KR20210085960A - 고구마 껍질 분말이 포함된 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물 및 이를 포함하는 건강 기능 식품 - Google Patents

고구마 껍질 분말이 포함된 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물 및 이를 포함하는 건강 기능 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질을 포함하는 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

고구마 껍질 분말이 포함된 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물 및 이를 포함하는 건강 기능 식품{COMPOSTION COMPRISING EXTRACT FROM MIXTURE HAVING SWEET POTATO PEEL POWDER AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}
본 발명은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질을 포함하는 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물로서, 면역세포의 산화질소(Nitric Oxide, NO) 분비 능력, 사이토카인(Cytokyne) 분비 능력을 증진하는 효능을 가지는 면역 활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
100 세 시대를 맞이하여 사람들은 건강하게 오래 사는 것을 바라고 있지만 서구화된 식생활, 스트레스 등에 의해 다양한 만성질환의 발병률이 증가하고 있다.
이러한 질병들을 예방 및 개선을 위해 면역 활성 증진 효과를 가진 기능성 식품소재 및 다양한 제품 개발에 대한 연구들이 진행되고 있다. 면역반응은 인체 내의 자기방어체계로 외부로부터 유입된 병원성 항원으로부터 우리 몸을 보호하기 위한 수단으로 작용한다.
면역세포는 Inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해 유도된 면역조절인자인 산화질소(Nitric oxide; NO), 종양괴사인자(Tumor necrosis factor; TNF-α), 인터루킨(Interleukin, IL-6, IL-1β, IL-10, INF-γ 등) 등을 분비하여 면역체계를 유지한다.
면역 활성 증진을 위한 기능성 식품을 제조하기 위해, 다양한 천연의 소재로부터 얻어진 추출물을 이용하는 연구가 계속되고 있으나, 관능 효과가 떨어져 사용자의 기호도가 떨어지거나, 의미있는 수준의 면역 활성 효과를 나타내는 식품은 아직 개발되지 못하고 있다.
한편, 고구마는 줄기, 뿌리, 잎에 이르기까지 식물의 전 부분이 식용이 가능한 식물이나, 고구마의 뿌리부분의 껍질 부분은 폐기되는 것이 일반적이다. 고구마의 뿌리부분의 껍질은 보라색을 띠고 있어, 안토시아닌이 풍부한 항산화활성을 가짐에도, 활용되지 못하고 버려지는 것이 일반적인 바, 폐기하지 않고 이를 활용할 수 있는 기술 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1771075호는 우엉-시금치 복합발효추출물을 포함하는 면역기능 증강용 조성물에 대해서 개시하고 있으나, 분쇄된 우엉과 시금치를 효소 처리하여 얻어진 복합물을 발효시킨 후 이로부터 추출하여 얻어진 복합발효추출물을 유효성분으로 포함함을 개시하고 있을 뿐, 고구마 껍질을 이용한 면역 활성 증진용 조성물에 대해서는 개시하고 있지 않다.
대한민국 등록특허 제10-1814296호는 고구마껍질을 주성분으로 하는 항산화용 차 조성물을 개시하고 있을 뿐, 고구마 껍질을 이용하여 면역세포의 면역 관련 성분의 분비를 촉진함으로써, 면역 활성 증진 효능을 가지는 면역 활성 증진용 조성물에 대해서는 개시하고 있지 않다.
본 발명의 발명자들은 상술한 기술적 과제를 해결하고자, 연구를 거듭한 끝에, 고구마껍질을 포함하는 혼합추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물을 완성하기에 이르렀다.
(0001) 대한민국 등록특허 제10-1771075호 (0002) 대한민국 등록특허 제10-1814296호
본 발명은 식품으로 간단하게 섭취하여 면역 활성을 증진시킬 수 있는 면역활성 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 천연소재를 활용하여 최적의 면역 활성 증진 효과를 가지는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 관능성이 취약하지 않으면서도 면역 활성 증진 효과가 우수한 면역 활성 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 면역 활성 증진 효과가 우수하면서도, 세포 독성이 없는 면역 활성 증진용 조성물로서, 이를 구성하는 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질의 최적 혼합 비율을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 일반적으로 폐기되는 소재인 고구마껍질을 이용한 면역 활성 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물은, 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질을 포함하는 혼합물의 추출물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 활성 증진용 조성물은 면역세포의 NO(Nitric Oxide) 분비 능력 증진 및/또는 사이토카인(Cytokyne) 분비 능력 증진 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 혼합물의 열수 추출물의 동결 건조 분말일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합물은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질을 1:0.8~1.2:0.2~0.7:2.5~3.5의 중량비율로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명은 천연소재를 활용하여 세포의 면역 활성을 증진시키는 효과를 가진다.
본 발명은 폐기되는 고구마 껍질을 활용할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명은 또한, 관능성이 양호하면서도 면역 활성 증진 효과가 우수한 효과를 가진다.
본 발명은 천연소재를 이용하여 최적의 면역 활성 효과를 가지면서도 세포독성이 없는 효과를 가진다.
도 1은 도라지, 더덕, 옥수수수염, 가시오가피, 작약 및 고구마껍질 추출물 각각의 농도별 세포생존율을 나타낸 그래프이다;
도 2는 다양한 식물 추출물을 처리한 대식세포에서의 NO 농도를 나타낸 그래프이다;
도 3은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 가시오가피 추출물을 처리한 대식세포에서의 사이토카인 농도를 나타낸 그래프이다;
도 4는 고구마 껍질 추출물을 처리한 대식세포에서의 NO 농도를 나타낸 그래프이다;
도 5는 고구마 껍질 추출물을 처리한 대식세포에서의 사이토카인 농도를 나타낸 그래프이다;
도 6은 실시예 1 내지 5의 혼합추출물을 처리한 대식세포에서의 NO 농도를 나타낸 그래프이다;
도 7은 실시예 1, 3 5의 혼합추출물 및 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질 각각의 추출물을 처리한 대식세포에서의 NO 농도를 나타낸 그래프이다;
도 8은 실시예 1, 3 5의 혼합추출물 및 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질 각각의 추출물을 처리한 대식세포에서의 사이토카인 농도를 나타낸 그래프이다;
도 9는 실시예 3과 제조예 3의 추출물을 섭취한 마우스 비장세포 증식율을 나타낸 그래프이다;
도 10은 실시예 3과 제조예 3의 추출물을 섭취한 마우스 비장세포에서의 NO 농도를 나타낸 그래프이다;
도 11은 실시예 3과 제조예 3의 추출물을 섭취한 마우스 비장세포에서의 IL-10의 농도를 나타낸 그래프이다;
도 12는 실시예 3과 제조예 3의 추출물을 섭취한 마우스 비장세포에서의 INF-γ의 농도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 각 구성을 보다 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.
본 발명은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질을 포함하는 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
도라지(Platycodon grandiflorum)는 초롱꽃과에 속하는 다년생 식물로 예부터 식품뿐만 아니라 해열, 진통, 진정작용과 항염증 효과를 가진 약재로서 사용되어져 왔다. 항암 효과와 간기능 개선에도 효과가 있는 트리테르페노이트(Triterpenoid)계 사포닌과 섬유질을 포함하고 있으며, 도라지의 주요 사포닌은 플라티코딘(Platycodin) A, C 및 D와 플라티코사이드(Platycoside) A, B, C, D 및 E가 있다고 알려져 있다.
더덕(Codonopsis lanceolata) 또한, 초롱꽃과에 속하는 다년생 식물로 구이, 무침, 장아찌 등 식품으로 이용되고 있고, 더덕의 주요성분은 사포닌(Saponin), 플라보노이드(Flavonoid) 및 이눌린(Inulin) 등으로 밝혀진 바 있다. 더덕의 효과에 관한 연구로는 면역력 증가, 혈청 지질의 감소 및 더덕 부위별 세포벽 물질의 항산화 효과가 보고된 바 있고, 거담, 해열, 배농, 강장제 등 질병치료 목적으로도 사용되고 있다.
최근에는, 흰쥐의 간과 혈액에 더덕 껍질과 더덕 육질을 섭취시킨 후 생체 내 항산화 방어 시스템을 확인한 결과, Glutathione peroxidase(GPx)와 Glutathione reductase(GR)의 활성이 증가된 결과가 보고된 바 있다.
본 발명에서는 도라지, 더덕 모두 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매 등과 같이 식물의 어떤 부위를 사용하더라도 무방하나, 바람직하게는, 뿌리를 이용할 수 있다. 이는, 상기의 도라지와 더덕이 모두 주로 뿌리부분을 데쳐 나물무침 등으로 무쳐서 섭취하고 있는 식물로서, 부작용에 대한 위험성이 없고, 주로 약용효과가 있다고 알려져 있으므로, 뿌리부분을 사용하는 것이 바람직하다.
가장 흔하게 접하는 식용작물 중 하나인 옥수수(Zea mays L.)는 전분가공, 음료, 통조림 등으로 가공되어 섭취된다. 옥수수의 부산물인 옥수수수염은 일부 옥수수수염 차 등 원료로 사용되고 있지만 대부분은 폐기되고 있어, 무용하게 버려지는 옥수수수염을 이용하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 옥수수수염은 황색-담갈색을 띄며 한국, 중국, 일본 등 동남아시아 지역에서 이뇨제와 신장질환 치료 목적으로 쓰여진 기록이 많으며, 아피메이신(Apimaysin), 메톡시아메이신(Methoxyamaysin)과 메이신(Maysin) 등이 존재하는데 이 중, 메이신은 종양 세포주를 사멸시키는 항암효과 및 라디칼 소거작용 등이 보고된 바 있다.
상기 옥수수수염 또한, 옥수수수염을 우린 물이 널리 식용되고 있으므로, 부작용에 대한 위험성이 없는 것으로 잘 알려져 있는 바, 본 발명에서는 폐기되는 옥수수수염을 차로 음용하는 외에 새로운 방식으로 활용할 수 있는 방법을 제공한다.
고구마(Ipomoea batatas L.)는 식량자원으로 이용되고 있고, 강한 항산화 효과가 있는 페놀화합물은 고구마 껍질부분에 많이 함유되어 있어, 고구마 속 부분보다 껍질부분이 항산화 활성이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 고구마의 껍질 부분의 주요물질은 카페인산(Caffeic acid)과 클로로겐산(Chlorogenic acid)을 포함하여 강한 항산화 효과를 가지며, 카페산과 카페인산 페네틸 에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)의 면역 활성 효능에 관한 연구가 보고된 바 있다. 고구마 말랭이 등 고구마 가공식품은 대부분 고구마 껍질을 제거한 후 사용하고 있어 고구마 가공 과정에서 발생하는 고구마 껍질을 이용한 다양한 가공식품 개발의 중요성이 대두되고 있다.
본 발명은 일반적으로 폐기되는 고구마 껍질을 활용함으로써, 고구마의 모든 부분이 버려지지 않고 활용이 가능하게 하는 효과를 가지며, 최근에는 다이어트를 목적으로 쌀을 대체하는 식량으로 이의 소비량이 크게 증가됨에 따라, 기술적 유용성이 큰 기술이다.
구체적으로, 본 발명은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질로부터 개별적으로 얻어진 추출물을 포함하는 것도 가능하고, 재료를 혼합한 상태에서 얻어진 추출물을 포함하는 것도 가능하다. 특별히 제한되지 않고 다양한 방법으로 추출된 추출물을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질은 건조하여 분말화하여 얻어진 건조 분말로부터 추출물을 얻을 수 있다. 각 재료의 건조 분말을 이용하여 추출물을 얻는 경우, 추출물을 얻기 위한 용매와 재료의 접촉면적이 증가함에 따라, 각 재료로부터 유효성분을 빠르게 많은 양으로 추출할 수 있는 장점이 있다. 특히, 고구마 껍질의 경우, 고구마의 뿌리부분에서 이의 껍질만을 얻은 후 35 내지 45℃에서 건조시킨 후 이를 분말화하여 사용할 수 있다.
한편, 상기 추출용매는 추출물을 얻기 위해 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고 사용이 가능하며, 식용추출물을 얻기에 바람직한 용매로서, 물, 에탄올 등의 식용 용매를 사용할 수 있다. 반드시 수용성 용매일 필요는 없고 유성 용매를 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 수용성 용매를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 특히, 증류수를 가열하여 얻어진 열수 추출물을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 각 재료의 8 내지 10배에 해당되는 증류수에 넣어 50 내지 70 ℃의 온도에서 20 내지 30 시간 동안 추출하여 얻어진 열수 추출물을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물을 상기 추출물을 그대로 포함하는 것도 가능하나, 이를 동결 건조시켜 얻어진 동결 건조 추출물, 이로부터 용매를 제거하여 얻어진 농축 추출물 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 바람직하게는 얻어진 열수 추출물을 동결 건조시켜 얻어진 동결 건조 추출물을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합물은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질을 1:0.8~1.2:0.2~0.7:2.5~3.5의 중량비율로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 1: 0.9~1.1:0.3~0.6:2.7~3.3의 중량비율로 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는, 1:1:0.5:3의 중량비율로 포함할 수 있다.
상기 비율보다 더덕을 소량으로 첨가하는 경우에는, 면역 활성 증진 효과가 감소될 수 있는 문제가 있고, 상기 함량보다 더덕을 과량으로 첨가하는 경우에는, 더덕 고유의 맛이 강해짐에 따라 관능효과(맛)가 떨어질 수 있는 문제가 있다.
상기 비율보다 옥수수수염을 소량으로 첨가하는 경우에는, 면역 활성 증진 효과가 감소되거나, 옥수수수염 고유의 고소하고 달착지근한 맛이 적어짐에 따라 관능효과가 떨어질 수 있는 문제가 있고, 상기 함량보다 옥수수수염을 과량으로 첨가하는 경우에는, 세포독성을 유발할 수 있는 문제가 있다.
상기 비율보다 고구마껍질을 소량으로 첨가하는 경우에는, 도라지나 더덕과 같은 강한 맛을 가지는 재료의 함량이 상대적으로 높아짐에 따라 관능효과가 떨어질 수 있는 문제가 있고, 상기 함량보다 고구마껍질을 과량으로 첨가하는 경우에는, 면역 활성 증진 효과가 저하될 수 있는 문제가 있다.
이에 따라, 본 발명은 인체에 무해한 천연의 재료를 활용하여 최적의 면역 활성 효능을 나타내는 최적 비율의 면역 활성 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물은 구체적으로, 면역세포의 NO(Nitric Oxide) 분비 능력 증진 및/또는 사이토카인 분비 능력 증진 효능을 가지는 것을 특징으로 한다. 면역세포의 기능을 향상시킴으로써, 인체의 면역기능을 향상시키는 효능을 가진다.
상기 사이토카인은 구체적으로, 종양괴사인자 및/또는 인터루킨일 수 있고, 더욱 상세하게는, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 및 INF-γ로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물은 희석 용매를 더 포함할 수 있고, 이의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 증류수를 더 포함하는 것이 바람직하다. 희석된 용매를 포함하는 상기 면역 활성 증진용 조성물의 농도는 80 내지 600 ㎍/ml일 수 있고, 바람직하게는 90 내지 550 ㎍/ml일 수 있다.
상기 범위보다 낮은 농도로 포함되는 경우에는, 목적하는 면역 활성 증진 효과가 미미한 문제가 있고, 상기 범위보다 높은 농도로 포함되는 경우에는, 관능효과(맛)가 저하되거나, 세포독성이 유발될 수 있는 문제가 있다.
본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법은, (a) 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질의 건조 분말을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 혼합물을 상기 혼합물의 중량을 기준으로 8 내지 12배의 증류수에 넣고, 50 내지 70 ℃의 온도로 가열하여 열수추출물을 얻는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 열수추출물을 동결 건조하여 동결 건조 추출물을 얻는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계는 각 재료의 건조 분말을 각각 혼합할 수 있고, 둘 이상의 재료를 혼합하여 얻은 건조 분말을 사용할 수도 있다.
상기 (b) 단계는 20 내지 30 시간 가열하여 열수추출물을 얻을 수 있고, 바람직하게는 22 내지 27시간 가열하는 것일 수 있다.
상기 (c) 단계를 거쳐 얻어진 동결 건조 추출물은 희석 용매에 희석시킬 수 있다. 상술한 바와 같이 상기 희석 용매는 이의 종류가 특별히 제한되지 않고 사용이 가능하나, 바람직하게는, 증류수를 사용할 수 있다.
희석 용매에 희석시킨 경우, 이의 농도는 상술한 바와 같이 80 내지 600 ㎍/ml의 농도로 희석될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 관한 상세한 내용은 상술한 면역 활성 증진용 조성물에 관한 구성 및 이에 관한 설명을 참조할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 면역 활성 증진용 조성물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 면역 활성 기능을 가지는 것을 특징으로 하며, 더욱 상세하게는, 면역세포의 NO 분비 능력 증진, 사이토카인 분비 능력 증진 기능을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 건강 기능 식품에 관한 상세한 내용은 상술한 면역 활성 증진용 조성물에 관한 구성 및 이에 관한 설명을 참조할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.
[제조예: 추출물 제조]
본 실험에 사용한 도라지(Platycodon grandiflorum, PG)와 더덕(Codonopsis lanceolate, CL)은 강원도 횡성 약재시장(Hoengseong, Korea)에서 건조한 것으로 2017년 10월에 구입하였고, 옥수수수염(Corn silk, CS)，당귀(Angelica gigas, AG), 가시오가피(Acanthopanax senticosus, AS), 황기(Astragalus membranaceus, AM), 천궁(Cnidium officinale, CO), 백출Atractylodes macrocephala Koidzumi, AR), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparat, RR), 마늘(Allium sativum L, ALS), 작약(Paeoniae radix, PR)은 한약재시장(Seoul, Korea)에서 2017년 10월에 건조한 것으로 구입하여 사용하였으며, 고구마(Sweet potato)는 광주광역시에 위치한 대형마트에서 한국산으로 2017년 10월에 구입하여 고구마껍질(Sweet potato peel)만 얻은 후 40℃에서 건조하여 사용하였다.
각 재료를 분말화하여 건조 분말로 제조한 후, 건조 분말 중량의 10배인 증류수를 넣어 60℃ Shaking incubator(JSSI-100C, JSR, Seoul, Korea)에서 24시간 추출하였다. 추출한 것을　Whatman filter paper No. 2(Whatman International Ltd., Springfield Mill, Kent, UK)를 사용하여 여과하였다. 여과한 추출물은 감압농축기(N-1200, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출 용매를 제거한 후 동결건조기(Clean vac 8, Hanil, Incheon, Korea)로 동결건조한 분말은 -20℃에 보관하였다. 각 추출물의 동결 건조 분말을 본 실험에 사용하였다.
[제조예 2: 혼합 추출물 제조]
상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 하기 표 1에 따라 혼합한 건조 분말로부터 추출물을 추출하여 이의 동결 건조 분말을 본 실험에 사용하였다.
건조분말(w/w) 실시예 대조군
1 2 3 4 5
도라지 1 1 1 1 1 -
더덕 1 1 1 1 1 -
옥수수수염 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -
가시오가피 - - - - - -
작약 - - - - - -
고구마껍질 1 2 3 4 5 -
건조분말(w/w) 비교예
1 2 3 4 5 6
도라지 1 - - - - -
더덕 - 1 - - - -
옥수수수염 - - 1 - - -
가시오가피 - - - 1 - -
작약 - - - - 1 -
고구마껍질 - - - - - 1
[실험예 1: 세포 생존율 측정]
1. 세포의 배양 및 처리
마우스 대식세포주 RAW264.7 cells는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였고, 10% 비활성화 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS; Gibco-BRL, Carlsbad, CA, USA) 및 1% Penicillin와 Streptomycin(PEST; WelGene Co., Daegu, Korea) 용액을　함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM; WelGene Co.)을 이용하여 5% CO2가 공급되는 배양기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 37℃ 조건으로 배양하였다. RAW264.7 cells은 충분한 세포를 얻기 위해 배양용 플라스크(T75 cm2)에서 세포를 배양하고, 약 80% 밀집하면 부착된 세포를 떼어 낸 후 각 실험에 사용하였다.
2. 세포 생존율 측정 방법
RAW264.7 cells를 떼어 낸 후 성장배지에 세포수를 1×104 cells/well으로 조정하여 24-well plates에 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 시료 처리를 하였다. 2시간이상 기아상태를 유지시킨 후 시료를 우태야 혈청이 첨가하지 않은 성장배지로 희석하여 24시간 처리하여 세포 생존율을 알아보았다.
세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl terazolium bromide(MTT: Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지의 10분의 1을 가해주고 다시 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 Formazon이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. 남아있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 Dimethyl Sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 용해시킨 시료를 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포생존율은 아래와 같이 계산하였다.
세포생존율(%)=[(시료처리군의 흡광도)/(대조군의 흡광도)]*100
3. 통계 처리
본 실험 결과들은 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군간 평균의 차이는 One-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검정하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다. 모든 통계 분석은 SPSS(Statistical package for the social science) version 17.0 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다.
4. 실험 결과
비교예 1 내지 6의 시료를 이용하여, 이의 농도에 따른 세포생존율을 도 1에 도시하였다.
도 1을 참조하면, 이들 추출물들을 처리한 결과 무처리군인 대조군(Control)과 비교하여 PG(100, 250 μg/mL), CL(100, 250, 500 μg/mL) 그리고 PR(100, 250, 500 μg/mL)의 일정농도에서 RAW264.7 대식세포 생존율이 유의적으로 증가하였다(p<0.05). RAW264.7 대식세포에 PG 1000 μg/mL와 CS 1000μg/mL를 처리한 군은 대조군과 비교하여 유의적으로 세포 생존율이 감소하여(p<0.05) 도라지 그리고 옥수수수염 물 추출물은 고농도에서 세포독성이 있음을 알 수 있었다.
RAW264.7 대식세포에 가시오가피 물 추출물을 처리한 결과 무처리군인 대조군과 비교하여 유의적 차이가 없었다(p>0.05). 면역세포 증식률은 면역 활성을 나타내는 바이오마커로 사용되고 있으며, 면역증진 효과가 알려진 주박 다당류 처리에 의해 RAW264.7 대식세포의 증식률이 증가하였고, 본 실험에서도 PG, CL 그리고 PR 처리가 RAW264.7 대식세포 증식률을 증가시키므로 면역 활성을 증진시키는 소재라는 것을 알 수 있었다.
[실험예 2: NO 농도 확인 실험]
1. 세포의 배양 및 처리
이는 상술한 실험예 1과 동일한 방법으로 수행되었다.
2. 실험 방법
RAW264.7 cells를 떼어 낸 후 성장배지에 세포수를 1×104 cells/well로 조정하여 24-well Plates에 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 면역증진 효과를 알아보기 위해, RAW264.7 cells에 동결건조 분말 시료를 농도별로 각각 24시간 처리하였다. 면역증진 효과 실험에서 양성대조군은 시료 대신 0.1 μg/mL LPS(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 처리군이다.
세포배양액 0.5 mL에 동량의 Griess 시약(1% Sulfanilamide in 5%　Phosphoric acid와 1% α-naphtylamide in H2O) 0.5 mL을 넣어 혼합하여　암실에서 10분간　반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 Sodium nitrite(NaNO2)를 사용하여 얻은 검량선으로 산출하였다.
본 실험은 도라지, 더덕, 잔대(AT), 옥수수수염, 당귀(AG), 가시오가피, 황기(AM), 천궁(CO), 백출(RR), 작약, 마늘(ALS)의 추출물에 대해 수행되었다.
3. 통계 처리
이는 상술한 실험예 1과 동일한 방법으로 수행되었다.
4. 실험 결과
각각의 식물소재 추출물의 대식세포에서 농도별 NO 생성 효과를 확인한 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2를 참조하면, 잔대와 마늘 추출물(AT, ALS)을 제외한 10종류의 추출물들은 농도 의존적으로 NO 생성량을 증가시켰다(p<0.05). 100 μg/mL 추출물 처리농도에서 NO 생성량이 높은 순서는 옥수수수염 추출물(CS)> 도라지 추출물(PG) = 가시오가피 추출물(AS) 순이었고, 이들 추출물들은 다른 추출물보다 현저하게 NO 생성량이 높았다(p<0.05). CS, PG 및 AS를 제외한 다른 추출물들 처리 후 RAW264.7 대식세포에 생성된 NO 생성량은 시료 간의 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p>0.05).
250 μg/mL 추출물 처리농도에서 NO 생성량은 PG > CS = AS > CL > PR > AG = AM > CO = AR 순으로 높았으며, AT와 ALS는 무처리군인 대조군과 비교하여 유의적 차이가 없었다(p>0.05).
과다한 NO의 생성은 혈관확장이나 염증반응에 의한 조직 손상을 일으켜 생체 내 유해한 작용을 나타낼 수 있으나 대식세포는 탐식 작용을 하는 동안 탐식된 병원균을 죽이기 위해 NO를 생성하고, 생성된 NO는 병원균을 죽이는 매개체로서 중요한 역할을 하므로 적당량의 NO 생성 촉진은 면역 기능을 증진시킬 수 있는 지표로 사용될 수 있다. 일부 연구결과에서 유근피 추출물 처리에 의한 NO 분비능이 증가하였는데, 이는 본 실험에서 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 가시오가피 추출물 처리에 의해 NO 생성량이 현저하게 증가한 것과 유사한 결과였다.
[실험예 3: 사이토카인 농도 확인 실험]
1. 세포의 배양 및 처리
이는 상술한 실험예 1과 동일한 방법으로 수행되었다.
2. 실험 방법
RAW264.7 cells를 떼어 낸 후 성장배지에 세포수를 1×104 cells/well로 조정하여 24-well plates에 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 면역증진 효과를 알아보기 위해, RAW264.7 cells에 동결건조 분말 시료를 농도별로 각각 24시간 처리하였다. 면역증진 효과 실험에서 양성대조군은 시료 대신 0.1 μg/mL LPS(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 처리군이다.
세포배양액　중　TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 농도는 ELISA kit(eBioscience Co., San Diego, CA, USA)을 이용하여 제조사 지침에　따라 microplate reader(AMR-100, Allsheng Co., Ltd., Hangzhou, China)로 측정하였다.
3. 통계 처리
이는 상술한 실험예 1과 동일한 방법으로 수행되었다.
4. 실험 결과
RWA264.7 대식세포에서 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 가시오가피 추출물(PG, CL, CS, AS)이 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6에 미치는 영향을 도 3에 나타냈다.
도 3을 참조하면, PG, CL, CS 그리고 AS 처리한 후 세포 상등액에서 TNF-α함량이 농도 의존적으로 증가하였고(p<0.05), 250 μg/mL 농도의 PG, CS 및 AS를 서로 비교했을 경우 유의적 차이가 없었지만(p>0.05), CL 처리군에 비하여 TNF-α함량이 유의적으로 높았다(p<0.05). 500 μg/mL 농도의 CL, CS 및 AS를 서로 비교했을 경우 유의적 차이가 없었지만(p>0.05), PG 처리군보다는 TNF-α함량이 유의적으로 낮았다(p<0.05). 500 μg/mL 시료 처리군 중에서 PG 처리에 의해 IL-1β 함량이 가장 높은 것은 TNF-α와 유사한 경향이었고, CS와 AS 처리군에서도 무처리군인 대조군과 비교하여 2배 이상 IL-1β 함량이 증가하였고 CL도 1.5배 이상 IL-1β 함량이 증가하였다.
IL-6 함량은 100, 250 그리고 500 μg/mL 시료 처리군 모두 PG 처리군이 CL, CS 그리고 AS 처리군보다 IL-6 함량이 더 높았다. 500 μg/mL CL, CS 그리고 AS 처리군은 대조군과 비교하여 8배 이상 IL-6 함량이 높았다.
활성화된 대식세포가 분비하는 사이토카인은 광범위한 면역신호 전달인자이고 면역조절에 관여하는 대표적인 사이토카인이 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6로 대식세포에서 면역증진 효과를 알아보는 중요한 바이오마커다.
유근피 추출물을 처리한 RAW264.7 대식세포에서 무처리군인 대조군과 비교하여 TNF-α함량은 농도 의존적으로 증가하였으나, IL-1β 함량은 변화가 없었다. RAW264.7 대식세포에 주박에서 분리한 다당류를 처리한 후 TNF-α와 IL-6 함량이 증가되었다는 보고가 있다. 어성초 물 추출물을 RAW264.7 대식세포에 처리했을 때 IL-1β가 농도 의존적으로 증가하였다고 하였다. 여러 연구에서 천연소재의 면역증진 효과를 알아보기 위해 시료 처리 후 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 함량 증가를 확인하였다. 따라서 천연소재를 처리했을 때 대식세포에서 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 함량이 증가하면 면역증진 효과를 가진 소재인 것으로 추정한다. 본 실험에서도 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 가시오가피 물 추출물이 RAW264.7 대식세포에서 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 함량을 증가시켰으므로 면역증진 효과를 가진 소재라는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 4: 고구마 껍질 추출물의 면역 활성 증진 효과 확인 실험]
상기 실험예 2 및 3과 동일한 방법으로, 고구마 껍질 추출물에 대한 면역 활성 증진 효과 확인 실험(NO 농도 확인 실험, 사이토카인 농도 확인 실험)을 진행하여 그 결과를 도 4와 도 5에 도시하였다.
도 4와 도 5를 참조하면, RAW264.7 대식세포에서 양성 대조군인 0.1 μg/mL LPS 처리군이 SP 처리군보다 NO, TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 함량이 높았으며, SP 처리에 의해 NO, TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 함량이 농도 의존적으로 증가하였다. 100 및 250 μg/mL SP 처리에 의해 NO 함량은 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(p<0.05). RAW264.7 대식세포에서 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6는 함량은 100 및 250 μg/mL SP 처리에 의해 변화가 없었으나 500와 1000 μg/mL SP 처리에 의해 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 고구마껍질은 농도 의존적으로 면역활성이 증진되었다.
[실험예 5: 혼합 추출물의 NO 농도 확인 실험]
상기 실험예 2와 동일한 방법으로, 실시예 1 내지 5의 추출물에 대한 NO 농도 확인 실험을 진행하여 그 결과를 도 5에 도시하였다.
도 6을 참조하면, RAW264.7 대식세포에 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3을 처리한 결과, 농도 의존적으로 NO 함량이 증가하였고 NO 생성량이 실시예 4와 실시예 5보다 높았다.
[실험예 6: 혼합 추출물의 사이토카인 농도 확인 실험]
상기 실험예 3와 동일한 방법으로, 실시예 1, 3 및 5의 추출물과 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질 각각의 추출물에 대한 NO 농도 및 사이토카인 농도 비교 실험을 진행하여 그 결과를 도 7과 도 8에 도시하였다.
RAW264.7 대식세포에서 고구마껍질을 주원료로 한 실시예 1, 3 및 5는 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6 모두 농도 의존적으로 증가하였고, 모든 농도에서 고구마껍질 추출물(SP)보다 면역 활성이 높았다(p<0.05).
RAW264.7 대식세포에 실시예 1과 실시예 3을 처리한 결과 이들 혼합물에 함유된 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질보다 NO 함량은 높았고 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6은 높거나 유사하였다. 따라서 면역 활성이 높으면서, 맛도 좋고 고구마껍질을 함유 비율도 높아 폐기되고 있는 고구마껍질의 활용도가 높은 실시예 3을 제품개발을 위한 최적 배합비로 결정하였다.
더덕 물 추출물이 마우스 복강 대식세포를 활성화시켜 IL-6 분비를 촉진시켰고 더덕 물 추출물을 마우스에 투여하였을 때와 면역세포에 처리했을 경우 TNF-α 생성량이 증가한다는 보고들이 있고, 더덕 및 가시오가피 물 추출물 처리가 면역세포에서 TNF-α 생성량을 유의적으로 증가시켰다는 보고가 있다. 본 실험 결과에서도 더덕 및 가시오가피 물 추출물 처리가 면역세포에서 면역관련 사이토카인 생성량을 증가시켰다.
폐기되고 있는 고구마껍질을 활용한 면역증진 효과가 우수한 가격 경쟁력이 있는 천연소재 최적 배합비를 가진 식물혼합물을 개발한 연구결과이므로 이들 식물혼합물을 이용한 면역력 증진 효과를 가진 다양한 제품 개발 등 산업, 경제적으로 활용가치가 높을 것으로 기대된다.
[제조예 3: 티백차 제조]
상기 제조예 2의 실시예 3와 동일한 비율의 건조 분말을 포함하는 티백차를 제조하였다. 실시예 3의 혼합물과 제조예 3의 티백차를 상기와 같은 방법으로 추출, 농축 및 동결 건조하여 얻은 동결 건조 분말을 동물 실험에 사용하였다.
[실험예 7: 마우스를 활용한 면역 활성 증진 효과 확인 실험]
1. 실험 동물
생후 6주령 수컷, Balb/c 마우스(25~30g)을 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 사용한다. 실험에 사용할 생쥐는 온도(21~23℃), 습도(40~60%)와 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 동물실에서 무균음료와 사료를 자유롭게 먹을 수 있게 사육하고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
적응이 끝난 Balb/c 마우스를 무작위로 5개군으로 구분한다. 즉 5개군은 ① 정상군(normal, n=6), ② 저농도 실시예 3 투여군(n=6, 100mg/kg), ③ 고농도 실시예 3 투여군(n=8, 300mg/kg), ④ 저농도 티백차 추출물 투여군(n=6, 100mg/kg), ⑤ 고농도 티백차 투여군(n=8, 300mg/kg) 이다.
10일 동안 일정한 시간에 존대를 이용하여 이들 추출물을 경구 투여하고, 10일간 절식 후 실험 11일 차에 Isoflurane(10mg/kg, 흡입) 마취하여 혈액을 취한 후 절개 후 비장 및 혈액을 취하였다. 일부 비장은 ELISA 및 Western blotting 분석을 위해 액체질소에 급속 냉동시켰다.
2. 비장세포 분리 및 배양
세포 배양액(RPMI 1640, 10% FBS, 1% PEST)으로 2회 세척하였다. 이들 세포 배양접시로 옮겨 10 mL의 배양액을 가한 뒤, 비장을 멸균한 슬라이글라스로 눌러 분쇄한 후, 40 μm Nylon cell strainer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 균질화하였다. 이렇게 얻어진 비장세포를 800xg(중력가속도)으로 4분간 원심분리 한 후 Red blood lysis buffer(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 가하여 상온에서 10분간 반응시켜 적혈구를 파괴하고 원심분리를 반복하여 세포를 세척한 후 배양액에 현탁하였다.
3. 비장세포의 증식능 측정
비장세포의 증식능은 MTT 방법으로 측정하였다. 비장세포가 5×106 cells/well이 되도록 희석하여 24-well plate에 분주하였다. 분주 후 Mitogen 없는 배지, 5 μg/mL Concanavalin A(Con A)을 함유한 배지 그리고 15 μg/mL LPS를 함유한 배지가 되도록 배지 조성을 조정하였다. 세포를 5% CO2가 포함된 습도 90%, 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 배양액은 NO, IL-10 그리고 INF-γ 측정을 위한 시료로 사용하기 위해 모아 원심분리(10,000 rpm, 10 min, 4 ℃)하여 상층액을 모았다. 배양액을 제거한 세포는 각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지의 10분의 1을 더하여 4시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거하여 건조한 후 DMSO로 용해한 후 Microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. NO와 사이토카인 생성량 측정
세포배양액 0.5 mL에 동량의 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5%　Phosphoric acid와 1% α-naphtylamide in H2O) 0.5 mL을 넣어 혼합하여　암실에서 10분간　반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 Sodium nitrite(NaNO2)를 사용하여 얻은 검량선으로 산출하였다.
세포배양액　중　IL-10 그리고 INF-γ 농도는 ELISA kit(eBioscience Co., San Diego, CA, USA)을 이용하여 제조사 지침에　따라 Microplate reader(AMR-100, Allsheng Co., Ltd., Hangzhou, China)로 측정하였다.
5. 실험결과
(1) 비장세포 세포증식 및 NO 분비 촉진 효과
실시예 3 및 제조예 3의 티백차 추출물을 마우스에 투여했을 때 비장세포 증식능에 미치는 영향과 NO 분비 촉진 효과를 각각 도 9와 10에 나타냈다. 분리된 비장세포는 Mitogen 없는 배지로 배양한 그룹, T 림프구를 자극하는 Con A를 첨가한 그룹 그리고 B 림프구를 자극하는 LPS를 첨가한 그룹으로 나누었고, 각 그룹은 추출물을 섭취하지 않은 일반처리군(normal), 실시예 3을 섭취한 군(100 mg/kg 실시예 3군, 300 mg/kg 실시예 3군) 그리고 제조예 3의 티백차 추출물을 섭취한 군(100 mg/kg 제조예 3군, 300 mg/kg 제조예 3군)에서 분리한 비장에서 얻은 비장세포를 포함하고 있다.
배지만으로 배양한 경우와 Mitogen(Con A와 LPS)을 첨가하여 배양한 경우 모두 일반처리군(normal)보다는 실시예 3과 제조예 3의 섭취군에서 분리한 비장의 세포들의 세포증식율과 NO 농도가 현저하게 증가하였다.
따라서, 실시예 3 및 이와 동일 혼합 비율로 제조된 제조예 3의 티백차 추출물은 면역세포의 증식율을 증가시키므로 면역활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
(2) 비장세포에서의 INF-γ 과 IL-10 분비 촉진 효과
실시예 3과 제조예 3의 티백차 추출물의 투여가 비장세포의 사이토카인 분비능에 미치는 영향을 도 11과 도 12에 나타내었다. 주로 세포성 면역력을 조절하는 Th1 cytokine 중에서 IFN-γ를 선정하고, 체액성 면역에 관여하는 Th2 cytokine으로 IL-10을 선정하여 배양세포 배양액에 분리된 이들 사이토카인의 농도를 ELISA법으로 정량하였다.
Mitogen를 처리하지 않은 비장세포 및 Con A를 처리한 비장세포 모두에서 INF-γ 분비능이 정상군(normal)과 비교하여 실시예 3 및 제조예 3의 티백차 추출물을 투여한 마우스 비장세포에서 농도에 의존하여 유의적으로 증가하였다(도 11).
Mitogen를 처리하지 않은 비장세포에서 정상군(normal)에서 분비되는 IL-10보다 실시예 3 및 제조예 3의 티백차 추출물을 투여한 마우스에서 분리한 비장세포에서 IL-10 분비능이 더 높았다(도 12(상)). Mitogen인 Con A를 처리한 비장세포에서도 유사한 경향을 나타내었다(도 12(하)). 모두 같은 농도에서 제조예 3이 실시예 3보다 IL-10 분비능을 다소 증가시켰다.
따라서, 실시예 3 및 이들을 이용하여 제조한 제조예 3의 티백차 추출물은 IFN-γ 같은 Th1 cytokine 및 IL-10과 같은 Th2 cytokine 분비를 조절함므로써 면역 증진 효과가 있다는 것을 확인할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 최적 혼합비의 추출물을 티백차와 같은 다양한 식품에 이용하더라도, 이의 면역 활성 증진 효과는 우수하게 유지되는 것으로 확인되었는 바, 티백차 외의 다양한 식품에서 면역 활성 촉진 기능성 건강 식품으로 활용 가능할 것으로 기대된다.

Claims (5)

  1. 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마 껍질을 포함하는 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역 활성 증진용 조성물은 면역세포의 NO(Nitric Oxide) 분비 능력 증진 및/또는 사이토카인(Cytokyne) 분비 능력 증진 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 혼합물의 열수 추출물의 동결 건조 분말인 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물은 도라지, 더덕, 옥수수수염 및 고구마껍질을 1:0.8~1.2:0.2~0.7:2.5~3.5의 중량비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 면역 활성 증진용 조성물을 포함하는 건강 기능 식품.
KR1020190179569A 2019-12-31 2019-12-31 고구마 껍질 분말이 포함된 혼합물의 추출물을 포함하는 면역 활성 증진용 조성물 및 이를 포함하는 건강 기능 식품 KR102383124B1 (ko)

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KR102647678B1 (ko) 2022-12-15 2024-03-15 정두희 고구마 부산물을 이용한 가축 사료 첨가제의 제조방법 및 이를 포함하는 가축 사료

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