KR20190035677A - 결장직장 선종 및 암종의 검출, 병기 설정 및 감시 방법 - Google Patents

결장직장 선종 및 암종의 검출, 병기 설정 및 감시 방법 Download PDF

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멜라니에 매 이반시스
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페리 조셉 픽하르트
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Abstract

본 발명은 결장직장암 개체 또는 결장직장암이 발병되기 쉬울 수 있는 개체에서 결장직장암의 병기 설정, 예후 및 감시, 및 치료적 개입에 유용한 최소 침습적 방법, 시약, 진단 및 예후 마커를 제공한다.

Description

결장직장 선종 및 암종의 검출, 병기 설정 및 감시 방법
관련 출원의 상호 참조
본 특허 출원은 2016년 6월 10일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/348,290의 우선권의 이익을 청구하며, 이 모두는 전문이 참조로 본원에 통합된다.
전자 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
이와 함께 전자 제출된 텍스트 파일의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 복사본 (파일명: 16-816-PRO_ST25_6-9-16.txt, 기록일: 2016년 6월 9일, 파일 크기 11 KB).
발명의 배경
발명의 분야
본 발명은 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, 카드헤린 2, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신, 혈청 아밀로이드 P 성분, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 I, 슈퍼옥사이드 디스무타제 3, 비트로펙틴, 트롬보스폰딘-4 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 결장직장암 개체 또는 결장직장암이 발병되기 쉬울 수 있는 개체에서 암성 또는 전-암성 결장 병변의 병기 설정, 예후 및 감시, 및 치료적 개입에 유용한 최소 침습적 방법, 시약, 진단 및 예후 마커를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예는 결장의 암성 또는 전-암성 병변의 임상 단계를 확인하는 혈청 바이오마커를 사용한다.
관련 기술의 설명
2016년에는 결장암 및 직장암의 약 135,000개의 새로운 케이스가 진단될 것이며, 거의 50,000명이 이러한 질병으로 사망하여, 미국에서 암 관련 사망의 가장 흔한 원인 중 하나가 될 것이다. [Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016. CA: a cancer journal for clinicians. 2016;66(1):7-30. doi: 10.3322/caac.21332. PubMed PMID: 26742998]. 조기 진단은 높은 생존율을 보이지만 권고되는 선별검사 지침을 잘 따르지 않아 약 2천3백만 명의 미시민권자(30-40%)는 선별검사를 받지 않은 상태로 남아 있다. [Winawer SJ, Fischer SE, Levin B. Evidence-Based, Reality-Driven Colorectal Cancer Screening Guidelines: The Critical Relationship of Adherence to Effectiveness. JAMA : the journal of the American Medical Association. 2016;315(19):2065-6. doi: 10.1001/jama.2016.3377. PubMed PMID: 27187294].
미국에서 결장직장암 예방의 주요 방법은 대장내시경 검사를 통한 조기 발견이다. [Winaer SJ, et al. 상기 참조]. 미국에서 대장내시경 검사에 의한 관례적인 결장암 선별 검사/감시의 위험-이득을 평가하는 최근의 연구에 따르면 반복된 대장내시경 검사는 의료 시스템에 부담이 되며, 환자에게 기대하는 것보다 적은 이득을 가짐을 나타낸다. [Kruse GR, Khan SM, Zaslavsky AM, Ayanian JZ, Sequist TD. Overuse of colonoscopy for colorectal cancer screening and surveillance. J Gen Intern Med. 2015;30(3):277-83. doi: 10.1007/s11606-014-3015-6. PubMed PMID: 25266407; PubMed Central PMCID: PMCPMC4351286; Austin GL, Fennimore B, Ahnen DJ. Can colonoscopy remain cost-effective for colorectal cancer screening? The impact of practice patterns and the Will Rogers phenomenon on costs. The American journal of gastroenterology. 2013;108(3):296-301. doi: 10.1038/ajg.2012.195. PubMed PMID: 23208273]. 최근 연구에서 절차의 1주 이내에 대장내시경 검사의 합병증으로 인한 2% 재-입원율이 확인되었다. [Ranasinghe I, Parzynski CS, Searfoss R, Montague J, Lin Z, Allen J, et al. Differences in Colonoscopy Quality Among Facilities: Development of a Post-Colonoscopy Risk-Standardized Rate of Unplanned Hospital Visits. Gastroenterology. 2016;150(1):103-13. doi: 10.1053/j.gastro.2015.09.009. PubMed PMID: 26404952]. 2016년 2월에 캐나다 보건 당국은 직장결장암의 가족력이 없는 저위험 무증상 환자는 대장내시경 검사에 의해 더 이상 선별검사를 받지 않아야 한다는 새로운 결장암 선별검사 지침을 발표하였다. [Boggs W. Canadian experts say 'no' to colonoscopy for colon cancer screening. Reuters (Internet). 2016 4/14/2016. Available from: www.reuters.com/article/us-health-colonoscopy-canada-idUSKCN0VV28A]. 대변 잠혈 검사 또는 대변 면역화학적 검사 (FOBTL 및 FIT)와 같은 덜 침습적인 대변 검사가 권고되었다.
결장암의 대부분은 양성 선종성 폴립으로 시작되며 유전적 변이가 순차적으로 축적되어 침습성 암종으로 진행된다(도 1). [Suehiro Y, Hinoda Y. Genetic and epigenetic changes in aberrant crypt foci and serrated polyps. Cancer Sci. 2008;99(6):1071-6. Epub 2008/04/04. doi: 10.1111/j.1349-7006.2008.00784.xCAS784 [pii]. PubMed PMID: 18384435; Fearon ER, Hamilton SR, Vogelstein B. Clonal analysis of human colorectal tumors. Science. 1987;238(4824):193-7. Epub 1987/10/09. PubMed PMID: 2889267]. 대장내시경 검사 동안 확인된 폴립의 생검은 폴립이 암성인지를 판단하는 병리학자에 의해 평가된다. 비-암성 폴립으로 진단된 대장내시경 검사의 케이스는 암 발생 위험에 의해 분류되며, 추정된 위험에 근거한 추적 감시가 권고된다.
결장직장 종양의 국소화된 진행을 정확하게 예측하는 능력은 결장암 생물학 분야에서 대체로 해결되지 않고 있다. 분자 유전학 접근은 유전자 배열을 이용하여 재발 위험을 예측하는 검사의 개발을 가져 왔지만, 진단시 이들의 림프절 관련(3기) 예측 능력은 제한되어 있다. [Maak M, Simon I, Nitsche U, Roepman P, Snel M, Glas AM, et al. Independent Validation of a Prognostic Genomic Signature (ColoPrint) for Patients With Stage II Colon Cancer. Ann Surg. 2013. Epub 2013/01/09. doi: 10.1097/SLA.0b013e31827c1180. PubMed PMID: 23295318]. 4기 전이(CT 스캔)를 확인하기 위해 사용된 이미징 기술은 림프절 침습의 존재를 확실하게 확인할 수 없었다. 게다가, 국부 림프절은 현재 환자의 정밀검사 절차(CT 스캔, MRI, PET/MRI) 중에 사용된 임의의 이미징 방법으로는 적절하게 시각화되지 않으며, 영향을 받은 작은 림프절 또는 부분적으로 영향을 받는 림프절 해상(resolving)은 이들 이미징 분야에서 미래의 기술 혁신으로도 거의 가능성이 없을 것으로 보인다.
현재 림프절 침습은 림프절의 외과적 절제와 병리학적 분석에 의해서만 신뢰성 있게 검출될 수 있다. 결장직장 수술 환자의 최대 35%가 사망 위험이 더 높고, 불량한 종양학 결과, 추가의 합병증 및 악화된 삶의 질을 갖는 것으로 나타난 수술후 합병증으로 고통 받고 있다. [Artinyan A, Orcutt ST, Anaya DA, Richardson P, Chen GJ, Berger DH. Infectious postoperative complications decrease long-term survival in patients undergoing curative surgery for colorectal cancer: a study of 12,075 patients. Annals of surgery. 2015;261(3):497-505. doi: 10.1097/SLA.0000000000000854. PubMed PMID: 25185465]. 국부 림프절 상태가 알려진 경우, 환자의 이환 발생을 감소시킬 수 있는 내시경 절제술과 같은 국소 수술 기법이 가능하다.
직장암은 치료받는 부위의 민감성으로 인해 결장암 대비 현저한 환자 이환 및 사망을 초래한다. 직장암과 관련된 이환 및 사망 수준은 임상 관리 동안 지속되는 우려 사항이다. 결장암과 직장암 둘 모두의 주요 치료법은 종양(들)을 제거하는 수술이다. 일부 직장암 환자는 방사선 및/또는 화학요법의 형태로 (수술 전) 신보조 치료로부터 이득을 얻는다. 그러나, 모든 환자가 신보조 요법으로부터 이득을 얻는 것은 아닐 것이다. 또한, 임시 누설치수(이는 임의의 보조 화학요법 치료 후 두 번째 수술에 의해 제거되어야 함)의 빈번한 필요와 결부된 연속적 치료의 대가는 직장암을 갖는 환자가 종종 일상의 건강과 생활 방식에 입히는 희생으로 인해 필요한 치료를 거부한다는 것을 의미한다.
따라서, 신보조 치료로부터 이득을 얻을 직장암 환자를 정확하고 신뢰성 있게 식별할 필요가 또한 존재한다. 특히, 신보조 치료를 제공하기 전에 환자의 림프절 상태의 일관된 병기 설정을 달성하는 방법이 필요하다. 어떠한 병기 설정도 하지 않은 의사는 특히, 환자가 T1 또는 T2 종양을 가질 경우 환자를 종종 과잉 치료한다. 치료하기 전에 직장암 환자를 병기 설정한 의사는 T3 또는 T4 종양(림프절 상태에 대해 어떠한 것도 알지 못함)을 가진 임의의 환자에게 신보조 치료를 제공할 것이다. 이는 원발 종양이 장 벽으로 더 성장했을 때의 림프절 침범의 가능성 때문이다. 그러나, 이것은 많은 환자들이 과잉 치료를 받아 불필요한 화학요법과 방사선 치료를 받는 고통에 더하여 환자가 치료 받는 시간의 양을 길게 함을 의미한다.
발명의 개요
본 발명은 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, 카드헤린 2, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신, 혈청 아밀로이드 P 성분, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 I, 슈퍼옥사이드 디스무타제 3, 비트로펙틴, 트롬보스폰딘-4 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 결장직장암 개체 또는 결장직장암이 발병되기 쉬울 수 있는 개체에서 결장직장암의 병기 설정, 예후 및 감시, 및 치료적 개입에 유용한 최소 침습적 방법, 시약, 진단 및 예후 마커를 제공한다.
일 양태에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, CD44, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 표피 성장 인자 수용체인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
추가의 또 다른 양태에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질, CD44, 표피 성장 인자 수용체 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
기타 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 응고 인자 V, C-반응성 단백질, 펩티다제 억제제 16, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4 및 류신-풍부 알파-2-당단백질인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
추가의 다른 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질 및 펩티다제 억제제 16인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 비-배타적 구체예에서, 본원은 정상 조직, 저위험 선종 및 고위험 선종(진행성 선종으로도 공지됨)을 구별하기 위한 혈청 바이오마커를 제공한다.
다른 예시적인 비-배타적 구체예에서, 본원은 정상 조직, 저위험 선종 및 융모 선종을 구별하기 위한 혈청 바이오마커를 제공한다.
또 다른 예시적인 비-배타적 구체예에서, 본원은 국소(1기 및 2기) 또는 국부(3기) 결장직장암을 구별하기 위한 혈청 바이오마커를 제공한다.
추가의 예시적인 비-배타적 구체예에서, 본원은 성장 선종을 검출하기 위한 혈청 바이오마커를 제공한다.
또 다른 예시적인 비-배타적 구체예에서, 본원은 폴립절제, 결장절제 또는 다른 치료학적 개입 후에 암성 또는 전-암성 결장 병변의 재발을 확인하기 위한 혈청 바이오마커를 제공한다.
본원의 일부 예시적인 비-배타적 구체예는 정상 조직, 저위험 선종 및 진행성 선종을 구별하기 위한 성별-특이적 혈청 바이오마커를 제공한다.
다른 예시적인 비-배타적 구체예는 대상체에서 직장 폴립의 존재를 확인하기 위한 특이적 혈청 바이오마커를 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 대상체에서 결장직장암을 확인하기 위한 혈청 바이오마커 및 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 바이오샘플은 암성 또는 전-암성 결장 병변으로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 방법은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 0기, 1기, 2기, 3기 또는 4기 암종에서의 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변의 병기를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 바이오샘플은 암성 또는 전-암성 결장 병변으로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 방법은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 저위험 선종, 고위험 선종 및 결장직장 암종에서의 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교하여 병변을 고위험 선종, 진행성 선종, 저위험 선종 또는 결장직장암종으로서 확인하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 바이오샘플은 암성 또는 전암성 결장 병변으로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 방법은 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준이 폴립절제 전의 암성 또는 전-암성 결장 병변에서 검출된 수준과 상이할 경우, 결장직장암을 제거하기 위해 폴립절제 후에 (본원에서는 폴립절제 후라고 칭함) 또는 외과적 절제 후에 암성 또는 전-암성 결장 병변의 재발을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
구체예에서, 본원은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 상동성인 하나 이상의 검출가능하게 라벨링된 합성 펩티드를 선택하는 단계; 검출가능하게 라벨링된 합성 펩티드를 바이오 샘플과 조합시키는 단계; 및 조합물을 물리적 분리 방법으로 처리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에 사용되는 "상동성"은 바이오마커의 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 동일성인 핵산, 펩티드, 아미노산 또는 단백질 서열을 나타낸다. 특정 구체예에서, 바이오마커의 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 상동성인 핵산, 펩티드, 아미노산, 또는 단백질 서열은 바이오마커의 서열 전부 또는 일부에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원의 물리적 분리 방법은 액체 크로마토그래피이며, 합성 펩티드는 동위원소로 라벨링된다.
본 발명의 이러한 및 다른 특성 및 장점은 첨부된 청구범위와 함께 하기 발명의 상세한 설명으로부터 더욱 충분히 이해될 것이다. 청구범위가 본원의 설명에 의해 규정되고, 본 설명에 제시된 특성 및 장점의 특정 논의에 의해 규정되는 것은 아니라는 것이 주지된다.
도 1은 결장직장암의 일반화된 병기를 확인시켜주는 미국 국립 암 연구소(United State National Cancer Institute)로부터의 이미지를 예시한다. 0기는 전-암성 폴립이며, 종종 선종으로 불린다. 1기 & 2기는 암성이나, 국부 림프절을 침습하지 않았다. 3기는 국부 림프절이 감염된 지점이다. 4기는 전이성 암이다.
도 2는 결장 조직에서 폴립 성장의 국소화에 중점을 둔 결장직장암 병기 설정을 보여준다. 상피층은 점막, 점막하, 근육 조직 및 장막의 4가지 상이한 조직 층으로 분류된다. 결장과 직장 벽의 바로 바깥쪽에는 림프절이 인접해 있고, 이어서 결장 종양 형성에 의해 영향을 받을 수 있는 신체의 다른 조직이 있다. 결장 암의 첫 번째 병기는 폴립이 장 점막에 형성되는 0기이다. 이 병기는 암성은 아니다. 나머지 모든 병기는 암성인 암종으로 불린다.
도 3은 표적화된 정량적 단백질체 실험의 작업 흐름(workflow)을 예시한 개략도이다. 안정한 동위원소 라벨링된 기준 표준물은 효소 분해 전에 단백질 추출물에 첨가된다. 이들 표준물은 관심 표적 단백질의 내인성 펩티드 서열과 매칭되지만, 하나의 안정한 중동위원소 라벨링된 아미노산을 함유한다. 펩티드는 역상 크로마토그래피에 의해 크로마토그래피로 분리되고 이후에 표적화된 전구체 및 단편 이온 질량(전이)이 선택되는 삼중 사극 질량 분광계(QQQ-MS)로 인-라인 분석된다. 2개의 민감한 사극 질량 필터가 관심 전구체(Q1) 및 단편 펩티드 이온(Q3)을 선택하는데 사용되며, q2는 충돌 셀로 사용된다. 중 펩티드 및 경 펩티드의 정량화는 추출된 이온 크로마토그램 영역을 사용하여 달성된다. 내재 크로마토그램 면적 대 기준 표준물 크로마토그램 면적의 비율이 상대적 비율을 얻는데 이용된다. 기준 표준물에 대한 상대적 비율은 생물학적 샘플간에 비교되어 생물학적 그룹 간의 상대적 차등 발현을 결정할 수 있다.
도 4는 3개의 별개 환자 등록 집단(타원) 및 등록 환자로부터 유래된 후속 환자 군(백색 박스)을 예시한다. 대장내시경 군으로부터, 다음과 같은 3개의 별개의 환자 부류가 존재한다: 고위험 폴립(진행성 선종), 저위험 폴립, 및 폴립 부재의 환자. "폴립 부재" 및 "저위험 폴립" 환자 모두는 전체 저위험 군에 배치하였다. 고위험 폴립을 갖는 모든 환자는 고위험 군에 배치하였다. "전-/후-" 연구로부터의 폴립절제 전의 환자는 CT 대장조영술에 의해 나타낸 바와 같이 공지된 폴립을 가졌다. 이들 환자의 폴립 각각은 저위험 또는 고위험 군에 속하였다. 결장직장 수술(결장절제술)로 처리된 환자 대부분은 비-전이성 암 군에 속하였다. 한 환자는 결국 진행성 선종에 이르게 되었고(고위험), 다른 몇몇 환자는 결국 다른 진단(예를 들어, 신경내분비 종양)에 이르게 되었다. 비-전이성 군은 직장결장암의 3개의 비-전이성 병기로 나누어질 수 있다: 1기, 2기 및 3기. 3기의 특징은 국부적 림프절 침습이다.
도 5는 본원의 실시예에 등록된 환자의 인구 통계를 추가로 예시한다. 대략 동일한 수의 남성 및 여성이 등록되었다. 환자의 연령은 30 내지 88세이며, 60세의 평균 중앙 연령을 갖는다. 폴립을 갖는 대부분의 환자는 1-2개 폴립을 가졌으며, 폴립-함유 환자 중 71명이 진행성 선종을 가졌다. 대부분의 암 케이스는 장 벽으로 국소화되었으며(1기 & 2기), 12개 케이스만 국부적이었다(3기). 이러한 비-전이성 케이스 중, 대다수의 보고된 CEA 수준은 2.5 ng/mL 미만의 정상 수준이었다.
도 6은 연구에 등록한 환자 연령 군에 걸친 비-암 케이스에 대한 성별 분석, 및 각 결장암 병기에 대한 성별 분석을 기술한다. 일반적으로, 연령 군 또는 암 병기에 걸쳐 등록된 환자에서 유의한 성별 차이는 존재하지 않았다.
도 7은 전-/후-폴립절제 비율의 계산의 개략도를 보여준다. 전-/후-폴립절제 비율은 비율들의 비율이다(여기에서, 각 개별 비율은 본원에서 "기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터"로서 칭해짐). 먼저, 각 생물학적 샘플의 비율을 내부의 중-라벨링된 기준 표준물과 비교한다. 두 번째, 비율을 이용하여 최종 전-/후-폴립절제 비율을 계산한다. 결장 선종 또는 암종에서 상향조절된 단백질은 또한, 상향조절된 전-/후-폴립절제 비율을 나타내야 한다. 결장 선종 또는 암종에서 하향조절된 단백질은 또한 하향조절된 전-/후-폴립절제 비율을 가져야 한다.
도 8은 저위험 케이스와 비교하여 진행성 선종(고위험) 대장내시경 케이스에서 CRP 및 EGFR에 대한 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다. 이 도면에서, 저위험은 대장내시경 선별검사가 정상이거나 결장직장암으로 진행될 위험이 적은 폴립을 가진 모든 케이스를 나타낸다. 점선의 각 원은 단일 환자 케이스를 나타낸다.
도 9는 고위험 선종을 확인하기 위한 CRP 및 EGFR에 대한 민감성 및 특이성을 시사하는 개별 수신자 조작 특성(ROC: receiver operator characteristic) 곡선을 보여준다. 대각선의 왼쪽에 있는 데이터 포인트는 진행성 선종을 확인하기 위한 양성 예측 값을 나타낸다. 대각선의 상의 또는 이에 더욱 근접한 데이터 포인트는 진행성 선종을 식별할 확률이 50%인 "동전 던지기(coin toss)"를 나타내지만, 대각선 오른쪽의 데이터 포인트는 음성 확률을 나타낸다.
도 10은 환자 성별에 기초하여 진행성 선종을 확인하는데 있어서 CRP 및 EGFR에 대한 민감성 및 특이성을 시사하는 개별 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 예시한다. 오른쪽 패널의 ROC 곡선은 여성 및 남성 각각에 대해 "F" 및 "M"으로 라벨링된다.
도 11은 합친 모든 성별(왼쪽 패널)에서 및 성별을 구분할 경우(오른쪽 패널) 진행성 선종을 확인하기 위한 ITIH4, CFI, CD44 및 F5의 민감성 및 특이성을 나타내는 개별 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 보여준다. 오른쪽 패널의 ROC 곡선은 여성 및 남성 각각에 대해 "F" 및 "M"으로 라벨링된다.
도 12는 다수의 비-암성 폴립 조직병리학에 결쳐 ITIH3, ITIH4 및 CRP에 대한 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다. 점선의 각 원은 단일 환자 케이스를 나타낸다.
도 13은 다른 유형의 폴립 조직병리학과 비교하여 관상융모 선종에서 QSOX1 발현의 성별 차이를 나타내는 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다.
도 14는 결장 대 직장 암 비교를 위한 4가지 범주 중 하나에 속하는 폴립을 갖는 환자 케이스의 수를 확인시켜 준다: 정상 대장내시경 선별검사, 결장 폴립만 갖는 환자, 결장 및 직장 폴립을 갖는 환자, 및 직장 폴립만 갖는 환자. 바이오마커 발현은 이러한 네 가지 범주 내의 선종의 위치와 관련하여 분석되었다.
도 15는 결장 대 직장 폴립의 경우 PI16, CD44, ITIH3 및 QSOX1에 대한 발현의 차이를 나타내는 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다. 점선의 각 원은 단일 환자 케이스를 나타낸다.
도 16은 비-전이성 암("암 케이스")과 비교하여 묶은 저위험과 정상 대장내시경 케이스("저위험 및 정상 케이스")에서 표시된 바이오마커에 대한 기준 표준물 대비 상대적 비율을 보여준다. P-값은 95% 신뢰도를 갖는 맨-휘트니(Mann-Whitney) p-값을 나타낸다. 점선의 각 원은 단일 환자 케이스를 나타낸다.
도 17은 비-전이성 암과 비교하여 저위험 및 정상 대장내시경 케이스에서 EGFR, DPP4, CD44, FETUB 및 PI16에 대한 ROC 곡선을 예시한다.
도 18은 비-전이성 암("암 케이스")과 비교하여 묶은 저위험과 정상 대장내시경 케이스("저위험 및 정상 케이스")에서 표시된 바이오마커에 대한 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다. P-값은 95% 신뢰도를 갖는 맨-휘트니 p-값을 나타낸다. 점선의 각 원은 단일 환자 케이스를 나타낸다.
도 19는 비-전이성 암("암 케이스")과 비교하여 묶은 저위험과 정상 대장내시경 케이스("저위험 및 정상 케이스")에서 상향조절된 단백질 각각에 대한 ROC 곡선을 예시한다.
도 20은 비-전이성 암(오른쪽 패널)과 비교하여 묶은 저위험과 정상 대장내시경 케이스(좌측 패널)에서 단백질에 대한 민감성 및 특이성의 성별-관련 차이를 보여주는 표시된 바이오마커 대한 ROC 곡선을 보여준다. ROC 곡선은 여성 및 남성 각각에 대해 "F" 및 "M"으로 라벨링된다.
도 21은 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 5개-마커 패널 ROC 곡선을 예시한다. 가장 왼쪽의 곡선은 CD44, DPP4, EGFR, ITIH3 및 LRG1의 5가지 마커에 대한 검증 데이터를 예시한다. 동일 데이터에 대한 훈련 곡선은 가장 오른쪽의 ROC 곡선이다. 회색 구체는 신뢰 구간을 나타낸다. ROC 곡선에는 시중에서 입수가능한 CRC 선별검사에 대해 설정된 민감성 및 특이성이 포함된다.
도 22은 여분의 트리 회귀 분석을 사용하는 5개-마커 패널 ROC 곡선을 예시한다. 가장 왼쪽의 곡선은 CD44, DPP4, EGFR, ITIH3 및 LRG1의 5가지 마커에 대한 검증 데이터를 예시한다. 동일 데이터에 대한 훈련 곡선은 가장 오른쪽의 ROC 곡선이다. 회색 구체는 신뢰 구간을 나타낸다. ROC 곡선에는 시중에서 입수가능한 CRC 선별 검사에 대해 설정된 민감성 및 특이성이 포함된다.
도 23은 국부 림프절 침습의 존재("국부 암") 및 부재("국소 암")의 비-전이성 암에서 표시된 바이오마커에 대한 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다. 3기는 하나 이상의 감염된 국부 림프절을 갖는 것으로서 특성 규명된다. 점선의 각 원은 단일 환자 케이스를 나타낸다.
도 24는 비-전이성 암 환자와 비교하여 영향을 받은 국부 림프절을 지닌 환자 케이스에서 표시된 바이오마커에 대한 민감성 대 특이성 ROC 곡선을 보여준다.
도 25는 국소화된 비-전이성 암 환자와 비교하여 국부 림프절 관련성의 존재를 예측할 수 있는 표시된 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널의 ROC 곡선을 예시한다.
도 26은 일반적인 선종(도 25a) 및 암으로 진행될 위험에 의해 구분된 선종(도 25b)에 있어서 폴립절제 전 및 후의 PI16 바이오마커 발현을 보여준다. 도 25a에 도시된 점선에서, x-축의 표시된 범주 내의 각 원은 한 환자를 나타낸다. 도 25b에서, 각 막대는 단일 환자에 대한 전-/후-폴립절제 비율을 나타낸다. PI16이 전형적으로 하향조절되기 때문에, 1 미만의 전-/후-비율은 폴립절제 후 정상적인 단백질 발현 수준으로의 회귀로 간주된다.
도 27은 일반적인 선종(도 26a) 및 암으로 진행될 위험에 의해 구분된 선종(도 26b)에 있어서 폴립절제 전 및 후의 CRP 바이오마커 발현을 보여준다. 도 26a에 도시된 점선에서, x-축의 표시된 범주 내의 각 원은 한 환자를 나타낸다. 도 26b에서, 각 막대는 단일 환자에 대한 전-/후-폴립절제 비율을 나타낸다. CRP가 전형적으로 상향조절되기 때문에, 1 초과의 전-/후-비율은 폴립절제 후 정상적인 단백질 발현 수준으로의 회귀로 간주된다. 이 경우, 대부분의 현저한 회귀가 진행성 선종 케이스에서 발생하였다.
도 28은 개별 환자가 전- 및 후-폴립절제 연구에서 폴립절제 전에 CT 대장조영술(CTC)에 의한 종단 모니터링 처리된 시간을 나타낸다. 각각의 원은 한 환자 케이스를 나타내며, 중앙 모니터링 시간은 대략 5년이다.
도 29는 공지된 성장 선종을 갖는 환자 및 비공지된 성장의 선종이 확인된 환자 케이스에서 표시된 바이오마커에 대한 기준 표준물 대비 상대적 비율 데이터를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본원에 언급된 모든 공개문, 특허 및 특허출원은 모든 목적에 있어서 본원에서 명확하게 참조로 포함된다.
본원에는 결장의 암성 또는 전암성 병변을 갖는 대상체의 진단 및 예후, 특히 대상체의 결과물을 병기 설정, 타이핑(typing) 또는 예측하기 위한 비-침습적 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 "병변"은 결장의 비정상적인 영역을 지칭하는 것으로서, 이형성, 이상 선와, 뿐만 아니라, 양성 또는 암성 폴립을 포함한다.
본원에서 사용되는 "폴립"은 직장결장암의 4개 병기 중 임의의 병기에 존재하는 폴립, 또는 전암성 질환의 폴립을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "결장직장암"은 TNM 시스템(조직학적 성질(T), 인근 림프절에의 종양 존재(N), 및 전이 확산(M)을 평가함)에 따라 미국공동암위원회(American Joint Committee on Cancer, AJCC)에 의해 분류된, 1기 내지 4기 범위의 4개의 병기 중 임의의 병기로 이루어진 질환을 지칭한다. [Gunderson LL, Jessup JM, Sargent DJ, Greene FL, Stewart AK. Revised TN categorization for colon cancer based on national survival outcomes data. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2010;28(2):264-71. Epub 2009/12/02. doi: 10.1200/JCO.2009.24.0952. PubMed PMID: 19949014; PubMed Central PMCID: PMC2815715; Greene FL. The American Joint Committee on Cancer: updating the strategies in cancer staging. Bulletin of the American College of Surgeons. 2002;87(7):13-5. Epub 2007/03/29. PubMed PMID: 17387902]. (표 1.)
표 1
미국공동암위원회(AJCC)에 의한 TNM 병기 설정 시스템 제6판
Figure pct00001
본원에서 사용되는 "전암성 질환"은 환자가 사람에게 결장암을 갖게 하는 전-침습, 전-전이 병변을 가짐을 나타낸다. 예는 이형성, 이상 선와의 존재, 및 선종의 존재를 포함한다. AJCC는 공식적으로, 선종을 "Tis"의 T-병기에 의해 전암성 폴립("0기")으로서 특성 규명하며, 여기서, "is"는 원위치(in situ)의 암종을 의미한다. Tis 선종은 창자 벽의 침습 없이, 대장 점막에 존재하는 폴립에 의해 특성 규명된다. (표 1.)
본원에 사용되는 "정상 조직"은 대장내시경 및/또는 조직병리학에 의해 외형이 건강해 보이는 결장 및/또는 직장의 조직을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "진행성 선종"은 암으로 진행될 위험이 높은 환자 내의 폴립 또는 전-암성 폴립의 그룹을 나타낸다.
본원에 사용되는 "융모 선종"은 특히 암성이 되는 경향이 있는 특정 조직병리학적 유형의 폴립을 나타낸다. 현미경으로 진단되며, 종종 "콜리플라워"-형 외형을 갖는다. 관상 선종은 조직병리학의 필요 없이 대장내시경으로 볼 수 있는 선종의 형상이다. 관상융모는 현미경 하에 융모 병상을 갖는 관 형상의 선종을 나타낸다.
본원에 사용되는 "국소" 결장직장암은 TNM 1기 및 TNM 2기 결장직장암을 지칭한다. 특히, 점막에서 장막까지 대장벽 어디든 침투한 암이 존재한다(도 2).
본원에 사용되는 "국부" 결장직장암은 대장벽에 임의의 수의 침습된 영역을 가지며, 장벽 바로 밖에 위치하는 림프절이 감염된 결장직장암을 나타낸다(도 2).
일부 구체예에서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, (a) 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, 카드헤린 2, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신, 혈청 아밀로이드 P 성분, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 I, 슈퍼옥사이드 디스무타제 3, 비트로펙틴, 트롬보스폰딘-4 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 단계; 및 (b) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 구체예에서, 방법은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 0기, 1기, 2기, 3기 또는 4기 암종의 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변의 병기를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 "병기" 또는 "병기 설정"은 결장에서 암성 또는 전암성 병변의 진행 및 중증도를 설명하기 위해 사용되는 하나 이상의 임상 분류 시스템을 나타낸다. 결장직장 종양 병기는 창자벽, 국부 림프절, 및 인접한 또는 원위의 조직으로의 종양 침습의 위치 및 수준을 설명한다.
본 발명의 구체예와 관련하여 사용되는 종양 병기 설정 시스템의 비배타적인 예는 TNM 시스템이다(문헌 [Gunderson LL, et al.; Greene, FL, 상기 참조] 참조) (표 1). TNM 시스템에서, 1기 및 2기는 각각, 림프절의 침습 또는 전이(N0 M0)가 없는, T1 또는 T2 및 T3 또는 T4의 T-병기를 갖는다. 1기 병변은 점막하 및 가능하게 근육층으로 진행되었다. 2기 병변은 장막을 침습하고, 창자벽을 통해 성장할 수 있지만 임의의 인근 림프절은 침습하지 않았다. 3개의 하위 분류를 갖는 3기 병변은 매우 복잡하지만, 광범위하게는, 임의의 T-병기 및 일부 또는 다수의 인근 림프절의 침습을 가짐을 특징으로 할 수 있다. 악성, 전이성 결장암을 구성하는 4기는 임의의 T 또는 임의의 N 분류를 가질 수 있지만, 다른 장기, 가장 일반적으로 간으로 전이되었다. (표 1.)
본원의 구체예에서, 종양의 "병기 설정"은 진행성 선종 대 저위험 선종과 같은 상대적 범주로 이들을 분류함으로써 달성된다. 기타 구체예에서, 병기 설정은 종양을 진행성 선종 대 저위험 선종과 정상 조직을 묶은 범주로 분류함으로써 달성된다.
다른 구체예에서, 병기 설정은 종양을 종양의 병리생리학 또는 종양의 해부학과 관련된 범주로 분류함으로써 달성된다. 예를 들어, 병기 설정은 종양을 융모 또는 관상융모 선종 대 저위험 선종(융모 또는 관상융모 특징 부재), 또는 대 정상 조직으로 분류함으로써 달성된다. 대안적으로, 병기 설정은 종양을 성장 선종 대 정적 또는 퇴행성 선종과 같이 성장 특징을 기반으로 하여 분류함으로써 달성된다.
더욱 추가의 구체예에서, 병기 설정은 종양을 대상체에서 이들의 위치를 기반으로 하여 분류함으로써 달성된다. 따라서, 일부 구체예에서, 국소(1기 및 2기) 종양은 결장직장암에서 국부(3기) 종양과 구별된다.
당업자는 현재 알려진 방법들과 관련하여 유용한 대안적인 병기 설정 시스템을 인지할 것이다. 다른 병기 설정 시스템의 예는 듀크의 분류 시스템(Duke's classification system)[Dukes, C.E., Journal of Pathological Bacteriology 1932, 35:323], 및 아슬러-콜러 분류 시스템(Astler-Coller classification system )[Astler V.B. and Coller F.A., Ann Surg 1954, 139:846]을 포함한다.
일부 구체예에서, 대상체의 결장에서 병변의 임상 등급을 분석하기 위한 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 "종양 등급(tumor grade)"은 종양 세포가 정상 결장 조직 세포로 분화되는 정도를 설명하는 조직학적 평가를 나타낸다. 현재의 종양 등급 분류는 결장암 분류의 TNM 가이드라인의 일부로서 G1 내지 G4의 범위이다. G1 등급의 세포는 조직학적으로 가장 건강한 결장 조직 세포처럼 보인다. G2 등급의 세포는 중간 정도로 분화되며, G3 등급의 세포는 불량하게 분화되며, G4 세포는 분화되지 않는다. 보다 높은 등급의 세포는 더욱 빠르게 성장하는 경향이 있고 암 치료 방법에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 단백질 바이오마커 및 방법은 세포 분화 수준(종양 등급)을 평가하기 위해 사용될 수 있고, 환자 치료 전략에 영향을 미친다.
일부 구체예에서, 방법은 대상체에서 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하고, 이어서 이러한 수준을 기준 수준 또는 범위와 비교하는 것을 포함한다. 전형적으로, 기준 수준은 결장암을 갖는 다수의 사람 또는 조직에서의 단백질 바이오마커를 대표하며, 조직 샘플 또는 생검 또는 기타 생물학적 샘플 예컨대, 세포, 혈청 또는 혈액을 사용하여 측정된, 이의 임상 예후 데이터가 이용가능하다.
일부 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, 카드헤린 2, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신, 혈청 아밀로이드 P 성분, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 I, 슈퍼옥사이드 디스무타제 3, 비트로펙틴, 트롬보스폰딘-4 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 단계; 및 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 방법은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 저위험 선종, 고위험 선종 및 결장직장 암종 중의 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교하여 암성 또는 전-암성 결장 병변을 고위험(진행성) 선종, 저위험 선종 또는 결장직장 암종으로서 확인하는 것을 추가로 포함한다.
결장직장암이 발생할 위험은 "저" 또는 "고"로 분류된다(표 2). 저위험 환자에는 5-10년 내에 대장내시경에 의한 추적 선별검사가 권고된다. 고위험으로 간주된 폴립을 갖는 환자에게는 3-5년 내에 대장내시경에 의한 추적 선별검사가 권고된다. 고위험 폴립은 "진행성 선종"으로 또한 칭해진다. 직장결장암 발병 위험이 높은 환자는 다음과 같은 특징 중 하나 또는 여러 개를 갖는다: 결장직장암의 임상 병력 또는 가족력; 10 밀리미터 초과의 폴립; 3-10개 관상 선종으로서, 하나 이상의 선종은 융모 특성을 가짐; 또는 이형성을 갖는 톱니형 선종. 결장직장암으로 진행될 위험이 낮은 환자는 대장내시경 검사시 폴립이 없으며; 톱니형 또는 10 밀리미터 초과를 제외한 과형성 특성을 갖는 폴립; 10 밀리미터보다 작은 3개 미만의 관상 선종; 또는 이형성을 갖지 않는 무경성 톱니형 폴립을 갖는다.
표 2:
결장직장암의 실질적 발생의 폴립 위험 인자
Figure pct00002
추가 구체예에서, 본원은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 대상체에서 결장직장암을 확인하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, CD44, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 표피 성장 인자 수용체를 포함하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
추가의 구체예에서, 본원은 대상체에서 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체에서 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 C-반응성 단백질 및 표피 성장 인자 수용체를 포함한다.
더욱 추가의 구체예에서, 본원은 대상체에서 관상융모 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체에서 관상융모 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 C-반응성 단백질, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원은 대상체에서 국소(1기 및 2기) 또는 국부(3기) 결장직장암을 확인하는 방법을 제공한다. 구체예에서, 대상체에서 국소(1기 및 2기) 또는 국부(3기) 결장직장암을 확인하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 C-반응성 단백질, CD44, 표피 성장 인자 수용체 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함한다.
다른 구체예에서, 본원은 대상체에서 성장 선종을 확인하는 방법을 제공한다. 구체예에서, 대상체에서 성장 선종을 확인하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 응고 인자 V, C-반응성 단백질, 펩티다제 억제제 16, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 및 류신-풍부 알파-2-당단백질을 포함한다.
추가의 다른 구체예에서, 방법은 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준이 폴립절제술 전의 암성 또는 전-암성 결장 병변에서 검출된 수준과 상이할 경우, 폴립절제 후 암성 또는 전-암성 결장 병변의 재발을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 폴립절제 후 암성 또는 전-암성 결장 병변의 재발을 확인하는 것은 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 C-반응성 단백질 및 펩티다제 억제제 16을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 암컷 대상체에서 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 것을 포함한다. 구체예에서, 암컷 대상체에서 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 것은 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 응고 인자 V, CD44, 및 표피 성장 인자 수용체를 포함한다.
다른 구체예에서, 방법은 수컷 대상체에서 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 확인하는 것을 포함한다. 구체예에서, 수컷 대상체에서 진행성 선종, 저위험 선종, 또는 정상 조직을 확인하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 C-반응성 단백질, 펩티다제 억제제 16, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 및 보체 인자 I을 포함한다.
추가 구체예에서, 방법은 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 대상체에서 직장 폴립의 존재를 확인하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체에서 직장 폴립의 존재를 확인하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 단백질 바이오마커는 펩티다제 억제제 16, CD44, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함한다.
당업자는 예를 들어, 결장직장암 또는 폴립의 가족력 및 절제된 폴립 또는 병변의 병기에 기초하여 결장의 감시가 수행되어야 하는 간격을 결정하기 위한 파라미터를 이해할 것이다. 특정 구체예에서, 감시를 위한 바이오샘플은 폴립절제 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 이내에 수집된다. 다른 구체예에서, 바이오샘플은 폴립절제 후 1년 또는 2년 이내에 수집된다.
인터-알파-트립신 억제제, 중쇄 H3(ITIH3) 및 중쇄 4, 아이소형 1(ITIH4)은 본 방법을 실행하는데 유용한 바이오마커로서 제공된다. 인터-알파 트립신 억제제는 세포외 기질 상의 히알루론산의 공유 결합 및 안정화에 관여한다. [Chen L, Mao SJ, McLean LR, Powers RW, Larsen WJ. Proteins of the inter-alpha-trypsin inhibitor family stabilize the cumulus extracellular matrix through their direct binding with hyaluronic acid. The Journal of biological chemistry. 1994;269(45):28282-7. Epub 1994/11/11. PubMed PMID: 7525572]. 히알루로난은 결장 폴립 및 종양의 성장과 함께 크기를 증가시키는 것으로 알려진 큰 상피 글리코사미노글리칸 복합물이다[14]. 또한, ITIH3은 종래에 인간 위암 환자의 혈장에서 상향조절되는 것으로 확인되었으며, 결장암에서 전이 및 종양 침습 활성의 예방에서 예측된 역할을 갖는다. [Misra S, Hascall VC, Berger FG, Markwald RR, Ghatak S. Hyaluronan, CD44, and cyclooxygenase-2 in colon cancer. Connective tissue research. 2008;49(3):219-24. Epub 2008/07/29. doi: 10.1080/03008200802143356. PubMed PMID: 18661347; Chong PK, Lee H, Zhou J, Liu SC, Loh MC, Wang TT, et al. ITIH3 is a potential biomarker for early detection of gastric cancer. Journal of proteome research. 2010;9(7):3671-9. Epub 2010/06/03. doi: 10.1021/pr100192h. PubMed PMID: 20515073].
또한, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 본 방법을 실시하는데 유용한 바이오마커로서 제공된다. EGFR은 나쁜 종양 예후와 연관되어 있다. [Lieto E, Ferraraccio F, Orditura M, Castellano P, Mura AL, Pinto M, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) is an independent prognostic indicator of worse outcome in gastric cancer patients. Annals of surgical oncology. 2008;15(1):69-79. Epub 2007/09/27. doi: 10.1245/s10434-007-9596-0. PubMed PMID: 17896140].
염증 반응에 연루된 특정 효소는 본 방법을 실시하는데 유용한 바이오마커로서 제공된다. 류신-풍부 알파-2-당단백질(LRG1)은 급성기 반응 및 염증에서 한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. [Hsu SJ, Nagase H, Balmain A. Identification of Fetuin-B as a member of a cystatin-like gene family on mouse chromosome 16 with tumor suppressor activity. Genome / National Research Council Canada = Genome / Conseil national de recherches Canada. 2004;47(5):931-46. Epub 2004/10/23. doi: 10.1139/g04-043. PubMed PMID: 15499407; Shirai R, Hirano F, Ohkura N, Ikeda K, Inoue S. Up-regulation of the expression of leucine-rich alpha(2)-glycoprotein in hepatocytes by the mediators of acute-phase response. Biochemical and biophysical research communications. 2009;382(4):776-9. Epub 2009/03/28. doi: 10.1016/j.bbrc.2009.03.104. PubMed PMID: 19324010]. LRG1은 다양한 마우스 연구에서의 상향조절을 나타내었으며, 인간 결장암 환자의 혈장에서 상향조절되는 것으로 나타났다. [Chong, PK, et al., Shirai, et al., 상기 참조; Ladd JJ, Busald T, Johnson MM, Zhang Q, Pitteri SJ, Wang H, et al. Increased plasma levels of the APC-interacting protein MAPRE1, LRG1, and IGFBP2 preceding a diagnosis of colorectal cancer in women. Cancer Prev Res (Phila). 2012;5(4):655-64. Epub 2012/01/27. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-11-0412. PubMed PMID: 22277732; PubMed Central PMCID: PMC3419141; Hung KE, Faca V, Song K, Sarracino DA, Richard LG, Krastins B, et al. Comprehensive proteome analysis of an Apc mouse model uncovers proteins associated with intestinal tumorigenesis. Cancer Prev Res (Phila). 2009;2(3):224-33. Epub 2009/02/26. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-08-0153. PubMed PMID: 19240248; PubMed Central PMCID: PMC2874864].
LRG1은 결장암의 인간 및 뮤린 모델의 혈액에서 상향조절되는 급성기 반응 단백질이다. [Chong, PK, et al., Ladd, JJ, et al., 상기 참조; Ivancic MM, Huttlin EL, Chen X, Pleiman JK, Irving AA, Hegeman AD, et al. Candidate serum biomarkers for early intestinal cancer using 15N metabolic labeling and quantitative proteomics in the ApcMin/+ mouse. Journal of proteome research. 2013;12(9):4152-66. Epub 2013/08/09. doi: 10.1021/pr400467c. PubMed PMID: 23924158; PubMed Central PMCID: PMC3792563]. 연구들은 이러한 단백질이 또한 궤양성 대장염을 갖는 환자의 혈청에서 상향조절됨을 보여주었으며, 이는 LRG1이 또한 장 질환의 전신 지시제일 수 있음을 시사하는 것이다. [Serada S, Fujimoto M, Terabe F, Iijima H, Shinzaki S, Matsuzaki S, et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflammatory bowel diseases. 2012;18(11):2169-79. Epub 2012/03/01. doi: 10.1002/ibd.22936. PubMed PMID: 22374925]. 한 연구는 LRG1이 ALK1-SMAD 1, 5, 및 8과의 상호작용을 통한 TGF-β 경로에 의한 신호전달을 통해 내피 세포 형성을 증진시키고, 이렇게 하여 혈관형성 상태(angiogenic state)를 유도한다는 것을 보여주었다. [Wang X, Abraham S, McKenzie JA, Jeffs N, Swire M, Tripathi VB, et al. LRG1 promotes angiogenesis by modulating endothelial TGF-beta signalling. Nature. 2013;499(7458):306-11. Epub 2013/07/23. doi: 10.1038/nature12345. PubMed PMID: 23868260; PubMed Central PMCID: PMC3836402]. 종양 침습 및 전이의 기본적인 속성들 중 하나인 혈관형성은 종양 형성에서 매우 초기에 촉발될 수 있다. [Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144(5):646-74. Epub 2011/03/08. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013. PubMed PMID: 21376230]. 다른 연구들에서는 혈액 혈장에서 LRG1의 순환 수준이 결장직장암을 진단하고 결장, 직장S상결장 접합부(rectosigmoid junction), 및 직장 내에서 국부 종양 국소화를 확인하는데 유용할 수 있는 것을 나타내고 있다(Surinova, S. et al., EMBO Mol Med 2015, 7, 1153-1165; Surinova, S. et al., EMBO Mol Med 2015, 7, 1166-1178).
C-반응성 단백질(CRP)은 또한 본 방법을 실시하는데 유용한 바이오마커중 하나로서 제공된다. CRP는 혈액 혈장에서 발견되는 환형(고리-형상) 펜타머 단백질이며, 이의 수준은 염증에 반응하여 증가한다. CRP는 대식세포 및 T 세포에 의한 인터류킨-6 분비 후 증가하는 간 기원의 급성기 단백질이다.
응집 인자 V(F5)는 또한 본 방법을 실시하는데 유용한 바이오마커 중 하나로서 제공된다. F5는 혈액 응고에 필수적인 활성 트롬빈 단백질을 형성시키기 위해 프로트롬빈의 분열에 도움을 주는 활성화된 응고 인자 X(Xa)에 대한 보조인자이다. [Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry. 1991;30(43):10363-70. Epub 1991/10/29. PubMed PMID: 1931959]. 지혈에서의 섭동(perturbation)은 결장암 환자에서 보고된 합병증으로서 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism)과 함께, 일반적으로 관찰되는 암의 부작용이다. [Falanga A, Marchetti M, Vignoli A. Coagulation and cancer: biological and clinical aspects. Journal of thrombosis and haemostasis: JTH. 2013;11(2):223-33. Epub 2013/01/03. doi: 10.1111/jth.12075. PubMed PMID: 23279708; Alcalay A, Wun T, Khatri V, Chew HK, Harvey D, Zhou H, et al. Venous thromboembolism in patients with colorectal cancer: incidence and effect on survival. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2006;24(7):1112-8. Epub 2006/03/01. doi: 10.1200/JCO.2005.04.2150. PubMed PMID: 16505431]. 응고제, 예를 들어, 피브리노겐, F5, 및 다른 응고 인자는 결장암 환자에서 증가된 수준을 갖는다. [Paspatis GA, Sfyridaki A, Papanikolaou N, Triantafyllou K, Livadiotaki A, Kapsoritakis A, et al. Resistance to activated protein C, factor V leiden and the prothrombin G20210A variant in patients with colorectal cancer. Pathophysiology of haemostasis and thrombosis. 2002;32(1):2-7. Epub 2002/09/06. doi: 57282. PubMed PMID: 12214157; Vossen CY, Hoffmeister M, Chang-Claude JC, Rosendaal FR, Brenner H. Clotting factor gene polymorphisms and colorectal cancer risk. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2011;29(13):1722-7. Epub 2011/03/23. doi: 10.1200/JCO.2010.31.8873. PubMed PMID: 21422408]. 또한, F5는 인자 V 레이덴 응고 질병과 이의 연관성에 대해 가장 잘 알려져 있다. 인자 V 레이덴은 R506Q 돌연변이를 수반하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 의해 야기된다. 이러한 돌연변이는 결합하는 F5로부터의 활성화된 단백질 C 항응고제 단백질의 능력을 감소시킨다. 활성화된 단백질 C와 F5 간의 정상 상호작용은 F5의 분해를 야기시킨다. 그러나, 이러한 상호작용의 부재 하에, F5 수준은 증가하고, 과도한 응고를 야기시킨다. 인자 V 레이덴 돌연변이에 대해 동형의 환자는 결장직장암에 대해 거의 6배 증가된 위험을 나타낸다. [Vossen, CY, et al., 상기 참조]. 최근 바이오마커 연구는 F5가 국소화된 결장직장암과 전이성 결장직장암을 구별하기 위한 혈액 혈장 마커일 수 있음을 나타내었다(Surinova, S. et al., EMBO Mol Med 2015, 7, 1153-1165).
디펩티딜 펩티다제-4(DPP4)는 또한 본원에 기재된 방법에서 바이오마커로서 사용될 수 있다. DPP4 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 대부분의 세포 유형의 표면 상에 발현된 항원 효소이며, 면역 조절, 신호 전달 및 아폽토시스와 관련된다. 이것은 폴리펩티이드의 N-말단으로부터 X-프롤린 디펩티드를 절단하는 내재 막 당단백질 및 세린 엑소펩티다제이다.
본원에 제시된 특정의 예시적 바이오마커에 대한 비-배타적인 NCBI 수탁 데이터
Figure pct00003
본 발명의 특정 양태는 바이오샘플을 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 것을 제공하며, 여기서, 검정 단계는 바이오샘플로부터 요망되는 펩티드를 추출하고 추출된 펩티드 혼합물을 분리시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 단백질은 관심 생물학적 물질로부터 추출되며, 단리된 단백질은 펩티드 단편을 발생시키기 위해 프로테아제로 효소 분해된다. 복잡한 펩티드 혼합물은 역상 크로마토그래피를 이용하여 크로마토그래피로 분리된다. 특정 구체예에서, 역상 크로마토그래피는 높은 pH 역상 크로마토그래피이다. 대안적으로, 복잡한 펩티드 혼합물은 오프라인 이온 교환 크로마토그래피 또는 높은 pH 역상 크로마토그래피를 이용하여 크로마토그래피로 분리된다. 또한, 당업자는, 다른 추출 및 분리 기술이 본 방법의 구체예를 실행하는데 적합하다는 것을 인지할 것이다.
특정 구체예에서, 안정한 동위원소 라벨링된 표준물은 효소 분해 전에 단백질 추출물에 첨가된다. 기준 표준물은 상대적 또는 절대 정량화를 위해 사용될 수 있다. [Yocum AK, Chinnaiyan AM. Current affairs in quantitative targeted proteomics: multiple reaction monitoring-mass spectrometry. Briefings in functional genomics & proteomics. 2009;8(2):145-57. Epub 2009/03/13. doi: 10.1093/bfgp/eln056. PubMed PMID: 19279071; PubMed Central PMCID: PMC2722263]. 통상적인 절대 정량화 방법은 AQUA(절대 정량화(Absolute QUAntification)를 나타냄)로서 알려져 있다. AQUA 펩티드는 공지된 농도로 샘플에 첨가된 안정한 중동위원소 아미노산을 제외하고 내인성 펩티드와 서열에 있어서 동일하다. 이에 따라, AQUA 펩티드와 비교할 때, 내인성 펩티드의 정확한 농도가 결정될 수 있다. [Gerber SA, Rush J, Stemman O, Kirschner MW, Gygi SP. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003;100(12):6940-5. Epub 2003/05/29. doi: 10.1073/pnas.0832254100. PubMed PMID: 12771378; PubMed Central PMCID: PMC165809]. 안정한 동위원소-라벨링된 펩티드의 정확한 농도가 알려져 있지 않을 때, 펩티드는 공지된 비율로 샘플에 첨가되고 상대적 정량화에 사용될 수 있다. 기준 표준물은 또한, 안정한 동위원소 라벨링된 단백질(PSAQ) 또는 콘카테머(QconCAT) 각각을 사용하여 생체내에서 전체 단백질 또는 합성 농축 트립신 펩티드로서 제조될 수 있다. [Kaiser SE, Riley BE, Shaler TA, Trevino RS, Becker CH, Schulman H, et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature methods. 2011;8(8):691-6. Epub 2011/07/12. doi: 10.1038/nmeth.1649. PubMed PMID: 21743460; PubMed Central PMCID: PMC3196335; Pratt JM, Simpson DM, Doherty MK, Rivers J, Gaskell SJ, Beynon RJ. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nature protocols. 2006;1(2):1029-43. Epub 2007/04/05. doi: 10.1038/nprot.2006.129. PubMed PMID: 17406340].
본원에 기술된 특정 구체예는 낮은-수준의 내인성 펩티드를 분석하고 정량적 피크 통합을 위해 피크 형상을 최적화하시키는데 최적화되는 역상 크로마토그래피를 이용한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, HPLC 시스템은 Nanoflex cHiPLC 시스템이 장착된 Eksigent Nano 2D LC이다. Nanoflex 시스템에는 임의적으로, 역상 구배에서 펩티드를 트랩핑하고 크로마토그래피로 용리시키기 위해 사용되는 C18 마이크로유체 칩이 장착된다. 또한, Nanoflex 시스템에는 임의적으로, 피크 분석시에 온도의 효과를 최적화하기 위해 컬럼 히터가 장착된다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 공동-용리 종의 수를 이동시키고 국소화된 샘플 복잡성을 감소시킴으로써 낮은 존재량의 내인성 펩티드를 식별하기 위하여 최적화된 크로마토그래피 구배 길이를 사용한다. 이에 따라, 특정 구체예에서, 본원의 방법은 크로마토그래피 분리를 위해 90분의 효과적인 구배 길이를 제공한다.
높은 특이성을 달성하기 위하여, 기준 표준물의 펩티드 아미노산 서열은 단백질 바이오마커에 대해 고유하다. [Lange V, Picotti P, Domon B, Aebersold R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular systems biology. 2008;4:222. Epub 2008/10/16. doi: 10.1038/msb.2008.61. PubMed PMID: 18854821; PubMed Central PMCID: PMC2583086]. 펩티드 길이는 우수한 크로마토그래피 피크 형상, 적절한 이온화, 및 최적 단편화를 달성하기 위하여 대략 6개 내지 20개의 아미노산으로 유지된다. [Elias JE, Haas W, Faherty BK, Gygi SP. Comparative evaluation of mass spectrometry platforms used in large-scale proteomics investigations. Nature methods. 2005;2(9):667-75. Epub 2005/08/25. doi: 10.1038/nmeth785. PubMed PMID: 16118637; Kirkpatrick DS, Gerber SA, Gygi SP. The absolute quantification strategy: a general procedure for the quantification of proteins and post-translational modifications. Methods. 2005;35(3):265-73. Epub 2005/02/22. doi: 10.1016/j.ymeth.2004.08.018. PubMed PMID: 15722223; Picotti P, Clement-Ziza M, Lam H, Campbell DS, Schmidt A, Deutsch EW, et al. A complete mass-spectrometric map of the yeast proteome applied to quantitative trait analysis. Nature. 2013;494(7436):266-70. Epub 2013/01/22. doi: 10.1038/nature11835. PubMed PMID: 23334424]. 특정 구체예에서, 펩티드 충돌 에너지는 가장 강한 단편 이온을 제공하기 위해 최적화되며, 스케쥴링 방법은 단지 제한된 수의 전이가 제공된 사이클 시간에 걸쳐 분석되도록 실행된다. 당업자는, 스케쥴링이 특정 이온에 대한 신호를 최대화하기 위하여 체류시간(전이가 분석되는 시간의 길이)을 증가시키는 능력을 갖는다는 것을 인지할 것이다. 일 구체예에서, 5 내지 7분의 스케쥴링 윈도우는 본 방법에서 사용되는 펩티드에 대하여 1.5초 사이클 시간 내에 적어도 20ms 또는 그 초과의 체류 시간을 야기시키도록 선택된다. 대안적으로, 상이한 길이의 사이클 시간 및 스케쥴링 윈도우가 또한 고려된다.
기준 표준물로서 안정한 동위원소의 사용은 동일한 분석 내에서 둘 이상의 샘플을 직접적으로 비교하는 능력을 제공하고, 이에 따라, 라벨-부재 방법에서 관찰된 실행간 변동성(run-to-run variability)과 관련된 문제를 제거한다. 표적 단백질 바이오마커에 대해 독특한 이러한 표준물은 표적 내인성 펩티드 바이오마커로부터 분화시키기 위해 안정한 중동위원소 라벨링된 아미노산을 함유한다. 게다가, 이러한 기준 표준물은 또한, 다수의 유사한 펩티드 서열이 복잡한 단백질 분해에 존재할 때 정확한 관심 펩티드 이성질체를 식별하는데 도움을 주는 능력을 가지며, 이에 따라, 검정의 특이성에 기여한다. [Banack SA, Downing TG, Spacil Z, Purdie EL, Metcalf JS, Downing S, et al. Distinguishing the cyanobacterial neurotoxin beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) from its structural isomer 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). Toxicon: official journal of the International Society on Toxinology. 2010;56(6):868-79. Epub 2010/06/22. doi: 10.1016/j.toxicon.2010.06.006. PubMed PMID: 20561540].
특정 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준은 질량 분광분석을 이용하여 검출된다. 특정 구체예에서, 단백질 바이오마커의 수준은 선택된 반응 모니터링 질량 분광분석법(SRM-MS)을 이용하여 검출된다. 다른 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준은 비제한적으로, 스펙트럼 카운팅, 동중 원소 질량 태그화(isobaric mass tagging), 또는 이온 이동성 질량 분광분석을 포함하는, 다른 정량적 질량 분광분석 기술을 이용하여 검출된다.
다른 구체예에서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 절대 농도가 결정된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 절대 농도는 AQUA 방법과 조합하여 SRM-MS를 이용하여 결정된다.
다른 구체예에서, 청구된 방법의 검출 단계는 질량 분광분석에 대한 대안을 이용한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 단백질 바이오마커의 수준은 당해 분야에 공지된 관례적인 면역검정 기술을 이용하여 검출된다. 이러한 면역검정 기술은, 비제한적으로, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 단백질 어레이, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 유동세포 분석법 세포 분류화, 면역조직화학, 면역세포화학, 또는 면역세포분석을 포함한다. 현재 기술된 방법의 일부 구체예에서, 검출 단계는 비제한적으로, 마이크로유체 칩-기반 ELISA 또는 웨스턴을 포함하는, 관례적인 면역검정 기술에 대한 변형을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법의 검출 단계는 전기영동에 의한 정량화를 이용한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 검출 단계는, 비제한적으로, 1차원 또는 2차원 전기영동, 또는 모세관 전기영동을 포함한다. 당업자는 본 발명을 실행하기에 적합한 또 다른 정량 전기영동 방법을 인지할 것이다.
또 다른 구체예에서, 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준은 전통적인 단백질 정량화 기술에 의해 검출된다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 하나 또는 복수의 바이오마커의 수준은, 비제한적으로, UV-VIS 분광법, Bradford, BCA, 또는 Lowry Assay을 사용하여 검출된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 복수의 바이오마커의 수준을 검출하는 것은 바이오마커가 바이오샘플로부터 정제된 후에 수행된다.
다른 구체예에서, 본원의 검출 단계는 하나 이상의 크로마토그래피 정량화 기술로 바이오샘플을 처리하는 것을 포함한다. 액체 크로마토그래피 방법의 예는 양이온 교환, 음이온 교환, 역상, 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 당업자는 크로마토그래피 피크 아래의 면적이 바이오샘플에 존재하는 바이오마커의 상대적 양을 나타냄을 인지한다.
본원에서 사용되는 "차등 발현된"은 둘 이상의 바이오샘플에서 결정된 바이오마커 간의 비교, 또는 바이오샘플에서 결정된 바이오마커와 바이오마커 기준 표준물 간의 비교를 지칭하며, 여기서, 측정된 바이오마커의 발현 수준은 비교된 바이오샘플 간에 또는 바이오샘플과 기준 표준물 간에 상이하다. 일부 구체예에서, 차등 발현은 비교된 바이오마커 수준의 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 차등 발현은 비교된 바이오마커 수준의 감소를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 차등 발현은 시간에 따른 비교된 바이오마커의 변화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 차등 발현은 대상체의 결장에 존재하는 폴립 또는 종양의 상이한 병기 간에 비교된 바이오마커의 변화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 차등 발현은 대상체의 결장에 존재하는 병변의 치료 동안 비교된 바이오마커의 변화를 포함한다.
구체예에서, 본 발명의 하나 또는 복수의 바이오마커의 차등 발현은 대상체의 결장에서의 병변의 병기를 결정하는데 사용된다. 특정 구체예에서, 차등 발현은 기준 바이오샘플로부터, 또는 바이오마커 기준 표준물로부터의 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 바이오마커의 수준의 편차를 포함한다. 일부 구체예에서, 상응하는 기준 양으로부터의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%의 하나 또는 복수의 바이오마커의 편차는 대상체의 결장에서 병변의 존재 또는 병기를 가리킨다. 대안적인 구체예에서, 상응하는 기준 양으로부터의 약 2배, 약 4배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 80배, 또는 약 100배의 하나 또는 복수의 바이오마커의 편차는 대상체의 결장에서 병변의 존재 또는 병기를 가리킨다.
인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 또는 소로부터 수집된 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 "바이오샘플"은 대상체로부터 단리된 생물학적 물질로 이루어지고, 비제한적으로, 혈액, 혈청, 조직, 혈장 또는 혈액 세포를 포함한다.
특히, 본원에 기술된 방법에 유용한 바이오마커는 종양 또는 선종 또는 폴립 세포에서 떨어져 가끔 발생하는 신체 반응을 포함한다. 주요 예는 간에서 생성되는 급성기 및 염증 반응 단백질을 포함한다. 급성기, 염증 및 면역 반응은 종양 존재에 대한 일반적인 반응으로서 식별되었다. [Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. Cancer-related inflammation. Nature. 2008;454(7203):436-44. Epub 2008/07/25. doi: 10.1038/nature07205. PubMed PMID: 18650914; Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 2010;140(6):883-99. Epub 2010/03/23. doi: 10.1016/j.cell.2010.01.025. PubMed PMID: 20303878; PubMed Central PMCID: PMC2866629]. 세포 유착은 암 전이와 관련하여 중요한 기능을 나타낸다. 히알루로난-결합 단백질, 예를 들어, 인터-알파-트립신 억제제는 성장 종양으로의 이러한 글리코사미노글리칸의 필수적인 이동을 제공한다. 이러한 것들은 암에 대한 전신 반응과 관련하여 본원에 제시된 단지 몇 가지 예일 뿐이다. 따라서, 당업자는, 본 발명의 바이오샘플이 종양 및 비-종양 세포 둘 모두로부터 유래됨을 인지할 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 바이오샘플이 임의적으로, 비제한적으로, 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 복수액, 소변, 및 배설물을 포함하는 광범위한 물질로부터 단리됨을 인지할 것이다.
본 발명의 구체예는 1차 선별 또는 진단 메카니즘으로서 대장내시경을 이용하는 관례적 선별검사에 대한 대안을 제공하기 위해 민감성 및 특이성을 갖는 결장직장암에 대한 바이오샘플-기반 시험을 제공한다. 선별검사 방법의 구체예는 고처리량 표적화된 질량 분광분석 절차를 이용하는데, 이는 많은 단백질 마커를 단일 정량적 선별검사 검정으로 다중화시킨다.
특정 구체예에서, SRM-MS를 이용한 결장직장암에 대한 바이오샘플-기반 시험은 유리하게는, 바이오마커 당 감소된 비용, 바이오마커 패널 분석에서 처리량이 증가될 가능성, 및 증가된 민감성 및 특이성을 제공한다.
특정 구체예는 전암성 또는 암성 질병의 존재에 대한 집단의 관례적 선별검사를 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 진단 목적에 유용한 혈액 및 다른 물질의 관례적인 수집을 포함한다. 또한, 특정 구체예에서, 본 발명의 바이오샘플은 대장내시경 또는 폴립절제 절차 동안 또는 이와 일치하여 수득된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 구체예의 바이오샘플은 대장내시경 또는 폴립절제술 이후에 주기적으로 수득된다. 또 다른 구체예에서, 바이오샘플은 대장내시경 전에 수득되며, 대장내시경을 필요로 하는 환자를 식별하기 위해 단백질 바이오마커의 수준이 결정된다.
본 방법의 구체예는 환자 집단의 관례적 선별검사에 유용하다. 본 방법은 적격 대상체가 현존하는 선별검사 권고를 따를 순응성이 낮은 경우에 특히 유리한데, 왜냐하면, 주로, 현존하는 선별검사 방법이 침습적이고, 고가이고, 지방에서는 이용 가능하지 않기 때문이다. 또한, 본 방법의 구체예는 결장직장암에 대한 상승된 위험 인자(예를 들어, 가족력)를 나타내지 않거나 현존하는 선별검사 또는 진단 방법에 대해 달리 지시되지 않은 환자 집단의 선별검사에 유용하다.
또 다른 구체예에서, 대장내시경 또는 폴립절제 절차에 의한 추가 평가 또는 처리를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 추가 임상 평가 또는 치료로부터 이득을 얻는 개체를 식별하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 수술후 또는 폴립절제 후 환자 모니터링이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 본 방법은 화학예방제 또는 화학치료제에 대한 환자의 반응성을 모니터링하는데 유용하다.
또한, 현존하는 결장직장 선별검사, 진단, 예후 및 치료 기술의 진단 및 예후 유용성을 향상시킬 수 있는 방법이 제공된다. 따라서, 대장내시경, CT 스캔, 또는 변잠혈 시험을 포함하는, 당해 분야에 공지된 다른 기술과 조합된 본원에 기술된 특정 구체예는 유용하다.
추가의 양태에서, 본원은 대상체에서 직장결장 병변의 병기 설정을 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 본 발명의 하나 또는 복수의 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 검출 시약을 포함하고, 임의적으로, 암성 또는 전암성 직장결장 병변의 병기와 관련된 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대한 한 세트의 표준 값을 포함한다.
또한, 본 발명은 a) 본 발명의 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 바이오마커의 양을 검출하기 위한 수단, b) 단계 a)에 결정된 양과 기준 양을 비교하기 위한 수단을 포함하는 상기에 언급된 본 발명의 방법을 수행하기에 적합화된 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 기타 특정 구체예에서, 키트는 바이오샘플이 수집되는 수집 용기를 포함한다. 수집 용기는 검정용 바이오샘플을 제조하기 위한 용액을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "키트"는 적합하게 별도로 또는 단일 용기 내에 제공된 상술된 수단의 콜렉션(collection)을 지칭한다. 용기는 또한, 적합하게는, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다.
본 발명은 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예 및 이의 다양한 사용을 예시한 것이다. 이러한 것들은 단지 예시적인 목적을 위해 기술된 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로서 여겨지지 않는다.
실시예
환자 집단
환자는 3개의 별개의 환자 군으로부터 등록되었다(도 4). 관례적인 대장내시경 선별검사를 수행한 무증상 성인(n=180), 질환의 제거 및 병기 설정을 위한 외과적 절제를 수행한 결장직장암을 갖는 환자(n=50), 및 CT 대장조영술(가상 대장내시경)로 관찰된 폴립을 갖는 환자(n=33). 폴립을 갖는 CT 대장조영술 환자는 후속하여 이들의 제거(폴립절제)를 위해 대장내시경으로 처리되었다.
모든 생검 폴립 또는 외과적 절제물은 분석을 위해 임상 병리과로 보내졌다. 비-암성 폴립을 갖는 환자는 표 2에 개략된 치료 기준의 현행 표준에 따라 진행성 선종(고위험) 또는 저위험 폴립을 갖는 것으로 분류되었다. 외과적 절제물은 표 1에 제시된 TNM 병기 설정 시스템에 따라 병기 설정되었다.
대장내시경 또는 직장결장 수술 전, 혈액 샘플을 각 환자로부터 취하였다. CT 대장조영술 및 후속 대장내시경 검사를 받은 환자는 폴립 제거 후 바이오마커 발현의 변화를 모니터링하기 위한 두 번째 혈액 추출을 위해 폴립절제 후 3-4주에 다시 왔다.
CT 대장조영술/대장내시경 종단 연구에서 환자 각각을 CT 대장조영술에 의해 2 내지 11년 동안 모니터링하고, 모니터링 기간 동안 폴립이 성장 가능성이 있는 것으로 분류되는 경우 대장내시경 동안 폴립을 생검하였다. 최종 성장 분류는 CT 대장조영술에 의해 결정된 바와 같이 폴립 길이 또는 측정된 부피를 기준으로 이루어졌다. 그러나, 일부 환자는 폴립이 1개 초과였고, 한 환자의 모든 폴립이 반드시 성장하는 것으로 분류되지는 않았다. 표 9는 대장내시경 검사시 폴립이 1개 초과로 있는 경우 환자 성장이 어떻게 분류되었는지를 설명한다. 따라서, 전-/후-폴립절제 케이스에 대한 한 가지 분석 방식은 성장 상태와 무관하게 단지 대장내시경 케이스 대해 행한 것과 동일한 저위험 및 고위험 범주로 환자 케이스를 분류하고, 특히 이들의 전- 및 후-폴립절제 상태에 기초하여 케이스를 분석하고자 하였다(표 2). 두 번째 분석 모드는 성장 선종 케이스의 전-폴립절제 값을 관례적인 대장내시경 선별검사로부터의 비공지 성장의 선종(즉, 케이스가 CT 대장조영술에 의해 종단 모니터링되지 않음)과 비교하여 종단적 성장 효과를 시험하고자 하였다.
단백질 바이오마커 후보 선택
SRM-MS 분석을 위한 혈청 단백질을 두 개의 상이한 연구로부터 선택하였다. 먼저, 일부 단백질을 문헌 [Ivancic, MM, Huttlin, EL, et al., 상기 참조]에 기술된 바와 같이 야생형과 비교하여 ApcMin /+ 마우스의 혈청으로부터의 정량적 단백질체 데이터로부터 선택하였다. ApcPirc /+ 래트 바이오마커 검증 연구에서 검증된 거의 모든 단백질을 또한 사용하였다. [Ivancic MM, Irving AA, Jonakin KG, Dove WF, Sussman MR. The concentrations of EGFR, LRG1, ITIH4, and F5 in serum correlate with the number of colonic adenomas in ApcPirc/+ rats. Cancer Prev Res (Phila). 2014;7(11):1160-9. Epub 2014/09/10. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-14-0056. PubMed PMID: 25200834; PubMed Central PMCID: PMC4221466]. 각 선택된 바이오마커 후보에 대해 고유한 동위원소로 라벨링된 펩티드 기준 표준물을 UW-Madison Biotechnology Center의 펩티드 합성 코어 설비에 의해 합성하였으며, 각 기준 펩티드에 하나의 안정한 중동위원소 라벨링된 아미노산(예: 13C15N 탄소 및 질소)이 혼입되었다. 선택된 바이오마커는 표 3에 열거되어 있다.
표 3: 바이오마커에 대한 단백질 및 관련 약어 목록
Figure pct00004
표 4:
기재된 구체예에 유용한 예시적인 펩티드 서열
Figure pct00005
샘플 처리
각 환자로부터의 혈액을 혈청으로 처리하였다. 5 밀리리터의 혈액을 1-5 ml 적색 탑 혈청 튜브 내에 수집하고, 실온(15-25℃)에서 30분-4시간 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 1500 x g에서 15분 동안 원심분리하였다. 모든 원심분리 단계는 스윙-아웃 로터에서 실온에서 수행하였다. 혈액 혈청을 0.5 mL 낮은 결합 에펜도르프 튜브 내로 100 μl 또는 300 μl 분취액으로 분취하고, -80℃에서 보관하였다.
혈청을 실온에서 해동하고, 상위 7개 주요 혈액 단백질을 Human 4.6 mm x 100 mm Agilent Multiple Affinity Removal Column을 사용하여 제거하였다. 독점 버퍼 및 필터 모두는 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 수동 샘플 주입기 및 1 mL 샘플 루프가 장착된 Waters 1740 HPLC를 사용하였다. 고갈 전, 50 μl의 혈청을 여과 전에 400 μl의 Agilent Buffer A에 첨가하였다. 각 샘플 주입은 Waters 2996 광다이오드 어레이 검출기를 사용하여 215 및 280 nm에서 모니터링하였으며, 결합된 분획물 및 비결합된 분획물 둘 모두를 수집하였다. 분획물을 추가 사용 때까지 -80℃에서 보관하였다.
비결합된 분획물을 실온에서 해동시키고, 대략 ≤500 μL의 액체가 남을 때까지 4000 x g (4℃)에서 Agilent 5 kDa MWCO 농축 필터 유닛을 사용하여 여과하였다. 50% 냉 트리클로로아세트산을 10%의 최종 농도가 되게 첨가하고, 샘플을 5min 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여 농축된 단백질을 침전시켰다. 4℃에서 4000 x g로 5분 동안 미세원심분리를 이용하여 단백질을 펠렛화시켰다. 물 중의 80% 냉 아세톤으로 4회 세척하고 이어서, 물 중의 50% 냉 메탄올로 1회 세척하면서 원심분리 단계를 반복하였다. 상청액을 각 세척 후 제거하고, 펠렛이 최종 세척 후 공기 건조되게 하였다. 펠렛을 50 mM 암모늄 바이카보네이트, 8 M 우레아, pH 8에서 4℃에서 밤새 용해시켰다. 부분적으로 용해된 펠렛을 1.6 M 우레아, 50 mM 암모늄 바이카보네이트 pH 8로 희석하였다. 각 샘플을 초음파 프로브를 사용하여 총 3회 5-초 펄스 동안 초음파 처리하였다.
BCA 단백질 농축 검정(Pierce)을 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 각 샘플로부터의 혈청 단백질의 100 μg 분취액은 시스테인 잔기의 환원 및 알킬화를 겪었으며, 1:50 트립신-단백질 비율에서 시퀀싱 등급 돼지 트립신(Promega)을 이용하여 37℃에서 밤새 분해시켰다. 환원 및 알킬화 전에, 각 표적 내인성 펩티드의 안정한 동위원소 라벨링된 펩티드 기준 표준물을 혈청 단백질 샘플에 첨가하였다. 얻어진 펩티드를 제조업체의 지시에 따라 SPEC C18 Pipette Tip (Agilent Technologies) 상에서 탈염화하였다. 용리된 펩티드는 진공 원심분리를 이용하여 건조시키고 LC-MS/MS 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다.
액체 크로마토그래피-질량 분광분석법
2 μg 샘플의 액체 크로마토그래피 분리를 37℃로 설정된 나노플렉스 cHiPLC가 장착된 NanoLC Ultra 2D(Eksigent)를 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 달성하였다. 90-분 구배를 문헌[Ivancic, MM, Huttlin, EL, et al., 상기 참조]에 기술된 바와 같이 펩티드 분리에 이용하고, 이어서 5500 QTrap (AbSciex)으로 직접적으로 용리시켰다. 펩티드 전구체를 사중극자 1(Q1)에서 선택하고, q2에서 단편화시키고, Q3에서 상부 3 내지 4 전이를 모니터링을 위해 선택하였다. 모든 Q1 및 Q3 질량을 단위 해상도에서 측정하였다. 7-분 스케쥴링 윈도우를 2-초 사이클 시간으로 적용하였다. 방법 개발 및 피크 분석은 Skyline 소프트웨어를 사용하여 수행하였다(Ivancic MM, et al. The concentrations of EGFR, LRG1, ITIH4, and F5 in serum correlate with the number of colonic adenomas in ApcPirc/+ rats. Cancer Prev Res (Phila). 2014;7:1160-9.). 모든 생물학적 샘플은 LC-MS/MS에 의해 3회 기술 반복으로 분석하였다.
질량 분광분석 데이터 처리 및 분석
질량 분광분석 결과를 Skyline으로 가져오고, 피크를 통합하였다. 각 펩티드를 3회의 기술적 반복에 대한 가장 강력한 전이의 평균 피크 면적을 사용하여 평가하였다. 각 단백질에 있어서, 평균 비율은 표 5에 나타낸 바와 같이 환자 군을 비교하여 펩티드 각각에 대해 계산하였다.
또한, 저위험, 고위험 및 융모/톱니형 폴립의 전-/후-폴립절제 비율을 비교하였다. P-값을 95% 신뢰 구간에서 양측(two-tailed) 비-파라미터 맨-휘트니(Mann-Whitney) t-테스트 사용하여 수득하였다. 맨-휘트니 p-값은 선종과 암종 병기를 비교한 케이스에 대해 벤자민 호츠버그(Benjamini Hochberg) 5% 거짓 발견율 계산을 이용하여 필터링하였다. CTC 연구 및 전-/후-폴립절제 연구는 맨-휘트니 p-값을 이용하였으나, 샘플 크기를 고려할 때 너무 많은 위음성 결과의 가능성에 근거하여 거짓 발견에 대해 필터링되지 않았다. 개별 단백질 ROC 곡선은 로지스틱 회귀 알고리즘을 사용하여 결정하였다. ROC 패널 곡선은 선형 SVM(Linear SVM), 로지스틱 회귀(Logistic Regression) 및 랜덤 포레스트(Random Forest)를 포함하는 여러 가지 상이한 기계-학습 알고리즘을 사용하여 최적화시켰다. [iaw AW, M. Classification and Regression by randomForest. R News. 2002;2/3:5; Burges CJC. A Tutorial on Support Vector Machines for Pattern Recognition. Data Mining and Knowledge Discovery. 1998;2:121-67; Zou KH, O'Malley AJ, Mauri L. Receiver-operating characteristic analysis for evaluating diagnostic tests and predictive models. Circulation. 2007;115(5):654-7. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.105.594929. PubMed PMID: 17283280].
표 5:
군 간의 배수-변화는 군 1/비교 군을 나눔으로써 계산하였다. 3기와 비교하여 "합친 1기&2기"는 국부 림프절 침습(3기) 및 기타 비-전이성 암(1기&2기) 사이를 구별하고자 하는 것이다.
Figure pct00006
실시예 1: 바이오마커는 직장결장암 및 전암성 상태의 검출을 위한 진단 및 예후 유용성을 갖는다.
대장내시경, 결장절제, 또는 CT 대장조영술/대장내시경 절차로부터 260명 환자 케이스에 걸쳐 혈액 혈청을 수집하고 분석하였다(도 5). 대부분의 대장내시경 케이스는 폴립 부재(정상 조직, n=56) 또는 저위험 폴립(n=87)을 갖는 저위험 군으로 분류되었다. 총 71명의 환자는 결장직장암을 발생시킬 위험이 높은 진행성 선종으로 간주된 폴립을 가졌다. 50개 결장절제 케이스 중 47명의 환자는 비-전이성 암을 가졌다. 케이스의 거의 절반은 1기(n=22)로 분류된 반면, 나머지는 2기(n=13) 및 3기(n=12) 결장직장암으로 나누었다. CT 대장조영술 후 대장내시경을 통해 폴립을 생검한 환자로부터 총 25 전- 및 후-폴립절제 쌍을 수집하였다. 8명의 환자는 폴립절제 후 혈액 채취를 위해 돌아오지 않았다. 이러한 종단 모니터링된 군에서, 11개의 저위험, 22개 고위험 케이스를 분석하였다(8개 저위험 전/후 쌍, 및 17개 고위험 전/후 쌍 케이스).
바이오마커는 고위험 및 저위험 결장직장 선종 사이의 차이를 제공한다.
대략 동일한 수의 남성 및 여성이 환자 연령 및 암 병기에 걸쳐 연구에 등록하였다(도 6). CRP는 합친 모든 성별에 대해 진행성 선종과 저위험 케이스 간의 발현에 있어서 평균 상향조절을 보여준다(도 8, 표 6). 유사하게는, EGFR은 진행성 선종 케이스에서 경미한 하향조절을 나타낸다. 로지스틱 회귀 분석을 기반으로 하는 민감성 및 특이성 수신자 조작 특성(ROC) 곡선은 이들 단백질이 진행성 선종을 예측함을 보여준다(도 9).
CRP 및 EGFR ROC 곡선은 성별에 의해 나눌 경우 민감성 및 특이성에 있어서 차이를 보여준다(도 10). 유사하게는, 진행성 선종 민감성 및 특이성에서의 성별 차이는 CD44, F5, CFI, 및 ITIH4에 대해서 관찰되었다(도 11).
일부 단백질은 폴립 조직학을 기반으로 하는 발현에서 특이적 변화를 보여주었다. 임의의 등급의 이형성을 갖는 융모(관상융모) 선종은 다른 유형의 폴립보다 암종으로 진행될 가능성이 현저하게 높았다. ITIH3, ITIH4 및 CRP는 관상융모 선종에서 다른 폴립 조직병리학보다 높은 중앙 상향조절을 보였다(도 12).
QSOX1은 성별의 함수로서 관상융모 선종 케이스에서 차등 발현을 보여준다(도 13). 감소된 QSOX1 발현은 관상융모 선종을 갖는 여성에 존재한 반면, 증가된 QSOX1 발현은 관상융모 선종을 갖는 남성에 존재하였다.
바이오마커는 직장 선종 및 결장 선종간에 차이를 제공한다.
폴립 위치에 의해 나누어진 바이오마커는 결장에 존재하는 선종 대비 직장에 존재하는 선종을 구분지었다. 대장내시경 환자는 4개의 범주로 나누었다: 정상, 결장 폴립 단독, 결장 및 직장 폴립, 및 직장 폴립 단독 선별. 폴립을 갖는 대부분의 환자는 결장 폴립 또는 결장과 직장의 혼합을 나타냈으나, 일부 케이스는 직장 단독에만 특이적이었다(도 14). CD44 및 PI16은 단지 직장 폴립만 존재하는 경우에 둘 모두 하향조절되었다(도 15). ITIH3 및 QSOX1은 직장 폴립과 결장 폴립의 혼합을 갖는 환자를 포함하여, 직장 폴립이 존재하는 경우에 둘 모두 상향조절되었다.
바이오마커는 결장직장 선종 및 결장직장 암종 간에 차이를 제공한다.
정상적인 대장내시경 또는 저위험 선종으로 선별검사된 환자는 직장결정 암 케이스와 구분되었다. 저위험 케이스 및 정상 케이스 대비 모든 비-전이성 결장직장암의 평균은 EGFR, DPP4, CD44, PI16, 및 FETUB에 있어서 하향조절을 보여주었다(도 16, 표 6). 이러한 단백질에 대한 ROC 곡선(도 17)은 EGFR이 결장직장암을 예측하는데 있어서 가장 높은 민감성 및 특이성을 갖는 반면, DPP4 및 CD44 또한 우수한 예측인자임을 나타낸다. LRG1, ITIH3, ITIH4, HPX, CRP, QSOX1, 및 F5는 저위험 대장내시경 케이스 대비 암에서 상향조절된다(도 18, 표 6). 분석된 모든 단백질 중에서, LRG1, ITIH3 및 ITIH4는 개별 마커로서 결장직장 암종의 존재를 예측하는데 있어서 전반적으로 가장 큰 민감성 및 특이성을 가졌다(도 19).
표 6a:
비교된 실험 군 내에서 단백질 바이오마커 발현에서의 배수 변화
Figure pct00007
표 6b:
6a에 제시된 단백질 발현에서 배수 변화에 대한 정확한 맨-휘트니 P-값
Figure pct00008
다중- 마커 패널은 선별 목적에 있어서 직장결장암 검출의 민감성 및 특이성을 증가시키는 능력을 갖는다.
민감성 및 특이성은 다중-마커 패널을 사용함으로써 증가될 수 있다. 여러 상이한 기계-학습 방법을 이용하여, 바이오마커 모두를 저위험 환자 대비 직장결장암을 검출하기 위한 민감성 및 특이성을 최대화시키기 위해 바이오마커 패널에 대한 잠재적인 후보로서 시험하였다. CD44, DPP4, EGFR, ITIH3, 및 LRG1을 포함하는 5-마커 단백질 패널은 저위험 및 정상 케이스 대비 암을 검출하기 위한 가장 최적인 패널로서 2개의 상이한 기계-학습 알고리즘을 사용하여 확인되었다(도 21 및 22). 먼저, 37개 암 및 71개 저위험 선종 및 정상 케이스의 훈련 세트를 사용하여 알고리즘을 훈련시켰다. 두 번째로, 10개 암 및 69개 저위험 선종 및 정상 케이스를 사용하여 훈련 후 알고리즘을 검증하였다. 신뢰 영역은 회색 구체로 나타내며, 문헌 [Tilbury JB, Van Eetvelt PW, Garibaldi JM, Curnow JS, Ifeachor EC. Receiver operating characteristic analysis for intelligent medical systems--a new approach for finding confidence intervals. IEEE Trans Biomed Eng. 2000;47(7):952-63. doi: 10.1109/10.846690. PubMed PMID: 10916267]에 따라 계산하였다. 로지스틱 회귀 및 여분의 트리 훈련 세트 둘 모두에 있어서의 AUC는 0.9에 가까운 반면, 여분 트리에 대한 검증 세트는 로지스틱 회귀 분석에 의해 수행된 임의의 개별 마커보다 실질적으로 더 높은 0.88이었다. 중요하게는, 다중-마커 패널은 결장직장암에 대한 현존하는 선별검사 도구와 경쟁할 수 있는 수준으로 전체 특이성을 증가시켰다.
바이오마커는 암 병기에서 국부 림프절 침습의 확인을 허용한다.
바이오마커는 초기-병기 암(1기 및 2기) 및 국부 림프절 침습(3기)을 구분할 수 있는 이들의 능력에 대해 평가되었다(도 23, 표 6). 개별 마커에 대한 AUC(도 24)는 3기 CRC에 있어서 가장 큰 민감성 및 특이성을 나타내는 CD44로 국부 림프절 존재를 확인하는 예측가능성을 보여준다.
램덤 포레스트 회귀 모델을 사용하여, 분석된 47명 환자 중에서 민감성 및 특이성을 갖는 CD44, CRP, DPP4, ITIH3, 및 VITD (GC)의 5-바이오마커 패널을 확인하였다(도 25). 회색 구체는 ROC 곡선에 걸친 전반적인 신뢰도를 나타내는 반면, 보라색 박스는 국부 림프절을 확인하기 위한 표적 신뢰 구간을 나타낸다. 훈련 데이터는 10개의 3기 암 및 27개의 1기 또는 2기 암으로 구성되는 반면, 검증 데이터는 2개의 3기 암 및 8개의 1기 또는 2기 암으로 구성되었다.
폴립절제 후 대비 폴립절제 전의 바이오마커 발현
전- 및 후-폴립절제 샘플을 제공하는 각 환자에 있어서, 전-/후-폴립절제 바이오마커 발현의 비율을 결정하였다. 평가한 단백질 바이오마커는 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, 카드헤린 2, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신, 혈청 아밀로이드 P 성분, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 I, 슈퍼옥사이드 디스무타제 3, 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1, 트롬보스폰딘-4, 및 비트로넥틴을 포함한다. 단백질은 하기가 참인 경우 폴리절제 후 정상 수준으로 되돌아가는 것으로 규정되었다(도 6):
1. 폴립절제 전의 샘플이 정상 수준으로부터 상향조절되는 경우, 기준 표준물 대비 후-폴립절제 비율은 기준 표준물 대비 전-폴립절제 비율보다 낮아야 한다. 따라서, 전-/후-폴립절제의 비율은 1보다 크다.
2. 폴립절제 전의 샘플이 정상 수준으로부터 하향조절되는 경우, 기준 표준물 대비 후-폴립절제 비율은 기준 표준물 대비 전-폴립절제 비율보다 높아야 한다. 따라서, 전-/후-폴립절제의 비율은 1보다 작다.
모든 환자의 전-/후-폴립절제 비율의 평균은 두 군 사이의 통계적으로 유의한 변화를 갖는 단백질 바이오마커를 확인시켜주었다. PI16은 폴립 제거 후 정상 수준으로의 평균 발현 변화를 보여주었다(도 26a, 표 7). PI16은 전형적으로 선종을 갖는 환자에서 하향조절을 보여주며, 이러한 경우, 기준 표준물 대비 평균 전-폴립절제 비율(0.391) 및 기준 표준물 대비 증가된 평균 후-폴립절제 비율(0.544)을 가졌다. PI16에 있어서 고위험(진행성 선종) 케이스와 저위험 케이스 사이의 케이스를 없앤 경우(도 26b, 표 7), 관찰된 전-폴립절제 대 후-폴립절제 발현 변화는 통계적으로 유의하지 않았으며, 이는 폴립 제거에 대한 일반적인 반응으로서 PI16에서 전반적 변화가 존재함을 의미한다.
C-반응성 단백질(CRP)은 고위험 케이스에서 전-폴립절제 대 후-폴립절제 비율에서의 차이를 나타내었다(도 27, 표 7).
표 7:
전-폴립절제 대 후-폴립절제 선종 케이스에 있어서 맨-휘트니 p-값. 굵은체 값은 0.05 미만의 통계적으로 유의한 p-값을 가졌다.
Figure pct00009
표 8:
공지된 성장 선종(선형 성장)을 비공지 성장의 선종과 비교하는 맨-휘트니 p-값 및 정상 대장내시경 선별검사를 받은 환자. 굵은체 값은 0.05 미만의 통계적으로 유의한 p-값을 가졌다.
Figure pct00010
비공지 성장의 전- 암성 폴립 대비 공지된 성장의 전- 암성 폴립에서의 바이 오마커 발현
혈액 바이오마커 발현을 폴립절제 전 및 후에 모니터링한 환자 케이스를 또한, CT 대장조영술 CTC를 사용하여 2-10년의 기간에 걸쳐 종단 모니터링하였다(도 28). 표 9는 성장, 정적, 퇴행, 또는 비공지 성장으로서 환자를 라벨링하는데 사용되는 룰을 기술한다. 간략하게는, 성장 폴립을 갖는 모든 환자는 모든 다른 폴립의 존재와 무관하게 성장으로서 분류하였다. 비공지 성장의 폴립을 정적 및 퇴행 폴립보다 우선으로 하였는데, 이들은 성장한 가능성이 더 크기 때문이다. 성장 폴립 또는 비공지 성장의 폴립의 부재하에, 정적 폴립은 퇴행되는 폴립보다 더 위험한 것으로 간주되었는데, 이들은 줄어들지 않으며, 성장 폴립 상태로 변화될 가능성이 더 크기 때문이다. CTC에 의해 모니터링되지 않은 환자 케이스를 관례적인 대장내시경 선별검사 군으로부터 모아서, 비공지 성장의 폴립 및 정상 대조군을 선별하는 형태로 성장 폴립 군과 추가적 비교로서 제공하였다.
표 9:
CTC 데이터 분석을 위한 성장 분류 배정
Figure pct00011
F5, CRP, PI16, ITIH4 및 LRG1 모두는 비공지 성장의 선종 케이스 대비 공지된 성장의 선종 케이스에서 통계학적으로 유의한 변화를 보여주었다(도 29, 표 8). ITIH4 이외의 모두는 또한 정상 대장내시경 선별검사와 비교하여 성장 선종에서 통계학적으로 유의한 단백질 발현 변화를 보여주었다.
본 발명을 상세히 그리고, 이의 특정 구체예를 참조하여 설명하였으나, 첨부된 청구 범위에서 규정된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 수정 및 변형이 가능하다는 것이 명백할 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 일부 양태가 본원에서 특히 유리한 것으로 확인되었지만, 본 발명은 반드시 본 발명의 이러한 특정 양태로 한정되지 않는 것으로 여겨진다.
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Receptor biomarker peptide <400> 5 Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Epidermal Growth Factor Receptor biomarker peptide <400> 6 Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3 biomarker peptide <400> 7 Glu Val Ser Phe Asp Val Glu Leu Pro Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Maltase Glucoamylase biomarker peptide <400> 8 Ala Tyr Val Ala Phe Pro Asp Phe Phe Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Maltase Glucoamylase biomarker peptide <400> 9 Ser Ser Val Tyr Ala Asn Ala Phe Pro Ser Thr Pro Val Asn Pro Leu 1 5 10 15 Arg <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Coagulation factor V biomarker peptide <400> 10 Asn Phe Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ser Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Hemopexin biomarker peptide <400> 11 Leu Trp Trp Leu Asp Leu Lys 1 5 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial biomarker peptide <400> 12 Thr Ile Glu Ala Glu Ala Ala His Gly Thr Val Thr Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Pyruvate Kinase, M2 biomarker peptide <400> 13 Glu Ala Glu Ala Ala Ile Tyr His Leu Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg 1 5 10 15 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Vitamin D-binding protein biomarker peptide <400> 14 Val Leu Glu Pro Thr Leu Lys 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Vitronectin biomarker peptide <400> 15 Phe Glu Asp Gly Val Leu Asp Pro Asp Tyr Pro Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Inter-alpha-trypsin inhibitor, Heavy chain 4 biomarker peptide <400> 16 Phe Ala His Thr Val Val Thr Ser Arg 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CEACAM5 biomarker peptide <400> 17 Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg 1 5 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Cathepsin B biomarker peptide <400> 18 Leu Cys Gly Thr Phe Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Gln Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Serum Amyloid P biomarker peptide <400> 19 Gly Tyr Val Ile Ile Lys Pro Leu Val Trp Val 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fetuin B biomarker peptide <400> 20 Ile Phe Phe Glu Ser Val Tyr Gly Gln Cys Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic C-reactive protein biomarker peptide <400> 21 Glu Ser Asp Thr Ser Tyr Val Ser Leu Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heparin cofactor 2 biomarker peptide <400> 22 Phe Thr Val Asp Arg Pro Phe Leu Phe Leu Ile Tyr Glu His Arg 1 5 10 15 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sulfhydryl Oxidase 1 biomarker peptide <400> 23 Leu Ala Gly Ala Pro Ser Glu Asp Pro Gln Phe Pro Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Rho-GDP Dissociation Inhibitor 1, Isoform a (ARHGDIA) biomarker peptide <400> 24 Ala Glu Glu Tyr Glu Phe Leu Thr Pro Val Glu Glu Ala Pro Lys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptidase inhibitor 16 biomarker peptide <400> 25 Trp Asp Glu Glu Leu Ala Ala Phe Ala Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Cadherin-2 (N-Cadherin) biomarker peptide <400> 26 Gly Pro Phe Pro Gln Glu Leu Val Arg 1 5 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Dipeptidyl peptidase 4 biomarker peptide <400> 27 Trp Glu Tyr Tyr Asp Ser Val Tyr Thr Glu Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] biomarker peptide <400> 28 Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Thrombospondin-4 biomarker peptide <400> 29 Asp Val Asp Ile Asp Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Leu Pro Cys Ser Ala 1 5 10 15 Arg <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic receptor-type tyrosine-protein phosphatase mu biomarker peptide <400> 30 Gly Phe Gly Pro Pro Ala Thr Asn Gln Phe Thr Thr Lys 1 5 10

Claims (38)

  1. 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 방법으로서,
    (a) 바이오샘플을 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 검정하는 단계로서, 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, 카드헤린 2, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신, 혈청 아밀로이드 P 성분, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 I, 슈퍼옥사이드 디스무타제 3, 비트로펙틴, 트롬보스폰딘-4 또는 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 단계; 및
    (b) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 바이오샘플이 대상체의 암성 또는 전-암성 결장 병변으로부터 유래되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 바이오샘플이,
    (a) 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커에 대해 상동성인 하나 이상의 검출가능하게 라벨링된 합성 펩티드를 선택하는 단계;
    (b) 검출가능하게 라벨링된 합성 펩티드를 바이오샘플과 조합하는 단계; 및
    (c) 조합물을 물리적 분리 방법으로 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 검정되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 물리적 분리 방법이 액체 크로마토그래피인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 합성 펩티드가 동위원소로 라벨링되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 검출하는 단계가 바이오샘플 중 단백질 바이오마커의 농도의 정량화를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 검정 단계가 면역학적 검정을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역학적 검정이 효소-결합 면역흡착 검정을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 검출 단계가 질량 분광분석을 포함하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변에서 이들의 병기를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 0기, 1기, 2기, 3기 또는 4기 암종의 암성 또는 전암성 결장 병변에서 검출되는 방법.
  12. 제2항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변에서 진행성 선종 또는 저위험 선종을 확인하는 단계로서,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 갖는 대상체에서 검출되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질 및 표피 성장 인자 수용체를 포함하는 방법.
  14. 제2항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변에서 융모 선종 또는 저위험 선종을 확인하는 단계로서,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 융모 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 갖는 대상체에서 검출되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변에서 국소(1기 및 2기) 또는 국부(3기) 결장직장암을 확인하는 단계로서,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 국소(1기 및 2기) 또는 국부(3기) 결장직장암을 갖는 대상체에서 검출되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질, CD44, 표피 성장 인자 수용체 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함하는 방법.
  18. 제2항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변에서 성장 선종을 확인하는 단계로서,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 성장 선종, 정적 선종 또는 퇴행 선종을 갖는 대상체에서 검출되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 응고 인자 V, C-반응성 단백질, 펩티다제 억제제 16, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4 및 류신-풍부 알파-2-당단백질을 포함하는 방법.
  20. 제2항에 있어서, 바이오샘플이 폴립절제 후, 결장절제 후 또는 기타 치료학적 개입 후 대상체로부터 유래되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, (c) 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준이 폴립절제 전의 암성 또는 전-암성 결장 병변에서 검출된 수준과 상이한 경우, 폴립절제, 결장 절제 또는 다른 치료학적 개입 후 암성 또는 전-암성 결장 병변의 재발을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 바이오샘플이 폴립절제 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 이내에 수집되는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 바이오샘플이 폴립절제 후 1년 또는 2년 이내에 수집되는 방법.
  24. 제20항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 폴립절제 또는 다른 치료학적 개입 후 폴립을 갖는 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질 및 펩티다제 억제제 16을 포함하는 방법.
  26. 제2항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 암성 또는 전암성 결장 병변에서 진행성 선종 또는 저위험 선종을 확인하는 단계로서,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 대상체의 성별에 의존적이며,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 진행성 선종, 저위험 선종 또는 정상 조직을 갖는 대상체에서 검출되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 대상체가 암컷이며, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 응고 인자 V, CD44 및 표피 성장 인자 수용체를 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 대상체가 수컷이며, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 C-반응성 단백질, 펩티다제 억제제 16, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4 및 보체 인자 I을 포함하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 바이오샘플이 대상체의 암성 또는 전-암성 결장 또는 직장 병변으로부터 유래되는 방법.
  30. 제29항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 대상체에서 직장 폴립을 확인하는 단계로서,
    상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준이 직장 폴립, 결장 폴립 또는 정상 조직을 갖는 대상체에서 검출되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 펩티다제 억제제 16, CD44, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3 및 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, (c) 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 수준을 상기 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커의 기준 수준과 비교함으로써 대상체에서 결장직장암을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 하나 또는 복수의 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신 또는 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 대상체가 수컷이며, 하나 또는 복수의 바이오마커가 보체 인자 I 및 혈청 아밀로이드 P 성분을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 대상체가 암컷이며, 하나 또는 복수의 바이오마커가 카드헤린 2를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 하나 또는 복수의 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, CD44, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3 또는 표피 성장 인자 수용체인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 방법이 비-침습성인 방법.
  38. 결장직장암을 갖는 대상체를 확인하는 방법으로서,
    대상체로부터의 바이오샘플 중 하나 또는 복수의 단백질 바이오마커를 검출하는 단계로서,
    하나 또는 복수의 단백질 바이오마커가 류신-풍부 알파-2-당단백질, 펩티다제 억제제 16, CD44, C-반응성 단백질, 디펩티딜 펩티다제 4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H4, 인터-알파 트립신 억제제, 중쇄 H3, 응고 인자 V, 표피 성장 인자 수용체, 페투인-B, 헤모펙신 또는 퀴에스신 설프하이드릴 옥시다제 1을 포함하는 단계를 포함하는 방법.
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