KR20200072959A

KR20200072959A - Dna 서열 분석용 형광 단백질 조성물 및 이를 이용한 dna 서열 분석 방법

Info

Publication number: KR20200072959A
Application number: KR1020180161115A
Authority: KR
Inventors: 조규봉; 이성현; 박지현; 신은지
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-06-23
Also published as: KR102145006B1; US20200190580A1; US11466322B2; US20230136510A1

Abstract

본 발명은 DNA 서열 분석용 조성물 및 시료에 이를 처리하는 단계를 포함하는 DNA 서열 분석 방법에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 DNA에 A/T 특이적 DNA-결합제 및 비특이적인 상보적 DNA-결합제를 동시에 결합시킴으로써 특히 단일 DNA 분자(single DNA molecule) 수준에서 효율적인 광학적 식별이 가능하므로, 게놈의 염색체 구성 및 단백질 면역 조직화(immunolocalization) 등을 연구하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

DNA 서열 분석용 형광 단백질 조성물 및 이를 이용한 DNA 서열 분석 방법{Composition of Fluorescent proteins for analyzing DNA sequences and method for analyzing DNA sequences using the same}

본 발명은 DNA 서열 분석용 조성물 및 이를 이용한 DNA 서열 분석 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 DNA 결합 형광 단백질을 포함하는 조성물 및 시료에 이를 처리하는 단계를 포함하는 DNA 서열 분석 방법에 관한 것이다.

개별 DNA 분자를 직접적으로 시각화하는 것은 DNA 서열의 맥락에서 생화학적 특성을 확인하기 위하여 매우 중요하다. 단일 뉴클레오타이드(nucleotide) 수준에서 시퀀싱(sequencing)하는 기술이 발전하고 있지만, 이러한 기술은 긴 게놈 내의 짧은 판독 길이 및 이에 따른 정보 손실 등 아직 미해결된 생물학적 문제를 가지고 있다.

DNA 분석의 궁극적인 목표는 단편화 또는 증폭 없이 염색체 DNA로부터 직접적으로 염기 서열 및 후성(epigenetic) 유전 정보를 얻는 것이다. 이러한 필요를 고려할 때, 단일 DNA 분자(Single DNA molecule)는 현재의 시퀀싱 기술의 한계를 극복하기 위한 유망한 플랫폼이라 할 수 있다.

이에, 커다란 DNA 분자를 시각화하여 유전 정보를 얻는 광학 매핑(Optical Mapping) 방법이 계속하여 개발되었다. 이는 단일 DNA 분자(Single DNA molecule)로부터 바코드와 같은 패턴을 만들어 시각화하는 방법이다.

다만, 종래의 서열-특이적 제한 효소(Restriction enzyme)를 사용하여 분석하는 방법은 DNA가 분해된다는 근본적인 문제가 존재하고, 삽입형 및 형광 염료 표지를 사용하여 분석하는 방법은 상기 형광 염료로 사용된 염료(예를 들어, YOYO-1)에 의해 광-유도 DNA 절단이 유발된다는 문제가 존재한다.

따라서, 효소 처리 및 별도의 시퀀싱 절차 없이 단일 DNA 분자 수준에서 게놈-특이적(genome-specific) DNA 분자 이미지를 얻을 수 있는 물질의 개발이 필요한 실정이다.

국내공개특허 제10-2018-0097956호

본 발명자들은 단일 DNA 분자 수준에서 게놈-특이적 DNA 분자 이미지를 얻을 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 A/T 특이적 DNA 결합 단백질 및 A/T 비특이적 상보적 DNA-결합 단백질을 동시에 사용하는 경우 별도의 시퀀싱 절차 없이도 단일 DNA 분자의 효율적인 광학적 식별을 위한 서열-특이적 DNA 지도를 제작할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 DNA 서열 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DNA 서열 분석 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 단일 DNA 분자 수준에서 게놈-특이적 DNA 분자 이미지를 얻을 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 A/T 특이적 DNA 결합 단백질 및 A/T 비특이적 상보적 DNA 결합 단백질을 동시에 사용하는 경우 별도의 시퀀싱 절차 없이도 단일 DNA 분자의 효율적인 광학적 식별을 위한 서열-특이적 DNA 지도를 제작할 수 있음을 규명하였다.

본 발명은 DNA 서열 분석용 조성물 및 이를 이용한 DNA 서열 분석 방법을 에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 제1 형광 단백질이 결합된 A/T(Adenine/Tymine)-특이적 DNA 결합 단백질; 및 제2 형광 단백질이 결합된 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질을 포함하는 DNA 서열 분석용 조성물에 관한 것이다.

상기 제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질은 서로 구분되는 다른 색을 나타낼 수 있다.

구체적으로는, 상기 제1 형광 단백질은 적색/제2 형광 단백질은 녹색, 제1 형광 단백질은 녹색/제2 형광 단백질은 청색, 또는 제1 형광 단백질은 노란색/제2 형광 단백질은 하늘색을 나타낼 수 있다.

상기 제1 형광 단백질은 mCherry, DsRed2, mScarlet, mStrawberry, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby, mPlum, mKate2, mNeptune 또는 TagRFP657일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제2 형광 단백질은 eGFP(enhanced Green fluorescent protein), Emerald, Superfolder GFP, TagGFP2, mClover2, mClover3, mEos2 또는 mEos3.2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 A/T(Adenine/Tymine)-특이적 DNA 결합 단백질은 A/T 염기쌍(W)-특이적으로 DNA에 결합할 수 있다.

상기 A/T-특이적 DNA 결합 단백질은 히스톤-유사 뉴클레오이드-구조(histone-like nucleoid-structuring; H-NS) 단백질 또는 고 이동성 그룹(high mobility group; HMG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 히스톤-유사 뉴클레오이드-구조 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 17에 나타내었다.

상기 고 이동성 그룹의 아미노산 서열은 서열번호 18에 나타내었다.

상기 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질은 A/T 염기쌍(W)-비특이적으로 DNA에 결합할 수 있다.

상기 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질은 BRCA1(breast cancer 1) 단백질 또는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1] (XY)_n 에서,

상기 X 및 Y는 각각 독립적으로 라이신(K), 트립토판(W) 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산일 수 있다.

상기 n은 1 내지 5의 정수일 수 있다.

상기 BRCA1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 19에 나타내었다.

상기 형광 단백질(제1 또는 제2 형광 단백질) 및 DNA 결합 단백질(A/T-특이적 또는 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질)은 링커(linker)를 통해 결합된 것일 수 있다. 형광 단백질의 종류에 따라 DNA 결합 단백질과 형광 단백질을 연결시킬 수 있는 다양한 종류의 링커가 사용될 수 있다.

상기 링커는 글라이신(G), 세린(S)，라이신(K) 및 알라닌(A)으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 링커일 수 있다.

상기 링커 서열은 예를 들어 GGSGG일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제1 형광 단백질(또는 제2 형광 단백질)은 A/T-특이적 DNA 결합 단백질(또는 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질)의 N-말단에 위치할 수도 있고, C-말단에 위치할 수도 있으며, N-말단 및 C-말단 모두에 위치할 수도 있다.

상기 제1 형광 단백질이 결합된 A/T-특이적 DNA 결합 단백질 및 제2 형광 단백질이 결합된 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질은 1:1-20, 1:1-10, 1:2-10, 1:3-10, 1:4-10, 1:5-10, 1:1-9, 1:1-8, 1:1-7, 1:1-6, 1:1-5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20의 농도비로 포함될 수 있다.

상기 DNA는 예를 들어, 단일 DNA 분자(Single DNA molecule), 올리고DNA(oligo DNA), 염색체(chromosome), 다사 염색체(polytene chromosome) 및 염색사(chromatin fiber)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 상기 제1 형광 단백질이 결합된 A/T-특이적 DNA 결합 단백질이 DNA의 A/T가 풍부한 부위에 우선적으로 결합하기 때문에, DNA에 A/T-특이적 DNA 결합 제제 및 비특이적 상보적 DNA 결합 제제를 동시에 결합시킴으로써 단일 DNA 분자의 효율적인 광학적 식별이 가능하다.

또한, 상기 조성물은 전통적인 시퀀싱 방법과 달리, 화학적으로 변형(modified)되거나 손상(damaged)된 DNA 백본(backbone)의 분석이 가능하므로, 단일 DNA 분자(single DNA molecule) 수준에서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 시료에 제1 형광 단백질이 결합된 A/T(아데닌/티민)-특이적 DNA 결합 단백질; 및 제2 형광 단백질이 결합된 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질을 포함하는 DNA 서열 분석용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 DNA 서열 분석 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 분석 대상의 전체 게놈(Genome) A/T(아데닌/티민) 프리퀀시(Frequency)와 상기 조성물을 처리한 시료의 A/T 프리퀀시를 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 시료는 예를 들어, 단일 DNA 분자(Single DNA molecule), 올리고DNA(oligo DNA), 염색체(chromosome), 다사 염색체(polytene chromosome) 및 염색사(chromatin fiber)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법은 예를 들어, Python 프로그램을 사용하여 인 실리코(in silico) 맵(map)에서 분석 대상의 전체 게놈 A/T 프리퀀시를 스캐닝하고, 상기 DNA 서열 분석용 조성물을 처리한 시료의 이미지와 상기 스캐닝한 전체 게놈 A/T 프리퀀시 사이의 가장 적절한 얼라인먼트(Alignment) 위치를 탐색함으로써 대상 DNA 서열을 분석할 수 있다.

상기 조성물의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락한다.

특히 이 조성물이 DNA 결합 능력을 가진 형광 단백질인 경우 유전자를 구성한 이후에는 생산이 쉽고 또한 돌연변이를 유도함으로써 다양한 새로운 성질을 부여할 수 있는 장점을 가지고 있다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 의해 염색된 DNA 분자를 나타내는 것으로, H-NS-mCherry 및 BRCA1-eGFP로 염색된 λ DNA 분자를 나타내는 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 의해 염색된 DNA 분자를 나타내는 것으로, 화살표는 5'에서 3'까지의 분자 배향을 나타내며, 흰색 프로파일은 λ DNA의 A/T 프리퀀시(스케일 막대: 10 μm)를 나타내고, 각 수치는 교차 상관 값(cc)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의해 다양한 농도의 H-NS-mCherry 및 BRCA1-eGFP로 염색된 λ DNA 분자를 나타내는 것으로, 각 수치는 교차 상관 값(cc)을 나타낸다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 의해 다양한 조합의 형광 단백질-DNA 결합 단백질로 염색된 λ DNA 분자를 나타내는 것으로, 각 조합은 하기와 같다(스케일 막대: 10 μm).
i) H-NS-mCherry 및 BRCA1-eGFP, ⅱ) H-NS-mCherry 및 2(KW)₂-eGFP, ⅲ) 2HMG-mCherry 및 BRCA1-eGFP, ⅳ) 2HMG-mCherry 및 2(KW)₂-eGFP, ⅴ) H-NS-mCherry 및 2HMG-eGFP, 및 ⅵ) 2(KW)₂-mCherry 및 BRCA1-eGFP.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 의해 다양한 조합의 형광 단백질-DNA 결합 단백질로 염색된 λ DNA 분자를 나타내는 것으로, 각 조합은 하기와 같다(스케일 막대: 10 μm).
i) H-NS-mCherry 및 BRCA1-eGFP, ⅱ) H-NS-mCherry 및 2(KW)₂-eGFP, ⅲ) 2HMG-mCherry 및 BRCA1-eGFP, 및 ⅳ) 2HMG-mCherry 및 2(KW)₂-eGFP.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 의해 다양한 조합의 형광 단백질-DNA 결합 단백질로 염색된 λ DNA 분자의 교차 상관 값을 나타낸 그래프이다(Random: 0.55±0.14, i: 0.84±0.10, ⅱ: 0.87±0.05, ⅲ: 0.84±0.04, ⅳ: 0.86±0.03, v: 0.61±0.15, 및 ⅳ: 0.59±0.11)(*p<0.02, **p<0.005).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의해 H-NS-mCherry 및 BRCA1-eGFP로 염색된 바이러스 게놈 DNA를 나타낸 모식도이다(스케일 막대: 5 μm).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

시험물질 및 시약

DNA 프라이머는 코스모진텍(한국)에서 구입하였다. 바이오틴 표지된 DNA 올리고머는 바이오니아(한국)에서 구입하였다. 대장균 BL21(DE3) 균주는 Yeastern(대만)에서 구입하였다. λ DNA(NC_001416.1, 48,502 bp) 및 단일 가닥 M13mp18(7,249 bp)는 New England Biolabs(미국)로부터 구입하였다. 에폭시(Epoxy)는 Devcon(미국)에서 구입하였다. N-트리메톡시메틸 실릴 프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드(N-trimethoxymethyl silyl propyl-N,N,N-trimethyl ammonium chloride)(50 % 메탄올)는 Gelest(Morrisville, US)로부터 구입하였다. Ni-NTA 아가로오스 레진 및 컬럼은 Qiagen(Venlo, Netherlands)으로부터 구입하였다. 기타 표기되어 있지 않은 효소는 NEB에서 구입했으며, 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

형광 현미경 및 DNA 시각화

역방향 광학 현미경(Olympus IX70, Japan)에 60Х 및 100Х Olympus UPlanSApo oil immersion 대물렌즈를 연결하였고, LED 광원(SOLA SM II light engine, Lumencor, US)을 사용하였다. 빛은 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장을 설정하기 위하여 corresponding filter sets(Semrock, US)를 통해 집속되었다.

형광 현미경 사진은 EMCCD(electron-multiplying charge-coupled device) 디지털 카메라 장치(Evolve EMCCD, Roper Scientific, US)를 통해 16-bit TIFF 형식으로 저장하였으며, 소프트웨어로 Micro-manager를 사용하였다. 이미지 보정과 분석을 위하여, ImageJ 소프트웨어와 본 발명자들이 개발한 Java plug-in 및 python 프로그램을 사용하였다.

Python 프로그램

- ImageCompare.py: 기능 라이브러리(a library of functions).

- seq2map.py: 인 실리코(in silico) 맵(map)의 FASTA 서열 파일을 이용하여 선택한 서열에 대해 빈도가 높은 부분을 백색으로, 낮은 부분을 흑색으로 표현한 그림으로 변환.

- insilicoMapFolder.py: 폴더 내의 모든 이미지에 대하여, 인 실리코 그림 파일과 실험으로 얻은 DNA 그림을 스캐닝하여 대조하고, 교차 상관 계수가 가장 높은 지점의 위치와 그 값을 반환, 새로운 기록 파일에 저장.

- sortView.py: insilicoMapFolder.py로 얻은 기록 파일을 읽어 신호 비교, 교차 상관 계수 탐색, 이미지 비교를 시각화하여 새 창에 생성.

- randomtiff.py: 임의의 밝기 값을 갖는 tiff 이미지를 생성.

형광 단백질-DNA 결합 단백질 준비

DNA 결합 단백질의 C-말단에 형광 단백질을 연결시키는 오버랩 연장 중합효소연쇄반응(overlap extension polymerase chain reaction; OE-PCR)에 의해 단백질 제작에 필요한 플라스미드를 제조하였다. 글라이신 및 세린을 포함하는 GGSGG 링커를 사용하였으며, 각 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

- HNS-mCherry: H-NS DNA는 E. coli MG1655 균주의 DNA plug를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 P1-HNS 및 역방향 프라이머 P2-HNS로 증폭시켰다. mCherry DNA는 정방향 프라이머 P3-mCherry 및 역방향 프라이머 P4-mCherry로 증폭시켰다. 그 다음, 오버랩 중합효소연쇄반응에 의해 H-NS와 mCherry를 연결하였다.

- BRCA1-eGFP: BRCA1 DNA 결합 도메인은 452-1079 잔기를 포함하는 부분적 BRCA1(Addgene 플라스미드 #71116)를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 P5-BRCA 및 역방향 프라이머 P6-BRCA로 증폭시켰다. eGFP DNA는 정방향 프라이머 P7-eGFP 및 역방향 프라이머 P8-eGFP로 증폭시켰다. 그 다음, 오버랩 중합효소연쇄반응에 의해 BRCA1 DNA 결합 도메인과 eGFP를 연결하였다.

- 2HMG-mCherry: 정방향 프라이머 P9-HMG-mCherry 및 역방향 프라이머 P10-HMG-mCherry를 사용하여 mCherry 각 말단의 DNA 결합 부위를 표지(tagging)하여 제작하였다.

- 2(KW) ₂ -mCherry: 정방향 프라이머 P11-(KW)₂-mCherry 및 역방향 프라이머 P12-(KW)₂-mCherry를 사용하여 mCherry 각 말단의 DNA 결합 부위를 표지하여 제작하였다.

- 2(KW) ₂ -eGFP: 정방향 프라이머 P13-(KW)₂-eGFP 및 역방향 프라이머 P14-(KW)₂-eGFP를 사용하여 eGFP 각 말단의 DNA 결합 부위를 표지하여 제작하였다.

- 2HMG-eGFP: 정방향 프라이머 P15-HMG-eGFP 및 역방향 프라이머 P16-HMG-eGFP를 사용하여 eGFP 각 말단의 DNA 결합 부위를 표지하여 제작하였다.

서열번호	명명	염기서열(5'-3')
1	P1-HNS	ACTTCACATATGATGAGCGAAGCACTTAAAATTCTG
2	P2-HNS	GCCACCAGAACCACCTTGCTTGATCAGGAAATCGTCG
3	P3-mCherry	CAAGCAAGGTGGTTCTGGTGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
4	P4-mCherry	ATTTCAGGATCCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC
5	P5-BRCA	TATGCACATATGGTAGAGAGTAATATTGAAGACAAAATATTTGGG
6	P6-BRCA	GCTCACCATACCGCCGCTGCCACCTTTTGGCCCTCTGTTTCTACCTAG
7	P7-eGFP	GGTGGCAGCGGCGGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
8	P8-eGFP	TATGCAGGATCCTTACGCCTTGTACAGCTCGTCCATG
9	P9-HMG-mCherry	ATATTGCATATGACCCCGAAACGCCCGCGCGGCCGCCCGAAAAAAGGCGGCAGCGGCGGC/ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
10	P10-HMG-mCherry	ATATTGGGATCCTTAGCCGCCGCTGCCGCCTTTTTTCGGGCGGCCGCGCGGGCGTTTCGGGGT/CTTGTACAGCTCGTCCATGCC
11	P11-(KW)₂-mCherry	ATGTTGCATATGAAATGGAAATGGAAAAAAGCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
12	P12-(KW)₂-mCherry	ATGTTGGGATCCTTATTTCCATTTCCATTTTTTCGCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
13	P13-(KW)₂-eGFP	ATGTTGCATATGAAATGGAAATGGAAAAAAGCGATGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
14	P14-(KW)₂-eGFP	ATGTTGGGATCCTTATTTCCATTTCCATTTTTTCGCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
15	P15-HMG-eGFP	ATATTGCATATGACCCCGAAACGCCCGCGCGGCCGCCCGAAAAAAGGCGGCAGCGGCGGCATGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
16	P16-HMG-eGFP	ATATTGGGATCCTTAGCCGCCGCTGCCGCCTTTTTTCGGGCGGCCGCGCGGGCGTTTCGGGGTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

분자 클로닝(Molecular Cloning)

표준 서브클로닝(subcloning) 절차를 사용하여 형광 단백질-DNA 결합 단백질 서열을 pET-15b 벡터에 삽입하고, NdeI 및 BamHI를 사용하여 E. coli BL21(DE3) 균주로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 암피실린을 함유하는 새로운 LB 배지에 접종하고 1 시간 동안 배양하였다.

형질전환된 세포가 포화된 후에, 대응하는 항생제를 사용하여 37 ℃에서 약 0.8의 광학 밀도로 배양하였다. 형광 표지된 단백질은 IPTG에 대해 최종농도 1 mM로 20 ℃ 및 250 rpm의 진탕기에서 밤새 과발현하였다.

단백질 정제를 위한 세포를 12,000 xg에서 10 분간 원심분리(하기 원심분리 모두 유사한 조건하에서 수행하였음)하여 수확하고, 잔류 배지를 세포 용해 완충액(50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0)으로 세척하였다. 세포를 30 분 동안 초음파 처리하여 용해시키고 세포 잔해(cell debris)를 4 ℃에서 10 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. His-표지된 FP-DNA 결합 단백질을 Ni-NTA 아가로오스 수지로 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.

세포 단백질 및 수지 혼합물을 4 ℃에서 1 시간 동안 진탕 플랫폼(shaking platform)에 두었다. 단백질 결합 Ni-NTA 아가로오스 수지를 함유하는 용해물을 중력 크로마토그래피용 칼럼 상에 로딩하고 단백질 세척 완충액(50 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 여러 번 세척하였다. 특히 H-NS-mCherry의 경우 35 mM 이미다졸이 포함된 세척 완충액(50 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 35 mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하였다.

마지막으로, 결합된 단백질을 단백질 용해 완충액(50 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 용출시켰다. 모든 단백질을 50 %w/w 글리세롤/1xTE 완충액(Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0)을 사용하여 희석시켰다(10 μg/mL).

커버슬립 및 개질된 표면 준비

유리 커버슬립을 테프론 랙(Teflon rack)에 끼우고 피라냐 에칭 용액(piranha etching solution)(30:70 v/v H₂O₂/H₂SO₄)에 2 시간 동안 담가둔 후, pH가 중성(pH 7)에 도달할 때까지 탈이온수로 세척하였다.

유리 표면을 양전하로 개질하기 위하여, 50 % 메탄올에 녹인 N-트리메톡시메틸실릴프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드(N-trimethoxymethylsilylpropyl-N,N,N-trimethyl ammonium chloride) 350 μL를 200 mL의 탈이온수와 혼합하였다.

DNA 결합(tethering)을 위한 유리 표면을 준비하기 위하여, N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine) 2 mL를 메탄올 200 mL 및 빙초산(glacial acetic acid) 10 mL에 첨가하여 1 차 아미노기를 첨가하였다. 유리 커버슬립을 용액에서 30 분 동안 배양하고, 15 분 동안 초음파 처리한 후 실온에서 12 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 메탄올 및 에탄올로 세척하였다.

미세유체 장치(microfluidic devices) 준비

양전하로 개질된 유리 표면에서 DNA의 신장(elongation) 및 증착(deposition)을 확인하기 위하여, 표준 쾌속 조형장치(rapid prototyping) 방법을 사용하여 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS) 미세유체 장치를 제조하였다.

보다 구체적으로, 마이크로채널(높이 4 μm, 폭 100 μm)용 실리콘 웨이퍼(wafer) 상의 패턴은 SU-8 2005 포토레지스트(Microchem, US)를 사용하여 제작되었다. 경화제(10:1 중량비)와 혼합된 PDMS pre-폴리머를 패턴화된 웨이퍼 상에 캐스팅하고, 65 ℃에서 4 시간 이상 경화시켰다. 경화된 PDMS를 패턴화된 웨이퍼로부터 벗겨내고, PDMS 장치를 공기 플라즈마 발생기(air plasma generator)에서 100 W(Femto Science Cute Basic, 한국)로 1 분 동안 처리하여 PDMS 표면을 친수성으로 개질하였다. PDMS 장치는 물에 저장하고 사용 전에 공기 건조시켰다.

실험예 1. 단일 분자(Single molecule) 수준에서 DNA 염색 확인

8 nM H-NS-mCherry 50 μL 및 40 nM BRCA1-eGFP 50 μL를 1:1 비율로 혼합하여 DNA 서열 분석용 조성물을 제조하였다.

먼저, 1xTE(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8)를 이용하여 λ DNA를 15 ng/μL로 묽힌 용액 10 μL 및 상기 DNA 서열 분석용 조성물 10 μL 를 혼합하였다. 잠시 동안 실온에서 배양한 후, 1xTE 용액에 1/10~1/20으로 묽힌 후 양전하로 개질된 유리 표면과 PDMS 마이크로채널(100 μm x 4 μm)을 부착한 구조체 입구에 넣고 DNA 분자를 현미경으로 촬영하였다.

도 1a에서 확인할 수 있듯이, H-NS-mCherry 및 BRCA1-eGFP를 사용하여 λ DNA를 염색한 결과, 녹색 DNA 백본에 3개의 별개의 빨간색 점을 기반으로 λ DNA 분자를 정렬할 수 있었다.

다음으로, 상기 1xTE 용액에 1/10~1/20으로 묽힌 용액 3 μL를 양전하로 개질된 유리 표면에 떨어뜨린 후 슬라이드 글라스와 닿게 하여 용액을 퍼트리고 형광 현미경으로 촬영하였다.

도 1b에서 확인할 수 있듯이, λ DNA 분자가 양전하를 띤 표면에 증착되었다. 무작위적으로 배열된 DNA 분자의 정렬 방향을 알 수 있었으며, 온전한 분자가 아닌 중간이 끊어진 DNA 분자의 경우에도 해당 절편의 위치 정보를 알 수 있었다.

실험예 2. 형광 단백질-DNA 결합 단백질의 최적 농도 확인

다양한 농도의 H-NS-mCherry(1, 2, 4, 8 또는 16 nM) 및 BRCA1-eGFP(0, 10 또는 20 nM)를 혼합하여 DNA 서열 분석용 조성물을 제조하고, 상기 실험예 1의 방법으로 PDMS 마이크로채널을 이용하여 λ DNA를 시각화하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 각 형광 단백질-DNA 결합 단백질의 농도에 따라 염색된 DNA 색상 패턴이 상이하였다.

보다 구체적으로, 1 nM H-NS-mCherry 및 20 nM BRCA1-eGFP를 사용한 경우 완전한 녹색 DNA 분자를 생성하였으나, 이와 대조적으로, 16 nM H-NS-mCherry 및 10 nM BRCA-eGFP를 사용한 경우 완전한 적색 DNA 분자를 생성하였다. 4 nM H-NS-mCherry 및 20 nM BRCA1-eGFP의 비율에서 최적 농도 비율을 나타냈다(cc 값이 0.91, 교차-상관 계수(이하, cc)는 하기 식을 이용하여 계산하였다.).

(

= 샘플의 개수,

= 각 지점에서의 값,

= 샘플 평균)

한편, H-NS-mCherry만 사용한 경우 4 nM 이하에서 염기서열(A/T)-특이적인 색상 패턴을 생성하였다. 이러한 결과는, H-NS-mCherry가 A/T-풍부 부위를 염색하고 BRCA1-eGFP가 H-NS-mCherry가 염색하지 않은 DNA 부분을 보완적으로 염색하는 것을 시사한다.

실험예 3. 형광 단백질-DNA 결합 단백질의 다양한 조합 확인

mCherry 및 eGFP의 형광 단백질을 기반으로, 다양한 조합의 형광 단백질-DNA 결합 단백질(H-NS-mCherry, BRCA1-eGFP, 2HMG-mCherry, 2(KW)₂-mCherry, 2(KW)₂-eGFP, 2HMG-eGFP)을 혼합하여 DNA 서열 분석용 조성물을 제조하고, 상기 실험예 1의 방법으로 양전하로 개질된 유리 표면을 이용하여 λ DNA를 시각화하였다.

도 3a 및 3b에서 확인할 수 있듯이, 6 가지 조합 중 4 가지(ⅰ, ⅱ, ⅲ 및 ⅳ)가 A/T-특이적

게놈 패턴을 생성하였다. 반면, DNA 결합 단백질을 모두 A/T-특이적 DNA 결합 단백질(H-NS 및 2HMG)로 사용한 경우(ⅴ) 무작위 패턴(cc=0.61)을 생성하였고, 모두 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질(BRCA1 및 2(KW)₂)로 사용한 경우(ⅵ) 또한 무작위 패턴(cc=0.59)을 생성하였다.

실험예 4. 짧은 DNA 단편 수준에서 DNA 염색 확인

상기 실시예 결과들을 참조하여, 추가적으로 본 발명의 조성물을 박테리아에 감염되는 박테리오파지 M13 및 마우스에 감염되는 레트로바이러스인 MLV(murine leukemia virus)와 같이 짧은 DNA 단편에도 사용 가능한지 확인하였다.

보다 구체적으로, M13 파지 게놈은 프라이머(GGAAACCGAGGA AACGCAATA ATAACGGAATACCC)를 사용하여 Top 중합효소 반응에 의해 단일 가닥의 원형 DNA로부터 이중 가닥 M13mp18을 합성하였다. 중합효소 반응 후, PstI로 선형화시켰다. 마우스의 백혈병 바이러스 게놈으로부터 이중 가닥의 레트로바이러스 게놈 DNA를 합성하였다. 반응 후, 원형 dsDNA는 BmtI에 의해 선형화시켰다.

8 nM H-NS-mCherry 50 μL 및 40 nM BRCA1-eGFP 50 μL를 1:1 비율로 혼합된 DNA 서열 분석용 조성물을 이용하여, 상기 실험예 1의 방법으로 각 바이러스 DNA를 시각화하였다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 선형화된 DNA 분자는 2색으로 염색되어 게놈 특유의 패턴을 생성하였다. 이러한 이미지 패턴을 기반으로 MLV DNA 및 M13 DNA를 구별할 수 있음을 확인하였다.

소결

상기 내용을 종합한 결과, 본 발명의 조성물은 보색 관계의 2색의 융합 단백질 조합을 사용하여 DNA의 AT-풍부 지역을 특이적으로 염색하고, DNA에 결합 시 DNA 백본(backbone)에서 AT-풍부 서열 특이적인 형광 강도 패턴을 보임을 알 수 있었다. 이러한 서열 특이적 패턴을 이용하면 전체 서열이 제공될 경우, 염색된 DNA의 현미경 이미지로부터 DNA 서열을 결정할 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 거대 단일 DNA 분자를 고속 및 고효율로 분석하기 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

<110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> Composition of Fluorescent proteins for analyzing DNA sequences and method for analyzing DNA sequences using the same <130> PN180309 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-HNS <400> 1 acttcacata tgatgagcga agcacttaaa attctg 36 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-HNS <400> 2 gccaccagaa ccaccttgct tgatcaggaa atcgtcg 37 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3-mCherry <400> 3 caagcaaggt ggttctggtg gcatggtgag caagggcgag gag 43 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4-mCherry <400> 4 atttcaggat ccctacttgt acagctcgtc catgcc 36 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5-BRCA <400> 5 tatgcacata tggtagagag taatattgaa gacaaaatat ttggg 45 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P6-BRCA <400> 6 gctcaccata ccgccgctgc caccttttgg ccctctgttt ctacctag 48 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7-eGFP <400> 7 ggtggcagcg gcggtatggt gagcaagggc gaggag 36 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P8-eGFP <400> 8 tatgcaggat ccttacgcct tgtacagctc gtccatg 37 <210> 9 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P9-HMG-mCherry <400> 9 atattgcata tgaccccgaa acgcccgcgc ggccgcccga aaaaaggcgg cagcggcggc 60 atggtgagca agggcgagga g 81 <210> 10 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-HMG-mCherry <400> 10 atattgggat ccttagccgc cgctgccgcc ttttttcggg cggccgcgcg ggcgtttcgg 60 ggtcttgtac agctcgtcca tgcc 84 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P11-(KW)2-mCherry <400> 11 atgttgcata tgaaatggaa atggaaaaaa gcgatggtga gcaagggcga ggag 54 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P12-(KW)2-mCherry <400> 12 atgttgggat ccttatttcc atttccattt tttcgccttg tacagctcgt ccatgcc 57 <210> 13 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P13-(KW)2-eGFP <400> 13 atgttgcata tgaaatggaa atggaaaaaa gcgatgcgtg agcaagggcg aggagc 56 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P14-(KW)2-eGFP <400> 14 atgttgggat ccttatttcc atttccattt tttcgccttg tacagctcgt ccatgcc 57 <210> 15 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P15-HMG-eGFP <400> 15 atattgcata tgaccccgaa acgcccgcgc ggccgcccga aaaaaggcgg cagcggcggc 60 atgcgtgagc aagggcgagg agc 83 <210> 16 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P16-HMG-eGFP <400> 16 atattgggat ccttagccgc cgctgccgcc ttttttcggg cggccgcgcg ggcgtttcgg 60 ggtcttgtac agctcgtcca tgcc 84 <210> 17 <211> 139 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> histone-like nucleoid-structuring <400> 17 His Met Met Ser Glu Ala Leu Lys Ile Leu Asn Asn Ile Arg Thr Leu 1 5 10 15 Arg Ala Gln Ala Arg Glu Cys Thr Leu Glu Thr Leu Glu Glu Met Leu 20 25 30 Glu Lys Leu Glu Val Val Val Asn Glu Arg Arg Glu Glu Glu Ser Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Glu Val Glu Glu Arg Thr Arg Lys Leu Gln Gln Tyr Arg 50 55 60 Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Ile Asp Pro Asn Glu Leu Leu Asn Ser 65 70 75 80 Leu Ala Ala Val Lys Ser Gly Thr Lys Ala Lys Arg Ala Gln Arg Pro 85 90 95 Ala Lys Tyr Ser Tyr Val Asp Glu Asn Gly Glu Thr Lys Thr Trp Thr 100 105 110 Gly Gln Gly Arg Thr Pro Ala Val Ile Lys Lys Ala Met Asp Glu Gln 115 120 125 Gly Lys Ser Leu Asp Asp Phe Leu Ile Lys Gln 130 135 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> high mobility group <400> 18 Thr Pro Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Lys Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 628 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> breast cancer 1 <400> 19 Val Glu Ser Asn Ile Glu Asp Lys Ile Phe Gly Lys Thr Tyr Arg Lys 1 5 10 15 Lys Ala Ser Leu Pro Asn Leu Ser His Val Thr Glu Asn Leu Ile Ile 20 25 30 Gly Ala Phe Val Thr Glu Pro Gln Ile Ile Gln Glu Arg Pro Leu Thr 35 40 45 Asn Lys Leu Lys Arg Lys Arg Arg Pro Thr Ser Gly Leu His Pro Glu 50 55 60 Asp Phe Ile Lys Lys Ala Asp Leu Ala Val Gln Lys Thr Pro Glu Met 65 70 75 80 Ile Asn Gln Gly Thr Asn Gln Thr Glu Gln Asn Gly Gln Val Met Asn 85 90 95 Ile Thr Asn Ser Gly His Glu Asn Lys Thr Lys Gly Asp Ser Ile Gln 100 105 110 Asn Glu Lys Asn Pro Asn Pro Ile Glu Ser Leu Glu Lys Glu Ser Ala 115 120 125 Phe Lys Thr Lys Ala Glu Pro Ile Ser Ser Ser Ile Ser Asn Met Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Asn Ile His Asn Ser Lys Ala Pro Lys Lys Asn Arg Leu 145 150 155 160 Arg Arg Lys Ser Ser Thr Arg His Ile His Ala Leu Glu Leu Val Val 165 170 175 Ser Arg Asn Leu Ser Pro Pro Asn Cys Thr Glu Leu Gln Ile Asp Ser 180 185 190 Cys Ser Ser Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys Lys Tyr Asn Gln Met Pro 195 200 205 Val Arg His Ser Arg Asn Leu Gln Leu Met Glu Gly Lys Glu Pro Ala 210 215 220 Thr Gly Ala Lys Lys Ser Asn Lys Pro Asn Glu Gln Thr Ser Lys Arg 225 230 235 240 His Asp Ser Asp Thr Phe Pro Glu Leu Lys Leu Thr Asn Ala Pro Gly 245 250 255 Ser Phe Thr Lys Cys Ser Asn Thr Ser Glu Leu Lys Glu Phe Val Asn 260 265 270 Pro Ser Leu Pro Arg Glu Glu Lys Glu Glu Lys Leu Glu Thr Val Lys 275 280 285 Val Ser Asn Asn Ala Glu Asp Pro Lys Asp Leu Met Leu Ser Gly Glu 290 295 300 Arg Val Leu Gln Thr Glu Arg Ser Val Glu Ser Ser Ser Ile Ser Leu 305 310 315 320 Val Pro Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ser Leu Leu Glu 325 330 335 Val Ser Thr Leu Gly Lys Ala Lys Thr Glu Pro Asn Lys Cys Val Ser 340 345 350 Gln Cys Ala Ala Phe Glu Asn Pro Lys Gly Leu Ile His Gly Cys Ser 355 360 365 Lys Asp Asn Arg Asn Asp Thr Glu Gly Phe Lys Tyr Pro Leu Gly His 370 375 380 Glu Val Asn His Ser Arg Glu Thr Ser Ile Glu Met Glu Glu Ser Glu 385 390 395 400 Leu Asp Ala Gln Tyr Leu Gln Asn Thr Phe Lys Val Ser Lys Arg Gln 405 410 415 Ser Phe Ala Pro Phe Ser Asn Pro Gly Asn Ala Glu Glu Glu Cys Ala 420 425 430 Thr Phe Ser Ala His Ser Gly Ser Leu Lys Lys Gln Ser Pro Lys Val 435 440 445 Thr Phe Glu Cys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Gln Gly Lys Asn Glu Ser 450 455 460 Asn Ile Lys Pro Val Gln Thr Val Asn Ile Thr Ala Gly Phe Pro Val 465 470 475 480 Val Gly Gln Lys Asp Lys Pro Val Asp Asn Ala Lys Cys Ser Ile Lys 485 490 495 Gly Gly Ser Arg Phe Cys Leu Ser Ser Gln Phe Arg Gly Asn Glu Thr 500 505 510 Gly Leu Ile Thr Pro Asn Lys His Gly Leu Leu Gln Asn Pro Tyr Arg 515 520 525 Ile Pro Pro Leu Phe Pro Ile Lys Ser Phe Val Lys Thr Lys Cys Lys 530 535 540 Lys Asn Leu Leu Glu Glu Asn Phe Glu Glu His Ser Met Ser Pro Glu 545 550 555 560 Arg Glu Met Gly Asn Glu Asn Ile Pro Ser Thr Val Ser Thr Ile Ser 565 570 575 Arg Asn Asn Ile Arg Glu Asn Val Phe Lys Glu Ala Ser Ser Ser Asn 580 585 590 Ile Asn Glu Val Gly Ser Ser Thr Asn Glu Val Gly Ser Ser Ile Asn 595 600 605 Glu Ile Gly Ser Ser Asp Glu Asn Ile Gln Ala Glu Leu Gly Arg Asn 610 615 620 Arg Gly Pro Lys 625

Claims

제1 형광 단백질이 결합된 A/T(아데닌/티민)-특이적 DNA 결합 단백질; 및
제2 형광 단백질이 결합된 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질을 포함하는 DNA 서열 분석용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질은 서로 다른 색을 나타내는 것인, DNA 서열 분석용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 형광 단백질은 mCherry인 것인, DNA 서열 분석용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제2 형광 단백질은 eGFP(enhanced Green fluorescent protein)인 것인, DNA 서열 분석용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 A/T-특이적 DNA 결합 단백질은 히스톤-유사 뉴클레오이드-구조(histone-like nucleoid-structuring; H-NS) 단백질 또는 고 이동성 그룹(high mobility group; HMG)인 것인, DNA 서열 분석용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 A/T-비특이적 DNA 결합 단백질은 BRCA1(breast cancer 1) 단백질 또는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 단백질로서,
(XY)_n [화학식 1],
상기 X 및 Y는 각각 독립적으로 라이신(K), 트립토판(W) 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산이고,
상기 n은 1 내지 5의 정수인 것인, DNA 서열 분석용 조성물.
시료에 제 1 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 DNA 서열 분석 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 방법은 분석 대상의 전체 게놈(Genome) A/T(아데닌/티민) 프리퀀시(Frequency)와 상기 조성물을 처리한 시료의 A/T 프리퀀시를 비교하는 단계를 더 포함하는 것인, DNA 서열 분석 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 시료는 단일 DNA 분자(Single DNA molecule)인 것인, DNA 서열 분석 방법.