KR20190017546A - Gene digital signal analyzing apparatus using microfluidic device and analysis method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 극미량의 병원균을 효율적으로 검출하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device and an analyzing method thereof, and more particularly, to a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device for efficiently detecting a trace amount of pathogens, .
박테리아, 병원균 감염에 의해 매년 수많은 사상자와 비용이 발생하고 있다. 이에 따라, 병원균 및 박테리아 등을 신속하고 정확하게 검출하여 분석하기 위한 다양한 분석방법의 개발이 이루어지고 있다.Bacteria, and pathogens are causing many casualties and costs each year. Accordingly, various analytical methods for rapidly and accurately detecting and analyzing pathogens and bacteria have been developed.
구체적으로, 미생물 분석방법 중 하나인 미생물 배양법은, 미생물을 증식이 이루어질 수 있는 환경에 일정 시간동안 배양시킨 다음 현미경 분석이나 염색법을 이용하여 미생물의 종류 등을 분석하는 방법이다. 그러나, 이러한 미생물 배양법은 미생물을 증식할 수 있는 환경을 조성하고, 복잡한 실험 단계를 거쳐야만 하기 때문에 기술의 숙련이 필요하며, 미생물을 분석하기 위해 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.Specifically, the microorganism culture method, which is one of the methods for analyzing microorganisms, is a method in which a microorganism is cultured for an extended period of time in an environment capable of proliferation, and then the kind of microorganism is analyzed using a microscope or a staining method. However, such a microorganism culture method requires a skill of skill because it requires an environment in which microorganisms can be propagated and must undergo complicated experimental steps, and it takes a lot of time to analyze microorganisms.
또한, 미생물의 면역반응법은, 병원체가 증식하는 곳에서 생산되는 각종의 특이항원이나 단독독소 혹은 효소 등을 검출하는 방법으로서, 미량의 병원체에 대해서 적용이 가능한 장점이 있다. 그러나, 이러한 면역반응법은 항원이 되는 미생물 그 자체를 확인하는 것이 아니라， 그 존재를 반영하는 항체가를 보기 때문에 항체가가 상승하기까지의 시간적 차이로 인해 병원체의 존재시기를 반영할 수 없는 결점이 있다.In addition, the immunological reaction method of microorganisms is a method of detecting various specific antigens, single toxins or enzymes produced in a place where a pathogen grows, and has an advantage that it can be applied to a small amount of pathogen. However, such an immune response method does not identify the microorganism itself as an antigen, but refers to an antibody that reflects the presence of the antigen, so that defects that can not reflect the presence of the pathogen due to the time difference until the antibody titer increases .
또한, ATP(Adensine triphonsphate)방법은, 생명체의 물질대사시 발생되는 빛을 측정하는 방법이다. 그러나, ATP 방법은 세균을 직접 측정하는 기기가 아니기 때문에 ATP측정 수치가 미생물 수에 정비례하지 않아 정확한 미생물 수 검출이 어려운 문제가 있다.In addition, the ATP (Adenosine triphosphate) method is a method of measuring light generated during metabolism of living organisms. However, since the ATP method is not a device for directly measuring bacteria, there is a problem that it is difficult to accurately detect the number of microorganisms since the ATP measurement value is not directly proportional to the number of microorganisms.
또한, 최근에는 중합효소연쇄반응(PCR) 기반의 기술을 이용하여 병원균을 배양하고, 유전자를 추출한 후 아가로스 겔(Agaros gel) 전기 영동법을 이용하여 유전자 증폭 여부를 분석하는 방법이 주로 사용되고 있다.Recently, a method of culturing a pathogen using PCR-based technology and extracting genes and analyzing the amplification of genes using agarose gel electrophoresis has been mainly used.
그러나, 이러한 아가로스 겔 전기 영동법은 병원균의 농도가 낮을 경우 육안으로 검사를 진행하여 실제 낮은 농도의 병원균 존재 유무 판독에 제한이 있는 문제가 있다.However, such an agarose gel electrophoresis method has a problem in that it is visually inspected when the concentration of the pathogen is low, and there is a limitation in actually detecting presence or absence of the pathogen at a low concentration.
구체적으로, 용액 대비 병원균의 농도가103 cells 이하일 때와 같이 병원균의 농도가 극미량인 경우, 병원균이 증폭되더라도 병원균이 분산되기 때문에 검출을 위한 신호가 매우 약해진다. 따라서, 병원균이 극미량인 경우, 정확하고 신속하게 병원균의 존재여무를 검출하기 어렵다는 문제가 있다.Specifically, when the concentration of the pathogen is extremely small, such as when the pathogen concentration is less than 10 3 cells per solution, even when the pathogen is amplified, the signal for detection is very weak because the pathogen is dispersed. Therefore, there is a problem that it is difficult to accurately and quickly detect the presence or absence of pathogens when the pathogens are extremely small.
또한, 종래의 아가로스 겔 전기 영동법을 이용한 분석방법은 병원균을 정량적으로 검출하기도 어렵다는 한계가 있다.In addition, the conventional analysis method using the agarose gel electrophoresis has a limitation in that it is difficult to quantitatively detect pathogens.
따라서, 보다 신속하고 효율적으로 병원균을 검출할 수 있고, 병원균을 정량적으로 검출할 수 있는 방법이 필요하다.Therefore, there is a need for a method capable of detecting pathogens more rapidly and efficiently and quantitatively detecting pathogens.
상기와 같은 문제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 극미량의 병원균을 효율적으로 검출하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 이의 분석방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a multi-gene digital signal analyzing apparatus and a method of analyzing the same using a microfluidic device for efficiently detecting a trace amount of pathogens.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not intended to limit the invention to the precise form disclosed. There will be.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 시료 및 검출대상균을 배출하는 캡슐부; 및 상기 캡슐부로부터 배출된 상기 검출대상균 내 다중유전자를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자를 검출하는 증폭검출부를 포함하며, 상기 캡슐부는 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하며, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 2종 이상이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a capsule endoscope comprising: a capsule unit for discharging a sample and a detection target bacterium; And an amplification detection unit for amplifying the multiple genes in the bacterium to be detected emitted from the capsule unit and detecting the amplified multiple genes, wherein the capsule unit discharges the sample in the form of a fine droplet, Wherein the microfluidic device is in a state in which two or more species of the detection object bacteria are accommodated.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 캡슐부는, 상기 시료 및 상기 검출대상균이 수용되는 시료저장유닛; 상기 시료저장유닛의 일단에 마련되며, 상기 시료저장유닛에 비해 상대적으로 단면적이 작게 형성된 미세방울형성유닛; 상기 미세방울형성유닛의 일측 또는 양측에 마련되며, 상기 미세방울형성유닛에 오일을 배출하는 오일배출유닛; 및 상기 미세방울형성유닛을 통과한 상기 미세방울을 상기 증폭검출부로 이송하는 미세방울이송유닛을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the embodiment of the present invention, the capsule portion may include a sample storage unit in which the sample and the detection target bacteria are accommodated; A fine droplet forming unit provided at one end of the sample storage unit and having a smaller cross-sectional area than the sample storage unit; An oil discharge unit provided at one side or both sides of the fine droplet forming unit and discharging oil to the fine droplet forming unit; And a fine droplet transfer unit for transferring the fine droplets having passed through the fine droplet forming unit to the amplification detecting unit.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛을 향해 배출됨으로써, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이루는 것을 특징으로 할 수 있다.In the embodiment of the present invention, the sample and the oil are discharged toward the fine droplet forming unit at different flow rates, so that the sample forms an independent fine droplet shape when passing through the fine droplet forming unit .
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5 μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20 μm/min인 것을 특징으로 할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the flow rate of the sample is 0.8 to 5 μm / min, and the flow rate of the oil is 8 to 20 μm / min.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 다중유전자를 추출하고, 추출된 상기 다중유전자에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the amplification detection unit may be configured to detect the microorganism to be detected in the micro-droplet to extract multiple genes, and to perform PCR on the extracted multiple genes, And amplifying the amplified signal.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법에 있어서, a) 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계; b) 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계; c) 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 a) 단계에서, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법을 제공한다.According to an aspect of the present invention, there is provided a method for analyzing a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device, comprising the steps of: a) discharging the sample in the form of a droplet; b) dissolving the microorganism to be detected in the micro-droplet to extract the multiple genes and amplifying the extracted multiple genes; c) detecting the amplified multiple genes, wherein in the step a), the detection target microorganisms are contained in a part of the fine droplets, and a method for analyzing multiple gene digital signals using the microfluidic device .
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계는, 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5 μm/min 이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20 μm/min 인 것을 특징으로 할 수 있다.In the embodiment of the present invention, in the step a), the flow rate of the sample is 0.8 to 5 μm / min, and the flow rate of the oil is 8 to 20 μm / min.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b) 단계는, b1) 상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계; b2) 변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계; b3) 형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the step b) comprises the steps of: b1) the microorganism to be detected is dissolved to extract the multiple genes, and the multiple genes are denatured; b2) the modified multiple genes are separated into a pair, and a fluorescent substance is bound to the separated pair of genes; and b3) each of the separated genes to which the fluorescent substance is bound is restored to multiple genes by two-stranded annealing and amplified.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b1) 단계에서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 15분 내지 25분간 가열하여 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하고, 상기 다중유전자를 변성시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the step b1), the amplification detecting unit may heat the micro-droplet at 90 to 100 DEG C for 15 to 25 minutes to dissolve the microorganism to be detected in the micro-droplet, Denatured.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b2) 단계에서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 25 내지 35 초, 60 내지 68℃에서 55초 내지 65초씩 총40회 반복 가열하여 상기 변성된 상기 다중유전자를 한 쌍으로 분리시키고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질을 결합시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the step b2), the amplification detecting unit may repeatedly heat the fine droplet for 40 to 60 seconds at 90 to 100 DEG C for 25 to 35 seconds at 60 to 68 DEG C for 55 to 65 seconds, The denatured multiple genes are separated into a pair, and the fluorescent substance is bound to the separated pair of separated genes.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 b3) 단계에서, 상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 290초 내지 310초간 가열하여 상기 분리유전자의 두가닥복원을 수행함으로써, 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the step b3), the amplification detecting unit may perform double-strand recovery of the isolated gene by heating the micro-droplet at 90 to 100 DEG C for 290 to 310 seconds, And amplifying the amplified signal.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서, 상기 시료에는 상기 검출대상균 내 다중유전자와 결합되는 형광물질이 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.In an embodiment of the present invention, in the step a), the sample may include a fluorescent substance that is bound to the multiple genes in the detection subject bacterium.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서, 상기 형광물질의 종류는 상기 다중유전자의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the embodiment of the present invention, in the step a), the type of the fluorescent substance may be included in the sample so as to correspond one-to-one with the type of the multiple gene.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서, 상기 검출대상균은 복수로 마련되며, 상기 형광물질을 서로 다른 형광색을 띄도록 마련되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the embodiment of the present invention, in the step a), a plurality of detection target bacteria are provided, and the fluorescent material is provided so as to have different fluorescence colors.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 c) 단계는, 상기 형광 현미경을 이용하여 상기 미세방울 내 다중유전자를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the embodiment of the present invention, in the step c), the multi-gene in the micro-droplet is detected using the fluorescence microscope.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치를 적용한 다중유전자 검출기를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a multiple gene detector using a multi-gene digital signal analyzer using a microfluidic device.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법을 적용한 다중유전자 검출기를 제공한다.According to an aspect of the present invention, there is provided a multi-gene detector using an analysis method of a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device.
상기와 같은 구성에 따르는 본 발명의 효과는, 용액 대비 병원균의 농도가 103 cells이하일 때에도 병원균의 존재 유무를 검출할 수 있다. 구체적으로, 종래의 PCR 방법으로는 살모넬라, 대장균과 같은 병원균의 농도가 용액 대비 103 cells 이하일 때에는 검출이 불가능한 한계가 있었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 살모넬라, 대장균과 같은 병원균의 농도가 용액 대비 103 cells이하의 극미량일 때에도 병원균의 존재 유무를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.The effect of the present invention according to the above-described construction can detect the presence or absence of a pathogen even when the concentration of the pathogen in solution is not more than 10 3 cells. Specifically, conventional PCR methods have a limitation in that detection can not be performed when the concentration of pathogens such as Salmonella and E. coli is 10 3 cells or less relative to the solution. However, according to the present invention, even when the concentration of pathogens such as Salmonella and E. coli is 10 3 cells or less relative to the solution, the presence or absence of pathogens can be detected quickly and accurately.
또한, 본 발명에 따르면, 병원균을 용이하게 정량적으로 파악할 수 있다.Further, according to the present invention, pathogens can be easily and quantitatively grasped.
또한, 본 발명에 따르면, 서로 다른 종류의 유전자에 대응되도록 발색 시약을 결합시키고, 유전자가 포함된 시료를 미세방울 형태로 배출하도록 이루어짐으로써, 각 미세방울의 색상변화를 별도로 판별할 수 있으므로, 여러 종류의 유전자를 동시에 정량적으로 검출할 수 있다.In addition, according to the present invention, the coloring reagent is bound to correspond to different kinds of genes, and the sample containing the gene is discharged in the form of a fine droplet, so that the color change of each fine droplet can be discriminated separately. Type genes can be quantitatively detected at the same time.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the above effects and include all effects that can be deduced from the detailed description of the present invention or the configuration of the invention described in the claims.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석을 위한 미세방울형성장치를 나타낸 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 미세방울형성유닛을 통과하는 시료를 시간순으로 나타낸 예시도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 순서도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 증폭하는 단계를 구체화한 순서도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 증폭하는 단계를 나타낸 예시도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 복수의 검출대상균을 분석하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 결과와 종래예를 대비한 예시도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 검출결과를 겔 전기 영동법으로 나타낸 예시도이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별 형광신호검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별형광신호 및 복합형광신호 검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다.FIG. 1 is a perspective view illustrating a micro droplet forming apparatus for analyzing a multi-gene digital signal using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG.
2 is an exemplary view showing a sample passing through a fine droplet forming unit according to an embodiment of the present invention in chronological order.
3 is an illustration of an apparatus for analyzing a multi-gene digital signal using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
4 is a flowchart of a method of analyzing a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a flowchart illustrating an amplifying step of an analysis method of a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
6 is a diagram illustrating an amplifying step according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is an illustration of an apparatus for analyzing multiple gene digital signals using a microfluidic device for analyzing a plurality of detection target bacteria according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 8 is a diagram illustrating results of an apparatus and method for analyzing multi-gene digital signals using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention and a conventional example.
FIG. 9 is an exemplary view showing a result of detection of a multi-gene digital signal analyzing apparatus and analysis method using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention by gel electrophoresis.
FIG. 10 is an exemplary diagram showing fluorescence signal detection results of a multi-gene digital signal analyzer and analysis method using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention using a fluorescence microscope.
FIG. 11 is a view showing fluorescence signals and composite fluorescence signal detection results of a multi-gene digital signal analyzer and analysis method using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention, using a fluorescence microscope.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. In order to clearly illustrate the present invention, parts not related to the description are omitted, and similar parts are denoted by like reference characters throughout the specification.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is referred to as being "connected" (connected, connected, coupled) with another part, it is not only the case where it is "directly connected" "Is included. Also, when an element is referred to as "comprising ", it means that it can include other elements, not excluding other elements unless specifically stated otherwise.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the invention. The singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, the terms "comprises" or "having" and the like refer to the presence of stated features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof, But do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 캡슐부를 나타낸 사시도이고, 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 미세방울형성유닛을 통과하는 시료를 시간순으로 나타낸 예시도이며, 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.FIG. 1 is a perspective view illustrating a capsule portion of a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is a perspective view showing a sample passing through a microdroplet forming unit according to an embodiment of the present invention, FIG. 3 is a diagram illustrating an apparatus for analyzing a multi-gene digital signal using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG.
도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치(100)는 캡슐부(110) 및 증폭검출부(120)를 포함한다.1 to 3, a multi-gene digital
상기 캡슐부(110)는 시료 및 검출대상균(10)을 배출하며, 시료저장유닛(111), 미세방울형성유닛(112), 오일배출유닛(113) 및 미세방울이송유닛(114)를 포함한다.The
상기 시료저장유닛(111)은 상기 시료 및 상기 검출대상균(10)을 수용하도록 마련될 수 있다. 여기서, 상기 시료저장유닛(111)에 수용된 상기 검출대상균(10)은 살모넬라균(Salmonella), 대장균 E. coli O157:H7을 포함한 병원균을 지칭할 수 있다.The
또한, 상기 시료는 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 PCR시약을 포함하며, 일 예로, 아가로스 겔 전기 영동법을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우, 상기 시료는 아가로스 겔(Agarose gel)일 수 있다. 형광 현미경을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우에는 상기 시료가 아가로스 겔로 한정되지 않으며, PCR시약을 모두 포함할 수 있다.In addition, the sample includes a PCR reagent for PCR (PCR). For example, when the
보다 구체적으로, 상기 PCR 시약에는 상기 검출대상균(10)과 대응되는 순방향 및 역방향 프라이머가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 검출대상균(10)이 대장균 E. coli O157:H7인 경우, 순방향 프라이머는 5'-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3'이고 역방향 프라이머는 384 bp 단편을 증폭하는 5'-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3'일 수 있다. 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균인 경우, 순방향 프라이머는 5'-AAA ACA TAT GCT GGA CCA ACT GGA AGC-3 '이고, 역방향 프라이머는 113bp 단편을 증폭하는 5'-GTT CGC TTA ACA AAC GCT GCA AAA CTT-3'일 수 있다. More specifically, the PCR reagent may include forward and reverse primers corresponding to the
상기 시료에는 상기 검출대상균(10) 내 다중유전자(20)와 결합되는 형광물질(F)이 더 포함될 수 있다. 그리고, 상기 형광물질(F)의 종류는 상기 다중유전자(20)의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함될 수 있다.The sample may further include a fluorescent substance (F) that binds to the multiple gene (20) in the detection target bacteria (10). The type of the fluorescent material F may be included in the sample so as to correspond one-to-one with the types of the
일 예로, 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균 하나인 경우, 상기 시료에는 상기 살모넬라균의 다중유전자(20)와 결합될 수 있는 하나의 형광물질(F)만 포함될 수 있다. 그러나, 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균 및 대장균 E. coli O157:H인 경우, 상기 시료에는 살모넬라균 및 대장균 E. coli O157:H7 각각의 다중유전자(20)와 결합될 수 있도록 두 개의 형광물질(F)이 포함될 수 있다. 이때, 복수의 종류로 마련된 상기 형광물질(F)은 서로 다른 색을 갖도록 마련될 수 있다.For example, when the
상기 미세방울형성유닛(112)은 상기 시료저장유닛(111)의 일단에 마련되며, 상기 시료저장유닛(111)에 비해 상대적으로 단면적이 작게 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 미세방울형성유닛(112)은 상기 시료저장유닛(111)의 일단으로부터 연장되어 형성되되, 점차 단면적이 작아지도록 형성될 수 있다. The fine
상기 오일배출유닛(113)은 상기 미세방울형성유닛(112)의 일측 또는 양측에 마련되며, 상기 미세방울형성유닛(112)에 오일을 배출하도록 마련될 수 있다.The
상기 미세방울이송유닛(114)은 상기 미세방울형성유닛(112)을 통과하면서 형성된 상기 미세방울(D)을 상기 증폭검출부(120)로 이송할 수 있다.The fine
상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛(112)을 향해 배출됨으로써, 도 2에 도시된 것처럼, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛(112)을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이룰 수 있다.The sample and the oil are discharged toward the fine
그리고, 도 3에 도시된 것처럼, 상기 미세방울(D) 중 일부에는 상기 시료에 포함되어 있던 상기 검출대상균(10)이 수용될 수 있다. 즉, 상기 검출대상균(10)이 많을수록 더 많은 미세방울(D)에 검출대상균(10)이 수용될 수 있다. 3, the
보다 구체적으로, 상기 미세방울(D)은 50 내지 200 μm의 평균 직경을 갖도록 마련됨이 바람직하며, 이를 위해, 상기 미세방울형성유닛(112)으로 배출되는 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20μm/min일 수 있다. More specifically, it is preferable that the fine droplets D are formed to have an average diameter of 50 to 200 μm. For this purpose, the flow rate of the sample discharged to the fine
상기 시료와 상기 오일의 유속이 상기 범위를 벗어날 경우, 상기 미세방울(D)의 평균 직경은 50 내지 200μm를 만족하지 못하며, 중합효소연쇄반응(PCR)이 활발히 이루어지지 못해 정확한 다중유전자(20) 검출이 이루어지지 못할 수 있다. When the flow rate of the sample and the oil is out of the above range, the average diameter of the fine droplets (D) does not satisfy the range of 50 to 200 탆. Since the polymerase chain reaction (PCR) Detection may not be achieved.
그리고, 상기 미세방울(D)의 평균 직경이 상술한 범위를 초과할 경우, 각 미세방울(D)에 상기 검출대상균(10)이 복수개가 포함되어 다중유전자(20)를 정량적으로 정확하게 검출하기 어려울 수 있으며, 평균 직경이 상술한 범위 미만일 경우, 각 미세방울(D)이 상기 검출대상균(10)보다 작아, 상기 검출대상균(10)의 검출이 이루어지지 않을 수도 있다.When the average diameter of the micro droplets D exceeds the above range, a plurality of the
상기 증폭검출부(120)는 상기 캡슐부(110)로부터 배출된 상기 검출대상균(10) 내 다중유전자(20)를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자(20)를 검출할 수 있다. The
구체적으로, 상기 증폭검출부(120)는, 상기 미세방울(D) 내 검출대상균(10)을 용해하여 다중유전자(20)를 추출하고, 추출된 상기 다중유전자(20)에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 다중유전자(20)를 증폭시킬 수 있다.Specifically, the
그리고, 상기 증폭검출부(120)는 증폭된 상기 다중유전자(20)를 겔 전기 영동 분석법 또는 형광 현미경을 통하여 검출할 수 있다.The
이하, 상술하나 바와 같이 마련된 상기 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치(100)의 분석방법을 설명하도록 한다.Hereinafter, an analysis method of the multi-gene digital
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 순서도이다.4 is a flowchart of a method of analyzing a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
도 4에 도시된 것처럼, 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법은 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계(S110), 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계(S120) 및 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)를 포함한다.As shown in FIG. 4, a method for analyzing a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device includes the steps of discharging the sample in the form of a droplet (S110), dissolving the microorganism to be detected in the micro- Extracting the extracted multiple genes (S120), and detecting the amplified multiple genes (S130).
상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계(S110)에서, 상기 시료는 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 PCR시약을 포함하며, 일 예로, 아가로스 겔 전기 영동법을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우, 상기 시료는 아가로스 겔(Agarose gel)일 수 있다. 형광 현미경을 이용하여 상기 검출대상균(10) 내 유전자(20)를 검출하고자 할 경우에는 상기 시료가 아가로스 겔로 한정되지 않으며, PCR시약을 모두 포함할 수 있다.In the step of discharging the sample in the form of a droplet (S110), the sample includes a PCR reagent for PCR (PCR). For example, the sample to be detected 10 (10) is detected by agarose gel electrophoresis ) Gene (20), the sample may be an agarose gel. When the
보다 구체적으로, 상기 PCR 시약에는 상기 검출대상균(10)과 대응되는 순방향 및 역방향 프라이머가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 검출대상균(10)이 대장균 E. coli O157:H인 경우, 순방향 프라이머는 5'-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3'이고 역방향 프라이머는 384 bp 단편을 증폭하는 5'-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3일 수 있다. 상기 검출대상균(10)이 살모넬라균인 경우, 순방향 프라이머는 5'-AAA ACA TAT GCT GGA CCA ACT GGA AGC-3 '이고, 역방향 프라이머는 113bp 단편을 증폭하는 5'-GTT CGC TTA ACA AAC GCT GCA AAA CTT-3'일 수 있다. More specifically, the PCR reagent may include forward and reverse primers corresponding to the
상기 시료에는 상기 검출대상균(10) 내 다중유전자(20)와 결합되는 형광물질(F)이 더 포함될 수 있다. 그리고, 상기 형광물질(F)의 종류는 상기 다중유전자(20)의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함될 수 있다.The sample may further include a fluorescent substance (F) that binds to the multiple gene (20) in the detection target bacteria (10). The type of the fluorescent material F may be included in the sample so as to correspond one-to-one with the types of the
상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계(S110)에서, 상기 캡슐부(110)는 상기 시료를 미세방울(D)형태로 상기 증폭검출부(120)를 향해 배출할 수 있다. 여기서, 미세방울(D)을 형성하기 위해 상기 미세방울형성유닛(112)으로 배출되는 상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20μm/min일 수 있다.In the step of discharging the sample in the form of a droplet (S110), the
상기와 같이, 상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛(112)을 향해 배출됨으로써, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛(112)을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이룰 수 있다. As described above, the sample and the oil are discharged toward the fine
그리고, 상기 미세방울(D) 중 일부에는 상기 시료에 포함되어 있던 상기 검출대상균(10)이 수용될 수 있다. 즉, 상기 검출대상균(10)이 많을수록 더 많은 미세방울(D)에 검출대상균(10)이 수용될 수 있다.A part of the fine droplets D may contain the
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법의 증폭하는 단계를 구체화한 순서도이고, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 증폭하는 단계를 나타낸 예시도이다.FIG. 5 is a flowchart illustrating an amplifying step of an analyzing method of a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention. FIG. 6 is a flowchart illustrating an amplifying step according to an embodiment of the present invention. Fig.
상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계(S120)는 상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계(S121), 변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계(S122) 및 형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계(S123)를 포함한다.(S120) of dissolving the microorganism to be detected in the micro-droplet and extracting the multiple genes and amplifying the extracted multi-genes (S120) comprises the step of dissolving the microorganism to be detected and extracting the multiple genes and denaturing the multiple genes (S121), the denatured multiple genes are separated into a pair, a fluorescent substance is bound to a separated pair of separated genes (S122), and each separated gene having a fluorescent substance is annealed (Step S123).
상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계(S121)에서, 상기 증폭검출부(120)는, 상기 미세방울(D)을 90 내지 100℃에서 15분 내지 25분간 가열하여 상기 미세방울 내 검출대상균(10)을 용해하여 상기 다중유전자(20)를 추출할 수 있다. In the step S121 in which the microorganism to be detected is dissolved and the multiple genes are extracted and the multiple genes are denatured, the
그리고, 도 6의 (a), (b)에 도시된 것처럼, 추출된 상기 다중유전자(20)는 열에 의해 변성되며, 변성된 상기 다중유전자(20)의 내부로 상기 시료에 포함되있던 형광물질(F)이 침투할 수 있다.6 (a) and 6 (b), the extracted
변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계(S122)에서, 상기 증폭검출부(120)는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 25 내지 35 초, 60 내지 68℃에서 55초 내지 65초씩 총40회 반복 가열하여 상기 변성된 상기 다중유전자(20)를 한 쌍으로 분리시킬 수 있다. 그리고, 분리된 한 쌍의 분리유전자(30)에는 도 6의 (b) 및 (c)에 도시된 것처럼 상기 형광물질(F)이 결합될 수 있다. In the step S122 in which the denatured multiple genes are separated into a pair and a fluorescent substance is bound to a separated pair of separation genes, the
형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계(S123)에서, 상기 증폭검출부(120)는, 도 6의 (c) 및 (d)에 도시된 것처럼, 상기 미세방울(D)을 90 내지 100℃에서 290초 내지 310초간 가열하여 상기 분리유전자(30)의 두가닥복원을 수행함으로써, 상기 다중유전자(20)를 증폭시킬 수 있다.6 (c) and 6 (d), in the step S123 in which each of the separated genes to which the fluorescent substance is bound is restored and amplified into multiple genes by two strand annealing, , The
상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)에서는 상기 미세방울(D) 내 상기 다중유전자(20)를 검출할 수 있다.In the step of detecting the amplified multiple genes (S130), the multiple genes (20) in the micro droplets (D) can be detected.
구체적으로, 상기 시료에 아가로스 겔이 포함된 경우, 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)에서, 상기 다중유전자(20)는 아가로스 겔 전기 영동 분석법에 의해 검출이 이루어질 수 있다.Specifically, when the sample contains agarose gel, the
상기 시료에 형광물질이 포함된 경우, 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계(S130)에서, 도 3에 도시된 것처럼, 상기 다중유전자(20)는 형광 현미경을 이용하여 검출이 이루어질 수 있다.In the case where the fluorescent material is included in the sample, in step S130 of detecting the amplified multiple gene, as shown in FIG. 3, the
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 복수의 검출대상균을 분석하기 위한 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 예시도이다.FIG. 7 is an illustration of an apparatus for analyzing multiple gene digital signals using a microfluidic device for analyzing a plurality of detection target bacteria according to an embodiment of the present invention. FIG.
도 7에 도시된 것처럼, 상기 시료에 복수의 종류의 검출대상균(10)이 포함된 경우, 상기 다중유전자(20)의 종류와 대응되는 종류의 형광물질(F)이 시료에 포함되어 상기 다중유전자(20)의 종류에 따른 형광물질이 검출될 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, 여러 종류의 검출대상균(10)의 존재 유무를 동시에 검출하는 것이 가능하다.7, when a plurality of types of
도 8 은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 결과와 종래예를 대비한 예시도이다. 도 8의 (a)는 종래예에 따른 중합효소연쇄반응을 통한 다중유전자 분석방법 결과를 나타낸 예시도이고, 도 8의 (b)는 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 결과를 나타낸 예시도이다.FIG. 8 is a diagram illustrating results of an apparatus and method for analyzing multi-gene digital signals using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention and a conventional example. FIG. 8 (a) is an illustration showing the result of a multiple gene analysis method using a polymerase chain reaction according to a conventional example, and FIG. 8 (b) And an analysis method of the present invention.
도 8의 (a)에 도시된 것처럼, 종래예에 따른 중합효소연쇄반응은 용액 대비 병원균의 농도가103 cells 이하일 때는 증폭이 이루어지지 않아 병원균의 검출이 이루어지지 못했다.As shown in FIG. 8 (a), when the concentration of the pathogen at a concentration of 10 3 cells or less in comparison with the solution was not amplified, the PCR was not able to detect the pathogen.
또한, 종래예에 따른 병원균 검출 방법은, 극미량의 병원균에 대해서 검출이 불가능할 뿐만 아니라, 병원균이 극미량이 아닐 때에도, 동시에 여러 종류의 병원균을 신속하고 정확하게 검출하기 어려웠다.In addition, the pathogen detection method according to the conventional example is not only impossible to detect a very small amount of pathogens, but also it is difficult to detect various kinds of pathogens quickly and accurately even when the pathogens are not very small.
구체적으로, 증폭된 병원균이 포함된 시료에 형광물질을 넣은 후에 이를 분석할 경우, 각 병원균이 서로 무질서하게 섞여 있기 때문에 각 병원균에 결합된 형광색이 뚜렷하게 구분되지 않았다. 일 예로, 병원균 A 및 병원균B와 결합되는 각각의 형광물질이 빨간색과 노란색인 경우, 병원균 A와 B가 섞여서 위치한 부분은 빨간색과 노란색이 검출되지 않고 주황색이 검출될 수 있다. 또한, 병원균 A와 병원균 B가 섞여있는 비율에 따라 주황색의 명도도 달라지게 된다.Specifically, when a fluorescent substance is added to a sample containing an amplified pathogen, fluorescence of each pathogen is not clearly distinguished because each pathogen is randomly mixed with each other. For example, when each of the fluorescent substances associated with the pathogen A and the pathogen B is red and yellow, the portion where the pathogens A and B are mixed may not be detected in red or yellow and orange may be detected. In addition, depending on the ratio of pathogen A and pathogen B, the lightness of orange is also different.
즉, 종래의 병원균 검출 방법은, 서로 다른 종류의 병원균이 각각 분리되어 위치하지 않고 섞여있는 상태에서 검출이 이루어지도록 마련되기 때문에 각 병원균을 정량적으로 신속하게 분석하기 어려웠다. That is, in the conventional pathogen detection method, it is difficult to quantitatively and quickly analyze each pathogen since the detection is performed in a state in which different kinds of pathogens are separately isolated and mixed.
반면에, 도 8의 (b)에 도시된 것처럼, 본 발명에 따르면 각 미세방울(D)에 상기 검출대상균(10)을 수용시키고, 각 미세방울(D) 내에서 상기 검출대상균(10) 내 상기 다중유전자(20)의 증폭을 수행함으로써, 신속한 증폭이 이루어질 수 있다. 그리고, 특히, 특정 영역에 증폭된 다중유전자(20)가 밀집하여 위치하기 때문에 상기 다중유전자(20)의 위치에 따른 신호가 증폭되어 겔 전기 영동법 또는 형광 현미경을 이용한 분석시 다중유전자(20)의 검출이 용이하다.On the other hand, as shown in FIG. 8 (b), according to the present invention, the microorganism to be detected 10 is contained in each fine droplet D, ) Amplification of the above-mentioned multiple gene (20). In particular, since the amplified
또한, 본 발명에 따르면, 상기 다중유전자(20)의 종류와 대응되는 종류의 형광물질(F)이 시료에 포함될 경우, 상기 다중유전자(20)의 종류에 따른 형광물질이 검출될 수 있음을 알 수 있다. 그리고, 복수의 종류가 동시에 미세방울(D) 내에 존재할 경우에도, 이에 대응되는 색으로 형광색이 나타나기 때문에 복수의 다중유전자(20)를 검출하기 용이하다.In addition, according to the present invention, when a fluorescent substance (F) of a kind corresponding to the type of the multiple gene (20) is included in a sample, it is determined that a fluorescent substance according to the type of the multiple gene . Even when a plurality of species are simultaneously present in the fine droplets D, fluorescence colors appear in the corresponding colors, so that it is easy to detect a plurality of
이처럼, 본 발명에 따르면, 상기 미세방울(D)에 각 검출대상균(10)이 수용되기 때문에 미세방울(D) 수에 따른 검출대상균(10)의 정량적 검출이 가능하며, 여러 종류의 검출대상균(10)이 포함된 경우에도 정량적 검출이 가능하다.As described above, according to the present invention, since the microorganisms to be detected 10 are contained in the fine droplets D, it is possible to quantitatively detect the microorganisms to be detected 10 according to the number of micro droplets D, Even when the
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 검출결과를 겔 전기 영동법으로 나타낸 예시도이다.FIG. 9 is an exemplary view showing a result of detection of a multi-gene digital signal analyzing apparatus and analysis method using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention by gel electrophoresis.
도 9의 (a)는 종래의 방법으로 증폭을 수행한 대장균 E. coli O157:H7의 겔 전기 영동법 결과이고, 도 9의 (b)는 일실시예에 따른 방법으로 증폭을 수행한 대장균 E. coli O157:H7의 겔 전기 영동법 결과를 나타낸 것이다.Of Figure 9 (a) is performed by amplification in a conventional manner E. coli E. coli O157: a gel electrophoresis results of the H7, (b) of Figure 9 is the E. coli to amplify the method according to one embodiment E. The results of gel electrophoresis of E. coli O157: H7 are shown.
도 9의 (c)는 종래의 방법으로 증폭을 수행한 살모넬라균의 겔 전기 영동법 결과이고, 도 9의 (d)는 일실시예에 따른 방법으로 증폭을 수행한 살모넬라균의 겔 전기 영동법 결과를 나타낸 것이다.FIG. 9 (c) is the result of gel electrophoresis of the Salmonella strain amplified by the conventional method, and FIG. 9 (d) shows the result of the gel electrophoresis of the Salmonella strain amplified by the method according to one embodiment .
도 9에 도시된 것처럼, 종래의 방법에 비해 본 발명에 따른 방법이 신호가 더 강함을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 9, it can be seen that the method according to the present invention is stronger than the conventional method.
도 10 은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별 형광신호검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다.FIG. 10 is an exemplary diagram showing fluorescence signal detection results of a multi-gene digital signal analyzer and analysis method using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention, using a fluorescence microscope.
구체적으로, 도 10의 (a)는 E. coli O157:H7의 형광신호검출 결과를 나타낸 것이고, 도 10의 (b)는 살모넬라균의 형광신호검출 결과를 나타낸 것이다.Specifically, FIG. 10 (a) shows the fluorescence signal detection result of E. coli O157: H7, and FIG. 10 (b) shows the fluorescence signal detection result of Salmonella.
도 10에 도시된 것처럼, 본 발명에 따르면 상기 다중유전자(20)가 특정 위치에 밀집되어 신호를 발산하기 때문에 다중유전자(20)가 흩어져 있을 때는 검출되지 않는 형광신호도 분명하게 검출할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면 보다 신속하고 정확하게 검출대상균(10)의 존재 유무를 분석할 수 있다.As shown in FIG. 10, according to the present invention, since the
또한, 본 발명에 따르면, 각 미세방울(D)에 각 검출대상균(10)이 위치하기 때문에 형광신호가 나타나는 각 미세방울(D)의 숫자를 헤아림으로써, 정량적으로 검출대상균(10)의 숫자를 파악할 수 있다. 즉, 검출대상균(10)의 양에 따른 균 감염 위험도를 보다 정확하게 파악할 수 있다. According to the present invention, since the respective
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치 및 분석방법의 개별형광신호 및 복합형광신호 검출결과를 형광 현미경을 이용하여 나타낸 예시도이다FIG. 11 is a graph showing the results of detection of individual fluorescence signals and complex fluorescence signals in a multi-gene digital signal analysis apparatus and method using a microfluidic device according to an embodiment of the present invention, using a fluorescence microscope
도 11의 (a) 는 E. coli O157:H7의 형광신호를 검출한 것이고, 도 11의 (b)는 살모넬라균의 형광신호를 검출한 것이며, 도 11의 (c)는 E. coli O157:H7과 살모넬라균이 혼합된 상태의 시료에 대한 형광신호를 검출한 것이다.(A) of Figure 11 E. coli O157: one will detect the fluorescent signal of the H7, (b) of Figure 11 shows a modification of detecting the fluorescent signal of the Salmonella, (c) of Figure 11 E. coli O157: H7 and salmonella were mixed with each other.
도 11의 (c)에 도시된 것처럼, 본 발명에 따르면, 여러 종류의 검출대상균이 혼합된 경우에도 개별적으로 존재할 때의 형광색과, 복수의 검출대상균이 동일 미세방울내에 존재할 때의 형광색이 다르기 때문에 정확하게 정량적으로 검출대상균을 검출할 수 있다.As shown in Fig. 11 (c), according to the present invention, even when a plurality of kinds of detection target bacteria are mixed, the fluorescence color when they exist separately and the fluorescent color when a plurality of detection subject bacteria are present in the same fine bubbles The detection target bacteria can be detected accurately and quantitatively.
전술한 바와 같이 마련된 본 발명은 다중유전자 검출기에 적용될 수 있다.The present invention as described above can be applied to a multiple gene detector.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included within the scope of the present invention.
100: 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치
110: 캡슐부
111: 시료저장유닛
112: 미세방울형성유닛
113: 오일배출유닛
114: 미세방울이송유닛
120: 증폭검출부
10: 검출대상균
20: 다중유전자
30: 분리유전자100: Multigene digital signal analysis device using microfluidic device
110: Capsule part
111: sample storage unit
112: fine droplet forming unit
113: Oil discharge unit
114: fine droplet transfer unit
120: amplification detector
10: Detection target bacteria
20: Multiple genes
30: Separation gene
Claims (17)
상기 캡슐부로부터 배출된 상기 검출대상균 내 다중유전자를 증폭하고, 증폭된 상기 다중유전자를 검출하는 증폭검출부를 포함하며,
상기 캡슐부는 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하며, 상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.A capsule portion for discharging the sample and the bacteria to be detected; And
And an amplification detector for amplifying the multiple genes in the bacterium to be detected emitted from the capsule and detecting the amplified multiple genes,
Wherein the capsule unit discharges the sample in the form of a fine droplet, and a part of the micro-droplet contains the detection subject microorganism.
상기 캡슐부는,
상기 시료 및 상기 검출대상균이 수용되는 시료저장유닛;
상기 시료저장유닛의 일단에 마련되며, 상기 시료저장유닛에 비해 상대적으로 단면적이 작게 형성된 미세방울형성유닛;
상기 미세방울형성유닛의 일측 또는 양측에 마련되며, 상기 미세방울형성유닛에 오일을 배출하는 오일배출유닛; 및
상기 미세방울형성유닛을 통과한 상기 미세방울을 상기 증폭검출부로 이송하는 미세방울이송유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.The method according to claim 1,
The capsule portion
A sample storage unit for storing the sample and the detection target bacteria;
A fine droplet forming unit provided at one end of the sample storage unit and having a smaller cross-sectional area than the sample storage unit;
An oil discharge unit provided at one side or both sides of the fine droplet forming unit and discharging oil to the fine droplet forming unit; And
And a fine droplet transfer unit for transferring the fine droplets having passed through the fine droplet forming unit to the amplification detecting unit.
상기 시료 및 상기 오일은 서로 다른 유속으로 상기 미세방울형성유닛을 향해 배출됨으로써, 상기 시료는 상기 미세방울형성유닛을 통과할 때 각각 독립적인 미세방울 형태를 이루는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.3. The method of claim 2,
Wherein the sample and the oil are discharged toward the fine droplet forming unit at different flow rates so that the sample forms an independent micro droplet when passing through the fine droplet forming unit. Gene digital signal analyzer.
상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 오일의 유속은 8 내지 20μm/min인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.The method of claim 3,
Wherein the flow rate of the sample is 0.8 to 5 μm / min, and the flow rate of the oil is 8 to 20 μm / min.
상기 증폭검출부는,
상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 다중유전자를 추출하고, 추출된 상기 다중유전자에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치.The method according to claim 1,
Wherein the amplification detection unit comprises:
Wherein the method comprises the steps of: (a) dissolving the microorganism to be detected in the micro-droplet to extract multiple genes, and (b) amplifying the multiple genes by performing PCR on the extracted multiple genes Digital signal analyzer.
a) 상기 시료를 미세방울 형태로 배출하는 단계;
b) 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하여 상기 다중유전자를 추출하고 추출된 상기 다중유전자를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 다중유전자를 검출하는 단계를 포함하며,
상기 a) 단계에서,
상기 미세방울 중 일부에는 상기 검출대상균이 수용된 상태인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.A method for analyzing a multi-gene digital signal analyzing apparatus using a microfluidic device according to claim 1,
a) discharging the sample in the form of a droplet;
b) dissolving the microorganism to be detected in the micro-droplet to extract the multiple genes and amplifying the extracted multiple genes; And
c) detecting the amplified multiple gene,
In the step a)
Wherein the detection target bacteria are contained in a part of the fine droplets.
상기 a) 단계에서,
상기 시료의 유속은 0.8 내지 5μm/min이고, 상기 시료와 함께 배출되는 오일의 유속은 8 내지 20μm/min인 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.The method according to claim 6,
In the step a)
Wherein the flow rate of the sample is 0.8 to 5 占 퐉 / min and the flow rate of the oil to be discharged together with the sample is 8 to 20 占 퐉 / min.
상기 b) 단계는,
b1) 상기 검출대상균이 용해되어 상기 다중유전자가 추출되고, 상기 다중유전자가 변성되는 단계;
b2) 변성된 상기 다중유전자가 한 쌍으로 분리되고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질이 결합되는 단계;
b3) 형광물질이 결합된 각각의 상기 분리유전자가 두가닥복원(annealing)에 의해 각각 다중유전자로 복원되어 증폭되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.The method according to claim 6,
The step b)
b1) the bacteria to be detected are dissolved to extract the multiple genes, and the multiple genes are denatured;
b2) the modified multiple genes are separated into a pair, and a fluorescent substance is bound to the separated pair of genes;
and b3) amplifying each of the separated genes to which the fluorescent substance is bound by restoring to multiple genes by two-strand annealing and amplifying the multiple genes.
상기 b1) 단계에서,
상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 15분 내지 25분간 가열하여 상기 미세방울 내 검출대상균을 용해하고, 상기 다중유전자를 변성시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.9. The method of claim 8,
In the step b1)
Wherein the amplification detecting unit is configured to heat the microdroplets at 90 to 100 DEG C for 15 to 25 minutes to dissolve the microorganism to be detected in the microdroplets to denature the multiple genes. Signal analysis method.
상기 b2) 단계에서,
상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 25 내지 35 초, 60 내지 68℃에서 55초 내지 65초씩 총40회 반복 가열하여 상기 변성된 상기 다중유전자를 한 쌍으로 분리시키고, 분리된 한 쌍의 분리유전자에 형광물질을 결합시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.9. The method of claim 8,
In the step b2)
The amplification detecting unit repeatedly heats the fine droplets at a temperature of 90 to 100 캜 for 25 to 35 seconds at 60 to 68 캜 for a total of 40 to 55 seconds to 65 seconds to isolate the denatured multiple genes as a pair, A method for analyzing multiple gene digital signals using a microfluidic device, characterized in that a fluorescent substance is bound to a pair of separated genes.
상기 b3) 단계에서,
상기 증폭검출부는, 상기 미세방울을 90 내지 100℃에서 290초 내지 310초간 가열하여 상기 분리유전자의 두가닥복원을 수행함으로써, 상기 다중유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.9. The method of claim 8,
In the step b3)
Wherein the amplification detecting unit amplifies the multiple gene by heating the fine droplet at 90 to 100 DEG C for 290 seconds to 310 seconds to perform double strand recovery of the separated gene. Signal analysis method.
상기 a) 단계에서,
상기 시료에는 상기 검출대상균 내 다중유전자와 결합되는 형광물질이 포함된 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.The method according to claim 6,
In the step a)
Wherein the sample contains a fluorescent substance that is bound to the multiple genes in the detection subject bacterium.
상기 a) 단계에서, 상기 형광물질의 종류는 상기 다중유전자의 종류와 일대일 대응되도록 상기 시료에 포함되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석방법.13. The method of claim 12,
Wherein the type of the fluorescent material is included in the sample in a one-to-one correspondence with the types of the multiple genes in the step a).
상기 a) 단계에서,
상기 검출대상균은 복수로 마련되며, 상기 형광물질을 서로 다른 형광색을 띄도록 마련되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법.14. The method of claim 13,
In the step a)
Wherein the plurality of microorganisms to be detected are provided, and the fluorescent material is provided to have different fluorescence colors.
상기 c) 단계는,
상기 형광 현미경을 이용하여 상기 미세방울 내 다중유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 다중유전자 디지털 신호 분석장치의 분석방법.13. The method of claim 12,
The step c)
And detecting the multiple genes in the micro-droplet by using the fluorescence microscope.
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |