KR20180122068A - 피부주름 개선물질을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피부주름의 생성에 관여하는 NFATc1 단백질의 탈인산화을 확인함으로써, 피부주름개선 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 피부주름개선 물질을 효과적으로 스크리닝하여 피부주름개선 물질의 개발에 이용할 수 있으며, 본 발명에서 확인한 결과를 바탕으로 피부주름개선의 메커니즘을 보다 효과적으로 연구할 수 있는 장점이 있다.

Description

피부주름 개선물질을 스크리닝하는 방법{Method for Screening Substance for Improving Skin Condition}
본 발명은 피부주름 개선물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 피부섬유아세포에서 NFATc1 단백질의 탈인산화를 확인함으로써, 피부주름 개선물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
피부 주름은 피부 수분함량, 콜라겐 함량 및 외부 환경에 대한 면역력 등 여러 가지 요소들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량 및 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현과 활성이다.
콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진되고 있다.
한편, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과생산은 UVB 노출 환경에서 보고된 바 있고, UVB 노출과 연관된 신호전달 체계는 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 카이나아제, 및 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질과 관련되어 있는데, NF-ĸB 및 AP-1 전사인자의 발현증가를 유도한다. 또한, AP-1 단백질은 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자의 활성과 관련되어 있고, NF-ĸB 단백질은 인터루킨과 같은 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 발현에 영향을 미친다.
노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다. 또한, 전염증 사이토카인은 콜라겐의 합성을 방해하고, 콜라겐의 붕괴를 촉진시킨다. 타입 I 콜라겐은 연결 조직의 세포외 기질에서 가장 풍부한 단백질이다. 세포외기질에는 타입 III, V, 및 VII 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 파이브로넥틴과 같은 다른 유형의 단백질을 포함한다.
타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광노화를 예방하는데 있어서 가장 중요한 인자이다. UVB의 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다.
따라서, AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성, 및 MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용하는 것으로 기존에 알려져 있다.
이와 같이 콜라겐 감소를 저해하여 피부 주름개선에 효과가 있는 천연물질을 탐색하고자 하는 여러 다양한 시도가 있었다. 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐합성 촉진물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP08-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP08-208424), 클로렐라 추출물(JP09-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다.
그러나 상기 물질은 피부 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나 그 효과가 미미하여 실질적으로 주름개선 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있었다. 따라서, 종래 주름개선용 조성물보다 생체에 안전하고 주름개선 효과가 높은 새로운 주름개선 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 전사인자 NFAT(nuclear factor of activated T cells) 단백질은 IL-2 프로모터에 결합하여 전사를 촉진하는 것으로 1988년 밝혀진 이후, 현재까지 5종의 단백질이 확인되었다. 즉, NFAT 단백질 패밀리는 NFAT1(NFATp 또는 NFATc2), NFAT2 (NFATc 또는 NFATc1), NFAT3(NFATc4), NFAT4(NFATx 또는 NFATc3) 및 NFAT5으로 구성되어 있다. NFAT 단백질의 가장 중요한 기능은 면역세포의 분화와 면역반응의 조절로 알려져 있다. T 면역세포에서, NFAT 단백질은 ⅰ) 흉선세포(thymocytes)의 발달, ⅱ) T 세포 분화, ⅲ) 자가면역내성(self-tolerance) 등의 활성 및 조절에 관여한다. NFAT 단백질 패밀리는 복잡한 작용기전으로 면역반응에 관여하며, 특히 칼슘 시그널링과 다른 시그널링의 상호작용에 의해 면역반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아직까지 NFAT 단백질 패밀리의 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자 발현 등 피부주름 생성 억제와 관련한 연구는 전무한 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부주름 개선 효과를 가진다고 알려진 다양한 천연 식물소재들을 대상으로 피부주름 개선 효과를 나타낼 수 있는 다양한 기전에 대해 밝히기 위하여 예의 노력한 결과, 주름개선에 효과가 있는 천연 식물소재 및 그 유효성분들이 UVB 조사된 인간 피부섬유아세포에서 NFATc1 단백질의 탈인산화를 저해하고, 그러한 경향은 피부주름생성에 직접적인 영향을 주는 MMP 단백질의 발현의 저해 경향과 직접적인 상관관계가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 피부섬유아세포에서 NFATc1 단백질의 탈인산화를 확인하여, 상기 NFATc1 단백질의 탈인산화가 저해되는 경우 피부주름개선물질로 판단하는, 피부주름개선물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인간 피부섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblasts)에 피부주름개선 후보물질을 처리하고 자외선을 조사하는 단계; (b) 상기 인간 피부섬유아세포의 세포질에서 NFATc1 단백질의 탈인산화를 확인하는 단계; (c) 상기 NFATc1 단백질의 탈인산화가 저해되는 경우 상기 피부주름개선 후보물질을 피부주름개선물질로 판단하는 단계;를 포함하는, 피부주름 개선물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "피부 주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.
본 발명에서 "피부주름개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하시키게 된다. 피부 세포외기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 제I형 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소되고, 이에 따라 표면 장력이 감소되어 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다.
따라서, 피부섬유아세포의 콜라겐은 피부 재생, 피부 탄력, 피부 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다고 볼 수 있다.
즉, 피부 섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.
상기 용어 "탈인산화(dephosphorylation)"는 하나의 화합물에서 다른 화합물로 인산기를 전이시키는 반응을 말한다. 상기 NFATc1 단백질의 탈인산화는 칼슘/칼시뉴린(calcium/calcineurin) 신호전달체계에 의해 활성화된 칼시뉴린 단백질에 내재된 인산가수분해효소(phosphatase)에 의해 탈인산화 되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "후보물질"은 상기 피부주름개선 효과 및 기능을 나타낼 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 피부주름개선 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 가능 예상물질을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 천연소재물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 쐐기풀 및 그 유효성분인 카페인산과 클로로겐산을 통하여 본 발명의 스크리닝 방법이 유효함을 확인하였다. 본 발명의 스크리닝 방법에서는 상기 NFATc1 단백질의 탈인산화가 저해되는 경우 피부주름개선 물질로 결정할 수 있다.
본 발명자들은 쐐기풀(Urtica thunbergiana)의 피부 주름개선 효과를 검증하는 과정에서, 쐐기풀과 그 유효성분인 클로로겐산(chlorogenic acid)이 콜라겐 분해 효소인 MMP-1 및 MMP-3의 발현을 억제하고, 타입 1 프로콜라겐의 mRNA 발현을 유의하게 증가시키며, AP-1 신호전달체계의 활성화를 억제하고, 이를 통해 세포외 기질을 구성하는 단백질을 분해하는 MMP 단백질이나 인터루킨의 생성을 저해하며, AP-1 신호전달체계, MAPK 신호전달체계, 및 NF-kB 신호전달체계를 통해 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 상기 AP-1 신호전달체계, MAPK 신호전달체계, 및 NF-kB 신호전달체계와 별개로, 쐐기풀과 그 유효성분인 클로로겐산(chlorogenic acid)이 칼시뉴린의 억제제인 타크롤리머스(tacrolimus)와 유사한 정도로 NFATc1 단백질의 탈인산화를 억제함을 확인하였고, 이를 통해 피부주름개선 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
상기 NFATc1 단백질은 칼슘/칼시뉴린(calcium/calcineurin) 신호전달체계에 의해 탈인산화가 진행되는데, 보통세포 상태에서는 NFATc1 단백질이 인산화된 상태로 세포질에 존재하며, 인산화된 상태에서는 매우 낮은 상태의 DNA 결합 능력을 갖는다. 그러나, 세포질 내에 칼슘 농도가 증가하게 되면 칼시뉴린이 활성화되게 되고, 활성화된 칼시뉴린에 내재된 인산가수분해효소(phosphatase)에 의해 NFATc1 단백질이 탈인산화되고, 탈인산화된 NFATc1 단백질은 핵으로 이동하여 c-Jun 및 AP-1 단백질의 인산화를 촉진시키고, 피부주름을 생성시키는 콜라겐 분해 효소인 MMP-1, MMP-3, 및 MMP-9 단백질의 발현을 증가시키고, 타입 1 프로콜라겐의 mRNA 발현을 감소시키게 된다.
따라서, 본 발명의 피부주름개선 물질의 스크리닝 방법은 상기 인간 피부섬유아세포의 세포질에서 NFATc1 단백질의 탈인산화를 확인하는 단계를 포함한다. 이에 따라, NFATc1 단백질의 탈인산화가 저해되는 경우 상기 피부주름개선 후보물질을 피부주름개선물질로 판단할 수 있다. 상기 단계에서는 추가적으로 상기 탈인산화된 NFATc1 단백질이 세포질에서 핵으로 이동하는 것을 확인를 포함할 수 있다.
이러한 단계를 추가적으로 포함함으로써, 피부주름개선 물질의 판단을 보다 정확하게 할 수 있으며, NFATc1 단백질의 탈인산화와 콜라겐 분해 효소인 MMP-1, MMP-3, 및 MMP-9 단백질의 발현과의 관계를 보다 명확하게 확인하여 그 신뢰도를 높일 수 있다.
한편, 상기 타크롤리머스(tacrolimus)는 칼시뉴린의 억제제로 칼시뉴린에 내재된 인산가수분해효소(phosphatase) 활성을 억제하는 것으로 알려져 있으며(Sieber, M., Karanik, M., Brandt, C., Blex, C., et al., 2007, Inhibition of calcineurin NFAT signaling by the pyrazolopyrimidine compound NCI3., European Journal of Immunology, 37, 2617-2626), 최근에는 코티코스테로이드의 처방에 내성이 있는 아토피 환자에게, 타크롤리머스(tacrolimus)의 투여가 효과가 있다는 연구 결과가 알려져 있다(Russell, J. J., 2002, Topical tacrolimus: a new therapy for atopic dermatitis. American Family Physician, 66, 1899-1902).
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 피부주름 개선에 효과가 있는 물질을 탐색하는 경우에, 피부 아토피 치료에 효과가 있는 물질을 동시에 탐색할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서 탐색된 피부주름개선 물질은 천연소재를 대상으로 하므로, 아토피 치료에 있어서 타크롤리머스에서 나타나는 두통, 기침 등의 부작용을 최소화 할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 피부주름개선 물질을 효과적으로 스크리닝하여 피부주름개선 물질의 개발에 이용할 수 있으며, 본 발명에서 확인한 결과를 바탕으로 피부주름개선의 메커니즘을 보다 효과적으로 연구할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 스크리닝 방법에 관여하는 신호전달체계를 나타내는 모식도이다.
도 2는 쐐기풀 추출물의 HPLC 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 인간섬유아세포에서 UVB 조사 유무 및 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 세포 생존률을 측정한 그래프이다.
도 4는 인간섬유아세포에서 UVB 조사 유무 및 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 MMP-1 및 MMP-3 유전자자 발현 변화에 대한 RT-PCR 측정 그래프이다.
도 5는 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 MMP-1 단백질의 발현양상을 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 6은 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 MMP-3 단백질의 발현양상을 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 7은 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 타입-1 프로콜라겐 단백질의 발현양상을 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 8은 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 IL-6 단백질의 발현양상을 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 9는 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 TGF-β1 단백질의 발현양상을 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 10은 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 c-Jun과 c-Fos 단백질의 인산화 변화를 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 11은 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 ERK, p38, 및 JNK 단백질의 인산화 변화를 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 12는 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 NFATc1 단백질의 인산화 변화를 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 13은 인간섬유아세포에서 쐐기풀 추출물과 클로로겐산처리 유무에 따른 NFATc1 단백질의 인산화 변화를 핵과 세포질에서 측정한 ELISA 어세이 결과이다.
도 14는 인간섬유아세포에서 타크롤리머스 처리에 따른 NFATc1 단백질의 인산화 변화를 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
도 15는 인간섬유아세포에서 타크롤리머스 및 클로로겐산 처리에 따른 NFATc1 단백질의 인산화 변화를 나타내는 ELISA 어세이 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 . 실험재료 및 방법
1. 화합물
DMEM, FBS(fetal bovine serum), 및 항생제(penicillin, streptomycin)는 Gibco(Grand Island, NY, USA) 사에서 구입하여 사용하였다. MTT[3-(4, 5- Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide], DMSO, CGA(chlorogenic acid), 및 CA(caffeic acid)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 유기농 쐐기풀은 루바마 네이쳐(Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 구입하여 사용하였다. 프로콜라겐 타입-1에 대한 ELISA kit는 Takara(procollagen type 1 C-Peptide ELISA Kit; Takara Bio, Otsu, Japan)에서 구입하였고, MMP-1, IL-6, 및 TGF-β1 키트에 대한 ELISA kit는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
유기용매는(hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol, 및 ethanol)은 삼천화학(Seoul, Korea) 및 대정 케미칼/메탈(Siheung, Korea)에서 구입하였고, 무기염은 Sigma-Aldrich에서, 실리카 겔은 Merck(Kenilworth, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다.
2. 샘플 처리
건조 중량 100g의 분쇄한 쐐기풀을 분쇄한 후, 50%(V/V) 에탄올 용액 1L로 24시간 동안 상온 추출하였다. 추출물을 여과지(Glassfiber, sartorius, 미국)로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 50℃ 이하에서 감압농축한 후 감압건조기(Eyela Rotary evaporator, Tokyo Rikakika Co.,LTD, 일본)를 이용해 완전히 건조시켜 쐐기풀 추출물을 수득하였다.
3. HPLC 분석
HPLC는 P580 및 UVD100 디텍터를 갖는 Dionex ChromeleonTM chromatography data system(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하였고, Waters Sunfire C18 chromatography column(250 × 4.6mm, 5μm particle size)을 사용하였다. 용출은 1% 포름산(formic acid)을 함유한 Methanol/Acetonitrile(3:1 gradient) 용매를 사용하여 수행하였다.
농도구배는 35분 동안 10%에서 90%로 점진적으로 증가시켰고, 인젝션 볼륨 10uL, 유속 1mL/min 으로 분석하였다.
4. 세포 배양
건강한 젊은 남성 지원자(MCTT Core사, 서울, 한국)를 선발하고, 피부 생검하여 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)들을 획득하였다. 세포들은 100-㎜조직 배양 플레이트에서 플레이팅 되었고, 5% CO2를 함유하는 습기 환경, 37℃ 에서 10%의 열-비활성화된 FBS 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지에서 배양되었다. 모든 실험은 오직 계대 10 세대를 넘지 않은 세포들을 사용하여 수행하였다.
5. UVB 조사 및 샘플 처리
UVB 조사 및 샘플 처리는 황 등의 실험 방법(Hwang, E., Park, S. Y., Lee, H. J., Lee, T. Y., et al., 2014, Gallic Acid Regulates Skin Photoaging in UVB-exposed Fibroblast and Hairless Mice, Phytotherapy Research 28, 1778-1788)에 따라 수행하였다.
정상 인간 진피 섬유아세포들은 35-㎜ 조직 배양 플레이트들(1.2×105 세포들)에 시드하였다. 정상 인간 진피 섬유아세포들이 80% 융합에 도달할 때, 인산 완충 식염수(PBS)로 두 차례 씻어내었다. 모든 조사는 PBS의 얇은 층 아래에서 수행되었고, 플레이트들은 조사를 수행하는 동안 닫혀 있었다. UVB 조사는 7.5㎝ 거리에서 일정한 조사를 전달하는 태양 전등(Sankyo Denki 사) 다섯 개를 밀접하게 배치하여 조사하였다. 조사(0.1mW/cm2)는 UVB 광도계(IL1700 광도계, International Light, Peabody, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.
세포에 40초 동안 자외선 조사(144mJ/㎠)를 수행하였다. 조사 후 즉시, 인간 진피 섬유아세포들은 따뜻한 PBS 용액으로 세 차례 세척하였고, 신선한 세럼-프리(serum-free) 배지 1980㎕와 샘플 20㎕를 각 웰에 첨가하고 배양하였다.
UVB 노출 없거나, 샘플 처리가 없는 대조군 세포들도 같은 배양 조건에서 보관되었다.
6. MTT 어세이
인큐베이션 72시간 후, 기질-함유 배지를 다른 튜브로 옮기고, 인간섬유아세포에 1 mg/mL의 MTT를 처리하고 세포를 37℃에서 2시간 동안 5%의 CO2 및 95%의 O2 존재 하에 배양하였다. 1㎖의 DMSO는 포마르잔 결정을 용해시키기 위해 각 튜브에 첨가되었다. 상온에서 30분 동안 오비탈 쉐이커로 플레이트를 흔들어 준 후, 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices E09090; 샌프란시스코, CA, 미국)를 사용하여 570㎚에서 흡수율을 측정함으로써 정량화하였다.
7. RT- PCR
100mm 세포 배양 접시에 10㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 6x105의 농도로 세포를 접종한 후, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144mJ/cm2 조건으로 조사한 후, 샘플을 포함한 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다.
이후, 황 등의 실험 방법(Hwang, E., Park, S. Y., Lee, H. J., Lee, T. Y., et al., 2014, Gallic Acid Regulates Skin Photoaging in UVB-exposed Fibroblast and Hairless Mice, Phytotherapy Research 28, 1778-1788)에 따라 RNA를 분리하였다. RT-PCR 방법을 이용하여 MMP-1, MMP-3, 및 타입 1 프로콜라겐(Type-1 Procollagen)의 mRNA 발현량을 확인하였다. GAPDH는 대조군으로 사용하였다.
사용한 프라이머는 다음과 같다.
[MMP-1]
정방향: 5′-ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA-3′
역방향: 5′-ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG-3′
[타입 1 프로콜라겐]
정방향: 5′-CTC GAG GTG GAC ACC ACC CT-3′
역방향: 5′--CAG CTG GAT GGC CAC ATC GG-3′
[GAPDH]
정방향: 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'
역방향: 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3'.
8. 단백질 발현량 분석
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144mJ/cm2 조건으로 조사한 후, 샘플을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I CPeptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan), TGF-β1, MMP-1, MMP-3 및 IL-6(Human Total TGF-β1 kit; Human Total MMP-1 kit; Human Total IL-6 kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) 단백질의 발현량을 확인하였다
각 샘플은 3회 반복하여 분석하였다.
9. 통계학적 처리
모든 실험은 3회 반복하여 수행되었다. 데이터는 평균±SD 값으로 표현되었다. 상이한 처리 간의 통계학적 비교는 편도 분산 분석(ANOVA)과 Tukey's 사후 비교를 통하여 수행되었다. 통계학적 분석을 위해, 대조군에 개별적인 처리를 비교하기 위한 Student's T-test가 수행되었다. 통계학적 의미는 p<0.05로 정하였다.
실험예 1. 쐐기풀 잎 추출물의 성분 분석
상기 실시예 2에서 추출한 쐐기풀의 유효성분을 상기 실시예 3의 HPLC 방법에 의해 분석하였다.
그 결과, 클로로겐산(CGA) 및 카페인산(CA)의 스탠다드 곡선과 비교하여 쐐기풀 추출물에서 6.93 및 10.53의 머무른 시간(retention times)에서 CGA 및 CA의 피크가 검출되었다(도 2).
CGA 및 CA가 차지하는 비중(proportions)은 각각 0.183% 및 0.443%로 나타났다.
실험예 2. 쐐기풀 잎 추출물의 피부주름 개선 효과
2-1. 세포 독성 평가
쐐기풀 추출물과 클로로겐산이 피부섬유아세포의 생장에 미치는 효과를 검증하기 위해, UVB 조사 유무 및 샘플처리 유무에 따라 세포 생존능력을 검증하였다. 그 결과, 쐐기풀 추출물과 클로로겐산이 처리된 군에서 세포 성장이 저해되지 않는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 쐐기풀 추출물과 클로로겐산이 인간 피부섬유아세포에 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(도 3).
2-2. MMP -1 mRNA 전사 억제 및 Type-1 Procollagen mRNA 전사 증가
쐐기풀 추출물과 클로로겐산이 MMP-1 및 Type-1 Procollagen 유전자의 전사에 미치는 효과를 검증하기 위해 상기 실시예 7의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다(도 4).
UVB 조사에 의해 MMP-1 유전자의 mRNA 전사는 293% 증가하였고, 타입 1 프로콜라겐 유전자의 mRNA 전사는 63% 수준으로 감소하였다.
그러나, 쐐기풀 추출물과 클로로겐산 처리군은 UVB 조사 처리 대조군에 비해 MMP-1 유전자의 mRNA 전사가 각각 35%(100μg/mL) 및 55%(10μg/mL) 감소하였다. 또한, UVB 조사 처리 대조군에 비해 타입 1 프로콜라겐 유전자의 mRNA 전사가 각각 254%(100μg/mL) 및 241%(10μg/mL) 증가하였다.
따라서, 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산은 MMP-1의 mRNA 전사를 효과적으로 억제함을 알 수 있었고, 타입 1 프로콜라겐의 mRNA 전사를 유의하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과를 통해, 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산은 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
2-3. 피부주름 관련 단백질 발현량 변화
피부주름과 관련된 중요한 단백질인 MMP-1, MMP-3, 타입-1 프로콜라겐, IL-6, 및 TGF-β1 단백질의 발현 변화를 상기 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 5 및 6을 참조하면, 자외선 조사에 의하여 발현이 증가된 콜라겐 분해 효소인 MMP-1(도 5) 단백질은 쐐기풀 추출물 처리군(100μg/mL)에서는 UVB 조사 대조군 대비 61%, 클로로겐산 처리군(10μg/mL)에서는 78% 감소하는 것이 관찰되었고, MMP-3(도 6) 단백질은 쐐기풀 추출물 처리군(100μg/mL)에서는 UVB 조사 대조군 대비 61%, 클로로겐산 처리군(10μg/mL)에서는 78% 감소하는 것이 관찰되었다.
또한, 도 7을 참조하면, 자외선 조사에 의하여 발현이 감소(57% 감소)된 타입-1 프로콜라겐 단배질은 쐐기풀 추출물 처리군(100μg/mL)에서는 UVB 조사 대조군 대비 255%, 클로로겐산 처리군(100μg/mL)에서는 169% 증가하는 것이 관찰되었다.
그리고, 도 8을 참조하면, 자외선 조사에 의하여 발현이 증가된 IL-6(146%) 은 쐐기풀 추출물 처리군(100μg/mL)에서는 UVB 조사 대조군 대비 60%, 클로로겐산 처리군(100μg/mL)에서는 74% 감소하는 것이 관찰되었다.
마지막으로, 도 9를 참조하면, 타입-1 프로콜라겐 합성의 주요 조절인자인 TGF-β1 단백질은 자외선 조사에 의하여 발현이 감소(48.7%)되었으나, 쐐기풀 추출물 처리군(100μg/mL)에서는 UVB 조사 대조군 대비 108%, 클로로겐산 처리군(100μg/mL)에서는 131% 증가하는 것이 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산은 TGF-β/Smad 신호전달체계에 작용하여 타입 1 프로콜라겐의 생성 및 TGF-β1의 생성을 촉진시키고, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1 및 MMP-3의 발현을 억제하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. AP-1 및 MAPK 신호전달체계
3-1. AP-1 신호전달 체계
쐐기풀 추출물과 클로로겐산이 AP-1 및 MAPK 신호전달체계에 미치는 효과를 검증하기 위해, UVB 조사 유무 및 샘플처리 유무에 따라 c-Jun과 c-Fos 단백질의 인산화 여부를 조사하였다.
100 mm 크기의 세포 배양 접시에 10㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 6x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 자외선 B를 144 mJ/cm2의 조건으로 조사한 후, 쐐기풀 추출물과 클로로겐산(각각 10, 100㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 4시간 동안 배양하였다. c-Jun과 c-Fos의 인산화를 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis) 방법을 이용하여 확인하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 자외선에 의해 자극되는 c-Jun과 c-Fos의 인산화가 각각 자외선 무처리군 대비 223% 및 294%로 증가하였으나, 쐐기풀 추출물(100㎍/㎖) 처리군에서는 자외선 처리군 대비 각각 32% 및 70%로 감소하였고, 클로로겐산(10㎍/㎖) 처리군에서는 자외선 처리군 대비 73% 및 55%로 감소하여 크게 억제됨을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산은 AP-1 신호전달체계의 활성화를 억제하고, 이를 통해 세포외 기질을 구성하는 단백질을 분해하는 MMP 단백질이나 인터루킨의 생성을 저해하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
3-2. MAPK 신호전달 체계
실험예 3-1에서 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산이 AP-1 프로모터 활성을 억제함을 알 수 있었다. 이러한 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산의 억제 작용이, AP-1 프로모터 활성을 유도하는 단백질 키나아제(protein kinae)에 영향을 끼쳐서 발생하는 지의 여부를 웨스턴 블랏(Western blot)를 통해 검증하였다. 우선 인간 섬유 아세포(human normal fibroblast cell)에 UVB를 144 mJ/cm2의 조건으로 조사한 후, 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산을 포함한 배지로 교체하여 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후, 세포를 수집하고, phospho-ERK, phospho-p38 및 phospho-JNK(Cell signaling technology)에 대한 웨스턴 블랏을 수행하였다.
도 11을 참조하면, ERK, p38, 및 JNK 단백질은 UVB 조사에 의해 인산화가 각각 480%, 251%, 및 343% 증가하였다. 그러나, 쐐기풀 추출물(100μg/mL)의 처리에 의해 ERK(14%), p38(38%), 및 JNK(32%) 단백질의 인산화를 억제하는 것으로 나타났고, 클로로겐산의 처리에 의해 ERK(26%), p38(23%), 및 JNK(41%) 단백질의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 쐐기풀 추출물과 그 유효성분인 클로로겐산은 MAPK Kinase 신호전달 체계의 활성화를 억제하고, 이를 통해 세포외 기질을 구성하는 단백질을 분해하는 MMP 단백질이나 인터루킨의 생성을 저해하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 4. UVB 조사에 따른 NFATc1 인산화
4-1. NFATc1 단백질의 인산화
UVB 조사에 따른 NFATc1 단백질의 인산화를 확인하기 위해, 자외선 B를 144 mJ/cm2의 조건으로 각각 0.5, 1, 2, 4, 및 8 시간 동안 조사하고, 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis) 방법을 이용하여 NFATc1 단백질의 인산화를 확인하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, UVB 조사 4시간 경과 후에는 자외선 무처리군 대비 NFATc1 단백질의 인산화가 73% 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 13을 참조하면, 핵에서 NFATc1 단백질의 인산화가 증가(240% 증가)한 반면, 세포질에서는 NFATc1 단백질의 인산화가 오히려 감소(38% 감소)함을 확인할 수 있었고, 이를 통해 인산화된 NFATc1 단백질이 세포질에서 핵으로 이동함을 알 수 있었다.
4-2. p- NFATc1의 인산화 비교실험
상기 실험예 4-1의 실험방법에 따라, 쐐기풀과 그 유효성분인 클로로겐산이 NFATc1의 인산화에 미치는 영향을 칼시뉴린의 억제제인 타크롤리머스와 비교 실험하였다.
그 결과, 피부주름개선 소재인 쐐기풀에서 추출한 유효성분인 클로로겐산은 NFATc1의 인산화 작용을 하는 것으로 알려진 타크롤리머스와 유사한 정도로 NFATc1 단백질의 탈인산화를 억제함을 확인하였고, NFATc1의 인산화 작용을 통해 피부주름개선 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 14 및 도 15).
이러한 결과를 통해 본 발명의 미르센 화합물은 AP-1 신호전달체계의 활성화를 억제하고, 이를 통해 세포외 기질을 구성하는 단백질을 분해하는 MMP 단백질이나 인터루킨의 생성을 저해하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 실험을 통해, 본 발명의 스크리닝 방법은 AP-1 신호전달체계, MAPK 신호전달체계, 및 NF-kB 신호전달체계와 별개로, 쐐기풀과 그 유효성분인 클로로겐산(chlorogenic acid)이 칼시뉴린의 억제제인 타크롤리머스(tacrolimus)와 유사한 정도로 NFATc1 단백질의 탈인산화를 억제함을 확인하였고, 이를 통해 피부주름개선 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, NFATc1 단백질의 탈인산화가 저해되는 경우 상기 피부주름개선 후보물질을 피부주름개선물질로 판단할 수 있다. 또한, 피부주름개선 소재인 쐐기풀에서 추출한 유효성분인 클로로겐산은 NFATc1의 인산화 작용을 하는 것으로 알려진 타크롤리머스와 유사한 정도로 NFATc1 단백질의 탈인산화를 억제함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 피부주름 개선에 효과가 있는 물질을 탐색하는 경우에, 피부 아토피 치료에 효과가 있는 물질을 동시에 탐색할 수 있는 장점이 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (4)

  1. (a) 인간 피부섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblasts)에 피부주름개선 후보물질을 처리하고 자외선을 조사하는 단계;
    (b) 상기 인간 피부섬유아세포의 세포질에서 NFATc1 단백질의 탈인산화를 확인하는 단계;
    (c) 상기 NFATc1 단백질의 탈인산화가 저해되는 경우 상기 피부주름개선 후보물질을 피부주름개선물질로 판단하는 단계;를 포함하는, 피부주름 개선물질의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 탈인산화된 NFATc1 단백질이 세포질에서 핵으로 이동하는 것을 확인하는 단계;를 추가로 포함하는 피부주름 개선물질의 스크리닝 방법.
  3. 제3항에 있어서,
    상기 핵으로 이동한 탈인산화된 NFATc1 단백질은 c-Jun 및 AP-1 단백질의 인산화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선물질의 스크리닝 방법.
  4. 제4항에 있어서,
    상기 인산화된 c-Jun 및 AP-1 단백질은 MMP-1, MMP-3, 및 MMP-9 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선물질의 스크리닝 방법.
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