KR20180095083A - 응고제로서 사용하기 위한 당단백질 v 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 응고제로서 사용하기 위한 그리고/또는 출혈성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 혈소판 당단백질 V(GPV)의 억제제에 관한 것이다.

Description

응고제로서 사용하기 위한 당단백질 V 억제제

배경

혈관 손상 부위에서의 혈소판 활성화 및 후속적 혈전 형성은 정상적인 지혈에 중대하지만, 심근 경색 및 뇌졸중을 야기할 수도 있다(Coughlin SR. Nature. 2000; 407: 258-64). 혈소판 부착 및 활성화는 다중 혈소판 수용체-리간드 상호작용에 관여하는 다단계 프로세스이다. 혈관벽 손상시, 혈소판의 순환은 노출된 내피하 세포외 매트릭스 상에(예를 들면, 콜라겐 상에) 고정된 폰 빌레브란트 인자(vWF: von Willebrand factor)와의 당단백질(GP) Ib-V-IX 복합체의 일시적 상호작용에 의해 신속하게 감속된다(Shapiro MJ, et al. JBC 2000; 275: 25216-21). 이러한 상호작용은 혈소판을 혈관벽에 가깝게 유지하여 GPVI와 콜라겐 사이의 접촉을 가능하게 한다(Nieswandt B, et al. Blood. 2003; 102: 449-61). GPVI-콜라겐 상호작용은 혈소판 활성화 및 트롬복산 A₂(TxA₂) 및 아데노신 디포스페이트(ADP)와 같은 2차 혈소판 작용제(agonist)의 방출을 유발하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 유도한다. 이들 가용성 작용제는 국소적으로 생산된 트롬빈과 함께 추가로, G 단백질(G_i, G_q, G_12/13) 커플링된 수용체를 통한 혈소판 활성화에 기여한다(Offermanns S. Circulation research. 2006; 99: 1293-304). 이들 모든 신호전달 경로들은 상승작용하여 인테그린의 활성화, 과립 함량의 방출 및 응혈 캐스케이드의 활성화를 위한 응혈촉진제(pro-coagulant) 표면의 준비(provision)와 같은 복잡한 세포 반응을 유도한다(Nakanishi-Matsui M, et al. Nature. 2000; 404: 609-13; Cunningham MA, et al. J Exp Med 2000; 191: 455-62). 최종 혈전은 흐르는 혈액에 의해 생성된 전단력(shear force)을 견디기 위해 피브린 네트워크에 내포되어 있다. 새롭게 형성된 혈전의 안정화는 혈관 손상 부위에서 출혈을 저지하는데 필수적이다.

혈소판 부착에 대한 이들의 중심 역할은 2개의 수용체 복합체에 혈소판 연구의 초점을 둔다: i) 손상된 혈관벽 상에 또는 활성화된 혈소판 상에 고정화된 vWF와 상호작용함으로써 상승된 전단력 조건 하에 혈류로부터 반응성 표면으로 혈소판을 유입시키는 GPIb-V-IX 복합체. ii) 작용제 수용체에 의해 매개된 인사이드-아웃(inside-out) 활성화를 요구하고 전단-내성(shear-resistant) 혈소판 부착을 단단하게 하는데 기여하고 응집체 형성에 필수적인 피브리노겐 및 vWF에 대한 수용체인 GPIIb/IIIa(인테그린 αIIbβ3). GPIb-V-IX 복합체는 2:4:2:1의 화학량론으로 회합되어 있는 4개의 관련 막관통 GP들: GPIbα, GPIbβ, GPV 및 GPIX로 이루어진다(Luo S-Z et al. Blood. 2007; 109(2): 603-9). 이러한 복합체 내에서, GPIbα 및 GPIbβ는 디설파이드-링크되어 있고 GPIX와 비공유결합적으로 회합되어 있다. GPV는 GPIb-IX와 비공유결합적으로 회합되어 있다(Nieswandt B, et al. J Thromb Haemost. 2009; 7: 206-9). GPIb-IX 복합체의 대략 30,000개의 카피가 사람 혈소판 표면 상에서 발견된다(Varga-Szabo D, et al. J Thromb Haemost. 2009; 7: 1057-66). GPIb-V-IX 기능의 손실은 중증의 출혈성 장애인 베르나르-술리에 증후군(BSS: Bernard-Soulier syndrome)을 야기한다. BSS는 vWF에 대한 접착력이 불량하고 트롬빈 반응성이 감소된 비정상적이고 거대한 순환 혈소판을 특징으로 한다(Canobbio I, et al. Cellular signalling. 2004; 16: 1329-44). GPIb 또는 GPIX의 결여 또는 기능장애는 BSS와 관련되어 있지만, GP5에서의 기능 돌연변이의 손실은 보고되어 있지 않으며 마우스에서의 GPV의 결여는 BSS-표현형을 유도하지 않는다(Ramakrishnan V, et al. PNAS. 1999; 96: 13336-41; Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21). GPV는 상기 복합체의 정확한 발현에 요구되지 않는 유일한 서브유닛이다(Dong J-f, et al. J Biol Chem. 1998; 273: 31449-54). GPV는 고도로 당화되어 있고, 혈소판 표면으로부터의 GPV의 정량적 제거 및 트롬빈의 존재 하에 가용성 GPV(sGPV)의 생성을 유도하는 트롬빈 절단 부위를 함유한다(Ravanat C, et al. Blood. 1997; 89: 3253-62; Azorsa DO, et al. Thrombosis and Haemostasis. 1999; 81: 131-8). 중요하게도, 이러한 트롬빈 절단 부위는 마우스, 래트 및 사람 단백질에서 보존된다(Ravanat C, et al. Blood. 1997; 89: 3253-62). 그러나, 트롬빈 자극시 반응하지 않는 프로테아제-활성화된 수용체(PAR) 4-결핍 마우스(Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21; Kahn ML, et al. Nature. 1998; 394: 690-4)와는 대조적으로, Gp5 ^-/- 마우스는 극도로 정상인 혈소판 기능성을 나타낸다.

시험관내에서, Gp5 ^-/- 혈소판은 야생형 혈소판과 거의 구별되지 않는다(Ramakrishnan V, et al. PNAS. 1999; 96: 13336-41; Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21). 트롬빈의 역치(threshold) 용량을 이용한 활성화 후에만, 증가된 반응성이 관찰되었고(Ramakrishnan V, et al. PNAS. 1999; 96: 13336-41), 이는 PAR과 경쟁하는 트롬빈에 대한 대안의 기질로서의 GPV의 결여에 기인하였다. 두 Gp5 ^-/- 마우스 스트레인(strain) 중 하나에 대해, 감소된 꼬리 출혈 시간, 가속화된 혈전 형성 및 증가된 색전형성이 보고되었고(Ramakrishnan V, et al. PNAS. 1999; 96: 13336-41; Ni H, et al. Blood. 2001; 98: 368-73), 한편 두번째 마우스 라인의 분석은 변경되지 않은 꼬리 출혈 시간 및 손상된 혈전 형성을 밝혔다(Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21; Moog S, et al. Blood. 2001; 98: 1038-46). 후자의 그룹은 결함이 있는 혈전 형성을 콜라겐 신호전달에서의 GPV의 역할로 돌리고, 이에 의해 콜라겐이 GPV에 대한 리간드로서 확립되었다(Moog S, et al. Blood. 2001; 98: 1038-46). Gp5 ^-/- 마우스에 대한 최근의 보고는 C57Bl/6 배경에 역교배된 마우스를 사용하였고, 증가된 트롬빈 반응성 및 콜라겐에 대한 약간 감소된 부착력을 확인시켜 주었다. 저자들은 레이저-손상을 이용하여, 혈전 형성에 대한 GPV-결핍의 영향이 손상의 중증도에 의존함을 입증하였고, GPV가 동맥 혈전 형성과의 관련성이 단지 미소하다고 결론지었다(Nonne C, et al. J Thromb Haemost. 2008; 6: 210-2). 현재까지, 혈전증 및 지혈에서의 GPV의 역할은 지혈 및 혈소판 기능을 유지하는데 미소한 관련성이 있는 것으로 보인다. 그러나, 혈전증, 지혈 및 혈전-염증성 뇌 경색에서의 GPV의 정확한 기능은 여전히 잘 이해되어 있지 않다.

본 발명의 요약

본 발명자들은 놀랍게도 GPV의 콜라겐-결합 부위와 별개인 GPV의 세포외 도메인의 영역에 대해 지시된 항체를 이용하여 치료한 마우스가 생체내 혈전 형성까지 가속화된 시간을 나타냈음을 발견하였다. 또한, GPV의 항체-매개된 차단은 생체내 혈전 형성 및 지혈에서 GPVI의 결여를 완전히 보완할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 실시형태 [1] 내지 [28]에 관한 것이다:

[1] 응고제로서 사용하기 위한 당단백질 V(혈소판 당단백질 V; GPV)의 억제제.

[2] 출혈성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 당단백질 V(혈소판 당단백질 V; GPV)의 억제제.

[3] 실시형태 [2]에 있어서, 상기 출혈성 병태가 혈소판 장애에 의해 야기되는, 억제제.

[4] 실시형태 [3]에 있어서, 상기 혈소판 장애가 감소된 혈소판의 수를 특징으로 하는, 억제제.

[5] 실시형태 [3] 또는 [4]에 있어서, 상기 혈소판 장애가 혈소판 감소증, 예를 들면 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 화학 치료요법에 의해 야기된 혈소판 감소증, 또는 면역성 혈소판 감소증인, 억제제.

[6] 실시형태 [2]에 있어서, 상기 출혈성 병태가 염증성 출혈, 출혈성 뇌졸중, 패혈증으로 인한 과다 출혈, 혈소판 감소증으로 인한 과다 출혈, 파종성 혈관내 응고(DIC: disseminated intravascular coagulation)로 인한 과다 출혈, 화학 치료요법으로 인한 과다 출혈, 용혈성-요독 증후군(hemolytic-uremic syndrome)으로 인한 과다 출혈, 가용성 GPV의 투여시 과다 출혈, 및 HIV 감염으로 인한 과다 출혈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 억제제.

[7] 선행하는 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPV가 사람 GPV인, 억제제.

[8] 실시형태 [7]에 있어서, 상기 사람 GPV가 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지는, 억제제.

[9] 선행하는 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제제가 폴리펩타이드인, 억제제.

[10] 실시형태 [9]에 있어서, 상기 억제제가 (i) GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 항체, (ii) GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 항체의 단편 또는 유도체, (iii) GPV의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합할 수 있는 항체, 또는 (iv) GPV의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 단편 또는 유도체인, 억제제.

[11] 실시형태 [10]에 있어서, 상기 세포외 도메인이 서열번호 3의 아미노산 1 내지 503을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지는, 억제제.

[12] 실시형태 [10] 또는 [11]에 있어서, 상기 항체 또는, 단편 또는 유도체가 GPV의 콜라겐-결합 부위와 상이한 GPV의 세포외 도메인의 영역에 결합하는, 억제제.

[13] 실시형태 [10] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체, 단편 또는 유도체가 콜라겐-유도된 응집을 지연시키기 않는, 억제제.

[14] 실시형태 [10] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프가 GPV의 콜라겐-결합 부위의 외부에 있고/있거나 GPV의 콜라겐-결합 부위와 중첩(overlap)되지 않는, 억제제.

[15] 실시형태 [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 유도체인, 억제제.

[16] 선행하는 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제제가 핵산인, 억제제.

[17] 실시형태 [16]에 있어서, 상기 핵산이 GPV의 발현을 감소시킬 수 있는, 억제제.

[18] 실시형태 [17]에 있어서, 상기 핵산이 안티센스(antisense) 핵산, siRNA 및 shRNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 억제제.

[19] 실시형태 [16]에 있어서, 상기 핵산이 GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있는, 억제제.

[20] 실시형태 [19]에 있어서, 상기 핵산이 압타머(aptamer)인, 억제제.

[21] 선행하는 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제제가 대상체에게 투여시, 상기 대상체에서의 혈소판 수에 실질적으로 영향을 미치지 않는, 억제제.

[22] 실시형태 [2] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제제가 응고제로서 사용되는, 억제제.

[23] 실시형태 [2] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료 또는 예방이 대상체에게, 바람직하게는 사람에게 상기 억제제의 약제학적 유효량을 투여함을 포함하는, 억제제.

[24] 실시형태 [23]에 있어서, 상기 치료 또는 예방이 상기 대상체에게 상기 억제제 이외의 다른 응고제를 투여함을 추가로 포함하는, 억제제.

[25] 실시형태 [24]에 있어서, 상기 억제제 이외의 다른 상기 응고제가 항-피브린용해제, 혈소판 농축물, 응고 인자 농축물 및 신선한 동결된 혈장으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 억제제.

[26] 선행하는 실시형태들 중 어느 하나에 정의된 억제제, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.

[27] 실시형태 [26]에 있어서, 출혈성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.

[28] 대상체, 바람직하게는 사람에서의 출혈성 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 실시형태 [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 정의된 억제제 또는 실시형태 [26]의 약제학적 조성물의 유효량을 투여함을 포함하는, 방법.

도 1: 모노클로날 항-GPV 항체는 GPV의 세포외 도메인에 결합한다.. (A) 89F12-FITC는 WT에 결합하지만, 유동 세포측정법에 의해 평가된 바와 같이 GPV-결핍 혈소판에는 결합하지 않는다. (B) 89F12-HRP는 ELISA 시스템에서 재조합 뮤린 sGPV를 검출한다.
도 2: 모노클로날 항-GPV 항체 89F12는 GPV의 혈소판 수 및 트롬빈-매개된 절단에 영향을 미치지 않고 GPV의 세포외 도메인에 결합한다. (A, B) 100μg의 89F12를 정맥내 주사하였고, 그 후 혈소판 수 및 GPV 표면 발현을 분석하였다. (C) 항체 89F12는 유동 세포측정법에 의해 평가시 GPV의 트롬빈-매개된 절단에 영향을 미치지 않는다. (D) 89F12는 트롬빈에 반응하여 αIIbβ3 인테그린-매개된 혈소판 활성화 및 P-셀렉틴 노출을 변경시키지 않는다.
도 3: 89H11은 89F12는 아니지만 GPV에 대한 콜라겐-결합 부위를 차단한다. 콜라겐-결합 인테그린 α2β1(Itga2 ^-/- )이 결여되어 있는 마우스로부터 세척된 뮤린 혈소판을 비히클(흑색 곡선) 또는 항-GPV 항체 89H11(밝은 회색) 또는 89F12(어두운 회색)의 존재 하에 2㎍/ml 원섬유성(fibrillar) 콜라겐을 이용하여 자극하였다. 각각의 그룹당 4마리의 마우스를 갖는 두 독립적인 실험의 대표적인 응집측정(aggregometry) 곡선이 표시된다.
도 4: 항체 89F12는 야생형 마우스에서 지혈을 전파하고 GPVI/CLEC-2 이중-결핍 동물에서 이를 회복시킨다. 명시된 마우스 라인의 꼬리 출혈 시간이 표시된다. 각각의 기호는 1마리의 동물을 나타낸다. 마우스가 출혈을 저지할 수 없었던 경우 피셔(Fisher)의 정확한 시험을 이용하여 P-값을 계산하였다.
도 5: 항체 89F12는 GPVI/ITGA2 이중-결핍 마우스에서 지혈을 회복시킨다. 명시된 마우스 라인의 꼬리 출혈 시간이 표시된다. 각각의 기호는 1마리의 동물을 나타낸다. 마우스가 출혈을 저지할 수 없었던 경우 피셔의 정확한 시험을 이용하여 P-값을 계산하였다.
도 6: 모노클로날 항-GPV 항체 89F12는 생체내 혈전 형성 모델에서 GPVI의 결여를 보완한다. 20% FeCl₃를 이용하여 장간막 세동맥을 손상시켰고 형광성-표지된 혈소판의 부착 및 혈전 형성을 생체 현미경(intravital microscopy)으로 모니터링하였다. 각각의 점은 하나의 혈관을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타낸다. ^* P<0.05; ^** P<0.01; ^*** P<0.001.
도 7: 항체 89F12는 지혈시 RhoA의 결여를 보완할 수 있다. 명시된 마우스 라인의 꼬리 출혈 시간이 표시된다. 각각의 기호는 1마리의 동물을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타낸다(중앙값이 1200초를 초과하면 도시하지 않음). 마우스가 출혈을 저지할 수 없었던 경우 피셔의 정확한 시험을 이용하여 P-값을 계산하였다. ^* P<0.05; ^** P<0.01.

상세한 설명

본 발명은 응고제로서 사용하기 위한 혈소판 당단백질 V(GPV)의 억제제에, 그리고/또는 출혈성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 GPV의 억제제에 관한 것이다.

당단백질 V

본원에서 사용되는 용어 "당단백질 V" 또는 "GPV"는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 막(membrane) 단백질을 나타낸다. 바람직하게, 상기 GPV는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 동일성을 갖는다. 상기 GPV는 기능성 막관통 도메인을 갖는다.

본 발명에 따르면, 평가되는 서열("비교 서열")은 두 서열의 정렬 후에 소정 "동일성 백분율"을 갖거나 청구된 또는 기술된 서열("참조 서열")과 소정 "백분율 동일"하다. "동일성 백분율"은 하기 식에 따라 결정된다:

동일성 백분율 = 100[1-(C/R)]

이러한 식에서, C는 두 서열 사이의 정렬의 길이에 걸친 참조 서열과 비교 서열 사이의 차이의 수이고, 여기서 (i) 비교 서열에서의 상응하는 정렬된 염기를 갖지 않는 참조 서열에서의 각각의 염기, 및 (ii) 참조 서열에서의 각각의 갭, 및 (iii) 비교 서열에서의 정렬된 염기와 상이한 참조 서열에서의 각각의 정렬된 염기가 차이를 구성한다. R은 염기로서 계수되는 참조 서열에서 생성된 임의의 갭과 비교 서열과의 정렬의 길이에 걸친 참조 서열의 염기의 수이다.

동일성 백분율(상기와 같이 계산됨)이 대략 명시된 최소값과 동일하거나 명시된 최소값보다 더 큰 비교 서열과 참조 서열 사이의 정렬이 존재하는 경우, 정렬이 명시된 것보다 더 낮은 동일성 백분율을 나타내는 서열의 다른 곳에 존재할 수 있는 경우라도 상기 비교 서열은 해당 명시된 최소값 동일성 백분율을 갖는다.

한 바람직한 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 60%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 80% 또는 90%이다.

두 아미노산 서열 사이의 서열의 비교 및 동일성 백분율(및 유사성 백분율)의 결정은 임의의 적합한 프로그램, 예를 들면, 프로그램 "BLAST 2 SEQUENCES(blastp)"를 하기 파라미터들: 매트릭스 BLOSUM62; 개방 갭(open gap) 11 및 연장 갭(extension gap) 1 페널티; 갭 x_dropoff50; 10.0 워드 크기 3 제외; 필터: 없음과 함께 이용하여 달성될 수 있다(Tatusova et al. FEMS Microbiol. Lett. 1999; 174: 247-250). 본 발명에 따르면, 서열 비교는 적어도 40개 아미노산, 바람직하게는 적어도 80개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 100개 아미노산, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 120개 아미노산을 포함한다.

전형적으로 본원에 나타내어지는 GPV는 혈소판 당단백질 V이다.

전형적으로, 상기 GPV는 천연 발생 GPV이다. 바람직하게, 상기 GPV는 포유동물 기원의 것이다. 가장 바람직하게, 상기 GPV는 사람 GPV이다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 GPV는 바람직하게는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진다.

GPV의 억제제

GPV의 억제제(본원 하기에 "GPV 억제제"로서 나타냄)는 (i) 응고-촉진 활성을 갖고 (ii) GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있거나 또는 GPV mRNA의 발현을 약화시킬 수 있는 화합물이다. 바람직하게, 상기 GPV 억제제는 (i) 응고-촉진 활성을 갖고 (ii) GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 화합물이다. 본 발명에 따르면, 응고-촉진 활성은 실시예에 기술되는 바와 같은 "출혈 시간 검정"으로 측정되고, 단 출혈 시간 검정에 사용된 마우스는 내인성 GPV가 결여되어 있고 사람 GPV를 발현하는 형질전환 마우스이다. GPV의 세포외 도메인에 대한 결합은 실시예에 기술된 바와 같이 ELISA에서 측정될 수 있다. 한 실시형태에서, GPV의 세포외 도메인에 대한 결합은 도 1B에 도시된 바와 같은 재조합 가용성 GPV를 사용한 ELISA에서 측정되고, 단 재조합 가용성 사람 GPV가 사용된다. 가장 바람직하게는, GPV의 세포외 도메인에 대한 결합은 도 1B에 도시된 바와 같은 재조합 가용성 GPV를 사용한 ELISA에서 측정되고, 단 실질적으로 서열번호 3의 아미노산 1 내지 503으로 이루어진 재조합 가용성 사람 GPV가 사용된다.

GPV 억제제는 대상체에게의 GPV 억제제의 투여시 대상체에서의 GPV의 트롬빈-매개된 절단에 영향을 미칠 수 있다, 예를 들면 이러한 절단을 억제시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 GPV 억제제는 대상체에게의 GPV 억제제의 투여시 대상체에서의 트롬빈-매개된 절단에 영향을 미치지 않는다.

GPV 억제제의 유형 또는 클래스는 특별하게 한정되는 것은 아니다. 그러나, 바람직하게는 상기 화합물은 펩타이드 또는 폴리펩타이드이고, 보다 바람직하게는 상기 화합물은 항체 또는 이의 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 GPV 억제제는 핵산이다.

항체

한 바람직한 실시형태에서, 상기 GPV 억제제는 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 항원과 결합하거나 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자를 말한고, 이로는 폴리클로날, 모노클로날, 유전자 조작된 형태 및 그렇지 않으면 변형된 형태의 항체가 포함되고, 이들로는 키메라 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 이종접합체(heteroconjugate) 항체(예를 들면, 이특이적 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)), 단일-도메인 항체(나노바디(nanobody)) 및 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 및 scFv 단편을 포함하는 항체의 항원 결합 단편이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "모노클로날 항체"(mAb)는 단백질에 결합할 수 있는 온전한(intact) 항체 및 항체 단편(예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편) 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편에는 온전한 항체의 Fc 단편이 결여되어 있고, 동물의 순환으로부터 보다 신속하게 제거되고, 온전한 항체보다 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl et al. J. Nucl. Med. 1983; 24: 316).

전형적으로, 상기 항체는 GPV의, 바람직하게는 사람 GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 분자 또는 항체가 GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있는지의 여부는 실시예/도 1A 또는 도 1B(하기 참조)에 기술된 결합 검정에 의해 결정될 수 있다.

본원에 언급된 항체, 단편 또는 유도체는 바람직하게는 GPV의 콜라겐-결합 부위와 별개인 GPV의 세포외 도메인 내의 영역에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체, 단편 또는 유도체는 콜라겐-유도된 응집을 지연시키지 않는다. 이는 실시예(도 3 및 재료 및 방법 참조)에 기술된 바와 같이 응집 검정에서 결정될 수 있다.

추가의 바람직한 억제제로는 사람 GPV에 결합하기 위해 항체 89F12와 경쟁하는 항체, 이의 단편 및 유도체가 있다. 추가로 바람직한 억제제로는 항체 89F12의 GPV 상의 에피토프와 중첩되는 GPV 상의 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 및 유도체가 있다. 추가로 바람직한 억제제로는 항체 89F12와 동일한 GPV 상의 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 및 유도체가 있다.

다른 실시형태들에서, 상기 억제제는 사람 GPV에 결합하기 위해 항체 89H11과 경쟁하지 않는 항체, 이의 단편 또는 유도체이다. 다른 실시형태에서, 상기 억제제는 항체 89H11의 GPV 상의 에피토프와 중첩되지 않는 GPV 상의 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 또는 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 억제제는 항체 89H11의 GPV 상의 에피토프와 상이한 GPV 상의 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 또는 유도체이다.

다른 실시형태들에서, 상기 억제제는 사람 GPV에 결합하기 위해 항체 V.3과 경쟁하지 않는 항체, 이의 단편 또는 유도체이다(Azorsa DO, et al. Thrombosis and Haemostasis. 1999; 81: 131-8; Moog S, et al. Blood. 2001; 98: 1038-46). 다른 실시형태에서, 상기 억제제는 항체 V.3의 GPV 상의 에피토프와 중첩되지 않는 GPV 상의 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 또는 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 억제제는 항체 V.3의 GPV 상의 에피토프와 상이한 GPV 상의 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 또는 유도체이다.

선행하는 단락들의 실시형태들은 서로 조합될 수 있다.

상기 항체는 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 1 내지 503 내의 에피토프에 결합한다. 예를 들면, 본 발명은 하기 실시형태들을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

GPV 및 항체의 세포외 도메인에 의해 형성된 복합체에 대한 해리 상수 K_D는 바람직하게는 100μM 미만, 보다 바람직하게는 10μM 미만, 가장 바람직하게는 5μM 미만이다. 전형적으로, K_D는 약 1pM 내지 약 10μM, 또는 약 10pM 내지 약 1μM, 또는 약 100pM 내지 약 100nM의 범위이다. 바람직하게는, 항체-GPV 복합체는 5pM 내지 1nM, 가장 바람직하게는 10pM 내지 500pM 범위의 K_D를 갖는다.

바람직하게는, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되는 것은 아니다. 용어 "모노클로날 항체"는 단일 클론으로부터 유도된 항체를 말하고, 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하지만 생산 방법은 포함하지 않는다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술의 사용, 또는 이들의 조합을 포함하여 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다(Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

사람에서의 항-GPV 항체의 생체내 사용을 포함하는 다른 실시형태에서, 키메라, 영장류화된, 사람화된 또는 사람 항체가 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 사람 항체 또는 사람화된 항체, 보다 바람직하게는 모노클로 날 사람 항체 또는 모노클로날 사람화된 항체이다.

본원에서 사용된 용어 "키메라" 항체는 비-사람 면역글로불린, 예를 들면 래트 또는 마우스 항체로부터 유도된 가변 서열 및 전형적으로 사람 면역글로블린 주형(tmplate)으로부터 선택된 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체를 말한다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Morrison. Science. 1985; 229(4719): 1202-7; Oi et al. BioTechniques. 1986; 4: 214-221; Gillies et al. J. Immunol. Methods 1985; 125: 191-202; US 5,807,715; US 4,816,567; 및 US 4,816,397]을 참조하고, 상기 문헌은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

"사람화된" 형태의 비-인간(예를 들면, 뮤린) 항체는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항체의 표적-결합 하위 서열)이고, 이는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 사람화된 항체는 실질적으로 적어도 하나 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인 전부를 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)은 비-사람 면역글로불린의 것과 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크(FR) 영역은 사람 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 것이다. 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 선택된 사람 면역글로불린 주형의 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 사람화는 사람 가변 도메인의 하나 이상의 아미노산 또는 일부가 비-사람 종 유래의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체를 제조하는 기술이다. 사람화된 항체는 비-사람 종 유래의 하나 이상의 CDR들 및 사람 면역글로불린 분자 유래의 FR들을 갖는 원하는 항원에 결합하는 비-사람 종에서 생성된 항체 분자이다. 종종, 사람 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시킬 것이다. 이들 프레임워크 치환은 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법에 의해, 예를 들면 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임 워크 잔기의 상호작용의 모델링에 의해 그리고 특정 위치의 특이한(unusual) 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인한다. 예를 들면, 문헌[Riechmann et al. Nature 1988. 332: 323-7 및 Queen et al. US 5,530,101; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; 및 US 6,180,370]을 참조한다(상기 문헌의 각각은 이들의 전분이 본원에 인용에 의해 포함된다). 항체는 예를 들면, CDR-절편이식(grafting)(EP239400; WO 91/09967; US 5,225,539; US 5,530,101 및 US 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(EP0592106; EP0519596; Padlan. MoI Immunol. 1991; 28: 489-498; Studnicka et al. Prot Eng. 1994; 7: 805-814; Roguska et al. PNAS 1994; 91: 969-973) 및 쇄 셔플링(chain shuffling)(US 5,565,332)을 포함하는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 기술들을 이용하여 사람화될 수 있고, 상기 문헌은 전부 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

몇몇의 실시형태들에서, 사람화된 항체는 문헌[Queen et al., US 5,530,101; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; 및 US 6,180,370](상기 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다)에 기술된 바와 같이 제조된다.

몇몇의 실시형태에들서, 항-GPV 항체는 사람 항체이다. 완전한 "사람" 항-GPV 항체는 사람 환자의 치료학적 치료에 바람직할 수 있다. 본원에 사용된 "사람 항체"로는 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함되고, 사람 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 사람 면역글로불린에 대해 형질전환된 동물로부터 단리되고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체가 포함된다. 사람 항체는 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 이용하여 상기 기술된 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법에 의해 제조될 수 있다. US 4,444,887 및 US 4,716,111; 및 WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; 및 WO 91/10741을 참조하고, 상기 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 사람 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 사람 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들면, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; US 5,413,923; US 5,625,126; US 5,633,425; US 5,569,825; US 5,661,016; US 5,545,806; US 5,814,318; US 5,885,793; US 5,916,771; 및 US 5,939,598을 참조하고, 상기 문헌은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 선택된 에피토프를 인식하는 완전한 사람 항체는 "유도된 선택(guided selection)"로서 언급되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서, 선택된 비-사람 모노클로날 항체, 예를 들면 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 사람 항체의 선택을 유도하는데 사용된다(Jespers et al. Biotechnology. 1988; 12: 899-903).

몇몇의 실시형태들에서, 항-GPV 항체는 영장류화된 항체이다. 용어 "영장류화된 항체"는 원숭이 가변 영역 및 사람 불변 영역을 포함하는 항체를 말한다. 영장류화된 항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, US 5,658,570; US 5,681,722; 및 US 5,693,780을 참조하고, 상기 문헌은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

몇몇의 실시형태들에서, 항-GPV 항체는 유도체화된 항체이다. 예를 들면, 당화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 공지의 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단 또는 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 링크에 의해 변형된 유도체화된 항체(항체 접합체의 논의에 관한 하기 참조)가 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다수의 화학적 변형들 중 임의의 것은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 또는 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 공지의 기술에 의해 행할 수 있다. 추가로, 유도체는 하나 이상의 비-전형적 아미노산을 함유할 수 있다.

몇몇의 실시형태들에서, 항-GPV 항체 또는 이의 단편은, 이들의 서열이 상응하는 야생형 서열에 비하여 적어도 하나의 불변 영역-매개된 생물학적 이펙터(effector) 기능을 감소시키도록 변형된 항체 또는 항체 단편일 수 있다. Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내도록 항-GPV 항체를 변형시키기 위해서, 항체의 면역글로불린 불변 영역 절편은 Fc 수용체(FcR) 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이될 수 있다(예를 들면, 문헌[Canfield and Morrison. J Exp Med. 1991; 173: 1483- 1491; 및 Lund et al. J Immunol. 1991; 147: 2657-2662]을 참조한다). 항체의 FcR 결합 능력의 감소는 또한 옵소닌화, 식세포작용 및 항원-의존성 세포의 세포독성과 같은 FcR 상호작용에 의존하는 다른 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다.

또 다른 양상에서, 항-GPV 항체 또는 이의 단편은 태아 Fc 수용체인 FcRn에 대한 이들의 결합 친화도를 증가시키거나 감소시키도록 변형된 항체 또는 항체 단편일 수 있다. FcRn에 대한 결합 친화도를 변경하기 위해서, 항체의 면역글로불린 불변 영역 절편은 FcRn 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이될 수 있다(예를 들면, WO 2005/123780을 참조한다). FcRn에 대한 결합 친화도의 증가는 항체의 혈청 반감기를 증가시켜야만 하고, FcRn에 대한 결합 친화도의 감소는 반대로 항체의 혈청 반감기를 감소시켜야만 한다. 적합한 아미노산 치환의 특정 조합은 WO 2005/123780의 표 1에서 확인되고, 이 표는 이의 전체가 본원에 인용에 의해 포함된다. 또한, 문헌[Hinton et al., US 7,217,797, US 7,361,740, US 7,365,168, 및 US 7,217,798]을 참조하고, 상기 문헌은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

또 다른 양상에서, 항-GPV 항체는 예를 들면 US 2007/0280931에 기술된 바와 같이 이의 초가변성 영역들 중 하나 이상에 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는다.

항체 접합체

몇몇의 실시형태들에서, 항-GPV 항체는 예를 들면, 공유결합적 부착이 GPV에 대한 결합을 간섭하지 않도록 항체에 임의의 유형의 분자를 공유결합적으로 부착시킴에 의해 변형되는 항체 접합체이다. 항체에 이펙터 모이어티(moiety)를 접합시키기 위한 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Hellstrom et al., Controlled Drag Delivery, 2nd Ed., 623-53 (Robinson et al., eds., 1987); Thorpe et al. Immunol Rev. 1982; 62: 119-58 및 Dubowchik et al. Pharmacology and Therapeutics 1999; 83: 67-123]을 참조한다).

한 예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 임의로 N-말단 또는 C-말단에서 공유결합적 결합(예를 들면, 펩타이드 결합)을 통해 다른 단백질의 아미노산 서열(또는 이의 일부; 바람직하게는 적어도 상기 단백질의 10, 20 또는 50 아미노산 부분)에 융합된다. 바람직하게, 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 항체의 불변 도메인의 N-말단에서 상기 다른 단백질에 링크된다. 예를 들면, 문헌[WO 86/01533 및 EP 0392745]에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 이용하여 이러한 융합을 생성할 수 있다. 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예를 들면 WO 2005/117984에 기술된 것들이 포함된다.

몇몇의 실시형태들에서, 항-GPV 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체가 항체 단편인 경우, 상기 PEG 모이어티는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 항체 단편에 위치된 말단의 아미노산 기능성 그룹, 예를 들면 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 그룹을 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 자연 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편으로 조작될 수 있다. 예를 들면, US 5,219,996을 참조한다. 다중 부위를 사용하여 2개 이상의 PEG 분자를 부착시킬 수 있다. 바람직하게는, PEG 모이어티는 항체 단편에 위치된 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 그룹을 통해 공유결합적으로 링크된다. 티올 그룹이 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 모이어티, 예를 들면 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택성 유도체가 사용될 수 있다.

다른 예에서, 항-GPV 항체 접합체는 예를 들면, EP 0948544에 개시된 방법에 따라 페길화된, 즉 공유결합적으로 부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))을 갖는 변형된 Fab' 단편이다. 또한, 문헌[Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); 및 Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); 및 Chapman. Advanced Drug Delivery Reviews 2002; 54: 531- 545]을 참조한다.

핵산

본 발명의 다른 실시형태들에서, GPV 억제제는 핵산이다. 한 특정 실시형태에서, 상기 핵산은 GPV mRNA의 발현을 약화시킬 수 있다. GPV의 발현은 예를 들면, siRNA 또는 shRNA를 이용함으로써 RNA 간섭에 의해 억제되거나 감소되거나 또는 폐지될 수 있다. 다른 가능성은 안티센스 핵산, 예를 들면 안티센스 RNA의 이용이다.

본원에서 사용되는 어구 "mRNA의 발현을 약화시키는"은 mRNA 절단을 통해 또는 번역의 직접적 억제를 통해 표적 mRNA의 단백질로의 번역을 감소시키기 위한 간섭 RNA(예를 들면, siRNA)의 양을 투여하거나 발현시키는 것을 의미한다. 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현의 감소는 일반적으로 "녹다운(knock-down)"으로서 나타내고, 비-표적화 대조군 RNA(예를 들면, 비-표적화 대조군 siRNA)의 투여 또는 발현 후 존재하는 수준과 비교하여 보고된다. 50% 내지 100%를 포함하는 양의 발현의 녹다운은 본원의 실시형태들에 의해 고려된다. 그러나, 이러한 녹다운 수준이 본 발명의 목적을 달성할 필요는 없다. 녹다운은 일반적으로 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR: quantitative polymerase chain reaction) 증폭을 사용하여 mRNA 수준을 측정함으로써 또는 웨스턴 블롯 또는 효소-링크된 면역흡착 검정(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 단백질 수준을 측정함으로써 평가된다. 단백질 수준의 분석은 mRNA 절단 및 번역 억제 둘 다에 대한 평가를 제공한다. 녹다운을 측정하기 위한 추가의 기술로는 RNA 용액 하이브리드화(hybridization), 뉴클레아제 보호, 노던(northern) 하이브리드화, 마이크로어레이(microarray)를 이용한 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 방사선 면역 검정 및 형광성 활성화된 세포 분석이 포함된다.

GPV mRNA 발현의 억제는 또한 예를 들면, GPV-간섭성 RNA의 형질감염 후 사람 세포에서의 GPV mRNA 수준 또는 GPV 단백질 수준을 평가함으로써 시험관내에서 측정될 수 있다.

본 발명의 한 실시형태에서, 간섭성 RNA(예를 들면, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖고, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 적어도 거의 완벽한 인접한 상보성의 영역을 포함한다. 본 발명의 한 추가의 실시형태에서, 간섭성 RNA(예를 들면, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖고, 각각 상기 안티센스 가닥은 GPV mRNA의 표적 서열에 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 적어도 거의 완벽한 인접한 상보성의 영역을 포함하고, 상기 센스 가닥은 GPV mRNA의 표적 서열과 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 적어도 거의 완벽한 인접한 동일성의 영역을 포함한다. 본 발명의 한 추가의 실시형태에서, 간섭성 RNA는 mRNA 내의 상응하는 표적 서열의 3' 말단의 각각 끝에서 두번째 13, 14, 15, 16, 17 또는 17개 뉴클레오타이드와 서열 상보성의 백분율을 갖거나 이들과 서열 동일성의 백분율을 갖는 적어도 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 인접한 뉴클레오타이드의 영역을 포함한다.

간섭성 RNA의 각각의 가닥의 길이는 19 내지 49개 뉴클레오타이드를 포함하고, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. siRNA의 안티센스 가닥은, 안티센스 가닥이 RISC에 포함되어 RISC가 절단 또는 번역 억압을 위한 안티센스 siRNA 가닥에 적어도 부분적 상보성을 갖는 표적 mRNA를 동정하도록 한다는 점에서 siRNA의 활성 유도제(guiding agent)이다. 본 발명의 실시형태들에서, GPV mRNA 서열 내의 간섭성 RNA 표적 서열(예를 들면, siRNA 표적 서열)은 입수가능한 디자인 툴(design tool)을 이용하여 선택된다. 이어서, GPV 표적 서열에 상응하는 간섭성 RNA는 표적 mRNA를 발현하는 세포의 형질감염에 의해, 이어서, 상기 기술된 녹다운의 평가에 의해 시험한다. siRNA에 대한 표적 서열을 선택하기 위한 기술은 문헌["siRNA Design: Methods and Protocols", edited by Debra J. Taxman, 2012 (ISBN-13: 9781627031189)]에 제공된다.

제2 특정 실시형태에서, 상기 핵산은 사람 GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 이러한 실시형태에 따르면, 상기 핵산은 압타머인 것이 바람직하다. 압타머는 문헌["De novo Molecular Design", 2013, edited by Gisbert Schneider, Chapter 21 (ISBN-13: 9783527677030)] 또는 문헌["The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications", 2006, edited by Sven Klussmann (ISBN-13: 9783527607914)]에 기술된 바와 같이 고안될 수 있다.

출혈성 병태

본원에 기술된 억제제는 바람직하게는 출혈성 병태의 치료 또는 예방헤 사용된다. 출혈성 병태는 과다 출혈을 특징으로 한다. 과다 출혈은 각종 원인을 가질 수 있다.

한 실시형태에서, 출혈성 병태는 혈소판 장애에 의해 야기된다.

혈소판 장애는 예를 들면, 혈소판 감소증의 경우에 감소된 혈소판의 수를 특징으로 한다. 특정 혈소판 감소증으로는 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, (예를 들면, 헤파린, 트리메토프림/설파메톡사졸에 의한) 면역-매개된 혈소판 파괴로 인한 약물-유도된 혈소판 감소증, (예를 들면, 화학 치료학적 제제에 의한) 용량-의존적 골수 억제로 인한 약물-유도된 혈소판 감소증, 전신 감염을 수반하는 혈소판 감소증, 화학 치료요법에 의해 야기된 혈소판 감소증, 임신성 혈소판 감소증 및 면역 혈소판 감소증(ITP, 이전에 면역 혈소판 감소성 자반병이라고 칭함)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

혈소판 장애는 예를 들면, 혈소판 수용체 또는 신호전달 분자의 결여로 인한 결함이 있는 혈소판 신호전달의 경우 혈소판의 기능장애를 특징으로 할 수 있다.

한 바람직한 실시형태에서, 출혈성 병태는 염증성 출혈, 출혈성 뇌졸중, 패혈증으로 인한 과다 출혈, 혈소판 감소증으로 인한 과다 출혈, 파종성 혈관내 응고(DIC)로 인한 과다 출혈, 화학 치료요법으로 인한 과다 출혈, 용혈성-요독 증후군으로 인한 과다 출혈, 및 HIV 감염으로 인한 과다 출혈로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 특정 실시형태에서, 본 발명은 가용성 GPV의 투여를 위한 해독제(antidote)로서의 본원에 기술된 억제제의 사용에 관한 것이다.

약제학적 조성물 및 치료

질환의 치료는 임의의 임상학적 병기의 질환 또는 징후의 임의의 형태를 갖는 것으로 이미 진단된 환자의 치료; 상기 질환의 증상 또는 증후의 발병 또는 발전 또는 악화 또는 퇴보의 지연; 및/또는 질환의 중증도의 예방 및/또는 감소를 포함한다.

GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체가 투여되는 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물, 예를 들면 비-영장류(예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들면, 원숭이 또는 사람)일 수 있다. 소정 양상들에서, 상기 사람은 소아 환자이다. 다른 양상들에서, 상기 사람은 성인 환자이다.

GPV 억제제 및 임의로 하나 이상의 추가의 치료학적 제제, 예를 들면 하기 기술되는 제2 치료학적 제제를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 상기 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균의 약제학적 조성물의 일부로서 공급된다. 이러한 조성물은 (환자에게 조성물을 투여하는 바람직한 방법에 따라) 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다.

GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체는 경구, 경피, 피하, 비내, 정맥내, 근육내, 척추강내, 국부 또는 국소와 같은 각종 경로에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 임의의 주어진 경우에 투여에 가장 적합한 경로는 특정 항체, 대상체, 질환의 성질 및 중증도 및 대상체의 신체적 상태에 의존할 것이다. 전형적으로, GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체는 정맥내로 투여될 것이다.

본 발명의 다른 양상은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물이다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약제학적 조성물을 제조하기 위한 공지의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들면, 이는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합할 수 있다. 예를 들면, 멸균수 또는 생리학적 염수를 사용할 수 있다. 다른 물질, 예를 들면 pH 완충액, 점도 감소제, 또는 안정화제도 포함될 수 있다.

다양한 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체는 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 약제학적 담체 및 부형제 및 적합한 약제학적 제형은 각종 출판물에 상세하게 기술되어 있다(예를 들면, 문헌["Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000) A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]을 참조한다). 특히, 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조된 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 절차에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 사용하기 전에 약제학적으로 허용되는 희석제, 예를 들면 주사용 멸균수 또는 멸균 생리학적 염수 용액을 첨가함으로써 재구성된다(reconstituted).

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에 익히 공지되어 있는 용량으로 그리고 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술에 의해 투여될 수 있다. 투여의 양 및 시점은 원하는 목적을 달성하도록 치료하는 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다. 투여의 경로는 치료되는 대상체의 혈액에 안전하고 치료학적으로 유효한 용량을 전달하는 임의의 경로를 통한 것일 수 있다. 가능한 투여의 경로로는 전신, 국부, 장 및 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 피하, 피부내, 복강내, 경구, 점막내, 경막외 또는 척추강내가 포함된다. 바람직한 경로는 정맥내 또는 피하이다.

투여의 유효 용량 및 경로는 대상체의 연령 및 체중과 같은 인자들에 의해 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 성질 및 치료학적 범위에 의해 결정된다. 용량의 결정은 공지의 방법에 의해 결정되고, 과도한 실험이 요구되지 않는다.

치료학적 유효 용량은 치료를 필요로 하는 환자 또는 대상체에서 긍정적인 치료학적 효과를 야기하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용량이다. 치료학적 유효 용량은 약 0.01 내지 50mg/kg, 약 0.01 내지 30mg/kg, 약 0.1 내지 30mg/kg, 약 0.1 내지 10mg/kg, 약 0.1 내지 5mg/kg, 약 1 내지 5mg/kg, 약 0.1 내지 2mg/kg 또는 약 0.1 내지 1mg/kg의 범위 내이다. 치료는 단일(예를 들면, 볼루스(bolus)) 용량 또는 다중 용량을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 대안으로, 연속적 투여가 가능하다. 다중 용량이 요구되는 경우, 이들은 매일, 격일마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 또는 필요에 따라 투여할 수 있다. 서서히 그리고 연속적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 방출하는 보관소(depository)도 또한 사용될 수 있다. 치료학적 유효 용량은 대상체에서 GPV를 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 99% 또는 심지어 100%까지 억제하는 용량일 수 있다.

상기 항체는 수용액으로서 제형화될 수 있다.

약제학적 조성물은 용량당 소정량의 GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 억제제를 함유하는 단위 투약형(unit dose form)로 편리하게 제공될 수 있다. 용량 당 항 -GPV 항체. 이러한 단위(unit)는 0.5mg 내지 5g, 예를 들면 이들에 한정되는 것은 아니지만 1mg, 10mg, 20mg, 30mg, 40mg, 50mg, 100mg, 200mg, 300mg, 400mg, 500mg, 750mg, 1000mg 또는 상기 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 임의의 범위, 예를 들면 10mg 내지 1000mg, 20mg 내지 50mg 또는 30mg 내지 300mg을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들면 치료되는 병태 또는 투여 경로에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다.

GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체를 이용한 유효 용량, 총 투약 수 및 치료 길이의 결정은 당해 분야 숙련가들의 능력 내이고, 표준 용량 상승 연구를 이용하여 결정될 수 있다.

본원에 기술된 방법에 적합한 GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체의 치료학적 제형은 보관을 위해 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 억제제, 예를 들면 항체를 당해 분야에서 전형적으로 사용되는 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(이들 전부는 본원에서 "담체"로서 언급됨), 즉 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제 및 기타 다양한 첨가제와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 제조할 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이어야만 한다.

완충제는 pH를 생리학적 조건에 근접하는 범위로 유지하는 것을 돕는다. 이들은 약 2mM 내지 약 50mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 적합한 완충제로는 유기산 및 무기산 둘 다 및 이들의 염, 예를 들면, 시트레이트 완충제(예를 들면, 시트레이트 1나트륨-2나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-3나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-1나트륨 시트레이트 혼합물 등), 석시네이트 완충제(예를 들면, 석신산-1나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화 나트륨 혼합물, 석신산-2나트륨 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제(예를 들면, 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화 나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제(예를 들면, 푸마르산-1나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-2나트륨 푸마레이트 혼합물, 1나트륨 푸마레이트-2나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제(예를 들면, 글루콘산-나트륨 글루코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화 나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제(예를 들면, 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화 나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제(예를 들면, 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화 나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제(예를 들면, 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화 나트륨 혼합물 등)가 포함된다. 추가로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예를 들면 Tris가 사용될 수 있다.

보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 부가될 수 있고, 0.2% 내지 1%(w/v) 범위의 양으로 부가될 수 있다. 적합한 보존제로는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 및 3-펜타놀이 포함된다. 종종 "안정화제"로서 공지되는 등장화제는 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위해 부가될 수 있고, 이로는 다가의 당 알콜, 바람직하게는 3가 또는 보다 높은 당 알콜, 예를 들면 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨이 포함된다. 안정화제는 벌킹제(bulking agent) 내지 치료학적 제제를 용해시키거나 컨테이너 벽에 대한 변성 또는 부착을 방지하는데 도움이 되는 첨가제 기능의 범위일 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 말한다. 전형적인 안정화제는 다가의 당 알콜(상기 열거됨); 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등과 같은 아미노산; 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들면 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이노시톨, 갈락티톨, 및 글리세롤 등(이노시톨과 같은 사이클리톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예를 들면 요소, 글루타티온, 티옥산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오설페이트; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들면, 10개 또는 그 미만의 잔기의 펩타이드); 단백질, 예를 들면 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈 모노사카라이드, 예를 들면 크실로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 디사카라이드, 예를 들면 락토스, 말토스, 슈크로스 및 트리사카라이드, 예를 들면 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들면 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 중량부당 0.1 내지 10,000중량의 범위로 존재할 수 있다.

비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로서도 공지됨)는 치료학적 제제를 용해시키는 것을 돕기 위해 또한 교반-유도된 응집에 대해 치료학적 단백질을 보호하기 위해 부가될 수 있고, 이는 또한 상기 제형이 단백질의 변성을 야기하지 않고 압력이 가해진 전단 표면에 노출되게 한다. 적합한 비-이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉(Pluronic) 폴리올, 폴리에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)가 포함된다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05mg/ml 내지 약 1.0mg/ml의 범위로 또는 약 0.07mg/ml 내지 약 0.2mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.

추가의 다양한 부형제로는 벌킹제(예를 들면, 전분), 킬레이팅제(chelating agent)(예를 들면, EDTA), 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공용매(co-solvent)가 포함된다.

본원의 제형은 또한 GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체에 추가하여 제2 치료학적 제제를 함유할 수 있다. 적합한 제2 치료학적 제제의 예는 하기에 제공된다.

투약 스케줄은 질환의 유형, 질환의 중증도 및 GPV 억제제, 예를 들면, 항-GPV 항체에 대한 환자의 감수성을 포함하는 다수의 임상학적 인자들에 따라 매월 1 회 내지 매일마다로 다양할 수 있다. 특정 실시형태들에서, GPV 억제제, 예를 들면, 항-GPV 항체는 매일, 매주 2회, 1주일에 3회, 5일마다, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다 또는 1개월에 1회 투여되거나, 상기 값들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로, 예를 들면 4일마다 내지 매달, 10일마다 내지 2주마다, 또는 매주 2 내지 3회 등으로 투여된다.

투여될 GPV 억제제, 예를 들면, 항-GPV 항체의 용량은 특정 항체, 대상체 및 질환의 성질 및 중증도, 대상체의 신체적 상태, 치료학적 용법(예를 들면, 제2 치료학적 제제가 사용되는지의 여부) 및 선택된 투여 경로에 따라 다를 것이고; 적절한 용량은 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

당해 분야 숙련가들 중 하나는 GPV 억제제, 예를 들면, 항-GPV 항체의 개별 용량의 최적 양 및 간격이 치료될 병태의 성질 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료될 특정 대상체의 나이와 병태에 의해 결정될 것임을 인지할 것이고, 의사가 궁극적으로 사용할 적절한 용량을 결정할 것임을 인지할 것이다. 이러한 용량은 적절한 정도로 종종 반복될 수 있다. 부작용이 나타나면 정상적인 임상학적 실행에 따라 양 및/또는 빈도를 변경하거나 감소시킬 수 있다.

병용 치료요법

바람직하게, 상기 GPV 억제제, 예를 들면 항-GPV 항체로 치료되는 환자는 또한 종래의 응고제로 치료된다. 예를 들면, 과다 출혈을 앓고 있는 환자는 전형적으로 또한 항-피브린용해제, 혈소판 농축물, 응고 인자 농축물 및/또는 신선한 동결된 혈장으로도 치료된다.

본 발명의 또 다른 양상은 지혈을 촉진시키기 위해 본원 상기에 정의된 억제제(바람직하게는 항체)를 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 과도한 출혈을 앓고 있는 환자에서 출혈 시간을 감소시키는데 사용하기 위한 본원 상기에 정의된 화합물(바람직하게는 항체)이다.

본 발명은 추가로 본원 상기에 정의된 억제제(바람직하게는 항체)의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하는, 출혈 시간을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 출혈성 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게 본원 상기에 정의된 억제제(바람직하게는 항체)의 유효량을 투여함을 포함하는, 출혈성 병태를 치료하는 방법이다. 상기 출혈성 병태는 상기 기술된 병태들 중 하나인 것이 바람직하다.

본 발명의 추가의 양상은 출혈성 병태의 예방을 필요로 하는 환자에게 본원 상기에 정의된 억제제(바람직하게는 항체)의 유효량을 투여함을 포함하는, 출혈성 병태를 예방하는 방법이다. 상기 출혈성 병태는 상기 기술된 병태들 중 하나인 것이 바람직하다.

뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 개요:

실시예

결과

89F12는 모노클로날 래트 항-마우스 GPV 항체이다. 이는 이것은 불멸화된(immortalized) AG14 골수종 세포와 마우스 혈소판으로 면역화된 래트의 비장 세포의 융합에 의해 생성되었다. 89F12는 야생형에 결합하지만 GPV-결핍 마우스 혈소판에는 결합하지 않고(도 1A), 89F12는 수용체의 트롬빈-절단시 형성되는 가용성 GPV에 결합한다(도 1B). 또한, 89F12는 뮤린 GPV의 재조합적으로 발현된 세포외 도메인에 결합한다(도 1B).

생체내에서, 89F12-IgG 또는 89F12-Fab 단편은 혈소판 수에 대해 영향을 갖지 않고 GPV의 트롬빈-매개된 절단에 영향을 갖지 않는다(도 2 그리고 데이터는 도시하지 않음). 또한, 89F12는 유동 세포측정법(도 2D), 응집측정법 또는 유동 부착 검정(도시하지 않음)에 의해 평가시 시험관내에서 혈소판 활성화에 영향을 미치지 않는다. GPV의 콜라겐-결합 부위를 차단하는 항-GPV 항체인 89H11과 대조적으로 - 중요하게도 89F12는 콜라겐-유도된 응집을 지연시키지 않으므로 GPV의 콜라겐-결합 부위를 간섭하지 않는다(도 3).

지혈 및 혈전 형성에 대한 항-GPV 항체의 영향을 생체내에서 시험하였다. WT 마우스에서의 100μg의 89F12의 정맥내 주사는 꼬리 출혈 시간 검정에서 혈액 손실의 중단까지 가속화된 시간을 초래하였다. JAQ1- 및 INU1-주사에 의한 GPVI 및 CLEC-2의 동시적 고갈은 각각 현저한 지혈 결함을 초래하였고, 이는 14마리의 마우스 중 5마리가 20분의 관찰 기간 내에 출혈을 멈출 수 없었지 때문이다. 89F12에 의한 GPV의 세포외 도메인의 차단은 GPVI/CLEC-2 이중-고갈된 마우스의 지혈 결함을 보완할 수 있었고, 이는 이들 마우스에서 89F12-처리된 WT 마우스와 비교할 만한 꼬리 출혈 시간을 초래하였다. 이는 89F12가 GPVI/CLEC-2 이중-고갈된 마우스에서 지혈을 회복시킬 수 있음을 의미한다. 이에 의해, 89F12는 GPVI 및 CLEC-2의 부재 하에 지혈 합병증을 예방한다(도 4). 수용체 이합체화(dimerization) 또는 항체의 Fc 부분이 혈전 형성에 대한 이의 영향에 요구되는지의 여부를 시험하기 위해서, GPVI-고갈된 α2-결핍(Itga2 ^-/- ) 마우스를 비히클 또는 89F12-Fab 단편으로 치료하였다. 비히클-처리된 GPVI-결핍된 Itga2 ^-/- 마우스는 20분 이상 출혈시켰고, 한편 89F12-Fab 단편은 이들 마우스의 지혈 기능을 회복시켰다(도 5).

GPV 차단이 지혈을 촉진시키므로, 혈전 형성은 89F12-처리된 마우스에서도 연구되었다. 89F12-처리된 마우스는 생체내에서 혈전 형성까지 가속화된 시간을 나타냈다. JAQ1을 이용한 주요 혈소판 활성화 콜라겐 수용체 GPVI의 고갈은 WT 마우스에서 지연된 혈전 형성 시간을 유도하였고, 13개의 혈관 중 6개만이 관찰 기간 내에 폐색되었다. 심지어 GPVI의 부재시에도, GPV의 89F12-매개된 차단은 혈전 형성의 조기 시작을 초래하였고(데이터 도시하지 않음), 이는 최종적으로 치료되지 않은 WT 대조군과 비교하는 경우에도 보다 빠른 혈관 폐색을 유도하였다(P<0.001, 도 6). GPV의 89F12-매개된 차단은 생체내 혈전 형성 및 지혈에서 GPVI의 결여를 완전히 보완할 수 있다.

GPV-차단이 (헴(hem))ITAM 수용체 GPVI 및 CLEC-2의 부재를 상쇄(counterbalance)할 수 있다는 사실은 GPV가 혈소판 활성화의 일반적인 음성적 조절인자로서 작용한다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 GPV 차단이 다른 중대한 신호전달 분자의 부재를 보완할 수 있는지의 여부를 조사하였다.

혈관 벽 손상시 혈소판 활성화는 과립 분비 및 퍼짐(spreading)을 위해 원반형으로부터 구형 혈소판 형태로의 전환에 결정적인 세포골격 재배열을 유도한다. RhoA와 같은 작은 GTPase의 Rho 패밀리는 다수의 이들 프로세스에 관여하는 것으로 생각된다. RhoA는 스트레스 섬유의 형성, 액토미오신 수축성의 조절 및 미세소관 역학의 조절을 통한 액틴 세포골격의 조직에 중심 역할을 한다(Bustelo XR, et al., BioEssays., 2007; 29: 356-70). 또한, RhoA는 G_q- 및 G₁₃-커플링된 작용제 수용체의 다운스트림의 상이한 세포 프로세스에 관여한다(Pleines I, et al., Blood., 2012; 119: 1054-63).

거핵구- 및 혈소판 특이적 RhoA-결핍 마우스는 50% 만큼의 혈소판 수의 감소로 현저한 거대 혈소판 감소증을 나타냈다(Pleines I, et al. Blood. 2012; 119: 1054-63). RhoA의 결여는 꼬리 출혈 시간을 지연시켰다(WT 마우스에서의 430 ± 267s과 비교하여 720 ± 321s). 대조적으로, RhoA-결핍 마우스의 89F12 치료는 RhoA^{fl/fl, PF4 - cre} 마우스의 지혈 결함을 구제하고(rescue), 이는 WT 마우스에 비해 단축된 출혈 시간을 초래한다(89F12-처리된 RhoA-결핍 마우스의 경우 286 ± 118s, RhoA-결핍 마우스와 비교하여 P<0.01, 도 7). 이는 항체-매개된 GPV-차단이 또한 중대한 다운스트림 신호전달 분자의 결여를 보완할 수 있음을 나타냈다.

혈소판 감소증은 출혈에 관한 중대한 위험 인자이다. 이러한 조건 하에서 GPV 차단의 역할을 평가하기 위해서, 2개의 모노클로날 항-GPIbα 항체의 주사에 의해 마우스에서 혈소판 감소증을 유도하였고, 이는 면역 이펙터 메커니즘과는 독립적으로 마우스에서 순환 혈소판을 고갈시킨다(Nieswandt B, et al. Blood. 2000; 96: 2520-7; Bergmeier W, et al. Blood. 2000; 95: 886-93). 초기 혈소판 수는 각각의 마우스에 대해 상기 기술한 바와 같이 평가하였고 100%인 것으로 간주하였다. 후속적 수는 항체의 주사 1시간 후에 평가하였고 초기 값에 대해 표준화하였다. 정상의 15% 미만인 혈소판 수 감소를 갖는 야생형 마우스는 지연된 출혈 시간을 나타냈고 20분의 관찰 기간 내에 출혈을 정지시킬 수 없었다. 대조적으로, 정상 혈소판 수를 갖는 89F12-처리된 마우스에 비해 정상의 5% 이하의 혈소판 수 감소는 꼬리 출혈 시간을 변경시키지 않았지만, 혈소판-고갈된 WT-마우스와 비교하여 유의하게 단축된 꼬리 출혈 시간을 나타냈고, 이는 GPV의 차단이 정상적인 지혈을 유지하는데 필요한 혈소판 수를 저감시킨다는 것을 나타낸다(도시하지 않음).

재료 및 방법

마우스

C57BL/6JRj(Janvier Labs)를 야생형 대조군 마우스로서 사용하였다. α2-인테그린 서브유니트(Itga2 ^-/- )인 GPV(Gp5 ^-/- )가 결여되어 있는 마우스는 이전에 기술되었다(Kahn M. et al., Blood 1999. 94: 4112-21; Holtkoetter O. et al., J Biol Chem. 2002. 277(13): 10789-94). 거핵구/혈소판(RhoA ^{fl /fl, Pf4 - cre +/-} )에서 RhoA가 결여되어 있는 마우스는 이전에 기술되었다(Pleines I. et al., Blood 2012. 119: 1054-63). GPVI는 실험 6일 전에 100㎍의 항-GPVI 항체인 JAQ1(Nieswandt B, et al. J Exp Med. 2001; 193: 459-69.)을 i.p. 주사함으로써 고갈되었다. CLEC-2는 200μg INU1((May F, et al. Blood. 2009; 114: 3464-72); 항-CLEC-2 항체)의 i.p. 주사에 의해 고갈되었다. GPV 차단은 실험 30분 내지 12시간 전에 50μg의 89F12-IgG 또는 Fab-단편을 주사함으로써 달성하였다. 동물 연구는 남부 프랑코니아(운터프랑켄 도청)의 지방 정부에 의해 승인되었다.

모노클로날 항체

항- GPV 항체의 생성

6 내지 8 주령의 암컷 Wistar 래트를 마우스 혈소판을 이용하여 반복적으로 면역접종하였다. 이어서, 래트 비장 세포를 마우스 골수종 세포(Ag14.653)와 융합시켰고, HAT 배지에서 하이브리도마를 선택하였다. 혈소판 표면 항원에 대한 모노클로날 항체(mAb)를 분비하는 하이브리도마는 유동 세포측정법에 의해 확인되었다(하기 참조). Gp5 ^-/- 혈소판을 대조군으로서 사용하여 GPV에 대한 항체 특이성을 시험하였다. 양성 하이브리도마는 대규모 생산 전에 2회 서브클로닝하였다.

사용된 추가의 항체는 하기 표에 요약된다.

완충액 및 배지

모든 완충액은 이중-증류수로 제조하였다.

포스페이트 완충된 염수(PBS), pH 7.14

NaCl 137mM

KCl 2.7mM

KH₂PO₄ 1.5mM

Na₂HPO₄ 8mM

시험관내 혈소판 분석

혈소판 제조 및 세척

마우스는 이소플루란 마취 하에 후안와 신경총(plexus)로부터 출혈시켰다. TBS(20U/ml, pH 7.3) 중의 300μl의 헤파린을 함유하는 1.5ml의 반응 튜브에 700㎕의 혈액을 수집하였다. 혈액을 RT에서 5분 동안 800rpm으로(52g, Eppendorf Centrifuge 5415C에서) 원심분리하였다. 상청액과 버피 코트(buffy coat)를 새로운 튜브에 이동시키고, RT에서 6분 동안 800rpm으로 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장(PRP: platelet rich plasma)을 얻었다. 세척된 혈소판을 제조하기 위해, 프로스타사이클린(PGI₂)(0.1μg/ml)의 존재 하에 RT에서 5분 동안 2800rpm(639g)으로 PRP를 원심분리하였고 펠릿(pellet)을 PGI₂(0.1μg/ml) 및 아피라제(0.02U/ml)를 함유하는 1ml의 Ca^{2 +}-불포함 타이로드(Tyrode) 완충액에 재현탁시켰다. 37℃에서 10분 인큐베이션 후, 상기 샘플을 2800rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 1ml의 Ca²⁺-불포함 타이로드 완충액에 혈소판을 1회 더 재현탁시킨 후, 혈소판 용액을 1:10으로 희석하고 Sysmex 계수기(하기 참조)에서 혈소판 수를 측정하여 혈소판 수준을 측정하였다. 펠릿을 50,000개 혈소판/μl를 얻는데 필요한 아피라제(0.02U/ml)를 함유하는 타이로드 완충액의 체적에 재현탁시키고 분석 전에 37℃에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하도록 방치하였다.

혈소판 수와 크기의 측정을 위해, 헤파린처리된(heparinized) 모세관을 사용하여 마취된 마우스의 후안와 신경총으로부터 50㎕의 혈액을 채혈하였고, TBS(20U/ml, pH 7.3) 중의 300㎕의 헤파린을 함유하는 1.5㎖ 반응 튜브에 수집하였다. 헤파린처리된 혈액을 PBS로 희석시켰고, 혈소판 수 및 크기를 Sysmex KX-21N 자동화 혈액학 분석기(Sysmex Corp., Kobe, Japan)를 사용하여 측정하였다.

유동 세포측정법

당단백질 발현 수준을 측정하기 위해, 혈소판(1*10⁶)을 상기 기술된 형광단-접합된 항체의 포화량을 이용하여 RT에서 10분 동안 염색하였고, 500μl의 PBS의 부가 직후 분석하였다. 500μl의 PBS를 부가하여 반응을 정지시키고 샘플을 FACSCalibur(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)에서 분석하였다. 혈소판 활성화 연구를 위해, 세척된 혈액을 15분 동안 JON/A-PE 및 항-P-셀렉틴-FITC의 존재 하에 명시된 작용제와 함께 인큐베이션하였다.

ELISA

세척된 혈소판을 상기 기술된 바와 같이 제조하였고 37℃에서 15분 동안 0.1U/ml의 트롬빈으로 자극하였다. 그 후, 혈소판 현탁액을 2800rpm으로 5분 동안 원심분리하였고, 상청액을 새로운 반응 튜브로 이동시켰고, 최대 속도로 5분 동안 재차 원심분리하였다. 100μl의 트롬빈-자극된 혈소판 상청액을 사전에 30μg의 89H11(항-GPV 항체)로 코팅하고 5% BSA/PBS로 차단한 96-웰 플레이트에 이동시켰다. 1시간의 인큐베이션 후, 96-웰 플레이트를 세척하였고, 절단된 GPV를 검출하기 위해 제2 항-GPV 항체인 HRP-표지된 89F12와 함께 인큐베이션하였다. TMB를 사용하여 HRP 기질을 전개시켰고, H₂SO₄로 반응을 정지시켰고, 405nm에서 ELISA 판독기로 현상하였다.

혈소판 응집

50μl의 세척된 혈소판(0.5x10⁶ 혈소판/μl의 농도를 가짐) 또는 헤파린처리된 PRP를 110μl의 타이로드 완충액(2mM CaCl₂ 및 100μg/ml 사람 피브리노겐 포함)을 함유한 큐벳(cuvette)에 이동시켰다. 응집의 측정을 위해, 항체를 최종 농도 10㎍/ml로 부가하였고, 100배 농축된 작용제를 부가하였고, Apact 4-채널 광학 응집 시스템(APACT, Hamburg, Germany) 상에서 10분 초과 동안 광 투과를 기록하였다. 작용제 부가 전에 각각의 측정의 보정(calibration)을 위해 타이로드 완충액을 100% 응집으로서 설정하였고, 세척된 혈소판 현탁액 또는 PRP를 0% 응집으로서 설정하였다.

혈소판 기능의 생체내 분석

혈소판 고갈

초기 혈소판 수는 각 마우스에 대해 상기 기술한 바와 같이 평가하였다. 이들 값을 100%로 간주하였고 후속적 수를 이들 값에 대해 표준화하였다. Fc-독립적 인 혈소판 감소증을 유도하기 위해 마우스 g당 0.2㎍의 항-GPIb 항체를 마우스에게 정맥내 주사하였다. FcγR-독립적인 혈소판 감소증을 유도하기 위해 5 내지 10%의 나머지 혈소판 수를 얻기 위해 실험 1시간 전에 마우스에게 주사하였다. 주사 1시간 후에 다시 혈소판 수를 평가하였다.

복부 대동맥의 기계적-손상

마취된 생쥐(10 내지 16주령)의 복강을 열기 위해서, 세로 방향의 중간선 절개를 수행하였고 복부 대동맥을 노출시켰다. 도플러(Doppler) 초음파 유동 프로브(Transonic Systems, Maastricht, Netherlands)를 대동맥 주위에 위치시켰고 유동 프로브의 업스트림에서 핀셋의 1회의 확고한 압박(15s)을 이용한 기계적 손상에 의해 혈전증을 유도하였다. 완전한 폐색이 발생하거나 30분이 경과할 때까지 혈류를 모니터링하였다.

출혈 시간 검정

마우스를 삼중 마취의 복강내 주사에 의해 마취시켰고, 꼬리 끝의 2mm 절편을 메스를 이용하여 제거하였다. 꼬리 출혈은 상처 부위에 직접적으로 접촉하지 않고 20초 간격으로 여과지를 이용하여 혈액을 부드럽게 흡수함으로써 모니터링하였다. 상기 여과지에 혈액이 관찰되지 않은 경우, 출혈이 중단된 것으로 결정되었다. 실험은 소작(cauterization)에 의해 20분 후에 수동으로 중단되었다.

통계학적 분석

결과는 그룹당 적어도 3회의 개별 실험으로부터의 평균 ± SD로서 나타내어진다. 적용가능한 경우 통계학적 분석을 위해 피셔(Fisher)의 정확한 시험(exact test)을 사용하였다. 그렇지 않은 경우, 통계학적 분석을 위해 웰치(Welch)의 t 시험을 수행하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계학적으로 유의하다고 간주되었다.

SEQUENCE LISTING <110> JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAT WURZBURG <120> GLYCOPROTEIN V INHIBITORS FOR USE AS COAGULANTS <130> 2015_M003_A252 <150> EP15202582.1 <151> 2015-12-23 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3493 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (32)..(1714) <400> 1 agttactttg gagtgcagaa ccatttcaga c atg ctg agg ggg act cta ctg 52 Met Leu Arg Gly Thr Leu Leu 1 5 tgc gcg gtg ctc ggg ctt ctg cgc gcc cag ccc ttc ccc tgt ccg cca 100 Cys Ala Val Leu Gly Leu Leu Arg Ala Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro 10 15 20 gct tgc aag tgt gtc ttc cgg gac gcc gcg cag tgc tcg ggg ggc gac 148 Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp 25 30 35 gtg gcg cgc atc tcc gcg cta ggc ctg ccc acc aac ctc acg cac atc 196 Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu Pro Thr Asn Leu Thr His Ile 40 45 50 55 ctg ctc ttc gga atg ggc cgc ggc gtc ctg cag agc cag agc ttc agc 244 Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser 60 65 70 ggc atg acc gtc ctg cag cgc ctc atg atc tcc gac agc cac att tcc 292 Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met Ile Ser Asp Ser His Ile Ser 75 80 85 gcc gtt gcc ccc ggc acc ttc agt gac ctg ata aaa ctg aaa acc ctg 340 Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu 90 95 100 agg ctg tcg cgc aac aaa atc acg cat ctt cca ggt gcg ctg ctg gat 388 Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp 105 110 115 aag atg gtg ctc ctg gag cag ttg ttt ttg gac cac aat gcg cta agg 436 Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe Leu Asp His Asn Ala Leu Arg 120 125 130 135 ggc att gac caa aac atg ttt cag aaa ctg gtt aac ctg cag gag ctc 484 Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu 140 145 150 gct ctg aac cag aat cag ctc gat ttc ctt cct gcc agt ctc ttc acg 532 Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr 155 160 165 aat ctg gag aac ctg aag ttg ttg gat tta tcg gga aac aac ctg acc 580 Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr 170 175 180 cac ctg ccc aag ggg ttg ctt gga gca cag gct aag ctc gag aga ctt 628 His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu 185 190 195 ctg ctc cac tcg aac cgc ctt gtg tct ctg gat tcg ggg ctg ttg aac 676 Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn 200 205 210 215 agc ctg ggc gcc ctg acg gag ctg cag ttc cac cga aat cac atc cgt 724 Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln Phe His Arg Asn His Ile Arg 220 225 230 tcc atc gca ccc ggg gcc ttc gac cgg ctc cca aac ctc agt tct ttg 772 Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu 235 240 245 acg ctt tcg aga aac cac ctt gcg ttt ctc ccc tct gcg ctc ttt ctt 820 Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu 250 255 260 cat tcg cac aat ctg act ctg ttg act ctg ttc gag aac ccg ctg gca 868 His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala 265 270 275 gag ctc ccg ggg gtg ctc ttc ggg gag atg ggg ggc ctg cag gag ctg 916 Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu 280 285 290 295 tgg ctg aac cgc acc cag ctg cgc acc ctg ccc gcc gcc gcc ttc cgc 964 Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg 300 305 310 aac ctg agc cgc ctg cgg tac tta ggg gtg act ctg agc ccg cgg ctg 1012 Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu 315 320 325 agc gcg ctt ccg cag ggc gcc ttc cag ggc ctt ggc gag ctc cag gtg 1060 Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val 330 335 340 ctc gcc ctg cac tcc aac ggc ctg acc gcc ctc ccc gac ggc ttg ctg 1108 Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu 345 350 355 cgc ggc ctc ggc aag ctg cgc cag gtg tcc ctg cgc cgc aac agg ctg 1156 Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu 360 365 370 375 cgc gcc ctg ccc cgt gcc ctc ttc cgc aat ctc agc agc ctg gag agc 1204 Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser 380 385 390 gtc cag ctc gac cac aac cag ctg gag acc ctg cct ggc gac gtg ttt 1252 Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe 395 400 405 ggg gct ctg ccc cgg ctg acg gag gtc ctg ttg ggg cac aac tcc tgg 1300 Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val Leu Leu Gly His Asn Ser Trp 410 415 420 cgc tgc gac tgt ggc ctg ggg ccc ttc ctg ggg tgg ctg cgg cag cac 1348 Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe Leu Gly Trp Leu Arg Gln His 425 430 435 cta ggc ctc gtg ggc ggg gaa gag ccc cca cgg tgc gca ggc cct ggg 1396 Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly 440 445 450 455 gcg cac gcc ggc ctg ccg ctc tgg gcc ctg ccg ggg ggt gac gcg gag 1444 Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu 460 465 470 tgc ccg ggc ccc cgg ggc ccg cct ccc cgc ccc gct gcg gac agc tcc 1492 Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser 475 480 485 tcg gaa gcc cct gtc cac cca gcc ttg gct ccc aac agc tca gaa ccc 1540 Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro 490 495 500 tgg gtg tgg gcc cag ccg gtg acc acg ggc aaa ggt caa gat cat agt 1588 Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr Gly Lys Gly Gln 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atggcttttc ctggagggaa aggataggct gttgctctat ctaatttttt gtttttgttt 2274 ttggacagtc tagctctgtg gcccaggctg gcgtgcagtg ggccgtctca gttcactgca 2334 gcctccgcct cccaggttca agtgattctc atgcctcagc gttctgagta gctgggatta 2394 gaggcgtgtg ccactacacc cggctaattt ttgtactttt taaagtagag acggggcttt 2454 gccatattgg cctggctgat ctcaaactcc tggtcttgaa ctcctggcca caagtgatct 2514 gcccgccttg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgta agccactaca cctggccctc 2574 ttcatcgaat tttatttgag aagtagagct cttgccattt tttcccttgc tccatttttc 2634 tcactttatg tctctctgac ctatgggcta cttgggagag cactggactc cattcatgca 2694 tgagcatttt caggataagc gacttctgtg aggctgagag aggaagaaaa cacggagcct 2754 tccctccagg tgcccagtgt aggtccagcg tgtttcctga gcctcctgtg agtttccact 2814 tgctttacat ccatgcaaca tgtcattttg aaactggatt gatttgcatt tcctggaact 2874 ctgccacctc atttcacaag catttatgga gcagttaaca tgtgactggt attcatgaat 2934 ataatgataa gcttgattct agttcagctg ctgtcacagt ctcatttgtt cttccaactg 2994 aaagccgtaa aacctttgtt gctttaattg aatgtctgtg cttatgagag gcagtggtta 3054 aaacaggggc tggcgagttg acaactgtgg gttcaaatcc cagctctacc acttactaac 3114 tgcatgggac tttgggtaag acacctgctt acattctcta agccttggtt tcctgaacct 3174 taaaacagga taacatagta cctgcttcgt agagtttttg tgagaattaa aggcaataaa 3234 gcatataatg acttagccca gcggcctgca ggcaatacat gttaatgaat gttagctatt 3294 attactaaag gatgagcaat tattattggc atcatgattt ctaaagaaga gctttgagtt 3354 ggtatttttc tctgtgtata agggtaagtc cgaactttct cagactggag gttacattca 3414 catcagtctg tcttcccctg cggatggcct cagccctggg tggccagact ctgtgctcac 3474 aatccagagc aatggatcc 3493 <210> 2 <211> 560 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Arg Gly Thr Leu Leu Cys Ala Val Leu Gly Leu Leu Arg Ala 1 5 10 15 Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala 20 25 30 Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu 35 40 45 Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val 50 55 60 Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp 85 90 95 Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His 100 105 110 Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe 115 120 125 Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys 130 135 140 Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe 145 150 155 160 Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 165 170 175 Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala 180 185 190 Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser 195 200 205 Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln 210 215 220 Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg 225 230 235 240 Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe 245 250 255 Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr 260 265 270 Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu 275 280 285 Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr 290 295 300 Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly 305 310 315 320 Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln 325 330 335 Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr 340 345 350 Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val 355 360 365 Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg 370 375 380 Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu 385 390 395 400 Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val 405 410 415 Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe 420 425 430 Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro 435 440 445 Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala 450 455 460 Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro 465 470 475 480 Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu 485 490 495 Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr 500 505 510 Gly Lys Gly Gln Asp His Ser Pro Phe Trp Gly Phe Tyr Phe Leu Leu 515 520 525 Leu Ala Val Gln Ala Met Ile Thr Val Ile Ile Val Phe Ala Met Ile 530 535 540 Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg Lys Leu Ile Arg Glu Arg Ala Leu Gly 545 550 555 560 <210> 3 <211> 544 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu 20 25 30 Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val 35 40 45 Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met 50 55 60 Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp 65 70 75 80 Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His 85 90 95 Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe 100 105 110 Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys 115 120 125 Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe 130 135 140 Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 145 150 155 160 Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala 165 170 175 Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser 180 185 190 Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln 195 200 205 Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg 210 215 220 Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe 225 230 235 240 Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr 245 250 255 Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu 260 265 270 Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr 275 280 285 Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly 290 295 300 Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln 305 310 315 320 Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr 325 330 335 Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val 340 345 350 Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg 355 360 365 Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu 370 375 380 Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val 385 390 395 400 Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe 405 410 415 Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro 420 425 430 Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala 435 440 445 Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro 450 455 460 Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu 465 470 475 480 Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr 485 490 495 Gly Lys Gly Gln Asp His Ser Pro Phe Trp Gly Phe Tyr Phe Leu Leu 500 505 510 Leu Ala Val Gln Ala Met Ile Thr Val Ile Ile Val Phe Ala Met Ile 515 520 525 Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg Lys Leu Ile Arg Glu Arg Ala Leu Gly 530 535 540 <210> 4 <211> 2215 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (30)..(1733) <400> 4 tcagtccagg gtgcagaact gcttcagac atg cta aga agc gcc ctg ctg tcc 53 Met Leu Arg Ser Ala Leu Leu Ser 1 5 gcg gtg ctc gca ctc ttg cgt gcc caa cct ttt ccc tgc ccc aaa acc 101 Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr 10 15 20 tgc aag tgt gtg gtc cgc gat gcc gcg cag tgc tcg ggc ggc agc gtg 149 Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val 25 30 35 40 gct cac atc gct gag cta ggt ctg cct acg aac ctc aca cac atc ctg 197 Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu 45 50 55 ctc ttc cga atg gac cag ggc ata ttg cgg aac cac agc ttc agc ggc 245 Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly 60 65 70 atg aca gtc ctt cag cgc ctg atg ctc tca gat agc cac att tcc gcc 293 Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala 75 80 85 atc gac ccc ggc acc ttc aat gac ctg gta aaa ctg aaa acc ctc agg 341 Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg 90 95 100 ttg acg cgc aac aaa atc tct cgt ctt cca cgt gcg atc ctg gat aag 389 Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys 105 110 115 120 atg gta ctc ttg gaa cag ctg ttc ttg gac cac aat gca cta agg gac 437 Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp 125 130 135 ctt gat caa aac ctg ttt cag caa ctg cgt aac ctt cag gag ctc ggt 485 Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly 140 145 150 ttg aac cag aat cag ctc tct ttt ctt cct gct aac ctt ttc tcg agc 533 Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser 155 160 165 ctg aga gaa ctg aag ttg ttg gat tta tcg cga aac aac ctg acc cac 581 Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His 170 175 180 ctg ccc aag gga ctg ctt ggg gct caa gtt aag ctt gag aaa ctg ctg 629 Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu 185 190 195 200 ctc tat tca aac cag ctc acg tct gtg gat tcg ggg ctg ctg agc aac 677 Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn 205 210 215 ctg ggc gcc ctg act gag ctg cgg ctg gag cgg aat cac ctc cgc tcc 725 Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser 220 225 230 gta gcc ccg ggt gcc ttc gac cgc ctc gga aac ctg agc tcc ttg act 773 Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr 235 240 245 cta tcc gga aac ctc ctg gag tct ctg ccg ccc gcg ctc ttc ctt cac 821 Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His 250 255 260 gtg agc agc gtg tct cgg ctg act ctg ttc gag aac ccc ctg gag gag 869 Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu 265 270 275 280 ctc ccg gac gtg ttg ttc ggg gag atg gcc ggc ctg cgg gag ctg tgg 917 Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp 285 290 295 ctg aac ggc acc cac ctg agc acg ctg ccc gcc gct gcc ttc cgc aac 965 Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn 300 305 310 ctg agc ggc ttg cag acg ctg ggg ctg acg cgg aac ccg cgc ctg agc 1013 Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser 315 320 325 gcg ctc ccg cgc ggc gtg ttc cag ggc cta cgg gag ctg cgc gtg ctc 1061 Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu 330 335 340 gcg ctg cac acc aac gcc ctg gcg gag ctg cgg gac gac gcg ctg cgc 1109 Ala Leu His Thr Asn Ala Leu Ala Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg 345 350 355 360 ggc ctc ggg cac ctg cgc cag gtg tcg ctg cgc cac aac cgg ctg cgg 1157 Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg 365 370 375 gcc ctg ccc cgc acg ctc ttc cgc aac ctc agc agc ctc gag agc gtg 1205 Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val 380 385 390 cag cta gag cac aac cag ctg gag acg ctg cca gga gac gtg ttc gcg 1253 Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala 395 400 405 gct ctg ccc cag ctg acc cag gtc ctg ctg ggt cac aac ccc tgg ctc 1301 Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu 410 415 420 tgc gac tgt ggc ctg tgg ccc ttc ctc cag tgg ctg cgg cat cac ccg 1349 Cys Asp Cys Gly Leu Trp Pro Phe Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro 425 430 435 440 gac atc ctg ggc cga gac gag ccc ccg cag tgc cgt ggc ccg gag cca 1397 Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro 445 450 455 cgc gcc agc ctg tcg ttc tgg gag ctg ctg cag ggt gac ccg tgg tgc 1445 Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys 460 465 470 ccg gat cct cgc agc ctg cct ctc gac cct cca acc gaa aat gct ctg 1493 Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu 475 480 485 gaa gcc ccg gtt ccg tcc tgg ctg cct aac agc tgg cag tcc cag acg 1541 Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr 490 495 500 tgg gcc cag ctg gtg gcc agg ggt gaa agt ccc aat aac agg ctc tac 1589 Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Tyr 505 510 515 520 tgg ggt ctt tat att ctg ctt cta gta gcc cag gcc atc ata gcc gcg 1637 Trp Gly Leu Tyr Ile Leu Leu Leu Val Ala Gln Ala Ile Ile Ala Ala 525 530 535 ttc atc gtg ttt gcc atg att aaa atc ggc cag ctg ttt cga aca tta 1685 Phe Ile Val Phe Ala Met Ile Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg Thr Leu 540 545 550 atc aga gag aag ctc ttg tta gag gca atg gga aaa tcg tgt aac taa 1733 Ile Arg Glu Lys Leu Leu Leu Glu Ala Met Gly Lys Ser Cys Asn 555 560 565 tgaaactgac cagagcattg tggacggggc cccaaggaga atgcagtcag gatgctggcg 1793 tgccattaca ctatttccca ggccttttct cctctcccgt gctcttagtg tctcttcttc 1853 tcccctctct tcagaagtag cttttgtaaa tcgctactgc tttctagcct ggcctgggtt 1913 acctcctctg ctgttagttt caagggggct gagggtgggg gttcgacggg acttggctca 1973 tcaggtccaa ctgtgcagcg ctgggtgcct agtggagaga ggagcccttt cttggtttct 2033 gaatttgagg acacatcctg ccagtgggca agacctctcc gggacccagc aagggttgag 2093 taacatttgc tgaaggaaca ccggcttaaa acgaacccta ggtccaagag atgaaggctc 2153 ttcccaaaat aaaggtggag tgttcttgtc cctttacctg aaaggaaaaa aaaaaaaaaa 2213 aa 2215 <210> 5 <211> 567 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Leu Arg Ser Ala Leu Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala 1 5 10 15 Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala 20 25 30 Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu 35 40 45 Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile 50 55 60 Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met 65 70 75 80 Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp 85 90 95 Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg 100 105 110 Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe 115 120 125 Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln 130 135 140 Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe 145 150 155 160 Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp 165 170 175 Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala 180 185 190 Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser 195 200 205 Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg 210 215 220 Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg 225 230 235 240 Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser 245 250 255 Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr 260 265 270 Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu 275 280 285 Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr 290 295 300 Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly 305 310 315 320 Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln 325 330 335 Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu Ala Leu His Thr Asn Ala Leu Ala 340 345 350 Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val 355 360 365 Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg 370 375 380 Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu 385 390 395 400 Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val 405 410 415 Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu Cys Asp Cys Gly Leu Trp Pro Phe 420 425 430 Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro 435 440 445 Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu 450 455 460 Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu 465 470 475 480 Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu 485 490 495 Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly 500 505 510 Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Tyr Trp Gly Leu Tyr Ile Leu Leu Leu 515 520 525 Val Ala Gln Ala Ile Ile Ala Ala Phe Ile Val Phe Ala Met Ile Lys 530 535 540 Ile Gly Gln Leu Phe Arg Thr Leu Ile Arg Glu Lys Leu Leu Leu Glu 545 550 555 560 Ala Met Gly Lys Ser Cys Asn 565 <210> 6 <211> 551 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu 20 25 30 Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile 35 40 45 Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met 50 55 60 Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp 65 70 75 80 Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg 85 90 95 Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe 100 105 110 Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln 115 120 125 Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe 130 135 140 Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp 145 150 155 160 Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala 165 170 175 Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser 180 185 190 Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg 195 200 205 Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg 210 215 220 Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser 225 230 235 240 Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr 245 250 255 Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu 260 265 270 Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr 275 280 285 Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly 290 295 300 Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln 305 310 315 320 Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu Ala Leu His Thr Asn Ala Leu Ala 325 330 335 Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val 340 345 350 Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg 355 360 365 Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu 370 375 380 Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val 385 390 395 400 Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu Cys Asp Cys Gly Leu Trp Pro Phe 405 410 415 Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro 420 425 430 Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu 435 440 445 Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu 450 455 460 Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu 465 470 475 480 Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly 485 490 495 Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Tyr Trp Gly Leu Tyr Ile Leu Leu Leu 500 505 510 Val Ala Gln Ala Ile Ile Ala Ala Phe Ile Val Phe Ala Met Ile Lys 515 520 525 Ile Gly Gln Leu Phe Arg Thr Leu Ile Arg Glu Lys Leu Leu Leu Glu 530 535 540 Ala Met Gly Lys Ser Cys Asn 545 550

Claims (19)

1. 응고제로서 사용하기 위한 혈소판 당단백질 V(GPV)의 억제제.
2. 출혈성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 혈소판 당단백질 V(GPV)의 억제제.
3. 제2항에 있어서, 상기 출혈성 병태가 혈소판 장애에 의해 야기되는, 억제제.
4. 제3항에 있어서, 상기 혈소판 장애가 감소된 혈소판의 수를 특징으로 하는, 억제제.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출혈성 병태가 염증성 출혈, 출혈성 뇌졸중, 패혈증으로 인한 과다 출혈, 혈소판 감소증으로 인한 과다 출혈, 파종성 혈관내 응고(DIC: disseminated intravascular coagulation)로 인한 과다 출혈, 화학 치료요법으로 인한 과다 출혈, 용혈성-요독 증후군(hemolytic-uremic syndrome)으로 인한 과다 출혈, 가용성 GPV의 투여시 과다 출혈, 및 HIV 감염으로 인한 과다 출혈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 억제제.
6. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPV가 사람 GPV인, 억제제.
7. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 GPV의 세포외 도메인에 대해 지시된 항체, 또는 GPV의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 항체의 기능성 단편 또는 유도체인, 억제제.
8. 제7항에 있어서, 상기 항체, 단편 또는 유도체가 GPV의 콜라겐-결합 부위와 상이한 GPV의 세포외 도메인의 영역에 결합하는, 억제제.
9. 제7항에 있어서, 상기 항체, 단편 또는 유도체가 콜라겐-유도된 응집을 지연시키지 않는, 억제제.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 이의 기능성 단편 또는 기능성 유도체인, 억제제.
11. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 GP5 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있는 핵산인, 억제제.
12. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 대상체에게의 투여시 상기 대상체에서의 혈소판의 수에 영향을 미치지 않는, 억제제.
13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 응고제로서 사용되는, 억제제.
14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 또는 예방이 대상체에게, 바람직하게는 사람에게 상기 억제제의 약제학적 유효량을 투여함을 포함하는, 억제제.
15. 제14항에 있어서, 상기 치료 또는 예방이 상기 대상체에게 상기 억제제 이외의 다른 응고제를 투여함을 추가로 포함하는, 억제제.
16. 제15항에 있어서, 상기 억제제 이외의 다른 상기 응고제가 항-피브린용해제, 혈소판 농축물, 응고 인자 농축물 및 신선한 동결된 혈장으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 억제제.
17. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 정의된 억제제, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
18. 제17항에 있어서, 출혈성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
19. 대상체, 바람직하게는 사람에서의 출혈성 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 억제제 또는 제17항의 약제학적 조성물의 유효량을 투여함을 포함하는, 방법.

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