KR20190031189A - 라이실 tRNA 합성효소 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

라이실 tRNA 합성효소 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 KRS N-말단 특이적 항체는 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 현저한 효과를 나타낸다.

Description

라이실 tRNA 합성효소 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating immunocyte migration-related diseases comprising antibody specifically binding to N-terminal domain of Lysyl-tRNA synthetase}
본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
체내의 여러 조직에서, 각각의 세포는 그들의 유전적 특성과 환경에 따라 다른 방식으로 이주한다. 통제되지 않은 세포 이동은 염증성 질환, 암 전이 등의 다양한 질병 상태들과 관계되나, 각각의 세포들이 지니는 이동 시그널링 및 메커니즘 특성이 완전히 규명되지 못한 상태이다. 특히, 각각의 세포에 따라서는 동일한 인자라도 관계하는 방식이 다른 것으로 보고되어 시그널링 과정 및 메커니즘 규명에 어려움이 더해지고 있는데, 일례로 AQP1(water channel aquaporin-1)은 상피 세포 등에서 세포의 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 특히 암 전이를 촉진시키는 것으로 알려졌지만(Hara-Chikuma M et al., Aquaporin-1 facilitates epithelial cell migration in kidney proximal tubule, J Am Soc Nephrol. 2006 Jan;17(1):39-45; Jiang Y, Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration, IUBMB Life. 2009 Oct;61(10):1001-9), 대식세포의 경우 상기 AQP1를 발현함에도 불구하고 이것이 대식세포의 이동을 억제하는 것으로 보고 되었다(Tyteca D et al., Regulation of Macrophage Motility by the Water Channel Aquaporin-1: Crucial Role of M0/M2 Phenotype Switch, PLoS One. 2015 Feb 26;10(2):e0117398). 이처럼 각 세포들은 이들의 이동에 여러 가지 방식 및 특성이 존재하기 때문에, 기존에 특정 세포의 이동을 방지하기 위해 설계된 약물들은 상당히 제한적이고 불충분한 효능을 보이고 있다. 따라서 세포의 이동성 스위치(migratory switch)를 제어하고 이주 관련 질병을 치료하는 새로운 전략을 모색하는 것이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 면역세포는 체내의 1차 방어망이기도 하지만, 최근 과도한 면역세포의 활성화가 주요한 발병 기전중의 하나임이 보고되고 있다. 염증성 면역세포의 활성화시 일반적으로 면역세포의 이동성 증가가 관찰되는데, 구체적으로 다음과 같은 질병들에서 이러한 면역세포 이동 및 침윤이 질병의 병리와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.
일례로, 심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 죽상동맥경화증과 관상동맥 질환 등이 포함된다(Ross R et al., New Engl J Med, 1999:340(2):115-26, Poli G et al., Redox Biol 2013;1(1):125-30, Libby P et al., Circulation 2002;5;105(9):1135-43). 죽상동맥경화증은 콜레스테롤에 의한 염증성 질환이고, 동맥 안쪽 막에 침착한 콜레스테롤과 혈액에서 동맥 안쪽으로 이동한 면역세포로 구성된 죽종에 의하여 발병한다. 즉, 콜레스테롤 산화물이 염증을 일으키고 있는 부위로 단핵구와 같은 면역세포가 이동하면서 죽종이 형성된다. 죽종이 형성될 경우 혈관의 내면은 껄끄러워지고 벽은 두꺼워지면서 혈액이 흐르는 내부의 지름이 좁아져 혈액순환에 장애가 생긴다. 죽종 주위를 둘러싼 섬유성막이 터지면 혈관 안에 혈전이 발생하고, 죽종 안으로 출혈이 일어나 혈관 내경이 급격하게 좁아지거나 막히게 된다. 주로 심장에 피를 공급하는 혈관, 뇌에 피를 공급하는 혈관, 콩팥에 피를 공급하는 혈관 및 말초혈관에 발생하여 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌혈관질환(뇌졸중), 신부전, 사지 허혈성 동맥 질환을 일으킨다. 기존에 이러한 심혈관계 질환의 발생 및 발달에는 단핵구의 이동을 유도함으로써 염증반응을 일으키는 CCL2(CC-Chemokine ligand 2, MCP-1)가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져, CCL2의 작용 및 이에 따른 단핵구의 이동을 억제함으로써 상기와 같은 심혈관계 질환을 치료하는 방법이 새로이 제시되기도 하였다(Gu L et al., Mol Cell, 1998;2(2):275-81, Aiello RJ et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19(6):1518-25, Gosling J1 et al., Clin Invest 1999;103(6):773-8, Harrington JR et al., Stem Cells 2000;18(1):65-6, Ikeda U et al., Clin Cardiol 2002;25(4):143-7). 또한 고혈압에서도 염증성 사이토카인을 분비하는 다양한 면역세포 등이 혈관으로 과도하게 이동하여 혈관벽이 두꺼워지고, 혈관의 탄력성을 상실하는 병리가 관계된다.
또한 폐동맥 고혈압(Pulmonary Arterial Hypertension, PAH)은 폐 고혈압 세계 보건기구 (WHO) 임상 분류 시스템 (ESC Guidelines, European Heart Journal 2015)의 Group 1으로 분류되며, 호흡곤란, 평균 폐동맥압 (mean pulmonary artery pressure, mPAP) 의 상승 (mPAP > 25 mm Hg) 및 우심실 기능부전을 공통적 임상특징으로 하는 희귀질환이다. 이러한 폐동맥 고혈압은 유전, 감염, 연관질환 등 여러 가지 선재요인이 관여하지만 혈관손상 (endothelial cell injury)에 따른 면역반응이 핵심 병리적 요인으로 작용하는 것으로 알려졌다(Huertas et al., Circulation, 129:1332-1340, 2014). 이러한 현상에는 면역세포의 침윤과 기능장애(dysfunction)에 따른 일련의 과정이 병리현상과 깊게 연관되어 있는 것으로 알려졌으며, 특히 PAH에서 면역세포와 혈관내피세포 상호작용이 중요한 것으로 알려졌다. 뿐만 아니라 최근 알포트 증후군(Alport syndrome)에 있어서도 단핵구, 대식세포의 침윤이 상기 병의 진행을 촉진시킨다는 보고가 있었다.
한편, 섬유화(fibrosis) 관련 질병에 있어서, 지속적인(만성적인) 염증반응이 상처치유 프로그램(wound-healing program)을 활성화시키게 되는데 이것이 섬유증(fibrosis)으로 이어지게 된다. 조직의 손상 후 단핵구/대식세포나 호중성 백혈구, 호산백혈구, 비만세포 등의 염증성 면역세포가 손상 부위로 빠르게 침투하면서 활성화되며 여러 사이토카인을 분비하게 되고 이것들은 주위의 섬유아세포나 상피세포, 평활근세포를 다시 활성화 시켜 이들을 미요브라스트형의 세포로 활성화시키는데 이 미요브라스트형의 세포는 다량의 세포외 기질 단백질을 생산 분비하게 하여 궁극적으로 조직에 세포외 기질 단백질의 다량 축적을 초래하여 상처를 남기며 또한 조직의 섬유화나 비대화를 유도하게 된다 (Gurtner GC et al., Trends Cell Biol. 15 : 599-607, 2005). 이 병리 기전은 창상, 화상, 욕창 등에 의한 피부 상처시 발생되는 피부 조직 내의 상흔 형성이나 간, 신장, 혈관, 폐등의 조직의 경화성 섬유화 현상의 근본적인 원인중 하나이다. 또한 만성 자가면역 질환인 경피증 (scleroderma), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 전신성 홍 반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu)에서도 섬유화는 주된 병리적 특성으로 나타난다. 아울러 아토피 질환, 천식 질환, COPD, 건선증, 켈로이드, 증식성 망막증등 에서도 염증성 면역세포의 활성화가 병리 현상에 기여한다고 알려져 있다.
특히, 상기 상처치유 프로그램(wound-healing program)에 있어서 미요브라스트형의 세포로 활성화된 섬유아세포를 myofibroblast(근섬유아세포)라고 한다. myofibroblast는 섬유화(fibrosis) 관련된 모든 질환병리의 중심에 있으므로 myofibroblast의 활성을 유도하는 분자생물학적 혹은 면역학적 기전을 제거하는 것이 질환치료의 핵심 요소가 된다. 많은 선천적 (innate immunity) 혹은 후천적 (adaptive immunity) 면역이 fibroblast의 활성과 분화에 중요하다는 사실은 널리 알려져 있으며, 이에 상처부위에서 염증반응을 제거하는 것이 섬유화로의 tissue remodeling 을 중단시키고 정상조직형태를 유지하는 핵심적 요소가 된다. 하지만 실제적으로 염증반응의 제거가 쉽게 이뤄지지 않으므로 선천적 후천적 면역의 기전을 이해하여 핵심 매개체(mediator)를 찾는 것이 섬유화를 늦추는데 중요하다.
단핵구, 대식세포 등은 wound healing에도 기여하는 부분이 있으나 reactive oxygen, nitrogen등을 분비하므로 주변 세포에 해로운 영향을 끼치게된다. 따라서 단핵구, 대식세포의 신속한 제거가 없다면 조직 손상을 더 유발하게 되며 섬유화를 초래하게 된다. 따라서 상기 질병의 초기에 가장 먼저 반응하는 단핵구, 대식세포들을 제한하는 것은 다양한 만성 염증 및 섬유화 관련 질환에 있어서 하나의 치료적 전략으로 여겨진다.
상기 wound-healing 기전이 섬유화 반응을 촉발 시킬 때, 혈구 응집에 관련된 PDGF(platelet-derived growth factor)는 다른 염증반응 면역세포들을 상처부위로 불러들이고 TGF-β1은 국소 fibroblast로부터 세포외 기질 합성을 촉진시키는 것으로 알려졌다. 하지만 상기 혈구응집 반응에 관련된 요소들은 이들이 결핍된 경우에도 섬유화를 유도하는 결과를 보임이 보고되었다.
상기와 같이 과도한 면역세포 활성화가 문제되는 질환들에 있어서 기존에 면역세포들의 이동(및 침윤)을 막기 위한 타겟 인자(target factor)들이 제시되어왔고 이들을 대상으로 질병의 치료적 방법을 고안하는 시도가 이루어지고 있지만 각각의 한계점들이 보고되고 있는 실정이며, 이에 따라 효과적인 질병 치료를 위해 여전히 면역세포 이동에 있어서 핵심 매개체(mediator)가 무엇인지 이를 제어할 전략은 무엇인지를 찾는 것이 중요한 해결 과제로서 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 면역세포 이동(침윤) 관련 질환의 새로운 치료적 전략을 찾고자 연구하던 중, 면역세포(단핵구/대식세포)의 세포막 영역에 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상임을 확인하였으며, 본 발명에서 제공하는 KRS N-말단 결합 항체가 면역세포의 세포막 영역에 증가된 KRS 수준을 감소시키며 실제로 면역세포 이동 및 침윤을 억제하여 관련 질환을 치료하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편들의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
라이실 tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 발명에서 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 발명에서 "숙주세포(host cell)"라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.
본 발명에서 "단백질" 은 "폴리펩티드(polypeptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 발명에서 용어 '라미닌(laminin)'은 α, β, γ 사슬로 이루어지는 헤테로 삼량체 분자로, 서브유닛 사슬의 조성이 상이한 아이소폼(isoform, 아형)이 존재하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로는, 라미닌은 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬의 헤테로 삼량체의 조합으로 약 15 종류의 아이소폼을 갖는다. α 사슬 (α1 ～ α5), β 사슬 (β1 ～ β4) 및 γ 사슬 (γ1 ～ γ3) 의 각각의 숫자를 조합하여, 라미닌의 명칭이 정해지고 있다. 예를 들어 α1 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN111 이라고 하고, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN511 이라고 하고, α5 사슬, β2 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN521 이라고 한다. 본 발명에서 용어 라미닌은 라미닌 아형 1종의 단일 성분을 의미할 수도 있고, 또는 2종 이상의 라미닌 아형이 혼합된 라미닌 혼합물을 의미하는 것일 수 있다.
하나의 실시양태(embodiment)에서 상기 'LN421 단백질'은 라미닌 아형α4β2γ1로 알려져 있는 폴리펩티드를 의미한다. 당업계에 LN421로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 LN421에서 α4 사슬은 서열번호 120으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, β2 사슬은 서열번호 122로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, γ1 사슬은 서열번호 124로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 LN421에서 α4 사슬은 서열번호 120으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, β2 사슬은 서열번호 122로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으며, γ1 사슬은 서열번호 124로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나. 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명에서 상기 LN421은 이의 기능적 동등물을 포함한다. 이의 기능적 동등물에 대해서는 후술하는 KRS의 기능적 동등물에 대한 설명을 준하며, 이때 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 단핵구, 대식세포 또는 호중구(neutrophil) 등등 면역세포의 특이적(선택적) 이동을 조절하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "라이실-tRNA 합성효소(KRS) N-말단 영역"은 세포 내에서 생성된 KRS가 이동하여 세포막(또는 원형질막)에 위치될 때 세포외(extracellular) 영역으로 또는 세포막 표면에 노출되는 특정 서열을 의미하는 것으로서, 통상 KRS N-말단의 1 내지 72개의 아미노산 영역의 일부 또는 전장 서열을 의미하는 것일 수 있다. 더욱 바람직한 일례로 인간에서는 서열번호 148으로 표시되는 서열을 포함하며, 마우스(mouse)에서는 서열번호 149로 표시되는 서열을 포함하며, 렛(rat)에서는 서열번호 150로 표시되는 서열을 포함한다. KRS N-말단 영역은 종간 서열유사성이 존재하며 특히 서열번호 117로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "KRS 단백질"은 라이실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 의미한다. KRS는 아미노산 라이신(lysine)과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. 본 발명에서 KRS는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로 알려진 것이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 117로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다(특히 N-말단에). 이러한 일례로, 본 발명의 KRS는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_005539.1 등으로 공지된 것을 포함하고, 마우스(Mus musculus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_444322.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 랫(Rattus norvegicus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. XP_006255692.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 이외 에도 하기의 서열정보를 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: XP_005004655.1(guinea-pig: Cavia porcellus), XP_021503253.1(gerbil, Meriones unguiculatus), XP_002711778.1(rabbit, Oryctolagus cuniculus), XP_536777.2(dog, Canis lupus familiaris), XP_003126904.2(swine, Sus scrofa), XP_011755768.1(monkey, Macaca nemestrina), XP_008984479.1 (marmoset, Callithrix jacchus), XP_019834275.1 (cow, Bos indicus), XP_511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes).
본 발명에서 KRS 전체 단백질은 서열번호 118로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다(Genbank Accession No. NP_005539.1). 또한 본 발명에서 상기 KRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 KRS 단백질은 바람직하게 세포내(intracellular) KRS 또는 세포막에 내재된 상태의 KRS를 의미하는 것으로, 이는 세포 외(extracellular)로 완전히 분비된 KRS와는 구별되는 의미이다.
상기 세포 내 KRS는 cytoplasmic form(lysyl-tRNA synthetase, cytoplasmic)과 mitochondrial form(lysyl-tRNA synthetase, mitochondrial)의 두 가지 아형(isoform)이 있다. 본 발명에서의 KRS는 바람직하게는 cytoplasmic form이다.
상기 기능적 동등물이란, 공지의 KRS 단백질을 구성하는 아미노산 서열(바람직한 일례로, 서열번호 118로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 공지의 KRS 단백질(바람직한 일례로, 서열번호 118로 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서,"실질적으로 동질의 생리활성"이란 면역세포 이동을 조절하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 KRS의 기능적 동등물은 서열번호 118의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 KRS의 기능적 동등물에는, KRS 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 KRS의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 KRS의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 KRS의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 KRS의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열(아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 118, 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 119)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, KRS 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에서 용어‘단백질(KRS)의 세포막으로(의) 이동’은 달리 지시되지 않는 한, 어떤 세포의 내인성 단백질(세포 내부에서 만들어진 단백질로서, 예를들어 세포질에 존재하던 것)이 동일한 세포의 세포 내(intracellular) 방향으로의 세포막으로 이동하는 것을 의미한다. 이때 KRS는 완전히 세포 내 방향으로만 존재하는 것일 수 있고, 또는 세포막사이에 끼어 있어서 일부(바람직하게 KRS의 경우 N term 일부)가 세포 외로 노출될 수 있으나, 어느 경우에도 단백질이 생성된 세포 밖으로 완전히 분리되는 것을 배제하는 것이 바람직할 수 있다. 즉, 본 발명에서 상기 세포막으로의 이동은, 달리 지시되지 않는 한, 어떤 세포에서 완전히 분리 및 분비된 단백질이 다른 세포 또는 조직의 밖(extracellular)으로부터 상호작용하는 것과 구분된다.
본 발명에서 용어‘세포막 위치’는 세포막 그 자체 및, 세포막과 매우 가까워 실질적으로 세포막과 상호작용하고 있을 것으로 인정되는 인근(부근)을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서 '항체(antibody)'는 면역 글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성을 갖게 된다.
항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.
본 명세서에서‘치료’는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 ‘예방’은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 면역세포 이동 및 침윤 상태와 관련하여 KRS가 면역세포의 세포질 대비 세포막에서 그 수준이 특이적으로 높아지는 것이 중요한 병리 현상임을 최초로 규명하였으며, 특히 LN421(라미닌 아형 α4β2γ1)과의 특별한 관련성을 가지고 면역세포 이동에 있어서 KRS의 특이적 조절 기능을 확인하였다. 이에 본원 발명에서 제공하는 KRS N-말단의 특정 에피토프(서열번호 117 포함 영역)에 결합특이적인 항체가 세포막의 KRS 수준을 현저하게 감소시키며, 실제로 폐동맥 고혈압과 같이 기존에 면역세포의 이동 및 침윤의 병리현상과 깊게 연관된 질환들에 있어서 현저한 치료효과를 나타냄을 밝혔다.
따라서 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '에피토프'는 어떠한 항체가 특이적으로 결합하는 임의의 대상물에 있어서, 상기 대상물 중에서 항원항체 반응 특이성을 결정하고 있는 특정 부분을 지칭한다. 본 발명에서 에피토프는 KRS N-말단 서열로부터 유래(종에 관계없이)되며 서열번호 117의 아미노산 서열을 (필수적으로)포함하는 연속되는 영역이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으며, 통상 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하여 13 내지 52개, 더욱 바람직하게 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42 개의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
바람직한 일례로서 본 발명의 상기 에피토프는, 인간 KRS N-말단에서 유래된 것으로서 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 또는 서열번호 148의 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 마우스 KRS N-말단에서 유래된 것으로서 서열번호 138, 서열번호 139, 서열번호 140, 서열번호 141, 또는 서열번호 149의 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 렛 KRS N-말단에서 유래된 것으로서 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 또는 서열번호 150의 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 상기 에피토프에서의 특이적 결합을 통해 세포막의 KRS 수준을 감소시키는 것을 특징으로 한다. 세포막 위치 특이적으로 KRS의 존재 수준을 감소시키는 경우 면역세포 이동 및 침윤을 억제할 수 있고, 이에 따른 관련 질환의 치료효과가 가능함은 본 발명자에 의해 최초로 규명되었다. 본 발명자들은 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체(N3 항체 및 이로부터의 개량항체들)가, 면역세포 이동 및 침윤현상에 동반된 면역세포 막의 KRS 수준 증가 현상을 효과적으로 억제 및 감소시키고(엔도사이토시스 등을 통해) 면역세포 이동을 억제하는 것을 확인하였으며, 실제 과도한 면역세포 이동 및 침윤이 주요한 병리인 질환(일례로 폐동맥 고혈압) 동물 모델에 적용하였을 때 현저한 치료효과를 가짐을 확인한 바 있다.
라이실 tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편은 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 한 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 일례로
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역; 및
서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 서열을 가지는 항체는 본 발명에서 N3 항체로 명명된다.
더욱 바람직하게 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편은, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(VH); 및 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 서열을 가지는 항체는 본 발명에서 N3 항체로 명명된다.
본 발명에 따른 항체는, 이에 제한되지 않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다. 가장 바람직하게 본 발명의 항체는 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어지는 것일 수 있다(본 발명에서 N3 항체로 명명).
또한 본 발명자들은 N3 항체의 가변영역 서열(서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(VH); 및 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(VL) 서열)을 기반으로, 치료 항체로서 유용성이 높은 개량항체(N3-1, N3-3, N3-4, N3-5, N3-6, N3-7, N3-8, N3-9, N3-8-1, N3-8-2, N3-8-3, N3-8-4, N3-8-5, N3-8-6, N3-8-7)들을 제작하였다. N3 항체와 이들 개량 항체는 하기 (a) 및 (b)의 CDR 서열상의 공통점 및 특징을 가진다.
이에 본 발명은 개량항체로서
(a) (a-1) 아미노산 서열 SYDMS를 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1);
(a-2) 아미노산 서열 X1IX2X3X4X5GX6X7YYADSVKG를 포함하고, 여기서 X1은 A 또는 V이고, X2은 S, D 또는 G이고, X3는 Y, P, S 또는 A 이고, X4는 D, Q, L 또는 Y이고, X5는 N, M, S, 또는 G이고, X6는 N, R 또는 P이고, X7는 T, V, I 또는 S인 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 및
(a-3) 아미노산 서열 X8ALDFDY를 포함하고, 여기서 X8은 M 또는 L인 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)를 포함하는 중쇄가변영역(VH), 및
(b) (b-1) 아미노산 서열 TGSSSNIGSNYVT를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1);
(b-2) 아미노산 서열 X9NX10X11RPS를 포함하고, 여기서 X9은 D, S 또는 R이고, X10는 S 또는 N이고, X11은 N 또는 Q인 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 및
(b-3) 아미노산 서열 X12SFSDELGAYV를 포함하고, 여기서 X12은 A 또는 S인 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)를 포함하는 경쇄가변영역(VL)
을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 항체 및 이의 기능적 단편은, 구체적으로
상기 (a) 중쇄가변영역(VH)은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 및 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5 및 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 (b) 경쇄가변영역(VL)은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 9, 서열번호 27 및 서열번호 29로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 CDR 서열로 구성된 항체들(N3 항체 및 N3 개량항체들)은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 능력이 뛰어나며, 면역세포 이동/침윤을 현저히 억제 및 감소시켜 면역세포 이동 관련 질환에 대하여 우수한 치료 효과를 보이는 것이 특징이다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명에 따른 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편(기능적 단편)은, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 아래와 같은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 CDR 구성을 포함하는 항체로서 하기 ⅰ, ⅱ, ⅲ, ⅳ, ⅴ, ⅵ, ⅶ, ⅷ, ⅸ, ⅹ, xi, xii 및 xiii는 각각 실시예의 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5, N3-6, N3-7, N3-8, N3-9, N3-8-1, N3-8-2, N3-8-3, N3-8-4, N3-8-5 및 N3-8-6, N3-8-7 항체의 CDR 조합을 나타낸다:
i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
ii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
iii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 151로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
iv) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 151로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
v) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
vi) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
vii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
viii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
ⅸ) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
ⅹ) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
xi) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
xii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체; 및
xiii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1), 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2), 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
가장 바람직하게 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그 단편은, 아래와 같은 중쇄가변영역(VH) 및 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다:
상기 항체 또는 그 단편에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53 및 서열번호 55로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 을 포함하는 항체이다.
상기 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 IgG 형태의 항체는 구체적으로는 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 95, 서열번호 97, 서열번호 99, 서열번호 101, 서열번호 103 및 서열번호 105 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열번호 107, 서열번호 109, 서열번호 111, 서열번호 113 및 서열번호 115로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체일 수 있다.
가장 바람직하게는 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 107로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 107로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 99로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 101로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 103으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 111로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 103으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 113으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 103으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 115로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 105로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 111로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 105로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 113으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 105로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 115로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 99로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 111로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는 항체이다.
본 발명의 항체는 단일클론(monoclonal, 단클론) 항체, 다클론(polyclonal) 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다. 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나, 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. 즉, 본 발명은 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 일례로 IgG로서 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 기능적 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 KRS N-말단 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명의 목적상 항체의 기능적 단편은 세포 외부로 노출되는 인간 KRS N-말단 영역에 대한 결합특이성을 유지하고 동일한 생리활성을 나타내는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 전술한 항체와 실질적으로 동일한 생리활성을 가지는 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 상기한 KRS N-말단 영역에 특이적인 CDR 구성 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서, VH과 VL이 링커를 통해 연결되는 것일 수 있다. 상기 링커는 당업계에 scFv에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 바람직하게 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 N3 scFv는 구체적으로 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 또한 N3 개량항체의 VH과 VL 서열구성에 따라서, 본 발명에서는 다음과 같은 scFV 들을 제공할 수 있다: 서열번호 61, 서열번호 63,서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85 및 서열번호 87 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 scFV.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함), 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 발명에서 '실질적으로 동질의 생리활성'이란, KRS N-말단에 결합하여 면역세포 이동 및 침윤을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 항체 또는 그 단편들을 제공하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열은, 전술한 서열구성을 만족하는 한 그 구체적 염기서열 구성이 특별히 제한되지 않는다. 즉, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서, 앞서 설명한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30 또는 서열번호 152로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 각각의 서열이 코딩하는 단백질은 서열목록에 기재되어있다.
또한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 32(VH), 서열번호 36(VH), 서열번호 38(VH), 서열번호 40(VH), 서열번호 42(VH), 서열번호 44(VH), 서열번호 46(VH), 서열번호 48(VH), 서열번호 34(VL), 서열번호 50(VL), 서열번호 52(VL), 서열번호 54(VL) 또는 서열번호 56(VL)으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 IgG 형태의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게 하기의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다: 중쇄(HC)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 90, 서열번호 94, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 100, 서열번호 102, 서열번호 104 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 경쇄(LC)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 92, 서열번호 108, 서열번호 110, 서열번호 112, 서열번호 114 및 서열번호 116 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한 상기 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 scFv를 암호화하는 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86 및 서열번호 88로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터를 통해 적절한 숙주세포로 내로 도입된 후, 본원 발명의 항체 단백질을 발현한다. 숙주세포를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하고, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 한 뒤, 이로부터 항체를 분리 수득하는 구체적 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
먼저 통상적인 방법에 따라 상기 항체를 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다.
상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현 벡터에 따라 적절한 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다.
중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 동일한 숙주세포에 공동형질전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고, 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있다.
상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 KRS N-말단에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
본 발명 제조(생산) 방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산 서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명에서 용어 '면역 세포'는 체내 면역반응에 관여하는 세포를 의미하는 것으로서, 당업계에 면역세포로 알려진 것, 특히 인체에 존재하는 면역세포로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염구, 수지상세포, 자연살해세포, 거핵구, T 세포 및 B 세포 등을 포함한다. 바람직하게 단핵구, 대식세포 또는 호중구(neutrophil)를 의미하는 것 일 수 있다. 면역세포는 KRS를 발현한다.
본 발명에서 용어 '면역세포 이동 관련 질환'은, 당업계에 과도한 면역세포 이동(또는/및 침윤)이 주요한 발병 기전인 것으로 공지된 것이라면 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 심혈관 질환, 섬유화 질환, 염증성 질환 및 알포트 증후군(Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 심혈관 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 고혈압(고혈압에 의한 염증성 합병증 포함), 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 섬유화 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 경피증(scleroderma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepathic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식 시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트 삽입 시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 그 종류가 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 피부염(예를들어 아토피성 피부염, 습진, 건선증 등), 당뇨성 안질환(당뇨병성 망막증 등), 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중(卒中, 뇌졸중 등), 기관지염, 세기관지염, 간염(간경변, 무알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis) 등), 신장염(당뇨병성 신부전증 등), 단백뇨증, 관절염(건선성 관절염, 골관절염 등), 신경염(당뇨병성 신경병증 , 다발성 경화증 등), 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 혈관염, 루게릭병, 베게너 육아종증, 과사이토카인 혈증(hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 또한 만성 염증질환을 포함한다.
본 발명에서 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 건선, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 GvHD (이식편대 숙주 반응 질환: graft-versus-host disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 만성 염증 질환은 전술한 염증성 질환의 종류를 참조로 하여 이들이 만성(chronic)화 된 상태를 포함하는 의미이며, 이들의 바람직한 일례로는 천식, 아토피성 피부염, 습진, 건선증, 골관절염, 통풍, 건선성 관절염, 간경변, 무알콜성 지방간염, 만성폐쇄성 폐질환, 비염, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신부전증, 당뇨병성 신경병증 및 다발성 경화증 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물의 투여 경로는 공지된 항체 투여 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 본 발명의 항체는 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 본 발명의 치료용 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))와 바람직한 순도를 갖는 항체를 혼합하여 저장하기 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학ㅈ거 조성물은 질환의 정도 및/또는 목적에 따라 유효성분(본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편)의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.01 ㎍ 내지 10000 mg, 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 1000 mg의 유효 용량으로 하루에 수차례 반복 투여 될 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에서 제공하는 KRS N-말단 특이적 항체는 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 현저한 효과를 나타낸다.
도 1은 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 대한 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2는 상기 도 1의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 3은 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 대한 다양한 라미닌 아형(LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4는 도 3의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 5는 LN421 처리에 의하여 단핵구/대식세포 막에서 KRS가 증가하는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 LN421에 특이적인 단핵구/대식세포 이동에 대한 본 발명 N3 항체(KRS N-말단 결합 항체)의 이동 억제 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 7는 도 6의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 8은 LN421 처리에 의해 단핵구/대식세포 막에서 증가된 KRS 수준이, 본 발명 N3 항체(KRS N-말단 결합 항체) 처리에 의하여 감소되는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 N3 항체(KRS N-말단 결합 항체)의 처리에 의하여, 세포막 영역의 KRS가 엔도사이토시스됨을 확인한 결과를 나타낸다. Alexa fluor 488 (Thermofisher) 형광 probe로 표지된 anti-KRS 항체(N3)와 대조군인 Mock IgG(Thermofisher)를 처리하고 시간에 따른 항체의 이동을 모니터링하였으며, 이때 엔도사이토시스 여부를 확인하기 위하여 lysosome 마커로서 Lysotracker(Thermofisher)를 사용하였다.
도 10은 human KRS N-말단 영역 중 본 발명 N3 항체의 결합위치 및 위치별 상대적 강도를 SPR(surface plasmon resonance) 실험으로 규명한 결과를 나타낸다(서열 하단의 회색 막대는 해당 영역(F1 내지 F5)에 대한 N3 항체의 결합력을 나타내는 것으로, 막대의 색이 진할수록 높은 결합강도를 나타내는 것을 표시함).
도 11은 사람(human, h), 마우스(mouse, m), 랫(rat, r)의 KRS N-말단영역에 대한 본 발명 N3 항체의 결합위치 및 위치별 상대적 결합강도를 SPR로 확인하여 공통의 에피토프 서열을 규명한 결과를 나타낸다(서열 하단의 회색 막대는 해당 영역(F1 내지 F5)에 대한 N3 항체의 결합력을 나타내는 것으로, 막대의 색이 진할수록 높은 결합강도를 나타내는 것을 표시함).
도 12는 본 발명의 N3 항체 투여에 의한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델의 우심실 수축기말 압력(right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나타낸다(Mock IgG: 음성 대조군, Ab 1mpk: N3 항체 1mpk, Ab 10mpk : N3 항체 10mpk, sildenafil: 양성 대조군).
도 13은 본 발명의 N3 항체 투여에 의한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델의 좌심실 수축기말 압력(left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 변화를 나타낸다(Mock IgG: 음성 대조군, Ab 1mpk: N3 항체 1mpk, Ab 10mpk : N3 항체 10mpk, sildenafil: 양성 대조군).
도 14는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 본 발명의 N3 항체 투여에 의해 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 15는 급성 폐손상 마우스 모델의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내에 증가된 총(total) 면역세포수가, N3 항체(KRS N-말단 결합 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 급성 폐손상 마우스 모델의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내에 특히 많이 증가되어있는 호중구(뉴트로필)이, N3 항체(KRS N-말단 결합 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 급성 폐손상 마우스 모델의 폐 조직 내에 증가된 대식세포(IM, CD11b+/F4/80+) 이동 및 침윤이, N3 항체(KRS N-말단 결합 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 FACS로 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은 상기 도 17의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 19는 급성 폐손상 마우스 모델의 폐 조직 내에 진행된 조직 섬유화가 N3 항체(KRS N-말단 결합 항체)의 처리에 의하여 억제됨을 보여주는 조직 이미지이다. 각 실험군 및 대조군의 조직은 Masson's trichrome 염색 처리된 후 현미경 관찰되었다.
도 20은 KRS N-term(1-72 aa.) peptide에 고친화도 및 특이성을 갖는 것으로 선별된 개량항체인 N3-1 항체와 대조군으로서 N3 항체 대하여, KRS N-말단에 대한 친화도를 측정하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 KRS N-term(1-72 aa.) peptide에 고친화도 및 특이성을 갖는 것으로 선별된 개량항체인 N3-1 항체, N3-3 항체, N3-4 항체 및 N3-5 항체의 KRS N-말단에 대한 친화도를 측정하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 N3 항체와 N3-1 항체의 KRS에 대한 친화도를 SPR(surface plasmon resonance)방법으로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 N3-1 항체, N3-6 항체, N3-7 항체, N3-8 항체 및 N3-9 항체의, KRS N-말단에 대한 친화도를 측정하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 N3-6 항체, N3-7 항체, N3-8 항체, N3-9 항체의 주요 결합 영역을 확인하면서, KRS에 대한 친화도를 SPR(surface plasmon resonance)방법으로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 각각 N3 항체, N3-6 항체, N3-8 항체 투여에 의한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델의 우심실 수축기말 압력(right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나타낸다.
도 26은 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 본 발명의 N3 항체, N3-6 항체, N3-8 항체 각각의 투여에 의해, 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 27은 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 폐 조직 내에 진행된 조직 섬유화가 본 발명의 N3 항체, N3-6 항체, N3-8 항체 각각의 투여에 의하여 억제되었음을 Masson's trichrome 염색을 통해 보여주는 조직 이미지이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 면역세포 이동 및 침윤에 있어서 , 라미닌 신호의 역할 확인
혈관을 이루고 있는 여러 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)들 중에서, 어떤 것이 단핵구/대식세포의 이동 및 침윤을 촉진하는지 확인하였다. 세포외 기질로서 콜라겐(collagen, Col), 파이브로넥틴(fibronectin, FN) 및 라미닌(laminin, LN)을 사용하여 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwell(Corning, #3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅한 후 RAW 264.7 cell(1 x 105 cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin(laminin mixture, Biolamina社), Fibronectin 또는 Collagen을 각각 10μg/ml씩 포함하는 Serum Free DMEM(500μl)을 bottom chamber에 넣어주었다. 24시간 뒤에 70% methanol을 30min 처리하여 고정(fix)한 후, 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다.
실험결과 도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 여러가지 세포외 기질 중 라미닌이 가장 강하게 단핵구/대식세포의 이동을 촉진함을 확인하였다. 즉, 단핵구/대식세포의 이동(migration)은 ECM(extracellular matrix) 중 라미닌(LN) 신호에 가장 강하게 반응함을 확인하였다.
실시예 2 : 라민닌 아형(subtype)별 면역세포 이동 및 침윤 효과 확인
면역세포 이동 및 침윤에 있어서, 라미닌 아형에 따른 효과를 평가하였다. 다양한 라미닌 아형 단백질(Biolamina로부터 구입)로서 LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521을 1μg/ml씩 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 상기 라미닌 아형들의 구체적 서열은 각 라미닌 아형을 이루고 있는 사슬에 따라 서열번호 120의α4 사슬, 서열번호 126의 α2 사슬, 서열번호 127의 α5 사슬, 서열번호 122의 β2사슬, 서열번호 128의 β1 사슬, 서열번호 124의 γ1 사슬을 참조로 할 수 있다.
실험결과 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 단핵구/대식세포는 라미닌 중에서도 α4β2γ1 아형 (LN421)에 특이적으로 반응하여 이동함을 확인하였다. 즉, 단핵구/대식세포의 이동은 라미닌 중에서도 LN421에 특이적임을 확인하였다.
실시예 3: 면역세포에 라미닌 처리에 따른, 세포질 KRS의 세포막으로의 이동 _ 면역세포 이동관련 질환의 신규 병리 현상 규명
100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cell(2 x 106cell)을 분주하고 18hr 동안 배양한 후, serum free-DMEM media에 LN421 1μg/ml 처리 후 0h, 12h, 24h에 harvest하였다. ProteoExtract　 Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiotech, cat# 539790)를 사용하여, RAW 264.7 cell protein을 cytosol과 membrane fraction으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Millipore)에 옮겨 3% skim milk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였다. 구체적으로 KRS polyclonal antibody(rabbit, Neomics, Co. Ltd. #NMS-01-0005) 항체를 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, anti-rabbit 2차 항체(ThermoFisher Scientific, #31460)를 첨가하여 반응시켰다. 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다. Na+/K+ ATPase(Abcam, ab76020)와 tubulin(Santa cruz SC-5286)에 대한 항체를 각각 plasma membrane과 cytosol 마커 확인용으로 사용하였다.
도 5에서 보는 바와 같이 단핵구/대식세포에 LN421을 처리할 경우 세포질(cytosol) 영역에서 KRS 검출량이 일부 감소되는 것과 대비하여 세포막 영역에 KRS 검출량이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단핵구/대식세포의 세포 내부에서 발현되어 일반적으로 세포질 영역에 존재하고 있는 KRS가 LN421처리에 의하여 세포막 영역으로 이동하는 것을 시사하며, 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다.
실시예 4: 세포막 위치의 KRS 수준 감소를 통한 면역세포 이동/침윤 제어, 면역세포 이동관련 질환의 치료 효과 확인_ KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물 이용
본 발명자들은 전술한 실시예의 결과로부터 단핵구/대식세포의 이동에 있어서 KRS의 세포 내 행태가 중요하게 영향을 미치는 것을 확인하였다. 특히 KRS가 세포막 쪽으로 이동하여 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다. 따라서 본 발명자들은 KRS의 이러한 병리 행태를 억제하는 것이 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환의 치료적 전략 중의 하나로 적용 가능함을 검증하였으며, 이를 대한민국 출원 10-2017-0076718 및 10-2018-0069146 문헌에 이를 개시한바 있다.
상기 문헌에서 본 발명자들은 면역세포 이동 관련 질환에서 면역세포 세포막에 KRS 수준이 증가되는 것을 억제하기 위하여, KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 화합물들을 발견하고, 이들의 면역세포 이동 관련 질환에 대한 치료 효과를 확인 및 검토하였다.
간략히, 면역세포 세포막에 KRS 수준이 증가되는 것을 억제하기 위하여, KRS의 세포막으로의 이동 저해제로서 대표적 일례로 BC-KI-00053 화합물(4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산) 등의 화합물을 발견하였다. 그리고, 급성염증반응(예를 들어, ear skin wound 모델) 및 허혈성 면역반응(예를 들어 간 허혈-재관류 손상 모델) 등의 염증성 병증 상태에서, 면역세포들의 이동 및 침윤이 KRS의 세포막으로의 이동저해제(특히, BC-KI-00053) 투여에 의해 저해되고 질환 완화 효과가 나타난 것을 확인하였다. 또한 간섬유화, 폐동맥 고혈압(PAH), 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증, 신장 섬유증 및 심장 섬유증, 알포트 증후군(Alport syndrome) 등 면역세포 이동 관련 질환의 다양한 in vivo 모델에 대하여, 면역세포 이동 및 침윤에 기인된 질환 상태를 확인하고 여기에 상기 KRS의 세포막으로의 이동 억제 화합물의 질환 치료 효과를 확인하였다.
실시예 5 : 세포막 KRS 수준 감소를 위한 KRS -N term 특이적 결합 항체 제작 및 면역세포 이동/침윤 제어 효과 확인
5-1. KRS -N term 특이적 결합 항체 제작_N3 항체
상기 실시예 4의 화합물이 세포막 위치에서의 KRS 수준 증가를 억제하여 면역세포 이동/침윤 관련 질환의 치료 및 개선효과를 나타낸 것과 같이, 본 발명자들은 유사한 원리로 우수한 치료 효능을 나타내는 항체를 제작하고자 하였다. 한편, 본 발명자들은 KRS가 세포질로부터 이동하여 세포막에 위치하면 세포막에 내재되기도 하여 일부 N-말단영역이 세포 외로 노출되는 것을 규명하였다(통상 KRS N-말단의 1 내지 72개의 아미노산 영역). 이에 anti-KRS 항체들 중에서도, KRS-N 말단에 결합할 수 있는 항체는 면역세포 이동/침윤 저해에 있어서 in vivo 상에서 더욱 현저한 이점을 가질 것으로 사료되었으며, 대표적 일례로 본 발명자들은 후술하는 바와 같이 N3 항체의 제작을 통하여 이러한 치료적 이점을 확인하였다. N3 항체는 다음과 같은 방법으로 수득되었다.
구체적으로, human KRS 전장 서열(서열번호 118) 중에서, 라미닌 신호에 의해 세포막으로 이동되었을 때 세포 외막에 노출되는 human KRS N-말단(서열번호 148) 영역에만 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하기 위하여, HA tag로 표지된 인간의 B 세포에서 유래한 scFv phage library를 이용한 phage display panning 실험을 실시하였다. 본 실험에 사용한 scFv display phage library(Library size: app. 7.6 x 109, Library produced by prof. Hyunbo Shim)에 대해서는 대한민국 등록특허 10-0961392호에 기재되어 있다. human KRS 전장 서열 및 N-말단 위치의 서로 다른 특정 영역의 KRS 단편들이 phage display panning 실험을 위한 항원단백질로서 사용되었다.
phage display panning 실험은 구체적으로 다음과 같이 수행되었다. 1ml의 1X PBS 용액을 포함하는 Immuno-튜브에 1~10μg의 항원 단백질을 첨가하고 37℃, 200rpm으로 1시간 동안 반응시켜 튜브 안쪽 표면에 항원을 코팅하였다. 항원 용액을 따라내고 수돗물로 1회 세척하여 코팅되지 않은 항원을 제거하였다. 항원 단백질과 phage간 비특이적 결합을 막기 위하여 immuno-튜브와 scFv library를 각각 3% 탈지유가 포함된 1X PBST(0.05% tween20을 포함하는 PBS)로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. Immuno-튜브에서 탈지유를 제거한 후, scFv library를 첨가하여 37℃, 150rpm으로 1시간 동안 반응시켜 항원에 scFv phage가 결합하도록 하였다. scFv phage를 튜브에서 반응시킨 후, 1X PBST로 2~5번 세척하여 결합하지 않은 scFv phage를 제거하였다. 각각의 항원에 특이적으로 결합한 scFv phage는 상온에서 triethylamine(100mM) 1ml을 첨가하여 10분 이내에 분리해내고, Tris(1M, pH 7.4)로 중화시켰다. 여과한 phage scFv를 OD < 1로 배양한 ER2537 E. coli에 첨가하여 37℃, 120rpm으로 1시간 30분 동안 배양하면서 감염시켰다. phage에 감염된 E.coli는 원심분리하여 배양 상층액을 일부 제거한 후 재분산하여 암피실린과 포도당(2%)을 포함하는 지름 15cm의 아가로즈 플레이트에 도포하였다. 다음날 5ml SB 배지를 도포하여 플레이트에서 자란 세포들을 모두 수득하고, glycerol(50%)을 전체 부피의 0.5배가 되도록 첨가하여 혼합하고 1ml씩 분주하여 -80℃에 보관하였다(scFv panning stock). 상기 제조한 stock 20μl를 20ml SB 용액에 접종하여 배양하고, helper phage를 이용하여 다음 단계의 phage panning을 위한 scFv phage library(1ml)로 제작하였다. 항원에 특이적인 scFv를 발현하는 phage를 분리하기 위한 상기 과정을 2~3회 반복하였다.
상기 바이오패닝 후에 웨스턴블랏, 면역침전 등을 추가로 수행하여 목적 단백질에 결합력이 높은 scFv 클론들을 선별하였다.
선별된 scFv 들을 IgG(전체 항체)로 전환하였으며, 구체적인 방법은 다음과 같다. 먼저 scFv 클론의 유전체에서 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 PCR로 증폭하였다. scFv의 VH 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: Forward(AGA GAG TGT ACA CTC C CA GGC GGC CGA GGT GCA G, 서열번호 129), Reverse(CGC CGC TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG, 서열번호 130) scFv의 VL 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:Forward(AAG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT TGG TAG CAA CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTC AG, 서열번호 131), Reverse(CGC CGC CGT ACG TAG GAC CGT CAG CTT GGT, 서열번호 132). 각각의 phage DNA(50ng)를 주형으로 하여 상기 프라이머(각각 10pmol)를 이용해 95℃/3min; 95℃/30sec, 60℃/30sec, 72℃/30sec, 30 cycles; 72℃/5min의 조건으로 PCR을 수행하여 scFv의 VH 또는 VL 유전자를 증폭하였다. PCR 산물은 제한효소를 이용하여 IgG 생산에 사용되는 벡터인 pcDNA3.4 벡터(Thermo Fisher Scientific)에 삽입하였다. IgG의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 단백질은 별개의 플라스미드에서 개별적으로 발현되도록 하였다.
이러한 방법으로 제조된, scFv의 가변영역을 포함하는 IgG의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터는 freestyle 293F 세포(ATCC)에 공동형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다. 형질전환된 293F 세포를 37℃, 8% CO2 조건에서 7일 동안 배양하여 상층액을 수득하였다. 상층액은 cellulose acetate membrane filter(pore size 0.22μm, Corning)로 여과하고 CaptivA™ PriMAB protein A column(Repligen, USA)을 사용하여 정제하였다. 수득한 항체 농도는 BCA kit (Pierce, 23225)를 이용하여 측정하였고, Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용하여 환원과 비환원 조건에서 생산된 IgG 항체 단백질을 분석하였다.
5-2. 면역세포 이동 및 침윤 저해 효능의 확인
상기 5-1에서 제작한 여러 후보군 항체들의 면역세포 이동 및 침윤에 대한 효과를 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwell (Corning#3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅하고, 이후 RAW 264.7 cell (1 x 105cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin 421(1 μg/ml)을 포함한 Serum Free DMEM(500 μl)을 bottom chamber에 넣어주었다. 각 항체는 top chamber에 100 nM 농도로 처리하였다. 24시간 뒤에 70% Methanol로 30 min동안 고정시킨 후, 50% Hematoxylin으로 30 min 동안 염색하였다. Membrane의 위쪽에 존재하는 비-이동(non-migrating) 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. Membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하였고(도 6), 수득된 이미지에서 세포수를 측정하여 그래프로 표시하였다(도 7).
또한 RAW 264.7 cell에 Laminin 421(1 μg/ml) 및 항체(100 nM)를 처리하여 24시간 배양하고 harvest하였으며, 이후 ProteoExtract　 subcellular proteom extraction kit(Calbiochem)를 사용하여 membrane과 cytosol fraction으로 나눠 샘플링 한 뒤 KRS에 대하여 western blot을 수행하였다. 구체적인 방법은 실시예 2에서 기재한 바와 같다.
실험결과, 본 발명의 N3 단클론 항체(KRS-N term 특이적 결합 항체)가 특이적으로 LN421 의존적인 단핵구/대식세포 이동을 효과적으로 저해하는 것을 확인하였으며, 이를 도 6 및 도 7에서 보여준다. 또한 도 8에서 보는 바와 같이, LN421 처리는 단핵구/대식세포의 세포막 위치에서의 KRS 수준을 증가시키며, N3 단클론 항체 처리에 의해 세포막 위치에서 특이적으로 KRS 수준이 감소됨을 확인하였다. 또한 도 9에서 보는 바와 같이, N3항체가 세포외로 노출된 KRS 영역(특히, N-말단 영역)에 결합하면 엔도사이토시스(endocytosis)가 일어나는 것을 확인하였다. 이는 KRS가 세포질에서 세포막으로 이동하는 것을 억제하는 방식 뿐만아니라, 이미 세포막으로 이동해 있는 KRS를 KRS에 특이적으로 결합하는 물질(특히, 세포 외부로 노출되어있는 N-말단에 특이적으로 결합하는 제제 등)을 이용하여 능동적으로 제거하는 방식으로 면역세포 이동을 저해 및 면역세포 이동 관련 질환을 치료할 수 있음을 시사한다.
이를 통해 KRS N-말단에 결합하는 항체의 면역세포 이동/침윤 질환에 대한 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하였다.
5-3. N3 항체 서열 분석
N3 scFv(서열번호 59) 및 N3 IgG 항체(서열번호 89 및 서열번호 91)의 서열은 Hye young Yang, et. al., 2009, Mol. Cells 27, 225-235O에 기재된 방법에 따라 Omp primer를 사용하여 확인하였다. 이와 같이 확보된 sequence를 Bioedit 프로그램을 사용하여 CDR region의 서열을 확인하였다. 항원 결합부위의 서열확인 결과를 표 1에 나타내며, scFv의 경우 서열번호 57의 링커를 추가로 포함하고 있다.
Figure pat00001
5-4. N3 단클론 항체의 human KRS 결합위치 확인
human KRS N-말단 영역 중, N3 단클론 항체 결합 위치를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 도 10 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 148의 KRS N-말단 영역 중 서로 조금씩 다른 위치에 대한 KRS 단편 펩타이드 F1 내지 F5를 항원(에피토프)으로 사용하여, Surface Plasmon Resonance(SPR)을 통해 N3 항체와의 결합력을 분석하였다. SPR 실험은 25℃에서 Series S 센서 칩 CM5 (GE Healthcare)가 장착 된 Biacore T200 (GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 아민 커플 링 키트(GE Healthcare)로 항체를 칩에 고정한 뒤 각 항원 펩타이드를 PBS 용액에 녹인 뒤 156 nM-15000 nM 범위에서 2배수 희석하여 60초간 흘려주었다. 이후 300초 동안 PBS를 흘려주었다. 얻어진 data는 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 v2.0 (GE Healthcare)으로 분석하였다.
Figure pat00002
실험결과 도 10에서 보는 바와 같이, N3 IgG 항체는 F5 펩타이드에는 전혀 결합하지 않았으며, F4>F3>F2>F1 순의 결합력을 보였다. 상기 F4, F3, F2 및 F1은 서열번호 148로 표시되는 human KRS N-말단 중 15 내지 29 아미노산을 공유한다. 이로부터 human KRS에 대한 N3 항체의 결합에는 15-29 aa 영역이 중요하게 작용함을 확인하였으며, human KRS 15-29 aa를 포함하는 영역 중에서도 F4 폴리펩티드에 해당하는 위치인 human KRS 15-42 aa 부위가 N3 항체의 주 결합부위인 것으로 사료되었다.
5-5. 다른 종 동물모델에서 N3 단클론 항체의 효능 평가 가능 여부 확인
마우스 및 랫 등을 대상으로 질환동물 모델을 제작하여 본 발명의 N3 항체에 대한 효능을 평가가 가능한지 여부를 확인하기 위하여, KRS N-말단 서열에 대한 종간 서열유사성을 분석하였다. 도 11 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 사람(h), 마우스(m), 렛트(r)의 KRS N-말단 영역 중 서로 조금씩 다른 위치에 대한 KRS 단편 펩타이드 F1 내지 F5를 항원(에피토프)으로 사용하여, Surface Plasmon Resonance(SPR)을 통해 N3 항체와의 결합력을 분석하였다. 구체적인 방법은 상기 실시예<5-4> 에서 기재한 바와 같다.
실험결과 도 11에서 보는 바와 같이, N3 항체는 사람(h), 마우스(m), 렛트(r)에서 동일한 결합패턴을 보여, F5 펩타이드에는 전혀 결합하지 않았고 F4>F3>F2>F1 순의 결합력을 보였다. 각 종들의 F1 내지 F4 서열을 비교하였을 때, 이들은 공통적으로 KLSKNELKRRLKA 서열을 포함하고 있었다. 이는 상기 실시예에 5-4에서 규명한 KRS 15-29 aa 영역 중에서도, 17-29 aa 영역(서열번호 117)이 항체 결합에 중요하게 작용하는 것으로 사료되었다. 상기 실험을 통해 N3 항체의 종간 교차반응성이 가능한 것으로 사료되었으며, 이러한 사실은 N3 항체의 독성 시험 및 in vivo 효능시험에 마우스, 렛 모델이 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 6 : KRS -N term 특이적 결합 항체의 면역세포 이동 관련 질환 in vivo 모델에서 효능 확인_ in vivo 폐동맥 고혈압 모델
KRS-N 말단에 특이적으로 결합하는 항체를 처리하면 세포막 위치에서의 KRS 수준이 감소(엔도사이토시스 등을 통해)되는 것을 통해 면역세포 이동/침윤이 저해되어, 결과적으로 상기 실시예 4의 화합물과 동일한 효과(세포막 KRS 수준 감소)를 가지는 것으로 볼 수 있다. 따라서 본 발명의 KRS N-term 특이적 항체(대표적으로 N3 항체)는 상기 실시예 4의 화합물의 동일한 적응증(면역세포 이동 관련 질환)에 대하여 치료효과를 보일 것임은 자명한 것으로 사료되며, 이는 후술되는 실시예들을 통해 더욱 증명되었다.
실험방법
1) 폐동맥 고혈압(PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여
7주령 SD rat(오리엔트바이오)에 PAH를 유도하기 위하여 MCT(monocrotaline) 60 mpk를 피하주사하였다. 이후 4개의 군으로 나누고(각 군당 5마리로 실험), 각각 Mock human IgG(Thermo Fisher Scientific, 음성 대조군) 1mpk, N3 IgG 항체 1mpk, N3 IgG 항체 10mpk, sildenafil(양성 대조군) 25 mpk를 3주간 투여하였다. 모든 항체는 주 2회 iv 주사하였고 sildenafil은 매일 경구투여하였다.
2) 혈류 및 혈압 측정
3주 후 rat를 isoflurane으로 마취하고, 동물용 초정밀공압측정시스템(MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모델명: MPVS Ultra, 제조사명: Millar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기압 (RVESP) 및 이완기압, 좌심실 수축기압 및 이완기압은 전용 카테터(Mikro-Tip　rat pressure catheter,제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였다. 심박출량은 혈관주위(perivascular) 혈류 탐침자(Transonic　Flowprobes,제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였으며, 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다:Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008;3(9):1422-34.
3) 면역조직화학염색(immunohistochemistry, IHC)
채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐조직 파라핀 블록을 3μm 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 염색을 수행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올, DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분간 washing하였다. 0.3 % H2O2의 처리 후, 샘플을 PBS로 5분 동안 2회 washing하였다. 0.01M citrate buffer에 담가 가열 후, PBS-T(0.03 % tween 20)로 세척하였다. 이후 30분간 실온에서 blocking(2 % BSA & 2 % goat serum in PBS)하였다. 항-CD68 항체(1 : 200, ED1 clone, Abcam)로 4℃에서 overnight 염색하였다. PBS-T로 5분간 3회 세척한 후, polymer-HRP anti-mouse envision kit(DAKO)로 4℃에서 1 시간 처리하였다. PBS-T로 3회 세척한 후, DAB substrate buffer 및 DAB chromogen 20을 처리하여 발색시켰다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer's hematoxylin(Sigma)으로 처리 한 다음, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 순서로 각각 2분간 2회 처리하였다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
실험결과
6-1. 혈압 및 심박출량 변화 확인
면역세포의 침윤이 병리현상과 깊이 관계된 질환인 PAH 모델에, N3 단클론 항체를 1mpk 또는 10 mpk로 3주간 처리한 뒤(iv, 주 2회), 우심실 수축기말 압력 (right ventricular end-systolic pressure; RVESP), 우심실 이완기말 압력 (right ventricular end-diastolic pressure; RVEDP), 좌심실 수축기말 압력 (left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 좌심실 이완기말 압력 압력 (left ventricular end-diastolic pressure; LVEDP) 및 심박출량 (cardiac output; CO)을 측정하였으며, 그 결과를 표 3에 나타낸다.
MCT + Mock IgG
(n = 4)		 MCT
+ N3 Ab 1mpk
(n = 5)		 MCT
+ N3 Ab 10mpk
(n = 5)		 MCT + Sildenafil
(n = 5)
RVESP (mmHg) 62.5 ± 5.7 45.0 ± 8.1 41.2 ± 7.7 48.4 ± 9.6
RVEDP (mmHg) 2.8 ± 1.5 1.4 ± 2.2 3.8 ± 1.3 2.6 ± 1.3
LVESP (mmHg) 81.5 ± 11.4 95.8 ± 4.8 93.4 ± 11.3 83.2 ± 4.7
LVEDP (mmHg) 1.0 ± 0.8 2.6 ± 1.9 4.6 ± 3.9 3.6 ± 2.3
CO (ml/min) 58 ± 4.7
(n = 4)		 74.0 ± 10.9
(n = 5)		 59.8 ± 12.9
(n = 5)		 49.6 ± 17.7
(n = 4)
(MCT +mock IgG 처리군 1마리는 마취사. Sildenafil 처리군 1마리는 수술 중 사망하여 CO 측정하지 못함).
폐동맥 고혈압은 폐동맥이 좁아짐으로 인하여 우심실 압력이 상승하며, 결과적으로 우심실 부전을 초래한다. 또한 지속적인 고혈압으로 그 보상 기전이 파괴되면 우심실 비대에 이어 우심실 확장이 일어나게 된다. 이는 심실중격의 이동으로 인한 좌심실의 압박을 가져오게 되고 좌심실의 확장기말 용적 및 심박출량의 감소를 가져오게 된다(이우석 et al., 중증 폐동맥 고혈압 환자의 임상적 특징과 예후 예측 인자, Korean Circulation J 2007;37 :265-270). 결과적으로 폐동맥 고혈압은 주로 우심실과 관계되지만 좌심실의 기능과도 연관된다.
PAH 환자에서는 RVESP가 증가되며 이는 본 실험의 PAH 동물 모델에서도 확인되었다. 이에 대하여 도 12에서 보는 바와 같이, N3 항체(KRS-N term 특이적 결합 항체)는 두 농도 모두에서 유의적으로 RVESP를 감소시켰으며, 특히 양성대조군 약물인 Sildenafil 보다 우수하게 RVESP를 감소시켰다.
또한 N3 항체(KRS-N term 특이적 결합 항체) 투여에 따른 좌심실 수축기말 압력(LVESP) 감소는 관찰되지 않았으며, 오히려 본 발명의 항체를 투여한 군에서는 도 13에서 보는 바와 같이 LVESP가 유의하게 증가되는 결과를 보였다. 이는 기존 폐동맥 고혈압의 치료제로 사용되고 있는 Sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐만 아니라, 전신동맥의 확장도 유발하여 전신 혈압(systemic blood pressure)을 저하시킬 위험이 있는 것과 대비되는 것이다. 즉, 본 발명의 N3 항체는 Sildenafil과 비교하여 전신 동맥압(systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이는 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 임상현장에서 Sildenafil 투여 시 저혈압 발생 위험을 염려하는 상황이 있음을 고려하였을 때, 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었다. 뿐만아니라, 폐동맥고혈압이 심한 경우 수축기 우심실 부전(systolic RV failure)이 발생함에 따라, 낮은 심박출량(cardiac output) 및 전신 저혈압(systemic hypotension)이 동반될 수 있다. 이에 대하여 본 발명의 N3 항체에 의한 폐동맥고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량(cardiac output)과 전신 혈압(systemic blood pressure)이 상승되어 혈압이 정상화되는 효과가 예상된다.
종합하여, 이로서 본 발명의 KRS N-term 결합 항체(특히, N3 항체)의 투여는 기존 치료 약물의 부작용 가능성을 개선하며, PAH 증상완화 및 치료 효과를 보임을 확인하였다.
6-2. 심초음파 검사(Echocardiography)
우심실의 압력 과부하를 시사하는 D-shaped left ventricle 소견은 MCT 단독 투여 군(즉, 실험물질 비투여 PAH 모델)에서 3마리, MCT + Sildenafil 투여한 군의 3마리에서 각각 관찰되었으며, 치료항체(N3 항체)를 투여한 군에서는 관찰되지 않았다.
뿐만아니라 하기 표 4에서 보는 바와 같이, 각 군의 체중은 비슷한 정도로 증가하였으며 유의적 차이가 없었다. 즉, 치료항체 투여를 통한 비정상적 몸무게 감소를 비롯한 이상 징후를 시사하는 소견은 관찰되지 않았다.
MCT + Mock IgG
(n = 4)		 MCT + Ab 1 mpk
(n = 5)		 MCT + Ab 10 mpk
(n = 5)		 MCT + Sildenafil
(n = 5)
Absolute change (g) 101.4 ± 14.2 113.5 ± 14.6 104.1 ± 12.3 104.1 ± 26.4
Relative change (%) 48.8 ± 7.8 43.6 ± 5.2 40.7 ± 5.0 49.8 ± 10.5
6-3. 단핵구/대식세포 이동 및 침윤 정도 확인
각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 실험 결과 도 14에서 보는 바와 같이, 본 발명의 N3 항체(KRS N-term 결합 항체) 처리군은 단핵구/대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였으며, 이러한 효과는 sildenafil 보다 현저히 우수함을 확인하였다.
실시예 7: KRS -N term 특이적 결합 항체의 면역세포 이동 관련 질환 in vivo 모델에서 효능 확인_급성 폐손상 모델
실험방법
1) LPS 유도 급성 폐손상 모델 제작 및 시험물질 투여
급성 폐손상 모델은 7주령 수컷 C57BL/6 마우스(두열바이오)에 LPS(Sigma) 2.5 mg/kg을 기관 내 주입하는 방식으로 제작되었다.
KRS 저해제의 급성 폐손상에 대한 효과를 알아보기 위하여, 먼저 C57BL/6 마우스에 N3 IgG 항체를 각각 1mg/kg 또는 10 mg/kg씩 IV 주입하고, 24시간 후 LPS 2.5 mg/kg을 기관내 주입하였다. 상기 LPS 주입 후 24시간 째에, 각 마우스들을 희생시켜 폐조직 및 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid)를 수집하고 분석하였다.
2) BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내 면역세포 수 측정
PBS로 폐를 세척하여 얻어진 BALF를 모아 800 x g에서 10 분간 4℃에서 원심하여 pellet을 수거하였다. 세포를 부유시킨 후 RBC lysis buffer(eBioscience cat.no.00-4333-57)를 이용해 red blood cell 제거하였다. 이후 PBS로 반응을 멈추고 2번 washing 한 뒤, 400 μl PBS에 부유시켜 hemocytometer로 세포수를 측정하고 Hema3 염색을 통해 neutrophil 수를 측정하였다.
3) 폐조직 내 면역세포에 대한 FACS
폐 조직을 수거하여 gentleMACS Octo Dissociator(MACS Miltenyi Biotec, Order no.130-095-937) 장비를 이용해 37℃에서 45 분간 rotation하여 조직을 으깼다. Cell strainer(40μm)를 이용해 filter한 뒤 1500 rpm에서 5분간 실온에서 원심분리를 수행하였다. Pellet을 수거하여 RBC lysis buffer(eBioscience cat.no.00-4333-57)를 이용해 red blood cell 제거하였다. 세포를 수거하여 FACS buffer (NaN3 1% 및 FBS 3%가 포함된 PBS)에 부유한 뒤 50μl를 tube에 담고, 동량의 항체 mxiture와 잘 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 빛을 차단하여 염색하였다. 폐로 이동하는 IM (interstitial macrophage) 분석을 위해, FITC Rat Anti-CD11b (BD Pharmingen) 과 PE Rat Anti-Mouse F4/80 (BD Pharmingen) 항체를 사용하였다. FACS buffer를 이용하여 400 x g에서 5분간 2번 washing 한 뒤, Navios Flow Cytometer(Beckman) 장비로 분석하였다.
4) 폐 조직에 대한 masson's trichrome 염색
폐 조직을 통상적인 방법으로 파라핀 포매한 후, 박절하였다. 그 후 xylene을 이용하여 파라핀을 제거한 조직 슬라이드를 DW로 washing한 뒤, 56-60℃의 Bouin Fluid에 1시간 처리하였다. Weigert’s iron hematoxylin solution으로 10분 염색하였고, 그 후 washing하고, 다시 Biebrich scarlet-acid fuchsin solution으로 10-15분 염색 한 뒤 washing하였다. Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution을 10-15 분간 처리하고, aniline blue solution으로 옮겨 5-10 분간 염색하였다. Washing 후 1% acetic acid solution에 2-5 분간 처리하였다. Washing 및 dehydration 이후 xylene 처리하여 mounting 하였다.
실험결과
7- 1. BALF ( Bronchoalveolar lavage fluid) 내 면역세포 이동 억제 효과 확인
도 15에서 보는 바와 같이 LPS 처리에 의하여 급성 폐손상을 유발한 마우스에서는 BALF 내 총(total) 면역세포수가 증가된 것을 확인하였으며, 이는 N3 항체(KRS N-term 결합 항체) 처리에 의하여 농도의존적으로 감소하였다.
특히, 도 16에서 보는 바와 같이, LPS 처리로 급성 폐손상을 유발한 마우스에서 호중구(neutrophil)가 많이 증가된 것이 확인되었고, N3 항체(KRS N-term 결합 항체) 처리는 이러한 호중구 수치를 감소시켰다. 이로서 KRS N-term에 특이적으로 결합하는 항체 처리에 의해 BALF 내 면역세포, 특히 neutrophil의 폐로의 침윤이 현저히 억제됨을 확인하였다.
7-2. 폐 조직 내 면역세포 이동 억제 효과 확인
도 17 및 도 18은 급성 폐손상에 의하여 폐 조직으로 이동해온 대식세포를 FACS로 분석한 결과를 나타낸다. IM(interstitial macrophage)은 CD11b+/F4/80+ 세포로서, 폐에 상주하지는 않고 특정 상황에서 폐로 이동해 오는 대식세포(migrating macrophages)이다. LPS 처리에 의해 IM의 폐로의 침윤이 증가하였으나, N3 항체 처리는 농도 의존적으로 IM의 폐로의 이동을 감소시켰다. 이를 통해 KRS N-term에 특이적으로 결합하는 항체(대표적으로, N3 항체) 처리에 의해 대식세포/단핵구 등 면역세포의 폐 조직으로의 이동 및 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.
상기 대식세포/단핵구 등 면역세포의 과도한 폐 조직으로의 이동 및 침윤은 조직 섬유화 질환에 있어서 중요한 병리 현상이다. 상기 급성 폐손상 모델에 대하여 폐조직을 Masson's trichrome 염색하여 관찰한 결과(도 19) 폐 조직 내의 섬유화가 상당히 진행된 것을 확인하였으며, 이에 대하여 N3 항체(KRS N-term에 특이적으로 결합하는 항체)의 처리는 이러한 섬유화를 억제한 것을 확인하였다.
실시예 8: KRS N-말단에 대한 친화도를 증가시킨 N3 개량항체의 제작
본 발명자들은 치료 항체로서 더 좋은 성능을 나타내는 항체를 제작하기 위하여, 상기 N3항체를 개량하여 KRS N-말단 영역에 대한 친화도가 더욱 우수한 항체를 수득하고자 하였다. 이에 다음과 같은 일련의 과정으로 N3 항체의 경쇄가변영역과 중쇄가변영역을 개량하였다.
8-1. N3 항체 기반 서열 변이 scFab 라이브러리(효모 세포 표면 발현 라이브러리)의 구축_ 1차 라이브러리
Homology modeling 방법을 이용하여 N3 항체의 대략적인 구조를 예측하였고, 이를 통해 항원 결합에 중요한 역할을 할 것으로 예측되는 CDR 부위에 무작위적인 돌연변이를 도입하여 라이브러리를 구축하였다. 구체적으로, 중쇄가변영역을 기반으로 한 라이브러리에서는, 중쇄 CDR2 또는 CDR3의 잔기들에 대하여 20개의 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있는 디제너레이트 코돈(degenerated codon)인 NNK를 사용하였다. 경쇄가변영역 라이브러리에서는 N3항체의 경쇄 CDR2 또는 CDR3 잔기들에 대하여 20개의 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있는 디제너레이트 코돈(degenerated codon)인 NNK를 사용하였다. 이처럼 디자인된 라이브러리를 코딩하는 DNA는 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 에탄올 침전법을 사용하여 농축하였다.
그 후, 경쇄가변영역의 다양한 변이를 포함하는 scFab 효모 표면 발현 라이브러리는 하기 문헌에 기재된 방법을 참조로 하여 제작되었다:Baek DS and Kim YS, Construction of a large synthetic human Fab antibody library on yeast cell surface by optimized yeast mating, J Microbiol Biotechnol. 2014 Mar 28;24(3):408-20.
간략하게, 상동성 접합(Homologous recombination)을 위한 C-말단에 aga2 단백질이 발현되는 효모표면발현 벡터(C-aga2: pYDS)에 NheI과 MluI 제한효소를 처리하고 아가로스 젤 추출법을 이용하여 정제하였으며, 에탄올 침전법을 이용하여 농축하였다.
각각의 라이브러리 코딩 DNA 12 μg 에 대하여 상기 제한효소 처리된 4 μg의 벡터를 효모 EBY100(표면 발현용 효모)에 전기천공법으로 형질전환하였고, 계단식 희석(serial dilution)을 통해 선택배지 SD-CAA(20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids)에 자란 콜로니의 수를 측정하여 라이브러리 크기를 확인하였다.
8-2. KRS (1-72 aa) peptide에 대한 친화도가 개량된 scFab 선별_1차 라이브러리 선별
GST가 결합된 KRS(1-72 aa, N-term) peptide를 항원으로 이용하여, 상기 실시예 8-1에서 구축된 라이브러리를 대상으로 친화도가 증가된 Fab을 선별하였다.
구체적으로, 1차 FACS 스크리닝을 위해 SG-CAA(20 g/L Galactose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids) 배지를 이용하여 GST가 결합된 KRS peptide(1-72 aa, 정제된 상태) 10 nM을, 상기 실시예 8-1에서 세포 표면에 scFab 라이브러리 발현을 유도한 효모와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 GST가 결합된 KRS(1-72 aa) peptide와 라이브러리를 발현하는 효모를, PE가 접합된 스트렙타아비딘(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate, SA-PE)과 4℃에서 20분간 반응하여 FACS(Fluorescence activated cell sorting, FACS Caliber; BD biosciences)를 통해 부유화하였다. 이후 동일한 방법으로 1 nM의 GST가 결합된 KRS(1-72 aa) peptide로 2차 FACS 스크리닝을 하였으며, 0.5 nM의 GST가 결합된 KRS(1-72 aa) peptide로 3차 FACS 스크리닝을 진행하였다.
상기 FACS를 이용한 선별과정을 통하여, N3 항체와 비교하여 KRS(1-72 aa) peptide에 대한 높은 친화도를 갖는 클론들이 선별되었다. 이와 같은 방법으로 개별 클론들에 대한 결합능 분석을 통해 KRS(1-72 aa) peptide에 고친화도 및 특이성을 갖는 3개의 우수한 클론(N3-1, N3-3, N3-4)를 선별하였고, 이들의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 서로 조합하여 또 다른 1개의 유니크(unique)한 클론 N3-5를 구축하였다. 상기 N3-5 클론또한 KRS(1-72 aa) peptide에 대한 친화도 및 특이성이 우수한 것으로 확인되었으며, 최종적으로 총 4개의 유니크(magnetic activated cell sorting)한 클론 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5을 선별하였다.
KRS (1-72 aa) peptide에 높은 결합능을 보이는 4개의 개별클론 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역의 CDR 서열을 표 5에 나타내었고, 중쇄가변영역 서열 및 경쇄가변영역 전체 서열을 표 6에 나타내었다.
Figure pat00003
Figure pat00004
또한, ELISA 방법을 이용하여 상기 선별된 개별클론 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5의 KRS N말단에 대한 친화도를 재확인 하였다. 본 실험에는 상기 클론들을 IgG 항체로 전환한 후 실험하였다. IgG 항체로 전환은 상기 실시예 5-1의 방법을 참조로 한다.
구체적으로, KRS의 N말단 부분(1-72 aa) peptide를 96 웰 EIA/RIA 플레이트(COSTAR Corning)에 처리하여 1시간 동안 25℃에서 결합시킨 후, PBS(pH 7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl)(SIGMA)로 10분간 3회 씻어냈다. 이후, 4% BSA PBS(4% Bovine Serum Albumin, pH7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl)(SIGMA)를 1시간 동안 처리한 다음, PBS로 10분간 3회 씻어내었다. 그 다음, IgG 형태의 N3 항체, N3-1 항체, N3-3 항체, N3-4 항체, N3-5항체를 각각 처리하여 결합시킨 후, 0.1 % PBST로 10분간 3회 씻어냈다. 표지항체로는 HRP가 접합된 항-인간 항체(Horseradish peroxidase-conjugated anti-human mAb)(SIGMA)를 사용하였다. 그 다음, TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)(Sigma)로 반응시켜 450nm 흡광도에서 측정하여 정량하였다.
그 결과 도 20 및 도 21에 나타난 바와 같이, N3 항체에 비해 개량항체인 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5 항체의 친화도가 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로 사용된 GST 또는 NRP1-b1b2에 대해서는 모든 클론이 결합하지 않은 것으로 나타났다. 돌연변이 항체인 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5 간의 KRS 결합력에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(도 21 참조).
8-3. N3 항체와 1차 개량항체의 친화도 비교 및 세포 이동 억제 효과 확인
개량항체인 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5 간의 KRS 결합력에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 이에 상기 실시예 8-2에서 선발된 개량 항체들 중 대표적으로 N3-1 IgG 항체를 이용하여, 이의 모(母)항체인 N3 항체와 KRS-N 말단에 대한 친화도를 더욱 구체적으로 비교하였다. KRS 단편(1-207 aa) 정제 단백질을 항원으로 사용하여, Surface Plasmon Resonance(SPR)를 통해 N3 항체 및 N3-1 항체(IgG)와의 결합력을 분석하였다. SPR 실험은 25℃에서 Series S 센서 칩 CM5(GE Healthcare)가 장착된 Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 실시하였다. 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하여 항체를 칩에 고정한 뒤, 항원을 4.8 nM-1250 nM 범위에서 PBS 용액에 4 배수 희석하여 60초간 흘려주었다. 이후 300초 동안 PBS를 흘려주었다. 얻어진 data는 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 v2.0(GE Healthcare)으로 분석하였다.
그 결과 도 22에 나타난 바와 같이, N3-1 항체의 KD 값이 31 nM 로 측정되어 N3 항체보다 KRS 단백질에 대한 결합력이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한 상기 항체를 처리하여 세포 이동 억제 효과를 확인한 결과(방법은 전술한 실시예 참조), N3-1 항체가 N3 항체에 비해 세포 이동을 현저히 억제하는 것을 확인하였다.
8- 4. N3 -3 항체 기반 서열 변이 scFab 라이브러리(효모 세포 표면 발현 라이브러리)의 구축_2차 라이브러리
상기 실시예 8-2에서 도출된 KRS의 N말단을 표적하는 N3-1, N3-3, N3-4, N3-5 항체들은 KRS에 대한 친화도가 유사하며, 상기 실시예 8-3에서 N3-1 항체의 결과에서 나타난 바와 같이 약 31 nM 수준의 친화도를 가지는 것으로 판단되었다. 이들의 KRS(특히 N-term 영역)에 대한 친화도를 증가시켜 더욱 효과적인 항체를 얻기 위해, 중쇄가변영역을 집중적으로 개량하였다.
경쇄가변영역 서열은 N3-3 항체의 서열(서열번호 51)으로 고정하고 중쇄가변영역에 다양한 변이서열을 포함하는 라이브러리를 구축하였다. 먼저 homology modeling 방법을 이용하여 N3-3 항체의 대략적인 modeling 구조를 예측하였으며, 이를 통해 항원 결합에 중요한 역할을 할 것이라 예측되는 CDR에 무작위적인 돌연변이를 도입하였다. 구체적으로, N3-3 항체 중쇄가변영역의 CDR2와 CDR3의 잔기들에 대하여 20개의 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있는 디제너레이트 코돈 (degenerated codon)인 NNK를 사용하였으며, 실시예 8-1과 동일한 방법으로 scFab 라이브러리를 구축하였다.
8-5. KRS (1-72 aa) peptide에 대한 친화도가 개량된 scFab 선별_2차 라이브러리 선별
GST가 결합된 KRS (1-72 aa) peptide를 항원으로 이용하여, 상기 실시예 8-4에서 구축된 라이브러리를 대상으로 친화도가 증가된 Fab을 선별하였다. N3-3과 N3-1의 친화도가 거의 동일한 것으로 판단되고 서열이 거의 유사하므로, 비교실험은 N3-1으로 진행하였다.
먼저, 상기 실시예 8-4에서 제작한 라이브러리 발현 효모에 GTP가 결합된 KRS (1-72 aa) peptide를 처리하여 반응시켰다. 이후, 상기 GTP가 결합된 KRS(1-72 aa) peptide와 결합된 라이브러리를 발현하는 효모를 스트렙타아비딘(Streptavidin) MicrobeadTM (Miltenyi Biotec)과 4℃에서 20분간 반응시킨 후, MACS(magnetic activated cell sorting)를 이용하여 상기 KRS(1-72 aa) peptide에 고친화도를 가지는 scFab를 발현하는 효모를 부유화하였다. 상기 MACS를 통해 선별된 라이브러리를 발현하는 효모를 SG-CAA(20 g/L Galactose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids) 배지에서 배양하여, 라이브러리 발현을 유도하였다. 그 다음. 실시예 8-2와 동일한 방법으로, FACS를 이용하여 순차적인 스크리닝을 진행하였다. 간략하게, 10 nM의 GST가 결합된 KRS(1-72) peptide로 1차 FACS 스크리닝 하였고, 1 nM의 GST가 결합된 KRS(1-72) peptide로 2차 FACS 스크리닝을 하였고, 0.5 nM의 GST가 결합된 KRS(1-72) peptide로 3차 FACS 스크리닝을 하였으며, 0.1 nM의 GST가 결합된 KRS (1-72) peptide로 4차 FACS 스크리닝을 진행하였다.
상기 MACS(magnetic activated cell sorting) 및 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 이용한 선별과정을 통하여, N3-1 항체(N3-3 항체와 유사한 친화도를 나타냄)와 비교하여 KRS(1-72 aa) peptide에 대해 중쇄가변영역(VH) 의존적으로 높은 친화도를 갖는 클론들이 선별되었다. 이와 같은 방법으로 개별클론들에 대한 결합능 분석을 통해 KRS(1-72 aa) peptide에 고친화도 및 특이성을 갖는 4개의 우수한 클론 N3-6, N3-7, N3-8, N3-9를 선별하였다.
KRS(1-72 aa) peptide에 높은 결합능을 보이는 4개의 개별클론 N3-6, N3-7, N3-8, N3-9의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역의 CDR 서열을 표 7에 나타내었고, 중쇄가변영역 서열 및 경쇄가변영역 전체 서열을 표 8에 나타내었다.
Figure pat00005
Figure pat00006
또한, ELISA 방법을 이용하여 상기 선별된 개별클론 N3-6, N3-7, N3-8, N3-9의 KRS N말단에 대한 친화도를 재확인 하였다. 본 실험에서 상기 클론들을 IgG 항체로 전환한 후 ELISA 실험에 이용하였으며, 그 방법은 상기 실시예 5-1을 참조로 한다.
그 결과 도 23에 나타난 바와 같이, N3-1 항체(N3-3과 친화도 유사)에 비해 개량항체인 N3-6, N3-7, N3-8, N3-9 항체의 친화도가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로 사용된 NRP1-b1b2에 대해서는 모든 클론이 결합하지 않은 것으로 나타났다.
또한 개량항체인 N3-6 항체, N3-7 항체, N3-8 항체, N3-9 항체(IgG)를 처리하여 세포 이동 억제 효과를 확인한 결과(방법은 전술한 실시예 참조), 상기 개량항체들은 N3-1 항체 보다 세포의 이동을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다. N3-6 항체, N3-7 항체, N3-8 항체 및 N3-9 항체 간에는 세포이동 저해 효과 상의 큰 차이가 보이지 않았다.
8-6. 개량항체 N3-6, N3-7, N3-8, N3-9의 에피토프 및 친화도 확인
KRS epitope peptide F4(EPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEAKQKE: 서열번호 136) 를 항원 epitope로 사용하여, Surface Plasmon Resonance(SPR)를 통해 N3 항체, N3-6 항체, N3-7 항체, N3-8 항체, N3-9 항체와의 결합력을 분석하였다. SPR 실험은 상기 실시에 5-4와 동일한 방법으로 실시하였으며, epitope를 PBS 용액에 희석하여 15.7 nM-4000 nM 범위에서 2배수 희석하여 90초간 흘려주었다. 이후 2400초 동안 PBS를 흘려주었다. 얻어진 data는 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 v2.0 (GE Healthcare)으로 분석하였다.
그 결과 도 24에 나타난 바와 같이, 개량항체 N3-6 항체, N3-7 항체, N3-8 항체, N3-9 항체들도 N3항체와 유사한 주요 결합부위(main biding site)를 가지는 것으로 확인되었다(실시예 5-4 참조). 추가적으로 KRS epitope peptide F4(서열번호136)의 구성 아미노산을 각각 알라닌(alanine, A)으로 치환한 펩티드(peptide)를 이용하여, 항체 epitope 결합에 중요하게 작용하는 잔기를 확인하기 위해, ELISA를 실시하였다. 그 결과 KRS epitope peptide F4에서 각 항체와의 결합에 중요하게 작용하는 잔기를 확인할 수 있었다.
또한 도 24에서 보는 바와 같이, N3-8 항체(KD = 0.8613nM)의 KD가 가장 우수한 것으로 나타났으며, N3-9(KD = 2.842 nM), N3-6 항체(KD = 4.114nM)가 유사한 KD 값을 나타냈고, N3-7 항체(KD = 18.77nM)의 KD 값이 가장 크게 나타났다. N3-6 항체의 해리(dissociation) 시간이 N3-7, N3-9보다 길고 결합이 더 오래 유지되는 sensorgram을 나타내었다.
8-7. N3-8 항체 기반 생산성 및 안정성 개량 항체 제작(N3-8 항체 sequence refinement)
상기 실시예에서 N3-8 항체가 KRS(특히 N-term)에 친화도가 가장 우수한 것을 확인하였다. 이에, N3-8 항체의 생산성, 안정성 등 물성을 확인하고 이러한 특성을 더욱 우수하게 만들기 위하여, N3-8 항체서열에서 안정성에 영향을 미칠 것으로 예상되는 서열에 변이(mutation)를 유도하여 N3-8 유도체(N3-8 derivative)들을 제작하였다.
그 결과, N3-8 항체의 중쇄가변영역에 변이가 도입된 2종의 중쇄서열(서열번호 45, 서열번호 47)을 얻을 수 있었다. 또한, 경쇄 가변영역에 변이가 도입된 3종의 경쇄 서열(서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55)을 얻을 수 있었다. 이와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 조합에 따른 N3-8 유도체(N3-8 derivatives) 7종의 서열을 하기 표 9 및 표 10에 나타내었으며, 이들은 N3-8 항체의 친화도 특성을 유지한다.
Figure pat00007
Figure pat00008
전술한 실시예들에서 사용된 IgG 전체 항체들의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 서열구성을 하기 표 11에 나타낸다.
Figure pat00009
8-8. N3-8 유도체의 생산성 및 안정성 측정( Tm 측정)
상기 실시예 8-7에서 수득한 N3-8 유도체 항체들의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 플라스미드를 이용하여 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 방법으로, 각각의 항체 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크 내 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)에, 상기 플라스미드 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다.
구체적으로, 200mL 진탕 플라스크(Corning)에 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 분주(seeding)하여, 150 rpm, 8 % CO2, 37℃에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산에 알맞은 중쇄 플라스미드 및 경쇄 플라스미드를 중쇄:경쇄 DNA 1:1, 혹은 1:2의 비율로 처리(10ml FreeStyle 293 발현 배지에 혼합 처리)하여 트랜스펙션 하였다. 먼저 중쇄:경쇄 DNA를 1:1 비율로 사용하는 경우 중쇄 125μg, 경쇄 125μg, 총 250μg(2.5 μg/ml)을 희석하여, PEI 750μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 비율 1:2의 경우 경쇄 DNA의 농도를 2배로 하였다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 분주한 HEK293-F 세포에 처리하여 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2, 37℃에서 배양 한다. 그리고 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다.
그 다음, 세포배양액을 50ml tubes에 옮겨 3000rpm 에서 5 분간 원심분리를 실시하였다. 이후 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼(Protein A Sepharose column)에 상기 상등액을 적용한 후, PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후, 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS(pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축하였다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
또한, 상기 정제한 각각의 항체들을 1 mg/ml 농도로 100 μl를 사용하여 항체의 thermal stability를 측정하였다. Protein thermal shift Dye kit(Thermofisher)를 이용하여 Quant Studio 3 Real-time PCR 장비(Thermofisher)로 4번 반복 수행하였다.
그 결과 하기 표 12에서 보이는 바와 같이, 테스트한 모든 N3-8 유도체 항체들의 수율(yield)이 N3-8 항체보다 개선된 것을 확인하였다. 또한 표 12와 같이, Tm 값을 얻었으며, 항체에 따라 thermal transition이 Tm1-Tm2로 다르게 관찰되었으나, 모든 N3-8 유도체 항체에서 Tm 값이 증가된 것으로 나타났다.
이를 통해 N3-8 항체 유도체들이 N3-8 항체에 비해 수율이 더 높으며, thermal stability가 개선된 것을 확인하였다.
항체 Yield (mg/L) Thermal stability
중쇄:경쇄 DNA 1:1 중쇄:경쇄 DNA 1:2 Tm1 Tm2
N3-8 69.9 104.61 67.37 -
N3-8-1 87.13 109.9 69.94 -
N3-8-2 96.76 109.68 72.41 -
N3-8-3 93.44 93.53 71.02 76.31
N3-8-4 86.14 89.23 70.31 -
N3-8-5 84.31 107.37 72.9 -
N3-8-6 105.95 92.9 71.0 76.97
(상기 표에서 '-'는 Tm1과 동일한 값을 나타냄을 의미한다)
실시예 9: N3 개량항체의 증가된 치료 효능 확인
상기 실시예에서 제작한 N3 개량항체들에 대하여, 실제 in vivo 상에서도 면역세포 이동 관련 질환 치료효과가 현저한지 확인하였다. 질환 모델로서 대표적으로 폐동맥 고혈압 모델을 사용하였으며, 개량 항체로는 대표적으로 N3-6 항체, 및 N3-8항체를 사용하여 실험하였다.
7주령 SD rat(오리엔트바이오)에 폐동맥고혈압을 유도하기 위하여 MCT (monocrotaline) 60 mpk를 피하주사 하였다. 2주간 질병 유발한 뒤 4개의 군으로 나누고(각 군당 5마리로 실험), 각각 PBS, N3 항체 1mpk, N3-6 항체 1mpk, N3-8 항체 1 mpk를 3주간 투여하였다. 모든 항체는 주 2회 iv 주사하였다. 각 실험군에 대하여 혈류 및 혈압 측정, 면역조직화학염색(IHC)은 상기 실시예 6에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다. 또한 각 실험군 폐조직을 Masson's trichrome 염색 방법으로 염색하여 폐의 섬유화(lung fibrosis)의 정도를 측정하였으며 Masson's trichrome 염색 방법은 실시예 7에서 기술된 바와 동일하게 수행되었다.
MCT 단독 처리군 동물의 폐에서는 폐혈관의 endothelitis, 소동맥(arterioles)의 평활근 증식(smooth muscle proliferation), 내막과다증식(intimal hyperplasia), 혈관폐색(vascular occlusion) 등이 관찰되었으며, 이에 폐동맥 고혈압 질환 모델이 잘 제작되었음을 확인되었다.
상기 폐동맥 고혈압에서 나타는 현상들은 본원 발명의 항체 처리에 의해 현저히 감소되었다. 구체적으로, 도 25에서 보는 바와 같이, 폐동맥 고혈압(MCT 단독 처리군)에서 증가된 RVESP가 본 발명의 N3 항체 및 N3 개량 항체 처리에 의하여 현저히 감소되었으며, 특히 N3-8항체는 RVESP 감소 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.
도 26은 각 대조군 및 실험군 폐조직에 대한 IHC 염색 결과를 나타낸다. 폐동맥 고혈압(MCT 단독 처리군) 동물의 폐에서 CD68+ monocyte/macrophage 염색이 강하게 나타난 반면, N3 항체 또는 N3-6 항체 처리군에서 상기 염색 정도가 약해졌으며, N3-8 항체 처리군에서는 negative control과 유사한 수준으로 염색 강도가 현저하게 감소된 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 항체 처리에 의해 monocyte/macrophage의 조직 내 침윤이 억제되었음을 의미하며, 특히 N3-8 항체의 우수한 효과를 보여준다.
또한 도 27에서 보는 바와 같이, 폐동맥 고혈압(MCT 단독 처리군) 동물의 폐조직에서는 폐섬유화 정도가 강하게 나타난 반면, N3 항체 또는 N3-6 항체 처리군에서는 섬유화 증상의 정도가 현저히 약해졌으며, N3-8 항체 처리군에서는 negative control과 거의 유사한 수준으로 섬유화가 감소됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 항체 처리에 의해 섬유화가 감소됨을 의미하며, 특히 N3-8 항체의 우수한 효과를 보여준다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 KRS N-말단 특이적 항체는 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating immunocyte migration-related diseases comprising antibody specifically binding to N-terminal domain of Lysyl-tRNA synthetase <130> NP17-0089P <150> KR 10-2017-0118917 <151> 2017-09-15 <160> 152 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR H1 amino acid <400> 1 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR H1 DNA <400> 2 agttatgata tgagc 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR H2 amino acid <400> 3 Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR H2 DNA <400> 4 gcgatctctt atgataatgg taatacatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR H3 amino acid <400> 5 Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR H3 DNA <400> 6 atggcgcttg atttcgacta c 21 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR L1 amino acid <400> 7 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR L1 DNA <400> 8 actggctctt catctaatat tggcagtaat tatgtcacc 39 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR L2 amino acid <400> 9 Asp Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR L2 DNA <400> 10 gataatagta atcggccaag c 21 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR L3 amino acid <400> 11 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 Ab CDR L3 DNA <400> 12 gcttcttggg atgatagcct gagtgcttat gtc 33 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 mutant 1 amino acid <400> 13 Ala Ser Phe Ser Asp Glu Leu Gly Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 mutant 1 DNA <400> 14 gcttctttta gtgatgagtt gggggcttat gtc 33 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 mutant 2 amino acid <400> 15 Ser Ser Phe Ser Asp Glu Leu Gly Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 mutant 2 DNA <400> 16 tcttctttta gtgatgagtt gggggcttat gtc 33 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 1 amino acid <400> 17 Ala Ile Ser Pro Gln Met Gly Arg Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 1 DNA <400> 18 gcgatctcgc cgcagatggg tcgggtgtat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 2 amino acid <400> 19 Ala Ile Asp Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 2 DNA <400> 20 gcgatcgatc cgttgggggg taatatttat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 3 amino acid <400> 21 Ala Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 3 DNA <400> 22 gcgatctctc cgtattcggg taggatttat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 4 amino acid <400> 23 Ala Ile Gly Ala Asp Gly Gly Pro Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 4 DNA <400> 24 gcgatcgggg ctgatggggg tccgtcttat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 mutant 1 amino acid <400> 25 Leu Ala Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 mutant 1 DNA <400> 26 ctggcgcttg atttcgacta c 21 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 mutant 1 amino acid <400> 27 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 mutant 1 DNA <400> 28 agtaataatc agcggccaag c 21 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 mutant 2 amino acid <400> 29 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 mutant 2 DNA <400> 30 cggaataatc agcggccaag c 21 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH <400> 32 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg ataatggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300 cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 33 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VL <400> 33 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 34 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VL <400> 34 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gataatagta atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH mutant 1 <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH mutant 1 <400> 36 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctcttctg atggtggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300 cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 37 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH mutant 2 <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Gln Met Gly Arg Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH mutant 2 <400> 38 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcgccgc agatgggtcg ggtgtattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300 cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 39 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH mutant 3 <400> 39 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH mutant 3 <400> 40 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atcgatccgt tggggggtaa tatttattac 180 gctgattctg 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ctatgtcagg 1500 gatgccgaag acatgaacag ggccacagca gccaggcagc gggaccatga gaaacaacag 1560 gaaagagtga gggaacaaat ggaagtggtg aacatgtctc tgagcacatc tgcggactct 1620 ctgacaacac ctcgtctaac tctttcagaa cttgatgata taataaagaa tgcgtcaggg 1680 atttatgcag aaatagatgg agccaaaagt gaactacaag taaaactatc taacctaagt 1740 aacctcagcc atgatttagt ccaagaagct attgaccatg cacaggacct tcaacaagaa 1800 gctaatgaat tgagcaggaa gttgcacagt tcagatatga acgggctggt acagaaggct 1860 ttggatgcat caaatgtcta tgaaaatatt gttaattatg ttagtgaagc caatgaaaca 1920 gcagaatttg ctttgaacac cactgaccga atttatgatg cggtgagtgg gattgatact 1980 caaatcattt accataaaga tgaaagtgag aacctcctca atcaagccag agaactgcaa 2040 gcaaaggcag agtctagcag tgatgaagca gtggctgaca ctagcaggcg tgtgggtgga 2100 gccctagcaa ggaaaagtgc ccttaaaacc agactcagtg atgccgttaa gcaactacaa 2160 gcagcagaga gaggggatgc ccagcagcgc ctggggcagt ctagactgat caccgaggaa 2220 gccaacagga cgacgatgga ggtgcagcag gccactgccc ccatggccaa caatctaacc 2280 aactggtcac agaatcttca acattttgac tcttctgctt acaacactgc agtgaactct 2340 gctagggatg cagtaagaaa tctgaccgag gttgtccctc agctcctgga tcagcttcgt 2400 acggttgagc agaagcgacc tgcaagcaac gtttctgcca gcatccagag gatccgagag 2460 ctcattgctc agaccagaag tgttgccagc aagatccaag tctccatgat gtttgatggc 2520 cagtcagctg tggaagtgca ctcgagaacc agtatggatg acttaaaggc cttcacgtct 2580 ctgagcctgt acatgaaacc ccctgtgaag cggccggaac tgaccgagac tgcagatcag 2640 tttatcctgt acctcggaag caaaaacgcc aaaaaagagt atatgggtct tgcaatcaaa 2700 aatgataatc tggtatacgt ctataatttg ggaactaaag atgtggagat tcccctggac 2760 tccaagcccg tcagttcctg gcctgcttac ttcagcattg tcaagattga aagggtggga 2820 aaacatggaa aggtgttttt aacagtcccg agtctaagta gcacagcaga ggaaaagttc 2880 attaaaaagg gggaattttc gggagatgac tctctgctgg acctggaccc tgaggacaca 2940 gtgttttatg ttggtggagt gccttccaac ttcaagctcc ctaccagctt aaacctgcct 3000 ggctttgttg gctgcctgga actggccact ttgaataatg atgtgatcag cttgtacaac 3060 tttaagcaca tctataatat ggacccctcc acatcagtgc catgtgcccg agataagctg 3120 gccttcactc agagtcgggc tgccagttac ttcttcgatg gctccggtta tgccgtggtg 3180 agagacatca caaggagagg gaaatttggt caggtgactc gctttgacat agaagttcga 3240 acaccagctg acaacggcct tattctcctg atggtcaatg gaagtatgtt tttcagactg 3300 gaaatgcgca atggttacct acatgtgttc tatgattttg gattcagcgg tggccctgtg 3360 catcttgaag atacgttaaa gaaagctcaa attaatgatg caaaatacca tgagatctca 3420 atcatttacc acaatgataa gaaaatgatc ttggtagttg acagaaggca tgtcaagagc 3480 atggataatg aaaagatgaa aatacctttt acagatatat acattggagg agctcctcca 3540 gaaatcttac aatccagggc cctcagagca caccttcccc tagatatcaa cttcagagga 3600 tgcatgaagg gcttccagtt ccaaaagaag gacttcaatt tactggagca gacagaaacc 3660 ctgggagttg gttatggatg cccagaagac tcacttatat ctcgcagagc atatttcaat 3720 ggacagagct tcattgcttc aattcagaaa atatctttct ttgatggctt tgaaggaggt 3780 tttaatttcc gaacattaca accaaatggg ttactattct attatgcttc agggtcagac 3840 gtgttctcca tctcactgga taatggtact gtcatcatgg atgtaaaggg aatcaaagtt 3900 cagtcagtag ataagcagta caatgatggg ctgtcccact tcgtcattag ctctgtctca 3960 cccacaagat atgaactgat agtagataaa agcagagttg ggagtaagaa tcctaccaaa 4020 gggaaaatag aacagacaca agcaagtgaa aagaagtttt acttcggtgg ctcaccaatc 4080 agtgctcagt atgctaattt cactggctgc ataagtaatg cctactttac cagggtggat 4140 agagatgtgg aggttgaaga tttccaacgg tatactgaaa aggtccacac ttctctttat 4200 gagtgtccca ttgagtcttc accattgttt ctcctccata aaaaaggaaa aaatttatcc 4260 aagcctaaag caagtcagaa taaaaaggga gggaaaagta aagatgcacc ttcatgggat 4320 cctgttgctc tgaaactccc agagcggaat actccaagaa actctcattg ccacctttcc 4380 aacagcccta gagcaataga gcacgcctat caatatggag gaacagccaa cagccgccaa 4440 gagtttgaac acttaaaagg agattttggt gccaaatctc agttttccat tcgtctgaga 4500 actcgttcct cccatggcat gatcttctat gtctcagatc aagaagagaa tgacttcatg 4560 actctatttt tggcccatgg ccgcttggtt tacatgttta atgttggtca caaaaaactg 4620 aagattagaa gccaggagaa atacaatgat ggcctgtggc atgatgtgat atttattcga 4680 gaaaggagca gtggccgact ggtaattgat ggtctccgag tcctagaaga aagtcttcct 4740 cctactgaag ctacctggaa aatcaagggt cccatttatt tgggaggtgt ggctcctgga 4800 aaggctgtga aaaatgttca gattaactcc atctacagtt ttagtggctg tctcagcaat 4860 ctccagctca atggggcctc catcacctct gcttctcaga cattcagtgt gaccccttgc 4920 tttgaaggcc ccatggaaac aggaacttac ttttcaacag aaggaggata cgtggttcta 4980 gatgaatctt tcaatattgg attgaagttt gaaattgcat ttgaagtccg tcccagaagc 5040 agttccggaa ccctggtcca cggccacagt gtcaatgggg agtacctaaa tgttcacatg 5100 aaaaatggac aggtcatagt gaaagtcaat aatggcatca gagatttttc cacctcagtt 5160 acacccaagc agagtctctg tgatggcaga tggcacagaa ttacagttat tagagattct 5220 aatgtggttc agttggatgt ggactctgaa gtgaaccatg tggttggacc cctgaatcca 5280 aaaccaattg atcacaggga gcctgtgttt gttggaggtg ttccagaatc tctactgaca 5340 ccacgcttgg cccccagcaa acccttcaca ggctgcatac gccactttgt gattgatgga 5400 cacccagtga gcttcagtaa agcagccctg gtcagcggcg ccgtaagcat caactcctgt 5460 ccagcagcct ga 5472 <210> 122 <211> 1798 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Laminin subunit beta-2 (Homo sapiens) <400> 122 Met Glu Leu Thr Ser Arg Glu Arg Gly Arg Gly Gln Pro Leu Pro Trp 1 5 10 15 Glu Leu Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ser Val 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ttcctgcctg ccatccctgc catgcatgct tcggggattg ggaccgagtg 3600 gtgcaggact tggcagcccg tacacagcgc ctagagcagc gggcgcagga gttgcaacag 3660 acgggtgtgc tgggtgcctt tgagagcagc ttctggcaca tgcaggagaa gctgggcatt 3720 gtgcagggca tcgtaggtgc ccgcaacacc tcagccgcct ccactgcaca gcttgtggag 3780 gccacagagg agctgcggcg tgaaattggg gaggccactg agcacctgac tcagctcgag 3840 gcagacctga cagatgtgca agatgagaac ttcaatgcca accatgcact aagtggtctg 3900 gagcgagata ggcttgcact taatctcaca ctgcggcagc tcgaccagca tcttgacttg 3960 ctcaaacatt caaacttcct gggtgcctat gacagcatcc ggcatgccca tagccagtct 4020 gcagaggcag aacgtcgtgc caatacctca gccctggcag tacctagccc tgtgagcaac 4080 tcggcaagtg ctcggcatcg gacagaggca ctgatggatg ctcagaagga ggacttcaac 4140 agcaaacaca tggccaacca gcgggcactt ggcaagctct ctgcccatac ccacaccctg 4200 agcctgacag acataaatga gctggtgtgt ggggcaccag gggatgcacc ctgtgctaca 4260 agcccttgtg ggggtgccgg ctgtcgagat gaggatgggc agccgcgctg tgggggcctc 4320 agctgcaatg gggcagcggc tacagcagac ctagcactgg gccgggcccg gcacacacag 4380 gcagagctgc 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Gly Cys Lys Pro Cys Glu Cys His Leu Gln Gly Ser Val Asn Ala Phe 820 825 830 Cys Asn Pro Val Thr Gly Gln Cys His Cys Phe Gln Gly Val Tyr Ala 835 840 845 Arg Gln Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Phe Pro Ser Cys 850 855 860 Gln Pro Cys Gln Cys Asn Gly His Ala Asp Asp Cys Asp Pro Val Thr 865 870 875 880 Gly Glu Cys Leu Asn Cys Gln Asp Tyr Thr Met Gly His Asn Cys Glu 885 890 895 Arg Cys Leu Ala Gly Tyr Tyr Gly Asp Pro Ile Ile Gly Ser Gly Asp 900 905 910 His Cys Arg Pro Cys Pro Cys Pro Asp Gly Pro Asp Ser Gly Arg Gln 915 920 925 Phe Ala Arg Ser Cys Tyr Gln Asp Pro Val Thr Leu Gln Leu Ala Cys 930 935 940 Val Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Cys Asp Asp Cys Ala Ser 945 950 955 960 Gly Tyr Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val Gly Gly Ser Cys Gln Pro Cys 965 970 975 Gln Cys His Asn Asn Ile Asp Thr Thr Asp Pro Glu Ala Cys Asp Lys 980 985 990 Glu Thr Gly Arg Cys Leu Lys Cys Leu Tyr His Thr Glu Gly Glu His 995 1000 1005 Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Asp Ala Leu Gln Gln Asp 1010 1015 1020 Cys Arg Lys Cys Val Cys Asn Tyr Leu Gly Thr Val Gln Glu His Cys 1025 1030 1035 1040 Asn Gly Ser Asp Cys Gln Cys Asp Lys Ala Thr Gly Gln Cys Leu Cys 1045 1050 1055 Leu Pro Asn Val Ile Gly Gln Asn Cys Asp Arg Cys Ala Pro Asn Thr 1060 1065 1070 Trp Gln Leu Ala Ser Gly Thr Gly Cys Asp Pro Cys Asn Cys Asn Ala 1075 1080 1085 Ala His Ser Phe Gly Pro Ser Cys Asn Glu Phe Thr Gly Gln Cys Gln 1090 1095 1100 Cys Met Pro Gly Phe Gly Gly Arg Thr Cys Ser Glu Cys Gln Glu Leu 1105 1110 1115 1120 Phe Trp Gly Asp Pro Asp Val Glu Cys Arg Ala Cys Asp Cys Asp Pro 1125 1130 1135 Arg Gly Ile Glu Thr Pro Gln Cys Asp Gln Ser Thr Gly Gln Cys Val 1140 1145 1150 Cys Val Glu Gly Val Glu Gly Pro Arg Cys Asp Lys Cys Thr Arg Gly 1155 1160 1165 Tyr Ser Gly Val Phe Pro Asp Cys Thr Pro Cys His Gln Cys Phe Ala 1170 1175 1180 Leu Trp Asp Val Ile Ile Ala Glu Leu Thr Asn Arg Thr His Arg Phe 1185 1190 1195 1200 Leu Glu Lys Ala Lys Ala Leu Lys Ile Ser Gly Val Ile Gly Pro Tyr 1205 1210 1215 Arg Glu Thr Val Asp Ser Val Glu Arg Lys Val Ser Glu Ile Lys Asp 1220 1225 1230 Ile Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ala Glu Pro Leu Lys Asn Ile Gly Asn 1235 1240 1245 Leu Phe Glu Glu Ala Glu Lys Leu Ile Lys Asp Val Thr Glu Met Met 1250 1255 1260 Ala Gln Val Glu Val Lys Leu Ser Asp Thr Thr Ser Gln Ser Asn Ser 1265 1270 1275 1280 Thr Ala Lys Glu Leu Asp Ser Leu Gln Thr Glu Ala Glu Ser Leu Asp 1285 1290 1295 Asn Thr Val Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Glu Phe Ile Lys Asn Ser 1300 1305 1310 Asp Ile Arg Gly Ala Leu Asp Ser Ile Thr Lys Tyr Phe Gln Met Ser 1315 1320 1325 Leu Glu Ala Glu Glu Arg Val Asn Ala Ser Thr Thr Glu Pro Asn Ser 1330 1335 1340 Thr Val Glu Gln Ser Ala Leu Met Arg Asp Arg Val Glu Asp Val Met 1345 1350 1355 1360 Met Glu Arg Glu Ser Gln Phe Lys Glu Lys Gln Glu Glu Gln Ala Arg 1365 1370 1375 Leu Leu Asp Glu Leu Ala Gly Lys Leu Gln Ser Leu Asp Leu Ser Ala 1380 1385 1390 Ala Ala Glu Met Thr Cys Gly Thr Pro Pro Gly Ala Ser Cys Ser Glu 1395 1400 1405 Thr Glu Cys Gly Gly Pro Asn Cys Arg Thr Asp Glu Gly Glu Arg Lys 1410 1415 1420 Cys Gly Gly Pro Gly Cys Gly Gly Leu Val Thr Val Ala His Asn Ala 1425 1430 1435 1440 Trp Gln Lys Ala Met Asp Leu Asp Gln Asp Val Leu Ser Ala Leu Ala 1445 1450 1455 Glu Val Glu Gln Leu Ser Lys Met Val Ser Glu Ala Lys Leu Arg Ala 1460 1465 1470 Asp Glu Ala Lys Gln Ser Ala Glu Asp Ile Leu Leu Lys Thr Asn Ala 1475 1480 1485 Thr Lys Glu Lys Met Asp Lys Ser Asn Glu Glu Leu Arg Asn Leu Ile 1490 1495 1500 Lys Gln Ile Arg Asn Phe Leu Thr Gln Asp Ser Ala Asp Leu Asp Ser 1505 1510 1515 1520 Ile Glu Ala Val Ala Asn Glu Val Leu Lys Met Glu Met Pro Ser Thr 1525 1530 1535 Pro Gln Gln Leu Gln Asn Leu Thr Glu Asp Ile Arg Glu Arg Val Glu 1540 1545 1550 Ser Leu Ser Gln Val Glu Val Ile Leu Gln His Ser Ala Ala Asp Ile 1555 1560 1565 Ala Arg Ala Glu Met Leu Leu Glu Glu Ala Lys Arg Ala Ser Lys Ser 1570 1575 1580 Ala Thr Asp Val Lys Val Thr Ala Asp Met Val Lys Glu Ala Leu Glu 1585 1590 1595 1600 Glu Ala Glu Lys Ala Gln Val Ala Ala Glu Lys Ala Ile Lys Gln Ala 1605 1610 1615 Asp Glu Asp Ile Gln Gly Thr Gln Asn Leu Leu Thr Ser Ile Glu Ser 1620 1625 1630 Glu Thr Ala Ala Ser Glu Glu Thr Leu Phe Asn Ala Ser Gln Arg Ile 1635 1640 1645 Ser Glu Leu Glu Arg Asn Val Glu Glu Leu Lys Arg Lys Ala Ala Gln 1650 1655 1660 Asn Ser Gly Glu Ala Glu Tyr Ile Glu Lys Val Val Tyr Thr Val Lys 1665 1670 1675 1680 Gln Ser Ala Glu Asp Val Lys Lys Thr Leu Asp Gly Glu Leu Asp Glu 1685 1690 1695 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Asn Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Glu Ser 1700 1705 1710 Ala Asp Ala Arg Arg Lys Ala Glu Met Leu Gln Asn Glu Ala Lys Thr 1715 1720 1725 Leu Leu Ala Gln Ala Asn Ser Lys Leu Gln Leu Leu Lys Asp Leu Glu 1730 1735 1740 Arg Lys Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Tyr Leu Glu Asp Lys Ala Gln Glu 1745 1750 1755 1760 Leu Ala Arg Leu Glu Gly Glu Val Arg Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ser 1765 1770 1775 Gln Lys Val Ala Val Tyr Ser Thr Cys Leu 1780 1785 <210> 129 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for scFv VH <400> 129 agagagtgta cactcccagg cggccgaggt gcag 34 <210> 130 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for scFv VH <400> 130 cgccgctggg cccttggtgg aggctgagct cacggtgacc ag 42 <210> 131 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for scFv VL <400> 131 aagcggccgc caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag 60 gtgtacactc ccagtctgtg ctgactcag 89 <210> 132 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for scFv VL <400> 132 cgccgccgta cgtaggaccg tcagcttggt 30 <210> 133 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F1 <400> 133 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 20 25 <210> 134 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F2 <400> 134 Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys 1 5 10 15 Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala 20 25 30 <210> 135 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F3 <400> 135 Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg 1 5 10 15 Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala 20 25 <210> 136 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F4 <400> 136 Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu 1 5 10 15 Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 20 25 <210> 137 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F5 <400> 137 Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys 1 5 10 15 Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser 20 25 <210> 138 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F1(mF1) <400> 138 Met Ala Thr Leu Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 20 25 <210> 139 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F2(mF2) <400> 139 Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys Leu Ser Lys Asn 1 5 10 15 Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala 20 25 <210> 140 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F3(mF3) <400> 140 Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala 20 25 <210> 141 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F4(mF4) <400> 141 Gln Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 20 25 <210> 142 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F5(mF5) <400> 142 Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln 1 5 10 15 Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 20 25 <210> 143 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F1(rF1) <400> 143 Met Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 20 25 <210> 144 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F2(rF2) <400> 144 Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn 1 5 10 15 Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala 20 25 <210> 145 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F3(rF3) <400> 145 Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala 20 25 <210> 146 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F4(rF4) <400> 146 Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 20 25 <210> 147 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F5(rF5) <400> 147 Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln 1 5 10 15 Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 20 25 <210> 148 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane exposed Lysyl-tRNA synthetase N-term(Homo sapiens) <400> 148 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr 50 <210> 149 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysyl-tRNA synthetase N-term(mouse) <400> 149 Met Ala Thr Leu Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu 20 25 30 Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 35 40 45 <210> 150 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysyl-tRNA synthetase N-term(rat) <400> 150 Met Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu 20 25 30 Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 35 40 45 <210> 151 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 5 amino acid <400> 151 Val Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 152 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 mutant 5 DNA <400> 152 gtgatctctt ctgatggtgg taatacatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51

Claims (16)

  1. 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase, KRS) N-말단 중에서 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 138, 서열번호 139, 서열번호 140, 서열번호 141, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호 149 및 서열번호 150으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 세포막의 KRS 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은
    서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은
    서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 기능적 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 면역세포 이동과 관련된 질환은 심혈관 질환, 섬유화 질환, 염증성 질환 및 알포트 증후군(Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 섬유화 질환은 경피증 (scleroderma), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepathic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 상기 염증성 질환은 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 건선증, 당뇨성 안질환, 당뇨병성 망막증, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 간경변, 무알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis), 신장염, 단백뇨증, 당뇨병성 신부전증, 관절염, 건선성 관절염, 신경염, 당뇨병성 신경병증, 다발성 경화증, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 혈관염, 루게릭병, 베게너 육아종증, 과사이토카인 혈증(hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염, 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 건선, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 이식편대 숙주 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은
    (a) (a-1) 아미노산 서열 SYDMS를 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1);
    (a-2) 아미노산 서열 X1IX2X3X4X5GX6X7YYADSVKG를 포함하고, 여기서 X1은 A 또는 V이고, X2은 S, D 또는 G이고, X3는 Y, P, S 또는 A 이고, X4는 D, Q, L 또는 Y이고, X5는 N, M, S, 또는 G이고, X6는 N, R 또는 P이고, X7는 T, V, I 또는 S인 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 및
    (a-3) 아미노산 서열 X8ALDFDY를 포함하고, 여기서 X8은 M 또는 L인 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)를 포함하는 중쇄가변영역(VH), 및
    (b) (b-1) 아미노산 서열 TGSSSNIGSNYVT를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1);
    (b-2) 아미노산 서열 X9NX10X11RPS를 포함하고, 여기서 X9은 D, S 또는 R이고, X10는 S 또는 N이고, X11은 N 또는 Q인 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 및
    (b-3) 아미노산 서열 X12SFSDELGAYV를 포함하고, 여기서 X12은 A 또는 S인 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)를 포함하는 경쇄가변영역(VL)
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서,(a) 중쇄가변영역(VH)은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 및 서열번호 151로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5 및 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서,(b) 경쇄가변영역(VL)은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 9, 서열번호 27 및 서열번호 29로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제6항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 61, 서열번호 63,서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85 및 서열번호 87 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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