KR20170121205A - Method for producing stem cell culture supernatant - Google Patents

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KR20170121205A
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Abstract

본 발명의 과제는 우수한 조직 재생능, 또는 우수한 질환 치유작용, 또는 높은 생리활성을 갖는 중간엽 줄기세포의 배양상청을 제작하는 방법을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법은 [a] 투과성 막 중공사의 내표면에 파종한 줄기세포에 배양액을 공급하는 공정, [b] 상기 줄기세포에 상기 배양액을 접촉시켜서 상기 줄기세포를 배양하는 공정, [c] 상기 줄기세포가 분비한 성분을 포함하는 배양액을 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
It is an object of the present invention to provide a method for producing a culture supernatant of mesenchymal stem cells having an excellent tissue regeneration ability, an excellent disease healing function, or a high physiological activity.
In order to solve the above problems, a method for producing a stem cell culture supernatant of the present invention comprises the steps of: (a) supplying a culture medium to stem cells sown on the inner surface of a permeable membrane hollow fiber; (b) A step of culturing the stem cells, and [c] a step of recovering the culture medium containing the components secreted by the stem cells.

Description

줄기세포 배양상청의 제조방법{Method for producing stem cell culture supernatant}[0001] The present invention relates to a method for producing a stem cell culture supernatant,

본 발명은 줄기세포의 배양상청을 제조하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a culture supernatant of stem cells.

줄기세포인 중간엽 줄기세포는 체성 줄기세포의 일종으로, 중간엽의 세포, 즉, 골세포, 심근세포, 연골세포, 지방세포 등으로의 분화능을 갖는 것으로부터, 뼈나 혈관, 심근의 재구축 등의 재생의료로의 응용이 기대되고 있다. 또한, 중간엽 줄기세포는 항염증작용이나 면역조절 등의 작용도 갖는 것으로부터, 간질환이나 이식편대숙주병, 자기면역질환 등, 이미 여러 질환에 대해 폭넓게 이용되고 있는 것이 알려져 있다. Since mesenchymal stem cells, which are stem cells, are a kind of somatic stem cells and have differentiation ability into mesenchymal cells, that is, bone cells, cardiac cells, chondrocytes, adipocytes, etc., Is expected to be applied to regenerative medicine. Since mesenchymal stem cells also have anti-inflammatory action and immunoregulatory action, it is already known that they are widely used for various diseases such as liver disease, graft versus host disease, and autoimmune disease.

이러한 가운데, 세포이식 치료에 있어서 생체 내에 이식된 이들 중간엽 줄기세포의 작용에는 중간엽 세포로부터 분비되는 각종 사이토카인 등의 생리활성물질이 크게 기여하고 있는 것으로 밝혀졌다. Among these, it has been found that physiologically active substances such as various cytokines secreted from mesenchymal cells contribute to the action of these mesenchymal stem cells transplanted in vivo in cell transplantation treatment.

중간엽 줄기세포를 인 비트로로 배양했을 때에는 배양액 중에 이러한 생리활성물질이 방출되게 된다. 이에, 중간엽 줄기세포의 배양에 사용한 배양액을 회수하여, 세포로부터 방출되는 물질을 많이 포함하는 이 배양액을 이용해서 조직을 재생하는 것 등에 성공한 예가 보고되고 있다. 우에다 등은 랫트를 사용한 실험에서 골수 중간엽 줄기세포의 배양상청이 뼈의 재생능력을 갖는 것을 나타내었다(비특허문헌 1). 이 중에서, 골수 중간엽 줄기세포의 배양상청 중에는 인슐린 유사 성장인자(IGF)나 혈관내피세포 증식인자(VEGF) 등이 많이 포함되어 있어, 이들 인자가 조직의 재생 등에 상관되어 있는 것이 시사되고 있다(비특허문헌 1). 우에다 등은 이 밖에도 중간엽 줄기세포의 배양상청이 창상 치유효과, 치주조직 재생촉진효과를 갖는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3). When mesenchymal stem cells are cultured in vitro, these physiologically active substances are released into the culture medium. Thus, there has been reported an example in which the culture medium used for culturing the mesenchymal stem cells is recovered and the tissue is regenerated by using the culture medium containing a large amount of the substance released from the cells. Ueda et al. Showed that the culture supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells had bone regeneration ability in an experiment using rats (Non-Patent Document 1). Among them, the culture supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells contains many insulin-like growth factor (IGF) and vascular endothelial cell growth factor (VEGF), suggesting that these factors are correlated with tissue regeneration and the like Non-Patent Document 1). Ueda et al. Have also reported that the culture supernatant of mesenchymal stem cells has wound healing effect and promotes periodontal tissue regeneration (Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).

또한, 아리무라 등은 골수 중간엽 줄기세포의 배양상청이 항염증작용을 가져 장염의 예방·치료 효과를 나타낸 것을 보고하고 있다(특허문헌 1). 또한, Su 등은 중간엽 줄기세포의 배양상청의 항알레르기 작용에 대해 보고하고 있다(비특허문헌 4). In addition, Arimura et al. Have reported that the culture supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells has an anti-inflammatory effect and has a preventive / therapeutic effect of enteritis (Patent Document 1). In addition, Su et al. Reported anti-allergic action of the culture supernatant of mesenchymal stem cells (Non-Patent Document 4).

또한 최근에는 세포로부터 분비되는 엑소솜이라 불리는 소포가 여러 단백질과 RNA를 포함하여, 이것이 세포 간의 전달을 담당하는 물질일 가능성이 지적되고 있다. Recently, it has been pointed out that a vesicle called exosome secreted from cells contains various proteins and RNA, and this is the substance responsible for cell-to-cell transfer.

이상의 사실로부터, 세포 배양에 있어서는 그것에 의해 얻어지는 세포뿐 아니라 배양상청도 또한 매우 귀중한 것으로, 이를 효율적으로 제작하는 것은 매우 중요한 것이다. From these facts, not only the cells obtained by the cell culture but also the culture supernatant are also very valuable, and it is very important to efficiently produce them.

일본국 특허공개 제2013-018756호 공보Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-018756

Tissue Engineering PartA. 2012;18:1479-1489 Tissue Engineering Part A. 2012; 18: 1479-1489 Cytotherapy, 2012;14(10):1171-1181 Cytotherapy, 2012; 14 (10): 1171-1181 Cytotherapy, 2015;17(4):369-381 Cytotherapy, 2015; 17 (4): 369-381 The Journal of allergy and clinical immunology, 2015;136(2):423-432 The Journal of allergy and clinical immunology, 2015; 136 (2): 423-432

본 발명의 과제는 우수한 조직 재생능, 또는 우수한 질환 치유작용, 또는 높은 생리활성을 갖는 줄기세포의 배양상청을 제작하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a culture supernatant of stem cells having excellent tissue regeneration ability or excellent disease-healing function or high physiological activity.

전술한 바와 같이, 중간엽 줄기세포 등의 줄기세포를 배양한 배양액 중에는 각종 작용을 갖는 생리활성물질 등이 포함되어 있어 이들이 조직 재생과 질환 치유의 효과에 기여하고 있다. 이러한 세포의 배양상청은 통상 플라스크나 샬레에 세포를 심고 이를 일정 기간 배양한 후에, 이때 배양에 사용한 배양액을 회수함으로써 얻어진다. As described above, a culture solution in which stem cells such as mesenchymal stem cells are cultured contains physiologically active substances having various actions and the like, and these contribute to tissue regeneration and healing effects. The culture supernatant of such cells is usually obtained by planting cells in a flask or a chalet, culturing the cells for a certain period of time, and then recovering the culture medium used for cultivation.

이 경우, 배양액 중에 방출되는 생리활성물질의 양은 세포의 수에 비례하여 커진다. 이 때문에 세포수가 많으면 좋으나, 예를 들면 중간엽 줄기세포와 같은 접착계 세포는 샬레나 플라스크의 바닥면에 한층으로 퍼져 증식하기 때문에, 세포로부터 방출되는 생리활성물질을 가능한 한 많이 고농도로 포함하는 배양상청을 회수하기 위해서는, 이 배양방법은 결코 효율이 좋다고는 할 수 없다. In this case, the amount of the physiologically active substance released into the culture liquid increases in proportion to the number of cells. For this reason, it is preferable that the number of cells is large. However, for example, adhesive cell such as mesenchymal stem cell grows on the bottom surface of a chalice or a flask so as to proliferate. Therefore, a culture containing a high concentration of physiologically active substance In order to recover the supernatant, this method of cultivation is not necessarily efficient.

즉, 종래의 세포 배양방법에 있어서는 세포수에 대해 접촉하는 배양액의 용량이 크기 때문에, 배양상청 중에 분비되는 유효한 성분은 희석되어 그 함유농도는 옅어지고 만다. 이 때문에 얻어진 배양상청을 조직 재생 등에 이용할 때에는 배양상청을 농축하거나 동결건조 등을 행할 필요가 있다. That is, in the conventional cell culture method, the effective amount of the component secreted in the culture supernatant is diluted so that the contained concentration thereof becomes thinner. For this reason, when the obtained culture supernatant is used for tissue regeneration or the like, it is necessary to concentrate the culture supernatant or perform freeze-drying or the like.

이러한 배경에 의해, 배양한 세포로부터 분비되는 생리활성물질을 가능한 한 고농도로 포함하는 배양상청을 효율적으로 제작하는 배양형태 및 방법이 요구되고 있다. With this background, there is a demand for a culture form and a method for efficiently producing a culture supernatant containing a physiologically active substance secreted from cultured cells at as high a concentration as possible.

본 발명자들은 상기 과제에 대해 예의 검토를 행한 결과 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 출원 발명의 개요는 아래와 같다. DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have made intensive studies on the above problems, and found that the above problems can be solved, and have completed the present invention. That is, the outline of the present invention is as follows.

1. 줄기세포 배양상청액의 제조방법으로서, 아래의 [a] 내지 [c]의 공정을 포함하는 방법. 1. A method for producing a stem cell culture supernatant comprising the following steps [a] to [c].

[a] 세포 배양용기 내의 투과성 막 중공사의 내표면에 파종한 줄기세포에 배양액을 공급하는 공정[a] Feeding the culture medium to the stem cells sown on the inner surface of the permeable membrane hollow fiber in the cell culture container

[b] 상기 줄기세포에 상기 배양액을 접촉시켜서 상기 줄기세포를 배양하는 공정[b] Step of culturing the stem cells by bringing the culture solution into contact with the stem cells

[c] 상기 줄기세포가 분비한 성분을 포함하는 배양액을 회수하는 공정[c] a step of recovering a culture solution containing components secreted by the stem cells

2. 상기 세포 배양용기는 투과성 막 중공사를 넣어 둔 모듈로서, 상기 중공사의 내강과 연통(連通)하는 2개의 개구부와, 상기 모듈의 내측인 동시에 상기 중공사의 외강과 연통하는 2개의 개구부를 갖는 것인, 1에 기재된 방법. 2. The cell culture container according to claim 1, wherein the cell culture container is a module having permeable membrane hollow fibers inserted therein. The module has two openings communicating with the hollow of the hollow fiber, and two openings communicating with the inside of the module 0.0 > 1, < / RTI >

3. 아래의 [d] 내지 [g]의 구성을 포함하는 세포 배양장치를 사용하여 상기 줄기세포의 배양을 행하는, 1 또는 2에 기재된 방법. 3. The method according to 1 or 2, wherein the stem cell is cultured using a cell culture apparatus comprising the following constitutions [d] to [g].

[d] 상기 세포 배양용기[d] The cell culture container

[e] 1개 이상의 배양액 저류용기[e] one or more culture liquid storage vessels

[f] 상기 세포 배양용기와 상기 배양액 저류용기를 접속하는 유로망[f] a flow path network connecting the cell culture container and the culture solution storage container

[g] 상기 유로망에 설치되어, 상기 세포 배양용기로의 배양액의 공급 및/또는 상기 세포 배양용기로부터의 배양액의 배출을 제어하는 수단[g] means for controlling the supply of the culture liquid to the cell culture container and / or the discharge of the culture liquid from the cell culture container,

4. 상기 투과성 막 중공사의 내강을 통과하는 배양액의 선속도가 0.01~1 ㎜/min인, 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 방법. 4. The method according to any one of 1 to 3, wherein the linear velocity of the culture liquid passing through the lumen of the permeable membrane hollow fiber is 0.01 to 1 mm / min.

5. 상기 투과성 막 중공사의 구멍 반경이 1~500Å인 것을 특징으로 하는, 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 방법. 5. The method according to any one of 1 to 4, wherein the pore diameter of the permeable membrane hollow fiber is 1 to 500 Å.

6. 상기 배양액이 동물 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 방법. 6. The method according to any one of 1 to 5, wherein the culture solution does not contain animal serum.

7. 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는, 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 방법. 7. The method according to any one of 1 to 6, wherein the stem cell is a mesenchymal stem cell.

예를 들면, 종래법인 샬레를 사용한 세포 배양에 있어서는 샬레 바닥면에 나는 세포는 세포수가 3~4만개/㎠ 정도에 달한다. 직경 약 10 ㎝인 샬레의 경우, 약 2,000,000~3,000,000개까지 세포가 증식하여, 이에 대해 10 ㎖ 정도의 배양액을 사용한다. 직경 10 ㎝×높이 1.5 ㎝, 즉 용기용적 120 ㎤로부터 배양상청이 10 ㎖ 회수된다. For example, in cell culture using a conventional corporation chalet, the cells on the bottom surface of the chal- lenge have cell numbers of 30 to 40,000 / cm < 2 > . In a chalet having a diameter of about 10 cm, about 2,000,000 to 3,000,000 cells are proliferated, and about 10 ml of the culture is used. 10 ml of culture supernatant is recovered from a diameter of 10 cm x height of 1.5 cm, that is, a container volume of 120 cm < 3 >.

이에 대해 본 발명에서는 투과성 막 중공사의 모듈을 사용한 배양을 행하고, 또한 이 중공사 모듈 내를 매우 낮은 속도로 배양액을 통과시키기 때문에, 세포수에 비해 회수하는 배양상청이 종래법에 비해 대폭 적다. 예를 들면, 수백 가닥의 투과성 막 중공사가 수납된 길이 10 ㎝, 두께 약 1 ㎝의 중공사 모듈에 있어서는 세포수는 10,000,000개 이상에 달하나, 세포에 직접 접하여 흐르는 배양액의 총량은 10 ㎖에 미치지 못하여 대(對) 세포수 비는 종래법의 약 1/5이고, 배양상청 중에 분비되는 물질농도는 반대로 약 5배가 된다. 또한 용기용적은 약 8 ㎤이기 때문에 용적당 회수효율도 향상된다. On the contrary, in the present invention, the culture supernatant recovered in comparison with the number of cells is significantly smaller than that of the conventional method because the culture using the permeable membrane hollow fiber module is performed and the culture medium is passed through the hollow fiber module at a very low rate. For example, in a hollow fiber module having a length of 10 cm and a thickness of about 1 cm in which hundreds of permeable membrane hollow fibers are accommodated, the number of cells reaches 10,000,000 or more, but the total amount of culture fluid flowing directly into the cells is less than 10 ml Cell ratio is about 1/5 of that of the conventional method and the concentration of the substance secreted in the culture supernatant is about 5 times that of the conventional method. Also, since the container volume is about 8 cm 3, the recovery efficiency per unit volume is improved.

즉, 본 발명에 의해 배양하는 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 생리활성물질을 고농도로 포함하는 배양상청액을 간편하고 효율적으로 제작하는 것이 가능해졌다. That is, it has become possible to easily and efficiently produce a culture supernatant containing a physiologically active substance secreted from mesenchymal stem cells cultured by the present invention at a high concentration.

도 1은 본 발명의 줄기세포 배양상청 제조 실시에 사용하는 중공사 모듈의 구성예를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 줄기세포 배양상청 제조 실시에 사용하는 세포 배양형태의 예를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 있어서 배양상청의 제작 스케쥴을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 있어서 배양상청 중의 VEGF 농도를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 있어서 배양상청 중의 IGF 농도를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에 있어서 배양상청에 의한 TNF-α 생산 억제효과를 나타내는 도면이다.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a diagram showing an example of the structure of a hollow fiber module used in the production of stem cell culture supernatant of the present invention. Fig.
Fig. 2 is a schematic diagram showing an example of a cell culture form used in the production of a stem cell culture supernatant of the present invention. Fig.
3 is a diagram showing a production schedule of a culture supernatant in Example 1 of the present invention.
4 is a graph showing the VEGF concentration in the culture supernatant in Example 1 of the present invention.
5 is a graph showing the IGF concentration in the culture supernatant in Example 1 of the present invention.
Fig. 6 is a graph showing the TNF-a production inhibitory effect by the culture supernatant in Example 1 of the present invention. Fig.

본 발명의 실시태양 중 하나는, 아래의 [a] 내지 [c]의 공정을 포함하는 줄기세포 배양상청액(순화배지, 조정배지(conditioned medium))의 제조방법이다. One of the embodiments of the present invention is a method for producing a stem cell culture supernatant (purification medium, conditioned medium) comprising the following steps [a] to [c].

[a] 세포 배양용기 내의 투과성 막 중공사 표면에 파종한 줄기세포에 배양액을 공급하는 공정[a] Step of feeding the culture liquid to the stem cells sown on the surface of the permeable membrane hollow fiber in the cell culture vessel

[b] 상기 줄기세포에 상기 배양액을 접촉시켜서 상기 줄기세포를 배양하는 공정[b] Step of culturing the stem cells by bringing the culture solution into contact with the stem cells

[c] 상기 줄기세포가 분비한 성분을 포함하는 배양액을 회수하는 공정[c] a step of recovering a culture solution containing components secreted by the stem cells

(세포 배양상청액)(Cell culture supernatant)

본 발명에 있어서 세포의 배양상청이란, 세포를 일정 기간(수 시간 내지 수일) 배양했을 때, 세포에 직접 또는 간접적으로 접촉하고 있던 배양액을 세포와 분리하여 얻어지는 것을 말한다. 배양액 순화배지, 조정배지(conditioned medium) 등과 같은 의미이다. In the present invention, the term "culture supernatant of a cell" means a culture obtained by separating a culture solution, which was directly or indirectly in contact with a cell, from the cell when the cell was cultured for a certain period of time (several hours to several days). Culture medium purifying medium, conditioned medium, and the like.

(배양의 대상이 되는 줄기세포)(Stem cells to be cultured)

본 발명의 대상의 하나가 되는 줄기세포로서는 특별히 한정되는 것은 아니나, 골수 중간엽 줄기세포 또는 지방조직 유래 중간엽 줄기세포가 적합하다. 1차세포(primary cell)에 한정되지 않고, 유전자 개변 등에 의해 주화(株化)된 중간엽 줄기세포도 사용할 수 있다. 동물종도 특별히 한정되지 않고, 인간, 마우스, 랫트 등의 어느 동물 유래의 것도 사용할 수 있다. 또한, 중간엽 줄기세포 이외의 접착성을 갖는 각종 체성 줄기세포(somatic stem cell)에도 적합하게 사용할 수 있다. The stem cells to be one of the subject of the present invention are not particularly limited, but bone marrow mesenchymal stem cells or adipose tissue derived mesenchymal stem cells are suitable. Mesenchymal stem cells, which are not limited to primary cells but can be co-cultured by genetic modification, may also be used. The species of the animal is not particularly limited, and any animal origin such as human, mouse, and rat can be used. In addition, it can be suitably used for various somatic stem cells having adhesiveness other than mesenchymal stem cells.

(배양액)(Culture solution)

본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법에 사용되는 배양액의 조성 등은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, DMEM, αMEM, RPMI 1640 등을 기초 배지로 하고, 이것에 적절히 동물피, 세포 증식인자, 호르몬 등을 첨가함으로써 조제된 것을 사용할 수 있다. The composition and the like of the culture solution used in the method for producing a stem cell culture supernatant of the present invention are not particularly limited. For example, those prepared by using DMEM, alpha MEM, RPMI 1640 or the like as a basal medium and appropriately adding animal blood, a cell growth factor, a hormone or the like thereto can be used.

본 발명에 사용하는 배양액은 경우에 따라서는 동물 혈청을 포함하지 않는 것이 바람직한 경우가 있다. 이는 동물 혈청에는 세포 증식인자 등의 생리활성물질이 풍부하게 포함되기 때문에, 때로는 이들 생리활성물질의 존재가 배양상청을 사용할 때 목적의 방해가 되거나, 마이너스로 작용하는 등의 가능성이 있기 때문이다. In some cases, the culture solution used in the present invention preferably contains no animal serum. This is because the animal serum abundantly contains physiologically active substances such as cell proliferation factors, so that sometimes the presence of these physiologically active substances may interfere with the intended use when the culture supernatant is used, or may act as minus.

(투과성 막 중공사)(Permeable membrane hollow fiber)

본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사는 세포를 중공사 내강에 보유할 수 있고, 용액이나 저분자의 물질을 투과시키는 구조를 취할 수 있는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. The permeable membrane hollow fibers used in the present invention are not particularly limited as long as they can retain the cells in the cavity of the hollow fiber and can take a structure for permeating a solution or a low molecular substance.

본 발명에 있어서 투과성 막 중공사를 사용하는 이유 중 하나는 배양면적당 세포 성육 수가 샬레 등의 플라스틱 소재보다도 많기 때문이다. 왜냐하면, 막 중공사 위에 접착하여 증식하는 세포는 플라스틱 위와 같이 크게 신전(伸展)되지 않아, 단위면적당 접착하는 세포수는 막 중공사 위쪽이 플라스틱 위보다도 수 배 많아지기 때문이다. 또한, 막 중공사를 긴밀하게 묶음으로써 단위체적당 배양면적을 현격히 증대시킬 수 있다.One of the reasons for using the permeable membrane hollow fiber in the present invention is that the cell number per culture area is larger than that of plastic material such as a chalet. The reason for this is that the cells that adhere to membrane hollow fiber and proliferate are not stretched as much as in plastic, and the number of cells adhering per unit area is several times higher than that on plastic upper side of membrane hollow fiber. Further, by tightly bundling membrane hollow fibers, the culturing area per unit volume can be remarkably increased.

본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사의 소재는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 셀룰로오스아세테이트, 셀룰로오스트리아세테이트 및 재생 셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 재료, 폴리설폰 및 폴리에테르설폰 등의 폴리설폰계 재료, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴, 불소계 수지, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴(PVDF) 등의 열가소성 고분자에 의한 골격구조를 갖는 불용성 담체를 적합하게 이용할 수 있다. 또한 이들의 유도체가 주성분이어도 된다. The material of the permeable membrane hollow fiber used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cellulosic materials such as cellulose acetate, cellulose triacetate and regenerated cellulose, polysulfone materials such as polysulfone and polyethersulfone, An insoluble carrier having a skeletal structure formed of a thermoplastic polymer such as propylene, polystyrene, polyvinyl alcohol, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, fluorine resin, polyamide, polyvinylidene fluoride (PVDF) . These derivatives may also be the main components.

본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사는 상기 소재에 화학적으로 수식을 가한 것이어도 된다. 예를 들면 본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사는 친수화 처리되어 있는 것이 바람직하다. 투과성 막 중공사를 친수화 처리함으로써 배양세포로의 배양액 등의 액체 성분의 공급이 용이해진다. 투과성 막 중공사를 친수화 처리하는 방법으로서는, 예를 들면 투과성 막 중공사를 에틸렌-비닐 알코올 공중합체 등의 친수성 고분자나, 글리세린, 에탄올로 처리하는 방법을 들 수 있다. 또는 사용하는 세포에 따라 중공사로의 접착 향상을 위해 콜라겐이나 피브로넥틴 등의 코팅제를 사용해도 된다. The permeable membrane hollow fiber used in the present invention may be chemically modified in the material. For example, the permeable membrane hollow fiber used in the present invention is preferably subjected to hydrophilization treatment. Hydrophilic treatment of the permeable membrane hollow fiber makes it easy to supply the liquid component such as the culture liquid to the cultured cells. Examples of the method of hydrophilizing the permeable membrane hollow fiber include a method of treating the permeable membrane hollow fiber with a hydrophilic polymer such as an ethylene-vinyl alcohol copolymer, glycerin or ethanol. Depending on the cells used, a coating agent such as collagen or fibronectin may be used to improve adhesion to hollow fibers.

본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사의 크기에 대해서도 특별히 제한은 없으나, 중공사 안지름의 바람직한 하한은 10 ㎛이고, 보다 바람직하게는 20 ㎛, 더욱 바람직하게는 50 ㎛이다. 한편, 중공사 안지름의 바람직한 상한은 1,000 ㎛, 보다 바람직하게는 500 ㎛이다. 막 두께에 대해서도 특별히 제한은 없으나, 중공사가 적당한 강도를 유지하고, 또한 물질의 투과성도 양호한 범위에서 설정하면 되고, 예를 들면 10~200 ㎛ 정도가 바람직하다. There is no particular limitation on the size of the permeable membrane hollow fiber used in the present invention, but the lower limit of the hollow fiber membrane inner diameter is preferably 10 占 퐉, more preferably 20 占 퐉, and still more preferably 50 占 퐉. On the other hand, the upper limit of the hollow fiber inner diameter is preferably 1,000 占 퐉, more preferably 500 占 퐉. There is no particular limitation on the film thickness, but it is sufficient that the hollow fiber is maintained at a suitable strength and the permeability of the material is set within a preferable range. For example, it is preferably about 10 to 200 占 퐉.

본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사의 구멍 직경은 세포는 통과시키지 않으나 물, 염류, 비교적 분자량이 작은 영양분 등의 배양액 성분은 통과시키는 통공(通孔)이라면 특별히 한정되는 것은 아니나, 세포의 배양 및 배양상청을 회수하는 것을 고려하면, 물질 교환이 어느 정도 효율적인 구멍 직경을 가지며, 또한 세포가 생산한 생리활성물질 등의 유용 성분을 투과하지 않는 것이 필요하다. 이 때문에, 투과성 막 중공사의 구멍 직경(구멍 반경)은 1~500Å이 바람직하고, 5~300Å이 보다 바람직하며, 10~150Å이 더욱 바람직하다.The pore diameter of the permeable membrane hollow fiber used in the present invention is not particularly limited as long as it is a through-hole through which the cells do not pass but the water, salt, nutrients with relatively low molecular weight, and the like are passed through. However, Considering the recovery of the supernatant, it is necessary that the substance exchange has a certain effective pore diameter and does not transmit useful components such as physiologically active substances produced by cells. Therefore, the pore diameter (hole radius) of the permeable membrane hollow fiber is preferably 1 to 500 angstroms, more preferably 5 to 300 angstroms, further preferably 10 to 150 angstroms.

투과성 막 중공사의 구멍 직경은 투과성 막 중공사의 투과성과 밀접하게 관련된다. 투과성 막 중공사의 투과성은, 예를 들면 단위시간·단위면적당 액 통과량으로 나타내어진다. 본 발명에서 사용하는 투과성 막 중공사에 있어서 투과성은 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, 1~1,000 ㎖/㎡/hr/㎜Hg, 더욱 바람직하게는 10~500 ㎖/㎡/hr/㎜Hg이 적합하다. The pore diameter of the permeable membrane hollow fibers is closely related to the permeability of the permeable membrane hollow fibers. The permeability of the permeable membrane hollow fiber is represented by, for example, the amount of liquid per unit time per unit area. The permeability of the permeable membrane hollow fiber used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 to 1,000 ml / m 2 / hr / mmHg, more preferably 10 to 500 ml / m 2 / hr / mmHg Is suitable.

(줄기세포 배양상청액의 제조공정)(Manufacturing Process of Stem Cell Culture Supernatant)

본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법은 아래의 공정을 포함한다. The method for producing the stem cell culture supernatant of the present invention includes the following steps.

[a] 투과성 막 중공사 내강에 존재하는 줄기세포에 배양액을 공급하는 공정[a] Process of supplying a culture medium to stem cells present in permeable membrane hollow lumen

[b] 상기 배양액을 연속적 또는 간헐적으로 상기 중공사 내강을 이동(통과)시킴으로써, 상기 줄기세포에 상기 배양액을 접촉시켜서 상기 줄기세포를 배양하는 공정[b] The step of culturing the stem cells by bringing the culture solution into contact with the stem cells by moving (passing) the hollow fiber lumens continuously or intermittently through the culture solution

[c] 상기 공정에 의해 얻어진 배양액을 회수하는 공정[c] a step of recovering the culture liquid obtained by the above step

그 순서는 예를 들면 [a][b][c] 순으로 행하면 되나, 조작 도중에 2개 이상의 공정이 중복되어도 된다. 단, [b]의 공정 개시가 [a]의 공정 개시에 앞서는 일은 없고, [c]의 공정 개시가 [b]의 공정 개시에 앞서는 일은 없다. The order may be, for example, [a] [b] [c], but two or more steps may be duplicated during the operation. However, the process initiation of [b] does not precede the process initiation of [a], and the process initiation of [c] does not precede the initiation of the process of [b].

본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법은 상기 이외의 제한은 특별히 없고, 예를 들면 상기 중공사를 사용하여 줄기세포의 배양을 중공사 내강 측에서 행하면 된다. 예를 들면 줄기세포를 배양할 때는 줄기세포 현탁액을 중공사 내강에 주입하는 것 등에 의해 줄기세포를 중공사 표면에 파종하고, 파종 종료 후 배양액을 줄기세포가 존재하는 중공사 내강에 관류시키는 것 등으로 공급한다. 이어서, 내강 측에서 배양을 행한다. 예를 들면 공급된 배양액을 연속적 또는 간헐적으로 상기 중공사 내강을 이동(통과)시킴으로써, 상기 줄기세포에 상기 배양액을 접촉시켜서 상기 줄기세포를 배양한다. 또한 간헐적인 이동(통과)이란, 일시적으로 배양액의 중공사 내에서의 흐름을 멈추거나 진행시키는 공정을 반복하는 것을 가리킨다. 여기서 흐름을 멈추거나 진행시키는 간격 설정은 특별히 제한되지 않고, 등간격이어도 되고 불규칙해도 된다. 배양액은 세포에 필요한 양분이나 산소 등을 공급하고, 반대로 노폐물을 배출하는 역할을 갖는다. 배양기간 중 가스 교환 및 세포로의 영양 공급, 노폐물 제거를 위해 내강 측, 외강 측 모두 배지를 계속해서 공급하는 것이 바람직하다. 이때, 연동 펌프(peristaltic pump) 등을 사용함으로써 적절한 속도로 공급·배출, 또는 순환시킬 수 있다. 이와 같이 하여 일정 기간 배양을 행한 후의 배양액을 회수하면 본 발명의 줄기세포 배양상청액을 얻을 수 있다. The method for producing the stem cell culture supernatant of the present invention is not particularly limited except the above. For example, the hollow fiber may be used to culture the stem cells on the side of the hollow fiber lumen. For example, when stem cells are cultured, the stem cells are sown on the hollow fiber surface by injecting the stem cell suspension into the hollow fiber lumen, and the culture solution is perfused through the hollow fiber lumen where the stem cells are present . Then, the culture is performed on the lumen side. For example, the stem cells are contacted with the culture medium by moving (passing) the hollow fiber lumen continuously or intermittently through the supplied culture medium to cultivate the stem cells. The intermittent movement (passing) means that the process of temporarily stopping or advancing the flow of the culture liquid in the hollow fiber is repeated. Here, the interval setting for stopping or proceeding the flow is not particularly limited, and may be equally spaced or irregular. The culture medium has a role of supplying nutrients, oxygen and the like necessary for the cells and discharging waste materials in the opposite way. It is preferable to continuously supply the medium on both the luminal side and the outer lumen side for gas exchange and nutrient supply to the cells during the incubation period and to remove waste matter. At this time, by using a peristaltic pump or the like, it can be supplied, discharged, or circulated at an appropriate speed. When the culture medium after culturing for a predetermined period is recovered, the stem cell culture supernatant of the present invention can be obtained.

(중공사 모듈)(Hollow fiber module)

본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법에서 사용하는 투과성 막 중공사는 통형상 용기에 수십 가닥~수만 가닥의 중공사가 묶인 중공사 다발을 넣어 두고 모듈화하여, 세포 배양용기로 해도 된다(이러한 모듈을, 이하 중공사 모듈이라고도 한다). 중공사 모듈에는 배양기재에 배지를 공급할 수 있는 개구부와, 배지를 배출할 수 있는 개구부를 각각 1개 이상 갖고 있을 필요가 있다. The permeable membrane hollow fiber used in the method for producing a stem cell culture supernatant of the present invention may be formed into a cell culture container by inserting a bundle of hollow fibers bundled with several tens to several tens of thousands of hollow fibers into a tubular container, Hereinafter also referred to as a hollow fiber module). The hollow fiber module needs to have at least one opening for supplying the culture medium to the culture base and at least one opening for discharging the culture medium.

이러한 투과성 막 중공사를 사용한 모듈의 구성은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 도 1에 나타내는 바와 같이, 4개의 개구부(단부 도관 및 측부 도관)를 갖는 모듈 케이스(1) 본체에 투과성 막 중공사(2)가 적당히 필요한 가닥 수 묶여 충전되어 있는 형태를 들 수 있다. 이 형태에 있어서는 상기 4개의 개구부 중 2개의 단부 도관(3)은 각각 상기 중공사 다발의 양단에 있어서 각 중공사의 중공부를 폐색하지 않도록 적당한 실링재(예를 들면, 폴리우레탄계 포팅제)에 의해 접속되어 있어, 상기 단부 도관(3)의 한쪽으로부터 도입된 액체 등이 중공사 내강을 통과하여 다른 한쪽의 단부 도관(3)으로부터 도출되도록(즉, 한 방향으로 흐르도록) 구성되어 있다. 한편, 상기 개구부 중 나머지 2개의 측부 도관(4)의 내측 공간은 각각 상기 모듈 케이스(1)의 내측인 동시에 상기 중공사의 외강인 공간(이하, 간단히 「외강 측」이라고도 한다.)과 접속되어 있어, 상기 측부 도관(4)의 한쪽으로부터 도입된 액체 등이 막 중공사의 외강 측을 통과하여 다른 한쪽의 측부 도관(4)으로부터 도출되도록(즉, 한 방향으로 흐르도록) 구성되어 있다. The structure of the module using the permeable membrane hollow fiber is not particularly limited. For example, as shown in Fig. 1, a module case 1 having four openings (an end conduit and a side conduit) 2) are suitably bundled and filled with necessary number of strands. In this embodiment, the two end conduits 3 of the four openings are connected to each other by a suitable sealing material (for example, a polyurethane type porting agent) so as not to block the hollow portion of each hollow fiber at both ends of the hollow fiber bundle So that liquid or the like introduced from one end of the end conduit 3 passes through the hollow fiber lumen and flows out from the other end conduit 3 (that is, flows in one direction). On the other hand, the inner spaces of the remaining two side conduits 4 of the openings are connected to a space which is an inner side of the module case 1 and an outer cavity of the hollow fiber (hereinafter simply referred to as "outer side") , So that liquid or the like introduced from one side of the side conduit 4 passes through the outer side of the membrane hollow fiber and flows out from the other side conduit 4 (that is, flows in one direction).

본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법에 배양용기로서 상기 중공사 모듈을 사용하는 경우, 예를 들면 줄기세포 현탁액을 상기 단부 도관으로부터 주입함으로써 파종하고, 파종 종료 후 배양액을 줄기세포가 존재하는 중공사 내강에 관류시키는 것 등으로 공급하면 된다. 또한, 배양 시에는 중공사 내강 측으로의 배양액의 관류와 동시에, 중공사 외강 측으로도 배지를 측부 도관으로부터 주입하여 관류시키는 것이 바람직하다. When the hollow fiber module is used as a culture container in the method for producing a stem cell culture supernatant of the present invention, for example, a stem cell suspension is inoculated by being injected from the end conduit, and after the completion of sowing, Or the like, or by supplying the solution through a tube. In addition, at the time of culturing, it is preferable that the culture medium is injected from the side conduit and perfused with the culture medium to the side of the inner cavity of the hollow fiber as well as to the outer side of the hollow fiber.

상기 중공사 또는 중공사 모듈은 적절한 방법으로 멸균하여 공급되는 것이 바람직하다. 멸균방법에 대해서는 특별히 제한은 없으나, 예를 들면 가압 가열 멸균, 감마선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균 등을 들 수 있다. The hollow fiber or hollow fiber module is preferably sterilized by an appropriate method. The sterilization method is not particularly limited, but for example, autoclaving under pressure, gamma sterilization, ethylene oxide gas sterilization and the like can be mentioned.

배양용기에 중공사 모듈을 사용함으로써 본 발명의 실시가 보다 효율적으로 실시 가능해진다. 중공사 모듈 내강의 세포로 신선한 배지를 낮은 속도로 균일하게 공급하는 것이 가능하여, 배양상청의 회수를 효율적으로 실시할 수 있다. By using the hollow fiber module in the culture container, the practice of the present invention can be performed more efficiently. It is possible to uniformly supply fresh medium to the cells of the lumen of the hollow fiber module at a low rate, and to recover the culture supernatant efficiently.

(본 발명에 사용하는 세포 배양 시스템)(A cell culture system used in the present invention)

본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법에 있어서는 아래의 [d] 내지 [g]의 구성을 포함하는 세포 배양 시스템을 사용해서 배양을 행하면 된다. In the method for producing a stem cell culture supernatant of the present invention, the culture may be carried out using a cell culture system comprising the following components [d] to [g].

[d] 상기 세포 배양용기[d] The cell culture container

[e] 1개 이상의 배양액 저류용기[e] one or more culture liquid storage vessels

[f] 상기 세포 배양용기와 상기 배양액 저류용기를 접속하는 유로망[f] a flow path network connecting the cell culture container and the culture solution storage container

[g] 상기 유로망에 설치되어, 상기 세포 배양용기로의 배양액의 공급, 및/또는 상기 세포 배양용기로부터의 배양액의 배출을 제어하는 수단[g] means for controlling the supply of the culture liquid to the cell culture container and / or the discharge of the culture liquid from the cell culture container, provided in the channel network,

상기 시스템에서 사용하는 세포 배양용기에 대해서는, 다공성 막 중공사를 사용한 모듈로서, 상기 중공사의 양단으로부터 각각 내강과 접속하는 2개의 개구부와, 외강과 접속하는 2개의 개구부를 갖는 세포 배양용기라면 특별히 한정되지 않는다. The cell culture container used in the system is a module using a porous membrane hollow fiber and is particularly limited as long as it is a cell culture container having two openings connected to respective lumens from both ends of the hollow fiber and two openings connected to the outer shaft. It does not.

(배양액 저류용기)(Culture reservoir)

상기 시스템에서 사용하는 배양액 저류용기의 형태나 소재에 대해서는 특별히 한정되지 않으나, 가스 투과성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 시스템의 하나의 태양에 있어서는 상기 중공사 모듈을 포함하는 배양장치를 구성하고, 그것을 CO2 인큐베이터 내에 설치하여 배양상청의 제작을 실시해도 되나, 이때 가스 투과성을 갖는 배양액 저류용기를 사용하면, 기포 발생 등의 문제점을 갖는 가스 교환용 튜브를 설치하지 않고 간편하게 배양을 행할 수 있다. 이러한 배양액 저류용기로서는, 예를 들면 시판되는 세포 배양 백(니프로사 제조, 도요 세이칸사 제조의 것 등을 입수할 수 있다.), 플라스틱제 병 등을 들 수 있다. The shape and material of the culture liquid storage container used in the system is not particularly limited, but it is preferable that it has gas permeability. In one aspect of the system and configuration of the culture apparatus including the hollow fiber module, it is CO 2 The culture supernatant may be provided in an incubator to prepare a culture supernatant. However, if a culture supernatant having gas permeability is used at this time, the cultivation can be carried out easily without providing a gas exchange tube having a problem such as generation of bubbles. Examples of such a culture solution storage container include a commercially available cell culture bag (manufactured by NIPPO Co., Ltd., available from Toyo Seika Co., Ltd.), a plastic bottle, and the like.

(유로망)(Euro network)

상기 시스템에 있어서 상기 세포 배양용기에는 몇 개의 유로(유로망)가 접속되어 있다. 그 구성(배관)은 특별히 한정되지 않으나, 적어도 상기 세포 배양용기와 상기 액체배지 저류용기의 접속 부분을 포함하여, 상기 액체배지 저류용기로부터 상기 액체배지 저류용기로의 배지의 공급이 가능하도록 배관되어 있을 필요가 있다. 이러한 유로망으로서, 적어도 (1) 상기 세포 배양용기와 상기 배양액 저류용기의 중공사 내강 측 개구부의 접속 부분, 및 (2) 상기 세포 배양용기와 상기 배양액 저류용기의 중공사 외강 측 개구부의 접속 부분을 포함하는 유로망을 들 수 있다. 또한 본 명세서에 있어서 「접속」이란, 직접 연결되어 있는 경우 및 배관 등의 유로를 매개로 연결되어 있는 경우 중 어느 것이어도 된다. In this system, several channels (channel net) are connected to the cell culture container. The composition (piping) is not particularly limited, but it is piped so that at least the connection portion of the cell culture container and the liquid medium storage container can be supplied from the liquid medium storage container to the liquid medium storage container It needs to be. (1) a connecting portion between the cell culture container and the hollow cavity lumen side opening of the culture solution storage container, and (2) a connection portion between the cell culture container and the hollow fiber outer diameter side opening of the culture solution storage container, And the like. In the present specification, the term " connection " means either a direct connection or a connection via a pipe such as a pipe.

상기 시스템에 사용하는 배관의 소재는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 실리콘 튜브나 마스터플렉스(등록상표), C-플렉스(등록상표), 타이곤(등록상표), 파메드(등록상표) BPT, 파마퓨어(등록상표), 노르프렌(등록상표), 사니테크(등록상표) 등을 사용할 수 있다. 상기 액체배지 저류용기와 상기 세포 배양용기를 접속하는 부분의 유로관에 대해서는 가스 투과성을 갖는 유로관을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 실리콘 튜브 등을 적합하게 이용할 수 있다. The material of the piping used in the system is not particularly limited. Such as, for example, silicone tubes, such as Silicone Tubes, Masterflex, C-Flex, Tigon, Pamed BPT, Pharma Pure, Norfren, TECH (registered trademark) and the like can be used. It is preferable to use a channel tube having gas permeability for the channel tube connected to the liquid culture medium storage vessel and the cell culture vessel. For example, a silicone tube or the like can be suitably used.

(배양액의 공급, 배출 등을 제어하는 수단)(Means for controlling supply, discharge, etc. of the culture liquid)

상기 시스템에는 상기 유로망에 설치되어 상기 세포 배양용기로의 배양액의 공급, 및/또는 상기 세포 배양용기로부터의 배양액의 배출을 제어하는 수단이 설치되어 있다. 세포 현탁액이나 배양액의 공급방법의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 연동 펌프를 사용한 관류나, 배양액 저류용기가 배양 백 등 연질의 것인 경우는 상기 용기에 롤러를 대고 배지를 짜내는 방법 등이 적합하다. 펌프의 설치 장소는 특별히 한정되지 않으나, 액체가 펌프 부분을 통과할 때 이물질이 혼입되는 등의 위험을 피하기 위해 배출 측에 설치하는 것이 바람직하다. The system is provided with means for controlling the supply of the culture liquid to the cell culture container and / or the discharge of the culture liquid from the cell culture container, which is installed in the channel network. The form of the cell suspension or the method of supplying the culture liquid is not particularly limited, but it is preferable to use a peristaltic pump or a method of squeezing the medium by putting a roller on the container when the culture liquid storage container is soft, such as a culture bag Do. The place of installation of the pump is not particularly limited, but it is preferable to install it on the discharge side to avoid the risk of foreign matter being mixed when the liquid passes through the pump portion.

(세포 배양 시스템의 일태양)(One aspect of a cell culture system)

상기 중공사 모듈이나 배양액 저류용기, 연동 펌프 등에 의해 구성되는 배양 시스템을 CO2 인큐베이터 내에 설치하고, 본 발명의 하나의 실시태양예를 도 2에 나타낸다. 도 2에 있어서 5 및 6은 각각 가스 투과성을 갖는 배양액 저류용기(세포 배양 백 등)이다. 배양액 저류용기(5)로부터는 중공사 모듈(7)의 단부 도관(3a)에 유로가 접속되어, 배양액 저류용기(5)에 들어 있는 배지가 중공사 내강 측으로 이송될 수 있도록 되어 있다. 한편, 배양액 저류용기(6)로부터는 중공사 모듈(7)의 측부 도관(4a)에 유로가 접속되어, 배양액 저류용기(6)에 들어 있는 배지가 중공사 외강 측으로 이송될 수 있도록 되어 있다. 중공사 모듈(7)의 내강 측을 통과한 배양액은 단부 도관(3b)으로부터 배출되어 연동 펌프(8)를 경유하여 배양상청 회수용기(11)까지 유로가 접속되어, 중공사 모듈 내강을 통과한 배양상청이 회수될 수 있도록 되어 있다. 한편, 중공사 모듈(7)의 외강 측을 통과한 배양액은 측부 도관(4b)으로부터 배출되어 연동 펌프(9)를 경유하여 폐액 회수용기(10)에 회수된다. The culture system constituted by the hollow fiber module or the culture medium storage container, a peristaltic pump CO 2 An example of the embodiment of the present invention is shown in Fig. 2, which is provided in an incubator. In Fig. 2, reference numerals 5 and 6 are culture reservoir containers (cell culture bags, etc.) each having gas permeability. A channel is connected to the end conduit 3a of the hollow fiber module 7 from the culture solution storage container 5 so that the medium contained in the culture solution storage container 5 can be transferred to the hollow fiber cavity side. On the other hand, a flow path is connected to the side conduit 4a of the hollow fiber module 7 from the culture liquid storage container 6 so that the medium contained in the culture liquid storage container 6 can be transferred to the hollow fiber outer side. The culture fluid that has passed through the lumen side of the hollow fiber module 7 is discharged from the end conduit 3b and connected to the culture supernatant collection container 11 via the peristaltic pump 8, So that the culture supernatant can be recovered. On the other hand, the culture liquid that has passed through the outer side of the hollow fiber module 7 is discharged from the side conduit 4b and collected in the waste liquid collecting container 10 via the peristaltic pump 9.

(중공사 내강에 있어서 줄기세포의 배양)(Culture of stem cells in hollow lumen)

상기 시스템을 사용하여 본 발명의 줄기세포 배양상청액의 제조방법을 실시하는 경우, 예를 들면 상기 투과성 막 중공사 모듈을 사용하는 경우, 중공사로의 배지의 공급은 내강 측 및 외강 측의 두 루트가 필요하다. 이때 배지의 공급에 있어 배양액 저류용기는 내강 측 및 외강 측에서 각각의 것을 사용해도 되며, 1개의 용기로부터 내강 측 및 외강 측 양쪽에 배지를 공급해도 된다. 또한, 중공사 내강 측과 외강 측의 수압 차나 침투압 차에 의해 내강으로부터 외강, 또는 외강으로부터 내강으로 배양액이 흐르는 것은 최대한 억제하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 중공사 내강을 흘러온 배양액에는 세포가 방출한 물질이 많이 포함되는 것에 비해 중공사 외강 측에는 세포가 존재하지 않아, 외강 측을 흐르는 배양액 중에는 세포가 방출하는 물질은 매우 소량이기 때문이다. 즉, 중공사 일단의 개구부로부터 내강으로 유입된 배양액은 가능한 한 외강으로의 유출이나 외강으로부터의 유입의 간섭 등을 받지 않고, 그대로 다른 한쪽의 개구부로부터 유출되어 가는 것이 바람직하다. When the above-described system is used to produce the stem cell culture supernatant of the present invention, for example, when the permeable membrane hollow fiber module is used, the supply of the medium to the hollow fiber is performed by two routes of the lumenal side and the outer- need. At this time, in the supply of the culture medium, each of the culture solution storage containers may be used on the lumen side and the outer side, or the culture medium may be supplied to both the lumen side and the outer side from one container. In addition, it is preferable to suppress the flow of the culture liquid from the inner cavity to the outer cavity or from the outer cavity to the inner cavity by the difference in the hydraulic pressure difference between the inner cavity side of the hollow fiber and the outer cavity side. This is because the culture fluid flowing through the lumen of the hollow fiber contains a large amount of the substance released by the cell, but the cell does not exist on the hollow fiber outer side, and the substance released from the culture medium flowing through the outer side is very small. In other words, it is preferable that the culture liquid flowing into the lumen from the opening of one end of the hollow fiber yarn is allowed to flow out from the other opening as much as possible without being influenced by the outflow to the outer river or the influx of the inflow from the outer lumen.

(배양상청을 제작하기 위한 배양액)(Culture solution for producing the culture supernatant)

배양에 사용되는 배양액은 특별히 한정되지 않고, 중간엽 줄기세포의 배양액으로서 통상 사용되는 것이면 되나, 줄기세포의 배양상청액을 치료 등의 목적으로 생체에 적용하는 경우에는, 배양액 중의 동물 혈청이 가능한 한 적거나 또는 동물 혈청을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 이 때문에, 혈청을 포함하는 배양액을 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우, 충분히 세포가 증가한 상태가 되었을 때 저혈청 배양액이나 무혈청 배양액으로 교환하여, 최종적으로 혈청 함유량이 적거나 또는 혈청을 포함하지 않는 배양상청액을 얻을 수 있다. 또한, 무혈청이어도 줄기세포의 배양을 가능하게 하도록 성분이 조정된 배양액을 사용하여 처음부터 세포 배양을 행하여, 혈청을 포함하지 않는 배양상청액을 얻는 것도 가능하다. The culture medium to be used for culturing is not particularly limited and may be any medium which is usually used as a medium for mesenchymal stem cells. However, when the culture supernatant of stem cells is applied to a living body for the purpose of treatment or the like, Or does not contain animal serum. Therefore, when a stem cell is cultured using a culture medium containing serum, the culture medium is replaced with a low-serum culture medium or a serum-free culture medium when the cells are sufficiently increased, Whereby a culture supernatant can be obtained. It is also possible to obtain a culture supernatant containing no serum by performing cell culture from the beginning using a culture medium whose components have been adjusted so as to enable cultivation of stem cells even in serum-free conditions.

(배양상청의 회수)(Recovery of culture supernatant)

상기와 같은 이유로, 본 발명에 의해 배양상청을 얻으려면 중공사 내강을 흘러온 배양액은 중공사 외강을 흘러온 배양액과는 구별하여 용기에 회수하는 것이 바람직하다. For the above reasons, in order to obtain the culture supernatant by the present invention, it is preferable that the culture liquid flowing in the hollow fiber lumen is recovered in the container separately from the culture liquid flowing in the hollow fiber outer lumen.

(배양액이 흐르는 속도)(The rate at which the culture flows)

세포 배양에 있어서 배양액, 특히 중공사 내강을 세포에 접하여 흐르는 배양액의 유속에 대해서는 유속을 엄밀하게 제어하는 것이 바람직하다. 유속이 지나치게 느리면 세포로의 영양공급이 충분히 이루어지지 않아 세포가 증식하기 어려워진다. 반대로 유속이 지나치게 빨라도 세포 주위의 환경변화가 격심하여 세포가 주변 환경에 어울리지 못해 세포가 증식하기 어려워진다. 이와 같이 배양액, 특히 중공사 내강을 흐르는 배양액의 유속은 세포 증식 정도나 환경에 따라 조정하는 것이 바람직하다. 세포 증식 정도를 조사하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 배양액 중의 글루코오스나 락트산염의 농도 등의 측정결과를 기반으로 행할 수 있다. 세포가 파종된 측에 흘리는 배양액의 바람직한 유속은 0.01~1 ㎜/min이다. 한편, 세포가 파종되지 않은 측에 흘리는 배양액의 바람직한 유속은 0.02~5 ㎜/min이다. In the cell culture, it is preferable to strictly control the flow rate of the culture fluid, particularly the flow rate of the culture fluid flowing through the hollow fiber lumen in contact with the cells. If the flow rate is too slow, the nutrient supply to the cells is not sufficient and the cells become difficult to multiply. Conversely, even if the flow rate is too fast, environmental changes around the cell become severe, making it difficult for the cells to grow in the surrounding environment. The flow rate of the culture medium, particularly the culture medium flowing through the hollow cavity lumen, is preferably adjusted depending on the degree of cell proliferation or the environment. The method of examining the degree of cell proliferation is not particularly limited, but can be carried out based on measurement results such as the concentration of glucose or lactate in the culture. The preferred flow rate of the culture medium in which the cells are sown is 0.01 to 1 mm / min. On the other hand, the preferable flow rate of the culture solution in which the cells are not sown is 0.02 to 5 mm / min.

본 발명에 있어서 중공사 내강을 흐르는 배양액, 즉, 상기 배양액 저류용기로부터 중공사 모듈의 중공사 내강을 통과하여 배양상청 회수용기로 흐르는 배양액의 흐름은 한 방향인 것이 바람직하다. 여기서 한 방향이란, 중공사 모듈로의 배지의 도입부터 도출의 루트가 항상 같은 방향인 것을 말한다. 구체적으로는, 예를 들면 중공사 모듈에 있어서 배지의 도입구와 도출구가 각각 1개씩 존재하여 배지가 항상 도입구로부터 도출구를 향하여 흐르는 형태를 들 수 있다. 한편, 중공사의 외강 측을 흐르는 배양액에 대해서는 한 방향으로 흘러도 되고, 일단 세포 배양용기로부터 도출된 배지가 재차 도입구로부터 도입되는, 이른바 순환식이어도 된다. In the present invention, the flow of the culture fluid flowing through the hollow fiber lumen, that is, the culture fluid flowing from the culture fluid storage container through the hollow fiber lumen of the hollow fiber module to the culture supernatant collection container is preferably one direction. Here, one direction means that the route of derivation from the introduction of the medium into the hollow fiber module is always in the same direction. Concretely, for example, in the hollow fiber module, the introduction port and the outlet port of the culture medium are respectively present so that the culture medium always flows from the inlet port toward the outlet port. On the other hand, the culture fluid flowing on the outer side of the hollow fiber may flow in one direction, or may be a so-called circulation type in which a medium once drawn from the cell culture container is introduced again from the introduction port.

실시예Example 1 One

(1) 중공사 모듈에 의한 중간엽 줄기세포의 배양 및 배양상청의 제작(1) Culture of mesenchymal stem cells by hollow fiber module and preparation of culture supernatant

세포 파종 전에 사전에 콜라겐(닛타 젤라틴)을 코팅한 중공사 모듈(중공사는 PES/PVP제, 안지름 200 ㎛, 바깥지름 260 ㎛, 막 두께 30 ㎛, 구멍 반경 75Å, 도요보)을 사용하고, 도 2에 나타내는 것과 동일한 구성장치를 CO2 인큐베이터 내에 설치하여, 본 실시예를 행하였다. 중공사 내강에 인간 골수 중간엽 줄기세포(CELL APPLICATIONS Inc.)를 파종(파종 세포수는 5.0×105 cells/모듈)하였다. 이때 중공사 모듈(중공사 안지름 기준)의 총 배양면적은 98 ㎠이기 때문에, 세포 파종밀도는 약 5,100 cells/㎠였다. 배양액은 배양 개시(세포 파종)로부터 96시간 후까지는 10% 소 태아 혈청(라이프 테크놀로지스)을 첨가한 DMEM GlutaMAX(라이프 테크놀로지스)를 사용하고, 배양상청을 채취하는 96시간 이후에는 MF-medium, 중간엽 줄기세포 증식배지(도요보)를 사용하였다. MF-medium은 혈청을 1%밖에 포함하지 않는 저혈청 배양액이다. Before cell seeding, a hollow fiber module (PES / PVP, inner diameter: 200 mu m, outer diameter: 260 mu m, film thickness: 30 mu m, hole radius: 75 ANGSTROM, Toyobo) coated with collagen (NITTA gelatin) 2 was replaced with CO 2 And then placed in an incubator to carry out this embodiment. Human bone marrow mesenchymal stem cells (CELL APPLICATIONS Inc.) were inoculated (5.0 × 10 5 cells / module) in the lumen of the hollow fiber. At this time, since the total culture area of the hollow fiber module (based on the hollow fiber inner diameter) was 98 ㎠, the cell seeding density was about 5,100 cells / ㎠. DMEM GlutaMAX (Life Technologies) supplemented with 10% fetal bovine serum (Life Technologies) was used as a culture medium from 96 days after the initiation of culturing (cell seeding). After 96 hours from the culture supernatant, MF- Stem cell proliferation medium (Toyobo) was used. MF-medium is a low serum culture medium containing only 1% of serum.

도 3에 본 발명의 방법에 의한 배양상청의 제작 스케쥴을 나타낸다. 세포 파종(배양 개시)으로부터 7일간(168시간 후)의 배양을 실시하였다. 그 사이, 중공사 내강을 흐르는 배양액의 유속(선속도)은 세포 파종을 행하고나서 96시간 후까지는 평균 0.066 ㎜/min, 96시간 후부터 144시간 후까지는 평균 0.20 ㎜/min, 144시간 후부터 168시간 후까지는 평균 0.33 ㎜/min로 하였다. 한편, 중공사 외강을 흐르는 배양액의 속도는 배양 개시부터 종료까지 3.4 ㎜/min로 하였다. 세포 배양상청은 배양 개시 96시간 후부터 168시간 후까지의 72시간분을 회수하여, 나중의 성능 평가에 사용할 때까지 4℃에 보존하였다. 배양상청의 양은 합계 7.9 ㎖였다. 또한 유속에 대해서는 중공사 내강, 외강 각각으로부터 유출되는 유량을 측정하여 중공사 단면적 등을 기반으로 산출하였다. 배양으로부터 168시간 후에 세포를 트립신으로 소화, 박리 회수하여 세포수를 계수한 결과, 1.2×107개의 세포가 회수되었다. Fig. 3 shows a production schedule of the culture supernatant by the method of the present invention. And cultivation was carried out for 7 days (after 168 hours) from cell seeding (initiation of culture). In the mean time, the flow rate (linear velocity) of the culture fluid flowing through the lumen of the hollow fiber was 0.066 mm / min on average from 96 hours after cell seeding, 0.20 mm / min on average from 96 hours to 144 hours, The average was 0.33 mm / min. On the other hand, the rate of the culture fluid flowing through the hollow fiber outer sleeve was 3.4 mm / min from the start to the end of the culture. The cell culture supernatant was recovered for 72 hours from 96 hours to 168 hours after the start of the culture and stored at 4 캜 until it was used for later performance evaluation. The total amount of the culture supernatant was 7.9 ml. In addition, the flow rate was measured based on the cross-sectional area of the hollow fiber by measuring the flow rate of the hollow fiber lumen and the outer pipe. After 168 hours from the culture, the cells were digested with trypsin, peeled and recovered, and the number of cells was counted. As a result, 1.2 × 10 7 cells were recovered.

(2) 샬레를 사용한 중간엽 줄기세포의 배양 및 배양상청의 제작(종래법)(2) Culture of mesenchymal stem cells using a chalet and preparation of culture supernatant (conventional method)

2장의 콜라겐 코팅 샬레(배양면적 55 ㎠, 아사히 테크노 글래스)에 인간 골수 중간엽 줄기세포(CELL APPLICATIONS Inc.)를 세포 파종밀도가 약 5,100 cells/㎠가 되도록 파종하였다. 배양액은 실시예 1과 동일하게, 세포 파종으로부터 96시간까지는 10% 소 태아 혈청(라이프 테크놀로지스)을 첨가한 DMEM GlutaMAX(라이프 테크놀로지스)를 사용하고, 96시간 이후에는 MF-medium, 중간엽 줄기세포 증식배지(도요보)로 배지를 교환하였다. Human bone marrow mesenchymal stem cells (CELL APPLICATIONS Inc.) were sown at a cell seeding density of about 5,100 cells / cm 2 in two collagen-coated chalets (culture area 55 cm 2, Asahi Techno Glass). DMEM GlutaMAX (Life Technologies) supplemented with 10% fetal bovine serum (Life Technologies) was used for culturing from 96 to 96 hours, and MF-medium, mesenchymal stem cell proliferation The medium was replaced with a medium (Toyobo).

도 3에 종래법에 의한 배양상청의 제작 스케쥴을 나타낸다. 배양 개시 48시간 후 및 96시간 후에 배양액 교환을 실시하였다. 그 후, 배양액을 교환하지 않고, 배양 개시로부터 168시간에서 100% 융합성(confluent)에 도달달했을 때 배양을 종료하였다. 이 최후의 배지 교환으로부터 배양 종료까지의 72시간의 배양을 행한 배양액을 배양상청으로서 회수하였다. 배양상청의 양은 합계 10.0 ㎖였다. 배양으로부터 168시간 후에 세포를 트립신으로 소화, 박리 회수하여 세포수를 계수한 결과, 2.6×106개의 세포가 회수되었다. Fig. 3 shows a production schedule of the culture supernatant by the conventional method. Cultures were exchanged after 48 hours and 96 hours from the initiation of culture. Thereafter, the culture was terminated when the culture broth was not exchanged and reached 100% confluency at 168 hours from the start of the culture. The cultured medium for 72 hours from the last medium exchange to the end of culturing was recovered as a culture supernatant. The total amount of the culture supernatant was 10.0 ml. After 168 hours from the culture, the cells were digested with trypsin, peeled and recovered, and the number of cells was counted. As a result, 2.6 × 10 6 cells were recovered.

(3) 회수한 배양상청의 평가(VEGF 및 IGF의 농도 측정)(3) Evaluation of recovered culture supernatant (measurement of VEGF and IGF concentration)

상기 (1) 및 (2)의 방법으로 회수한 각각의 배양상청에 대해, 조직 재생에 상관된 성능을 평가하기 위해 배양상청에 포함되는 VEGF(혈관내피세포 증식인자) 및 IGF(인슐린 유사 성장인자)의 농도를 측정하였다. Each of the culture supernatants recovered by the above methods (1) and (2) was assayed for VEGF (vascular endothelial cell growth factor) and IGF (insulin-like growth factor ) Was measured.

VEGF의 정량에는 human VEGF ELISA Kit(R&D Systems)를 사용하였다. For quantification of VEGF, a human VEGF ELISA kit (R & D Systems) was used.

배양상청 중의 VEGF 농도를 측정한 결과를 도 4에 나타낸다. 그 결과, 종래법으로 회수한 배양상청 중의 VEGF 농도가 561.6 pg/㎖였 것에 비해, 본 발명에 의해 회수된 배양상청 중에서는 3,597.1 pg/㎖로, 명확한 고농도를 나타내었다. 또한, 이 농도로부터 72시간의 배양시간 중에 회수된 총 VEGF량은 종래법의 경우는 5,616 pg인 것에 비해, 본 발명의 경우는 28,417.1 pg였다. The results of measurement of the VEGF concentration in the culture supernatant are shown in Fig. As a result, the VEGF concentration in the culture supernatant recovered by the conventional method was 561.6 pg / ml, and the concentration in the culture supernatant recovered according to the present invention was as high as 3,597.1 pg / ml. In addition, the total amount of VEGF recovered during the culturing time of 72 hours from this concentration was 5,616 pg in the case of the conventional method, and 28,417.1 pg in the case of the present invention.

IGF의 정량에는 human IGF-I ELISA Kit(R&D Systems)를 사용하였다. Human IGF-I ELISA Kit (R & D Systems) was used for quantification of IGF.

배양상청 중의 IGF 농도를 측정한 결과를 도 5에 나타낸다. 그 결과, 종래법으로 회수한 배양상청 중의 IGF 농도가 1,864.6 pg/㎖였던 것에 비해, 본 발명에 의해 회수된 배양상청 중에서는 13,798.0 pg/㎖로, 명확한 고농도를 나타내었다. 또한, 이 농도로부터 72시간의 배양시간 중에 회수된 총 VEGF량은 종래법의 경우는 18.6 ng인 것에 비해, 본 발명의 경우는 109.0 ng였다. The results of measuring the IGF concentration in the culture supernatant are shown in Fig. As a result, the concentration of IGF in the culture supernatant recovered by the conventional method was 1,864.6 pg / ml, and the concentration in the culture supernatant recovered by the present invention was 13,798.0 pg / ml, clearly high. In addition, the total amount of VEGF recovered during the culturing time of 72 hours from this concentration was 18.0 ng in the case of the conventional method and 109.0 ng in the case of the present invention.

(4) 회수한 배양상청의 평가(활성화 매크로파지에 대한 효과 측정)(4) Evaluation of recovered culture supernatant (measurement of effect on activated macrophages)

상기 (1) 및 (2)의 방법으로 회수한 각각의 배양상청에 대해서 항염증작용을 평가하였다. 이는 매크로파지 유사 세포주인 RAW 264.7 세포(다이닛폰 제약)를 리포다당류(LPS)로 자극하여, 자극에 의해 생산되는 염증성 사이토카인(TNF-α)의 생산을 측정함으로써 평가하였다. Each of the culture supernatants recovered by the methods (1) and (2) above was evaluated for anti-inflammatory activity. This was evaluated by measuring the production of inflammatory cytokines (TNF-a) produced by stimulation with RAW 264.7 cells (Dainippon Pharmaceuticals), a macrophage-like cell line, with lipopolysaccharide (LPS).

측정은 아래와 같이 실시하였다. 즉, RAW 264.7 세포를 10% 소 태아 혈청(라이프 테크놀로지스)을 포함하는 RPMI 1640 배지(라이프 테크놀로지스)에 현탁하여, 24웰 플레이트에 5×105개/웰로 파종하였다. 24시간 배양 후에 배양액의 절반을 상기 (1) 또는 (2)의 배양상청으로 교환하였다. 그 1시간 후, LPS를 최종 100 ng/㎖가 되도록 첨가하여 추가로 3시간 배양하고, 배양액을 회수하여 Mouse TNF-α ELISA Kit(R&D Systems)를 사용하여 배양액 중의 TNF-α를 측정하였다. The measurement was carried out as follows. That is, RAW 264.7 cells were suspended in RPMI 1640 medium (Life Technologies) containing 10% fetal bovine serum (Life Technologies), and seeded at a density of 5 × 10 5 cells / well in a 24-well plate. After 24 hours of culture, half of the culture was replaced with the culture supernatant of (1) or (2) above. One hour later, LPS was added to a final concentration of 100 ng / ml, followed by further culturing for 3 hours. The culture medium was recovered and TNF-α was measured in the culture medium using a Mouse TNF-α ELISA Kit (R & D Systems).

배양상청에 의한 TNF-α 생산억제효과를 도 6에 나타낸다. 그 결과, 본 발명의 방법에 의해 제작한 중간엽 줄기세포의 배양상청은, 종래법으로 제작한 배양상청에 비해 현저히 TNF-α의 생산을 억제하고 있는 것을 알 수 있었다. The inhibitory effect of TNF-? Production by the culture supernatant is shown in Fig. As a result, it was found that the culture supernatant of the mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention significantly inhibited the production of TNF-? Compared to the culture supernatant prepared by the conventional method.

상기 (3) 및 (4)에 나타내어진 결과로부터, 본 발명에 의해 제작된 줄기세포의 배양상청은 종래의 것에 비해 생리활성물질이 풍부하며, 조직 재생과 항염증작용이 우수한 것이라 할 수 있다. From the results shown in the above (3) and (4), it can be said that the culture supernatant of the stem cells produced by the present invention is rich in physiologically active substance and superior in tissue regeneration and anti-inflammatory action as compared with the conventional culture supernatant.

본 발명에 의해 조직 재생과 항염증 등, 여러 가지 작용을 갖는 줄기세포의 배양상청을 간편하고 또한 고효율로 제조하는 것을 가능하게 한다. The present invention makes it possible to produce a culture supernatant of stem cells having various actions such as tissue regeneration and anti-inflammation in a simple and high-efficiency manner.

1 모듈 케이스
2 투과성 막 중공사
3 단부 도관
4 측부 도관
5, 6 배양액 저류용기
7 세포 배양용기(중공사 모듈)
8, 9 연동 펌프
10 폐액 회수용기
11 배양상청 회수용기
1 module case
2 permeable membrane hollow fiber
3-end conduit
4 side conduit
5, 6 culture reservoir
7 Cell culture container (hollow fiber module)
8, 9 peristaltic pump
10 waste liquid collection container
11 Culture supernatant collection container

Claims (7)

줄기세포 배양상청액의 제조방법으로서, 아래의 [a] 내지 [c]의 공정을 포함하는 방법.
[a] 세포 배양용기 내의 투과성 막 중공사의 내표면에 파종한 줄기세포에 배양액을 공급하는 공정
[b] 상기 줄기세포에 상기 배양액을 접촉시켜서 상기 줄기세포를 배양하는 공정
[c] 상기 줄기세포가 분비한 성분을 포함하는 배양액을 회수하는 공정
A method for producing a stem cell culture supernatant, which comprises the following steps [a] to [c].
[a] Feeding the culture medium to the stem cells sown on the inner surface of the permeable membrane hollow fiber in the cell culture container
[b] Step of culturing the stem cells by bringing the culture solution into contact with the stem cells
[c] a step of recovering a culture solution containing components secreted by the stem cells
제1항에 있어서,
상기 세포 배양용기는 투과성 막 중공사를 넣어 둔 모듈로서, 상기 중공사의 내강과 연통하는 2개의 개구부와, 상기 모듈의 내측인 동시에 상기 중공사의 외강과 연통하는 2개의 개구부를 갖는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the cell culture container is a module in which a permeable membrane hollow fiber is inserted and has two openings communicating with the lumen of the hollow fiber and two openings communicating with the inside of the module and with the outer shell of the hollow fiber.
제1항 또는 제2항에 있어서,
아래의 [d] 내지 [g]의 구성을 포함하는 세포 배양장치를 사용하여 상기 줄기세포의 배양을 행하는 방법.
[d] 상기 세포 배양용기
[e] 1개 이상의 배양액 저류용기
[f] 상기 세포 배양용기와 상기 배양액 저류용기를 접속하는 유로망
[g] 상기 유로망에 설치되어, 상기 세포 배양용기로의 배양액의 공급 및/또는 상기 세포 배양용기로부터의 배양액의 배출을 제어하는 수단
3. The method according to claim 1 or 2,
A method for culturing a stem cell using a cell culture apparatus comprising the following components [d] to [g]:
[d] The cell culture container
[e] one or more culture liquid storage vessels
[f] a flow path network connecting the cell culture container and the culture solution storage container
[g] means for controlling the supply of the culture liquid to the cell culture container and / or the discharge of the culture liquid from the cell culture container,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투과성 막 중공사의 내강을 통과하는 배양액의 선속도가 0.01~1 ㎜/min인 방법.
4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the linear velocity of the culture liquid passing through the lumen of the permeable membrane hollow fibers is 0.01 to 1 mm / min.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투과성 막 중공사의 구멍 반경이 1~500Å인 것을 특징으로 하는 방법.
5. The method according to any one of claims 1 to 4,
Wherein the pore diameter of the permeable membrane hollow fiber is 1 to 500 ANGSTROM.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양액이 동물 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
6. The method according to any one of claims 1 to 5,
Wherein the culture solution does not contain animal serum.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
Wherein said stem cells are mesenchymal stem cells.
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