KR20210011941A - 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및/또는 배위자를 포함하는 복합체 - Google Patents

항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및/또는 배위자를 포함하는 복합체 Download PDF

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미치노리 아카이와
히로요시 야마다
노부유키 시라이시
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및/또는 배위자를 포함하는 복합체, 상기 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물, 그리고 당해 복합체를 사용하여 암을 진단 및/또는 치료하는 방법 등의 제공. 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 펩티드 링커 등을 통하여 배위자와 결합시킨 복합체를 사용한다.

Description

항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및/또는 배위자를 포함하는 복합체
본 발명은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및/또는 배위자를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물, 그리고 당해 복합체를 사용하여 암을 진단 및/또는 치료하는 방법 등에 관한 것이다.
뮤신 1(Mucin 1: MUC1)은 유선, 기관 및 소화관 등의 상피 조직을 구성하는 상피 세포의 내강측에 발현하는 막 결합형 당단백질이다(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1): 45-60.). MUC1은 유방암(Mod. Pathol., 2005 Oct; 18(10): 1295-304.), 폐암(Hum. Pathol., 2008 Jan; 39(1): 126-36.), 대장암(Int. J. Oncol., 2000 Jan; 16(1): 55-64.), 방광암(PLoS One, 2014 Mar; 9(3): e92742.), 피부암(Histopathology, 2000 Sep; 37(3): 218-23.), 갑상선암(J. Pathol., 2003 Jul; 200(3): 357-69.), 위암(J. Pathol., 2000 Mar; 190(4): 437-43.), 췌장암(Int. J. Oncol., 2004 Jan; 24(1): 107-13.), 신장암(Mod. Pathol., 2004 Feb; 17(2): 180-8.), 난소암(Gynecol. Oncol., 2007 Jun; 105(3): 695-702.) 및 자궁경부암(Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul; 122(1): 61-9.) 등의 암 세포에서 과잉으로 발현하고 있으며, MUC1은 암 병소를 검출하기 위한 표적 분자로서 유용하다(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1): 45-60., Pathol. Res. Pract., 2010 Aug 15; 206(8): 585-9.).
MUC1은 세포 외 도메인에 존재하는 20 아미노산의 탠덤 리피트 서열인 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(서열 번호 15)의 9번째의 트레오닌이 O-글리코실화된다. 암 세포에서는 이 O-글리코실화가 불완전하고, T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr), Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr) 및 2,3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr) 등의 O-글리코실화가 암 특이적으로 일어나는 것이 알려져 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). 정상 조직의 MUC1은, 이들 암 특이적인 O-글리코실화는 받지 않기 때문에, 인간 암 특이적 MUC1은 인간에서의 각종 암을 치료하기 위한 표적 분자로서 특히 유용하다. 이러한 항인간 암 특이적 MUC1 항체로서, 예를 들어 1B2 항체(특허문헌 1), PankoMab 항체(비특허문헌 2), 5E5 항체(특허문헌 2) 등이 알려져 있다. 이 항체 중, 1B2 항체는 PankoMab 항체에 비교하여 인간 암 특이적 MUC1에 대한 특이성이 높은 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).
또한, 암 병소의 가시화나 조기 발견에는 큰 니즈가 있다. 또한, 암 병소와 양성 병변의 감별에도 니즈가 있다. 이러한 요구로부터, 인간 암 특이적 MUC1에 특이적으로 결합하는 항체를 체내 진단약으로서 사용하여, γ선 이미징(PET, SPECT) 등의 분자 이미징 기법에 의해 암 병소를 가시화하는 것은 유용하며, 또한 항체와 암 치료약을 결합시킨 항체 의약도 주목받고 있다.
한편, 항체는 일반적으로 혈중 반감기가 길어, 체내에 투여 후, 암을 가시화하기에 충분한 시그널 대 백그라운드비를 부여하는 종양 대 혈액비에 달하는 데 4 내지 5일의 긴 기간을 필요로 한다(Clin. Pharmacol. Ther., 2010 May; 87(5): 586-92.). 또한, 항체의 Fc 영역은, 항체 의존성 세포 장애(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity: ADCC)나 보체 의존성 세포 장애(Complement-Dependent Cytotoxicity: CDC)의 약리 작용을 야기한다(비특허문헌 1, Curr. Opin. Biotechnol., 2002 Dec; 13(6): 609-14.). 또한, 항체는 표적에 관계없이 간장에 고집적되지만, 유방암 등의 암 세포는 간장으로 전이하는 경우가 많아, 원격 전이에 의한 전신의 암 병소를 진단할 때에 간 전이 검출의 방해가 되어 버린다(Clin. Pharmacol. Ther., 2010 May; 87(5): 586-92.).
이에 비해, Fab, scFv, 다이아보디, 미니보디와 같은 저분자화된 항체 프래그먼트는, 조직 침투성이 높기 때문에 병소에 도달하기 쉽고, 대장균이나 효모에서의 발현계를 사용한 저비용으로의 제조를 기대할 수 있다는 점에서 치료용 항체로서 이용된다. 또한, 일반적으로 Fab 등의 항체 프래그먼트는, 혈중 반감기가 짧고, 신장 배설되는 특성을 갖는다는 점에서, 진단약으로서의 이용에도 적합하다(Nat. Biotechnol., 2005 Sep; 23(9): 1126-36.).
WO2010/050528 WO2008/040362
Glycoconj. J., 2013 Apr; 30(3): 227-36. Cancer Immunol Immunother, 2006 Nov; 55(11): 1337-47.
1가의 Fab 프래그먼트는 분자량 약 50kDa이며, 약 150kDa의 항체보다 작고, 신장 배설되며, 혈중 반감기도 짧다. 그 때문에, 투여 후 2 내지 32시간 이내에 암을 가시화하기에 충분한 시그널 대 백그라운드비를 부여하는 종양 대 혈액비에 달한다. Fc 영역이 없기 때문에 ADCC나 CDC를 야기하는 일도 없다. Fab 프래그먼트는 주로 신장 배설이기 때문에, 간 전이 검출의 방해가 되는 일도 없다. 이러한 특징으로부터, 항체와 비교하여, Fab 프래그먼트는 체내 진단약으로서 보다 유효한 것을 기대할 수 있다.
그러나 Fab 프래그먼트에서는, 2가로부터 1가가 되기 때문에, 그의 결합 활성이 감약되는 경우가 많다. 또한 항체를 체내 진단약이나 광면역 요법에서 사용하는 약제로서 이용하기 위해서는, 형광 색소 또는 조영제 등의 검출 가능한 물질로 표지해야 하지만, 그러한 물질로 표지됨으로써, 그의 결합 활성이 감약된다는 과제가 있다.
본 발명의 과제는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 동등한 인간 암 특이적 MUC1에 대한 우수한 결합 활성을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 배위자를 포함하는 복합체를 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 다른 과제는, 상기 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및 그것을 이용한 진단 방법을 제공하는 것, 그리고 상기 복합체를 포함하는 의약 조성물 및 그것을 이용한 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 인간 암 특이적 MUC1에 대한 양호한 친화성을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 제작하고, 더 예의 검토를 거듭한 결과, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 배위자를, 펩티드 링커를 통하여(혹은 통하지 않고) 결합시킨 복합체를 제작하였다. 당해 복합체는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 자체와 동등한 인간 암 특이적 MUC1에 대한 친화성을 갖는다. 즉, 본 발명은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 특정 배위자를 포함하는 복합체를 제공한다. 또한, 당해 복합체가, 표지부의 결합에 의해서도 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성이 감약되지 않고, 양호한 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 유지하고 있는 것을 확인하고, 이들 결과에 기초하여 본 발명의 복합체를 사용한 진단 수단 및 치료 수단을 제공하는 것이다.
즉, 일 양태에 있어서, 본 발명은 이하와 같아도 된다.
[1] 하기 식 (I):
(Y-S1-X)p-Fab (I)
[식 중, Fab는, 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 및
(b) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이고;
X는 펩티드 링커 또는 결합이고;
S1은 스페이서 또는 결합이고;
Y는 배위자이고; 그리고,
p는 1 내지 25의 자연수이며;
단, X가 결합일 때에는, S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이고, Y는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)이다]
로 표시되는 복합체.
[2] Fab가, 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트;
로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [1]에 기재된 복합체.
[3] Fab가, 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트;
로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [1]에 기재된 복합체.
[4] Fab가, 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트;
로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [2]에 기재된 복합체.
[5] Fab가, 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인, 상기 [4]에 기재된 복합체.
[6] Fab가, 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인, 상기 [4]에 기재된 복합체.
[7] X가 신장 쇄자연막(renal brush boarder membrane) 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 포함하는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[8] S1이 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)- 또는 결합이고,
X가, 이하의 (1) 내지 (9):
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys-Z2-,
(5) -Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys-Z2-,
(8) -Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 및
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-
[식 중, Met는 메티오닌을, Ile는 이소류신을, Gly는 글리신을, Lys는 리신을, Phe는 페닐알라닌을, Val은 발린을, Tyr은 티로신을, Arg는 아르기닌을, Z1은 하기 식 (II)로 표시되는 기를, -Lys-Z2-는 하기 식 (III)으로 표시되는 기를, -Tyr-CH2-는 하기 식 (IV)로 표시되는 기를, -Lys-C(=S)-는 하기 식 (V)로 표시되는 기를 각각 나타낸다]
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [7]에 기재된 복합체.
Figure pct00001
[9] Y가 데페록사민(DFO) 또는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[10] Y가 DFO인, 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[11] Y가 DOTA인, 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[12] Y가 DOTA이고,
S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이고,
X가 결합인,
상기 [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[13] (Y-S1-X)p-Fab가
Figure pct00002
로 이루어지는 군에서 선택되고, Fab에 포함되는 아미노기의 질소 원자가 X 말단의 C(=NH)기의 탄소 원자와 결합되어 있는, 상기 [10]에 기재된 복합체.
[14] (Y-S1-X)p-Fab가
Figure pct00003
로 이루어지는 군에서 선택되고, Fab에 포함되는 아미노기의 질소 원자가 X 말단의 C(=NH)기의 탄소 원자와 결합되어 있는, 상기 [11]에 기재된 복합체.
[15] (Y-S1-X)p-Fab가
Figure pct00004
로 이루어지는 군에서 선택되고, Fab에 포함되는 아미노기의 질소 원자가 말단의 C(=O)기 또는 C(=S)기의 탄소 원자와 결합되어 있는, 상기 [12]에 기재된 복합체.
[16] p가 1 내지 4의 자연수인, 상기 [13] 내지 [15]에 기재된 복합체.
[17] 금속을 더 포함하는, 상기 [1] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[18] 금속이 금속 방사성 동위 원소인, 상기 [17]에 기재된 복합체.
[19] 금속이 89Zr인, 상기 [18]에 기재된 복합체.
[20] PET 트레이서인, 상기 [18] 또는 [19] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[21] 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 진단용 조성물.
[22] 조기 진단약, 병기 진단약 또는 수술 중 진단약인, 상기 [21]에 기재된 진단용 조성물.
[23] 인간 MUC1을 발현하는 암의 진단에 사용하는, 상기 [21] 또는 [22]에 기재된 진단용 조성물.
[24] 암이 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암인, 상기 [23]에 기재된 진단용 조성물.
[25] 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
[26] 인간 MUC1을 발현하는 암을 치료하기 위한 의약 조성물인, 상기 [25]에 기재된 의약 조성물.
[27] 암이 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암인, 상기 [26]에 기재된 의약 조성물.
[28] 암의 진단용 조성물, 및/또는 암을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 복합체의 사용.
[29] 암의 진단 및/또는 암의 치료에 있어서 사용하기 위한, 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[30] 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 복합체의 진단 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 진단 방법.
[31] 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 복합체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법.
[32] 암의 진단 및/또는 암의 치료를 위한 상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 복합체의 사용.
본 발명의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 특정 배위자를 포함하는 복합체는, 인간 암 특이적 MUC1에 대한 우수한 결합 활성을 갖는다. 그 때문에, 추가로 금속을 포함하는 본 발명의 복합체는 암의 진단 및/또는 치료에 유용할 것으로 기대된다.
도 1은, P10-1 Fab, P10-2 Fab 및 비교예인 1B2 Fab의 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 나타내는 그래프 및 표이다.
이하에, 본 발명에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명에 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 한다.
1. 본 발명의 복합체
본 발명의 복합체는, 하기 식 (I):
(Y-S1-X)p-Fab (I)
[식 중,
Fab는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이고,
X는 펩티드 링커 또는 결합이고,
S1은 스페이서 또는 결합이고,
Y는 배위자이고, 그리고
p는 1 내지 25의 자연수이며,
단, X가 결합일 때에는, S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이고, Y는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)이다]
로 표시되는 복합체이다.
1-1. 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab)
상기 식 (I)에 있어서 「Fab」로 표시되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대하여 설명한다.
항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로 분자량 5만 내지 7만의 중쇄와 2만 내지 3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는 통상적으로 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 γ, μ, α, δ, ε쇄라고 불린다. 또한 IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 존재하고, 각각 γ1, γ2, γ3, γ4라고 불리고 있다. 경쇄는 통상적으로 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지며, L형과 K형의 2종이 알려져 있고, 각각 λ, κ쇄라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만 내지 19만이다. 2종의 경쇄는 어느 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개로 이루어질 수 있다.
쇄 내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100 내지 110 잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프간에서 유사하고, 구조 단위 혹은 도메인이라 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이라도, 그의 아미노산 서열이 일정하지 않고, 가변 영역이라 불리며, 각 도메인은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라 불리고 있다. 이로부터 C 말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 혹은 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은 각각 CH1, CH2, CH3 혹은 CL로 표시된다.
항체와 항원의 결합의 특이성은, VH 및 VL에 의해 구성되는 부분의 아미노산 서열에 의한다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정되는 것을 알았으며, 이들 영역을 상호 보완성 결정 영역(CDR; 각각 N 말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라 부르고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불리며, 비교적 일정하다.
항체의 중쇄 정상 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 있는 영역은 힌지 영역이라고 불리며, 이 영역은 프롤린 잔기를 많이 포함하고, 2개의 중쇄를 연결하는 복수의 쇄간 S-S 결합을 포함한다. 예를 들어, 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 힌지 영역에는, 중쇄간의 S-S 결합을 구성하고 있는, 각각 2개, 4개, 11개, 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 힌지 영역은, 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해 효소에 대한 감수성이 높은 영역이다. 항체를 파파인으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄간 S-S 결합보다도 N 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, 2개의 Fab 프래그먼트와 1개의 Fc 프래그먼트로 분해된다. Fab 프래그먼트는, 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성된다. Fab 프래그먼트는 가변 영역을 포함하며, 항원 결합 활성을 갖는다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 특징을 갖는 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4 등의 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역은, 인간 Igγ1 정상 영역이다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ의 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역은, 인간 Igκ 정상 영역이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다.
Fab 프래그먼트를 포함시켜, 항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C 말단의 리신의 카르복시펩티다아제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 당화 등을 들 수 있고, 다양한 항체에 있어서 이러한 번역 후 수식이 발생하는 것이 알려져 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008 Jul; 97(7): 2426-2447.).
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에는, 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab 프래그먼트도 포함될 수 있다. 번역 후 수식에 의해 발생할 수 있는 본 발명의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 N 말단의 피로글루타밀화한 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 들 수 있다. 이러한 N 말단의 피로글루타밀화에 의한 번역 후 수식은, 항체의 활성에 영향을 미치지 않는 것은 당해 분야에서 알려져 있다(Anal. Biochem. 2006 Jan 1; 348(1): 24-39.).
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 하기의 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 하기의 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 하기의 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 하기의 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 인간 암 특이적 MUC1에 결합한다. 암 특이적 MUC1은 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암 등의 암에 있어서 발현하고 있다. 얻어진 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, ELISA나 FACS 등의 방법이 있다. 예를 들어, ELISA를 사용하는 경우, 인간 암 특이적 MUC1 양성 세포(예를 들어, T-47D 세포)를 ELISA 플레이트에 고정화하고, 이에 대하여 Fab 프래그먼트를 첨가하여 반응시킨 후, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 등으로 표지한 항Igκ 항체 등을 반응시킨 후, 그의 활성을 검출하는 시약(예를 들어, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 표지의 경우, 화학 발광 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 기질) 등을 사용한 활성 측정에 의해, 2차 항체의 결합을 동정한다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 본 명세서에 개시되는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 후술하는 <본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산 방법>에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
1-2. 배위자(Y)
상기 식 (I)에 있어서 「Y」로 표시되는 배위자에 대하여 설명한다.
「배위자」란, 본 발명의 복합체에 있어서 금속과 킬레이트 착체를 형성할 수 있는 부분이며, 킬레이트제로 구성되는 기를 의미한다. 구성되는 기란, 킬레이트제로부터 프로톤이 제거되어, 결합손을 갖는 기이다. 당해 킬레이트제로 구성되는 기는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 직접, 혹은 스페이서 및/또는 펩티드 링커를 통하여 결합하는 것이다.
「킬레이트제」란, 금속과 배위 결합할 수 있는 화합물을 말한다. 본 명세서에 있어서의 「킬레이트제」로서는, 시데로포어와 비시데로포어를 들 수 있다. 시데로포어로서는 히드록삼산형, 카테콜형 또는 혼합 배위자형을 들 수 있다. 히드록삼산형 시데로포어로서는, 예를 들어 페리크롬, 하기 식:
Figure pct00005
로 표시되는 데페록사민(DFO), 프사리닌 C, 오르니박틴, 로도토루르산을 들 수 있다. 카테콜형 시데로포어로서는, 예를 들어 엔테로박틴, 바실리박틴, 비브리오박틴을 들 수 있다. 혼합 배위자형 시데로포어로서는, 예를 들어 아조토박틴, 피요베르딘, 에르시니아박틴을 들 수 있다. 또한, 상기 시데로포어의 경우, DFO는 그의 반응성 관능기인 -NH2를 통하여 스페이서 또는 펩티드 링커와 반응시킬 수 있고, DFO 이외의 시데로포어의 경우에는, 카르복실기, 수산기, 아미노기 등의 반응성 관능기를 통하여, 당업자가 통상 사용하는 방법으로 스페이서 또는 펩티드 링커와 반응시킬 수도 있다.
비시데로포어로서는, 예를 들어 하기 식:
Figure pct00006
로 표시되는 DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산, CAS 번호: 60239-18-1), DTPA(디에틸렌트리아민오아세트산, CAS 번호: 67-43-6), DTPA-BMA(1,7-비스(메틸카르바모일메틸)-1,4,7-트리아자헵탄-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 119895-95-3), EOB-DTPA(N-[(2S)-2-[비스(카르복시메틸)아미노]-3-(4-에톡시페닐)프로필]-N-[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]글리신, CAS 번호: 158599-72-5), TTHA(트리에틸렌테트라민육아세트산, CAS 번호: 869-52-3), DO3A(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 217973-03-0), HP-DO3A(10-(2-히드록시프로필)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 120041-08-9), 및 이들의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 배위자를 형성하는 「킬레이트제」의 어떤 양태로서는 DFO, DOTA, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A, HP-DO3A를 들 수 있다. 어떤 양태로서는 DFO, DOTA를 들 수 있다.
또한, 본 명세서 중의 화합물 및 복합체는, 특별히 기재되지 않는 한 프리체 및 그의 염도 포함한다. 여기서 「그의 염」이란, 그 화합물 및 복합체의 치환기의 종류에 따라서, 산부가염 또는 염기와의 염을 형성하는 경우가 있고, 그 화합물 및 복합체가 형성할 수 있는 염이다. 구체적으로는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산이나, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 만델산, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 디톨루오일타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 아스파라긴산, 글루탐산 등의 유기산과의 산부가염, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등의 무기 염기, 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 리신, 오르니틴 등의 유기 염기와의 염, 아세틸류신 등의 각종 아미노산 및 아미노산 유도체와의 염이나 암모늄염 등을 들 수 있다. 예를 들어, DFO는 데페록사민메탄술폰산염으로서도 존재하고, 다른 염으로서도 존재한다. DTPA는 프리체와 함께 나트륨염으로서도 존재한다.
금속을 포함하는 본 발명의 복합체는, 각종 조영제 및/또는 암의 치료제에 사용할 수 있으며, 예를 들어 MRI 조영제, PET 트레이서에 사용되는 약제 등에 사용된다.
MRI 조영제에 사용하는 경우의 「킬레이트제」의 어떤 양태로서는 상기 시데로포어 및 비시데로포어 킬레이트제이다.
PET 트레이서에 사용하는 경우의 「킬레이트제」의 어떤 양태로서는 상기 시데로포어 및 비시데로포어 킬레이트제이고, 어떤 양태로서는 DFO 또는 DOTA이다.
본 발명의 복합체에 있어서, 킬레이트제는 금속을 포함하고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서, 「금속」은 상자성 금속 이온 또는 금속 방사성 동위 원소를 의미한다. 금속으로서는 각 킬레이트제에 배위 결합하는 금속이면 특별히 제한은 없다. 복합체의 사용 목적에 따라, 적절한 킬레이트제와 금속의 조합이 선택된다.
상자성 금속 이온은 MRI 조영제에 적합하게 사용된다. 상자성 금속 이온의 양태로서는 Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Rh2+, Co2+, Gd3+, Eu3+, Dy3+, Tb3+, Pm3+, Nd3+, Tm3+, Ce3+, Y3+, Ho3+, Er3+, La3+, Yb3+, Mn3+ 또는 Mn2+를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 어떤 양태로서는 Gd3+, Mn3+, Mn2+, Fe2+ 또는 Fe3+를 들 수 있다. 어떤 양태로서는 Mn3+ 또는 Mn2+를 들 수 있다. 이 경우, 복합체에는 카운터 음이온으로서 할로겐 등을 사용할 수 있다. 또한, 카운터 음이온은 배위자의 C(=O)O-여도 되며, 또한 복합체는 Na+ 등의 카운터 양이온을 가져도 된다.
금속 방사성 동위 원소는 PET 트레이서 등에 사용된다. 금속 방사성 동위 원소의 어떤 양태로서는 89Zr, 51Mn, 52Fe, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 90Y, 99mTc, 111In 또는 177Lu를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. PET 트레이서에 사용되는 금속 방사성 동위 원소의 어떤 양태로서는 89Zr, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc 또는 111In을 들 수 있다. 어떤 양태로서는 지르코늄의 방사 동위체를 들 수 있다. 어떤 양태로서는 89Zr을 들 수 있다. 암의 치료에 사용되는 금속 방사성 동위 원소의 어떤 양태로서는 90Y 또는 177Lu를 들 수 있다.
본 발명의 복합체의 어떤 양태로서는 Y가 89Zr이 배위 결합되어 있는 DFO인 복합체이다. 다른 양태로서는 Y가 89Zr, 90Y, 67Ga, 68Ga 및 177Lu로 이루어지는 금속 방사성 동위 원소가 배위 결합되어 있는 DOTA인 복합체이다. 또한 다른 양태로서는 Y가 89Zr, Gd3+ 및 Y3+로 이루어지는 상자성 금속 이온이 배위 결합되어 있는 DOTA인 복합체이다. 또한 다른 양태로서는 Y가 Gd3+ 및 Y3+로 이루어지는 상자성 금속 이온이 배위 결합되어 있는 DOTA인 복합체이다.
1-3. 펩티드 링커 또는 결합(X)
본 발명의 복합체는 배위자(Y) 또는 스페이서(S1)와 Fab가 직접 결합되어 있어도 되지만, 펩티드 링커(X)를 통하여 결합되어 있어도 된다. 상기 식 (I)에 있어서 「X」로 표시되는 펩티드 링커에 대하여 설명한다.
본 명세서에 있어서 「펩티드 링커」란, 2 내지 4개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 포함하는 링커이며, 원한다면 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와의 결합에 적합한 스페이서 Z1 또는 Z2를 가져도 된다. 여기서, 펩티드 링커에 포함되는 펩티드로서는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 글리신(Gly), 리신(Lys), 메티오닌(Met), 이소류신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 티로신(Tyr), 아르기닌(Arg), 알라닌(Ala), 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 히스티딘(His) 및 류신(Leu)으로 이루어지는 군에서 각각 선택되는, 2 내지 4개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드, 보다 바람직하게는 글리신, 리신, 메티오닌, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 티로신 및 아르기닌으로 이루어지는 군에서 각각 선택되는 2 내지 4개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드이다. 또한, 특별히 언급하지 않는 한 글리신 이외의 아미노산 잔기의 입체는 L-체로 한다.
펩티드 링커의 어떤 양태로서는, 신장 쇄자연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는 2 내지 4개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 포함하고, 추가로 스페이서를 가져도 되는 펩티드 링커이다. 신장 쇄자연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커는, 신장에 존재하는 이들 효소에 의해 특이적으로 절단되기 때문에, 표지부의 신장으로의 집적이 저감되는 것이 보고되어 있다. 예를 들어, Adv Drug Deliv Rev. 2008 Sep; 60(12): 1319-28., Bioconjug Chem. 2005 Nov-Dec; 16(6): 1610-6. 및 Cancer Res. 1999 Jan 1; 59(1): 128-34.에는 글리신-리신 링커가 신장에 존재하는 신장 쇄자연막 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있다. 일본 특허 제6164556호 공보에는 글리신-페닐알라닌-리신 링커가 신장에서 신장 쇄자연막 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있고, 또한 Bioconjug Chem. 2002 Sep-Oct; 13(5): 985-95.에는 글리신-류신-글리신-리신 서열을 포함하는 링커가, 또한 Bioconjug Chem. 2013 Feb 20; 24(2): 291-9.에는 글리신-티로신 링커가, 신장 쇄자연막 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있다. 또한, Bioconjug Chem. 2014 Nov 19; 25(11): 2038-45.에는 메티오닌-이소류신 서열을 포함하는 링커가, 신장에 존재하는 리소좀 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있다. 펩티드 링커의 어떤 양태로서는 Met-Ile, Gly-Lys, Gly-Phe-Lys, Met-Val-Lys, Gly-Tyr, Gly-Lys-Lys 및 Gly-Arg-Lys로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커이다. 어떤 양태로서는 Gly-Lys 및 Met-Ile로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커이다.
「펩티드 링커」는, 임의로 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와의 결합에 적합한 스페이서를 가져도 되며, 여기서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와의 결합에 적합한 스페이서란, 펩티드 링커부와 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 아미노기의 질소 원자 또는 디술피드 결합 유래의 티올기 사이를 유기 화학적으로 결합시키는 기이며, 어떤 양태로서는 말단에 말레이미드 유래의 기(예를 들어, 하기 식 (II)로 표시되는 기) 또는 이소티오시아네이트 유래의 기(-NH-C(=S)-)를 포함하는 기이다. 어떤 양태로서는 -NH-(CH2)2-Z1-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 -NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-이며, 여기서 Z1은 하기 식 (II)로 표시된다.
스페이서는 펩티드 말단의 아미노산의 아미노기 또는 카르복실기와, 혹은 아미노산의 측쇄 중의 아미노기(예를 들어 리신)나 수산기(예를 들어 티로신)와 결합하여 펩티드 링커를 형성하고 있다. 펩티드 말단의 아미노산의 측쇄 중의 관능기에 스페이서가 결합하여 펩티드 링커를 형성한 예로서는, 예를 들어 Lys와 일체로 된 스페이서로서 하기 식 (III)으로 표시되는 기를 들 수 있으며, 본 명세서에 있어서는 이것을 -Lys-Z2-로 기재한다.
Figure pct00007
또한, 본 명세서 중에서는, 마찬가지로 말단 아미노산의 측쇄 중의 관능기와 스페이서가 결합한 구조를 갖는, 하기 식 (IV)로 표시되는 기를 -Tyr-CH2-, 하기 식 (V)로 표시되는 기를 -Lys-C(=S)-로 각각 기재한다.
Figure pct00008
스페이서를 포함하는 펩티드 링커의 어떤 양태로서는 (1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2) -Gly-Lys-Z2-, (3) -Gly-Phe-Lys-Z2-, (4) -Met-Val-Lys-Z2-, (5) -Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6) -Gly-Lys-Lys-Z2-, (7) -Gly-Arg-Lys-Z2-, (8) -Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 및 (9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-이며, 어떤 양태로서는 (1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1- 및 (2) -Gly-Lys-Z2-이다. 어떤 양태로서는 (8) -Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 및 (9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-이다.
1-4. 스페이서 또는 결합(S1)
본 발명의 복합체는 배위자(Y)와 펩티드 링커(X) 또는 Fab가 직접 결합되어 있어도 되지만, 스페이서를 통하여 결합되어 있어도 된다.
본 명세서에 있어서 S1에 기재된 「스페이서」는, 배위자와 펩티드 링커 또는 Fab 사이에 일정한 거리를 만들기 위해, 혹은 배위자와 펩티드 링커 또는 Fab의 결합을 위해 도입하는 기이며, 어떤 양태로서 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)- 등을 들 수 있다. 어떤 양태로서는 S1은 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -C(=O)-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)- 또는 결합이다. 어떤 양태로서는 S1은 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)- 또는 결합이다. 어떤 양태로서는 S1은 결합이다. 또한, 본 발명의 Y가 DOTA인 복합체는, DOTA와 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab)가 직접 결합 또는 스페이서(-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-)를 통하여 결합되어 있어도 된다. 단, DOTA와 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab)가 스페이서인 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-를 통하여 결합하는 경우에는, 하기 식 (VI)으로 표시되는 복합체이다.
Figure pct00009
본 발명의 복합체의 제조에 있어서, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 배위자, 스페이서 및/또는 펩티드 링커의 결합, 및 배위자와 스페이서 및/또는 펩티드 링커의 결합은, 공지된 방법에 의해 당업자가 적절하게 행할 수 있다.
본 명세서에서 「표지부」란, (i) 배위자 및 펩티드 링커(Y-S1-X: 단, S1이 결합이고, X가 펩티드 링커이다.), (ii) 배위자(Y-S1-X: 단, S1 및 X가 각각 결합이다.), 또는 (iii) 배위자, 스페이서 및 펩티드 링커(Y-S1-X: 단, S1이 스페이서이고, X가 펩티드 링커이다.)이다. 어떤 양태로서는 (i) 배위자 및 펩티드 링커, 또는 (ii) 배위자를 들 수 있다. 「표지부」의 배위자는 추가로 금속을 포함하고 있어도 되며, 어떤 양태로서는 금속을 포함하는 (i) 배위자 및 펩티드 링커 또는 (ii) 배위자이며, 바꾸어 말하면 (i) 금속과 킬레이트 착체를 형성한 배위자 및 펩티드 링커, 또는 (ii) 금속과 킬레이트 착체를 형성한 배위자이다.
1-5. 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab)에 대한 표지부(Y-S1-X)의 결합수(p)
본 발명의 복합체는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab) 중의 1 이상의 아미노기의 질소 원자 또는 디술피드 결합 유래의 티올기를 통하여 1 이상의 표지부(Y-S1-X)가 결합한 복합체이다. 본 발명의 복합체는 결합하는 표지부의 수가 서로 다른 복합체의 혼합물이어도 되고, 식 (I)에 있어서, Fab는 1 내지 25의 표지부(Y-S1-X)가 결합한 Fab 중 어느 것 또는 그들의 혼합물인 것을 나타낸다. 어떤 양태로서는 본 발명의 복합체는 1개의 Fab에 대하여 1 내지 25의 표지부(Y-S1-X)를포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 23의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 15의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 7의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 5의 표지부(Y-S1-X)를 포함하며, 또한 어떤 양태로서는 1 내지 4의 표지부(Y-S1-X)를 포함한다. 즉, 1개의 Fab에 대한 표지부(Y-S1-X)의 결합수를 나타내는 「p」는, 어떤 양태로서는 1 내지 25의 자연수이고, 어떤 양태로서는 1 내지 23의 자연수이고, 어떤 양태로서는 1 내지 15의 자연수이고, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 자연수이고, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 자연수이고, 어떤 양태로서는 1 내지 7의 자연수이고, 어떤 양태로서는 1 내지 5의 자연수이며, 또한 어떤 양태로서는 1 내지 4의 자연수이다.
2. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 어떤 양태에서는, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
어떤 양태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 7에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 염기 서열에 기초하여, 당해 기술 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 제90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다.
3. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터에는, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
바람직한 발현 벡터로서는, 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 들 수 있다.
이들 발현 벡터는, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 각종 숙주 세포 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 코딩되는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 발현 벡터로서는, 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 사용할 수 있다.
또한, 이들 발현 벡터는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 중쇄 프래그먼트 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 숙주 세포 중에서 Fab 프래그먼트를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 숙주 세포가 에세리키아속균인 경우, 예를 들어 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 중에서의 발현용 프로모터로서는, 예를 들어 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있고, 바실루스속균에서의 발현용 프로모터로서는, SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 포유 동물 세포 등의 진핵 세포인 경우, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다.
이들 발현 벡터는, 숙주 세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 더 포함할 수 있다. 한편, 숙주로서 효모, 동물 세포 또는 곤충 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터는 개시 코돈, 종지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 중쇄 프래그먼트 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 목적에 따라서 통상 사용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
4. 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포
발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포에는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주 세포가 포함된다:
(a) 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어, Fab 프래그먼트를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 다양한 세포(예를 들어, 세균(에세리키아속균, 바실루스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물 세포 또는 곤충 세포(예를 들어, Sf9) 등), 포유 동물 세포주(예를 들어, CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포 등의 배양 세포)가 예시된다. 형질 전환 자체는, 예를 들어 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다.
5. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산 방법
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산은, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서 배양하는 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된다:
(a) 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
어떤 양태로서는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서 배양하는 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된다:
(a) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
바람직하게는, 사용되는 형질 전환된 숙주 세포는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 혹은 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서, 형질 전환된 숙주 세포는 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 혹은 유기 질소원을 포함하는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 혹은 유기 질소원으로서는, 예를 들어 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 카제인, 고기 엑기스, 콩깻묵, 바레이쇼 추출액 등이 예시된다. 또한 원하는 경우에 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)을 포함하고 있어도 된다.
형질 전환된 숙주 세포의 배양 자체는 공지된 방법에 의해 행해진다. 배양 조건, 예를 들어 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은 적절히 선택된다. 예를 들어, 숙주가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 약 5 내지 20％의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science; 1952; 122: 501.), DMEM 배지(Virology; 1959; 8: 396-97.), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-24.), 199 배지(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73: 1-8.) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하고, 배양은 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 336시간 행해지고, 필요에 따라서 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 예를 들어 태아 소 혈청을 포함하는 Grace's 배지(PNAS; 1985; 82: 8404-8.) 등을 들 수 있고, 그의 pH는 약 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 40℃에서 15 내지 100시간 행해지고, 필요에 따라서 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들어 상기 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 바람직하게는 pH가 5 내지 8인 배지이다. 숙주가 E.coli인 경우, 바람직한 배지로서 LB 배지, M9 배지(Miller 등, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431.) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은 필요에 따라서 통기, 교반하면서, 통상 14 내지 43℃, 약 3 내지 24시간 행할 수 있다. 숙주가 바실루스속균인 경우, 필요에 따라서 통기, 교반을 하면서, 통상 30 내지 40℃, 약 16 내지 96시간 행할 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들어 Burkholder 최소 배지(PNAS; 1980; 77: 4505-8.)를 들 수 있고, pH는 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 35℃에서 약 14 내지 144시간 행해지고, 필요에 따라서 통기나 교반을 행할 수도 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정에 더하여, 발현시킨 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 회수, 바람직하게는 단리, 정제하는 공정을 포함시켜도 된다. 단리, 정제 방법으로서는, 예를 들어 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
6. 본 발명의 복합체를 생산하는 방법
본 발명의 복합체를 생산하는 방법에는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 표지부(Y-S1-X)와 공유 결합시키는 공정을 포함시킬 수 있다. 상기 표지부(Y-S1-X)에 있어서의 각 구성 요소간의 결합은, 공지된 방법에 의해 당업자가 적절하게 행할 수 있다. 반응예로서는, 배위자(Y)를 직접 또는 스페이서(S1)를 통하여 펩티드 링커(X)에 결합시킨 후에, 상기 펩티드 링커와 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 결합시킬 수 있다. 또한, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 펩티드 링커(X)에 결합시킨 후에, 상기 펩티드 링커와 배위자(Y)를 직접 또는 스페이서(S1)를 통하여 결합시킬 수도 있다. 또한, 배위자, 예를 들어 DOTA와 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 직접 공지된 방법에 의해 결합시킬 수도 있다. 또한, 원료로서 미리 배위자와 스페이서(S1)가 결합된 화합물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 복합체를 생산하는 방법은 또한, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트와 표지부(Y-S1-X)를 공유 결합시키는 공정을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 복합체를 생산하는 방법은 또한, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 발현시킨 당해 Fab 프래그먼트를 회수하는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트와 표지부(Y-S1-X)를 공유 결합시키는 공정을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 복합체를 생산하는 방법은 또한, 금속을 첨가하는 공정을 포함해도 된다. 사용되는 킬레이트제, 펩티드 링커, 스페이서, 표지부의 수, 금속 등은 본 명세서에 기재된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 복합체를 생산하는 방법은, 상기에서 특정하는 2 이상의 공정을 일련의 공정으로서 포함하는 방법으로서 실시할 수도 있고, 상기에서 특정하는 적어도 하나의 공정을 포함하는 방법으로서 실시할 수도 있다. 예를 들어, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 표지부(Y-S1-X)와 결합시키는 공정을 포함하는 방법, 및 표지부(Y-S1-X)를 결합시킨 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 금속을 배위시키는 공정을 포함하는 방법도 또한, 본 발명의 복합체를 생산하는 방법에 포함된다. 또한, 본 발명의 복합체를 생산하는 방법에는, 공정의 순번이 다른 방법도 포함된다. 예를 들어, 배위자에 금속을 배위시킨 표지부(Y-S1-X)에 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 공유 결합시키는 방법도, 본 발명의 복합체를 생산하는 방법에 포함된다.
7. 진단용 조성물ㆍ진단 방법
본 발명은 금속을 포함하는 본 발명의 복합체(이하, 검출 가능한 본 발명의 복합체라고 칭함)를 포함하는 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진단용 조성물은 본 발명의 복합체를 1종류 이상 포함하는 것이어도 된다. 즉, 본 발명의 진단용 조성물은 본 발명의 복합체를 1종류 포함하는 것이어도 되고 또는 2종류 이상의 본 발명의 복합체의 조합을 포함하는 것이어도 된다. 검출 가능한 본 발명의 복합체는 통상법에 따라서 제제화되어, 조기 진단약 또는 병기 진단약(특히 암의 진단약)으로서 이용할 수 있다.
조기 진단약이란, 병상이 관찰되지 않거나, 또는 병기의 조기 단계에서 진단을 행하는 것을 목적으로 하는 진단약을 의미한다. 예를 들어, 암에 있어서는, 병상이 관찰되지 않거나, 스테이지 0 또는 스테이지 1의 단계에서 사용하는 진단약을 의미한다.
병기 진단약이란, 병상이 어느 정도 진행되어 있는지를 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다. 예를 들어, 암에 대해서는, 그의 스테이지를 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다.
본 발명의 진단용 조성물에 의해 진단할 수 있을 것이 기대되는 암은, 인간 MUC1을 발현하는 암이다. 어떤 양태로서는, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암을 들 수 있다. 바람직하게는, 당해 암은 유방암 또는 방광암이다.
본 발명의 진단용 조성물의 제제화 시의 본 발명의 복합체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 또는 Fab 프래그먼트의 결합 역가 등에 따라서 다르지만, 예를 들어 환자의 단위 체중당 Fab 프래그먼트의 질량 베이스로 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용하면 된다.
본 발명의 진단용 조성물의 제형의 예로서는, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 주사, 표적 조직 국소에의 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 또한, 제제화 시에는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체나 첨가제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 주지된 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 암의 조기 진단용 조성물, 병기 진단용 조성물의 제조를 위한, 검출 가능한 본 발명의 복합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 암의 조기 진단, 병기 진단에 있어서 사용하기 위한, 검출 가능한 본 발명의 복합체에도 관한 것이다.
그리고, 본 발명은, 검출 가능한 본 발명의 복합체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 진단 방법에도 관한 것이다. 여기에 있어서 「대상」이란, 그 진단을 받는 것을 필요로 하는 인간 또는 기타 포유 동물이며, 어떤 양태로서는 그 진단을 받는 것을 필요로 하는 인간이다. 본 발명의 진단 방법에 있어서의 검출 가능한 본 발명의 복합체의 유효량은 상기 제제화 시의 본 발명의 복합체의 유효량과 동일한 양이어도 된다. 본 발명의 진단 방법에 있어서, 검출 가능한 본 발명의 복합체는, 표적 조직 국소에의 근육내 주사, 피하 주사 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 복합체의 제조를 위한, 본 발명의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 사용에도 관한 것이다. 어떤 양태로서는, 본 발명은, 본 발명의 복합체를 포함하는 진단용 조성물의 제조를 위한, 본 발명의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 사용에도 관한 것이다.
또한, 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 본 발명의 진단용 조성물이 제공될 때의 양태로서는, 사용 직전에 금속 방사성 동위 원소로 표지되어도 되고, 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 진단용 조성물로서 제공되어도 된다.
8. 의약 조성물ㆍ치료 방법
본 발명에는 90Y 또는 177Lu 등의 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 1종류 이상의 본 발명의 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 복합체를 1종류 포함하는 것이어도 되고 또는 2종류 이상의 본 발명의 복합체의 조합을 포함하는 것이어도 된다. 본 발명의 복합체는, 당해 분야에 있어서 통상 사용되고 있는 담체, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 사용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 의약 조성물의 조제에 사용할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 방광내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화 시에는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
상기 제제화 시의 본 발명의 복합체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 또는 Fab 프래그먼트의 결합 역가 등에 따라서 상이하지만, 예를 들어 환자의 단위 체중당 Fab 프래그먼트의 질량 베이스로 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용할 수 있다.
본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물은, 암의 치료를 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물에 의해 치료할 수 있을 것이 기대되는 암은, 인간 MUC1을 발현하는 암이며, 예를 들어 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암을 들 수 있다.
본 발명에는 본 발명의 복합체를 포함하는, 유방암 또는 방광암을 치료하기 위한 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는 본 발명의 복합체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 유방암 또는 방광암을 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는 본 발명의 복합체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 유방암 또는 방광암의 암 세포의 세포사를 유도하는 방법이 포함된다.
암을 치료하기 위한 의약 조성물은, 암의 진단에도 사용할 수 있다. 예를 들어, 유방암 또는 방광암을 치료하기 위한 의약 조성물을, 당해 암의 진단에도 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명에는, 유방암 또는 방광암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 복합체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 유방암 또는 방광암을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 본 발명의 복합체의 사용이 포함된다.
다른 실시 형태에 있어서 본 발명은, 본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조를 위한, 본 발명의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 사용에도 관한 것이다.
본 발명에 대하여 전반적으로 기재하였지만, 더욱 이해를 얻기 위해 참조하는 특정 실시예를 여기에 제공한다. 그러나, 이들은 예시를 목적으로 하는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
(실시예 1: 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 제작)
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab라고 칭하는 2종류의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 제작하였다.
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 구체적으로는 마우스 유래의 항인간 암 특이적 MUC1 항체인 1B2 항체를 문헌(Front Biosci., 2008 Jan 1; 13: 1619-33.)에 기재된 방법을 참고로 하여 인간화 후, 문헌(Proteins, 2014 Aug; 82(8): 1624-35.)에 준하여 구축한 인간화 항체의 분자 모델을 사용하여, 친화성의 향상 및 표지부를 결합시켜도 친화성이 감약되지 않을 것이 기대되는 서열을 설계하였다.
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 각 중쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(서열 번호 13))을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 Igγ1의 정상 영역 유전자(서열 번호 1 및 3의 염기 번호 355로부터 669까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결시킬 수 있는 중쇄 프래그먼트 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE6.4(Lonza사)를 제작하였다. 여기서, Fab 프래그먼트로서 발현시키기 위해서, 중쇄 정상 영역 유전자에 있어서, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 기초하는 221번째의 Asp(후술하는 서열 번호 2 및 4의 아미노산 서열 중의 222번째의 Asp에 대응)의 코돈 후에 정지 코돈을 삽입하였다. 또한, P10-1 Fab 및 P10-2 Fab 공통의 경쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(서열 번호 14))을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 κ쇄의 정상 영역 유전자(서열 번호 5의 염기 번호 340으로부터 660까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결시킬 수 있는 경쇄 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE12.4(Lonza사)를 제작하였다.
일과성 발현의 방법으로 Fab 프래그먼트의 발현을 행하였다. Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사)에서 약 250만개/mL로 배양된 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific사)에 대하여, 전술한 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 GS 벡터를 ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 트랜스펙트하고, 8일간 배양하였다. 발현시킨 후, 배양 상청을 KappaSelect(GE Healthcare사)를 사용하여 정제하고, 각 Fab 프래그먼트를 얻었다.
P10-1 Fab의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에 각각 나타낸다. P10-1 Fab의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 7에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 8에 각각 나타낸다.
P10-2 Fab의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. P10-2 Fab의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 9에, 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 10에 각각 나타낸다.
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 경쇄는 공통이며, 그의 염기 서열은 서열 번호 5에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 6에 각각 나타낸다. P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 11에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 12에 각각 나타낸다.
(실시예 2: Fab 프래그먼트의 아미노산 수식 분석)
정제한 P10-2 Fab의 아미노산 수식을 분석한 결과, 정제 항체의 대부분에 있어서, 중쇄 N 말단의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식되어 있는 것이 시사되었다.
(실시예 3: 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 제작)
본 실시예에 있어서의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab)로서는 P10-1 Fab를 사용하였다.
또한, 이하의 실시예에 있어서, MS 해석에 의해 확인된 각 복합체의 Fab가 결합하는 (Y-S1-X)의 수를 나타내고 있지만, 그 결과는 그 이외의 결합수를 갖는 복합체를 포함하지 않는 것을 나타내는 것은 아니다. MS 해석 기기의 정밀도의 관계로 그 존재를 확인할 수 없는 결합수의 복합체가 존재하고 있을 가능성은 남는다는 것이 이해될 것이다.
(실시예 3-1: 샘플 No.1([DFO-C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab)의 합성)
Figure pct00010
(i) N-(3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카르보닐}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(11.5g)를 아니솔(2.8mL)에 녹이고, 트리플루오로아세트산(이하 TFA라고 약칭)(58mL)을 실온에서 적하하여 2시간 교반하였다. HPLC로 원료의 소실과 목적물의 생성을 확인하고, 반응액을 감압 증류 제거하였다. 잔사에 디에틸에테르(200mL)를 첨가하여 석출된 고체를 여과 취출하고, 디에틸에테르로 세정하여 글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신모노(트리플루오로아세트산)염(8.70g)을 얻었다. MS(ESI+); 284
글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신모노(트리플루오로아세트산)염(105mg)과, 1,1'-[1,3-페닐렌비스(카르보닐옥시)]디(피롤리딘-2,5-디온)(272mg)을 디메틸포름아미드(이하 DMF라고 약칭)(3mL)에 녹이고, 트리에틸아민(이하 TEA라고 약칭)(0.07mL)을 실온에서 천천히 첨가하여 20분 교반하였다. LCMS로 목적물의 생성과 원료의 소실을 확인하고, TFA 수용액을 첨가하여 반응을 ??칭하고 pH를 4 부근으로 조제하였다. 역상 칼럼 크로마토그래피(YMC Triart C18, 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제를 행하고, 목적물을 포함하는 프랙션을 모아서 농축, 동결 건조시켜 표제 화합물(155mg)을 얻었다. MS(ESI+); 529
(ii) N-{3-[(3,14,25-트리히드록시-2,10,13,21,24-펜타옥소-3,9,14,20,25-펜타아자트리아콘탄-30-일)카르바모일]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-(3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카르보닐}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(141mg)을 DMF(5mL)에 녹이고, N4-{5-[아세틸(히드록시)아미노]펜틸}-N1-(5-{4-[(5-아미노펜틸)(히드록시)아미노]-4-옥소부탄아미드}펜틸)-N1-히드록시부탄디아미드모노메탄술폰산염(177mg) 및 TEA(0.075mL)를 실온에서 첨가하였다. 원료가 녹기 어렵고 백탁되어 있었으므로 디메틸술폭시드(이하 DMSO라고 약칭)(5mL)를 첨가하여 녹이고, 실온에서 1시간 교반하였다. LCMS로 목적물의 생성과 원료의 소실을 확인하고, TFA 수용액을 첨가하여 반응을 ??칭하고 pH를 5 부근으로 조제하였다. 역상 칼럼 크로마토그래피(YMC Triart C18, 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제를 행하고, 목적물을 포함하는 프랙션을 모아서 농축, 감압 하 2시간 건조시켜 표제 화합물(150mg)을 얻었다. MS(ESI+); 975
(iii) N-{3-[(3,14,25-트리히드록시-2,10,13,21,24-펜타옥소-3,9,14,20,25-펜타아자트리아콘탄-30-일)카르바모일]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 정제
N-{3-[(3,14,25-트리히드록시-2,10,13,21,24-펜타옥소-3,9,14,20,25-펜타아자트리아콘탄-30-일)카르바모일]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(122mg)을 DMSO(8mL)와 DMF(4mL)에 녹이고, 역상 칼럼 크로마토그래피(YMC Triart C18, 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 모아서 농축, 감압 하 2시간 건조시켜 표제 화합물(19mg)을 얻었다. MS(ESI-); 973
(iv) 샘플 No.1의 합성
0.1M 붕산 완충액에서 4mg/mL로 조제한 Fab 용액에 0.1M 붕산 완충액에서 조제한 2-이미노티올란(2-IT) 용액을 첨가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 과잉의 2-IT는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터(머크 밀리포어사)를 사용하여 EDTA 함유 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 세정을 3회 반복하고, 마지막에 농축 여과하였다.
얻어진 여액에, 0.1M 붕산 완충액(pH8.5)으로 희석한 후에, DMF에 용해시킨 N-{3-[(3,14,25-트리히드록시-2,10,13,21,24-펜타옥소-3,9,14,20,25-펜타아자트리아콘탄-30-일)카르바모일]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신을 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 과잉의 시약은 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 EDTA 함유 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 세정하고, 그것을 3회 반복하고, 마지막에 농축 여과하였다.
계속해서, 얻어진 상청에, 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)에서 10mg/mL로 조제한 2-요오도아세트아미드 용액을 첨가한 후, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 과잉의 요오도아세트아미드는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 인산 완충 생리 식염수(pH7.0)로 세정을 3회 반복하고, 마지막에 농축 여과하여 Fab가 결합된 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 1076의 [DFO-C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]가 1개 결합된 복합체 및 2개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 3-2: 샘플 No.2([DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab)의 합성)
Figure pct00011
(i) 3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조산의 합성
(3-포르밀페녹시)아세트산벤질에스테르(2.90g)(Chemistry. 2015 Aug 24; 21(35): 12421-30.), 2-메틸프로판-2-올(60mL) 및 물(30mL)의 혼합물에, 실온에서 2-메틸부트-2-엔(6mL), 나트륨이수소포스페이트 수화물(1:1:2)(3.35g) 및 아염소산나트륨(3.64g)을 첨가하여 2시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸과 1M 염산(60mL)을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조, 여과하였다. 여액을 농축함으로써 표제 화합물(2.93g)을 얻었다. MS(ESI-); 285
(ii) N-{3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조일}글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르의 합성
글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(760mg), 3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조산(600mg) 및 DMF(10mL)의 혼합물에, 빙냉 하, 헥사플루오라이드인산(1-)1-(디메틸아미노)-N,N-디메틸-1-[(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일)옥시]메탄이미늄(800mg)과 디이소프로필에틸아민(이하 DIPEA라고 약칭)(1mL)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 교반 후, 그 혼합물에 물과 아세트산에틸을 첨가하여 유기층을 분리 후, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 합친 유기층을 물 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 여액을 농축 후, 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10-0/100)로 정제함으로써 표제 화합물(1.19g)을 얻었다. MS(ESI+); 662
(iii) N-[3-(카르복시메톡시)벤조일]글리실-L-리신tert-부틸에스테르의 합성
N-{3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조일}글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(1.18g) 및 에틸알코올(20mL)의 혼합물에, 실온에서 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 200mg)를 첨가하였다. 그 혼합물을 수소 기류 하(1atm) 실온에서 밤새 교반하였다. 그 혼합물을 셀라이트를 사용하여 여과 후, 농축함으로써 표제 화합물(804mg)을 얻었다. MS(ESI+); 438
(iv) N-[3-(카르복시메톡시)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-(카르복시메톡시)벤조일]글리실-L-리신tert-부틸에스테르(600mg), DMF(2mL) 및 테트라히드로푸란(4mL)의 혼합물에 2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-카르복실산메틸에스테르(350mg) 및 DIPEA(700μL)를 실온에서 첨가하고, 60℃에서 가열 교반하였다. 9시간 후에 DIPEA(500μL)를 추가하고, 또한 60℃에서 밤새 교반하였다. 실온까지 방랭하고, TFA(600μL)로 중화하고, 감압 농축하고, 그대로 역상 칼럼 크로마토그래피(YMC Triart C18, 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하였다. 목적물의 프랙션을 감압 농축하고, 잔사에 물 및 아세트산에틸을 첨가하여 분액 추출하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과한 후, 여액을 감압 농축 및 건조함으로써 표제 화합물(378mg)을 얻었다. MS(ESI+); 518
(v) N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
N4-{5-[아세틸(히드록시)아미노]펜틸}-N1-(5-{4-[(5-아미노펜틸)(히드록시)아미노]-4-옥소부탄아미드}펜틸)-N1-히드록시부탄디아미드모노메탄술폰산염(400mg), N-[3-(카르복시메톡시)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(365mg) 및 DMF(4mL)의 혼합물에 3-{[(에틸이미노)메틸리덴]아미노}-N,N-디메틸프로판-1-아민 일염산염(이하 EDC HCl이라고 약칭)(240mg), 1H-벤조트리아졸-1-올(이하 HOBt라고 약칭)(165mg) 및 DIPEA(500μL)를 빙냉 하에서 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 TFA(200μL)와 물(500μL)의 혼합 용액으로 희석하고, 그대로 역상 칼럼 크로마토그래피(YMC Triart C18, 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하였다. 목적물의 프랙션을 모아서 감압 농축하고, 동결 건조함으로써 표제 화합물(285mg)을 얻었다. MS(ESI-); 1059
(vi) N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(370mg)에, TFA(1.5mL)를 빙냉 하에서 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 감압 농축한 후, DMF(4mL) 및 물(500μL)을 첨가하여 희석하고, 그대로 역상 칼럼 크로마토그래피(YMC Triart C18, 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하였다. 목적물의 프랙션을 모아서 감압 농축하고, 동결 건조시킴으로써 표제 화합물(194mg)을 얻었다. MS(ESI-); 1003
(vii) 샘플 No.2의 합성
(vi)의 화합물을 사용하여, 실시예 3-1의 (iv)와 마찬가지로 하여 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 1106의 [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]가 1개 결합된 복합체 및 2개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 3-3: 샘플 No.3([DOTA-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)]p-Fab)의 합성)
Figure pct00012
킬레이트제인 DOTA의 Fab로의 결합에는, p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics사)를 사용하였다. Fab 용액에, 인산 완충 생리 식염수(pH7.4) 및 글리세린을 첨가하고, 최종적으로 0.1M 탄산나트륨 용액(pH9.0)을 첨가함으로써 pH8.8-9.0의 6mg/mL의 탄산나트륨 용액으로 하였다. 이것에 p-SCN-Bn-DOTA를 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 반응 후, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터로 회수하고, 복합체를 정제하였다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 553의 [DOTA-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)]가 1개 결합된 복합체, 2개 결합된 복합체, 3개 결합된 복합체 및 4개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 3-4: 샘플 No.4([DOTA]p-Fab)의 합성)
Figure pct00013
2,2',2",2"'-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)사아세트산(DOTA)(16mg) 및 물(810μL)의 혼합 용액에, 빙냉 하, 1M 수산화나트륨 수용액(80μL)을 첨가하고 pH6으로 조제하였다. 조제한 용액(239μL)에, 빙냉 하, 물(117μL)에 용해시킨 1-히드록시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술폰산나트륨(2.3mg)을 첨가하였다. 그 후, EDC HCl 수용액(8.3μL, 25mg/mL)을 첨가하고, 빙냉 하 30분 교반하여 N-히드록시술포숙시니미딜 DOTA 용액을 조제하였다. Fab 첨가 전에 0.2M 인산수소이나트륨 용액(pH9)(40μL)을 첨가하여 pH7로 조제하였다.
20.8mg/mL Fab(27μL)의 0.1M 인산수소이나트륨 용액(198μL)에 조제한 N-히드록시술포숙시니미딜 DOTA 용액(100μL)을 첨가하고, 37℃에서 20시간 인큐베이션하였다. 아미콘 울트라를 사용하여 10mM 인산 완충액(pH7.0)으로 세정을 2회 반복하고, 0.3M의 아세트산암모늄 완충액으로 세정하고 마지막에 농축 여과하여 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 387의 DOTA가 1개 결합된 복합체 및 2개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 3-5. 샘플 No.5([DOTA-Gly-Lys-Z2]p-Fab)의 합성)
Figure pct00014
(i) N-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
빙냉 하, N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(1g)의 디클로로메탄(12mL) 용액에 TFA(6mL)를 첨가하고, 빙냉 하에서 2시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에 농축함으로써 글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(1.1g)을 얻었다. MS(ESI+); 340.3
2,2',2",2"'-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)사아세트산(320mg) 및 물(12mL)의 혼합물에, 빙냉 하, 1M 수산화나트륨 수용액(1.58mL)을 첨가하고, pH6으로 조제하였다. 그 후, 빙냉 하, 1-히드록시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술폰산나트륨(170mg) 및 EDC HCl(150mg)를 첨가하여 30분 교반하였다. 0.2M 인산수소이나트륨 용액(pH9)(3mL)을 첨가하고, pH7로 한 후, 글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(750mg), 1M 수산화나트륨 수용액(672μL) 및 0.2M 인산수소이나트륨 용액(pH9)(800μL)을 첨가하여 pH8로 하고, 빙냉 하 2시간 교반하였다. 역상 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→100％ 아세토니트릴/물(0.05％ TFA 수용액))로 정제함으로써 표제 화합물(347mg)을 얻었다. MS(ESI-): 726.3
(ii) N-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 사염산염의 합성
N-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염(347mg)의 4M 염화수소/디옥산(3mL) 및 디클로로메탄(3mL) 혼합 용액을 실온에서 3시간 교반한 후, 반응 용액을 감압 하에 농축하였다. 잔사를 역상 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→100％ 아세토니트릴/물(0.05％ TFA 수용액))로 정제함으로써 표제 화합물(168mg)을 얻었다. MS(ESI+): 670
(iii) 샘플 No.5의 합성
5.2mg/mL의 Fab의 붕산 완충액(100μL)에 2mg/mL 2-IT의 0.1M 붕산 완충액(3.33μL)을 첨가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 과잉의 2-IT는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 EDTA 함유 0.1M 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 세정을 3회 반복하고, 마지막에 농축 여과하였다.
얻어진 여액에 25mg/mL 신규 링커(DMF 용액 20μL)를 첨가하고, 70μL가 되도록 0.1M 붕산 완충액(pH8.5)으로 희석하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 EDTA 함유 0.1M 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 세정을 2회 반복하고, 인산 완충 생리 식염수(pH7.0)로 세정하고 마지막에 농축 여과하여 복합체를 얻었다.
당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 772의 [DOTA-Gly-Lys-Z2]가 1개 결합된 복합체 및 2개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 3-6. 샘플 No.6([DOTA-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab)의 합성)
Figure pct00015
(i) N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조산(460mg), 글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(750mg) 및 디클로로메탄(15mL) 혼합물에, EDC HCl(380mg), HOBt(110mg) 및 TEA(700μL)를 첨가하여 실온에서 15시간 교반하였다. 반응 용액을 농축 후, 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(전개 용매; 아세트산에틸)로 정제함으로써 표제 화합물(478mg)을 얻었다. MS(ESI+): 595
(ii) N-[3-(아미노메틸)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(478mg)의 TFA(1.5mL) 및 디클로로메탄(3mL) 혼합물을 실온에서 30분 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에 농축함으로써 표제 화합물(500mg)을 얻었다. MS(ESI+): 473
(iii) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-[3-(아미노메틸)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(489mg)을 사용하여, 상기 실시예 3-5의 공정 (i)과 마찬가지로 하여 표제 화합물(160mg)을 얻었다. MS(ESI-): 857
(iv) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 사염산염의 합성
N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염(160mg)을 사용하여, 상기 실시예 3-5의 공정 (ii)와 마찬가지로 하여 표제 화합물(80mg)을 얻었다. MS(ESI+): 803
(v) 샘플 No.6의 합성
(iv)의 화합물을 사용하여, 상기 실시예 3-5의 공정 (iii)의 공정과 마찬가지로 하여 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 905의 [DOTA-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]가 1개 결합된 복합체, 2개 결합된 복합체 및 3개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 3-7. 샘플 No.7([DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]p-Fab)의 합성)
Figure pct00016
(i) N-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
2,2',2",2"'-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)사아세트산(330mg) 및 물(16mL)의 혼합물에, 빙냉 하, 1M 수산화나트륨 수용액(1.6mL)을 첨가하고, pH6으로 조제하였다. 그 후, 빙냉 하, 1-히드록시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술폰산나트륨(90mg) 및 EDC HCl(80mg)를 첨가하여 30분 교반하였다. 0.2M 인산수소이나트륨 용액(pH9)(3mL)을 첨가하고, pH7로 한 후, L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드 일염산염(100mg)(Bioconjug Chem. 2014 Nov 19; 25(11): 2038-45.), 1M 수산화나트륨 수용액(570μL)을 첨가하고, 약 pH8로 하여 빙냉 하 2시간 교반하였다. 역상 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(아세토니트릴/0.05％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(98mg)을 얻었다. MS(ESI-): 769
(ii) 샘플 No.7의 합성
(i)의 화합물을 사용하여, 상기 실시예 3-5의 공정 (iii)의 공정과 마찬가지로 하여 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab 1개에 대하여, 분자량 873의 [DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]이 1개 결합된 복합체, 2개 결합된 복합체 및 3개 결합된 복합체의 혼합물인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
상기 실시예와 마찬가지의 방법, 또는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 후기 합성 반응식에 따라 표 1-1 내지 1-4의 제조예 No.A1 내지 A19의 화합물을 합성하였다.
<표 1-1>
Figure pct00017
<표 1-2>
Figure pct00018
<표 1-3>
Figure pct00019
<표 1-4>
Figure pct00020
(합성 반응식)
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
제조예 No.A1 내지 A19의 화합물을 사용하여, 상기 실시예 3-1의 공정 (iv), 실시예 3-3 또는 실시예 3-5의 공정 (iii)과 마찬가지의 방법에 의해 대응하는 표 2의 복합체 No.B1 내지 B19를 합성할 수 있다. 또한, 표 중, p는 1 내지 25의 자연수(어떤 양태로서는 1 내지 4의 자연수)를, 1,3-Ph는 1,3-페닐렌을, 또한 1,4-Ph는 1,4-페닐렌을 각각 나타낸다.
<표 2>
Figure pct00040
(실시예 4: Fab 프래그먼트의 결합 활성 평가)
실시예 1의 방법으로 발현시킨 P10-1 Fab 및 P10-2 Fab에 대하여, 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 Cell ELISA법에 의해 키메라 1B2 항체 Fab 프래그먼트(이하, 1B2 Fab로 표기하는 경우가 있음. 1B2 항체(특허문헌 1)의 VH 도메인 및 VL 도메인(서열 정보는 특허문헌 1로부터 인용)에, 인간 IgG1의 CH1 도메인, κ쇄의 CL 도메인을 각각 연결하여 제작하였다. CH1 도메인 및 CL 도메인을 연결하는 사정상, VH 도메인의 Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 기초하는 113번째의 알라닌 잔기가 세린 잔기로, VL 도메인의 Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 기초하는 109번째의 알라닌 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되어 있음)와 비교하였다. 즉, 인간 암 특이적 MUC1을 발현하는 유방암 세포주 T-47D 세포(ATCC로부터 구입 가능; HTB-133)를 1웰당 0.75×104 세포, 콜라겐 I로 코팅한 96웰 ELISA 플레이트에 파종하고, 밤새 배양 후, 세포를 포르말린으로 고정화하고, 그것에 대하여 상기 P10-1 Fab, P10-2 Fab 또는 1B2 Fab를 반응시킨 후, 2차 항체로서 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase: HRP) 표지 염소 항인간 Igκ 항체(Southern Biotechnology Associates사)를 반응시키고, ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare사)를 첨가하여 발광시켜, 그의 발광도를 조사하였다. 그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이 P10-1 Fab 및 P10-2 Fab는 1B2 Fab의 약 10배 이상의 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 갖는 것이 확인되었다.
(실시예 5: 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 결합 활성 평가)
실시예 3의 방법으로 제작한 각 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 대하여, 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 평가하기 위해 ELISA법을 행하였다.
샘플 No.5: [DOTA-Gly-Lys-Z2]p-Fab
샘플 No.6: [DOTA-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab
샘플 No.7: [DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]p-Fab
샘플 No.3: [DOTA-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)]p-Fab
인간 암 특이적 MUC1 펩티드(특허문헌 1)를 1웰당 0.5μmol/L, 384웰 ELISA 플레이트에 고상하였다. 그것에 대하여 상기 각 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체(샘플 No.5, 6, 7 또는 3)를 반응시킨 후, 2차 항체로서 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 표지 염소 항인간 Igκ 항체(Southern Biotechnology Associates사)를 반응시키고, ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare사)를 첨가하여 발광시켜, 그의 발광도를 조사하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 샘플 No.5, 6, 7 및 3의 복합체는 P10-1 Fab와 동등한 인간 암 특이적 MUC1 펩티드에 대한 결합 활성을 갖는 것이 확인되었다.
<표 3>
Figure pct00041
마찬가지로 하여, 이하의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 대해서도 결합성 평가를 행하였다. 결과를 표 4 및 표 5에 나타낸다.
샘플 No.4: [DOTA]p-Fab
샘플 No.1: [DFO-C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab
샘플 No.2: [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab
<표 4>
Figure pct00042
<표 5>
Figure pct00043
그 결과, 샘플 No.4, 1 및 2의 복합체에 대해서도, P10-1 Fab와 동등한 인간 암 특이적 MUC1 펩티드에 대한 결합 활성을 갖는 것이 확인되었다.
본 발명의 복합체는 인간 암 특이적 MUC1에 대한 우수한 결합 활성을 갖는다는 점에서, 암의 진단 및/또는 치료에 유용할 것으로 기대된다.
[서열목록 프리텍스트]
서열 번호 1: P10-1 Fab 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 2: P10-1 Fab 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열
서열 번호 3: P10-2 Fab 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 4: P10-2 Fab 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열
서열 번호 5: 항체 경쇄를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 6: 항체 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 7: P10-1 Fab 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 8: P10-1 Fab 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 9: P10-2 Fab 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 10: P10-2 Fab 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 11: 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 12: 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 13: 중쇄 시그널 서열
서열 번호 14: 경쇄 시그널 서열
서열 번호 15: MUC1의 세포 외 도메인의 탠덤 리피트 서열
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Complex having anti-human MUC1 antibody Fab fragment, peptide linker and/or ligand <130> A19005A00 <140> PCT/JP2019/019663 <141> 2019-05-17 <150> JP 2018-095461 <151> 2018-05-17 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-1 Fab heavy chain fragment <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgactga 669 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-1 Fab heavy chain fragment <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 <210> 3 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-2 Fab heavy chain fragment <400> 3 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgactga 669 <210> 4 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-2 Fab heavy chain fragment <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 <210> 5 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding antibody light chain <400> 5 gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60 atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300 tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain <400> 6 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-1 Fab heavy chain variable region <400> 7 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-1 Fab heavy chain variable region <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-2 Fab heavy chain variable region <400> 9 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-2 Fab heavy chain variable region <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding antibody light chain variable region <400> 11 gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60 atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300 tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339 <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain variable region <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain signal sequence <400> 13 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain signal sequence <400> 14 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tandem repeat sequence of an extracellular domain of MUC1 <400> 15 His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ala 20

Claims (32)

  1. 하기 식 (I):
    (Y-S1-X)p-Fab (I)
    [식 중,
    Fab는, 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 및
    (b) 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이고;
    X는 펩티드 링커 또는 결합이고;
    S1은 스페이서 또는 결합이고;
    Y는 배위자이고; 그리고,
    p는 1 내지 25의 자연수이며;
    단, X가 결합일 때에는, S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이고, Y는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)이다]
    로 표시되는 복합체.
  2. 제1항에 있어서, Fab가, 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
    (b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트;
    로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체.
  3. 제1항에 있어서, Fab가, 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
    (b) 서열 번호 10에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트;
    로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체.
  4. 제2항에 있어서, Fab가, 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
    (b) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트;
    로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체.
  5. 제4항에 있어서, Fab가, 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 복합체.
  6. 제4항에 있어서, Fab가, 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, X가 신장 쇄자연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 포함하는 펩티드 링커인 복합체.
  8. 제7항에 있어서, S1이 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)- 또는 결합이고,
    X가, 이하의 (1) 내지 (9):
    (1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
    (2) -Gly-Lys-Z2-,
    (3) -Gly-Phe-Lys-Z2-,
    (4) -Met-Val-Lys-Z2-,
    (5) -Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
    (6) -Gly-Lys-Lys-Z2-,
    (7) -Gly-Arg-Lys-Z2-,
    (8) -Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 및
    (9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-
    [식 중, Met는 메티오닌을, Ile는 이소류신을, Gly는 글리신을, Lys는 리신을, Phe는 페닐알라닌을, Val은 발린을, Tyr은 티로신을, Arg는 아르기닌을, Z1은 하기 식 (II)로 표시되는 기를, -Lys-Z2-는 하기 식 (III)으로 표시되는 기를, -Tyr-CH2-는 하기 식 (IV)로 표시되는 기를, -Lys-C(=S)-는 하기 식 (V)로 표시되는 기를 각각 나타낸다]
    로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인 복합체.
    Figure pct00044
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 데페록사민(DFO) 또는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)인 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 DFO인 복합체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 DOTA인 복합체.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 DOTA이고,
    S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이고,
    X가 결합인 복합체.
  13. 제10항에 있어서, (Y-S1-X)p-Fab가
    Figure pct00045

    로 이루어지는 군에서 선택되고, Fab에 포함되는 아미노기의 질소 원자가 X 말단의 C(=NH)기의 탄소 원자와 결합되어 있는 복합체.
  14. 제11항에 있어서, (Y-S1-X)p-Fab가
    Figure pct00046

    로 이루어지는 군에서 선택되고, Fab에 포함되는 아미노기의 질소 원자가 X 말단의 C(=NH)기의 탄소 원자와 결합되어 있는 복합체.
  15. 제12항에 있어서, (Y-S1-X)p-Fab가
    Figure pct00047

    로 이루어지는 군에서 선택되고, Fab에 포함되는 아미노기의 질소 원자가 말단의 C(=O)기 또는 C(=S)기의 탄소 원자와 결합되어 있는 복합체.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1 내지 4의 자연수인 복합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 금속을 더 포함하는 복합체.
  18. 제17항에 있어서, 금속이 금속 방사성 동위 원소인 복합체.
  19. 제18항에 있어서, 금속이 89Zr인 복합체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, PET 트레이서인 복합체.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 진단용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 조기 진단약 또는 병기 진단약인 진단용 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 인간 MUC1을 발현하는 암의 진단에 사용하는 진단용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암인 진단용 조성물.
  25. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 인간 MUC1을 발현하는 암을 치료하기 위한 의약 조성물인 의약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경부암인 의약 조성물.
  28. 암의 진단용 조성물, 및/또는 암을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 사용.
  29. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 진단 및/또는 암의 치료에 있어서 사용하기 위한 복합체.
  30. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 진단 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 진단 방법.
  31. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법.
  32. 암의 진단 및/또는 암의 치료를 위한 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 사용.
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