KR20180085689A - Recognition ability materials for detection and treatment of virus that manufacture methods thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for manufacturing a material capable of recognition which is prepared by binding a connector in which an aminooxy group has been introduced with sialyllactose, comprises sialyllactose and a photosensitizer as active ingredients, and can recognize viruses through a sialyllactose complex. According to the present invention, the material capable of recognition has a size in nano-units and can be bound to viruses in an easy manner. The manufactured material capable of recognition intercepts the intracellular infection pathway by interacting with a virus which has recognized receptors within a cell, preventing intracellular infection. In addition, when the material capable of recognition interacts with a virus, the size of the virus increases and binding effect to an immune factor in a body also increases. Therefore, treatment efficacy can be increased by the efficient immune reaction. Since the material capable of recognition includes the photosensitizer, when the material capable of recognition is irradiated with light, the material capable of recognition directly induces destruction of viruses in accordance with an effect of photodynamic therapy (PDT). Therefore, the material capable of recognition can treat viral diseases. In addition, as induction of immunity is increased, the material capable of recognition can be an innovative treatment method against viruses. The material capable of recognition can also be used to treat diseases caused by bacteria.

Description

바이러스 진단 및 치료를 위한 인지능 물질 및 이의 제조방법{Recognition ability materials for detection and treatment of virus that manufacture methods thereof}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0001] The present invention relates to a cognitive substance for virus diagnosis and treatment,

본 발명은 바이러스를 특이적으로 인지하여 바이러스 진단 및 치료에 유용하게 이용할 수 있는 인지능 물질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a cognitive substance which can be used for virus diagnosis and treatment by specifically recognizing a virus and a method for producing the same.

바이러스는 세균보다 작은 전염성 병원체이다. 유전물질인 RNA와 그 유전 물질을 둘러싸고 있는 단백질로 구성되며 극소수 바이러스는 DNA를 가지고 있기도 한다. 크기는 세균 여과기를 통과할 수 있을 정도로 작으며 주로 10 ~ 1000 nm 사이이다. 스스로 물질대사를 할 수 없기 때문에, 자신의 DNA나 RNA를 숙주 세포 안에 침투시킨 뒤 침투당한 세포의 소기관들을 이용하여 자신의 유전물질을 복제하고, 자기 자신과 같은 바이러스를 생산하며 번식한다. Viruses are infectious pathogens smaller than bacteria. It consists of RNA, which is a genetic material, and proteins that surround the genetic material, and very few viruses have DNA. The size is small enough to pass through the bacterial filter and is usually between 10 and 1000 nm. Since it can not metabolize itself, it penetrates its own DNA or RNA into the host cell, replicates its own genetic material using the invaded cell organelles, and reproduces itself by producing a virus like itself.

바이러스는 숙주의 종류에 따라서 식물 바이러스, 동물 바이러스 및 세균 바이러스로 나누기도 한다. 그러나, 생물 증식의 근원이 핵산에 있기 때문에, 핵산의 종류에 따라 분류한다. 2개의 종류의 핵산 중에서 어떤 핵산을 가졌는가에 따라 DNA 바이러스와 RNA 바이러스로 나뉜다. 바이러스는 RNA나 DNA의 유전물질과 그것을 둘러싸고 있는 단백질 껍질로 구성되는 매우 간단한 구조를 가진다. 단백질 껍질인 캡시드는 구슬 모양의 단백질(capsomere)이 모여 이루어진 것으로 어떤 바이러스는 단백질 껍질 이외에 지질로 이루어진 막을 가지기도 한다. 이러한 바이러스는 일반적인 영양 배지에서는 배양할 수 없지만 살아 있는 세포에서는 선택적으로 증식한다. 이러한 바이러스가 원인으로 인한 질병에는 독감, 에이즈, 담배 모자이크병, 천연두, 소아마비, 구제역, 에볼라 등이 있으며, 국내에서는 인플루엔자 바이러스로 인한 독감과 코로나바이러스의 일종인 메르스 바이러스(MERS virus)로 인한 중동 호흡기 증후군의 발병으로 큰 문제점을 안고 있다.Viruses may be divided into plant viruses, animal viruses and bacterial viruses depending on the type of host. However, since the source of the proliferation is in the nucleic acid, it is classified according to the type of the nucleic acid. It is divided into DNA viruses and RNA viruses depending on which of two kinds of nucleic acids have nucleic acid. The virus has a very simple structure consisting of a genetic material of RNA or DNA and a protein shell surrounding it. Capsid, a protein shell, is made up of capsomere, and some viruses have membranes made of lipids in addition to protein shells. These viruses can not be cultured on general nutrient media but selectively propagate in living cells. These diseases include flu, AIDS, mosaic disease of tobacco, smallpox, polio, foot-and-mouth disease, ebola, etc. In Korea, the influenza virus caused by influenza virus and the coronavirus MERS virus There is a big problem with the onset of respiratory syndrome.

인플루엔자 바이러스는 과거 오래 전부터 현재까지 인류와 함께 해 온 대표적인 감염성 바이러스로 인플루엔자의 증상은 감염 초기에 콧물, 코막힘, 인후통, 두통, 기침, 발열 등 일반적임 감기와 유사한 증상을 보이나, 오한, 근육통 등 감기보다는 심각한 병증을 보이며 특히 섭씨 38도 이상의 고열을 동반하는 것이 특징이고 폐렴 등 세균 감염에 의한 합병증 발병 위험이 높다. 인플루엔자 바이러스의 종류는 크게 A, B, C (또는 D) 바이러스로 분류되며, 이중 가장 흔한 종류는 A와 B 바이러스이고, 특히 A 바이러스가 가장 일반적이다. 인플루엔자 A 바이러스는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피막(envelope)을 가지고 있는 single-stranded, negative-sense RNA 바이러스이다. 다른 RNA 바이러스들과 달리 인플루엔자 A 바이러스의 지놈(genome)은 8개(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS)의 분절(segment)로 이루어져 있으며, 약 10개 정도의 바이러스 단백질을 암호화한다. 인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 단백질 중 표면 당단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA)의 항원특이성에 따라 현재까지 16 종류의 HA와 9종류의 NA가 존재하는 것으로 알려져 있으며, HA와 NA의 조합에 의해 인플루엔자 A 바이러스의 아형(subtype)이 결정된다.Influenza virus is a typical infectious virus that has been associated with human beings for a long time. It has symptoms similar to common cold such as runny nose, nasal congestion, sore throat, headache, cough and fever in early infections. It is characterized by severe fever rather than cold, especially fever of 38 degrees Celsius or more, and high risk of complications due to bacterial infection such as pneumonia. The most common types of influenza viruses are A, B, C (or D) viruses, of which the A and B viruses are the most common. Influenza A virus is a single-stranded, negative-sense RNA virus with an envelope that belongs to Orthomyxoviridae. Unlike other RNA viruses, the genome of influenza A virus consists of eight segments (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, and NS) . Influenza A virus is known to have 16 types of HA and 9 kinds of NA to date depending on the antigen specificity of the surface glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) among the virus proteins And the subtype of influenza A virus is determined by the combination of HA and NA.

이와 같은 특징을 가지는 인플루엔자 바이러스의 치료는 바이러스가 인체의 세포 내에 침투하여 증식할 때 이를 저해하는 방법이 대표적인 치료 방법이다. 이는 바이러스가 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포내에 침투하여 증식하는데, 바이러스가 증식한 이후 밖으로 나가기 위해서는 엑소사이토시스(exocytosis)가 이루어져야 한다. 이 때, 인플루엔자 바이러스는 시알산(sialic aicd)을 포한한 수용체와 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)이 결합되어 있는 상태인데 이 결합은 뉴라미니데이즈가 관여한다. 최근에 개발된 약은 뉴라미니데이즈의 저해제로 작용하여 바이러스가 수용체와의 결합을 끊어지는 것을 막아서 인플루엔자에 관한 병을 치료하고 있다.Treatment of influenza viruses having such characteristics is a typical treatment method in which viruses infiltrate into human cells and proliferate. This is because the virus penetrates into the cells through endocytosis and proliferates. After the virus has propagated, exocytosis must be made to go out. At this time, the influenza virus is in a state in which a receptor including sialic acid (sialic acid) and hemagglutinin of a virus are bound, and this binding is involved in neuraminidase. The recently developed drug acts as an inhibitor of neuraminidase, preventing the virus from breaking the binding with the receptor and treating the disease related to influenza.

한편, 코로나바이러스는 코로나바이러스과에 속하는 바이러스를 통칭하는 말로, 감기의 주된 원인으로, 다른 병원에 의한 감기와의 가장 큰 차이점은, 소화기관도 감염시킨다는 것이다. 코로나바이러스는 보통 인간보다는 다른 동물을 대상으로 전염되며, 종종 인간에게 전염되는 변종이 등장하여 큰 위험을 주고 있다. 동물에서 인간에게 전염될 수 있기 때문에, 변이로 인해 가끔씩 유행병을 가져올 수 있다. 예를 들어 사스와 최근 발생한 메르스이다. 코로나바이러스는 리노 바이러스와 마찬가지로, 폐를 직접 공격할 수 있기 때문에 심할 경우 매우 치명적 일 수 있다. 이러한 코로나바이러스는 유전물질로 단일가닥의 RNA를 가지고 있으며 외피로 둘러싸여 있다. 코로나바이러스의 게놈 크기는 26~32 kb로, RNA 바이러스 중 큰 게놈 크기를 가지고 있다. On the other hand, coronavirus is a virus that belongs to the coronavirus. It is the main cause of the cold, and the biggest difference from the cold by other hospitals is that it infects the digestive organs. Coronaviruses are usually transmitted to other animals rather than humans, and are often dangerous because of the emergence of variants that are infectious to humans. Because it can be spread from animal to human, mutations can sometimes lead to epidemics. For example, it is SARS and recent mens. Coronavirus, like the renovirus, can be very lethal in severe cases because it can attack the lungs directly. These coronaviruses are genetic material with a single strand of RNA and are enveloped in the envelope. The genome size of the coronavirus is 26 to 32 kb, and it has a large genome size among the RNA viruses.

지난 2003년에는 세계적으로 약 8,000여 명의 사람이 사스(SARA-CoV)에 감염되어 약 10%가 사망했다. 최근에 한국에서도 코로나바이러스의 일종인 메르스가 발병하여 감염자 중 약 10%가 사망하였다. 이러한 코로나바이러스는 연구가 계속 되고 있지만 실질적인 백신이나 치료제가 없는 실정이다. 코로나바이러스의 경우 인체에 DPP4(Dipeptidyl peptidase-4)라는 단백질을 매개로 하여 감염이 일어난다고 알려져 있다. 이와 같은 바이러스의 특징을 고려해 볼 때, 고분자를 활용한 기술 개발이나 광감작제를 통한 기술 개발이 현재 이루어지지 않은 실정이다. In 2003, about 8,000 people worldwide were infected with SARA-CoV and about 10% died. Recently, in Korea, about 10% of the infected people have died due to the onset of merse, which is a type of coronavirus. Although these coronaviruses continue to be studied, there is no practical vaccine or therapeutic agent. In the case of coronaviruses, it is known that infection occurs through the protein called DPP4 (Dipeptidyl peptidase-4) in the human body. Considering the characteristics of such viruses, the development of technologies using polymers or the development of technologies using photosensitizers has not been achieved at present.

미국공개특허 제2012-0015344호 (2012.01.19 공개)United States Patent Publication No. 2012-0015344 (published Jan. 19, 2012)

본 발명의 목적은 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체를 제공하는 데에 있다.It is an object of the present invention to provide a sialic lactose complex having a virus-cognate ability to which a sialyl lactose is conjugated with a linker to which an aminooxy group is introduced.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing a virus comprising the sialic lactose complex as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a viral disease comprising the sialic lactose complex as an active ingredient.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법을 제공하는 데에 있다.Still another object of the present invention is to provide a method for producing the sialic lactose complex having the virus-cognitive ability.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a sialic lactose complex having a virus-cognate ability to which a linker having an aminooxy group introduced thereto and a sialic lactose are conjugated.

본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for diagnosing a virus comprising the above-described sialic lactose complex as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a viral disease comprising the sialic lactose complex as an active ingredient.

또한, 본 발명은 1) 아미노옥시 그룹을 도입하여 연결체의 반응기를 활성화시키는 단계; 및 2) 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 시알릭락토오스를 접합하는 단계를 포함하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a process for preparing a compound of formula (I), comprising the steps of: 1) activating a reactant of a conjugate by introducing an aminooxy group; And 2) a step of conjugating the sialic lactose to the conjugate into which the aminooxy group is introduced, to obtain a sialyllactose complex having a virus-cognate ability.

본 발명은 아미노 옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알리락토오스를 접합하여 제조하는 시알릭락토오스 및 광감작제를 유효성분으로 포함하는 시알릭락토오스 복합체를 통하여 바이러스를 인지할 수 있는 인지능 물질의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인지능 물질은 나노 단위의 크기를 가지며 바이러스와 쉽게 결합할 수 있다. 이는 바이러스가 세포내의 수용체를 인식하여 감염되는 경로를 제조한 인지능 물질과 바이러스가 상호작용함으로써 세포내 감염을 막는 역할을 한다. 또한 인지능 물질과 상호작용하는 바이러스의 경우 그 크기가 커져 체내 면역인자와의 결합이 높아져 효율적으로 면역작용을 통한 치료를 높일 수 있으며, 광감작제를 포함하고 있어 광원을 조사하였을 경우 광역학 치료(Photodynamic Therapy, PDT) 효과에 따른 바이러스의 직접적인 사멸을 유도하여 바이러스 질환의 치료가 가능하며, 또한 면역유도가 더욱 높아져 바이러스에 대한 혁신적인 치료법이 될 수 있으며, 이를 통하여 박테리아 세포 등을 치료하기 위하여 사용 될 수 있다.The present invention relates to a method for producing a cognitive substance capable of recognizing a virus through a sialic lactose prepared by conjugating an aminoxy group-introduced conjugate with sialyl lactose and a sialic lactose complex containing an optical sensitizer as an active ingredient ≪ / RTI > The cognitive substance according to the present invention has a size of nano unit and can easily bind to a virus. It plays a role to prevent intracellular infection by the interaction of the virus with the cognitive substance that produces the pathway through which the virus recognizes the receptor in the cell. In addition, viruses that interact with cognitive substances have a larger size, which increases binding to the body's immune factors. Thus, it is possible to efficiently treat the virus through immunization, and includes a photosensitizer. When the light source is irradiated, (PDT), it is possible to treat viral diseases. Moreover, it can be an innovative treatment method for viruses due to higher immunity induction, and it can be used for treating bacterial cells etc. .

도 1은 시알릭락오스와 바이러스 간의 결합과, 그로 인한 크기의 증가로 면역세포 인지능이 향상되어 식세포 작용을 통한 바이러스의 치료 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 1.8K의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 25K의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-DAB-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 1.8K-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 25K-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-DAB-Pp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI-Pp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 입자의 크기를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 농도별 세포독성을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 시간변화에 따른 세포내 흡수를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 MDCK 세포에 바이러스를 감염시킬 때, a) 제조한 SLPEGCe6, SLDABCe6를 함께 반응시키고 레이저 조사 유무에 따라 생성되는 플락의 개수를 비교하여 나타낸다. b) 제조한 SL-PEI 1.8K-Ce6, SL-PEI 25K-Ce6의 농도별로 바이러스와 반응시켜 생성되는 plaque 개수의 감소정도를 나타낸다. c) 항바이러스제의 일종인 oseltamivir (Tamiflu®)와 비교하여 농도별로 비교하고 레이저의 조사 유무에 따른 plaque 개수의 감소 정도를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용 후 세포내 바이러스 표면 단백질의 발현 정도를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 농도별 바이러스 검출정도를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와의 상호작용과 레이저 조사 후 바이러스의 변화를 투과 전자현미경 사진으로 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용을 공초점 현미경 사진으로 나타낸다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 STD-NMR 실험법을 이용하여 바이러스 표면 단백질과 일실시예 사이의 상호작용하는 것을 나타낸다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용 후 마우스 비강내로 접종하였을 때 바이러스의 생체내 감염 억제와 레이저 조사에 따른 바이러스의 불활성화로 인한 동물모델에서의 항바이러스 효과를 나타낸다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용 시킨 후 레이저를 조사하여 불활성화 시킨 다음 마우스 내로 접종하였을 때 마우스가 바이러스에 감염이 되면 보이는 증상이 실시예를 처리한 그룹에는 관찰되지 않는 것을 나타낸다. FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of treating a virus through phagocytosis by improving the immune cell perception through binding between sialyllactose and virus and increasing the size thereof.
2 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-PEI 1.8K according to an embodiment of the present invention.
3 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-PEI 25K according to an embodiment of the present invention.
4 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-PEG-Ce6 according to an embodiment of the present invention.
5 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-DAB-Ce6 according to an embodiment of the present invention.
6 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-PEI 1.8K-Ce6 according to an embodiment of the present invention.
7 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-PEI 25K-Ce6 according to an embodiment of the present invention.
8 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-DAB-Pp according to an embodiment of the present invention.
9 shows a 1 H-NMR spectrum of SL-PEI-Pp according to an embodiment of the present invention.
Figure 10 shows the particle size according to an embodiment of the present invention.
Figure 11 shows the cytotoxicity by concentration according to one embodiment of the present invention.
Figure 12 shows intracellular uptake according to time according to an embodiment of the present invention.
FIG. 13 shows the results of comparing the number of the generated SLPEGCe6 and SLDABCe6 together and the number of generated flocks according to the presence or absence of the laser irradiation, when infecting MDCK cells according to an embodiment of the present invention. b) the degree of decrease in the number of plaques produced by reacting with viruses at the concentrations of SL-PEI 1.8K-Ce6 and SL-PEI 25K-Ce6 prepared. c) Compared with oseltamivir (Tamiflu®), a type of antiviral agent, the concentration is compared according to concentration and the degree of decrease in plaque number with or without laser irradiation is shown.
14 shows the expression level of intracellular virus surface protein after interaction with virus according to an embodiment of the present invention.
15 shows the degree of virus detection by concentration according to an embodiment of the present invention.
FIG. 16 shows transmission electron microscope photographs of viruses after interaction with viruses and laser irradiation according to an embodiment of the present invention.
Figure 17 shows a confocal microscope photograph of the interaction with virus according to an embodiment of the present invention.
Figure 18 shows interaction between virus surface protein and an embodiment using STD-NMR experiments according to an embodiment of the present invention.
19 shows the antiviral effect in an animal model due to in vivo infection inhibition of virus when inoculated into mouse nasal cavity after virus interaction according to an embodiment of the present invention and virus inactivation according to laser irradiation.
FIG. 20 is a graph showing the results of a case where mice were infected with a virus when they were inactivated by irradiating the virus after interacting with the virus according to an embodiment of the present invention, .

바이러스가 해당하는 수용체(receptor)에 결합할 때, 대부분 구조적인 부분을 인식하여 결합을 하게 된다. 구조적인 부분이 맞지 않으면 바이러스가 해당 수용체를 인식하기 힘들다. 따라서 본 발명자들은 바이러스가 인식할 수 있는 수용체의 구조적인 부분을 유지하기 위해 구조체를 선택적으로 합성하는 방법인 옥심케미스트리를 이용하여 바이러스 표적화 물질의 활성을 극대화 시켰다. 옥심케미스트리(oxime chemistry)는 클릭케미스트리(click chemistry)의 한 종류로 아미노옥시그룹(aminooxy group)이 환원력을 가지는 당구조체 부분과 선택적으로 반응한다. 이러한 반응의 경우 당단백질이나 당구조체 간의 구조적인 특이성을 가지고 입자간 상호작용을 하는 경우에 응용이 가능하다. 구조적으로 중요한 부분을 보호하면서 상대적으로 영향이 적은 부분을 개질화 함으로서 실제 입자간 상호작용과 매우 유사하게 반응시킬 수 있다. When a virus binds to a corresponding receptor, it recognizes and binds most structural parts. If the structural part is not right, it is difficult for the virus to recognize the receptor. Therefore, the present inventors have maximized the activity of the virus targeting substance using oxime chemistry, which is a method of selectively synthesizing a structure to maintain a structural part of a receptor recognizable by viruses. Oxime chemistry is a kind of click chemistry, in which the aminooxy group selectively reacts with a sugar moiety that has a reducing power. These reactions can be applied to interactions between particles with structural specificity between glycoproteins and sugar structures. Protecting structurally important parts and reacting with relatively less affected parts can react very similarly to actual interactions between particles.

이에 본 발명자들은 옥심케미스트리를 이용하여 바이러스 표적화 물질의 활성을 극대화 시키고, 선택적으로 고분자를 접합하여 바이러스와 인지능 물질간의 상호작용을 더욱 증대시켰다. 바이러스의 치료를 위한 인지능 물질을 개발하고 이를 통하여 바이러스를 인식할 수 있는 인지능 물질을 제조하고, 광감작제를 포함하여 인체 내 바이러스를 인지하여 직접적인 사멸효과를 통한 바이러스의 질환의 치료효과를 기대할 수 있다.Therefore, the present inventors maximized the activity of the virus targeting substance using oxime chemistry and selectively conjugated polymers to further increase the interaction between the virus and the cognitive function substance. We have developed a cognitive substance for the treatment of viral diseases, and made a cognitive ability substance capable of recognizing the virus through this, and recognized the virus in the human body including the photosensitizer, You can expect.

본 발명은 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체는 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 광감각제가 추가적으로 접합될 수 있다.The present invention provides a sialic lactose complex having a virus-cognate ability to which a sialyl lactose is conjugated with a linkage to which an aminooxy group is introduced. Preferably, the sialic lactose complex may further comprise a photosensitizer to which the aminooxy group is attached.

바람직하게는, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the linking entity is selected from the group consisting of polyethylene glycol, diaminobutane, polyethyleneimine, pullulan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, chitosan, polycaprolactone and polydioxan, but is not limited thereto .

바람직하게는, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 클로린 e6 또는 포르피린일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the photosensitizer may be chlorins or phophyrins, more preferably chlorin e6 or porphyrin, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the virus is selected from the group consisting of influenza virus, coronavirus, adenovirus, reovirus, and rotavirus, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민(SL-PEI)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the sialic lactose complex is selected from the group consisting of sialic lactose-polyethylene glycol-chlorine (SL-PEG-Ce6), sialic lactose-diaminobutaine-chlorine (SL-DAB-Ce6), sialic lactose- (SL-PEI-P6), sialic lactose-diaminobutaine-porphyrin (SL-DAB-Pp), sialic lactose-polyethyleneimine-porphyrin (SL-PEI-Pp) or sialic lactose- (SL-PEI), but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing a virus, comprising the sialic lactose complex as an active ingredient.

바람직하게는, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the virus is selected from the group consisting of influenza virus, coronavirus, adenovirus, reovirus, and rotavirus, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a viral disease comprising the sialic lactose complex as an active ingredient.

바람직하게는, 상기 바이러스 질환은 인플루엔자바이러스로 인한 질환, 중증급성호흡기증후군(SARS), 중동호흡기증후군(MERS) 등과 같은 코로나바이러스로 인한 호흡기 질환, 호흡기 감염증, 유행성 각결막염, 출혈성 방광염, 신생아 장염 등과 같은 아데노바이러스로 인한 질환, 구토, 발열, 설사 등과 같은 레오바이러스로 인한 질환, 로타바이러스로 인한 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the viral disease is selected from the group consisting of influenza virus-related diseases, respiratory diseases caused by coronavirus such as severe acute respiratory syndrome (SARS), middle respiratory syndrome (MERS), respiratory infections, epidemic conjunctivitis, hemorrhagic cystitis, But are not limited to, diseases caused by the same adenovirus, diseases caused by viral diseases such as vomiting, fever, diarrhea and the like, and diseases caused by rotavirus.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학적으로 유효한 양의 시알릭락토오스 복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions according to the present invention may comprise a pharmaceutically effective amount of a sialic lactose complex alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.

본 발명에 따른 시알릭락토오스 복합체의 약학적으로 유효한 양은 0.01 ~ 100 mg/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.The pharmaceutically effective amount of the sialic lactose complex according to the present invention may be 0.01 to 100 mg / day / kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the severity of the disease symptoms, the age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the patient.

또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to humans.

상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.

또한, 본 발명의 약학조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal. The formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatine capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered orally or parenterally, depending on the intended method. The dosage can be varied depending on the body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, The severity of the disease, and the like.

또한, 본 발명의 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 약학조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 이때, "비경구"란 근육내, 복막내,복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로 본 발명의 고분자 나노접합체를 포함하는 약학조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제화될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by injecting or otherwise administering to a person or other mammal having a disease state or symptom effective for treatment according to the objective method (for example, transplantation, body cavity, (E. G., By coating the tissue surface of the body with a coating or coating the surface of an implantable device), but it is particularly preferred that the pharmaceutical composition is delivered parenterally. Herein, "parenteral" means intramuscular, intraperitoneal, intravesical, subcutaneous, intravenous, and intraarterial. Therefore, the pharmaceutical composition containing the polymeric nano-conjugate of the present invention can be formulated into a typical injection preparation.

본 발명의 주사가능한 약학조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간 내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체 내임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.The injectable pharmaceutical compositions of the present invention may be injected or injected into the body of a human or other mammal by any suitable method, preferably by injection through a hypodermic needle. For example, it can be administered by intravenous, intravenous, genitourinary, subcutaneous, intramuscular, subcutaneous, intracranial, intrathecal, intrapleural, or other bodily fluids or possible space by injection or other means. Diagnosis, or surgery, through the catheter or syringe, into the joint, for example, into the joint during arthroscopy, into the urogenital tract, into the pulmonary, into the lining or into the pleura, or into any cavity or space within the body It can be introduced during the intervention procedure.

또한, 본 발명은 1) 아미노옥시 그룹을 도입하여 연결체의 반응기를 활성화시키는 단계; 및 2) 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 시알릭락토오스를 접합하는 단계를 포함하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체 제조방법은 상기 (1) 단계 이후 광감각제를 추가적으로 접합할 수도 있다.The present invention also relates to a process for preparing a compound of formula (I), comprising the steps of: 1) activating a reactant of a conjugate by introducing an aminooxy group; And 2) a step of conjugating the sialic lactose to the conjugate into which the aminooxy group is introduced, to obtain a sialyllactose complex having a virus-cognate ability. Preferably, the method for producing a sialic lactose complex may further comprise bonding a photosensitizer after the step (1).

바람직하게는, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the linking entity is selected from the group consisting of polyethylene glycol, diaminobutane, polyethyleneimine, pullulan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, chitosan, polycaprolactone and polydioxan, but is not limited thereto .

바람직하게는, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 클로린 e6 또는 포르피린일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the photosensitizer may be chlorins or phophyrins, more preferably chlorin e6 or porphyrin, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 1) 단계는 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester) 또는 t-Boc-아미노옥시아세트산(t-Boc-aminooxyacetic acid)으로 활성화시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the step 1) is performed in the presence of t-Boc-aminooxyacetyl N-hydroxysuccinimide ester or t-Boc-aminooxyacetic acid (t-Boc- aminooxyacetic acid, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민(SL-PEI)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the sialic lactose complex is selected from the group consisting of sialic lactose-polyethylene glycol-chlorine (SL-PEG-Ce6), sialic lactose-diaminobutaine-chlorine (SL-DAB-Ce6), sialic lactose- (SL-PEI-P6), sialic lactose-diaminobutaine-porphyrin (SL-DAB-Pp), sialic lactose-polyethyleneimine-porphyrin (SL-PEI-Pp) or sialic lactose- (SL-PEI), but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the virus is selected from the group consisting of influenza virus, coronavirus, adenovirus, reovirus, and rotavirus, but is not limited thereto.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

<< 실시예Example 1>  1> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민(SL-PEI 1.8K) 바이러스 - Polyethyleneimine (SL-PEI 1.8K) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. One. 옥심케미스트리를Oxime chemistry 이용하기 위한  For use 아미노옥시그룹이The aminooxy group is 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 1.8 KDa) 고분자 제조 Introduction of Polyethyleneimine (PEI, M.W = 1.8 KDa) Polymer

폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W=1.8 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, M.W=1.8 KDa) 분자 한 개당 대략 16개 ~ 17개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 300 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 360 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 360 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 5mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=1.8 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다. Blends amino-oxyacetic acid molecules protected with t-Boc-groups to amine groups in polyethyleneimine (PEI, MW = 1.8 KDa) to convert the amine groups of polyethyleneimine to aminooxy groups Respectively. There are approximately 16 to 17 primary amine groups per molecule of polyethyleneimine (PEI, M.W = 1.8 KDa) and the amount of reactants to convert the primary amine groups to aminooxy groups is calculated. First, a catalyst was used to increase the reactivity of the carboxyl group of t-Boc-aminooxyacetic acid. 360 mM of t-Boc-aminooxyacetic acid (300 mM) and 360 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) were dissolved in dimethylformamide After 4 hours of reaction, 20 mM of polyethyleneimine (MW = 1.8 KDa) was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and the solution was added to the pre-reacted t-Boc-aminooxyacetic acid solution The reaction mixture was allowed to react at room temperature for 36 hours. After 36 hours, the unreacted material was removed, and the precipitate was recrystallized from excess diethylether to remove the solvent and catalyst used to obtain a precipitate. I got it.

얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.To remove the tert- butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours. Then, the mixture was purified by rotary evaporator After evaporation of the trifluoroacetic acid, the reaction mixture was dialyzed against primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por; molecular weight cutoff size 3500 Da) to remove the remaining solvent and t-Boc- And dried to obtain a powder.

2. 2. 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민 (- Polyethyleneimine ( SLSL -- PEIPEI 1.8K)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조 1.8K) to prepare a polymeric material for virus treatment interacting with virus

상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민 (Aminooxy-PEI 1.8K) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 15배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 1.8K-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 2).The aminoxy-polyethyleneimine powder prepared in order to bond the sialic lactose to the aminooxy-polyethyleneimine (Aminooxy-PEI 1.8K) prepared above was weighed and the molar ratio of the sialic lactose Add lactose. The reaction was carried out by dissolving aminooxy-polyethyleneimine-choline (Aminooxy-PEI 1.8K-Ce6) and sialic lactose after adjusting the pH of the third distilled water to pH 5.3 with 0.1 mM acetic acid, Lt; / RTI &gt; After 24 hours, the reaction mixture was filtered and dialyzed against primary distilled water for 3 days using a spectral / Por (molecular weight cutoff size 3500 Da) to remove unreacted materials. After the dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain a powder (FIG. 2).

<< 실시예Example 2>  2> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민 (- Polyethyleneimine ( SLSL -- PEIPEI 25K) 바이러스  25K) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. One. 옥심케미스트리를Oxime chemistry 이용하기 위한  For use 아미노옥시그룹이The aminooxy group is 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 25 KDa) 고분자 제조 Introduction of Polyethyleneimine (PEI, M.W = 25 KDa) Polymer

폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W= 25 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, MW=25 KDa) 분자 한 개당 대략 200개 ~ 211개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 200 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 240 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 240 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 10mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=25 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다. Blends amino-oxyacetic acid molecules protected with t-Boc-groups to amine groups in polyethyleneimine (PEI, MW = 25 KDa) to convert the amine groups of polyethyleneimine to aminooxy groups Respectively. About 200 to 211 primary amine groups per molecule of polyethyleneimine (PEI, MW = 25 KDa) were present and the amount of reactants was calculated to convert primary amine groups to aminooxy groups. First, a catalyst was used to increase the reactivity of the carboxyl group of t-Boc-aminooxyacetic acid. 240 mM of t-Boc-aminooxyacetic acid and 240 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) were dissolved in dimethylformamide After 4 hours of reaction, 20 mM of polyethyleneimine (MW = 25 KDa) was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and the solution was added to the pre-reacted t-Boc-aminooxyacetic acid solution The reaction mixture was allowed to react at room temperature for 36 hours. After 36 hours, the unreacted material was removed, and the precipitate was recrystallized from excess diethylether to remove the solvent and catalyst used to obtain a precipitate. I got it.

얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.To remove the tert- butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours. Then, the mixture was purified by rotary evaporator After evaporating the trifluoroacetic acid, dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) to remove the remaining solvent and t-Boc- Was lyophilized to obtain a powder.

2. 2. 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민 (- Polyethyleneimine ( SLSL -- PEIPEI 25K)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조 25K) to produce virus polymer-interacting macromolecules

제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI 25K) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 200배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI-Pp)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 3).The weight of the aminoxy-polyethyleneimine powder prepared to bond the sialic lactose to the prepared aminooxy-polyethyleneimine-porphyrin (Aminooxy-PEI 25K) was measured, and the sialic lactose And the like. The reaction was carried out by adjusting the pH of the third distilled water to pH 5.3 with 0.1 mM acetic acid, dissolving aminooxy-polyethyleneimine-porphyrin (Aminooxy-PEI-Pp) and sialic lactose, Respectively. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) to remove unreacted materials. After the dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain a powder (FIG. 3).

<< 실시예Example 3>  3> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -클로린(SL-PEG-Ce6) 바이러스 -Chlorin (SL-PEG-Ce6) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조 Material manufacturing

1. One. 광감각제인Light sensation agent 클로린과With chlorine 폴리에틸렌글라이콜Polyethylene glycol (PEG-(PEG- Ce6Ce6 ) 고분자 제조) Polymer manufacturing

폴리에틸렌글리콜과 클로린의 합성시 클로린의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. 클로린(chlorin e6, Ce6) 60mg, N,N-디사이클로핵실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 25mg, N-하이드록시숙신이미드(N-Hydrosuccinimide, NHS) 14mg을 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5ml에 녹인 후 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-diamine, PEG) 200mg을 디메틸설폭시드 5ml에 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 클로린 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어낸다.Catalysts were used to increase the reactivity of the carboxyl groups of chlorine in the synthesis of polyethylene glycol and chlorine. 60 mg of chlorin e6, Ce6, 25 mg of N, N-dicyclohexycarbodiimide (DCC) and 14 mg of N-hydrosuccinimide (NHS) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO ) And reacted at room temperature for 4 hours. After 4 hours' reaction, 200 mg of polyethylene glycol-diamine (PEG) was dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide, and the solution was added to the chlorin solution, which was reacted for 24 hours at room temperature. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 1,000) to remove the used solvent and catalyst. After the dialysis, the reaction product is lyophilized to obtain a powder.

2. 2. 광감각제인Light sensation agent 클로린과With chlorine 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol (PEG-(PEG- Ce6Ce6 ) 고분자 분리 및 정제) Polymer separation and purification

상기에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 1 대 1 당량의 결합 산물을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 6mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5 비율에서 1대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득률은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively isolate and purify the polyethylene glycol-choline 1 to 1 equivalent of the conjugate prepared above. After the polyethylene glycol-chlorine conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 6 mg / ml, methanol containing the polyethylene glycol-chlorine conjugate was injected into hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) and the ratio of water to methanol was 5 5 ratio and 1 to 9 ratio, and the yield was recovered at intervals of 1 minute. The yields obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) were removed using a rotary evaporator and recovered via lyophilization.

3. 3. 시알릭락토오스Sialic lactose -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 클로린Chlorine (( SLSL -PEG--PEG- Ce6Ce6 ) 접합하여 바이러스 인지능 물질 제조 ) To produce a virus-cognitive ability substance

상기에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-클로린 합성물과 시알릭락토오스를 접합하기에 앞서 시알릭락토오스의 글루코스 부분에 선택적으로 합성하기 위해 먼저 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester)를 정제 후 얻은 분말의 1.5배의 몰비율로 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 5ml에 정제 후 얻은 분말과 함께 넣어 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어낸다.In order to selectively synthesize the sialic lactose in the glucose portion of the polyethylene glycol-chlorin compound and the sialic lactose, the t-Boc-aminooxyacetyl N-hydroxysuccinimide ester ((t -Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester was dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide (DMSO) solution at a molar ratio of 1.5 times that of the powder obtained after purification. The resulting powder was dissolved in the powder and reacted at room temperature for 24 hours. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 1,000) to remove the solvent and unreacted materials. After the dialysis, the reaction product is lyophilized to obtain a powder.

얻은 분말에서 t-Boc-보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다. To remove the tert- butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours. Then, the mixture was purified by rotary evaporator After evaporating the trifluoroacetic acid, dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por; molecular weight cutoff size: 1,000) to remove the remaining solvent and t-Boc- To obtain a powder.

얻어낸 산물은 t-Boc- 보호 그룹을 제거한 아미노옥시(aminooxy) 반응기를 가진 폴리에틸렌글리콜-클로린(aminooxy-PEG-Ce6) 형태로 시알릭락토오스를 접합하기 위해 얻어낸 산물의 1.2 몰비율의 시알릭락토오스를 1차증류수 10ml을 100uM의 아세틱산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌글리콜-클로린(aminooxy-PEG-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후 60℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 최종 산물을 얻어내었다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다(도 4).The resulting product contained 1.2 moles of the sialic lactose of the product obtained to conjugate the sialic lactose in the form of a polyethylene glycol-choline (aminooxy-PEG-Ce6) with an aminooxy reactive group removed from the t-Boc- 10 ml of primary distilled water was adjusted to pH 5.3 with 100 uM acetic acid, and aminooxy-PEG-Ce6 and sialic lactose were dissolved, followed by reaction at 60 ° C for 24 hours . After 24 hours, the reaction product was filtered, and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 1,000 Da) to remove unreacted materials. After dialysis, the reaction product was lyophilized to obtain the final product. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR) (FIG. 4).

<반응식 1><Reaction Scheme 1>

Figure pat00001
Figure pat00001

<< 실시예Example 4>  4> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -- 디아미노뷰테인Diaminobutane -클로린(SL-DAB-Ce6) 바이러스 -Chlorin (SL-DAB-Ce6) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. One. 광감각제인Light sensation agent 클로린과With chlorine 디아미노뷰테인(DAB-Ce6)의Of diaminobutane (DAB-Ce6) 접합체 제조 Assembly

디아미노뷰테인(Diaminobutane, DAB)과 클로린(Chlorin e6, Ce6)의 합성시 클로린의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. 클로린 150mg, N,N-디사이클로핵실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 62mg, N-하이드록시숙신이미드(N-Hydrosuccinimide, NHS) 35mg을 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5ml에 녹인 후 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 디아미노뷰테인 0.44ml을 디메틸설폭시드 5ml에 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 클로린 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.A catalyst was used to increase the reactivity of the carboxyl groups of chlorine in the synthesis of diaminobutane (DAB) and chlorine (Chlorin e6, Ce6). 150 mg of chlorine, 62 mg of N, N-dicyclohexycarbodiimide (DCC) and 35 mg of N-hydrosuccinimide (NHS) were dissolved in 5 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) For 4 hours. After reacting for 4 hours, 0.44 ml of diaminobutane was dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide, added to the chlorin solution which had been previously reacted, and then reacted at room temperature for 24 hours. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove the used solvent and catalyst. After dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain a powder.

2. 2. 시알릭락토오스Sialic lactose -- 디아미노뷰테인Diaminobutane -- 클로린(SL-DAB-Ce6)을Chlorine (SL-DAB-Ce6) 접합하여 바이러스 인지능 물질 제조  To produce virus-cognitive ability

상기에서 합성한 디아미노뷰테인-클로린 합성물과 시알릭락토오스를 접합하기에 앞서 시알릭락토오스의 글루코스 부분에 선택적으로 합성하기 위해 먼저 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester)를 얻은 분말의 1.5배의 몰비율로 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 5ml에 얻은 분말과 함께 넣어 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 분말을 얻어내었다.In order to selectively synthesize the above-synthesized diaminobutaine-choline compound and the sialic lactose, the t-Boc-aminooxyacetyl N-hydroxysuccinimide ester (( t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester) was dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide (DMSO) solution at a molar ratio 1.5 times that of the obtained powder, and the resulting powder was reacted at room temperature for 24 hours. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove the used solvent and unreacted materials. After dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain a powder.

얻은 분말에서 t-Boc-보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-보호 그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다. To remove the tert-butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours and then purified by rotary evaporator After evaporating the trifluoroacetic acid, dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove the remaining solvent and t-Boc- The reaction product was freeze-dried to obtain a powder.

얻어낸 산물은 t-Boc-보호 그룹을 제거한 아미노옥시(aminooxy) 반응기를 가진 디아미노뷰테인-클로린(amiooxy-DAB-Ce6) 형태로 시알릭락토오스를 접합하기 위해 얻어낸 산물의 1.2 몰비율의 시알릭락토오스를 1차 증류수 10ml을 100uM의 아세틱산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-디아미노뷰테인-클로린(aminooxy-DAB-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후 60℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 반응물을 얻어내었다.The resulting product was a 1.2 molar ratio of the product obtained to conjugate the sialic lactose to the amiooxy-DAB-Ce6 form with the t-Boc-protecting group removed aminooxy reactor, Lactose was dissolved in 10 ml of primary distilled water at pH 5.3 using 100 uM of acetic acid, and then aminooxy-DAB-Ce6 and sialic lactose were dissolved. Lt; / RTI &gt; After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove unreacted materials. After dialysis, the reaction product was lyophilized to obtain a reaction product.

3. 3. 시알릭락토오스Sialic lactose -- 디아미노뷰테인Diaminobutane -- 클로린Chlorine ( ( SLSL -DAB--DAB- Ce6Ce6 )을 접합한 물질의 분리 및 정제 ) Is separated and purified

상기에서 제조된 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6) 결합 산물을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린 접합체를 6mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 최종산물을 회수하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다(도 5).Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively isolate and purify the sialic lactose-diaminobutaine-chlorine (SL-DAB-Ce6) binding product prepared above. The methanol containing the sialic lactose-diaminobutaine-chlorine conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 6 mg / ml and subjected to hydrophobic chromatography (sephadex LH-20 ) And the yields were recovered at intervals of 1 minute with the ratio of water to methanol being varied from 5: 5 to 1: 9. The product obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was subjected to methanol removal using a rotary evaporator and the final product was recovered by lyophilization. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR) (FIG. 5).

<반응식 2><Reaction Scheme 2>

Figure pat00002
Figure pat00002

<< 실시예Example 5>  5> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI 1.8K-- Polyethyleneimine-chlorine (SL-PEI 1.8K- Ce6Ce6 ) 바이러스 ) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. One. 옥심케미스트리를Oxime chemistry 이용하기 위한  For use 아미노옥시그룹이The aminooxy group is 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 1.8 KDa) 고분자 제조 Introduction of Polyethyleneimine (PEI, M.W = 1.8 KDa) Polymer

폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W=1.8 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, M.W=1.8 KDa) 분자 한 개당 대략 16개 ~ 17개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 300 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 360 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 360 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 5mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=1.8 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다. Blends amino-oxyacetic acid molecules protected with t-Boc-groups to amine groups in polyethyleneimine (PEI, MW = 1.8 KDa) to convert the amine groups of polyethyleneimine to aminooxy groups Respectively. There are approximately 16 to 17 primary amine groups per molecule of polyethyleneimine (PEI, M.W = 1.8 KDa) and the amount of reactants to convert the primary amine groups to aminooxy groups is calculated. First, a catalyst was used to increase the reactivity of the carboxyl group of t-Boc-aminooxyacetic acid. 360 mM of t-Boc-aminooxyacetic acid (300 mM) and 360 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) were dissolved in dimethylformamide After 4 hours of reaction, 20 mM of polyethyleneimine (MW = 1.8 KDa) was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and the solution was added to the pre-reacted t-Boc-aminooxyacetic acid solution The reaction mixture was allowed to react at room temperature for 36 hours. After 36 hours, the unreacted material was removed, and the precipitate was recrystallized from excess diethylether to remove the solvent and catalyst used to obtain a precipitate. I got it.

2. 2. 아미노옥시아세트산Aminooxyacetic acid -폴리에틸렌이민-- Polyethylene imine - 클로린Chlorine (( AminooxyaceticacidAminooxyacetic acid -- PEIPEI 1.8K-  1.8K- Ce6Ce6 ) 을 접합하여 바이러스 치료효과를 나타내는 고분자 물질 제조) To produce a polymer material exhibiting an effect of treating with a virus

상기에서 합성한 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민(t-Boc-Aminooxyacetic acid-PEI 1.8K) 합성물과 클로린 (Chlorin e6, Ce6)을 접합하기 위에 클로린 분자에 있는 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 클로린 20mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 24 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 24 mM을 디메틸설폭시드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 2mL 에서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 반응물을 디메틸설폭시드 10mL 에 미리 녹여놓은 Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 접합체 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.Boc-Aminooxyacetic acid (PEI 1.8K) compound synthesized above was conjugated with chlorine (Chlorin e6, Ce6). To increase the reactivity of the carboxyl group in the chlorine molecule, chloramine 20mM 24 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) 24 mM (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) was dissolved in 2 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) at room temperature for 4 hours After reacting for 4 hours, the reaction mixture was added to the Boc aminoxyacetic acid-polyethyleneimine conjugate solution which had been preliminarily dissolved in 10 ml of dimethylsulfoxide, and then the reaction was carried out at room temperature for 24 hours After 24 hours, the reaction product was filtered, Was dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 3500 Da). It served a foul.

얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.To remove the tert- butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours. Then, the mixture was purified by rotary evaporator After evaporation of the trifluoroacetic acid, the reaction mixture was dialyzed against primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por; molecular weight cutoff size 3500 Da) to remove the remaining solvent and t-Boc- And dried to obtain a powder.

3. 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린 (SL-PEI 1.8K-Ce6)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조3. Preparation of macromolecules for the treatment of viruses which interact with virus by conjugating sialic lactose-polyethyleneimine-chlorine (SL-PEI 1.8K-Ce6)

상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 1.8K -Ce6) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 15배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 1.8K-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 6).The aminoxy-polyethyleneimine-chlorine powder prepared to bond the sialic lactose to the aminooxy-polyethyleneimine-choline (Aminooxy-PEI 1.8K-C6e) prepared above was weighed 15 times By weight of the sialic lactose. The reaction was carried out by dissolving aminooxy-polyethyleneimine-choline (Aminooxy-PEI 1.8K-Ce6) and sialic lactose after adjusting the pH of the third distilled water to pH 5.3 with 0.1 mM acetic acid, Lt; / RTI &gt; After 24 hours, the reaction mixture was filtered and dialyzed against primary distilled water for 3 days using a spectral / Por (molecular weight cutoff size 3500 Da) to remove unreacted materials. After the dialysis, the reaction product was lyophilized to obtain a powder (FIG. 6).

<반응식 3><Reaction Scheme 3>

Figure pat00003
Figure pat00003

<< 실시예Example 6>  6> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI 25K-- Polyethyleneimine-chlorine (SL-PEI 25K- Ce6Ce6 ) 바이러스 ) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. 옥심케미스트리를 이용하기 위한 아미노옥시그룹이 도입된 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W=25 KDa) 고분자 제조1. Preparation of Polyethyleneimine (PEI, M.W = 25 KDa) Polymer with Aminooxy Group Introduced for Oxime Chemistry

폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W= 25 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, MW=25 KDa) 분자 한 개당 대략 200개 ~ 211개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 200 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 240 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 240 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 10mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=25 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다.Blends amino-oxyacetic acid molecules protected with t-Boc-groups to amine groups in polyethyleneimine (PEI, MW = 25 KDa) to convert the amine groups of polyethyleneimine to aminooxy groups Respectively. About 200 to 211 primary amine groups per molecule of polyethyleneimine (PEI, MW = 25 KDa) were present and the amount of reactants was calculated to convert primary amine groups to aminooxy groups. First, a catalyst was used to increase the reactivity of the carboxyl group of t-Boc-aminooxyacetic acid. 240 mM of t-Boc-aminooxyacetic acid and 240 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) were dissolved in dimethylformamide After 4 hours of reaction, 20 mM of polyethyleneimine (MW = 25 KDa) was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and the solution was added to the pre-reacted t-Boc-aminooxyacetic acid solution The reaction mixture was allowed to react at room temperature for 36 hours. After 36 hours, the unreacted material was removed, and the precipitate was recrystallized from excess diethylether to remove the solvent and catalyst used to obtain a precipitate. I got it.

2. 2. 아미노옥시아세트산Aminooxyacetic acid -폴리에틸렌이민-- Polyethylene imine - 클로린Chlorine (( AminooxyaceticacidAminooxyacetic acid -- PEIPEI 25K -Ce6)을 접합하여 바이러스 치료효과를 나타내는 고분자 물질 제조 25K-C6) were bonded to produce a polymer substance exhibiting an effect of treating with a virus

상기에서 합성한 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 (t-Boc-Aminooxyacetic acid-PEI 25K) 합성물과 클로린 (Chlorin e6, Ce6)을 접합하기 위에 클로린 분자에 있는 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 클로린 10mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 12 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 12 mM을 디메틸설폭시드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 2mL 에서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 반응물을 디메틸설폭시드 15mL 에 미리 녹여놓은 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 접합체 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.Boc-Aminooxyacetic acid (PEI 25K) complex with chlorine (Chlorin e6, Ce6) synthesized above was conjugated with 10mM of chlorine to increase the reactivity of the carboxyl group in the chlorine molecule. 12 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) 12 mM (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) was reacted with 2 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) for 4 hours at room temperature After 4 hours' reaction, the reaction mixture was added to the t-Boc aminooxyacetic acid-polyethyleneimine conjugate solution preliminarily dissolved in 15 ml of dimethyl sulfoxide, and reacted at room temperature for 24 hours. The catalyst was dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da). After dialysis, the reaction product was freeze-dried Served achieved over the powder.

얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.To remove the tert- butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours. Then, the mixture was purified by rotary evaporator After evaporating the trifluoroacetic acid, dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) to remove the remaining solvent and t-Boc- Was lyophilized to obtain a powder.

3. 3. 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민-- Polyethylene imine - 클로린Chlorine ( ( SLSL -- PEIPEI 25K- 25K- Ce6Ce6 )을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조) To prepare a polymeric material for virus treatment interacting with virus

상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 25K -Ce6) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 200배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 25K-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 7).The amount of aminoxy-polyethyleneimine-choline powder prepared to bond the sialic lactose to the aminooxy-polyethyleneimine-choline (Aminooxy-PEI 25K-C6e) prepared above was 200 times Add the sialic lactose to the molar ratio. The reaction was carried out by adjusting the pH of the third distilled water to pH 5.3 with 0.1 mM acetic acid, and then dissolving aminooxy-polyethyleneimine-choline (Aminooxy-PEI 25K-Ce6) and sialic lactose, Lt; / RTI &gt; After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) to remove unreacted materials. After the dialysis, the reaction product was lyophilized to obtain a powder (Fig. 7).

<< 실시예Example 7>  7> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -- 디아미노뷰테인Diaminobutane -포르피린 (- porphyrin ( SLSL -DAB--DAB- PpPp ) 바이러스 ) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. One. 광감각제인Light sensation agent 포르피린와Porphyrin 디아미노뷰테인(DAB-Pp)의Diaminobutaine (DAB-Pp) 접합체 제조 Assembly

디아미노뷰테인(Diaminobutane, DAB)과 포르피린 (Porphyrin , Pp)의 합성시 포르피린의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. 포르피린 150mg, N,N-디사이클로핵실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 62mg, N-하이드록시숙신이미드(N-Hydrosuccinimide, NHS) 35mg을 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5ml에 녹인 후 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 디아미노뷰테인 0.44ml을 디메틸설폭시드 5ml에 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 포르피린 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.A catalyst was used to increase the reactivity of the porphyrin carboxyl group in the synthesis of Diaminobutane (DAB) and Porphyrin (Pp). 150 mg of porphyrin, 62 mg of N, N-dicyclohexycarbodiimide (DCC) and 35 mg of N-hydrosuccinimide (NHS) were dissolved in 5 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) For 4 hours. After reacting for 4 hours, 0.44 ml of diaminobutane was dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide, and the resulting solution was added to the porphyrin solution which had been previously reacted, followed by reaction at room temperature for 24 hours. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove the used solvent and catalyst. After dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain a powder.

2. 2. 시알릭락토오스Sialic lactose -- 디아미노뷰테인Diaminobutane -포르피린 (- porphyrin ( SLSL -DAB--DAB- PpPp )을 접합하여 바이러스 인지능 물질 제조) To produce a virus-cognitive ability substance

상기에서 합성한 디아미노뷰테인-포르피린 합성물과 시알릭락토오스를 접합하기에 앞서 시알릭락토오스의 글루코스 부분에 선택적으로 합성하기 위해 먼저 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester)를 얻은 분말의 1.5배의 몰비율로 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 5ml에 얻은 분말과 함께 넣어 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 분말을 얻어내었다.In order to selectively synthesize the diaminobutane-porphyrin compound and the sialic lactose synthesized above in the glucose portion of the sialic lactose, t-Boc-aminooxyacetyl N-hydroxysuccinimide ester ( t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester) was dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide (DMSO) solution at a molar ratio 1.5 times that of the obtained powder, and the resulting powder was reacted at room temperature for 24 hours. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove the used solvent and unreacted materials. After dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain a powder.

얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다. To remove the tert-butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours and then purified by rotary evaporator After evaporating the trifluoroacetic acid, dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 100-500 Da) to remove remaining solvent and t-Boc- Was lyophilized to obtain a powder.

얻어낸 산물은 t-Boc- 보호 그룹을 제거한 아미노옥시(aminooxy) 반응기를 가진 디아미노뷰테인-포르피린 (aminooxy-DAB-Pp) 형태로, 시알릭락토오스를 접합하기 위해 얻어낸 산물의 1.2 몰비율의 시알릭락토오스를 1차 증류수 10ml을 100uM의 아세틱산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-디아미노뷰테인-포르피린 (aminooxy-DAB-Pp)와 시알릭락토오스를 녹인 후 60℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1 KDa)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 반응물을 얻어내었다.The resulting product was in the form of an aminooxy-DAB-Pp with an aminooxy reactor with the t-Boc-protected group removed, in a 1.2 molar ratio of the product obtained to conjugate the sialic lactose After 10 ml of primary distilled water was adjusted to pH 5.3 with 100 uM of acetic acid, the aminooxy-DAB-Pp and sialic lactose were dissolved, And reacted for 24 hours. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 1 KDa) to remove unreacted substances. After dialysis, the reaction product was lyophilized to obtain a reaction product.

3. 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 (SL-DAB-Pp)을 접합한 물질의 분리 및 정제 3. Isolation and Purification of Sialic Lactose-Diaminobutaine-porphyrin (SL-DAB-Pp) Bonded Material

상기에서 제조된 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 (SL-DAB-Pp) 결합 산물을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 접합체를 6mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 최종산물을 회수하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다(도 8).Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively isolate and purify the sialic lactose-diaminobutaine-porphyrin (SL-DAB-Pp) conjugate prepared above. The sialic lactose-diaminobutane-porphyrin conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 6 mg / ml, and the methanol containing the sialic lactose-diaminobutaine-porphyrin conjugate was subjected to hydrophobic chromatography (sephadex LH-20 ) And the yields were recovered at intervals of 1 minute with the ratio of water to methanol being varied from 5: 5 to 1: 9. The product obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was subjected to methanol removal using a rotary evaporator and the final product was recovered by lyophilization. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR) (FIG. 8).

<< 실시예Example 8>  8> 옥심케미스트리(oxime chemistry)Oxime chemistry 를 이용하여 Using 시알릭락토오스Sialic lactose -폴리에틸렌이민-포르피린 (- polyethylene imine - porphyrin ( SLSL -- PEIPEI -- PpPp ) 바이러스 ) virus 인지능Cognitive ability 물질 제조  Material manufacturing

1. One. 옥심케미스트리를Oxime chemistry 이용하기 위한  For use 아미노옥시그룹이The aminooxy group is 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 25 KDa) 고분자 제조  Introduction of Polyethyleneimine (PEI, M.W = 25 KDa) Polymer

폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W= 25 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, MW=25 KDa) 분자 한 개당 대략 200개 ~ 211개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 200 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 240 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 240 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 10mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=25 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다. Blends amino-oxyacetic acid molecules protected with t-Boc-groups to amine groups in polyethyleneimine (PEI, MW = 25 KDa) to convert the amine groups of polyethyleneimine to aminooxy groups Respectively. About 200 to 211 primary amine groups per molecule of polyethyleneimine (PEI, MW = 25 KDa) were present and the amount of reactants was calculated to convert primary amine groups to aminooxy groups. First, a catalyst was used to increase the reactivity of the carboxyl group of t-Boc-aminooxyacetic acid. 240 mM of t-Boc-aminooxyacetic acid and 240 mM of dicyclohexycarbodiimide (DCC) (1.8, N-hydrosuccinimide, NHS) were dissolved in dimethylformamide After 4 hours of reaction, 20 mM of polyethyleneimine (MW = 25 KDa) was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and the solution was added to the pre-reacted t-Boc-aminooxyacetic acid solution The reaction mixture was allowed to react at room temperature for 36 hours. After 36 hours, the unreacted material was removed, and the precipitate was recrystallized from excess diethylether to remove the solvent and catalyst used to obtain a precipitate. I got it.

2. 2. 아미노옥시아세트산Aminooxyacetic acid -폴리에틸렌이민-포르피린 (- polyethylene imine - porphyrin ( AminooxyaceticacidAminooxyacetic acid -- PEIPEI 25K-Pp)을 접합하여 바이러스 치료효과를 나타내는 고분자 물질 제조 25K-Pp) were bonded to produce a polymer material exhibiting the effect of the virus treatment

상기에서 합성한 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 (t-Boc-Aminooxyacetic acid-PEI) 합성물과 광감작제의 일종인 포르피린 (Protoporphyrin IX, Pp)을 접합하기 위에 포르피린 분자에 있는 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 포르피린 10mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 12 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 12 mM을 디메틸설폭시드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 2mL 에서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 반응물을 디메틸설폭시드 15mL 에 미리 녹여놓은 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 접합체 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.Bonding the t-Boc-aminooxyacetic acid (PEI) compound synthesized above and porphyrin (Protoporphyrin IX, Pp), which is a kind of photosensitizer, the reactivity of the carboxyl group in the porphyrin molecule 12 mM porphyrin, 12 mM dicyclohexycarbodiimide (DCC), and 12 mM N-hydrosuccinimide (NHS) were dissolved in 2 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) After reacting for 4 hours at room temperature, the reaction mixture was added to the t-Boc aminooxyacetic acid-polyethyleneimine conjugate solution preliminarily dissolved in 15 ml of dimethylsulfoxide, and reacted at room temperature for 24 hours. , And the dialysis membrane (Spectra / Por: molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) was dialyzed with primary distilled water for 3 days to remove the used solvent and catalyst. After three freeze-drying the reaction served to obtain a powder.

얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다. To remove the tert- butyloxycarbonyl protecting group from the obtained powder, 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) solution was added, and the mixture was reacted for 2 hours. Then, the mixture was purified by rotary evaporator After evaporating the trifluoroacetic acid, dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) to remove the remaining solvent and t-Boc- Was lyophilized to obtain a powder.

3. 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린 (SL-PEI 25K-Pp)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조3. Preparation of macromolecules for the treatment of viruses which interact with virus by conjugating sialic lactose-polyethyleneimine-porphyrin (SL-PEI 25K-Pp)

상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI 25K -Pp) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 200배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI-Pp)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 9).The aminoxy-polyethyleneimine-porphyrin powder prepared for bonding the sialic lactose to the aminooxy-polyethyleneimine-porphyrin (Aminooxy-PEI 25K -Pp) prepared above was 200 times Add the sialic lactose to the molar ratio. The reaction was carried out by adjusting the pH of the third distilled water to pH 5.3 with 0.1 mM acetic acid, dissolving aminooxy-polyethyleneimine-porphyrin (Aminooxy-PEI-Pp) and sialic lactose, Respectively. After 24 hours, the reaction product was filtered and dialyzed with primary distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, molecular weight cutoff size 12,000 ~ 14,000 Da) to remove unreacted materials. After the dialysis, the reaction product was lyophilized to obtain a powder (FIG. 9).

<< 실험예Experimental Example 1> 바이러스  1> virus 인지능Cognitive ability 물질의 크기 측정 Measure the size of a substance

1. One. 실험을 실시한Experimented 목적 purpose

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 바이러스와 상호작용하기 위해 적정한 크기를 가지고 있는지 확인하는데 목적이 있다. It is an object of the present invention to confirm whether the virus-sensitive substance prepared in the above example has an appropriate size for interacting with viruses.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 제조한 인지능 물질의 입자 사이즈 분포를 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK)를 이용하여 측정하였다.The particle size distribution of the perceptible substance prepared in the above examples was measured using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK).

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 인지능 물질의 입자 사이즈 분포를 Zetasizer Nano ZS로 측정한 결과, SL-PEG-Ce6의 크기는 102.0nm, SL-DAB-Ce6의 크기는 211.3nm, SL-PEI 1.8K-Ce6의 크기는 129.9nm로 측정되었다(도 10). The particle size distribution of the perceptible substance prepared in the above example was measured by Zetasizer Nano ZS. As a result, the size of SL-PEG-Ce6 was 102.0 nm, the size of SL-DAB-Ce6 was 211.3 nm, The size of Ce6 was measured to be 129.9 nm (FIG. 10).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 크기를 측정한 결과 물질의 크기가 100nm~200nm 정도로 인플루엔자 바이러스의 크기로 알려져 있는 80nm~120nm 와 유사한 크기를 갖는 것을 측정하였다. 바이러스와 유사한 크기를 갖는 것이 바이러스와 상호작용하기에 효과적일 것으로 판단할 수 있었다. As a result of measuring the size of the virus-susceptible substance prepared in the above example, the size of the substance was measured to be about 100 nm to 200 nm, which is similar to the size of 80 to 120 nm known as the size of influenza virus. It was concluded that having a virus-like size would be effective for interacting with viruses.

<< 실험예Experimental Example 2> 제조한 바이러스  2> The virus 인지능Cognitive ability 물질의 세포독성 확인 To check the cytotoxicity of substances

1. 실험을 실시한 목적1. Purpose of experiment

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 세포독성을 나타내지 않는 농도를 확인하는데 목적이 있다. It is an object of the present invention to confirm the concentration at which the virus-sensitive substance produced in the above-mentioned Examples does not show cytotoxicity.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 세포독성을 확인하기 위하여 L929 (마우스 섬유아세포), MDCK (개과동물 신장상피세포), A549 (사람 폐암세포)에 대하여 각각의 세포를 96well에 1 × 104 cells/well의 농도로 세포를 각 well에 100ul씩 넣어 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후 각각의 세포에 상기 실시예에서 제조한 인지능 물질을 0.5ug/mL 에서 50ug/mL 까지 다양한 농도로 처리하고 4시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 반응 후 MTT 시험법을 이용하여 세포 생존율을 대조군과 비교하여 계산하였다. 대조군은 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다. MTT 용액 처리 후 나타나는 형광강도를 570nm에서 멀티리더기 (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek)을 이용하여 확인 하였다.To confirm the cytotoxicity of the virus-cognitive substance prepared in the above examples, each cell was plated in 96-well plates at a density of 1 × 10 6 cells / well for L929 (mouse fibroblasts), MDCK (canine kidney epithelial cells) and A549 Cells were plated at a concentration of 4 cells / well in each well and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours. After 24 hours, each cell was treated with various concentrations of the cognitive substance prepared in the above example from 0.5 ug / mL to 50 ug / mL for 4 hours at 37 ° C and 5% CO 2 , and then MTT And cell viability was calculated by comparing with the control group. A control group was used in which no treatment was performed. The fluorescence intensity after MTT solution treatment was confirmed at 570 nm using a multi-reader (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek).

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 일반 세포에서 독성을 나타내는 농도를 파악할 수 있었고, 실시예에서 제조한 물질 모두 5μg/mL 이하의 농도에서 세포 독성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인하였다(도 11). It was confirmed that the cytotoxicity of the virus-cognitive substance prepared in the above example showed almost no cytotoxicity at a concentration of 5 μg / mL or less (FIG. 11) .

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 여러 세포주에서 어떤 농도에서 세포독성을 나타내는지 확인할 수 있었고, 실시예의 인지능 물질 모두 5μg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 제조한 바이러스 인지능 물질을 세포독성이 없으면서 바이러스 치료효과를 보이는 농도 범위를 설정하는데 참고할 수 있었다.It was confirmed that the virus-cognitive substance prepared in the above example showed cytotoxicity at various concentrations in various cell lines, and it was confirmed that the cytotoxicity of all the cognitive substances in the examples hardly shows cytotoxicity at a concentration of 5 μg / mL or less. As a result, we could refer to the virus-carious substance to determine the concentration range showing the effect of virus treatment without cytotoxicity.

<< 실험예Experimental Example 3> 시간 변화에 따른 바이러스  3> Time-varying virus 인지능Cognitive ability 물질의 일반 세포 내로 함입 확인 Confirmation of inclusion of substances into normal cells

1. 실험을 실시한 목적1. Purpose of experiment

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 시간변화에 따라 세포 내로 어느 정도 유입되는지 확인하고, 바이러스와 인지능 물질 간의 반응시간을 결정하고자 하는데 목적이 있다. It is an object of the present invention to determine how much the virus-cognitive substance prepared in the above-mentioned example is introduced into cells according to time and determine the reaction time between the virus and the cognitive substance.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 MDCK 세포 (개과동물 신장상피세표)에 2-3μg/mL의 농도로 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 별로 처리하였다. 4시간 후 DPBS로 2번 세척 후 세포를 회수한 후 유세포 분석기 (Flow cytometer, BD FACSCanto Ⅱ)로 분석하였다.The virus-susceptible substance prepared in the above example was treated at a concentration of 2-3 μg / mL for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 4 hours in MDCK cells (canine kidney epithelium). After 4 hours, the cells were washed twice with DPBS, and then analyzed with a flow cytometer (BD FACSCanto Ⅱ).

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 유세포 분석기로 분석한 결과, SL-PEG-Ce6는 30분-4시간 동안 세포 내 흡수가 큰 변화를 보이지 않았으며, SL-DAB-Ce6는 처리 후 30분부터 세포 내 흡수가 진행되고 시간이 경과함에 따라 더 많은 물질이 세포내 흡수되는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 SL-PEI 1.8K-Ce6, SL-PEI 25K-Ce6도 30분부터 세포내 흡수가 진행되고 시간이 경과함에 따라 더 많은 물질이 세포내로 흡수되는 것을 확인 할 수 있었다(도 12). As a result of the flow cytometry analysis of the virus-susceptible substance prepared in the above example, SL-PEG-Ce6 showed no significant change in intracellular absorption during 30 minutes-4 hours and SL-DAB- Minute, it was confirmed that the intracellular uptake proceeded, and as time passed, more substances were absorbed into the cells. Likewise, SL-PEI 1.8K-Ce6 and SL-PEI 25K-Ce6 also showed intracellular uptake from 30 minutes and more material was absorbed into the cells over time (FIG. 12).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 세포내 흡수를 시간변화에 따라 결과를 유세포 분석기로 관찰하였다. 그 결과 SL-DAB-Ce6의 경우가 30분부터 세포 내로 흡수가 되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 제조한 물질이 실제 세포환경에서 바이러스와 상호작용을 하고 추후 진행되는 실험에서 제조한 인지능 물질과 바이러스의 상호작용시 시간 범위 설정에 있어 참고할 수 있었다. The intracellular uptake of the virus-cognitive substance prepared in the above example was observed with a time-varying flow cytometer. As a result, it was confirmed that SL-DAB-Ce6 was absorbed into cells from 30 minutes. Based on these results, it was possible to refer to the time range of interactions between the cognitive substance and the virus prepared in the later experiments, as the substance interacts with the virus in the actual cell environment.

<< 실험예Experimental Example 4>  4> 플락Flack 억제 분석(Plaque inhibition assay)을 통한 바이러스  Virus through a plaque inhibition assay 인지능Cognitive ability 물질의 바이러스의  Of the virus of matter 세포내Intracellular 감염 억제와 레이저 조사 후 활성화된 바이러스 개수 변화 관찰하여 바이러스 사멸효과 확인 Infection control and observation of the number of activated virus after laser irradiation

1. 실험을 실시한 목적1. Purpose of experiment

바이러스 인지능 물질에 포함되어 있는 광감각제의 효과로 레이저를 조사했을 때 발생되어 지는 일항산소로 바이러스가 불활화되어 감염력을 잃는지 확인하고 세포 내 감염시켰을 때 일정 시간 후 증식된 바이러스의 차이가 있는지 확인하는 데 목적이 있다.The effect of the photosensitizer contained in the virus-cognitive substance confirms whether the virus is inactivated due to anoxic oxygen generated when the laser is irradiated and the virus is lost. The purpose is to make sure.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 3ug/ml 농도와 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza virus A H1N1 A/California/07/2009) 1 × 104 PFU/ml 농도를 1:1로 섞은 후 37℃에서 2시간 반응시킨다. 반응 후 671nm 파장의 레이저를 3 J/cm2의 세기로 조사한 후, MDCK 세포가 있는 12well 세포배양 접시에 0.1mL 씩 넣고 1시간 30분 동안 세포에 바이러스를 감염시킨다. 1시간 30분 후 무혈청 DMEM 배지가 포함된 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 well에 1.5mL 씩 넣어 준 후 굳힌다. 37℃, 5% 조건에서 72시간 동안 배양한다. 72시간 후 고정용액(메탄올:아세트산=3:1)과 크리스탈바이올렛 용액을 1대1로 섞은 후 굳은 겔 위에 2mL씩 넣어준 후, 24시간 염색한다. 염색 후 well에 들어있는 겔을 제거하고 세척하여 건조한 후 염색되지 않은 부분인 플락(plaque)의 개수를 세어 결과를 확인한다. The virus-targeted photosensitizing sialic lactose complex prepared in the above example was mixed at a concentration of 3 ug / ml and a 1: 1 concentration of influenza virus A (Influenza virus A H1N1 A / California / 07/2009) at a concentration of 1 × 10 4 PFU / ml Followed by reaction at 37 ° C for 2 hours. After the reaction, the cells were irradiated with a laser having a wavelength of 671 nm at a rate of 3 J / cm 2 , and 0.1 mL of the cells was placed in a 12-well cell culture dish containing MDCK cells. The cells were infected with virus for 1 hour and 30 minutes. After 1 hour and 30 minutes, add 1.5 mL of 1% agarose gel containing serum-free DMEM medium to each well, and then harden. And cultured at 37 ° C and 5% for 72 hours. After 72 hours, mix the fixing solution (methanol: acetic acid = 3: 1) and the crystal violet solution one by one, add 2 mL to the hard gel, and dye for 24 hours. After the staining, remove the gel in the well, wash it, dry it, count the number of plaques that are not stained, and check the result.

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 바이러스와 반응시킨 후 레이저를 조사하고 이를 세포에 감염시키게 되면, 레이저를 조사한 실험군에서 바이러스가 생성하는 플락의 개수가 감소하는 것을 확인하였다. 실시예에서 제조한 인지능 물질 SL-PEG-Ce6, SL-DAB-Ce6, SL-PEI 1.8K-Ce6, SL-PEI 25K-Ce6를 비교한 결과 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 효과적으로 바이러스를 불활화시키는 것을 확인하였다(도 13). When the virus-cognitive substance prepared in the above example was reacted with a virus and then irradiated with a laser and infected with the virus, it was confirmed that the number of virus-generated flocks decreased in the laser-irradiated experimental group. Comparing the cognitive materials SL-PEG-Ce6, SL-DAB-Ce6, SL-PEI 1.8K-Ce6 and SL-PEI 25K-Ce6 prepared in the examples, the virus- (Fig. 13).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 인지능 물질을 바이러스와 반응시키고 레이저 조사 후 세포에 감염시켰을 때, 감염 후 바이러스가 생성하는 플락의 개수가 감소하였다. 이는 감염력을 가지는 바이러스의 개수가 감소한 것을 의미하고 제조한 인지능 물질이 바이러스의 불활성화를 유도한 것으로 판단하였다. 또한 실시예에서 제조한 인지능 물질에 레이저를 조사하지 않은 실험군에서도 플락의 개수가 감소한 것으로 보아 인지능 물질을 처리하는 것으로도 바이러스의 세포감염을 억제하는 것을 확인하였다. When the cognitive substance prepared in the above example was reacted with the virus and the cells were infected after the laser irradiation, the number of the virus-generated flocks decreased. This means that the number of infectious viruses decreased and that the produced cognitive substance induced virus inactivation. In addition, it was confirmed that the number of the flak was decreased in the experimental group not irradiated with the laser to the cognitive substance prepared in the example, and it was confirmed that the treatment of the cognitive substance also inhibited the cell infection of the virus.

<< 실험예Experimental Example 5> 바이러스 인지능 물질의 바이러스의 세포내 감염 억제 및 바이러스 불활화 정도를 Western blot 실험을 통한 확인 5> Confirmation of viral inactivation and virus inactivation of viral cognitive substance by Western blot

1. One. 실험을 실시한Experimented 목적 purpose

바이러스 인지능 물질과 바이러스를 같이 처리하고 바이러스의 표면단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)를 인식하는 항체를 이용하여 세포내 존재하는 바이러스 단백질의 양을 western blot 실험을 통해 확인한 결과, 바이러스만 처리한 대조군에 비해서 적은 양의 바이러스 표면단백질이 검출되는지 확인하여 실제로 바이러스와 제조한 인지능 물질이 바이러스의 세포내 감염을 억제하는지 확인하는데 목적이 있다.The amount of viral proteins present in the cells was determined by western blot analysis using an antibody that recognizes the hemagglutinin (HA), a surface protein of the virus, The purpose of the present study was to confirm whether a small amount of virus surface protein was detected as compared with the control group, and whether or not the virus and the cognitive substance actually inhibited the intracellular infection of the virus.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 각각 제조한 바이러스 인지능 물질 15 μg/mL 을 MDCK (Canine kidney cell line) 세포 5 × 105 cells/well에 바이러스(인플루엔자 A H1N1 A/California/07/2009) 2 × 104 PFU와 동시에 처리한 후 한 그룹에는 레이저를 조사하고 다른 한 그룹에는 레이저를 조사하지 않고 이틀간 배양한다. 이틀후 Cell lysis buffer (RIPA buffer)처리 후 scraper로 세포가 배양되고 있는 plate의 각 well을 긁어 세포를 모은다. 모은 세포를 원심분리하여 상층액을 분리해 내고 분리해낸 상층액에 존재하는 단백질의 양을 BCA 정량법을 이용하여 정량한다. 각 well에서 정량하여 계산한 단백질의 양을 기준으로 SDS-PAGE를 실시하여 전기영동을 실시한다. 전기영동 후 Gel에 존재하는 단백질을 PVDF membrane에 transfer 시킨 후 5% skim milk 용액으로 blocking 과정을 거친다. Blocking 후 1차 항체(mouse anti-hemagglutinin antibody)로 인플루엔자 A 바이러스의 표면단백질인 헤마글루티닌(HA, Hemagglutinin)에 특이적으로 인식하는 항체를 처리한 후 4℃ 에서 overnight 반응 시킨다. 반응 후 0.1 % tween 20 이 포함되어 있는 TBS buffer 용액으로 충분히 세척 후, 2차 항체(goat anti-mouse antibody HRP conjugated)를 처리한 후 상온에서 2시간 정도 반응 후, 0.1 % tween 20 이 포함되어 있는 TBS buffer 용액으로 충분히 세척한다. 세척 후 Chemi-doc 이라는 장비를 이용하여 blotting하여 나타나는 밴드를 관찰한다. 15 μg / mL of the virus-susceptible substance prepared in each of the above Examples was infected with virus (Influenza A H1N1 A / California / 07/2009) 2 × 10 4 PFU (5 × 10 4 cells / well) in MDCK (Canine kidney cell line) And then one group is irradiated with laser and the other group is cultured without irradiation with laser for two days. After two days, the cell lysis buffer (RIPA buffer) is treated and scraped into each well of the plate where the cells are being cultured. The collected cells are centrifuged to separate the supernatant, and the amount of protein present in the separated supernatant is quantitated by BCA assays. SDS-PAGE is performed on the basis of the amount of protein calculated in each well and electrophoresis is performed. After electrophoresis, proteins present in the gel are transferred to a PVDF membrane and blocked with 5% skim milk solution. After blocking, anti-hemagglutinin (HA), the surface protein of influenza A virus, is treated with a primary antibody (mouse anti-hemagglutinin antibody) and reacted overnight at 4 ° C. After the reaction, the cells were washed thoroughly with TBS buffer solution containing 0.1% tween 20, treated with a secondary antibody (goat anti-mouse antibody HRP conjugate), reacted at room temperature for about 2 hours, Wash thoroughly with TBS buffer solution. After washing, observe the band by blotting using a device called Chemi-doc.

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 바이러스와 함께 처리 후 이틀간 배양한 결과, SL-PEG-Ce6에서는 인플루엔자 표면단백질인 헤마글루티닌이 검출이 된 반면, SL-DAB-Ce6에서는 레이저 조사 유무에 관계없이 세포내에서 인플루엔자 바이러스의 표면단백질은 헤마글루티닌이 검출되지 않은 것을 확인할 수 있었다(도 14). In the SL-PEG-Ce6, hemagglutinin, which is an influenza surface protein, was detected while SL-DAB-Ce6 was detected with laser irradiation , It was confirmed that hemagglutinin was not detected in the surface protein of influenza virus in the cells (Fig. 14).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 바이러스와 함께 세포에 처리하였을 때, 인플루엔자 바이러스이 표면단백질인 헤마글루티닌에 대한 western blot 실험 결과 바이러스 표면단백질이 세포내에서 검출되지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해 제조한 바이러스 인지능 물질이 바이러스가 세포내로 감염되는 것을 충분히 억제하는 것으로 판단하였다.When the virus-cognitive substance prepared in the above example was treated with virus, the virus surface protein was not detected in the cells as a result of the western blot test on hemagglutinin, a surface protein of influenza virus. It was judged that the virus-cognitive substance prepared by this method sufficiently inhibited the virus from infecting the cells.

<< 실험예Experimental Example 6> ELISA  6> ELISA 키트를Kit 이용하여 바이러스  Using virus 인지능Cognitive ability 물질과 바이러스 간의 상호작용 확인 Identification of interactions between substances and viruses

1. 실험을 실시한 목적1. Purpose of experiment

바이러스 표적화 기능을 가진 시알릭락토오스 복합체와 바이러스를 같이 처리하고 바이러스의 표면단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)를 인식하는 ELISA 키트상에서 바이러스만 처리한 대조군에 비해서 더 낮은 바이러스 양이 검출되는지 확인하여 실제로 바이러스와 제조한 시알릭락토오스 복합체가 상호작용을 하는지 확인하는데 목적이 있다.The sialic lactose complex with the virus targeting function was treated in the same way as the virus and the lower virus amount was detected in the ELISA kit recognizing the surface protein of the virus, hemagglutinin (HA) The purpose of this study is to confirm whether the virus actually interacts with the sialic lactose complex.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 각각 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 포함되어 있는 클로린(Ce6)의 농도로 양을 결정하고 바이러스(인플루엔자 A H1N1 A/Puerto Rico/8/1934) 1 × 106 PFU/ml 농도에 0.25ug/ml 10ug/ml 농도로 시료를 준비한 후 ELISA 키트 (Influenza A H1N1 A/Pureto Rico/8/1934 Hemagglutinin ELISA kit, Sino Biological Inc.) 96well판에 농도별 4개의 well을 사용한다. 결과는 멀티리더기를 이용하여 키트의 형광강도를 측정하여 바이러스의 양을 확인한다. (Influenza A H1N1 A / Puerto Rico / 8/1934) at a concentration of 1 × 10 6 PFU / ml of virus (Influenza A H1N1 A / Puerto Rico / 8/1934) ml, and the concentration was adjusted to 0.25 ug / ml at a concentration of 10 ug / ml. Four wells of each concentration were used in a 96 well plate of an ELISA kit (Influenza A H1N1 A / Pureto Rico / 8/1934 Hemagglutinin ELISA kit, Sino Biological Inc.) . The results confirm the amount of virus by measuring the fluorescence intensity of the kit using a multi-reader.

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 바이러스와 함께 인플루엔자 헤마글루티닌 ELISA 키트의 각 well에 농도별로 넣어 주었을 때, 바이러스만 처리한 대조군에 비해서 제조한 시알릭락토오스 복합체를 함께 처리한 군에서 바이러스의 검출이 확연히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 15).  When the virus-targeted photosensitizing sialic lactose complex prepared in the above Example was added to each well of the influenza hemagglutinin ELISA kit together with the virus, the sialic lactose complex prepared as compared to the control group treated with the virus alone It was confirmed that the detection of the virus was significantly reduced in the treated group (Fig. 15).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 바이러스와 함께 처리하였을 때, 인플루엔자 헤마글루티닌 ELISA 키트에 의한 바이러스의 검출량이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 바이러스가 세포내 존재하는 바이러스 유도기(receptor)에 결합하는 것을 제조한 시알릭락토오스 복합체가 방해하고 바이러스의 세포감염을 방해할 수 있을 것으로 판단하였다. When the virus-targeted photosensitizing sialic lactose complex prepared in the above Example was treated with virus, it was confirmed that the amount of virus detected by the influenza hemagglutinin ELISA kit was reduced. It was concluded that the sialic lactose complex, which produced the virus to bind to the existing viral receptor in the cell, could interfere with the cell infection of the virus.

<< 실험예Experimental Example 7> 투과전자현미경을 통한 바이러스와  7> Transmission electron microscopy 표적화Targeting 물질의 상호작용 및 레이저 조사 후 바이러스의 형태 변화 관찰 Observation of morphological changes of virus after interaction of material and laser irradiation

1. 실험을 실시한 목적1. Purpose of experiment

상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체가 바이러스와 실제로 상호작용을 하는지 직접적으로 확인하고 레이저 조사 후 광감각제에 의해 발생하는 일항산소가 바이러스에 어떤 영향을 미치는지 확인하는데 목적이 있다. It is an object of the present invention to directly confirm whether the virus-targeting light-sensitive sialic lactose complex prepared in the above example actually interacts with the virus, and to ascertain the effect of the oxygen species generated by the photosensitizer after the laser irradiation on the virus .

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

바이러스 인지능 물질인 SL-DAB-Ce6에서 25ug/ml의 클로린 농도를 바이러스(인플루엔자 A H1N1 A/PR/8/34) 2.5 × 107 PFU/ml에 처리하고 2시간 37℃에서 반응시킨다. 2시간 후 바이러스-시알릭락토오스 복합체에 671nm 파장의 레이저를 3J/cm2 세기로 조사 후 투과전자현미경 전용 그리드(Grid)에 올린 후 건조시켜 전처리 과정을 한다. 투과전자 현미경으로 바이러스-인지능 물질을 관찰하였다. In the virus-sensitive material SL-DAB-Ce6, the concentration of 25 ug / ml of chlorine was treated with 2.5 × 10 7 PFU / ml of virus (influenza A H1N1 A / PR / 8/34) and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After 2 hours, the virus-sialic lactose complex was irradiated with a laser of 671 nm wavelength at 3 J / cm 2 intensity, and then transferred to a grid for transmission electron microscopy, followed by drying and pretreatment. Transmission electron microscopy was used to observe the virus-cognitive ability.

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 반응시킨 후 투과 전자현미경을 통해 관찰한 결과, 바이러스와 인지능 물질간 서로 붙어있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인지능 물질에 포함되어 있는 광감각제(클로린, Chlorin e6)의 영향으로 바이러스와 인지능 물질을 반응시킨 후 레이저를 조사하였을 때, 바이러스의 외막(envelope)이 일부 파괴되어 있는 것을 관찰하였다(도 16). The virus-cognitive substance prepared in the above example was reacted with the virus and observed through a transmission electron microscope. As a result, it was confirmed that the virus and the cognitive substance were stuck to each other. In addition, it was observed that the envelope of the virus was partially destroyed when the laser was irradiated after reacting the virus with the cognitive substance by the influence of the photosensitizer (chlorine, e6) contained in the cognitive substance 16).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스가 실제로 상호작용을 하는 것을 투과전자현미경을 통해 파악할 수 있었다. 그리고 바이러스와 반응시킨 인지능 물질에 레이저를 조사하면 바이러스의 외막이 파괴되어 불활화가 되는 것으로 예상할 수 있었다.The transmission electron microscope was able to grasp the fact that the virus-cognitive substance prepared in the above example actually interacted with the virus. When the laser was irradiated with the cognitive substance reacted with the virus, it could be expected that the virus outer membrane would be destroyed and become inactive.

<< 실험예Experimental Example 8>  8> 공초점현미경을Confocal microscope 통한 바이러스  Virus through 인지능Cognitive ability 물질의 상호작용 확인 Identification of material interactions

1. 실험을 실시한 목적1. Purpose of experiment

상기 실시예에서 제조한 인지능 물질이 세포주변, 세포막, 세포질 내부에서도 바이러스와 상호작용을 하는지 확인하는 데 목적이 있다. It is an object of the present invention to confirm whether the cognitive substance produced in the above Examples interacts with viruses in the vicinity of the cell, the cell membrane and the cytoplasm.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

MDCK 세포(개과동물 신장 상피세포, 한국세포주은행)를 1 × 105 cells/well의 농도로 2mL의 배양액을 유리 글라스가 덧대어져 있는 6well 세포배양접시에 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양조건에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후 바이러스(인플루엔자 A H1N1 Influenza A H1N1 A/California/07/2009), 시알릭락토오스 복합체(SL-PEG-Ce6, SL-DAB-Ce6), 바이러스-인지능 물질 그룹으로 각각의 well에 처리하고 2시간 동안 세포와 반응시킨다. 바이러스는 1.5 × 105 PFU/ml, 인지능 물질 5ug/ml 농도로 처리하였다. 2시간 후 DPBS로 2번에 걸쳐 세척 후, 세포가 붙어 있는 유리글라스를 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)에서 30분간 세포성장을 정지시키고 고정한 후, DPBS로 2회 세척 후, PBST(PBS 용액에 0.1%의 트윈20)에 5% BSA(Bovine serum albumin)가 포함된 용액을 넣고 30분간 반응시킨 후 DPBS로 2회 세척한다. PBST에 1% BSA가 포함된 용액으로 항바이러스 항체(rabbit Anti-neuraminidase antibody, Abcam)를 희석하여 2ug/ml의 농도로 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 후 DPBS로 2회 세척하고 PBST에 1% BSA가 포함된 용액으로 FITC가 포함된 항토끼 항체(goat Anti-rabbit antibody FITC labeled, Santa cruz)를 희석하여 2ug/ml에 농도로 처리한 후 1시간 반응시킨다. 1시간 후 DPBS로 2회 세척 후 각각의 시료를 처리한 세포에 대해 세포핵 염색을 실시하였다. 결과는 공초점 현미경 (Confocal laser scanning microscope, Carl Zeiss, LSM710)을 이용하여 관찰하였다.MDCK cells (canine kidney epithelial cells, Korean Cell Line Bank) were dispensed in a 6-well cell culture dish in which 2 mL of the culture solution was poured at a concentration of 1 × 10 5 cells / well, CO 2 incubation conditions. After the culture medium was removed, the cells were suspended in each well as virus (Influenza A H1N1 Influenza A H1N1 A / California / 07/2009), sialic lactose complex (SL-PEG-Ce6, SL-DAB- And reacted with the cells for 2 hours. The virus was treated with 1.5 × 10 5 PFU / ml and 5 μg / ml of cognitive substance. After 2 hours, the cells were washed twice with DPBS, and the cells were stained with 4% paraformaldehyde for 30 minutes. The cells were fixed with DPBS, washed twice with PBST (PBS solution, 0.1% Tween 20) was added with a solution containing 5% BSA (Bovine serum albumin) for 30 minutes, followed by washing twice with DPBS. Dilute the anti-viral antibody (rabbit anti-neuraminidase antibody, Abcam) in PBST containing 1% BSA and incubate at a concentration of 2 ug / ml for 1 hour. After 1 hour, the cells were washed twice with DPBS. FITC-conjugated anti-rabbit anti-rabbit antibody (FITC labeled, Santa Cruz) was diluted in PBST containing 1% BSA and treated at a concentration of 2 ug / ml React for 1 hour. After 1 hour, the cells were washed twice with DPBS, and the cells treated with the respective samples were subjected to nucleus staining. The results were observed using confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, LSM710).

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 동시에 세포에 처리한 후 바이러스에 대한 항체를 이용하여 이미지를 확인하고, 광감각제가 빛을 흡수한 후 더 낮은 파장의 빛으로 방출한다는 특성을 이용하여 공초점 현미경에서 바이러스와 제조한 인지능 물질이 동일한 곳에 존재하는 지를 확인하였다. 상기 실시예에서 제조한 인지능 물질을 바이러스와 함께 처리해준 실험군에서 바이러스를 나타내는 색인 초록색의 강도가 증가하는 것을 확인하였다(도 17). The virus-cognitive substance and the virus prepared in the above-mentioned examples were treated with cells simultaneously, and then images were confirmed using an antibody against viruses. Then, the photosensitizer absorbed light and emitted light of lower wavelength The confocal microscope showed that the virus and the cognitive substance were present at the same place. In the experimental group treated with the virus with the cognitive substance prepared in the above example, the intensity of the green color indicating the virus was increased (FIG. 17).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 동시에 처리한 실험군이 그렇지 않은 대조군에 비해 바이러스를 나타내는 초록색의 형광강도가 더 높은 수치를 나타내었고, 또한 실시예 4의 경우가 실시예 3에 비해 동시에 처리한 실험군에서 바이러스에 대한 형광강도와 인지능 물질의 형광강도가 타 실험군 및 대조군에 비해 더욱 큰 것을 확인할 수 있다. 이를 바탕으로 실시예 4에서 제조한 인지능 물질이 인플루엔자 바이러스와 확실히 상호작용하는 것을 확인할 수 있으며, 바이러스와 인지능 물질이 동일한 곳에 존재하게 되면 색이 노란색으로 보이게 되는데 이 부분도 타 실험군에 비해 크게 증가하고 노란색으로 보이는 영역이 크게 존재하는 것으로 실시예 4에서 제조한 인지능 물질이 바이러스와 상호작용하는 것으로 판단하였다.The experimental group treated with the virus-cognitive substance and the virus prepared in the above example showed a higher value of the green fluorescence intensity indicating the virus than the control group not treated with the virus-like substance and the virus, The fluorescence intensity of the virus and the fluorescence intensity of the cognitive substance in the experimental group treated at the same time are larger than those of the other experiment group and the control group. Based on this, it can be confirmed that the cognitive substance prepared in Example 4 interacts with the influenza virus, and when the virus and the cognitive substance are present in the same place, the color appears yellow, And that the visible region in yellow was largely present, indicating that the cognitive substance prepared in Example 4 interacted with the virus.

<< 실험예Experimental Example 9> STD-NMR을 통한 바이러스  9> Virus through STD-NMR 인지능Cognitive ability 물질과 실제 바이러스 유래  Material and actual virus origination 단백질간의Between proteins 상호작용 확인 Confirm interaction

1. One. 실험을 실시한Experimented 목적 purpose

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 바이러스 유래 단백질인 헤마글루티닌과 상호작용을 하는지 확인하여 바이러스와 실제로 상호작용을 하는지 STD-NMR을 통하여 확인하는데 목적이 있다. It is an object of the present invention to confirm whether the virus-cognitive substance prepared in the above example interacts with virus-derived protein hemagglutinin and actually interact with the virus through STD-NMR.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 제조한 인지능 물질과 바이러스 표면 단백질인 헤마글루티닌과의 상호작용을 확인하기 위해 제조한 인지능 물질과 표면단백질을 적정농도로 PBS buffer에 용해 시킨 후, 측정전 튜브에 인지능 물질과 표면단백질을 1:1로 섞은 후 Burker 850 MHz 기기를 이용하여 STD-NMR을 측정한다. The cognitive substance and the surface protein prepared in order to confirm the interaction of the cognitive substance and the virus surface protein, hemagglutinin, prepared in the above Examples were dissolved in PBS buffer at an appropriate concentration, STD-NMR is measured using a Burker 850 MHz instrument after 1: 1 mixing of the active substance and the surface protein.

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 인지능 물질이 유기체 인식 물질인 시알릭락토오스가 바이러스 표면단백질인 헤마글루티닌과 상호작용하는 특정 피크를 제조한 인지능 물질에서 나타나는 것을 확인하였다(도 18). It was confirmed that the cognitive substance prepared in the above example appears in a cognitive substance which has a specific peak interacting with hemagglutinin, which is a virus surface protein (Fig. 18).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스 표면단백질인 헤마글루티닌과 상호작용을 STD-NMR을 통해 측정한 결과 유기체 인식 물질인 시알릭락토오스와 바이러스 표면 단백질과의 상호작용시 나타나는 특정 피크가 동일하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 시알릭락토오스보다 제조한 인지능 물질에서 그 특정 피크의 크기가 더 크게 나타나는 것으로 바이러스 표면 단백질과 더 강하게 상호작용하는 것으로 판단하였다. The interaction between the virus-cognitive substance and the virus surface protein, hemagglutinin, produced in the above-mentioned Example was measured by STD-NMR, and as a result, it was found that a specific peak appearing upon interaction between the sialic lactose, Were found to be the same. In addition, it was judged that the specific peak size was larger in the cognitive substance prepared from the sialic lactose and strongly interacted with the virus surface protein.

<< 실험예Experimental Example 10> 바이러스 감염 동물 모텔을 통한 바이러스 인지능 물질의 바이러스 불활화 능력 및 치료효과 확인 10> Identification of viral inactivation ability and therapeutic effect of virus-sensitive substance through virus-infected animal motel

1. One. 실험을 실시한Experimented 목적 purpose

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 동물모델에서 바이러스 치료효과 및 레이저 조사에 의한 바이러스 불활화로 인한 감염 억제를 확인하는데 목적이 있다.The object of the present invention is to confirm the effect of virus treatment and the inhibition of infection due to virus inactivation by laser irradiation in the animal model of the virus susceptible substance prepared in the above examples.

2. 실험 재료 및 방법2. Materials and Methods

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 동물모델에서 항바이러스효과를 나타내는지 확인하기 위해, 6주령의 BALB/C 마우스에 인플루엔자 바이러스 (인플루엔자 A 바이러스 H1N1 A/California/07/2009)를 양성대조군으로 설정하고 인플루엔자 바이러스와 SL-DAB-Ce6를 5mg/kg, SL-PEI 1.8K-Ce6를 0.5mg/kg, SL-PEI 25K-Ce6를 0.5mg/kg의 농도로 설정하여 바이러스 인지능 물질을 미리 37 ℃에서 2시간 배양하여 상호작용을 유도한 후 671 nm 파장의 레이저의 조사한 그룹(10mW, 300s, 3J), 조사하지 않은 그룹으로 나눈 후 각각의 그룹을 마우스에 비강내 접종하여 바이러스를 전달하고 몸무게와 생존율을 확인하여 실제 동물에서 레이저 조사 유무 및 인지능 물질에 따른 바이러스 감염 억제 효능을 확인하였다. Influenza virus (influenza A virus H1N1 A / California / 07/2009) was administered to 6-week-old BALB / C mice in a positive control group And the influenza virus was set at a concentration of 5 mg / kg of SL-DAB-Ce6, 0.5 mg / kg of SL-PEI 1.8K-Ce6 and 0.5 mg / kg of SL-PEI 25K- The cells were incubated at 37 ° C for 2 hours to induce interactions. The irradiated groups (10mW, 300s, and 3J) of 671 nm wavelength laser were divided into untreated groups. We confirmed the effect of laser irradiation and cognitive substances on viral infection in real animals by checking body weight and survival rate.

3. 결과 확인3. Confirm the results

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 상호작용 후 마우스 비강내로 감염시켰을 때, 바이러스 인지능 물질을 처리하지 않은 바이러스만 마우스내로 감염시킨 군에서는 바이러스의 감염증상으로 나타나는 털의 뭉침현상 및 지속적인 몸무게 감소로 인한 생존율의 감소가 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 상기 제조한 바이러스 인지능 물질과 상호작용한 바이러스를 비강내 감염시킨 마우스 그룹에서는 일시적인 털 뭉침현상 및 바이러스 감염에 따른 몸무게 감소가 나타나지만 9일 뒤부터 털이 정상적으로 변하고 몸무게가 다시 회복하고 생존율의 변화도 나타나지 않은 것을 확인하였다. 더욱이 실시예 4와 실시예 5에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스의 상호작용 후 레이저를 조사한 뒤 비강내 감염시킨 그룹에서는 생존율의 변화도 없을 뿐 아니라 털뭉침현상 및 몸무게의 감소도 관찰되지 않아 바이러스 인지능 물질에 포함되어 있는 광감작제의 역할로 인한 바이러스가 불활성화되어 그 감염력을 상실하여 마우스로 감염되지 않은 것으로 판단되었다(도 19 및 도 20).When the virus-cognitive substance prepared in the above-mentioned example was infected into the mouse nasal cavity after interaction with the virus, only the virus not treated with the virus-susceptible substance was infected into the mouse, and the cluster of hair, And a decrease in survival rate due to continuous weight loss. However, in the mouse group that intravenously infected with the virus that interacts with the virus-cognitive substance prepared above, transient hair clumping and weight loss due to virus infection were observed, but after 9 days, the hair was normalized, the body was regained again, And confirmed that they did not appear. Furthermore, after the interaction between the virus-cognitive substance and the virus prepared in Example 4 and Example 5, the survival rate was not changed in the group infected with the nasal cavity after the laser irradiation and the decrease of the hairiness and the weight was not observed, It was judged that the virus was inactivated due to the role of the photosensitizer contained in the cognitive substance and lost its infectivity and was not infected with the mouse (FIGS. 19 and 20).

4. 결과에 따른 결론4. Result Conclusion

상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 상호작용한 후 레이저의 조사 유무에 따른 바이러스 감염 동물모델에서 항바이러스 효능을 확인한 결과 제조한 바이러스 인지능 물질과 상호작용을 한 후 동물모델에 투여한 그룹에서 바이러스만 감염시킨 마우스보다 생존율의 변화 없이 오랜기간동안 생존해 있는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 인지능 물질에 포함되어 있는 광감작제의 역할로 인해 특정 레이저를 조사해 준 그룹에서는 바이러스 감염에 따른 마우스의 체중의 감소가 나타나지 않고 생존율로 유지하는 것을 관찰하였다. 이로 인해 상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 생체내 바이러스의 감염을 억제하는 역할을 충분히 수행하고 또한 레이저조사에 따른 바이러스를 불활성화를 유도하여 바이러스의 감염을 효과적으로 막고 치료할 수 있는 것을 확인하였다. The antiviral efficacy of virus-infected animal models according to the presence or absence of laser irradiation after interacting with the virus-cognitive substance prepared in the above-mentioned examples was interacted with the virus- We could confirm that survival was maintained for a long period of time in a group without change in survival rate compared with virus infected mice. In addition, we observed that the survival rate of the group irradiated with the specific laser was not decreased due to the virus infection due to the role of photosensitizer contained in the cognitive substance. Thus, it was confirmed that the virus-cognitive substance prepared in the above example sufficiently plays a role of suppressing the infection of the viral virus and can effectively prevent and treat the infection of the virus by inducing inactivation of the virus by laser irradiation .

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

Claims (17)

아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.A sialic lactose complex having a virus-cognate ability to which a sialyl lactose is conjugated with a linkage to which an aminooxy group is introduced. 청구항 1에 있어서, 상기 시알릭락토오스 복합체는 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 광감각제가 추가적으로 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.The sialic lactose complex according to claim 1, wherein the sialic lactose complex has a virus-cognitive ability to which a photosensitizer is additionally conjugated to a linkage to which the aminooxy group is introduced. 청구항 1에 있어서, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.[Claim 4] The method according to claim 1, wherein the linking member is selected from the group consisting of polyethylene glycol, diaminobutane, polyethyleneimine, pullulan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, chitosan, polycaprolactone and polydioxan Gt; sialic &lt; / RTI &gt; lactose complex. 청구항 2에 있어서, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.3. The sialic acid-lactose complex according to claim 2, wherein the photosensitizer is chlorins or phophyrins. 청구항 1에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.The sialic lactose complex according to claim 1, wherein the virus is selected from the group consisting of influenza virus, coronavirus, adenovirus, reovirus, and rotavirus. 청구항 2에 있어서, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민(SL-PEI)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.The method of claim 2 wherein the sialic lactose complex is selected from the group consisting of sialic lactose-polyethylene glycol-chlorine (SL-PEG-Ce6), sialic lactose-diaminobutaine-chlorine (SL-DAB-Ce6), sialic lactose- (SL-PEI-P6), sialic lactose-diaminobutaine-porphyrin (SL-DAB-Pp), sialic lactose-polyethyleneimine-porphyrin (SL-PEI). &Lt; / RTI &gt; 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 따른 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물.A composition for diagnosing a virus comprising the sialic lactose complex according to any one of claims 1 to 6 as an active ingredient. 청구항 7에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 조성물.The virus diagnosis composition according to claim 7, wherein the virus is selected from the group consisting of influenza virus, coronavirus, adenovirus, reovirus and rotavirus. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 따른 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating viral diseases comprising the sialic lactose complex according to any one of claims 1 to 6 as an active ingredient. 청구항 9에 있어서, 상기 바이러스 질환은 인플루엔자바이러스로 인한 질환, 코로나바이러스로 인한 호흡기 질환, 아데노바이러스로 인한 질환, 로타바이러스로 인한 질환 및 레오바이러스로 인한 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 질환 치료 또는 예방용 약학조성물.[Claim 11] The viral disease according to claim 9, wherein the viral disease is selected from the group consisting of diseases caused by influenza viruses, respiratory diseases caused by coronaviruses, diseases caused by adenoviruses, diseases caused by rotaviruses and diseases caused by reoviruses &Lt; / RTI &gt; 1) 아미노옥시 그룹을 도입하여 연결체의 반응기를 활성화시키는 단계; 및
2) 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 시알릭락토오스를 접합하는 단계를 포함하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.1) introducing an aminooxy group to activate a reactant of the conjugate; And
2) A method for producing a sialic lactose complex having a virus-cognate ability, which comprises the step of binding a sialic lactose to a conjugate into which the aminooxy group is introduced. 청구항 11에 있어서, 상기 시알릭락토오스 복합체 제조방법은 상기 (1) 단계 이후 광감각제를 추가적으로 접합하는 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.[Claim 11] The method for producing a sialic lactose complex according to claim 11, wherein the method further comprises bonding the photosensitizer after the step (1). 청구항 11에 있어서, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.[Claim 12] The method according to claim 11, wherein the link member is selected from the group consisting of polyethylene glycol, diaminobutane, polyethyleneimine, pullulan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, chitosan, polycaprolactone and polydioxan &Lt; / RTI &gt; 청구항 12에 있어서, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.[Claim 12] The method according to claim 12, wherein the photosensitizer is chlorins or phophyrins. 청구항 11에 있어서, 상기 1) 단계는 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester) 또는 t-Boc-아미노옥시아세트산(t-Boc-aminooxyacetic acid)으로 활성화시키는 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.12. The method of claim 11, wherein step 1) is performed using t-Boc-aminooxyacetyl N-hydroxysuccinimide ester or t-Boc-aminooxyacetic acid (t-Boc -aminooxyacetic &lt; / RTI &gt; acid). &lt; / RTI &gt; 청구항 12에 있어서, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민(SL-PEI)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.The method of claim 12 wherein the sialic lactose complex is selected from the group consisting of sialic lactose-polyethylene glycol-chlorine (SL-PEG-Ce6), sialic lactose-diaminobutaine-chlorine (SL-DAB-Ce6), sialic lactose- (SL-PEI-P6), sialic lactose-diaminobutaine-porphyrin (SL-DAB-Pp), sialic lactose-polyethyleneimine-porphyrin (SL-PEI). &Lt; / RTI &gt; 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.

12. The method of claim 11 or 12, wherein the virus is selected from the group consisting of influenza virus, coronavirus, adenovirus, reovirus, and rotavirus.

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