KR20210135779A - 다공성 실리콘 마이크로 입자를 포함하는 영상화용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다공성 실리콘 마이크로 입자를 포함하는 영상화용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자의 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화제는 기존 영상화제와 비교하여 생체 내에서 번짐 현상 없이 지속적으로 영상 신호를 제공하므로, 생체 내 목표 조직의 정확한 환부 확인을 통해 수술 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에 따른 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자의 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화제는 기존 영상화제와 비교하여 생체 내에서 번짐 현상 없이 지속적으로 영상 신호를 제공하므로, 생체 내 목표 조직의 정확한 환부 확인을 통해 수술 안정성을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 다공성 실리콘 마이크로 입자를 포함하는 영상화용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물에 관한 것이다.
영상화용 조성물은 여러 가지 영상 기술 중의 임의의 하나를 사용하여 발생된 영상에서 체내의 가시화, 특히 조영을 개선시키기 위해 사용되는 재료이다. 이들 기술 또는 양상에는 x-선, 컴퓨터 단층촬영 촬영(computed tomography, CT), 자기 공명 영상(MRI), 섬광조영술, 형광 및 초음파가 포함되지만, 이로써 제한되지 않는다. 영상화용 조성물은 기관 또는 조직을 포함한 신체 또는 신체의 일부가 영상화 또는 치료를 위한 정확한 위치 또는 시야에서 정확하게 위치를 잡는데 사용될 수 있다.
한편, 폐암은 폐 조직에서 조절되지 않는 세포 성장으로 특정되는 악성 폐 종양으로, 컴퓨터 단층 촬영 (CT)을 통해 환자의 폐암 발병 여부를 조사할 수 있다. 폐암 환자에게 나타나는 단독 폐 결절 (SPNs)과 아열 결절 (SNs)은 이질적 특징과 악성 잠재력을 나타낸다. 폐에서 상기 SPNs와 SNs를 제거하기 위한 폐암 초기의 수술은 필수적이다.
초기 단계의 폐 종양의 절제술에 있어 개흉술(thoracotomy)보다 비디오 흉강경 수술(Video-assisted thoracoscopic surgery, VATS)이 환자의 몸에 부담을 줄이고 생존률을 높일 수 있다 (Kaseda. S. et al., Ann. Thorac. Surg. 2000, 70, 1644; Whitson. B. A. et al., Ann. Thorac. Surg. 2008, 86, 2008).
최근 CT 촬영을 이용한 비디오 흉강경 수술 (VATS)은 조직 샘플 생검과 폐암 수술에서 최소 침습과 높은 안정성으로 인해 표준 방법이 되었다. 그러나 (i) SPNs와 SNs는 매우 작으며 흉막으로부터 멀리 떨어져 위치하고, (ii) 폐 붕괴에 의해 이전에 결정된 CT 이미지와 왜곡된 현장 이미지가 불일치한다는 두 가지 주요 원인으로 인해 VATS 중에 SPNs와 SNs 위치를 정확히 파악하기 어렵다는 문제가 있다. 따라서, VATS를 실시하기 전에 크기가 작고 깊이 위치한 SPNs와 SNs를 정확하게 표지하는 것이 이미지 왜곡을 최소화하고 VATS 수술의 성공률을 높이기 위해 필수적이다.
최근 다양한 폐 국소화 표적 기술 (LLMT)과 금속 소재 (훅-와이어, 마이크로-코일), 유기 염료 (메틸렌 블루; MB, 인디고카민; IC), 방사성 추적기 (T-cm) 및 조영제 (바륨 설페이트, 리피오돌)와 같은 제재가 소개되고 있다. 그 중 CT-기반 표적 제재인 리피오돌은 수술 시 환자가 느끼는 낮은 불편함, 간단하고 쉬운 사용법, 경미한 염증 반응, 방사선 비노출 및 병변 깊이에서의 정보 제공 때문에 VATS에서 가장 널리 사용되고 있다.
리피오돌은 양귀비 씨 오일과 요오드로 구성된 방사선-비투과성 조영제이다. SPNs와 SNs에서의 VATS에서 많은 장점이 있음에도 불구하고 리피오돌은 흉막 내에서의 유출 위험과 낮은 수용성으로 인한 색전증이라는 심각한 결점을 가지고 있다. (17.
Y. D. Kim, Y. J. Jeong, I. Hoseok, J. S. Cho, J. W. Lee, H. J. Kim, S. H. Lee and D. H. Kim, Actaradiol., 2011, 52, 64-69.) 또한 기관 근처에 표지를 하게 될 경우 호흡에 의한 압력으로 폐 전체로 번지거나 기관지로 번지는 부작용이 있으며, 주입 후 확산이 빠르기 때문에 제거하려는 종양 부위보다 더 큰 부위를 제거하게 될 가능성이 있다. 따라서, 특정 부위에 주입한 후 다른 기관으로 번지지 않는 새로운 영상화 물질 개발이 필요하다.
본 발명자들은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자를 부착한 신규 복합체를 개발하였다. 생체 내 조직에 주입하였을 때 독성 반응을 보이지 않고, 강한 영상신호를 제공하며, 주입한 부위 주변으로 퍼지지 않는 특성을 가진 영상화용 조영제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체 (pSi-Ag-MPs)를 개발하여 생체 내 주입 후 표지하는 특정 부위 외에 다른 기관으로 번지지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석시킨 생체 조직 영상화제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 a) 다공성 실리콘 마이크로 입자를 산화하는 단계; 및 b) 상기 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자를 부착하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 생체 조직 영상화용 조성물을 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화제의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석시킨 생체 조직 영상화제를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 다공성 실리콘 마이크로 입자를 산화하는 단계; 및 b) 상기 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자를 부착하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생체 조직 영상화용 조성물을 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자의 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화제는 기존 영상화제와 비교하여 생체 내에서 번짐 현상 없이 지속적으로 안정적인 영상신호를 제공하므로, 생체 내 목표 조직의 정확한 환부 확인을 통해 수술 안정성을 높일 수 있다.
도 1은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자 복합체의 제작방법 모식도이다.
도 2는 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자 복합체의 개략도이다.
도 3은 다공성 실리콘 마이크로 입자, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 본 발명에 따른 복합체의 주사전자현미경 영상 결과이다.
도 4는 복합체의 합성 단계에 따른 푸리에 변환 적외선 (Fourier transform infrared, FTIR) 측정 결과이다.
도 5는 복합체의 합성 단계에 따른 라만 분광법 (Raman Spectroscopy, RAMAN) 측정 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 복합체의 실리콘, 산소 및 은의 에너지 분산 X-선분광법 (Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX) 원소 분석 이미지 결과이다.
도 7은 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자의 실리콘, 산소 및 은의 에너지 분산 X-선분광법 (Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX) 원소 분석 이미지 결과이다.
도 8은 다공성 실리콘 마이크로 입자, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 본 발명에 따른 복합체의 에너지 분산 X-선 분광법측정 결과이다.
도 9는 복합체의 합성 단계에 따른 X선회절 분석 (X-Ray Diffraction, XRD) 결과이다.
도 10은 복합체의 합성 단계에 따른 질소 흡탈착 (nitrogen adsorption desorption, BET) 측정 결과이다.
도 11은 복합체의 합성 이전의 CT 신호와 합성 이후 용매 조성비를 달리하여 각각 측정한 CT 신호 세기의 측정 결과이다.
도 12는 75% 글리세롤 혼합물의 주사기 주입 성공을 확인한 결과이다.
도 13은 복합체의 상층액을 시간 단위로 수집한 후 CT 신호 세기를 확인한 결과이다.
도 14는 도 13의 복합체의 상층액을 시간 단위로 수집한 후 CT신호 세기를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 15는 토끼의 CT 영상 촬영의 이해를 돕기 위한 모식도이다.
도 16은 토끼 흉부에서 복합체를 이용한 생체 내 폐 CT 영상 확인 결과이다.
도 17은 상기 CT 영상에서 추출된 HU signal을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 18은 리피오돌과 상기 복합체 주입 후 토끼 폐의 생체 내 CT 영상을 확인한 결과이다.
도 19는 복합체 주입 후 마우스 혈청에서 ALT와 AST 수준이 유지되는 것을 확인한 생체 내 독성 평가 자료이다.
도 20은 복합체 주입 후 마우스 혈청에서 TNF-α 수준이 유지되는 것을 확인한 생체 내 독성 평가 자료이다.
도 21은 마우스 생체 내 복합체 처리 8시간 이후 세포 집단 활성 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 22는 마우스 생체 내 복합체 처리 8시간 이후 마우스의 간 및 신장 조직 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 23은 마우스 생체 내 복합체 처리 24시간 이후 세포 집단 활성 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 24는 마우스 생체 내 복합체 처리 24시간 이후 마우스의 간 및 신장 조직 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 25는 마우스 생체 내 복합체 처리 8시간 및 24시간 이후 간, 신장 및 비장의 크기 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 2는 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자 복합체의 개략도이다.
도 3은 다공성 실리콘 마이크로 입자, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 본 발명에 따른 복합체의 주사전자현미경 영상 결과이다.
도 4는 복합체의 합성 단계에 따른 푸리에 변환 적외선 (Fourier transform infrared, FTIR) 측정 결과이다.
도 5는 복합체의 합성 단계에 따른 라만 분광법 (Raman Spectroscopy, RAMAN) 측정 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 복합체의 실리콘, 산소 및 은의 에너지 분산 X-선분광법 (Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX) 원소 분석 이미지 결과이다.
도 7은 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자의 실리콘, 산소 및 은의 에너지 분산 X-선분광법 (Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX) 원소 분석 이미지 결과이다.
도 8은 다공성 실리콘 마이크로 입자, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 본 발명에 따른 복합체의 에너지 분산 X-선 분광법측정 결과이다.
도 9는 복합체의 합성 단계에 따른 X선회절 분석 (X-Ray Diffraction, XRD) 결과이다.
도 10은 복합체의 합성 단계에 따른 질소 흡탈착 (nitrogen adsorption desorption, BET) 측정 결과이다.
도 11은 복합체의 합성 이전의 CT 신호와 합성 이후 용매 조성비를 달리하여 각각 측정한 CT 신호 세기의 측정 결과이다.
도 12는 75% 글리세롤 혼합물의 주사기 주입 성공을 확인한 결과이다.
도 13은 복합체의 상층액을 시간 단위로 수집한 후 CT 신호 세기를 확인한 결과이다.
도 14는 도 13의 복합체의 상층액을 시간 단위로 수집한 후 CT신호 세기를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 15는 토끼의 CT 영상 촬영의 이해를 돕기 위한 모식도이다.
도 16은 토끼 흉부에서 복합체를 이용한 생체 내 폐 CT 영상 확인 결과이다.
도 17은 상기 CT 영상에서 추출된 HU signal을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 18은 리피오돌과 상기 복합체 주입 후 토끼 폐의 생체 내 CT 영상을 확인한 결과이다.
도 19는 복합체 주입 후 마우스 혈청에서 ALT와 AST 수준이 유지되는 것을 확인한 생체 내 독성 평가 자료이다.
도 20은 복합체 주입 후 마우스 혈청에서 TNF-α 수준이 유지되는 것을 확인한 생체 내 독성 평가 자료이다.
도 21은 마우스 생체 내 복합체 처리 8시간 이후 세포 집단 활성 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 22는 마우스 생체 내 복합체 처리 8시간 이후 마우스의 간 및 신장 조직 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 23은 마우스 생체 내 복합체 처리 24시간 이후 세포 집단 활성 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 24는 마우스 생체 내 복합체 처리 24시간 이후 마우스의 간 및 신장 조직 변화 없음을 확인한 결과이다.
도 25는 마우스 생체 내 복합체 처리 8시간 및 24시간 이후 간, 신장 및 비장의 크기 변화 없음을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 다공성 실리콘 마이크로 입자의 크기는 1 내지 10 μm일 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 7 μm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 μm일 수 있다.
본 발명에 따른 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 복합체는 실리콘 원소, 산소 원소 및 은 원소를 100 : 100 내지 120 : 15 내지 30의 중량비로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 100 : 105 내지 115 : 20 내지 25의 중량비로 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 100 : 113 : 24의 중량비로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 복합체를 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석시킨 생체 조직 영상화제를 제공한다.
본 발명에 따른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 혼합액은 글리세롤 용액과 물이 2 내지 4 : 1의 비율로 혼합된 용액일 수 있으며, 바람직하게는 2.5 내지 3.5 : 1의 비율로 혼합된 용액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 3 : 1의 비율로 혼합된 용액일 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 생체 조직 영상화는 자기 공명 영상(MRI), X-선 촬영, 섬광조영술, 형광 및 초음파 및 컴퓨터단층촬영 (CT)에 의하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 컴퓨터단층촬영 (CT)에 의하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 생체 조직은 폐, 간, 심장, 콩팥 및 위장을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폐 조직일 수 있다.
또한 본 발명은 a) 다공성 실리콘 마이크로 입자를 산화하는 단계; 및 b) 상기 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자를 부착하는 단계를 포함하는, 생체 조직 영상화용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 다공성 실리콘 마이크로 입자는 산화된 Si 골격 (SiO2)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 은 나노입자의 부착은비스아민실버 수용액 ([Ag(NH3)2)+])을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 또다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 산화는 붕산염 (borate)에 의해 이루어질 수 있다.
또한 본 발명은 상기 생체 조직 영상화용 조성물을 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 혼합액은 글리세롤 용액과 물이 2 내지 4 : 1의 비율로 혼합된 용액일 수 있으며, 바람직하게는 2.5 내지 3.5 : 1의 비율로 혼합된 용액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 3 : 1의 비율로 혼합된 용액일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "다공성 실리콘 마이크로 입자"란 입자의 크기가 1 내지 10 μm이며 기공 크기가 5 내지 100 nm이며 실리콘 원소, 탄소 원소 및 산소 원소를 구성 성분으로 포함하는 입자이다. 생체 내에서 독성이 없고 분해가 되며, 공극율이 높아 많은 양의 물질 탑재가 가능하고 단단한 무기물로 생체 내 주입 시 이동하지 않고 고정되는 특징을 가진다.
본 발명에서 사용되는 용어 "나노입자"란 크기가 1 nm 내지 100 nm를 기본단위로 하는 물질로서, 각 단위의 크기, 조성,모양, 조합형태, 각 물질의 표면 형태에 따라 다양한 특성을 나타내게 된다. 나노기술을 통해 종양의 표적화가 가능해지고, 약물, 유전자, 조영제를 질병 부위에 효과적으로 전달할 수 있으며, 외부 자극에 의하여 약물 방출을 제어할 수 있을 뿐만 아니라 약물의 반응까지도 영상화할 수 있다. 나노입자에 다양한 화학적 방법을 통해 여러 가지의 약물들과 조영제들이적재되면 암세포 특이적인 표적 물질들이 표지된 다기능성 나노약물 전달체 구축이 가능하여 암 표적화, 치료 및 영상화에 활용될 수 있다
본 발명에서 사용되는 용어 "생체 조직 영상화용 조성물"은 여러 영상 기술 중 임의의 하나를 사용하여 발생된 영상에서 체내의 가시화, 특히 조영을 개선시키기 위해 사용되는 재료이다. 상기 생체 조직 영상화용 조성물은 기관 또는 조직 포함 신체 또는 신체의 일부가 영상 또는 치료를 위한 정확한 위치 또는 시야에서 정확하게 위치를 잡기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "영상화제"란 생물리학적 특성에 의해 특정 양상 하에서 이들이 보이도록 개발하여 해부학적 구조에 대해 신호를 제공하는 물질을 의미한다. 영상화제는 바늘, 카테터, 네불라이져 등을 통해 투여될 수 있으며, 액체, 고체 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 또한 개복술 또는 비디오 흉강경 수술 시 사용될 수 있다.
본 발명자들은 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자의 복합체(pSi-Ag-MPs)를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물을 개발하였으며, 구체적인 실시예를 통해 상기 조성물을 포함하는 영상화제는 생체 내에서 충분한 영상 신호를 발생함으로써 표적 부위의 조영이 가능하며, 다른 기관으로 번지지 않는다는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 하나의 실시예에서는 본 발명에 따른 복합체의 영상 신호를 in vitro 상에서 측정한 결과, 생체 내 영상화 물질로서 충분한 영상 신호 세기를 나타냄을 확인하였다. 상기 실시예의 결과를 통해 상기 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물은 비디오 흉강경 수술 시 효과적으로 사용될 수 있으며, 기타 조직들의 영상화에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다 (실시예5-1 참조).
본 발명에 따른 다른 하나의 실시예에서는, 글리세롤이 혼합물 내 70 내지 80% 비율일 경우 폐의 압력과 주사기에 주입하는 힘 사이의 최적의 균형이 이루어진다는 것을 확인하였다 (실시예5-2 참조).
본 발명에 따른 또 다른 하나의 실시예에서는, 본 발명에 따른 영상화제를 토끼의 폐에 주입 후 생체 내 영상화를 수행한 결과, 본 발명에 따른 영상화제를 주입한 조직(폐)에서만 국소적인 영역 반응성을 나타내는 것을 확인하였다 (실시예6 참조).
본 발명에 따른 또 다른 하나의 실시예에서는, 본 발명에 따른 영상화제와 LPS를 각각 폐 조직에 주입한 결과, LPS에 비하여 영상화제를 주입한 경우 독성이 낮게 나타나는 효과를 확인하였다 (실시예7 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비
1-1. 재료
본 연구에 사용된 상업용 시약은 시그마 알드리치(US), 알파 에이자(US),TCI (Japan) 및 삼천 케미칼 (Rep. of Korea)에서 구입하였다. 소듐테트라보레이트데카하이드레이트 (CAS No. 1303-96-4)와 실버나이트레이트 (CAS No. 7761-88-8)는 알파 에이자 (US)에서 구매하였다. 암모니아 용액 (28% in H2O, CAS No. 1336-21-6)은 TCI (Japan)에서 구매하였다. 에탄올 (제품 No. E0223)은 삼천 케미칼에서 구매하였다. 글리세롤 (CAS No. 56-81-5)은 알파 에이자 (US)에서 구매하였다. 미리 준비된 pSiMPs는 트루텍 테크놀로지 인코퍼레이션 (Kapolei, Hawaii, US)에서 제공받았다 (pSiMPs의 제품 번호 :TruTagmicrotags (batch 200-3292, 200-3293, 200-3294)).
1-2. 사용 기기
입자의 형태는 주사전자현미경 (SEM, SU8220, Hitachi, Japan)을 이용하여 특정하였다. 입자 표면 성분 분석은 에너지 분산형 X-선 분광법 (EDS, E-max Evolution EX-370 (Analyzer), X-Max 50 (Detector), Horiba, Japan)을 이용하여 특정하였다. 입자의 표면 기능은 반사율 푸리에 변환 적외선을 이용하여 측정하였다. (ATR-FTIR, Nicolet iS5, ASB1817871, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 입자의 결정도는 X-선 회절 (XRD, X'-Pert-PRO MPD, PANalytical. B.V., Warsaw, Poland) 및 라만 분석 (AFM-Raman, NT-MDT, Russia)을 이용하여 측정하였다. X-선 회절 스펙트럼은 Cu Kα (*?*=1.5425
) 방사선 (40 kV, 30 mA)을 사용하여, 실온에서 스캔 속도 0.1초/단계, 단계 크기 2F에서 0.017°, 2F의 범위 5-80° 조건으로 수집하였다. 라만 분석은 437 nm (100mW) 레이저 파장대를 이용하여 측정되었다. 기체 흡착 등온선은 BEL Belsorp mini II 기체 흡착 기구 (Mictrotrac BEL, Japan)를 이용하여 최대 1기압의 기체 압력을 이용해 측정하였다. 등온선은 순수한 N2 (99.999%)를 사용하여 77 k에서 측정되었다. 가스흡착법 (Brunnauer-Emmett-Teller,BET)을 이용하여 측정하였으며, 질소 흡착 실험하기 전, 입자를 120 °C에서 진공 하에 밤새 탈기시켰다. 한국 기초과학센터 (고려대학교, 서울)에서 SEM, XRD, Raman, BET 및 EDS 분석을 수행하였다. 본 발명에 따른 복합체의 제조를 위해 인큐베이터 (Orbital Shaker-Incubator, RC-41W-0001, Hangzhou Ruicheng Ins., China)를 사용하였다. 초음파 처리기 (Ultrasonic cleaner, 97043-960, VWR, US)와 원심분리기 (Eppendorf Centrifuge model 5418, 5418FQ924939, Eppendorf AG, US)를본 발명에 따른 복합체 제조의 세척 단계에서 사용하였다.
1-3. 산화된 다공성 마이크로 입자 제조
산화된 다공성 마이크로 입자는 붕산염 (borate)을 이용해 제조하였다. 다공성 마이크로입자(10mg)를 유리 바이알 (20 mL size)에 분산시킨 후 붕산염 수용액 (borax, 40 mM, 0.5 mL), 에탄올 (1.0 mL) 및 증류수(0.5 mL)를 상온 (25 °C)에서 자기 교반 (450 rpm)을 이용하여 추가하였다. 6시간 교반 후 생성된 입자를 원심 분리 (14,000 rpm, 15 min)로 수집하였고 증류수로 3번 세척하였다.
1-4. 본 발명에 따른 복합체 (Psi-Ag-MPs) 제조
본 발명에 따른 복합체 제조를 위한 은 전구체로 비스아민실버 수용액 [Ag(NH3)2)+]을 사용하였다. 비스아민실버 수용액을 제조하기 위하여, 유리 바이알(20mL) 안에서 제조하였으며, 암모니아 수용액 (1M, 200 uL)과 증류수(2.8 mL)의혼합물을 실버나이트레이트 용액 (AgNO3, 1 M, 0.75 mL)에 첨가하였다. 이후, 이전에 붕산염 (borate) 수용액을 처리한 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 (50mg)를 25mL 증류수에 분산시킨 후, 비스아민실버 수용액 [Ag(NH3)2)+] 1.5mL을 분주하였다. 이후, 인큐베이터에 상기 다공성 실리콘 마이크로 입자를 포함한 튜브를 넣은 후 상온 (25 °C)에서 쉐이킹 (300 rpm)하면서 3시간 동안 교반시켜주었다. 교반 후 입자는 원심 분리 (1,4000 rpm, 3 min)로 수집하였고 증류수로 3번 세척하였다.
실시예2. 영상화 방법
2-1. 동물
뉴질랜드산 수컷 흰 토끼 (3-3.5kg)를 마이크로-CT 흉부 영상화에 사용하였다 (승인 번호: IACUC, 승인 No: 2017-0338 (승인 기관: 연세대학교 보건제도 운영위원회 및 동물보호 이용위원회)).
2-2. 프로토콜
뉴질랜드산 수컷 흰 토끼들 (n=6, 무게 3.0-3.5kg)에 근육 내 졸레틸 주사 (30mg/kg) 및 자일라진 (5mg/kg)에 의해 국소 마취하여 눕힌 자세에서 상하위 방향을 영상화하였다. 먼저, 바늘 구멍 부위를 선택하여 멸균하였다. CT-형광법 방법 하에서, 본 발명에 따른 0.2cc의 복합체를 멸균된 1cc의 주사 바늘로 토끼의 폐에 직접 주입하였다. 본 발명에 따른 복합체 주입 후, 주사바늘을 제거하고 주입된 복합체의 축적 정도 및 CT 세기를 평가하기 위해 CT 스캔을 0, 15, 30 및 60분마다 수행하였다.
2-3. Set-up
흉부 CT 스캔은 CT-형광법이 장착된 64-슬라이스 다중 검출기 휴먼 CT 스캐너 (Discovery CT750 HD; GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 스캔 파라미터는 다음과 같다 : 검출기 시준 = 64 x 0.625 mm ; 갠트리 회전 시간 = 0.5초 ; 튜브 전압 = 120 kV ; 튜브 전류 = 200 mA; 피치 = 0.984 : 1. 모든 이미지는 0.625 mm 슬라이스 두께로 재구성하였다.
2-4. 면역독성 분석 동물
C57BL/6J 마우스를 서울대학교 의과대학의 동물 시설에서 특정 병원체가 없는 상태로 제공되었다. 20-25 g 무게의 6-8주 수컷 마우스를 실험에 사용하였다. 실험을 위한 동물 프로토콜은 서울대학교 윤리위원회에서 검토 및 승인하였다.
2-5. 본 발명에 따른 복합체 처리
본 발명에 따른 복합체 (142 μg/25 g; 마우스 = 20 mg/3.5 kg; 토끼)와 LPS (Sigma, St. Louis, MO E.coli로부터 10 mg/kg 용량으로 추출)를 복강 내 주입으로 마우스에 투여하였다. 동량의 75% 글리세롤이 대조군으로 주입되었다. 사이토카인 측정을 위해 주입 2시간 후 혈액을 수집하였다. 24시간 처리 후 전용키트 (Sigma)를 이용해 ALT 및 AST 혈장 효소 활성을 측정하여 제조사의 설명에 따라 간 손상을 정량화하였다.
2-6. 사이토카인 측정
헤파린화된 모세혈관으로 장내 늑막으로부터 혈액을 채취하였고 원심분리에 의해 혈장을 수득하였다. 혈장 내 사이토카인의 양을 ELISA로 측정하였다. TNF-α ELISA 키트는 바이오레전드 (San Diego, CA, US)에서 구매하였다. ELISA는 제조사의 설명에 따라 수행하였다.
2-7. 비장 세포의 분리
마우스를 안락사 시킨 후 비장을 무균상태로 제거하고 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml과 함께 차가운 RPMI640 (WELGENE, Daegu, Rep. of Korea)을 함유한 세척 배지에 넣었다. 균질화된 비장을 70-μm 세포 스트레이너에 통과하여 600 G에서 10분간 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 모아 RBC 용해 완충액에서 재현탁하였다. 세척 배지에서 세척 후 세포를 계수하였다.
2-8. 유세포 분석
주입 후 8시간 및 24시간에 비장세포를 0.5% BSA를 함유하는 차가운 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 완충액에 재현탁시킨 후, TruStainFcX 항체 (BioLegend, San Diego, CA, US)로 10분간 실온 (25℃)에서 블록으로 제조하였다. 그 후 세포를 30분 동안 항-CD25/CD69/CD80/CD86 (BD Biosciences, San Jose, MN, US)으로 얼음 위에서 염색하였다. 차가운 FACS 완충액으로 세척 후 세포를 FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, MN, US)로 분석하였다. 데이터 분석을 위해 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, US)를 사용하였다.
2-9. 간 및 신장 손상 검사
마우스를 졸레틸 (25mg/kg) 및 롬푼 (10 mg/kg)으로 마취시킨 후 간문맥을 평형화하고 간에 멸균된 포스페이트-완충 식염수(PBS, pH 7.4)를 사용하여 관류시켰다. 간 및 신장 조직을 제거하고 면역조직화학을 위해 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 주입 후 8시간 및 24시간에 파라핀에 고정시켰다. 조직검사를 위해 절편을 헤마톡실린과에오신 (H&E)으로 염색하였다.
2-10. 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준편차 (SDs)로 제시되었다. 두 그룹 [대조군 vs. pSi-Ag-MPs 또는 pSi-Ag-MPs vs. LPS]의 비교를 위해 짝을 이루지 않은 양측 t-테스트를 사용하였다. P값 < 0.05인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 통계 테스트는 GraphPadInStat version 5.01 (GraphPad Software, La Jolla, CA, US) 을 이용해 수행하였다.
실시예3. 복합체 합성
본 발명에 따른 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자의 복합체를 합성하기 위한 실험이 수행되었다. 본 발명에 따른 복합체의 합성 방법은 도 1에 도시된 바와 같으며, 이에 따라 도 2에 도시된 바와 같이 최종 복합체를 합성하였다.
먼저, 에탄올성 불산 (HF) 전해질에서 중질 붕소-도핑된 p형 폴리싱 (100 면) 단결정 실리콘 웨이퍼의 일정한 양극 산화 전류를 사용하여 다공성 실리콘 마이크로 입자를 제조하였다. 이후 다공성 실리콘 마이크로 입자 50 mg (입자크기: 5 um) 을 20 mL 바이알 (vial)에 10 mg씩 나눠 담고 붕산염수용액 (소듐테트라보레이트데카하이드레이트, 381 mg, 40 mM, borate)을 각각 0.5 mL씩 추가하였다. 그리고 100 % 에탄올 용액 1 mL 과 증류수 0.5 mL 을 추가하였다.
이후, 상온(25 ℃)에서 6시간 동안 교반시켰다. 이후, 원심분리기를 사용해 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자를 가라앉힌 뒤 (14,000 rpm, 15 min) 증류수를 사용해 3회 세척하였다. 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 (Oxi-pSiMPs로 명명)는 산화된 Si구조 (SiO2)를 가진다. 이러한 산화 단계는 마이크로 입자의 친수성 개선 및 표면에 은 이온의 나노입자 형성 유도를 위해 필수적이다.
이후, 1 M 암모니아수용액 (200uL), 증류수 2.8 mL 및 질산은 수용액 (1 M) 0.75 mL를 섞어 비스아민실버 수용액([Ag(NH3)2]+)을 만들었다. 붕산염 수용액을 처리한 다공성 실리콘 마이크로입자를 50 mL 튜브에 25 mg 씩 담아준 다음 증류수를 25 mL 씩 추가해 분산시켜주고 비스아민실버 수용액을 1.5 mL 씩 추가하였다. 이후 3시간 동안 교반한 다음 원심분리기(14,000 rpm, 3 min)를 이용해 증류수로 3회 세척하였다. 생성물(pSi-Ag-MPs)은 동결건조기를 통해 용매를 제거하여 최종적으로 본 발명에 따른 복합체를 수득하였다.
이와 같이 수득된 상기 물질을 다공성 실리콘 마이크로입자-은 나노입자 복합체(pSi-Ag-MPs) 라고 명명하였다.
실시예4. 본 발명에 따른 복합체 (pSi-Ag-MPs) 특성 확인
4-1. 본 발명에 따른 복합체의 기공 구조 확인
본 발명에 따른 복합체 (pSi-Ag-MPs)의 형태적 또는 화학적 특징을 확인하기 위하여 다공성 실리콘 마이크로 입자, 산화된 다공성 실리콘 마이크로입자 및 본 발명에 따른 복합체의 주사전자현미경 영상 분석을 수행하였다. 즉, 주사전자현미경으로 측정된 이미지를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이 1~3 mm 입자 크기를 갖는 평판형 다공성 실리콘 마이크로 입자가 주로 관찰되었으며, 샘플의 평면도에서 기공 크기가 5-100 nm인 개방 기공 구조가 관찰되었다 (도 3, 왼쪽).
산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자의 주사전자현미경 이미지는 산화 및 세척 단계 중 파쇄로 인해 줄어든 크기를 나타냈으나 기공 구조는 유지되었다 (도 3, 중간).
은 나노입자의 기공 내로의 접합/로딩 및 반응 동안의 다공성 실리콘 마이크로 입자의 산화로 인해 본 발명에 따른 복합체의 기공 구조는 붕괴되었으나, 입자의 크기는 동일하게 유지됨을 확인하였다. (도 3, 오른쪽).
4-2. 본 발명에 따른 복합체의 분자 구조 확인
본 발명에 따른 복합체의 분자 구조를 측정하기 위하여 푸리에 변형 적외선 (ATR-FTIR)측정을 수행하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 합성 전구 물질이면서 산화 전인 다공성 실리콘 마이크로 입자는 실리콘 (Si)에 수소 (H)가 결합된 구조를 갖는 것으로 확인된 반면, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 본 발명에 따른 복합체 (pSi-Ag-MPs)는 실리콘 (Si)에 산소 (O)가 결합된 구조가 주로 나타났다.
4-3. 본 발명에 따른 복합체에의 은 나노입자 부착 확인
다공성 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자의 부착 여부를 확인하기 위하여 본 발명에 따른 복합체에 라만 분석을 수행하였다. 대조군으로서 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자를 사용하였으며, 이를 라만 분석한 결과 Si 프레임워크의 결정성이 나타났다 (Si 격자모드 495 cm-1). 도 5에 나타난 바와 같이, 합성 전구 물질인 다공성 실리콘 마이크로 입자에서는 실리콘 (Si) 원소가 주로 측정되었으며, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 는 주로 실리콘 (Si)과 산소 (O)로 이루어진 것을 확인할 수 있다. 이와 비교하여 은 이온 입자가 부착된 본 발명에 따른 복합체의 경우, 은 나노입자 신호 세기가 매우 크게 측정되어 포화된 신호를 나타남에 따라,다공성 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자가 부착된 것임을 확인할 수 있다.
4-4. 본 발명에 따른 복합체 표면상 일정한 은 나노입자 부착 확인
다공성 실리콘 마이크로 입자의 표면에 은 나노입자가 고르게 부착되었는지 확인하기 위하여 본 발명에 따른 복합체에 X선 분광분석법(EDS)을 수행하였다. 복합체의 합성 과정에 따라 X선 분광분석법을 측정해 다공성 실리콘 마이크로 입자의 표면 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 6 내지 8에 나타내었다.
합성 전구 물질인 다공성 실리콘 마이크로 입자의 X선 분광분석법에 나타난 바와 같이 실리콘 (Si, 77.7%)이 가장 주요한 원소로 확인되었고 (도 8 왼쪽), 산화 이후에는 산소 (O, 53.1%)가 실리콘 (Si, 45.5%)보다 표면상 더 많이 존재함을 확인하였으며 (도 8 중간), 은 이온 입자를 부착한 본 발명에 따른 복합체의 경우 은 나노입자가 표면에 약 10.0% 부착된 것 (도8 오른쪽)으로 확인되었다.
위의 실험 결과를 통해 본 발명에 따른 복합체의 표면에 은 나노입자가 고르게 부착되어 있음을 확인할 수 있었다.
4-5. 본 발명에 따른 복합체의 격자구조 확인
본 발명에 따른 복합체의 격자구조 변화를 확인하기 위하여 다공성 실리콘 마이크로 입자, 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자 및 본 발명에 따른 복합체의 X선 회절을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 합성 전구 물질인 다공성 실리콘 마이크로 입자와 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자는 동일한 격자 구조를 나타냈으나, 본 발명에 따른 복합체는 표면에 부착된 은 나노입자들로 인해 은 나노입자들의 격자 구조를 나타내었다. 따라서 상기 복합체에 은 나노입자가 부착되어 있음을 확인할 수 있었다.
4-6.본 발명에 따른 복합체의 표면적 및 기공 크기 확인
본 발명에 따른 복합체의 표면상 특징을 확인하기 위하여 합성 과정 별 물질에 대하여 질소 흡탈착을 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 합성 전구 물질인 다공성 실리콘 마이크로 입자가 산화됨에 따라 표면의 기공이 소실되어 크기에 변화가 있음이 표 1에서와 같이 확인되었다.
| BET 표면적 (m2 g-1) |
BJH 기공 부피 (cm3 g-1) |
BJH 기공 크기 (nm) | |
| pSiMPs | 477.47 | 2.1407 | 9.23 |
| Oxi-pSiMPs | 725.85 | 0.9587 | 1.21 |
| pSi-Ag-MPs | 471.26 | 0.6998 | 1.85 |
바렛-조이너-헬렌다 (Barrett-Joyner-Halenda, BJH) 방법을 이용해 측정한 기공 크기 및 부피 데이터는 산화 후 줄어든 기공 부피 및 크기를 나타내었다. 다공성 실리콘 마이크로 입자는 9.23 nm 기공 크기를 가진 것으로 확인된 반면, 본 발명에 따른 복합체의 상당히 기공 크기는 상당히 감소한 1.85 nm로 확인되었다. 이에 따라, 본 발명에 따른 복합체는 전구 물질에 비해 표면적 및 기공 크기가 감소한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예5. 본 발명에 따른 복합체의 생체 외 CT 신호 측정
5-1. CT 신호 세기확인
본 발명에 따른 복합체가 조영제로서 충분한 CT세기를 가지는지 확인하기 위하여, 기존에 사용되던 CT 조영 물질인 리피오돌과 본 발명에 따른 복합체의 CT 신호 세기를 비교하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
본 실시예에서, 식염수와 CT 조영제인 리피오돌을 각각 음성 대조군과 양성 대조군으로 사용하였다. 또한 합성 출발 물질인 다공성 실리콘 마이크로 입자 (set 1)를 비교예로 하여, 붕산염 수용액을 사용하여 산화시킨 다공성 실리콘 마이크로 입자 (Set 2), 본 발명에 따른 복합체 (Set 3)의 입자, 상기 복합체가 증류수에 분산된 상태 (Set 4), 상기 복합체가 증류수와 글리세롤 1:3에 분산된 상태 (Set 5), 상기 복합체가 증류수와 글리세롤 1:1에 분산된 상태 (Set 6), 상기 복합체가 증류수와 글리세롤 3:1에 분산된 상태 (Set 7), 상기 복합체가 순수한 글리세롤에 분산된 상태 (Set 8)를 각각의 샘플로 준비한 후 CT 신호 세기를 측정했다. 그 결과, 본 발명에 따른 복합체가 포함된 Set 3 내지 8에서만 CT 신호가 1300 H.U. 이상으로 측정되었다.
이를 통해, 본 발명에 따른 복합체가 CT 조영제로서 우수한 특성을 가짐을 확인하였다.
5-2. 본 발명에 따른 복합체의 생체 내 안정성 확인
본 발명에 따른 복합체에서 은 나노입자의 분해 여부로 인한 생체 내 안정성 확인을 위해 복합체의 시간 별 CT 신호 세기를 분석하였다.
국소화 표적 처리 전공 외과의사에 의해 본 발명에 따른 복합체가 희석된 용액을 토끼 폐에 주입하여 복합체와 혼합되는 글리세롤 용액의 최적 비율을 확인하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, 물과 글리세롤이 혼합된 75% 글리세롤 혼합물 (set 5)을 주입했을 경우 주입이 더 잘 이루어지는 것을 확인하였다. 이후 24시간 동안 37 ℃ 배양을 통한 in vitro 분석에서 복합체의 시간 별 CT 신호 세기를 분석하였다. 도 13 및 14에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 복합체에서 분해 유도된 은 나노입자의 방출이 관찰되지 않음을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명에 따른 복합체가 생체 내에서 분해되지 않고 안정성을 유지함을 확인할 수 있었다.
실시예6. 본 발명에 따른 복합체의 생체 내 국소적 표적 가능성 확인
본 발명에 따른 복합체의 생체 내 조직 국소화 표적 처리 가능성을 확인하기 위해, 상기 복합체를 토끼 폐에 처리한 후 생체 내 CT 영상으로 표적 결과를 확인하였다. 도 16에서 나타난 바와 같이, 건강한 토끼 흉부의 마이크로-CT 영상에서 폐는 어둡게 나타나며, 척추, 흉골 및 갈비뼈는 흰 색으로 나타났다. 본 발명에 따른 복합체를 폐 조직에 주입 후 실시간 모니터링으로 생체 내 CT 영상화를 수행하였다 (도 16의 노란색 원, 상단 중앙의 국소화 이미지). 본 발명에 따른 복합체를 글리세롤 75% 용액에 희석하여 토끼의 폐에 주입 후 CT 영상화하였다. 주입된 제형은 20 mg의 본 발명에 따른 복합체가 300 mL 의 글리세롤(glycerol) 75% - 물 25% 용매에 분산되어 있는 형태이며, 300 mL가 전량 한번에 주입되었다. 본 발명에 따른 복합체 주입 부위에서 높은 조영 CT 영상을 확보하였다.
도 16 및 17에서 나타난 바와 같이 주입 지점에서 60분 동안 확산률과 CT 신호 강도 변화를 추적하였으나, 큰 변화는 나타나지 않았다. 그 후 주입된 본 발명에 따른 복합체의 확산 속도를 리피오돌과 비교하였다. 도 16에서 나타난 바와 같이, 토끼의 폐에 동일 부피 (300mL)의 본 발명에 따른 복합체와 리피오돌을 각각 주입하고 3분 이내에 마이크로 CT 영상을 확인하였다. 3D CT 영상을 통해 리피오돌이 처리된 토끼의 폐에서 광범위한 CT 영역 반응 (2D 면적 측정 시 46.487 cm2)이 모니터링 되는 반면, 본 발명에 따른 복합체가 처리된 토끼의 폐에서는 국소적 영역 반응성 (7.387 cm2)을 나타내었다.
위와 같은 실험을 통해, 본 발명의 복합체는 생체 내 CT 신호측정 및 생체 내 마이크로 CT 영상을 위한 폐 국소화 표적 처리 용도로 충분히 이용될 수 있으며, 폐암 수술을 위한 CT 이미지에서 새로운 영상 유도 국소화제로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예7. 본 발명에 따른 복합체의 생체 내 독성 확인
본 발명에 따른 복합체의 실제 생체 내 활용 가능성을 확인하기 위하여 생체 내 투입 시간, 신장 독성 및 면역 독성이 나타나는지 여부를 확인하였다. 마우스 (C57BL/6J, i.p. 주입)에서 본 발명에 따른 복합체의 생체 내 독성을 분석하였으며, 실험에서 양성 대조군으로 리포폴리사카라이드 (LPS, 10mg/kg)를 사용하였다.
도 19에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 복합체를 처리한 마우스 그룹에서 간 독성은 나타나지 않았다. 또한 도 20에 나타난 바와 같이, 혈청에서 주요 염증성 사이토카인인 TNF-α수준의 유의미한 변화는 나타나지 않았다.
T세포 활성화에서 초기 활성화 마커 중 하나인 CD의 수준을 이중 양성 세포주 (즉, CD69+,CD25+)에서 분석하였으며, 도 21에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 복합체에 대한 세포 집단의 유의미한 활성이 나타나지 않았다. 이와 유사하게, 수지상 세포, 대식세포 및 B-세포의 활성 마커로 나타나는 공동 자극 분자인 CD80과 CD86의 발현 수준에서 유의미한 변화가 나타나지 않았다.
또한 도22 내지 25에서 나타난 바와 같이, 활성화된 림프구 또는 조직학적 변화가 나타나지 않았다.
이처럼, 본 발명에 따른 복합체는 마우스 면역 시스템에 영향을 주지 않고 독성이 거의 나타나지 않는 바, 임상 영역에서 안전하게 적용될 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (13)
- 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자와 은 나노입자가 결합된 복합체를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 다공성 실리콘 마이크로 입자의 크기가 1 내지 10 μm인 것을 특징으로 하는, 생체 조직 영상화용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 복합체는 실리콘 원소, 산소 원소 및 은을 100 : 100 내지 120 : 15 내지 30의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 영상화용 조성물.
- 제1항에 따른 복합체를 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석시킨 생체 조직 영상화제.
- 제4항에 있어서,
상기 혼합액은 글리세롤 용액과 물이 2 내지 4 : 1로 혼합된 것을 특징으로 하는, 생체 조직 영상화제.
- 제4항에 있어서,
상기 생체 조직 영상화는 컴퓨터단층촬영(CT)인 것을 특징으로 하는 생체 조직 영상화제.
- 제4항에 있어서,
상기 생체 조직은 폐 조직인 것을 특징으로 하는, 생체 조직 영상화제.
- a) 다공성 실리콘 마이크로 입자를 산화하는 단계; 및
b) 상기 산화된 실리콘 마이크로 입자에 은 나노입자를 부착하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화용 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 a) 단계에서 산화된 다공성 실리콘 마이크로 입자는 산화된 Si 골격 (SiO2)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 영상화용 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 b) 단계의 은 나노입자의 부착은 비스아민실버 수용액([Ag(NH3)2)+])을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체 조직 영상화용 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 산화는 붕산염 (borate)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체 조직 영상화용 조성물의 제조방법.
- 제8항에 따라 제조된 생체 조직 영상화용 조성물을 글리세롤 용액과 물의 혼합액에 희석하는 단계를 포함하는 생체 조직 영상화제의 제조방법.
- 제12항에 있어서,
상기 혼합액은 글리세롤 용액과 물이 2 내지 4 : 1로 혼합된 것을 특징으로 하는, 생체 조직 영상화제의 제조방법.
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