KR20210060570A

KR20210060570A - 혈액뇌장벽을 통과 가능한 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20210060570A
Application number: KR1020217011426A
Authority: KR
Inventors: 리슈펑; 치앵 조우
Original assignee: 선전 루이지엔 바이오싸이언스 테크놀로지 리미티드 컴퍼니
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2021-05-26
Also published as: WO2020056987A1; EP3854818A1; US20220112250A1; JP2021536499A; CN109232745B; EP3854818A4; CN109232745A; US11814416B2

Abstract

본 발명은 혈액뇌장벽을 통과 가능한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 지코노타이드의 C말단과 세포막 투과성 펩티드의 N말단이 1개의 글리신을 통해 연결되어, 획득한 혈액뇌장벽을 통과 가능한 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리펩티드는 정맥, 복강 또는 비강 투여 방식에 적용되어, 조작이 간편하고, 임상 위험이 작으며, 정맥, 복강 또는 비강을 통해 시용하고, 체내에서의 약효 작용 시간이 길며, 진통 효과가 훌륭하고, 펩티드의 부작용이 약소하기에, 대규모적인 임상 응용에 적합하다. 본 발명의 폴리펩티드는 제조가 간단하고, 제조 공정과 제조 과정에서 품질 제어가 가능하기에, 대규모적인 산업화 생산에 적합하다.

Description

혈액뇌장벽을 통과 가능한 폴리펩티드

본 발명은 폴리펩티드(polypeptide) 약물 기술 분야에 관한 것으로서, 특히 지코노타이드(ziconotide)의 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.

지코노타이드(상품명 PrialtTM, Elan Pharmaceuticals)는 미국 식약청(FDA)에서 2004년에 허가한 첫 번째 사례의 코노톡신류 약물이다. 그 목표 작용 부위는 N형 전압 게이트 컨트롤 칼슘 이온 통로이며, 지주막하강(척수강 내) 복합 진통의 일선 약물이다. 지코노타이드는 태평양 코노톡신―청자고둥―체내 독액 펩티드에서 친수성 폴리펩티드ω―MVIIA의 인공 합성물이고, 첫 번째로 임상에 응용되는 신형의 비모르핀류 진통제로서, 그 분자식은 C₁₀₂H₁₇₂N₃₆O₃₂S₇이고, 구조식은 H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH₂이다.

지코노타이드는 임상에서 대상포진 후유 신경통, 환지통, 에이즈 관련 신경성 동통, 난치성 암 통증, 수술 후 통증, 예컨대 전신성 진통제, 보조 요법, 척수강 내 주사 아편류 약물 무효의 통증을 완화하는 등과 같이 다른 치료 방법에 불내성을 가지거나 거부 반응이 있는 것을 치료할 수 있다. 살리실산염, NSAIDs 및 국부 마취제가 말초 신경/외상 수용기를 통해 주요하게 작용하고, 아편류 약물 및 전신 마취약은 대뇌 수준에 주요하게 작용되어 통증과 의식을 해소하는 것과 상이하게, 지코노타이드의 치료 작용 메커니즘은 N형 칼슘 통로 수용체와 결합되는 능력에 의존한다. N형 칼슘 이온 통로 수용체는 척수 후부 표면 Rexed'sI 및 II층 내의 주요 상해성 A-δ 및 C- 슬러우 섬유 통증 섬유(외상 수용기)에 위치하고, 완화 가능한 기타 치료 수단은 척수강 내 주사 모르핀 무효의 통증을 포함하고, 장기간 사용하여도 상기 약물은 내성 및 탐닉성이 발생하지 않으며, 외상, 종양 및 신경통 등과 관련된 만성 통증을 치료하는데 응용되고, 특히 아편류 약물에 민감하지 않은 난치성 통증 또는 아편류에 내성이 없는 환자를 치료하는데 독특한 우세가 있다. 그러나, 지코노타이드는 혈액뇌장벽을 관통할 수 없고, 현재 단지 척수강 내 튜브 삽입 투여 경로만으로 주입이 가능하며, 삽입관과 주입펌프를 피하에 매몰하고, 수술로 완성해야 하기에 임상 사용에서 불편하다. 현재 지코노타이드는 단지 기존의 진통 약물에 대한 저항성, 만성 통증의 장기적, 영구적인 치료에만 사용된다. 이러한 투여 방식은 상기 약물의 고유적인 장점의 임상 응용을 지대하게 제한하였다.

혈액뇌장벽(BBB)은 뇌조직과 혈액 사이에 존재하는 하나의 복잡한 세포 시스템인데, 혈액뇌 양측의 물질 운행을 제어함으로써, 중추 신경 조직 내의 환경의 안정적인 혈액 중의 유용한 물질은 모세 혈관 내피 세포막의 여러 가지 수용체를 통해 상호 작용하도록 보장하며, 유기체의 필요에 따라 대뇌에 운반되어 작용을 발휘한다. 일부 유독 유해 물질은 상기 장벽에 의해 뇌조직 밖에 차단되어 대뇌가 손상되는 것을 방지한다. 혈액뇌장벽(BBB)이라는 특수한 보호 작용은 대부분 약물이 대뇌에 진입하기 어렵게 되어 중추 신경류 질병의 치료 및 투여에 어려움을 겪게 된다.

세포 투과성 펩티드(cell penetrating peptides, CPP)는 한 가지 생물막을 통해 세포에 진입 가능한 올리고 펩티드(일반적으로 35개 아미노산 잔기보다 적음)이다. 이는 1988년에 발견된 것으로, 학자는 HIV-1의 트랜스 활성자 단백질(Tat)이 막전이하여 세포 내에 도입되는 것을 발견하였고, 그러자 또 다른 사람은 초파리 전사 단백질도 유사한 특성이 있음을 발견하였다. 그 후, 다른 수많은 CPP가 잇따라 발견되었고, CPP는 상대 분자 질량, 아미노산 구성, 아미노산 배열 서열에서 다양성이 표현되었으며, 포함된 아미노산 수량과 종류는 상이하고, 극성과 전하량도 상이하지만 이들은 일부 공통점을 구비한다. 예를 들면, 농도가 낮은 조건 하에서, 세포막을 관통하여 세포에 진입할 수 있으며 막에 대해 뚜렷한 파괴 및 손상을 일으키지 않고; 자체적으로 막 관통 능력을 구비하며, 또한 여러 물질이 소분자, 핵산, 단백질 폴리펩티드 및 나노 입자 등 엔도시토시스를 포함하도록 유도하고; 효율이 높고 독성이 낮다. 최근, 세포 투과성 펩티드를 사용하여 약물 분자와 연결하는 것은 혈액뇌장벽을 관통하는 효과에 달성하는 것을 연구 발견하였는데, 이는 중추 신경 약물 투여에 새로운 방향을 제시하였다.

현재, 선행기술에는 세포 투과성 펩티드를 이용하여 코노톡신이 혈액뇌장벽을 관통하도록 보조하는 기술적 방법이 존재하는 바, 예를 들면, 지코노타이드를 바이러스 입자에 포장시키고, 바이러스 입자 표면에서 TAT 폴리펩티드를 연결하며, 상기 바이러스 입자는 지코노타이드가 혈액뇌장벽을 통과하도록 전달할 수 있다. 그러나, 이러한 제조 방법의 공정은 복잡하고, 바이러스의 포장 과정은 훌륭한 품질 제어가 불가능하여, 산업 상에서 대규모적으로 응용하기 어렵다. 또한, TAT 펩티드와 코노톡신의 N 단은 두 개의 GG를 연결 유닛으로 하고, 융합 폴리펩티드를 제조 획득하며, 상기 융합 폴리펩티드는 혈액뇌장벽을 통해 정맥 주사 투여에 적용될 수 있지만, N말단에 연결된 융합 폴리펩티드는 정맥 주사 투여을 통해, 체내에서의 진통 효과 및 존속 시간이 임상 응용의 요구에 도달하지 못하기에 대규모적인 보급을 진행할 수 없다. 따라서, 혈액뇌장벽을 통과 가능하고 척수강 내 삽입관 투여의 흠결을 극복하며, 임상에서 대규모적으로 사용 가능한 개선형 지코노타이드를 획득하는 것은 현재 시급히 해결해야 할 과제이다.

본 발명의 목적 중의 하나는 혈액뇌장벽을 통과 가능한 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명자는 장기적인 연구 끝에 지코노타이드의 C말단을 통해 세포막 투과성 펩티드의 N말단과 연결하여, 혈액뇌장벽을 통과 가능한 융합 펩티드를 획득하여, 선행기술에 존재하는 흠결을 극복할 수 있고, 정맥, 복강 또는 비강 투여에 적용하며, 체내에서 진통 효과가 바람직하고 약효 시간이 비교적 길기에 임상에서 대규모적으로 사용 가능함을 발견하였다.

구체적으로, 상기 목적을 구현하는 기술적 해결수단은 하기와 같다.

폴리펩티드는 지코노타이드와 세포막 투과성 펩티드로 구성된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 지코노타이드가 C말단을 통해 세포막 투과성 펩티드와 연결되어 구성되거나, 또는 상기 지코노타이드의 C말단이 코넥손을 통해 세포막 투과성 펩티드의 N말단과 연결되는 것이며, 바람직하게는, 상기 코넥손은 1개의 글리신(glycine)이다.

부가적으로, 지코노타이드의 아미노산은 CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC(예컨대 SEQ ID NO.1로 표시됨), 또는, 융합 폴리펩티드에서 지코노타이드는 역시 CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC(예컨대 SEQ ID NO.1로 표시됨)가 10개보다 적고, 8개보다 적으며, 6개보다 적고, 4개보다 적으며, 2개 또는 1개의 아미노산이 결실, 돌연변이 또는 삽입된 아미노산의 변이체일 수도 있다.

부가적으로, 상기 세포막 투과성 펩티드는 페네트라틴(Penetratin), TAT 펩티드, Pep-1펩티드, S4₁₃-PV, 메가이닌 2(Magainin 2) 또는 부포린 2(Buforin 2)일 수 있다.

여기서, TAT 펩티드는 HIV-1의 트랜스 활성자 단백질(Tat)에서 원천된 것으로서, 막전이하여 세포 내에 도입될 수 있다. TAT 펩티드의 아미노산이 YGRKKRRQRRR(예컨대 SEQ ID NO.2로 표시됨)이거나, 또는, 융합 폴리펩티드에서 TAT 펩티드는 YGRKKRRQRRR(예컨대 SEQ ID NO.2로 표시됨)가 10개보다 적고, 8개보다 적으며, 6개보다 적고, 4개보다 적으며, 2개 또는 1개의 아미노산이 결실, 돌연변이 또는 삽입된 아미노산의 변이체, 또는 그 펩티도미메틱( Peptido Mimetic)일 수도 있다.

바람직하게는, 전술한 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드 또는 개선형 지코노타이드의 아미노산 서열은 CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKCGYGRKKRRQRRR(예컨대 SEQ ID NO.5로 표시됨)이거나 또는, 10개보다 적고, 8개보다 적으며, 6개보다 적고, 4개보다 적으며, 2개 또는 1개의 아미노산이 결실, 돌연변이 또는 삽입된 아미노산의 변이체, 또는 그 펩티도미메틱일 수도 있다.

상기 펩티도미메틱은 천연 아미노산으로 구성된 펩티드와 기본상 동일한 구조 및/또는 기능 특징을 구비하는 합성 화학 화합물을 가리킨다. 펩티도미메틱은 아미노산의 합성된 비천연 유사물, 또는 부분 천연 펩티드 아미노산 및 부분 비천연 아미노산 유사물의 키메라 분자를 완전히 포함할 수 있다. 펩티도미메틱은 임의의 수량의 천연 아미노산 보존적 치환 위치 포인트에 혼입될 수도 있고, 이러한 치환이 기본적으로 시뮬레이션 모의물의 구조 및/또는 활성 억제 또는 결합 활성을 개변시키지지 않기만 하면 된다. 폴리펩티드의 시뮬레이션 성분은 비천연 구조 성분의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 상기 비천연 구조 성분은 통상적으로 3개의 구조 그룹에서 원천되는 바, a) 비천연 아미도 결합(“펩티드 결합”) 연결된 잔기 연결그룹; b) 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 대체한 비천연 잔기이거나; 또는 c) 2차 구조 시뮬레이션을 유도하는, 즉 2차 구조 예를 들면 β 회전각, γ 회전각, β 접철, α 나선 정렬형태(conformation) 등의 잔기를 유도하거나 안정시킨다.

본 발명의 두 번째 목적은 약학 조성물 또는 제제를 제공하는 것이고, 바람직하게는 약물 제제이며, 부가적으로, 상기 약학 조성물 또는 제제/약물 제제는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 허용 가능한 담체를 포함한다.

상기 약학 조성물 또는 제제/약물 제제는 아래 개시된 임의의 약제량(dose)의 단위 약제량 형식(즉, 1 횟수에 시용되는 약제량)으로 제공되는 약학 조성물을 포함할 수 있다. 통상적인 혼합, 용해, 조립, 드라제(dragee) 제조, 그라인딩, 유화, 포낭, 포매 또는 동결 건조 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 활성제를 약용 가능 제제로 가공할 수 있는 한 가지 또는 여러 가지 생리학적 수용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조재를 사용하여, 통상적인 방식으로 상기 약학 조성물 또는 제제/약물 제제를 조제할 수 있다. 적합한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 결정된다.

투여 방식은 위장 외, 정맥 내, 경구, 피하, 동맥 내, 두개강 내, 척수강 내, 복막 내, 국부, 비강 내 또는 근육 내에 투여할 수 있다. 바람직하게는 정매 내 투여 또는 복강 주사 방식이다. 위장 밖 투여되는 상기 약학 조성물 또는 제제/약물 제제는 바람직하게는 무균 및 기본상 등장성 삼투적인 것이다. 주사에 대해, 활성제를 수용액에 조제하고 바람직하게는 생리적으로 상호 용납되는 완충액, 예를 들면 Hank's 용액, 링거액 또는 생리식염수 또는 아세테이트 완충액(주사 부위의 불편함을 감소하기 위함)에 조제할 수 있다. 상기 용액은 서스펜션화제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 조제제가 함유될 수 있다.

본 발명의 세 번째 목적은 폴리펩티드의 용도를 제공하는 것이다. 상기 용도는, 약물 제조를 위한 것으로, 바람직하게는, 진통 약물을 제조하기 위한 것이며, 바람직하게는, 상기 진통 약물은 칼슘 통로에 작용한다.

부가적으로, 상기 약물은 통증 치료, 통증 관련 질병을 치료하기 위한 것이며, 예를 들면, 당뇨병, 관절염(예를 들면, 골관절염, 류마티스 관절염 및 청소년 만성 관절염), 암증 또는 화학 요법의 독성 작용, 섬유근통, 대상 포진, 과민성 대장증후군, 혈관 문제 또는 검상 적혈구병을 포함하는, 만성 통증을 초래하는 질병을 치료하는 것이다.

우발적인 일반 통증 관련의 질병은 류마티스성 다발근통, 심기증, 우울증, 당뇨병, 악성 빈혈, 검상 적혈구병 및 매독을 포함한다. 신경성 동통과 관련된 질병은 신경통(예를 들면, 삼차 신경통, 비전형 안면통 및 대상 포진 또는 포진으로 인한 대상 포진 신경통), 외주 신경병, Charcot-Marie-Tooth병, 프리드라이히운동실조, 당뇨병(예를 들면, 당뇨병성 신경병증), 식음 결함(특히 비타민 B-12), 지나친 알콜 사용(알콜성 신경병증), 요독증(신부전에서 비롯됨), 암, 에이즈, 간염, 콜로라도진드기열, 디프테리아, 길랑-바레 증후군, 에이즈로 발전하지 않은 HIV 감염, 한센병, 라임병, 다발성 결절성 동맥염, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 조직적 루푸스성 구내염 및 중독성 화합물에 노출되는 것을 포함한다.

염증 통증과 관련된 질병은 (A)관절염 질환, 예를 들면 류마티스 관절염; 청소년 만성 관절염; 조직적 루푸스성 구내염(SLE); 통풍성 관절염; 공피증; 골관절염; 건선성 관절염; 강직성 척추염; 라이터증후군(반응 관절염); 성인 스틸씨병; 바이러스 감염으로 인한 관절염; 세균 전염으로 인한 관절염, 예를 들면, 임균성 관절염 및 비임균성 세균성 관절염(패혈성 관절염); 3급 라임병; 결핵성 관절염; 및 진균 감염으로 인한 관절염, 예컨대 사카로미세스증; (B)자가 면역 질환, 예를 들면 길랑-바레 증후군, 하르시모토 갑상선염, 악성 빈혈, 애디슨병, I형 당뇨병, 조직적 루푸스성 구내염, 발진병, 쇼그렌 증후군, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 중증근무력증, 라이터증후군 및 그레이브스병. (C)결합조직병, 예를 들면 척추 관절염, 발진병 및 섬유근통; (D)손상으로 인한 염증; (E)감염, 예를 들면 결핵병 또는 간질성 각막염; 및 (G) 관절염, 예를 들면 활액낭염 또는 근건염을 포함한다. 두통의 유형은 근육의/근육 원천성 두통, 혈관성 두통, 견인성 또는 염증성 두통, 군발성 두통, 호르몬 두통, 반발성 두통 또는 만성 부비강염 두통을 포함한다.

몸체 통증은 하기 요소와 관련되는 바, 과도한 근육 수축, 반복적인 운동 질병, 예컨대 다발성근염의 근육 질병, 발진병, 낭창, 섬유근통, 류마티스성 다발근통, 및 횡문근변성, 근육통, 예컨대 근육 농양과 같은 감염, 선모충증, 유행성 감기, 라임병, 말라리아, 로키산 홍반열, 조류 독감, 일반 감기, 지역사회 획득 폐렴, 뇌막염, 원숭이 두, 중증 급성 호흡기 증후군, 독소 충격 증후군, 선모충증, 티푸스, 및 상기도 감염이다. 내장 통증은 하기 요소와 관련되는 바, 과민성 대장증후군, 만성 기능성 복통(CFAP), 기능성 변비, 기능성 소화 불량, 비심장성 가슴 통증(NCCP) 및 만성 복통, 만성 위장염, 예를 들면 위염, 염증성 장질환, 예를 들면 크론병, 궤양성 결장염, 미시적 결장염, 게실염 및 위장염; 간질성 방광염; 장허혈; 담낭염; 충수염; 위식도 역류; 궤양, 신장 결석, 요로 감염, 췌장염 및 헤르니아이다.

본 발명의 네번째 목적은 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는 것으로서, 바람직하게는, 화학적 합성의 방식으로 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한 바람직하게는, 고체상 합성법 또는 재조합 발현법을 사용하여 제조되며, 부가적으로, F-moc 완전자동 고체상 합성법을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조한다.

선행기술에 비해, 본 발명의 유익한 효과는, 지코노타이드의 C말단과 세포막 투과성 펩티드를 연결하여 개선형 지코노타이드를 획득함으로써, 지코노타이드가 혈액뇌장벽을 통과 불가한 것을 극복하였고, 근육 내 주사가 불가능하며, 주요하게 뇌실 및 척추관 투여로 인한 외과 수술의 위험도가 높고 감염 위험성이 높은 등 부족점을 극복하였다. 본 발명의 폴리펩티드는 혈액뇌장벽을 통과할 수 있어, 정맥, 복강 또는 비강 투여 방식에 적용되며, 조작이 간편하고, 임상 위험이 작으며, 정맥, 복강 또는 비강을 통해 시용되고, 체내에서의 약효 작용 시간이 길며, 진통 효과가 훌륭하고, 또한 본 발명의 폴리펩티드는 부작용이 적기에, 대규모적인 임상 응용에 적합하다. 이 밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 제조가 간단하고, 제조 공정과 제조 과정에서 품질 제어가 가능하기에, 대규모적인 산업화 생산에 적합하다.

도 1은 MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d의 원 스텝 산화 폴딩 HPLC 분석도이다.
도 2는 MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d의 원편광 이색성 그로마토그램이며, 폴리펩티드의 최종농도는 35 μmol/L이고, 각각 인산염 완충 용액(10 mM, pH = 7.2)에 용해된다.
도 3은 MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d가 CaV2.2 통로 전류에 대한 억제 작용으로서, MVIIA의 약제량 효과 곡선은 도 3A에 도시된 바와 같으며, MVIIA 변이체의 약제량 효과 곡선은 도 3B-3E에 도시된 바와 같다. 반수 억제 농도 및 경사치의 데이터는 모두 도면에 표시되고, 데이터는 평균값 ± 표준 오차로 표시되며, 각각의 그룹은 5마리의 마우스이다. 도 F에 도시된 바와 같이, 10 μM L-MVIIA(청색) 및 2 μM MVIIA(적색)일 경우, -80 mv 내지 10 mv의 전압 스텝에 의해 여기되는 전체 세포 칼슘 통로 전류 흔적의 중첩이고; 도 G는 MVIIA 및 그 변이체의 반수 억제 농도의 일괄표이다.
도 4는 MVIIA 및 MVIIA-c핫 플레이트 통증 비교 결과이며, 측뇌실에 MVIIA를 투여하고(도 4A), 미정맥(caudal vein)에 MVIIA(도 4B) 및 MVIIA-c(도 4C)를 투여한 후의 체내 진통 효과이다. 진통 효과는 반응 잠복 시간으로 표시한다. 데이터는 평균값 ± 표준 오차로 표시되며, 각각의 그룹은 6~8마리의 마우스이다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001은 생리 식염수 그룹과 비교한 것을 표시한다(데이터 분석은 다변량 분산 반복 분석 및 던컨의 다중범위 검정법을 사용함).
도 5는 MVIIA-a, b, d핫 플레이트 통증 실험 결과이고, 도 5A-도 5C는 미정맥에 MVIIA-a, b, d폴리펩티드를 투여한 후 체내 진통 효과이다. 진통 효과는 백분율로 최대 가능한 영향(%MPE)을 표시한다. 데이터는 평균값 ± 표준 오차로 표시되며, 각각의 그룹은 8-10마리의 마우스이다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001은 생리 식염수 그룹과 비교한 것을 표시한다.
도 6은 아세트산 꼬임 실험에서 MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d의 진통 효과이고, 복강에 1% 아세트산을 주사한 후의 5 내지 20분 내에, 마우스의 뒹굼 횟수를 기록하며; 도 A에 도시된 바와 같이, 측뇌실에 약물투여한 지 30분 후, 복강에 1%의 아세트산을 주사한 작용을 비교한다. 도 B에 도시된 바와 같이, 미정맥에 약물투여한 지 30분 후, 복강에 1%의 아세트산을 주사한 작용을 비교한다. #은 생리 식염수 그룹(saline)과 비교한다. *은 MVIIA 그룹과 비교한다. &은 MVIIA-C 그룹과 비교한다. *, #, &, p<0.05; ***, ###, &&&, p<0.001. 데이터는 평균값 ± 표준 오차로 표시되며, 각각의 그룹은 9-11마리의 마우스이다.
도 7은 MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d가 마우스 진전 시간에 대한 영향이며, 측뇌실에 6 μL의 폴리펩티드(0.9 nmol/kg) 및 생리 식염수를 투여한다. 투여 후 30분 및 120분에, 5분 내에 마우스의 누적 진전 시간을 기록한다. 데이터는 평균값 ± 표준 오차(n= 12)로 표시된다.
도 8은 MVIIA의 질량 스펙트럼이다.
도 9는 MVIIA-a의 질량 스펙트럼이다.
도 10은 MVIIA-b의 질량 스펙트럼이다.
도 11은 MVIIA-c의 질량 스펙트럼이다.
도 12는 MVIIA-d의 질량 스펙트럼이다.
도 13은 MVIIA 및 상이한 약제량의 MVIIA-c를 비강 투여한 후의 진통 능력이다.
도 14는 MVIIA-a,b,d비강 투여 시 핫 플레이트 통증 실험에서의 진통 능력이다.

선행기술 중의 지코노타이드의 부족점을 극복하기 위해, 본 발명자는 장기적인 연구 끝에 지코노타이드의 C말단을 통해 세포막 투과성 펩티드의 N말단과 연결하여 획득한 개선형 지코노타이드의 융합 펩티드는 정맥 또는 복강 투여에 적용된다는 것을 발견하였다. 상이한 타입의 개선형 지코노타이드의 진통 효과를 더욱 연구하기 위해, 본 발명은 여러 가지 상이한 타입 및 구조의 융합 폴리펩티드를 설계 합성하였는 바, 코넥손을 사용하지 않고, 지코노타이드의 C말단을 통해 세포막 투과성 펩티드의 N말단과 직접 연결되는 융합 폴리펩티드; 하나 또는 다수 개의 글리신을 코넥손 취급으로 구축한 융합 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다. 부가적으로, 상기 상이한 타입의 융합 폴리펩티드에 대해 구조 표상을 진행하고, 세포 실험, 체내 실험 및 부작용 검증 실험에 의해 상이한 타입의 개선형 지코노타이드의 효과를 설명한다.

본 발명의 기술적 해결수단을 더욱 잘 이해하기 위해, 이하 실시예와 결부하여 상세하게 설명하도록 한다.

실시예 1: 상이한 타입의 지코노타이드 융합 펩티드의 제조

4 가지 상이한 타입의 융합 펩티드를 제조하고, 각각 보호 받는 폴리펩티드MVIIA-a, MVIIA-b, MVIIA-c, MVIIA-d로 명명한다. 동시에 지코노타이드를 제조하고, MVIIA로 명명하며, 대조군으로 한다. 본 실험은 F-moc 완전자동 고체상 합성법을 사용하는 바, 구체적인 단계는 하기와 같다.

폴리펩티드의 합성: 433A 자동 합성기(ABI, Foster City, CA)의 모델을 사용하여 수지 상에서 보호 받는 폴리펩티드 및 그 유도체를 조립한다. 실온 하에, 펩티드 수지는 현탁액에서 2.5 시간 부화되어, 보호기를 탈리시킨다. 현탁액 체계는 10밀리리터 TFA, 0.75 그램 페놀, 0.25 밀리리터의 1,2-에틸렌디티오글리콜, 0.5 밀리리터의 싸이오아니졸 및 0.5 밀리리터의 물로 구성된 것이다.(플루오닐메틸(Fmoc), 흔히 볼 수 있는 알콕시카르보닐계 아미노기 보호기의 한가지). 여과를 거쳐, 폴리펩티드에서 보호기 제거 혼합물 중 수지를 분리한다. 조립형(Coarse Grain) 폴리펩티드는 150ml 예랭된 에틸에테르 용액에서 침전되고, 10% 빙초산을 용리 작용제로 하여 덱스트란 겔G-25 칼럼에서 크로마토그래피 정제를 진행한다. 그 다음, 폴리펩티드를 함유한 구성 성분을 취합 및 동결 건조시키고, 고성능 액상 크로마토그래피를 사용하여 조립형 폴리펩티드의 순도가 80% 정도인 것을 측정하였다.

폴리펩티드 폴딩: MVIIA는 6개의 시스테인 잔기를 포함하고, 그 3개의 디설파이드 결합 구조를 유지하며, 산화 조건 하의 폴딩은 여러 가지 이성질체를 생성할 수 있다. 산화 환원 시스템, 완충 용액, 염, 농도 및 온도의 선별을 거친 후, 두 개의 MVIIA의 고효율 폴딩 조건을 선택하였는 바, (a) 0.5 M NH4Ac 완충 용액(pH 7.9)이고, 여기서 1 mM GSH, 0.1 mM GSSG, 1 mM EDTA, 및 0.2 mg/mL MVIIA를 포함하며; (b) 0.5 M NH4Ac완충 용액이며, 여기서 1 mM cysteine, 1 mM EDTA, 및 0.2 mg/mL MVIIA를 포함한다. 4°C일 경우, 직선형 폴리펩티드MVIIA는 a 조건 하에서 48~72 시간 및 b 조건에서 24~48 h 하에서 폴딩된다.

폴리펩티드 순화 및 캐릭터리제이션: MVIIA가 산화된 후, 우선 아세트산을 사용하여 반응 혼합물을 산성화(pH < 4.5) 처리하고, 이어서 여과한다. 여과액은 직접 Zorbax 21.2×250mm인 C18 액상 크로마토그래피 컬럼에 로딩되고, 여기서 사용되는 것은 고효율 액상 크로마토그래피 펌프(Waters 2000 series, Milford, MA)를 제조하는 것이다. C18 컬럼은 우선 완충 용액A(0.1%TFA의 수용액)를 사용하여 컬럼을 미리 세척하고, 그 다음 10-40% 완충 용액B(0.1%TFA인 아세토니트릴 용액)을 사용하여, 8 mL/min의 속도로 40 분 동안 선형 기울기 용리를 진행한다. 획득한 유분은 90%의 MVIIA를 함유한 농축액이고, 이어서 9.4× 250 mm Zorbax C18 액상 크로마토그래피 컬럼이 장착된 반분취된 역위상 고성능 액상 크로마토그래피를 사용하여 한층 더 순화시킨다. 마지막으로, 덱스트란 겔G-25 크로마토그래피 컬럼에서 20% 초산 용액을 용리액으로 하여, 최종 산물을 TFA 염 용액에서 아세테이트 용액으로 전환시킨다. 폴리펩티드의 순도는 분석형의 역위상 고성능 액상 크로마토그래피로 평가되며, 평가 시 분당 1ml의 유속 하에, Zorbax C18액상 크로마토그래피 컬럼 (4.6 × 250 mm)을 사용하여, 8-40% 완충 용액B(0.1% TFA인 아세토니트릴 용액)에 대해 25분 동안 선형 기울기 용리를 진행한다. 최종적으로, 획득된 최종 산물은 순도가 98%인 폴리펩티드이다.

실시예 2: 상이한 타입의 지코노타이드 융합 펩티드의 화학적 특성 및 구조 표상

1.MVIIA 및 그 변이체의 화학적 특성

4℃ 일 경우, 완충 용액은 24-48 시간 동안 선형 폴리펩티드를 처리하고, 그 다음 고성능 액상 크로마토그래피로 분석하여 선형 폴리펩티드의 폴딩에 의해 하나의 주요한 피크와 몇 개의 작은 피크가 나타난다는 것을 발견하였다. 완충 용액 체계는 1 mM 글루타티온, 0.1 mM 산화형 글루타티온, 1 mM EDTA, 및 0.2 mg/mL 선형 폴리펩티드를 포함하고, 용액의 pH는 7.9이다. 주요한 산물은 정제를 거쳐, 역위상 고성능 액상 크로마토그래피를 분석하는 것을 통해 평가되며, 아울러 폴리펩티드의 순도는 98%보다 큰 것으로 결정된다. Ultraflex III TOF/TOF 질량 분석계로써 결정된다(Bruker). 제조하여 획득된 폴리펩티드서열은 표 1과 같으며, 그것의 1차원 산화 폴딩 HPLC 분석도는 도 1에 도시된 바와 같다.

명칭	서열
MⅦA(SEQ ID NO.1 )	CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC
MⅦA-a(SEQ ID NO.4 )	CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKCYGRKKRRQRRR
MⅦA-b(SEQ ID NO.5 )	CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKCGYGRKKRRQRRR
MⅦA-c(SEQ ID NO.3 )	CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKCGGYGRKKRRQRRR
MⅦA-d(SEQ ID NO.6 )	CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKCGGGYGRKKRRQRRR

2. 원형 이색성 분광폴리펩티드가 PBS(10 mM, pH = 7.2) 용액에서 용해되고, 최종 농도는 35 μM이다. 실온 하에, 190nm 내지 260nm 파장 범위 내의 원형 이색성 분광을 검출하며, 사용된 것은 Chirascan Plus spectropolarimeter(Applied Photophysics Ltd., Leatherhead, Surrey, UK) 기구이다. 설정된 검출 인덱스는 step resolution 1.0 nm; speed 20 nm/min, 및 cell path length of 1.0 mm로 표시된다.

도 2에 도시된 바와 같이, MVIIA는 195nm-205nm파장 범위에서 선명한 β 폴딩 구조를 나타낸다. 우리는 TAT 변이체가 유사한 랜덤 코일 구조를 구비함을 발견하였고, 200nm 좌우를 선회하며, 선명한 약화 파문 구간이 나타난다. 이러한 결과는 MVIIA와 TAT 사이의 연결 서열의 길이가 확대될 경우, 폴리펩티드의 2차 구조는 변화되지 않음을 나타낸다. 연결 서열이 확장 증가될 경우, TAT 변이체의 몰 타원도는 이에 따라 깊어지며, MVIIA와 TAT 사이의 연결 서열이 확장 증가되는 것은 랜덤 코일 구조를 형성하는데 유리하다는 것을 나타낸다. 질량 스펙트럼(Voyager MALDI-TOF 분광기를 사용함)의 방법을 사용하여 산물의 폴리펩티드의 정확한 분자량을 감정하는 것은, 표 2에 개시된 바와 같으며, MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d의 질량 스펙트럼은 도 8 내지 도 12에 도시된 바와 같다. 디설파이드 결합의 브리지 모드는 부분 감소 시스테인 커플링 및 아미노산 침묵의 방법으로 할당된다. 합성된 폴리펩티드는 MVIIA 표준품의 고성능 액상 크로마토그래피 및 원편광 이색성 크로마토그래피의 결과가 일치한다.

샘플	이론 MW	실측 m/z	이론 값과 실측한 결과의 차이
MⅦA	2645.54	2639.0198	6.5202
MⅦA-a	4186.0784	4180.0108	6.0676
MⅦA-b	4243.0978	4237.0300	6.0678
MⅦA-c	4299.1353	4292.0362	7.0991
MⅦA-d	4356.1568	4351.0842	5.0726

실시예 3: 상이한 타입의 지코노타이드 융합 펩티드의 전기 생리학 실험

상이한 타입의 개선형 지코노타이드 전기 생리학 효과와 칼슘 이온(CaV2.2) 통로에 대한 억제 작용을 연구하기 위해 하기와 같은 실험을 진행한다.

HEK293T 세포(SV40 대형 T 항원을 발현 가능함)는 10% 소 태아 혈청, 1%의 페니실린, 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 고당 배양기(Gibco)에서 배양된다. 인큐베이터 환경은 37 ℃, 5% CO₂이다. Dr. Diane Lipscombe는 래트 CaV2.2 통로의 α_1B 접합 변이체 e37a를 제공하였고, 부차적 단위 α₂δ₁ 및 β₃ 플라스미드(Addgene plasmid # 26569, # 26575, # 26574)를 보조한다. 이어서 세 가지 플라스미드(3 μg), 0.4 μg 증강형 초록색 형광 단백질 유전자와 리포솜은 함께 HEK293T 세포에 순간 트랜스펙션된다. 24 시간 트랜스펙션된 후, 세포는 유리 슬라이드에 접종되고, 인큐베이터(37 ℃, 5% CO₂)에서 적어도 6 시간 배양한 후, 전기적 생리 기록을 진행한다.

본 연구는 이전에 앞서 발표한 연구 문헌 중 세포 전압 고정 기록의 방법에 따라 기록된 것이다(F. Wang et al., 2016). 요약하여 말하면, 전극이 약 3 MΩ인 전기 저항을 기록하고, 내부 용액에 의해 가득 충전된다. 내부 용액은 135 mM CsCl, 10 mM NaCl, 10 mM HEPES, 및 5 mM EGTA를 포함하고, CsOH로 용액 pH를 7.2가 되게 조절한다. 세포 외 기록 용액은 135 mM N-Methyl-D-glucamine, 10 mM BaCl₂.2H₂O, 2 mM MgCl₂.6H₂O 및 10 mM HEPES를 포함하고, 용액의 최종 pH는 7.4이다. 실온 하에(~22 ℃), MultiClamp 700B 증폭기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 및 Clampex 10.3/Digidata1440A 데이터 수집 시스템 및 디지탈아날로그변환기를 사용하여 수집된 전류를 기록한다. 막전류가 2 kHz에서 여과된 후, 10 kHz에서 샘플링된다. 모든 데이터는 데이터 분석 시스템 clampfit 10.3을 사용하여 분석되고(Molecular Devices), 평균값 ± 표준 오차로 표시된다. N형 Ca 이온 전류를 차단하는 독소의 약제량 - 반응효과 곡선은 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA) 소프트웨어로 제작되며, 전류 폭 억제 곡선은 약물 농도의 함수로 취급되어, 힐 방정식으로 핏팅된다.

MVIIA 및 그 변이체 MVIIA-a,b,c,d의 주요 아미노산 서열 및 그 전기생리학 활성은 표 3에 개시된 바와 같다.

MVIIA 및 그 변이체가 칼슘 이온(CaV2.2) 통로에 대한 억제 작용

알려진 바와 같이, MVIIA는 선택성 CaV2.2 통로 억제제이다. 농도가 2μM MVIIA이면 CaV2.2 통로를 90% 이상 차단할 수 있다.(F. Wang. 2016, and other articles) 본 연구에서, 우리는 293T 세포에서 CaV2.2 통로(α_1B, α₂δ₁ and ß₃)의 Ca²⁺ 피크 전류(ICa)를 기록하였다. 모든 전류는 100ms로 -80 mv 내지 10 mv인 전압 스텝으로 여기된다. 1 μM 농도의 MVIIA, MVIIA-a, MVIIA-b, MVIIA-c 및 MVIIA-d 처리는 Ca²⁺ 피크 전류를 감소시킬 수 있고, 그 감소 값은 각각 98.24 ± 0.708%, 89.45 ± 0.752%, 91.70 ± 1.477%, 98.81 ± 0.427% 및 84.26 ± 3.127%이다. 우리는 MVIIA-c와 MVIIA가 유사한 Ca_V2.2 통로 차단 능력을 가지는 것을 발견하였다. L-MVIIA가 Ca_V2.2 통로를 차단하는 능력은 현저하게 감소되고, 10μM의 농도 하에서 단지 23.28 ± 3.347%의 Ca²⁺ 피크 전류를 감소시킬 수 밖에 없다. MVIIA의 농도와 Ca_V2.2 통로의 억제 응답 관계의 반수 억제 농도는 0.0436 μM이고, TAT 변이체와 비교하면, 거의 5 내지 10배 증가되었다. TAT변이체(MVIIA-a, MVIIA-b, MVIIA-c 및 MVIIA-d)의 반수 억제 농도는 각각 0.413, 0.379, 0.237 및 0.345 μM이고, 도 3에 도시된 바와 같다. 이러한 결과는, MVIIA-a, MVIIA-b, MVIIA-c 및 MVIIA-d가 Ca_V2.2 통로에 대해 일정한 억제 효과를 구비하고 있으며, MVIIA 및 TAT 변이체 사이 연결 서열의 길이는 Ca_V2.2 통로의 결합 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 상이한 타입의 지코노타이드 융합 펩티드의 체내 진통 효과 실험

1. 핫 플레이트 통증 실험

1.1 실험 방법

본 실험에서, 도합 9 그룹의 마우스이고, 각 그룹은 6~8 마리의 마우스이며, 각각 측뇌실 투여 MVIIA(0.11, 0.33 or 1.00 nmol/kg), 미정맥 투여 MVIIA 및 MVIIA-a, MVIIA-b, MVIIA-c 및 MVIIA-d(0.33, 1.00 or 3.00 μmol/kg)을 사용한다. 두 가지 경로로 투여할 경우, 생리 식염수 그룹은 모두 블랭크 대조군이다. 동물은 온도가 정상(Steady State)적으로 55±0.5 °C인 핫 플레이트에 올려져 있고, 지연 시간은 마우스가 핫 플레이트의 표면에 올려진 시간으로부터 처음으로 뒷다리의 발을 핥거나 또는 처음으로 올리 뛴 시간을 기록하여 통증 지수의 문턱값으로 한다(Eddy and Leimbach, 1953). 60s의 시간을 한계로, 60s를 초과하면 마우스를 꺼내, 마우스 조직이 손상되는 것을 방지한다. 약물 투여하기 전에, 지연 시간은 사전에 측정되어 기준 값으로 되고; 이어서, MVIIA, MVIIA-c 및 Saline(측뇌실 투여 또는 미정맥 투여)를 투여한 후의 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 12 h 시의 지연 시간을 기록한다. 지연 기준 시간과 비교하여, 지연 시간이 5s 보다 짧거나 또는 20s보다 긴 마우스는 모두 민감하지 않은 마우스 및 지나치게 민감한 마우스로 인정되어, 추후에 제거된다. 진통 효과는 잠복기 시간으로 표시된다.

1.2 진통 능력 비교

도 4에 도시된 바와 같이, 측뇌실에 MVIIA(0.11, 0.33및1.00 nmol/kg)을 투여한 지 1시간 후, MVIIA의 약효는 최고치에 달하며; 4시간이 도달될 때, MVIIA의 약효는 기본상 소실된다(도 4A). 그러나, 미정맥에 주사될 경우, 많은 약제량의 MVIIA는 모두 약효가 발생되지 않았다(도 4B). MVIIA-c는 MVIIA의 TAT 변이체에서 가장 강하게 CaV2.2 통로 전류를 억제하는 작용을 가진 변이체이다. 도 4C에 도시된 바와 같이, MVIIA-c는 투여된 지 3시간일 때 가장 강한 약효를 나타내며, 이의 최대 약효 지속 시간은 4시간 정도이며, 약효 지속 시간은 12시간이다.

도 5에 도시된 바와 같이, 미정맥에 상이한 약제량의 MVIIA-a,b,d(0.11 umol/kg, 0.33 umol/kg 및 1.00μmol/kg)를 주사한 지 1시간 후, 모두 진통 효과를 나타내며, 투여한 지 2~3시간일 때 가장 강한 약효를 나타내고, 약효는 4시간 정도 지속되며, 시간의 흐름에 따라 단계적으로 감소되고, 투여 12시간 후에도 투여 그룹과 식염수 그룹은 여전히 현저한 차이를 보이며, 약효 지속 시간은 12시간이다.

2. 아세트산 꼬임 실험(Koster et al., 1959)

2.1 실험 방법

세 가지 약제량의 MVIIA-a,b,c,d 폴리펩티드 그룹(0.6, 1.8 및 5.4 nmol/kg, 도면에서 저, 중, 고 약제량), 식염수 대조군(saline), 세 가지 약제량의 양성은 약물 그룹 MVIIA(0.11, 0.33 및 1.00 nmol/kg, 도면에서 저, 중, 고 약제량) 동물 처리를 참조한다. 꼬임 실험 진행 시, 복강에 1% 아세트산을 주입하기 30분 전에 각각 MVIIA(측뇌실) or MVIIA-a,b,c,d(측뇌실)를 투여하고, 이어서 MVIIA 및 MVIIA- MVIIA-a,b,c,d의 체내 진통 효과를 측정한다. MVIIA and MVIIA-a,b,c,d가 혈액뇌장벽을 통과하는 능력을 검출하기 위해, 복강에 1% 아세트산을 주입하기 3시간 전에, 미정맥 투여 방식으로 MVIIA 및 MVIIA-a,b,c,d를 각각 투여한다. 생리 식염수 그룹은 모두 블랭크 대조군(측뇌실 투여 또는 미정맥 투여)이다. 아세트산을 주사한 후 5분 내지 20분 내의 마우스의 뒹굼 횟수를 기록한다(Galeotti et al., 2008). 꼬임 운동의 횟수는 복부 근육이 수축되고 한편 뒷다리의 인장 및 몸체의 인장이 수반되는 특징을 기록한 것이다.

2.2 진통 능력 비교

아세트산 꼬임 실험에서, 세 가지 약제량의 MVIIA-a,b,c,d 폴리펩티드 그룹(0.6, 1.8 및 5.4 nmol/kg, 도 6에서 저, 중, 고 약제량), 식염수 대조군(saline), 세 가지 약제량의 양성 참조 약물 그룹 MVIIA(0.11, 0.33 및 1.00 nmol/kg, 도 6에서 저, 중, 고 약제량) 동물 처리를 진행하고, 각각의 그룹이 3 가지 상이한 약제량에서, 정맥 투여 및 측뇌실 투여 조건에서의 뒹굼 횟수를 대조한다. MVIIA-a,b,c,d 폴리펩티드 그룹과 양성 참조 약물 그룹 MVIIA가 모두 아세트산 유도의 뒹굼 횟수를 감소시키는 것을 발견하였고, 약제량 의존성이 표현되었다. 측뇌실 투여 조건에서, MVIIA, MVIIA-a,b,c,d는 각각 마우스의 뒹굼 회수가(식염수 그룹에 비해) MVIIA 8.97%, 53.37%, 76.88%; MVIIA-A, 2.94%, 13.36%, 48.35%; MVIIA-B, 10.82%, 42.79%, 77.60%; MVIIA-C, 14.75%, 39.53%, 81.77%; MVIIA-D, 12.08%, 23.95%, 56.54%로 감소되도록 한다. 정맥 투여 조건에서, 양성 참조 약물 MVIIA는 마우스의 뒹굼 횟수를 감소시키는 작용이 없고, MVIIA-a,b,c,d는 각각 마우스의 뒹굼 횟수가(식염수 그룹에 비해) MVIIA-a, 10.47%, 27.82%, 30.03%; MVIIA-b, 17.08%, 45.94%, 51.79%; MVIIA-c, 19.81%, 49.30%, 62.95%; MVIIA-d, 6.33%, 35.86%, 47.57%로 감소되도록 하며, 도 6에 도시된 바와 같다.

결론: 상기 실험 결과로부터 알 수 있는 바, MVIIA에 비해, MVIIA-a,b,c,d 폴리펩티드가 정맥 주사되는 상황에서, 진통 효과를 가지고 약제량 의존성을 나타내며, 특히, 중, 고 약제량일 경우, MVIIA-a,b,c,d 폴리펩티드는 정맥 주사를 통해, 훌륭한 진통 효과를 달성시켜, 임상 사용 수요를 만족할 수 있다. 부가적으로, MVIIA에 비해, 정맥 주사를 통해 MVIIA-a,b,c,d를 투여하면 약효는 12시간이나 길이 지속되고, 체내에서 훌륭한 슬로우 릴리즈 효과를 갖는다.

전술한 진통 실험은 단일 요소 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하고, 중복 측정된 다중 요소 분산 분석(two-way ANOVA with repeated measures)은 그룹간에 던컨 또는 Newman-Keuls 검출법의 방법으로 분석한다. 모든 데이터는 모두 평균값 ± 표준차 또는 표준 오차 또는 95%의 신뢰 구간을 적용한다. p 값의 차이가 0.05보다 작을 경우, 데이터가 통계학적인 의미를 가지는 것으로 인정한다.

실시예 5: 상이한 타입의 지코노타이드 융합 펩티드의 부작용 실험

상이한 타입의 개선형 지코노타이드가 체내에서의 부작용을 더욱 연구하기 위해, 하기와 같은 실험을 진행한다.

1. 실험 방법

진전 시간은 지코노타이드의 한 부류의 전형적인 부작용으로 인정된다. 진전 시간은 일정한 시간 내에 마우스의 사지, 두부 및 몸체가 절주성 있는 진동의 총 시간을 기록하는 것이다. 마우스 랜덤 배정: MVIIA(0.9 nmol/kg) 그룹, MVIIA-a,b,c,d(0.9 nmol/kg) 그룹 및 정상 대조군(6 μL,측뇌실 투여; n=12, 자웅 각각 반반). 약물 투여한 지 30분 및 120분 후 디지털 카메라로 5분내 마우스의 동적 비디오를 녹취하고, 실험에 대해 알지 못하는 한 사람이 5 마리 각각의 마우스가 5분 내에 누적된 진전 시간을 통계하도록 한다.

독성물리학 실험은 단일 요소 분산 분석(one-way ANOVA) 및 Newman-Keuls 검출법의 방법으로 분석한다. 모든 데이터는 모두 평균값 ± 표준차 또는 표준 오차 또는 95%의 신뢰 구간을 적용한다. p 값의 차이가 0.05보다 작을 경우, 데이터가 통계학적인 의미를 가지는 것으로 인정한다.

2.1 부작용 비교

도 7에 도시된 바와 같이, 투여 30분일 때, MVIIA는 더욱 선명한 진전 증상과 더욱 긴 진전 시간을 초래하며; 투여 120분일 때, 각 그룹 폴리펩티드는 MVIIA와 비교하면, 초래된 진전 증상과 더욱 긴 진전 시간에 뚜렷한 차이가 없다. 상기 결과로부터 볼 수 있는 바, MVIIA와 MVIIA-a,b,c,d폴리펩티드는 부작용 면에서 뚜렷한 차이를 보이지 않으며, 심지어, 투여 시작 단계에서, MVIIA-a,b,c,d의 부작용은 MVIIA보다 낮으며, 보다시피, 본원 발명의 MVIIA-a,b,c,d 폴리펩티드의 독성 부작용은 비교적 미약하다.

실시예 6: MVII-A뇌실 투여와 MVIIA-a,b,c,d 비강 드립 진통 실험 비교

1.1 핫 플레이트 통증 실험 방법

핫 플레이트 통증 실험 방법은 전술한 바와 같다. 마우스는 본 실험에서, 모두 9 그룹이고, 각 그룹은 10 마리의 마우스이며, 뇌실 내에 MVIIA(1.00 nmol/kg, 5 ul/10g)를 투여하여 양성 대조군(실험에서 MVIIA 비강 내 투여가 무효함을 발견)으로 하며, 비강에 각각 생리 식염수(saline, 2 ul/10g), MVIIA-C(3.3, 6.6 or 9.9 nmol/kg, 2ul/10g)를 투입한다. 생리 식염수 그룹은 블랭크 대조군이다. 뇌실 내 MVIIA 투여, 비강 MVIIA-c 및 Saline 투여 후의 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 h일 때의 지연 시간을 기록한다. 지연 기준 시간에 비해, 지연 시간이 5s 보다 짧거나 또는 20s보다 긴 마우스는 모두 민감하지 않은 마우스 및 지나치게 민감한 마우스로 인정되어, 추후에 제거된다.

진통 효과는 백분율로 최대 가능한 영향(%MPE)을 표시하고, 나중에 하기의 방정식으로 산출한다. %MPE=(T₁ - T₀) × 100/(T₂ - T₀)

여기서, T₀ 및 T₁은 각각 투여 전후의 지연 시간을 표시하고, T₂는 회당 테스트한 한계 시간이다.

1.2 실험 결과

MVIIA 및 상이한 약제량의 MVIIA-c를 비강 투여한 후의 진통 능력은 도 13에 도시된 바와 같다. 도 13은 MVIIA뇌실 및 MVIIA-c 비강 투여 시 핫 플레이트 통증 실험에서의 진통 효과를 나타낸다. MVIIA(1.00 nmol/kg)를 뇌실 투여한 후, 약효는 4시간 지속된다. MVIIA-C(3.3, 6.6, 9.9 nmol/kg)를 비강 투여한 후 신속하게 효과가 나타나고, 높은 약제량의 MVIIA-C의 약효 지속 시간은 길며, 8시간일 때에도 여전히 생리 식염수 그룹과 현저한 차이를 보이며, 투여 10시간 후 약효가 소실된다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001은 생리 식염수 그룹과 비교한 것을 표시한다.

1.3 MVIIA-a,b,d 비강 드립 진통 실험

도 14에 도시된 바와 같이, MVIIA-a,b,d 비강 투여 시 핫 플레이트 통증 실험에서의 진통 효과이다. MVIIA-C와 유사하게, MVIIA-a,b,d(9.9 nmol/kg) 비강 투여 후 신속하게 효과가 나타나고, MVII-b는 8시간일 때에도 여전히 생리 식염수 그룹과 현저한 차이를 보이며, 투여 10시간 후 약효가 소실된다. *p<0.05, ***p<0.001은 생리 식염수 그룹과 비교한 것을 표시한다.

상기 내용에서는 이미 일반적인 설명 및 구체적인 실시형태로 본 발명을 상세하게 서술하였으나, 본 발명의 기초상에서, 이에 대해 보정 또는 개선을 진행할 수 있음은 해당 기술분야의 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 기초상에서 진행된 이러한 보정 또는 개선은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.

<110> SHENZHEN RUIJIAN BIOSCIENCE TECHNOLOGY LIMITED COMPANY <120> POLYPEPTIDE CAPABLE OF PASSING THROUGH BLOOD-BRAIN BARRIER <130> P-2024 <150> PCT/CN 2018/124253 <151> 2018-12-27 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ziconotide <400> 1 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion polypeptide of ziconotide and TAT peptide <400> 3 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys Gly Gly Tyr Gly Arg Lys Lys 20 25 30 Arg Arg Gln Arg Arg Arg 35 <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion polypeptide of ziconotide and TAT peptide <400> 4 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg 20 25 30 Gln Arg Arg Arg 35 <210> 5 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion polypeptide of ziconotide and TAT peptide <400> 5 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 20 25 30 Arg Gln Arg Arg Arg 35 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion polypeptide of ziconotide and TAT peptide <400> 6 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys Gly Gly Gly Tyr Gly Arg Lys 20 25 30 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 35

Claims

지코노타이드(ziconotide)를 포함하고, 혈액뇌장벽을 통과 가능한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드(polypeptide).
제1항에 있어서,
상기 지코노타이드의 C말단은 코넥손을 통해 세포막 투과성 펩티드의 N말단과 연결되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제2항에 있어서,
상기 코넥손은 1개의 글리신(glycine)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지코노타이드의 아미노산은 SEQ ID NO.1로 표시되거나, 또는 상기 지코노타이드는 SEQ ID NO.1로 표시된 아미노산이 10개보다 적은 결실, 돌연변이 또는 삽입을 가지는 아미노산의 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포막 투과성 펩티드는 페네트라틴(Penetratin), TAT 펩티드, Pep-1펩티드, S4₁₃-PV, 메가이닌 2(Magainin 2) 또는 부포린 2(Buforin 2)로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 TAT 펩티드의 아미노산은 SEQ ID NO.2로 표시되거나, 또는 상기 TAT 펩티드는 SEQ ID NO.2로 표시된 아미노산이 10개보다 적은 결실, 돌연변이 또는 삽입을 가지는 아미노산의 변이체, 또는 그 펩티도미메틱(Peptido Mimetic)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되거나, 또는 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO.5로 표시된 아미노산이 10개보다 적은 결실, 돌연변이 또는 삽입을 가지는 아미노산의 변이체, 또는 그 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 약학 조성물은 정맥, 복강 또는 비강에 투여하기 위한 것이고, 약학 조성물 제형은 정맥, 복강 또는 비강 투여 제형인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 제제에 있어서,
바람직하게는, 제제는 정맥, 복강 또는 비강 투여 제제인 것을 특징으로 하는 제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서,
상기 폴리펩티드는 합성의 방식으로 제조된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.