KR20180042697A

KR20180042697A - 신규한 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 k 제조방법

Info

Publication number: KR20180042697A
Application number: KR1020160135189A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 신경철; 김태훈
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2018-04-26
Also published as: KR101878392B1

Abstract

본 발명은 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 균주로부터 유래한 고온성 β-글리코시다아제(β-glycosidase) 효소를 이용하여 고수율의 진세노사이드 컴파운드 K를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 β-글리코시다아제 효소를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다. 특히, 본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 사용하면, 70℃ 이상의 고온에서도 반응을 수행할 수 있어 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시킬 수 있고, 동시에 주요 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 C-K로 전환함에 있어서 다른 부산물을 생산하지 않아 빠르고 특이적인 C-K 전환 반응이 가능하여 생산 수율을 증가시켜 고수율의 C-K를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 이용한 C-K 생산 방법은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 K 제조방법{Preparation method of ginsenoside compound K using a novel thermostable β-glucosidase}

본 발명은 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 균주로부터 유래한 고온성 β-글리코시다아제(β-glycosidase) 효소를 이용하여 고수율의 진세노사이드 컴파운드 K를 생산하는 방법에 관한 것이다.

β-글리코시다아제는 올리고당이나 배당체의 글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하여 글루코오스를 생성하는 효소를 의미한다. 진세노사이드는 기본 구조에 글루코오스와 기타 당들의 결합으로 이루어져 있는데 고온성 β-글리코시다아제는 인삼뿌리 추출물에서 글루코오스 및 아라비노스 부분을 가수분해 함으로 목적하는 진세노사이드를 생산 하는데 사용될 수 있다. 또한 이 β-글리코시다아제는 미생물에서부터 고등 동식물에 이르기까지 넓은 범위에서 발견되는 효소이기도 하다.

진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K, C-K)는 하기 [화학식 1]로 표기 되는 화합물이다. 인삼에 풍부하게 포함된 성분으로서 잘 알려진 진세노사이드 화합물 중에서, C-K는 극미량 포함되어있는 희귀한 성분이기 때문에, 인삼에 대량 포함된 주요 진세노사이드인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd로부터 글루코오스(glucose) 및 아라비노스(arabinose)를 선택적으로 가수분해하여 생 전환된 C-K를 생산할 수 있다.

C-K의 효과로는 면역 증강 작용, 종양 혈관 신생 작용 억제작용, 암세포 침윤 억제작용, 암세포 증식 억제작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 피부 내에서 단백질과 점성 용액이나 겔을 형성하여 조직구조의 유지 및 윤활작용 등을 하는 히알루론산(hyaluronic acid)의 생성에 큰 영향을 주어 주름 개선 효과가 있는 것으로 알려져 화장품 산업에 크게 이용되고 있다. 이에 따라, C-K를 건강식품, 화장품 산업 분야에 있어 안정적이고 효율적으로 생산할 수 있는 공정이 보다 요구되고 있다.

[화학식 1]

.

기존 C-K는 10 내지 50 ℃ 범위의 중온성 효소를 이용하여 생산되고 있지만, 이 효소는 낮은 반응 온도에서 작용하기 때문에 미생물에 오염되기 쉽고 생산 수율도 떨어지는 문제점이 있다. 최근 C-K 생산에 관련하여 비교적 수율이 높다고 보고된 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래 β-글리코시다아제(β-glycosidase)의 경우 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd 및 컴파운드 엠시(Mc)로 전환하는 반응이 동시에 나타나, Mc의 축적으로 인해 C-K로의 100% 전환이 되지 않는다는 제한점이 있다. 따라서, 산업적으로 유용하며 고수율의 C-K를 생산할 수 있는 고온성 효소를 개발하는 것이 절실히 필요하다.

고온성 효소를 사용하여 C-K를 합성하는 것과 관련하여, 고온성 베타-글리코시다제 효소를 이용하여 C-K 및 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol)의 생산 방법에 관하여 보고된 바 있다(특허문헌 001 내지 특허문헌 005). 이 외에도 β-글리코시다아제(β-glycosidase)와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase) 두 가지 효소를 혼합하여 프로토파낙사디올형태의 진세노사이드에 대한 C-K의 몰 수율을 100% 근처까지 증가시킬 수 있음이 보고된 바 있다(비특허문헌 002). 그러나, 상기 보고된 방법에서 사용한 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase) 효소는 미생물에서 잘 발현되지 않고 활성이 낮아 아라비노퓨라노스 잔기를 함유된 진세노사이드 Rc로부터 C-K로의 전환 과정에서 효소 준비에 어려움이 많아 산업화에 한계가 있으며, 두 가지 효소를 사용함에 따라 공정이 복잡하여 비효율적이다.

따라서, 본 발명자들은 단일 효소에 의한 고수율의 C-K 생산방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 초고온성 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 균주 유래의 고온성 β-글리코시다아제 유전자를 형질전환 미생물에서 과발현하고, β-글리코시다아제를 인삼뿌리 추출물과 반응시켜 이로부터 C-K를 생전환한 결과, 높은 반응온도에서 빠른 반응속도로 생전환 반응이 가능하여 C-K로의 전환율이 99.9% 이상 나타날 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1079293 B2 (2011.10.27) KR 10-1210453 B2 (2012.12.04) KR 10-1156204 B2 (2012.06.07) KR 10-1210454 B2 (2012.12.04)

Kyeong-Hwan Noh et al.(2009) Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 73(2), 316-321. Kyung-Chul Shin et al. PLoS One 10(12), e0145876, 2015). Kim SK, Kwak YS, Kim SW, Hwang YS, Ko ys, Yoo CM : Improved method for the preparation of crude ginseng saponin. J. Ginseng Res 1988;22;155-160

이에, 본 발명자들은 칼디셀루로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 고온성 β-글리코시다아제를 사용하였을 때 인삼 추출물 내의 진세노사이드 화합물을 진세노사이드 컴파운드 K로 전환할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고온성 미생물 유래의 고온성 β-글리코시다아제를 이용하여 고수율의 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 i) 내지 iii)의 단계를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법을 제공한다:

i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 β-글리코시다아제(β-glycosidase)를 삼(ginseng) 추출물 또는 반응 배지에 첨가하여 반응액을 제조하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 제조한 반응액을 반응시키는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K, C-K)를 분리하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 β-글리코시다아제는 칼디셀루로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 단백질인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼을 용매 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 반응 배지는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)의 반응은 1 내지 40 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 초고온성 칼디셀룰로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다. 특히, 본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 사용하면, 70℃ 이상의 고온에서도 반응을 수행할 수 있어 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시킬 수 있고, 동시에 주요 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 C-K로 전환함에 있어서 다른 부산물을 생산하지 않아 빠르고 특이적인 C-K 전환 반응이 가능하여 생산 수율을 증가시켜 고수율의 C-K를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 이용한 C-K 생산 방법은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제에 대한 반응 pH의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제에 대한 반응 온도의 효과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래 β-글리코시다아제의 온도 안정성 확인을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제를 이용하여 인삼추출물 내의 주요 진세노사이드로부터 C-K의 생전환 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 인삼 내 사포닌 성분 중 극미량 포함되어있는 희귀 진세노사이드인 컴파운드 K는 의약산업, 식품산업 및 화장품 산업 등에서 다양하게 사용할 수 있으나 희귀 성분이므로, 고수율로 전환 생산하는 공정의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 초고온성 칼디셀룰로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 i) 내지 iii)의 단계를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법을 제공한다:

ii) 상기 단계 i)에서 제조한 반응액을 반응시키는 단계; 및

본 발명의 단계 i)의 β-글리코시다아제는 칼디셀루로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 단백질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 β-글리코시다아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.

본 발명의 β-글리코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 β-글리코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환된 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단계 i)의 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼을 용매 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 용매 추출은 물, C1내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것일 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 단계 i)의 반응 배지는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단계 ii)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 pH 4.5 내지 6.5에서 수행하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 pH 5.5에서 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 β-글리코시다아제가 효율적으로 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)를 생산할 수 있는 활성이 유지되는 pH 범위라면 어떤 조건에서 수행하여도 무방하다.

본 발명의 단계 ii)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 70 내지 80℃에서 수행하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 75 내지 80℃에서 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 β-글리코시다아제가 효율적으로 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)를 생산할 수 있는 활성이 유지되는 온도 범위라면 어떤 조건에서 수행하여도 무방하다. 보다 바람직하게는, β-글리코시다아제의 열안정성을 고려하였을 때, 본 발명의 단계 ii)의 반응은 75℃에서 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단계 ii)의 반응은 1 내지 40 시간 동안 수행하는 것이 바람직하고, 구체적으로 10 내지 20 시간 동안 수행하는 것이 더욱 바람직하며, 보다 구체적으로 10 내지 15 시간 동안 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 반응액 내에 포함된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd가 전부 C-K로 전환될 수 있는 시간 범위에서 자유롭게 조절할 수 있다. 다만, 본 발명의 효소 반응 공정의 시간을 단축하였을 때 생산성이 높아지고 단가가 저렴해 효과적이라는 측면에서, 짧은 반응 시간 동안 최대 전환수율을 나타낼 수 있는 조건의 범위를 선택하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제를 C-K 합성 반응에 이용하기 위해, β-글리코시다아제 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 형질전환한 대장균으로부터, β-글리코시다아제를 과발현하였다.

또한, 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제를 이용한 C-K 합성 반응의 최적 조건을 설정하기 위해 생물화학적 특성을 확인한 결과, β-글리코시다아제의 최적 pH는 pH 5.5이며, 최적 반응 온도는 80℃인 것을 확인하여, 본 발명의 β-글리코시다아제는 고온성 효소로서 열 안정성을 가져 고온 반응에 사용하여도 효율적일 것으로 확인하였다(도 1 내지 도 3).

아울러, 본 발명자들은 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제를 이용하여 C-K 합성 반응을 수행한 결과, pH 5.5로 조절한 인삼 추출물을 기질로 하여 β-글리코시다아제를 첨가하였을 때, 75℃ 온도에서 6 시간 동안 배지 내 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 C-K로 전환할 수 있음을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제는 종래 고온성 미생물 유래의 β-글리코시다아제로서 C-K 합성에 사용 할 수 있는 것으로 보고된 β-글리코시다아제보다 C-K 생산성 및 전환율이 높은 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 초고온성 칼디셀룰로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다. 특히, 본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 사용하면, 70℃ 이상의 고온에서도 반응을 수행할 수 있어 고수율의 C-K를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 이용한 C-K 생산 방법은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

칼디셀룰로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii ) 유래의 β-글리코시다아제의 발현

<1-1> 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명의 고온성 β-글리코시다아제를 제조하기 위하여, 칼디셀룰로시럽터 베시의 유전자로부터 β-글리코시다아제를 암호화하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제의 재조합 벡터를 만들기 위하여 Gibson 어셈블리 방법을 이용하여 β-글리코시다아제를 암호화는 염기서열을 증폭하였다. 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제의 공지된 염기서열(Genebank 번호: ACM59590, 서열번호 1)을 기반으로 하여, 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 정방향 프라이머(서열번호 3: 5`-CAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATATGAGTTTACCAAAAGGA TTTCTGTGGGG-3`) 및 역방향 프라이머(서열번호 4: 5`-ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTC GAGTTATGAGTTTTCCTTTATATACTGCTGATA-3`)를 제작하여, 이를 사용해 PCR 반응으로 β-글리코시다아제를 암호화는 염기서열을 증폭하였다. 발현 벡터는 pET 28(+)a(Novagen사 제품)를 사용하였으며, 제한효소 없이 ligation하여 제작한 발현 벡터를 pET 28(+)a/β-글리코시다아제로 명명하였다. 그런 다음, pET 28(+)a/β-글리코시다아제를 대장균에 형질전환하고, C-K의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에는 20% 글리세린 용액을 첨가하여 -70 ℃에 냉동 보관하였다.

<1-2> 고온성 β-글리코시다아제의 발현 및 제조

효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 첨가한 500 ㎖의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지를 포함하는 플라스크에 접종하고, 200 rev/min의 통기조건으로 37℃에서 배양하였다. 배양한 재조합 대장균의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, β-글리코시다아제의 과발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다. 배양 후, 배지를 수득하고 3000 rpm으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 침전된 균체를 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음, C-K를 생산하기 위한 효소의 정제를 위해 사용하였다.

또한 상기와 같이 생산된 고온성 β-글리코시다아제 효소를 정제하기 위하여, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 13,000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리한 다음 상기 세포 용액을 프렌치 프레서로 15,000 lb/in²에서 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000 rpm 으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 고온인 70℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000 rpm 으로 4℃에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 그 결과 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 C-K의 생산을 위한 효소액으로 분리하였다.

고온성 β-글리코시다아제의 생물화학적 특성 확인

본 발명에서는 상기 실시예 1에서 분리한 고온성 β-글리코시다아제 효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.

<2-1> 고온성 β-글리코시다아제의 효소 활성 측정

베타-글리코시다제 활성 측정에는 순수 분리된 진세노사이드 Rd를 사용하였다. 구체적으로 상기 반응에는 최종농도 1 mM 진세노사이드 Rd, 50 mM pH 5.5 구연산나트륨 완충용액 및 효소를 희석하여 총 부피 1 ㎖이 되게 섞은 후 95℃ 20분 동안 반응을 진행시켰다. 또한 1 ㎖ n-butanol의 첨가로 상기 반응을 정지시켰다. 이때 사용된 진세노사이드 Rd와 효소반응으로 인하여 생성된 컴파운드케이의 양은 VWD 검출기 및 YMC-PackTM Pro C18TM의 칼럼이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 실시하여 산정하였고, YMC-PackTM Pro C18TM 칼럼은 37℃에서 1 ㎖/분 속도로 0%에서 80%까지 아세토니트릴을 통과시키도록 하였다. 이때 효소의 단위(Unit)는 1 마이크로몰(μmole) 의 컴파운드케이를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한 효소 단백질의 양으로는 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 기준으로 한 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 산정하였다

<2-2> 고온성 β-글리코시다아제의 최적 반응 pH 확인

먼저 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제에 대한 반응 pH의 효과를 조사하기 위하여, pH 4.5 내지 7.0의 범위로 조절한 킬바인(Mcilvaine) 완충용액에 0.4 ㎎/㎖ 진세노사이드 Rb1 및 0.2 ㎎/㎖ β-글리코시다아제를 가하고, 80℃에서 20분 동안 반응을 유도하였다. 반응 후, 각각의 pH에서의 β-글리코시다아제 효소 활성을 확인하여, 가장 높은 β-글리코시다아제 활성을 나타내는 pH를 최적 pH로서 정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바아 같이 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제의 최적 반응 pH는 5.5인 것을 확인하였다(도 1).

<2-3> 고온성 β-글리코시다아제의 최적 반응 온도 확인

본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제에 대한 반응 pH의 효과를 조사하기 위하여, pH 5.5의 킬바인 완충용액에 0.4 ㎎/㎖ 진세노사이드 Rb1 및 0.2 ㎎/㎖ β-글리코시다아제를 가하고, 70 내지 90℃에서 20분 동안 반응을 유도하였다. 반응 후, 각각의 온도에서의 β-글리코시다아제 효소 활성을 확인하여, 가장 높은 β-글리코시다아제 활성을 나타내는 온도를 최적 온도로서 정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바아 같이 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제의 최적 반응 온도는 80℃인 것을 확인하였다(도 2).

<2-4> 고온성 β-글리코시다아제의 온도 안정성 조사

본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 70℃ 내지 90℃의 온도 범위에서 β-글리코시다아제의 활성이 절반으로 감소할 때까지 소요되는 시간을 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 본 발명의 β-글리코시다아제는 유의적인 온도안정성을 가져 70℃에서 134 시간, 75 ℃에서 28 시간, 80℃에서 4.5 시간; 및 85 ℃에서 5 분의 효소활성 반감기를 가지는 것을 확인하였다(도 3).

고온성 β-글리코시다아제를 이용한 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)의 생산

<3-1> 인삼뿌리 추출물의 제조 및 진세노사이드 함량 분석

인삼추출물의 제조는 MeOH/water mixture(4:1 v/v) 1 l 에 100 g 의 건조된 인삼 가루를 넣고 80 ℃에서 1시간 동안 추출한 후 필터링과 농축을 거쳐 1 ℓ의 2차 증류수에 녹여 실험에 사용하였다(비특허문헌 003). 제조한 인삼 뿌리 추출물 내의 진세노사이드 함량은 HPLC 분석으로 정량하였다.

그 결과, 10% 인삼뿌리 추출물 수용액에 1.25 ㎎/㎖ 진세노사이드 Rb1; 0.47 ㎎/㎖ Rb2; 0.69 ㎎/㎖ Rc; 및 0.19 ㎎/㎖ Rd가 함유된 것을 확인할 수 있었다.

<3-2> 인삼뿌리 추출물로부터 β-글리코시다아제를 이용한 C-K의 생산

본 발명에서 확인한 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제의 최적 반응 조건을 적용하여, 인삼뿌리 추출물로부터 C-K로의 생전환을 수행하였다. β-글리코시다아제의 최적 반응 온도는 80℃이지만 온도 안정성의 관점에서 반응 온도는 75℃로 선정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 pH 5.5 환경의 10% 인삼뿌리 추출물에 β-글리코시다아제를 15 ㎎/㎖ 농도로 가하였다. 그런 다음, 75 ℃에서 6 시간 동안 반응을 유도하여 C-K를 합성하였다. 반응 후, 반응액을 수득하고 HPLC 분석하여 합성된 C-K의 생산량을 구하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 β-글리코시다아제는 최적 반응 조건에서 유의적인 C-K 합성 활성을 나타내어, 6 시간의 반응 동안 인삼뿌리 추출물 내의 프로토파낙사디올 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 C-K로 전환하였고, 이 때의 최종 생산량이 1.49 ㎎/㎖임을 확인하여, 100%의 전환율을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).

종래 보고된 연구들에 의하면, C-K 생산을 위해 사용되는 β-글리코시다아제 중 가장 높은 생산성을 나타내는 것은 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제인 것으로 알려져 있다(비특허문헌 0001). 보고에 따르면, 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제는 인삼뿌리 추출물로부터 12 시간의 반응을 통해 총 1.63 ㎎/㎖의 생산량으로 C-K를 생산하였고, 이 때의 전환율은 80%인 것으로 보고된 바 있다.

이를 본 발명의 칼디셀룰로시럽터 베시 유래의 β-글리코시다아제와 비교하였을 때, 본 발명의 β-글리코시다아제는 한 가지 효소를 사용하여 짧은 시간 동안 높은 생산성을 나타낼 수 있으며 이 때의 전환율이 100%를 나타낼 수 있으므로, C-K 생합성에 효과적인 것을 확인하였다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Preparation method of ginsenoside compound K using a novel thermostable b-glucosidase <130> 1061545 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 1 Met Ser Leu Pro Lys Gly Phe Leu Trp Gly Ala Ala Thr Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Glu Asp Gly Lys Gly Glu Ser Ile Trp 20 25 30 Asp Arg Phe Thr His Gln Lys Gly Asn Ile Leu Tyr Gly His Asn Gly 35 40 45 Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Phe Glu Glu Asp Val Ser Leu 50 55 60 Met Lys Glu Leu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ala 65 70 75 80 Arg Ile Phe Pro Asp Gly Phe Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly Leu Glu 85 90 95 Phe Tyr Asp Arg Leu Ile Asn Lys Leu Val Glu Asn Gly Ile Glu Pro 100 105 110 Val Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Lys Leu Gln Asp Ile 115 120 125 Gly Gly Trp Ala Asn Pro Glu Ile Val Asn Tyr Tyr Phe Glu Tyr Ala 130 135 140 Met Leu Ile Val Asn Arg Tyr Lys Asp Lys Val Lys Lys Trp Ile Thr 145 150 155 160 Phe Asn Glu Pro Tyr Cys Ile Ala Phe Leu Gly His Phe Tyr Gly Val 165 170 175 His Ala Pro Gly Ile Lys Asp Phe Lys Val Ala Met Asp Val Val His 180 185 190 Asn Ile Met Leu Ser His Phe Lys Val Val Lys Ala Val Lys Glu Asn 195 200 205 Asn Ile Asp Val Glu Val Gly Ile Thr Leu Asn Leu Thr Pro Val Tyr 210 215 220 Phe Gln Thr Glu Arg Leu Gly Tyr Lys Val Ser Glu Ile Glu Arg Glu 225 230 235 240 Met Val Asn Leu Ser Ser Gln Leu Asp Asn Glu Leu Phe Leu Asp Pro 245 250 255 Val Leu Lys Gly Ser Tyr Pro Gln Lys Leu Phe Asp Tyr Leu Val Gln 260 265 270 Lys Asp Leu Leu Glu Thr Gln Lys Val Leu Ser Met Gln Gln Glu Val 275 280 285 Lys Glu Asn Phe Val Phe Pro Asp Phe Leu Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr 290 295 300 Arg Ala Val Arg Leu Tyr Asp Glu Asn Ser Asn Trp Ile Phe Pro Ile 305 310 315 320 Arg Trp Glu His Pro Ala Gly Glu Tyr Thr Glu Met Gly Trp Glu Val 325 330 335 Phe Pro Gln Gly Leu Tyr Asp Leu Leu Ile Trp Ile Lys Glu Ser Tyr 340 345 350 Pro Gln Ile Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Asn Asp 355 360 365 Lys Val Glu Asp Gly Arg Val His Asp Gln Lys Arg Val Glu Tyr Leu 370 375 380 Lys Gln His Phe Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ile Glu Asn Gly Val Asp 385 390 395 400 Leu Arg Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ala 405 410 415 Met Gly Tyr Thr Lys Arg Phe Gly Val Ile Tyr Val Asp Tyr Glu Thr 420 425 430 Gln Lys Arg Ile Lys Lys Asp Ser Phe Tyr Phe Tyr Gln Gln Tyr Ile 435 440 445 Lys Glu Asn Ser Glx 450 <210> 2 <211> 1359 <212> DNA <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 2 atgagtttac caaaaggatt tctgtggggt gctgcaactg catcatatca gattgagggt 60 gcttggaatg aagatggaaa aggtgaatct atatgggaca ggtttacaca tcaaaaagga 120 aatattttat atggtcataa tggcgacgtt gcctgtgacc actatcatag gttcgaagaa 180 gatgtctctc ttatgaaaga acttggacta aaagcctaca ggttttctat tgcatgggcg 240 agaatttttc cagatggttt cggtactgtg aatcaaaaag gtcttgagtt ttatgataga 300 ctcatcaaca agcttgttga aaacggtatt gaaccggttg tcaccattta tcactgggat 360 cttcctcaaa agctacaaga cattggcggt tgggcaaacc cagaaattgt aaattattat 420 tttgaatatg caatgcttat cgtaaaccgt tataaagaca aagtaaaaaa atggataaca 480 tttaatgaac cttattgtat tgcctttttg ggacactttt atggagttca tgcaccagga 540 ataaaagact ttaaagttgc aatggatgtt gtgcacaaca ttatgctttc tcattttaag 600 gttgtaaaag ctgtaaagga aaacaatatt gatgttgagg taggaattac actaaattta 660 actccagttt actttcaaac agagcgtctt ggatataagg taagcgaaat tgaaagagaa 720 atggtaaacc tcagcagcca gcttgacaat gaacttttcc ttgatccagt actcaaagga 780 agctatccac aaaagctgtt tgattacctt gttcaaaaag atttgttgga aactcaaaaa 840 gtattgagta tgcagcagga agtaaaagaa aatttcgttt ttcctgattt tcttggtatc 900 aactactata cacgtgctgt caggctttac gatgaaaatt ctaactggat atttccaata 960 agatgggaac atcctgcagg agagtacacc gagatgggct gggaagtgtt cccacaagga 1020 ctttatgatc ttttgatttg gattaaagaa agttacccac aaattccaat ttatataaca 1080 gaaaacggtg ctgcttataa cgacaaggta gaagatggaa gagttcatga ccaaaagaga 1140 gtggagtatt taaaacagca ctttgaagca gcaagaaagg caattgaaaa tggagtggat 1200 ttgcgaggtt attttgtgtg gtctttgttg gacaatcttg aatgggcaat gggttataca 1260 aaaaggtttg gagttatata tgtggactat gaaacccaaa aaaggattaa aaaagacagc 1320 ttctattttt atcagcagta tataaaggaa aactcataa 1359 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_primer <400> 3 cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatat atgagtttac caaaaggatt tctgtgggg 59 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_primer <400> 4 atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag ttatgagttt tcctttatat actgctgata 60 60

Claims

i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 β-글리코시다아제(β-glycosidase)를 삼(ginseng) 추출물 또는 반응 배지에 첨가하여 반응액을 제조하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 제조한 반응액을 반응시키는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K, C-K)를 분리하는 단계를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 β-글리코시다아제는 칼디셀루로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼을 용매 추출한 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 반응 배지는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 반응은 1 내지 40 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.