KR20170143464A - 분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

Description

분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for Prevention or treatment of bone diseases comprising postpartum tissue extracts and inhibitor of epidermal growth factor as active ingredients}
본 발명은 분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors, EGF) 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
뼈는 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호해주며 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉, 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 성장이 끝난 성인의 뼈는 오래된 뼈를 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 되는데, 이를 골 재형성(bone remodeling)이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl);664-669, 2005). 이러한 뼈의 순환은 성장과 스트레스에 의해 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고, 그 기능을 유지하는데 필수적이다. 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 골흡수-골형성의 리모델링을 통하여 재형성된다.
골 재형성은 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다. 예를 들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand) 및 그의 유도 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지한다. 이러한 골의 항상성이 물리적 영향, 호르몬 체계 등에 의해 유지되지 않은 경우 및 골조직 손상시 동반되는 골질환의 치료와 관련하여 과거에는 주로 골 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 연구가 진행되어 왔으며, 그 기전 규명에 있어서 진전을 보지 못하였다. 일반적으로, 골다공의 치료 및 예방을 위하여 칼슘이 함유된 식이요법이 추천되며, 폐경기의 여성들에게는 에스트로겐 또는 비타민 D 투여가 추천되고 있다. 그 외에, 포사맥스(Fosamax, 성분명: alendronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열이 파골세포를 억제하고 사멸을 유도하는 골흡수 억제제로서 새로운 대체 치료제로 주목받고 있다. 그러나, 골질환 치료제로 널리 사용되는 칼슘보강제는 부갑상선 호르몬의 분비를 억제하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하나, 골량 유지의 개인 차이가 심한 것으로 알려져 있다(Heandy R.P. principles of bone biology, Academic press, 1007-1017, 1996). 또한, 에스트로겐이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된바 있다(Nelson, H.D et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J.Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-7152-3). 또한, 비스포스포네이트 제제의 경우, 최근 복용하는 환자에서 턱뼈의 괴사, 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다(Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008). 따라서 부작용 발현이 적으면서도 효과적으로 골흡수를 억제할 수 있는 새로운 골질환 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 양막(amnion membrane)과 융모막(amnion/chorion membrane)은 태반을 구성하고 있는 여러 층 중 가장 안쪽에 있는 막으로, 양수와 태아를 둘러싸 태아를 외부의 병원균으로부터 보호하고 양수와 태아의 생체항상성을 유지하여 태아가 정상적으로 성장/발달할 수 있는 환경을 조성하는 역할을 한다. 양막/융모막은 콜라겐으로 구성된 세포외 기질과 상피세포로 구성되어 있으며, 표피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 전환 성장인자(transforming growth factor, TGF-b), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF) 및 간장 성장인자(hepatic growth factor, HGF) 등의 다양한 성장인자들과 항염증(anti-inflammation), 항균(anti-bacterial) 성분을 포함하고 있으며 혈관생성 조절 성분(angiogenic modulatory properties) 등을 포함하고 있다(Hao Y et al., Cornea, 19(3):348-352, 2000).
1910년 Davis가 처음 양막을 생체 재료로 사용한 후(Davis JW et al., Johns Hopkins Hosp Rep, 15; 307, 1910) 화상, 창상 및 안과 수술 후 상처 치유의 목적으로 널리 사용되고 있다(Faulk WP et al., The Lancet, 315(8179):1156-1158, 1980, Mohammadi AA et al., Burns, 39(2):349-353, 2013, Dua HS et, al., Survey of Ophthalmology, 49(1):51-77, 2004). 그 이외에도, 대한민국 등록특허 제10-0756974호에는 히스타민, 면역글로불린 및 태반 추출물을 함유하는 알레르기 질환 및 만성 염증성 질환 치료용 약학적 조성물을 개시한바 있고, 대한민국 등록특허 제10-0725133호에는 자가혈청과 태반추출물을 이용하여 콜라겐을 생성하는 세포인 섬유아세포(fibroblast)를 배양하는 방법 및 이를 이용한 피부 재생용 조성물을 개시한 바 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 골질환의 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 약학조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 혼합하되, 상피세포 성장인자 저해제의 첨가량을 조절하여 골형성의 촉진, 상기 골형성 촉진의 속도조절 및 상기 골형성의 촉진량을 조절하는 방법을 제공한다.
상술한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 분만 후 조직 유래 추출물은 양막추출물, 융모막추출물 및 양막(Amnion membrane)과 융모막(Chorion membrane)의 복합추출물 중에서 선택되는 어느 하나의 추출물일 수 있다.
본 발명에 다른 일 구현예에 의하면, 상기 분만 후 조직 유래 추출물은 양막, 융모막 및 양막과 융모막의 복합물 중에서 선택되는 분만 후 조직의 물 추출물 상청액 또는 2-30부피%의 C1 - 4알콜 수용액 추출물 상청액일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 골질환은 골소실 또는 골조직의 손상에 의해 유발된 질환이며, 구체적으로 골결손, 골다공증, 골절, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 및 부정교합 중에서 선택되는 질환을 의미하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 태반으로부터 양막과 융모막을 각각 박리 또는 양막과 용모막의 복합체를 박리하고 세척하는 단계;
(2) 세척된 양막, 융모막 또는 양막과 융모막의 복합체를 분쇄하여 분쇄물을 얻는 단계;
(3) 상기 분쇄물을 물 또는 2-30부피%의 C1 - 4알콜 수용액에 투입하여 단백질을 용출시켜 추출물을 얻는 단계;
(4) 상기 추출물을 원심분리하여 상청액을 수집하는 단계; 및
(5) 상기 상청액에 상피세포 성장인자 저해제를 첨가하는 단계;를 포함하는 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물은 골형성 촉진 또는 칼슘 침착(석화)을 증가시킴으로써 골질환 치료 또는 예방의 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 혼합하되, 상피세포 성장인자 저해제의 첨가량을 조절함으로써 골형성 촉진속도 또는 촉진률을 조절하는 방법을 제공한다. .
본 발명에 따른 분만 후 조직 유래 추출물; 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 골형성을 촉진시키고, 칼슘의 침착을 유도하는 효과가 우수하다. 따라서 골소실 또는 골조직이 손상되어 유발되는 골관련 질환들, 구체적으로 골결손, 골다공증, 골절, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 및 부정교합과 같은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 적용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 βTCP(β-Tritricalcium phosphate), 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 골재생용 지지체와 같이 사용하는 경우 약학조성물과 골재생용 지지체를 각각 단독으로 사용하는 경우에 비하여 현저히 향상된 골재생 효과를 나타내었다.
도 1A는 태반에서 분리한 양막(Amnion membrane), 융모막(Chorion membrane), 양막/융모막(Amnion/Chorion membran) 복합체의 이미지이며, 도 1B는 양막추출물(AME) 및 융모막추출물(CME)이다.
도 2는 양막추출물(Amnion membrane extract, AME) 및 융모막추출물(Chorion membrane extract, CME)에 함유된 골재생 관련 성장인자를 분석한 결과이다.
도 3은 양막추출물의 ALP(Alkaline Phosphatase)활성도를 검증한 결과이다.
도 4는 양막추출물의 칼슘 침착도를 측정한 결과이다.
도 5는 EGF 저해제 처리된 양막추출물의 칼슘 침착도를 측정한 결과이다.
도 6은 EGF 저해제 처리된 양막추출물의 골분화 촉진 유전자 발현 증가를 검증한 결과이다.
도 7은 EGF 처리된 융모막추출물의 칼슘 침착도를 측정한 결과이다.
도 8은 융모막추출물과 BMP-2의 골분화형성 효과를 비교한 결과이다.
도 9는 기전에 따른 EGF 저해제의 종류를 나열한 도표이다.
도 10은 PD153035 대신 AG1478을 EGF 저해제로 포함한 약학조성물의 칼슘침착도 측정한 결과이다.
도 11은 PD153035 대신 Gefitinib을 EGF 저해제로 포함한 약학조성물의 칼슘침착도 측정한 결과이다.
도 12는 양막추출물의 농도에 따른, AG1478을 EGF 저해제로 포함한 약학조성물의 칼슘침착도 측정한 결과이다.
도 13은 EGF 저해제의 종류에 따른 약학조성물의 칼슘침착도를 측정하여 비교한 결과이다.
도 14는 PD153035만을 포함하는 약학조성물의 칼슘침착도를 측정한 결과이다.
도 15는 양막추출물, 융모막 추출물과 EGF 저해제와 양막추출물을 포함하는 약학조성물의 칼슘침착도를 측정한 결과이다.
본 발명의 발명자들은 골질환을 예방 또는 치료할 수 있는 생체재료를 찾기 위해 예의 노력한 끝에 출산 후 대부분 버려지는 생체폐기물이 골생성을 촉진하고, 칼슘의 침착도를 높이는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 양막추출물, 융모막추출물 및 양막(Amnion membrane)과 융모막(Chorion membrane)의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물; 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제;를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 골질환은 골결손, 골소실 또는 골조직의 손상에 의해 유발된 질환일 수 있다. 골 재형성은 뼈를 생성하는 조골세포와 뼈를 파괴하는 파골세포가 관여한다. 골결손 또는 골소실은 생성되는 골에 비해 소실되는 골의 양이 더 많아 골조직이 부족하여 발생되는 질환이다. 골조직을 증가시키기는 방법으로서 조골세포의 활성을 도와 골 생성량을 늘리는 방법과 파골세포의 활성을 억제하여 골의 소실을 줄이는 방법이 대표적이다.
본 발명에 따른 상기 분만 후 조직 유래 추출물; 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 조골세포의 분화와 골형성을 촉진하고, 칼슘의 침착(석화)을 증가시키는 효과를 통해 골생성량을 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 골질환의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물로 적용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 양막과 융모막에는 골재생 촉진과 관련된 여러 종류의 성장인자들이 함유되어 있는데, 구체적으로 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 형질전환 성장인자 베타-1(Transforming Growth Factor beta-1, TGF beta-1) 및 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF) 등이 포함되어 있다. 특히, 상피세포 성장인자(EGF)는 태반 및 탯줄과 같은 분만 후 조직 중에서 양막에만 유의적인 함량으로 함유된 성장인자이다. 본 발명의 발명자들은 양막추출물, 융모막 추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물에 상피세포 성장인자 저해제를 처리하였더니 상피세포 성장인자 저해제 처리 전보다 골형성 촉진 효과가 현저히 향상되는 것을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 상기 융모막에는 상피세포 성장인자의 함량이 낮으므로, 상피세포 성장인자 저해제를 첨가하지 않은 융모막추출물을 포함하는 약학조성물도 골형성을 촉진을 기대할 수 있으나, 상피세포 성장인자 저해제를 첨가하면 골형성이 더욱 촉진되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 상기 분만 후 조직 유래 추출물은 분만 후 조직(양막, 융모막 또는 양막과 융모막의 복합체)의 물 추출물 상청액 또는 2-30부피%의 C1 - 4알콜 수용액 추출물 상청액일 수 있다.
상기 C1 - 4알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 이소프로판올 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올인 것이 다른 알콜류로 추출한 추출물에 비하여 골형성 촉진이 우수하다.
본 발명에 따른 상기 추출물은 2 내지 15 ℃, 바람직하게는 2 내지 10 ℃에서 추출된 추출물일 수 있으며, 물 추출물인 것이 알콜 추출물에 비해 골형성 촉진 효과가 더욱 우수하다.
본 발명에 따른 상기 상피세포 성장인자 저해제는 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)의 티로신 키나제 저해제(tyrosin kinase inhibitor; tki), 단일클론성 항체 저해제(Monoclonal antibody inhibitor), 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(mitogen-activated protein kinase kinase enzymes inhibitor; MEK inhibitor) 및 포스포이노시타이드-3-키나제 저해제(phosophoinositide-3-kinase inhibitor; PI3K inhibitor) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 상피세포 성장인자 수용체를 저해할 수 있는 것이면 상기 예시된 것에 제한되지 않는다.
상기 상피세포 성장인자 저해제는 앞서 나열한 바와 같이, 상피세포 성장인자를 억제하기 위한 기전에 따라 다양하게 분류될 수 있는데, 이중에서 바람직한 상기 상피세포 성장인자 저해제는 단일클론성 항체 저해제(monoclonal antibody inhibitors), 상피세포 성장인자 수용체의 티로신 키나제 저해제(EGFR tyrosin kinase inhibitors), 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(MEK1/2 inhibitor) 및 PI3K 저해제(PI3K inhibitors)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 단일클론성 항체 저해제는 Matuzumab, Nimotuzumab, Zalutumumab, Cetuximab 및 panitumumab로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 상기 단일클론성 항체 저해제(monoclonal antibody inhibitors)는 PD153035, Gefitinib, Erlotinib, AG494 및 AG1478로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(MEK1/2 inhibitor)는 U0126, PI3K 저해제는 Wortmannin일 수 있다.
상기 상피세포 성장인자(EGF) 억제제 중에서 EGF 이외의 성장인자의 신호전달에 영향을 미치지 않으면서, 본 발명의 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물과 혼합시 응집되거나, 상기 추출물의 효과를 저하시키거나, 활성을 떨어뜨리는 등의 문제를 야기하지 않는, 티로신 키나제 저해제인 PD 153035, Gefitinib, Erlotinib, AG494 및 AG1478로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 가장 바람직하다.
상기 티로신 키나제 저해제를 제외한 다른 상피세포 성장인자 억제제의 경우, EGF 이외의 성장인자들의 신호전달에도 관여하거나, 생체 내로 투여시 세포 독성을 나타내거나, 부작용을 가지는 등의 문제들 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물과 혼합시 응집되거나, 추출물의 효과가 저하되거나 활성이 낮아지거나, 비용이 높아지는 등의 문제가 발생할 수 있다.
또한, 상기 티로신 키나제 저해제는 PD153035가 가장 바람직한데, 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물과 혼합시에 특이적으로 EGF 수용체 1에 대한 저해 효과를 나타내었으며, 그 저해효과가 다른 티로신 키나제 저해제를 혼합하였을 때에 비해 칼슘침착도가 2 내지 2.5배 향상되었음을 세포 실험을 통해 확인하였다. 또한 PD153035와 함께 투여한 군이 골 재생 관련 유전자 발현도 PD153035를 투여하지 않은 대조군에 비해 2 배~10배 이상 증가한 것을 확인하였다.
게다가, 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물없이 상기 티로신 키나제 저해제 PD153035만 처리한 경우, 세포 실험에서 골분화 유도시에 칼슘침착도가 전혀 증가하지 않은 것을 확인하였다. 즉, 티로신 키나제 저해제 PD153035 자체로 골 재생 촉진 효과는 없는 것을 후술하는 실험예를 통해 알 수 있다.
상기 약학조성물은 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물을 50 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제를 10 내지 40 μM의 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 약학조성물에서 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 100 내지 400 ㎍/㎖ 농도일 때, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제가 10 내지 20 μM의 농도로 포함되는 것이, 칼슘침착도 및 골재생인자의 발현 정도가 2~10 배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있으므로, 가장 바람직하다.
또한, 상기 약학조성물에서 상기 약학조성물에서 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 100 ㎍/㎖ 농도 미만이거나, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제가 10 μM 미만일 경우, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 유의한 효과가 전혀 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 약학조성물에서 상기 약학조성물에서 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 400 ㎍/㎖ 농도를 초과하거나, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제가 20 μM를 초과할 경우, 농도의 증가대비 효과의 증가가 미미하므로, 상기 범위의 농도를 포함하는 것이 비용절감에 있어 바람직하다는 것을 알 수 있다. 게다가 약학조성물 내에 존재하는 약물의 농도를 증가시키는 것은 세포에 동시에 접촉할 수 있는 약물의 함량이 증가함을 의미하는 것으로, 세포에 대한 약물의 강한 작용은 내성 혹은 생체 내 기작에 대한 부차적 효과를 유발할 수 있음을 고려하여 최대의 효과를 내는 최소한의 약물 농도로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학조성물은 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물을 단독으로 사용할 때에 비해, 현저히 그 사용량(농도)를 줄여도 칼슘침착도, 골분화 촉진 유전자 발현 등의 골질환 예방 또는 치료 효과는 그대로 유지하거나 향상된 효과를 가지기 때문에, 비용절감 효과를 얻을 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물; 및 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 포함하는 약학조성물은 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물을 단독으로 사용했을 때보다 용량을 2 내지 4 배이상 줄여도, 줄이기 전과 동등하거나 현저한 칼슘침착도 및 골분화 촉진 유전자 발현 증가를 나타내기 때문에, 태반 당 얻은 추출물을 가지고 태반 당 BMP-2 500 ng/mL로 처리로 얻을 수 있는 효과의 추출물 500 내지 1600 회분을 얻을 수 있다.
상기 약학조성물은 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 PD153035와 혼합시 우수한 효과를 나타내는 양막추출물 또는 양막과 융모막의 복합추출물이 바람직하고, 특히 PD153035와 혼합시 2 내지 4 배 이상의 고농도에서의 약리효과를 갖게되는 양막추출물인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물을 단독으로 사용하여 골형성 촉진의 효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, βTCP(β-Tritricalcium phosphate), 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 골재생용 지지체와 병용 또는 혼합하여 사용이 가능하다. 상기 약학조성물과 골재생용 지지체를 혼합하여 사용하는 방법은 특별히 제한은 없으며, 예를 들어, 골재생용 지지체의 표면에 본 발명에 따른 약학조성물을 코팅하여 사용하거나 골재생용 지지체와 본 발명에 따른 약학조성물을 화학적으로 결합시킨 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 골재생용 지지체의 표면에 본 발명에 따른 약학조성물을 코팅 또는 화학적으로 결합시키면 골재생을 목적으로 하는 특정 위치에 정량적으로 골재생 효율을 증가시킬 수 있으므로 보다 바람직하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 약학조성물과 골재생용 지지체를 각각 단독으로 사용하는 경우에 비해 골재생 효과가 현저하게 향상된 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 약학조성물은 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자 저해제 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 투여용 약제학적 활성 화합물을 제형화할 경우에 유용하고 사용 조건하에 사실상 비독성 및 비민감성인 공지된 약제학적 부형제를 의미한다. 이러한 부형제의 정확한 비율은 활성 화합물의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 적합하고 생리학적으로 허용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제 등과 같은 보조제를 사용하여 원하는 투여 방법에 적합한 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제, 액제 또는 주사제의 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 고체 제제, 예를 들어 정제, 미립자, 액체 또는 분말을 함유한 캡슐제, 환제, 과립제, 산제, 로젠지제(lozenge)(액체-충전된 것 포함), 츄제(chew), 멀티- 및 나노-미립제, 겔제, 고용제(solid solution), 리포솜, 필름제(점막-점착성 포함), 난형제(ovule), 분무제(spray) 및 액제를 포함한다. 액제는 예를 들어 현탁액제, 용액제, 시럽제 및 엘릭시르(elixir)제를 포함한다.
정제는 약물 이외에도 일반적으로 붕해제를 함유한다. 붕해제로서 나트륨 전분 글리콜레이트, 옥수수 전분, 감자 전분 또는 예비 젤라틴화 전분 등의 전분 또는 변성전분과, 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 비검(veegum) 등의 클레이와, 미세결정성 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류와, 알긴산 나트륨 또는 알긴산 등의 알긴류와, 크로스카멜로스(croscarmellose) 나트륨 등의 가교 셀룰로오스류와, 구아검, 잔탄검 등의 검류와, 크로스포비돈(crospovidone) 등의 가교 중합체와, 중탄산 나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제 등을 혼합 사용할 수 있다. 일반적으로, 붕해제는 투여 형태의 약 1 중량% 내지 약 25 중량%, 바람직하게는 투여 형태의 약 2 중량% 내지 약 10 중량%를 포함할 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
결합제는 일반적으로 정제 제제에 점착성을 부여하기 위해 사용된다. 적합한 결합제는 미세결정성 셀룰로오스, 젤라틴, 당(sugar), 폴리에틸렌 글리콜, 천연 및 합성 검(gum), 폴리비닐피롤리돈, 예비젤라틴화된 전분, 전분, 코포비돈, 고분산성 실리카, 만니톨, 락토스, 하이드록시프로필 셀룰로스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스를 포함한다. 일반적으로, 결합제는 투여 형태의 약 1 중량% 내지 약 40 중량%, 바람직하게는 투여 형태의 약 2중량% 내지 약 25 중량%를 포함할 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 정제는 희석제로서, 예를 들어 전분, 미세결정성 셀룰로오스, 유당, 포도당, 만니톨, 알기네이트, 알칼리토류금속염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜 및 디칼슘 포스페이트 등을 사용할 수 있다. 일반적으로, 희석제는 투여 형태의 약 1 중량% 내지 약 70 중량%, 바람직하게는 투여 형태의 약 2 중량% 내지 약 50 중량%를 포함할 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
정제는 또한 계면활성제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트 및 폴리솔베이트 80, 및 활택제(glidant), 예컨대 이산화규소 및 활석을 선택적으로 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 계면활성제는 정제의 약 0.2 중량% 내지 약 5 중량%를 포함할 수 있고, 활택제는 정제의 약 0.2 중량% 내지 약 1 중량%를 포함할 수 있다.
또한 윤활제로서, 예컨대 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 라우릴 설페이트, 수소화 식물성 오일, 나트륨 벤조에이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 폴리에틸렌글리콜 4000 등을 사용할 수 있다. 윤활제는 일반적으로 정제의 약 0.25 중량% 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 3 중량%를 포함한다.
그 밖의 다른 가능한 성분은 산화방지제, 착색제, 향미제, 보존제 및 맛-차단제를 포함한다.
정제 배합물은 직접적으로 압착되거나 롤러로 압착되어 정제를 형성할 수 있다. 다른 방법으로 정제 배합물 또는 그 배합물의 일부는 정제화되기 전에 습식, 건식, 용융-과립화(granulated), 용융 응고(melt congealed) 또는 압출될 수 있다. 최종 제제는 하나 이상의 층을 포함할 수 있고, 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있으며, 캡슐화될 수 있다.
경구 투여용 고체 제제는 즉시(immediate) 방출형 및/또는 변형(modified) 방출형으로 제제화될 수 있다. 변형 방출형 제제는 지연(delayed), 지속(sustained), 펄스(pulsed), 제어(controlled), 표적(targeted) 및 프로그램(programmed) 방출형을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정제일 수 있다. 정제는 임의적으로 필름 코팅될 수 있다. 복용 단위당 약의 총량은 환자에게 편리한 크기의 복용 형태를 제공하는 양일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 약학조성물은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 유효량이 조절될 수 있다. 예컨대, 성인의 경우, 의사 또는 약사의 판단에 따라 0.0001 내지 4000 mg/day의 용량을 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 골질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 하기 단계를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있다.
(1) 태반으로부터 양막과 융모막을 각각 박리 또는 양막과 용모막의 복합체를 박리하고 세척하는 단계;
(2) 세척된 양막, 융모막 또는 양막과 융모막의 복합체를 분쇄하여 분쇄물을 얻는 단계;
(3) 상기 분쇄물을 물 또는 2-30부피%의 C1 - 3알콜 수용액에 투입하여 단백질을 용출시켜 추출물을 얻는 단계;
(4) 상기 추출물을 원심분리하여 상청액을 수집하는 단계; 및
(5) 상기 상청액에 상피세포 성장인자 저해제를 첨가하는 단계.
상기 제조방법에 있어서, 양막의 박리, 세척, 분쇄 및 양막 내 단백질 용출은 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막과 융모막의 복합추출물을 제조하기 위한 통상의 방법을 이용하여 준비될 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 상기 (4) 단계의 원심분리 전에 단백질 용출이 용이하도록 초음파 분쇄기로 처리하는 단계를 더 포함하여 수행할 수 있다. 또한 수집된 상청액은 필터한 뒤, 냉동 또는 초저온에서 보관하여 실험에 이용하는 것이 바람직하다. 제조된 추출물은 단백질의 농도를 정량한 뒤 실험에 이용하였다.
또한, 본 발명은 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물; 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제;를 혼합하여 처리하는 단계를 포함하는 골형성 촉진방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 상피세포 성장인자 저해제는 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)의 티로신 키나제 저해제(tyrosin kinase inhibitor; tki), 단일클론성 항체 저해제(Monoclonal antibody inhibitor), 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(mitogen-activated protein kinase kinase enzymes inhibitor; MEK inhibitor) 및 포스포이노시타이드-3-키나제 저해제(phosophoinositide-3-kinase inhibitor; PI3K inhibitor) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 상피세포 성장인자 수용체를 저해할 수 있는 것이면 상기 예시된 것에 제한되지 않는다.
상기 상피세포 성장인자 저해제는 앞서 나열한 바와 같이, 상피세포 성장인자를 억제하기 위한 기전에 따라 다양하게 분류될 수 있는데, 이 중에서 바람직한 상기 상피세포 성장인자 저해제는 단일클론성 항체 저해제(monoclonal antibody inhibitors), 상피세포 성장인자 수용체의 티로신 키나제 저해제(EGFR tyrosin kinase inhibitors), 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(MEK1/2 inhibitor) 및 PI3K 저해제(PI3K inhibitors)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 상피세포 성장인자(EGF) 억제제 중에서 EGF 이외의 성장인자의 신호전달에 영향을 미치지 않으면서, 본 발명의 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물과 혼합시 응집되거나, 상기 추출물의 효과를 저하시키거나, 활성을 떨어뜨리는 등의 문제를 야기하지 않는, 티로신 키나제 저해제인 PD153035, Gefitinib, Erlotinib, AG494 및 AG1478로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 가장 바람직하다.
상기 티로신 키나제 저해제를 제외한 다른 상피세포 성장인자 억제제의 경우, EGF 이외의 성장인자들의 신호전달에도 관여하거나, 생체 내로 투여시 세포 독성을 나타내거나, 부작용을 가지는 등의 문제들 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물과 혼합시 응집되거나, 추출물의 효과가 저하되거나 활성이 낮아지거나, 비용이 높아지는 등의 문제가 발생할 수 있다.
또한, 상기 티로신 키나제 저해제는 PD153035가 가장 바람직한데, 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물과 혼합시에 특이적으로 EGF 수용체 1에 대한 저해 효과를 나타내었으며, 그 저해효과가 다른 티로신 키나제 저해제를 혼합하였을 때에 비해 칼슘침착도가 2~2.5배 향상되었음을 세포 실험을 통해 확인하였다. 또한 PD153035와 함께 투여한 군이 골 재생 관련 유전자 발현도 PD153035를 투여하지 않은 대조군에 비해 2 배~10배 이상 증가한 것을 확인하였다.
게다가, 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물없이 상기 티로신 키나제 저해제 PD153035만 처리한 경우, 세포 실험에서 골분화 유도시에 칼슘침착도가 전혀 증가하지 않은 것을 확인하였다. 즉, 티로신 키나제 저해제 PD153035 자체로 골 재생 촉진 효과는 없는 것을 후술하는 실험예를 통해 알 수 있다.
상기 (5) 단계에서 상기 상청액에는 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 50 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제는 10 내지 40 μM의 농도로 포함하도록 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 약학조성물에서 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 100 내지 400 ㎍/㎖ 농도일 때, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제가 10 내지 20 μM의 농도로 포함되는 것이, 칼슘침착도 및 골재생인자의 발현 정도가 2~10 배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있으므로, 가장 바람직하다.
또한, 상기 약학조성물에서 상기 약학조성물에서 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 100 ㎍/㎖ 농도 미만이거나, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제가 10 μM 미만일 경우, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 유의한 효과가 전혀 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 약학조성물에서 상기 약학조성물에서 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 400 ㎍/㎖ 농도를 초과하거나, 상기 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제가 20 μM를 초과할 경우, 농도의 증가대비 효과의 증가가 미미하므로, 상기 범위의 농도를 포함하는 것이 비용절감에 있어 바람직하다는 것을 알 수 있다. 게다가 약학조성물 내에 존재하는 약물의 농도를 증가시키는 것은 세포에 동시에 접촉할 수 있는 약물의 함량이 증가함을 의미하는 것으로, 세포에 대한 약물의 강한 작용은 내성 혹은 생체 내 기작에 대한 부차적 효과를 유발할 수 있음을 고려하여 최대의 효과를 내는 최소한의 약물 농도로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학조성물은 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물을 단독으로 사용할 때에 비해, 현저히 그 사용량(농도)를 줄여도 칼슘침착도, 골분화 촉진 유전자 발현 등의 골질환 예방 또는 치료 효과는 그대로 유지하거나 향상된 효과를 가지기 때문에, 비용절감 효과를 얻을 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물; 및 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 포함하는 약학조성물은 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물을 단독으로 사용했을 때보다 용량을 2 내지 4 배이상 줄여도, 줄이기 전과 동등하거나 현저한 칼슘침착도 및 골분화 촉진 유전자 발현 증가를 나타내기 때문에, 태반 당 얻은 추출물을 가지고 태반 당 BMP-2 500 ng/mL로 처리로 얻을 수 있는 효과의 추출물 500 내지 1600 회분을 얻을 수 있다.
상기 (1) 단계에서 양막 또는 양막과 융모막의 복합체를 이용하여 제조하는 것이 가장 바람직한데 왜냐하면 PD153035와 혼합시 우수한 효과를 나타내기 때문이다. 더 바랍직하게는 PD153035와 혼합시 2 내지 4 배 이상의 고농도에서의 약리효과를 갖게되는 양막을 이용하여 제조하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 혼합하되, 상피세포 성장인자 저해제의 첨가량을 조절함으로써 골형성 촉진속도 또는 촉진률을 조절할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 성명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예
제조예
내과, 산과 또는 외과 합병증의 증상을 보이지 않고 혈액 검사를 통해 HBV, HCV 그리고 HIV 바이러스가 감염되지 않은 정상 인간 태반(=37 주 임신)을 제왕절개술 이후 수득하였고, 공여자 모두로부터 동의를 받았다. 샘플의 수집 및 실험 목적으로의 사용은 고려대학교 의과대학으로부터 IRB 승인을 받았다.
제조예 1: 양막추출물 제조
태반의 탯줄을 중심으로 칼집을 내어 양막을 태반으로부터 조심스럽게 박리하여 채취하고 채취한 양막은 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 첨가된 PBS 또는 생리식염수에 세척하였다. 양막의 점액질과 혈액을 제거한 후 호모지나이저를 이용하여 분쇄시킨 후 1:1=양막의 질량(g):PBS(mL)의 비율로 완충용액을 넣고 하룻밤 동안 4 ℃에서 보관하여 단백질이 방출되도록 하였다. 다음으로 초음파 분쇄기를 이용하여 단백질 방출을 도운 후 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 실린지 필터로 여과하여 -80 ℃에서 보관하였다. 제조된 양막추출물은 단백질의 농도를 측정하여 필요량을 실험에 사용하였다.
제조예 2 : 양막/융모막 복합추출물 제조
태반으로부터 양막과 융모막의 복합체를 박리한 뒤 세척하고 분쇄하여 양막추출물의 제조방법과 동일한 방법으로 양막/융모막 복합추출물을 제조하였다.
제조예 3: 융모막추출물 제조
양막 대신 융모막을 박리하여 양막추출물의 제조방법과 동일한 방법으로 융모막추출물을 제조하였다.
시험예
성장인자 분석
제조예 1, 3에서 제조한 양막추출물(Amnion membrane extract, AME) 및 융모막추출물(Chorion membrane extract, CME)에 함유된 골재생 관련 성장인자들을 확인하기 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석법을 실시하였다. 실험에 사용된 농도는 pg of growth factor/mg of protein in extraxt이다.
하기 표 1및 도 2에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF) 및 형질전환 성장인자 베타-1(Transforming Growth Factor β-1, TGFβ-1)는 양막추출물 및 융모막추출물에서 모두 검출되었으며, 특히, 양막추출물에 함유된 TGFβ-1은 융모막추출물보다 40%가량 더 많이 함유하는 것으로 확인되었다.
한편, 제2형 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein 2, BMP-2)은 양막추출물과 융모막추출물에서 모두 검출되지 않았으며, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF)는 양막추출물에만 유의적으로 검출되었으며, 융모막추출물에는 극소량 존재하는 것으로 확인되었다.
구분 AME CME
FGF 3.310 3.024
BMP-2 -1.846 -1.604
TGFβ-1 33.070 23.820
EGF 8.229 0.008
양막추출물의 ALP(Alkaline Phosphatase )활성도와 칼슘량 측정
조골세포와 비슷한 세포로 알려진 인간 골육종 세포주인 MG-63(한국세포주은행, KCLB)을 in vitro 골형성 실험에 사용하였으며, 10%(v/v) FBS(Fetal bonine serum) 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 37 ℃, 5% CO2 습한 환경 하에서 세포를 배양하였다.
① ALP(Alkaline Phosphatase )활성도
골형성시 초기 단계에 나타나는 골 형성 지표인 ALP 효소를 측정하는 실험을 실시하였다. 양막추출물의 ALP 활성도를 측정하기 위해서 이미 골형성을 촉진하여 ALP의 활성화를 촉진하는 융모막추출물과 양막/융모막 복합추출물과 비교하여 ALP 측정을 확인하고자 하였으며, 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포에 100 ㎍/mL추출물들(AME:양막추출물, ACME:양막/융모막 복합추출물, CME:융모막추출물)를 처리한 후, 추출물을 처리하지 않은 대조군(OIM)과 함께 ALP 활성도를 측정하였다.
3일, 7일째의 시료를 취하여, 차가운 PBS buffer로 2회 세척한 다음, 0.1% Triton X-10이 첨가된 세포막 분해 용액(cell lysis buffer)로 용해(lysis) 시켰다. 용해된 세포를 4 ℃, 13000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상청액을 회수하여 브래드포드법으로 정량하고, 동량의 단백질을 ALP kit(아나스펙, Inc, Fermont, Canada)로 제조사의 지침에 따라 405 ㎚에서 ALP 활성도를 측정하여 도 3에 나타내었다.
분화 7일 차에 융모막추출물의 ALP 활성도가 가장 높았으며, 양막/융모막 복합추출물 및 양막추출물 순으로 나타났다.
② 칼슘 침착도 측정
칼슘 침착 평가(석화작용)는 조골세포의 분화 중 중후반 지표로 널리 사용된다. 양막추출물의 칼슘 침착도를 측정하기 위해서 이미 골형성을 촉진하여 칼슘 침착을 촉진하는 융모막추출물과 양막/융모막 복합추출물과 비교하여 본 실험을 실시하였다. 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 추출물을 100, 200, 400, 800 ㎍/mL의 농도로 처리한 후, 추출물을 처리하지 않은 대조군과 함께 칼슘의 함량을 분화 후 7일 후에 측정하였다. 칼슘의 함량은 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
분화 7일차에 측정한 칼슘 함량결과에서 확인할 수 있듯이, 양막추출물이 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물을 처리한 군에 비하여 칼슘 침착 유도 효과가 낮은 것으로 나타났다(*P<0.05).
EGF 저해제 처리된 양막추출물의 칼슘 침착도 및 골분화 촉진 유전자 발현 증가 검증
조골세포와 비슷한 세포로 알려진 인간 골육종 세포주인 MG-63(한국세포주은행, KCLB)을 in vitro 골형성 실험에 사용하였으며, 10%(v/v) FBS(Fetal bonine serum) 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 37 ℃, 5% CO 2 습한 환경 하에서 세포를 배양하였다.
① 칼슘 침착도 측정
양막추출물에 EGF 저해제를 처리 후 칼슘 침착도를 측정하기 위해서, 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 PD153035(Calbiochem사, EGF의 세포내 수용체의 전달체인 tyrosin kinase를 저해하는 물질)를 5, 10, 20 μM의 농도로 처리한 후, 1시간 후 양막추출물 200 ㎍/mL을 처리하여 7일 동안 분화를 유도하여 칼슘의 함량을 측정하였다(A).
동일한 분화 조건에서 PD153035 10μM를 처리한 후, 1시간 후 양막추출물을 100, 200, 400 ㎍/mL의 농도로 처리한 후 처리하여 7일 동안 칼슘의 함량을 측정하였다(B). 칼슘의 함량은 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5A 및 B를 살펴보면, 양막추출물(AME 200 ㎍/㎖)와 PD153035 10-20 μM을 첨가한 약학조성물일 때, 양막추출물만 첨가하였을 때보다 1.5~2 배 이상 증가된 칼슘 함량이 측정되었다. 이는 동량의 융모막추출물 또는 양막/융모막 추출물에 비해 1.5~2 배 이상 증가된 수치로, 얻기 어려운 재료인 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 추출물의 함량(필요 투여량)을 2~4배 이상 현저히 낮추어도, 함량을 낮추기 이전과 동등하거나 향상된 효과를 발휘할 수 있음을 알 수 있다.
다만, 상기 약학조성물에서 양막추출물이 100 내지 400 ㎍/㎖의 농도일 때, 상기 PD153035가 10 μM 미만 즉, 5 μM인 경우에는 칼슘 침착도 즉, 골질환 치료효과가 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명에 따른 약학조성물은 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막과 융모막 복합추출물의 농도를 종래보다 2 내지 4 배 이상 감소시켜, 경쟁력을 확보하였음에도 불구하고, 종래보다 우수한 골질환 치료 효과를 나타내고 있음을 확인한 것이다.
도 5A, 5B 두 결과 모두 EGF 저해제(PD153035)를 처리한 그룹에서 칼슘의 함량이 현저히 높게 측정되었을 뿐만 아니라 칼슘함량이 EGF 저해제의 농도의존적 증가되는 것을 확인하였다.
본 발명의 발명자들은 상피세포 성장인자 억제제(바람직하게는, 티로신 키나제 저해제인 PD153035)와 양막, 융모막 혹은 양막과 융모막 추출물으로 이루어진 약학조성물은, 상피세포 성장인자 억제제(바람직하게는, 티로신 키나제 저해제인 PD153035)의 혼합을 통해, 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막과 융모막의 복합추출물에 포함되어 있는 성장인자인 EGF를 억제 및 이외의 작용으로, 골형성 방해 효과(혹은 저해 효과)를 제거함으로써, 적은 농도만으로도 효과적인 골형성 촉진, 골질환 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
② 골분화 촉진 유전자 발현 증가 검증
양막추출물에 EGF 저해제(PD153035)를 처리 후 칼슘 침착도를 측정하기 위해서, 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 PD153035(Calbiochem사, EGF의 세포내 수용체의 전달체인 tyrosin kinase를 저해하는 물질)를 10 μM의 농도로 처리한 후, 1시간 후 양막추출물 100, 200 ㎍/mL을 각각 처리하여 분화를 유도한 후, 4일째 되는 날에 각 세포에서 골분화 촉진 유전자 발현 증가를 검증하여, 도 6에 나타내었다.
분화 과정 중 유전자 변화를 확인해보기 위해 분화 단계별 세포로부터 전체 RNA를 트리졸 시약(인비트로젠, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. ALP와 IBSP(integrin-binding sialoprotein)는 골형성시 초기 단계에 나타나는 골 형성의 지표 단백질로서, RUNX2와 OSTERIX는 골분화에 중요한 유전자 전사인자로 모두 4일째에 세포로부터 전체 RNA를 얻어 실험을 수행하였다. 배양된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 다음 트리졸 시약 1 ml을 넣어 용해시켰다. 200 ㎕ 클로로포름을 넣어 섞어준 다음 섭씨 4도, 12000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상청액을 분리하였다. 분리된 상청액에 500 ㎕의 이소프로판올을 넣어 섞어준 다음 섭씨 4도, 12000 rpm으로 다시 원심 분리하였다. 상청액은 버리고 남은 펠렛을 70% 에탄올로 3회 세척한 다음 RNA를 분리하였다. RT-PCR을 위해 동량의 전체 RNA(5 ㎕)에 RT-PCR 증폭 키트를 넣어 섭씨 45도에서 60분간 반응시켜 cDNA를 제조하였다. cDNA는 각각 ALP, IBSP, RUNX2, OSTERIX에 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 증폭하였다. 실시간 PCR은 cDNA에 SYBR 그린 시약(로슈, Basel, Switzerland)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 구체적으로 동량의 cDNA에 2X SYBR 그린을 10 ㎕와 각각의 0.5 p㏖/㎕ 프라이머를 1 ㎕ 넣은 후 95도에서 30초, 섭씨 60도에서 1 분씩, 40 회 반응을 시켜 증폭하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 결과, 골분화 마커 유전자들이 본 발명의 약학조성물인 양막추출물과 EGF 저해제를 동시에 처리한 경우에만 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 본 발명의 약학조성물은 양막추출물만 처리하거나, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 2 내지 10 배 이상의 골분화 촉진 유전자 발현이 증가하였음을 알 수 있다.
EGF 처리된 융모막추출물의 칼슘 침착도 검증
EGF에 의해 골형성이 저해되는 것을 입증하기 위하여, 단일 추출물 상태에서, 충분히 우수한 칼슘 침착도를 나타내는 고농도의 융모막추출물(400 내지 800 ㎍/㎖)에 EGF를 첨가하여 실험을 실시하였다.
동일한 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 다양한 농도(100, 200, 400, 800 μg/mL)의 융모막추출물에 EGF(100 ng/mL, PeproTECH, recombinant human EGF)를 처리 또는 미처리하여 9일 동안 분화를 유도한 후 칼슘 침착도를 측정하였다(A). 도 7A에 나타낸 바와 같이, 융모막 추출물 역시 단독으로 사용할 경우 400 내지 800 ㎍/㎖ 이상의 고농도에서만 칼슘 침착도가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
이에, 융모막추출물의 농도를 400 ㎍/mL으로 동일하게 고정한 다음, EGF를 농도별(50, 100, 500 ng/mL)로 처리하여 9일 동안 분화를 유도한 후 EGF 농도 변화에 따른 칼슘침착도 변화를 측정하였다(B). 도 7B에 나타낸 바와 같이, EGF가 처리되지 않은 군(0 ng/mL)에서는 칼슘 침착도가 유의적으로 증가하였으나, EGF가 첨가된 경우(50, 100, 500 ng/㎖) 첨가로 칼슘 침착이 저해되는 것을 확인하였다.
융모막추출물 및 BMP-2의 골형성 비교 실험
제2형 골형성 단백질인 BMP-2와 비교하여 본 발명에 따른 추출물의 효과를 확인하기 위하여 동일한 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 BMP-2와 융모막추출물(CME)를 농도별로 처리하여 18일 동안 분화를 유도하였다.
하기 도 8에 나타낸 바와 같이, 융모막추출물 400 ㎍/mL의 농도에서 BMP-2 500 ng/mL로 처리한 것보다 우수한 결과를 얻었다. 상기 표 2의 결과로부터 융모막추출물 400 ㎍/mL에는 FGF가 1.209 pg, TGF-β1이 9.258 pg 함유되는 것으로 계산되었다.
양막/융모막 조직은 태반 당 50-80g을 얻을 수 있었다. 양막/융모막 1g의 조직당 총단백질량과 추출물별 총단백질량을 확인하여 하기 표 2 나타내었다.
구분 총단백질량mg/조직g
양막추출물 1.46ㅁ0.44
융모막추출물 2.50ㅁ0.56
상기와 같은 결과를 통해, 태반 당 양막추출물의 단백질량은 36.5-58.4 mg, 융모막추출물의 단백질량은 63-100 mg이며, 양막/융모막 복합추출물은 99-158 mg을 얻을 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 태반 당 BMP-2 500 ng/mL로 처리로 얻을 수 있는 효과의 추출물 250-400회분을 얻을 수 있었다.
게다가 본 발명에 따른 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물; 및 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 포함하는 약학조성물은 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물을 단독으로 사용했을 때보다 용량을 2 내지 4 배이상 줄여도, 줄이기 전과 동등하거나 현저한 칼슘침착도 및 골분화 촉진 유전자 발현 증가를 나타내기 때문에, 태반 당 얻은 추출물을 가지고 태반 당 BMP-2 500 ng/mL로 처리로 얻을 수 있는 효과의 추출물 500 내지 1600 회분을 얻을 수 있다.
상기 결과를 통해 입증한 바와 같이, 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막/융모막 복합추출물; 및 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 포함하는 약학조성물은 골형성을 촉진하고, 칼슘침착을 향상시킴으로 골소실 또는 골조직의 손상에 의한 골질환의 치료 또는 예방에 유용하게 적용할 수 있다. 또한, 양막/융모막을 이용하여 높은 부가가치의 창출이 가능하다.
PD153035 외 다른 상피세포 성장인자 저해제를 포함하는 약학조성물의 칼슘침 착도 비교 실험
① 세포 배양
조골세포와 비슷한 세포로 알려진 인간 골육종 세포주인 MG-63(한국세포주은행, KCLB)을 in vitro 골형성 실험에 사용하였으며, 10%(v/v) FBS(Fetal bonine serum) 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 37 ℃, 5% CO2 습한 환경 하에서 세포를 배양하였다.
② AG1478 또는 Gefitinib 을 상피세포 성장인자 저해제로 포함하는 약학조성물의 칼슘침착도 측정
칼슘 침착 평가(석화작용)는 조골세포의 분화 중 중후반 지표로 널리 사용된다. 상피세포 성장인자 저해제의 종류에 따른 본 발명에 따른 약학조성물의 골분화 촉진, 골질환 예방 또는 치료효과를 확인하고자, 칼슘침착도를 비교하여 본 실험을 실시하였다. 이때, 상기 상피세포 성장인자 저해제는 PD153035와 동일한 티로신 키나제 저해제 중에서 선정하였다. 특히 알려져있는 티로신 키나제 저해제 중에서도PD153035와 유사한 효과(EGF 수용체 1에 의한 신호전달을 특이적으로 저해한다고 알려진)를 갖는 AG1478(Tyrphostin AG1478)과 Gefitinib(ZD1839)를 사용하였다.
동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 AG1478(Calbiochem사, EGF의 세포내 수용체의 전달체인 tyrosin kinase를 저해하는 물질) 또는 Gefitinib(Calbiochem사, EGF의 세포내 수용체의 전달체인 tyrosin kinase를 저해하는 물질)를 1, 5, 10, 20 μM의 농도로 처리한 후, 1시간 후 양막추출물 200 ㎍/mL을 처리하여 7일 동안 분화를 유도하여 칼슘의 함량을 측정하였다. 상기 칼슘의 함량은 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 그 결과를 하기 도 10, 11에 나타내었다.
도 10, 11에 나타난 바와 같이, 분화 7일차에 측정한 칼슘 함량결과에서 확인할 수 있듯이, PD153035 대신에 AG1478, Gefitinib를 사용한 약학조성물은 아무것도 처리하지 않은 대조군(OIM)에 비하여 칼슘 침착 유도 효과의 변화가 거의 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다(*P<0.05).
③ 양막조성물의 농도에 따른, AG1478 을 상피세포 성장인자 저해제로 포함하는 약학조성물의 칼슘침착도 측정
도 12는 앞선 ①에서와 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 AG1478를 10 μM의 농도로 처리한 후, 1시간 후 양막추출물 100, 200, 400 ㎍/mL을 처리하여 7일 동안 분화를 유도하여 칼슘의 함량을 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다(상기 ② 과정 참고)(*P<0.05).
도 12에 나타난 바와 같이, PD153035 대신에 AG1478을 포함하는 약학조성물은, 골형성 촉진 효과를 갖는 양막추출물의 농도를 증가시킴에도 불구하고, 칼슘침착도 효과의 증가가 농도 증가에 비해 미미한 것을 알 수 있다. 게다가 AG1478을 포함하는 약학조성물은 400 ㎍/㎖ 양막추출물을 단독으로 사용했을 때(도 4 참조)와 비교하였을 때 칼슘침착도 변화가 거의 없음을 확인하였다.
④ 상피세포 성장인자 저해제에 따른, 약학조성물의 칼슘침착도 비교
도 13은 앞선 ①에서와 동일하게 골형성 유도배지(OIM)에서 분화된 MG-63 세포에 PD153035, AG1478, Gefitinib를 각각 5, 10, 20 μM로 처리한 후, 1 시간 후 양막추출물 200 ㎍/㎖를 처리하여 7일 동안 분화를 유도하여 칼슘의 함량을 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다(*P<0.05).
도 13에 나타난 바와 같이, PD153035를 10-20 μM, 양막추출물을 200 ㎍/㎖ 포함하는 약학조성물로 처리한 경우에 칼슘침착도가 아무것도 처리하지 않은 대조군(OIM)에 비해 1.5 내지 2 배이상 증가하였음을 확인하였다.
PD153035를 10-20 μM, 양막추출물을 200 ㎍/㎖ 포함하는 약학조성물은 800 ㎍/㎖ 양막추출물 혹은 400 ㎍/㎖ 융모막추출물을 단독으로 사용하는 것보다 동등하거나 더 우수한 칼슘침착도를 갖는 것을 알 수 있다.
이를 통해 PD153035를 10-20 μM, 양막추출물을 200 ㎍/㎖ 포함하는 약학조성물은 양막추출물의 함량(사용량)을 2 내지 4 배 이상 감축할 수 있음을 확인하였다.
PD153035 만을 포함하는 약학조성물의 칼슘침착도 비교 실험
① 세포 배양
조골세포와 비슷한 세포로 알려진 인간 골육종 세포주인 MG-63(한국세포주은행, KCLB)을 in vitro 골형성 실험에 사용하였으며, 10%(v/v) FBS(Fetal bonine serum) 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 37 ℃, 5% CO2 습한 환경 하에서 세포를 배양하였다.
② 칼슘침착도 측정
칼슘 침착 평가(석화작용)는 조골세포의 분화 중 중후반 지표로 널리 사용된다. 상피세포 성장인자 저해제만을 포함할 경우, 약학조성물의 골분화 촉진, 골질환 예방 또는 치료효과를 확인하고자, 칼슘침착도를 비교하여 본 실험을 실시하였다. 이때, 상기 상피세포 성장인자 저해제는 가장 효과가 우수한 PD153035를 사용하였다.
동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후 PD153035(Calbiochem사, EGF의 세포내 수용체의 전달체인 tyrosin kinase를 저해하는 물질)를 5, 10, 20 μM의 농도로 처리한 후, 7일 동안 분화를 유도하여 칼슘의 함량을 측정하였다. 상기 칼슘의 함량은 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 그 결과를 하기 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 분화 7일차에 측정한 칼슘 함량결과에서 확인할 수 있듯이, PD153035만을 사용한 경우에는 아무것도 처리하지 않은 대조군(OIM)에 비하여 칼슘 침착 유도 효과의 변화가 거의 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다(*P<0.05). 즉, 상피세포 성장인자 저해제 자체는 골재생 촉진 효과가 없다는 것을 알 수 있다.
양막추출물 , 융모막 추출물과 상피세포 성장인자 저해제와 양막추출물을 포함하는 약학조성물의 칼슘침착도 비교 실험
① 세포 배양
조골세포와 비슷한 세포로 알려진 인간 골육종 세포주인 MG-63(한국세포주은행, KCLB)을 in vitro 골형성 실험에 사용하였으며, 10%(v/v) FBS(Fetal bonine serum) 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 37 ℃, 5% CO2 습한 환경 하에서 세포를 배양하였다.
② 칼슘침착도 측정
칼슘 침착 평가(석화작용)는 조골세포의 분화 중 중후반 지표로 널리 사용된다. 양막 또는 융모막추출물을 단독으로 사용할 때와, 본 발명에 따른 약학조성물(AME+PD)의 골분화 촉진, 골질환 예방 또는 치료효과를 확인하고자, 칼슘침착도를 비교하여 본 실험을 실시하였다.
도 15는 앞선 ①과 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후, 양막추출물 200 ㎍/㎖만을 처리한 그룹(AME 200 ㎍/㎖), 융모막추출물 200 또는 400 ㎍/㎖만을 처리한 그룹(CME 200, 400 ㎍/㎖), PD153035(Calbiochem사)를 10, 20 μM의 농도로 처리한 후, 1 시간 후 양막추출물 200 ㎍/㎖를 처리한 그룹(AME 200㎍/㎖+PD 10(또는 20) μM)를 제조하였다. 상기 각 그룹을 7일 동안 분화를 유도한 후, 칼슘의 함량을 QuantiChromTM 칼슘 분석 키트(DICA-500)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다(*P<0.05).
도 15에 나타난 바와 같이, AME 200 ㎍/㎖, CME 200 ㎍/㎖만 처리한 그룹에서 골재생 효과가 전혀 없었으나, EGF 저해제인 PD153035를 처리하면 칼슘침착도가 유의하게 증가하여, 두 배 농도의 CME 400 ㎍/㎖만을 처리한 그룹과 동등하거나 더 높은 효과를 갖는 것을 확인되었다.
본 실험예에서는 미도시하였으나, 융모막 추출물 혹은 양막과 융모막 복합추출물과 PD153035를 포함하는 약학조성물은 양막 추출물과 PD153035를 포함하는 약학조성물보다는 낮으나, 대조군에 비해 효과의 증가를 확인할 수 있었다. 구체적으로 융모막 추출물과 PD153035를 포함하는 약학조성물은 1.1 내지 1.5 배의 농도에서 나타낼 수 있는 효과를 나타냄을 확인하였고, 양막과 융모막 복합추출물과 PD153035;를 포함하는 약학조성물도 2 배 이상의 농도에서 나타낼 수 있는 효과를 나타냄을 확인하였다.
즉, 낮은 농도의 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막과 융모막 추출물을 PD153035와 함께 사용할 경우에, 높은 농도의 양막추출물, 융모막추출물 또는 양막과 융모막 추출물과 동등하거나 더 우수한 효과(칼슘침착도 증가, 골분화 촉진 유전자 발현 증가, 골분화 촉진 효과 및 골질환 예방 혹은 치료 효과)를 갖는다는 것을 알 수 있다.

Claims (21)

  1. 양막추출물, 융모막추출물 및 양막(Amnion membrane)과 융모막(Chorion membrane)의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물; 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제;를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분만 후 조직 유래 추출물은 양막, 융모막 및 양막과 융모막 복합물 중에서 선택되는 분만 후 조직의 물 추출물 상청액 또는 2-30부피%의 C1 - 4알콜 수용액 추출물 상청액인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 상피세포 성장인자 저해제는 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)의 티로신 키나제 저해제(tyrosin kinase inhibitor; tki), 단일클론성 항체 저해제(Monoclonal antibody inhibitor), 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(mitogen-activated protein kinase kinase enzymes inhibitor; MEK inhibitor) 및 포스포이노시타이드-3-키나제 저해제(phosophoinositide-3-kinase inhibitor; PI3K inhibitor)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 상피세포 성장인자 저해제는 티로신 키나제 저해제인 PD153035, Gefitinib, Erlotinib, AG494 및 AG1478로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 상피세포 성장인자 저해제는 PD153035인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학조성물은 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물을 100 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 상피세포 성장인자 저해제가 10 내지 20 μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 분만 후 조직 유래 추출물은 양막추출물 또는 양막과 융모막의 복합추출물인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 골질환은 골소실증, 골결손, 골다공증, 골절, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 및 부정교합으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 약학조성물은 βTCP(β-Tritricalcium phosphate), 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 골재생용 지지체와 병용하여 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 약학조성물은 βTCP(β-Tritricalcium phosphate), 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 골재생용 지지체의 표면에 물리적으로 코팅시키거나 또는 화학적으로 결합시켜 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제, 액제 또는 주사제의 형태로 제형화된 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    골형성 촉진 또는 칼슘 침착(석화)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  13. (1) 태반으로부터 양막과 융모막을 각각 박리 또는 양막과 용모막의 복합체를 박리하고 세척하는 단계;
    (2) 세척된 양막, 융모막 또는 양막과 융모막의 복합체를 분쇄하여 분쇄물을 얻는 단계;
    (3) 상기 분쇄물을 물 또는 2-30부피%의 C1 - 4알콜 수용액에 투입하여 단백질을 용출시켜 추출물을 얻는 단계;
    (4) 상기 추출물을 원심분리하여 상청액을 수집하는 단계; 및
    (5) 상기 상청액에 상피세포 성장인자 저해제를 첨가하는 단계;를 포함하는 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 상피세포 성장인자 저해제는 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)의 티로신 키나제 저해제(tyrosin kinase inhibitor; tki), 단일클론성 항체 저해제(Monoclonal antibody inhibitor), 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 저해제(mitogen-activated protein kinase kinase enzymes inhibitor; MEK inhibitor) 및 포스포이노시타이드-3-키나제 저해제(phosophoinositide-3-kinase inhibitor; PI3K inhibitor) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 상피세포 성장인자 저해제는 티로신 키나제 저해제인 PD153035, Gefitinib, Erlotinib, AG494 및 AG1478로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학조성물의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 상피세포 성장인자 저해제는 PD153035인 것을 특징으로 하는 약학조성물의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 (5) 단계에서 상기 상청액에는 상기 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물이 100 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 상피세포 성장인자 저해제가 10 내지 20 μM의 농도로 혼합되는 것을 특징으로 하는 약학조성물의 제조방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 양막 또는 양막과 융모막의 복합체를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 약학조성물의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 골질환은 골소실증, 골결손, 골다공증, 골절, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환 및 부정교합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학조성물의 제조방법.
  20. 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물; 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factors; EGF) 저해제;를 혼합하여 처리하는 단계를 포함하는 골형성 촉진방법.
  21. 양막추출물, 융모막추출물 및 양막과 융모막의 복합추출물 중에서 선택되는 분만 후 조직 유래 추출물과 상피세포 성장인자(EGF) 저해제를 혼합하되, 상피세포 성장인자 저해제의 첨가량을 조절함으로써 골형성 촉진속도 또는 촉진률을 조절하는 방법.
KR1020170078456A 2016-06-21 2017-06-21 분만 후 조직 유래 추출물 및 상피세포 성장인자 저해제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 KR101915735B1 (ko)

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