KR20200041368A - 하이드롤라제 검출용 bret 센서 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플에서 하이드롤라제, 예컨대, 포스파타제, 글리코시다제, 에스터라제, 엑소펩티다제 및 리파제를 검출하기 위한 센서 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 식품, 음료 및 임상 샘플에서 하이드롤라제를 검출하기 위한 센서 및 방법에 관한 것이다. 이러한 센서 및 방법은 샘플에 존재하는 하이드롤라제의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 샘플에서 하이드롤라제, 예컨대, 포스파타제, 글리코시다제, 에스터라제, 엑소펩티다제 및 리파제를 검출하기 위한 센서 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 식품, 음료 및 임상 샘플에서 하이드롤라제를 검출하기 위한 센서 및 방법에 관한 것이다. 이러한 센서 및 방법은 샘플에 존재하는 하이드롤라제의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다.
하이드롤라제는 생물체의 모든 도메인들에서 발견되는 효소 부류이다. 이들의 역할은 다양하며, 예를 들어, 하이드롤라제는 바이오매스의 분해, 방어, 발병기전 및 정상적인 세포 기능에 관여한다. 하이드롤라제의 활성을 결정하기 위한 검정법은 식품, 임상 및 진단 세팅에서 일상적으로 사용된다. 이들 검정법은 종종, 분광광도(spectrophotometric), 전류측정(amperometric), 비색(colorimetric) 또는 형광 검출에 의존한다. 그러나, 보다 전통적인 검정법 포맷에 대한 단순하며, 민감하고/하거나 비용-효과적인 대안을 제공하는 검정법에 대한 필요성이 커지고 있다. 또한 고속 대량 스크리닝(high throughput screening)에 적합한 재현 가능한 검정법에 대한 필요성이 존재한다. 광범위하게 다양한 가수분해적 효소, 예컨대, 포스파타제, 글리코시다제, 에스터라제, 엑소펩티다제 및 리파제의 수준을 검출하고 측정하는 데 사용될 수 있는 센서 및 검정법이 특히 관심 대상이다.
본 발명자들은 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 데 사용될 수 있는 센서 분자를 식별하였다. 본 발명자들은 또한 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법을 식별하였다.
일 양태에서, 하이드롤라제를 검출하기 위한 센서 분자가 제공되며, 상기 센서 분자는
R1-L-R2-B
(I), 또는
B-R2-L-R1
(II)
로부터 선택되는 일반식을 가지고,
식 중,
R1은 생물발광 단백질이고;
L은 연결 요소이며;
R2는 비-단백질 수용체 도메인이고;
B는 차단기이며,
여기서 B에 결합된 R2는 가수분해성 결합을 포함하고, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 가수분해는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)의 변화를 생성한다.
일 구현예에서, 비-단백질 수용체 도메인은 비-단백질 형광 수용체 도메인이다.
일부 구현예에서, 차단기는 수용체 도메인을 비-형광 상태에서 안정화시킨다. 일부 구현예에서, 차단기는 수용체 도메인을 낮은 형광 상태에서 안정화시킨다.
일부 구현예에서, B는 포스페이트 함유 모이어티, 당 함유 모이어티, 아미노산 함유 모이어티, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 에스테르 또는 에테르를 포함한다.
일부 구현예에서, 연결 요소는 알킬 쇄, 글리콜, 에테르, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리에스테르, 펩타이드, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, R1-L 또는 L-R1은 단일 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 시스테인 잔기 및/또는 라이신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, R2는 시스테인 잔기를 통해 연결 요소에 부착된다.
일부 구현예에서, R2는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료, 보디피(Bodipy) 염료, Cy 염료, 플루오레세인, 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone), 형광 미소구체, 발광 미소구체, 형광 나노결정, 마리나 블루(Marina Blue), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이드 옐로우(Cascade Yellow), 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 오레곤 그린(Oregon Green), 테트라메틸로다민, 로다민, 쿠마린, 보디피(BODIPY), 레조루핀(resorufin), 텍사스 레드(Texas Red), 희토류 원소 킬레이트, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 생물발광 단백질 R1은 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 또는 β-글루코시다제로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R1은 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 반딧불이(Firefly) 루시퍼라제, 강장동물(Coelenterate) 루시퍼라제, 북미 글로웜(North American glow worm) 루시퍼라제, 방아벌레(click beetle) 루시퍼라제, 철도 벌레(railroad worm) 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 가우시아(Gaussia) 루시퍼라제, 애큐오린(Aequorin), 아라크노캄파(Arachnocampa) 루시퍼라제, 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 키메라의 생물학적 활성 변이체 또는 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 생물발광 단백질, R1은 기질을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 기질은 루시페린, 칼슘, 코엘렌테라진(coelenterazine), 또는 코엘렌테라진의 유도체 또는 유사체이다.
일부 구현예에서, 하이드롤라제는 에스터라제, 리파제, 프로테아제, 포스파타제, 뉴클레아제, 글리코시다제, DNA 글리코실라제 및 산 무수물 하이드롤라제이다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 에스터라제이다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 포스파타제이다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 리파제이다.
일부 구현예에서, R1은 RLuc8을 포함하며, L은 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드이고, B에 결합된 R2는 플루오레세인 디아세테이트이다. 이러한 구현예에서, B에 결합된 R2는 말레아미드 연결기를 통해 시스테인에 부착되며, L은 28개의 아미노산을 포함하고, L-R1은 단일 폴리펩타이드이다. 이러한 센서는 에스터라제 센서로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하이드롤라제의 존재 및/또는 부재 하에 R1 및 R2의 분리 및 상대 배향은 푀르스터 거리(
distance)의 ± 50% 내이다. 일부 구현예에서, R1과 R2의 푀르스터 거리는 적어도 4.0 nm이다. 일부 구현예에서, R1과 R2의 푀르스터 거리는 적어도 5.6 nm이다. 일부 구현예에서, R1과 R2의 푀르스터 거리는 약 4.0 nm 내지 약 10 nm이다. 일부 구현예에서, R1과 R2의 푀르스터 거리는 약 5.6 nm 내지 약 10 nm이다.
또 다른 양태에서, 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
i) 샘플을 본원에 정의된 센서 분자와 접촉시키는 단계; 및
ii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재에 상응하는, 단계
를 포함한다.
또 다른 양태에서, 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
i) 샘플을, 구조 B-R2를 갖는 차단된 비-단백질 수용체 도메인과 접촉시켜, 처리된 샘플을 형성하는 단계;
ii) L로의 R2의 부착을 야기하는 조건 하에, 처리된 샘플을 화학식 R1-L 또는 L-R1의 화합물과 접촉시키는 단계; 및
iii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재, 및 화학식 R1-L-R2 또는 R2-L-R1의 화합물의 형성에 상응하는, 단계
를 포함하고,
R1은 생물발광 단백질이고;
L은 연결 요소이며;
R2는 비-단백질 수용체 도메인이고;
B는 차단기이고, B에 결합된 R2는 가수분해성 결합을 포함한다.
일 구현예에서, 비-단백질 수용체 도메인 R2는 비-단백질 형광 수용체 도메인이다.
일부 구현예에서, R2는 시스테인 특이적인 친전자체 또는 아민 특이적인 친전자체를 포함한다. 일부 구현예에서, L은 시스테인 및/또는 라이신 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 정의된 방법은 샘플에서 하이드롤라제의 농도 및/또는 활성을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 정의된 방법은 미세유체 장치 상에서 수행된다.
일부 구현예에서, 샘플은 공기, 액체, 생물학적 물질 및 토양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 임의의 적합한 생물학적 물질, 예컨대, (비제한적으로) 밀크, 혈액, 혈청, 가래, 점액, 고름, 소변, 땀, 대변, 눈물 또는 복막액일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 밀크, 혈액, 혈청, 가래, 점액, 고름 및 복막액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 수용액에서 고형 농산물(solid agricultural), 식품 또는 다른 물질을 세척하거나, 침지시키거나, 분쇄하거나 침연시키고, 액체상을 사용함으로써 수득되는 현탁액 또는 추출물일 수 있다. 액체상은 침강, 여과 또는 원심분리에 의해 정화될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상응하는 천연 발생 단백질과 비교한 경우, 적어도 하나 더 적은 시스테인 잔기를 포함하는 변이형 생물발광 단백질이 제공된다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc(SEQ ID NO: 49)의 아미노산 번호 24, 73 및/또는 124에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 24 RLuc의 아미노산 번호에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 73 RLuc의 아미노산 번호에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 124 RLuc의 아미노산 번호에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc8의 아미노산 번호 24 및/또는 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc8(SEQ ID NO: 50)의 위치 24 또는 위치 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc8(SEQ ID NO: 50)의 위치 24 및 위치 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc2(SEQ ID NO: 51)의 아미노산 번호 24, 73 및/또는 124에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 정의된 변이형 생물발광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 정의된 변이형 생물발광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 정의된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질을 생성하는 프로세스가 제공되며, 상기 프로세스는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 본원에 정의된 숙주 세포 또는 본원에 정의된 벡터를 배양하는 단계, 및 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 센서 분자가 제공되며, 여기서 R1은 본원에 정의된 바와 같은 변이형 생물발광 단백질이다.
본원의 임의의 구현예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 임의의 다른 구현예에 준용되도록 적용되어야 한다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 이는 단지 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로-동등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 분명히 본 발명의 범위 내에 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일한 단계, 물질의 조성, 단계들의 그룹, 또는 물질의 조성들의 그룹은 하나 또는 복수(즉, 하나 이상)의 이들 단계, 물질의 조성, 단계들의 그룹, 또는 물질의 조성들의 그룹을 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 그리고 첨부 도면을 참조로 하여 이하에 설명된다.
도 1 - 본원에 정의된 바와 같은 하이드롤라제를 검출하기 위한 예시적인 센서 분자이다. 예시된 구현예에서, 생물발광 단백질, R1은 연결 요소, L에 의해 비-단백질 수용체 도메인, R2에 연결되고, 이의 형광은 아세테이트 차단기, B에 의해 조절된다. 예시된 구현예에서, 차단기, B는 에스터라제에 의해 제거되어, 비-단백질 수용체 도메인의 형광을 복구하고 BRET가 발생하게 한다.
도 2 - 마이클(Michael) 수용체, 예컨대, 말레이미드, 아크릴아미드 및 페닐카보닐아크릴아미드를 사용하는 시스테인 특이적인 표지화 전략의 예이다.
도 3a 내지 도 3b - 내부 RLuc8 표지화를 최소화하기 위한 표지화 조건의 최적화이다. 5 μM R1-L(연결 요소를 갖는 RLuc8)을 4℃에서 50 mM MES 완충제, pH 5.0 중 4 당량의 플루오레세인-5-말레이미드(20 μM)와 함께 인큐베이션하고, 반응을 플루오레세인-5-말레이미드의 첨가 전에, 그리고 플루오레세인-5-말레이미드의 첨가 후 6, 15, 30 및 60분째에 BRET을 사용하여 모니터링하였다. (도 3a) wt-RLuc8(SEQ ID NO: 1); (도 3b) RLuc8Cys1(SEQ ID NO: 2).
도 4a 내지 도 4b - (도 4a) 예시적인 센서 분자(RLuc8Cys2-플루오레세인-디아세테이트)(실선), 및 37℃에서 30분 동안 에스터라제(0.8 U)와 함께 인큐베이션한 후의 센서 분자에 대한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)의 비교이다. (도 4b) 예시적인 센서 분자(실선) 및 비차단된 센서 분자(RLuc8Cys2-플루오레세인)에 대한 BRET의 비교이다.
도 5 - pH 7.0, 7.5 및 8.0에서 RLuc8Cys1-FM 컨쥬게이트(50 mM HEPES, 50 mM NaCl 중 1 μM 컨쥬게이트)에 대한 BRET 비의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3).
도 6a 내지 도 6b - (도 6a) 위치 1(R1과 R2 사이에서 1개의 아미노산, SEQ ID NO: 2), 2(R1과 R2 사이에서 11개의 아미노산, SEQ ID NO: 3) 또는 3(R1과 R2 사이에서 21개의 아미노산, SEQ ID NO: 4) 중 하나에서 RLuc8의 N-말단 펩타이드 연결 요소 상에서의 단일 시스테인 잔기의 도입이며; (도 6b) 1 μM의 센서 분자의 BRET 비이다(평균 ± S. D., n = 6).
도 7a 내지 도 7c - (도 7a) 플루오레세인-말레이미드로 표지된 RLuc8Cys1, RLuc8Cys2, RLuc8Cys3, RLuc8Cys4, RLuc8Cys5 및 MBP(K239C)RLuc8에 대한 BRET의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3). (도 7b) 플루오레세인-말레이미드(FM) 또는 로다민 레드 C2 말레이미드(RM)로 표지된 RLuc8Cys1, RLuc8Cys2, RLuc8Cys3, RLuc8Cys4, RLuc8Cys5 및 MBP(K239C)RLuc8에 대한 BRET의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3). (도 7c) 플루오레세인-말레이미드로 표지된 RLuc8Cys1, RLuc8Cys2, RLuc8Cys3, RLuc8Cys4, RLuc8Cys5 및 MBP(K239C)RLuc8에 대한 BRET2 비의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3).
도 8 - pH 7.0 및 25℃에서 에스터라제 활성을 검출하고 측정하기 위한, 예시적인 센서 분자, RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트, RLuc8Cys3-플루오레세인-디아세테이트 및 RLuc8Cys2-플루오레세인-디아세테이트의 용도이다.
도 9a 내지 도 9c - 30℃(도 9a), 25℃(도 9b) 또는 20℃(도 9c)에서 에스터라제 활성을 검출하고 측정하기 위한, 예시적인 센서 분자(RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트)의 용도이다.
도 10a 내지 도 10b - 본 개시내용의 구현예에 따라 하이드롤라제를 검출하는 방법이다. (도 10a) 이러한 구현예에서, 소분자 수용체는 하이드롤라제와 접촉하기 전에 BRET 공여체에 공유 부착된다. (도 10b) 이러한 구현예에서, 소분자 수용체, R2는 검출을 위해 BRET 공여체에 공유 부착되기 전에 하이드롤라제에 의해 사전-활성화된다.
서열 목록에 대한 기호표
SEQ ID NO: 1 - wt-RLuc8(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 2 - RLuc8Cys1(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 3 - RLuc8Cys2(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 4 - RLuc8Cys3(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 5 내지 7 - 연결 요소 서열.
SEQ ID NO: 8 - wt-RLuc8(C24X).
SEQ ID NO: 9 - wt-RLuc8(C73Z).
SEQ ID NO: 10 - wt-RLuc8(C24X.C73Z).
SEQ ID NO: 11 - wt-RLuc8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 12 - RLuc8Cys1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 13 - RLuc8Cys2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 14 - RLuc8Cys3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 15 내지 20 - 프라이머 서열.
SEQ ID NO: 21 내지 22 - mTG에 대한 고 친화성 기질.
SEQ ID NO: 23 - 소르타제(Sortase) 인지 서열.
SEQ ID NO: 24 내지 30 - 스페이서 서열.
SEQ ID NO: 31 - mTG에 대한 고 친화성 기질.
SEQ ID NO: 32 - RLuc8Cys4(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 33 - RLuc8Cys5(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 34 - MBP(K239C)RLuc8(MBP(K239C)를 포함하는 N-말단 연결 요소 및 RLuc8을 포함함).
SEQ ID NO: 35 - RLuc8Cys4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 36 - RLuc8Cys5를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 37 - MBP(K239C)RLuc8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 38 내지 43 - 프라이머 서열.
SEQ ID NO: 44 내지 48 - 시스테인 잔기를 함유하는 연결 요소.
SEQ ID NO: 49 - RLuc의 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 50 - RLuc8의 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 51 - RLuc2의 아미노산 서열.
도 2 - 마이클(Michael) 수용체, 예컨대, 말레이미드, 아크릴아미드 및 페닐카보닐아크릴아미드를 사용하는 시스테인 특이적인 표지화 전략의 예이다.
도 3a 내지 도 3b - 내부 RLuc8 표지화를 최소화하기 위한 표지화 조건의 최적화이다. 5 μM R1-L(연결 요소를 갖는 RLuc8)을 4℃에서 50 mM MES 완충제, pH 5.0 중 4 당량의 플루오레세인-5-말레이미드(20 μM)와 함께 인큐베이션하고, 반응을 플루오레세인-5-말레이미드의 첨가 전에, 그리고 플루오레세인-5-말레이미드의 첨가 후 6, 15, 30 및 60분째에 BRET을 사용하여 모니터링하였다. (도 3a) wt-RLuc8(SEQ ID NO: 1); (도 3b) RLuc8Cys1(SEQ ID NO: 2).
도 4a 내지 도 4b - (도 4a) 예시적인 센서 분자(RLuc8Cys2-플루오레세인-디아세테이트)(실선), 및 37℃에서 30분 동안 에스터라제(0.8 U)와 함께 인큐베이션한 후의 센서 분자에 대한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)의 비교이다. (도 4b) 예시적인 센서 분자(실선) 및 비차단된 센서 분자(RLuc8Cys2-플루오레세인)에 대한 BRET의 비교이다.
도 5 - pH 7.0, 7.5 및 8.0에서 RLuc8Cys1-FM 컨쥬게이트(50 mM HEPES, 50 mM NaCl 중 1 μM 컨쥬게이트)에 대한 BRET 비의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3).
도 6a 내지 도 6b - (도 6a) 위치 1(R1과 R2 사이에서 1개의 아미노산, SEQ ID NO: 2), 2(R1과 R2 사이에서 11개의 아미노산, SEQ ID NO: 3) 또는 3(R1과 R2 사이에서 21개의 아미노산, SEQ ID NO: 4) 중 하나에서 RLuc8의 N-말단 펩타이드 연결 요소 상에서의 단일 시스테인 잔기의 도입이며; (도 6b) 1 μM의 센서 분자의 BRET 비이다(평균 ± S. D., n = 6).
도 7a 내지 도 7c - (도 7a) 플루오레세인-말레이미드로 표지된 RLuc8Cys1, RLuc8Cys2, RLuc8Cys3, RLuc8Cys4, RLuc8Cys5 및 MBP(K239C)RLuc8에 대한 BRET의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3). (도 7b) 플루오레세인-말레이미드(FM) 또는 로다민 레드 C2 말레이미드(RM)로 표지된 RLuc8Cys1, RLuc8Cys2, RLuc8Cys3, RLuc8Cys4, RLuc8Cys5 및 MBP(K239C)RLuc8에 대한 BRET의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3). (도 7c) 플루오레세인-말레이미드로 표지된 RLuc8Cys1, RLuc8Cys2, RLuc8Cys3, RLuc8Cys4, RLuc8Cys5 및 MBP(K239C)RLuc8에 대한 BRET2 비의 비교이다(평균 ± S. D., n = 3).
도 8 - pH 7.0 및 25℃에서 에스터라제 활성을 검출하고 측정하기 위한, 예시적인 센서 분자, RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트, RLuc8Cys3-플루오레세인-디아세테이트 및 RLuc8Cys2-플루오레세인-디아세테이트의 용도이다.
도 9a 내지 도 9c - 30℃(도 9a), 25℃(도 9b) 또는 20℃(도 9c)에서 에스터라제 활성을 검출하고 측정하기 위한, 예시적인 센서 분자(RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트)의 용도이다.
도 10a 내지 도 10b - 본 개시내용의 구현예에 따라 하이드롤라제를 검출하는 방법이다. (도 10a) 이러한 구현예에서, 소분자 수용체는 하이드롤라제와 접촉하기 전에 BRET 공여체에 공유 부착된다. (도 10b) 이러한 구현예에서, 소분자 수용체, R2는 검출을 위해 BRET 공여체에 공유 부착되기 전에 하이드롤라제에 의해 사전-활성화된다.
서열 목록에 대한 기호표
SEQ ID NO: 1 - wt-RLuc8(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 2 - RLuc8Cys1(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 3 - RLuc8Cys2(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 4 - RLuc8Cys3(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 5 내지 7 - 연결 요소 서열.
SEQ ID NO: 8 - wt-RLuc8(C24X).
SEQ ID NO: 9 - wt-RLuc8(C73Z).
SEQ ID NO: 10 - wt-RLuc8(C24X.C73Z).
SEQ ID NO: 11 - wt-RLuc8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 12 - RLuc8Cys1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 13 - RLuc8Cys2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 14 - RLuc8Cys3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 15 내지 20 - 프라이머 서열.
SEQ ID NO: 21 내지 22 - mTG에 대한 고 친화성 기질.
SEQ ID NO: 23 - 소르타제(Sortase) 인지 서열.
SEQ ID NO: 24 내지 30 - 스페이서 서열.
SEQ ID NO: 31 - mTG에 대한 고 친화성 기질.
SEQ ID NO: 32 - RLuc8Cys4(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 33 - RLuc8Cys5(RLuc8 및 N-말단 연결 요소를 포함함).
SEQ ID NO: 34 - MBP(K239C)RLuc8(MBP(K239C)를 포함하는 N-말단 연결 요소 및 RLuc8을 포함함).
SEQ ID NO: 35 - RLuc8Cys4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 36 - RLuc8Cys5를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 37 - MBP(K239C)RLuc8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
SEQ ID NO: 38 내지 43 - 프라이머 서열.
SEQ ID NO: 44 내지 48 - 시스테인 잔기를 함유하는 연결 요소.
SEQ ID NO: 49 - RLuc의 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 50 - RLuc8의 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 51 - RLuc2의 아미노산 서열.
일반적인 기법 및 정의
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것(예를 들어, 세포 배양, BRET 기반 센서 기술, 바이오컨쥬게이션 기법, 단백질 화학, 생화학 등)과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명에서 이용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기법은 당업자에게 널리 공지된 표준 절차이다. 이러한 기법은 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트를 포함함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지의 모든 업데이트를 포함함)]와 같은 출처의 문헌 전체에 걸쳐 기재되고 설명되어 있다.
용어 "및/또는(and/or)", 예를 들어, "X 및/또는 Y(X and/or Y)"는 "X 및 Y(X and Y)" 또는 "X 또는 Y(X or Y)"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 둘 모두의 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명백한 뒷받침을 제공하도록 해석되어야 한다.
본원에 사용되는 용어 약(about)은, 반대로 언급되지 않는 경우, 지정된 값의 +/- 10%, 보다 바람직하게는 +/- 5%, 보다 더 바람직하게는 +/- 1%를 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 용어 "포함하다(comprise)", 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
센서
명세서 전체에 걸쳐, "센서" 및 "센서 분자"는 상호교환적으로 사용된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 하이드롤라제를 검출하기 위한 센서 분자를 제공하며, 상기 센서 분자는
R1-L-R2-B
(I), 또는
B-R2-L-R1
(II)
로부터 선택되는 일반식을 가지고,
식 중,
R1은 생물발광 단백질이고;
L은 연결 요소이며;
R2는 비-단백질 수용체 도메인이고;
B는 차단기이며,
여기서 B에 결합된 R2는 가수분해성 결합을 포함하고, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 가수분해는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)의 변화를 생성한다.
일부 구현예에서, R1-L 또는 L-R1은 단일 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, R1-L은 아미노산의 연속 스트레치이다. 다른 구현예에서, L-R1은 아미노산의 연속 스트레치이다. 예를 들어, 생물발광 단백질(R1) 및 연결 요소는 아미노산의 단일 스트레치, 예컨대, 비제한적으로, 연결 요소의 N-말단에 공유 부착된 생물발광 단백질, 또는 연결 요소의 C-말단에 공유 부착된 생물발광 단백질이다. 공유 부착은 펩타이드 결합이다. 예를 들어, R1-L 또는 L-R1은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 33으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 단일 폴리펩타이드는 또한 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 33 중 어느 하나 이상과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 R1-L 또는 L-R1을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 단리된 핵산이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 33 중 어느 하나 이상과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4 중 어느 하나 이상과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 본 발명의 센서를 인코딩하는 서열(또는 이의 일부) 외에도, 핵산 분자는 다른 서열, 예컨대, 프라이머 부위, 전사 인자 결합 부위, 벡터 삽입 부위, 및 핵산 분해에 저항하는 서열(예를 들어, 폴리아데노신 꼬리)을 함유할 수 있다. 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 폴리뉴클레오타이드가 본 발명의 단백질을 합성하기 위해 여전히 번역될 수 있는 경우, 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산은 벡터, 예컨대, 플라스미드의 일부를 형성한다. 상기 기재된 핵산 서열 외에도, 플라스미드는 다른 요소, 예컨대, 원핵생물 복제 기점(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) OR1 복제 기점), 자율 복제 서열, 동원체 서열; 핵산에 작동 가능하게 연결된, 숙주 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있는 프로모터 서열, 핵산 서열의 다운스트림에 위치한 종결자 서열, 항생제 내성 유전자 및/또는 분비 신호 서열을 함유할 수 있다. 자율 복제 서열을 포함하는 벡터는 또한 효모 인공 염색체이다. 일부 대안적인 구현예에서, 벡터는 바이러스, 예컨대, 박테리오파지이고, 본 발명의 핵산 서열 외에도, 박테리오파지의 복제를 위한 핵산 서열, 예컨대, 구조 단백질, 프로모터, 전사 활성자 등을 포함한다.
본 발명의 핵산 또는 벡터는 본 발명의 센서 또는 표적 서열을 합성하기 위해 숙주 세포를 형질감염시키거나 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대, 이. 콜라이, 및 진핵생물 세포, 예컨대, 효모 세포, 또는 포유동물 또는 식물 세포주를 포함한다. 숙주 세포는 당업계에 공지된 기법, 예컨대, 전기천공; 칼슘 포스페이트 기반 방법; 비올리스틱(biolistic) 기법을 사용하거나 바이러스 벡터를 사용함으로써 형질감염되거나 형질전환될 수 있다.
형질감염/형질전환 후, 본 발명의 핵산 또는 벡터는 필요에 따라 전사되고, 번역된다. 일부 구현예에서, 합성된 단백질은, 예를 들어, 벡터에서의 분비 신호의 존재로 인해 세포로부터 분비되거나, 숙주 세포의 용해 및 이로부터의 단백질의 정제에 의해 숙주 세포로부터 추출된다.
일부 구현예에서, 센서(또는 이의 일부, 예를 들어, R1-L 또는 L-R1)는 세포-비함유 조성물로서 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 비함유 조성물"은 존재할 경우, 온전한 세포를 거의 함유하지 않고, 센서를 포함하는 단리된 조성물을 지칭한다. 세포-비함유 조성물의 예는 단리되고/되거나 정제된 및/또는 재조합 센서 분자(예컨대, 단백질)를 함유하는 세포(예컨대, 효모 세포) 추출물 및 조성물을 포함한다. 세포로부터 세포-비함유 조성물을 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
차단기
본 발명의 센서에 있어서, "B"는 차단기를 지칭하고, R2에 결합된 B는 가수분해성 결합을 포함한다. B는, 가수분해성 결합이 온전한 경우 B에 결합된 R2의 형광 특성이, 가수분해성 결합이 절단되었을 경우 B에 결합된 R2의 형광 특성과 상이하도록, R2의 형광 특성을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 차단기 B는 수용체 도메인 R2를 형광 상태 A에서 안정화시킨다. 하이드롤라제에 의한 R2-B 또는 B-R2의 가수분해성 결합의 절단은 수용체 도메인 R2의 형광 상태를 형광 상태 A*로 변화시킨다. 형광 상태 A 및 형광 상태 A*는 상이해서, 가수분해성 결합의 절단은 BRET의 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, B는 B에 결합된 R2가, B가 없는 R2의 신호에 비해 감소된 신호를 갖도록 선택된다.
일부 구현예에서, 차단기 B는, 기질의 첨가 시 R2에 의해 방출되는 광의 강도가 형광 상태 A와 형광 상태 A* 사이에서 상이하고 가수분해성 결합의 절단이 BRET의 변화를 초래하도록 R2의 흡수 스펙트럼을 변화시킨다. 예를 들어, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 R2에 의해 방출되는 광의 강도를 증가시킬 수 있다. 이는 수용체 도메인이 ?처(quencher)이고 차단기가 수용체 도메인의 형광 특성을 변화시켜 상기 수용체 도메인이 더 이상 ?처로서 작용하지 않을 때 발생할 수 있다. 가수분해성 결합의 절단은 수용체 도메인이 ?처로 되돌아가게 하고 BRET의 감소를 초래한다. 대안적으로, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 R2에 의해 방출되는 광의 강도를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 차단기 B는 수용체 도메인 R2를 낮은-형광 상태에서 안정화시킨다. 일부 구현예에서, 차단기 B는 수용체 도메인 R2를 비-형광 상태에서 안정화시킨다. 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단 후, R2는 더 이상 낮은 또는 비-형광 상태로 존재하지 않는다. 결과적으로, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 검출되고/되거나 정량화될 수 있는 BRET의 변화를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, "낮은-형광 상태"는 높은-형광 상태의 형광 상태와 구분 가능한 형광 상태를 지칭한다. 예를 들어, 낮은-형광 상태는 B에 결합되지 않았을 때의 R2보다 적어도 20% 적은 형광, 적어도 30% 적은 형광, 적어도 40% 적은 형광, 적어도 50% 적은 형광, 적어도 60% 적은 형광, 적어도 70% 적은 형광, 적어도 80% 적은 형광, 적어도 90% 적은 형광, 적어도 95% 적은 형광, 적어도 98% 적은 형광 또는 적어도 99% 적은 형광일 수 있다. 일부 구현예에서, 낮은-형광 상태는 B에 결합되지 않았을 때의 R2보다 적어도 90% 적은 형광, 적어도 95% 적은 형광, 적어도 98% 적은 형광 또는 적어도 99% 적은 형광이다. 일부 구현예에서, 낮은-형광 상태는 B에 결합되지 않았을 때의 R2보다 20 내지 99%, 30 내지 99%, 40 내지 99%, 50 내지 99%, 60 내지 99%, 70 내지 99%, 80 내지 99% 또는 90 내지 99% 적은 형광이다. 일부 구현예에서, 낮은-형광 상태는 B에 결합되지 않았을 때의 R2보다 80 내지 99% 적은 형광, 85 내지 97% 적은 형광 또는 90 내지 95% 적은 형광이다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-형광 상태"는 백그라운드 노이즈(background noise) 수준의 100배, 백그라운드 노이즈 수준의 50배, 백그라운드 노이즈 수준의 20배, 백그라운드 노이즈 수준의 10배 또는 백그라운드 노이즈 수준의 5배인 형광 상태를 지칭한다. 예를 들어, "비-형광" 상태에서 형광단은 베이스라인 부근에서 여기 및 방출을 나타낼 수 있다. 당업자는 "비-형광 상태" 및 "낮은-형광 상태"가 상호 배제적이지 않음을 이해할 것이다.
낮은-형광 또는 비-형광 상태에서의 차단된 형광단은 또한 마스킹된(masked) 또는 잠재성(latent) 형광단으로서 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 차단기 B는, 흡수 스펙트럼의 피크 파장이 형광 상태 A와 형광 상태 A* 사이에서 상이하고 가수분해성 결합의 절단이 BRET의 변화를 초래하도록 R2의 흡수 스펙트럼을 변화시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 차단기 B는, R2가 여기 시 광을 거의 방출하지 않거나 전혀 방출하지 않도록 R2의 흡수 스펙트럼을 변화시킨다. 이들 구현예에서, R1과 R2 사이에 에너지 전달이 존재할 수 있으나, R2는 가수분해성 결합이 절단될 때까지 ?처로서 기능한다. 다시 말해, R1에 대한 기질의 존재 시, 비절단된 센서는 R2-B의 작용으로 인해 어둡다. 일단 가수분해성 결합이 하이드롤라제에 의해 절단되면, R2는 더 이상 ?처로서 기능하지 않고 여기 시 광을 방출한다. 결과적으로, R1에 대한 기질의 첨가 시, R2로부터의 형광 방출의 증가(및 BRET의 상응하는 변화)가 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 다른 구현예에서, 차단기 B는, R1의 방출 스펙트럼과의 중첩(overlap)이 전혀 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않고 R1과 R2 사이에서 에너지 전달이 전혀 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않도록, R2의 흡수 스펙트럼을 변화시킨다. 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단 후, R2의 형광 상태는, R2의 흡수 스펙트럼이 R1의 방출 스펙트럼과 (적어도 부분적으로) 중첩하고 R1과 R2 사이에서 에너지 전달이 존재하도록 변한다. 결과적으로, R1에 대한 기질의 첨가 시, R2로부터의 형광 방출의 증가(및 BRET의 상응하는 변화)가 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 차단기 B는, 방출 스펙트럼이 형광 상태 A와 형광 상태 A* 사이에서 상이하고 가수분해성 결합의 절단이 BRET의 변화를 초래하도록, R2의 방출 스펙트럼을 변화시킨다. 예를 들어, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 R2에 의해 방출되는 광의 강도를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 R2에 의해 방출되는 광의 강도를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 차단기 B는 수용체 도메인 R2를 낮은-형광 상태 또는 비-형광 상태에서 안정화시킨다. 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단 후, R2는 더 이상 낮은-형광 상태 또는 비-형광 상태로 존재하지 않는다. 결과적으로, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 BRET의 변화를 초래하고, 이러한 변화는 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본 개시내용에 따른 차단기 B는, BRET 쌍(pair)의 활성의 결과로서 방출된 에너지를 광 에너지로서 재-발광시키지 않으면서 수용함으로써 ?처로서 작용할 수 있고, BRET 쌍, R1 및 R2에 의해 방출되는 광의 강도를 감소시킨다. 이들 구현예에서, R1과 R2 사이에 그리고 R2와 B 사이에 에너지 전달이 존재할 수 있으나, B는 가수분해성 결합이 절단될 때까지 ?처로서 기능한다. 다시 말해, R1에 대한 기질의 존재 시, 센서는 B의 작용으로 인해 어둡다. 일단 가수분해성 결합이 하이드롤라제에 의해 절단되면, B는 제거되고, BRET 쌍은 여기 시 광을 방출한다. 결과적으로, R1에 대한 기질의 첨가 시, BRET의 변화는 검출되고/되거나 정량화될 수 있다.
B는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 차단기일 수 있고, 관심 하이드롤라제를 기반으로 당업자에 의해 선택될 수 있다. 적합한 차단기는 R2의 형광 특성을 조절할 수 있는 기이다. B, 또는 R2에 결합된 B는 하이드롤라제에 대한 기질을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, B는 가수분해성 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, B는 가수분해성 결합을 통해 R2에 부착된다.
본 개시내용의 맥락에서, B는 포스페이트 함유 모이어티, 당 함유 모이어티, 아미노산 함유 모이어티, 아미드 함유 모이어티, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 에스테르 또는 에테르를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 포스페이트 함유 모이어티, 당 함유 모이어티, 또는 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 포스페이트 함유 모이어티 또는 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 에스테르를 포함한다. 당업자는 차단기 B가 상기 중 하나 이상으로서 분류될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 포스페이트 함유 모이어티와 뉴클레오타이드 둘 모두이다.
일부 구현예에서, B는 포스페이트 함유 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, B는 하나 이상의 공유 결합된 포스페이트기를 포함하는 포스페이트 에스테르 모이어티를 포함한다. 예를 들어, B는 하기 구조를 갖는 포스페이트 에스테르 모이어티를 포함한다:
여기서, n은 1 내지 4의 정수이다. 일 세트의 구현예에서, B는 H2PO4-이다. 일례로서, B는 포스포에스테르 결합을 포함하거나 포스포에스테르 결합에 의해 R2에 부착된다. 이들 구현예에서, 센서는 포스파타제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
대안적인 구현예에서, B는 아미노산 함유 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, B는 (Xaa)n을 포함하며, 여기서 Xaa는 아미노산이고, n은 1 내지 10, 2 내지 9, 3 내지 7, 4 내지 6, 또는 5의 정수이다. 일부 구현예에서, B는 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하며, 예를 들어, B는 프로테아제에 대한 적어도 바람직한 P1-P1' 아미노산을 함유한다(문헌[Schechter and Berger, 1967; Schechter and Berger, 1968]). 이들 구현예에서, 센서는 프로테아제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
다른 구현예에서, B는 아미드 결합을 포함하거나 아미드 결합을 통해 R2에 부착된다. 예를 들어, B는 하기 구조들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
여기서, Ra는 (Xaa)n을 포함하며, 여기서 Xaa는 아미노산이고, n은 1 내지 10, 2 내지 9, 3 내지 7, 4 내지 6, 또는 5의 정수이다. 이들 구현예에서, 센서는 비-펩타이드 C-N 결합에 작용하는 프로테아제 또는 하이드롤라제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
다른 구현예에서, B는 당 함유 모이어티를 포함한다. 일례에서, B는 글리코시드 결합을 포함하거나 글리코시드 결합에 의해 R2에 부착된다. 본원에 사용된 바와 같이, 글리코시드 결합은 탄수화물(당) 분자를, 또 다른 탄수화물일 수 있거나 아닐 수 있는 또 다른 기에 접합시키는 공유 결합이다. 일부 구현예에서, 글리코시드 결합은 O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합 또는 N-글리코시드 결합이다. 예를 들어, B는 글루코스 모이어티, 갈락토스 모이어티 또는 프룩토스 모이어티를 포함한다. 이들 구현예에서, 센서는 글리코시다제, 예컨대, α-글리코시다제 또는 β-글리코시다제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 뉴클레오사이드를 포함한다. 뉴클레오사이드는 질소성 염기 및 5-탄소 당을 포함한다. 일부 구현예에서, 5-탄소 당은 리보스이다. 일부 구현예에서, 5-탄소 당은 데옥시리보스이다. 일부 구현예에서, 질소성 염기는 아데닌(A), 우라실(U), 구아닌(G), 티민(T) 및 시토신(C)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드는 시티딘, 우리딘, 아데노신, 구아노신, 티미딘 및 이노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드는 데옥시시티딘, 데옥시우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 및 데옥시이노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 구현예에서, 센서는 뉴클레오사이드 하이드롤라제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드는 광범위하게 정의되고, 적어도 하나의 포스페이트기, 질소성 염기 및 5-탄소 당을 포함한다. 일부 구현예에서, 5-탄소 당은 리보스이다. 일부 구현예에서, 5-탄소 당은 데옥시리보스이다. 일부 구현예에서, 질소성 염기는 아데닌(A), 우라실(U), 구아닌(G), 티민(T) 및 시토신(C)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드와 적어도 하나의 포스페이트기, 예를 들어, 비제한적으로, 뉴클레오사이드 모노포스페이트, 뉴클레오사이드 디포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 일부 구현예에서, B는 선형 뉴클레오타이드, 예컨대, ATP, GTP, CTP 및 UTP를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 환식(cyclic) 뉴클레오타이드, 예컨대, 환식 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 및 환식 아데노신 모노포스페이트(cAMP)를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 조효소 A, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD), 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD) 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(NADP+)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 구현예에서, 센서는 N-글리코실 하이드롤라제 또는 뉴클레오타이드 하이드롤라제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, B는 (XNT)n을 포함할 수 있으며, 여기서 XNT는 뉴클레오타이드이고, n은 1 내지 10, 2 내지 9, 3 내지 7, 4 내지 6, 또는 5의 정수이다. 일부에서, XNT는 아데닌(A), 우라실(U), 구아닌(G), 티민(T) 및 시토신(C)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소성 염기를 포함한다. 이들 구현예에서, 센서는 뉴클레아제 또는 DNA 글리코실라제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 하기 구조들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 선택적으로 치환되는 C1-30 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C3-8 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, C3-8 헤테로사이클릴 또는 아릴이다. 일부 구현예에서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 선택적으로 치환되는 C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬이다. 일부 구현예에서, Ra는 메틸, 에틸, 부틸, 프로필, 부틸 또는 t-부틸이다. 일부 구현예에서, Ra는 메틸이다. 이들 구현예에서, 센서는 에스터라제에 대한 기질을 형성할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, B는 하기 구조를 갖는 하나 이상의 기를 포함하고, 여기서 Ra는 본원에 정의된 바와 같다:
일부 구현예에서, B는 티오에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 하기 구조들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 선택적으로 치환되는 C1-30 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C3-8 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, C3-8 헤테로사이클릴 또는 아릴이다. 일부 구현예에서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 선택적으로 치환되는 C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬이다. 일부 구현예에서, Ra는 메틸, 에틸, 부틸, 프로필, 부틸 또는 t-부틸이다. 이들 구현예에서, 센서는 티오에스터라제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 에테르 또는 티오에테르를 포함한다. 일부 구현예에서, B는 하기 구조들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 선택적으로 치환되는 C1-30 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C3-8 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, C3-8 헤테로사이클릴 또는 아릴이다. 일부 구현예에서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 선택적으로 치환되는 C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬이다. 일부 구현예에서, Ra는 메틸, 에틸, 부틸, 프로필, 부틸 또는 t-부틸이다. 이들 구현예에서, 센서는 데알킬라제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 할로겐 또는 할로알킬을 포함한다. 일부 구현예에서, B는
여기서 n은 1 내지 8의 정수이며, X는 할로겐이다. 일부 구현예에서, X는 Cl, Br, F 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 구현예에서, 센서는 데할로게나제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 β-락탐을 포함한다. 일부 구현예에서, B는 β-락탐 항생제, 예컨대, 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신 또는 카바페넴을 포함한다. 일부 구현예에서, B는 페니실린 및 세팔로스포린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 β-락탐 항생제를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, B는 하기 구조를 포함한다:
이들 구현예에서, 센서는 β-락타마제에 대한 기질을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, B는 본원에 사용된 바와 같이 "트리메틸 록(lock)"을 포함하고, "트리메틸 록"은 o-하이드록시-신남산 유도체이다. 이들 구현예에서, R2에 결합된 B는 종종 "잠재성 형광단", "마스킹된 형광단" 또는 "프로-형광단(pro-fluorophore)"으로 지칭되고, 낮은-형광 상태 또는 비-형광 상태로 존재한다. 트리메틸 록을 갖는 센서의 일례는 하기 구조를 가진다:
여기서, 형광단은 트리메틸 록에 연결될 수 있는 임의의 적합한 형광단이고, ORb는 관심 하이드롤라제에 의해 가수분해되어 페놀성 산소를 언마스킹(unmask)할 수 있는 가수분해성 결합을 포함한다. 예를 들어, Rb는 아실기, 포스포릴기, 설푸릴기 또는 글리코실기일 수 있다. 일례에서, Rb는 아세틸기이다. 형광단에 따라, 센서는 1개 초과의 "트리메틸 록"을 포함할 수 있다. 일단 페놀성 산소가 언마스킹되면, 3개의 메틸기들 사이에서의 바람직하지 못한 입체 상호작용이 신속한 락톤화, L-R1에 결합된 형광단의 방출, 및 BRET 비의 증가를 유발한다. 적합한 형광단은 로다민 110, 7-아미노-4-메틸쿠마린 및 크레실 바이올렛(cresyl violet)을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 이 예에서, 센서는 에스터라제에 대한 기질을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, ORb는 OPO3H2 기이고, 센서는 포스파타제에 대한 기질을 형성할 수 있다. 트리메틸 록을 기반으로 한 잠재성 형광단의 예는 Chandran 등, 2005, Levine과 Raines, 2012; Lavis 등, 2006a 및 Lavis 등, 2006b에 제공되어 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 가수분해성 결합과 형광단 사이에서 트리메틸 블록을 포함하는 것은 하이드롤라제로의 가수분해성 결합의 접근성을 향상시킬 수 있는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, B는 자가-희생(immolative) 링커를 포함한다. 자가-희생 링커는 형광단과 가수분해성 결합 사이에 위치하고, 하이드롤라제에 대한 가수분해성 결합의 접근성을 잠재적으로 향상시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "자가-희생 링커"는 2개의 분자종 사이의 가역적인 공유 연결(이 경우 형광단과 가수분해성 결합)이다. 가수분해성 결합의 절단 전에, 형광단은 낮은-형광 또는 비-형광 상태로 존재한다. 공유 연결기의 자가-분해는 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단에 의해 촉발되어, 형광단을 높은-형광 상태에서 방출시킨다. 따라서 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 BRET 비를 증가시킨다. 적합한 자가-희생 형광원성 프로브는 Zadlo-Dobrowolska 등, 2016에 기재되어 있다.
가수분해성 결합
본 발명의 센서는 가수분해성 결합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "가수분해성 결합"은 하이드롤라제에 의해 끊어질 수 있는 공유 결합이다. 다시 말해, 가수분해성 결합은 하이드롤라제에 대한 기질이다. 가수분해성 결합의 절단은 R2의 형광 특성을 변화시켜, BRET의 변화를 초래한다. B, 또는 R2에 결합된 B는 가수분해성 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, B는 가수분해성 결합을 포함한다. 다른 구현예에서, B는 가수분해성 결합에 의해 R2에 결합된다.
본 발명은 본 개시내용의 센서에 있어서 임의의 적합한 가수분해성 결합의 용도를 제공한다. 일부 예에서, 가수분해성 결합은 에스테르 결합, 아미드(또는 펩타이드) 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 글리코시드 결합, 티오에스테르 결합, 포스페이트 에스테르 결합, 탄소-질소 결합, 산 무수물 결합, 탄소-탄소 결합, 할라이드 결합, 인-질소 결합, 황-질소 결합, 탄소-인 결합, 황-황 결합 및 탄소-황 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 가수분해성 결합은 에스테르 결합, 아미드(또는 펩타이드) 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 글리코시드 결합, 티오에스테르 결합, 포스페이트 에스테르 결합 및 탄소-질소 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 가수분해성 결합은 에스테르 결합이다.
본 개시내용의 구현예에서, R2-B/B-R2는 가수분해성 결합을 포함하고, 관심 하이드롤라제에 대한 기질을 형성한다. R2-B/B-R2의 적합한 비제한적인 예는 표 1에 열거되어 있다.
[표 1]
B에 결합된 R2의 비제한적인 예.
바람직한 구현예에서, R2-B/B-R2는 플루오레세인 아세테이트 또는 플루오레세인 디아세테이트를 포함한다.
상기 화합물은 상업적인 공급업체로부터 입수 가능하거나, 당업계에 공지된 방법에 따라 합성될 수 있거나, 공개된 방법에 따라 합성될 수 있다.
연결 요소
본 발명의 센서는 연결 요소, L을 포함한다. 연결 요소는 R1을 R2에 부착시키는 분자 모이어티이다. 일부 구현예에서, 연결 요소(또는 이의 일부)는 R1의 필수적인 부분이다(예를 들어, R2가 천연 발생 시스테인 또는 라이신의 측쇄를 통해 R1에 직접적으로 결합되게 하는 R1의 N-말단 또는 C-말단, 또는 R1 내의 천연 발생 시스테인 또는 라이신 잔기). 일부 구현예에서, 연결 요소(또는 이의 일부)는 R2의 필수적인 부분이다(예를 들어, R1이 아민 또는 티올 기를 통해 R2에 직접적으로 결합되게 하는 R2 내의 아민 또는 티올 기, 또는 소르타제 인지 서열). 일부 구현예에서, 연결 요소는 R1을 R2에 부착시키는 별도의 화학적 엔티티이다.
적합한 연결 요소는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 글리콜 쇄의 적어도 하나의 산소가 질소로 치환되는 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민(Herve et al., 2008), 펩타이드 핵산(PNA)(Egholm et al., 2005), 잠금 핵산(LNA)(Singh et al., 1998), 트리아졸, 피페라진, 옥심, 티아졸리딘, 방향족 고리 시스템, 알칸, 알켄, 알킨, 환식 알칸, 환식 알켄, 아미드, 티오아미드, 에테르 및 하이드라존을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 알킬 쇄, 글리콜, 폴리글리콜, 에테르, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리에스테르, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이다.
연결 요소의 길이는 선택되는 연결 요소, 뿐만 아니라 선택되는 R1-R2 쌍에 의해 좌우된다. 예를 들어, 연결 요소의 길이는 선택되는 R1-R2 쌍의 작동 거리 범위에 의해 좌우된다. 일부 구현예에서, 연결 요소의 길이는 BRET 비의 변화를 변경시키거나 제어하도록 바뀔 수 있다.
일부 구현예에서, 연결 요소는 폴리알킬렌 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 포함한다. PEG는 에틸렌 글리콜의 중합체이고, 치환에 따라 화학식 C2n+2H4n+6On+2를 가질 수 있다. 예를 들어, 연결 요소는 에틸렌 글리콜 모이어티를 약 40개까지 갖는 PEG 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 에틸렌 글리콜 모이어티를 약 30개까지 갖는 PEG 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 에틸렌 글리콜 모이어티를 약 20개까지 갖는 PEG 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 에틸렌 글리콜 모이어티를 약 10개까지 갖는 PEG 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 에틸렌 글리콜 모이어티를 약 8개까지 갖는 PEG 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 에틸렌 글리콜 모이어티를 약 6개까지 갖는 PEG 링커를 포함한다. 다른 유용한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르 및 PEG-옥시카보닐이미다졸이다.
대안적인 구현예에서, 연결 요소는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 둘 모두의 뉴클레오사이드 염기 또는 변형된 뉴클레오사이드 염기, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 연결 요소는 뉴클레오사이드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오사이드 염기를 약 50개까지 가질 수 있다. 일 구현예에서, 연결 요소는 뉴클레오사이드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오사이드 염기를 약 40개까지 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 뉴클레오사이드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오사이드 염기를 약 30개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 뉴클레오사이드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오사이드 염기를 약 20개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 뉴클레오사이드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오사이드 염기를 약 10개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 뉴클레오사이드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오사이드 염기를 약 5개까지 포함한다.
바람직한 구현예에서, 연결 요소는 폴리펩타이드를 포함한다. 펩타이드, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산들의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 전형적으로, 올리고펩타이드는 2 내지 10개의 아미노산을 함유하는 쇄에 대해 사용되고, 용어 폴리펩타이드는 10개 초과의 아미노산을 함유하는 쇄에 대해 사용된다. 펩타이드는 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 50개까지 가질 수 있다. 일 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 40개까지 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 37개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 31개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 30개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 28개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 23개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 21개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 20개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 13개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 11개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 10개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 5개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 아미노산 잔기를 약 3개까지 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 1개의 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 약 1 내지 30개의 아미노산, 약 5 내지 25개의 아미노산, 약 7 내지 23개의 아미노산, 약 10 내지 20개의 아미노산, 또는 약 13 내지 18개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 약 1 내지 30개의 아미노산, 약 10 내지 30개의 아미노산, 약 20 내지 30개의 아미노산, 약 25 내지 30개의 아미노산, 또는 약 28개의 아미노산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 연결 요소는 약 25 내지 30개의 아미노산, 또는 약 28개의 아미노산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 연결 요소는 유리(free) 시스테인 또는 유리 라이신을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산을 정의할 때 "유리"는 비변형된 측쇄, 예를 들어, 각각 a-SH 기 또는 -NH2/-NH3 + 기를 갖는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 R1의 N-말단에서의 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 R1의 C-말단에서의 펩타이드 서열이다.
일부 구현예에서, 연결 요소는 서열 C를 포함하는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 서열 CDDKDRWGSEF(SEQ ID NO: 5)를 포함하는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 서열 CQQMGRDLYDDDDKDRWGSEF(SEQ ID NO: 6)를 포함하는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 서열 MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSEF(SEQ ID NO: 7)를 포함하는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 상기 서열에서 적어도 하나의 아미노산은 시스테인에 의해 대체된다. 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7에서 적어도 하나의 아미노산은 시스테인에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 및 SEQ ID NO: 48 중 임의의 하나에 제공된 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
일부 구현예에서, 연결 요소는 미생물 트랜스글루타미나제에 대한 고 친화성 Gln 기질을 포함한다(Oteng-Pabi et al., 2014). 예를 들어, 연결 요소는 WALQRPH(SEQ ID NO: 21) 및 WELQRPY(SEQ ID NO: 22)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 소르타제 인지 서열을 포함한다(Theile et al., 2013). 예를 들어, 연결 요소는 서열 LPXT를 갖는 펩타이드를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산(SEQ ID NO: 23)이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 소르타제 매개 반응은 R1의 N-말단을 표지하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 하나 이상의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 GSSGGS(SEQ ID NO: 24), GGSGGS(SEQ ID NO: 25), GGTGGG(SEQ ID NO: 26), GGGGGT(SEQ ID NO: 27), LQGGTGGG(SEQ ID NO: 28), FEGGTGGG(SEQ ID NO: 29) 및 GGSGGSL(SEQ ID NO: 30)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
연결 요소는 약 5 kD 미만, 약 4.5 kD 미만, 약 4.0 kD 미만, 약 3.5 kD 미만, 약 3 kD 미만 또는 약 2.5 kD 미만의 질량을 가질 수 있고, 약 2 kD 미만일 수 있다. 연결 요소는 약 1 kDa 내지 5 kD, 약 2 kDa 내지 약 5 kD, 및 약 3 KDa 내지 약 5 kD의 질량을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 연결 요소는 반응성 모이어티를 포함한다. 반응성 모이어티는 임의의 수단의 화학 반응에 의해 R1 및/또는 R2의 화학기와 반응하여, 본원에 기재된 센서 분자를 형성할 수 있다. 임의의 적합한 반응성 모이어티가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티는 설피드릴 반응성 모이어티, 아민 반응성 모이어티 및 카보닐 반응성 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티는 설피드릴 반응성 모이어티, 아민 반응성 모이어티 및/또는 카보닐 반응성 모이어티와 반응하는 기이다. 예를 들어, 반응성 모이어티는 유리 시스테인 잔기, 유리 라이신 잔기 또는 카보닐기를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 연결 요소는, R1 및/또는 R2 내의 유리 시스테인(예를 들어, 천연 발생 시스테인 또는 돌연변이에 의해 도입된 시스테인)과 반응성인 설피드릴 반응성 모이어티가 제공되어 이들 사이에서 공유 연결을 형성한다. 다른 구현예에서, 연결 요소는, R1 및/또는 R2 내의 라이신 잔기(예를 들어, 천연 발생 라이신 또는 돌연변이에 의해 도입된 라이신)와 반응성인 아민 반응성 모이어티가 제공되어 이들 사이에서 공유 연결을 형성한다. 다른 구현예에서, 연결 요소는, R1 및/또는 R2 내의 카보닐기와 반응성인 카보닐 반응성 모이어티가 제공되어 이들 사이에서 공유 연결을 형성한다. 보다 다른 구현예에서, 연결 요소는, R1 및/또는 R2 내의 설피드릴 반응성 모이어티와 반응성인 유리 시스테인 또는 유리 라이신이 제공되어 이들 사이에서 공유 연결을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 R1 및/또는 R2 내의 아민 반응성 모이어티와 반응성인 유리 라이신이 제공되어 이들 사이에서 공유 연결을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 R1 및/또는 R2 내의 카보닐 반응성 모이어티와 반응성인 카보닐기가 제공되어 이들 사이에서 공유 연결을 형성한다.
설피드릴 반응성 모이어티는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르 또는 말레이미드 모이어티를 포함한다. 바람직한 설피드릴 반응성 모이어티는 말레이미드, 아크릴아미드, 페닐카보닐아크릴아미드 및 요오도아세타미드를 포함한다. 아민 반응성 모이어티는 활성 에스테르(비제한적으로, 숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르 및 설포디클로로페놀 에스테르를 포함함), 이소티오시아네이트, 디클로로트리아진, 아릴 할라이드, 아실 아자이드 및 설포닐 클로라이드를 포함한다. 이들 아민 반응성 모이어티 중에서, 활성 에스테르는 이들이 안정한 카복사미드 결합을 생성하므로 바람직한 시약이다(예를 들어, Banks와 Paquette, 1995 참조). 카보닐 반응성 모이어티는 1차 아민, 예컨대, 하이드라자이드 및 알콕시아민을 포함한다. 카보닐 함유 모이어티는 알데하이드(RCHO) 및 케톤(RCOR')을 포함한다. 일부 예에서, 알데하이드는 연결 요소 내의 당 기의 퍼요오데이트-산화에 의해 만들어진다.
일례에서, 연결 요소가 PEG(또는 NPEG)를 포함하는 경우, 이러한 연결 요소는 또한 하나 이상의 반응성 모이어티, 예컨대, 친전자체성 또는 친핵성 기(예를 들어, WO 2007/140282 참조)를 포함할 수 있으며, 이는 PEG 링커를 R1 및/또는 R2에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 PEG-이산 또는 NPEG-이산으로부터 유래된다. 이들 구현예에서, PEG-이산 또는 NPEG-이산 연결 요소의 카복실기는 아미드 결합을 통해 R1의 말단 잔기의 말단 아미노기에 연결된다. PEG-이산 또는 NPEG-이산 연결 요소의 다른 카복실기는 아미드 결합을 통해 R2에 연결된다.
일례에서, 연결 요소가 펩타이드를 포함하는 경우, 이는 또한 시스테인 잔기 및/또는 라이신 잔기를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 연결 요소는 시스테인을 포함한다.
당업자는 링커의 길이가 생물발광 단백질과 수용체 도메인 사이의 BRET에 영향을 줄 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 링커의 바람직한 길이는 센서에 사용되는 생물발광 단백질 및 수용체 도메인에 따라 바뀔 수 있다.
비-단백질 수용체 도메인(R2)
R2는 임의의 적합한 비-단백질 수용체 도메인일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "수용체 도메인"은 생물발광 단백질, R1(본원에 기재된 바와 같음)의 활성의 결과로서 방출되는 에너지를 수용할 수 있는 임의의 분자이다. 일부 구현예에서, 비-단백질 수용체 도메인은 형광 수용체 도메인 또는 ?처일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형광 수용체 도메인"(또한 본원에서 "형광 수용체 분자"로 지칭됨)은 생물발광 단백질, R1의 활성의 결과로서 방출되는 에너지를 수용하고 이를 광 에너지로서 재-방출할 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "?처"는 생물발광 단백질, R1의 활성의 결과로서 방출되는 에너지를 광 에너지로서 재-방출하지 않으면서 이러한 에너지를 수용할 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 비-형광 수용체는 ?처일 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 많은 수용체 도메인들이 존재한다. 바람직한 구현예에서, 적합한 수용체 도메인은 R2가 유기 수용체 도메인이도록, 비-단백질성이며 유기 분자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 수용체 도메인은 양자점(quantum dot)이 아니다.
일부 구현예에서, R2는 비-단백질 형광 수용체 도메인이다. 임의의 적합한 비-단백질 형광 수용체 도메인이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, R2는 알렉사 플루오르 염료, 보디피 염료, Cy 염료, 플루오레세인, 단실, 엄벨리페론, 마리나 블루, 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우, 퍼시픽 블루, 오레곤 그린, 테트라메틸로다민, 로다민, 쿠마린, 보론-디피롤메텐(보디피), 레조루핀, 텍사스 레드, 희토류 원소 킬레이트, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유도체의 예는 아민 반응성 유도체, 알데하이드/케톤 반응성 유도체, 시토신 반응성 또는 설피드릴 반응성 유도체를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, R2는 플루오레세인 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 플루오레세인 유도체, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), NHS-플루오레세인, NHS-LC-플루오레세인, 설피드릴-반응성 플루오레세인 유도체, 5-(및 6)-요오도아세타미도-플루오레세인, 플루오레세인-5-말레이미드, 플루오레세인-6-말레이미드, SAMSA-플루오레세인, 알데하이드/케톤 및 시토신 반응성 플루오레세인 유도체, 플루오레세인-5-티오세미카바자이드 및 5-(((2-(카보하이드라진)메틸)티오) 아세틸)-아미노플루오레세인을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, R2는 플루오레세인-5-말레이미드 유도체이다. 일부 구현예에서, R2는 플루오레세인-6-말레이미드 유도체이다. 바람직한 구현예에서, B-R2 또는 R2-B는 플루오레세인-디아세테이트-6-말레이미드이다. 바람직한 구현예에서, B-R2 또는 R2-B는 플루오레세인-디아세테이트-5-말레이미드이다.
일부 구현예에서, R2는 로다민 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 로다민 유도체, 테트라메틸로다민-5-(및 6)-이소티오시아네이트, NHS-로다민, Lissamine? 로다민 B 설포닐 클로라이드, Lissamine? 로다민 B 설포닐 하이드라진, 설피드릴-반응성 로다민 유도체, 테트라메틸로다민-5-(및 6)-요오도아세타미드, 알데하이드/케톤 및 시토신 반응성 로다민 유도체, 텍사스 레드 하이드라진 및 텍사스 레드 설포닐 클로라이드를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, R2는 설포로다민 B, C2 말레이미드 유도체((RhodamineRed? C2-말레이미드 또는 2-(6-(디에틸아미노)-3-(디에틸이미노)-3H-크산텐-9-일)-5-(N-(2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)에틸)설파모일)벤젠설포네이트라고도 지칭됨)이다.
일부 구현예에서, R2는 쿠마린 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 쿠마린 유도체, AMCA, AMCA-NHS, AMCA-설포-NHS, 설피드릴-반응성 쿠마린 유도체, AMCA-HPDP, DCIA, 알데하이드 및 케톤 반응성 쿠마린 유도체 및 AMCA-하이드라자이드를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, R2는 보론-디피로메텐(보디피) 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 보론-디피로메텐 염료, 보디피 FL C3-SE, 보디피 530/550 C3, 보디피 530/550 C3-SE, 보디피 530/550 C3-하이드라자이드, 보디피 493/503 C3-하이드라자이드, 보디피 FL C3-하이드라자이드, 설피드릴-반응성 보론-디피로메텐 염료, 보디피 FL 1A, BOPDIY 530/550 1A, Br-BOPDIPY 493/503, 및 알데하이드 및 케톤 반응성 보론-디피로메텐 염료를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, R2는 Cy(시아닌) 염료 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민 반응성 시아닌 염료, 티올-반응성 시아닌 염료 및 카보닐-반응성 시아닌 염료를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, R2는 ?처이다. 임의의 적합한 ?처가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, R2는 DABCYL [4-((4-(디메틸아미노) 페닐)아조)벤조산], DABSYL(디메틸아미노아조설폰산), 금속 나노입자, 예컨대, 금 및 은, 블랙홀 ?처(BHQ), QSY 염료 및 QXL ?처로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R2는 DABCYL [4-((4-(디메틸아미노) 페닐)아조)벤조산], DABSYL(디메틸아미노아조설폰산), 블랙홀 ?처(BHQ), QSY 염료 및 QXL ?처로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R2는 연결 요소 L에 부착되어, R1에서 천연 발생하는 반응성 모이어티, 연결 요소 L에서 천연 발생하는 반응성 모이어티를 통해, 커플링기를 연결 요소 L에 첨가함으로써 및/또는 R2에 존재하는 커플링기에 의해 센서를 형성할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 연결 요소는 R2가 시스테인의 티올 함유 측쇄를 통해 연결 요소 L에 부착될 수 있도록 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 R2가 라이신의 아민 함유 측쇄를 통해 연결 요소 L에 부착될 수 있도록 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 R2가 비-천연 아미노산의 측쇄를 통해 연결 요소 L에 부착될 수 있도록 비-천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 R2가 하이드라자이드 반응 화학 또는 알콕시아민 반응 화학을 통해 연결 요소 L에 부착될 수 있도록 당 기를 포함한다.
예시적인 커플링기는 이후에 기재되고, 이러한 커플링기를, R2 또는 R1에 부착하기 위해 연결 요소 L 내로 혼입하거나 연결 요소 L에 부착하기 위해 R2 또는 R1 내로 혼입하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 적합한 커플링기 및 연관된 기법은 문헌[Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Third Edition), Academic Press (2013)]에 기재되고 설명되어 있다. 보호된 기능성 모이어티 또는 보호된 커플링기를 포함하는 본 발명의 화합물의 경우, 보호기의 제거는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행된다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같이, 용어 "부착"은 연결기 L과 R1 사이에서의 및/또는 L과 R2 사이에서의 공유 결합의 형성을 지칭한다.
적합한 커플링기는 시스테인 특이적인 친전자체 및/또는 아민 특이적인 친전자체를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, R1, R2 및 연결 요소 중 하나 이상은 시스테인 특이적인 친전자체를 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 시스테인 특이적인 친전자체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 특이적인 친전자체는 말레이미드, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, α-할로카보닐(예를 들어, 요오도아세타미드), 피리딜 디설파이드, 아크릴아미드 및 페닐 카보닐 아크릴아미드를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 티올 특이적인 커플링기는 할로아세틸 및 알킬할라이드 유도체, 아지리딘, 아크릴로일 유도체, 아릴화제, 티올-디설파이드 교환 시약, 비닐 설폰 유도체, 금속 티올 다티브(dative) 결합, 천연 화학 결찰(native chemical ligation), 메티오닌 및 시스테인의 시스플라틴 변형을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 시스테인 특이적인 친전자체는 도 2에 제시된 마이클 수용체, 예컨대, 말레이미드, 아크릴아미드 및 페닐카보닐아크릴아미드이다. 일부 구현예에서, R1은 마이클 수용체에 직접적으로 결합되거나 연결 화학을 통해 마이클 수용체에 간접적으로 결합될 수 있다. 적합한 연결 화학(linking chemistry)의 예는 C1-6 알킬 직쇄 또는 분지쇄, -NO2, -NH2, =O, 할로겐, 트리할로메틸, C1-6 알콕시,-OH, -CH2OH 및 -C(O)NH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되는, 0 내지 4개의 백본(즉, 비-치환기) 헤테로원자를 포함하는 C1-10 알킬렌 직쇄 또는 분지쇄를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 시스테인 특이적인 친전자체는 반응식에 따라 연결되는 말레이미드이다:
여기서 R2-L-SH는 유리 티올을 유리 티올로서 포함하거나, 보호된 티올의 탈보호 후에 포함한다.
당업자에게 공지된 임의의 아민 특이적인 친전자체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 아민 특이적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 설포닐 클로라이드 및 이소티오시아네이트를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 아민 특이적인 커플링기는 이소시아네이트, 아실 아자이드, N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, 토실레이트 에스테르, 알데하이드 및 글리콕살, 에폭사이드 및 옥시란, 카보네이트, 아릴화제, 이미도에스테르, 카보디이미드, 무수물, 플루오로페닐 에스테르, 하이드록시메틸포스핀 유도체 및 아민의 구아니딘화를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
바람직한 아민 특이적인 친전자체는 이미도에스테르 및 NHS 에스테르를 포함한다. NHS 에스테르는 1차 또는 2차 아민과의 반응 시 안정한 생성물을 산출한다. 커플링은 생리학적 pH에서 효율적이고, NHS-에스테르 가교-링커는 용액 내에서 이들의 이미데이트 대응물보다 더 안정하다. 1차 아민은 NHS-에스테르에 대한 주요한 표적이다. 단백질의 N-말단 상에 존재하는 접근 가능한 α-아민기는 NHS-에스테르와 반응하여, 아미드를 형성할 수 있다. 라이신의 ε-아미노기는 NHS-에스테르와 유의하게 반응한다. NHS-에스테르 가교제가 1차 아민과 반응하는 경우 공유 아미드 결합이 형성되어, N-하이드록시숙신이미드를 방출시킨다.
다른 적합한 기법은 R2를 L에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 카보디이미드는 카복실을 1차 아민 또는 하이드라자이드에 커플링시키는 데 사용되어, 아미드 또는 하이드라존 결합의 형성을 초래할 수 있다. 카보디이미드는, 커플링되는 분자와 카보디이미드 사이에 어떠한 가교도 형성되지 않는다는 점에서 다른 커플링제와는 다르며; 더 정확히 말하면, 이용 가능한 카복실기와 이용 가능한 아민기 사이에서 펩타이드 결합이 형성된다. 이용 가능성에 따라, 단백질의 카복시 말단, 뿐만 아니라 글루탐산 및 아스파르트산 측쇄가 표적화될 수 있다. 또 다른 예에서, 소듐 시아노보로하이드라이드의 존재 하에 알데하이드를 사용하는 환원적 알킬화는 R2를 L에 부착시키는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, R2는 효소 매개 표지화를 통해 L에 부착될 수 있다. 적합한 효소는 소르타제 및 트랜스글루타미나제를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 소르타제는 단백질의 부위-특이적인 N-말단 표지화에 영향을 줄 수 있다(Theile et al., 2013). 트랜스글루타미나제는 글루타민 특이적인 잔기의 부위-특이적인 표지화에 영향을 줄 수 있다(Oteng-Pabi et al., 2014). 예를 들어, 소르타제-매개 N-말단 표지화의 경우, R2는 서열 LPXTZ를 갖는 펩타이드를 포함하는 커플링기를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산이고 Z는 글리신 또는 알라닌이다(SEQ ID NO: 31).
다른 기법은 천연 화학 결찰, 디엘스-알더(Diels-Alder) 시약 쌍, 하이드라진-알데하이드 시약 쌍, 아미노옥시-알데하이드 시약 쌍, 클릭(click) 화학 및 스타우딩거(Staudinger) 결찰을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들 기법은 문헌[Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Third Edition), Academic Press (2013)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
커플링기가 본원에서 작용기 특이성을 기반으로 정의되긴 했지만, 당업자는 이들 커플링기가 의도된 작용기 이외의 작용기와 반응하는 잠재성을 가짐을 인지할 것이다. 예를 들어, N-하이드록시숙신이미드 에스테르는 본원에서 아민 특이적인 커플링기로서 정의되어 있긴 하지만, 이들은 또한 시스테인, 히스티딘, 세린, 트레오닌 및 티로신 측쇄 기와 반응할 수 있다. 유사하게는, 말레이미드가 본원에서 시스테인 특이적인 친전자체로서 정의되어 있긴 하지만, 이들은 또한 올바른 조건 하에 아민과 반응할 수 있다.
생물발광 단백질(R1)
생물발광은 화학발광의 한 형태이다. 화학발광은 화학 반응의 결과로서 열의 제한된 방출(발광)을 갖는 에너지의 방출이다. 화학발광 방출은, 화학적으로 유도되는 유기 염료의 여기된 상태로부터 에너지가 기저 상태까지 붕괴됨에 따라 발생한다. 화학발광 방출의 기간 및 강도는 대체로, 반응 용액에 존재하는 화학적 시약의 정도(extent)에 의해 좌우된다. 비-효소적 화학발광은 촉매의 존재 하에 유기 염료와 산화제 사이의 화학 반응의 결과이다. 생물발광은 종종 생물발광 단백질로 지칭되는 효소의 활성에 의존한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물발광 단백질"은 적합한 기질에 작용하여 발광을 발생시킬 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다.
생물발광 단백질은 기질을 활성화된 생성물로 전환시키는 효소이며, 이후 활성화된 생성물은 진정됨에 따라 에너지를 방출하는 것이 당업계에서 이해되어 있다. 활성화된 생성물(기질 상에서 생물발광 단백질의 활성에 의해 발생함)은 수용체 분자로 전달되는 생물발광 단백질-발생 발광의 공급원이다.
예시적인 생물발광 단백질은 이후에 기재된다(예를 들어, 표 2 참조). 발광 시스템은 공지되어 있으며, 박테리아, 원생동물, 강장동물, 연체동물, 어류, 노래기(millipede), 파리, 진균, 벌레, 갑각류, 및 딱정벌레, 특히 피로포루스(Pyrophorus) 속의 방아벌레 및 포티누스(Photinus), 포투리스(Photuris) 및 루시올라(Luciola) 속의 반딧불이를 포함하는 많은 발광 유기체들로부터 분리되었다. 생물발광을 나타내는 추가의 유기체는 WO 00/024878, WO 99/049019 및 Viviani(2002)에 열거되어 있다.
본 발명의 센서에서, R1은 임의의 적합한 생물발광 단백질일 수 있다. 하나의 매우 널리 공지된 예는 특정 생화학 물질인 루시페린(천연 발생 형광단)이 루시퍼라제 활성을 갖는 효소에 의해 산화되는 에너지-산출 화학 반응을 촉매작용하는 루시퍼라제로 공지된 단백질의 부류이다(Hastings, 1996). 박테리아, 조류, 진균, 곤충, 어류 및 다른 해양성(marine form)의 종들을 포함하여 매우 다양한 유기체들, 원핵생물과 진핵생물 둘 모두는 이러한 방식으로 광 에너지를 방출할 수 있고, 각각은 다른 유기체의 그것과 화학적으로 구별되는 특이적인 루시퍼라제 활성 및 루시페린을 가진다. 루시페린/루시퍼라제 시스템은 형태, 화학 및 기능에 있어서 매우 다양하다. 따라서, 루시퍼라제 활성을 갖는 생물발광 단백질은 다양한 공급원들로부터 또는 다양한 수단들에 의해 입수 가능하다. 루시퍼라제 활성을 갖는 생물발광 단백질의 예는 US 5,229,285, 5,219,737, 5,843,746, 5,196,524 및 5,670,356에서 찾을 수 있다. 가장 광범위하게 사용되는 루시퍼라제 중 2가지는 (i) 레닐라 루시퍼라제(알. 레니포르미스(R. reniformis) 유래), 코엘렌테라진을 기질로서 사용하고 480 nm에서 광을 방출하는 35 kDa 단백질(Lorenz 등, 1991); 및 (ii) 반딧불이 루시퍼라제(포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 유래), 루시페린을 기질로서 사용하고 560 nm에서 광을 방출하는 61 kDa 단백질 (de Wet et al., 1987)이다.
가우시아 루시퍼라제(가우시아 프린셉스(Gaussia princeps) 유래)는 생화학적 검정법에 사용되어 왔다(Verhaegen et al., 2002). 가우시아 루시퍼라제는 신속한 반응에서 코엘렌테라진을 산화시켜 470 nm에서 밝은 광 방출을 초래하는 20 kDa 단백질이다.
본 발명에 유용한 루시퍼라제는 또한 아나크로캄파 종(Anachnocampa sp)(WO 2007/019634)으로부터 특성규명되었다. 이들 효소는 크기가 약 59 kDa이고 ATP-의존적 루시퍼라제로서, 방출 스펙트럼의 청색 부분 내에서 방출 스펙트럼으로 발광 반응을 촉매작용하는 ATP-의존적 루시퍼라제이다.
천연 발생 생물발광 단백질의 생물학적 활성 변이체 또는 단편은 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 본 발명에 유용한 이러한 변이체의 3가지 예는 RLuc2(Loening et al., 2006), RLuc8(Loening et al., 2006) 및 RLuc8.6-535(Loening et al., 2007)이고, 이들은 각 레닐라 루시퍼라제의 변이체이다. RLuc8은 RLuc에 비해 돌연변이 A55T, C124A, S130A, K136R, A143M, M185V, M253L 및 S287L을 함유한다. RLuc2는 RLuc에 비해 돌연변이 M185V 및 Q235A를 함유한다. 추가의 예는 NanoLuc?(Hall et al., 2012)이다. 추가의 바람직한 구현예에서, BRET 화학발광 공여체의 서열은 천연 레닐라 루시퍼라제 센서를 혼입하는 센서 분자보다 더 큰 열 안정성을 갖도록 선택된다. RLuc2 또는 RLuc8은 적합한 선택에 관한 편리한 예이며, 이들은 결과적으로, 천연 레닐라 루시퍼라제 서열을 혼입하는 서열보다 5x 이상 또는 10x 이상 더 높은 발광성을 나타낸다. 이러한 증강된 발광성은 임의의 주어진 시간 분해능을 위해 시약의 보다 경제적인 사용을 가능하게 하므로 유의한 이점을 갖는다. 생물발광 단백질의 비제한적인 예는 표 2에 제공된다.
[표 2]
예시적인 생물발광 단백질.
본 발명에 이용될 수 있는 대안적인 비-루시퍼라제, 생물발광 단백질은 적합한 기질 상에서 작용하여 발광 신호를 발생시킬 수 있는 임의의 효소이다. 이러한 효소의 구체적인 예는 β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 및 β-글루코시다제이다. 이들 효소에 대한 합성 발광 기질은 당업계에 잘 알려져 있고, 회사들, 예컨대, Tropix Inc.(미국 매세추세츠주 베드포드 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명에 유용한 퍼옥시다제의 일례는 Hushpulian 등(2007)에 의해 기재되어 있다.
일부 구현예에서, R1은 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 및 β-글루코시다제 또는 이들의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함할 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 생물발광 단백질은 루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, R1은 레닐라 루시퍼라제, 반딧불이 루시퍼라제, 강장동물 루시퍼라제, 북미 글로웜 루시퍼라제, 방아벌레 루시퍼라제, 철도 벌레 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 가우시아 루시퍼라제, 애큐오린, 아라크노캄파 루시퍼라제, 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 키메라의 생물학적 활성 변이체 또는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, R1은 RLuc(SEQ ID NO: 49) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, R1은 RLuc8(SEQ ID NO: 50) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, R1은 RLuc2(SEQ ID NO: 51) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, R1은 SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 및 SEQ ID NO: 51 중 어느 하나 이상에 제공된 서열과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, R1은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 33 중 어느 하나 이상에 제공된 서열과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 단편"은 전장 폴리펩타이드의 정의된 활성을 유지하는, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 일부이다. 예를 들어, 전장 폴리펩타이드가 생물발광 단백질인 구현예에서, "생물학적 활성 단편"은 전장 생물발광 단백질의 활성의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%를 유지하며, 여기서 활성은, 기질을 활성화된 생성물로 전환시키고 그 후에 이러한 활성화된 생성물이 진정됨에 따라 에너지를 방출시키는, 폴리펩타이드의 능력의 측정치이다.
생물학적 활성 단편은 전형적으로, 천연 발생 및/또는 정의된 폴리펩타이드와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일하다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 변이체"는 천연 폴리펩타이드의 정의된 활성을 유지하는, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 서열 변이체이다. 생물학적 활성 변이체는 전형적으로, 천연 발생 및/또는 정의된 폴리펩타이드와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일하다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 변이체"는 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 융합된 생물발광 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)을 포함한다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 태그, 예를 들어, 가용성 태그 또는 정제 태그일 수 있다. 융합 단백질은 선택적으로, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 생물발광 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 절단을 가능하게 하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, R1은 상응하는 천연 발생 단백질과 비교한 경우 적어도 하나 더 적은 시스테인 잔기를 포함하는 생물발광 단백질의 생물학적 활성 변이체이다. 예를 들어, 생물학적 활성 변이체는 상응하는 천연 발생 단백질과 비교한 경우 적어도 하나 더 적은 시스테인 잔기, 적어도 2개 더 적은 시스테인 잔기 또는 적어도 3개 더 적은 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 시스테인 잔기는 천연 또는 비-천연 발생 아미노산으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인은 세린, 발린, 알라닌, 트레오닌 또는 셀레노시스테인에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc(SEQ ID NO: 49)의 아미노산 위치 24에 상응하는 위치에서, 아미노산 위치 73에 상응하는 위치에서, 또는 아미노산 위치 124에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc(SEQ ID NO: 49)의 아미노산 위치 24 및 73에 상응하는 위치에서, 아미노산 위치 24 및 124에 상응하는 위치에서, 또는 아미노산 위치 73 및 124에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc(SEQ ID NO: 49)의 아미노산 위치 24, 73 및 124에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc8(SEQ ID NO: 50)의 아미노산 위치 24에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc8(SEQ ID NO: 50)의 아미노산 위치 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 RLuc8의 아미노산 위치 24 및 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이형 생물발광 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "아미노산 위치에 상응하는 위치에서" 또는 이의 변형은 주변 아미노산과 비교하여 아미노산의 상대 위치를 지칭한다. 이러한 측면에서 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 49에 대해 정렬된 경우 아미노산의 상대 위치화를 변경시키는 결실 또는 치환 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, R1은, 상응하는 천연 발생 단백질이 동일한 서열 위치에서 시스테인 잔기를 포함하지 않는 경우, 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 생물발광 단백질의 생물학적 활성 변이체이다. 일부 구현예에서, R1은, 상응하는 천연 발생 단백질이 노출된 시스테인 잔기를 포함하지 않는 경우, 적어도 하나의 노출된 시스테인 잔기를 포함하는 생물발광 단백질의 생물학적 활성 변이체이다. 본원에 사용된 바와 같이, "노출된 시스테인"은, 본원에 기재된 센서 분자를 형성하기 위해 시스테인의 측쇄가 L 또는 R2와 반응하도록, 단백질의 표면 부근에 또는 표면 상에 놓이는 시스테인이다. 시스테인으로의 아미노산 변화를 통해 또는 노출된 시스테인 잔기의 제공을 통해 달성되는 돌연변이화된 시스테인 잔기는 본원에 정의된 센서에서 연결 요소로서 작용하거나 그의 일부를 형성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이화된 시스테인의 측쇄는 R2 내의 티올 반응기와 반응하여, 본원에 정의된 바와 같은 센서를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, R1은, 상응하는 천연 발생 단백질이 동일한 서열 위치에서 시스테인 잔기를 포함하지 않는 경우 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고, 상응하는 천연 발생 단백질이 동일한 서열 위치에서 시스테인 잔기를 포함하는 경우 적어도 하나 더 적은 시스테인 잔기를 포함하는 생물발광 단백질의 생물학적 활성 변이체이다.
바람직한 구현예에서, 적은 분자량을 갖는 생물발광 단백질은, 입체 장해로 인한 하이드롤라제와 센서 사이의 상호작용의 저해를 방지하거나 감소시키는 데 사용된다. 생물발광 단백질은 바람직하게는 단일 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또한 생물발광 단백질은 바람직하게는 올리고머 또는 응집물(aggregate)을 형성하지 않는다. 생물발광 단백질 레닐라 루시퍼라제, 가우시아 루시퍼라제 및 반딧불이 루시퍼라제는 이들 기준을 모두 또는 대부분 충족시킨다.
일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 기질을 변형시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기질"은 화학발광 공여체와 함께 사용되어 발광을 발생시키거나 흡수할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 기질의 선택은 화학발광 공여체에 의해 발생하는 광의 파장 및 강도에 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 루시페린, 칼슘, 코엘렌테라진, 코엘렌테라진의 유도체 또는 유사체, 또는 루시페린의 유도체 또는 유사체로부터 선택되는 기질을 가진다. 바람직한 구현예에서, 기질은 루시페린, 칼슘, 코엘렌테라진, 또는 코엘렌테라진의 유도체 또는 유사체이다.
코엘렌테라진은 자포동물(cnidarian), 요각류(copepod), 모악동물(chaetognath), 유즐동물(ctenophore), 십각목 새우(decapod shrimp), 미시드 새우(mysid shrimp), 방산충(radiolarian) 및 일부 어류 분류군에서 발생하는 광범위하게 공지된 기질이다(Greer and Szalay, 2002). 레닐라 루시퍼라제의 경우, 예를 들어, 418 내지 547 nm 사이에서 광 방출을 초래하는 코엘렌테라진 유사체/유도체가 이용 가능하다(Inouye et al., 1997, Loening et al., 2007). DeepBlueC코엘렌테라진 유사체/유도체(400A, 딥블루C)는 레닐라 루시퍼라제에 의해 400 nm에서 광을 방출하는 것으로 기재되었다(WO 01/46691). 코엘렌테라진 유사체/유도체의 다른 예는 엔두렌(EnduRen), 프롤룸 퍼플(Prolume purple), 프롤룸 퍼플 II, 프롤룸 퍼플 III, 비비렌(ViviRen) 및 푸리마진(Furimazine)이다. 코엘렌테라진 유사체/유도체의 다른 예는 WO/2014/036482 및 US20140302539에 기재된 화합물을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "루시페린"은 광범위하게 정의되어 있고, 생물발광을 할 수 있는 유기체에서 발견되는 발광 생물학적 색소뿐만 아니라 합성 유사체 또는 기능적으로 동등한 화학물질의 부류를 지칭하고, 루시페린은 효소 루시퍼라제의 존재 하에 산화되어 옥시루시페린 및 광 형태의 에너지를 생성한다. D-루시페린, 또는 2-(6-하이드록시벤조티아졸-2-일)-2-티아졸린-4-카복실산은 처음에 반딧불이 포티누스 피랄리스로부터 단리되었다. 그 이후로, 다양한 화학적으로 구별되는 형태의 루시페린이 다양한 상이한 유기체들로부터, 주로 해양, 예를 들어, 어류 및 오징어로부터 발견되고 연구되어 왔으나, 많은 것들은 육지에 사는 유기체들, 예를 들어, 벌레, 딱정벌레 및 다양한 다른 곤충들에서 식별되어 왔다(Day et al., 2004; Viviani, 2002). 본원에 사용된 바와 같이, 루시페린은 또한 루시페린의 유도체 또는 유사체를 포함한다.
전체 합성 루시페린, 예컨대, 환식 알킬아미노루시페린(CycLuc1) 외에도, 적어도 5가지의 일반적인 유형의 생물학적으로 진화된 루시페린이 존재하며, 이는 각각 화학적으로 상이하고, 광범위한 범위의 상이한 보조인자들을 이용하는 화학적으로 그리고 구조적으로 상이한 루시퍼라제들에 의해 촉매작용된다. 제1 유형은 반딧불이 루시페린으로서, 이는 촉매작용을 위해 ATP를 필요로 하는 반딧불이 루시퍼라제의 기질이다(EC 1.13.12.7). 제2 유형은 일부 오징어 및 어류에서도 발견되는 박테리아 루시페린으로서, 이는 장쇄 알데하이드 및 환원된 리보플라빈 포스페이트로 구성된다. 박테리아 루시퍼라제는 FMNH-의존적이다. 제3 유형은 와편모충(dinoflagellate) 루시페린으로서, 야간에 해양 인광을 담당하는 유기체인 와편모충에서 발견되는 테트라피롤 클로로필 유도체(해양 플랑크톤)이다. 와편모충 루시퍼라제는 와편모충 루시페린의 산화를 촉매작용하고, 3개의 동일한 촉매적 활성 도메인들로 구성된다. 제4 유형은 이미다졸피라진 바르굴린(vargulin)으로서, 이는 소정의 오스트라코드(ostracod) 및 심해 어류, 예를 들어, 포리히티스(Porichthys)에서 발견된다. 마지막 유형은 방산충, 유즐동물, 자포동물, 오징어, 요각류, 모악동물, 어류 및 새우에서 발견되는 단백질 애큐오린의 발광체인 코엘렌테라진(이미다졸피라진)이다.
일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 보조인자를 필요로 한다. 보조인자의 예는 ATP, 마그네슘, 산소, FMNH2, 칼슘, 또는 이들 중 임의의 2개 이상의 조합을 포함하지만 본질적으로 이들로 한정되는 것은 아니다.
하이드롤라제
하이드롤라제는 가수분해 반응을 촉매작용하는 효소이다. 가수분해는 물의 첨가에 의한 화학 결합의 절단이다. 수소는 끊어진 화학 결합의 어느 한 쪽에 첨가되고, 하이드록실은 끊어진 화학 결합의 다른 쪽 면에 첨가된다. 예를 들어:
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하이드롤라제"는 가수분해 반응을 촉매작용할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 하이드롤라제는 효소의 EC 번호(효소 번호(enzyme commission number)) 분류에서 EC 3으로 분류된다. 이들은 이들이 가수분해하는 화학 결합을 기반으로 하위부류로 더 분류될 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 EC 3.1; EC 3.2; EC 3.3; EC 3.4; EC 3.5; EC 3.6; EC 3.7; EC 3.8; EC 3.9; EC 3.10; EC 3.11 및 EC 3.13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 EC 번호를 갖는 폴리펩타이드, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체일 수 있다.
상기 EC 번호에 의해 정의되는 폴리펩타이드의 세부사항은 부록 1(1993), 부록 2(1994), 부록 3(1995), 부록 4 (1997) 및 부록 5(각각 Tipton 1994; Barrett 1995; Barrett 1995; Barrett 1997 및 명명법 위원회 1999에서)가 있는 효소 명명법 1992[Academic Press, San Diego, California, ISBN 0-12-227164-5(양장본), 0-12-227165-3(문고판)]에 기재된 바와 같다. 또한 세부사항은 특히 국제 생화학 및 분자생물학 연합의 명명법 위원회(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/) 및 ExPASy http://enzyme.expasy.org/EC/3.-.-.-)로부터 입수 가능하다.
관련 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 당업자에 의해 용이하게 수득될 수 있다. 예를 들어, 서열은 ExPASy http://enzyme.expasy.org/EC/3.-.-.-를 통해 입수 가능하다.
예시적인 하이드롤라제는, 에스테르 결합에 작용하는 하이드롤라제, 에테르 결합에 작용하는 하이드롤라제, 펩타이드 결합에 작용하는 하이드롤라제, 펩타이드 결합 이외의 탄소-질소 결합에 작용하는 하이드롤라제, 산 무수물에 작용하는 하이드롤라제, 탄소-탄소 결합에 작용하는 하이드롤라제, 할라이드 결합에 작용하는 하이드롤라제, 인-질소 결합에 작용하는 하이드롤라제, 황-질소 결합에 작용하는 하이드롤라제, 탄소-인 결합에 작용하는 하이드롤라제, 탄소-황 결합에 작용하는 하이드롤라제, 황-황 결합에 작용하는 하이드롤라제, 및 글리코실라제를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 예에서, 에스테르 결합에 작용하는 하이드롤라제는 카복실에스터라제, 아릴에스터라제, 아세틸에스터라제, 아세틸콜린에스터라제, 콜린에스터라제, 티오에스터라제(예컨대, 아세틸-CoA 하이드롤라제, 글루타티온 티올에스터라제), 포스파타제(알칼리성 포스파타제), 황산(sulfuric) 에스테르 하이드롤라제 및 리파제를 포함한다. 일부 예에서, 펩타이드 결합에 작용하는 하이드롤라제는 세린 및 시스테인 프로테아제, 카복시- 및 아미노펩티다제, 메탈로펩티다제, 디펩티다제, 디펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜-펩티다제를 포함한다. 일부 예에서, 펩타이드 결합 이외의 탄소-질소 결합에 작용하는 하이드롤라제는 선형 아미드 또는 환식 아미드를 표적화하는 아미다제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 β-락타마제이다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 글리코시다제, 예컨대, α-글리코시다제 또는 β-글리코시다제이다. 글리코시다제는 N-, O- 및 S-글리코실 화합물을 가수분해하고, 아밀라제, 말타제, 수크라제, 락타제 및 갈락토시다제를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 뉴클레오사이드 하이드롤라제, 예컨대, 퓨린 뉴클레오시데아제 또는 피리미딘 뉴클레오시데아제이다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 뉴클레오타이드 하이드롤라제, 예컨대, GTPase이다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 또는 DNA 글리코실라제이다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 데알킬라제이다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 데할로게나제이다.
일부 구현예에서, 하이드롤라제는 콜린에스터라제, 에스터라제, 리파제, 프로테아제, 포스파타제, 뉴클레아제, 글리코시다제, DNA 글리코실라제 및 산 무수물 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 하이드롤라제는 콜린에스터라제, 리파제, 프로테아제 및 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 에스터라제이다. 적합한 하이드롤라제의 일례는 돼지 간 에스터라제이다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제는 포스파타제이다.
R1 및 R2
임의의 수의 R1과 R2 조합이 본 발명의 센서에서 사용될 수 있다. 당업자는 효율적인 에너지 전달을 가능하게 하는 R1 및 R2 쌍을 선택할 수 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, R1 및 R2의 분리 및 상대 배향은 푀르스터 거리의 ± 50% 내에 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "R1 및 R2의 분리 및 상대 배향은 푀르스터 거리의 ± 50% 내에 존재한다"는, R0의 ± 50% 범위 내에서 수행될 수 있는 정상 상태 RET 측정을 지칭한다(
1948; 
1960). 이 어구는 10 내지 90% 범위의 화학발광 공여체 도메인으로부터 수용체 도메인으로의 발광 에너지 전달의 효율을 포괄한다. 일부 구현예에서, 화학발광 공여체 도메인과 수용체 도메인의 푀르스터 거리는 적어도 4 nm이거나, 적어도 4.5 nm이거나, 적어도 5.0 nm이거나, 적어도 5.6 nm이거나, 적어도 6 nm이다. 일부 구현예에서, 화학발광 공여체 도메인과 수용체 도메인의 푀르스터 거리는 약 4 nm 내지 약 10 nm이거나, 약 4.5 nm 내지 약 10 nm이거나, 약 5.0 nm 내지 약 10 nm이거나, 약 5.6 nm 내지 약 10 nm이거나, 약 6 nm 내지 약 10 nm이다.
적합한 쌍형성(pairing)을 결정하는 데 있어서 고려되어야 하는 기준은 생물발광 단백질(R1)과 비교하여 수용체 분자(R2)의 상대 방출/형광 스펙트럼이다. 일부 구현예에서, 생물발광 단백질의 방출 스펙트럼은 공여체 분자와 수용체 분자가 서로에 대해 적당한 근접성 및 배향에 존재하는 경우, 공여체 발광 방출로부터의 광 에너지가 수용체 분자를 여기시켜 수용체 분자 형광을 촉진할 수 있는 파장에 존재하도록, 수용체 분자의 흡광도 스펙트럼과 중첩되어야 한다. 잠재적인 쌍형성을 연구하기 위해, 융합은 (예를 들어) 선택된 생물발광 단백질 및 수용체 도메인을 차단기 B 없이 함유하도록 제조되고 시험된다(실시예 참조).
또한 공여체 분자 및 수용체 분자는 서로 부적절하게(spuriously) 회합하지 않는다는 것이 확증되어야 한다.
공여체 방출은 기질에 대한 변형에 의해 조작될 수 있다. 레닐라 루시퍼라제의 경우, 기질은 코엘렌테라진이다. 공여체 방출을 변경하는 이유는 공여체 방출과 수용체 방출 사이의 분해능을 향상시키기 위해서이다. 원래의 BRET 시스템은 레닐라 루시퍼라제를 공여체로서, EYFP(또는 토파즈)를 수용체로서, 그리고 코엘렌테라진 h 유도체를 기질로서 사용한다. 이들 구성성분은 BRET 검정법에서 조합되는 경우, 생물발광 단백질에 대해 475 내지 480 nm 범위 및 수용체 분자에 대해 525 내지 530 nm 범위에서 광을 발생시켜, 45 내지 55 nm의 스펙트럼 분해능을 제공한다.
레닐라 루시퍼라제는 GFP 방출과 실질적으로 중첩하는 넓은 방출 피크를 발생시키며, 이는 결국 시스템의 신호 대 노이즈를 감소시키는 데 기여한다. 본 발명에 사용하기 위한 하나의 BRET 시스템은 coel400a를 레닐라 루시퍼라제 기질로서 갖고, 공여체와 수용체 방출 파장(약 105 nm) 사이에서 넓은 스펙트럼 분해능을 제공한다.
레닐라 루시퍼라제 활성의 결과로서 다양한 파장에서 광을 발생시키는(야생형 코엘렌테라진에 의해 발생되는 것과는 구별됨) coel400a을 포함하여 다양한 코엘렌테라진 유도체들이 당업계에 알려져 있다. 당업자는, 공여체의 광 방출 피크가 변하였기 때문에, 이 파장에서 광을 흡수하여 효율적인 에너지 전달을 가능하게 할 수용체 분자를 선택할 필요가 있음을 이해할 것이다. 공여체의 광 방출과 수용체의 광 흡수 피크 사이의 스펙트럼 중첩은 효율적인 에너지 전달을 위한 다른 조건들 중 하나의 조건이다.
추가의 생물발광 단백질 및 수용체 분자 쌍의 예가 표 3에 제공된다.
[표 3]
예시적인 BRET 생물발광 단백질(R1) 및 수용체 분자(R2) 쌍.
생물발광 공명 에너지 전달(BRET)
본원에 사용된 바와 같이, "BRET" 또는 "생물발광 공명 에너지 전달"은 생물발광 단백질 공여체와 수용체 분자 사이에서 에너지의 비-방사성 전달을 기반으로 하는 근접 검정법이다. "생물발광 공명 에너지 전달" 및 "BRET"는 상호교환적으로 사용된다.
하이드롤라제에 의한 본원에 기재된 센서의 가수분해성 결합의 절단은 BRET 비의 변화를 생성한다. 생물발광 단백질과 수용체 분자 사이에서 발생하는 에너지 전달은 특이적인 파장을 선택하는 광학 필터(하나는 수용체 분자 방출에 대한 것이고, 다른 하나는 생물발광 단백질 방출에 대한 것임)를 사용하여 측정되는 방출로부터 계산되는 비로서 제시된다(방정식 1 참조).
Ea/Ed = BRET 비
(1)
상기 방정식에서, Ea는 수용체 분자 방출 강도(방출 광은 수용체의 방출에 적합화된 특정 필터를 사용하여 선택됨)로서 정의되고, Ed는 생물발광 단백질 방출 강도(방출 광은 생물발광 단백질의 방출에 적합화된 특정 필터를 사용하여 선택됨)로서 정의된다.
당업자는, 광학 필터가 BRET에 적합한 파장 판별을 가능하게 하는 임의의 유형의 필터일 수 있음을 용이하게 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 광학 필터는 간섭 필터, 롱 패스(long pass) 필터, 쇼트 패스(short pass) 필터 등일 수 있다. 필터를 통과하는 파장의 강도(통상 1초 당 카운트(CPS) 또는 상대 발광 단위(RLU))는 고체 상태 마이크로-광전자 증배관(micro-PMT; micro-photomultiplier), 광전자 증배관(PMT; photo-multiplier tube), 캐스케이드 포토다이오드를 포함하는 포토다이오드, 포토다이오드 어레이 또는 민감 카메라(sensitive camera), 예컨대, 전하 결합 소자(CCD; charge coupled device) 카메라를 사용하여 정량화될 수 있다. 정량화된 신호는 후속하여, BRET 비를 계산하고 에너지 전달 효율을 나타내는 데 사용된다. 수용체 방출의 강도를 증가시킴에 따라 BRET 비는 증가한다.
일반적으로, 공여체 방출 강도에 대한 수용체 방출 강도의 비가 결정되며(방정식 1 참조), 상기 비는 에너지 전달 효율을 반영하는 임의 단위로 표현되는 숫자이다. 에너지 전달 효율의 증가에 따라 상기 비는 증가한다(Xu et al., 1999 참조).
에너지 전달 효율은 또한 수용체 방출 강도에 대한 공여체 방출 강도의 역비(inverse ratio)를 사용하여 표현될 수 있다(방정식 2 참조). 이 경우, 에너지 전달 효율이 증가함에 따라 비율이 감소한다. 이 계산을 수행하기 전에, 방출 강도는 기질의 백그라운드 광 및 자동-발광의 존재에 대해 보정된다. 이러한 보정은 일반적으로, 기질을 함유하지만 본 발명의 생물발광 단백질, 수용체 분자, 센서 또는 폴리펩타이드를 함유하지 않는 대조군 샘플로부터 적절한 파장에서 측정된 방출 강도를 차감함으로써 이루어진다.
Ed/Ea = BRET 비
(2)
여기서 Ea 및 Ed는 상기 정의된 바와 같다.
생물발광 단백질 및 수용체 분자 방출의 광 강도는 또한 단색기 기반 기기, 예컨대, 분광형광계, 전하 결합 소자(CCD) 카메라 또는 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 정량화될 수 있다. 분광형광계를 사용하여, 생물발광 단백질 및 수용체 분자 방출 피크 둘 모두가 기질의 첨가 시 검출되도록 방출 스캔이 수행된다. 최대 강도에 비한 임의의 임의(arbitrary) 강도 퍼센트에 의해 정의되는 파장에서, 또는 λmax에서, 피크 또는 강도 아래 영역은 상대 광 강도를 나타내는 데 사용될 수 있고, 상기 서술된 바와 같이 상기 비를 계산하는 데 사용될 수 있다. 동일한 샘플로부터 생물발광 단백질 및 수용체 분자에 대한 광을 측정할 수 있는 임의의 기기는 본 발명의 BRET 시스템을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 수용체 분자 방출 단독은 BRET의 효과적인 검출 및/또는 정량화에 적합하다. 이 경우, 에너지 전달 효율은 수용체 방출 강도만 사용하여 표현된다. 당업자에게 있어서, 에너지 전달을 측정하기 위해 당업자가 임의의 비율 계산 없이도 수용체 방출 강도를 사용할 수 있다는 것이 용이하게 명백할 것이다. 이는 이상적으로 수용체 분자가 생물발광 단백질로부터 전달된 광을 흡수하는 경우에만 광을 방출한다는 사실에 기인한다. 이 경우, 단지 하나의 광 필터가 필요하다.
관련된 구현예에서, 생물발광 단백질 방출 단독은 BRET의 효과적인 검출 및/또는 정량화에 적합하다. 이 경우, 에너지 전달 효율은 생물발광 단백질 방출 강도만 사용하여 계산된다. 에너지 전달을 측정하기 위해, 임의의 비율 계산 없이 공여체 방출 강도를 사용할 수 있음이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 이는, 수용체 분자가 생물발광 단백질로부터 전달되는 광을 흡수함에 따라 생물발광 단백질로부터의 검출 가능한 방출의 상응하는 감소가 존재한다는 사실에 기인한다. 이 경우, 단지 하나의 광 필터가 필요하다.
대안적인 구현예에서, 에너지 전달 효율은 측정을 위한 하나의 광학 필터만을 필요로 하는 비율계량 측정을 사용하여 표시된다. 이 경우, 공여체 또는 수용체에 대한 광 강도는 적절한 광학 필터를 사용하여 결정되며, 샘플의 또 다른 측정은 임의의 필터(개방 스펙트럼의 강도)를 사용하지 않고 이루어진다. 이러한 후자의 측정에서, (모든 파장에 대해) 전체 광 출력이 정량화된다. 그 후에, 비율 계산은 방정식 3 또는 4를 사용하여 이루어진다. 방정식 3의 경우, 수용체에 대한 광학 필터만이 필요하다. 방정식 4의 경우, 공여체에 대한 광학 필터만이 필요하다.
Ea/Eo-Ea = BRET 비 또는 = Eo-Ea/Ea
(3)
Eo-Ed/Ed = BRET 비 또는 = Ed/Eo-Ed
(4)
여기서 Ea 및 Ed는 상기 정의된 바와 같고, Eo는 조합된 모든 파장(개방 스펙트럼)에 대한 방출 강도로서 정의된다.
추가의 방정식이 방정식 1 내지 4로부터 유도될 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백해야 한다. 예를 들어, 하나의 이러한 유도체는 생물발광 단백질 및/또는 수용체 분자에 대한 방출 파장에서 존재하는 백그라운드 광에 대한 보정을 수반한다.
BRET 검정법을 수행하는 데 있어서, 광 방출은 각각의 웰로부터 BRETCount를 사용하여 결정될 수 있다. BRETCount 기기는 변형된 TopCount이며, TopCount는 Packard Instrument(미국 코네티컷주 메리던 소재)에 의해 판매되는 미세역가플레이트(microtiterplate) 신틸레이션 및 발광 계수기이다. 백그라운드 노이즈를 없애기 위해 2개의 광전자 증배관(PMT)을 동시에 이용하는 고전적인 계수기와 달리, TopCount는 표준 불투명 미세역가 플레이터에서의 계수를 가능하게 하도록 노이즈 감소를 위해 단일-PMT 기술 및 시간-분해 펄스 계수를 이용한다. 불투명한 미세역가플레이트의 사용은 광학 혼선을 무시할 만한 수준까지 감소시킬 수 있다. TopCount는 1, 2, 6 또는 12개의 샘플의 동시 판독을 각각 가능하게 하는 1, 2, 6 및 12개의 검출기(PMT)를 포함하여 다양한 포맷으로 응답한다. BRETCount 외에도, 다른 상업적으로 입수 가능한 기기가 BRET를 수행할 수 있다: Victor 2(핀란드 발락 소재(Perkin Elmer Life Sciences)) 및 Fusion(Packard Instrument, 미국 메리던 소재). BRET는 적어도 수용체 분자 방출 및 바람직하게는 2개의 파장(수용체 분자 및 생물발광 단백질에 대해) 또는 그 이상을 검출할 수 있는 판독기를 사용하여 수행될 수 있다.
당업자가 이해하게 될 바와 같이, BRET는 센서가 화학발광 공여체 도메인(이 경우, 생물발광 단백질) 및 수용체 도메인을 포함하는 것을 필요로 한다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인에 비한 화학발광 공여체 도메인의 공간적 위치 및/또는 쌍극자 배향은, 가수분해성 결합이 하이드롤라제에 의해 절단되는 경우 변경되어 BRET 비의 변화를 초래한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공간적 위치"는, 공여체 도메인이 더 이상 표적 서열을 통해 수용체 도메인에 연결되지 않도록, 센서 분자를 절단하는 프로테아제의 결과로서 변하는 수용체 분자에 대한 공여체의 3-차원 위치결정을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "쌍극자 배향"은 3-차원 공간에서 공여체 및/또는 수용체 분자의 배향에 대한 이들 분자와 연관된 쌍극자 모멘트의 3-차원 공간에서의 방향을 지칭한다. 쌍극자 모멘트는 분자에 걸친 전하의 변화의 결과이다.
일부 구현예에서, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 형광 수용체 도메인, R2에 대한 흡수 및/또는 방출 스펙트럼의 변화를 초래한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가수분해성 결합의 절단은 하이드롤라제에 의해 절단되어 형광 수용체 도메인에 대한 최대 여기(Ex) 및/또는 방출(Em) 파장의 변화를 초래한다. 이들 변화는 BRET 비의 변화를 초래할 수 있다.
하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 BRET 비의 변화를 초래하며, 예를 들어, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 최대 관찰 BRET 비의 약 2% 내지 약 100%의 BRET 비의 변화를 초래할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "최대 관찰 BRET 비"는 R1-L-R2 또는 R2-L-R1(즉, B의 부재 하에 선택적인 연결 요소를 통해 R1에 접합된 R2)에 대해 관찰되는 BRET 비이다. 일부 구현예에서, BRET 비의 변화는 최대 관찰 BRET 비의 약 5% 내지 약 95%, 약 15% 내지 약 50%, 또는 약 15% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 최대 관찰 BRET 비의 2% 이상인 BRET 비의 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 최대 관찰 BRET 비의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 BRET 비의 변화를 초래한다. 15% 이상의 BRET 비의 변화는 하이드롤라제 검출의 신호 대 노이즈 비를 증가시킨다. 이는 임의의 주어진 샘플화 시간 동안 검출의 상극한(superior limit), 및 하이드롤라제의 농도의 보다 정밀한 측정을 야기한다. 대안적으로, 고정된 한계의 검출에서, 더 큰 BRET 비의 변화는 더 짧은 신호 통합 시간, 및 따라서 보다 신속한 검출을 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 절단은 약 2배 초과만큼, 약 3배 초과만큼, 약 4배 초과만큼, 약 5배 초과만큼, 약 10배 초과만큼, 약 20배 초과만큼, 약 30배 초과만큼, 약 40배 초과만큼, 약 50배 초과만큼, 약 60배 초과만큼, 약 70배 초과만큼, 약 80배 초과만큼, 약 90배 초과만큼, 또는 약 100배 초과만큼의 BRET 비의 변화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, BRET 비의 변화는 약 1배 내지 약 60배, 약 2배 내지 약 50배, 약 3배 내지 약 40배, 또는 약 4배 내지 약 30배이다.
본원에 사용된 바와 같이, "스토크스 이동(Stokes shift)"은 동일한 전자 전이(transition)의 흡수 및 방출 스펙트럼의 대역 최대치(band maxima)의 위치들 사이의 파장의 차이이다. 바람직하게는, 수용체 도메인은 큰 스토크스 이동을 가진다. 큰 스토크스 이동은, 흡수 및 방출 스펙트럼의 대역 최대치의 위치들 사이의 큰 차이가, 반사된 여기 방사선을 방출된 신호로부터 없애는 것을 더 용이하게 하기 때문에 바람직하다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인은 약 50 nm 초과의 스토크스 이동을 가진다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인은 약 50 nm 내지 약 350 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm의 스토크스 이동을 가진다. 일부 구현예에서, 수용체 도메인은 약 90 nm, 예를 들어, 100 nm, 110 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm 또는 150 nm 초과의 스토크스 이동을 가진다.
조성물 및 키트
본 발명의 센서는 하이드롤라제의 검출에 사용하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 에스터라제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 콜린에스터라제 또는 리파제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 포스파타제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 알칼리성 포스파타제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 또한 다른 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 글리코시다제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 락타제, 글루코시다제, 갈락토시다제 또는 말타제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 프로테아제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 카스파제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 뉴클레아제 또는 DNA/RNA 하이드롤라제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 리보뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 센서는 β-락타마제를 검출하기 위한 조성물에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 센서 및 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "허용 가능한 담체"는 본 발명의 방법 및 용도와 상용성인 임의의 그리고 모든 고체 또는 용매(예컨대, 포스페이트 완충 염수 완충제, 물, 염수) 분산 매질, 코팅제 등을 포함한다. 허용 가능한 담체는 조성물의 다른 성분들과 상용성이고 시험되는 하이드롤라제를 저해하거나 손상시키지 않는다는 측면에서 '허용 가능'해야 한다. 일반적으로, 허용 가능한 적합한 담체는 당업계에 알려져 있고, 최종 용도 적용분야를 기반으로 선택된다.
본 발명의 센서는 하이드롤라제의 검출에 사용하기 위한 키트에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 센서 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다. 일례에서, 상기 키트는 본 발명에 따른 센서, 사용 설명서, 및 센서의 생물발광 단백질에 적합한 기질을 포함한다.
방법 및 용도
당업자가 이해하게 될 바와 같이, 본 발명의 센서는 샘플에서 하이드롤라제의 존재 또는 부재를 검출하는 데 사용될 수 있고, 만약 존재한다면 하이드롤라제의 활성을 결정하는 데에도 사용될 수 있다(도 10a 내지 도 10b). 따라서, 일 양태에서, 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 샘플을 본 발명의 센서 분자와 접촉시키는 단계; 및 (ii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재에 상응하는, 단계를 포함한다(예를 들어, 도 10a 참조). 예를 들어, 일부 구현예에서, 샘플에서 에스터라제를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 샘플을 본 발명의 센서 분자와 접촉시키는 단계; 및 (ii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 에스터라제의 존재에 상응하는, 단계를 포함한다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 단계 (i)에서 "접촉"은 하이드롤라제에 의한 센서의 가수분해에 적합한 조건 하에 발생한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 단계 (ii) 후에 형성된 조성물을 생물발광 단백질 기질 및 선택적으로 보조인자와 사전에 접촉시키는 단계를 포함한다.
대안적인 구현예에서, 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 샘플을, 구조 B-R2를 갖는 차단된 비-단백질 수용체 도메인과 접촉시켜, 처리된 샘플을 형성하는 단계; (ii) L로의 R2의 부착을 야기하는 조건 하에, 처리된 샘플을 화학식 R1-L 또는 L-R1의 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (iii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재, 및 화학식 R1-L-R2 또는 R2-L-R1의 화합물의 형성에 상응하는 단계를 포함하고, 여기서 R1은 생물발광 단백질이고; L은 연결 요소이며; R2는 비-단백질 수용체 도메인이고; B는 가수분해성 결합을 포함하는 차단기이다(예를 들어, 도 10b 참조). R1, L, R2 및 B는 모두 본원에서 이전에 정의되어 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 단계 (ii) 후에 형성된 조성물을 생물발광 단백질 기질 및 선택적으로 보조인자와 단계 (iii) 전에 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 샘플에서 에스터라제를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 샘플을, 구조 B-R2를 갖는 차단된 비-단백질 수용체 도메인과 접촉시켜, 처리된 샘플을 형성하는 단계; (ii) L로의 R2의 부착을 야기하는 조건 하에, 처리된 샘플을 화학식 R1-L 또는 L-R1의 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (iii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재, 및 화학식 R1-L-R2 또는 R2-L-R1의 화합물의 형성에 상응하는 단계를 포함하고, 여기서 R1은 생물발광 단백질이고; L은 연결 요소이며; R2는 비-단백질 수용체 도메인이고; B는 차단기이고, B에 결합된 R2는 가수분해성 결합을 포함한다. R1, L, R2 및 B는 모두 본원에서 이전에 정의되어 있다. 이들 구현예의 이점은, 가수분해적 효소의 범위에 반응성인 BRET 센서를 선택적으로 상이한 적용들에 대해 최적화된 상이한 색상 출력들과 함께 산출하기 위해, 차단기(이에 따라 가수분해성 결합)가 용이하게 바뀔 수 있다는 것이다. 이들 구현예는 또한 실제 적용이 그것(예를 들어, 특이적인 효소에 대한 센서의 장해, 효소 반응성 형광 태그의 불안정성 등)을 필요로 할 때 유용할 수 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 샘플을 구조 B-R2를 갖는 차단된 비-단백질 수용체 도메인과 접촉시켜 처리된 샘플을 형성하는 것은 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 가수분해에 적합한 조건 하에 발생한다.
당업자가 이해하게 될 바와 같이, 본 발명의 센서는 또한 샘플에 존재하는 하이드롤라제의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플에서 하이드롤라제의 농도 및/또는 활성을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
당업자가 인지하게 될 바와 같이, 본 발명의 센서는 또한 다중화될 수 있다. 이 시스템에서, 상이한 하이드롤라제들에 의해 절단되는 2개 이상의 상이한 센서 분자들이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 센서는 소 플라스민에 의해 절단되는 센서(예를 들어, WO 2013/155553 참조), 및/또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 프로테아제에 의해 절단되는 센서와 다중화될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상이한 센서 분자는, 상이한 공여체 및/또는 수용체 분자가 상이한 파장에서 방출되어 상이한 표적 화합물들의 검출 및 정량화를 가능하게 하도록 상이한 공여체 및/또는 수용체 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상이한 센서 분자는 동일한 공여체 및/또는 수용체 분자를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유체 검출 챔버가 사용된다. 대안적인 구현예에서, 다중-채널 검출 장치가 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 BRET 비의 변화를 검출하기에 적합한 임의의 시스템 상에서 수행될 수 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 본 발명의 방법은 배치(batch)(예를 들어, 플레이트 판독기를 사용하는 배치 포맷) 또는 유동 포맷에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 적절한 필터가 장착된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 마이크로플레이트 포맷으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 예컨대, WO 2013/155553에 기재된 미세유체 장치 상에서 수행될 수 있다. 미세유체 장치(CYBERTONGUE 장치) 상에서 수행되는 BRET 기반 검정법의 일례는 PCT/AU2018/050824에 제공된다.
당업자가 이해하게 될 바와 같이, 본 개시내용의 센서, 조성물 및 키트는 또한 하이드롤라제의 활성을 측정하고/하거나 하이드롤라제의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 센서, 조성물 및 키트는 또한 하이드롤라제의 활성제 또는 저해제의 농도를 검출하고, 측정하고/하거나 결정하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 센서 및 조성물은 식품, 음료, 동물 건강 및 인간 건강 진단 분야에서 하이드롤라제 활성을 모니터링하기 위해, 식품, 화학적, 생화학적 및 생물약제학적 제조 및 가공에서 프로세스 제어를 위해, 그리고 생물적 환경 정화(bioremediation)를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 일례에서, 본원에 기재된 센서 및 조성물은 신경 작용제의 검출에 사용될 수 있다. 이 예에서, 센서는 콜린에스터라제에 대한 기질일 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 센서 및 조성물은 밀크에서 알칼리성 포스파타제 활성의 검출을 통해 젖소에서 유선염을 조기 진단하는 데 사용될 수 있다. 이 예에서, 센서는 알칼리성 포스파타제에 대한 기질일 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 센서 및 조성물은 밀크 샘플에서 포스파타제 활성의 검출을 통해 밀크 저온살균의 유효성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 이 예에서, 센서는 알칼리성 포스파타제에 대한 기질일 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 센서 및 조성물은 췌장 병리(pathology)의 조기 진단을 위해 리파제 활성 수준, 예컨대, 혈중 리파제 활성 수준을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이 예에서, 센서는 에스터라제, 예를 들어, 리파제에 대한 기질일 수 있다.
샘플
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 센서는 샘플에서 하이드롤라제의 존재 또는 부재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 센서는 또한 샘플에서 하이드롤라제 양 및/또는 활성을 정량화하는 데 사용될 수 있다. "샘플"은 하이드롤라제를 함유할 잠재성을 갖는 임의의 물질 또는 조성물일 수 있다. 전형적으로, 샘플은 하이드롤라제를 포함하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 임의의 물질이다. 일부 구현예에서, 샘플은 공기, 액체, 생물학적 물질, 수의학적 샘플, 임상 샘플, 토양, 식물 샘플 또는 이의 추출물일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 공기, 액체, 생물학적 물질, 및 토양 또는 이의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 샘플은 또한 기기일 수 있다.
일부 예에서, 샘플은 생물학적 물질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 물질"은 광범위하게 정의되고, 유기체로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래되는 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 물질은 체액, 세포, 연조직(예컨대, 결합 및 비-결합 조직) 및 경조직(예컨대, 골 및 연골)을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 체액은 혈액, 혈청, 가래, 점액, 고름, 복막액, 소변, 눈물, 대변, 땀 또는 다른 체액이다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 살아 있는 유기체로부터 수확되거나 수합된 후, 추가의 가공 및/또는 화학적 처리를 거쳤을 수 있다. 일 구현예에서, 센서는 살아 있는 세포 내에서 하이드롤라제를 검출하는 데 사용되지 않는다. 생물학적 물질은 식물 물질, 동물 물질, 박테리아 물질 등 또는 이의 추출물을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 임상 샘플을 포함한다. 임상 샘플은 혈액, 혈청, 가래, 점액, 고름, 눈물, 대변, 땀, 복막액 및 다른 체액을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 예에서, 샘플은 유제품을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유제품"은 밀크, 및 밀크로부터 부분적으로 또는 전체적으로 유래되는 제품을 포함한다. 밀크는 임의의 포유동물, 예를 들어, 소, 양, 염소, 말, 낙타, 버팔로, 인간 등으로부터 수득될 수 있다. 유제품은 생 밀크(raw milk), 저지방 밀크, 탈지 밀크, 저온살균 밀크, UHT 밀크, 락토스-변형된 UHT 밀크, 강화 UHT 밀크, 향료첨가 UHT 밀크 및 이들 제품의 조합, 뿐만 아니라 UHT 영아 조제분유(infant formula), 치즈, 요구르트, 유장(whey), 버터밀크, 크림, 밀크 분말, 분말화된 영아 조제분유 및 버터 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 예에서, 샘플은 밀크 또는 희석된 밀크이다. 유제품은 또한 관심 탄수화물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 유제품의 추출물, 예컨대, 부분적으로 정제된 부분일 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 토양 또는 이의 추출물, 의료 장비로부터의 샘플(예를 들어, 면봉시료(swab), 헹굼액(rinse) 등), 기계류(machinery)로부터의 샘플(예를 들어, 면봉시료, 헹굼액 등), 식품 가공 장비로부터의 샘플(예를 들어, 면봉시료, 헹굼액 등) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 식품 가공 장비는 수송 탱커, 보유 탱크(holding tank), 가공 기계, 라인, 배관, 연결기, 밸브 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 샘플은 기계류로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 면봉시료, 헹굼액 등). 기계류는 관심 하이드롤라제 및/또는 관심 하이드롤라제를 발현시키는 박테리아의 온상인 것으로 의심되거나 알려진 임의의 기계류, 예를 들어, 유제품의 생산, 저장 및 가공에 관여하는 임의의 기계류를 포함한다. 일부 구현예에서, 기계류는 완충제 및 보유 사일로, 용접 접합부, 완충제 탱크 유출구, 컨베이어 벨트, 초여과막, 밸브, 공기 분리기, 탱커 트럭, 탱커 트럭 저장 탱크, 개스킷(gasket), 연결 파이프 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 샘플은 또한 의료 장비로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 샘플은 비제한적으로 카테터, 정맥주사선, 인공 호흡기, 상처 드레싱, 컨택트 렌즈, 투석 장비, 의료 장치 등을 포함하는 의료 장비로부터의 면봉시료 또는 헹굼액일 수 있다.
샘플은 환경 또는 공급원으로부터 직접적으로 수득될 수 있거나, 본 발명의 방법이 수행되기 전에 적합한 절차에 의해 추출되고/되거나 적어도 부분적으로 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 수성 액체이다. 예를 들어, 샘플은 밀크, 과일 쥬스, 기타 음료, 및 혈액과 혈청을 포함하는 체액을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 샘플은 수용액에서 고형 농산물, 식품 또는 다른 성분을 세척하거나, 침지시키거나, 분쇄하거나 침연시키고 액체상을 샘플로서 사용함으로써 수득되는 현탁액 또는 추출물일 수 있다. 액체상 샘플은 임의의 적합한 기법, 예를 들어, 침강, 여과 또는 원심분리에 의해 정화될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 공기 또는 다른 기체상 샘플을 수성상을 통해 버블링시키거나, 수성상을 공기 또는 다른 기체상을 통해 분무하거나, 그렇지 않으면 공기 또는 다른 기체상 샘플로부터 분자를 수성상으로 전달시킴으로써 수득될 수 있다. 그 후에, 생성된 수성상은 분석용 샘플로서 사용될 것이다.
실시예
실시예 1 - 센서 분자의 구축
에스터라제 활성을 측정하기 위한 센서 분자를 설계하였다. 센서는 차단기로서의 아세테이트와 함께 N-말단 펩타이드 연결 요소를 통해 합성 형광 프로브 플루오레세인에 공유 부착된 RLuc8을 포함한다. 아세테이트 차단기는 에스테르 결합이 에스터라제에 의해 절단될 때까지 플루오레세인을 비-형광 상태에서 안정화시킨다. 결과적으로, 공여체로부터 소분자 형광단으로의 BRET는 에스터라제에 의한 아세테이트기의 제거 및 플루오레세인 수용체의 활성화 후에만 관찰된다.
재료 및 방법
wt-RLuc8 및 RLuc8Cys 변이체 1, 2 및 3의 생성
예시된 센서에서, RLuc8은 N-말단 펩타이드 연결 요소를 통해 합성 형광단에 연결된다(도 1). 연결 요소의 특이적인 태깅을 가능하게 하기 위해, 단일 Cys 잔기를 펩타이드 링커 내에서 도입하였다. 2개의 Cys 잔기들이 RLuc8에 대해 내인성이긴 하지만, Cys 잔기를 연결 요소 내로 도입하여, 형광 수용체 도메인 및/또는 하이드롤라제와의 반응에 대한 증가된 유용성을 제공하였다.
pRSET RLuc8 PCR은 SEQ ID NO: 7에 제시된 서열을 갖는 N-말단 연결 요소 다음의 RLuc8(SEQ ID NO: 1)을 인코딩한다. 주형으로서 pRSET RLuc8을 적절한 프라이머와 함께 사용하는 PCR에 의해 N-말단 펩타이드 연결 요소 내의 다양한 위치들에서 단일 시스테인 잔기를 도입하였다(표 4). pRSET-RLuc8의 돌연변이유발을 공개된 절차에 따라 수행하였다(Zheng et al., 2004). RLuc8Cys1, 2 및 3(SEQ ID NO: 12 내지 14)을 인코딩하는 플라스미드를 DNA 시퀀싱에 의해 식별하고 확증하였다.
[표 4]
pRSET RLuc8 Cys 돌연변이체의 제조에 사용된 올리고뉴클레오타이드.
* F는 포워드 프라이머이고; R은 리버스 프라이머이다.
** RLuc8의 N-말단 잔기와 도입된 시스테인 사이의 아미노산의 수.
야생형(wt) RLuc8 및 시스테인 변이체, RLuc8Cys1, 2 및 3을 이. 콜라이 BL21(DE3)(New England BioLabs)에서 발현시켰다. 밤샘 배양물을 100 μg /mL 암피실린 및 2% 글루코스를 함유하는 LB(1 L 당 10 g 트립톤, 5 g 효모 추출물, 5 g NaCl(pH 7.4)) 중 단일 콜로니로부터 37℃, 200 rpm에서 성장시켰다. 밤샘 배양물을 사용하여 250 mL LB(100 μg/mL 암피실린)를 0.05의 OD600까지 접종하였고, 배양물을 37℃, 200 rpm에서 4.5시간 동안 인큐베이션하였다. 온도를 22℃까지 감소시키고 200 rpm에서 밤새 인큐베이션함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 접종 후 24시간째에, 세포를 원심분리(5000 x g, 10분, 4℃)에 의해 수확하였다. 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 PBS로 세척한 후, 50 mM NaPi, 0.3 M NaCl, pH 7.0에 재현탁시켰다. 균질기(미세유체 M-110P)를 P= 20,000 psi에서 사용하여 세포를 분열시키고, 가용성 분획을 원심분리(15 000 x g, 15분, 4℃)에 의해 단리하였다. 코발트 친화성 크로마토그래피(TALON® Superflow 금속 친화성 수지(Takara Clontech, 오스트레일리아))를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 His6-태깅된 단백질을 단리하였다. 150 mM 이미다졸 용액을 이용한 용리 후, 단백질을 투석 유닛(GE Healthcare, Vivaspin 6, 10 kDa MWCO)을 사용하여 MES 완충제(50 mM MES, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 6.0)에 대해 투석하였다. 정제된 단백질의 500 μL 분취물을 액체 질소 내에서 순간-냉동시키고, -80℃에서 저장하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다.
플루오레세인 유사체를 이용한 RLuc8 시스테인 변이체의 표지화
50 mM MES, pH 5.0 중 wt-RLuc8 또는 RLuc8Cys 1, 2 및 3 변이체(5 μM)를 4x 몰 과량(20 μM)의 플루오레세인 유사체(DMSO 중 1 mM 스탁(stock)으로부터)와 함께 인큐베이션하고, 혼합물을 지시된 시간(6분 내지 60분) 동안 4℃에서 부드럽게 흔들었다(shake). 인큐베이션 시간 종료 시, 반응 혼합물을 원심분리(10 kDa MWCO, 13000 x g, 13분, 4℃) 또는 탈염 컬럼(HiTrapTM 탈염, GE Healthcare)에 의해 완충제 교환하여, 과량의 표지화 작용제를 제거하였다. 하기 기재된 바와 같은 생물발광 스펙트럼은 표지화 후 짧게 기록되었다.
BRET 검정법
BRET 검정법을 96-웰 플레이트(Perkin-Elmer, 오스트레일리아)에서 100 μL의 최종 부피로 수행하였다. 1 μM의 정제된 단백질을 모든 BRET 검정법을 위해 100 μL의 최종 부피로 사용하였고, 여기서 단백질을 필요에 따라 PBS 또는 MES에 희석시켰다.
BRET 측정을 위해, EtOH 중 5 μL의 코엘렌테라진 400a를 단백질 센서 용액(최종 [coel 400a] = 16.7 μM)에 첨가하고, 스펙트럼 스캔을 즉시 기록하였다. 스펙트럼 스캔을 Spectramax M2 플레이트-판독 분광형광계(Molecular Devices)를 이용하여 기록하였다. 발광 스캔 모드를 380 내지 600 nm에서 20 nm 간격으로 사용하여 생물발광 스캔을 기록하였다.
데이터 분석
BRET2 비를 최대 공여체 방출 강도(420 nm)에 대한 최대 수용체 방출 강도(520 nm)의 비로서 계산하였다.
결과
RLuc8Cys2의 N-말단 펩타이드 링커를 가수분해성 플루오레세인 디아세테이트-5-말레이미드로 표지화함으로써 에스터라제 센서를 제조하였다. 플루오레세인 유도체의 아세테이트기의 화학적 가수분해를 최소화하면서, RLuc8의 N-말단 펩타이드 링커의 표지화 효율을 최대화하기 위해 표지화 조건을 최적화시켰다. 효소적 검정법 전에 태그의 화학적 가수분해를 최소화하는 것은 센서의 백그라운드 형광을 감소시키고, 효소 검출의 민감성을 증가시킨다.
최적의 표지화 조건을 결정하기 위해, 플루오레세인-5-말레이미드를 다양한 인큐베이션 시간과 함께 사용하여 wt-RLuc8과 RLuc8Cys 변이체 둘 모두의 표지화를 수행하였다. 과량의 표지화 작용제를 여과에 의해 제거하고, 생물발광 스펙트럼을 기록하였다. 측정된 BRET 비를 wt-RLuc8(도 3a) 및 RLuc8Cys1(도 3b)에 대해 시간 경과에 따른 표지화 효율의 지표로서 사용하였다. 도 3a 내지 도 3b에 제시된 바와 같이, 플루오레세인을 이용한 RLuc8Cys1의 표지화는 시험된 모든 인큐베이션 시간에 대해 대략 6.5의 BRET 비를 산출하였으며(도 3b), 이는 표지화가 6분 내에 완료에 도달하였음을 나타낸다. 본 센서의 경우, 바람직한 표지화 시간은 6분이었다.
매우 불량한 BRET 비가 wt-RLuc8 표지화에 대해 측정되긴 하였지만(도 3a), BRET 비의 약간의 증가가 6분 내지 60분의 표지화 시간 동안 관찰되었다. 이는, 측쇄 Cys의 정량적 표지화가 수 분 내에 달성되기 하지만 인큐베이션 시간을 연장시키는 것이 내인성 Cys 잔기의 표지화를 증가시키는 잠재력을 가짐을 나타낸다.
도 4a에 제시된 바와 같이, 플루오레세인 디아세테이트 5-말레이미드를 이용한 RLuc8Cys2의 표지화는 0.11의 매우 낮은 BRET 비를 제공하였다(실선). '차단된' 소분자 수용체에서 관찰된 낮은 BRET 수준은, 최적화된 표지화 및 정제 조건이 최소 백그라운드 형광과 함께 에스터라제 BRET 센서를 산출하는 데 적합함을 나타낸다.
BRET 비의 pH 의존도는 도 5에 제시된다. BRET 비는 pH 7.0에서 최고이다.
실시예 2 - 링커 길이
예시된 센서 분자에 있어서 BERT에 대한 연결 요소의 길이의 효과를 평가하기 위해, 시스테인 잔기를 RLuc8의 N-말단으로부터의 N-말단 연결 요소 1 아미노산, 11 아미노산 및 21 아미노산 내에 도입하였다(표 4; 도 6a). RLuc8Cys 변이체(즉, RLuc8Cys1, 2 및 3)를 실시예 1에 기재된 최적화된 프로토콜에 따라 플루오레세인-5-말레이미드로 표지하였고, BRET 비를 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였다(도 6b). 도 6b에 도시된 바와 같이, RLuc8과 플루오레세인 사이의 아미노산의 수가 증가함에 따라, BRET 비는 감소한다. 시험된 3개의 센서 중에서, RLuc8Cys2 센서는, 이것이 거의 최대 BRET 비를 제공하였으나 가수분해성 결합의 접근성을 향상시키는 것으로 생각되는 더 긴 연결 요소를 가졌으므로 추가의 조사를 위해 선택되었다.
실시예 3 - RLuc8Cys2 센서를 사용한 에스터라제 활성의 측정
RLuc8Cys2가 에스터라제의 활성을 검출하고 측정하는 데 사용될 수 있는지 결정하기 위해, 센서를 돼지 간 에스터라제(PLE; 8 U/mL)와 반응시켜, 아세테이트기를 가수분해하고 형광 수용체를 유리시켰다. 간략하게는, 최종 부피 100 μL MES pH 5.0에 희석된 1 μM RLuc8Cys2를 PLE(0.8 U)와 함께 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 종료 시, EtOH 중 5 μL의 코엘렌테라진 400a를 단백질 센서 용액(최종 [coel 400a] = 16.7 μM)에 첨가하고, 스펙트럼 스캔을 실시예 2에 기재된 바와 같이 즉시 기록하였다.
도 4에 제시된 바와 같이, PLE를 이용한 에스터라제 센서의 처리는 부분적으로 비차단된 수용체를 산출하였고, 0.11의 BRET 비를 4.4배 증가시켜 0.47까지 증가시켰다(도 4a 내지 도 4b, 점선). 사용된 가수분해 조건 하에 4.4배 BRET 증가가 관찰되긴 하였지만, 6.6의 최대 BRET 비(도 4b, 점선)가 잠재적으로 수득될 수 있으며, 이는 60배까지의 잠재적인 동적 범위를 나타내므로 주목할 만하다.
실시예 4 - 센서 분자의 클로닝, 발현 및 정제
재료 및 방법
RLuc8Cys 변이체 4와 5 및 MBP(K239C)RLuc8의 클로닝
적절한 프라이머와 함께 pRSET RLuc8을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 위치 2 및 11(즉, His6 태그 바로 뒤)에서 단일 Cys 잔기를 펩타이드 링커 내에 도입하였다(표 5). pRSET-RLuc8의 돌연변이유발을 공개된 절차에 따라 수행하였다(Zheng et al., 2004). RLuc8Cys4 및 5(SEQ ID NO: 35 및 36)를 인코딩하는 플라스미드를 식별하고, DNA 시퀀싱에 의해 확증하였다.
공여자 도메인과 수용체 도메인 사이의 더 긴 거리의 효과를 조사하기 위해, 말토스 결합 단백질을 (N-말단 히스티딘 태그를 인코딩하는 서열과 RLuc8 사이에서) pRSET RLuc8 내로 클로닝하여, pRSET MBP RLuc8을 형성하였다. MBP의 표면 상에 존재하는 것으로 예측된 라이신 잔기(K289)를 시스테인으로 돌연변이화시켜, 형광 수용체 도메인으로 표지화시켰다. 적절한 프라이머와 함께 pRSET RLuc8을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 돌연변이유발을 수행하였다(표 5)(Zheng et al., 2004). MBP(K289C)RLuc8(SEQ ID NO: 34)을 인코딩하는 플라스미드를 식별하고, DNA 시퀀싱에 의해 확증하였다.
모든 작제물은 N-말단 헥사-히스티딘 태그와 함께 발현되었다.
RLuc8 센서의 발현 및 정제
야생형(wt) RLuc8, 시스테인 변이체, RLuc8Cys1, 2, 3, 4 및 5, 및 MBP(K239C)RLuc8을 이. 콜라이 BL21(DE3)(New England BioLabs)에서 발현시켰다. 밤샘 배양물을 100 μg /mL 암피실린 및 2% 글루코스를 함유하는 LB(1 L 당 10 g 트립톤, 5 g 효모 추출물, 5 g NaCl(pH 7.0)) 중 단일 콜로니로부터 37℃, 200 rpm에서 성장시켰다. 밤샘 배양물을 사용하여 250 mL LB(100 μg/mL 암피실린)를 0.05의 OD600까지 접종하였고, 배양물을 37℃, 200 rpm에서 4.5시간 동안 인큐베이션하였다. 온도를 22℃까지 감소시키고 200 rpm에서 밤새 인큐베이션함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리(4000 x g, 10분, 4℃)에 의해 수확하였다. 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 PBS로 세척한 후, 50 mM NaPi, 0.1 M NaCl, pH 7.0에 재현탁시켰다. 균질기(미세유체 M-110P)를 P= 20,000 psi에서 사용하여 세포를 분열시키고, 가용성 분획을 원심분리(15 000 x g, 15분, 4℃)에 의해 단리하였다. 코발트 친화성 크로마토그래피(TALON® Superflow 금속 친화성 수지(Takara Clontech, 오스트레일리아))를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 His6-태깅된 단백질을 단리하였다. 150 mM 이미다졸, 50 mM NaPi, 0.1 M NaCl(pH 7.4)을 이용한 용리 후, 단백질을 투석 유닛(Novagen, D-Tube? Dialyzer Mega, MWCO 6 내지 8 kDa)을 사용하여 MES 완충제(50 mM MES, 50 mM NaCl, pH 7.5)에 대해 투석하였다. 정제된 단백질을 액체 질소 내에서 순간-냉동시키고, -80℃에서 저장하였다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 방법(Sigma Aldrich 프로토콜)을 사용하여 결정하였다.
[표 5]
pRSET RLuc8 Cys 돌연변이체의 제조에 사용된 올리고뉴클레오타이드.
* F는 포워드 프라이머이고; R은 리버스 프라이머이다.
** RLuc8의 N-말단 잔기와 도입된 시스테인 사이의 아미노산의 수.
***위치 239의 시스테인 잔기와 RLuc8의 중심 사이의 거리는 Qiagen으로부터 입수 가능한 CLCsequence view 8, 및 MBP의 결정 구조를 사용하여 추정하였다(PDB ID: 1ANF; Quiocho et al., 1997).
RLuc8 변이체의 바이오컨쥬게이션
8:2 MES:HEPES, pH 5.5(50 mM MES, 50 mM NaCl, pH 3.6; 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.5) 중 RLuc8 또는 RLuc8 변이체(10 μM)를 10 당량(100 μM)의 플루오레세인-5-말레이미드(FM; Sapphire Bioscience), 설포로다민 B,C2-말레이미드(RM; Serateh Biotech, USA) 또는 플루오레세인-디아세테이트-6-말레이미드(FD; Sapphire Bioscience)(DMSO 중 10 내지 20 mM 스탁으로부터)와 함께 25℃에서 5분 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 종료 시, RLuc8 바이오컨쥬게이트를 HiTrapTM 탈염 컬럼(GE Healthcare) 상에서 정제하여, 과량의 표지화 작용제를 제거하였다. MES pH 5.0(50 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.0)을 용리 완충제로서 사용하였다. RLuc8 바이오컨쥬게이트를 액체 질소 내에서 순간-냉동시키고, -80℃에서 저장하였다.
RLuc8 바이오컨쥬게이트 정량화
완충제(50 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.0) 중 5 μL의 BSA 표준(0, 0.1, 0.3, 0.6, 1.0, 1.4 mg/mL) 또는 RLuc8 바이오컨쥬게이트를 투명한 96-웰 플레이트의 개별 웰에 3벌 중복하여 분배하였다. 250 μL의 실온 브래드포드 시약(Sigma Aldrich)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 30초 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 595 nm에서의 흡광도(A595)를 측정하였다. 샘플의 A595를 BSA 표준 농도에 대해 도시함으로써 표준 곡선을 구축하였다. 순(net) A595 값을 표준 곡선에 대해 비교함으로써, RLuc8 바이오컨쥬게이트 농도를 결정하였다.
RLuc8 바이오컨쥬게이트의 SDS-PAGE
RLuc8 바이오컨쥬게이트(5 μg) 및 NuPage LDS 샘플 완충제 4x(ThermoFisher)를 혼합하고, 샘플을 98℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 샘플을 NuPage bis-tris 겔(ThermoFisher) 상에 로딩(load)하고, 200 V에서 40분 동안 진행(run)시켰다. 형광 겔을 gelDoc(5 msec 노출(exposition))에서 기록하고, Coomassie BullDog 염색에서 염색하였다.
BRET 검정법
BRET 검정법을 96-웰 플레이트(Perkin-Elmer, 오스트레일리아)에서 100 μL의 최종 부피로 수행하였다. 1 μM의 정제된 단백질을 모든 BRET 검정법을 위해 100 μL의 최종 부피로 사용하였고, 이때, 단백질을 8:2 HEPES:MES, pH 7.5(50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.8; 50 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.0)에 희석시켰다.
BRET 측정을 위해, EtOH 중 1 μL의 코엘렌테라진 400a를 반응 혼합물(최종 [coel 400a] = 17 μM)에 첨가하고, 1 msec 동안 흔들고, 스펙트럼 스캔을 즉시 기록하였다. 스펙트럼 스캔을 Spectramax M3 플레이트-판독 분광형광계(Molecular Devices)를 이용하여 기록하였다. 플루오레세인 기반 센서의 경우, 발광 스캔 모드를 360 내지 600 nm에서 20 nm 간격으로 사용하여 생물발광 스캔을 기록하였다. 로다민 기반 센서의 경우, 발광 스캔 모드를 360 내지 700 nm에서 20 nm 간격으로 사용하여 생물발광 스캔을 기록하였다.
데이터 분석
BRET2 비를, 최대 공여체 방출 강도(420 nm)에 대한 최대 수용체 방출 강도(520 nm(플루오레세인) 또는 600 nm(로다민))의 비로서 계산하였다.
결과
예시된 센서 분자에 있어서 BERT에 대한 연결 요소의 길이의 효과를 추가로 평가하기 위해, 시스테인 잔기를 위치 2(RLuc8Cys5; SEQ ID NO: 33) 및 위치 11(RLuc8Cys4; SEQ ID NO: 32)에서 N-말단 연결 요소 내에 도입하였다. 공여체 도메인과 수용체 도메인 사이의 더 큰 갭의 영향을 평가하기 위해 MBP(K239C)RLuc8 융합을 또한 발생시켰다(표 5). RLuc8Cys 변이체를 플루오레세인-5-말레이미드(FM) 또는 설포로다민 B,C2-말레이미드(RM)로 표지하고, BRET 스펙트럼을 FM 변이체(도 7a) 및 RM 변이체(도 7b)에 대해 측정하였다. FM 및 RM 변이체들에 대한 BRET 비를 또한 계산하였다(도 7c). 도 7a 내지 도 7c에 도시된 바와 같이, 공여체와 수용체 사이의 아미노산의 수가 증가함에 따라, BRET 비는 감소한다. 또한 도 7a 내지 도 7c에 도시된 바와 같이, BRET 비는 FM 변이체의 경우 더 크고, 이들 변이체는 추가의 조사를 위해 선택되었다. 그러나, RM 변이체의 BRET 비는 로다민이 본 출원의 센서에 사용되기에 적합할 것임을 나타낸다.
실시예 5 - 에스터라제 활성의 측정
재료 및 방법
백색 96-웰 플레이트에서, 1 μM의 RLuc8Cys(변이체)-플루오레세인 디아세테이트 센서(RLuc8Cys-FD))를 2.9 U의 돼지 간 에스터라제(PLE)(Sigma-Aldrich #E3019)와 함께 다양한 온도에서 10분, 20분, 40분 또는 60분 동안 인큐베이션하였다(표 6). 최종 반응 혼합물은 20% 40 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.0, 및 80%의, 표 6에 기재된 완충제를 함유하였다.
인큐베이션 시간 종료 시, EtOH 중 1 μL의 코엘렌테라진 400a를 첨가하고(최종 [coel 400a] = 17 μM)에 첨가하고, 스펙트럼 스캔을 실시예 4에 기재된 바와 같이 즉시 기록하였다. 센서의 화학적 가수분해를 평가하기 위해, 동일한 검정법을 PLE의 부재 하에 수행하였다. 데이터를 센서의 화학적 가수분해에 대해 보정하였다. pH 7.0, pH 7.5 및 pH 8.0에서의 실험을 단지 20분 동안 수행하였다. pH 6.0 및 pH 6.5에서의 실험을 20분, 40분 및 60분에 걸쳐 모니터링하였다.
[표 6]
RLuc8Cys-FD를 사용하는 에스터라제 검정법에 사용되는 완충제
결과
초기 실험은 에스터라제, PLE의 활성을 20℃ 및 pH 7.0에서 검출하고 측정하는 RLuc8Cys2-플루오레세인-디아세테이트 센서, RLuc8Cys3-플루오레세인-디아세테이트 센서 및 RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트 센서의 능력을 특징으로 하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, BRET 비의 증가 퍼센트는 RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트 센서에서 가장 컸다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 에스테르 연결은 RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트 센서에서 더 접근 가능한 것으로 생각된다. 따라서 RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트 센서를 추가의 조사를 위해 선택하였다.
에스터라제의 활성을 검출하고 측정하는 RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트 센서의 능력을 추가로 특성규명하기 위해, 센서를 다양한 pH 및 온도에서 PLE와 반응시켰다. 도 9a 내지 도 9c에 제시된 바와 같이, PLE를 이용한 RLuc8Cys4-플루오레세인-디아세테이트 센서의 처리는 부분적으로 비차단된 수용체를 산출하였으며, pH 6.5, 7.0 및 7.5에서 BRET 비를 증가시켰다. pH 6.0에서, PLE의 활성은 검출 불가능하였고, 이는 PLE의 알려진 pH 의존도와 일관된 것이었다. pH 8.0에서, 센서의 화학적 가수분해의 속도가 에스터라제 활성의 속도보다 더 높았으므로, PLE의 활성은 검출 불가능하였다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 시간 경과에 따른 BRET 비의 증가 %의 선형성(linearity)의 결여 또한 센서의 화학적 가수분해의 결과인 것으로 생각된다. 또한 에스터라제 효소가 화학적 가수분해(배경 가수분해)의 속도에 비해 시간 경과에 따라 활성을 상실하고 있는 것이 가능하다.
실시예 6 - 밀크 저온살균의 유효성을 평가하기 위한 포스파타제 활성의 측정.
포스파타제(EC 3.1.3.x)는 포스포모노에스테르의 가수분해를 촉매작용하는 하이드롤라제의 하위부류이다. 포스파타제 효소는 핵산 형질전환, 단백질의 번역후 변형, 및 생물에너지학(bioenergetics)과 2차 대사의 많은 반응들에 관여하며 자연에서 대체로 어디에나 있다. 포스파타제 활성, 또는 포스파타제 활성의 저해제의 효과는 본 개시내용에 정의된 센서를 사용하여 편리하게 측정될 수 있다. 예를 들어, 알칼리성 포스파타제(EC 3.1.3.1)는 광범위하게 분포된 포스파타제이고, 이의 활성의 측정은 종종 다양한 의료 및 다른 진단 목적들을 위한 대용물로서 사용된다. 예를 들어, 잔여 알칼리성 포스파타제 활성의 측정은 생 밀크의 저온살균의 유효성을 평가하는 데 사용될 수 있는데(Kay, 1935; Hoy 및 Neave, 1937; Rankin et al., 2010), 왜냐하면 생 밀크에 천연적으로 존재하는 알칼리성 포스파타제 활성을 불활성화시키는 데 필요한 온도-시간 프로파일이 밀크에 잠재적으로 존재하는 주요 병원체를 불활성화시키는 데 필요한 것보다 약간 더 엄격하기 때문이다. 따라서, 본원에 기재된 유형의 포스페이트-차단된 센서(예를 들어, 표 1 참조)는 처리 후 또는 처리 전과 후에 알칼리성 포스파타제의 잔여 수준을 측정함으로써 밀크의 저온살균의 유효성을 결정하는 데 적용될 수 있다.
재료 및 방법
BRET 검정법을 96-웰 플레이트에서 100 μL의 최종 부피로 수행할 것이다. 스펙트럼 스캔을 백색 96-웰 플레이트(Opti-plate?-96, PerkinElmer)에서 발광 모드(20 nm 증분)에서 Spectramax M3 플레이트-판독 분광형광계(Molecular Devices)로 기록할 것이다.
1 μM의 본원에 정의된 센서 분자, 예컨대, R1이 RLuc8을 포함하며, L이 시스테인 잔기를 포함하는 28개의 아미노산 폴리펩타이드를 포함하고, B에 결합된 R2가 플루오레세인 포스페이트 또는 플루오레세인 디포스페이트(표 1에 제시된 바와 같음)이고, B에 결합된 R2가 말레이미드 연결기를 통해 28개의 아미노산 폴리펩타이드 상의 시스테인 잔기에 부착되는 센서 분자. 센서를, 적합한 완충제, 예컨대, 100 mM TrisHCl, 68 mM NaCl, pH 8.0을 사용하여 요망되는 농도까지 희석시킬 것이고, 45 μL의 이러한 조제물을 50 μL의 밀크와 혼합할 것이다. 임의의 적합한 밀크, 예를 들어, 대조군으로서의 소의 생 밀크, 또는 저온살균된 밀크를 검정법에 사용할 수 있으며, 이는 달리 비변형되거나 변형된 수준의 지방 및/또는 단백질, 및/또는 락토스를 가지거나 실제로 추가의 열처리 또는 첨가(예컨대, 풍미제 또는 착색제)를 거칠 것이다. 밀크와 센서의 혼합물을 20℃ 내지 30℃에서 1분 내지 120분, 전형적으로 5분 내지 10분의 기간 동안 인큐베이션할 것이다. 인큐베이션 시간 종료 시, EtOH 중 5 μL의 코엘렌테라진 400a를 (17 μM의 최종 코엘렌테라진 400a 농도까지) 첨가하여, 반응물을 100 μL의 최종 부피까지 만들 것이고, 스펙트럼 스캔을 즉시 기록할 것이다. BRET 비를 피크 공여체 방출 강도에 대한 피크 형광 수용체 방출 강도의 비로서 계산할 것이며, RLuc의 경우 BRET 비는 전형적으로 420 nm에서 존재할 것이다. 대안적으로, 공여체 및 수용체 방출의 강도를 밴드패스(bandpass) 또는 다른 스펙트럼 필터를 갖는 기기, 예컨대, Clariostar 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 측정할 수 있으며, BRET 비를 형광 수용체 방출 강도에 대한 RLuc 방출 강도의 비로서 계산할 수 있다. 이러한 검정법을 또한 예컨대, WO 2013/155553 및 PCT/AU2018/050824에 기재된 미세유체 장치 상에서 수행할 수 있다.
데이터 분석 및 결과의 해석
공지된 양의 알칼리성 포스파타제 및/또는 저온살균되지 않은 생 밀크 샘플(높은 수준의 알칼리성 포스파타제를 가짐) 및 확실히 저온살균된 밀크 또는 심지어 UHT 밀크 샘플(매우 낮거나 검출 불가능한 수준의 알칼리성 포스파타제를 가짐)을 사용하여 전형적으로 관찰되는 BRET 비의 변화와 비교함으로써 저온살균의 유효성을 평가할 것이다. 성공적인 저온살균은 낮거나 검출 불가능한 수준의 알칼리성 포스파타제를 가질 것이다. 따라서, 밀크가 성공적으로 저온살균된 경우, 낮은 BRET 비에 상응하여, 높은 수준의 RLuc 공여체 방출 강도 및 낮은 수준의 형광 수용체 모이어티 방출 강도가 관찰될 것이다. 성공적이지 못한 저온살균, 또는 저온살균되지 않은 우유로 인한 저온살균된 우유의 오염의 경우, 상승된 BRET 비 또는 높은 BRET 비에 상응하여, 더 낮은 수준의 공여체 피크 방출 강도 및 더 높은 수준의 수용체 피크 방출 강도가 관찰될 것이다. 음성 대조군 샘플보다 높은 BRET 비의 중간 정도의 상승조차 우려 요인인 것으로 여겨질 것이며, 이는 불완전한 저온살균 또는 저온살균되지 않은 밀크로 인한 오염을 나타낼 것이다.
실시예 7 - 전-임상 또는 임상 유선염을 진단하기 위한 포스파타제 활성의 측정.
소에서의 전-임상 및 임상 유선염은 밀크에서 알칼리성 포스파타제(EC3.1.3.1)의 상승과 연관이 있고, 이는 염증을 갖는 쿼터(quarter) 또는 쿼터들로부터의 밀크에 국소화될 수 있다(Bogin and Ziv, 1973). 연구는 홀스타인(Holstein) 소의 밀크에서 알칼리성 포스파타제를 측정하는 것이 개별 소에서 준-임상(subclinical) 유선염을 진단하는 데 사용되기에 충분한 민감성 및 특이성을 가진다는 것을 나타낸다(Babaei et al., 2007). 따라서, 본원에 기재된 유형의 포스페이트-차단된 센서(예를 들어, 표 1 참조)는 개별 소, 또는 소로부터의 특정 쿼터가 전-임상 유선염 또는 유선염을 경험할 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
재료 및 방법
BRET 검정법을 96-웰 플레이트에서 100 μL의 최종 부피로 수행할 것이다. 스펙트럼 스캔을 백색 96-웰 플레이트(Opti-plate?-96, PerkinElmer)에서 발광 모드(20 nm 증분)에서 Spectramax M3 플레이트-판독 분광형광계(Molecular Devices)로 기록할 것이다.
1 μM의 본원에 정의된 센서 분자, 예컨대, R1이 RLuc8을 포함하며, L이 시스테인 잔기를 포함하는 28개의 아미노산 폴리펩타이드를 포함하고, B에 결합된 R2가 플루오레세인 포스페이트 또는 플루오레세인 디포스페이트(표 1에 제시된 바와 같음)이고, B에 결합된 R2가 말레이미드 연결기를 통해 28개의 아미노산 폴리펩타이드 상의 시스테인 잔기에 부착되는 센서 분자. 센서를, 적합한 완충제, 예컨대, 100 mM TrisHCl, 68 mM NaCl, pH 8.0을 사용하여 요망되는 농도까지 희석시킬 것이다. 45 μL의 센서를 50 μL의 비변형된 소의 생 밀크와 혼합할 것이다. 샘플을 젖통의 각 쿼터로부터 별도로 수합할 수 있거나, 대안적으로 샘플을 2개 이상의 쿼터들로부터 조합할 수 있다. 센서와 함께 밀크를 20℃ 내지 30℃에서 1분 내지 120분, 전형적으로 5분 내지 10분의 시간 동안 인큐베이션할 것이다. 인큐베이션 시간 종료 시, 에탄올 중 5 μL의 코엘렌테라진 400a를 (17 μM의 최종 코엘렌테라진 400a 농도까지) 첨가할 것이고, 스펙트럼 스캔을 즉시 기록하였다. BRET 비를 피크 공여체 방출 강도에 대한 피크 형광 수용체 방출 강도의 비로서 계산할 것이며, RLuc의 경우 BRET 비는 전형적으로 420 nm에서 존재할 것이다. 대안적으로, 공여체 및 수용체 방출의 강도를 밴드패스 또는 다른 스펙트럼 필터를 갖는 기기, 예컨대, Clariostar 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 측정할 수 있으며, BRET 비를 형광 수용체 방출 강도에 대한 RLuc 방출 강도의 비로서 계산할 수 있다. 이러한 검정법을 또한 예컨대, WO 2013/155553 및 PCT/AU2018/050824에 기재된 미세유체 장치 상에서 수행할 수 있다.
데이터 분석 및 결과의 해석
검정법이 (예를 들어, 유선염을 갖고 있는 것으로 의심되는 소로부터의) 시험 샘플을 사용하여 수행되는 경우에 수득되는 BRET 비를, 동일한 무리의 건강한 동물로부터의 생 밀크 샘플 또는 동일한 동물로부터의 이전의 밀크 수합물을 사용하여 검정법이 수행되는 경우에 수득되는 BRET 비에 대해 비교함으로써, 또는 이상적으로는 각 소의 각 쿼터에서 측정되는 알칼리성 포스파타제 활성의 이전 기록과 비교함으로써, 유선염 또는 준-임상 유선염의 가능성을 평가할 것이다. 이 접근법은, 개별 쿼터로부터의 밀크를 일상적으로 수합하고 분석하는 자동화된 현대적인 착유 시스템을 사용하는 경우 실현 가능하다.
상승된 수준의 알칼리성 포스파타제는 더 낮은 수준의 공여체 피크 방출 강도 및 더 높은 수준의 수용체 피크 방출 강도(본원에 기재된 바와 같은 상승된 BRET 비 또는 높은 BRET 비에 상응함)를 초래할 것이다. 통계학적 임계값, 예컨대, 해당 소 또는 해당 쿼터로부터 이전에 관찰된 평균 수준보다 높은 1 내지 3 표준 편차 이상의 알칼리성 포스파타제 활성의 상승은, 언제 BRET 비의 상승이 우려 요인인 것으로 여겨질지 및/또는 언제 추적 조사를 촉발할지를 결정하는 데 사용될 수 있을 것이다.
실시예 8 - 리파제 활성의 측정
리파제(EC 3.1.1.x)는 알코올과 중간쇄 내지 장쇄 지방산 사이에서 형성된 에스테르를 가수분해하는 에스터라제의 하위-부류이다. 리파제는 자연에서 어디에나 있고, 많은 중요한 산업적 및 다른 용도들을 밝혀냈다. 따라서, 임상 진단, 생산 가공에 있어서, 그리고 리파제를 함유하는 상업적인 제품을 제형화하는 동안의 품질 관리의 일부를 포함하는 다양한 상황에서 리파제 활성을 측정하는 것이 중요하다(Stoytcheva et al., 2012). 리파제 활성의 측정은, B가 예를 들어, 아실에스테르 결합을 통해 형광단에 연결된 중간쇄 내지 장쇄 지방산 또는 아실 또는 디아실 글리세롤인, 본원에 기재된 센서를 사용하여 달성될 수 있다.
재료 및 방법
BRET 검정법을 96-웰 플레이트에서 100 μL의 최종 부피로 수행할 것이다. 스펙트럼 스캔을 백색 96-웰 플레이트(Opti-plate?-96, PerkinElmer)에서 발광 모드(20 nm 증분)에서 Spectramax M3 플레이트-판독 분광형광계(Molecular Devices)로 기록할 것이다.
본원에 정의된 바와 같은 센서 분자, 예컨대, R1이 RLuc8을 포함하며, L이 시스테인 잔기를 포함하는 28개의 아미노산 폴리펩타이드를 포함하고, B에 결합된 R2가 플루오레세인 라우레이트 또는 플루오레세인 디라우레이트이고, B에 결합된 R2가 말레이미드 연결기를 통해 28개의 아미노산 폴리펩타이드 상의 시스테인 잔기에 부착되는 센서 분자를, 적합한 완충제(예를 들어, 50 내지 100 mM NaCl, 40 내지 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.0125 내지 0.05%(v/v) Zwittergent 또는 Triton X-100, 또는 동등한 미셀(micelle) 형성 세제, 및 2 내지 4%(w/v) 지방산-비함유 소 혈청 알부민을 사용하여 2 내지 5 μM의 최종 농도까지 희석시킬 것이다(Basu et al., 2011을 기반으로 함). 45 μL의 이러한 조제물을 50 μL의 리파제 함유 샘플과 혼합할 것이고, 20℃ 내지 30℃에서 1분 내지 120분, 전형적으로 5분 내지 10분의 시간 동안 인큐베이션할 것이다. 인큐베이션 시간 종료 시, EtOH 중 5 μL의 코엘렌테라진 400a를 (17 μM의 최종 코엘렌테라진 400a 농도까지) 첨가하고, 스펙트럼 스캔을 즉시 기록할 것이다. BRET 비를 피크 공여체 방출 강도에 대한 피크 형광 수용체 방출 강도의 비로서 계산할 것이며, RLuc의 경우 BRET 비는 전형적으로 420 nm에서 존재할 것이다. 대안적으로, 공여체 및 수용체 방출의 강도를 밴드패스 또는 다른 스펙트럼 필터를 갖는 기기, 예컨대, Clariostar 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 측정할 수 있으며, BRET 비를 형광 수용체 방출 강도에 대한 RLuc 방출 강도의 비로서 계산할 수 있다. 대안적으로, 공여체 및 수용체 방출의 강도를 밴드패스 또는 다른 스펙트럼 필터를 갖는 기기, 예컨대, Clariostar 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 측정할 수 있으며, BRET 비를 형광 수용체 방출 강도에 대한 RLuc 방출 강도의 비로서 계산할 수 있다. 이러한 검정법을 또한 예컨대, WO 2013/155553 및 PCT/AU2018/050824에 기재된 미세유체 장치 상에서 수행할 수 있다.
검정법을 수행하기 전에, 리파제 함유 샘플을 예를 들어, Iglesias 등, 2016에서 언급된 것들로부터 선택되는 특이적인 리파제 저해제와 함께 사전-인큐베이션할 수 있고, 이는 리파제 검정법의 특이성을 관심 리파제 또는 리파제들에 대해서만 조율될 수 있게 할 것이다.
검정법을 비제한적으로, 관심 리파제(들)를 함유하는 임상 샘플 또는 다른 유형의 생물학적 샘플 또는 산업적 샘플을 포함하는 샘플을 함유하는 잠재적인 리파제로 수행할 수 있을 것이다.
데이터 분석 및 결과의 해석
센서 변형의 정도와 그에 따른 BRET 비의 변화를, 알려진 양의 표준 리파제에 의해 동일한 조건 하에 유발된 BRET 비의 변화와 비교함으로써, 특이적인 리파제 저해제의 존재 또는 부재 하에 특정 리파제의 상대 활성을 평가할 수 있다. 비슷한 조건 하에, 더 높은 수준의 리파제 활성은 더 낮은 수준의 공여체 피크 방출 강도 및 더 높은 수준의 수용체 피크 방출 강도(본원에 정의된 바와 같은 상승된 BRET 비 또는 높은 BRET 비에 상응함)를 초래할 것이다.
실시예 9 - 에스터라제, 포스파타제 또는 리파제 활성의 계산
.
본원에 정의된 센서로 측정된 바와 같은 BRET 비의 변화로부터 에스터라제, 포스파타제 또는 리파제 활성을 계산할 수 있다. 효소 활성은 상대적인 용어로 편리하게 표현될 수 있고, 이 경우에는 시간 경과에 따른 BRET 비의 변화로 편리하게 표현될 수 있다. 표준 검정법 조건 하에 샘플들 사이에서 및/또는 샘플과 표준 사이에서, 및/또는 샘플과 양성 및 음성 대조군들 사이에서 BRET 비의 변화(예를 들어, 1분의 기간에 걸친 BRET 비의 수적 변화) 속도를 비교하는 것은 본원에 정의된 에스터라제, 포스파타제 및 리파제 또는 다른 하이드롤라제 센서의 대부분의 실용적인 적용들에 적합할 것이다.
결과를 절대 용어(즉, 1분 당 전환되는 기질의 마이크로몰)로 추정하는 것이 요망된다면, 본원에 정의된 BRET 기반 센서는 미지의 샘플에 의해 야기되는 BRET 비의 변화 속도를, 동일한 에스터라제, 포스파타제, 리파제 또는 다른 하이드롤라제 효소의 정제된 조제물에 의해 야기되는 BRET 비의 변화 속도와 비교함으로써 교정될 수 있으며, 이들의 비활성도(specific activity)는 동일한 또는 유사한 조건 하에 또 다른 수단에 의해 결정되어 왔다. 효소의 이러한 정제된 많은 조제물들은 다양한 공급업체들, 예컨대, Merck로부터 상업적으로 입수 가능하다. 대안적으로, 병행 검정법에서 코엘렌테라진을 후자의 반응으로부터 생략하고 대신에 비차단된 형광단의 농도 증가 속도를 흡광도 분광분석법을 사용하여 측정함으로써 기질의 전환 속도를 추정할 수 있다. 차단된 플루오레세인기, 예컨대, 플루오레세인 아세테이트, 플루오레세인 포스페이트 또는 플루오레세인 라우레이트의 경우, 당업자는 주어진 파장에서의 플루오레세인의 공개된 몰 흡수성, 및 임의의 백그라운드 흡수를 차감시키는 검정법 pH(예를 들어, Sjoback et al., 1995에 개시된 바와 같음)을 사용하여, 동일한 검정법 조건들 하에서 BRET 비의 변화 속도를 1분 당 전환되는 센서의 몰 수로서 교정할 것이다. 교정은 일단 수행되면, 유사하거나 동일한 조건 하에 상이한 시점들에서 취해진 측정에 적용될 수 있었다.
효소 활성을 비활성도(즉, 1 mg의 단백질 당 1분 당 전환되는 기질의 마이크로몰)로 표현하는 것이 요망된다면, 임의의 일반적으로 허용 가능한 방법, 예컨대, 280 nm에서의 흡수, 브래드포드 단백질 검정법, 로리(Lowry) 단백질 검정법, 비시초닌산(bicinchoninic acid) 단백질 검정법, 또는 공개되고/되거나 상업적으로 입수 가능한 대안들 중 임의의 것 또는 당업자에게 알려져 있는 이들 방법의 변형을 이용하여 샘플 내 단백질의 농도를 추정하는 것이 또한 필요할 것이다.
샘플에 존재하는 효소의 양을 활성의 측면에서가 아니라 오히려 질량으로서 표현하는 것이 요망된다면, 이를 관심 효소의 순수한 조제물에 대한 전형적인 또는 측정된 비활성도를 사용하여 계산하는 것이 가능할 것이다. 예를 들어, 상기 접근법을 사용하여, 특정 에스터라제-함유 샘플이 검정법에서 1분 당 전환되는 0.005 마이크로몰의 기질과 동등한 것으로 결정되었던 BRET 비의 변화 속도를 뒷받침하고, 순수한 에스터라제의 비활성도가 1 밀리그램의 단백질 당 1분 당 전환되는 100 마이크로몰의 기질인 것으로 알려져 있다면, 존재하는 에스터라제의 양은 어떤 부피의 샘플이 사용되었든지 간에 0.005/100 = 0.00005 mg 또는 50 ng으로서 계산될 수 있을 것이다.
이를 몰 수로서 표현하는 것이 요망된다면, 당업자는 관심 효소의 공개된 분자 질량을 적용할 것이다. 예를 들어, 돼지 간 카복실에스터라제(M = 163,000 ± 15,000; Horgan et al., 1969)의 경우에, 그리고 상기로부터의 임의 실시예 값을 사용하는 경우에, 존재하는 에스터라제의 몰 양은 대략 50 ng/163,000 gM-1 
0.3 펨토몰로서 추정될 것이다.
본 출원은 2017년 8월 24일에 출원된 오스트레일리아 출원 제2017903420호로부터 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
당업자는 광범위하게 기재된 바와 같은 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 특정 구현예에 제시된 바와 같이, 본 발명에 많은 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 구현예는 모든 측면에서 예시적이지만 제약적이지 않은 것으로 여겨져야 한다.
본원에서 고찰되고/되거나 참조된 모든 간행물은 이들의 전문이 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 포함되었던 문헌, 법령, 물질, 장치, 물품 등에 대한 임의의 고찰은 오직 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이들 내용 중 임의의 것 또는 전부는 종래 기술 기초의 일부를 형성하거나, 본 출원의 각 청구의 우선권 날짜 이전에 존재하는 바와 같은 본 발명과 관련된 분야의 공통적인 일반 지식인 것으로 인정되지 않아야 한다.
참조문헌
SEQUENCE LISTING
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Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Glx Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly
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Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp
85 90 95
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys
100 105 110
Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His
115 120 125
Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu
130 135 140
Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu
145 150 155 160
Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu
165 170 175
Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg
180 185 190
Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro
210 215 220
Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr
225 230 235 240
Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu
245 250 255
Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys
260 265 270
Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln
275 280 285
Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu
290 295 300
Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
305 310
<210> 11
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding wt-RLuc8
<400> 11
atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga attcatggct 120
tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct 180
cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc ttcatcaact actatgattc cgagaagcac 240
gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt aacgctacct ccagctacct gtggaggcac 300
gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt 360
aagtccggca agagcgggaa tggctcatat cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc 420
gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg 480
gctgctctgg cctttcacta cgcctacgag caccaagaca ggatcaaggc catcgtccat 540
atggagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat 600
atcgccctga tcaagagcga agagggcgag aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc 660
gagaccgtgc tcccaagcaa gatcatgcgg aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac 720
ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag 780
atccctctcg ttaagggagg caagcccgac gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc 840
taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag ctgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt 900
tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag 960
ggcctccact tcctccagga ggacgctcca gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc 1020
gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1050
<210> 12
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding RLuc8Cys1
<400> 12
atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga atgcatggct 120
tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct 180
cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc ttcatcaact actatgattc cgagaagcac 240
gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt aacgctacct ccagctacct gtggaggcac 300
gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt 360
aagtccggca agagcgggaa tggctcatat cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc 420
gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg 480
gctgctctgg cctttcacta cgcctacgag caccaagaca ggatcaaggc catcgtccat 540
atggagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat 600
atcgccctga tcaagagcga agagggcgag aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc 660
gagaccgtgc tcccaagcaa gatcatgcgg aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac 720
ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag 780
atccctctcg ttaagggagg caagcccgac gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc 840
taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag ctgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt 900
tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag 960
ggcctccact tcctccagga ggacgctcca gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc 1020
gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1050
<210> 13
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding RLuc8Cys2
<400> 13
atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga ctgcgacgat aaggatcgat ggggatccga attcatggct 120
tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct 180
cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc ttcatcaact actatgattc cgagaagcac 240
gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt aacgctacct ccagctacct gtggaggcac 300
gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt 360
aagtccggca agagcgggaa tggctcatat cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc 420
gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg 480
gctgctctgg cctttcacta cgcctacgag caccaagaca ggatcaaggc catcgtccat 540
atggagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat 600
atcgccctga tcaagagcga agagggcgag aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc 660
gagaccgtgc tcccaagcaa gatcatgcgg aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac 720
ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag 780
atccctctcg ttaagggagg caagcccgac gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc 840
taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag ctgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt 900
tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag 960
ggcctccact tcctccagga ggacgctcca gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc 1020
gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1050
<210> 14
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding RLuc8Cys3
<400> 14
atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg ttgccagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga attcatggct 120
tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct 180
cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc ttcatcaact actatgattc cgagaagcac 240
gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt aacgctacct ccagctacct gtggaggcac 300
gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt 360
aagtccggca agagcgggaa tggctcatat cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc 420
gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg 480
gctgctctgg cctttcacta cgcctacgag caccaagaca ggatcaaggc catcgtccat 540
atggagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat 600
atcgccctga tcaagagcga agagggcgag aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc 660
gagaccgtgc tcccaagcaa gatcatgcgg aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac 720
ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag 780
atccctctcg ttaagggagg caagcccgac gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc 840
taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag ctgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt 900
tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag 960
ggcctccact tcctccagga ggacgctcca gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc 1020
gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1050
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys1-F
<400> 15
atggggatcc gaatgcatgg cttccaagg 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys1-R
<400> 16
ccttggaagc catgcattcg gatccccat 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys2-F
<400> 17
ggatctgtac gactgcgacg ataaggatcg 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys2-R
<400> 18
cgatccttat cgtcgcagtc gtacagatcc 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys3-F
<400> 19
ctagcatgac tggttgccag caaatgggtc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys3-R
<400> 20
gacccatttg ctggcaacca gtcatgctag 30
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High affinity substrate for mTG
<400> 21
Trp Ala Leu Gln Arg Pro His
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High affinity substrate for mTG
<400> 22
Trp Glu Leu Gln Arg Pro Tyr
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sortase recognition sequence
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X is any amino acid
<400> 23
Leu Pro Xaa Thr
1
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spacer sequence
<400> 24
Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer sequence
<400> 25
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer sequence
<400> 26
Gly Gly Thr Gly Gly Gly
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer sequence
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer sequence
<400> 28
Leu Gln Gly Gly Thr Gly Gly Gly
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Specaer sequence
<400> 29
Phe Glu Gly Gly Thr Gly Gly Gly
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer sequence
<400> 30
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High affinity substrate for mTG
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> Z
<222> (5)..(5)
<223> Z is Gly or Ala
<400> 31
Leu Pro Xaa Thr Glx
1 5
<210> 32
<211> 349
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys4
<400> 32
Met Arg Gly Ser His His His His His His Cys Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln
35 40 45
Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln
50 55 60
Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His
65 70 75 80
Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr
85 90 95
Leu Trp Arg His Val Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile
100 105 110
Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly
115 120 125
Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu
130 135 140
Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys
165 170 175
Ala Ile Val His Met Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp
180 185 190
Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu
195 200 205
Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu
210 215 220
Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser
245 250 255
Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val
260 265 270
Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile
290 295 300
Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys
305 310 315 320
Gly Leu His Phe Leu Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr
325 330 335
Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
340 345
<210> 33
<211> 349
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys5
<400> 33
Met Cys Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln
35 40 45
Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln
50 55 60
Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His
65 70 75 80
Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr
85 90 95
Leu Trp Arg His Val Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile
100 105 110
Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly
115 120 125
Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu
130 135 140
Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys
165 170 175
Ala Ile Val His Met Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp
180 185 190
Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu
195 200 205
Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu
210 215 220
Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr
225 230 235 240
Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser
245 250 255
Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val
260 265 270
Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile
290 295 300
Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys
305 310 315 320
Gly Leu His Phe Leu Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr
325 330 335
Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
340 345
<210> 34
<211> 724
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP(K239C)RLuc8
<400> 34
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile
35 40 45
Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys
50 55 60
Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp
65 70 75 80
Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro
85 90 95
Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser
100 105 110
Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu
115 120 125
Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala
130 135 140
Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu
145 150 155 160
Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys
165 170 175
Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu
180 185 190
Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe
195 200 205
Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn
210 215 220
Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn
225 230 235 240
Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe
245 250 255
Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser
260 265 270
Asn Ile Asp Thr Ser Cys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr
275 280 285
Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly
290 295 300
Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu
305 310 315 320
Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys
325 330 335
Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys
340 345 350
Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile
355 360 365
Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr
370 375 380
Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu
385 390 395 400
Lys Asp Ala Gln Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Phe Glu Met Ala Ser
405 410 415
Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro Gln
420 425 430
Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile Asn
435 440 445
Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu His
450 455 460
Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val Pro His Ile
465 470 475 480
Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys
485 490 495
Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His Tyr Lys
500 505 510
Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys Ile Ile
515 520 525
Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr Ala Tyr
530 535 540
Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu Ser Val Val
545 550 555 560
Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp Ile
565 570 575
Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn Asn
580 585 590
Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu
595 600 605
Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly Glu
610 615 620
Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val Lys
625 630 635 640
Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr
645 650 655
Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser Asp Pro
660 665 670
Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn
675 680 685
Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln Glu Asp Ala
690 695 700
Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val Leu
705 710 715 720
Lys Asn Glu Gln
<210> 35
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding RLuc8Cys4
<400> 35
atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat tgcatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga attcatggct 120
tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct 180
cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc ttcatcaact actatgattc cgagaagcac 240
gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt aacgctacct ccagctacct gtggaggcac 300
gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt 360
aagtccggca agagcgggaa tggctcatat cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc 420
gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg 480
gctgctctgg cctttcacta cgcctacgag caccaagaca ggatcaaggc catcgtccat 540
atggagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat 600
atcgccctga tcaagagcga agagggcgag aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc 660
gagaccgtgc tcccaagcaa gatcatgcgg aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac 720
ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag 780
atccctctcg ttaagggagg caagcccgac gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc 840
taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag ctgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt 900
tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag 960
ggcctccact tcctccagga ggacgctcca gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc 1020
gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1050
<210> 36
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding RLuc8Cys5
<400> 36
atgtgcggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga attcatggct 120
tccaaggtgt acgaccccga gcaacgcaaa cgcatgatca ctgggcctca gtggtgggct 180
cgctgcaagc aaatgaacgt gctggactcc ttcatcaact actatgattc cgagaagcac 240
gccgagaacg ccgtgatttt tctgcatggt aacgctacct ccagctacct gtggaggcac 300
gtcgtgcctc acatcgagcc cgtggctaga tgcatcatcc ctgatctgat cggaatgggt 360
aagtccggca agagcgggaa tggctcatat cgcctcctgg atcactacaa gtacctcacc 420
gcttggttcg agctgctgaa ccttccaaag aaaatcatct ttgtgggcca cgactggggg 480
gctgctctgg cctttcacta cgcctacgag caccaagaca ggatcaaggc catcgtccat 540
atggagagtg tcgtggacgt gatcgagtcc tgggacgagt ggcctgacat cgaggaggat 600
atcgccctga tcaagagcga agagggcgag aaaatggtgc ttgagaataa cttcttcgtc 660
gagaccgtgc tcccaagcaa gatcatgcgg aaactggagc ctgaggagtt cgctgcctac 720
ctggagccat tcaaggagaa gggcgaggtt agacggccta ccctctcctg gcctcgcgag 780
atccctctcg ttaagggagg caagcccgac gtcgtccaga ttgtccgcaa ctacaacgcc 840
taccttcggg ccagcgacga tctgcctaag ctgttcatcg agtccgaccc tgggttcttt 900
tccaacgcta ttgtcgaggg agctaagaag ttccctaaca ccgagttcgt gaaggtgaag 960
ggcctccact tcctccagga ggacgctcca gatgaaatgg gtaagtacat caagagcttc 1020
gtggagcgcg tgctgaagaa cgagcagtaa 1050
<210> 37
<211> 2175
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding MBP(K239C)RLuc8
<400> 37
atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60
atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga attcatgaaa 120
atcgaagaag gtaaactggt aatctggatt aacggcgata aaggctataa cggtctcgct 180
gaagtcggta agaaattcga gaaagatacc ggaattaaag tcaccgttga gcatccggat 240
aaactggaag agaaattccc acaggttgcg gcaactggcg atggccctga cattatcttc 300
tgggcacacg accgctttgg tggctacgct caatctggcc tgttggctga aatcaccccg 360
gacaaagcgt tccaggacaa gctgtatccg tttacctggg atgccgtacg ttacaacggc 420
aagctgattg cttacccgat cgctgttgaa gcgttatcgc tgatttataa caaagatctg 480
ctgccgaacc cgccaaaaac ctgggaagag atcccggcgc tggataaaga actgaaagcg 540
aaaggtaaga gcgcgctgat gttcaacctg caagaaccgt acttcacctg gccgctgatt 600
gctgctgacg ggggttatgc gttcaagtat gaaaacggca agtacgacat taaagacgtg 660
ggcgtggata acgctggcgc gaaagcgggt ctgaccttcc tggttgacct gattaaaaac 720
aaacacatga atgcagacac cgattactcc atcgcagaag ctgcctttaa taaaggcgaa 780
acagcgatga ccatcaacgg cccgtgggca tggtccaaca tcgacaccag ctgcgtgaat 840
tatggtgtaa cggtactgcc gaccttcaag ggtcaaccat ccaaaccgtt cgttggcgtg 900
ctgagcgcag gtattaacgc cgccagtccg aacaaagagc tggcaaaaga gttcctcgaa 960
aactatctgc tgactgatga aggtctggaa gcggttaata aagacaaacc gctgggtgcc 1020
gtagcgctga agtcttacga ggaagagttg gtgaaagatc cgcgtattgc cgccactatg 1080
gaaaacgccc agaaaggtga aatcatgccg aacatcccgc agatgtccgc tttctggtat 1140
gccgtgcgta ctgcggtgat caacgccgcc agcggtcgtc agactgtcga tgaagccctg 1200
aaagacgcgc agactggcgg cggtaccggt ggattcgaaa tggcttccaa ggtgtacgac 1260
cccgagcaac gcaaacgcat gatcactggg cctcagtggt gggctcgctg caagcaaatg 1320
aacgtgctgg actccttcat caactactat gattccgaga agcacgccga gaacgccgtg 1380
atttttctgc atggtaacgc tacctccagc tacctgtgga ggcacgtcgt gcctcacatc 1440
gagcccgtgg ctagatgcat catccctgat ctgatcggaa tgggtaagtc cggcaagagc 1500
gggaatggct catatcgcct cctggatcac tacaagtacc tcaccgcttg gttcgagctg 1560
ctgaaccttc caaagaaaat catctttgtg ggccacgact ggggggctgc tctggccttt 1620
cactacgcct acgagcacca agacaggatc aaggccatcg tccatatgga gagtgtcgtg 1680
gacgtgatcg agtcctggga cgagtggcct gacatcgagg aggatatcgc cctgatcaag 1740
agcgaagagg gcgagaaaat ggtgcttgag aataacttct tcgtcgagac cgtgctccca 1800
agcaagatca tgcggaaact ggagcctgag gagttcgctg cctacctgga gccattcaag 1860
gagaagggcg aggttagacg gcctaccctc tcctggcctc gcgagatccc tctcgttaag 1920
ggaggcaagc ccgacgtcgt ccagattgtc cgcaactaca acgcctacct tcgggccagc 1980
gacgatctgc ctaagctgtt catcgagtcc gaccctgggt tcttttccaa cgctattgtc 2040
gagggagcta agaagttccc taacaccgag ttcgtgaagg tgaagggcct ccacttcctc 2100
caggaggacg ctccagatga aatgggtaag tacatcaaga gcttcgtgga gcgcgtgctg 2160
aagaacgagc agtaa 2175
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys4-F
<400> 38
tcatcatcat catcattgca tggctagcat gac 33
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys4-R
<400> 39
gtcatgctag ccatgcaatg atgatgatga tga 33
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys5-F
<400> 40
aaggagatat acatatgtgc ggttctcatc atcat 35
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8Cys5-R
<400> 41
atgatgatga gaaccgcaca tatgtatatc tcctt 35
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP(K239C)-F
<400> 42
tggtccaaca tcgactgcag caaagtgaat tatgg 35
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP(K239C)-R
<400> 43
aacatcgaca ccagctgcgt gaattatggt gtaac 35
<210> 44
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linking element containing a cysteine residue
<400> 44
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Cys
35
<210> 45
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linking element containing a cysteine residue
<400> 45
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Cys Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe
35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linking element containing a cysteine residue
<400> 46
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Cys Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe
35
<210> 47
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linking element containing a cysteine residue
<400> 47
Met Arg Gly Ser His His His His His His Cys Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe
35
<210> 48
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linking element containing a cysteine residue
<400> 48
Met Cys Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Trp Gly Ser Glu Phe
35
<210> 49
<211> 311
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc
<400> 49
Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr
1 5 10 15
Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser
20 25 30
Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile
35 40 45
Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val
50 55 60
Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly
65 70 75 80
Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp
85 90 95
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys
100 105 110
Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His
115 120 125
Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu
130 135 140
Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu
145 150 155 160
Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu
165 170 175
Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg
180 185 190
Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro
210 215 220
Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr
225 230 235 240
Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu
245 250 255
Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys
260 265 270
Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln
275 280 285
Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu
290 295 300
Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
305 310
<210> 50
<211> 311
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc8
<400> 50
Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr
1 5 10 15
Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser
20 25 30
Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile
35 40 45
Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val
50 55 60
Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly
65 70 75 80
Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp
85 90 95
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys
100 105 110
Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His
115 120 125
Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu
130 135 140
Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu
145 150 155 160
Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu
165 170 175
Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg
180 185 190
Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro
210 215 220
Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr
225 230 235 240
Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu
245 250 255
Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys
260 265 270
Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln
275 280 285
Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu
290 295 300
Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
305 310
<210> 51
<211> 311
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RLuc2
<400> 51
Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr
1 5 10 15
Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser
20 25 30
Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile
35 40 45
Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val
50 55 60
Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly
65 70 75 80
Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp
85 90 95
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys
100 105 110
Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His
115 120 125
Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu
130 135 140
Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu
145 150 155 160
Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu
165 170 175
Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg
180 185 190
Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro
210 215 220
Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Ala Ile Val Arg Asn Tyr
225 230 235 240
Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu
245 250 255
Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys
260 265 270
Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln
275 280 285
Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu
290 295 300
Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
305 310
Claims (31)
- 하이드롤라제를 검출하기 위한 센서 분자로서, 상기 센서 분자는
R1-L-R2-B (I), 또는
B-R2-L-R1 (II)
로부터 선택되는 일반식을 가지고,
식 중,
R1은 생물발광 단백질이고;
L은 연결 요소이며;
R2는 비-단백질 수용체 도메인이고;
B는 차단기이며,
여기서 B에 결합된 R2는 가수분해성 결합을 포함하고, 하이드롤라제에 의한 가수분해성 결합의 가수분해는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)의 변화를 생성하는,
센서 분자. - 제1항에 있어서, 차단기는 수용체 도메인을 낮은 형광 또는 비-형광 상태에서 안정화시키는, 센서 분자.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 차단기는 포스페이트 함유 모이어티, 당 함유 모이어티, 아미노산 함유 모이어티, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 에스테르 또는 에테르를 포함하는, 센서 분자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연결 요소는 알킬 쇄, 글리콜, 에테르, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리에스테르, 펩타이드, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 센서 분자.
- 제4항에 있어서, 연결 요소는 폴리펩타이드를 포함하는, 센서 분자.
- 제5항에 있어서, R1-L 또는 L-R1은 단일 폴리펩타이드인, 센서 분자.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 연결 요소는 시스테인 잔기 및/또는 라이신 잔기를 포함하는, 센서 분자.
- 제7항에 있어서, R2는 시스테인 잔기를 통해 연결 요소에 부착되는, 센서 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료, 보디피(Bodipy) 염료, Cy 염료, 플루오레세인, 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone), 형광 미소구체, 발광 미소구체, 형광 나노결정, 마리나 블루(Marina Blue), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이드 옐로우(Cascade Yellow), 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 오레곤 그린(Oregon Green), 테트라메틸로다민, 로다민, 쿠마린, 보디피(BODIPY), 레조루핀(resorufin), 텍사스 레드(Texas Red), 희토류 원소 킬레이트, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체로부터 선택되는, 센서 분자.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 또는 β-글루코시다제로부터 선택되는, 센서 분자.
- 제10항에 있어서, 루시퍼라제는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 반딧불이(Firefly) 루시퍼라제, 강장동물(Coelenterate) 루시퍼라제, 북미 글로웜(North American glow worm) 루시퍼라제, 방아벌레(click beetle) 루시퍼라제, 철도 벌레(railroad worm) 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 가우시아(Gaussia) 루시퍼라제, 애큐오린(Aequorin), 아라크노캄파(Arachnocampa) 루시퍼라제, 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 키메라의 생물학적 활성 변이체 또는 단편을 포함하는, 센서 분자.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드롤라제는 에스터라제, 리파제, 프로테아제, 포스파타제, 뉴클레아제, 글리코시다제, DNA 글리코실라제 또는 산 무수물 하이드롤라제인, 센서 분자.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드롤라제의 존재 및/또는 부재 하에 R1 및 R2의 분리 및 상대 배향은 푀르스터 거리(distance)의 ± 50% 내인, 센서 분자.
- 제13항에 있어서, R1과 R2의 푀르스터 거리는 적어도 4.0 nm인, 센서 분자.
- 제14항에 있어서, R1과 R2의 푀르스터 거리는 약 4.0 nm 내지 약 10 nm인, 센서 분자.
- 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 샘플을 제1항 내지 제15 및 제31항 중 어느 한 항의 센서 분자와 접촉시키는 단계; 및
ii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재에 상응하는, 단계
를 포함하는, 방법. - 샘플에서 하이드롤라제를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 샘플을, 구조 B-R2를 갖는 차단된 비-단백질 수용체 도메인과 접촉시켜, 처리된 샘플을 형성하는 단계;
ii) L로의 R2의 부착을 야기하는 조건 하에, 처리된 샘플을 화학식 R1-L 또는 L-R1의 화합물과 접촉시키는 단계; 및
iii) BRET 비의 변화를 검출하는 단계로서, 여기서 BRET 비의 변화는 샘플에서 하이드롤라제의 존재, 및 화학식 R1-L-R2 또는 R2-L-R1의 화합물의 형성에 상응하는, 단계
를 포함하고,
R1은 생물발광 단백질이고;
L은 연결 요소이며;
R2는 비-단백질 수용체 도메인이고;
B는 차단기이고, B에 결합된 R2는 가수분해성 결합을 포함하는,
방법. - 제17항에 있어서, R2는 시스테인 특이적인 친전자체 또는 아민 특이적인 친전자체를 포함하는, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, L은 시스테인 및/또는 라이신 잔기를 포함하는, 방법.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 하이드롤라제의 농도 및/또는 샘플에서 하이드롤라제의 활성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 장치 상에서 수행되는 방법.
- 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 공기, 액체, 생물학적 물질 또는 토양 중 임의의 하나인, 방법.
- 제22항에 있어서, 샘플은 밀크, 혈액, 혈청, 가래, 점액, 고름 및 복막액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 물질을 포함하는, 방법.
- 상응하는 천연 발생 단백질과 비교한 경우, 적어도 하나 더 적은 시스테인 잔기를 포함하는 변이형 생물발광 단백질.
- 제24항에 있어서, RLuc8(SEQ ID NO: 50)의 위치 24 또는 위치 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있는 변이형 생물발광 단백질.
- 제24항에 있어서, RLuc8(SEQ ID NO: 50)의 아미노산 위치 24 및 위치 73에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기가 결여되어 있는 변이형 생물발광 단백질.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 변이형 생물발광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제27항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제27항의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제28항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 변이형 생물발광 단백질을 생성하는 프로세스로서, 상기 프로세스는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 제29항의 숙주 세포 또는 제28항의 벡터를 배양하는 단계, 및 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 변이형 생물발광 단백질인, 센서 분자.
Applications Claiming Priority (3)
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