KR20170086036A - 부티릴콜린에스테라제 양성이온성 중합체 컨쥬게이트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Fc 융합 단백질 및 그 융합 단백질에 컨쥬게이트된 친수성 기를 함유하는 다중-팔의 고분자량 중합체를 포함하여, 재조합 부티릴콜린에스테라제 융합 단백질, 및 그런 중합체의 제조 방법을 제공한다.
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1.
바이오스캐빈저
유기인 화합물 (OP)은 인간에게 매우 독성이다. 1930년대에 처음 살충제로서 개발되었는데, 인간에 대한 OP의 극심한 독성은 결국 전쟁용 신경 작용제로서의 개발을 유도하게 되었다. 오늘날, 비록 일반적으로는 국제법에 의해 금지되고 있긴 하지만, OP는 점점 더 군인과 민간인을 위협하고 있다. 1995년에, 도쿄 지하철은 사린 공격의 대상이었고, 12명 이상의 승객이 사망하였으며 수십 명의 다른 피해자들이 부상을 입었다. 사린 가스는 또한 최근에 시리아에서의 충돌에 지대지 미사일에 사용되었고 치명적 효과를 나타낸 것으로 보고되었다.
사린과 같은 OP 신경 작용제는 아세틸콜린에스테라제의 강력한 억제제이다. 척추동물에서, 아세틸콜린은 신경계로부터 근섬유까지 신호를 전파하기 위해 사용되는 신경전달물질이다. 정상적으로, 아세틸콜린은 근육을 자극하기 위하여 뉴런으로부터 방출된다. 자극 후, 아세틸콜린에스테라제는 아세틸콜린을 대사하여 근육이 이완되도록 허용한다. 그러나, 사린과 같은 OP는 아세틸콜린의 분해를 억제하는 아세틸콜린에스테라제를 비가역적으로 억제한다. OP 신경 작용제는 일반적으로 매우 적은 용량으로도 치명적이며 대상은 일반적으로 일부 유형의 질식으로 쓰러진다. 치사량 미만의 OP를 받은 대상들은 영구적인 신경 손상으로 발달할 수 있다. 또한, OP 살충제가 여전히 광범위하게 사용중이다. 비록 OP 살충제가 신경 작용제보다는 훨씬 덜 독성이지만, 인간에 대한 OP 살충제 독성은 여전히 큰 관심 대상이다.
OP 중독에 대한 해독제 및 치료는 매우 제한된다. OP 중독 증상 (예컨대 떨림)에 대한 작은 분자 치료가 있다. 그러나, 전체적으로 이들 치료법은 매우 제한된 유익이 있을 뿐이다. 무스카린 ACh 수용체 차단에 대해 아트로핀이 투여될 수 있고 경련 증상의 관리를 위해 다이아제팜이 투여될 수 있다. Lee E.C. (2003) Clinical manifestations of sarin nerve gas exposure. J. Am. Med. Assoc. 290:659-662. 추가로, 2-프랄리드옥심 (2-PAM)을 사용한 옥심 치료법은 모든 OP-AChE 부가물이 아닌 일부에 효과적으로 반응할 수 있다. Cannard, K. (2006) The acute treatment of nerve agent exposure. J Neurol Sci 249:86-94. 비록 이들 치료법이 살충제 또는 매우 적은 용량의 신경 작용제와 같은 덜 독성인 OP의 경우에 사망률을 감소시킬 수 있긴 하지만, 그것들은 일반적으로 임상의들에게는 OP 신경 작용제에 대한 가능한 전쟁터 수준의 노출과 관련하여 매우 비효율적인 것으로 보여진다.
예방적 항-OP 치료법에 대해, 특정 효소가 바이오스캐빈저 (bioscavanger)로서 작용함으로써 사린과 같은 OP를 해독할 것으로 밝혀졌다. OP가 비가역적으로 비활성화시키는 것과 동일한 효소인, 아세틸콜린에스테라제 (AChE) (우태아 혈청-유도됨)는 예방적으로 투여될 때, 붉은털 원숭이를 화학전을 위해 디자인된 고도로 독성인 OP 신경 작용제인 3,3-다이메틸부탄-2-일메틸포스포노플루오리데이트 (soman)의 LD50의 2 내지 5회의 도전에 대해 보호할 수 있었다. Wolfe, A.D., et al., (1992) Use of cholinesterases as pretreatment drugs for the protection of rhesus monkeys against soman toxicity. Toxicol. Appl Pharmacol. 117:189-193.
AChE는 광범위한 카르복실에스테르를 가수분해하는 효소의 다중-유전자 패밀리인 카르복실/콜린에스테라제 (CE/ChE)의 일원이다. 패밀리의 구성원들은 AChE, 인간 카르복실에스테라제 1 (hCE1) 및 2 (hCE2) 및 부티릴콜린에스테라제 (BuChE)를 포함한다. 이들 중에서, BChE가 바이오스캐빈저로서 가장 큰 관심을 받았다. BuChE는 인간 혈청 중의 주요 콜린에스테라제이다. 비록 밀접하게 관련된 효소 AChE가 콜린작용성 전달의 일차 시냅스 조절자로서 잘 기술되어 있긴 하지만, BChE에 대한 확정적인 생리적 역할은 아직 입증되지 않았다.
BuChE는 촉매적으로 혼잡하고 아세틸콜린 (ACh)뿐 아니라 장쇄 콜린 에스테르 (예컨대 부티릴콜린, 그것의 바람직한 기질, 및 석신일콜린) 및 다양한 비-콜린 에스테르, 예컨대 아세틸살리실산 (아스피린) 및 코카인을 가수분해한다. 더욱이, BuChE는 인공 OP 살충제 및 신경 작용제뿐만 아니라 대부분의 환경적으로 발생하는 ChE 억제제와 결합한다. 그러나, 천연 BuChE의 생리적으로 활용가능한 수준은 OP와 관련하여 임의의 의미있는 보호를 제공하기에는 너무 낮다.
인간 혈청으로부터 정제된 BuChE는 인간을 치료하기 위해 사용되었다. 환자들은 근육 이완제의 효과에 대응하기 위하여 및 OP 살충제 중독에 대해 부분적으로 정제된 인간 BuChE를 성공적으로 받았다. Cascio, C., et al. (1988) The use of serum cholinesterase in severe phosphorous poisoning. Minerva Anestesiol (Italian) 54:337-345. 그러나, 인간 혈청으로부터 정제된 생성물은 물론 그것에 대해 시험될 수 없는 미지의 혈액 기원 병원체에 의한 오염의 위험으로 인해 고도로 바람직하지 않다. 이런 관점에서, 예를 들어, 혈우병의 치료를 위한 FVIII는 오늘날 재조합 DNA 기술에 의해 제조되고 수천 명의 환자가 70대 후반 및 80대 초반에 HIV 바이러스로 감염된 후에는 인간 혈청으로부터 더 이상 정제되지 않는다. 또한, 혈청으로부터 정제된 BuChE의 제조는 활용 가능한 혈청의 부피에 의해 심각하게 제한된다. Lockridge, O., et al. (2005) J. Med. Chem. Biol. Radiol. Def. 3:nimhs5095.
혈액 혈청으로부터 정제된 BuChE를 사용하는 것을 피하기 위하여, 재조합 BuChE (rBuChE)가 대장균에서 제조되었다. Masson, P. (1992) in Multidisciplinary Approaches to cholinesterase Functions, eds Shafferman, A., Velan, B. (Plenum, New York) pp 49-52. 그러나, 제조된 단백질은 비-기능적이었다. rBuChE는 또한 포유류 293T에서 (Altamirano, C.V. and Lockridge, O. (1999) Chem. Biol. Interact. 119-120:53-60) 및 CHO에서 (Millard, C.B., Lockridge, O., and Broomfield, C.A. (1995) Biochemistry 34:15925-15933) 제조되었다. 그러나, 포유류 발현 시스템은 충분한 양의 단백질을 생성하지 못하여서 혈장 정제된 BuChE에 대한 요구가 제거될 수 있었다. 포유류 세포의 발현 시스템으로 경험된 어려움이 있다고 한다면, 염소 β-카제인 프로모터의 제어하에 인간 BuChE 유전자를 가지는 형질전환 염소가 제조되었고, 제조된 rBuChE가 염소 젖으로부터 정제되는 것이 허용된다. Huang, Y.J. et al (2007) Recombinant human butyrylcholinesterase from milk of transgenic animals to protect against organophosphate poisoning. Proc. Nat. Acad. Sci. 104(34):13603-13608. 그러나, 형질전환 염소 rBuChE가 동물에서 시험될 때, PK 및 생체이용률 결과는 효소 자체 및 PEG에 컨쥬게이트된 효소 둘 다에 대해 매우 만족스럽지 못하였다. 형질전환 염소에서 생성된 rBuChE는 혈장으로부터 정제된 천연 인간 BuChE에 유사한, OP 중독의 예방을 위한 제제로서 개발되는 것을 허용하기 위한 거주 시간을 외관적으로는 갖지 못하였다.
그러므로 다량으로 제조될 수 있고 양호한 PK 특성을 가지는 BuChE의 재조합 버전 및 관련된 바이오스캐빈저에 대한 요구가 남아 있다.
2.
요오도아세트아미드
컨쥬게이션
제1 재조합 인슐린 생성물이 1982년에 승인된 이래, 단백질 및 펩티드 치료제가 광범위한 병리생리학 질환의 치료를 위한 매우 효과적인 약물로서 성공적으로 사용되어 왔다. 이들 약물의 개발은 지난 수십년 동안의 재조합 DNA 기술의 진전에 의해 박차가 가해졌다. 단백질 치료제는 일반적으로 다음 두 범주 중 하나에 속한다: (1) 천연 단백질을 모방하고 대체물로서 작용하는 바이오제약, 예컨대 인슐린 및 (2) 다양한 경로의 아고니스트 또는 길항체로서 작용하는 단클론성 항체, 예컨대 AVASTIN®. 단백질 치료제가 질환 완화 및 판매의 두 가지 관점에서 모두 대단한 성공을 누린 한편, 많은 것들이 차선의 물리화학적 및 약물동역학적 특성을 가지고 있는 것이 관찰되었다. 단백질 치료제에서 볼 수 있는 주요 결점은 물리화학적 불안정성, 제한된 용해도, 단백질 가수분해적 불안정성, 짧은 제거 반감기, 면역원성 및 독성이다.
단백질 치료제의 약물동역학적 특성을 개선하기 위한 한 가지 접근법은 단백질의 생체고분자에의 컨쥬게이션이다. 이런 관점에서, 10여개 정도의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 컨쥬게이트가 현재, 예컨대 Neulasta®와 같이 승인되었다. 단백질 페길화 (PEGylation)로 다양한 유익, 이를테면 개선된 약물 용해도, 효능의 감소 없이 및 잠재적으로 감소된 독성을 가지면서 감소된 단위용량 빈도, 연장된 순환 주기, 증가된 약물 안정성 및 단백질 가수분해적 분해에 대한 보다 큰 저항이 관찰되었다. 페길화의 상업적 유익이 또한 관찰되었는데, 이를테면 새로운 전달 포맷과 투약 양생법에 대한 기회였다. 또한, 페길화가 새로운 화학적 실체를 생성하기 때문에 더 많은 특허 보호에 대한 기회가 있다.
역사적으로, 대부분의 페길화 시약은 단백질 상의 접근 가능한 아민 기능성의 장점을 취하기 위해 개발되었다. 아민기는 모든 단백질에서 정의에 의해 존재하고 (즉 아미노 말단) 대부분의 단백질에서 예컨대 Lys에 의해 기여되는 것과 같이, 하나 이상의 아미노기가 있다. 아민 컨쥬게이트된 PEG 단백질은 규제 승인을 받았다. Alconel, S.N.S., Baas, A.S. and Maynard, H.D. (2011) FDA-approved poly(ethylene glycol)-protein conjugate drugs. Polym. Chem. 2 (7), 1442. 적어도 2개의 아민 PEG 단백질 컨쥬게이트가 제일선의 치료제이다. Foster, G.R. (2010) Pegylated Interferons for the Treatment of Chronic Hepatitis C: Pharmacological and Clinical Differences between Peginterferon-2a and Peginterferon-2b. Drugs 70 (2), 147-165; Piedmonte, D.M. and Treuheit, M.J. (2008) Formulation of Neulasta (pegfilgrastim). Adv. Drug Delivery Rev. 60, 50-58.
그러나, 아민 컨쥬게이션과 관련된 많은 문제점들이 있다. 아민 컨쥬게이션에 특이적인 시약은 자주 시약 (예컨대 PEG-N-하이드록시석신이미드 에스테르)의 경합적인 가수분해 반응 또는 환원성 아민화 컨쥬게이션에 필요한, 이민 형성 동안의 바람직하지 못한 평형으로 인해 비효과적이다. Wang, X., Kumar, S., and Singh, S. (2011) Disulfide Scrambling in IgG2 Monoclonal Antibodies: Insights from Molecular Dynamics Simulations. Pharm. Res. 28, 3128-3143. 더욱이, 대부분의 단백질은 반응에 활용할 수 있는 여러 개의 아민 잔기를 가진다. 그러므로, 아민 PEG 컨쥬게이트는 부위 특이적이지 않는 경향이 있고, 결과적으로 최종 생성물에 상이한 PEG-단백질 컨쥬게이트의 이질적인 혼합물이 초래된다. Veronese, F. (2001) Peptide and protein PEGylation a review of problems and solutions. Biomaterials 22 (5), 405-17; Luxon, B.A., Grace, M., Brassard, D., and Bordens, R. (2002) Pegylated interferons for the treatment of chronic hepatitis C infection. Clin. Ther. 24 (9) 1363-1383.
단백질 아민기를 통한 PEG의 컨쥬게이션과 관련된 다양한 결점들은 시스테인을 통한 페길레이트 (PEGylate) 단백질에 대한 방법의 개발을 유도하였다. 실제로, Cys를 통한 중합체 컨쥬게이션은 오늘날의 연구자들이 취한 주요 접근법들 중 하나이다. Roberts, M.J. and Harris, B.J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv. Drug Del. Rev. 54, 459-576; Stenzel, M.H. (2012) Bioconjugation Using Thiols: Old Chemistry Rediscovered to Connect Polymers with Nature's Building Blocks. ACS Macro Letters 2, 14-18. 단백질의 표면상의 유리 시스테인의 수는 리신의 그것보다 훨씬 적다. 만약 유리 시스테인이 부족하면, 하나 이상의 유리 시스테인이 유전자 엔지니어링에 의해 첨가될 수 있다. Goodson, R.J. and Katre, N.V. (1990) Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site. Biotechnology 8, 343-46.
알킬 할라이드, 에스테르 아크릴레이트 및 비닐 설폰 시약을 포함한 다양한 화학물질이 시스테인을 통한 단백질에의 중합체 컨쥬게이팅에 대해 개발되었다. 그러나 대부분의 만연된 컨쥬게이션 기는 말레이미드이다. Roberts, M.J., Bentley, M.D., and Harris, J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv. Drug Del. Rev. 54, 459-76. 말레이미드 시약은 중성 pH에서 컨쥬게이트를 제공하기 위해 티올기와 효과적으로 반응하고, 단백질 변성과 관련된 위험을 감소시킨다. 말레이미드 컨쥬게이션은 임상적으로 승인된 PEG 약물에 사용되었다. Goel, N. and Stephens, S. (2010) Certolizumab pegol. mAbs 2 (2), 137-47. 말레이미드는 또한 일부 승인된 비-PEG 컨쥬게이트에 사용되었다. 예컨대 Gualberto, A. (2012) Brentuximab Vedotin (SGN-35), an antibody-drug conjugate for the treatment of CD30-positive malignancies. Expert Opin. Invest. Drugs 21 (2), 205-16 참조함.
비록 여러 말레이미드 기반 생성물이 승인되었지만, 일부 말레이미드-티올 컨쥬게이트는 불안정한 것으로 알려져 있다. 이런 관점에서, 말레이미드 기반 컨쥬게이트는 교환 반응을 수행할 수 있는 것이 관찰되었다. Baldwin, A.D. and Kiick, K.L. (2011) Tunable Degradation of Maleimide-thiol Adducts in Reducing Environments. Bioconjugate Chem. 22 (10), 1946-53; Baldwin, A.D. and Kiick, K.L. (2012) Reversible maleimide-thiol adducts yield glutathione-sensitive poly(ethylene glycol)-heparin hydrogels. Polym. Chem. 4 (1), 133. 더욱이, 교환 생성물은 내인성 단백질과 관련하여 검출되었다. Alley, S.C., Benjamin, D.R., Jeffrey, S.C., Okeley, N.M., Meyer, D.L., Sanderson, R.J. and Senter, P.D. (2008) Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chem. 19, 759-65; Shen, B.Q., et al. (2012) Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnol. 30 (2), 184-89.
말레이미드 컨쥬게이트는 일부 상황하에서 불안정한 것으로 알려져 있기 때문에, 대체 컨쥬게이션 전략이 사용되었다. Roberts, M.J. and Harris, B.J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv. Drug Del. Rev. 54, 459-576. 이들 대체 접근법 중 하나는 아래에 나타낸 것과 같이 요오도아세트아미드 기반 컨쥬게이션의 사용이다:
PEG-요오도아세트아미드는 유리 티올과 친핵성 치환에 의해 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 생성한다. 티오에테르 연결은 말레이미드 화학 물질을 사용하여 만들어진 상응하는 구조보다 훨씬 더 안정하다. 요오도아세트아미드의 티올과의 반응은 pH 의존적이다. 티올은 일반적으로 티올레이트 음이온 형태에서만 알킬화된다. Lindley, H. (1960) A study of the kinetics of the reaction between thiol compounds and chloroacetamide. Biochem. J. 74, 577-84. Cys의 티올의 pK 값은 일반적으로 약 8.5 +/- 0.5이지만, 요오도아세트아미드 모이어티에 컨쥬게이팅될 때 천연 단백질의 Cys의 환경에 의존한다. Kallis, G. and Holmgren, A. (1980) Differential reactivity of the functional sulfhydryl groups of cysteine-32 and cysteine-35 present in the reduced form of thioredoxin from Escherichia coli. J. Bio. Chem. 255 (21) 10261-10266.
Kallis와 Holmgren은 약 8.5의 정상적인 pK를 갖는 Cys 잔기가 요오도아세트아미드로 쉽게 아실화되지 않거나 중성 pH에서 요오도아세트산으로 알킬화되는 것을 관찰하였다. 이들 정상 티올의 신속한 반응은 단지 상승된 pH로 관찰되었다. 높은 pH에 대한 단백질의 노출은 자주 단백질 변성을 유도한다는 것이 기술분야에 잘 알려져 있다. 염기성 또는 높은 pH에 노출된 단백질의 변성은 매우 단백질 의존적이다. 몇몇 단백질이 높은 pH에 대한 노출에서 생존할 수 있다. 그러나, 많은 것들은 영구적으로 변성되어 활성 및/또는 결합 능력의 손실을 초래한다.
그러므로 생리적 pH에서 요오도아세트아미드 컨쥬게이션을 사용하여 단백질에 중합체를 컨쥬게이팅하는 방법에 대한 요구가 있다.
발명은 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 유기인 (organophosphorus, OP) 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 포함하는 컨쥬게이트 (conjugate)를 제공하며, 여기서 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체 유닛을 포함하고 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 양성이온성 기를 포함한다. 선택적으로, OP 바이오스캐빈저(bioscavenger)는 아릴다이알킬포스파타제(aryldialkylphosphatases), 오가노포스페이트 가수분해효소 (organophosphate hydrolases, OPH), 카르복실에스테라제(carboxylesterases), 트라이에스테라제(triesterases), 포스포트라이에스테라제(phosphotriesterases), 아릴에스테라제(arylesterases), 파라옥소나제 (paraoxonases, PON), 오가노포스페이트 산 탈수효소(organophosphate acid anhydrases) 및 다이아이소프로필플루오로포스파타제 (diisopropylfluorophosphatases, DFPase)로 구성되는 군으로부터 선택된 촉매 바이오스캐빈저이다. 선택적으로, OP 바이오스캐빈저는 아세틸콜린에스테라제 (acetylcholinesterase, AChE) 및 부티릴콜린에스테라제 (butyrylcholinesterase, BChE)로 구성되는 군으로부터 선택된 콜린에스테라제(cholinesterase)를 포함하는 화학양론적 OP 바이오스캐빈저이다. 선택적으로, 콜린에스테라제는 혈액 혈장으로부터 정제된다. 선택적으로, 콜린에스테라제는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 선택적으로, 콜린에스테라제는 부티릴콜린에스테라제이다. 선택적으로, 부티릴콜린에스테라제는 비-부티릴콜린에스테라제 단백질에 융합 단백질로서 융합된다. 선택적으로, 비-부티릴콜린에스테라제 단백질은 면역글로불린 (immunoglobulin, Ig) 도메인을 포함한다. 선택적으로, Ig 도메인은 IgG-Fc, IgG-CH 및 IgG-CL로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선택적으로, IgG는 IgG1이다. 선택적으로, Ig 도메인은 IgG-Fc (SEQ ID NO. 8)이다. 선택적으로, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 가진다. 선택적으로, Fc 도메인은 다음의 치환 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 가진다. 선택적으로, Fc 도메인은 다음의 치환 Q347C 또는 L443C 중 하나를 더 가진다. 선택적으로, 치환은 Q347C이다. 선택적으로, 융합 단백질은 부티릴콜린에스테라제 효소와 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 사이에 링커를 더 포함한다. 선택적으로, 링커는 G, GG, GGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23), 및 GGGES (SEQ ID NO: 24) 및 전술한 것들의 올리고머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 링커는 GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21) 및 GGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 25)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 카르복실 절단물이다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 아미노산 29 내지 561을 포함하거나 그것으로 구성된다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 아미노산 29 내지 562를 포함하거나 그것으로 구성된다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 잔기 94에서의 C가 Y인 돌연변이를 가진다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 융합은 SEQ ID NO.2로 표시된 아미노산 서열을 가진다.
상기 컨쥬게이트들 중 임의의 것에서, 양성이온성 기는 포스포릴콜린을 포함할 수 있다. 선택적으로, 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트를 포함한다. 선택적으로, 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트 (HEMA-PC)를 포함한다. 선택적으로, 중합체는 3개 이상의 팔 (arm)을 가진다. 선택적으로, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 가진다. 선택적으로, 중합체는 3, 6 또는 9개의 팔을 가진다. 선택적으로, 컨쥬게이트의 중합체 부분은 300,000 내지 1,750,000 달톤의 피크 분자량을 가진다. 선택적으로, 컨쥬게이트의 중합체 부분은 500,000 내지 1,000,000 달톤의 피크 분자량을 가진다. 선택적으로, 컨쥬게이트의 중합체 부분은 600,000 내지 800,000 달톤의 피크 분자량을 가진다. 선택적으로, 중합체는 콜린 에스테라제의 아미노기, 하이드록실기, 설프하이드릴기 및 카르복실기 중 적어도 하나에 공유적으로 결합된다. 선택적으로, 설프하이드릴기는 콜린 에스테라제의 시스테인 잔기로부터 유래한다. 선택적으로, 시스테인 잔기는 시스테인이 콜린 에스테라제에 자연적으로 존재하지 않는 위치에 있다.
선택적으로, 콜린에스테라제는 SEQ ID NO. 2의 그것에 상응하는 부티릴콜린에스테라제 융합이고 시스테인 잔기는 그 아미노산 672에 있다. 선택적으로, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 아미노산 29 내지 562를 포함하거나 그것으로 구성된다. 선택적으로, 잔기 94는 티로신이다. 선택적으로, 부티릴콜린에스테라제 효소는 재조합 DNA 엔지니어링을 통해 도입된 시스테인 잔기를 더 포함한다. 선택적으로, 청구범위 41항에 따르는 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 13을 포함한다.
발명은 추가로 부티릴콜린에스테라제 효소 및 비-부티릴콜린에스테라제 단백질을 포함하는 부티릴콜린에스테라제 효소 융합 단백질을 제공한다. 선택적으로 비-부티릴콜린에스테라제 단백질은 면역글로불린 (Ig) 도메인을 포함한다. 선택적으로, Ig 도메인은 IgG-Fc, IgG-CH 및 IgG-CL로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선택적으로, IgG는 IgG1이다. 선택적으로, IgG1 도메인은 IgG1-Fc (SEQ ID NO. 8)이다. 선택적으로, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 가진다. 선택적으로, Fc 도메인은 다음의 치환 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 가진다. 선택적으로, Fc 도메인은 다음의 치환 Q347C 또는 L443C 중 하나를 더 가진다. 선택적으로, 치환은 Q347이다. 선택적으로, 융합 단백질은 부티릴콜린에스테라제 효소와 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 사이에 링커를 필요로 한다. 선택적으로, 링커는 G, GG, GGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23), 및 GGGES (SEQ ID NO: 24) 및 전술한 것들의 올리고머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 링커는 GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21) 및 GGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 25)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 카르복실 절단물이다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 아미노산 29 내지 561을 포함하거나 그것으로 구성된다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 아미노산 29 내지 562를 포함하거나 그것으로 구성된다. 선택적으로 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO.1의 잔기 94에서의 C가 Y인 돌연변이를 가진다. 선택적으로 융합 단백질은 SEQ ID NO.2로 표시된 아미노산 서열을 가진다.
발명은 추가로 임의의 선행하는 청구범위의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질들 중 임의의 것의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 OP 중독의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 선택적으로, 컨쥬게이트는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 병변내 투여 또는 피부내 투여에 의해 투여된다. 선택적으로, 컨쥬게이트는 근육내 투여에 의해 투여된다.
발명은 추가로 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 포함하는 컨쥬게이트를 OP 화합물에 대한 예상된 노출보다 적어도 7일 전에 투여하는 단계를 포함하는, OP 중독에 대한 장기간 예방을 실시하는 방법을 제공하며, 여기서 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체 유닛을 포함하고 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 양성이온성 기를 포함한다. 선택적으로, OP 화합물은 OP 살충제 또는 OP 신경 작용제이다. 선택적으로, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출보다 적어도 14일 전에 투여된다. 선택적으로, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출보다 적어도 21일 전에 투여된다. 선택적으로, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출보다 적어도 30일 전에 투여된다.
발명은 추가로 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 포함하는 컨쥬게이트를 OP 화합물에 대한 예상된 노출보다 적어도 12시간 전에 투여하는 단계를 포함하는, OP 중독에 대한 신속한 예방을 실시하는 방법을 제공하며, 여기서 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체 유닛을 포함하고 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 양성이온성 기를 포함한다. 선택적으로, OP 화합물은 OP 살충제 또는 OP 신경 작용제이다. 선택적으로, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출보다 적어도 24시간 전에 투여된다.
임의의 상기 방법은 카바메이트(carbamate), 항-무스카린(anti-muscarinic), 콜린에스테라제 재활성화제 및 항-경련제 중에서 선택된 다른 약학 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
발명은 추가로 다음을 포함하는 중합체 합성을 위한 개시제를 제공한다:
식에서 L1은 제1 링커이고, L2는 제2 링커이며 L3은 제3 링커이고, 이때 L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하며 각각은 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)1-20-NH-(CH2CH2-O-)1-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고; R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 H (단 R1 및 R2는 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 염기성 기는 
(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되며; R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하고
선택적으로, Y는 Br이다. 선택적으로, R3, R4 및 R5는 각각 
이다.
선택적으로, R3, R4 및 R5는 각각 
이다.
선택적으로, R4, R5 및 R6은 각각
선택적으로 L3은 결합이고 R2는 H이며 R1은 
이다.
선택적으로, L2는 -(CH2)1-6-이다. 선택적으로, L2는 -(CH2)3-이다.
발명은 추가로 하나 이상의 라디칼 중합 가능한 단량체를: 라디칼적으로 이동 가능한 원자 또는 기로 균질분해반응적으로 절단 가능한 결합을 포함하는 개시제; 전이 금속 화합물; 및 
(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 리간드의 존재하에 중합시키는 단계를 포함하는, 중합반응 과정을 제공하며; 리간드는 전이 금속 화합물에 배위 결합되고, 전이 금속 화합물 및 리간드는 단량체의 중합화를 개시하고 증식하기 위해 매치된다. 선택적으로 리간드는 단일분자 개시제 리간드를 형성하기 위하여 개시제에 공유 연결된다.
선택적으로, 단일분자 개시제 리간드는 
의 구조를 가지며, 식에서 L1은 제1 링커이고, L2는 제2 링커이며 L3은 제3 링커이고, 이때 L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하며 각각은 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)1-20-NH-(CH2CH2-O-)1-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고; R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 H (단 R1 및 R2는 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 염기성 기는 
(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되고; R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하며 
, 
및 
(식에서 Y는 NCS, F, Cl, Br 또는 I임)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
선택적으로 Y는 Br이다. 선택적으로, R3, R4 및 R5는 각각 
이다.
선택적으로, R3, R4 및 R5는 각각 
이다.
선택적으로, R4, R5 및 R6은 각각 
이다.
선택적으로 L3은 결합이고 R2는 H이며 R1은 
이다.
선택적으로, L2는 -(CH2)1-6- 또는 -(CH2)3-이다. 선택적으로, 라디칼 중합 가능한 단량체는 올레핀 불포화된 단량체이다. 선택적으로, 불포화 단량체는 HEMA-PC를 포함한다. 선택적으로, 전이 금속은 저 원자가 상태의 전이금속 또는 적어도 하나의 배위결합하는 비-하전된 리간드에 배위결합된 전이 금속 중 하나이며 전이 금속은 카운터이온을 포함한다. 선택적으로, 전이 금속은 구리, 철, 니켈 또는 루테늄으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
도 1은 혈장 유도된 rhBuChE의 시간 경과에 따른 활성 대 시간 경과에 따른 시노몰구스 원숭이 혈장에 보관된 형질전환 염소, rBuChE534GGC (C66Y) 및 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)의 젖으로부터의 전길이 rhBuChE의 활성을 도시한다.
도 2는 시노몰구스 원숭이 혈장에 4℃ 및 37℃에서의 인간 혈장 유도된 BuChE와 비교한 9개의 팔(arm)을 가진 750 kDa HEMA-PC 중합체에 컨쥬게이트된 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)에 대한 활성 대 시간의 도표를 도시한다.
도 3은 시간 경과에 따른 마우스에 주사된 후의 컨쥬게이트되지 않은 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C), 3개의 팔을 가진 500 kDa MPC 중합체에 컨쥬게이트된, 9개의 팔을 가진 750 kDa MPC 중합체에 컨쥬게이트된 및 혈장 유도된 hBuChE의 활성, 표준화된 활성 (유닛 x 106)을 도시한다.
도 4는 요오도아세트아미드 및 말레이미드를 통해 MPC 중합체에 컨쥬게이트된 형질전환 염소의 젖으로부터의 전 길이 rhBuChE에 대한 안정성 프로필을 도시한다.
도 5는 변형된 (R1) 요오도아세트아미드 모이어티를 가진 3-팔(arm), 250 kDa, MPC 중합체를 도시한다.
도 2는 시노몰구스 원숭이 혈장에 4℃ 및 37℃에서의 인간 혈장 유도된 BuChE와 비교한 9개의 팔(arm)을 가진 750 kDa HEMA-PC 중합체에 컨쥬게이트된 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)에 대한 활성 대 시간의 도표를 도시한다.
도 3은 시간 경과에 따른 마우스에 주사된 후의 컨쥬게이트되지 않은 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C), 3개의 팔을 가진 500 kDa MPC 중합체에 컨쥬게이트된, 9개의 팔을 가진 750 kDa MPC 중합체에 컨쥬게이트된 및 혈장 유도된 hBuChE의 활성, 표준화된 활성 (유닛 x 106)을 도시한다.
도 4는 요오도아세트아미드 및 말레이미드를 통해 MPC 중합체에 컨쥬게이트된 형질전환 염소의 젖으로부터의 전 길이 rhBuChE에 대한 안정성 프로필을 도시한다.
도 5는 변형된 (R1) 요오도아세트아미드 모이어티를 가진 3-팔(arm), 250 kDa, MPC 중합체를 도시한다.
I. 일반적 사항
본 발명은 친수성 기 또는 양성이온을 가진 고분자량 (MW) 중합체, 예컨대 포스포릴콜린을 제공한다. 또한 본 발명에 따르면 고분자량 중합체를 제조하기 위한 방법 및 신규한 출발 물질이 제공된다. 또한 본 발명에 따르면 고분자량 중합체와 콜린에스테라제의 컨쥬게이트가 제공된다. WO2011/130694 및 WO/2007/100902는 본원에 모든 목적에 대해 참조로 포함된다.
II. 정의
"콜린에스테라제" (Cholinesterase, ChE)는 신경 임펄스 전달에 포함된 효소의 패밀리를 나타낸다. 콜린에스테라제는 콜린작용성 시냅스에서 아세틸콜린의 가수분해를 촉매한다. 콜린에스테라제를 한정하는 것은 아니지만 아세틸콜린에스테라제 및 부티릴콜린에스테라제를 포함한다.
아세틸콜린에스테라제 및 부티릴콜린에스테라제를 포함한 콜린에스테라제에 대한 언급은 전구체 콜린에스테라제 및 성숙한 콜린에스테라제 (예컨대 신호 서열이 제거되어 있는 것들), 활성을 가지고 있는 그것들의 절단된 형태를 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 변이체, 및 참조된 SEQ ID NO.들에 나타낸 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한 다른 변이체들을 포함한다. 변이체들은 OP 비활성화 활성을 나타낸다. 콜린에스테라제는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 함유하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 함유하지 않는 것들을 포함한다. 그런 변형으로는, 한정하는 것은 아니지만, 페길화(PEGylation), 폴리(HEMA-PC)의 첨가, 알부민화(albumination), 글리코실화(glycosylation), 파르네실화(farnesylation), 카르복실화(carboxylation), 하이드록실화(hydroxylation), 인산화(phosphorylation), 및 기술분야에 공지되어 있는 다른 폴리펩티드 변형을 포함한다. 절단된 콜린에스테라제는 그것의 임의의 N- 또는 C-말단의 단축 형태, 특히 절단되고 OP 비활성화 활성을 가지는 형태이다.
"아세틸콜린에스테라제" (Acetylcholinesterase, AChE)는 아세틸콜린을 포함하여, 아세틸 에스테르를 가수분해할 수 있는 효소 또는 폴리펩티드를 나타내며, 그것의 촉매 활성은 화학적 억제제 BW 284C51에 의해 억제된다. 아세틸콜린에스테라제로는, 한정하는 것은 아니지만, 혈장 유도된 또는 재조합 아세틸콜린에스테라제를 포함한다. 아세틸콜린에스테라제는 인간 및 비-인간 기원의 어느 것, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 래트, 마우스, 고양이, 닭, 토끼 및 소의 아세틸콜린에스테라제를 포함한다. 예시적인 인간 아세틸콜린에스테라제는 SEQ ID NO.3으로 표시되는 인간 AChE이다. 아세틸콜린에스테라제는 한정하는 것은 아니지만, 단량체, 이량체 및 사량체 형태를 포함하여, 임의의 형태로 있을 수 있다.
"부티릴콜린에스테라제" (Butyrylcholinesterase, BuChE)는 아세틸콜린 및 부티릴콜린을 가수분해할 수 있는 효소 또는 폴리펩티드를 나타내며, 그것의 촉매적 활성은 화학적 억제제인 테트라아이소프로필-피로포스포라미드 (iso-OMPA)에 의해 억제된다. 부티릴콜린에스테라제는 한정하는 것은 아니지만, 혈장 유도된 또는 재조합 부티릴콜린에스테라제를 포함한다. 부티릴콜린에스테라제는 비인간 기원, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 래트, 마우스, 고양이, 말, 닭, 돼지, 토끼 및 소의 임의의 것을 포함한다. 부티릴콜린에스테라제는 또한 인간 기원의 부티릴콜린에스테라제를 포함한다. 예시적인 인간 부티릴콜린에스테라제는 SEQ ID NO.1로 표시되는 인간 BuChE이다. 부티릴콜린에스테라제는 한정하는 것은 아니지만, 단량체, 이량체 및 사량체 형태를 포함하여, 임의의 형태로 있을 수 있다.
"유기인 화합물", "오가노포스페이트 화합물", "OP 화합물" , "Organophosphorus compound" 및 "OP"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 포스포릴 중심을 함유하고, 추가로 하나 이상의 에스테르 연쇄를 함유하는 화학적 화합물을 나타낸다. 일부 측면으로, 포스포에스테르 결합 및/또는 포스포릴 센터에서의 추가의 공유 결합의 유형이 유기인 화합물을 분류하게 된다. 유기인 화합물은 유기인계 살충제 및 유기인계 신경 작용제를 포함한다.
"유기인계 신경 작용제", "오가노노포스페이트 신경 작용제" 또는 "OP 신경 작용제"는 예컨대 효소 아세틸콜린에스테라제의 작용을 억제함으로써, 유기체의 신경계의 기능을 파괴하는 화학적 화합물을 나타낸다. 신경 작용제는 일반적으로 화학적 합성에 의해 제조되고 흡입, 흡수, 섭취 또는 그렇지 않고 근접하게 되는 경우 매우 독성이다. 신경 작용제는 임의의 유기인계 화합물, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 G-타입 신경 작용제 및 V-타입 신경 작용제를 포함한다. 예시적인 유기인계 신경 작용제는 타분 (tabun, GA), 사린 (sarin, GB), 소만 (soman, GD), 사이클로사린 (GF), VX, 러시안 VX (VR), 및 분류된 비-관례적 신경 작용제 (NTA)를 포함한다.
"유기인계 살충제", "오가노포스페이트 살충제" 또는 "OP 살충제"는 해충과 곤충을 파괴하기 위한 살충제 또는 살곤충제로 사용될 수 있는 유기인계 화합물을 나타낸다. 유기인계 살충제는 임의의 유기인계 살충제, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 아세페이트, 아진포스-메틸, 벤설라이드, 카두사포스, 클로레톡시포스, 클로르피리포스, 클로르피리포스메틸, 클로르티오포스, 코우마포스, 다이알리플로르, 다이아지논, 다이엘로르보스 (DDVP), 다이에로토포스, 다이메토에이트, 다이옥사티온, 다이설포톤, 에티온, 에토프로프, 에틸 파라티온, 펜아미포스, 페니트로티온, 펜티온, 포노포스, 이사조포스 메틸, 이소펜포스, 말라티온, 메타미도포스, 메티다티온, 메틸 파라티온, 메빈포스, 모노크로토포스, 날레드, 옥시데메톤 메틸, 포레이트, 포살론, 포스메트, 포스파미돈, 포스테부피림, 피리미포스 메틸, 프로페노포스, 프로페탐포스, 설포테프, 설프로포스, 테메포스, 테르부포스, 테트라엘로르빈포스, 트라이부포스 (JDEF) 및 트라이클로르폰일 수 있다.
"유기인계 중독" 또는 "OP 중독"은 유기인계 신경 작용제 또는 유기인계 살충제와 같은 유기인계 화합물에 노출된 살아있는 생명체에 대한 유해한 또는 바람직하지 못한 효과를 나타낸다.
"콜린작용성 독성"은 아세틸콜린에스테라제의 신경 작용제 억제, 신경전달물진 아세틸콜린의 축적 및 부교감계, 교감계, 운동 및 중추 신경계에 미치는 부수적인 효과에 의해 이루어진 독성을 나타낸다. 콜린작용성 독성은 근 질환, 정신병, 일반적인 마비 및 사망을 초래할 수 있다. 노출의 증상은 연축 (twitching), 떨림, 과다분비, 마비된 호흡, 경련 및 궁극적으로 사망을 포함한다. 콜린작용성 독성은 혈장의 순환하는 (활성) 콜린에스테라제 수준을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 일반적으로 치사 (lethality)는 콜린에스테라제 활성이 신경 작용제에 의한 결합으로 인해 정상 수준의 20% 아래로 떨어진 때에만 일어난다.
"유기인계 노출 관련 손상"은 예를 들어 콜린작용성 독성으로 인해 생리적 기능 (예컨대 운동 및 인지 기능)에 대한 단기 (예컨대 노출 후 수분 내지 수시간) 및 장기 (예컨대 노출 후 1주 내지 수년) 손상을 나타낸다. 유기인계 노출 관련 손상은 다음의 임상적 증상들, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 두통, 미만성 근경축, 약함, 과잉 분비, 메스꺼움, 구토 및 설사에 의해 나타날 수 있다. 상태는 발작, 혼수상태, 마비, 호흡기 부전, 지연된 신경병증, 근육 약함, 떨림, 경련, 영구저인 뇌 기형, 사회적/행동적 결함 및 일반적인 콜린작용성 위기 (예를 들어 악화된 염증 및 저혈구수에 의해 표시될 수 있음)로 진행될 수 있다. 극한 경우는 중독된 대상의 사망을 유도할 수 있다.
"유기인계 바이오스캐빈저" 또는 "오가노포스페이트 바이오스캐빈저" 또는 "OP 바이오스캐빈저"는 유기인계 살충제 및 유기인계 신경 작용제를 포함하여, 유기인계 화합물에 결합하거나 가수분해할 수 있는 효소이다. 유기인계 바이오스캐빈저는 한정하는 것은 아니지만, 콜린에스테라제, 아릴다이알킬포스파타제, 오가노포스페이트 가수분해효소 (OPH), 카르복실에스테라제, 트라이에스테라제, 포스포트라이에스테라제, 아릴에스테라제, 파라옥소나제 (PON), 오가노포스페이트 산 탈수효소 및 다이아이소프로필플루오로포스파타제 (DFPase)를 포함한다. 유기인계 바이오스캐빈저는 화학양론적 유기인계 바이오스캐빈저 또는 촉매적 유기인계 바이오스캐빈저일 수 있다.
"화학양론적 유기인계 바이오스캐빈저" 또는 "화학양론적 OP 바이오스캐빈저"는 효소의 각각의 활성 부위가 1:1의 화학양론적 비율로 유기인계 화합물에 결합하는 효소를 나타낸다. 화학양론적 OP 바이오스캐빈저는 한정하는 것은 아니지만, 콜린에스테라제, 예컨대 아세틸콜린에스테라제 및 부티릴콜린에스테라제를 포함한다.
"촉매적 유기인계 바이오스캐빈저" 또는 "촉매적 OP 바이오스캐빈저"는 유기인계 화합물을 가수분해하는 효소를 나타낸다. 촉매적 OP 바이오스캐빈저는, 한정하는 것은 아니지만, 아릴다이알킬포스파타제, 오가노포스페이트 가수분해효소 (OPH), 카르복실에스테라제, 트라이에스테라제, 포스포트라이에스테라제, 아릴에스테라제, 파라옥소나제 (PON), 오가노포스페이트 산 탈수효소 및 다이아이소프로필플루오로포스파타제 (DFPase)와, OP 화합물을 가수분해하는 능력을 증가시키기 위하여 그런 효소들에 도입된 재조합 돌연변이를 포함한다.
"아릴다이알킬포스파타제(aryldialkylphosphatases)"는 유기인계 화합물을 비활성화하거나 가수분해하는 자연적으로 발생하는 또는 재조합 효소를 나타낸다. 아릴다이알킬포스파타제 (EC 3.1.8.1)는 광범위한 유기인계 화합물을 가수분해할 수 있는 금속-의존성 OP-가수분해효소의 부류이다. 아릴다이알킬포스파타제는 효소 활성을 위해 이가 금속 이온, 예컨대 Zn2+, Mn2+, Co2+ 또는 Cd2+를 필요로 한다. 아릴다이알킬포스파타제는 한정하는 것은 아니지만, 포스포트라이에스테라제 또는 OP 가수분해효소 (PTE 또는 OPH), 파라옥손 가수분해효소 또는 파라옥소나제, 파라티온 가수분해효소 (PH), OpdA, 카르복실에스테라제, 트라이에스테라제, 포스포트라이에스테라제 및 아릴에스테라제를 포함한다. 아릴다이알킬포스파타제는 한정하는 것은 아니지만, 슈도모나스 디미누아타 (Pseudomonas diminuata) MG, 플라보박테리움 (Flavobacterium) 종, 플레시오모나스 (Plesiomonas) 종 스트레인 M6, 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 및 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter)로부터의 유기인계 가수분해효소; 버크홀데리아 (Burkholderia) 종 JBA3, 슈도모나스 디미누타 MG, 브레번디오모나스 디미누타 (Brevundiomonas diminuta), 플라보박테리움 종 스트레인 ATCC 27552 및 설폴로버스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius)로부터의 파라티온 가수분해효소; 및 바실러스 서브틸리스 WB800 및 플레시오모나스 종 스트레인 M6로부터의 메틸 파라티온 가수분해효소 (MPH)를 포함한다. 예시적인 아릴다이알킬포스파타제는 한정하는 것은 아니지만 SEQ ID NO.5에 표시되는 아릴다이알킬포스파타제를 포함한다.
아릴다이알킬포스파타제에 대한 언급은 활성을 가지는 그것의 끝이 절단된 형태를 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 변이체, 및 다른 변이체들, 이를테면 SEQ ID NO.5에 표시되는 폴리펩티드에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드들을 포함한다. 변이체는 OP 비활성화 활성을 나타낸다.
"파라옥소나제(Paraoxonase)"는 유기인계 화합물을 비활성화하거나 가수분해하는 자연적으로 발생하는 또는 재조합 효소를 나타낸다. 파라옥소나제는 한정하는 것은 아니지만, 천연 또는 재조합 파라옥소나제를 포함한다. 비-인간 파라옥소나제는 한정하는 것은 아니지만, 토끼, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 터키 칠면조 및 개를 포함한다. 예시적인 파라옥소나제는 한정하는 것은 아니지만, PON1 (SEQ ID NO.6)을 포함하여, 인간 파라옥소나제를 포함한다.
파라옥소나제에 대한 언급은 활성을 가지는 그것의 끝이 절단된 형태를 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 변이체, 및 다른 변이체들, 이를테면 SEQ ID NO.6에 표시되는 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드들을 포함한다. 변이체는 OP 비활성화 활성을 나타낸다. 파라옥소나제는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 함유하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 함유하지 않는 것들을 포함한다. 그런 변형은 한정하는 것은 아니지만, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파렌실화, 카르복실화, 하이드록실화, 인산화 및 기술분야에 공지되어 있는 다른 폴리펩티드 변형을 포함한다.
"다이아이소프로필플루오로포스파타제(Diisopropylfluorophosphatase)"는 유기인계 화합물을 비활성화하거나 가수분해하는 자연적으로 발생하는 또는 재조합 효소를 나타낸다. 다이아이소프로필플루오로포스파타제는 한정하는 것은 아니지만, 롤리고 불가리스 (Loligo vulgaris), 알테로모나스 (Alteromonas) 종, 슈도알테로모나스 할로플란크티스 (Pseudoalteromonas haloplanktis), 마리노모나스 메디테라네아 (Marinomonas mediterranea), 아플리시아 칼리포르니카 (Aplysia californica), 옥토퍼스 불가리스 (Octopus vulgaris) 및 래트 노쇠 마커 단백질 30으로부터의 다이아이소프로필플루오로포스파타제; 미코박테리움 종, 아미코락토프시스 메디테라네이 (Amycolatopsis mediterranei), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 spAA4, 스트렙토마이세스 리비단스 TK24, 스트렙토마이세스 스비세우스 (Streptomyces sviceus) 및 스트렙토마이세스 그리세오아루안티아커스 (Streptomyces griseoaurantiacus) M045로부터의 오가노포스페이트 산 탈수효소를 포함한다. 예시적인 다이아이소프로필플루오로포스파타제 및 오가노포스페이트 산 탈수효소는 한정하는 것은 아니지만, SEQ ID NO.7에 표시되는 롤리고 불가리스로부터의 다이아이소프로필플루오로포스파타제를 포함한다.
다이아이소프로필플루오로포스파타제데 대한 언급은 활성을 가지는 그것의 끝이 절단된 형태를 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 변이체, 및 다른 변이체들, 이를테면 SEQ ID NO.7에 표시되는 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드들을 포함한다. 변이체는 OP 비활성화 활성을 나타낸다.
"카바메이트(Carbamate)"는 콜린에스테라제의 카바메이트 억제제인 임의의 화합물을 나타낸다. 예시적인 카바메이트는 피리도스티그민 브로마이드이다.
"항-무스카린(Anti-muscarinic)"은 무스카린 아세틸콜린 수용체를 포함하여, 무스카린 수용체에 대해 경합성 길항체인 임의의 화합물을 나타낸다. 예시적인 항-무스카린은 아트로핀이다.
"콜린에스테라제 재활성화제"는 콜린에스테라제로부터 결합된 유기인계 화합물을 방출시키는 임의의 화합물을 나타낸다. 콜린에스테라제 재활성화제는 콜린-재활성화 옥심, 이를테면 피리디늄 및 비스피리디늄 알독심, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 프랄리독심, 트리메독심, 오비독심 및 HI-6, 메톡심 및 다이아제팜을 포함한다.
"항-경련"은 발작에 대해 보호하거나 또는 반전시키는 임의의 화합물을 나타낸다.
"컨쥬게이트(Conjugate)"는 중합체와 같은 하나 이상의 화학적 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결된 폴리펩티드를 나타낸다.
"융합 단백질(Fusion protein)"은 한 핵산 분자로부터의 코딩 서열 및 다른 핵산 분자로부터의 코딩 서열을 함유하는 핵산 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드를 나타내고 여기서 코딩 서열은 동일한 리딩 프레임에 있어서 융합 구성물이 숙주 세포에서 전사되고 번역될 때 두 개의 단백질을 함유하는 단백질이 생성된다. 두 분자는 구성물에서 인접해 있거나 1, 2, 3 또는 그 이상, 그러나 전형적으로 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 또는 6보다 적은 수의 아미노산을 함유하는 링커 폴리펩티드에 의해 분리될 수 있다. 융합 구성물에 의해 코드화된 단백질 생성물은 융합 폴리펩티드 또는 단백질로서 언급된다. 융합 단백질은 두 단백질 사이에 연결된 펩티드 또는 단백질을 가질 수 있다.
"반감기" 또는 "제거의 반감기" 또는 "t1/2"는 임의의 특수한 특성 또는 활성이 절반으로 감소하는 데 필요한 시간을 나타낸다. 예를 들어, 반감기는 물질 (예컨대 유기인계 바이오스캐빈저)이 그것의 원래의 활성 수준의 절반이 되는 데 걸리는 시간을 나타낸다. 그러므로, 반감기는 혈장에서의 물질의 활성을 측정함으로써 측정되거나, 또는 혈장에서의 물질의 혈장 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 반감기는 약물이 다양한 신체 과정을 통해 신체에서 그것의 원래 수준의 절반으로 감소하는 데 필요한 시간으로서 측정될 수 있다. 반감기가 길어질수록, 물질 또는 약물이 신체로부터 제거되는 시간은 더 길어질 것이다. 반감기에 대한 단위는 일반적으로 시간, 분 또는 일과 같은 시간 단위일 것이다.
"흡수"는 약물이 혈류 안으로 이동하는 것을 나타낸다.
"생체이용률"은 전신 순환에 도달하는 약물의 투여된 용량의 분율을 나타낸다. 생체이용률은 혈류 안으로의 약물의 흡수의 함수이다.
"용량"은 치료 또는 예방 목적으로 대상에 투여되는 약물의 정량 또는 양을 나타낸다.
"핵산"은 DNA, RNA 및 펩티드 핵산 (PNA) 및 그것들의 혼합물을 포함하여, 그것들의 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 예컨대 검출가능한 표지, 예컨대 형광 또는 방사성표지로 선택적으로 표지되는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 그런 분자는 라이브러리를 프로빙 또는 프라이밍하기 위해 전형적으로 그것들의 표적이 통계학적으로 특유한 또는 저복사수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)의 것이 되는 길이를 가진다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심의 유전자에 상보하는 또는 동일한 서열의 적어도 14, 16 또는 30개의 연속적인 뉴클레오티드를 함유한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 핵산 길이일 수 있다.
"폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 두 개의 폴리펩티드 (예컨대 VH 및 VL 도메인 또는 VH 도메인과 세포외 트랩 세그먼트)를 연결시키기 위해 사용되는 펩티드 결합에 의해 결합된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 그런 링커 폴리펩티드의 실례는 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123 참조). 예시적인 링커는 G, GG, GGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23), 및 GGGES (SEQ ID NO: 24), 및 그런 링커들의 올리고머 (예컨대 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 4) 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 26))를 포함한다.
"중합체"는 함께 연결된 일련의 단량체 기를 나타낸다. 고분자량 중합체는 한정하는 것은 아니지만, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈, 및 비닐 아세테이트와 같은 비닐 에스테르를 포함하는 단량체로부터 제조된다. 추가의 단량체들이 본 발명의 고분자량 중합체에 유용하다. 두 개의 상이한 단량체 유형이 사용될 때, 두 개의 모노머 유형은 "공단량체"로서 언급되고, 상이한 단량체 유형이 단일 중합체를 형성하기 위해 공중합되는 것을 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 중합체가 분지형일 때, 각각의 중합체 사슬은 "중합체 팔 (arm)"로서 언급된다. 개시제 모이어티에 연결된 중합체 팔의 단부는 근위 단부이고, 중합체 팔의 성장하는-사슬 단부는 원위 단부이다. 중합체 팔의 성장하는 사슬-단부에서, 중합체 팔 단부 기는 방사상 스캐빈저 또는 다른 기일 수 있다.
"개시제"는 단량체 또는 공단량체를 사용하여 중합반응을 개시할 수 있는 화합물을 나타낸다. 중합반응은 종래의 유리 라디칼 중합반응 또는 바람직하게는 제어된/ "살아있는" 라디칼 중합반응, 예컨대 원자 전달 라디칼 중합반응 (ATRP), 가역적인 첨가 단편화 종결 (RAFT) 중합반응 또는 니트록사이드 매개된 중합반응 (NMP)일 수 있다. 중합반응은 "위 (pseudo)" 제어된 중합반응, 예컨대 퇴행성 전달일 수 있다. 개시제가 ATRP에 적합한 때, 그것은 라디칼 중합반응을 개시할 수 있는 라디칼인 개시제 단편 I을 형성하기 위하여 균질반응 분해적으로 절단될 수 있는 가변 결합, 및 중합반응을 가역적으로 종결하기 위하여 성장하는 중합체 사슬의 라디칼과 반응하는 라디칼 스캐빈저 I'를 함유한다. 라디칼 스캐빈저 I'는 전형적으로 할로겐이지만, 또한 유기 모이어티, 예컨대 니트릴일 수 있다.
"링커"는 두 개의 기를 함께 연결시키는 화학적 모이어티를 나타낸다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 절단 가능한 링커는 다른 것들 중에서도 가수분해 가능한, 효소적으로 절단 가능한, pH 민감한, 광가변성인 또는 이황화물 링커일 수 있다. 다른 링커는 동종이중기능성 및 이종이중기능성 링커를 포함한다. "연결기"는 생체활성제에 대해 하나 이상의 결합으로 구성되는 공유 연쇄를 형성할 수 있는 기능기이다. 비제한적인 실례로는 표 1에 예시된 것들을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "반응기"는 공유 결합을 형성하기 위하여 다른 화학적 기와 반응할 수 있는, 즉 적합한 반응 조건하에 공유적으로 반응할 수 있는 기를 나타내고, 일반적으로 다른 물질에 대한 부착점을 나타낸다. 반응기는 상이한 화합물 상의 기능기와 화학적으로 반응하여 공유 연쇄를 형성할 수 있는 본 발명의 화합물 상의 모이어티, 예컨대 말레이미드 또는 석신이미딜 에스테르이다. 반응기는 일반적으로 친핵체, 친전자체 및 광활성기를 포함한다.
"기능성 제제"는 생체활성제 또는 진단시약을 포함하는 것으로 정의된다. "생체활성제"는 특이적인 생물학적 위치 (표적화 제제)를 표적으로 하고 및/또는 생체내에서 또는 시험관 내에서 측정될 수 있는 일부 국소적 또는 전신적 생리적 또는 약물학적 효과를 제공하는 임의의 제제, 약물, 화합물 또는 그것들의 혼합물을 포함하는 것으로 정의된다. 비-제한적인 실례로는 약물, 백신, 항체, 항체 단편, scFv, 디아바디, 아비머 (avimer), 비타민 및 조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산 (예컨대 mRNA, tRNA, snRNA, RNAi, DNA, cDNA, 안티센스 구성물, 리보자임 등)을 포함한다. "진단시약"은 조직 또는 질환의 검출 또는 영상화를 가능하게 하는 임의의 제제를 포함하는 것으로 정의된다. 진단시약의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 방사성 표지, 형광 발색단 및 염료가 있다.
"치료용 단백질"은 전체적으로 또는 부분적으로 약물을 만들고 인간 또는 동물 약제학적 용도에 사용될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 길이와 관계없는 펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 많은 치료용 단백질이 제한 없이, 본원에 개시된 것들을 포함하여 알려져 있다.
"PC"로도 표시되는 "포스포릴콜린"은 다음: 
을 나타내며, 식에서 *는 부착점을 나타낸다.
"포스포릴콜린 함유 중합체"는 포스포릴콜린(phosphorylcholine)을 함유하는 중합체이다. "양성이온 함유 중합체"는 양성이온을 함유하는 중합체를 나타낸다.
폴리(아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체는 단량체로서 2-(아크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트를 함유하는 중합체를 나타낸다.
폴리(메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체는 단량체로서 2-(메타크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트를 함유하는 중합체를 나타낸다.
명시된 단량체 유형에 대한 언급에 의해 정의된 중합체는 단일중합체일 수 있고, 즉 오직 명시된 유형의 단량체만이 존재하거나, 또는 명시된 유형의 단량체가 다른 단량체 유형(들)과 함께 존재하는 공중합체일 수 있다. 만약 공중합체가 바람직하다면, 적어도 50, 75 또는 90%의 단량체 분자는 명시된 유형의 것이다.
중합체의 맥락에서 "분자량"은 수 평균 분자량, 또는 중량 평균 분자량 또는 피크 분자량 중 어느 하나로서 표현될 수 있다. 다르게 표시되지 않는 한, 본원에서 분자량에 대한 모든 참조는 피크 분자량을 나타낸다. 이들 분자량 측정, 수 평균 (Mn), 중량 평균 (Mw) 및 피크 (Mp)는 크기 축출 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 분자량 값을 측정하는 다른 방법들 또한 사용될 수 있는데, 예컨대 수 평균 분자량을 측정하기 위해 단부-기 분석 또는 총괄성의 측정 (예컨대 동결점 침체, 비등점 상승 또는 삼투압)의 사용, 또는 중량 평균 분자량을 측정하기 위해 광산란 기법, 한외여과 또는 점도계의 사용을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 분자량은 SEC-MALS (크기 축출 크로마토그래피 - 다중 각 광산란)에 의해 측정된다. 발명의 중합체 시약은 전형적으로, 겔 투과 크로마토그래피에 의해 판단되는 바 다중분산성 (즉 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동일하지 않음), 바람직하게는 낮은, 예를 들면 약 1.5 미만의 다중분산성 지수 (PDI)를 가진다. 다른 실시예에서, 다중분산성은 보다 바람직하게는 약 1.4 내지 약 1.2의 범위, 보다 더 바람직하게는 약 1.15 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 여전히 보다 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 가장 바람직하게는 약 1.03 미만이다.
본원에서 사용되는 구절 "한" 또는 "하나"의 실체는 하나 이상의 그 실체를 나타낸다; 예를 들면 한 화합물은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 한 화합물을 나타낸다. 그로써, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 "약"은 상이한 기기, 샘플 및 샘플 제제들 중에서 취한 측정에서 볼 수 있는 차이를 의미한다.
"보호된", "보호된 형태", "보호기" 및 "보호성 기"는 특정 반응 조건 하에서 분자의 특정한 화학적 반응성 기능기의 반응을 방지하거나 차단하는 기 (즉 보호기)의 존재를 나타낸다. 보호기는 사용될 반응 조건 및 존재한다면 분자의 추가의 반응성 또는 보호기의 존재뿐 아니라 보호되는 화학적 반응기의 유형에 따라 달라진다. 적합한 보호기는 Greene 등의 논문 (Greene et al., "Protective Groups In Organic Synthesis," 3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999)에서 발견되는 것과 같은 것들을 포함한다.
"알킬(Alkyl)"은 표시된 수의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지형, 포화된, 지방족 라디칼을 나타낸다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 한정하는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 이차-부틸, 삼차-부틸, 펜틸, 아이소펜틸, 헥실 등을 포함한다. 다른 알킬기는, 한정하는 것은 아니지만, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함한다. 알킬은 임의의 수의 탄소, 예컨대 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6개의 탄소를 포함할 수 있다. 알킬기는 전형적으로 일가지만, 예컨대 알킬기가 두 개의 모이어티에 함께 연결될 때와 같이 이가일 수 있다.
상기 및 이하에서 유기 라디칼 또는 화합물과 관련하여 언급된 용어 "저급"은 각각 7까지의 및 7을 포함하는, 바람직하게는 4까지의 및 4를 포함하는 및 (분지되지 않은) 하나 또는 2개의 탄소 원자를 포함하는 분지형 또는 분지되지 않은 화합물 또는 라디칼을 가지는 분지형 또는 분지되지 않은 화합물 또는 라디칼을 각각 규정한다.
"알킬렌(Alkylene)"은 상기 정의된 것과 같이, 적어도 2개의 다른 기, 즉 이가의 탄화수소 라디칼을 연결시키는 알킬기를 나타낸다. 알킬렌에 연결된 2개의 모이어티는 알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자들에 연결될 수 있다. 예를 들어, 직쇄 알킬렌은 -(CH2)n의 이가 라디칼일 수 있고, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 알킬렌기는, 한정하는 것은 아니지만, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 아이소프로필렌, 부틸렌, 아이소부틸렌, 이차-부틸렌, 펜틸렌 및 헥실렌을 포함한다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼 (자주 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클로알케닐로 언급되는 기들을 포함함)에 대한 치환체는 0 내지 (2m'+1)의 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2로부터 선택된 다양한 기일 수 있으며, 여기서 m'는 그런 라디칼의 탄소 원자의 총 수이다. R', R" 및 R"'는 각각 독립적으로 수소, 치환되지 않은 (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 치환되지 않은 아릴, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴-(C1-C4)알킬 기를 나타낸다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 그것들은 질소 원자와 조합하여 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "알킬"은 할로알킬 (예컨대 -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예컨대 -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)과 같은 기를 포함한다. 바람직하게, 치환된 알킬 및 헤테로알킬 기는 1 내지 4개의 치환체, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환체를 가진다. 예외적인 것은 퍼할로 알킬 기 (예컨대 펜타플루오로에틸 등)로, 그것들 또한 바람직하고 본 발명에 의해 고려된다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼 (자주 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로서 언급된 기들을 포함함)에 대한 치환체는 한정하는 것은 아니지만 다음으로부터 선택된 다양한 기들 중 하나 이상일 수 있다: 0 내지 (2m'+1)의 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, 여기서 m'는 그런 라디칼 중의 탄소 원자의 총 수이다. R', R", R"' 및 R""은 각각 바람직하게 독립적으로 수소, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 예컨대 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 나타낸다. 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 가질 때, 예를 들어 R 기의 각각은 독립적으로 이들 기의 하나 이상이 존재할 때 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기로서 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 그것들은 질소 원자와 조합하여 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 한정하는 것은 아니지만, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "알킬"은 수소 기 이외의 기들에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬 (예컨대 -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예컨대 -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함한다.
"알콕시(Alkoxy)"는 알콕시 기를 부착점에 연결시키거나 알콕시 기의 두 개의 탄소에 연결된 산소 원자를 가지는 알킬기를 나타낸다. 알콕시기는 예를 들면 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소-프로폭시, 부톡시, 2-부톡시, 아이소-부톡시, 이차-부톡시, 삼차-부톡시, 펜톡시, 헥속시 등을 포함한다. 알콕시기는 추가로 본원에 기술된 다양한 치환체로 치환된다. 예를 들어, 알콕시기는 할로겐으로 치환되어 "할로-알콕시" 기를 형성할 수 있다.
"카르복시알킬(Carboxyalkyl)"은 카르복시 기로 치환된 알킬 기 (본원에서 정의된 것과 같음)를 의미한다. 용어 "카르복시사이클로알킬"은 카르복시 기로 치환된 사이클로알킬 기 (본원에서 정의된 것과 같음)를 의미한다. 용어 알콕시알킬은 알콕시 기로 치환된 알킬 기 (본원에서 정의된 것과 같음)를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "카르복시"는 카르복실산 및 그것의 에스테르를 나타낸다.
"할로알킬(Haloalkyl)"은 일부 또는 전부의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 상기에서 정의된 것과 같은 알킬을 나타낸다. 할로겐 (할로)는 바람직하게 클로로 또는 플루오로를 나타내지만, 또한 브로모 또는 요오도일 수 있다. 예를 들어, 할로알킬은 트라이플루오로메틸, 플루오로메틸, 1,2,3,4,5-펜타플루오로-페닐 등을 포함한다. 용어 "퍼플루오로"는 플루오르로 대체되는 모든 활용가능한 수소를 가지는 화합물 또는 라디칼을 규정한다. 예를 들어, 퍼플루오로페닐은 1,2,3,4,5-펜타플루오로페닐을 나타내고, 퍼플루오로메틸은 1,1,1-트라이플루오로메틸을 나타내며, 퍼플루오로메톡시는 1,1,1-트라이플루오로메톡시를 나타낸다.
"플루오로-치환된 알킬(Fluoro-substituted alkyl)"은 하나, 일부 또는 모든 수소 원자가 플루오르에 의해 대체된 알킬기를 나타낸다.
"사이클로알킬(Cycloalkyl)"은 약 3 내지 12, 3 내지 10, 또는 3 내지 7개의 내향고리 탄소 원자를 함유하는 고리형 탄화수소기를 나타낸다. 사이클로알킬 기는 융합된, 가교된 및 스피로 고리 구조를 포함한다.
"내향고리(Endocyclic)"는 고리형 고리 구조의 일부를 포함하는 원자 또는 원자들의 기를 나타낸다.
"외향고리(Exocyclic)"는 부착되지만 고리형 고리 구조를 규정하지는 않는 원자 또는 원자들의 기를 나타낸다.
"고리형 알킬 에테르(Cyclic alkyl ether)"는 3 또는 4개의 내향고리 탄소 원자 및 1개의 내향고리 산소 또는 황 원자를 가지는 4 또는 5원 고리형 알킬 기 (예컨대 옥세탄, 티에탄, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로티오펜); 또는 1 또는 2개의 내향고리 산소 또는 황 원자를 가지는 6 내지 7원 고리형 알킬 기 (예컨대 테트라하이드로피란, 1,3-다이옥산, 1,4-다이옥산, 테트라하이드로티오피란, 1,3-다이티안, 1,4-다이티안, 1,4-옥사티안)를 나타낸다.
"알케닐(Alkenyl)"은 적어도 하나의 이중 결합을 가지는, 2 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 나타낸다. 알케닐 기의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 비닐, 프로페닐, 아이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 아이소부테닐, 부타다이에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 아이소펜테닐, 1,3-펜타다이에닐, 1,4-펜타다이에닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 1,3-헥사다이에닐, 1,4-헥사다이에닐, 1,5-헥사다이에닐, 2,4-헥사다이에닐, 또는 1,3,5-헥사트라이에닐을 포함한다. 알케닐 기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6개의 탄소를 가질 수 있다. 알케닐 기는 전형적으로 일가지만, 예컨대 알케닐 기가 두 개의 모이어티에 함께 연결될 때 이가일 수 있다.
"알케닐렌(Alkenylene)"은 적어도 두 개의 다른 기, 즉 이가 탄화수소 라디칼을 연결시키는, 상기에서 정의된 것과 같은 알케닐 기를 나타낸다. 알케닐렌에 연결된 두 개의 모이어티는 알케닐렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자들에 연결될 수 있다. 알케닐렌 기는 한정하는 것은 아니지만, 에테닐렌, 프로페닐렌, 아이소프로페닐렌, 부테닐렌, 아이소부테닐렌, 이차-부테닐렌, 펜테닐렌 및 헥세닐렌을 포함한다.
"알키닐(Alkynyl)"은 적어도 하나의 삼중 결합을 가지는, 2 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 나타낸다. 알키닐 기의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 아이소부티닐, 이차-부티닐, 부타다이이닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 아이소펜티닐, 1,3-펜타다이이닐, 1,4-펜타다이이닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 1,3-헥사다이이닐, 1,4-헥사다이이닐, 1,5-헥사다이이닐, 2,4-헥사다이이닐, 또는 1,3,5-헥사트라이이닐을 포함한다. 알키닐 기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6개의 탄소를 가질 수 있다. 알키닐 기는 전형적으로 일가지만, 예컨대 알키닐 기가 두 개의 모이어티에 함께 연결될 때 이가일 수 있다.
"알키닐렌(Alkynylene)"은 적어도 두 개의 다른 기, 즉 이가 탄화수소 라디칼을 연결시키는, 상기에서 정의된 것과 같은 알키닐 기를 나타낸다. 알키닐렌에 연결된 두 개의 모이어티는 알키닐렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자들에 연결될 수 있다. 알키닐렌 기는 한정하는 것은 아니지만, 에티닐렌, 프로피닐렌, 부티닐렌, 이차-부티닐렌, 펜티닐렌 및 헥시닐렌을 포함한다.
"사이클로알킬(Cycloalkyl)"은 3 내지 12개의 고리 원자를 함유하는, 또는 표시된 원자 수의, 포화된 또는 부분적으로 불포화된 단일고리형, 융합된 이중고리형 또는 가교된 다중고리형 고리 어셈블리를 나타낸다. 단일고리형 고리는, 예를 들면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 사이클로옥틸을 포함한다. 이중고리형 및 다중고리형 고리는 예를 들면, 노르보르난, 데카하이드로나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예를 들어, C3-8사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸 및 노르보르난을 포함한다.
"사이클로알킬렌(Cycloalkylene)"은 적어도 두 개의 다른 기, 즉 이가 탄화수소 라디칼을 연결시키는, 상기에서 정의된 것과 같은 사이클로알킬 기를 나타낸다. 사이클로알킬렌에 연결된 두 개의 모이어티는 사이클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자들에 연결될 수 있다. 사이클로알킬렌 기는 한정하는 것은 아니지만 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌 및 사이클로옥틸렌을 포함한다.
"헤테로사이클로알킬(Heterocycloalkyl)"은 3개의 고리 구성원 내지 약 20개의 고리 구성원을 가지는 및 1 내지 약 5개의 N, O 및 S와 같은 헤테로원자를 가지는 고리 시스템을 나타낸다. 추가의 헤테로원자, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, B, Al, Si 및 P가 또한 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한 예컨대 한정하는 것은 아니지만 -S(O)- 및 -S(O)2-와 같이 산화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로고리는, 한정하는 것은 아니지만 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 모르폴리노, 피롤리디닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 인돌리닐, 퀴누클리디닐 및 1,4-다이옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-8-일을 포함한다.
"헤테로사이클로알킬렌(Heterocycloalkylene)"은 적어도 두 개의 다른 기를 연결시키는, 상기에서 정의된 것과 같은 헤테로사이클로알킬기를 나타낸다. 헤테로사이클로알킬렌에 연결된 두 개의 모이어티는 헤테로사이클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자들에 연결될 수 있다.
"아릴(Aryl)"은 6 내지 16개의 고리 탄소 원자를 함유하는 단일고리형 또는 융합된 이중고리형, 삼중고리형 또는 더 큰, 방향족 고리 어셈블리를 나타낸다. 예를 들어, 아릴은 페닐, 벤질 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐일 수 있다. "아릴렌"은 아릴기로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다. 아릴기는 알킬, 알콕시, 아릴, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 아미노, 아미노-알킬, 트라이플루오로메틸, 알킬렌다이옥시 및 옥시-C2-C3-알킬렌으로부터 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 라디칼; 그것들은 모두 선택적으로 추가로, 예를 들면 상기에서 정의된 것과 같이 치환되며; 또는 1- 또는 2-나프틸; 또는 1- 또는 2-페난트레닐에 의해 단일-, 이중- 또는 삼중-치환될 수 있다. 알킬렌다이옥시는 예컨대 메틸렌다이옥시 또는 에틸렌다이옥시와 같이, 페닐의 두 개의 인접한 탄소 원자에 부착된 이가 치환체이다. 옥시-C2-C3-알킬렌은 또한 예컨대 옥시에틸렌 또는 옥시프로필렌과 같이, 페닐의 두 개의 인접한 탄소 원자에 부착된 이가 치환체이다. 옥시-C2-C3-알킬렌-페닐에 대한 실례는 2,3-다이하이드로벤조푸란-5-일이다.
아릴로서 바람직한 것은 나프틸, 페닐 또는 알콕시, 페닐, 할로겐, 알킬 또는 트라이플루오로메틸에 의해 단일- 또는 이중치환된 페닐, 특히 페닐 또는 알콕시, 할로겐 또는 트라이플루오로메틸에 의해 단일- 또는 이중치환된 페닐, 특히 페닐이다.
R로서 치환된 페닐 기의 실례는 예컨대 헤테로고리형 고리에서 선택적으로 치환된 4-클로로펜-1-일, 3,4-다이클로로펜-1-일, 4-메톡시펜-1-일, 4-메틸펜-1-일, 4-아미노메틸펜-1-일, 4-메톡시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-하이드록시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-하이드록시에틸-(메틸)-아미노메틸펜-1-일, 3-아미노메틸펜-1-일, 4-N-아세틸아미노메틸펜-1-일, 4-아미노펜-1-일, 3-아미노펜-1-일, 2-아미노펜-1-일, 4-페닐-펜-1-일, 4-(이미다졸-1-일)-페닐, 4-(이미다졸-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(모르폴린-1-일)-펜-1-일, 4-(모르폴린-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(2-메톡시에틸아미노메틸)-펜-1-일 및 4-(피롤리딘-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(티오페닐)-펜-1-일, 4-(3-티오페닐)-펜-1-일, 4-(4-메틸피페라진-1-일)-펜-1-일, 및 4-(피페리디닐)-페닐 및 4-(피리디닐)-페닐이다.
"아릴렌"은 적어도 두 개의 다른 기를 연결시키는, 상기에서 정의된 것과 같은 아릴기를 나타낸다. 아릴렌에 연결된 두 개의 모이어티는 아릴렌의 상이한 원자들에 연결된다. 아릴렌 기는 한정하는 것은 아니지만 페닐렌을 포함한다.
"아릴렌-옥시"는 아릴렌에 연결된 모이어티들 중 하나가 산소 원자를 통해 연결되어 있는, 상기에서 정의된 것과 같은 아릴렌 기를 나타낸다. 아릴렌-옥시 기는, 한정하는 것은 아니지만 페닐렌-옥시를 포함한다.
유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환체는 다르고 다음으로부터 선택된다: 0 내지 방향족 고리 시스템 상의 개방 원자가의 총 수의 범위의 수의, -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(O)2R', ,-NR'-C(O)NR"R"', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시, 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬; 여기서 R', R" 및 R"'는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 치환되지 않은 아릴 및 헤테로아릴, (치환되지 않은 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (치환되지 않은 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자들 상의 치환체들 중 두 개는 식 -T-C(O)-(CH2)q-U-의 치환체로 선택적으로 대체될 수 있고, 식에서 T 및 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH2- 또는 단일 결합이며, q는 0 내지 2의 정수이다. 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자들 상의 치환체들 중 두 개는 식 -A-(CH2)r-B-의 치환체로 선택적으로 대체될 수 있고, 식에서 A 및 B는 독립적으로 -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이며, r은 1 내지 3의 정수이다. 그렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합들 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자들 상의 치환체들 중 두 개는 선택적으로 식 -(CH2)s-X-(CH2)t-의 치환체로 선택적으로 대체될 수 있고, 식에서 s 및 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이며, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. -NR'- 및 -S(O)2NR'-에서 치환체 R'는 수소 또는 치환되지 않은 (C1-C6)알킬로부터 선택된다.
"헤테로아릴"은 5 내지 16개의 고리 원자를 함유하는 단일고리형 또는 융합된 이중고리형 또는 삼중고리형 방향족 고리 어셈블리를 나타내며, 고리 원자의 1 내지 4개는 각각 N, O 또는 S인 헤테로원자이다. 예를 들어, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 푸라닐, 피롤릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 또는 예컨대 알킬, 니트로 또는 할로겐에 의해 치환된, 특히 단일- 또는 이중-치환된 임의의 다른 라디칼을 포함한다. 피리딜은 2-, 3- 또는 4-피리딜, 유리하게는 2- 또는 3-피리딜을 나타낸다. 티에닐은 2- 또는 3-티에닐을 나타낸다. 퀴놀리닐은 바람직하게는 2-, 3- 또는 4-퀴놀리닐을 나타낸다. 아이소퀴놀리닐은 바람직하게는 1-, 3- 또는 4-아이소퀴놀리닐을 나타낸다. 벤조피라닐, 벤조티오피라닐은 바람직하게는 각각 3-벤조피라닐 또는 3-벤조티오피라닐을 나타낸다. 티아졸릴은 바람직하게는 2- 또는 4-티아졸릴을 나타내고, 가장 바람직하게는 4-티아졸릴을 나타낸다. 트라이아졸릴은 바람직하게는 1-, 2- 또는 5-(1,2,4-트라이아졸릴)이다. 테트라졸릴은 바람직하게는 5-테트라졸릴이다.
바람직하게는, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 퀴놀리닐, 피롤릴, 티아졸릴, 아이속사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 푸라닐, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 아이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 옥사졸릴, 인다졸릴, 또는 치환된, 특히 단일- 또는 이중-치환된 라디칼 중 어느 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬"은 1 내지 3개의 N, O 및 S와 같은 헤테로원자를 가지는 알킬 기를 나타낸다. 추가의 헤테로 원자, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, B, Al, Si 및 P를 포함하는 것들도 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한, 예컨대 한정하는 것은 아니지만 -S(O)- 및 -S(O)2-와 같이 산화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬은 에테르, 티오에테르, 알킬-아민 및 알킬-티올을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬렌"은 적어도 두 개의 다른 기를 연결시키는, 상기에서 정의된 것과 같인 헤테로알킬 기를 나타낸다. 헤테로알킬렌에 연결된 두 개의 모이어티는 헤테로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자들에 연결될 수 있다.
"친전자체"는 친핵체와 반응할 수 있는 친전자성 중심, 즉 전자를 찾는 중심을 가지는, 이온성일 수 있는, 이온 또는 원자 또는 원자 집단을 나타낸다. 친전자체 (또는 친전자성 시약)는 그것의 반응 파트너 (친핵체)에 대한 결합을, 그 반응 파트너로부터의 두 결합 전자를 수용함으로써 형성하는 시약이다.
"친핵체"는 친핵성 중심, 즉 친전자성 중심을 추구하고 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 가지는, 이온성일 수 있는, 이온 또는 원자 또는 원자 집단을 나타낸다. 친핵체 (또는 친핵성 시약)는 그것의 반응 파트너 (친핵체)에 대한 결합을, 두 결합 전자를 기증함으로써 형성하는 시약이다. "친핵성 기"는 반응성 기와 반응한 후의 친핵체를 나타낸다. 비 제한적인 실례는 아미노, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시 등을 포함한다.
"말레이미도"는 다음의 구조:
본 발명의 목적에 대하여, 단백질 및 폴리펩티드에서 발견되는 "자연적으로 발생하는 아미노산"은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 또는 L-발린이다. 단백질에서 발견되는 "비-자연적으로 발생하는 아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산으로서 인용된 것들 이외의 임의의 아미노산이다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 제한 없이, 자연적으로 발생하는 아미노산의 D 이성질체이다 (혼합물은 일부 자연적 및 일부 비-자연적 아미노산으로서 보다 정확하게 기술될 것이다). 다른 아미노산, 예컨대 4-하이드록시프롤린, 데스모신, 아이소데스모신, 5-하이드록시리신, 엡실론-N-메틸리신, 3-메틸히스티딘은 비록 자연적으로 발생하는 단백질에서 발견되지만, 본 발명의 목적에 대해서는 그것들이 일반적으로 mRNA의 리보솜성 번역 이외의 수단에 의해 도입되기 때문에 단백질에서 발견되는 비-자연적으로 발생하는 아미노산인 것으로 여겨진다.
중합체의 기하학적, 구조적 또는 전체적인 구조와 관련하여 "선형"은 단일 중합체 팔을 가지는 중합체를 나타낸다.
중합체의 기하학적, 구조적 또는 전체적인 구조와 관련하여 "분지형"은 개시제로부터 연장되는 2개 이상의 중합체 "팔"을 가진 중합체를 나타낸다. 개시제는 원자 전달 라디칼 중합반응 (ATRP) 반응에서 사용될 수 있다. 분지형 중합체는 2개의 중합체 사슬 (팔), 3개의 중합체 팔, 4개의 중합체 팔, 5개의 중합체 팔, 6개의 중합체 팔, 7개의 중합체 팔, 8개의 중합체 팔, 9개의 중합체 팔, 10개의 중합체 팔, 11개의 중합체 팔, 12개의 중합체 팔 또는 그 이상을 가질 수 있다. 각각의 중합체 팔은 중합체 개시 부위로부터 연장한다. 각각의 중합체 개시 부위는 단량체의 첨가에 의한 중합체 사슬의 성장에 대한 부위일 수 있다. 예를 들어 및 제한 없이, ATRP를 사용하여, 개시제 상의 각각의 중합체 개시 부위는 전형적으로 제1 구리 할로겐화물과 같은 전이 금속 화합물에 의해 촉매된 가역적인 산화환원 과정을 진행하는 유기 할로겐화물이다. 바람직하게, 할로겐화물은 브롬이다.
"약제학적으로 허용되는" 조성물 또는 "약제학적 조성물"은 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 약제학적으로 허용되는 부형제들을 포함하는 조성물을 나타낸다.
"약제학적으로 허용되는 부형제" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 발명의 조성물에 포함될 수 있고 환자에 대해 유의할만한 해로운 독물학적 효과를 유발하지 않으며 치료 용으로, 특히 인간에서의 용도에 대해 FDA에 의해 승인된 또는 승인 가능한 부형제를 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 비-제한적인 실례는 물, NaCl, 정상 식염수용액, 락테이트 첨가된 링거액, 정상 수크로오스, 정상 글루코오스 등을 포함한다.
"환자" 또는 "필요로 하는 대상"은 본원에 제공되는 약제학적 조성물의 투여에 의해 방지 또는 치료될 수 있는 상태로 고생하는 또는 증명된 살아있는 유기체를 나타낸다. 비-제한적 실례는 인간, 다른 포유류 및 다른 비-포유류 동물을 포함한다.
컨쥬게이트는 바람직하게는 분리된 형태로 제공된다. 분리된은 목표로 하는 종이 그것과 자연적으로 결합되는 또는 그것의 제조에 사용되지만 분리된 종과 함께 작용하는 것으로 의도된 다른 성분들, 예컨대 약제학적 부형제의 존재를 반드시 배제하지는 않는 오염물로부터 적어도 부분적으로 분리된 것을 의미한다. 바람직하게 컨쥬게이트는 조성물 중의 샘플에 (즉 몰 기준으로) 존재하는 우세한 거대분자 종이고 전형적으로 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50% (분자 기준으로)를 포함한다. 일반적으로, 분리된 컨쥬게이트는 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 80, 90, 95 또는 99% 이상을 포함한다. 가장 바람직하게, 컨쥬게이트는 필수 동질성으로 정제되어 (즉 오염 종이 종래의 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음), 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다. 컨쥬게이트는 동일한 중쇄 및 경쇄를 가지고 단백질 모이어티에 글리코실화의 편차 및 컨쥬게이트의 상이한 분자에 연결된 중합체 모이어티의 단량체의 수에 편차가 있을 수 있음에도 불구하고 동일한 종인 것으로 여겨진다.
"유효량"은 확인된 질환 또는 상태의 치료, 개선, 또는 예방에 유용한, 또는 검출 가능한 치료 또는 억제 효과를 나타내기 위한 컨쥬게이트된 기능성 제제 또는 약제학적 조성물의 양을 나타낸다. 효과는 치료 전에 기준선 측정과 관련하여 또는 치료된 집단과 대조 집단 사이의 결과에 통계학적으로 유의미한 차이를 측정함으로써 개별적인 환자에서 검출될 수 있다. 마찬가지로 유효한 양생법은, 질환의 적어도 하나의 신호 또는 증상을 감소, 억제 또는 지연시키기에 효과적인, 본원에 기술된 임의의 컨쥬게이션, 융합 단백질 또는 다른 제제의 양, 빈도 및 투여 경로의 조합을 의미한다.
물질의 "생물학적 반감기"는 물질이 유기체에 도입된 후 물질의 절반이 유기체로부터 제거되는 데 필요한 시간을 명시하는 약물동역학적 매개변수이다.
서열 동일성은 알고리즘, 예컨대 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI의 BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA를 사용하여, 디폴트 갭 매개변수를 사용하여 또는 검사에 의해, 및 최상의 배열에 의해 서열을 배열함으로써 (즉 비교창에 걸쳐 서열 유사성의 최고의 백분율을 초래함) 측정될 수 있다. 서열 동일성의 백분율은 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교창 위에서 비교하고, 동일한 잔기가 두 서열에서 발생하여 매치된 위치의 수를 얻게 되는 위치의 수를 측정하며, 매치된 위치의 수를 비교창의 위치의 총 수 (즉 창의 크기)로 나누고, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산된다.
만약 특이적 SEQ ID NO.가 전-길이 성숙한 단백질에 대해 제공된다면, 잔기들은 성숙한 단백질의 제1 잔기에 대해 1에서 출발하여 연속적으로 넘버링된다 (즉, 임의의 신호 펩티드의 잔기들은 고려하지 않음). SEQ ID NO.의 변이체 또는 단편들의 잔기는 SEQ ID NO.와 최대의 배열 및 동일한 번호를 배열된 잔기에 배정함으로써 넘버링된다.
용어 "단백질"은 가장 광범위한 의미로 둘 이상의 하위유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티도 모방물의 화합물을 나타내기 위해 사용된다. 하위유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, 하위유닛은 다른 결합, 예컨대 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 두 개의 아미노산을 함유해야 하고 단백질의 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한이 없어야 한다. 3개 이상의 아미노산의 펩티드는 펩티드 사슬이 짧다면 통상 올리고펩티드로 불린다. 만약 펩티드 사슬이 길다면, 펩티드는 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질로 불린다.
단백질의 비-제한적 실례는 다음을 포함한다: 효소, 사이토카인, 신경 영양인자, 항체, 펩티드, 호르몬, DNA-결합 단백질, 앱타머, 백신, 독소, 인터류킨-1 (IL-1 α), IL-1 β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32, IL-33, 콜로니 자극 인자-1 (CSF-1), 마크로파지 콜로니 자극 인자, 글루코세로브로시다제, 티로트로핀, 줄기세포 인자, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), EPO, 인터페론-알파 (IFN-α), 공통 인터페론-베타 (IFN-β), 인터페론- (IFN-), 인터페론-Ω (IFN-Ω), 트롬보포이에틴 (TPO), 안지오포이에틴-1 (Ang-1), Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 1 (ANGPTL1), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 2 (ANGPTL2), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 3 (ANGPTL3), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 4 (ANGPTL4), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 5 (ANGPTL5), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 6 (ANGPTL6), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 7 (ANGPTL7), 비트로넥틴, 혈관 내피 성장 안자 (VEGF), 안지오게닌, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 골형성원성 단백질-1, 골형성원성 단백질-2, 골형성원성 단백질-3, 골형성원성 단백질-4, 골형성원성 단백질-5, 골형성원성 단백질-6, 골형성원성 단백질-7, 골형성원성 단백질-8, 골형성원성 단백질-9, 골형성원성 단백질-10, 골형성원성 단백질-11, 골형성원성 단백질-12, 골형성원성 단백질-13, 골형성원성 단백질-14, 골형성원성 단백질-15, 골형성원성 단백질 수용체 IA, 골형성원성 단백질 수용체 IB, 골형성원성 단백질 수용체 II, 뇌 유도된 신경 영양인자, 카디오트로핀-1, 섬모 호중구성 인자, 섬모 호중구성 인자 수용체, 크립토, 크립틱, 사이토카인-유도된 호중구 화학주성 인자 1, 사이토킨-유도된 호중구, 화학주성 인자 2α, B형 간염 백신, C형 간염 백신, 드로트레코긴. 알파, 사이토킨-유도된 호중구 화학주성 인자 2β, 내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 내피 성장 인자 (EGF), 에피겐, 에피레굴린, 상피-유도된 호중구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 21, 섬유아세포 성장 인자 산성, 섬유아세포 성장 인자 염기성, 교질 세포주-유도된 호중구성 인자 수용체 알파.1, 교질 세포주-유도된 호중구성 인자 수용체, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 a, IgG, IgE, IgM, IgA, 및 IgD, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, DNAse, 페투인, 루틴화 호르몬, 알테플라제 (alteplase), 에스트로겐, 인슐린, 알부민, 리포단백질, 페토단백질, 트란스페린, 트롬보포이에틴, 유로키나제, 인테그린, 트롬빈, 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 Vila (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 인자 XIII (FXIII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF), ADAMTS 13 프로테아제, 성장 관련 단백질.베타., 성장 관련 단백질, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 간종양-유도된 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴 생성 세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 소마트로핀, 항혈우병 인자, 페가스파르가제, 오르토클론 OKT 3, 아데노신 탈아민효소, 알글루세라제, 이미글루세라제, 백혈병 억제 인자 수용체.알파., 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 뉴로포이에틴, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 온코스타틴 M (OSM), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유도된 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유도된 성장 인자 AA, 혈소판 유도된 성장 인자 AB, 혈소판 유도된 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유도된 성장 인자 BB, 혈소판 유도된 성장 인자 수용체.알파., 혈소판 유도된 성장 인자 수용체.베타., 전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기 세포 인자 (SCF), 줄기 세포 인자 수용체, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, 형질전환 성장 인자 α, 하이믹 (hymic) 간질 림포포이에틴 (TSLP), 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 유로키나제-형 플라스미노셀 활성화제 수용체, 포스포리파제-활성화 단백질 (PUP), 인슐린, 렉틴 리신, 프로락틴, 융모막 고나도트로핀, 낭포-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 렙틴, 엔브렐 (에타네르셉프트 (etanercept)).
일부 실시예에서, 단백질은 항체이다. 본원에서 사용되는 "항체"는, 제한 없이, 전 항체 및 제한 없이 Fab 또는 그것의 단일 사슬을 포함하여, 임의의 항원 결합 단편을 포함한다. 그러므로 용어 "항체"는 제한 없이, 항원에 결합하는 생물학적 활성을 가지는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 그런 것들의 실례는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그것들의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역 또는 그것들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. "항체"는 또한 단클론성 항체 및 다클론성 항체 둘 다를 포함한다.
항체의 실례는 제한 없이 다음을 포함한다: 인플릭시맙 (Infliximab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 세툭시맙 (Cetuximab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 팔리비주맙 (Palivizumab), 아바고보맙 (Abagovomab), 아브식시맙 (Abciximab), 악토크수맙 (Actoxumab), 아달리무맙 (Adalimumab), 아펠리모맙 (Afelimomab), 아푸투주맙 (Afutuzumab), 알라시주맙 (Alacizumab), 알라시주맙 페골 (Alacizumab pegol), ALD518, 알렘투주맙 (Alemtuzumab), 알리로쿠맙 (Alirocumab), 알렘투주맙 (Alemtuzumab), 알투모맙 (Altumomab), 아마툭시맙 (Amatuximab), 아나투모맙 마페나톡스 (Anatumomab mafenatox), 안루킨주맙 (Anrukinzumab), 아폴리주맙 (Apolizumab), 알시투모맙 (Arcitumomab), 아셀리주맙 (Aselizumab), 알티누맙 (Altinumab), 아틀리주맙 (Atlizumab), 아토롤리미우맙 (Atorolimiumab), 토실리주맙 (tocilizumab), 바피네우주맙 (Bapineuzumab), 바실릭시맙 (Basiliximab), 바비툭시맙 (Bavituximab), 벡투모맙 (Bectumomab), 벨리무맙 (Belimumab), 벤랄리주맙 (Benralizumab), 베르틸리무맙 (Bertilimumab), 베실레소맙 (Besilesomab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 베즐로톡수맙 (Bezlotoxumab), 비시로맙 (Biciromab), 비바투주맙 (Bivatuzumab), 비바투주맙 메르탄신 (Bivatuzumab mertansine), 블리나투모맙 (Blinatumomab), 블로소주맙 (Blosozumab), 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin), 브리아키누맙 (Briakinumab), 브로달루맙 (Brodalumab), 카나키누맙 (Canakinumab), 칸투주맙 메르탄신 (Cantuzumab mertansine), 칸투주맙 메르탄신 (Cantuzumab mertansine), 카플라시주맙 (Caplacizumab), 카프로맙 펜데티드 (Capromab pendetide), 카를루맙 (Carlumab), 카투막소맙 (Catumaxomab), CC49, 세델리주맙 (Cedelizumab), 세르톨리주맙 페골 (Certolizumab pegol), 세툭시맙 (Cetuximab), 시타투주맙 보가톡스 (Citatuzumab bogatox), 식수투무맙 (Cixutumumab), 클라자키주맙 (Clazakizumab), 클레놀릭시맙 (Clenoliximab), 클리바투주맙 테트락세탄 (Clivatuzumab tetraxetan), 코나투무맙 (Conatumumab), 크레네주맙 (Crenezumab), CR6261, 다세투주맙 (Dacetuzumab), 다클리주맙 (Daclizumab), 달로투주맙 (Dalotuzumab), 다라투무맙 (Daratumumab), 뎀시주맙 (Demcizumab), 데노수맙 (Denosumab), 데투모맙 (Detumomab), 도를리모맙 아리톡스 (Dorlimomab aritox), 드로지투맙 (Drozitumab), 둘리고투맙 (Duligotumab), 두피루맙 (Dupilumab), 에크로멕시맙 (Ecromeximab), 에쿨리주맙 (Eculizumab), 에도바코맙 (Edobacomab), 에드레콜로맙 (Edrecolomab), 에팔리주맙 (Efalizumab), 에푼구맙 (Efungumab), 엘로투주맙 (Elotuzumab), 엘실리모맙 (Elsilimomab), 에나바투주맙 (Enavatuzumab), 엔리모맙 페골 (Enlimomab pegol), 에노키주맙 (Enokizumab), 에노키주맙 (Enokizumab), 에노티쿠맙 (Enoticumab), 에노티쿠맙 (Enoticumab), 엔시툭시맙 (Ensituximab), 에피투모맙 시툭세탄 (Epitumomab cituxetan), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 에를리주맙 (Erlizumab), 에르투막소맙 (Ertumaxomab), 에타라시주맙 (Etaracizumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 엑스비비루맙 (Exbivirumab), 엑스비비루맙 (Exbivirumab), 파놀레소맙 (Fanolesomab), 파랄리모맙 (Faralimomab), 파를레투주맙 (Farletuzumab), 파시누맙 (Fasinumab), FBTA05, 펠비주맙 (Felvizumab), 페자키누맙 (Fezakinumab), 피클라투주맙 (Ficlatuzumab), 피지투무맙 (Figitumumab), 플란보투맙 (Flanvotumab), 폰톨리주맙 (Fontolizumab), 포랄루맙 (Foralumab), 포라비루맙 (Foravirumab), 프레솔리무맙 (Fresolimumab), 풀라누맙 (Fulranumab), 푸툭시맙 (Futuximab), 갈릭시맙 (Galiximab), 가니투맙 (Ganitumab), 간테네루맙 (Gantenerumab), 가빌리모맙 (Gavilimomab), 겜투주맙 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin), 게보키주맙 (Gevokizumab), 기렌툭시맙 (Girentuximab), 글렘바투무맙 베도틴 (Glembatumumab vedotin), 골리무맙 (Golimumab), 고밀릭시맙 (Gomiliximab), GS6624, 이발리주맙 (Ibalizumab), 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab tiuxetan), 이크루쿠맙 (Icrucumab), 이고보맙 (Igovomab), 임시로맙 (Imciromab), 임가투주맙 (Imgatuzumab), 인클라쿠맙 (Inclacumab), 인다툭시맙 라브탄신 (Indatuximab ravtansine), 인플릭시맙 (Infliximab), 인테투무맙 (Intetumumab), 이놀리모맙 (Inolimomab), 이노투주맙 오조가미신 (Inotuzumab ozogamicin), 이필리무맙 (Ipilimumab), 이라투무맙 (Iratumumab), 이톨리주맙 ( Itolizumab), 익세키주맙 (Ixekizumab), 켈릭시맙 (Keliximab), 라베투주맙 (Labetuzumab), 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 레말레소맙 (Lemalesomab), 레르델리무맙 (Lerdelimumab), 렉사투무맙 (Lexatumumab), 리비비루맙 (Libivirumab), 리겔리주맙 (Ligelizumab), 린투주맙 (Lintuzumab), 리릴루맙 (Lirilumab), 로르보투주맙 메르탄신 (Lorvotuzumab mertansine), 루카투무맙 (Lucatumumab), 루밀릭시맙 (Lumiliximab), 마파투무맙 (Mapatumumab), 마슬리모맙 (Maslimomab), 마브릴리무맙 (Mavrilimumab), 마투주맙 (Matuzumab), 메폴리주맙 (Mepolizumab), 메텔리무맙 (Metelimumab), 밀라투주맙 (Milatuzumab), 민레투모맙 (Minretumomab), 미투모맙 (Mitumomab), 모가물리주맙 (Mogamulizumab), 모롤리무맙 (Morolimumab), 모타비주맙 (Motavizumab), 모크세투모맙 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox), 무로모납-CD3 (Muromonab-CD3), 나콜로맙 타페나톡스 (Nacolomab tafenatox), 나밀루맙 (Namilumab), 납투모맙 에스타페나톡스 (Naptumomab estafenatox), 나르나투맙 (Narnatumab), 나탈리주맙 (Natalizumab), 네바쿠맙 (Nebacumab), 네시투무맙 (Necitumumab), 네렐리모맙 (Nerelimomab), 네스바쿠맙 (Nesvacumab), 니모투주맙 (Nimotuzumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 노페투모맙 메르펜탄 (Nofetumomab merpentan), 오카라투주맙 (Ocaratuzumab), 오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 오둘리모맙 (Odulimomab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 올라라투맙 (Olaratumab), 올로키주맙 (Olokizumab), 오말리주맙 (Omalizumab), 오나르투주맙 (Onartuzumab), 오포르투주맙 모나톡스 (Oportuzumab monatox), 오레고보맙 (Oregovomab), 오르티쿠맙 (Orticumab), 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 오크셀루맙 (Oxelumab), 오자네주맙 (Ozanezumab), 오조랄리주맙 (Ozoralizumab), 파기박시맙 (Pagibaximab), 팔리비주맙 (Palivizumab), 파니투무맙 (Panitumumab), 파노바쿠맙 (Panobacumab), 파르사투주맙 (Parsatuzumab), 파스콜리주맙 (Pascolizumab), 파테클리주맙 (Pateclizumab), 파트리투맙 (Patritumab), 펨투모맙 (Pemtumomab), 페라키주맙 (Perakizumab), 페르투주맙 (Pertuzumab), 펙셀리주맙 (Pexelizumab), 피딜리주맙 (Pidilizumab), 핀투모맙 (Pintumomab), 플라쿨루맙 (Placulumab), 포네주맙 (Ponezumab), 프릴릭시맙 (Priliximab), 프리투무맙 (Pritumumab), PRO140, 퀼리주맙 (Quilizumab), 라코투모맙 (Racotumomab), 라드레투맙 (Radretumab), 라피비루맙 (Rafivirumab), 라무시루맙 (Ramucirumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 락시바쿠맙 (Raxibacumab), 레가비루맙 (Regavirumab), 레슬리주맙 (Reslizumab), 릴로투무맙 (Rilotumumab), 리툭시맙 (Rituximab), 로바투무맙 (Robatumumab), 롤레두맙 (Roledumab), 로모소주맙 (Romosozumab), 론탈리주맙 (Rontalizumab), 로벨리주맙 (Rovelizumab), 루플리주맙 (Ruplizumab), 사말리주맙 (Samalizumab), 사릴루맙 (Sarilumab), 사투모맙 펜데티드 (Satumomab pendetide), 세쿠키누맙 (Secukinumab), 세비루맙 (Sevirumab), 시브로투주맙 (Sibrotuzumab), 시팔리무맙 (Sifalimumab), 실툭시맙 (Siltuximab), 심투주맙 (Simtuzumab), 시플리주맙 (Siplizumab), 시루쿠맙 (Sirukumab), 솔라네주맙 (Solanezumab), 솔리토맙 (Solitomab), 소네프시주맙 (Sonepcizumab), 손투주맙 (Sontuzumab), 스타물루맙 (Stamulumab), 술레소맙 (Sulesomab), 수비주맙 (Suvizumab), 타발루맙 (Tabalumab), 타카투주맙 테트락세탄 (Tacatuzumab tetraxetan), 타도시주맙 (Tadocizumab), 탈리주맙 (Talizumab), 타네주맙 (Tanezumab), 타플리투모맙 팝톡스 (Taplitumomab paptox), 테피바주맙 (Tefibazumab), 텔리모맙 아리톡스 (Telimomab aritox), 테나투모맙 (Tenatumomab), 테피바주맙 (Tefibazumab), 텔리모맙 아리톡스 (Telimomab aritox), 테나투모맙 (Tenatumomab), 테넬릭시맙 (Teneliximab), 테플리주맙 (Teplizumab), 테프로투무맙 (Teprotumumab), TGN1412, 트레멜리무맙 (tremelimumab), 티실리무맙 (Ticilimumab), 틸드라키주맙 (Tildrakizumab), 티가투주맙 (Tigatuzumab), TNX-650, 토실리주맙 (Tocilizumab), 토랄리주맙 (Toralizumab), 토시투모맙 (Tositumomab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), TRBS07, 트레갈리주맙 (Tregalizumab), 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 투코투주맙 셀모류킨 (Tucotuzumab celmoleukin), 투비루맙 (Tuvirumab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 우렐루맙 (Urelumab), 우르톡사주맙 (Urtoxazumab), 우스테키누맙 (Ustekinumab), 바팔릭시맙 (Vapaliximab), 바텔리주맙 (Vatelizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 벨투주맙 (Veltuzumab), 베팔리모맙 (Vepalimomab), 베센쿠맙 (Vesencumab), 비실리주맙 (Visilizumab), 볼로식시맙 (Volociximab), 보르세투주맙 마포도틴 (Vorsetuzumab mafodotin), 보투무맙 (Votumumab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 자놀리무맙 (Zanolimumab), 자툭시맙 (Zatuximab), 지랄리무맙 (Ziralimumab) 및 졸리모맙 아리톡스 (Zolimomab aritox). 상기의 각각에 대해, 본 발명은 전체 항체로서뿐 아니라 Fab의 사용을 고려한다.
III.
바이오스캐빈저
컨쥬게이트
및 구성물
인간 혈청으로부터 분리된 BuChE는 분자량이 340 kDa인 원형의, 사량체 분자이다. Haupt H, Heide K, Zwisler O and Schwick HG. 1966. Isolierun und Physikalischchemiscle Charakterisierung der Cholinesterase aus Humanserum. Blut. 14:65-75. 효소의 4개의 하위유닛의 각각은 574 아미노산 길이이다. 각각의 사슬은 9개의 Asn-연결된 탄수화물 사슬을 가진다. Lockridge O, Bartels CF, Vaughan TA, Wong CK, Norton SE, Johnson LL. 1987. Complete amino acid sequence of human serum cholinesterase. J Biol Chem. 262:549-557.
BuChE의 재조합 버전을 제조하기 위하여 다양한 시도가 이루어졌다. 그러나, 혈장에서 관찰된 지배적인 사량체 형태가 결국 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 단백질의 바로 미미한 성분인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 rhBuChE의 발현은 단백질들의 혼합물: 이량체 (안정하지 않음) (50 내지 55%), 단량체 (15 내지 40%) 및 상대적으로 적은 백분율의 사량체 (10 내지 30%)를 생성한다. Blong RM, Bedows E, Lockridge O. 1997. Tetramerization domain of human butyrylcholinesterase is at the C-terminus. Biochem J. 327:747-757.
hBuChE의 C-말단은 사량체화에 기여하는 것으로 확인되었다. C-말단이 결실된 단백질의 발현은 단량체의 배타적 생성을 초래한다. 또한, Blong 등은 C-말단의 50개까지의 아미노산이 효소 활성을 잃지 않으면서 제거될 수 있다고 보고하였다 (상기에서 주지된 것과 같이 단지 단량체 형태만이 검출 가능하다). 그러나 C-말단으로부터 51 아미노산의 결실은 세포에서 유지되는 (즉 분비되지 않음) 단백질의 비활성 버전을 초래한다.
인간 부티릴콜린에스테라제 (P06276.1)의 602 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1에 제시된다. 처음 28개의 아미노산 (MHSKVTIICIRFLFWFLLLCMLIGKSHT (SEQ ID NO: 27))은 hBuChE의 천연 리더 서열을 구성한다. 그러므로, 성숙한 효소는 서열 EDDIII (SEQ ID NO: 28)로 시작한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 부티릴콜린에스테라제 (BuChE) 효소가 제공된다. 바람직하게, 부티릴콜린에스테라제 효소는 인간 효소 (hBuChE)이다. 보다 바람직하게, 효소는 재조합 인간 효소 (rhBuChE)이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 하나 이상의 결실 및 또는 아미노산 치환을 가진다. 바람직하게, 성숙체의 N-말단으로부터 출발하여 위치 66에 있는 시스테인 잔기는 일부 다른 천연 또는 비천연 아미노산으로 교체된다. 보다 바람직하게, C66은 티로신 또는 아이소류신으로 전환된다. 가장 바람직하게, C66은 티로신으로 전환된다 (C66Y).
본 발명의 한 측면에 따르면, rhBuChE의 C-말단 결실이 제공된다. 50보다 많지 않은 아미노산이 rhBuChE의 C-말단으로부터 결실되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 50 아미노산이 rhBuChE의 C-말단으로부터 결실되는 것은 구성물 rhBuChE524를 초래한다 (524 N-말단 보유된 아미노산을 참조함). 보다 바람직하게는, 40 아미노산이 rhBuChE의 C-말단으로부터 결실되어 구성물 rhBuChE534가 초래된다. 바람직하게, 결실 돌연변이는 상기 기술된 C66 돌연변이 중 하나 이상을 가진다. 보다 바람직하게, 결실 돌연변이는 C66Y 돌연변이를 가진다. 본 발명의 가장 바람직한 측면으로, C66Y 돌연변이를 가진 524 결실의 단백질 서열 (rhBChE524 (C66Y))은 SEQ ID NO. 11에 제시된다. 본 발명의 다른 가장 바람직한 측면으로, C66Y 돌연변이를 가진 534 결실의 단백질 서열 (rhBChE534 (C66Y))은 SEQ ID NO. 10에 제시된다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 중합체가 BuChE에 컨쥬게이션될 수 있다. 바람직하게, 중합체는 말레이미드를 사용하여 Cys 잔기에 컨쥬게이트된다. Cys 잔기는 성숙해짐에 따라 발생하는 시스테인일 수 있다. 본 발명의 바람직한 다른 실시예에서, 시스테인 잔기는 rhBuChE C-말단 결실 중 하나에 첨가되어서 단백질이 중합체에 컨쥬게이트될 수 있다. 바람직하게, 시스테인은 결실된 rhBuChE의 C-말단에 첨가된다. 또 다른 보다 바람직한 실시예에서, 시스테인은 GGC 또는 GGGC (SEQ ID NO:20) 펩티드를 통해 C-말단에 첨가된다. 보다 바람직한 실시예들 중 하나에서, 펩티드 GGGC (SEQ ID NO: 20)는 rhBuChE524 (C66Y) 효소의 C-말단에 첨가된다 (SEQ ID NO. 12 참조). 다른 보다 바람직한 실시예에서, 펩티드 GGC는 rhBuChE534 (C66Y)의 C-말단에 첨가된다 (SEQ ID NO. 13 참조).
본 발명의 한 측면에 따르면, 부티릴콜린에스테라제 효소 세그먼트와 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 세그먼트를 가지는 부티릴콜린에스테라제 융합 단백질이 제공된다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 부티릴콜린에스테라제 단백질 세그먼트는 비-부티릴콜린에스테라제 세그먼트에 대해 N-말단이다. 바람직하게, 비-부티릴콜린에스테라제 단백질은 면역글로불린 (Ig) 도메인이다. 보다 바람직하게, Ig 도메인은 IgG-Fc, IgG-CH 및 IgG-CL로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게, Ig 도메인은 IgG1 (SEQ ID NO. 8)으로부터 유래된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, IgG1 Fc 서열은 다양한 방법으로, 예를 들면 상보물 결합 및 이펙터 기능을 조절하기 위해 변형될 수 있다. 선택적으로, IgG1 Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키기 위해 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 선택적으로, 돌연변이는 다음의 아미노산 위치 중 하나 이상에 대한 것이다 (EU 넘버링): E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331. 바람직하게 이런 관점에서, IgG1 Fc는 다음의 치환을 가진다: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S. Fc 도메인의 C-말단에 있는 리신 잔기는 때때로 번역후 프로세싱에 의해 결실될 수 있다. 그러므로, Fc 도메인의 SEQ ID가 리신에서 종결될 때, 리신은 생략될 수 있거나 생략되지 않을 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, Fc 영역의 변형은 중합체 컨쥬게이션의 부위를 허용하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 중합체 컨쥬게이션의 부위일 수 있는 시스테인 잔기가 첨가될 수 있다. 바람직하게, Fc 도메인은 Q347C 및 L443C로 구성되는 군으로부터 선택된 돌연변이를 가진다. 보다 바람직하게, 돌연변이는 Q347C이다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 융합 단백질은 바람직하게 부티릴콜린에스테라제 효소와 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 사이에 폴리펩티드 링커를 함유한다. 바람직하게, 링커는 G, GG, GGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23), 및 GGGES (SEQ ID NO: 24), 및 전술한 것들의 올리고머이다. 보다 바람직하게, 링커는 GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21) 및 GGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 25)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 융합 단백질의 부티릴콜린에스테라제 효소는 융합의 N-말단에서 바람직한 C66Y 돌연변이 (rhBuChE524 (C66Y) 또는 rhBuChE534 (C66Y))와 이어서 링커 및 C-말단에 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 서열을 가지는 상기 기술된 C-말단 절단물 중 하나이다. 본 발명의 보다 바람직한 측면으로, 융합 단백질은, N-말단에서 출발하여, 링커 GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)에 융합된, C66Y 돌연변이를 가지는, 상기 기술된 524 또는 534 C-말단 절단물과 이어서 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 가지는 IgG1 Fc 서열로 구성된다. 발명의 가장 바람직한 실시예에서, 융합 단백질의 부티릴콜린에스테라제 절단물은 rhBuChE534 (C66Y)이다. 이 구성물의 단백질 서열은 SEQ ID NO. 15에 제시된다. 본 발명의 다른 고도로 바람직한 실시예에서, 융합물의 Fc 영역은 Q347C 또는 L443C 중 어느 하나의 돌연변이를 가진다. 가장 바람직하게, 융합물의 Fc 영역은 Q347C 돌연변이 및 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 가진다. 이 바람직한 실시예의 단백질 서열은 SEQ ID NO. 2로 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 중합체에 공유 결합된, 촉매적 OP 바이오스캐빈저 또는 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 중 하나인 OP 바이오스캐빈저를 가지는 단백질-중합체 컨쥬게이트가 제공된다. 바람직하게, 중합체는 양성이온성 중합체이고, 하나 이상의 단량체 유닛을 가지며, 단량체 유닛의 적어도 하나는 양성이온을 가진다. 촉매적 OP 바이오스캐빈저는 전형적으로 아릴다이알킬포스파타제, 오가노포스페이트 가수분해효소 (OPH), 카르복실에스테라제, 트라이에스테라제, 포스포트라이에스테라제, 아릴에스테라제, 파라옥소나제 (PON), 오가노포스페이트 산 탈수효소 및 다이아이소프로필플루오로포스파타제 (DFPase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소이다.
본 발명의 한 측면으로, OP 바이오스캐빈저는 화학양론적 OP 바이오스캐빈저이다. 바람직하게, 화학양론적 OP 바이오스캐빈저는 아세틸콜린에스테라제 (AChE) 및 부티릴콜린에스테라제로 구성되는 군으로부터 선택된 콜린에스테라제이다. 바람직하게, 콜린에스테라제는 BuChE이다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 부티릴콜린에스테라제를 포함하여 콜린에스테라제는 공지된 기법을 따라 혈액의 혈청으로부터 정제될 수 있다. 그러므로, 인간에게 투여하기 위해 본 발명의 측면에 따르는 컨쥬게이트를 제조하는 것이 바람직하다면, 인간 혈액 혈청이 콜린에스테라제의 공급원으로서 사용될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 다른 측면에 따라, 콜린에스테라제, 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저와 관련된 다양한 효소들이 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 콜린에스테라제 (또는 촉매적 OP 바이오스캐빈저와 관련된 효소들)의 제조는 (i) 유전자 엔지니어링에 의한 재조합 DNA의 제조, (ii) 예를 들면, 제한 없이 트랜스펙션, 전기천공 또는 미세주입에 의해 원핵 또는 진핵 세포 안으로의 재조합 DNA의 도입, (iii) 상기 형질전환된 세포의 배양, (iv) 단백질의, 예컨대 구성적으로 또는 유도된 발현, 및 (v) 예를 들면 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포의 수확에 의한, (vi) 정제된 단백질을 얻기 위한 단백질의 분리를 위해 기술분야에 공지된 모든 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 측면으로, 단백질은 약물학적으로 허용되는 단백질 분자를 제조하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서의 발현에 의해 제조된다. 진핵 세포의 실례는 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip, 및 HepG2이다.
또 다른 측면으로, 광범위한 벡터가 단백질의 제조를 위해 사용되고 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵세포 발현을 위한 벡터의 실례는 플라스미드, 예컨대, 및 제한 없이, 프리셋 (preset), 펫 (pet) 및 패드 (pad)를 포함하고, 이때 원핵세포 발현 벡터에 사용된 프로모터는 하나 이상의, 및 제한 없이, lac, trc, trp, recA, 또는 araBAD를 포함한다. 진핵세포 발현을 위한 벡터의 실례는: (i) 효모에서의 발현을 위해, 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 AOX1, GAP, GAL1, 또는 AUG1을 사용하는 벡터, 예컨대, 및 제한 없이 pAO, pPIC, pYES, 또는 pMET; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위해, 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, 또는 polh를 사용하는 벡터, 예컨대 및 제한 없이 pMT, pAc5, pIB, pMIB, 또는 pBAC, 및 (iii) 포유류 세포에서의 발현을 위해, 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 베타-악틴을 사용하는 벡터, 예컨대 및 제한 없이 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, 또는 pBPV, 및 한 측면으로 바이러스 시스템, 예컨대 및 제한 없이 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유도된 벡터를 포함한다.
기술분야에 공지된 BuChE에 대한 분석에서, BuChE는 아세틸티오콜린 (ATCh) - 효소의 천연 기질의 황 유사체 -의 가수분해를 효과적으로 촉매한다. 다른 티올콜린 기질, 이를테면 S-부티릴티오콜린 (BTCH) 요오드화물이 사용될 수 있다. 가수분해시, 이 기질 유사체는 아세테이트와 티오콜린을 생성한다. 티오콜린은 고도로 반응성인 다이티오비스니트로-벤조에이트 (DTNB) 이온의 존재하에 황색을 생성하는데, 그것은 가시적이고 405 nm에서의 분광학적 흡수에 의해 정량적으로 모니터링될 수 있다. 그런 기법은 모두 참조로 포함되는 다음 참조문헌에서 기술된다: G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres, and R. M. Featherstone, "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity," Biochemical Pharmacology, vol. 7, no. 2, pp. 88-95, 1961; M. A. Gordon, D. E. Carpenter, H. W. Barrett, and I. B. Wilson, "Determination of the normality of cholinesterase solutions," Analytical Biochemistry, vol. 85, no. 2, pp. 519-527, 1978; 및 V. Gorun, I. Proinov, V. Baltescu, G. Balaban, and O. Barzu, "Modified Ellman procedure for assay of cholinesterases in crude enzymatic preparations," Analytical Biochemistry, vol. 86, no. 1, pp. 324-326, 1978.
본 발명의 한 측면에 따르면, hBuChE의 내인성 리더 펩티드가 단백질의 재조합 발현에 사용될 수 있다. 그러나, 보다 바람직하게는, 리더 펩티드는 단백질 발현 수준을 최대화하기 위해 선택되어야 한다. 바람직한 실시예에서, CTLA4 리더가 사용된다. 가장 바람직하게, SEQ ID NO. 18에 제시된 리더 펩티드가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 양성이온성 중합체는 포스포릴콜린 기를 가지는 단량체들로 형성된다. 바람직하게 단량체는 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트이다. 보다 바람직하게, 단량체는 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸) 포스페이트 (HEMA-PC)이다.
바이오스캐빈저에 컨쥬게이트된 중합체는 바람직하게 적어도 2개의 중합체 팔, 보다 바람직하게는 3개 이상의 팔을 가진다. 일부 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 가진다. 보다 바람직하게 중합체는 3, 6 또는 9개의 팔을 가진다. 가장 바람직하게, 중합체는 9개의 팔을 가진다. 바람직하게, 중합체 피크 분자량은 300,000 내지 1,750,000 Da이다. 보다 바람직하게, 중합체 피크 분자량은 500,000 내지 1,000,000 Da이다. 보다 더 바람직하게, 중합체는 600,000 내지 800,000 Da의 피크 분자량을 가진다. 다르게 명시되지 않는 한, 분지형 중합체의 분자량은 모든 팔의 응집체 분자량을 나타낸다.
본 발명의 한 측면에 따르는 컨쥬게이트 중합체에 대해 사용될 수 있는, 항체를 포함하여, 단백질 상의 친핵성 기는, 한정하는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예컨대 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예컨대 시스테인, 및 (iv) 단백질이 글리코실화되는 당 하이드록실 또는 아미노기. 아민, 티올 및 하이드록실 기는 친핵성이며 (i) NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할로겐화물과 같은 활성 에스테르; (ii) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할로겐화물; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기를 포함하여 중합체에 부착된 링커 모이어티 및 링커 시약에서 친전자성 기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있다. 항체를 포함하여 많은 단백질이 컨쥬게이션에 잠재적으로 사용될 수 있는 시스테인 티올기를 가진다. 바람직하게, 시스테인 잔기는 재조합 DNA 기술에 의해 컨쥬게이션에 첨가된다. 많은 시스테인 잔기가 환원성 사슬내 이황화물, 즉 시스테인 가교의 형태로 존재한다. 이황화물 형태의 시스테인 잔기는 일반적으로 말레이미드와 같은 시약과의 반응에 활용될 수 없다. 시스테인 잔기는 또한 유리 (free) 상태이거나 쌍을 이루지 않을 수 있다. 그러나, 유리 시스테인 잔기는 빈번하게 다양한 배지에서 하나 이상의 시약에 의해 "뚜껑이 덮인" 것으로 발견되고 또한 컨쥬게이션에 이용할 수 없다. 시스테인 잔기는 DTT (다이티오트레이톨) 또는 트라이카르보닐에틸포스핀 (TCEP)과 같은 환원제로의 처리에 의해 말레이미드와 같은 링커 시약과의 컨쥬게이션에 대해 반응성으로 만들어질 수 있어서, 단백질이 전체적으로 또는 부분적으로 환원된다. 그러므로, 각각의 시스테인 가교는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 유리 시스테인의 경우에, 하나의 티올 친핵체가 환원에 의해 형성된다.
사용된 조건에 따라, TCEP 또는 DTT에 의한 환원은 활성의 부수적인 손실이 따르는 적절한 단백질 접힘의 손실을 초래할 수 있다. 그러나, 활성은 적절한 조건하에서 단백질 재접힘을 허용함으로써 회복될 수 있다.
추가의 친핵성 기가 아민의 티올로의 전환을 초래하는 리신 잔기의 변형을 통해, 예컨대 리신 잔기와 2-이미노티올란 (Traut 시약)과의 반응에 의해 항체에 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 단백질에 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 시스테인 잔기의 도입에 의해 (예컨대 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체를 제조함으로써) 도입될 수 있다.
발명의 바람직한 측면들에 따르면, SEQ ID NO. 2의 그것과 중합체에 대한 컨쥬게이션을 위한 Cys 잔기에 상응하는 부티릴콜린에스테라제 융합은 아미노산 672에서의 그것이다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질이 효과적인 양생법으로 그것을 필요로 하는 환자에게 투여되는, OP 중독의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 예방과 관련하면, 일반 대중으로부터 무작위로 선택된 개인들의 대조 집단보다 통계학적으로 유의미하게 더 높은 빈도로 OP 화합물 (OP 살충제 또는 OP 신경 작용제 중 어느 하나)에 노출될 또는 노출될 수 있는 대상은 본 발명을 필요로 하는 상태일 것이다. 예를 들어, 전쟁터 또는 범죄의 맥락에서 OP 신경 작용제에 노출될 수밖에 없는 병사 또는 법 집행 사무관은 본 발명을 필요로 할 것이다. 유사하게, 농작물에 OP 살충제를 살포하는 데 참여한 작업자들은 살충제 또는 신경 작용제의 사고로 인한 누출을 취급하는 데 책임이 있는 작업자가 그런 것처럼 본 발명을 필요로 할 것이다. 비록 보호용 의류 및 가스 마스크가 노출을 방지하기 위해 이용될 수 있어야 하지만, 그런 보호용 수단들이 보호를 제공하지 못할 수 있다. 그런 실패의 경우에, 본 발명의 예방 방법이 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면으로, 컨쥬게이트 또는 융합 단백질은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 병변내 투여 또는 피내 투여에 의해 투여된다. 바람직하게, 투여는 근육내 투여에 의한 것이다.
본 발명의 다른 측면으로, OP 중독에 대해 장기간 예방을 실시하는 방법이 제공되는데, 방법에서 하나 이상의 단량체 유닛을 가지고 적어도 하나의 단량체는 양성이온성 기를 가지는 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 가지는 컨쥬게이트가 OP 화합물에 대한 예상된 노출 전 적어도 7일 전에 투여된다. 달리 표현하면 예방적으로 투여된 그런 컨쥬게이트는 OP 중독에 대한 가능한 노출에 대해 적어도 7일 동안 유효하다.
본 발명의 바람직한 측면으로, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 14일 전에 투여된다. 보다 바람직하게, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 21일 전에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 30일 전에 투여된다. 또는 다른 방법으로, 컨쥬게이트는 OP에 대한 가능한 노출에 대해 적어도 14, 21 또는 30일 동안 보호를 제공하는 데 효과적이다.
본 발명의 다른 측면으로, 하나 이상의 단량체 유닛을 가지고 적어도 하나의 단량체는 양성이온성 기를 가지는 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 가지는 컨쥬게이트가 OP 화합물에 대한 예상된 노출 전 적어도 12시간 전에 그것을 필요로 하는 대상에게 투여되는, OP 중독에 대한 신속한 예방을 이루기 위한 방법이 제공된다. 보다 바람직하게, 컨쥬게이트는 OP 화합물에 대한 예상된 노출 전 적어도 24시간 전에 투여된다. 달리 표현하면, 컨쥬게이트는 적어도 12 또는 24시간 동안 보호를 제공하는 데 효과적으로 유지된다.
발명의 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해 적응된 약제학적 조성물은 캡슐과 같은 구별되는 단위로서, 용액, 시럽 현탁액 (수성 또는 비-수성 액체 중에; 또는 섭취 가능한 형태 또는 휩 (whip)으로서; 또는 에멀션으로서)으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐에 적합한 부형제는 락토오스, 옥수수 전분 또는 그것의 유도체, 스테아르산 또는 그것의 염을 포함한다. 연질 젤라틴 캡슐과 사용하기에 적합한 부형제는 예를 들면 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함한다. 용액 및 시럽의 제조를 위해, 사용될 수 있는 부형제는 예를 들면 물, 폴리올 및 당을 포함한다. 현탁액 오일 (예컨대 식물성 오일)의 제제는 수-중-유 또는 오일 중의 물 현탁액을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
담체가 고체인 비강 투여용으로 적응된 약제학적 조성물은 입자 크기가 예를 들어 20 내지 500 마이크론의 범위인 조악한 분말을 포함하고, 그것은 스너프 (snuff)가 취해지는 방식으로, 즉 코 가까이에서 유지된 분말의 용기로부터 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다. 담체가 액체이고, 비강 스프레이 또는 비강 점적으로서 투여하기에 적합한 조성물은 활성 성분의 수성 또는 오일 용액을 포함한다. 흡입에 의한 투여를 위해 적응된 약제학적 조성물은 계량된 용량 가압식 에어로졸, 분무기 또는 취입기의 다양한 형태에 의해 생성될 수 있는 미세한 입자 먼지 또는 미스트를 포함한다.
비경구 투여를 위해 적응된 약제학적 조성물은 항산화제, 완충제, 세균 발육 억제제 및 제형이 실질적으로 의도된 수령체의 혈액과 등장성이 되도록 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 주사용 용액에 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들면 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 들 수 있다. 조성물은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고 단지 운반된 멸균 액체, 예를 들면 주사용 물의, 사용 직전의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조 (동결건조) 조건에서 보관될 수 있다. 즉석의 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 실질적으로 등장성이어서, 약 250 내지 350 mOsm/kg 물의 삼투압농도를 제공할 수 있다.
일반적으로, 약제학적 조성물은 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 착취제, 염 (본 발명의 물질은 그자체가 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다), 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 본 발명의 물질에 더불어 치료적 활성 제제를 함유할 수 있다. 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제, 또는 담체와 조합하여 사용될 수 있다. 그런 부형제로는, 한정하는 것은 아니지만, 식염수, 완충된 식염수 (예컨대 포스페이트 완충된 식염수), 덱스트로오스, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그것들의 조합을 들 수 있다.
약제학적 조성물은 환자의 질환을 치료하기 위해, 예를 들면 다른 것들 중에서도 경구, 정맥내, 피하, 근육내, 뼈속, 비강내 경로에 의한 투여를 포함하여, 임의의 효과적이고, 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 치료법 또는 예방제로서, 활성 제제가 주사 가능한 조성물로서, 예를 들면 멸균 수성 분산액, 바람직하게는 등장성으로서 개체에게 투여될 수 있다.
포유류, 및 특히 인간에게의 투여를 위해, 활성 제제의 매일 단위용량은 0.01 mg/kg 체중, 전형적으로 대략 1 mg/kg일 것으로 예상된다. 어떠한 경우에든지 의사가 개인의 연령, 체중, 성별 및 반응을 포함한 인자들에 좌우될, 개인에게 가장 적합할 실제 단위용량을 결정할 것이다. 상기 단위용량은 평균적인 경우를 예시한다. 물론 더 높거나 더 낮은 단위용량이 당연한 경우도 있을 수 있고, 그런 경우도 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 물질의 단위용량은 치료될 질환 또는 장애, 치료될 개인의 연령 및 상태 등등에 따라 광범위한 한계 내에서 달라질 수 있고, 궁극적으로는 의사가 적절한 단위용량을 결정할 것이다.
이런 단위용량은 자주 적절하게 반복될 수 있다. 만약 부작용이 발생한다면, 단위용량의 양 및/또는 빈도는, 정상적인 임상 실시에 따라, 감소될 수 있다. 한 실시예에서, 약제학적 조성물은 30일까지 매일 1회 투여될 수 있다.
발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 화합물들, 예컨대 치료용 화합물 또는 분자, 예컨대 카바메이트, 항-무스카린, 콜린에스테라제 재활성화제 및 항-경련제와 함께 사용될 수 있다. 다른 화합물들과의 그런 투여는 동시에, 별도로 또는 순차적일 수 있다. 성분들은 필요에 따라 설명서를 포함할 수 있는 키트의 형태로 제조될 수 있다.
바람직하게, 발명의 약제학적 조성물 및 다른 치료 화합물들은 그것을 필요로 하는 환자에게 직접 (어떤 것과는 반대로) 투여된다.
발명은 또한 발명의 약제학적 조성물, 및 한정하는 것은 아니지만 경구 투여를 위한 캡슐, 폐 투여를 위한 흡입기 및 비경구 투여를 위한 주사용 용액을 포함하는 투여 비히클을 포함하는 부분들의 키트를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 인간 또는 비-인간 동물에게 유익을 줄 수 있는 임의의 양생법을 포함한다. "비-인간 동물"의 치료는 가축용 동물, 이를테면 말과 반려 동물 (예컨대 고양이 및 개) 및 양, 개, 돼지, 소 및 말 과 (family)의 구성원들을 포함하여 농장/경작용 동물들의 치료에 확대된다. 치료는 임의의 기존의 상태 또는 장애와 관한 것일 수 있거나 예방적 (예방 치료)일 수 있다. 치료는 유전성 또는 후천적 질환의 치료일 수 있다. 치료는 급성 또는 만성 상태의 치료일 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 중합체 시약을 유리 설프하이드릴 잔기를 포함하는 생물학적 활성 제제와 컨쥬게이트를 제공하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계를 가지는 컨쥬게이트의 제조 방법이 제공되며, 이때 중합체 시약은 다음의 구조를 가진다:
식에서 P는 분지형 또는 분지되지 않은 수용성 중합체이고; L1은 제1 링커이며, L2는 제2 링커이고 L3은 제3 링커이며, L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하고 각각 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)0-20-NH-(CH2CH2-O-)0-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며; X는 F, Cl, Br 및 I로 구성되는 군으로부터 선택되고; R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 H (단 R1 및 R2 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 염기성 기는 
(식에서 R3, R4, R5, R6 및 R7은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R8 및 R9는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아릴6-12, 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R10, R11, R12, R13 및 R14는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 생물학적 활성 제제는 치료용 단백질 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 생물학적 활성 제제는 치료용 단백질이다. 치료용 단백질은 바람직하게는 사이토카인, 효소, 항체 및 항체 단편이다. 보다 더 바람직하게, 치료용 단백질은 Fab이다. 가장 바람직하게, Fab는 IgG1이다.
생물학적 활성 제제는 치료용 단백질이고, 유리 설프하이드릴기는 바람직하게는 단백질의 시스테인 잔기에 의해 기여된다. 본 발명의 일부 측면에서, 시스테인 잔기는 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기이다. 다르게는, 시스테인 잔기는 재조합 DNA 기술을 통해 도입된다.
P는 바람직하게는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(MPC), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린(polyoxazoline) 또는 폴리(N-아크릴로일모르폴린)이다. 보다 바람직하게, P는 폴리(알킬렌 옥사이드)이다. 보다 더 바람직하게, P는 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로서 더 흔하게 알려져 있는 폴리(에틸렌 옥사이드)이다. P가 PEG인 경우, PEG는 바람직하게는 분지형이다. 바람직하게, 분지형 PEG는 두 개의 팔을 가진다. 각각의 팔은 바람직하게 약 5 내지 약 40 kDa이다. 보다 바람직하게, 각각의 팔은 약 20 kDa의 PEG의 분자량을 가진다.
수용성 중합체와 관련하여, 발명의 중합체 시약은 또한 적어도 하나의 수용성 중합체 세그먼트를 포함한다. 비펩티드이고 수용성이며, 2 내지 약 2000개의 단량체 유닛을 가지는 수용성 중합체가 특히 발명에 유용하다. 적합한 수용성 중합체의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG"), 수용성을 가지는 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀계 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(MPC) 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 예컨대 미국 특허 제 5,629,384호 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들을 포함한다. 상대적으로 높은 수용성이 바람직한 일부 용도에서, 수용성 중합체는 폴리(프로필렌 옥사이드)가 아니다.
본 발명의 다른 측면으로, P는 폴리(MPC)이다. 폴리(MPC)는 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12개의 팔을 가진다. 보다 바람직하게, 폴리MPC는 3, 6 또는 9개의 팔을 가진다. 가장 바람직하게, 폴리(MPC)는 9개의 팔을 가진다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 폴리(MPC)는 바람직하게 300,000 내지 1,750,000 달톤, 보다 바람직하게는 500,000 내지 1,000,000 달톤, 보다 바람직하게는 600,000 내지 800,000 달톤의 피크 분자량을 가진다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, L3은 결합이고, R2는 H이며 R1은 
이다.
바람직하게, L2는 -(CH2)1-6-이다. 보다 바람직하게, L2는 -(CH2)3-이다.
본 발명의 다른 측면에서, 다음의 구조를 가지는, 중합체 합성을 위한 개시제가 제공된다:
식에서 L1은 제1 링커이며, L2는 제2 링커이고 L3은 제3 링커이며, L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하고 각각 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)1-20-NH-(CH2CH2-O-)1-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며; R1 및 R2는 동일하거나 상이하고 H (단 R1 및 R2는 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되며, 여기서 염기성 기는 
(식에서 R17 및 R18은 C1-6 알킬이고, 바람직하게는 R17 및 R18은 둘 다 메틸임); 
(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하고 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하고 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨); 
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하고 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되고; R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하며 다음:
바람직하게, Y는 Br이다. R3, R4 및 R5는 바람직하게는 각각 
이다.
보다 바람직하게, R3, R4 및 R5는 각각 
이다.
보다 더 바람직하게, R4, R5 및 R6은 각각
본 발명의 한 측면에서, 바람직하게 L3은 결합이고, L2는 H이며 R1은 
이다.
L2는 바람직하게 -(CH2)1-6-이다. 보다 바람직하게, L2는 -(CH2)3-이다.
IV.
실시예
실시예
1.
rBuChE
절단물
OP 바이오스캐빈저를 hBuChE 효소를 위치 524 (성숙한 단백질을 참조함)에서 절단함으로써 만들었다 (rhBuChE524). 또한, 돌연변이 C66Y를 도입하였다. rhBuChE524 (C66Y)의 단백질 서열은 SEQ ID NO. 10으로 나타낸다. 만약 중합체를 rhBuChE524 (C66Y)에 컨쥬게이트하는 것이 바람직하면, GGC 및 GGGC 서열 (SEQ ID NO: 20)이 단부에 첨가될 수 있다. rhBuChE524GGGC (C66Y)의 단백질 서열은 SEQ ID NO. 12로 나타낸다 (SEQ ID NO: 20으로서 개시된 "GGGC").
다른 바이오스캐빈저를 hBuChE를 위치 534 (성숙한 단백질을 참조함)에서 절단함으로써 만들었다. rhBuChE534 (C66Y)의 서열은 SEQ ID NO. 10으로 나타낸다. 시스테인을 사용한 중합체에의 컨쥬게이션에 대해, GGC를 선택적으로 단부에 첨가한다. rhBuChE534GGC (C66Y)의 단백질 서열을 SEQ ID NO. 13으로 나타낸다.
실시예
2.
rBuChE
융합 단백질
rhBuChE-Fc 융합 단백질을 상기에서 기술한 534 절단물을 사용하여 그것을 IgG1의 Fc 영역에 두 단백질 세그먼트 사이에 GS 링커 (GGGSGGGSGGGS) (SEQ ID NO:21)로 융합시킴으로써 재조합 유전자 엔지니어링에 의해 만들었다. rhBuChE534-Fc의 서열을 SEQ ID NO. 16으로 나타낸다. C66Y 돌연변이를 가지는 융합 구성물 (rhBuChE534 (C66Y)-Fc)을 SEQ ID NO. 17로 나타낸다. 다른 버전으로, 다양한 이펙터 기능 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 도입한다. hBuChE534 (C66Y)-Fc(L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S) 융합을 SEQ ID NO. 15로 나타낸다. 단백질의 Fc 부분에 엔지니어링될 수 있는 다른 돌연변이는 Q347C이고 폴리(MPC)와 같은 중합체를 단백질에 컨쥬게이트하기 위해 사용될 수 있다. rhBuChE534 (C66Y)-Fc(L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)의 단백질 서열을 SEQ ID NO. 2로 나타낸다.
다양한 단백질 구성물을 CHO-K1 세포에서 진핵세포 유전자 발현에 적절한 DNA 구성물을 사용하여 발현시켰다. 내인성 hBuChE 리더 서열을 구성물 (SEQ ID NO. 1 참조)의 재조합 발현을 위해 사용할 수 있는데, CTLA4 리더가 바람직하고, 그것의 서열은 SEQ ID NO. 18로 나타낸다. rhBuChE534 (C66Y)-Fc(L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)를 발현하기 위해 사용한 DNA 서열은 SEQ ID NO. 9에 제시한다.
실시예
3. 구성물의 일시적 발현
일시적 발현 분석을 Expi293 발현 시스템 (Gibco)에서 수행하였다. 많은 rhBuChE524 절단물의 발현을 조사하였다. 일반적으로, rhBuChE524 구성물은 발현되지 않았을 뿐 아니라 상응하는 rhBuChE534 구성물도 발현되지 않았다. rhBuChE534 구성물과 관련해서는, C66Y 구성물은 일반적으로 이런 변화가 없는 구성물보다 잘 발현되었다. 534 구성물에 대한 일시적인 발현 데이터의 요약을 아래의 표에 나타낸다:
| 구성물 | 엘만 분석 시험 (유닛/mL) |
| rhBuChE534 | 15 |
| rhBuChE534GGC | 7.5 |
| rhBuChE534GGC (C66Y) | 32 |
| rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C) | 27 |
실시예
4. 안정한 형질전환체
일시적인 발현 분석의 결과를 기반으로, 안정한 형질전환체를 rhBuChE534GGC (C66Y) 및 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)로 만들었다. Fc 융합에 대한 안정한 형질전환체는 CTLA4 리더를 사용하는데, 그것은 SEQ ID NO. 18에 제시되고 SEQ ID NO. 2에 제시된 단백질의 N-말단에 융합된다. 이 구성물의 DNA 서열을 SEQ ID NO. 9에 나타낸다.
실시예
5.
MPC
중합체에 대한
BuChE
-
Fc
융합 단백질의
컨쥬게이션
SEQ ID NO. 2에 따르는 인간 BuChE-Fc 융합 단백질을 TCEP로 변성시켜서 (아래의 실시예 6에서 설명한 것과 같이) Fc 사슬의 위치 347에 유리 시스테인 티올을 제공한 후 제한적으로 재변성하였다. 그런 다음 TCEP 처리된 BuChE-Fc를 단백질에 대해 15 내지 50배 과잉량의 중합체를 사용하여 750 kDa 중합체에 컨쥬게이트하여 아래에 제시된 것과 같은 컨쥬게이트를 생성하였다:
실시예
6.
BuChE
-
Fc의
탈캡핑
및
재접힘
BuChE-Fc 융합을 실온에서 30배 몰 과잉량의 TCEP로 여러 시간 동안 실온에서 EDTA의 존재하에 환원시켰다. 이 환원에 이어서, 단백질은 UF/DF 중에서 TCEP 세척 단계를 수행하여 TCEP 농도를 약 8배 몰 과잉으로 감소시켰다. 추가의 UF/DF 및 희석을 수행하여 TCEP를 1 μM 미만으로 감소시켰다. 그런 다음 환원된 BuChE-Fc를 재변성 및 재변성 진전 (단량체 BuChE-Fc의 소멸 및 이량체 BuChE-Fc의 드러남에 의해 알 수 있음)을 허용하고 이어서 SDS-PAGE를 하였다. 재변성 후에, 단백질의 중합체에의 컨쥬게이션을 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다.
실시예
7. 중합체 R5743의 합성
아래에 나타낸 중합체 R5743을 다음과 같이 합성하였다:
아래의 구조를 가지는 TFA/아민 염 개시제 (화합물 L)를 다음과 같이 합성하였다:
먼저, 다음의 구조를 가지는 화합물 K를 합성하였다:
200 mL의 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에 화합물 J (1.9 g, 2.67 mmol, 3.3 당량): 
(화합물 J) 및 화합물 E (0.525 g, 0.81 mmol, 1.0 당량)(하기 참조) 
(화합물 E)를 넣고, 이어서 다이메틸포름아미드 (10 mL) 및 다이아이소프로필에틸아민 (2.5 mL, 14.6 mmol, 18 당량)을 넣었다. 플라스크를 얼음 배스를 사용하여 0℃로 냉각하였다. 이것에 프로필포스폰산 무수물 용액 (에틸 아세테이트 중에 50 wt. %, 2.5 mL, 4.04 mmol, 5 당량)을 ~6분에 걸쳐 첨가하였다.
반응을 실온으로 가온하고 15분 동안 교반하였다. 반응을 물 (20 mL), 포화 중탄산 나트륨 수용액 (20 mL) 및 에틸 아세테이트 (100 mL)를 첨가하여 퀀칭하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트 (75 mL)로 추출하였다. 조합한 유기층을 포화 중탄산 나트륨 수용액 (30 mL), 0.5 M 수성 시트르산 (40 mL), 물 (25 mL) 및 포화 염화나트륨 수용액 (40 mL)으로 세척한 후, 건조시키고 (황산 나트륨), 여과하고 진공하에 농축하였다. 그 잔류물을 추가의 정제 없이 사용하여 2.0 g (0.80 mmol, 99%)의 화합물 K를 얻었다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ= 1.36 (s, 9H, OCCH3), 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.98 (d, J = 5.6 Hz, 6H, CCH2NH), 3.04 (q, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2CH2NH), 3.18 (s, 2H, OCH2C), 3.3-3.37 (m, 8H, CH2), 3.47-3.55 (m, 12H, CH2), 3.58 (s, 6H, OCH2C), 3.87 (s, 6H, d 실온에서 30분 동안. 반응을 진공 하에 농축하였다. 반응을 다이클로로메탄 (10 mL)을 사용하여 희석하고 진공 하에 농축하였다. 그 잔류물을 아세토니트릴 (10 mL)에 녹이고, 주사기 필터 (Acrodisc CR25, PN 4225T)를 통하여 여과한 후, 예비용 HPLC 칼럼 상에 로딩하고 물 중의 60% 아세토니트릴 (0.1% 트라이플루오로아세트산 사용)로부터 98% 아세토니트릴 (0.1% 트라이플루오로아세트산 사용)로 용출하였다. 생성물을 함유한 튜브를 모으고, 진공하에 농축하고, 냉동시켜서 동결건조기에 넣었다. 이것으로 990 mg (0.4 mmol, 2단계에 걸쳐 50%)의 화합물 L을 백색 분말로서 얻었다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ= 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.97-3.0 (m, 8H, CCH2NH 및 OCH2CH2NH), 3.17 (s, 2H, OCH2C), 3.3 (q, 6H, CH2CH2NHC=O), 3.4-3.59 (m, 20H, CH2), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7.69-7.84 (m, 9H, CH2NHC=O 및 NH3+ 모두).
LC-MS (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ (C84H136Br9N7O33+2H)/2에 대한 계산값 = 1196.6; 실측값 1197.4.
아래의 구조를 가지는 TFA/아민 염 개시제 (화합물 P)를 다음과 같이 합성하였다:
20 mL의 바이알에 화합물 L (430 mg, 0.172 mmol, 1.0 당량)(상기 참조) 및 알파-t-부틸옥시카르보닐아미노-오메가-카르복시 도데카 (에틸렌 글리콜) (154 mg, 0.215 mmol, 1.25 당량)와 이어서 N,N-다이메틸포름아미드 (2 mL) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.18 mL, 1.03 mmol, 6 당량)을 넣었다. 플라스크를 얼음 배스를 사용하여 0℃로 냉각하였다. 이것에 프로필포스폰산 무수물 용액 (에틸 아세테이트 중에 50 wt. %, 0.215 mL, 0.343 mmol, 2 당량)을 1분에 걸쳐 첨가하였다. 반응을 실온으로 가온하고 30분 동안 교반하였다. 반응을 물, 포화 중탄산 나트륨 수용액 및 에틸 아세테이트를 첨가하여 퀀칭하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합한 유기층을 포화 중탄산 나트륨 수용액, 0.5 M 수성 시트르산, 물 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세척한 후, 건조시키고 (황산 나트륨), 여과하고 진공하에 농축하였다. 그 잔류물을 추가의 정제 없이 사용하여 0.6 g (0.194 mmol)의, 아래에 나타낸 화합물 N을 얻었다.
LC-MS (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ (C111H189Br9N8O46+2H-Boc)/2에 대한 계산값 = 1496.3; 실측값 1497.2.
100 mL의 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에 화합물 N (0.6 g), 다이클로로메탄 (4 mL) 및 이어서 트라이플루오로아세트산 (3 mL)을 첨가하였다. 반응을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응을 진공 하에 농축하였다. 그 잔류물을 아세토니트릴 (3 mL)을 사용하여 용해하고, 주사기 필터 (Acrodisc CR25, PN 4225T)를 통해 여과한 후, 예비용 HPLC 칼럼에 로딩하고 50% 물 중의 50% 아세토니트릴 (0.1% 트라이플루오로아세트산을 사용함)부터 90% 까지의 아세노니트릴 (0.1% 트라이플루오로아세트산을 사용함)로 용출하였다. 생성물을 함유하는 튜브를 모아서 진공 하에 농축하고, 냉동시켜서 동결건조기에 넣었다. 이것으로 200 mg (0.064 mmol, 2단계에 걸쳐 37%)의 화합물 P를 얻었다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ = 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.3 ( br t, 8H, CCH2CH2NH 및 CH2CH2C=O), 3.0 (m, 8H, CCH2NH 및 OCH2CH2NH), 3.1-3.6 (m, 84H, OCH2C), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7.6-7.8 (m, 10H, CH2NHC=O 및 NH3+ 모두).
LC-MS (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ (C106H181Br9N8O44+2H)/2에 대한 계산값 = 1496.3; 실측값 1496.6.
실시예
8. 양성이온성 중합체의 제조
개시제를 전형적으로 약 100 mg/mL의 DMF 중의 스톡 용액으로서 제조한다. 개시제 및 리간드 (2,2'-비피리딜)를 Schlenk 튜브에 넣었다. 그 결과의 용액을 드라이 아이스/아세톤 혼합물을 사용하여 -78℃로 냉각하고, 진공 하에 10분 동안 탈기하였다. 튜브를 다시 아르곤 및 촉매 (다르게 표시되지 않는 한 CuBr)로 채우고, 아르곤 하에서 유지하고 Schlenk 튜브에 넣었다 (개시제/촉매 (CuBr)/리간드 상에서 원자 브롬의 몰 비율은 1/1/2로 유지하였다). 용액은 즉시 어두운 갈색이 되었다. Schlenk 튜브를 밀봉하고 즉시 짧은 사이클의 진공/아르곤을 적용함으로써 퍼지하였다. HEMA-PC 용액을, 질소 하에 유지한 글로브 박스에서 제조한 규정된 양의 단량체를 200 프루프 탈기 에탄올과 혼합함으로써 제조하였다. 단량체 용액을 Schlenk 튜브에 (캐뉼라를 통해) 한 방울씩 첨가하였다. 온도를 -78℃에서 유지하였다. 완전한 진공을 반응 혼합물에 용액으로부터 기포 발생이 중지될 때까지 적어도 10 내지 15분 동안 적용하였다. 그런 다음 튜브를 아르곤으로 다시 채우고 실온으로 가온하였다. 용액을 교반하였고, 중합반응이 진행됨에 따라, 용액은 점성이 되었다. 3 내지 8시간 후 또는 하룻밤이 지난 후, 반응을 Cu (I)을 Cu (II)로 산화시키기 위하여 공기에 직접 노출시켰고, 혼합물은 청록색이 되었으며, 구리 촉매를 제거하기 위하여 실리카 칼럼을 통과시켰다. 수집한 용액을 회전 증발에 의해 농축하고 그 결과의 혼합물을 테트라하이드로푸란으로 침전시키거나 물에 대해 투석한 후 냉동 건조시켜서 자유롭게 흐르는 백색 분말을 얻었다. 아래의 표 2는 본 발명에 따라 제조한 예시적인 중합체를 나타낸다.
| Theor. MW (kDa) |
중합체 ID No. | 개시제 (표 3 참조) |
Mn (kDa) |
Mp (kDa) |
PDI |
| 150 [w2199] [d2191] |
60 | B5 | 150 | 158 |
1.05 |
| 250 [wR2765] [dR2731] |
70 | B4 | 205 | 230 |
1.05 |
| 250 [wR3350] [dR3324] |
80 | B5 | 117 | 137 |
1.1 |
| 250 [wR3373] [dR3372] |
90 | B6 | 235 | 258 |
1.1 |
| 250 [wR3460I] [wR3461M] [dR3418] |
100 | B | 242 | 259 |
1.1 |
| 250 [wR3482I] [wR3483M] [dR3463] |
110 | F1 | 245 | 270 |
1.1 |
| 500 [wR3763] [dR3662] |
120 | F1 | 490 | 557 |
1.1 |
| 500 [wR3758] [dR3706] |
130 | L | 490 | 530 |
1.1 |
| 750 [wR3764] [dR3667] |
140 | F1 | 586 | 695 |
1.1 |
| 750 [wR3759] [dR3707] |
150 | L | 645 | 750 |
1.1 |
| 750 [wR3836] [dR3804] |
160 | O | 656 | 740 |
1.1 |
| 750 [wR3835] [dR3808] |
170 | P | 785 | 900 |
1.1 |
| B |
 |
| B4 |
 |
| B5 |
 |
| B6 |
 |
| F1 |
 |
| L |
 |
| O |
 |
| P |
 |
실시예
9.
말레이미드
9-팔
컨쥬게이팅
가능한 중합체의 제조
다음의 구조를 가지는 말레이미드 컨쥬게이팅 가능한 9-팔 중합체 (Q)를 다음과 같이 합성하였다:
컨쥬게이팅 가능한 중합체 Q를 다음과 같이 제조하였다: 20 mL의 바이알에 중합체 ID No. 160 (표 2) (540 mg, 0.0007 mmol, 1.0 당량)을 넣고 물 (4 mL)을 사용하여 녹였다. 이것에 0.5 M 인산 나트륨 2염기성 수용액 (0.4 mL)을 첨가하였다. 별도의 바이알에서 테트라하이드로푸란 (1 mL)에 3-말레이미도프로피온산, NHS 에스테르 (0.93 mg, 0.0035 mmol, 5 당량)를 녹였다. NHS 에스테르 용액을 중합체 용액에 약 2분에 걸쳐 실온에서 첨가하고 그 결과의 용액을 30분 동안 교반하였다. 반응을 물 (~15 mL)로 희석하고, 주사기 필터 (Acrodisc Supor, PN 4612)를 통해 여과한 후, 3개의 아미콘 원심분리 막 투석 튜브 (30,000 mwco)에 평평하게 넣었다. 튜브를 희석하고 물 (각각 ~5 mL)과 혼합하고, 원심분리기 (rpm 3000)에 30분 동안 넣었다. 분석을 위해 여과물을 제거하는 한편 보유물을 희석하고 물 (~10 mL/튜브)과 혼합하였다. 원심분리 과정을 5회 더 반복한 후, 보유물을 제거하여 바이알에 넣었다. 아미콘 막 튜브를 물로 세정하고 (각 튜브당 2 x ~2 mL) 이것을 보유물과 조합하였다. 보유물 용액을 주사기 필터 (Acrodisc Supor, PN 4612)를 통해 여과한 후, 냉동시키고 동결건조기에 넣었다. 이것으로 508 mg (94%)의 중합체 Q를 백색 분말로서 얻었다.
실시예
10.
말레이미드
9-팔
컨쥬게이팅
가능한 중합체의 제조
다음 구조를 가지는 말레이미드 컨쥬게이팅 가능한 9-팔 중합체 (R)를 컨쥬게이팅 가능한 중합체 Q에 대해 기술한 것과 동일한 기법을 사용하여 합성하였다:
실시예
11.
컨쥬게이트들의
활성
BuChE 효소 활성을 아래의 표 1에 나타낸 것과 같이 컨쥬게이트된 및 컨쥬게이팅되지 않은 단백질에 대해 측정하였다. 표 1에서, rBuChE534 (C66Y)는 rhBuChE534GGC이고 rBuChE534Fc는 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)이다:
| 샘플 | 효소 활성 (EU/mg) |
S.D. (%) | Δ 활성 |
| rBuChE534 (CHO-K1) | 724 | 4 | - |
| rBuChE534Fc (CHO-K1) | 788 | 5 | - |
| rBuChE534-9A750K HEMA-PC | 620 | 4 | 14% |
| rBuChE534Fc-9A750K HEMA-PC | 748 | 3 | 5% |
| BuChE (인간 혈장) (대조표준) | 640 | 4 | - |
| rBuChE (염소 젖) (대조표준) | 423 | 5 | - |
rBuChE (염소 젖)는 유전자이식 염소에서 생성된 rhBuChE를 나타낸다. 요약하면, BuChE-Fc 융합 단백질은 양호한 활성을 유지하였다. 더욱이, 활성은 중합체에 컨쥬게이션된 후에도 잘 유지되었다. Fc 구성물에 대해서는, MPC 중합체에 컨쥬게이션된 후에 활성 손실은 단지 5%였다.
실시예
12.
BuChE의
혈장 안정성
rBuChE534GGC (C66Y) (SEQ ID NO. 13) 및 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C (SEQ ID NO. 2)가 유전자이식 염소 rBuChE와 관련된 안정성 문제점을 극복하였는지를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 시노몰구스 원숭이 (cyno) 혈장에서 이들 구성물 대 인간 혈장 유도된 BuChE, 및 유전자이식 염소의 rhBuChE (전 길이)의 안정성을 시험하였다. 샘플들을 상업적으로 입수 가능한 cyno 혈장에 넣고 시간 경과에 따른 부분표본을 뽑아 엘만 분석을 통해 효소 활성을 측정하였다. 도 1은 rBuChE534GGC (C66Y)) 및 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C) 둘 다의 활성이 거의 35일에 걸쳐 37℃에서 cyno 혈장에서 보관한 후에 잘 유지되었음을 보여준다. 이들 구성물은 둘 다 골드 스탠다드 인간 혈장 정제된 BuChE보다 더 잘 수행하였다. 대조적으로, 유전자이식 염소 효소의 활성은 시간경과에 따라 급속하게 떨어졌고, 연구가 끝났 무렵에는 5% 미만에 도달하였다.
또한 중합체에 대한 컨쥬게이션이 효소 안정성에 영향을 미쳤는지를 측정하였다. 도 2는 9개의 팔을 가진 750 kDa HEMA-PC 중합체에 컨쥬게이트된 단백질 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C에 대한 활성 대 시간의 도표를 인간 혈장 유도된 BuChE에 4℃ 및 37℃에서 비교한 결과를 나타낸다. 비록 단백질에 컨쥬게이트된 중합체의 활성이 시간 경과에 따라 다소 감소했지만, 그 감소는 인간 혈장 유도된 효소로 볼 수 있었던 것보다 크지 않았다.
실시예
13. 신경 작용제에 의한
BuChE의
시험관내
억제
본 발명의 rBuChE가 신경 작용제에 대해 활성인지를 측정하기 위하여, 컨쥬게이트되거나 컨쥬게이트되지 않은 다양한 BuChE 배치를 상기 기술한 엘만 분석을 사용하여 다음의 OP 제제들의 존재 하에 분석하였다: GA (타분 (에틸 다이메틸아미도시아노포스페이트)), GB (사린 (프로판-2-일 메틸포스포노플루오리데이트)), GD (소만 (3,3-다이메틸부탄-2-일 메틸포스포노플루오리데이트)), GF (사이클로사린(사이클로헥실 메틸포스포노플루오리데이트)), VX (V 시리즈 신경 작용제 (에틸 ({2-[비스(프로판-2-일)아미노]에틸}설파닐)(메틸)포스피네이트), 및 VR (V 시리즈 신경 작용제 (N,N-다이에틸-2-(메틸-(2-메틸프로폭시)포스포릴)설파닐에탄아민)). 표 5는 다양한 신경 작용제를 가지는 인간 혈장 rBuChE, rBuChE534 = rBuChE534GGC (C66Y), rBuChE534-Fc = rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C), 및 rBuChE534-Fc-polymer = rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C)-9개의 팔 750 kDa HEMA-PC 중합체에 대한 억제 상수 Ki를 나타낸다.
| 제제 | 혈장 BuChE | rBuChE534 | rBuChE534-Fc | rBuChE534-Fc-중합체 |
| GA | 4.93 x 106 | 4.75 x 106 | 3.25 x 106 | 8.89 x 106 |
| GB | 8.62 x 106 | 8.48 x 106 | 7.19 x 106 | 6.87 x 106 |
| GD | 8.52 x 107 | 4.76 x 107 | 3.74 x 107 | 5.61 x 107 |
| GF | 1.61 x 108 | 9.43 x 107 | 6.81 x 107 | 1.27 x 108 |
| VX | 6.92 x 106 | 3.12 x 106 | 2.93 x 106 | 9.06 x 106 |
| VR | 1.08 x 108 | 4.34 x 107 | 4.53 x 107 | 4.53 x 107 |
표로부터 알 수 있는 것과 같이, 컨쥬게이트를 포함하여 구성물의 각각은 표준 인간 혈장 BuChE에 매우 가깝다.
실시예
14.
BuChE
구성물의
생체내
약물동역학
본 발명의 rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C) (및 상응하는 컨쥬게이트)의 생체내 약물동역학적 특성을 측정하기 위하여, 구성물들을 C57BL/6 바탕의 동형접합성 카르복실에스테라제 ES1 녹아웃 마우스 (-/-)에 주입 투여하였다. Duysen, E.G., et al. Production of ES1 Plasma Carboxylesterase Knockout Mice for Toxicity Studies (2011) Chem. Res. Toxicol. 24(11) 1891-1898. 이들 ES1 KO 마우스들은 완전히 인간과 관련하여 마우스에서 신경 작용제의 LD50을 부스팅하는 것으로 보고된 혈장 카르복실에스테라제 활성이 결핍되었다. Duysen et al.
다양한 구성물들 및 하기에서 기술되는 컨쥬게이트들의 혈청 안정성을 원숭이 혈청에 대해 상기 기술한 마우스 혈청 (C57BL/6)에서 시험하였다. 그 결과는 유사하였다 (데이터는 제시하지 않음). 다양한 구성물 및 컨쥬게이트들을 4 내지 6마리씩의 마우스 그룹에 시간 0 (제로)에 정맥내로 주사하였다. 그런 다음 혈액의 부분표본을 동물로부터 주사 후 다양한 시간에 채혈하여 BuChE 의 활성을 상기에서 기술한 것과 같이 측정하였다. 아래는 KO 마우스에 주사한 시험 물품을 요약한 것이다.
| 시험 물품 | 비활성 (U/mg) | 농도 (단백질) | 전달된 용량 (mg/Kg) |
| BuChE (혈장-유도) | 641 ± 22 | 5 | 60.6 |
| rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S 및 Q347C) | 534 ± 14 | 5.58 | 17 |
| 3A500K-컨쥬게이트 | 503 ± 9 | 5.17 | 17.2 |
BuChE 효소 활성을 채혈한 혈액 샘플에서 모니터링하고 상기 활성 데이터를 기준으로 표준화하였다. 표 1에 제시한 다양한 구성물들에 대한 pK 데이터를 아래의 도 3에 도시한다.
실시예
15. 37℃에서
BuChE 컨쥬게이트들의
완충액 안정성 비교
유전자이식 염소의 젖으로부터 정제된 전 길이 rhBuChE를 천연 시스테인을 통해 중합체에 말레이미드 또는 요오도아세트아미드를 사용하여 컨쥬게이션하였다. 이들 두 가지 상이한 컨쥬게이트의 안정성을 아래의 도 4에서 비교하였다. 컨쥬게이트 안정성을 평가하기 위하여, 말레이미드 및 요오도아세트아미드 기반 컨쥬게이트를 37℃, pH 7.0의 포스페이트 완충된 식염수에서 30일 동안 인큐베이션하였다. 부분표본을 취하여 SDS PAGE에 의해 유리 단백질을 평가하였다. 그 결과를 도 4에서 볼 수 있다. 요오도아세트아미드 컨쥬게이트는 30일 동안 매우 안정하였는데, 선이 시간 0에 설정한 기준선에 가깝게 유지되었다. 대조적으로, 말레이미드 기반 컨쥬게이트는 시간 0에 설정한 기준선에서 급속하게 상승되었다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 요오도아세트아미드 기반 컨쥬게이트가 실질적으로 말레이미드 컨쥬게이트보다 일부 단백질에 대해 더 안정하다고 볼 수 있다. 말레이미드 컨쥬게이트의 불안정성은 단백질 의존적이다. 많은 말레이미드 컨쥬게이트가 꽤 안정적이다.
실시예
16. 염소 유도된
rhBuChE에
컨쥬게이트된
말레이미드
750
kDa
MPC
중
합체
말레이미드 컨쥬게이션을 위해, 열 탈보호성 말레이미드 개시제를 사용하여 MPC 중합체를 BuChE에 컨쥬게이션하였다. 상기 구조를 가지는 개시제, 화합물 AA를 PCT/US2012/060301에서 설명한 것과 같이 합성하였다 (실시예 6 참조):
MPC 중합체의 합성을, 대략 750 kDa의 6-팔 MPC 중합체를 제조하기 위하여 PCT/US2012/060301의 실시예 11에서 기술된 것과 같이 수행하였다. 중합체를 미국 임시 출원 번호 US 61/875,099에 기술된 것과 같이 열 탈보호에 의한 컨쥬게이션을 위해 제조하였다. 그 결과의 열 탈보호된 중합체를 트리스 완충된 식염수, pH 7.5 4℃에서 TCEP 처리된 BuChE에 밤새 컨쥬게이션하였다. 컨쥬게이션을 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 컨쥬게이트를 유리 단백질 및 중합체로부터 DEAE 크로마토그래피를 통하여 정제하였다.
실시예
17. 염소 유도된
rhBuChE에
컨쥬게이트된
요오도아세트아미드
3 팔, 250 kDa MPC 중합체
아래의 구조를 가지는 TFA/아민 염 개시제 (화합물 B)를 다음과 같이 합성하였다:
먼저, 다음의 구조를 가지는 BOC 보호된 3-팔 개시제, 화합물 A:
를 다음과 같이 제조하였다: 25 mL의 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에 삼차-부틸 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸카바메이트 (66 mg, 0.26 mmol, 1.2 당량) 및 (2,2,2-트라이(2-브로모-2-메틸-프로피오닐옥시메틸)-에톡시)-아세트산 (생성물 4.5에 대해 PCT/US2012/060301 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 대로 제조됨)(142 mg, 0.22 mmol, 1.0 당량)을 넣고 이어서 N,N-다이메틸포름아미드 (2 mL) 및 다음에 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.19 mL, 1.1 mmol, 5.0 당량)을 넣었다. 플라스크를 얼음 배스를 사용하여 0℃로 냉각하였다. 이것에 프로필포스폰산 무수물 용액 (에틸 아세테이트 중의 50 wt. %, 0.16 mL, 0.26 mmol, 1.2 당량)을 1분에 걸쳐 첨가하였다. 반응을 실온으로 가온하고 1.5시간 동안 교반하였다. 반응을 물을 첨가함으로써 퀀칭한 후, 물과 에틸 아세테이트를 사용하여 분배하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합한 유기층을 물, 포화 중탄산 나트륨 수용액, 물, 0.5 M 시트르산 수용액, 물로 세척한 다음 건조시키고 (황산 나트륨), 여과한 후 진공 하에 농축하였다. 그 잔류물을 실리카겔 칼럼 (60 mL)에 적용하고 30% 헥산과 함께 70% 에틸 아세테이트로 용출하였다. 생성물을 함유한 튜브를 모아서 진공 하에 농축하였고, 그 결과 150 mg (0.17 mmol, 77%)의 화합물 A를 얻었다.
화합물 A를 다음과 같이 탈보호하여 화합물 B를 얻었다: 20 mL의 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에 화합물 A (120 mg, 0.14 mmol, 1 당량), 다이클로로메탄 (2 mL) 및 이어서 트라이플루오로아세트산 (2 mL, 26.9 mmol, 192 당량)을 첨가하였다. 반응을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응을 헥산 다이클로로메탄 (20 mL)을 사용하여 희석하고 진공하에서 농축하였다. 반응을 헥산 (50 mL)을 사용하여 희석하고 진공하에서 농축하고 (2회), 결과적으로 2.2 g (2.73 mmol, (잔류하는 다이클로로메탄을 포함함))의 화합물 B를 얻었다.
다음의 구조를 가지는 중합체 B2를 다음과 같이 제조하였다:
20 mL의 바이알에 중합체 103 (280 mg, 0.00123 mmol, 1.0 당량)을 넣고 물 (2 mL)을 사용하여 녹였다. 이것에 0.5 M 인산나트륨 2염기 수용액 (0.2 mL)을 첨가하였다. 별도의 바이알에서 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르 (1.6 mg, 0.00548 mmol, 4.5 당량)를 테트라하이드로푸란 (0.5 mL)에 녹였다. NHS 에스테르 용액을 중합체 용액에 ~2분에 걸쳐 실온에서 첨가하고 그 결과의 용액을 75분 동안 교반하였다. 반응을 4:1의 물:테트라하이드로푸란 (4 mL)으로 희석하고 아미콘 원심분리 막 투석 튜브 (30,000 mwco)에 넣고 튜브를 원심분리기 (rpm 3000)에 30분 동안 넣었다. 여과물을 분석을 위해 제거한 한편, 보유물을 희석하고 4:1의 물:테트라하이드로푸란 (6 mL)과 혼합하였고 튜브를 원심분리기 (rpm 3000)에 30분 동안 넣었다. 분석을 위해 여과물을 제거하는 한편, 보유물을 물 (8 mL)로 희석하고 혼합한 후, 원심분리기 (rpm 3000)에 30분 동안 넣었다. 분석을 위해 여과물을 제거하는 한편, 보유물을 물 (8 mL)로 희석하고 혼합하였다. 원심분리 과정을 3회 더 반복한 후, 보유물을 제거하여 바이알에 넣었다. 아미콘 막 튜브를 물로 세정하고 (2 x ~2 mL) 이것을 보유물과 조합한 후 냉동시켜서 동결건조기에 넣었다. 이것으로 270 mg (96%)의 중합체 B2를 백색 분말로서 얻었다.
중합체 B2를 상기에서 기술된 대로 제조된, TCEP 처리된 rhBuChE에 컨쥬게이션하였다. rhBuChE에 대해 대략 5x 몰 과잉량의 중합체 B2를 실온의 대략 pH 8.5의 탄산나트륨 완충액에서 밤새 사용하였다. 컨쥬게이트를 유리 중합체 및 단백질로부터 DEAE 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
실시예
18. 염기성 기를 통한 3A-250
kDa
요오도아세트아미드
MPC
중합체의 향상된 컨쥬게이션
다양한 염기성 기들은 요오도아세트아미드 기능성에 가깝게 위치하였고 그것들의 rBuChE에 대한 컨쥬게이션 향상 능력을 분석하였다.
| 구조 re R1에 대한 요오도아세트아미드 기능성 (도 5 참조) | 중합체 몰 과잉 | pH | 컨쥬게이션 효율 |
| [R4341] R1 = CH3 | 10x | 7.5 | 11% |
| [R4118] R1 = (CH2)3-구아니딘 | 10x | 7.5 | 24% |
| [R4440] R1 = CH2-구아니딘 | 10x | 7.5 | 17% |
| [R4442] R1 = (CH2)2-구아니딘 | 10x | 7.5 | 32% |
| [R4341] R1 = CH3 | 10x | 8.5 | 23% |
| [R4118] R1 = (CH2)3-구아니딘 | 10x | 8.5 | 57% |
| [R4440] R1 = CH2-구아니딘 | 10x | 8.5 | 40% |
| [R4442] R1 = (CH2)2-구아니딘 | 10x | 8.5 | 64% |
| [R4341] R1 = CH3 | 10x | 9.5 | 74% |
[R4342] R1 =  |
10x | 8.5 | 22% |
| [R4439] R1 = (CH2)3-N(CH3)2 | 10x | 8.5 | 43% |
| [R4441] R1 = (CH2)2-N(CH3)2 | 10x | 8.5 | 6% |
| [R4320] R1 = (CH2)4-N(CH3)2 | 10x | 8.5 | 42% |
| [R4438] R1 = CH2-N(CH3)2 | 10x | 8.5 | 4% |
| [R4451] R1 = (CH2)4-구아니딘 | 10x | 8.5 | 51% |
| [R4118] R1 = (CH2)3-구아니딘 | 20x | 8.5 | 70% |
| [R4451] R1 = (CH2)4-구아니딘 | 20x | 8.5 | 75% |
실시예
19. 중합체 R4341의 합성
먼저, 다음 구조를 가지는 R4163을 합성하였다:
아래에 나타낸 구조를 가지는 화합물 R3329를 JStar Research로부터 구매하였다:
6 g의 R3329를 2.8 g의 N-BOC-2,2'-(에틸렌다이옥시)다이에틸아민과 THF에서 실온에서 혼합하였다. 이것에 8.2 ml의 다이아이소프로필에틸 아민을 첨가하고, 이어서 7.7 ml의 프로필포스폰산 무수물 용액 (1.6 M)을 첨가하였다. 그것을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후에, 반응 혼합물을 EtOAcMTBE 및 물에 의해 분배하였다. 이것에 이어 0.5 M 시트르산으로 1회 세척하고, 포화 중탄산 나트륨 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물을 황산 마그네슘 상에서 건조시켰다. R4163을 LCMS에 의해 확인하였다.
다음에 BOC 기를 R4613으로부터 제거하였다. 9.4 g의 R4163을 60 ml의 다이클로로메탄에 녹였다. 이것에 60 ml의 트라이플루오로 아세트산을 첨가하였다. 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 용액을 건조시켰다. 생성된 고체 물질을 물/아세토니트릴에 녹였고, 아래에 나타낸 R4180을 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
다음에, 아래의 구조를 가지는 화합물 R4203을 제조하였다:
200 mg의 R4180을 2 ml의 아세토니트릴 중의 43 mg의 BOC-L-Ala-OH와 혼합하였다. 이것에 200 μl의 다이아이소프로필에틸 아민과, 이어서 175 μl의 프로필포스폰산 무수물 용액 (1.6 M)을 첨가하였다. 그것을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후에, 물을 첨가하고 그 용액을 5분 동안 교반하였다. 그런 다음 용액을 아세트산에 의해 산성화하고 메탄올에 희석하였다. R4203을 RV-HPLC에 의해 정제하였다.
중합체 합성을 위한 개시제를 BOC 기능성을 트라이플루오로 아세트산을 통해 제거하여 TFA 염을 생성함으로써 제조하였다. 171 mg의 R4203을 500 μl의 트라이플루오로 아세트산에 녹이고 실온에서 수분 동안 인큐베이션하였다. 아래에 나타낸 R4235를 RV-HPLC에 의해 정제하고 LCMS 및 NMR에 의해 확인하였다.
화합물 R4235
그런 다음 R4235를 사용하여 MPC 중합체 합성을 개시하여 아래에 나타낸 화합물 R4258을 제조하였다:
25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, 47.7 uL의 DMF 중의 개시제 (R4235)의 스톡 용액 (63 uL의 DMF에 6.3 mg의 개시제)을 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체 (2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA) 포스포릴콜린 (PC))의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에서 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 퀀칭하고, 전환 및 MW 분석을 위해 샘플링함. 투석에 의해 정제하고 (MWCO는 1 kDa임) 4회 세척한 후 냉동-건조시켰다.
마지막으로, R4341을, 단독의 일차 아민에 요오도아세테이트 기를 놓음으로써 합성하였다. 중합체 R4258 (100 mg)을 물에 녹이고 포스페이트 완충액을 첨가하였다. 이것에 THF 중의 요오도아세트산 N-하이드록시 석신이미드 에스테르의 6.5 mg/ml 용액 100 μl를 첨가하였다. 5분 후에 다른 100 μl의 에스테르를 첨가하고 그 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 물로 ~10 mL로 희석하였다. 여과하였다. 원심분리로 투석하였다 (30 kDa 컷-오프). 재투석을 4회 실시하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다: 생성물: Mp: 221.9 kDa, PDI 1.10.
실시예
20. 중합체 R4118의 합성
중합체 R4118을 아래에 나타낸다:
먼저, R4180을 상기 기술한 대로 합성하였다. 그런 다음 R4180을 다음의 반응에 사용하여 RXXX1을 제조하였다:
화합물 RXXX1
200 mg의 R4180 및 107 mg의 RXXX1을 아세토니트릴 (2 ml)에 녹였다. 이것에 200 μL의 N,N'-다이아이소프로필에틸아민 및 175 μL의 프로필포스폰산 무수물 (에틸 아세테이트 중의 50%)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 약 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 거기에 3 ml의 물을 첨가하고 용액을 5분 동안 교반하였다. 그 용액을 아세트산으로 산성화하고 1 ml의 메탄올로 희석하였다. RXXX1을 RV-HPLC에 의해 정제하였다.
BOC 보호기를 TFA로 제거하여 TFA 염을 제조하였다. 140 mg의 RXXX1을 1.5 ml의 다이클로로메탄에 녹였다. 이것에 1.5 ml의 TFA를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 약 2시간 45분 동안 인큐베이션하였다. TFA 및 다이클로로메탄을 진공 제거하고 고체 물질을 물/아세토니트릴에 녹였다. 아래에 나타낸 화합물 R4037을 RV-HPLC에 의해 정제하고 LCMS에 의해 확인하였다.
다음으로, MPC 중합체를 개시제로서 R4037을 사용하여 제조하였다. 10 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, 57.7 uL의 DMF 중의 개시제 (R4037)의 스톡 용액 (62 uL의 DMF에 6.2 mg의 개시제)을 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.9 mg의 Cu(I)Br을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체 (2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA) 포스포릴콜린 (PC))의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다.
반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에서 밀봉하였다. 반응을 밤새 RT에서 진행되도록 놓아두었다 (20시간). 그런 다음 아래에 나타낸 R4053에 대해 SEC/MALS를 수행하였고 1.073의 PDI 및 213.7 kDa의 Mp를 가지는 것으로 나타났다.
화합물 R4053.
그런 다음 화합물 R4118을, R4053을 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응시킴으로써 제조하였다. 150 mg의 중합체를 물에서 그것이 녹을 때까지 교반하였고 포스페이트 완충액을 첨가하였다. 3 mg의 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 450 μl의 THF에 녹였다. 거기에 150 μl의 NHS 에스테르 용액의 2개의 부분일정액을 5분 간격으로 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그것을 ~10 mL로 물을 사용하여 희석하고 원심분리 및 투석하였다 (30 K 컷오프). ~10 mL의 물로 5회 재-투석하였다.
상층액을 ~10 mL의 물에 녹이고, 여과하고 동결건조시킨다: SEC/MALS: Mp 215.3kDa, PDI 1.1.
실시예
21. 중합체 R4440의 합성
먼저, R4180 (상기 참조)을 아래에 나타낸 것과 같이 반응시켜서 BOC 보호된 개시제를 제조하였다:
화합물 R4810 화합물 R4247
R4180 (200 mg) 및 R4247 (111 mg)을 2 ml의 아세토니트릴에 녹였다. 200 ｕl의 N,N'-다이아이소프로필에틸아민을 첨가하고 이어서 175 ｕl의 프로필포스폰산 무수물을 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 물을 첨가하고, 이어서 아세트산과 메탄올을 첨가하였다. R4302를 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 생성물의 정체를 LCMS에 의해 확인하였다.
다음에, BOC 기를 R4302로부터 TFA를 통하여 제거하여 아래에 나타낸 R4315를 제조하였다.
173 mg의 R4302를 500 ｕl의 TFA에 녹이고 실온에서 80분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 물/아세토니트릴로 희석하고 생성물을 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 생성물의 정체를 LCMS 및 NMR로 확인하였다.
화합물 4315를 중합체 합성에 대한 개시제로서 사용하여 MPC 중합체 (R4367, 아래에 나타냄)를 제조하였다. 25 mL의 Schlenk튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제 (R4315)의 스톡 용액 (68 uL의 DMF 중의 6.8 mg의 개시제) 56.2 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 Cu(I)Br을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체 ({2-[(2-메틸프로프-2-엔오일)옥시]에톡시}[2-(트라이메틸아미노)에톡시]포스핀산)의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 퀀칭, 전환 및 MW 분석에 대한 샘플링. 투석에 의해 정제 (MWCO는 1 kDa임)하고 4회 세척 후 냉동-건조시켰다. 그 결과의 중합체를 SEC/MALS에 의해 분석하였다: PDI 1.1 및 Mp 200.7 kDa.
마지막으로, 아래에 제시한 화합물 R4440을, 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 R4367에 커플링함으로써 제조하였다. 100 mg의 R4367을 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 80 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. 완충된 용액에 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕL를 첨가하였다. 그것을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 추가로 100 ｕL를 더 넣고, 추가로 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과한 후, 원심분리 및 투석 (30 kDa 컷-오프)하였다. 물로부터 재-투석을 4회 하였다. ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS 분석: Mp 206 kDa, PDI 1.1.
실시예
22. 중합체 R4342의 합성
먼저, R4180 (상기 참조)을 BOC-His(3-Me)-OH와 반응시켜서 아래의 반응도에 도시된 것과 같이 R4176을 제조하였다:
화합물 R4180BOC-His(3-Me)-OH
165 mg의 R4180 및 50 mg의 BOC-His(3-Me)-OH를 아세토니트릴에 현탁하였다. R4180은 녹았지만 BOC-His(3-Me)-OH는 녹지 않았다. 165 ｕl의 N,N-다이아이소프로필에틸아민을 첨가하고 산을 녹였다. 다음에, 144 ｕl의 폴리포스폰산 무수물 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다른 80 ｕl의 폴리포스폰산 무수물 용액을 첨가하고 그 반응 혼합물을 다시 45분 동안 놓아두었다. 그런 다음 반응 혼합물을 아세트산으로 산성화하고 메탄올로 희석하였다. R4176을 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
다음에, R4176의 BOC 기를 TFA를 통하여 제거하여 아래에 나타낸 화합물 R4182를 제조하였다. 117 mg의 R4176을 500 ｕl의 TFA에 녹이고 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 물/아세토니트릴로 희석하고 R4182를 RV-HPLC에 의하여 정제하였다.
화합물 R4182를 MPC 중합체 합성에 대한 기질로서 사용하여 화합물 R4259를 제조하였다. 25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제 (R4182)의 스톡 용액 (68 uL의 DMF 중의 6.8 mg의 개시제) 57.1 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 포스포릴콜린의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 퀀칭, 전환 및 MW 분석에 대한 샘플링. 투석에 의해 정제 (MWCO는 1 kDa임)하고 4회 세척 후 냉동-건조시켰다. SEC/MALS:PDI 1.1 및 Mp = 225.7 kDa.
마지막으로, 화합물 R4259를 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응시켜서 아래에 제시한 화합물 R4342를 제조하였다. 100 mg의 중합체 R4259를 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 50 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. 거기에 THF 중의 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕL를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 거기에 추가의 100 ｕL의 6.5 mg/mL NHS 에스테르/THF 용액을 첨가하였다. 추가로 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 물로 ~10 mL로 희석하였다. 여과하였다. 투석에 의해 원심분리 (30 kDa 컷-오프)하였다. 재-투석을 4회 하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS: Mp 227.7 kDa, PDI 1.1.
중합체 R4342
실시예
23. 중합체 R4439의 합성
먼저, 상기와 같은 R4180을 아래에 나타낸 2-{[(삼차-부톡시)카르보닐]아미노}-5-(다이메틸아미노)펜탄산 트라이플루오로아세트산 염과 반응시켜서 화합물 R4301을 제조하였다.
화합물 R4180 화합물 R4301
200 mg의 R4180을 2 ml의 아세토니트릴에 녹였다. 이 용액을 녹여놓은 130 mg의 2-{[(삼차-부톡시)카르보닐]아미노}-5-(다이메틸아미노)펜탄산 트라이플루오로아세트산 염에 첨가하였다. 300 μl의 N,N'-다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 175 μl의 프로필포스폰산 무수물 (T3P용액)을 첨가한 것처럼 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 약 30분 동안 실온에 세워두었다. 추가의 200 μl의 DIPEA 및 100 μl의 T3P를 첨가하고 반응 혼합물을 다시 15분 동안 세워두었다. 그 혼합물을 물, 아세트산 및 메탄올로 희석하였다. R4301을 RP-HPLC에 의해 정제하고 LCMS에 의해 확인하였다.
다음에, BOC 보호 모이어티를 R4301로부터 TFA를 통해 제거하여 화합물 R4314를 제조하였다. 93 mg의 R4301을 500 μl의 TFA에 녹였다. 그 반응 혼합물을 20분 동안 실온에서 세워두었다. 그런 다음 반응 혼합물을 물/아세토니트릴로 희석하고 R4314를 RV-HPLC에 의해 정제하였다.
그런 다음 R4314를 MPC 중합체 제조에 대한 기질로서 사용하여 R4366을 제조하였다. 25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제 (R4314)의 스톡 용액 (92 uL의 DMF 중의 9.2 mg의 개시제) 56.9 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 퀀칭, 전환 및 MW 분석에 대한 샘플링. 투석에 의해 정제 (MWCO는 1 kDa임)하고 4회 세척 후 냉동-건조시켰다. SEC/MALS:PDI 1.1, Mp = 233.4 kDa.
마지막으로, R4366을 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응시켜서 (아래에 나타낸) 화합물 R4439를 제조하였다. 100 mg의 중합체 R4366을 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 80 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. 이것에 THF 중의 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕl를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 세워두었고, 그 때 다른 100 ｕl의 에스테르를 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가로 30분 동안 실온에 세워두었다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고, 원심분리 투석하였다 (30 kDa 컷-오프). 물로부터의 재-투석을 4회 하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS: Mp 233.4 kDa, PDI 1.1.
중합체 R4439
실시예
24. R4441의 합성
먼저, R4108 (상기 참조)을 아래 반응도에 나타낸 것과 같이 BOC-Dab(Me2)-OH, TFA 염과 반응시켜서 R4308을 제조하였다:
화합물 R4108BOC-Dab(Me2)-OH, TFA 화합물 R4308
200mg의 R4180을 2 ml의 아세토니트릴에 녹였다. 그런 다음 이 용액을 사용하여 106 mg의 BOC-Dab(Me2)-OH, TFA 염을 녹였다. 200 μl의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 265 μl의 프로필포스폰산 무수물 (T3P)을 첨가하였다. 이것을 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 200 μl의 추가의 DIPEA 및 175 μl의 T3P를 첨가하고 15분 동안 더 인큐베이션하였다. 물을 첨가한 후, 아세트산을 첨가하였다. 메탄올로 희석하였다. R4308을 RP-HPLC를 통해 정제하였다. LCMS에 의해 확인하였다.
다음에, BOC 보호 기를 TFA를 통해 제거하여 R4331을 제조하였다. 135 mg의 R4308을 500 μl의 TFA에 녹였다. 그 반응 혼합물을 15분 동안 세워두었다. R4331을 RV-HPLC에 의해 정제하였다.
그런 다음 R4314를 중합체 합성에 대한 개시제로서 사용하여 중합체 R4368을 제조하였다. 25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제의 스톡 용액 (71 uL의 DMF 중의 7.1 mg의 개시제) 56.2 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉한 다음 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었고 그때 갈색 착색이 일어났다. 그런 다음 반응을 샘플링, 전환 및 MW 분석을 위해 퀀칭하였다. 투석에 의해 정제 (MWCO는 1 kDa임)하고 4회 세척 후 냉동-건조시켰다. SEC/MALS 분석:PDI 1.1, Mp 256.6 kDa.
마지막으로, R4368을 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응시켜서 아래에 나타낸 R4441을 제공하였다. 100 mg의 R4368을 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 80 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. NHS 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕL를 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 놓아 둔 후, 추가로 100 ｕL를 첨가하였다. 30분 동안 정착되도록 허용하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고, 원심분리 투석하였다 (30 kDa 컷-오프). 물로부터의 재-투석을 4회 하였다. ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS R4441 Mp 256.6 kDa, PDI 1.1.
실시예
25. 중합체 R4320의 합성
먼저, R4180 (상기 참조)을 BOC-Lys(Me2)-OH와 반응시켜서 R4196을 제조하였다.
화합물 R4180BOC-L-Lys(Me2)-OH 화합물 R4196
200 mg의 R4180 및 74 mg의 BOC-L-Lys(Me2)-OH를 2 ml의 아세토니트릴에 녹였다. 여기에 200 μl의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 204 μl의 프로필포스폰산 무수물 (T3P)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 실온에서 세워두었다. 그런 다음 반응 혼합물을 물로 희석하고 5분 동안 교반하였다. 마지막으로, 반응 혼합물을 아세트산으로 산성화하고 메탄올로 희석하였다. R4196을 RV-HPLC에 의해 정제하고 생성물을 LCMS에 의해 확인하였다.
다음에, R4196의 BOC 기를 TFA를 통해 제거하여 아래에 나타낸 화합물 R4211을 제조하였다. 153 mg의 R4196을 500 μl의 TFA에 녹였다. 그 용액을 15분 동안 실온에서 정착되도록 놓아두었다. 물/아세토니틸에 의해 희석하였다. RV-HPLC에 의해 정제하였다. 구조는 LCMS 및 NMR에 의해 확인하였다.
다음으로, R4211을 MPC 중합체 제조에 대한 기질로서 사용하여 중합체 R4255를 제조하였다. 25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제의 스톡 용액 (80 uL의 DMF 중의 8 mg의 개시제) 57.7 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 전환 및 MW 분석을 위해 퀀칭하고 샘플링하였다. 투석에 의해 정제 (MWCO는 1 kDa임)하고 4회 세척 후 냉동-건조시켰다. SEC/MALS:PDI 1.076, Mp = 205.3.
마지막으로, 중합체 R4320 (아래에 나타냄)을, 중합체 R4255를 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 커플링시킴으로써 제조하였다. 100 mg의 R4255를 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 80 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. 이것에 THF 중의 NHS 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕl를 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, 추가로 100 ｕl의 NHS 에스테르 용액을 첨가하였다. 그것을 30분 동안 실온에 세워두었다. 물로 ~10 mL 부피로 희석하고, 여과하고, 원심분리하고 투석하였다 (30 kDa MW 컷-오프). ~10 mL로 희석하고 재-투석을 4회 하였다. ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS: Mp 225.7 kDa, PDI 1.1.
실시예
26. 중합체 R4438의 합성
먼저, R4180 (상기 참조)을 아래에 나타낸 것과 같이 BOC-Dap(Me2)-OH TFA 염과 반응시켜서 화합물 R4300을 제조하였다.
화합물 R4180BOC-Dap(Me2)-OH, TFA 화합물 R4300
200 mg의 R4180 및 86 mg의 BOC-Dap(Me2)-OH TFA 염을 2 ml의 아세토니트릴에 녹였다. 여기에 200 μl의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 175 μl의 프로필포스폰산 무수물 용액 (T3P)을 첨가하고 그 용액을 실온에서 약 15분 동안 인큐베이션하였다. 40 mg의 추가의 BOC-Dap(Me2)-OH TFA 염, 200 μl의 추가의 DIPEA및 100 μl의 추가의 T3P를 첨가하고, 이어서 다시 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 물로 희석하고, 아세트산으로 산성화한 후 메탄올로 희석하였다. R4300을 RV-HPLC에 의해 정제하고 LCMS에 의해 확인하였다.
다음으로, R4300 상의 BOC 기를 아래의 반응도에서 볼 수 있는 것과 같이 TFA를 통해 제거하여 R4307을 제조하였다:
화합물 R4300 화합물 R4307
118 mg의 R4300을 500 ｕl의 TFA에 녹이고 반응 혼합물을 20분 동안 세워두었다. 물/아세토니트릴을 첨가하고 화합물 4307을 RF-HPLC에 의해 정제하고 LCMS에 의해 확인하였다.
다음에, R4307을 MPC 중합체 합성에 대한 개시제로서 사용하였다. 25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제의 스톡 용액 (68 uL의 DMF 중의 6.8 mg의 개시제) 55.5 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 전환 및 MW 분석을 위해 퀀칭하고 샘플링하였다. 투석에 의해 정제 (MWCO는 1 kDa임)하고 세척 후 냉동-건조 과정을 수행했다. SEC/MALS: Mp 230.8 kDa, PDI 1.1.
마지막으로, 화합물 R4438 (아래에 나타냄)을 제조하기 위하여 요오도아세트아미드 기능성을 R4307에 첨가하였다. 100 mg의 R4307을 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 80 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. 그런 다음 NHS 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕl를 첨가하고, 이어서 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 추가로 100 ｕl의 NHS 에스테르의 6.5 mg/mL 용액을 첨가하고 약 40분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고, 원심분리하고 투석하였다 (30 kDa 컷-오프). 물로부터의 재-투석을 4회 하였다. ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS: Mp 230.8 kDa, PDI 1.1.
중합체 R4438
실시예
27. 중합체 R4451의 합성
먼저, R4180 (상기 참조)을 아래에 나타낸 것과 같이 BOC-homoarg-OH.HCl과 반응시켜서 R4366을 제조하였다:
화합물 R4180 BOC-homoarg-OH.HCl 화합물 R4366
200 mg의 R4180을 2 ml의 아세토니트릴에 녹였다. 이 용액을 부분적으로 가용성인 80 mg의 BOC-homoarg-OH.HCl에 첨가하였다. 175 μl의 다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 첨가하였고 BOC-homoarg-OH.HCl이 모두 침전으로 나타났다. 그러나, 200 μl의 프로필포스폰산 무수물 용액 (T3P)을 첨가했을 때에는 모든 고체가 녹았다. 이 반응 혼합물을 40분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 다른 81 mg의 BOC-homoarg-OH.HCl을 첨가하고 이어서 200 μl의 추가의 DIPEA 및 175 μl의 추가의 T3P를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 R4366을 RV-HPLC에 의해 정제하고 LCMS에 의해 확인하였다.
다음으로, 제시된 것과 같이 BOC 기를 제거하여 화합물 R4354를 제조하였다:
화합물 R4366 화합물 R4354
90 mg의 R4366을 500 μl의 TFA에 녹였다. 30분 동안 실온에 두었다. 물/아세토니트릴을 첨가하였다. RV-HPLC에 의해 정제하고 LCMS 및 NMR에 의해 확인하였다.
다음으로, R4354를 R4386을 제조하기 위한 MPC 중합체 합성에 대한 기질로서 사용하였다. 25 mL의 Schlenk 튜브에 4.8 mg의 2,2'-비피리딜을 로딩한 후, DMF 중의 개시제 (R4354)의 스톡 용액 (74 uL의 DMF 중의 7.4 mg의 개시제) 58.3 ｕL를 로딩하였다. 스톡 용액을 탈기한 후 2.8 mg의 CuBr을 첨가하고, 탈기한 후 에탄올 중의 단량체의 스톡 용액 (4 mL의 에탄올 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 1시간 동안 탈기하고 3 psi의 Ar 하에 밀봉하였다. 반응을 20시간 동안 RT에서 진행되도록 놓아두었다. 갈색 착색: 전환 및 MW 분석을 위해 퀀칭하고 샘플링하였다. 투석에 의해 정제 (MWCO는 3.5 kDa임)한 후 냉동-건조 과정을 수행했다. SEC/MALS PDI 1.1 Mp 258.4 kDa.
마지막으로, R4551 (아래에 나타냄)을 제조하기 위하여 요오도아세트아미드 기능성을 R4386에 첨가하였다. 100 mg의 R4386을 800 ｕl의 물에 녹였다. 이것에 80 ｕl의 0.5 M pH 7.4 인산나트륨 완충액을 첨가하였다. 요오도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 6.5 mg/mL 용액 100 ｕl를 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고 추가로 100 ｕl의 NHS 에스테르를 첨가하였다.
실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 물로 ~10 mL로 희석하고, 여과하고, 원심분리하고 투석하였다 (30 kDa 컷-오프). 물로부터의 재-투석을 4회 하였다. ~10 mL로 희석하고, 여과하고 동결건조하였다. SEC/MALS: Mp 258.4 kDa, PDI 1.1.
화합물 R4451.
실시예
28. PEG 시약의 합성
PEG 시약을 편리하게 NHS 에스테르의 아민에의 커플링을 통하여 만든다. 아민 기능성으로 종결되는 분지형 PEG가 상업적으로 활용가능하다. 예를 들어, 다음의 PEG 요오도아세트아미드 시약은 본 발명에 따라 사용될 수 있다:
식에서 n은 PEG 유닛의 수이다. PEG 시약 R500은 편리하게는 다음의 반응에 의해 합성된다:
실시예
29
rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S, Q347C)에 대한 포유류 발현 벡터, 세포주 및 발현 최적화
rhBuChE534 (C66Y) - Fc (L234A, L235E, G237A, A330S, P331S, Q347C) 구성물을 함유하는 DNA 단편을 퓨로마이신 내성 유전자를 코드화하는 포유류 발현 벡터 안에 클론하였다. 삽입된 서열은 SEQ ID NO. 9에 나타낸다. 삽입된 BuChE - Fc 융합을 가지는 발현 벡터는 구성물 14로 불린다. 구성물 14를 CHO 세포 안에 트랜스펙션하고 안정하게 트랜스펙션된 푸울을 구성하였다. 안정한 푸울에 대해 세포주를 발달시키고 C98로 불리는 안정하게 트랜스펙션된 클론을 분리하였다. 진동 플라스크 연구를 수행하여 생성된 단백질의 양을 최대화하기 위하여 어떤 배지 및 조건을 사용할 수 있는 지를 측정하였다. 각 플라스크에 대한 시딩 밀도는 0.4 x 106 세포/ml이었다. 그 결과를 아래의 표 8에 나타낸다:
| 플라스크 # | 배지 | 공급 조건 | 공급량 | 공급일 | 온도 변동? | 피크 역가 (mg/L) |
| 1 | CD OptiCHO | 글루코오스 단독 |
4 g/L까지 | 필요에 따라 | 없음 | 60 |
| 2 | CD OptiCHO | CD 효율적인 공급 C | 10% | 3,6 | 없음 | 40 |
| 3 | CD OptiCHO | CD 효율적인 공급 C | 10% | 3,6 | 있음 | 35 |
| 4 | CD FortiCHO | 글루코오스 단독 |
4 g/L까지 | 필요에 따라 | 없음 | 145 |
| 5 | CD FortiCHO | CD 효율적인 공급 C (2x) | 5% | 3,6 | 없음 | 475 |
| 6 | CD FortiCHO | CD 효율적인 공급 C (2x) | 5% | 3,6 | 있음 | 265 |
| 7 | ActiCHO P | 글루코오스 단독 |
4 g/l까지 | 필요에 따라 | 없음 | 150 |
| 8 | ActiCHO P | ActiCHO 공급 A+B | 3% + 0.3% | 3 | 없음 | 100 |
| 9 | ActiCHO P | ActiCHO 공급 A+B | 3% + 0.3% | 3 | 있음 | 80 |
| 10 | BalanCD CHO A | 글루코오스 단독 |
4 g/L까지 | 필요에 따라 | 없음 | 35 |
| 11 | BalanCD CHO A | BalanCD 공급 3 | 15% | 3,6 | 없음 | 40 |
| 12 | BalanCD CHO A | BalanCD 공급 3 | 15% | 3,6 | 있음 | 40 |
실시예
30: 단일분자
개시제
이전의 ATRP 개시제에 공유 부착된 염기성 기 (예컨대 구아니딘 또는 삼차 아민)의 도입은 리간드가 첨가되었을 때 (2,2'-비피리딘으로 알려져 있는 bpy) 구리 할로겐화물 종 (CuBr)과 그런 염기성 기들의 잠재적인 복합체화로 인해 ATRP에 의한 중합반응 과정 동안 잠재적인 간섭을 초래하였다. 이 실례는 발명에서 청구된 그런 염기성 기가 또한 ATRP 과정에서 리간드로서 작용할 수 있을 것인지 그리고 그런 개시제를 사용하여 주문-맞춤식 중합체를 얻고자 할 때 그런 화합물의 사용을 생략할 수 있는지를 시험한다.
공유적으로 부착된 삼차 아민기를 함유하는 단일분자 ATRP 개시제는 이미 스티렌의 중합반응에서 보고된 바 있다 (polym. Preprint 2012 43(2), p 245). 비닐계 단량체 (스티렌, 메틸 메타크릴레이트)에 대한 ATRP 시스템에서 그런 개시제를 사용할 때의 목표는 생체활성 화합물이 포함되는 경우에 컨쥬게이션 목적에 대해서가 아니라 개시제에 대한 아민의 공유 부착에 의해 단지 외부 제제의 사용을 억압하는 것이었다. 단일분자 개시제에 대한 연구는 단지 가열을 필요로 하는 유기 용매 (톨루엔) 중의 스티렌 및 MMA에 대해서만 수행되었다. 본 저자들에 따르면, 분자량의 적절한 제어가 얻어졌다. 고분자량은 더 광범위한 분포로 이루어졌다.
ATRP 과정에서 리간드로서 구아니딘 분자의 사용은 구아니딘-피리딘 유도체 (다이메틸에틸렌구아니딘)메틸렌피리딘 (DMEGpy) 또는 (테트라메틸구아니딘)메틸렌피리딘 (TMGpy)으로서 보고되었다. 이들 구조는 스티렌 및 메틸 메타크릴레이트의 중합반응을 제어하기 위한 ATRP 과정에서 리간드로서 사용되지 않았다. 저분자량 중합체만이 얻어졌다 (10,000Da 아래).
이 실례는 개시제에 새롭게 도입된 기들이 상기 기술된 전통적인 ATRP 과정을 간섭하지 않는지를 시험하고 그리고 ATRP 중합반응 과정에서 리간드로서 사용될 가능성에 대해 조사한다.
중합체 형성 및 분자량의 제어에 대해 조사하기 위하여 임의의 bpy 도입이 없이 제1 블록 폴리(HEMA-PC)를 합성하였다 (단계 1). 이 단계에 이어서 bpy의 도입 및 사슬 연장 및 아래의 반응도에 따르는 시스템의 생명성에 대해 조사하기 위한 단량체의 증분적 첨가 (단계 2)가 이어진다.
화합물 R4235를 참조로서 사용하였다. 사용된 모든 다른 화합물의 구조를 아래에 기술한다:
사용된 프로토콜은 모든 개시제에 대해 동일하였다:
리간드(ligand)로서 bpy 없는 중합반응 프로토콜. DMF 중의 100 mg/mL로서 개시제의 스톡 용액을 새롭게 제조하였다. 5x10-6 mol의 개시제를 Schlenk 튜브에 도입하기 위해 용액을 분배하였다. 용액을 2.48 mg의 CuBr (1.7 x10-5mol)의 첨가 전에 탈기하였다 (색의 변화 없음). 에탄올 중의 HEMA-PC의 스톡 용액 (4 mL 중의 1 g)을 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 3 psi 하에 정착시키고 중합반응 및 RT에서 20시간 동안 RT에서 진행되도록 허용하였다.
반응은 무색으로 유지되었고 부분표본을 취하여 각각의 경우에 전환 및 분자량을 분석하였다 (단계 1에 대해 아래의 표 참조).
단계 2에서, bpy를 단계 1의 미정제 혼합물에 첨가하고 바로 이어서 용액 중의 단량체 (HEMA-PC)(2 mL의 에탄올 중의 1 g) 및 반응 혼합물 내부의 4.8 mg의 bpy (3.1x10-5mol)를 증분적으로 첨가하였다 (갈색의 착색이 즉시 나타남). 반응을 밀봉하고, 철저하게 탈기하고, 균질화하고 최종 퀀칭전에 점성이 될 때까지 실온에서 진행되도록 허용하였다.
그 결과를 아래의 표 9에 나타낸다:
| 제1 차단 (bpy 도입이 없음) 단계 1 |
제2 차단 (외부 리간드로서 bpy의 도입 후 중합반응이 계속됨) 단계 2 |
||||||||
| 개시제 | Mn | Mp | PDI | 전환 | Mn | Mp | PDI | 전환 | |
| 참조 | R4235 | N/A | N/A | N/A | N/A | 335 | 406 | 1.15 | 92 |
| 구아니딘 시리즈 |
R4315 | 220 | 245 | 1.15 | 81 | 350 | 415 | 1.15 | 95 |
| R4334 | 255 | 318 | 1.2 | 96 | 368 | 436 | 1.2 | 95 | |
| R4037 | 210 | 255 | 1.2 | 91 | 354 | 410 | 1.15 | 95 | |
| R4354 | 260 | 330 | 1.2 | 94 | 360 | 420 | 1.2 | 95 | |
| 삼차아민 시리즈 |
R4314 | 215 | 283 | 1.2 | 94 | 323 | 410 | 1.2 | 91 |
| R4211 | 218 | 280 | 1.2 | 90 | 354 | 425 | 1.15 | 90 | |
| 히스티딘 시리즈 |
R4182 | 205 | 260 | 1.2 | 95 | 335 | 415 | 1.2 | 97 |
참조 (화합물 R4235)에 대한 bpy가 없을 때 bpy가 있을 때 얻어진 중합체 형성이 없었다. 중합반응은 리간드로서 비피리딜이 반응 혼합물 내부에 도입될 때에만 진행되어 원하는 분자량 및 높은 전환율이 이루어졌다.
표에 열거된 다른 모든 개시제들 (화합물 R4315, R4334, R4037, R4354, R4314, R4211 및 R4182)에 대해 중합반응은 단계 1에 대해 반응에 도입된 임의의 bpy 리간드 없이 모든 경우에 진행되었다. 제어된 분자량을 낮은 PDI (1.2 및 그 아래)로 얻었다. 단계 2에 대하여 HEMA-PC 단량체의 증분적 첨가로 bpy를 첨가할 때, 갈색 착색이 즉시 나타났고, 그것은 구리 종과 bpy와의 재복합체화를 시사한다. 중합반응은 모든 경우에 단계 1에서 얻어진 중합체의 사슬 연장에 의해 원하는 분자량 및 좁은 다중분산성으로 재개되었다.
새롭게 도입된 기는 중성 pH에서 컨쥬게이션에 참여할 뿐 아니라 ATRP에서 효과적인 리간드로서도 작용할 수 있다. 그런 중합반응에 대해, 외부 리간드 (예컨대 bpy)의 사용은 불필요하다.
상기 또는 아래에서 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공보, 승인 번호 등은 각각의 개별적인 항목들이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적에 대해 전체 내용이 참조로 포함한다. 만약 서열의 상이한 버전이 상이한 시점에서의 승인 번호와 관련된다면, 본 출원의 유효한 출원일에서의 승인 번호와 관련된 버전이라는 의미이다. 유효한 출원일은 적용가능하다면 승인 번호와 관련된 우선권 출원의 실제 출원일 또는 출원일보다 앞선 거을 의미한다. 마찬가지로 만약 상이한 버전의 공보, 웹사이트 등이 상이한 시점에 공개된다면, 다르게 표시되지 않는 한 출원의 유효한 출원일에 가장 가깝게 공개된 버전을 의미한다. 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시예 또는 측면은 구체적으로 다르게 표시되지 않는 한 임의이 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 비록 본 발명이 명료성 및 이해를 목적으로 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 특정 수정 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있는 것이 드러날 것이다.
서열 목록
SEQ ID NO. 1 (인간 부티릴콜린에스테라제 P06276.1)
MHSKVTIICI RFLFWFLLLC MLIGKSHTED DIIIATKNGK VRGMNLTVFG GTVTAFLGIP
YAQPPLGRLR FKKPQSLTKW SDIWNATKYA NSCCQNIDQS FPGFHGSEMW NPNTDLSEDC
LYLNVWIPAP KPKNATVLIW IYGGGFQTGT SSLHVYDGKF LARVERVIVV SMNYRVGALG
FLALPGNPEA PGNMGLFDQQ LALQWVQKNI AAFGGNPKSV TLFGESAGAA SVSLHLLSPG
SHSLFTRAIL QSGSFNAPWA VTSLYEARNR TLNLAKLTGC SRENETEIIK CLRNKDPQEI
LLNEAFVVPY GTPLSVNFGP TVDGDFLTDM PDILLELGQF KKTQILVGVN KDEGTAFLVY
GAPGFSKDNN SIITRKEFQE GLKIFFPGVS EFGKESILFH YTDWVDDQRP ENYREALGDV
VGDYNFICPA LEFTKKFSEW GNNAFFYYFE HRSSKLPWPE WMGVMHGYEI EFVFGLPLER
RDNYTKAEEI LSRSIVKRWA NFAKYGNPNE TQNNSTSWPV FKSTEQKYLT LNTESTRIMT
KLRAQQCRFW TSFFPKVLEM TGNIDEAEWE WKAGFHRWNN YMMDWKNQFN DYTSKKESCV GL
천연 리더, C66Y 돌연변이 및 C-말단 제거된 도메인은 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO. 2 (바람직한 rBuChE534(C66Y)-GS10-Fc(w/돌연변이) 융합)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGGGSGGG
SGGGSDKTHT CPPCPAPEAE GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPSSIEKT
ISKAKGQPRE PCVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
BuChE는 GS 링커 및 밑줄친 야생형으로부터의 아미노산 변화를 가지는 IgG1-Fc에 대한 연결 (밑줄로 표시됨)을 통해 연결되었다.
SEQ ID NO. 3 (인간 AChE AAA68151.1)
MRPPQCLLHT PSLASPLLLL LLWLLGGGVG AEGREDAELL VTVRGGRLRG IRLKTPGGPV
SAFLGIPFAE PPMGPRRFLP PEPKQPWSGV VDATTFQSVC YQYVDTLYPG FEGTEMWNPN
RELSEDCLYL NVWTPYPRPT SPTPVLVWIY GGGFYSGASS LDVYDGRFLV QAERTVLVSM
NYRVGAFGFL ALPGSREAPG NVGLLDQRLA LQWVQENVAA FGGDPTSVTL FGESAGAASV
GMHLLSPPSR GLFHRAVLQS GAPNGPWATV GMGEARRRAT QLAHLVGCPP GGTGGNDTEL
VACLRTRPAQ VLVNHEWHVL PQESVFRFSF VPVVDGDFLS DTPEALINAG DFHGLQVLVG
VVKDEGSYFL VYGAPGFSKD NESLISRAEF LAGVRVGVPQ VSDLAAEAVV LHYTDWLHPE
DPARLREALS DVVGDHNVVC PVAQLAGRLA AQGARVYAYV FEHRASTLSW PLWMGVPHGY
EIEFIFGIPL DPSRNYTAEE KIFAQRLMRY WANFARTGDP NEPRDPKAPQ WPPYTAGAQQ
YVSLDLRPLE VRRGLRAQAC AFWNRFLPKL LSATDTLDEA ERQWKAEFHR WSSYMVHWKN
QFDHYSKQDR CSDL
리더 펩티드는 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO. 5 (아릴다이알킬포스파타제[Desulfarculus baarsii DSM 2075; ADK83762.1])
MAAKMVNTVA GPVSADELGL TLMHEHIVFG YPGWNGDVTL GAFDRPAAVK QAVETLSALK
QAFGLGTLVD ATPNETGRDP LLLKEVSEKS GVNIVCSTGY YSQAEGGAAY FAFRASLGDA
VAEIREMFLT ELTKGVADTG VRPGVIKLAS SQGQITDYEK MFFTAAVAAQ KETGAPIITH
TEHGTMGPEQ AKFLLELGAD PKRTMIGHMC DNLDLDYQEA VLRQGVYVSW DRMGLQGLAG
CPMEATRYPV LNELIQRGWA KQLMLSHDSI NTWLGRPLSI PEAALPMVID WRPDHIFNKV
APALLAGGAT QADLDVILKD NPRRLFAGV
SEQ ID NO. 6 (인간 PON 1, P27169.3)
MAKLIALTLL GMGLALFRNH QSSYQTRLNA LREVQPVELP NCNLVKGIET GSEDLEILPN
GLAFISSGLK YPGIKSFNPN SPGKILLMDL NEEDPTVLEL GITGSKFDVS SFNPHGISTF
TDEDNAMYLL VVNHPDAKST VELFKFQEEE KSLLHLKTIR HKLLPNLNDI VAVGPEHFYG
TNDHYFLDPY LQSWEMYLGL AWSYVVYYSP SEVRVVAEGF DFANGINISP DGKYVYIAEL
LAHKIHVYEK HANWTLTPLK SLDFNTLVDN ISVDPETGDL WVGCHPNGMK IFFYDSENPP
ASEVLRIQNI LTEEPKVTQV YAENGTVLQG STVASVYKGK LLIGTVFHKA LYCEL
SEQ ID NO. 7 (롤리고 불가리스 Q7SIG4.1로부터의 다이아이소프로필플루오로포스파타제)
MEIPVIEPLF TKVTEDIPGA EGPVFDKNGD FYIVAPEVEV NGKPAGEILR IDLKTGKKTV
ICKPEVNGYG GIPAGCQCDR DANQLFVADM RLGLLVVQTD GTFEEIAKKD SEGRRMQGCN
DCAFDYEGNL WITAPAGEVA PADYTRSMQE KFGSIYCFTT DGQMIQVDTA FQFPNGIAVR
HMNDGRPYQL IVAETPTKKL WSYDIKGPAK IENKKVWGHI PGTHEGGADG MDFDEDNNLL
VANWGSSHIE VFGPDGGQPK MRIRCPFEKP SNLHFKPQTK TIFVTEHENN AVWKFEWQRN
GKKQYCETLK FGIF
SEQ ID NO. 8 (인간 IgG1)
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
SEQ ID NO. 9 (DNA 서열 바람직한 BuChE-GS10-Fc (w/돌연변이)융합)
GCTAGCGCCG CCACCATGGC ATGCCTCGGA TTTCAAAGAC ATAAAGCCCA GTTGAACCTC
GCCACTAGAA CCTGGCCTTG CACCCTGCTG TTCTTCCTCC TGTTCATTCC GGTGTTCTGC
AAGGCTGAGG ACGACATCAT CATCGCTACC AAGAATGGAA AGGTCCGCGG TATGAACCTT
ACGGTGTTCG GCGGAACTGT CACTGCCTTC TTGGGGATCC CATACGCACA ACCCCCACTT
GGCAGACTGC GCTTTAAGAA ACCTCAATCG CTCACGAAGT GGAGCGATAT CTGGAACGCG
ACCAAGTACG CAAATAGCTG CTACCAGAAT ATCGATCAGA GCTTCCCCGG ATTCCACGGC
TCGGAAATGT GGAACCCGAA CACCGATCTG TCGGAGGATT GCCTGTACCT GAACGTCTGG
ATCCCGGCCC CTAAGCCGAA AAATGCTACC GTGTTGATCT GGATCTACGG GGGAGGATTC
CAAACCGGAA CTTCCAGCCT GCACGTCTAC GACGGAAAGT TTTTGGCGCG CGTGGAGCGG
GTCATTGTGG TGTCCATGAA TTACAGAGTG GGGGCTCTCG GATTCCTGGC ACTGCCAGGT
AACCCAGAGG CCCCGGGAAA CATGGGCCTG TTCGACCAGC AGCTCGCGCT TCAGTGGGTG
CAGAAGAATA TCGCCGCCTT TGGCGGTAAC CCGAAGTCGG TGACTCTCTT TGGCGAATCA
GCCGGAGCTG CATCAGTCTC CCTTCATCTG TTGTCCCCCG GAAGCCACTC GCTGTTCACC
AGGGCGATCC TGCAATCCGG ATCCTTCAAC GCCCCATGGG CGGTTACTTC ACTTTACGAG
GCCCGTAACC GGACCCTTAA CCTGGCAAAG CTCACCGGAT GTAGCCGCGA GAACGAAACC
GAAATCATAA AGTGCCTGCG AAACAAAGAC CCACAAGAAA TCCTCCTGAA TGAGGCATTC
GTGGTCCCAT ACGGTACCCC GCTCTCAGTG AACTTCGGCC CCACTGTGGA CGGAGACTTC
CTGACCGACA TGCCGGACAT TTTGCTGGAG CTGGGCCAGT TCAAGAAAAC GCAGATCCTG
GTGGGCGTCA ACAAAGATGA AGGAACTGCG TTCCTCGTGT ACGGCGCCCC GGGCTTCTCA
AAGGACAACA ATTCCATCAT TACGCGGAAG GAGTTCCAAG AAGGGCTGAA AATCTTCTTC
CCTGGAGTGT CGGAATTTGG AAAGGAAAGC ATCCTGTTCC ACTACACCGA CTGGGTGGAC
GATCAGCGGC CGGAAAACTA CCGGGAGGCG CTGGGTGATG TGGTCGGAGA CTATAACTTC
ATCTGCCCGG CCCTGGAGTT TACCAAAAAG TTTTCCGAAT GGGGGAATAA TGCTTTCTTT
TACTACTTCG AACATAGAAG CTCGAAGCTC CCTTGGCCGG AATGGATGGG AGTTATGCAC
GGGTATGAAA TCGAGTTTGT CTTTGGGCTC CCTCTGGAGC GCAGGGATAA CTACACTAAA
GCCGAAGAGA TCCTGTCACG CTCGATCGTG AAGCGGTGGG CGAATTTCGC GAAGTACGGA
AATCCAAACG AAACTCAGAA CAACTCGACC TCGTGGCCGG TGTTCAAGTC TACCGAGCAG
AAATACCTCA CTCTGAATAC TGAATCAACC CGCATTATGA CTAAGCTCAG GGCCCAGCAA
TGTCGGTTCT GGACTTCCTT CTTCCCGAAA GTGCTCGAAA TGACTGGCGG TGGATCCGGA
GGCGGATCGG GTGGAGGCTC CGACAAGACG CACACCTGTC CGCCCTGCCC TGCCCCTGAA
GCCGAGGGAG CACCGTCGGT GTTTCTCTTC CCGCCAAAGC CAAAGGACAC TCTGATGATC
TCGCGCACTC CAGAGGTGAC TTGCGTCGTC GTGGATGTCA GCCACGAGGA CCCAGAAGTG
AAGTTTAACT GGTACGTGGA TGGGGTGGAA GTCCACAACG CTAAGACCAA GCCAAGGGAA
GAACAATACA ATTCAACCTA CCGCGTCGTG TCCGTCCTGA CCGTGCTGCA CCAAGATTGG
CTGAACGGAA AGGAGTACAA GTGTAAAGTG TCAAACAAAG CCCTCCCGTC ATCCATTGAA
AAGACTATCT CGAAGGCGAA AGGTCAGCCT AGAGAGCCGT GCGTGTATAC TCTCCCACCG
TCGCGCGATG AACTGACCAA AAACCAGGTG TCCCTTACGT GTCTCGTGAA GGGGTTCTAC
CCGTCCGACA TCGCAGTGGA GTGGGAGTCA AATGGCCAAC CGGAAAACAA TTACAAGACT
ACCCCGCCTG TGCTGGACAG CGATGGATCC TTTTTCTTGT ACAGCAAGCT GACCGTCGAC
AAGAGCCGGT GGCAGCAGGG GAACGTGTTT AGCTGCAGCG TGATGCATGA AGCTCTGCAT
AATCATTACA CTCAGAAAAG CCTGTCGCTC TCGCCCGGAA AGTAATAATA CGTAGAATTC
SEQ ID NO. 10 (rBuChE534)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTG
SEQ ID NO. 11 (rBuChE524 절단물 w/C66Y)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTS
SEQ ID NO. 12 (rBuChE524GGGC 절단물 w/C66Y)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSGGGC
SEQ ID NO. 13 (rBuChE534GGC 절단물 w/C66Y)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGGGC
SEQ ID NO. 14 (rBuChE534(C66Y)-GS10-Fc(wt) 융합)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGGGSGGG
SGGGSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
GS 링커는 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO. 15 (rBuChE534(C66Y)-GS10-Fc(no Q347C w/ 이펙터 기능 돌연변이) 융합)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGGGSGGG
SGGGSDKTHT CPPCPAPEAE GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPSSIEKT
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
GS 링커 및 이펙터 기능 돌연변이가 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO. 16 (rBuChE534-GS10-Fc(wt) 융합)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCCQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGGGSGGG
SGGGSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
GS 링커가 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO. 17 (rBuChE534 (C66Y)-GS10-Fc(wt) 융합)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCYQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGGGSGGG
SGGGSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
GS 링커가 밑줄로 표시된다.
SEQ ID NO. 18 (리더 펩티드)
MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKA
SEQ ID NO. 19 (hBuChE 성숙한 단백질 서열)
EDDIIIATKN GKVRGMNLTV FGGTVTAFLG IPYAQPPLGR LRFKKPQSLT KWSDIWNATK
YANSCCQNID QSFPGFHGSE MWNPNTDLSE DCLYLNVWIP APKPKNATVL IWIYGGGFQT
GTSSLHVYDG KFLARVERVI VVSMNYRVGA LGFLALPGNP EAPGNMGLFD QQLALQWVQK
NIAAFGGNPK SVTLFGESAG AASVSLHLLS PGSHSLFTRA ILQSGSFNAP WAVTSLYEAR
NRTLNLAKLT GCSRENETEI IKCLRNKDPQ EILLNEAFVV PYGTPLSVNF GPTVDGDFLT
DMPDILLELG QFKKTQILVG VNKDEGTAFL VYGAPGFSKD NNSIITRKEF QEGLKIFFPG
VSEFGKESIL FHYTDWVDDQ RPENYREALG DVVGDYNFIC PALEFTKKFS EWGNNAFFYY
FEHRSSKLPW PEWMGVMHGY EIEFVFGLPL ERRDNYTKAE EILSRSIVKR WANFAKYGNP
NETQNNSTSW PVFKSTEQKY LTLNTESTRI MTKLRAQQCR FWTSFFPKVL EMTGNIDEAE
WEWKAGFHRW NNYMMDWKNQ FNDYTSKKES CVGL
<110> KODIAK SCIENCES INC.
<120> BUTYRYLCHOLINESTERASE ZWITTERIONIC POLYMER CONJUGATES
<130> MPI17-008
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1685
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Pro His Glu Leu Glu Pro His Glu Thr Arg Pro Pro His Glu Leu
35 40 45
Glu Leu Glu Leu Glu Cys Tyr Ser Met Glu Thr Leu Glu Ile Leu Glu
50 55 60
Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg His Ile Ser Thr His Arg Gly
65 70 75 80
Leu Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ile Leu Glu
85 90 95
Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu
100 105 110
Tyr Ser Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Met Glu Thr Ala Ser
115 120 125
Asn Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly
130 135 140
Leu Tyr Thr His Arg Val Ala Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Pro His
145 150 155 160
Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Ala Leu
165 170 175
Ala Gly Leu Asn Pro Arg Pro Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Arg Gly
180 185 190
Leu Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Pro Arg
195 200 205
Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr Arg
210 215 220
Pro Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Thr Arg Pro Ala Ser Asn
225 230 235 240
Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Gly Leu Asn Ala Ser
260 265 270
Asn Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ser Glu Arg Pro His Glu
275 280 285
Pro Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu His Ile Ser Gly Leu Tyr Ser Glu
290 295 300
Arg Gly Leu Met Glu Thr Thr Arg Pro Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser
305 310 315 320
Asn Thr His Arg Ala Ser Pro Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Ala Ser
325 330 335
Pro Cys Tyr Ser Leu Glu Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Val Ala
340 345 350
Leu Thr Arg Pro Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg Leu Tyr
355 360 365
Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ala Leu Ala Thr His Arg Val
370 375 380
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385 390 395 400
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Asn Thr
405 410 415
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420 425 430
His Ile Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Leu
435 440 445
Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Leu
450 455 460
Gly Leu Ala Arg Gly Val Ala Leu Ile Leu Glu Val Ala Leu Val Ala
465 470 475 480
Leu Ser Glu Arg Met Glu Thr Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Arg Gly
485 490 495
Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Pro His
500 505 510
Glu Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn
515 520 525
Pro Arg Gly Leu Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Met
530 535 540
Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Pro Gly Leu Asn
545 550 555 560
Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Asn Thr Arg Pro
565 570 575
Val Ala Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ala
580 585 590
Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala Ser
595 600 605
Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg Leu
610 615 620
Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly
625 630 635 640
Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser Glu
645 650 655
Arg Leu Glu His Ile Ser Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly
660 665 670
Leu Tyr Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Leu Glu Pro His Glu
675 680 685
Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Leu Ala Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu
690 695 700
Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Ser Asn
705 710 715 720
Ala Leu Ala Pro Arg Thr Arg Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr His
725 730 735
Arg Ser Glu Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ala Leu Ala Ala Arg
740 745 750
Gly Ala Ser Asn Ala Arg Gly Thr His Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu
755 760 765
Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Tyr Cys
770 775 780
Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu Thr
785 790 795 800
His Arg Gly Leu Ile Leu Glu Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser
805 810 815
Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Pro Arg
820 825 830
Gly Leu Asn Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser Asn Gly
835 840 845
Leu Ala Leu Ala Pro His Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Pro Arg Thr
850 855 860
Tyr Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro Arg Leu Glu Ser Glu Arg Val
865 870 875 880
Ala Leu Ala Ser Asn Pro His Glu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr His Arg
885 890 895
Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Pro His Glu Leu
900 905 910
Glu Thr His Arg Ala Ser Pro Met Glu Thr Pro Arg Ala Ser Pro Ile
915 920 925
Leu Glu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Asn
930 935 940
Pro His Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Asn Ile
945 950 955 960
Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ala Ser Asn
965 970 975
Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Gly Leu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Leu
980 985 990
Ala Pro His Glu Leu Glu Val Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Ala
995 1000 1005
Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr Ser
1010 1015 1020
Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ile
1025 1030 1035 1040
Leu Glu Thr His Arg Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Gly Leu Pro His Glu
1045 1050 1055
Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Ile Leu Glu
1060 1065 1070
Pro His Glu Pro His Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ser Glu
1075 1080 1085
Arg Gly Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Glu
1090 1095 1100
Arg Ile Leu Glu Leu Glu Pro His Glu His Ile Ser Thr Tyr Arg Thr
1105 1110 1115 1120
His Arg Ala Ser Pro Thr Arg Pro Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala Ser
1125 1130 1135
Pro Gly Leu Asn Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Ala Ser Asn Thr Tyr
1140 1145 1150
Arg Ala Arg Gly Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser
1155 1160 1165
Pro Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Thr Tyr Arg
1170 1175 1180
Ala Ser Asn Pro His Glu Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Leu
1185 1190 1195 1200
Ala Leu Glu Gly Leu Pro His Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu Tyr
1205 1210 1215
Ser Pro His Glu Ser Glu Arg Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Tyr Ala
1220 1225 1230
Ser Asn Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Thr Tyr
1235 1240 1245
Arg Thr Tyr Arg Pro His Glu Gly Leu His Ile Ser Ala Arg Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Pro Arg Thr Arg Pro Pro
1265 1270 1275 1280
Arg Gly Leu Thr Arg Pro Met Glu Thr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Met
1285 1290 1295
Glu Thr His Ile Ser Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu
1300 1305 1310
Gly Leu Pro His Glu Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr Leu Glu
1315 1320 1325
Pro Arg Leu Glu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ala
1330 1335 1340
Ser Asn Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Gly Leu
1345 1350 1355 1360
Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Ser Glu Arg
1365 1370 1375
Ile Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Thr Arg Pro Ala
1380 1385 1390
Leu Ala Ala Ser Asn Pro His Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr Tyr
1395 1400 1405
Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser Asn Gly Leu Thr His
1410 1415 1420
Arg Gly Leu Asn Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr His Arg
1425 1430 1435 1440
Ser Glu Arg Thr Arg Pro Pro Arg Val Ala Leu Pro His Glu Leu Tyr
1445 1450 1455
Ser Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Thr
1460 1465 1470
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1475 1480 1485
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1490 1495 1500
Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Leu Ala Gly Leu
1505 1510 1515 1520
Asn Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Thr Arg Pro
1525 1530 1535
Thr His Arg Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Pro Arg Leu Tyr
1540 1545 1550
Ser Val Ala Leu Leu Glu Gly Leu Met Glu Thr Thr His Arg Gly Leu
1555 1560 1565
Tyr Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Ala Gly
1570 1575 1580
Leu Thr Arg Pro Gly Leu Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Gly
1585 1590 1595 1600
Leu Tyr Pro His Glu His Ile Ser Ala Arg Gly Thr Arg Pro Ala Ser
1605 1610 1615
Asn Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Met Glu Thr Met Glu Thr Ala Ser Pro
1620 1625 1630
Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Asn Pro His Glu Ala
1635 1640 1645
Ser Asn Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Tyr
1650 1655 1660
Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Gly
1665 1670 1675 1680
Leu Tyr Leu Glu Ala
1685
<210> 2
<211> 2151
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 2
Gly Leu Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ile Leu
1 5 10 15
Glu Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Tyr
20 25 30
Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Met Glu Thr Ala
35 40 45
Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr
50 55 60
Gly Leu Tyr Thr His Arg Val Ala Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Pro
65 70 75 80
His Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Ala
85 90 95
Leu Ala Gly Leu Asn Pro Arg Pro Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Arg
100 105 110
Gly Leu Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Pro
115 120 125
Arg Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr
130 135 140
Arg Pro Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Thr Arg Pro Ala Ser
145 150 155 160
Asn Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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Ser Asn Thr His Arg Ala Ser Pro Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Ala
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
Gly Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Pro
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435 440 445
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser
565 570 575
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580 585 590
Gly Leu Tyr Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Leu Glu Pro His
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Asn Ala Leu Ala Pro Arg Thr Arg Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr
645 650 655
His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ala Leu Ala Ala
660 665 670
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675 680 685
Leu Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Tyr
690 695 700
Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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1090 1095 1100
Arg Ala Ser Asn Pro His Glu Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Pro Arg Ala
1105 1110 1115 1120
Leu Ala Leu Glu Gly Leu Pro His Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu
1125 1130 1135
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1140 1145 1150
Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Thr
1155 1160 1165
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1170 1175 1180
Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Pro Arg Thr Arg Pro
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Pro Arg Gly Leu Thr Arg Pro Met Glu Thr Gly Leu Tyr Val Ala Leu
1205 1210 1215
Met Glu Thr His Ile Ser Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu
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Glu Gly Leu Pro His Glu Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr Leu
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1250 1255 1260
Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Gly
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Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ala Arg Gly Gly Leu Asn Thr Arg Pro
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
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<212> PRT
<213> Abedus herberti
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Leu Ala Ser Glu Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ala Leu Ala
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<213> Homo sapiens
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Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Pro His Glu Ala
275 280 285
Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Ser
290 295 300
Asn Pro Arg His Ile Ser Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Ser Glu Arg Thr
305 310 315 320
His Arg Pro His Glu Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala Ser Pro
325 330 335
Ala Ser Asn Ala Leu Ala Met Glu Thr Thr Tyr Arg Leu Glu Leu Glu
340 345 350
Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Asn His Ile Ser Pro Arg Ala Ser
355 360 365
Pro Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr His Arg Val Ala Leu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro His Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Gly Leu Asn
385 390 395 400
Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu
405 410 415
His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Ala Arg
420 425 430
Gly His Ile Ser Leu Tyr Ser Leu Glu Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn
435 440 445
Leu Glu Ala Ser Asn Ala Ser Pro Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Leu
450 455 460
Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Gly Leu His Ile Ser Pro His
465 470 475 480
Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Ser Asn Ala Ser Pro
485 490 495
His Ile Ser Thr Tyr Arg Pro His Glu Leu Glu Ala Ser Pro Pro Arg
500 505 510
Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Asn Ser Glu Arg Thr Arg Pro Gly Leu
515 520 525
Met Glu Thr Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Leu Ala
530 535 540
Thr Arg Pro Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Val Ala Leu Val Ala Leu Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu Val
565 570 575
Ala Leu Ala Arg Gly Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu
580 585 590
Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Leu Ala Ala
595 600 605
Ser Asn Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu
610 615 620
Arg Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Val
625 630 635 640
Ala Leu Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Glu Leu
645 650 655
Glu Ala Leu Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Glu His Ile Ser
660 665 670
Val Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Leu Tyr Ser His Ile Ser Ala Leu
675 680 685
Ala Ala Ser Asn Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Pro
690 695 700
Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu Ala Ser Pro Pro His
705 710 715 720
Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala
725 730 735
Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Pro Arg
740 745 750
Gly Leu Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Leu Glu Thr Arg Pro
755 760 765
Val Ala Leu Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser His Ile Ser Pro Arg Ala Ser
770 775 780
Asn Gly Leu Tyr Met Glu Thr Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Pro His Glu
785 790 795 800
Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Ser Glu Arg Gly Leu Ala Ser
805 810 815
Asn Pro Arg Pro Arg Ala Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu Val Ala Leu
820 825 830
Leu Glu Ala Arg Gly Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Ser Asn Ile Leu
835 840 845
Glu Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Gly Leu Pro Arg Leu Tyr Ser Val
850 855 860
Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ala Leu
865 870 875 880
Ala Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr His Arg Val Ala Leu Leu
885 890 895
Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Val Ala Leu
900 905 910
Ala Leu Ala Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Gly
915 920 925
Leu Tyr Leu Tyr Ser Leu Glu Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Thr
930 935 940
His Arg Val Ala Leu Pro His Glu His Ile Ser Leu Tyr Ser Ala Leu
945 950 955 960
Ala Leu Glu Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Ala Leu Glu Ala
965 970 975
<210> 7
<211> 884
<212> PRT
<213> Loligo vulgaris
<400> 7
Met Glu Thr Gly Leu Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu
1 5 10 15
Gly Leu Pro Arg Leu Glu Pro His Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val
20 25 30
Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Tyr Ala Leu Ala Gly Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Val Ala Leu Pro
50 55 60
His Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Ser
65 70 75 80
Pro Pro His Glu Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Leu Ala
85 90 95
Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly
100 105 110
Leu Tyr Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ile
115 120 125
Leu Glu Leu Glu Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Ser Pro Leu Glu Leu
130 135 140
Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His
145 150 155 160
Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Gly
165 170 175
Leu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr
180 185 190
Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Cys Tyr
195 200 205
Ser Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Arg Gly Ala Ser Pro
210 215 220
Ala Leu Ala Ala Ser Asn Gly Leu Asn Leu Glu Pro His Glu Val Ala
225 230 235 240
Leu Ala Leu Ala Ala Ser Pro Met Glu Thr Ala Arg Gly Leu Glu Gly
245 250 255
Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Asn Thr
260 265 270
His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro His Glu Gly Leu
275 280 285
Gly Leu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser
290 295 300
Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Gly Met
305 310 315 320
Glu Thr Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Ala Ser
325 330 335
Pro Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Pro Thr Tyr Arg
340 345 350
Gly Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Thr Arg Pro Ile Leu Glu
355 360 365
Thr His Arg Ala Leu Ala Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu
370 375 380
Val Ala Leu Ala Leu Ala Pro Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Ser Glu Arg Met Glu Thr Gly Leu Asn
405 410 415
Gly Leu Leu Tyr Ser Pro His Glu Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ile Leu
420 425 430
Glu Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Pro His Glu Thr His Arg Thr His Arg
435 440 445
Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Met Glu Thr Ile Leu Glu Gly
450 455 460
Leu Asn Val Ala Leu Ala Ser Pro Thr His Arg Ala Leu Ala Pro His
465 470 475 480
Glu Gly Leu Asn Pro His Glu Pro Arg Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ile
485 490 495
Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Arg Gly His Ile Ser Met Glu
500 505 510
Thr Ala Ser Asn Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Pro Arg Thr
515 520 525
Tyr Arg Gly Leu Asn Leu Glu Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Leu Ala
530 535 540
Gly Leu Thr His Arg Pro Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser
545 550 555 560
Leu Glu Thr Arg Pro Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Ile Leu
565 570 575
Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ile
580 585 590
Leu Glu Gly Leu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Val Ala Leu
595 600 605
Thr Arg Pro Gly Leu Tyr His Ile Ser Ile Leu Glu Pro Arg Gly Leu
610 615 620
Tyr Thr His Arg His Ile Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala
625 630 635 640
Leu Ala Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Met Glu Thr Ala Ser Pro Pro His
645 650 655
Glu Ala Ser Pro Gly Leu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala Ser Asn Leu
660 665 670
Glu Leu Glu Val Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Asn Thr Arg Pro Gly
675 680 685
Leu Tyr Ser Glu Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly Leu
690 695 700
Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Met Glu Thr Ala
725 730 735
Arg Gly Ile Leu Glu Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Pro Arg Pro His Glu
740 745 750
Gly Leu Leu Tyr Ser Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Leu Glu His
755 760 765
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770 775 780
Leu Tyr Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Pro His Glu Val Ala Leu Thr
785 790 795 800
His Arg Gly Leu His Ile Ser Gly Leu Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ala
805 810 815
Leu Ala Val Ala Leu Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Pro His Glu Gly Leu
820 825 830
Thr Arg Pro Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu
835 840 845
Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Gly Leu
850 855 860
Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Gly Leu Tyr Ile Leu
865 870 875 880
Glu Pro His Glu
<210> 8
<211> 626
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Thr His Arg His Ile Ser Thr His Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Ser Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg
20 25 30
Gly Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Ser Glu
35 40 45
Arg Val Ala Leu Pro His Glu Leu Glu Pro His Glu Pro Arg Pro Arg
50 55 60
Leu Tyr Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr His Arg Leu Glu
65 70 75 80
Met Glu Thr Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Pro
85 90 95
Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Val
100 105 110
Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg His Ile
115 120 125
Ser Gly Leu Ala Ser Pro Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Leu Tyr Ser
130 135 140
Pro His Glu Ala Ser Asn Thr Arg Pro Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ala
145 150 155 160
Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu His Ile Ser
165 170 175
Ala Ser Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr Ser Pro
180 185 190
Arg Ala Arg Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Ala Ser
195 200 205
Asn Ser Glu Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Val Ala Leu
210 215 220
Val Ala Leu Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Glu Thr His Arg Val Ala
225 230 235 240
Leu Leu Glu His Ile Ser Gly Leu Asn Ala Ser Pro Thr Arg Pro Leu
245 250 255
Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Thr Tyr Arg Leu
260 265 270
Tyr Ser Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Ser
275 280 285
Asn Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg
290 295 300
Ile Leu Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Ser Glu
305 310 315 320
Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Asn
325 330 335
Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Pro Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr
340 345 350
Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Ala Arg
355 360 365
Gly Ala Ser Pro Gly Leu Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Ser
370 375 380
Asn Gly Leu Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Leu Glu Thr His Arg Cys
385 390 395 400
Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro His Glu
405 410 415
Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu
420 425 430
Ala Val Ala Leu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Ser Glu Arg Ala Ser
435 440 445
Asn Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Gly Leu Ala Ser Asn Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Thr His Arg Pro Arg Pro
465 470 475 480
Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala Ser Pro Gly
485 490 495
Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Leu Glu Thr Tyr Arg
500 505 510
Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ala Ser
515 520 525
Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr Arg Pro Gly Leu Asn
530 535 540
Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala Leu Pro His Glu Ser
545 550 555 560
Glu Arg Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Met Glu Thr His Ile
565 570 575
Ser Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu His Ile Ser Ala Ser Asn His Ile
580 585 590
Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ser Glu Arg
595 600 605
Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu Tyr Leu
610 615 620
Tyr Ser
625
<210> 9
<211> 2460
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 9
gctagcgccg ccaccatggc atgcctcgga tttcaaagac ataaagccca gttgaacctc 60
gccactagaa cctggccttg caccctgctg ttcttcctcc tgttcattcc ggtgttctgc 120
aaggctgagg acgacatcat catcgctacc aagaatggaa aggtccgcgg tatgaacctt 180
acggtgttcg gcggaactgt cactgccttc ttggggatcc catacgcaca acccccactt 240
ggcagactgc gctttaagaa acctcaatcg ctcacgaagt ggagcgatat ctggaacgcg 300
accaagtacg caaatagctg ctaccagaat atcgatcaga gcttccccgg attccacggc 360
tcggaaatgt ggaacccgaa caccgatctg tcggaggatt gcctgtacct gaacgtctgg 420
atcccggccc ctaagccgaa aaatgctacc gtgttgatct ggatctacgg gggaggattc 480
caaaccggaa cttccagcct gcacgtctac gacggaaagt ttttggcgcg cgtggagcgg 540
gtcattgtgg tgtccatgaa ttacagagtg ggggctctcg gattcctggc actgccaggt 600
aacccagagg ccccgggaaa catgggcctg ttcgaccagc agctcgcgct tcagtgggtg 660
cagaagaata tcgccgcctt tggcggtaac ccgaagtcgg tgactctctt tggcgaatca 720
gccggagctg catcagtctc ccttcatctg ttgtcccccg gaagccactc gctgttcacc 780
agggcgatcc tgcaatccgg atccttcaac gccccatggg cggttacttc actttacgag 840
gcccgtaacc ggacccttaa cctggcaaag ctcaccggat gtagccgcga gaacgaaacc 900
gaaatcataa agtgcctgcg aaacaaagac ccacaagaaa tcctcctgaa tgaggcattc 960
gtggtcccat acggtacccc gctctcagtg aacttcggcc ccactgtgga cggagacttc 1020
ctgaccgaca tgccggacat tttgctggag ctgggccagt tcaagaaaac gcagatcctg 1080
gtgggcgtca acaaagatga aggaactgcg ttcctcgtgt acggcgcccc gggcttctca 1140
aaggacaaca attccatcat tacgcggaag gagttccaag aagggctgaa aatcttcttc 1200
cctggagtgt cggaatttgg aaaggaaagc atcctgttcc actacaccga ctgggtggac 1260
gatcagcggc cggaaaacta ccgggaggcg ctgggtgatg tggtcggaga ctataacttc 1320
atctgcccgg ccctggagtt taccaaaaag ttttccgaat gggggaataa tgctttcttt 1380
tactacttcg aacatagaag ctcgaagctc ccttggccgg aatggatggg agttatgcac 1440
gggtatgaaa tcgagtttgt ctttgggctc cctctggagc gcagggataa ctacactaaa 1500
gccgaagaga tcctgtcacg ctcgatcgtg aagcggtggg cgaatttcgc gaagtacgga 1560
aatccaaacg aaactcagaa caactcgacc tcgtggccgg tgttcaagtc taccgagcag 1620
aaatacctca ctctgaatac tgaatcaacc cgcattatga ctaagctcag ggcccagcaa 1680
tgtcggttct ggacttcctt cttcccgaaa gtgctcgaaa tgactggcgg tggatccgga 1740
ggcggatcgg gtggaggctc cgacaagacg cacacctgtc cgccctgccc tgcccctgaa 1800
gccgagggag caccgtcggt gtttctcttc ccgccaaagc caaaggacac tctgatgatc 1860
tcgcgcactc cagaggtgac ttgcgtcgtc gtggatgtca gccacgagga cccagaagtg 1920
aagtttaact ggtacgtgga tggggtggaa gtccacaacg ctaagaccaa gccaagggaa 1980
gaacaataca attcaaccta ccgcgtcgtg tccgtcctga ccgtgctgca ccaagattgg 2040
ctgaacggaa aggagtacaa gtgtaaagtg tcaaacaaag ccctcccgtc atccattgaa 2100
aagactatct cgaaggcgaa aggtcagcct agagagccgt gcgtgtatac tctcccaccg 2160
tcgcgcgatg aactgaccaa aaaccaggtg tcccttacgt gtctcgtgaa ggggttctac 2220
ccgtccgaca tcgcagtgga gtgggagtca aatggccaac cggaaaacaa ttacaagact 2280
accccgcctg tgctggacag cgatggatcc tttttcttgt acagcaagct gaccgtcgac 2340
aagagccggt ggcagcaggg gaacgtgttt agctgcagcg tgatgcatga agctctgcat 2400
aatcattaca ctcagaaaag cctgtcgctc tcgcccggaa agtaataata cgtagaattc 2460
2460
<210> 10
<211> 1490
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 10
Gly Leu Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ile Leu
1 5 10 15
Glu Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Tyr
20 25 30
Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Met Glu Thr Ala
35 40 45
Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr
50 55 60
Gly Leu Tyr Thr His Arg Val Ala Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Pro
65 70 75 80
His Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Ala
85 90 95
Leu Ala Gly Leu Asn Pro Arg Pro Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Arg
100 105 110
Gly Leu Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Pro
115 120 125
Arg Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr
130 135 140
Arg Pro Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Thr Arg Pro Ala Ser
145 150 155 160
Asn Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala
165 170 175
Ala Ser Asn Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Ala
180 185 190
Ser Asn Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ser Glu Arg Pro His
195 200 205
Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu His Ile Ser Gly Leu Tyr Ser
210 215 220
Glu Arg Gly Leu Met Glu Thr Thr Arg Pro Ala Ser Asn Pro Arg Ala
225 230 235 240
Ser Asn Thr His Arg Ala Ser Pro Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Ala
245 250 255
Ser Pro Cys Tyr Ser Leu Glu Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Val
260 265 270
Ala Leu Thr Arg Pro Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg Leu
275 280 285
Tyr Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ala Leu Ala Thr His Arg
290 295 300
Val Ala Leu Leu Glu Ile Leu Glu Thr Arg Pro Ile Leu Glu Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Asn
325 330 335
Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu
340 345 350
Glu His Ile Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr
355 360 365
Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala
370 375 380
Leu Gly Leu Ala Arg Gly Val Ala Leu Ile Leu Glu Val Ala Leu Val
385 390 395 400
Ala Leu Ser Glu Arg Met Glu Thr Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Arg
405 410 415
Gly Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Pro
420 425 430
His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser
435 440 445
Asn Pro Arg Gly Leu Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn
450 455 460
Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Pro Gly Leu
465 470 475 480
Asn Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Asn Thr Arg
485 490 495
Pro Val Ala Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ile Leu Glu
500 505 510
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala
515 520 525
Ser Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg
530 535 540
Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser
565 570 575
Glu Arg Leu Glu His Ile Ser Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg
580 585 590
Gly Leu Tyr Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Leu Glu Pro His
595 600 605
Glu Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Leu Ala Ile Leu Glu Leu Glu Gly
610 615 620
Leu Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Ser
625 630 635 640
Asn Ala Leu Ala Pro Arg Thr Arg Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr
645 650 655
His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ala Leu Ala Ala
660 665 670
Arg Gly Ala Ser Asn Ala Arg Gly Thr His Arg Leu Glu Ala Ser Asn
675 680 685
Leu Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Tyr
690 695 700
Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu
705 710 715 720
Thr His Arg Gly Leu Ile Leu Glu Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Tyr
725 730 735
Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Pro
740 745 750
Arg Gly Leu Asn Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser Asn
755 760 765
Gly Leu Ala Leu Ala Pro His Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Pro Arg
770 775 780
Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro Arg Leu Glu Ser Glu Arg
785 790 795 800
Val Ala Leu Ala Ser Asn Pro His Glu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr His
805 810 815
Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Pro His Glu
820 825 830
Leu Glu Thr His Arg Ala Ser Pro Met Glu Thr Pro Arg Ala Ser Pro
835 840 845
Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu
850 855 860
Asn Pro His Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Asn
865 870 875 880
Ile Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ala Ser
885 890 895
Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Gly Leu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala
900 905 910
Leu Ala Pro His Glu Leu Glu Val Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr
915 920 925
Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr
930 935 940
Ser Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ser Glu Arg Ile Leu Glu
945 950 955 960
Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Gly Leu Pro His
965 970 975
Glu Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Ile Leu
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435 440 445
Asn Pro Arg Gly Leu Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn
450 455 460
Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Pro Gly Leu
465 470 475 480
Asn Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Asn Thr Arg
485 490 495
Pro Val Ala Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ile Leu Glu
500 505 510
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala
515 520 525
Ser Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg
530 535 540
Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser
565 570 575
Glu Arg Leu Glu His Ile Ser Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg
580 585 590
Gly Leu Tyr Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Leu Glu Pro His
595 600 605
Glu Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Leu Ala Ile Leu Glu Leu Glu Gly
610 615 620
Leu Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Ser
625 630 635 640
Asn Ala Leu Ala Pro Arg Thr Arg Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr
645 650 655
His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ala Leu Ala Ala
660 665 670
Arg Gly Ala Ser Asn Ala Arg Gly Thr His Arg Leu Glu Ala Ser Asn
675 680 685
Leu Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Tyr
690 695 700
Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu
705 710 715 720
Thr His Arg Gly Leu Ile Leu Glu Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Tyr
725 730 735
Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Pro
740 745 750
Arg Gly Leu Asn Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser Asn
755 760 765
Gly Leu Ala Leu Ala Pro His Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Pro Arg
770 775 780
Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro Arg Leu Glu Ser Glu Arg
785 790 795 800
Val Ala Leu Ala Ser Asn Pro His Glu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr His
805 810 815
Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Pro His Glu
820 825 830
Leu Glu Thr His Arg Ala Ser Pro Met Glu Thr Pro Arg Ala Ser Pro
835 840 845
Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu
850 855 860
Asn Pro His Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Asn
865 870 875 880
Ile Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ala Ser
885 890 895
Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Gly Leu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala
900 905 910
Leu Ala Pro His Glu Leu Glu Val Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr
915 920 925
Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr
930 935 940
Ser Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ser Glu Arg Ile Leu Glu
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
Glu Arg Gly Leu Pro His Glu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Ser
1010 1015 1020
Glu Arg Ile Leu Glu Leu Glu Pro His Glu His Ile Ser Thr Tyr Arg
1025 1030 1035 1040
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1045 1050 1055
Ser Pro Gly Leu Asn Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Ala Ser Asn Thr
1060 1065 1070
Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Ala
1075 1080 1085
Ser Pro Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Thr Tyr
1090 1095 1100
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1105 1110 1115 1120
Leu Ala Leu Glu Gly Leu Pro His Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu
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1140 1145 1150
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1155 1160 1165
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1170 1175 1180
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
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1235 1240 1245
Glu Pro Arg Leu Glu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Ser Pro
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Tyr Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser Asn Gly Leu Thr
1330 1335 1340
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1345 1350 1355 1360
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1365 1370 1375
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1445 1450 1455
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Tyr Ser Val Ala Leu Leu Glu Gly Leu Met Glu Thr Thr His Arg Gly
1475 1480 1485
Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu
1490 1495 1500
Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr
1505 1510 1515 1520
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1525 1530 1535
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1540 1545 1550
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1570 1575 1580
Pro Arg Pro Arg Leu Tyr Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr
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1605 1610 1615
Thr His Arg Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser
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1635 1640 1645
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1650 1655 1660
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1810 1815 1820
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1845 1850 1855
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1890 1895 1900
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1905 1910 1915 1920
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1925 1930 1935
Leu Tyr Pro His Glu Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro
1940 1945 1950
Ile Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu
1955 1960 1965
Ser Glu Arg Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Gly Leu
1970 1975 1980
Ala Ser Asn Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Thr
1985 1990 1995 2000
His Arg Pro Arg Pro Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu
2005 2010 2015
Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu
2020 2025 2030
Leu Glu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg
2035 2040 2045
Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr
2050 2055 2060
Arg Pro Gly Leu Asn Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala
2065 2070 2075 2080
Leu Pro His Glu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu
2085 2090 2095
Met Glu Thr His Ile Ser Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu His Ile Ser
2100 2105 2110
Ala Ser Asn His Ile Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu
2115 2120 2125
Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Pro
2130 2135 2140
Arg Ala Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser
2145 2150
<210> 16
<211> 2150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 16
Gly Leu Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ile Leu
1 5 10 15
Glu Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Tyr
20 25 30
Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Met Glu Thr Ala
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Asn Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala
165 170 175
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180 185 190
Ser Asn Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ser Glu Arg Pro His
195 200 205
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210 215 220
Glu Arg Gly Leu Met Glu Thr Thr Arg Pro Ala Ser Asn Pro Arg Ala
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Val Ala Leu Leu Glu Ile Leu Glu Thr Arg Pro Ile Leu Glu Thr Tyr
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Gly Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Pro
420 425 430
His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser
435 440 445
Asn Pro Arg Gly Leu Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Asn
450 455 460
Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Pro Gly Leu
465 470 475 480
Asn Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Asn Thr Arg
485 490 495
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500 505 510
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala
515 520 525
Ser Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg
530 535 540
Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser
565 570 575
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580 585 590
Gly Leu Tyr Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Leu Glu Pro His
595 600 605
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610 615 620
Leu Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Ser
625 630 635 640
Asn Ala Leu Ala Pro Arg Thr Arg Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr
645 650 655
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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770 775 780
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785 790 795 800
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820 825 830
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885 890 895
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915 920 925
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980 985 990
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1445 1450 1455
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1475 1480 1485
Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu
1490 1495 1500
Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr
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Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Thr His Arg His Ile Ser Thr
1525 1530 1535
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1540 1545 1550
Ala Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro
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1585 1590 1595 1600
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1605 1610 1615
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1620 1625 1630
Ala Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu
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1650 1655 1660
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1700 1705 1710
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1715 1720 1725
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1765 1770 1775
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Pro Arg Pro Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala
2005 2010 2015
Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Leu Glu
2020 2025 2030
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<210> 17
<211> 2150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
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1345 1350 1355 1360
Arg Ser Glu Arg Thr Arg Pro Pro Arg Val Ala Leu Pro His Glu Leu
1365 1370 1375
Tyr Ser Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser
1380 1385 1390
Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Ala Ser Asn Thr His Arg
1395 1400 1405
Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Met Glu
1410 1415 1420
Thr Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Leu Ala Gly
1425 1430 1435 1440
Leu Asn Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Thr Arg
1445 1450 1455
Pro Thr His Arg Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Pro Arg Leu
1460 1465 1470
Tyr Ser Val Ala Leu Leu Glu Gly Leu Met Glu Thr Thr His Arg Gly
1475 1480 1485
Leu Tyr Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Ala
1490 1495 1500
Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala
1505 1510 1515 1520
Gly Leu Tyr Pro His Glu His Ile Ser Ala Arg Gly Thr Arg Pro Ala
1525 1530 1535
Ser Asn Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Met Glu Thr Met Glu Thr Ala Ser
1540 1545 1550
Pro Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Asn Pro His Glu
1555 1560 1565
Ala Ser Asn Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Leu
1570 1575 1580
Tyr Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu
1585 1590 1595 1600
Gly Leu Tyr Leu Glu Ala
1605
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 20
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 21
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu
20 25 30
Tyr Ser Glu Arg
35
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 22
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg
1 5 10 15
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 23
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 24
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 25
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu
20 25 30
Arg
<210> 26
<211> 63
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 26
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu
20 25 30
Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr
35 40 45
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr
50 55 60
<210> 27
<211> 79
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Glu Thr His Ile Ser Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Leu Glu Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Ile Leu Glu Ala Arg
20 25 30
Gly Pro His Glu Leu Glu Pro His Glu Thr Arg Pro Pro His Glu Leu
35 40 45
Glu Leu Glu Leu Glu Cys Tyr Ser Met Glu Thr Leu Glu Ile Leu Glu
50 55 60
Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg His Ile Ser Thr His Arg
65 70 75
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Gly Leu Ala Ser Pro Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ile Leu
1 5 10 15
Glu
Claims (119)
- 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 유기인 (OP) 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 포함하는 컨쥬게이트로서, 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체 유닛을 포함하고 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 양성이온성 기를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
- 제1 항에 있어서, OP 바이오스캐빈저는 아릴다이알킬포스파타제, 오가노포스페이트 가수분해효소 (OPH), 카르복실에스테라제, 트라이에스테라제, 포스포트라이에스테라제, 아릴에스테라제, 파라옥소나제 (PON), 오가노포스페이트 산 탈수효소 및 다이아이소프로필플루오로포스파타제 (DFPase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 촉매적 바이오스캐빈저인 것인 컨쥬게이트.
- 제1 항에 있어서, OP 바이오스캐빈저는 아세틸콜린에스테라제 (AChE) 및 부티릴콜린에스테라제 (BChE)로 구성되는 군으로부터 선택된 콜린에스테라제를 포함하는 화학양론적 OP 바이오스캐빈저인 것인 컨쥬게이트.
- 제3 항에 있어서, 콜린에스테라제는 혈액 혈장으로부터 정제되는 것인 컨쥬게이트.
- 제3 항에 있어서, 콜린에스테라제는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 것인 컨쥬게이트.
- 제3 항에 있어서, 콜린에스테라제는 부티릴콜린에스테라제인 것인 컨쥬게이트.
- 제6 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제는 비-부티릴콜린에스테라제 단백질에 융합 단백질로서 융합되는 것인 컨쥬게이트.
- 제7 항에 있어서, 비-부티릴콜린에스테라제 단백질은 면역글로불린 (Ig) 도메인을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
- 제8 항에 있어서, Ig 도메인은 IgG-Fc, IgG-CH 및 IgG-CL로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
- 제9 항에 있어서, IgG는 IgG1인 것인 컨쥬게이트.
- 제10 항에 있어서, Ig 도메인은 IgG-Fc (SEQ ID NO. 8)인 것인 컨쥬게이트.
- 제11 항에 있어서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제12 항에 있어서, Fc 도메인은 다음의 치환 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제12 항에 있어서, Fc 도메인은 다음의 치환 Q347C 또는 L443C 중 하나를 더 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제14 항에 있어서, 치환은 Q347C인 것인 컨쥬게이트.
- 제7 항에 있어서, 융합 단백질은 부티릴콜린에스테라제 효소와 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 사이에 링커를 더 포함하는 것인 컨쥬게이트.
- 제16 항에 있어서, 링커는 G, GG, GGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23), 및 GGGES (SEQ ID NO: 24), 및 전술한 것들의 올리고머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
- 제17 항에 있어서, 링커는 GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21) 및 GGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 25)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
- 제7 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 카르복실 절단물인 것인 컨쥬게이트.
- 제19 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 1의 아미노산 29 내지 561을 포함하거나 그것들로 구성되는 것인 컨쥬게이트.
- 제7 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 1의 아미노산 29 내지 562를 포함하거나 그것들로 구성되는 것인 컨쥬게이트.
- 제20 항 또는 제21 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 1의 잔기 94에서 C가 Y인 돌연변이를 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제15 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 융합은 SEQ ID NO. 2에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 양성이온성 기는 포스포릴콜린을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
- 제24 항에 있어서, 적어도 한 유형의 단량체 유닛이 2-(아크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸)포스페이트를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
- 제15 항에 있어서, 적어도 한 유형의 단량체 유닛이 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄에틸)포스페이트 (HEMA-PC)인 것인 컨쥬게이트.
- 제25 항 또는 제26 항에 있어서, 중합체는 3개 이상의 팔을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제27 항에 있어서, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제28 항에 있어서, 중합체는 3, 6 또는 9개의 팔을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제29 항에 있어서, 중합체는 9개의 팔을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제28 항에 있어서, 컨쥬게이트의 중합체 부분이 300,000 내지 1,750,000 달톤의 피크 분자량을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제31 항에 있어서, 컨쥬게이트의 중합체 부분이 500,000 내지 1,000,000 달톤의 피크 분자량을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제32 항에 있어서, 컨쥬게이트의 중합체 부분이 600,000 내지 800,000 달톤의 피크 분자량을 가지는 것인 컨쥬게이트.
- 제28 항에 있어서, 중합체는 콜린에스테라제의 아미노기, 하이드록실기, 설프하이드릴기 및 카르복실기 중 적어도 하나에 공유 결합되는 것인 컨쥬게이트.
- 제34 항에 있어서, 설프하이드릴기는 콜린에스테라제의 시스테인 잔기로부터 유래되는 것인 컨쥬게이트.
- 제35 항에 있어서, 시스테인 잔기는 시스테인이 콜린에스테라제에 자연적으로 존재하지 않는 위치에 있는 것인 컨쥬게이트.
- 제36 항에 있어서, 콜린에스테라제는 SEQ ID NO. 2의 그것에 상응하는 부티릴콜린에스테라제 융합이고 시스테인 잔기는 아미노산 672에 있는 그것인 것인 컨쥬게이트.
- SEQ ID NO. 1의 아미노산 29 내지 562를 포함하거나 그것으로 구성되는 부티릴콜린에스테라제 효소.
- 제38 항에 있어서, 잔기 94가 티로신인 것인 부티릴콜린에스테라제 효소.
- 제38 항에 있어서, 재조합 DNA 엔지니어링을 통해 도입되는 시스테인 잔기를 더 포함하는 것인 부티릴콜린에스테라제 효소.
- 제40 항에 있어서, SEQ ID NO. 13을 포함하는 것인 부티릴콜린에스테라제 효소.
- 부티릴콜린에스테라제 효소 및 비-부티릴콜린에스테라제 단백질을 포함하는 부티릴콜린에스테라제 효소 융합 단백질.
- 제42 항에 있어서, 비-부티릴콜린에스테라제 단백질은 면역글로불린 (Ig) 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제43 항에 있어서, Ig 도메인은 IgG-Fc, IgG-CH 및 IgG-CL로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
- 제44 항에 있어서, IgG는 IgG1인 것인 융합 단백질.
- 제45 항에 있어서, IgG1 도메인이 IgG1-Fc (SEQ ID NO. 8)인 것인 융합 단백질.
- 제46 항에 있어서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 가지는 것인 융합 단백질.
- 제47 항에 있어서, Fc 도메인은 다음의 치환 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 가지는 것인 융합 단백질.
- 제48 항에 있어서, Fc 도메인은 다음의 치환 Q347C 또는 L443C 중 하나를 더 가지는 것인 융합 단백질.
- 제49 항에 있어서, 치환은 Q347C인 것인 융합 단백질.
- 제42 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소와 비-부티릴콜린에스테라제 단백질 사이에 링커를 더 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제51 항에 있어서, 링커는 G, GG, GGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23), 및 GGGES (SEQ ID NO: 24), 및 전술한 것들의 올리고머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
- 제52 항에 있어서, 링커는 GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21) 및 GGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 25)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
- 제52 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 카르복실 절단물인 것인 융합 단백질.
- 제54 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 1의 아미노산 29 내지 561을 포함하거나 그것들로 구성되는 것인 융합 단백질.
- 제55 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 1의 아미노산 29 내지 562를 포함하거나 그것들로 구성되는 것인 융합 단백질.
- 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 부티릴콜린에스테라제 효소는 SEQ ID NO. 1의 잔기 94에서 C가 Y인 돌연변이를 가지는 것인 융합 단백질.
- 제51 항에 있어서, 융합 단백질은 SEQ ID NO. 2에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것인 융합 단백질.
- 제1 항 내지 제58 항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질 중 어느 것의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, OP 중독의 치료 또는 예방 방법.
- 제59 항에 있어서, 컨쥬게이트는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 병변내 투여 또는 피내 투여에 의해 투여되는 것인 치료 또는 예방 방법.
- 제59 항에 있어서, 컨쥬게이트는 근육내 투여에 의해 투여되는 것인 치료 또는 예방 방법.
- OP 중독에 대해 장기 예방을 실시하는 방법으로서, 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 포함하는 컨쥬게이트를 OP 화합물에 대한 예상된 노출 전 적어도 7일 전에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체 유닛을 포함하며 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 양성이온성 기를 포함하는 것인 방법.
- 제62 항에 있어서, OP 화합물은 OP 살충제인 것인 방법.
- 제62 항에 있어서, OP 화합물은 OP 신경 작용제인 것인 방법.
- 제62 항에 있어서, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 14일 전에 투여되는 것인 방법.
- 제62 항에 있어서, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 21일 전에 투여되는 것인 방법.
- 제62 항에 있어서, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 30일 전에 투여되는 것인 방법.
- OP 중독에 대한 신속한 예방을 실시하는 방법으로서, 양성이온성 중합체에 공유 결합된 화학양론적 OP 바이오스캐빈저 및 촉매적 OP 바이오스캐빈저로 구성되는 군으로부터 선택된 OP 바이오스캐빈저를 포함하는 컨쥬게이트를 OP 화합물에 대한 예상된 노출 전 적어도 12시간 전에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체 유닛을 포함하며 적어도 한 유형의 단량체 유닛은 양성이온성 기를 포함하는 것인 방법.
- 제68 항에 있어서, OP 화합물은 OP 살충제인 것인 방법.
- 제68 항에 있어서, OP 화합물은 OP 신경 작용제인 것인 방법.
- 제70 항에 있어서, 컨쥬게이트는 OP 신경 작용제에 대한 예상된 노출 전 적어도 24시간 전에 투여되는 것인 방법.
- 제1 항 내지 제71 항 중 어느 한 항에 있어서, 카바메이트, 항-무스카린, 콜렌에스테라제 재활성화제 및 항-경련제 중에서 선택된 다른 약제학적 제제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 치료 또는 예방 방법.
- 컨쥬게이트의 제조 방법으로서, 중합체 시약을 유리 설프하이드릴 잔기를 포함하는 생물학적 활성 제제와 그로 인해 컨쥬게이트를 제공하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 중합체 시약은 다음의 구조를 가진다:
,
식에서
P는 분지형 또는 분지되지 않은 수용성 중합체이고;
L1은 제1 링커이며, L2는 제2 링커이고 L3은 제3 링커이며, L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하고 각각 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)1-20-NH-(CH2CH2-O-)1-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며;
X는 F, Cl, Br 및 I로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 H (단 R1 및 R2 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 염기성 기는(식에서 R3, R4, R5, R6 및 R7은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R8 및 R9는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아릴6-12, 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R10, R11, R12, R13 및 R14는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택된다.
- 제73 항에 있어서, 생물학적 활성 제제는 치료용 단백질 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제74 항에 있어서, 생물학적 활성 제제는 치료용 단백질인 것인 방법.
- 제74 항에 있어서, 단백질은 사이토카인, 효소, 항체 및 항체 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제75 항에 있어서, 유리 설프하이드릴기는 단백질의 시스테인 잔기에 의해 기여되는 것인 방법.
- 제77 항에 있어서, 시스테인 잔기는 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기인 것인 방법.
- 제76 항에 있어서, 단백질은 IgG1 Fab인 것인 방법.
- 제78 항에 있어서, 시스테인 잔기는 재조합 유전자 엔지니어링을 통해 도입되는 것인 방법.
- 제73 항에 있어서, P는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(MPC), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제81 항에 있어서, P는 폴리(알킬렌 옥사이드)인 것인 방법.
- 제81 항에 있어서, P는 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEG)인 것인 방법.
- 제83 항에 있어서, PEG는 분지형 것인 방법.
- 제84 항에 있어서, 분지형 PEG는 두 개의 팔을 가지는 것인 방법.
- 제85 항에 있어서, 각각의 분지가 약 5 내지 약 40 kDa의 PEG의 분자량을 가지는 것인 방법.
- 제86 항에 있어서, 각각의 분지가 약 20 kDa의 PEG의 분자량을 가지는 것인 방법.
- 제73 항에 있어서, 중합체가 폴리(MPC)인 것인 방법.
- 제88 항에 있어서, 중합체가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 가지는 것인 방법.
- 제89 항에 있어서, 중합체가 3, 6 또는 9개의 팔을 가지는 것인 방법.
- 제90 항에 있어서, 중합체가 9개의 팔을 가지는 것인 방법.
- 제89 항에 있어서, 중합체가 300,000 내지 1,750,000 달톤의 피크 분자량을 가지는 것인 방법.
- 제92 항에 있어서, 중합체가 500,000 내지 1,000,000 달톤의 피크 분자량을 가지는 것인 방법.
- 제93 항에 있어서, 중합체가 600,000 내지 800,000 달톤의 피크 분자량을 가지는 것인 방법.
- 제73 항에 있어서, L3은 결합이고 R2는 H이며 R1은인 것인 방법.
- 제95 항에 있어서, L2는 -(CH2)1-6-인 것인 방법.
- 제96 항에 있어서, L2는 -(CH2)3-인 것인 방법.
- 다음을 포함하는, 중합체 합성을 위한 개시제:
,
식에서 L1은 제1 링커이며, L2는 제2 링커이고 L3은 제3 링커이며, L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하고 각각 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)1-20-NH-(CH2CH2-O-)1-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며;
R1 및 R2는 동일하거나 상이하고 H (단 R1 및 R2는 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되며, 여기서 염기성 기는(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하고 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하고 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하고 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하며 다음:
,
및
(식에서 Y는 NCS, F, Cl, Br 또는 I이다)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
- 제98 항에 있어서, Y는 Br인 것인 개시제.
- 제99 항에 있어서, R3, R4 및 R5는 각각인 것인 개시제.
- 제99 항에 있어서,R3, R4 및 R5는 각각인 것인 개시제.
- 제99 항에 있어서, R4, R5 및 R6은 각각
인 것인 개시제.
- 제98 항에 있어서, L3은 결합이고 R2는 H이며 R1은인 것인 개시제.
- 제98 항에 있어서, L2는 -(CH2)1-6-인 것인 개시제.
- 제104 항에 있어서, L2는 -(CH2)3-인 것인 개시제.
- 중합반응 과정으로서,
하나 이상의 라디칼 중합 가능한 단량체를: 라디칼적으로 이동 가능한 원자 또는 기로 균질분해반응적으로 절단 가능한 결합을 포함하는 개시제;
전이 금속 화합물; 및
(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하며 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하며 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 리간드의 존재하에 중합시키는 단계를 포함하고;
리간드는 전이 금속 화합물에 배위 결합되며,
전이 금속 화합물 및 리간드는 단량체의 중합화를 개시하고 증식하기 위해 매치되는 것인 중합반응 과정. - 제106 항에 있어서, 리간드는 개시제에 공유적으로 연결되어 단일분자 개시제 리간드를 형성하는 것인 중합반응 과정.
- 제107 항에 있어서, 단일분자 개시제 리간드는 다음의 구조를 가지는 것인 중합반응 과정:
,
식에서
L1은 제1 링커이며, L2는 제2 링커이고 L3은 제3 링커이며, L1, L2 및 L3은 동일하거나 상이하고 각각 -C1-C12 알킬-, -C3-C12 사이클로알킬-, (-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-, (-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-, -(CH2)1-12O-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-, -(CH2)1-12-(CO)-O-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-, -(CH2)1-12-O-(CO)-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-, (-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-, -(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-, -(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C1-C8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-, -(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -(C1-8알킬)-(C3-C12 사이클로알킬)-(C1-8알킬)-, -NH-(CH2CH2-O-)1-20-NH-(CH2CH2-O-)1-20- 및 -(CH2)0-3-아릴-(CH2)0-3-, 결합 및 상기의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며;
R1 및 R2는 동일하거나 상이하며 H (단 R1 및 R2 둘 다 H가 아님), 및 하나 이상의 염기성 기로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 염기성 기는(식에서 R6, R7, R8, R9 및 R10은 동일하거나 상이하고 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R11 및 R12는 동일하거나 상이하고 결합, H, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(식에서 R13, R14, R15, R16 및 R17은 동일하거나 상이하고 결합, H, 아미노, 아릴6-12 및 알킬1-6으로 구성되는 군으로부터 선택됨) 및 하나 이상의 아르기닌 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하며 다음:
,
및
(식에서 Y는 NCS, F, Cl, Br 또는 I이다)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
- 제108 항에 있어서, Y는 Br인 것인 중합반응 과정.
- 제109 항에 있어서, R3, R4 및 R5는 각각인 것인 중합반응 과정.
- 제109 항에 있어서, R3, R4 및 R5는 각각인 것인 중합반응 과정.
- 제109 항에 있어서, R4, R5 및 R6은 각각
인 것인 중합반응 과정.
- 제108 항에 있어서, L3은 결합이고 R2는 H이며 R1은인 것인 중합반응 과정.
- 제113 항에 있어서, L2는 -(CH2)1-6-인 것인 개시제.
- 제114 항에 있어서, L2는 -(CH2)3-인 것인 개시제.
- 제108 항에 있어서, 라디칼 중합 가능한 단량체는 올레핀 불포화 단량체인 중합반응 과정.
- 제116 항에 있어서, 불포화 단량체는 HEMA-PC를 포함하는 것인 중합반응 과정.
- 제108 항에 있어서, 전이 금속은 저 원자가 상태의 전이금속 또는 적어도 하나의 배위결합하는 비-하전된 리간드에 배위결합된 전이 금속 중 하나이며 전이 금속은 카운터이온을 포함하는 것인 중합반응 과정.
- 제108 항에 있어서, 전이 금속은 구리, 철, 니켈 또는 루테늄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 중합반응 과정.
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