KR20170127768A - 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법 - Google Patents

환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자 유래 체액 종양세포(tumor cells)를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 자동화된 종양 세포 분리장치를 활용하여 환자의 체액(body fluid)으로부터 체액 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 방법에 관한 것이다.

Description

환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법 {The personalized anti-cancer agent screening system using the tumor cells derived on body fluid of patients with cancer}
본 발명은 환자 체액 종양세포(tumor cells)를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 자동화된 종양 세포 분리장치를 활용하여 환자의 체액(body fluid)으로부터 체액 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 방법에 관한 것이다.
암은 혈청 특이 항원(antigen) 검사, 초음파 검사, 조직생검 등의 방법을 이용하여 진단할 수 있다. 그러나 조직생검은 암 환자로부터의 반복적인 채취가 어렵고, 한 번의 조직생검 후 일정시간의 회복기간을 필요로 하기 때문에 환자에게도 육체적인 부담을 줄 뿐만 아니라 조직생검을 하기 전 다양한 검사로 인해 효율적이지 못한 문제점이 있다. 또한 부작용으로 감염이나 출혈을 일으킬 수 있는 문제점이 있다. 따라서, 조직생검이 불가능한 환자 또는 반복적인 조직생검을 필요로 하는 환자를 위해 간단한 방법으로 암 진단을 가능하게 하는 검사 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
암 진단, 유전자 해석 등 바이오 기술의 발달에 따라 세포를 이용한 다양한 검사 또는 검진 방법이 개발되고 있다. 이러한 세포를 이용한 검사 또는 검진을 위해서는 인간 또는 동물의 혈액으로부터 살아 있는 세포(live cell)를 포집하기 위한 기술이 필요하다. 세포 포집의 예로서 암 진단을 위해 체액으로부터 체액 종양세포를 이용하는 방법이 있다.
체액이란, 혈액, 흉수, 복수, 심낭액, 양수, 관절액, 요, 뇌척수액 등 체내의 액체로서, 특히 체액 중에서도 복수는 암 진단 및 예방의 판단에 활용되고 있다. 체강내에 체액이 고이는 경우는 매우 다양한 양성 및 악성 질환에서 질병의 경과 중 발생하게 되고, 이러한 체액은 별도의 도구나 장비가 없어도 쉽게 주사기를 삽입하여 천자할 수 있으므로 체액을 이용한 암 진단은 널리 활용될 수 있는 이점을 가지고있다.
복수(ascites)는 복강 내에 비정상적 혹은 병적으로 체액이 저류되는 것으로 정의된다. 복수는 대부분 간경변증에 의해 발생하는 경우가 60%, 악성 종양에 의해 발생하는 경우가 26%, 결핵성 복막염에 의해 발생하는 경우가 7%, 기타 질환에 의해 발생하는 경우가 8%로 간경변증 이외에 다른 여러 가지 질환에 의해 발생하게 된다. 복수가 생기는 이유는 체내 수분과 염분의 과다 상태로 인해 발생하지만, 이런 상태를 유도하는 원인이 무엇인지는 정확히 밝혀져 있지 않고 여러 가지 요인들이 관여하는 것으로 알려져 있다.
복수에는 종양성 세포 중 중피와 이를 지지하고 있는 결합 조직에서 발생하는 종양인 원발(성) 중피종 또는 전이암을 발견할 수 있다. 이때 복수에서 채취한 복수 종양세포(ATC/ATCs)는 1차적인 종양조직, 즉 원발암으로부터 떨어져 나와 혈액 속을 돌아다니는 소수의 종양세포로 전이암의 핵심요인으로 알려져 있다. 통계에 따르면 암 환자의 약 90%가 전이암으로 인하여 사망하고 있는 것으로 알려져 있다.
체내 종양세포의 포집을 위한 방법으로서, 항 EpCAM(상피 세포 접착 분자) 항체를 고정화한 자성 입자 또는 기둥 형상 구조 등의 수지 표면에 캡처 항체를 결합시킨 마이크로 유체 디바이스를 이용하는 방법과, 종양세포와 혈구 세포의 크기 차이를 이용하여 필터를 사용하는 방법이 알려져 있다.
필터를 사용하는 방법으로서, 유체로부터 세포를 여과하기 위한 파릴렌 멤브레인 필터(parylene membrane filter)를 사용하는 방법이 있다. 멤브레인 필터는 챔버 내에 장착되어 있으며, 표적 세포가 통과되지 못하도록 형성되어 있는 다수의 기공(pore)들을 갖는다. 그러나 이 기술에서는 멤브레인 필터에 여과되어 있는 암세포를 챔버로부터 회수하여 채집하기 곤란한 문제가 있다. 또한, 주사기에 의하여 챔버에 주입되는 세포가 손상될 우려가 높다.
세포 포집을 위한 필터로서, 정밀여과 장치의 중앙사각구멍(central square hole)에 다수의 필터패치(filter patch)들을 설치하는 방법이 있다. 필터패치들은 세포의 여과를 위한 다수의 기공들을 갖는 멤브레인으로 구성되어 있다. 그러나 이 방법 역시 정밀여과 장치의 필터패치에 여과되어 있는 세포를 중앙사각구멍으로부터 회수하여 채집하기 곤란하고, 표적 세포가 손상될 우려가 높다.
따라서, 표적 세포에 대한 회수율이 높으면서도 세포의 손상이나 변형이 방지되고 활성에 영향을 주지 않는 간단하면서도 경제적인 구조의 세포 포집 필터가 요구되고 있다.
또한, 체내 종양세포를 활용하여 암을 진단하고, 항암제 반응 분석을 이용하여 후보 항암제 중 개인 맞춤형 항암제를 선별함으로써, 암의 치료율을 향상시키고 예후를 모니터링할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이와 관련하여 국제특허 제 2014032205호(발명의 명칭: 암을 스크리닝 하는 방법, 이하 종래기술 1이라고 한다.)는 스미어(smear), 복수(ascite), 혈액, 소변, 대변, 가래, 구강 점막 세포, 위액, 담즙, 자궁경부 상피 세포, 또는 수술 후 암 조직의 시험관내 샘플인 것을 특징으로 하는 암을 스크리닝 하는 방법을 개시하고 있다.
상기 종래기술 1은 스미어(smear), 복수(ascite), 혈액, 소변, 대변, 가래, 구강 점막 세포, 위액, 담즙, 자궁경부 상피 세포, 또는 수술 후 암 조직의 시험관내 샘플인 것을 특징으로 하는 암을 스크리닝하는 방법을 개시하고 있으나, 체액으로부터 분리한 체액 종양세포를 활용하여 개인 맞춤형 항암제 선별방법은 개시되어 있지 않다.
따라서 종래기술의 문제점을 해소하고자 안출된 본 발명은 환자 유래 체액 종양세포(tumor cells)를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 자동화된 종양 세포 분리장치를 활용하여 환자의 체액(body fluid)으로부터 체액 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 환자 유래 체액 종양세포(tumor cells)를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 자동화된 종양 세포 분리장치를 활용하여 환자의 체액(body fluid)으로부터 체액 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 방법에 관한 기술을 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법은 i) 암 환자의 체액(body fluid)을 추출하는 단계, ii) 체액으로부터 체액 종양세포(tumor cells)를 분리하는 단계, iii) 분리된 체액 종양세포를 단기 배양하는 단계, iv) 단기 배양된 체액 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계, v) 후보 항암제 반응을 분석하는 단계 및 vi) 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 체액은 혈액, 흉수, 복수, 심낭액, 양수, 관절액, 요, 뇌척수액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 실시예에 있어서, (v) 단계는, (v-1) 체액 종양세포의 유전정보와 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계, (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계, (v-3) 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계 및 (v-4) 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 맞춤형 항암제 선별 시스템은, 암 환자의 체액으로부터 분리된 세포로부터 체액 종양세포를 분리하는 분리장치, 분리된 체액 종양세포를 배양하는 배양장치, 배양된 체액 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치, 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치 및 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 분리장치는 체액 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 세포 포집 필터 및 세포 포집 장치일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 세포 포집 필터는, 금속으로 이루어진 필터 본체에 매트릭스 형상으로 배치된 다수개의 사각 형상 기공이 마련되며, 필터 본체의 두께를 t, 기공의 가로 방향 길이를 a, 기공의 세로 방향 길이를 b, 필터의 가로 방향을 따라 인접한 기공 사이의 거리를 l, 필터의 세로 방향을 따라 인접한 기공 사이의 거리를 m이라고 할 때, a와 b의 비율 a/b는 0.8 내지 1.2이고, l과 m의 비율 l/m은 0.8 내지 1.2이며, t와 a의 비율 또는 t와 b의 비율 t/x(여기서 x는 a 또는 b)는 0.5 내지 1.8일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, a와 l의 비율 a/l은 0.9 내지 1.6이고, b와 m의 비율 b/m은 0.9 내지 1.6일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, a 또는 b는 표적 세포의 직경에 대하여 40 내지 70%의 크기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 필터 본체는 니켈 또는 니켈합금으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 실시예는 세포 포집 장치로서, 내측에 유체 유통 가능한 중공부를 가진 튜브와, 튜브의 하측에 마련되며, 전술한 바와 같은 체액 종양세포 포집 필터를 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 유체의 흐름 방향 상 상류 쪽으로부터 하류 쪽으로 순차적으로 배치되며, 다수의 세포 포집 필터들을 구비하며, 상류 쪽에 배치된 세포 포집 필터는 하류 쪽에 배치된 필터보다 크기가 큰 형상 기공을 구비하며, 각 필터 사이에는 유체를 일시적으로 수용하는 저장층이 구비된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상류 쪽에 배치된 세포 포집 필터의 형상 기공들의 수가 하류 쪽에 배치된 세포 포집 필터의 형상 기공들의 수보다 더 적은 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 표적세포에 대한 회수율이 높으면서도 표적세포의 손상이나 변형이 방지되고 활성에 영향을 주지 않는 간단하면서도 경제적인 구조의 종양세포 포집 필터 및 이를 구비한 포집 장치를 활용하여 암 환자의 체액으로부터 체액 종양세포를 분리한다는 제 1효과, 기존 조직생검에서 활용되지 못하거나 시행하지 못하였던 반복적이고 비침습적인 방법으로 개인 맞춤형 항암제 반응 검사를 가능하게 한다는 제 2효과, 기존 조직생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감 뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 제 3효과, 암 환자에게 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별함으로써 민감도 및 특이도를 향상시켜 암 치료율을 증가시킨다는 제 4효과, 체내에 선별 항암제 투여 시 치료반응을 모니터링 할 수 있으며, 치료 시 수반되는 시행착오와 위험성을 감소시킬 수 있다는 제 5효과, 암에 특이적인 항암제 반응 시 종양세포의 강도를 통하여 항암제 반응 분석에 응용이 가능하다는 제 6효과를 갖는다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 암 환자를 위한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다.
도 2는 암 환자의 유전정보를 이용한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다.
도 3은 맞춤형 항암제 선별 시스템을 보여주는 도면이다.
도 4는 세포 분리장치의 개략적인 구성을 나타내는 평면도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 세포 포집 장치를 나타내는 분해 구성도이다.
도 6은 도 7의 세포 포집 장치의 측단면도이다.
도 7은 도 7의 세포 포집 장치의 세포 포집 필터의 개략적인 구성을 나타낸 사시도이다.
도 8은 표적 세포의 포집 프로세스를 설명하는 부분 단면도이다.
도 9는 도 9의 세포 포집 필터의 일부를 나타낸 절단 사시도이다.
도 10은 체액 중 복수 종양세포를 바이오마커로 확인한 사진이다.
도 11은 세포 포집 장치를 이용하여 체액 중 복수 종양세포의 회수율을 비교한 그래프이다.
이하에서는 화학식, 반응식, 구체적인 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결 (접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 실시예에서 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법은 i) 암 환자의 체액(body fluid)을 추출하는 단계, ii) 상기 체액으로부터 체액 종양세포(tumor cells)를 분리하는 단계, iii) 상기 분리된 체액 종양세포를 단기 배양하는 단계, iv) 상기 단기 배양된 체액 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계, v) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계 및 vi) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계일 수 있다.
도 1은 암 환자를 위한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다. 도 1을 참조하여 보면, 맞춤형 항암제 선별을 하기 위해 우선, 암 환자로부터 체액을 추출하는 단계(S10)를 실시한다. 기존 암 검진의 방법으로 사용되고 있는 조직생검은 환자로부터의 반복적인 채취가 어렵고, 한 번의 조직생검 후 일정시간의 회복기간을 필요로 하기 때문에 환자에게도 육체적인 부담을 줄 뿐만 아니라 조직생검을 하기 전 다양한 검사로 인해 효율적이지 못한 문제점이 있다. 또한 부작용으로 감염이나 출혈을 일으킬 수 있는 문제점이 있다. 따라서, 조직생검이 불가능한 환자 또는 반복적인 조직생검을 필요로 하는 환자를 위해 간단한 방법으로 암 진단을 가능하게 하는 검사 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
체액을 이용하여 질병을 진단하는 방법은 반복적이고 비침습적인 방법으로 조직생검 보다 간편하며, 기존 조직생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 시간적, 경제적 이점이 있다. 체액 추출 후 체액 종양세포를 분리하는 과정이나 배양하는 과정에서 후보 항암제 반응검사를 실시하기에 충분한 개수의 체액 종양세포를 획득하지 못한 경우나 선별된 후보 항암제의 효과가 예상보다 좋지 않은 경우, 신속하게 다음 체액을 추출하여 체액 종양세포를 획득함으로써 빠른 시간 내에 반복적인 후보 항암제 반응검사를 실시할 수 있는 이점이 있다.
체액으로부터 체액 종양세포를 분리하는 단계(S11)는 체액 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 세포 포집 필터 및 세포 포집 장치를 포함하는 분리장치를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 체액은 혈액, 흉수, 복수, 심낭액, 양수, 관절액, 요, 뇌척수액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 체강내에 체액이 고이는 경우는 매우 다양한 양성 및 악성 질환에서 질병의 경과 중 발생하게 되고, 이러한 체액은 별도의 도구나 장비가 없어도 쉽게 주사기를 삽입하여 천자할 수 있으므로 체액을 이용한 암 진단은 널리 활용될 수 있는 이점을 가지고 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일일 수 있다. 체액으로부터 분리된 체액 종양세포는 체액 내 극소수의 종양세포를 획득한 것으로서, 종양세포를 단기 배양 단계(S12)를 거쳐 짧은 시간 내에 후보 항암제와의 반응검사를 실시할 수 있을 다량의 종양세포를 확보해야 한다. 종양세포를 단기 배양하는 기간은 7일 내지 14일이 적합할 수 있으나, 체액 종양세포는 암의 종류에 따라 증식속도가 다르고, 환자의 암 진행 정도와 환자의 상태에 따라 체액로부터 획득할 수 있는 체액 종양세포의 개수가 다르기 때문에, 단기 배양기간을 7일 내지 14일로 제한하는 것은 아님을 명시한다. 나아가, 일반적으로 항암제 치료를 받는 경우 환자가 항암제를 처음 투약한 후 3주 정도를 항암치료의 일반적인 주기로 보는데, 이는 항암제의 독성이 커서 연속적으로 치료할 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 선별방법에 따른 항암제가 환자에게 적합하지 않으면 1차 항암치료를 한 이후 2차 항암치료를 준비할 수 있도록, 배양 기간을 더 길게 설정할 수도 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
암 환자의 정보는 유전적 정보 또는 임상정보가 될 수 있다. 암 환자의 정보로서 암의 유전형을 분석하여 수득한 SNP, 돌연변이, 일배체형, 전장 염기서열 등의 유전적 정보를 사용할 경우, 유전적 정보를 약물반응 데이터 베이스에 적용하여 유전적 정보에 상응하는 후보 항암제를 도출하는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 암의 유전적 정보를 수득하지 않고서 환자의 임상정보만을 사용할 경우에도 후보 항암제를 도출할 수 있는데, 구체적으로는 암의 발생부위, 암 특이적 유전자 마커 분석 결과, 전이 관련 정보, 환자의 증상정보 등의 임상정보를 암의 임상정보와 유전적 정보를 포함하는 데이터 베이스에 적용하여, 후보 항암제를 도출하는 방식으로 수행될 수 있다.
체액 종양세포의 단기 배양 후, 환자의 유전적 정보를 고려한 후보 항암제 군을 선별하고, 상기 후보 항암제군을 환자의 체액 종양세포와 반응시키는 단계(S13)를 수행한다. 이후, 후보 항암제 군의 반응결과를 분석하면서 항암 활성 효과 및 부작용 등 후보 항암제의 반응 분석 단계(S14)를 수행한다. 후보 항암제 반응검사의 결과를 토대로 후보 항암제를 비교 분석하여 개인 맞춤형 항암제 선별 단계(S15)를 수행한다. 맞춤형 항암제란, 맞춤의학(tailored medicine)을 이용하여 결정되어 암이 발병한 개체에게 특이적으로 최적의 치료효과를 나타낼 수 있는 의약 조성물을 의미한다. 맞춤의학(tailored medicine)이란 맞춤의료(order-made medicine) 또는 환자 맞춤형 의학(personalized medicine)이라고도 하며, 환자 개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 치료법을 결정하는 방법 또는 치료하는 방법을 의미한다.
본 발명의 실시예에서 상기 (v) 단계는, (v-1) 상기 체액 종양세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계, (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계, (v-3) 상기 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계 및 (v-4) 상기 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계일 수 있다.
도 2는 암 환자의 유전정보를 이용한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다. 도 2를 참조하여 보면, 상기 분석단계는 체액 종양세포의 유전정보 분석 단계(S20) 및 체액 종양세포와 후보 항암제 간의 반응 분석하는 단계(S21)를 포함한다. 상기 정보들을 취합하여 정보 클러스터를 구축 단계(S22) 및 상기 정보클러스터를 이용하여 데이터 마이닝(data mining) 단계(S23)를 수행한다. 데이터 마이닝이란 취합한 환자의 유전정보 및 체액 종양세포와 후보 항암제 간의 무수한 정보 가운데 숨겨져 있는 유용한 상관관계를 발견하여, 실행 가능한 정보를 추출하고 선별 결정에 이용하는 과정을 의미한다. 상기 상관관계를 발견하는 과정에서 체액 종양세포와 후보 항암제 간의 반응 효과에 따른 알고리즘 구축 단계(S24)를 수행할 수 있다. 본 발명에서의 알고리즘은 환자의 유전정보에 맞는 항암제를 선별하기 위하여 후보 항암제 중에 가장 적합한 항암제를 발견하기 위해 거치는 일련의 순서화된 절차를 의미한다.
개인 맞춤형 항암제 선별방법으로 도출된 결과 데이터를 축적하고, 축적된 데이터를 이용하면 암의 유전적 정보 데이터 및 환자의 임상정보 데이터의 상관관계를 분석할 수 있고, 상기 분석결과를 이용하여 이들 데이터 간의 연관성을 예측하는 알고리즘을 구축할 수 있다. 구축된 알고리즘은 개인 맞춤형 항암제 선별방법에 사용된 데이터와 상기 방법으로부터 도출된 데이터를 연계시킬 수 있으므로, 도축된 알고리즘을 이용하면 보다 용이하게 개인 맞춤형 항암제를 선별할 수 있다. 암의 유전적 정보, 환자의 임상정보 및 환자 맞춤형 항암제 정보 데이터 사이의 상관관계를 분석하여 구축된 알고리즘은 in vitro 및 in vivo 조건에서 추가적인 실험 없이 암의 유전적 정보 데이터 및 환자의 임상정보 데이터로부터 개인 맞춤형 항암제를 선별하는데 사용될 수 있으며, 알고리즘에 환자 데이터를 추가하여 갱신함으로써 개인 맞춤형 항암제 선별 성공률을 향상시킬 수 있다.
도 3은 맞춤형 항암제 선별 시스템을 보여주는 도면이다.
본 발명의 실시예에서 맞춤형 항암제 선별 시스템(3000)은, 암 환자의 체액으로부터 분리된 세포로부터 체액 종양세포를 분리하는 분리장치(1), 상기 분리된 체액 종양세포를 배양하는 배양장치(500), 상기 배양된 체액 종양세포에 상기 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치(1000), 상기 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치(1500) 및 상기 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치(2000)일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 정량적 중합효소 연쇄반응 기기란 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 것으로 DNA 또는 RNA를 시간에 따라 모니터링하는 기기이다. 플레이트 리더기 및 멀티플렉스 리더기는 세포 수준의 반응을 미량으로 실행하고, 상기 변화를 감지하여 분석하는 기기이다. 공초점 현미경은 바늘구멍 조리개를 통해 여러 단면에 초점을 맞추는 현미경으로, 세포를 깊이감 있는 3차원 구조로 관찰할 수 있는 기기이다.
본 발명의 실시예에서 상기 분리장치는 체액 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 세포 포집 필터 및 세포 포집 장치일 수 있다.
도 4는 세포 분리장치의 개략적인 구성을 나타내는 평면도이다.
도시된 바와 같이, 세포 분리장치(1)는 피펫팅 모듈(pipetting module)(10)과 작업 모듈(20)을 포함하며, 피펫팅 모듈(10)은 레일(30)을 따라 작업 모듈(20) 상에서 이동하며(도면에서 좌우 방향으로 이동) 세포 분리/포집 공정을 수행한다.
피펫팅 모듈(10)은 다수개의 피펫 작업대(11)와, 이 피펫 작업대(11)를 피펫팅 모듈 본체에 대해 상하 및 좌우로 이동시키는 구동부(12)를 포함할 수 있다.
작업 모듈(20)은 샘플 튜브 보관부(21), 제1 피펫 랙(pipette rack)(22), 프로세스부(23), 디쉬(dish)/칩(chip) 카트리지부(24), 제2 피펫 랙(25), 및 회수용 튜브 보관부(26)를 포함한다. 참고로, 본 명세서에서 제1 피펫 랙(22)과 제2 피펫 랙(25)의 어느 하나, 또는 양자를 총칭하여 피펫 랙이라 한다.
프로세스부(23)에는 버퍼(buffer)액 보관을 버퍼액 보관 튜브와 액 혼합/추출/분리를 위한 프로세스 튜브가 위치한다.
제1 및 제2 피펫 랙(22; 25)에는 각각 상이한 크기의 피펫이 다수개 보관될 수 있으며, 사용이 완료된 피펫을 수거하기 위한 수거박스가 함께 또는 별도로 마련될 수 있다.
이와 같이 세포 분리장치(1)에는 세포 분리/포집/회수 공정을 위한 각종 구성이 포함되는데, 이러한 세포 분리장치(1)를 이용한 공정 중 가장 중요한 부분 중의 하나는 혈액을 원심분리하거나 버퍼액을 혼합하는 등의 전처리 과정을 거친 후, 이 혼합 시료로부터 표적 세포를 필터링하는 과정이다. 이를 위해 세포 포집 필터(200)(도 5참조)를 구비한 세포 포집 장치(100)를 디쉬 상에 위치시키고 여기에 버퍼액 등을 투입하여 유체의 흐름 압력에 의해 필터링을 수행하게 된다.
디쉬로 유출된 버퍼액은 별도의 장소로 수거될 수 있다. 또한 세포 포집 장치(100)는 이미 버퍼액이 있는 디쉬 상에 놓여진 상태에서 필터링 작업이 이루어질 수도 있다. 버퍼액은 다수회 세포 포집 장치(100) 내부로 투입될 수 있으며, 또한 세포 포집 장치(100)에 투입되는 버퍼액은 버퍼액 보관 튜브로부터 공급될 수도 있고, 디쉬에 있는 버퍼액으로부터 공급될 수도 있다.
이와 같이, 세포 분리장치(1)는 혈액으로부터 표적 세포를 분리하여 포집하기 위한 장치로서, 세포 포집 필터(200)를 구비한 세포 포집 장치(100)를 포함한다. 여기서, 세포 포집 장치(100)를 세포 포집용 칩, 또는 간략하게 칩(chip)으로 표현하기도 한다.
본 발명의 실시예에서 상기 세포 포집 필터는, 금속으로 이루어진 필터 본체에 매트릭스 형상으로 배치된 다수개의 사각 형상 기공이 마련되며, 상기 필터 본체의 두께를 t, 상기 기공의 가로 방향 길이를 a, 상기 기공의 세로 방향 길이를 b, 필터의 가로 방향을 따라 인접한 상기 기공 사이의 거리를 l, 필터의 세로 방향을 따라 인접한 상기 기공 사이의 거리를 m이라고 할 때, 상기 a와 b의 비율 a/b는 0.8 내지 1.2이고, 상기 l과 m의 비율 l/m은 0.8 내지 1.2이며, 상기 t와 a의 비율 또는 상기 t와 b의 비율 t/x(여기서 x는 a 또는 b)는 0.5 내지 1.8일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 a와 l의 비율 a/l은 0.9 내지 1.6이고, 상기 b와 m의 비율 b/m은 0.9 내지 1.6일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 a 또는 b는 표적 세포의 직경에 대하여 40 내지 70%의 크기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 필터 본체는 니켈 또는 니켈합금으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 실시예는 세포 포집 장치로서, 내측에 유체 유통 가능한 중공부를 가진 튜브와, 상기 튜브의 하측에 마련되며, 전술한 바와 같은 체액 종양세포 포집 필터를 제공한다.
본 발명의 실시예에서 상기 유체의 흐름 방향 상 상류 쪽으로부터 하류 쪽으로 순차적으로 배치되며, 다수의 세포 포집 필터들을 구비하며, 상기 상류 쪽에 배치된 세포 포집 필터는 상기 하류 쪽에 배치된 필터보다 크기가 큰 상기 형상 기공을 구비하며, 상기 각 필터 사이에는 상기 유체를 일시적으로 수용하는 저장층이 구비된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 상류 쪽에 배치된 세포 포집 필터의 형상 기공들의 수가 상기 하류 쪽에 배치된 세포 포집 필터의 형상 기공들의 수보다 더 적은 것일 수 있다.
이하, 세포 포집 장치 또는 세포 포집 필터의 구성을 구체적으로 설명하도록 한다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 세포 포집 장치를 나타내는 분해 구성도, 도 6은 도 5의 세포 포집 장치의 측단면도, 도 7는 도 5의 세포 포집 장치의 세포 포집 필터의 개략적인 구성을 나타낸 사시도이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 세포 포집 장치(100)는 상측의 제1 튜브(110) 및 하측의 제2 튜브(120)를 결합하여 구성될 수 있으며, 제2 튜브(120)의 하측에 세포 포집 필터(200)가 마련될 수 있다.
도 6을 함께 참조하면, 제1 튜브(110)는, 제1 튜브 본체(111)와 이 제1 튜브 본체(111)의 하측에 마련된 돌출형 결합부(112)를 가질 수 있다. 제2 튜브(120)는, 제2 튜브 본체(121)와, 이 제2 튜브 본체(121)의 하측에서 내측 방향으로 돌출 설치된 돌출부(122)를 가질 수 있다. 돌출부(122)의 하측에 세포 포집 필터(200)가 고정 결합될 수 있다. 도시된 바와 달리 세포 포집 필터(200)가 돌출부(122)의 상측에 고정 결합되는 것도 가능하다.
이와 같이, 세포 포집 장치(100)는 내측에 유체 유통가능한 중공부를 가진 튜브(110; 120)와, 이 튜브(110; 120)의 하측에 마련된 세포 포집 필터(200)를 포함하여 구성될 수 있다. 여기서 튜브(110; 120)는 2개의 제1 튜브(110) 및 제2 튜브(120)로 구성된 것으로 도시되어 있으나, 하나의 단일한 튜브로 구성되거나 3개 이상의 파트로 구성된 것일 수도 있다.
또한 세포 포집 필터(200)가 결합된 제2 튜브(120)의 하측에 추가로 튜브가 결합될 수도 있다. 즉, 유체 유통 가능한 튜브의 중간부에 세포 포집 필터(200)가 삽입되어 있는 형태로 구성될 수 있다. 따라서 본 발명의 명세서 또는 청구범위에서 튜브의 하측에 세포 포집 필터(200)가 설치되는 것으로 표현했다고 해서, 이것이 튜브의 중간부에 세포 포집 필터(200)가 마련된 형태의 세포 포집 장치(100) 구성을 배제하는 것은 아니다.
또한 도면에서는 결합부(112)와 제2 튜브 본체(121) 사이의 억지 끼워맞춤에 의해 제1 튜브(110)와 제2 튜브(120)가 고정 결합되는 것으로 도시되어 있으나, 이러한 결합 방식으로 한정되는 것은 아니며, 예컨대 나사산 형태에 의한 결합, 또는 접착, 융착 등의 방식으로 제1 튜브(110)와 제2 튜브(120)가 결합되는 것도 가능하다.
세포 포집 장치(100)의 튜브(110); 120)를 통해 유체가 이동하며, 세포 포집 필터(200)의 사이즈 선택성에 의해 표적 세포가 포집 및 회수될 수 있다. 유체는 정량의 유체를 토출할 수 있는 피펫에 의해 세포 포집 장치(100)의 내측으로 공급될 수 있으며, 그 외에도 주사기/시린지(syringe)나 채혈관, 팩 형태의 유체 저장장치 등으로부터 유체가 공급될 수도 있다.
유체는 예컨대 복수 또는 복수를 포함하는 용액일 수 있으며, 그 외에도 표적 세포 또는 표적 물질의 포집이 필요한 여하한 형태의 액체 또는 액상 물질일 수 있다. 그러한 예로서, 유체는 종양세포를 포함하는 혈액일 수 있으며, 이 경우 혈종 종양세포가 표적세포가 되고, 그 외의 혈구(백혈구, 적혈구)가 비표적 세포가 될 수 있다.
도면에서는 세포 포집 장치(100)가 원통 형태로 도시되어 있으나, 반드시 이러한 형태로 한정되는 것은 아니며, 예컨대 사각형 등의 다각형으로 구성될 수도 있다.
도 7을 참조하면, 세포 포집 필터(200)는 금속으로 이루어진 필터 본체(210)와, 이 필터 본체(210)에 매트릭스 형상으로 배치된 다수개의 사각 형상 기공(220)을 포함한다. 이 도면에서는 기공(220)의 크기를 과장하여 표현하였으나, 체액 종양세포와 같은 표적 세포의 크기를 고려할 때 기공(220)은 도시된 것보다 크기가 작고 그 수는 훨씬 많다. 본 명세서 및 도면에서 x방향은 가로 방향을, y방향은 세로 방향을 각각 나타내는 것으로 한다.
한편, 기공(220)이 매트릭스 형상으로 배치되어 있다고 하여, 기공(220)의 가로방향 배치와 세로방향 배치가 반드시 동일해야 하는 것은 아니며, 또한 예컨대 제1, 3, 5... 열의 기공(220)과 제2, 4, 6열의 기공(220)이 엇갈린 형태로 배치되는 것도 가능하다.
도 8은 표적 세포의 포집 프로세스를 설명하는 부분 단면도이다. 필터 본체(210)에 형성된 기공(220)은 표적 세포(2)의 직경보다는 작고 비표적 세포(3)의 직경보다는 크게 마련된다. 다만, 기공(220)의 길이가 표적 세포(2)의 직경보다 작다 하더라도 그 차이가 너무 작은 경우, 즉 기공(220)이 표적 세포(2)와 비슷한 크기인 경우에는 필터링시 또는 회수시 표적 세포(2)가 손상되거나 변형될 수 있다. 이에 대한 상세는 후술하기로 한다.
도 9는 도 7의 세포 포집 필터의 일부를 나타낸 절단 사시도이다.
도시된 바와 같이 세포 포집 필터(200)의 필터 본체(210)의 두께를 t, 기공(220)의 가로 방향 길이를 a, 기공(220)의 세로 방향 길이를 b, 세포 포집 필터(200)의 가로 방향을 따라 인접한 2개의 기공(220) 사이의 거리를 l, 세포 포집 필터(200)의 세로 방향을 따라 인접한 2개의 기공(220) 사이의 거리를 m이라고 할 때, 각 거리(또는 두께)는 다음과 같은 관계를 만족해야 한다. 이러한 관계를 만족할 경우 체액 종양세포와 같은 극소수 표적 세포를 80% 이상 회수하는 것이 가능하게 되며, 그 표준 편차는 10% 이하가 된다.
1. a와 b의 비율 a/b는 0.8 내지 1.2
2. l과 m의 비율 l/m은 0.8 내지 1.2
3. t와 a의 비율 또는 t와 b의 비율 t/x(여기서 x는 a 또는 b)는 0.5 내지 1.8
4. a와 l의 비율 a/l은 0.9 내지 1.6
5. b와 m의 비율 b/m은 0.9 내지 1.6
여기서, 특히 위 3에서 제시한 t/x(x는 a 또는 b) 비율이 표적 세포의 회수율에 있어 중요하며, 또한 a/l 및 b/m의 비율도 회수율 및 세포 포집 필터(200)의 안정성(비변형성)에 중요하다. 이하 각 수치범위의 의미를 설명하면 다음과 같다.
먼저, 기공(220)의 가로 방향 길이(a)와 기공(220)의 세로 방향 길이(b) 사이의 비율, 즉 a/b가 0.8 미만이거나 1.2 초과인 경우는 기공(220)이 어느 한 쪽의 길이가 상대적으로 긴 직사각 형태가 되는데, 이 경우 기본적으로 원형 형상인 표적 세포의 여과에 적절하지 않으며, 세포의 변형을 유발할 수 있다.
다음으로, 세포 포집 필터(200)의 가로 방향을 따라 인접한 2개의 기공(220) 사이의 거리(l)와, 세포 포집 필터(200)의 세로 방향을 따라 인접한 2개의 기공(220) 사이의 거리(m)의 비율, 즉 1/m이 0.8 미만이거나 1.2 초과인 경우는 다수개의 기공의 분포가 어느 한 쪽 방향으로 불균일하게 배치되며, 따라서 표적 세포의 회수시 회수 방법에 따른 편차가 크게 나오게 된다.
다음으로, 세포 포집 필터(200)의 필터 본체(210)의 두께(t)와, 기공(220)의 가로 방향 또는 세로 방향 길이(a; b)의 비율, 즉 t/x(여기서 x는 a 또는 b)가 0.5 미만이면 표적 세포가 필터를 통과하는 에러가 커지게 되고, t/x가 1.8 초과가 되면 비표적 세포가 필터를 통과하지 못하는 에러가 커지게 되며, 또한 세포에 손상을 주거나 변형을 줄 위험이 커진다.
필터 본체(210)는 금속으로 이루어지는데, 예컨대 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄, 구리 등으로 제조될 수 있다. 이러한 금속제 세포 포집 필터(200)는 유체의 흐름 압력에 대한 저항성이 상대적으로 강하기는 하지만, 필터 본체(210)의 두께가 기공(220)의 길이에 비해 50% 미만으로 작아지면 강한 유체 압력에 의해 일시적으로 변형되었다가 탄성 복원력에 의해 원래 형태로 돌아가면서 기공(220)에 포집되어 있던 표적 세포가 손상되거나 변형될 수 있다. 또한 세포의 활성에 변화가 일어날 수도 있는데, 이로 인해 예컨대 체액 종양세포(표적 세포)에 의한 암 진단의 정확도가 낮아질 수 있다.
한편, 필터 본체(210)의 두께가 기공(220)의 길이에 비해 80% 초과하여 클 경우 필터 본체(210)의 두께가 지나치게 커져서 비표적 세포, 예컨대 혈구 세포가 기공(220)을 제대로 통과하지 못할 수 있다.
예를 들어 기공(220)의 가로 방향 길이(a) 및 세로 방향 길이(b)를 각각 5㎛(마이크로미터)로 하는 경우, 필터 본체(210)의 두께(t)는 2.5㎛ 내지 9㎛ 이어야 하며, 그 두께(t)가 2.5㎛ 미만이 되거나 9㎛ 초과가 되면 전술한 바와 같은 문제가 발생한다.
다음으로, 기공(220)의 가로 방향 길이(a)와 세포 포집 필터(200)의 가로 방향을 따라 인접한 2개의 기공(220) 사이의 거리(l)의 비율, 즉 a/l이 0.9 미만인 경우 기공(220) 사이의 간격이 커지게 되어 표적 세포의 회수율이 작아지게 되며, a/l이 1.6 초과가 되면 필터 본체(210)의 전체 부피에 비해 캐비티(기공)의 전체 부피가 너무 커지게 되어 필터 본체(210)의 강성이 유지되지 못하게 된다. 이 경우 필터링시 필터 본체(210)가 변형될 위험이 커진다.
한편, 기공(220)의 세로 방향 길이(b)와, 세포 포집 필터(200)의 세로 방향을 따라 인접한 2개의 기공(220) 사이의 거리(m)의 비율, 즉 b/m도 위 a/l의 경우와 동일하게 0.9 미만인 경우 기공(220) 사이의 간격이 커지게 되어 회수율이 작아지게 되고, b/m이 1.6 초과가 되면 필터 본체(210)의 전체 부피에 비해 캐비티의 전체 부피가 너무 커지게 되어 필터 본체의 강성을 유지하지 못하게 된다.
세포 포집 필터(200)의 필터 본체(210)를 폴리머로 하면 필터의 두께를 작게 하는 것이 어렵다. 세포의 포집을 위해서는 유체에 압력을 주어 필터링시켜야 하는데, 이 과정에서 압력에 의해 필터 본체가 휘게 되는 등 필터 본체(210)에 변형이 생기게 되고, 이러한 필터 본체(210)의 변형에 의해 기공 내에 세포가 끼거나 손상을 입게 될 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 필터 본체(210)를 금속으로 하여 유체 압력에 의한 변형 저항성을 크게 하였다. 이로써 필터 본체(210)의 두께를 작게 하는 것이 가능하게 되고, 이러한 필터 본체(210)의 두께에 대해 기공의 크기(a; b)와 기공 사이의 크기(l; m)를 일정 비율 내가 되도록 하여 표적 세포의 회수율을 크게 높일 수 있게 된다.
한편, 기공(220)의 가로 방향 길이(a)와, 기공(220)의 세로 방향 길이(b)는 표적 세포의 직경에 대하여 40 내지 70%의 크기를 가질 수 있다. 이 비율이 40% 미만이 되면 표적 세포와 비표적 세포에 대한 선택률이 낮아지게 된다. 즉, 비표적 세포가 기공을 통과하는 비율이 낮아질 수 있게 된다. 반대로 위 비율이 70% 이상이 되면 표적 세포가 기공을 통과하는 비율이 높아지게 되고, 또한 표적 세포가 기공에 끼이게 되어 표적 세포의 회수율이 저하된다. 한편 회수율을 높이기 위해 역세척하는 경우 표적 세포가 손상되거나 활성이 저하되는 문제가 발생한다.
구체적으로, 직경 7.5 내지 15㎛의 체액 종양세포에 대해 100mmHg의 유체 압력이 가한 실험에서는 체액 종양세포가 직경 8㎛의 기공(220)을 통과할 수 있었다. 또한 기공(220)의 크기를 일정 정도 이상으로 하면 이에 따라 기공(220) 사이의 거리도 커지게 되는데, 예컨대 7.5㎛의 체액 종양세포에 대해 기공(220) 사이의 거리(l; m)가 5㎛ 이상이 되면, 기공(220)들 사이에 위치하는 체액 종양세포는 역세척에 의해 필터 본체(210)의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다(즉, 회수되지 않을 수 있다). 여기서, 역세척(back washing)이란 체액 종양세포를 포집한 이후에 포집시의 유체의 흐름과 반대 방향으로 유체를 유동시키는 것을 의미한다. 만약 체액 종양세포의 회수율을 높이기 위하여 유체의 역세척시 압력을 높이게 되면 체액 종양세포가 손상될 위험이 커지게 된다.
따라서 기공(220)의 가로/세로 방향의 길이를 표적 세포의 직경에 대해 어느 이상의 크기로 하는 것은 부적절하며, 표적 세포의 회수율 80% 이상 및 그 표준 편차 10% 이하를 위해, 위 비율은 70% 이하가 되어야 한다.
한편, 기공(220)의 가로/세로 방향 길이를 표적 세포의 직경에 대해 40% 미만으로 하면 표적 세포와 비표적 세포에 대한 선택률이 낮아지게 될 뿐만 아니라, 기공(220)의 크기가 지나치게 작아지게 되고 이로 인해 인접한 기공(220) 사이의 거리도 작아지게 된다. 이 경우 세포 포집 필터(200)의 제작이 어려워질 뿐만 아니라 역세척시 세포 포집 필터(200)가 파손되는 문제가 발생한다.
필터 본체(210)는 니켈 또는 니켈합금으로 이루어질 수 있다. 필터 본체(210)를 금속으로 하는 경우의 효과에 대해서는 전술한 바와 같다. 예컨대 필터 본체(210)는 전주법(electroforming)에 의해 웨이퍼 상에 니켈을 도금한 후, 이 니켈층을 분리함으로써 얻을 수 있는데, 본 발명이 이러한 제조방법으로 한정되는 것이 아님은 물론이다. 예컨대, 마이크로미터 크기의 기공(220)을 형성하기 위하여 MEMS 기술을 이용한 에칭 방법을 사용하는 것도 가능하다.
한편 도시하지는 않았으나, 필터 본체(210)의 표면에 친수성 박막층 또는 친수성으로 변환 가능한 박막층을 형성하는 것도 가능하다. 이 경우 비교적 적은 압력으로도 유체가 기공(220)을 통과할 수 있게 되어, 필터 본체(210)의 두께를 작게 할 수 있고, 또한 필터링 시 세포 포집 필터(200)가 손상되거나 변형되는 위험이 낮아지게 된다.
도 10은 회수된 체액 중 복수 종양세포를 바이오마커인 CK(cytokeratin), vimentin, CD45로 염색하였고, 대조염색(counterstaining)을 위해 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)를 염색한 후 형광 현미경으로 확인한 사진이다. CK는 특이적 종양세포의 마커로 복수 종양세포를 선택하기 위해 사용되었으며, vimentin은 상피세포 표지인자로 사용되었으며, CD45는 백혈구 공통 항원으로 CD45 양성을 제외함으로써 복수 종양세포와 구별하기 위해 사용되었다. 따라서 복수 종양세포는 DAPI+/CK+/vimentin+/CD45- 세포일 수 있다. 종양세포 분리장치를 이용하여 회수된 복수 종양세포가 13.5%의 회수율을 보이는 것을 확인하였다.
도 11은 종양세포 분리장치를 이용하여 체액 중 복수 종양세포의 회수율을 비교한 그래프이다. A 내지 C는 기존 문헌의 방법을 이용하여 복수 종양세포 분리하였을 때 회수율로, 회수율이 8% 미만의 값을 가지는 반면, 상기 종양세포 분리장치를 이용하였을 때의 회수율은 13.5%로 높은 것을 확인하였고, 기존 문헌의 방법보다 더 효율적으로 복수 종양세포를 수득할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 기재한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
3000 : 개인 맞춤형 항암제 선별 시스템
1 : 분리장치
10: 피펫팅 모듈
20: 작업 모듈
100: 세포 포집 장치
200: 세포 포집 필터
210: 필터 본체
220: 기공
500 : 배양장치
1000 : 반응검사 장치
1500 : 분석장치

Claims (16)

  1. i) 암 환자의 체액(body fluid)을 추출하는 단계;
    ii) 상기 체액으로부터 체액 종양세포(tumor cells)를 분리하는 단계;
    iii) 상기 분리된 체액 종양세포를 단기 배양하는 단계;
    iv) 상기 단기 배양된 체액 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계;
    v) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및
    vi) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계;
    를 포함하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 체액은 혈액, 흉수, 복수, 심낭액, 양수, 관절액, 요, 뇌척수액인 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일인 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 (v) 단계는,
    (v-1) 상기 체액 종양세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계;
    (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계;
    (v-3) 상기 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계; 및
    (v-4) 상기 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계;
    를 포함하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별방법.
  7. 맞춤형 항암제 선별 시스템에 있어서,
    암 환자의 체액으로부터 분리된 세포로부터 체액 종양세포를 분리하는 분리장치;
    상기 분리된 체액 종양세포를 배양하는 배양장치;
    상기 배양된 체액 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치;
    상기 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치; 및
    상기 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치;
    를 포함하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 분리장치는 체액 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 세포 포집 필터 및 세포 포집 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 세포 포집 필터는,
    금속으로 이루어진 필터 본체에 매트릭스 형상으로 배치된 다수개의 사각 형상 기공이 마련되며,
    상기 필터 본체의 두께를 t, 상기 기공의 가로 방향 길이를 a, 상기 기공의 세로 방향 길이를 b, 필터의 가로 방향을 따라 인접한 상기 기공 사이의 거리를 l, 필터의 세로 방향을 따라 인접한 상기 기공 사이의 거리를 m이라고 할 때, 상기 a와 b의 비율 a/b는 0.8 내지 1.2이고, 상기 l과 m의 비율 l/m은 0.8 내지 1.2이며, 상기 t와 a의 비율 또는 상기 t와 b의 비율 t/x(여기서 x는 a 또는 b)는 0.5 내지 1.8인 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 a와 l의 비율 a/l은 0.9 내지 1.6이고, 상기 b와 m의 비율 b/m은 0.9 내지 1.6인 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 a 또는 b는 표적 세포의 직경에 대하여 40 내지 70%의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  13. 청구항 10에 있어서,
    상기 필터 본체는 니켈 또는 니켈합금으로 이루어진 것으로 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  14. 청구항 9에 있어서,
    세포 포집 장치는,
    내측에 유체 유통 가능한 중공부를 가진 튜브와,
    상기 튜브의 하측에 마련되며, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 체액 종양세포 포집 필터를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 유체의 흐름 방향 상 상류 쪽으로부터 하류 쪽으로 순차적으로 배치되며, 다수의 세포 포집 필터들을 구비하며,
    상기 상류 쪽에 배치된 세포 포집 필터는 상기 하류 쪽에 배치된 필터보다 크기가 큰 상기 형상 기공을 구비하며,
    상기 각 필터 사이에는 상기 유체를 일시적으로 수용하는 저장층이 구비된 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 상류 쪽에 배치된 세포 포집 필터의 형상 기공들의 수가 상기 하류 쪽에 배치된 세포 포집 필터의 형상 기공들의 수보다 더 적은 것을 특징으로 하는 환자 유래 체액 종양세포를 활용한 맞춤형 항암제 선별 시스템.
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