: γδT 세포 조성물 또는 NK 세포 조성물)와 함께 투여될 수 있다.
예를 들어, 상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 항체는 세포 요법, 특히 γδT 세포 요법, NK 세포 요법, 화학요법, 항종양제 또는 면역요법제와 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 요법"은 이를 필요로 하는 대상체에게 적어도 치료적 유효량의 세포 조성물을 생체내 투여하는 것을 포함하는 요법을 지칭한다. 환자에게 투여된 세포는 동종 또는 자가일 수 있다. 용어 "γδT 세포 요법"은 세포 조성물이 유효성분으로서 γδT 세포, 특히 Vγ9/Vδ2 T 세포(예: 입양 γδT 세포 전달 또는 키메라 항원 수용체-발현 γδT 세포)를 포함하는 세포 요법을 지칭한다. "NK 세포 요법"이라는 용어는 세포 조성물이 유효성분으로서 입양 NK 세포 전달 또는 키메라 항원 수용체-발현 NK 세포(CAR-NK)와 같은 NK 세포를 포함하는 세포 요법을 지칭한다.
세포 치료제(cell therapy product)는 치료 목적으로 상기 환자에게 투여되는 세포 조성물을 지칭한다. 상기 세포 치료제는 치료적으로 효율적인 용량의 세포 및 선택적으로 추가 부형제, 보조제 또는 기타 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
적절한 항신생물제는 알킬화제(예: 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 니트로우레아, 테모졸로미드), 안트라사이클린(예: 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신), 탁산류(예: 파클리탁셀, 도세탁셀), 에포틸론, 토포이소머라제 I 억제제(예: 이리노테칸 또는 토포테칸), 토포이소머라제 II 억제제(예: 에토포사이드, 테니포사이드 또는 타플루포사이드), 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체(예: 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 플루로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트 또는 티오구아닌), 펩타이드 항생제(예: 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴), 레티노이드(예: 트레티노인, 알리트레티노인, 벡사로텐), 빈카 알칼로이드 및 유도체(예: 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 키나제 억제제와 같은 표적 치료제(예: 이브루티닙, 이델라리십, 엘로티닙, 제피티닙, 이마티닙, 베무라페닙, 비스모데깁), 프로테아좀 억제제(예: 보르테조밉, 카르필조밉), 히스톤 데아세틸라제 억제제(예: 보리노스탯 또는 로미뎁신)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
면역치료제의 예에는 인산항원(예: 졸레드론산 또는 기타 비스포스포네이트), 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체 및 사이토카인(예: 인터루킨 2(IL-2)(Choudhry H et al. 2018, Biomed Res Int.), 인터루킨 15(IL-15)(Patidar M et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2016), 인터루킨 21(IL-21)(Caccamo N. et al. PLoS One 2012), 또는 인터루킨 33(IL-33)(Duault C et al. J Immunol. 2016), 또는 이들의 재조합 형태 및 이들의 유도체, 또는 림프구 활성(예: 증식 또는 사이토카인 생산 또는 대사 변화)을 유도할 수 있는 임의의 사이토카인이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 유도체라는 용어는 페길화(예: 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬에 대한 접합), 아미노산 결실, 치환 또는 삽입과 같은 돌연변이, 또는 강화제(IgG1 Fc에 융합된 IL15/IL15Ra 복합체, 여기서 IL-15가 추가로 돌연변이되어(asn72asp) 이 복합체를 IL-2 및 IL-15Rα 초작용제로 만드는 생물학적 활성을 추가로 증가시킨다)와의 연관에 의존할 수 있는 임의의 사이토카인 변형에 대해 사용된다(Rhode PR et al, Cancer Immunol Res. 2016)(Barroso-Sousa R et al, Curr Oncol Rep. 2018).
"IL-2"라는 용어는 일반적인 의미를 가지며 인간 인터루킨-2를 지칭한다. IL-2는 주로 IL-2 수용체에 결합하여 림프구 활성을 조절한다.
"L-15"라는 용어는 일반적인 의미를 가지며 인간 인터루킨-15를 지칭한다. IL-2와 마찬가지로 IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬(CD122)과 공통 감마 사슬(감마-C, CD132)로 구성된 복합체에 결합하고 이를 통해 신호를 보낸다. IL-15는 T 세포와 자연 살해(NK) 세포의 활성화와 증식을 조절한다.
"IL-21"이라는 용어는 일반적인 의미를 가지며 인간 인터루킨-21을 지칭한다. IL-21은 NK 세포 및 CD8+T 세포의 세포독성 향상, 형질 세포 분화 조절 및 Treg 세포 억제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다면발현성의 특성이 있다.
"IL-33"이라는 용어는 일반적인 의미를 가지며 인간 인터루킨-33을 지칭한다. IL-33은 조직 스트레스 또는 손상 시 방출되는 알람민으로 간주되며 IL-1 계열의 구성원이며 ST2 수용체에 결합한다. IL-33은 TH1 면역 세포, 자연 살해(NK) 세포, iNKT 세포 및 CD8 T 림프구의 효과적인 자극제로 알려져 있다.
용어 "PD-1"은 당업계에서 일반적인 의미를 가지며 programmed death-1 receptor를 지칭한다. 용어 "PD-1"은 또한 CD28, 세포독성 T-림프구 관련 항원 4(CTLA-4), 유도성 보조자극제(ICOS), 및 B- 및 T-림프구 감쇠기(BTLA)를 포함하는 수용체의 CD28-B7 신호전달 패밀리에 속하는 타입 I 막횡단 단백질을 지칭한다(Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et al. 2005).
용어 "항-PD-1 항체" 또는 "항-PD-L1"은 당업계에서 일반적인 의미를 가지며 각각 PD-1 또는 PD-L1에 대한 결합 친화도 및 PD-1에 대한 길항제 활성을 갖는 항체를 지칭한다. 즉, PD-1과 관련된 신호 전달 캐스케이드를 억제하고 PD-1 리간드 결합(PD-L1; PD-L2)을 억제한다. 이러한 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체는 수용체의 CD28-B7 신호전달 패밀리(CD28; CTLA-4; ICOS; BTLA)의 다른 아형 또는 이소폼과의 상호작용보다 각각 더 큰 친화도 및 효능으로 PD-1을 우선적으로 불활성화시킨다. 화합물이 PD-1 길항제인지 여부를 결정하기 위한 검사 및 분석은 Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005에 기술된 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
이러한 항-PD1 항체의 예는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 세미플리맙 또는 아테졸리주맙을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
전술한 바에 따르면, 본 개시내용은 또 다른 양태에서 다음을 제공한다:
치료적 유효량의 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체 및 적어도 하나의 제2 약물을 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 공동-투여하는 것을 포함하되, 상기 제2 약물은 항-바이러스제 또는 항-증식제 또는 면역치료제 또는 사이토카인 또는 예를 들어 상기 표시된 대로 세포 치료제(예: γδ T 세포)인 방법.
일 구체예에서, 본 개시내용의 항체를 사용하여 가용성 BTN2A1의 수준, 또는 BTN2A1을 발현하는 세포의 수준을 검출할 수 있다. 이것은 예를 들어, 항체와 BTN2A1 사이에 복합체가 형성될 수 있는 조건에서 샘플(예: 시험관내 샘플)과 대조군 샘플을 항-BTN2A1 항체와 접촉시킴으로써 달성할 수 있다(세포의 표면 또는 가용성 BTN2A1, 예를 들어 혈액 샘플). 항체와 BTN2A1 사이에 형성된 모든 복합체는 샘플과 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, ELISA 및 유세포 분석과 같은 당업계에 잘 알려진 표준 검출 방법은 본 개시내용의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 항체 또는 이의 일부와 BTN2A1 사이에 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에 BTN2A1에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체 또는 단백질, 또는 이의 항원 결합 영역과 샘플 및 대조군 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 샘플에서 BTN2A1(예를 들어, 인간 BTN2A1 항원)의 존재를 검출하거나 BTN2A1의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공한다. 그런 다음 복합체의 형성이 검출되며, 여기서 대조군 샘플과 비교한 샘플 간의 복합체 형성의 차이는 샘플에서 BTN2A1의 존재를 나타낸다.
또한 본 개시내용의 범위 내에 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 인간화 항체, 접합 항체 및 다중특이적 분자) 및 사용 설명서로 구성된 키트가 있다. 키트는 하나 이상의 추가 시약, 또는 하나 이상의 추가 항체 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 키트에는 일반적으로 키트 내용물의 용도를 나타내는 라벨이 포함되어 있다. 용어, 라벨은 키트에 또는 키트와 함께 제공되거나 키트와 함께 제공되는 모든 기록 또는 녹음된 자료가 포함된다. 키트는 환자가 상기 정의된 바와 같이 항-BTN2A1 항체 치료에 반응할 그룹에 속하는지 여부를 진단하기 위한 도구를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 치료 전략은 인간 대상체의 샘플로부터 분리된 NK 세포를 선택적으로 활성화하는 작용제로서 본원에 개시된 인간화 항체의 사용에 기초한다.
따라서, 본 개시내용은
(a) 대상체의 혈액 샘플로부터 NK 세포, 예를 들어 PBMC를 포함하는 혈액 세포를 분리하는 단계,
(b) 본원에 개시된 항-BTN2A1 및 선택적으로, 다른 종양 또는 부속 세포의 존재 하에서 시험관내에서 NK 세포를 확장시키는 단계,
(c) 확장된 NK 세포를 수집하는 단계, 및
(d) 선택적으로, 확장된 NK 세포를 제형화하고 상기 NK 세포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는
이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 키메라 항원 수용체 (CAR) NK 세포를 선택적으로 활성화시키는 작용제로서 본원에 개시된 인간화 항체의 용도에 관한 것이다. CAR NK 세포 및 입양 NK 세포 암 면역요법에서의 사용은 예를 들어 Rezvani, K et al. ("adoptive cell therapy using engineered natural killer cells"(Bone Marrow Transplant 2019)에 기술되어 있다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는, 전형적으로 암을 앓고 있는 대상체에서 NK 세포 요법의 강화제로서 생체내 사용을 위한 본원에 개시된 바와 같은 항-BTN2A1 항체에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 NK 세포 요법은 적어도 유효량의 NK 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 요법을 지칭한다. 그러한 NK 세포는 동종 또는 자가일 수 있다. 특정 구체예에서, NK 세포는 특정 유전자의 결실 또는 녹아웃 또는 삽입 또는 녹인에 의해 유전적으로 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 NK 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK 세포를 포함한다. NK 세포는 생체 외에서 확장 및/또는 정제되었을 수 있다. 대안으로, NK 세포는 또한 다른 혈액 세포, 및 예를 들어 면역계의 다른 세포를 포함하는 세포 조성물에 포함될 수 있다. γδT 세포 요법에 대한 참고 문헌은 Rezvani, K. Bone Marrow Transplant 2019를 참조할 것.
따라서 본 개시내용은 예를 들어, 혈액 악성종양, 특히 급성 골수성 백혈병과 같은 백혈병 및 종양 세포, 예를 들어 혈액 종양 세포를 갖는 암을 앓고 있는 대상체의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-BTN2A1 항체의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계,
(ii) 상기 대상체에서 유효량의 NK 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하되,
상기 유효량의 항-BTN2A1 항체는 상기 종양 세포에 대한 상기 NK 세포 조성물에 의해 매개되는 항종양 세포용해를 강화하는 능력을 갖는다. 본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 NK 세포, 예를 들어 CAR NK 세포 및 본원에 개시된 인간화 항체의 병용투여(동시 또는 순차적)를 포함한다.
대안적 또는 추가적 구체예에서, 치료 전략은 또한 인간 대상체의 샘플로부터 분리된 Vγ9/Vδ2 T 세포를 선택적으로 확장 및/또는 활성화하는 작용제로서 본원에 개시된 인간화 항체의 사용에 기초할 수 있다.
따라서 본 개시내용은
(a) 대상의 혈액 샘플로부터 Vγ9/Vδ2 T 세포, 예를 들어 PBMC를 포함하는 혈액 세포를 분리하는 단계,
(b) 본원에 개시된 항-BTN2A1 및 선택적으로, 다른 종양 또는 부속 세포의 존재 하에 시험관내에서 Vγ9/Vδ2 T 세포를 확장시키는 단계,
(c) 확장된 Vγ9/Vδ2 T 세포를 수집하는 단계,
(d) 선택적으로, 확장된 Vγ9/Vδ2 T 세포를 제형화하고 상기 Vγ9/Vδ2 T 세포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는
이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 키메라 항원 수용체(CAR) Vγ9/Vδ2 T 세포를 선택적으로 확장시키는 작용제로서 본 명세서에 개시된 인간화 항체의 용도에 관한 것이다. CAR γδT 세포 및 입양 T 세포 암 면역요법에서의 사용은 예를 들어 Mirzaei et al, Cancer Lett 2016에 설명되어 있다.
본 개시내용의 항체는 또한 인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)로도 알려져 있음)를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역은 스페이서를 통해 TCR의 막횡단 도메인 및 신호전달 엔도도메인에 연결되고 T 세포의 표면에서 생성될 수 있는 Fab 또는 scFv를 형성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 CAR은 예를 들어 증식성 장애를 치료하기 위한 입양 전달 요법에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는, 전형적으로 암을 앓고 있는 대상체에서 γδT 세포 요법에서 종양 세포의 강화제로서 생체내 사용을 위한 항-BTN2A1 항체에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 γδT 세포 요법은 γδT 세포의 적어도 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 요법을 지칭한다. 이러한 γδT 세포는 동종 또는 자가일 수 있다. 특정 구체예에서, γδT 세포는 특정 유전자의 결실 또는 녹아웃 또는 삽입 또는 녹인에 의해 유전적으로 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 γδT 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 γδT 세포를 포함한다. γδT 세포는 생체 외에서 확장 및/또는 정제되었을 수 있다. 대안으로, γδT 세포는 또한 다른 혈액 세포, 및 예를 들어 면역계의 다른 세포를 포함하는 세포 조성물에 포함될 수 있다. γδT 세포 요법에 대한 참고문헌은 Pauza CD et al, Front Immunol. 2018 J Saudemont A. et al, Frontiers Immunol 2018를 참조한다.
실제로, 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용의 항-BTN2A1 항체의 제안된 작용 방식은 종양 세포의 표면에서 발현된 BTN2A1에 대한 그의 결합이 그의 카운터-Vγ9/Vδ2 T 세포의 수용체에 대한 신호전달을 허용하는 형태적 변화를 유발한다는 것이다.
따라서 본 개시내용은 예를 들어, 혈액 악성종양, 특히 급성 골수성 백혈병과 같은 백혈병 및 종양 세포, 예를 들어 혈액 종양 세포를 갖는 암을 앓고 있는 대상체의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-BTN2A1 항체의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및
(ii) 상기 대상체에게 유효량의 γδT 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하되,
상기 유효량의 항-BTN2A1 항체는 상기 종양 세포에 대한 상기 γδT 세포 조성물에 의해 매개되는 항종양 세포용해를 강화하는 능력을 갖는다. 본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 CAR T 세포, 예를 들어 CAR γδT 세포, 및 본원에 개시된 인간화 항체의 병용 투여(동시 또는 순차적)를 포함한다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이러한 예 및 도면은 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 어떤 식으로든 해석되어서는 안 된다.
[실시예]
재료 및 방법
세포 배양, 단핵세포 및 NK 세포 분류:
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 지역 혈액 은행(Etablissement Francais du Sang(EFS)-Marseille-France)에서 제공한 건강한 공여자(HD)의 EDTA(Ethylene Diamine-tetraacetic acid)-버피 코트에서 얻었고 밀도 구배에 대한 원심분리(Eurobio)에 의해 분리되었다. 신선한 PBMC를 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute medium 1640(RPMI; Lonza)에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
자연 살해(NK) 세포는 제조사의 지침에 따라 EasySepTM Human NK Cell Enrichment Kit(StemCell Technologies)를 사용하여 음성 선택에 의해 신선한 PBMC에서 분류되었다. 인간 CD14+ 단핵세포를 제조사의 지침에 따라 CD14+ 마이크로비드 키트(Miltenyi)를 사용하여 분류하였다. 단핵세포는 1% L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM HEPES, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 10% FBS(모두 Thermofisher에서 제공)가 보충된 RPMI에서 106 cell/mL의 밀도로 37℃에서 5일 동안 배양되었다. 췌장 선암종 세포주 PANC-1을 10% FBS가 보충된 RPMI에서 배양하였다. 90% 컨플루언시로 성장하면, 배양 배지를 버리고 세포를 PBS 1X에서 두 번 헹구었다. 그런 다음 PANC-1 세포를 5% FBS가 보충된 RPMI에서 추가로 24시간 동안 배양하였다(175cm2 플라스크당 30 mL). 그런 다음 PANC-1 컨디션드 배지를 수집하고 여과하였고(0.2 μM), 사용 전까지 -20℃에서 저장하였다. 다른 인간 세포주 및 그들의 해당 배양 배지는 아래 표 1에 요약되어 있다.
| 세포주 | 조직 | 질환 | 세포유형 | 배지 | |
| HEK-293T | 배아 신장 | NA | 상피 | DMEM Glutamax |
10% FBS 1mM NaPyr |
| DU-145 | 전립선 | 암종 | 상피 | RPMI Glutamax |
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| MDA-MB-231 | 유방 | 선암종 | 상피 | DMEMGlutamax | |
| A-549 | 폐 | 암종 | 상피 | F-12K Medium | |
| HT-29 | 대장 | 결장직장 선암종 | 상피 | DMEM Glutamax |
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| HCT-116 | 대장 | 결장직장 암종 | 상피 | McCoy's 5a | 10% FBS |
| RAJI | B 림프아구 | 버킷 림프종 | B 림프구 | RPMI Glutamax |
10% FBS 1mM NaPyr |
| HL60 | 말초혈액 | 급성 전골수성 백혈병 | 전-골수아세포 | ||
다음의 인간 세포주는 American Type Culture Collection에서 입수하였다: Daudi(Burkitt's 림프종), Jurkat(급성 T 세포 백혈병), MDA-MB-134(유관암) 및 HEK-293T(배아 신장). 인간 췌장 선암종 세포주 L-IPC(PDAC087T)는 Dr. Juan IOVANNA에 의해 친절하게 주어졌다. Daudi 및 Jurkat 세포, 그리고 PBMC는 10% 소태아 혈청(FCS), 1% Na-피루베이트, 1% L-글루타민(모두 Life Technologies에서 제공)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. HEK-293T BTN2 KO 세포는 BTN2의 모든 이소폼의 CRISPR-Cas9-매개 비활성화에 의해 생성되었다(데이터는 표시되지 않음). MDA-MB-134, L-IPC, HEK-293 세포 및 HEK-293T BTN2 KO 세포를 10% FCS가 포함된 DMEM 배지(Life Technologies)에서 배양하였다. 하이브리도마는 DMEM/Ham's F12(1:1)(ThermoFisher Scientific), 4% FetalClone I(Hyclone), 화학적으로 정의된 지질 농축액(1:250), 1% 글루타민, 1% 피루브산 나트륨 및 100 ㎍/mL PenStrep에서 배양되었다(모두 ThermoFisher Scientific에서 제공). 하이브리도마 상등액의 수집을 위해 하이브리도마를 Fetalclone 없이 4-5일 동안 배양하였다.
항-BTN2A1 mAbs 특이성을 평가하기 위해 HEK-293T BTN2 KO 세포는 Lipofectamine 3000 시약(Thermofisher Scientific)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 BTN2A1 및 BTN2A2 CFP(Nter)-융합 단백질을 인코딩하는 pcDNA3-Zeo-BTN2A1-CFP 플라스미드로 독립적으로 형질감염되었다.
레퍼런스 항-BTN2A1 mAb 107G3의 확인
마우스 항-인간 BTN2A1 항체는 6개의 상이한 MHC 조합을 보유하는 48마리의 마우스를 재조합 인간 BTN2A1-Fc 융합 단백질로 면역화함으로써 생성되었다. 21일 후에 마우스를 채혈하고 BTN2A1-특이적 다클론 항체의 혈청 역가를 Luminex 분석을 통해 결정하였다. 가장 높은 BTN2A1-특이적 항체 역가를 나타내는 마우스를 안락사시켰다. 비장 B 세포는 양성 선택을 통해 분리되었고 하이브리도마 생성을 위해 골수종 세포에 PEG-유도 융합을 거쳤다.
하이브리도마는 희석을 제한하여 복제되었고 하이브리도마 상등액은 표적 특이성과 Vγ9Vδ2-T 세포의 탈과립을 유도하는 능력에 대해 두 차례의 스크리닝을 거쳤으며(도 1C 및 2), 레퍼런스 mAb 107G3의 확인으로 이어졌다. 이러한 서브클론의 VH 및 VL 영역의 시퀀싱을 수행하였다(표 1 참조).
Vγ9Vδ2-T 세포의 확장
효과기 Vγ9Vδ2-T 세포는 0일에 시작하여 졸레드론산(Sigma, 1 μM) 및 재조합 인간 (rh)IL-2(프로류킨, 200 IU/mL)의 존재 하에서 HV로부터 PBMC를 배양함으로써 확립되었다. 5일부터, rhIL-2는 격일로 갱신되었고 세포 밀도는 총 15일 동안 1.15 x 106/mL로 유지되었다. 마지막 날 유세포 분석에 의해 Vγ9Vδ2-T 세포의 순도가 평가되었다. Vγ9Vδ2-T 세포의 순도가 80% 이상에 도달한 세포 배양물만 선택하여 기능 검사에 사용하였다. 정제된 Vγ9Vδ2-T 세포는 사용 전까지 동결시켰다.
Luminex 분석
자성 COOH 비드(Biorad)를 제조자의 지침에 따라 rhBTN2A1 단백질(R&D)에 접합시키고 비드를 사용 전까지 -20℃에서 저장 완충액(Biorad)에 저장하였다. 마우스 혈청의 적정을 위해, 희석 단계 1:4에 의해 1:50에서 시작하여 Luminex 분석 완충액(Nanotools)에서 일련의 혈청 희석이 이루어졌다. 100 ㎕ 비드 현탁액을 100 ㎕ 혈청 희석과 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 비드를 세척 완충액에서 3회 세척하고, Luminex 분석 완충액에서 1 ㎍/mL의 비오틴화된 염소 항마우스 IgG-Fc와 함께 배양하고, Luminex 분석 완충액에서 3회 더 세척하였다. 마지막으로, 비드를 Luminex 판독 완충액(Nanotools)에서 3회 최종 세척하기 전에 Luminex 분석 완충액에서 1 ㎍/mL의 스트렙타비딘 PE와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비드를 Luminex 판독 완충액에 재현탁하고 Luminex 100/200 시스템에서 데이터를 수집하였다. 히트 확인을 위해 30 ㎕의 상등액을 96웰 플레이트에 옮기고 90 ㎕의 Luminex 분석 완충액을 첨가하였다. 상기에서 설명한 프로토콜을 진행하기 전에 100 ㎕의 비드 현탁액을 100 ㎕의 상등액 희석과 혼합하고 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 히트 확인을 위해 표적에 대한 친화도가 가장 높은 것과 무관한 대조군 단백질(Rank-Fc)에 대한 친화도가 가장 낮은 것을 선택하였다. 친화도/Kd 계산을 위해, 하이브리도마 상등액은 희석 단계 1:4에 의해 Luminex 분석 완충액에서 40.000 pM에서 시작하여 연속 희석을 거쳤고, 상기에서 설명한 대로 분석하였다. Kd는 해당 결합 곡선의 중간점에 해당한다.
유세포 분석
PBMC, 정제된 Vγ9Vδ2-T 세포 -T 세포 또는 세포주는 FlowJo 10.5.3 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 BD LSRFortessa(BD Biosciences), CytoFlex LX 또는 CytoFlex S(Beckman Coulter)에서 분석하기 전에 지정된 mAb와 함께 배양되었다. Vγ9Vδ2-T 세포의 탈과립 분석에 사용된 항체는 항-CD107a-FITC(BD Biosciences), 항-CD107b-FITC(BD Biosciences), 항-CD3-PeVio700(Miltenyi), 항-PanTγδ -PE(Miltenyi), live/dead 근적외선(Thermofisher)이다. 모든 면역 염색은 FcR 차단 시약(Miltenyi), 염소 항-마우스-PE 1:100(Jackson Immunoresearch) 및 live/dead 근적외선(Thermofisher)의 존재에서 10 ㎍/mL의 정제된 mAb를 사용하여 수행하였다. 마우스 항-인간 CD277(BTN3A로도 알려짐; IgG2a 이소타입을 갖는 클론 103.2)은 이전에 개시되었다(WO2012/080351). 항-BTN2A1 mAb 특이성을 평가하기 위해, 형질감염 24시간 후, HEK-293T BTN2 KO 세포(5x104/샘플)를 수집하고 상기에서 설명한 대로 항-인간 BTN2A1 107G3 mAb의 표시된 농도(5 ng/mL ~ 75 ㎍/mL)로 염색하였다. 마우스 IgG1 항체(Miltenyi)를 염색을 위한 이소타입 대조군으로 사용하였다.
Vγ9/Vδ2-T 세포에 대한 기능적 분석
HV로부터 정제된 Vγ9/Vδ2-T 세포를 rhIL-2(200 UI/mL)에서 밤새 배양하였다. 그런 다음, Vγ9/Vδ2-T 세포를 37℃에서 다음의 mAb(표시된 대로, 50 ㎕의 하이브리도마 상등액 또는 10 ㎍/mL의 정제된 mAb)의 유무에 따라 표시된 표적 세포주(효과기:표적(E:T) 비율 1:1)와 공배양하였다: 항-BTN2A1 mAb, mIgG1(이소타입 대조군 항체) 또는 하이브리도마 배양 배지. 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, 20 ng/mL)와 이오노마이신(1 ㎍/mL)을 Vγ9/Vδ2-T 세포 활성화에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 하이브리도마 상등액 스크리닝의 1차 라운드를 위해, 배양 상등액을 4시간 후에 수집하고 인간 IFNγ ELISA 세트(BD Biosciences)를 사용하여 Vγ9/Vδ2-T 세포 활성화의 지표인 IFNγ에 대한 함량을 검사하였다. 하이브리도마 상등액 특성화의 2차 라운드를 위해, Vγ9/Vδ2-T 세포의 탈과립을 GolgiStop(BD Biosciences) 및 가용성 CD107(a&b)-FITC의 존재 하에서 4시간 인큐베이션하여 평가하였다. 4시간 후, 세포를 수집하고 PBS 2% 파라포름알데히드에 고정하고 FlowJo 10.5.3 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 CytoFlex LX(Beckman Coulter)에서 분석하였다.
Vγ9/Vδ2-T 세포의 증식
Vγ9Vδ2-T 세포는 항-TCR γδ 마이크로비드 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 건강한 공여자의 PBMC로부터 분리되었다. 유세포 분석에 의해 평가된 γδ-T 세포의 순도는 80% 이상이었다. γδ-T 세포를 37℃에서 20분 동안 CellTrace Violet으로 표지하였다. 그런 다음, 5x105 CellTrace-표지된 세포를 IL-2(200 UI/mL)의 존재, pAg의 존재 또는 부재, 및 정제된 항-BTN2A1 107G3 항체(10 ㎍/mL)의 존재 또는 부재 하에서 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 배양하였다. 배양 5일 후, CellTrace 희석액은 FlowJo 10.5.3 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 CytoFlex LX(Beckman Coulter)에서 유세포 분석에 의해 평가되었다.
통계 분석
Vγ9/Vδ2-T 세포의 탈과립의 경우 결과는 평균±SEM으로 표시된다. BTN2A1-형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포에 대한 정제된 항 BTN2A1 mAb의 EC50은 가변 기울기 모델에 따른 비선형 회귀 후 로그(용량) 반응 곡선을 기반으로 결정되었다. 모든 분석은 GraphPad Prism 7.04 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 수행되었다.
레퍼런스 항-BTN2A mAb 101G5의 확인
VH 및 VL 시퀀싱 후, 상기 기재된 바와 같이 마우스 하이브리도마 생성으로부터 수득된 23개의 항-BTN2A mAb가 키메라 IgG1 포맷 하에서 생산되었다. 간단히 말해서, 쥐 VH 및 VK 항-BTN2A mAb 서열을 시험관내에서 합성하고 PrimeSTAR Max DNA 중합효소(Takara)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. In Fusion system(Clontech)을 사용하여 PCR 산물을 중쇄 및 경쇄 발현 벡터(MI-mAbs)에 클로닝하고 플라스미드를 스텔라 컴피턴트 세포(Clontech)에 형질전환시켰다. 벡터 시퀀싱(MWG Eurofins)은 추가 형질감염을 위한 플라스미드의 대규모(최대) 준비 전에 항-BTN2A mAb를 검증하기 위해 수행되었다. 각 항-BTN2A 클론에 대해 일치하는 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 벡터를 HEK-293 세포(2.9x106 세포/mL)에서 중쇄/경쇄 비율 1:1.2로 일시적으로 형질감염시키고 배지를 18시간 후에 갱신하였다. 형질감염 7일 후, 배양 상등액을 mAb 정제를 위해 수확하였다. 항체의 친화도 정제는 44℃에서 밤새 Protein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)로 수행하였다. 결합 완충액은 0.5 M 글리신, 3 M NaCl, pH 8.9였다. 용출은 다음의 완충액으로 수행하였다: 0.1 M 시트레이트 pH3. 샘플은 1 M Tris-HCl, pH9(10% v/v)로 용출 직후 중화되었다. 마지막으로, 키메라 항-BTN2A mAb를 PBS 1X로 투석하고 0.22 μM 필터(Millex GV 친수성 PVDF, Millipore)를 통해 여과하였다. 키메라 항-BTN2A mAb 농도는 항체의 흡광 계수를 고려하여 Nanodrop 2000 Spectrophotometer(ThermoScientific)에서 결정되었다. mAb 단량체의 분획으로 정의된 순도는 Acquity UPLC Protein-BEH-200A, 1.7㎛ 4.6x50 mm 컬럼(Waters)과 함께 Acquity UPLC-HClass Bio(Waters)를 사용하여 UPLC-SEC에 의해 결정되었다. 역상 컬럼(PLRP-S 4000 A, 5 ㎛, 50 x 2.1 mm(Agilent Technologies))을 사용하여 Xevo G2-S Q-Tof 질량 분광광도계(Waters)에서 항체 질량을 측정하였다. 모든 샘플은 37℃에서 PNGase F 글리코시다제(New England Biolabs)로 탈-당화 후 분석되었다. 예상치 못한 덩어리가 발견되면 생물정보학 도구를 사용하여 1차 아미노산 서열을 분석하여 Fab 영역 내에서 추정되는 글리코실화 부위를 확인하였다. 정제된 항체의 SDS-PAGE는 최종 물질 얼룩이 없는 Mini protean TGX gel 4-15(Biorad)의 단편화 및/또는 응집의 검출을 허용하였다. 내독소 수준은 ClarioStar 분광광도계(BMG Labtech)를 사용하는 발색성 LAL Limulus Amebocyte Lysate kinetic assay(Charles River Endosafe)를 사용하여 결정되었다.
시험관내 대식세포 분극화 분석
M1 또는 M2 대식세포는 건강한 공여자의 분류된 단핵세포에서 분극화되었다. 이를 위해, 분류된 단핵세포를 GM-CSF 또는 M-CSF(40 ng/mL; Miltenyi)의 존재 하에서 배양하여 각각 M1 또는 M2 대식세포를 생성하였다. 5일 후, 생성된 대식세포를 표현형 분석을 위해 수집하거나 추가 2일 동안 LPS(200 ng/mL)로 자극하였다. 일부 실험에서는 IL-4(20 ng/mL)를 4일째에 M2 대식세포에 첨가하여 "M2+IL-4" 또는 대식세포를 생성하였다. 일부 실험에서 M2 대식세포는 M-CSF 보충 없이 PANC-1 암세포-컨디션드 배지(배양 배지에서 30% v/v 희석됨, 0일 및 3일)의 존재 하에서 단핵세포를 배양함으로써 생성되었다. 생성된 M2 대식세포는 이 응용 프로그램에서 "Tum-ind-M2"라고 한다. M2 분화를 조절하는 능력에 대해 항-BTN2A mAb를 스크리닝하기 위해, 키메라 항-BTN2A mAb 또는 이의 이소타입 대조군(인간 IgG1; Sigma)이 있거나 없이 표시된 농도에서 M2 대식세포를 상기 기재된 바와 같이 단핵세포로부터 생성하였다. 모든 mAb는 습식 코팅된다(PBS 1X에서 실온에서 밤새). M2 분화 억제를 위한 대조군으로서, GM-CSF(40 ng/mL) 및 IFNγ(100 ng/mL, BioTechne)를 M-CSF-유도 M2 분극화 동안 단핵세포에 첨가하였다. GM-CSF의 존재 하에서 분극화된 M1 대식세포를 표현형 대조군으로 사용하였다. 분극화 후, 생성된 대식세포 및 이들의 배양 상등액을 수집하고, 세포막에서 M1 및 M2 관련 마커의 발현을 유세포 분석에 의해 평가하였다. 또한, 배양 상등액의 사이토카인 함량은 제조사의 지침에 따라 IL-10 및 TNFα ELISA 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 정량화되었다.
시험관내 M2 대식세포 복귀 분석
M2 대식세포는 레퍼런스 mAb의 부재 하에서 상기 기재된 바와 같이 M-CSF의 존재 하에서 단핵세포로부터 생성되었다. M2 대식세포를 수집하고 10 ㎍/mL의 레퍼런스 항체 또는 이의 대조군 이소타입 mAb(Sigma의 인간 IgG1)로 밤새 습식 코팅한 배양 웰에서 LPS의 유무에 따라 2일 동안 배양하였다. M2 복귀의 대조군으로서, GM-CSF(40 ng/mL) 및 IFNγ(100 ng/mL)를 2일 동안 M2 대식세포 배양에 첨가하였다. GM-CSF의 존재 하에서 분극화된 M1 대식세포를 표현형 대조군으로 사용하였다. 복귀 실험 후, 유세포 분석에 의한 표현형 분석을 위해 LPS를 첨가하지 않고 복귀된 대식세포를 수집하였다. LPS-자극된 복귀된 대식세포로부터의 배양 상등액을 ELISA를 사용하여 수확된 사이토카인을 정량화하였다.
T 세포 증식 및 IFNγ 생산의 M2 대식세포-매개 억제에 대한 시험관내 분석
M1 및 M2 대식세포는 상기 기재된 바와 같이 레퍼런스 항체 또는 이의 이소타입 대조군 mAb의 첨가 유무에 따라 생성되었다. CD3+ T 세포를 제조사의 지침에 따라 CD3+ Microbead 키트(Miltenyi)를 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 분류하고 공배양 전까지 동결시켰다. 활성화된 CD3+ T 세포는 다음과 같이 생성되었다: CD3+ T 세포를 5 μM CellTrace Violet dye(ThermoFisher Scientific)로 염색한 다음, 1 ㎍/mL 항-CD3 mAb(클론 OKT3, BD biosciences)로 미리 코팅된 96웰 평면 바닥 플레이트에서 이러한 세포 105개를 20 U/mL의 IL-2(Miltenyi), LPS(200 ng/mL) 및 CountBright 절대 계수 비드(웰당 5x103, ThermoFisher Scientific)가 보충된 X-Vivo 10 배지에서 배양하였다. 대식세포와의 공배양을 위해, 2x104 동종이계 M1, M2 또는 M-CSF 및 레퍼런스 mAb 또는 이의 대조군 이소타입의 존재 하에서 분극화된 대식세포를 활성화된 동종이계 CD3+ 세포에 추가하였다. 5일의 공배양 후, 5시간 동안 GolgiStop 단백질 수송 억제제의 존재 하에서, 20 ng/mL PMA 및 0.5 ㎍/mL 이오노마이신을 공배양물에 첨가하여 사이토카인 생성을 향상시켰다. 그런 다음, 유세포 분석에 의한 표현형 분석을 위해 세포를 회수하였다. CellTrace 희석액은 CD3+ T 세포 증식의 지표로 사용되었다. 표현형 및 증식 결과는 mL당 백분율 또는 절대 세포 수로 표현되었다(절대 계수 비드로 보정 후).
레퍼런스 항-BTN2A1 mAb를 사용한 자연 살해(NK) 챌린지:
건강한 공여자로부터 분류된 자연 살해(NK) 세포를 표지한 후 37℃, 5% CO2에서 10% FBS 및 1%P/S이 보충된 RPMI에서 IL-15(10 ng/mL)의 유무, IL-2(50 UI/mL) 자극의 유무에 따라 배양하였다. 레퍼런스 항-BTN2A mAb 또는 대조군 이소타입(10 ㎍/mL)을 0일째 배양물에 첨가하였다. 5일 후, NK 세포를 활성화 마커의 발현이 세포외로 표현되었다. NK 활성화는 CD69 및 CD25 발현의 유도에 의해 평가되었다(백분율 및 중앙 형광 강도 MFI). NK 세포에 대한 게이팅 전략은 도 4에 나와 있다. NK 세포의 세포독성 측정을 위해 3명의 건강한 공여자로부터 분류된 NK 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% FBS 및 1% P/S이 보충된 RPMI에서 IL-2(50 UI/mL) 및 IL-15(10 ng/mL)의 유무에 따라 배양하였다. 레퍼런스 항-BTN2A mAb 또는 대조군 이소타입(10 ㎍/mL)을 비-자극 또는 IL-2/IL-15-자극된 NK 세포에 밤새 첨가하였다. 다음날, NK 세포를 표시된 혈액 또는 암종 세포주와 1:1 비율로 공배양하고 FITC 표지된 항-CD107a 및 항-CD107b mAb(모두 BD Biosciences)를 공배양물에 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. NK 세포의 탈과립은 비-자극 또는 IL-2/IL-15-자극된 NK 세포에 대한 CD107ab+ 세포의 백분율로서 유세포 분석에 의해 평가되었다. NK 세포의 탈과립 증진의 EC50 계산을 위해 레퍼런스 항-BTN2A mAb 및 이의 이소타입 대조군 mAb를 0.005 nM에서 300 nM 범위의 농도로 사용하였다. 암 세포의 NK 세포-매개된 살해 평가를 위해, 정제된 NK 세포를 10 ㎍/mL의 레퍼런스 101G5 및 107G3 mAb 또는 상응하는 IgG1 대조군과 함께 37℃, 5% CO2에서 10% FBS 및 1%P/S가 보충된 RPMI에서 IL-2(50 UI/mL) 및 IL-15(10 ng/mL)과 함께 밤새 사전 인큐베이션하였으며, 이를 양성 대조군으로 사용하였다. 다음날, NK 세포를 표시된 CellTrace 표지된 암세포주와 1:1 비율로 4시간 동안 공배양하였다. 암세포 사멸은 종양 세포주에서 CellEventTM Caspase -3/7 Green Detection 시약(Thermofisher Scientific)을 사용하여 caspase 3/7+ 세포의 백분율을 이용하여 평가하였다.
유세포 분석
염색하기 전에, PBMC/NK 세포 및 단핵세포/대식세포는 Fc 수용체 포화를 위해 인간 Fc 블록(Miltenyi) 또는 인간 IgG1(Sigma)과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 표지된 mAb는 다음과 같다: CD14-FITC 및 -APC-Vio770(Miltenyi), CD163-VioBlue(Miltenyi), DC-SIGN-PE-Vio770(Miltenyi), CD80-PE(BD Biosciences), PDL1-APC(BD Biosciences), CD3-PE-CF594(BD Biosciences) 및 CD3-BV605(Biolegend), CD56-PE-Vio770(Miltenyi) 및 -BV605(BD Biosciences), CD69-BV421(BD Biosciences), CD25-APC(BD Biosciences). 세포를 4℃에서 30분 동안 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. live/dead 근적외선 염료(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 "live" 게이트를 정의하기 위해 죽은 세포를 제외하였다. 세포내 IFNγ 염색을 위해, 세포외 염색된 세포를 세포내 고정 및 투과 완충 세트(eBioscience)를 사용하여 고정하고 투과시켜 APC-표지된 항-IFNγ(BD Biosciences)와 함께 인큐베이션하였다. FlowJo 10 소프트웨어를 사용하여 Fortessa 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 수집을 수행하였다. BTN2A1 및 BTN2A2 표현형의 경우, 정제된 항-BTN2A1-특이(mAb5) 및 항-BTN2A2-특이(mAb17)을 10 ㎍/mL로 사용하고 PE-표지된 항 IgG(H+L)로 밝혀냈다(Jackson Immunoresearch). NK 세포는 단일 세포 선택 후 "live" 게이트 내의 CD45+CD14-CD3-CD56+ 세포였다. 단핵세포는 단일 세포 선택 후 "live" 게이트 내의 CD45+CD19-CD3-CD56-CD14+ 세포였다. 획득은 Cytoflex LS(Beckman Coulter), iQue Screener(Intellicyt) 또는 Fortessa(BD Biosciences) 유세포 분석기에서 수행되었으며 데이터는 FlowJo 10 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 결과는 해당 염색 대조군으로 얻은 값을 뺀 후 중앙 형광 강도(MFI)로 표시된다.
옥텟 기반 BTN2A1 에피토프 친화도 측정 및 비닝 분석
키메라 IgG1 포맷으로 레퍼런스 항-BTN2A 항체를 생성한 후, 이 표적의 2개의 상이한 이소타입(BTN2A1 및 BTN2A2)에 대한 친화도를 평가하고 이들 mAb가 BTN2A1의 동일한 에피토프 영역을 인식하는지 여부를 결정하기 위해 경쟁 분석을 수행하였다. BLI(Bio-layer interferometry) 기술을 기반으로 하는 시스템인 Octet Red96 플랫폼(Fortebio/PALL)에서 친화도 및 비닝 실험을 수행하였다. 친화도 실험을 위해, 제조사의 지침에 따라 EZ-Link® NHS-PEG4 Biotinylation Kit를 사용하여 재조합 인간 (rh)BTN2A1-Fc(GTP)를 비오틴화하고, 비오틴화된 rhBTN2A2-Fc는 R&D Systems에서 구입하였다. BTN2A1 친화도 분석의 경우, 비오틴화된 rhBTN2A1-Fc를 로딩 목표 수준이 약 1 nm인 Kinetic Buffer 1X(ForteBio)에 희석된 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(ForteBio)에 로딩되었으며, 키메라 항-BTN2A 항체를 분석물로 사용하였다. BTN2A2 친화도 분석을 위해 키메라 항-BTN2A 항체를 상기에서 설명한 대로 FAB2G 센서(항 인간 CH1; Fortebio)에 로딩하고 비오틴화된 rhBTN2A2-Fc를 분석물로 사용하였다. 두 경우 모두 분석물은 용액에 남아 있었고 작업 농도는 Kinetic Buffer 10X(ForteBio)에서 희석되었다. 첫 번째 실행의 경우 표준 작업 농도 범위는 200 내지 3.125 nM이다. 두 번째 실행에 필요한 경우 작업 농도를 80 내지 1.25 nM으로 조정하였다. 모든 실행(적재, 평형, 분석물에 센서의 결합/침지, 해리 및 재생 포함)은 1000 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 수행되었다. 옥텟(Octet) 소프트웨어에 의해 계산된 1:1 또는 2:1 Langmuir 모델(각각 BTN2A1 또는 BTN2A2)을 사용하여 분석을 수행함으로써 더 나은 피팅 계산이 가능하였다. 비닝 실험을 위해 His-tagged BTN2A1(rhBTN2A-His)을 R&D Systems에서 구입하였다. 레퍼런스 항-BTN2A 항체는 BTN2A1에 대해 쌍으로 검사되었다. 비닝 실험은 ≪ in-tandem ≫ 포맷에 따라 수행하였으며, 이는 rhBTN2A-His가 바이오센서(anti-Penta-His ≪ HIS1K 바이오센서; ForteBio/PALL)에 고정되고 연속적인 단계에서 2개의 경쟁 항체에 제시되었음을 의미한다. 이 키네틱 스크리닝을 위해 HIS1K(신호 강도: 1 nm)에 rhBTN2A-His를 로딩한 다음 3분 동안 10 ㎍/mL의 항체와 결합 단계를 수행한 다음 3분의 해리 단계를 수행하였다. rhBTN2A1-His 활성은 비닝 분석(리간드로서의 BTN2A1/센서 및 분석물로서의 항체)과 동일한 형식으로 수행된 키네틱 스크리닝 분석을 통해 확인되었다. 모든 항체(포화 또는 경쟁 항체)를 10 ㎍/mL로 사용하고 Kinetic Buffer 1X에 희석하였다. 이 키네틱 스크리닝을 위해 HIS1K(신호 강도: 1 nm)에 rhBTN2A1-His를 로딩한 후 3분 동안 항체와의 결합 단계를 수행한 다음 3분의 해리 단계를 수행하였다. 분석 단계는 다음과 같았다: 기준선 -> 항원 포획 -> 기준선 -> 포화 항체 -> 기준선 -> 경쟁 항체 -> "in-tandem" 계획에 따른 재생. 비닝 데이터는 에피토프 빈 작업을 이용하여 Octet Data Analysis HT 11.1을 사용하여 분석되었다.
레퍼런스 mAb 107G3 및 101G5의 에피토프 매핑
BTN2A1과 레퍼런스 mAb 107G3 및 101G5 간의 상호작용은 107G3 또는 101G5와 함께 BTN2A1 단독의 펩타이드 질량 지문의 차등 평가에 의해 평가되었다. 에피토프 매핑을 시작하기 전에 CovalX의 HM4 상호작용 모듈(CovalX)이 장착된 Autoflex II MALDI ToF 질량 분석기(Bruker)를 사용하여 무결성 및 응집 수준을 확인하기 위해 rhBTN2A1-Fc 단백질(GTP Technologies)에 대한 고질량 MALDI 분석을 수행하였으며, 샘플에 BTN2A1의 비공유 응집체 또는 다량체가 존재하지 않음을 확인하였다. BTN2A1을 특성화하고 BTN2A1/107G3 및 BTN2A1/101G5의 에피토프를 결정하기 위해, 샘플에 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모리신 단백질 분해를 제공한 후 LTQ-Orbitrap 질량 분석기(Thermo Scientific)와 함께 nLC Ultimate 3000-RSLC 시스템을 사용하여 nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석을 수행하였다. BTN2A1/107G3 및 BTN2A1/101G5 복합체의 경우, 단백질 복합체를 다중 효소 절단 전에 중수소화 가교제와 함께 인큐베이션하였다. 가교된 펩타이드를 강화한 후 샘플을 분석하고 생성된 데이터를 XQuest 2.0 및 Stavrox 3.6 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 샘플 준비를 위해 환원 알킬화를 다음과 같이 수행하였다: 실온에서 180분 인큐베이션 시간 전에 BTN2A1(4.04 μM)을 DSS d0/d12(2 mg/mL; DMF)와 혼합하였다. 인큐베이션 후, 실온에서 1시간 인큐베이션 시간 전에 1 ㎕의 암모늄 바이카보네이트(20 mM 최종 농도)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그런 다음, H2O 8M 요소 현탁(10 ㎕) 전에 스피드백을 사용하여 용액을 건조시켰다. 혼합 후, 1 ㎕의 DTT(500 mM)를 용액에 첨가하였다. 그런 다음 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 암실에서 실온에서 1시간 인큐베이션 시간 전에 1 ㎕의 아이오도아세트아미드(1 M)를 첨가하였다. 인큐베이션 후, 100 ㎕의 단백질 분해 완충액을 첨가하였다. 트립신 완충액은 50 mM Ambic pH 8.5, 5% 아세토니트릴을 포함하고 키모트립신 완충액은 Tris HCl 100 mM, CaCl2 10 mM pH 7.8을 포함한다. ASP-N 완충액은 인산염 완충액 50 mM pH 7.8을 포함한다. 엘라스타제 완충액은 Tris HCl 50 mM pH 8.0을 포함하고 열분해 완충액은 Tris HCl 50 mM, CaCl2 0.5 mM pH 9.0을 포함한다. 트립신 단백질 분해를 위해 100 ㎕의 환원/알킬화된 BTN2A1을 1/100의 비율로 1 ㎕의 트립신(Roche Diagnostic)과 혼합하였다. 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 배양하였다. 키모트립신 단백질 분해를 위해 100 ㎕의 환원/알킬화된 BTN2A1을 0.5㎕의 키모트립신(Roche Diagnostic)과 1/200의 비율로 혼합하였다. 단백질 분해 혼합물을 25℃에서 밤새 배양하였다. ASP-N 단백질 분해를 위해 100 ㎕의 환원/알킬화된 BTN2A1을 0.5 ㎕의 ASP-N(Roche Diagnostic)과 1/200의 비율로 혼합하였다. 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 배양하였다. 엘라스타제 단백질 분해를 위해 환원/알킬화된 BTN2A1 100 ㎕를 1/100 비율로 엘라스타제(Roche Diagnostic) 1 ㎕와 혼합하였다. 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 배양하였다. 써모리신 단백질 분해를 위해 100 ㎕의 환원/알킬화된 BTN2A1을 2 ㎕의 써모리신(Roche Diagnostic)과 1/50의 비율로 혼합하였다. 단백질 분해 혼합물을 70℃에서 밤새 배양하였다. 소화 후 1% 최종 포름산을 용액에 첨가하였다. 단백질 분해 후, 단백질 분해에 의해 생성된 10 ㎕의 펩타이드 용액을 다음의 설정으로 나노-액체 크로마토그래피 시스템(Ultimate 3000-RSLC)에 로딩하였다: A: 95/05/0.1 H2O/ACN/HCOOH v/v/v; B: 20/80/0.1 H2O/ACN/HCOOH v/v/v, 기울기 5-40% B, 35분, 주입 부피 10㎕, precolumn 300μm ID x 5mm C18 PepMapTM, precolumn 유속 20 ㎕/min, 컬럼 75μm ID x 15cm C18 PepMapRSLC, 컬럼 유속, 200 nL/min.
인간 및 시노몰구스 BTN2A1 교차-반응성에 대한 ELISA 분석
인간 BTN2A1 아미노산 서열을 이용한 BLAST 검색 후 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그 서열(XM_015448906.1)을 확인하였고, EcoRI/EcoRV 제한 부위를 이용하여 세포외 도메인을 pFUSE-hIgG1FC2 벡터(InvivoGen)에 클로닝하였다. 재조합 cynoBTN2A1-Fc 융합 단백질은 생성된 pFUSE-hIgG1FC2-cynoBTN2A1 플라스미드를 제조사의 지침에 따라 ExpiFectamine™ 293(ThermoFisher)으로 Expi293FTM 세포에 형질감염시켜 생산하였다. 6일차에 채취한 세포 배양 상등액을 친화성 정제 컬럼을 통한 정제에 사용하였다. 정제된 cynoBTN2A1-Fc 단백질을 분자량 및 순도 측정을 위해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. cynoBTN2A1-Fc 단백질 농도는 BSA를 표준으로 하는 Bradford 분석에 의해 결정되었다. ELISA를 위해, cynoBTN2A1-Fc 단백질 또는 재조합 인간 BTN2A1-Fc(huBTN2A1-Fc, GTP Technologies)를 4℃에서 밤새 코팅하였다(1X PBS 중 5 ㎍/mL). PBS에서 3회 세척한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS 중 BSA 2% v/v로 포화시킨 다음, 포화 완충액을 버렸다. 레퍼런스 mAb 101G5 및 107G3 또는 대조군 인간 IgG1을 PBS BSA 2%에서 1 μM에서 시작하여 1 pM까지 10배 캐스케이드 희석액으로 희석하고, 웰당각 희석액 100 ㎕를 첨가하고 플레이트 진탕기에서 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 염소 항-마우스 IgG HRP(Jackson ImmunoResearch, PBS BSA 2%에서 1:10000 희석)를 첨가 및 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하기 전에 모든 웰을 PBS에서 3회 세척하였다. 그런 다음, Spark 분광계(Tecan)에서 405 nm에서의 흡광도에 의해 평가될 때와 같이, 모든 웰을 PBS로 3회 세척하고 결합 발견을 위해 1단계 ABTS 용액(ThermoFisher)을 첨가하였다. 모든 샘플은 이중으로 평가되었다.
결과
레퍼런스 항체 항-BTN2A1 107G3의 확인
레퍼런스 항-BTN2A1 107G3 항체는 다음과 같이 확인되었다: BTN2A1-Fc 항원으로 마우스를 면역화하고 BTN2A1-특이적 혈청의 최고 역가를 나타내는 마우스의 비장세포를 수집하고 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 얻었다. BTN2A1에 대한 가장 높은 친화도를 나타내는 하이브리도마 배양 상등액은 Vγ9/Vδ2-T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 조절하는 능력에 기초하여 1차 스크리닝을 위해 선택되었다. 이 1차 스크리닝 라운드에서 선택한 클론을 서브클로닝하고 IFN-γ 분비 및 Vγ9/Vδ2-T 세포의 탈과립 및 IFN-γ 분비를 유도하는 능력, 특히 Vγ9/Vδ2-T 세포의 탈과립을 유도하는 능력에 대해 검사하였고(도 1c 및 2), 레퍼런스 mAb 107G3의 확인으로 이어졌다. 이들 서브클론의 VH 및 VL 영역의 시퀀싱을 수행하였다(하기 표 2 참조).
항-BTN2A1 107G3 항체는 다른 암세포 표적에 대해 Vγ9/Vδ2-T 세포의 탈과립을 유도한다
정제된 Vγ9/Vδ2 T 세포는 건강한 공여자의 PBMC에서 확장되었고, 항-BTN2A1 107G3 하이브리도마 배양 상등액의 유무에 따라 표적 세포로서 Daudi(Burkitt's 림프종), Jurkat(급성 T 세포 백혈병), L-IPC(췌장 선암종) 및 MDA-MB-134(유방 암종)를 포함한 다양한 암 세포주와 공배양되었다. 도 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 항-BTN2A1 107G3 하이브리도마 상등액의 첨가는 CD107+ 탈과립 세포의 백분율로 측정할 때 표적 세포 단독 또는 대조군 하이브리도마 세포 배지의 존재에서의 공배양물과 비교하여 Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능의 유도로 이어진다. Vγ9/Vδ2 T 세포의 PMA/이오노마이신 처리는 예상대로 표적 세포와 독립적으로 세포용해 기능의 최대 유도로 이어진다. 항-BTN2A1 107G3 하이브리도마 상등액에 의해 유도된 CD107+ 세포의 백분율은 대조군 하이브리도마 배양 배지와의 공배양물에서 각각 Daudi 세포에서는 71.1 ± 7.4% 범위에서 MDA-MB-134 세포에서는 17.1 ± 2.9% 대 24.9 ± 4.7% 및 4.9 ± 0.4%의 범위였다. Vγ9/Vδ2 T 세포의 공배양물에서 표적으로 시험된 모든 암세포주와 함께 항-BTN2A1 107G3은 대조군 하이브리도마 배양 배지의 존재에서와 같은 공배양물과 비교하여 2배 내지 8배 더 많은 Vγ9/Vδ2 T 세포의 탈과립을 유도하였다.
정제된 항-BTN2A1 mAb 107G3은 CD107+ 세포의 백분율로 표시되는 바와 같이, 항-BTN2A1 107G3 mAb의 증가하는 농도(0 내지 18 ㎍/mL)의 존재에서 표적으로서 Daudi 세포와 공배양된 Vγ9/Vδ2 T 세포의 탈과립의 유도에 대해 0.77 ㎍/mL(95%IC 0.32 - 13.22 ㎍/mL)의 EC50을 나타냈다(도 2b).
| 항-BTN2A1 107G3 | 대조군 하이브리도마 상등액 | |
| HEK-293T BTN2 KO + BTN2A1에서 EC50 | 0.32 (95%IC 0.21-0.46) ㎍/mL | 해당없음 |
| Daudi에서 기능 분석 시 EC50 | 0.77 (95%IC 0.32 - 13.22) ㎍/ml | 해당없음 |
| Daudi (% CD107+ cells)에서 기능 분석 | 71.1±7.4% | 24.9±4.7% |
| MDA-MB-134 (%CD107+ cells)에서 기능 분석 | 17.1±2.9% | 4.9±0.4% |
| L-IPC (%CD107+ cells)에서 기능 분석 | 31.1±3.6% | 14.4±0.5% |
| Jurkat (%CD107+ cells)에서 기능 분석 | 25.7±5.1% | 3.7±0.4% |
항-BTN2A1 107G3 항체는 BTN2A1을 인식하지만 BTN3은 인식하지 못한다
BTN2A1 이소폼에 대해서만 항-BTN2A1 mAb 107G3의 특이성을 확립하기 위해, 두 BTN2 이소폼의 CRISPR-Cas9-매개 불활성화를 보유하는 HEK-293T BTN2 KO 세포에 CFP-융합 단백질로서 BTN2A1을 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 정제된 항-BTN2A1 mAb 107G3을 사용한 염색은 BTN2A1-인코딩 플라스미드로 형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포에서만 검출되었지만 HEK-293T BTN2 KO 세포 단독으로는 검출되지 않았다.
모든 BTN3 이소폼을 인식하는 항-BTN3 mAb 103.2는 HEK-293T BTN2 KO 세포에서 BTN3 발현을 쉽게 검출하였다. 따라서 항-BTN2A1 107G3은 BTN2A1 이소폼에 특이적이며 BTN3과 교차-반응하지 않는다.
세포에서(
in cellulo
) BTN2A1에 대한 항-BTN2A1 107G3 mAb의 친화도
표적에 대한 항-BTN2A1 107G3 mAb의 친화도를 측정하기 위해, BTN2A1-인코딩 플라스미드로 형질감염된 HEK-293T BTN2 KO 세포를 정제된 항-BTN2A1 107G3 mAb 또는 대조군 mIgG1의 농도를 증가시키면서(5 ng/mL 내지 75 ㎍/mL) 염색하였다(도 3b). 평균 형광 강도 데이터의 비선형 회귀 분석은 항-BTN2A1 107G3 mAb에 대해 0.32 ㎍/mL(95%IC 0.21-0.46 ㎍/mL)의 EC50을 발견하였다.
키메라 항-BTN2A mAb의 생산, 친화도 측정 및 BTN2A 이소폼 특이성:
23개의 단클론 항체가 HEK-293T 세포에서 일시적으로 생성되어 다양한 범위의 생산성을 달성하였다. 대부분의 항-BTN2A 항체는 높은 수준(>100 mg/L 및 최대 430 mg/L)으로 생성되었다. 한 항체, 항-BTN2A mAb3(표 3)은 HEK-293T 세포에서 6 내지 8 mg/L 범위로 매우 불량한 생산을 나타냈다. 아미노산 서열 분석은 VH의 CDR1에서 Fab 부분 내의 N-글리코실화 부위를 나타내었다. 2개의 다른 항체, 항-BTN2A mAb9 및 mAb11은 또한 그들의 Fab 영역 내에서 N-글리코실화 부위를 나타내었다(mAb9의 경우 CDR1_VH 및 mAb11의 경우 CDR1_VL에서). 6개의 항체는 더 낮은 순도 수준(단량체에서 < 95%)을 나타내었지만 항-BTN2A mAb1 및 mAb3 만이 순도 수준 < 90%(각각 86% 및 75%)를 나타내었다. 모든 최종 정제된 항-BTN2A mAb는 매우 낮은 수준의 내독소(0.1 EU/mg 범위)를 나타내었다. mAb3 만이 다른 것들보다 더 높은 내독소 수준(0.73 EU/mg)을 갖지만 여전히 허용 기준(<1 EU/mg) 내에 있다. 23개의 항-BTN2A 키메라 mAb의 친화도 상수(KD, kon 및 koff)는 비오틴화된 재조합 Fc-융합 가용성 단백질을 이용하여 옥텟 기술을 사용하여 BTN2A1 및 BTN2A2 이소폼에 대해 결정되었다. 표 4는 각 항-BTN2A mAb에 대한 KD 상수를 요약한 것이다. mAb6 및 mAb9의 경우 측정 시간 동안 관찰된 해리의 부재로 인해 KD 계산이 불가능했으며(koff <10-7 s-1), 이는 표적으로부터의 해리를 늦추는 이러한 항체의 결합 효과로 설명될 수 있다. 8개의 항-BTN2A mAb는 BTN2A1 이소폼에만 결합하는 것으로 밝혀졌고(mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb8, mAb9 및 mAb10), 8개의 항-BTN2A mAb는 BTN2A2, mAb17, mAb16, , mAb19, mAb20, mAb21, mAb22 및 mAb23) 및 7개의 mAb가 두 이소폼(mAb1, mAb7, mAb11, mAb12, mAb13, mAb14 및 mAb15)에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
| 항체 |
단량체 순도(%)
(SEC-UPLC) |
내독소 (EU/mg) |
이론적 질량(Da) (reduced/
intact-Kterm) |
실제 질량(Da) (reduced/
intact-Kterm) |
생산량
(mg/L) |
KD (nM)
BTN2A1 |
KD (nM)
BTN2A2 |
| mAb1(101G5) | 85.66 |
0.09 |
MW = 144302 LC = 23236 HC = 48941 |
MW = 144331 LC = 23235 HC = 48938 |
158.11 |
0.041 | 4.4 |
| mAb2(107G3) | 98.41 | 0.04 | MW = 144688 LC = 23749 HC = 48611 |
MW = 144661 LC = 23747 HC = 48591 |
246 |
0.41 | 결합 없음 |
| mAb3* | 74.9 | 0.73 | MW = 146116LC = 23451 HC = 49623 |
MW=146093 LC=23448 HC=49606 |
6.75 | 0.14 | 결합 없음 |
| mAb4 | 100 | 0.1 | MW = 146300LC = 23556 HC = 49610 |
MW = 146275 LC = 23554 HC = 49590 |
58.22 | 0.1 | 결합 없음 |
| mAb5 | 98.08 | 0.06 | MW = 146092LC = 23498 HC = 49564 |
MW = 146067 LC = 23496 HC = 49544 |
82.22 | 0.16 | 결합 없음 |
| mAb6 | 100 | 0.07 | MW = 146286LC = 23369 HC = 49790 |
MW = 146262 LC = 23366 HC = 49770 |
28.6 | <10 -3 | 결합 없음 |
| mAb7 | 94.72 | 0.07 | MW = 145098LC = 23460 HC = 49105 |
MW = 145105 LC = 23458 HC = 49101 |
279.78 |
0.1 | 7 |
| mAb8 | 98.93 | 0.15 | MW = 146274LC = 23556 HC = 49597 |
MW = 146248 LC = 23554 HC = 49576 |
44.22 |
0.11 | 결합 없음 |
| mAb9* | 98.78 | 0.03 | MW = 146790LC = 23476 HC = 49935 |
MW = 146765 LC = 23473 HC = 49921 |
328.89 |
<10 -3 | 결합 없음 |
| mAb10 | 98.24 | 0.12 | MW = 147132LC = 23383 HC = 50199 |
MW = 147141 LC = 23381 HC = 50194 |
105.4 | 0.79 | 결합 없음 |
| mAb11* | 98.88 | 0.05 | MW = 147422LC = 23995 HC = 49732 |
MW = 147428 LC = 23991 HC = 49733 |
243.3 |
0.008 | 3.2 |
| mAb12 | 93.36 | 0.09 | MW = 143976LC = 23391 HC = 48613 |
MW = 143950 LC = 23388 HC = 48593 |
127 | 0.03 | 3.3 |
| mAb13 | 97.64 | 0.03 | MW = 145140LC = 23679 HC = 48907 |
MW = 145148 LC = 23677 HC = 48903 |
430 | 0.07 | 0.8 |
| mAb14 | 93.57 | 0.08 | MW = 144180LC = 23440 HC = 48666 |
MW = 144154 LC = 23338 HC = 48647 |
75.78 | 0.004 | 2.8 |
| mAb15 | 97.07 | 0.07 | MW = 143972LC = 23558 HC = 48444 |
MW = 143945 LC = 23556 HC = 48424 |
129.78 | 0.012 | 1.2 |
| mAb16 | 98.15 | 0.06 | MW = 146944LC = 23983 HC = 49505 |
MW = 146953 LC = 23981 HC = 49503 |
75.5 | 결합 없음 | 0.2 |
| mAb17 | 100 | 0.09 | MW = 146976LC = 23983 HC = 49521 |
MW = 146985 LC = 23981 HC = 49518 |
84.44 | 결합 없음 | 0.3 |
| mAb18 | 97.87 | 0.12 | MW = 146408LC = 23977 HC = 49243 |
MW = 146415 LC = 23975 HC = 49239 |
152.56 | 결합 없음 | 0.8 |
| mAb19 | 91.73 | 0.04 | MW=147130LC = 24000 HC = 49581 |
MW = 147140 LC = 23995 HC = 49577 |
252.2 | 결합 없음 | 0.3 |
| mAb20 | 98.69 | 0.06 | MW=146584LC = 23970 HC = 49338 |
MW =146594 LC = 23968 HC = 49334 |
238 | 결합 없음 | 0.8 |
| mAb21 | 98.05 | 0.09 | MW=147088LC = 23992 HC = 49568 |
MW =147097 LC = 23990 HC = 49565 |
66.78 | 결합 없음 | 0.22 |
| mAb22 | 96.98 | 0.05 | MW=146952LC = 23508 HC = 49984 |
MW =147087 LC = 23506 HC = 49981 |
312.22 | 결합 없음 | 4.7 |
| mAb23 | 100 | 0.03 | MW=147080LC = 23969 HC = 49587 |
MW =147089 LC = 23967 HC = 49585 |
78.56 | 결합 없음 | 0.3 |
*VH 또는 VL에서 N-글리코실화 부위의 존재.
단핵세포 및 NK 세포에서 BTN2A1 및 BTN2A2 세포막 발현
항-BTN2A mAb가 치료 목적으로 말초 혈액의 비-Vγ9Vδ2 T 세포 구획, 즉 단핵세포 및 NK 세포를 표적화할 수 있는지 여부를 결정하고자 하였다. 따라서 옥텟 분석에서 발견된 mAb5 및 mAb17을 사용하여 말초 혈액의 단핵세포 및 NK 세포 표현형을 각각 BTN2A1 또는 BTN2A2에만 결합하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 항-BTN2A1 mAb5 만이 단핵세포 및 NK 세포 둘 다의 세포막을 염색하였고, 단핵세포에서 더 강한 신호가 관찰되었다. 따라서, BTN2A1은 단핵세포 및 NK 세포의 세포막에서 검출되었으며, 이는 이러한 면역 세포 구획의 면역 기능을 조절하는 능력에 대해 BTN2A1을 인식하는 mAb를 스크리닝하는 데 합리성을 제공한다.
단핵세포의 대식세포로의 분극화를 조절하는 능력에 대한 항-BTN2A mAb의 스크리닝
미세환경의 신호에 대한 응답으로 단핵세포는 M1 또는 M2 대식세포로 분극화될 수 있다. M1 대식세포는 염증 촉진 및 항종양 특성을 나타내는 반면, M2 대식세포는 항염증 특성을 가지며 종양 발달과 관련이 있다. 단핵세포의 세포막에서 BTN2A1 이소폼만이 발견되었다는 점을 감안할 때, BTN2A1 단독 또는 BTN2A1/BTN2A2 이소폼 모두를 인식하는 항-BTN2A mAb는 M-CSF 존재 하에 시험관내에서 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 방해하는 능력에 대해 평가되었다. GM-CSF의 존재 하에 생성된 M1 대식세포(CD14+/- CD163-) 및 M-CSF의 존재 하에 생성된 M2(CD14+ CD163+) 대식세포를 둘 다 mAb 없이 대식세포 분극화에 대한 대조군으로 사용하였다. 시험관내 분극화 5일 후, 항-BTN2A mAb 또는 이들의 대조군 IgG1의 존재 하에 분극화된 M1, M2 및 M-CSF 유도 대식세포의 세포막에서의 CD14 및 CD163의 발현을 유세포 분석에 의해 평가하였다(표 4). 예상대로 M1 세포는 낮은 CD14 발현과 검출 불가능한 CD163 발현을 나타내는 반면(표 5 및 도 4), M2 대식세포는 두 마커의 높은 발현을 나타냈다. 흥미롭게도, 앞으로 101G5로 명명될 항-BTN2A mAb1은 M-CSF가 있는 상태에서 CD14 및 CD163의 발현을 가장 강력하게 감소시켜 M-CSF에 의해 유도된 대식세포 분극화를 M1 유사 표현형으로 왜곡한다(표 4 및 도 4B). M-CSF 유도 M2 대식세포 분극화의 두 번째로 우수한 억제제는 mAb2였으며, 이는 107G3이다(표 5 및 도 4B). 이는 처리되지 않은 M2 대식세포와 유사한 M-CSF 및 대조군 IgG1의 존재 하에서 수득된 대식세포의 표현형과 대조된다.
| M2-관련 마커(MFI; n=3) | |||||
| 분극화 사이토카인 | CD14 | CD163 | |||
| Median | SEM | Median | SEM | ||
| M1 | GM-CSF | 1047 | 463.6 | 64 | 17.27 |
| M2 | M-CSF | 38878 | 3866 | 6405 | 1051 |
| hIgG1 | 28070 | 2937 | 4524 | 839.4 | |
| mAb1(101G5) | 347 | 1892 | 38 | 60.87 | |
| mAb2(107G3) | 4408 | 8448 | 289 | 1407 | |
| mAb3 | 42997 | 3756 | 6757 | 1428 | |
| mAb4 | 43853 | 4650 | 6493 | 1129 | |
| mAb5 | 45119 | 4004 | 6450 | 949.7 | |
| mAb6 | 38277 | 4793 | 5299 | 932.3 | |
| mAb7 | 42071 | 3227 | 6337 | 1176 | |
| mAb8 | 39483 | 3564 | 6722 | 1199 | |
| mAb9 | 43203 | 4869 | 6432 | 1135 | |
| mAb10 | 45362 | 3078 | 6737 | 1097 | |
| mAb11 | 41519 | 3675 | 6605 | 1090 | |
| mAb12 | 44750 | 2845 | 6909 | 1113 | |
| mAb13 | 5684 | 9480 | 642 | 1173 | |
| mAb14 | 33889 | 10427 | 4614 | 1498 | |
| mAb15 | 17411 | 10372 | 2553 | 1429 | |
도 5는 CD14 및 CD163 발현 억제(도 5A 및 5B)뿐만 아니라 M1 표현형의 특징인 PDL1 및 CD86의 발현 증가(도 5C 및 5D) 면에서, 이소타입 대조군과 비교한 레퍼런스 101G5 및 107G3 항-BTN2A mAb의 M2 억제 효과의 용량 의존성을 보여준다. 사이토카인 분비 프로파일은 M2 대 M1 대식세포를 구별하는 특징이기도 하다. 따라서, IL-10(항염증성, M2 관련) 및 TNFα(전염증성, M1 관련) 분비는 레퍼런스 항-BTN2A mAb 유무에 따라 M-CSF 유도 대식세포의 배양 상등액으로부터 LPS 자극 후 ELISA에 의해 평가되었다. 도 5E 및 5F에 나타낸 바와 같이, 레퍼런스 항-BTN2A mAb는 이소타입 대조군과 대조적으로 용량 의존적 방식으로 IL-10의 분비를 억제하고 TNFα 분비를 증가시켰다. 이러한 관찰은 101G5 및 107G3이 M1-유사 표현형으로 기울어짐으로써 표현형 및 사이토카인 분비의 관점에서 M2 대식세포로의 M-CSF 유도 단핵세포의 분극화를 억제한다는 것을 확인시켜준다. 또한, 101G5 및 107G3의 이러한 효과는 용량 의존적이다. 각 mAb의 IC50 및 EC50은 표 6에 나와 있다. 참고로, PD-L1을 제외한 모든 매개변수에 대해 가장 낮은 IC50 및 EC50은 107G3과 비교하여 101G5에서 얻어졌다.
| 마커 | 레퍼런스 항-BTN2A mAbs의 효과 | IC 50 /EC 50 (㎍/mL) | |
| 101G5 | 107G3 | ||
| CD14 | 억제 | 0.51 | 7.7 |
| CD163 | 억제 | 0.43 | 6.2 |
| CD86 | 유도 | 2.55 | 25 |
| PDL1 | 유도 | 37.09 | 7 |
| IL-10 | 억제 | 0.105 | 14.8 |
| TNFα | 유도 | 1.12 | 19.8 |
종양 미세환경의 다른 자극은 M2 대식세포 분극화를 유도하는 것으로 설명되었다(Mosser and Edwards, Nat Rev Immunol 2008; Mantovani and Allavena, J Exp Med 2015). M-CSF 외에도 M2 분극화를 유도하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 자극 중 하나는 IL-4이다. 본 발명자들은 M-CSF 및 IL-4로 자극한 후 단핵세포로부터 생성된 소위 전종양 "M2+IL-4" 대식세포의 분화에 대한 101G5 및 107G3의 영향을 결정하였다. 이러한 조건에서 배양 5일 후, 101G5 및 107G3은 "M2+IL-4" 관련 마커(CD14, CD163 및 DC-SIGN, 도 6A, 6B 및 6D)의 발현 및 IL-10 분비를 억제하면서(도 6F), M1 관련 마커(CD86, PDL1) 및 TNFα 분비의 발현을 증가시켰다(도 6C, 6E 및 6G). 따라서, 전-종양 환경(M-CSF 및 IL-4)에서, 101G4 및 107G3은 "M2+IL-4" 분화를 억제하고 전염증성 M1 대식세포 분화를 향상시킨다. 또한 단핵세포로부터의 암 세포-유도된 M2 분극화에 대한 101G5 및 107G3의 효과는 PANC-1(췌장 선암종 세포주)-컨디션드된 배양 상등액의 존재 하에서 분류된 단핵세포를 배양함으로써 평가되었다. 이 설정에서 101G5 또는 107G3이 추가되면 M2 관련 마커(CD14, CD163) 및 IL-10 분비의 감소된 발현(도 7A-C) 및 M1 관련된 전염증성 TNFα의 증가된 발현에 의해 나타난 바와 같이 M2 분극화가 억제되었다(도 7D).
M2-대식세포의 M1으로의 리프로그래밍에 대한 레퍼런스 항-BTN2A mAb 101G5 및 107G3의 효과
M2-분극화된 대식세포를 M1 표현형으로 복귀하는 레퍼런스 101G5 및 107G3 mAb의 잠재력을 평가하였다. 이 목적을 위해, 5일 동안 M-CSF의 존재 하에 미리 분극화된 M2 대식세포를 101G5 및 107G3 mAb로 미리 코팅된 웰에 씨딩하고 추가로 2 또는 4일 동안 배양하였다. IFNγ에 의한 M2 대식세포의 처리는 M2->M1 복귀의 양성 대조군으로 제공하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 101G5 및 107G3의 존재 하에서 배양된 M2 대식세포는 IFNγ 처리와 유사한 M1-유사 표현형을 획득하였다. 실제로, 레퍼런스 101G5 및 107G3 mAb로 M2 대식세포를 처리하면 CD14(도 8A) 및 CD163(도 8B) 발현이 감소하고 CD86 발현이 증가하였다(도 8C). PDL1의 상향 조절은 각각 101G5 또는 107G3으로 처리한 후 관찰되지 않았다(도 8D). 또한, 101G5 및 107G3으로 M2 대식세포를 처리하면 IL-10 분비가 억제되고(도 8E), TNFα 분비가 향상되며(도 8F), 이는 M1 표현형을 나타내는 것이다. 도 8G 내지 I는 CD163 발현 억제 측면에서(도 8G), IL-10의 감소 및 TNFα 분비의 증가(도 8H 및 I) 측면에서, 이소타입 대조군과 비교하여 M1 대식세포로 리프로그래밍되는 M2 대식세포에 대한 레퍼런스 101G5 및 107G3 mAb의 효과의 용량 의존성을 보여 준다. 각 mAb의 IC50 및 EC50은 항-BTN2A 101G5 mAb가 M1 대식세포로 리프로그래밍되는 M2-대식세포에서 최고의 활성을 나타내는 관련 특정 M1/M2 마커에 대해 표 7에 나와 있다.
| 마커 | 레퍼런스 항-BTN2A mAbs의 효과 | IC 50 /EC 50 (㎍/mL) | |
| 101G5 | 107G3 | ||
| CD14 | 억제 | 3.77 | nd |
| CD163 | 억제 | 6.79 | 15.46 |
| CD86 | 유도 | 1.14 | nd |
| IL-10 | 억제 | 0.87 | 3.03 |
| TNFα | 유도 | 6.44 | 80.33 |
레퍼런스 항-BTN2A mAb 101G5 및 107G3은 T 세포 증식의 M2-매개 억제를 나타낸다
레퍼런스 101G5 및 107G3 mAb가 M2 대식세포의 기능에 영향을 미치는 능력, 즉 M2-매개 T 세포 증식을 억제하는 능력을 조사하였다. 이를 위해, 동종이계의 사전 활성화된 CD3+ T 세포를 M1, M2 또는 mAb의 존재 하에서 생성된 M2와 공배양하였다. 예상대로 기존의 M2 대식세포와의 공배양은 M1 대식세포와 비교하여 CD3+ T 세포의 수가 감소하고 T 세포 증식(CTV 희석에 의해 평가됨) 및 IFNγ 생산이 감소하였다(도 9A, C, G , E 및 I). 대조적으로, 101G5 및 107G3의 존재 하에서 생성된 M2 대식세포는 대조군 IgG1의 존재 하에서 생성된 M2 대식세포의 배양물과 비교하여 더 높은 백분율 및 CD3+ T 세포의 절대 수에 의해 보여지는 바와 같이 T 세포 증식을 억제하는 것으로 보이지 않았다(도 9B, 9H 및 9J). 더욱이, IFNγ-생산 T 세포의 백분율 및 수는 대조군 IgG1과 비교하여 101G5 및 107G3의 존재 하에서 생성된 대식세포를 포함하는 공배양에서도 더 높았다(도 9D 및 9F).
따라서, M-CSF 단독에 의해 유도된 M2 대식세포와 대조적으로, M-CSF에 더하여 101G5 또는 107G3의 존재 하에서 생성된 대식세포는 M1 대식세포와 유사한 동종의 CD3+ T 세포의 증식 및 Th1 기능(IFNγ 생산)을 허용한다.
레퍼런스 항-BTN2A mAb 101G5 및 107G3은 NK 세포 활성화 및 세포독성을 유발한다
BTN2A1이 NK 세포의 세포막에서 발견되었기 때문에, NK 세포 활성화를 조절하는 101G5 및 107G3의 잠재적 능력을 조사하였다. 건강한 공여자로부터 정제된 NK 세포를 추가 활성화(각각 IL-2 및 IL-15 또는 IL-2만)의 유무에 따라 101G5 또는 107G3의 존재 하에서 5일 동안 배양하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 101G5 및 107G3 둘 모두는 시험된 모든 조건에서 NK 세포의 세포막에서 CD69의 발현을 향상시켰다(도 10A). 또한, 101G5 및 107G3은 또한 NK 세포의 IL-2 및 IL-15 처리에 의해 유도된 CD25의 발현을 향상시켰다(도 10B). 101G5 및 107G3이 정제된 NK 세포를 활성화할 수 있었기 때문에, 이러한 mAb가 NK 세포 세포독성을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 따라서, 암 세포주 HL-60(골수성 백혈병), HT-29(대장 암종), MDA-MB-231(유방 선암종) 및 A549(폐 선암종)에 대한 NK 세포의 탈과립(%CD107+ 세포)이 IL-2 및 IL-15 자극의 유무에 따라 101G5 또는 107G3의 존재 하에서 평가되었다. 예상대로, 대조군 IgG1의 존재 하에서, HL-60 세포만이 NK 세포의 탈과립을 촉발시켰고(도 10C), 이는 IL-2 및 IL-15에 의한 자극에 의해 강화되었다(도 10D). 고형 종양 세포주 HT-29, MDA-MB-231 및 A549에 대한 적당한 NK 세포의 탈과립도 대조군 IgG1 및 IL2+IL-15의 존재 하에서 관찰되었다. 표 8은 시험된 이들 및 다른 암 세포주(Raji, HCT116, DU-145)에 대한 NK 세포의 탈과립을 요약한다. 흥미롭게도, 레퍼런스 mAb 101G5 및 107G3은 IL-2+IL-15 자극 없이 고형 종양 세포주 MDA-MB-231 및 A549에 대해 NK 세포의 탈과립을 향상시켰고 HT-29에 대해서는 더 적은 정도로 향상시켰다. IL-2 및 IL-15의 추가는 MDA-MB-231, A549 및 DU145 세포에서 101G5 및 107G3의 효과를 강조하였다(표 8). 레퍼런스 101G5 또는 107G3 mAb의 추가에 의한 HL-60 및 Raji 혈액암 세포주에서는 이러한 향상이 관찰되지 않았다(표 8 및 도 10C 및 D). 추가로, 레퍼런스 mAb 101G5 및 107G3은 공배양에 mAb를 추가로 첨가하지 않고 공배양 전에 NK 세포와 사전 인큐베이션할 때 A549 세포에 대한 NK 세포의 탈과립을 유발할 수 있었다(도 10E). 이것은 암 세포에 대한 세포독성을 유발하는 NK 세포와의 직접 결합에 의한 레퍼런스 107G3 및 101G5 mAb의 직접적인 효과를 시사한다. 또한, 전립선 선암종 DU-145 세포주에 대한 NK 세포의 탈과립 증진에 대한 101G5 및 107G3의 용량 의존성을 평가하였다. 실제로, 101G5 및 107G3은 용량 의존적 방식으로 DU-145 세포에 대한 NK 세포의 탈과립을 향상시켰다(EC50(no stim)= 0.14 및 0.54 nM; EC50(IL-2+IL-15)= 0.08 및 0.2 nM의 101G5 및 107G3).
| 자극 | 표적 세포 | IgG1 | 101G5 | 107G3 | |||
| Mean | SEM | Mean | SEM | Mean | SEM | ||
| None | None | 1.74 | 1.26 | 2.06 | 0.95 | 1.81 | 1.03 |
| HL-60 | 24.57 | 0.71 | 22.43 | 1.31 | 27.23 | 2.29 | |
| Raji | 8.70 | 1.43 | 9.19 | 0.84 | 11.68 | 0.56 | |
| HT-29 | 4.69 | 0.35 | 5.76 | 1.00 | 9.19 | 0.15 | |
| HCT116 | 2.79 | 0.46 | 3.98 | 1.81 | 5.62 | 0.47 | |
| MDA-MB-231 | 2.28 | 0.73 | 7.24 | 1.16 | 9.66 | 1.09 | |
| A549 | 1.68 | 0.07 | 6.78 | 2.44 | 12.57 | 1.15 | |
| DU-145 | 3.29 | 0.19 | 14.6 | 4.91 | 25.1 | 3.13 | |
| IL-2+IL-15 | None | 3.32 | 0.84 | 6.14 | 2.01 | 5.22 | 2.01 |
| HL-60 | 65.83 | 1.09 | 57.37 | 3.18 | 58.57 | 3.18 | |
| Raji | 21.33 | 2.31 | 28.83 | 0.00 | 24.50 | 0.00 | |
| HT-29 | 22.43 | 2.11 | 20.73 | 2.18 | 19.83 | 2.18 | |
| HCT116 | 25.53 | 2.62 | 27.70 | 1.93 | 26.20 | 1.93 | |
| MDA-MB-231 | 11.85 | 3.26 | 29.00 | 4.00 | 30.70 | 4.00 | |
| A549 | 14.53 | 2.64 | 24.57 | 1.38 | 32.03 | 1.38 | |
| DU-145 | 23.73 | 4.71 | 41.07 | 0.67 | 56.80 | 0.67 | |
마지막으로, 백혈병 세포주 HL-60 또는 폐 선암종 세포주 A459와 정제된 NK 세포의 공배양 후 카스파제 3/7 세포의 비율을 평가하여 암세포의 NK 세포 매개 사멸을 향상시키는 101G5 및 107G3의 능력을 검사하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 101G5 및 107G3은 선암종 A549 세포(~2배)의 NK 세포-매개 사멸을 향상시켰지만 HL-60 백혈병 세포는 그렇지 않았다. 종합하면, 이러한 관찰은 101G5 및 107G3이 고형 종양의 암세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 우선적으로 향상시킨다는 것을 나타낸다.
레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 BTN2A1의 서로 다른 에피토프를 인식한다
101G5 및 107G3 모두 BTN2A1에 결합하고 M2 대식세포 분극화를 억제하며 NK 세포 활성화 및 세포독성을 향상시키는 능력을 공유한다. 따라서 이러한 mAb가 BTN2A1 단백질에서 동일한 에피토프 영역을 인식하는지 여부를 조사하였다. 따라서 101G5 및 107G3이 "in-tandem" 설정을 사용하여 BTN2A1 결합에 대해 경쟁하는 옥텟 기반 비닝 실험이 수행되었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 101G5 및 107G3은 BTN2A1에 대한 서로의 결합을 차단하지 않았으며, 이는 이들 2개의 mAb가 BTN2A1의 동일한 에피토프 영역에 결합하지 않음을 나타낸다.
레퍼런스 mAb 101G5 및 107G3의 에피토프 매핑
BTN2A1을 특성화하기 위해 샘플에 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모리신 단백질 분해를 제공한 후 nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석을 수행하였다. 트립신 단백질 분해 후, BTN2A1의 서열에서 32개의 펩타이드가 확인되었으며, 이는 서열의 79.84%를 차지한다. BTN2A1 서열의 94.76%를 차지하는 27개의 펩타이드가 키모트립신 단백질 분해 후 확인되었다. BTN2A1 서열의 12.50%를 차지하는 2개의 펩타이드가 ASP-N 단백질 분해 후에 확인되었고; BTN2A1 서열의 89.11%를 차지하는 33개의 펩타이드가 엘라스타제 단백질 분해 후 확인되었다. 29개의 펩타이드가 BTN2A1 서열의 78.23%를 차지하는 열분해 단백질 분해 후 확인되었다. 얻은 결과를 기반으로 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써모리신 펩타이드의 중첩 매핑을 설계하였다(도 13). 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써모리신 펩타이드의 단백질 분해를 조합함으로써, BTN2A1 서열의 96.37%가 포함되었다. BTN2A1/107G3 및 BTN2A1/101G5 복합체의 에피토프를 고해상도로 결정하기 위해 단백질 복합체를 다중 효소 절단에 적용하기 전에 중수소화 가교제와 함께 인큐베이션하였다. 단백질 복합체 BTN2A1/107G3의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써모리신 단백질 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 BTN2A1과 항체 107G3 사이에 17개의 가교결합된 펩타이드를 검출하였다.
|
서열
(단백질1의 서열-단백질2의 서열) |
효소 | 단백질1 | 단백질2 | 단백질1의 서열 위치 | 단백질2의 서열 위치 |
| LTNYV-EDMEVRWFRSQFSPA-a4-b6 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 29-33 | 60-74 |
| LTNYV-EDMEVRWFRSQFSPA-a2-b9 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 29-33 | 60-74 |
| LTNYV-EDMEVRWFRSQFSPA-a4-b9 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 29-33 | 60-74 |
| WTGGDTNYNS-RWFRSQFSPAV-a8-b4 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 52-61 | 65-75 |
| YCQHSRDLPYAF-FRSQFSPAVF-a10-b3 | 키모트립신 | 107G3_VL | BTN2A1 | 91-102 | 67-76 |
| GLEWLGVIWTGGDTNYNSALKSR-SQFSPAVFVYKGGR-a18-b4 | 트립신 | 107G3_VH | BTN2A1 | 44-66 | 69-82 |
| LTNYV-EDMEVRWFRSQFSPA-a2-b13 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 29-33 | 60-74 |
| TNYVI-EDMEVRWFRSQFSPA-a3-b13 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 30-34 | 60-74 |
| YSYMHWYQQKPGQPPKL-FVYKGG-a2-b3 | 엘라스타제 | 107G3_VL | BTN2A1 | 34-50 | 76-81 |
| YCARGGQLGL-VYKGGRERTEEQMEEYRGRTTF-a4-b8 | 키모트립신 | 107G3_VH | BTN2A1 | 94-103 | 77-98 |
| KSRLS-RERTEEQMEEYRGRTTFV-a2-b4 | 엘라스타제 | 107G3_VH | BTN2A1 | 64-68 | 82-99 |
| ALKSR-VYKGGRERTEEQMEEYRGRTTF-a3-b9 | 써모리신 | 107G3_VH | BTN2A1 | 62-66 | 77-98 |
| SLTNYVISW-KGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVAL-a3-b17 | 키모트립신 | 107G3_VH | BTN2A1 | 28-36 | 79-110 |
| YCARGGQLGL-VYKGGRERTEEQMEEYRGRTTF-a4-b21 | 키모트립신 | 107G3_VH | BTN2A1 | 94-103 | 77-98 |
| GQRATISCRASKTVSSSGYSY-RGRTTFVSKDISRGSVAL-a13-b5 | 키모트립신 | 107G3_VL | BTN2A1 | 16-36 | 93-110 |
| TVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPK-TTFVSK-a11-b5 | 트립신 | 107G3_VL | BTN2A1 | 28-49 | 96-101 |
| TVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPK-TTFVSK-a8-b5 | 트립신 | 107G3_VL | BTN2A1 | 28-49 | 96-101 |
따라서 우리의 분석은 BTN2A1과 107G3 mAb 간의 상호작용이 BTN2A1에 다음 아미노산을 포함함을 나타낸다: 65, 68, 69, 72, 78; 84, 85, 95, 97, 100. 이러한 결과는 도 14A 및 도 15에 나와 있다. 단백질 복합체 BTN2A1/101G5의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써모리신 단백질 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석 BTN2A1과 항체 101G5 사이에 14개의 가교결합된 펩타이드를 검출하였다.
|
서열
(단백질1의 서열- 단백질2의 서열) |
효소 | 단백질1 | 단백질2 | 단백질1의 서열 위치 | 단백질2의 서열 위치 |
| QSPEKSLEWIGEINPSTGGTTYNQKFK-DKSVR-a16-b2 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 39-65 | 211-215 |
| QSPEKSLEWIGEINPSTGGTTYNQKFK-DKSVR-a17-b2 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 39-65 | 211-215 |
| QSPEKSLEWIGEINPSTGGTTYNQKFK-DKSVR-a25-b2 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 39-65 | 211-215 |
| FTVYYM-IRDKSVRNMSCS-a4-b5 | 써모리신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 29-34 | 209-220 |
| FKAKATLTVDK-NMSCSINNTLLGQKK-a2-b3 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 64-74 | 216-230 |
| FKAKATLTVDK-NMSCSINNTLLGQKK-a4-b3 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 64-74 | 216-230 |
| TTYNQKFKAKA-VRNMSCS-a6-b5 | 엘라스타제 | 101G5_VH | BTN2A1 | 58-68 | 214-220 |
| TTYNQKFKAKA-VRNMSCS-a8-b5 | 엘라스타제 | 101G5_VH | BTN2A1 | 58-68 | 214-220 |
| INPSTGGTTYNQK-MSCSINNT-a10-b2 | 써모리신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 51-63 | 217-224 |
| INPSTGGTTYNQK-MSCSINNT-a8-b2 | 써모리신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 51-63 | 217-224 |
| FKAKATLTVDK-NMSCSINNTLLGQKK-a4-b5 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 64-74 | 216-230 |
| LLIYRTSNLASGVPGR-SVRNMSCSINNTLLGQK-a7-b12 | 트립신 | 101G5_VL | BTN2A1 | 47-62 | 213-229 |
| ISSNYLHWYRHKPGFSPK-MSCSINNTL-a2-b8 | 써모리신 | 101G5_VL | BTN2A1 | 29-46 | 217-225 |
| FKAKATLTVDK-NMSCSINNTLLGQKK-a2-b14 | 트립신 | 101G5_VH | BTN2A1 | 64-74 | 216-230 |
따라서 우리의 분석은 BTN2A1과 101G5 간의 상호작용이 BTN2A1에 다음 아미노산을 포함함을 나타낸다: 212, 213, 218, 220, 224, 229. 이러한 결과는 도 14B와 도 16에 나와 있다.
레퍼런스 항-BTN2A 101G5 및 107G3 mAb는 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그와 교차-반응성을 나타낸다
BTN2A1 오르토로그는 시노몰구스(Macaca fascicularis)를 포함한 대부분의 비인간 영장류에 존재한다. 레퍼런스 mAb 101G5 및 107G3과 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그(cynoBTN2A1; NCBI 참조 XM_015448906.1, 인간 BTN2A1에 대한 93.31% 동일성)와의 교차-반응성을 결정하기 위해, cynoBTN2A1(cynoBTN2A1-Fc)의 엑토도메인을 포함하는 재조합 Fc-융합 단백질을 생성하고 이 단백질에 대한 레퍼런스 mAb의 결합을 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 인간과 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그 간의 레퍼런스 mAb의 친화도를 비교하기 위해 재조합 인간 BTN2A1-Fc 단백질을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 101G5 및 107G3 둘 모두는 각각 0.60 및 0.57 nM의 EC50으로 cynoBTN2A1 엑토도메인에 결합할 수 있었으며, 이는 huBTN2A1에서 수득된 상응하는 EC50(각각 0.82 및 0.56 nM)에 필적한다.
| SEQ ID NO : | 유형 | 서열의 설명 | 서열 |
| 19 | aa | 항-BTN2A1 101G5 mAb 중쇄 가변 영역( 리더 서열 포함) |
MGWNWIFILILSVTTGVHSE VQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTVYYMLWVKQSPEKSLEWIGEINPSTGGTTYNQKFKAKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARGPSFYALDYWGQGTSVTVSS- |
| 20 | aa | 항-BTN2A1 101G5 mAb 경쇄 가변 영역( 리더 서열 포함) |
MDFQMQIISLLLISVTVIVSHG EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSATSSISSNYLHWYRHKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPRTFGGGTKLEIK |
| 21 | aa | 101G5 mAb의 HCDR1 | VYYML |
| 22 | aa | 101G5 mAb의 HCDR2 | EINPSTGGTTYNQKFKA |
| 23 | aa | 101G5 mAb의 HCDR3 | GPSFYALDY |
| 24 | aa | 101G5 mAb의 LCDR1 | SATSSISSNYLH |
| 25 | aa | 101G5 mAb의 LCDR2 | RTSNLAS |
| 26 | aa | 101G5 mAb의 LCDR3 | QQGSSIPRT |
| 27 | nt | 101G5 mAb의 HCDR1 | GTCTACTACATGCTC |
| 28 | nt | 101G5 mAb의 HCDR2 | GAGATTAATCCTAGCACTGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGCC |
| 29 | nt | 101G5 mAb의 HCDR3 | GGCCCGAGCTTTTATGCTCTGGACTAC |
| 30 | nt | 101G5 mAb의 LCDR1 | AGTGCCACCTCTAGTATAAGTTCCAATTACTTGCAT |
| 31 | nt | 101G5 mAb의 LCDR2 | AGGACATCCAATCTGGCTTCT |
| 32 | nt | 101G5 mAb의 LCDR3 | CAGCAGGGTAGTAGTATACCACGCACG |
| 33 | nt | 101G5 mAb 중쇄 가변 영역( 리더 서열 포함) | ATGGGATGGAACTGGATCTTTATTTTAATCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCT GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGTCTACTACATGCTCTGGGTGAAACAAAGTCCTGAAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCACTGGTGGTACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGGGGCCCGAGCTTTTATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA |
| 34 | nt | 101G5 mAb 경쇄 가변 영역( 리더 서열 포함) | A TGGATTTTCAGATGCAGATTATCAGCTTGCTGCTAATCAGTGTCACAGTCATAGTGTCTCATGGA GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCACCTCTAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCGACATAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGGTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCACGCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA |
| 35 | aa | Macaca fascicularis (Cynomolgus monkey) BTN2A1 | MQRQFSKASRPCLPWVLMEPAAALHFSLPASLILLLLLLRLCALVSAQFTVVGPTDPILAMVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALIIHNVTAQENGTYRCYFQEGRSYDEAILHLMVAGLGSKPLVEMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRDPYGRVVPALKEVFPPDTDGLFMVTTAVIIRDKSMRNMSCSISDTLLGQKKESVIFIPESFMPSVSPCVVALPIIVVFLMIIIAVCIYWINRLQKETKILSGEKESERKTREIAVKELKKERVQKEKELQVKEQLQEELRWRRTVLHAVDVVLDPDTAHPDLLLSEDRRSVRRCPLGHLGESVPDNPERFNSEPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKEEVLLRPRNGFWTLEMCKGQYRALSSPKRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRLAFSVPVRPFFRIGSDDSPIFICPALTGASGITVPEEGLILHRVGTNQSLMPVGTRCYGHGMRPTGFIRMREERGIHRTTREEREPDMQNFDLGAHWSNNLPSARSREFLNSDLVPDHSLESPVTPGLANKTGEPQAEVTCLCFSLPSSELRAFPSTATNHNHKATALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITDPFFRNAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATKQEISLRGGEKSLAYHGTHISYLAAPERWEMAVFPNSGLPRCLLTLILLQLPKLDSAPFDVIGPPEPILAVVGEDAELPCRLSPNASAEHLELRWFRKKVSPAVLVHRDGREQEAEQMPEYRGRATLVQDGIAEGRVALRIRGVRVSDDGEYTCFFREDGSYEEALVHLKVAALGSDPHISMQVQENGEIWLECTSVGWYPEPQVQWRTSKGEKFPSTSESRNPDEEGLFTVAASVIIRDTSVKNVSCYIQNLLLGQEKEVEIFIPG |
참조:
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 참고문헌이 본 발명이 속하는 기술의 상태를 기술한다. 이들 참고문헌의 개시내용은 본 개시내용에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> IMCHECK THERAPEUTICS
INSERM
CNRS
Universit?d'Aix-Marseille
Institut Jean Paoli & Irene Calmettes
<120> ANTIBODIES HAVING SPECIFICITY FOR BTN2 AND USES THEREOF
<130> BCT200062 QT
<150> EP19305345.1
<151> 2019-03-20
<150> EP19219691.3
<151> 2019-12-24
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Met Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Gly Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gln Leu Gly Leu Arg Gly Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 2
<211> 131
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Thr
35 40 45
Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asn Tyr Val Ile Ser
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Val Ile Trp Thr Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Gly Gln Leu Gly Leu Arg Gly Tyr
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Tyr Ala
1 5
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
aactatgtta taagc 15
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
gtaatttgga ctggtggaga cacaaattat aattcagctc tcaaatcc 48
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
gggggacagc tcgggctacg tggttat 27
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
agggccagca aaactgtcag ttcatctggc tatagttata tgcac 45
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cttgcatcca acctagaatc t 21
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
cagcacagta gggatcttcc gtacgcg 27
<210> 15
<211> 408
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
atggctgtcc tggcgctact cctctgcctg atgactttcc caagctgtgc cctgtcccag 60
gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcaca 120
tgcactgtct ctgggttctc attaaccaac tatgttataa gctgggttcg ccagccacca 180
ggaaagggtc tggagtggct tggagtaatt tggactggtg gagacacaaa ttataattca 240
gctctcaaat ccagactgag catcagcaaa gacaactcca agagtcaagt tttcttaaaa 300
atgaacagtc tgcaaactgg tgacacagcc aggtactact gtgccagagg gggacagctc 360
gggctacgtg gttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 408
<210> 16
<211> 393
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc taacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
atctcatgca gggccagcaa aactgtcagt tcatctggct atagttatat gcactggtac 180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttccgtac 360
gcgttcggag gggggaccaa gttggaaata aaa 393
<210> 17
<211> 527
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Glu Ser Ala Ala Ala Leu His Phe Ser Arg Pro Ala Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ser Leu Cys Ala Leu Val Ser Ala Gln Phe Ile Val
20 25 30
Val Gly Pro Thr Asp Pro Ile Leu Ala Thr Val Gly Glu Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Arg Cys His Leu Ser Pro Glu Lys Asn Ala Glu Asp Met Glu Val
50 55 60
Arg Trp Phe Arg Ser Gln Phe Ser Pro Ala Val Phe Val Tyr Lys Gly
65 70 75 80
Gly Arg Glu Arg Thr Glu Glu Gln Met Glu Glu Tyr Arg Gly Arg Thr
85 90 95
Thr Phe Val Ser Lys Asp Ile Ser Arg Gly Ser Val Ala Leu Val Ile
100 105 110
His Asn Ile Thr Ala Gln Glu Asn Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Phe Gln
115 120 125
Glu Gly Arg Ser Tyr Asp Glu Ala Ile Leu His Leu Val Val Ala Gly
130 135 140
Leu Gly Ser Lys Pro Leu Ile Ser Met Arg Gly His Glu Asp Gly Gly
145 150 155 160
Ile Arg Leu Glu Cys Ile Ser Arg Gly Trp Tyr Pro Lys Pro Leu Thr
165 170 175
Val Trp Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Val Ala Pro Ala Leu Lys Glu Val
180 185 190
Ser Met Pro Asp Ala Asp Gly Leu Phe Met Val Thr Thr Ala Val Ile
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Ser Val Arg Asn Met Ser Cys Ser Ile Asn Asn Thr
210 215 220
Leu Leu Gly Gln Lys Lys Glu Ser Val Ile Phe Ile Pro Glu Ser Phe
225 230 235 240
Met Pro Ser Val Ser Pro Cys Ala Val Ala Leu Pro Ile Ile Val Val
245 250 255
Ile Leu Met Ile Pro Ile Ala Val Cys Ile Tyr Trp Ile Asn Lys Leu
260 265 270
Gln Lys Glu Lys Lys Ile Leu Ser Gly Glu Lys Glu Phe Glu Arg Glu
275 280 285
Thr Arg Glu Ile Ala Leu Lys Glu Leu Glu Lys Glu Arg Val Gln Lys
290 295 300
Glu Glu Glu Leu Gln Val Lys Glu Lys Leu Gln Glu Glu Leu Arg Trp
305 310 315 320
Arg Arg Thr Phe Leu His Ala Val Asp Val Val Leu Asp Pro Asp Thr
325 330 335
Ala His Pro Asp Leu Phe Leu Ser Glu Asp Arg Arg Ser Val Arg Arg
340 345 350
Cys Pro Phe Arg His Leu Gly Glu Ser Val Pro Asp Asn Pro Glu Arg
355 360 365
Phe Asp Ser Gln Pro Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Phe Ala Ser Gly
370 375 380
Lys His Tyr Trp Glu Val Glu Val Glu Asn Val Ile Glu Trp Thr Val
385 390 395 400
Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Glu Arg Lys Gly Glu Val Leu Leu Ile
405 410 415
Pro Gln Asn Gly Phe Trp Thr Leu Glu Met His Lys Gly Gln Tyr Arg
420 425 430
Ala Val Ser Ser Pro Asp Arg Ile Leu Pro Leu Lys Glu Ser Leu Cys
435 440 445
Arg Val Gly Val Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly Asp Val Ser Phe Tyr
450 455 460
Asn Met Arg Asp Arg Ser His Ile Tyr Thr Cys Pro Arg Ser Ala Phe
465 470 475 480
Ser Val Pro Val Arg Pro Phe Phe Arg Leu Gly Cys Glu Asp Ser Pro
485 490 495
Ile Phe Ile Cys Pro Ala Leu Thr Gly Ala Asn Gly Val Thr Val Pro
500 505 510
Glu Glu Gly Leu Thr Leu His Arg Val Gly Thr His Gln Ser Leu
515 520 525
<210> 18
<211> 523
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Glu Pro Ala Ala Ala Leu His Phe Ser Leu Pro Ala Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Cys Ala Leu Val Ser Ala
20 25 30
Gln Phe Thr Val Val Gly Pro Ala Asn Pro Ile Leu Ala Met Val Gly
35 40 45
Glu Asn Thr Thr Leu Arg Cys His Leu Ser Pro Glu Lys Asn Ala Glu
50 55 60
Asp Met Glu Val Arg Trp Phe Arg Ser Gln Phe Ser Pro Ala Val Phe
65 70 75 80
Val Tyr Lys Gly Gly Arg Glu Arg Thr Glu Glu Gln Met Glu Glu Tyr
85 90 95
Arg Gly Arg Ile Thr Phe Val Ser Lys Asp Ile Asn Arg Gly Ser Val
100 105 110
Ala Leu Val Ile His Asn Val Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ile Tyr Arg
115 120 125
Cys Tyr Phe Gln Glu Gly Arg Ser Tyr Asp Glu Ala Ile Leu Arg Leu
130 135 140
Val Val Ala Gly Leu Gly Ser Lys Pro Leu Ile Glu Ile Lys Ala Gln
145 150 155 160
Glu Asp Gly Ser Ile Trp Leu Glu Cys Ile Ser Gly Gly Trp Tyr Pro
165 170 175
Glu Pro Leu Thr Val Trp Arg Asp Pro Tyr Gly Glu Val Val Pro Ala
180 185 190
Leu Lys Glu Val Ser Ile Ala Asp Ala Asp Gly Leu Phe Met Val Thr
195 200 205
Thr Ala Val Ile Ile Arg Asp Lys Tyr Val Arg Asn Val Ser Cys Ser
210 215 220
Val Asn Asn Thr Leu Leu Gly Gln Glu Lys Glu Thr Val Ile Phe Ile
225 230 235 240
Pro Glu Ser Phe Met Pro Ser Ala Ser Pro Trp Met Val Ala Leu Ala
245 250 255
Val Ile Leu Thr Ala Ser Pro Trp Met Val Ser Met Thr Val Ile Leu
260 265 270
Ala Val Phe Ile Ile Phe Met Ala Val Ser Ile Cys Cys Ile Lys Lys
275 280 285
Leu Gln Arg Glu Lys Lys Ile Leu Ser Gly Glu Lys Lys Val Glu Gln
290 295 300
Glu Glu Lys Glu Ile Ala Gln Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Trp Arg
305 310 315 320
Arg Thr Phe Leu His Ala Ala Asp Val Val Leu Asp Pro Asp Thr Ala
325 330 335
His Pro Glu Leu Phe Leu Ser Glu Asp Arg Arg Ser Val Arg Arg Gly
340 345 350
Pro Tyr Arg Gln Arg Val Pro Asp Asn Pro Glu Arg Phe Asp Ser Gln
355 360 365
Pro Cys Val Leu Gly Trp Glu Ser Phe Ala Ser Gly Lys His Tyr Trp
370 375 380
Glu Val Glu Val Glu Asn Val Met Val Trp Thr Val Gly Val Cys Arg
385 390 395 400
His Ser Val Glu Arg Lys Gly Glu Val Leu Leu Ile Pro Gln Asn Gly
405 410 415
Phe Trp Thr Leu Glu Met Phe Gly Asn Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Glu Arg Ile Leu Pro Leu Lys Glu Ser Leu Cys Arg Val Gly Val
435 440 445
Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly Asp Val Ser Phe Tyr Asn Met Arg Asp
450 455 460
Arg Ser His Ile Tyr Thr Cys Pro Arg Ser Ala Phe Thr Val Pro Val
465 470 475 480
Arg Pro Phe Phe Arg Leu Gly Ser Asp Asp Ser Pro Ile Phe Ile Cys
485 490 495
Pro Ala Leu Thr Gly Ala Ser Gly Val Met Val Pro Glu Glu Gly Leu
500 505 510
Lys Leu His Arg Val Gly Thr His Gln Ser Leu
515 520
<210> 19
<211> 137
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 19
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Val Tyr Tyr Met Leu Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Ser Phe Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 20
<211> 130
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Met Asp Phe Gln Met Gln Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ile Ser Val Thr
1 5 10 15
Val Ile Val Ser His Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr
20 25 30
Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Arg His Lys Pro Gly
50 55 60
Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Gly Ser Ser Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys
130
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
Val Tyr Tyr Met Leu
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
Gly Pro Ser Phe Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 27
gtctactaca tgctc 15
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 28
gagattaatc ctagcactgg tggtactacc tacaaccaga agttcaaggc c 51
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
ggcccgagct tttatgctct ggactac 27
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 30
agtgccacct ctagtataag ttccaattac ttgcat 36
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 31
aggacatcca atctggcttc t 21
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 32
cagcagggta gtagtatacc acgcacg 27
<210> 33
<211> 411
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 33
atgggatgga actggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggttactc attcactgtc tactacatgc tctgggtgaa acaaagtcct 180
gaaaagagcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca ctggtggtac tacctacaac 240
cagaagttca aggccaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag gggcccgagc 360
ttttatgctc tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411
<210> 34
<211> 390
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 34
atggattttc agatgcagat tatcagcttg ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtct 60
catggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca accaccatgg ctgcatctcc cggggagaag 120
atcactatca cctgcagtgc cacctctagt ataagttcca attacttgca ttggtatcga 180
cataagccag gattctcccc taaactcttg atttatagga catccaatct ggcttctgga 240
gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aattggcacc 300
atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtagtagtat accacgcacg 360
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 390
<210> 35
<211> 1083
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 35
Met Gln Arg Gln Phe Ser Lys Ala Ser Arg Pro Cys Leu Pro Trp Val
1 5 10 15
Leu Met Glu Pro Ala Ala Ala Leu His Phe Ser Leu Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Cys Ala Leu Val Ser Ala Gln
35 40 45
Phe Thr Val Val Gly Pro Thr Asp Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu
50 55 60
Asn Thr Thr Leu Arg Cys His Leu Ser Pro Glu Lys Asn Ala Glu Asp
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Trp Phe Arg Ser Gln Phe Ser Pro Ala Val Phe Val
85 90 95
Tyr Lys Gly Gly Arg Glu Arg Thr Glu Glu Gln Met Glu Glu Tyr Arg
100 105 110
Gly Arg Thr Thr Phe Val Ser Lys Asp Ile Ser Arg Gly Ser Val Ala
115 120 125
Leu Ile Ile His Asn Val Thr Ala Gln Glu Asn Gly Thr Tyr Arg Cys
130 135 140
Tyr Phe Gln Glu Gly Arg Ser Tyr Asp Glu Ala Ile Leu His Leu Met
145 150 155 160
Val Ala Gly Leu Gly Ser Lys Pro Leu Val Glu Met Arg Gly His Glu
165 170 175
Asp Gly Gly Ile Arg Leu Glu Cys Ile Ser Arg Gly Trp Tyr Pro Lys
180 185 190
Pro Leu Thr Val Trp Arg Asp Pro Tyr Gly Arg Val Val Pro Ala Leu
195 200 205
Lys Glu Val Phe Pro Pro Asp Thr Asp Gly Leu Phe Met Val Thr Thr
210 215 220
Ala Val Ile Ile Arg Asp Lys Ser Met Arg Asn Met Ser Cys Ser Ile
225 230 235 240
Ser Asp Thr Leu Leu Gly Gln Lys Lys Glu Ser Val Ile Phe Ile Pro
245 250 255
Glu Ser Phe Met Pro Ser Val Ser Pro Cys Val Val Ala Leu Pro Ile
260 265 270
Ile Val Val Phe Leu Met Ile Ile Ile Ala Val Cys Ile Tyr Trp Ile
275 280 285
Asn Arg Leu Gln Lys Glu Thr Lys Ile Leu Ser Gly Glu Lys Glu Ser
290 295 300
Glu Arg Lys Thr Arg Glu Ile Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Gln Lys Glu Lys Glu Leu Gln Val Lys Glu Gln Leu Gln Glu Glu
325 330 335
Leu Arg Trp Arg Arg Thr Val Leu His Ala Val Asp Val Val Leu Asp
340 345 350
Pro Asp Thr Ala His Pro Asp Leu Leu Leu Ser Glu Asp Arg Arg Ser
355 360 365
Val Arg Arg Cys Pro Leu Gly His Leu Gly Glu Ser Val Pro Asp Asn
370 375 380
Pro Glu Arg Phe Asn Ser Glu Pro Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Phe
385 390 395 400
Ala Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Glu Val Glu Asn Val Ile Glu
405 410 415
Trp Thr Val Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Glu Arg Lys Glu Glu Val
420 425 430
Leu Leu Arg Pro Arg Asn Gly Phe Trp Thr Leu Glu Met Cys Lys Gly
435 440 445
Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Ser Pro Lys Arg Ile Leu Pro Leu Lys Glu
450 455 460
Ser Leu Cys Arg Val Gly Val Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly Asp Val
465 470 475 480
Ser Phe Tyr Asn Met Arg Asp Arg Ser His Ile Tyr Thr Cys Pro Arg
485 490 495
Leu Ala Phe Ser Val Pro Val Arg Pro Phe Phe Arg Ile Gly Ser Asp
500 505 510
Asp Ser Pro Ile Phe Ile Cys Pro Ala Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ile
515 520 525
Thr Val Pro Glu Glu Gly Leu Ile Leu His Arg Val Gly Thr Asn Gln
530 535 540
Ser Leu Met Pro Val Gly Thr Arg Cys Tyr Gly His Gly Met Arg Pro
545 550 555 560
Thr Gly Phe Ile Arg Met Arg Glu Glu Arg Gly Ile His Arg Thr Thr
565 570 575
Arg Glu Glu Arg Glu Pro Asp Met Gln Asn Phe Asp Leu Gly Ala His
580 585 590
Trp Ser Asn Asn Leu Pro Ser Ala Arg Ser Arg Glu Phe Leu Asn Ser
595 600 605
Asp Leu Val Pro Asp His Ser Leu Glu Ser Pro Val Thr Pro Gly Leu
610 615 620
Ala Asn Lys Thr Gly Glu Pro Gln Ala Glu Val Thr Cys Leu Cys Phe
625 630 635 640
Ser Leu Pro Ser Ser Glu Leu Arg Ala Phe Pro Ser Thr Ala Thr Asn
645 650 655
His Asn His Lys Ala Thr Ala Leu Gly Ser Asp Leu His Ile Glu Val
660 665 670
Lys Gly Tyr Glu Asp Gly Gly Ile His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly
675 680 685
Trp Tyr Pro Gln Pro Gln Ile Gln Trp Ser Asn Thr Lys Gly Gln His
690 695 700
Ile Pro Ala Val Lys Ala Pro Val Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr
705 710 715 720
Ala Val Ala Ala Ser Val Ile Met Arg Gly Ser Ser Gly Glu Gly Val
725 730 735
Ser Cys Ile Ile Arg Asn Ser Leu Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser
740 745 750
Ile Ser Ile Thr Asp Pro Phe Phe Arg Asn Ala Gln Pro Trp Ile Ala
755 760 765
Ala Leu Ala Gly Thr Leu Pro Ile Ser Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala
770 775 780
Ser Tyr Phe Leu Trp Arg Gln Gln Lys Glu Lys Ile Ala Leu Ser Arg
785 790 795 800
Glu Thr Glu Arg Glu Arg Glu Met Lys Glu Met Gly Tyr Ala Ala Thr
805 810 815
Lys Gln Glu Ile Ser Leu Arg Gly Gly Glu Lys Ser Leu Ala Tyr His
820 825 830
Gly Thr His Ile Ser Tyr Leu Ala Ala Pro Glu Arg Trp Glu Met Ala
835 840 845
Val Phe Pro Asn Ser Gly Leu Pro Arg Cys Leu Leu Thr Leu Ile Leu
850 855 860
Leu Gln Leu Pro Lys Leu Asp Ser Ala Pro Phe Asp Val Ile Gly Pro
865 870 875 880
Pro Glu Pro Ile Leu Ala Val Val Gly Glu Asp Ala Glu Leu Pro Cys
885 890 895
Arg Leu Ser Pro Asn Ala Ser Ala Glu His Leu Glu Leu Arg Trp Phe
900 905 910
Arg Lys Lys Val Ser Pro Ala Val Leu Val His Arg Asp Gly Arg Glu
915 920 925
Gln Glu Ala Glu Gln Met Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Ala Thr Leu Val
930 935 940
Gln Asp Gly Ile Ala Glu Gly Arg Val Ala Leu Arg Ile Arg Gly Val
945 950 955 960
Arg Val Ser Asp Asp Gly Glu Tyr Thr Cys Phe Phe Arg Glu Asp Gly
965 970 975
Ser Tyr Glu Glu Ala Leu Val His Leu Lys Val Ala Ala Leu Gly Ser
980 985 990
Asp Pro His Ile Ser Met Gln Val Gln Glu Asn Gly Glu Ile Trp Leu
995 1000 1005
Glu Cys Thr Ser Val Gly Trp Tyr Pro Glu Pro Gln Val Gln Trp
1010 1015 1020
Arg Thr Ser Lys Gly Glu Lys Phe Pro Ser Thr Ser Glu Ser Arg
1025 1030 1035
Asn Pro Asp Glu Glu Gly Leu Phe Thr Val Ala Ala Ser Val Ile
1040 1045 1050
Ile Arg Asp Thr Ser Val Lys Asn Val Ser Cys Tyr Ile Gln Asn
1055 1060 1065
Leu Leu Leu Gly Gln Glu Lys Glu Val Glu Ile Phe Ile Pro Gly
1070 1075 1080
Claims (17)
- 다음의 기능 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 항-부티로필린-2A(butyrophilin-2A; BTN2A) 항체:
i. 단핵세포의 M2 대식세포로의 분극화를 억제하고,
ii. M2 대식세포의 항종양 M1 대식세포로의 복귀를 유도하며,
iii. NK 세포 활성화를 직접적으로 유발하고,
iv. NK 세포-매개 세포독성을 향상시킨다. - 제1항에 있어서,
- (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 레퍼런스 항체 mAb 107G3, 또는
- (i) SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (ii) SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 레퍼런스 항체 mAb 101G5과 BTN2A1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항-BTN2 항체. - 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 17의 위치 65, 68, 69, 72, 78, 84, 85, 95, 97 및 100에 위치한 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체. - 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 17의 위치 212, 213, 218, 220, 224 및 229에 위치한 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 BTN3 이소폼과 교차-반응하지 않고, 및/또는 시노몰구스 BTN2A1 오르토로그와 교차-반응하는 항체. - 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
- SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
- SEQ ID NO: 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 및 SEQ ID NO: 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3를 포함하는 항-BTN2A1 항체. - 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
- SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-BTN2A1 항체. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다음의 기능 중 적어도 하나를 더 갖는 항-BTN2A 항체:
i. γ9Vδ2 T 세포의 세포용해 분자의 분비를 활성화하고,
ii. Vγ9Vδ2 T세포의 세포용해 기능을 활성화하며, 및/또는
iii. Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 활성화한다. - 제8항에 있어서,
(i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 레퍼런스 쥐(murine) 항체 mAb 107G3과 BTN2A1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항-BTN2A 항체. - 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
- SEQ ID NO: 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
- SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-BTN2A 항체. - 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 BTN2A1 이소폼에 대해 특이성을 갖는 항-BTN2A 항체. - 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
인간, 키메라 또는 인간화 항체인 항-BTN2A 항체. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-BTN2A 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자.
- 제13항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
요법(therapy)에 사용하기 위한 항-BTN2A 항체. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 항-BTN2A 항체. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항-BTN2A 항체 및 적어도 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
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