KR20170048202A - 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 압타머; 고분자; 및 광응답제로 이루어진 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체에 관한 기술로, 보다 상세하게는 상기 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체는 수용액 상에서 안정하게 분산되어 광응답제의 난용성 부작용을 감소시킬 수 있으며, 특정 암세포와 특이적으로 결합하는 압타머에 의해 광응답제의 암세포 표적화를 증가시켰으며, 광 조사시 암세포와 결합된 광응답제가 생성하는 일항산소로 인하여 효과적인 항암 치료가 가능하다.
Description
본 발명은 친수성이 증가된 광응답제를 이용한 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 각종 종양에 대한 선택성 및 광증감성이 있는 광응답제(photosensitizer, PS)를 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하는 기술로, 암의 진단과 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술 및 관절염 등의 치료에서 환자의 면역성을 높이기 위해 사용되는 등 응용 범위가 점차 확대되고 있다.
암을 비롯한 다양한 질병을 치료하기 위해, 상기 광응답제를 정맥주사에 의해 대상자에 투여하고, 빛을 조사하면 그로 인해 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 질병 부위의 세포를 파괴 및 궤멸시키게 된다. 이러한 광역학 치료는 정상 세포를 보존하면서 질병 부위의 세포만을 선택적으로 제거할 수 있다. 광응답제에는 포르피린(porphyrin) 유도체, 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine) 등이 있고, 화합물의 특성상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단으로도 활용될 수 있다.
압타머(aptamer)는 특이적이고 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 대하여 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 단일가닥 DNA, RNA 또는 변형핵산을 이르는 말로, 1990년에 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 기술이 개발된 이후, 이온, 약물, 펩타이드, 효소와 같은 단백질, 세포와 같은 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 다양한 압타머가 지속적으로 발굴되고 있다.
압타머는 높은 친화성과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있는 특성 덕분에 종종 단일 항체와 비교되는데, 항체와 달리 압타머는 염기서열만 알면 생체 밖에서 화학적으로 합성이 가능하므로 대량생산이 가능하여 'chemical antibody'라 불리며 항체를 대체할 물질로서의 높은 가능성을 보이고 있다.
항체는 분자 구조가 커서 (~150 kDa) 생산하기 어렵고 부가적인 변형이 어렵지만, 압타머는 약 20~60 mer 길이의 핵산 올리고머로, 여러 필요한 변형이 용이하며, 진단을 위한 형광물질을 분자량이 큰 항체에 접합하는 경우, 형광물질의 접합 개수가 일정하지 않아 원하는 접합체를 분리, 정제하는 것이 쉽지 않은 반면에, 분자량이 작은 압타머와 형광물질을 접합하는 경우 1 대 1 접합이 가능하며, 분리, 정제 과정이 훨씬 용이하다. 또한, 압타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다.
단백질로 이루어진 항체는 우선 pH와 온도에 굉장히 민감하고, 체내에서 소수성 상호작용에 의하여 응집될 수 있으며, 실온 보관 및 운반이 불가능하지만, 압타머의 경우에는 실온 보관 및 운반이 가능하고 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있어, 만약 변성이 되더라도 단시간 내에 재생이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다.
항체는 동물이나 세포를 이용하여 생산하기 때문에 많은 시간과 비용이 요구되고, 생산된 시기에 따라 항체의 기능성이 달라질 가능성(batch to batch variation)이 있으나, 압타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에 단시간에 적은 비용으로 대량생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며, 높은 순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다.
또한, 항체에 물질을 접하는 경우, 항체에 기본적으로 존재하는 thiol group, amine group 등의 반응기에 물질이 무작위적으로 부착되기 때문에 항원결합부위에 부착될 수 있고 균일한 결과물이 제조되기에 어려움이 있으며, 항체는 Fab 부위 (Fab region, fragment antigen-binding region)와 Fc 부위 (Fc region, fragment crystallizable region)로 이루어져 있는데, 이 중에서 Fc 부위는 체내 보체 단백질이나 세포막에 존재하는 Fc 수용체 (Fc receptor)와 상호작용하여 체내 면역반응을 활성화시키는 반면에, 압타머는 Fc 부위가 존재하지 않는 핵산 올리고머 형태이기 때문에, 생체 내에 적용하였을 때 항체나 다른 의약용 단백질의 경우 쉽게 나타나는 생체 내 면역반응이 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며, 이는 치료용으로의 개발연구에 매우 중요한 장점이다.
최근에는 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 다양한 압타머가 지속적으로 발굴되기 때문에 항체를 만들기 어려운 독소나 단백질 복합체, 당과 단백질 복합체에 대한 압타머를 만들 수 있다. 이처럼 다양한 장점을 가지는 압타머를 생체 내 이미징에 적용하면, 작은 크기 덕분에 항체에 비해 더 빠른 반응속도를 나타내고 더 우수한 신호-노이즈 비를 가질 수 있다. 또한 압타머와 광응답제를 접합하여 내시경에 적용하면 질병 부위를 눈으로 확인하면서 진단과 치료를 즉각적으로 할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 면역반응의 활성화와 관련된 항체를 이용할 경우에는 감염성 질환을 중심으로 정성적 검사가 가능하지만 압타머를 활용하면 감염성 질환을 비롯한 만성질환까지 진단이 가능하며 정성적, 정량적 검사를 할 수 있다.
따라서, 암치료제로써의 압타머는 성장인자나 성장인자 수용체를 막음으로써 암세포 성장 신호경로를 직접 억제하거나, 암세포 치료분자를 타겟세포로 운반하는 'escort aptamer'로 사용될 수 있으므로, 다른 암세포 타입이나 암세포 표면 단백질을 타겟팅하는 특이적인 압타머의 수득은 신규 암진단제 및 치료제의 개발에 도움이 된다.
본 발명은 질병 부위 표지 및 질병 부위 치료를 위해 부가적으로 형광 물질을 접합하거나 항암제를 봉입하여 전달하는 기존의 광응답제 접합체의 생체안정성 및 질환 표적성 문제를 해결하기 위해, 친수성 고분자 및 압타머가 결합된 광응답제 접합체를 제조하고 이를 암 진단 및 치료제로 사용하는 기술에 관한 것이다.
본 발명은 압타머, 고분자, 및 광응답제로 이루어진 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 광응답제를 촉매가 포함된 유기용매에 용해시키는 단계(제1단계); 친수성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계(제2단계); 상기 제1단계 용해물과 제2단계 용해물을 혼합하여 반응시키는 단계(제3단계); 상기 제3단계의 반응혼합물을 여과하여 친수성 고분자-광응답제 접합체를 수득하는 단계(제4단계); 상기 제4단계의 친수성 고분자-광응답제 접합체를 촉매가 포함된 증류수에 용해시키고 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계(제5단계); 및 상기 제5단계의 반응혼합물을 여과하고 원심분리하여 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 수득하는 단계(제6단계)를 포함하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 제조방법을 제공한다.
본 발명은 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 광역학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 진단용 광역학 조성물을 제공한다.
본 발명은 압타머와 친수성 고분자-광응답제 접합체의 1:1 반응로 균일한 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 제조할 수 있으며, 상기 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체는 수용액 상에서 안정하게 분산되어 광응답제의 난용성 부작용을 감소시킬 수 있으며, 특정 암세포와 특이적으로 결합하는 압타머에 의해 광응답제의 암세포 표적화를 증가시켰으며, 광 조사 시 암세포와 결합된 광응답제가 생성하는 일항산소로 인하여 효과적인 항암 치료가 가능하다.
도 1은 본 발명의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 제조하는 과정의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜-헤마토포르피린 접합체의 1H-NMR 결과이다.
도 3는 본 발명에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체의 1H-NMR 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체의 1H-NMR 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 UV-VIS 분석 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 제타-포텐셜(Zeta-potential) 분석 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 일항산소 생성능 분석 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 농도에 따른 정상세포와 암세포에서 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 농도에 따른 정상세포와 암세포에서의 세포 내 유입을 확인한 공초점 현미경 분석 결과이다.
도 10은 정상세포와 암세포에서 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 세포 내 유입 정도를 확인하기 위해, 유세포 분석기로 세포 내 형광강도를 정량적으로 분석 결과이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 처리된 정상세포와 암세포에서 레이저 조사량에 따른 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜-헤마토포르피린 접합체의 1H-NMR 결과이다.
도 3는 본 발명에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체의 1H-NMR 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체의 1H-NMR 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 UV-VIS 분석 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 제타-포텐셜(Zeta-potential) 분석 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 일항산소 생성능 분석 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 농도에 따른 정상세포와 암세포에서 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 농도에 따른 정상세포와 암세포에서의 세포 내 유입을 확인한 공초점 현미경 분석 결과이다.
도 10은 정상세포와 암세포에서 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 세포 내 유입 정도를 확인하기 위해, 유세포 분석기로 세포 내 형광강도를 정량적으로 분석 결과이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 처리된 정상세포와 암세포에서 레이저 조사량에 따른 세포독성을 확인한 결과이다.
본 발명은 압타머, 친수성 고분자, 및 광응답제로 이루어진 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 제공할 수 있다.
상기 친수성 고분자 및 광응답제는 에스테르 결합할 수 있으며, 상기 압타머는 친수성 고분자와 펩티드 결합할 수 있다.
상기 광응답제는 포르피린계 (porphyrin) 화합물, 클로린계 (chlorin)화합물, 박테리오클로린계 (bacteriochlorin) 화합물, 프탈로시아닌계 (phthalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanine) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계 (5-aminolevulinic acid ester) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 광응답제는 헤마토포르피린, 클로린 e6 및 프탈로시아닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 플루로닉, 플루란, 히알루론산, 글리콜키토산, 헤파린, 콘트로이친황산, 푸코이단, 덱스트란 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 압타머는 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종 및 피부암으로 이루어진 군에 선택된 어느 하나의 암에 특이적으로 나타나는 펩타이드, 단백질 또는 세포에 결합할 수 있다.
상기 압타머는 양쪽 말단 중 어느 하나에 아민기를 포함할 수 있다.
보다 상세하게는 종래 기술인 항체를 이용하여 물질을 접합하는 경우, 항체에 기본적으로 존재하는 티올기(thiol group), 아민기(amine group) 등의 반응기에 물질이 무작위적으로 부착되기 때문에 균일한 결과물이 제조되기에 어려운 반면, 본원발명의 압타머는 5번 말단에만 아민기가 존재하므로 친수성 고분자-광응답제 접합체와 1대 1로 반응할 수 있어 균일한 결과물을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 광응답제를 촉매가 포함된 유기용매에 용해시키는 단계(제1단계); 친수성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계(제2단계); 상기 제1단계 용해물과 제2단계 용해물을 혼합하여 반응시키는 단계(제3단계); 상기 제3단계의 반응혼합물을 여과하여 친수성 고분자-광응답제 접합체를 수득하는 단계(제4단계); 상기 제4단계의 친수성 고분자-광응답제 접합체를 촉매가 포함된 증류수에 용해시키고 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계(제5단계); 및 상기 제5단계의 반응혼합물을 여과하고 원심분리하여 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 수득하는 단계(제6단계)를 포함하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 촉매는 디메틸아미노피리딘, 디사이클로헥실카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이거나 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 유기용매는 디메틸설폭사이드, 포름아마이드 및 디메틸포름아마이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 암세포 특이적으로 유입되는지를 정량적으로 확인하기 위해, 정상세포인 L-929와 암세포인 MCF-7 및 HCT 116을 배양한 후 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 2시간동안 처리하고 완충용액으로 세척한 후 유세포 분석기를 이용하여 세포에 따른 유입 특성을 분석하였다.
그 결과, 도 10과 같이 정상세포에서는 non-treat군과 sample군의 형광강도가 유사하게 나타난 것이 확인됨에 따라, 정상세포에서는 압타머에 의한 세포 유입이 일어나지 않는 것이 확인된 반면, 암세포에서는 non-treat군에 비해서 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 처리한 군(sample군)의 형광강도가 크게 증가하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 본 발명의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체는 암세포 특이적으로 유입되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 정상세포인 L-929와 암세포인 MCF-7 및 HCT 116 세포에 상기 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 처리한 후 레이저를 조사해주었을 때 정상세포 및 암세포에서의 세포 생존율의 변화를 분석한 결과, 도 11과 같이 정상세포에서는 조사해준 레이저의 세기에 관계없이 세포 독성이 나타나지 않은 반면, 뉴클레올린이 과 발현된 암세포에서는 압타머에 의한 세포 내 유입이 일어나기 때문에 동일한 농도의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 처리하고 레이저 조사량을 늘릴수록 세포 독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 본 발명의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체는 암세포 내로 효과적으로 유입되며, 레이저 조사 시 일항산소를 효과적으로 생성함으로써 암세포의 독성을 유도하는 것이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 광역학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 진단용 광역학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<
실시예
1> 친수성이
증가된
고분자-
광응답제
접합체 제조
1.
폴리에틸렌글리콜
-
헤마토포르피린
접합체 제조
헤마토포르피린(hematoporphyrin; HP) 0.043g, 디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 0.022g과 디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP) 0.013g을 50ml 플라스크에서 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxid; DMSO) 5ml에 용해시키고, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG) 0.2g을 디메틸설폭사이드 5ml에 녹여서 각각 6시간 동안 교반하였다.
상기 두 용액을 섞은 후에 상온에서 24시간 반응시켰고, 반응에 참여하지 않은 물질과 불순물을 제거하기 위하여 필터링을 한 후 투석막(molecular weight cut-off size : 1,000 Da)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물은 동결 건조를 통하여 건조하여 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체를 수득하였다.
폴리에틸렌글리콜
-
헤마토포르피린
접합체
1
H-NMR 분석
상기 방법으로 제조된 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체의 접합 여부를 확인하기 위하여, (a) 실시예 1, (b) 폴리에틸렌글리콜, (c) 광응답제를 각각 NMR용 디메틸설폭사이드에 분산하여 측정하였다.
그 결과 도 2와 같은 데이터를 얻었다.
1-2.
폴리에틸렌글리콜
-
클로린
e6 접합체 제조
클로린 e6(chlorin e6; Ce6) 0.047g, 디사이클로헥실카보디이미드 0.018g과 디메틸아미노피리딘 0.011g을 50ml 플라스크에서 디메틸설폭사이드 5ml에 용해시키고, 폴리에틸렌글리콜 0.2g을 디메틸설폭사이드 5ml에 녹여서 각각 6시간 동안 교반하였다.
상기 두 용액을 섞은 후에 상온에서 24시간 반응시키고, 반응에 참여하지 않은 물질과 불순물을 제거하기 위하여 필터링을 한 후 투석막(molecular weight cut-off size : 1,000 Da)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물은 동결 건조를 통하여 건조하여 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체를 수득하였다.
폴리에틸렌글리콜
-
클로린
e6
1
H-NMR 분석
상기 방법으로 제조된 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체의 접합 여부를 확인하기 위하여, (a) 실시예 1-2, (b) 폴리에틸렌글리콜, (c) 클로린 e6을 각 NMR용 디메틸설폭사이드에 분산하여 측정하였다.
그 결과 도 3과 같은 데이터를 얻었다.
1-3. 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체 제조
폴리에틸렌글리콜 0.01ml, 디사이클로헥실카보디이미드 0.022g과 디메틸아미노피리딘 0.013g을 25ml 플라스크에서 디메틸설폭사이드 5ml에 용해시키고, 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌(polyethylene glycol-phthalocyanine, PEG-PC) 0.2g을 디메틸설폭사이드 5ml에 녹여서 각각 6시간 동안 교반하였다.
상기 두 용액을 섞은 후에 상온에서 24시간 반응시키고, 반응에 참여하지 않은 물질과 불순물을 제거하기 위하여 필터링을 한 후 투석막(molecular weight cut-off size : 1,000 Da)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물은 동결 건조를 통하여 건조하여 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체를 수득하였다.
폴리에틸렌글리콜
-
프탈로시아닌
1
H-NMR 분석
상기 방법으로 제조된 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체의 접합 여부를 확인하기 위하여, (a) 실시예 1-3, (b) 폴리에틸렌글리콜, (c) 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 을 각 NMR용 디메틸설폭사이드에 분산하여 측정하였다.
그 결과 도 4와 같은 데이터를 얻었다.
<
실시예
2>
압타머
-친수성 고분자-
광응답제
접합체 제조
2-1.
압타머
-
폴리에틸렌글리콜
-
헤마토포르피린
접합체 제조
상기 실시예 1-1에서 수득한 폴리에틸렌글리콜-헤마토포르피린 접합체를 이용하여 하기 반응식 1과 같은 과정으로 압타머-폴리에틸렌글리콜-헤마토포르피린 접합체를 얻었다.
[반응식 1]
폴리에틸렌글리콜-헤마토포르피린 접합체 0.015g을 핵산분해효소가 없는 증류수 0.15ml에 녹이고, 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC) 0.012g과 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 0.002g을 각각 0.2ml에 녹여서 혼합한 다음 상온에서 30분 동안 교반하였다. 압타머(5´-NH2-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3´) 0.001g을 증류수 1ml에 녹여서 활성화된 폴리에틸렌글리콜-헤마토포르피린 접합체 용액에 섞은 후 4시간 동안 반응시키고 정제 필터(molecular weight cut-off size : 10,000 Da)로 옮겨서 원심분리기를 이용하여 반응에 참여하지 않은 물질을 제거하였다.
2-2.
압타머
-
폴리에틸렌글리콜
-
클로린
e6 접합체 제조
상기 실시예 1-2에서 수득한 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체를 이용하여 하기 반응식 2와 같은 과정으로 압타머-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체를 얻었다.
[반응식 2]
폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체 0.015g을 핵산분해효소가 없는 증류수 0.15ml에 녹이고, 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드 0.012g과 N-하이드록시숙신이미드 0.002g을 각각 0.2ml에 녹여서 혼합한 다음 상온에서 30분 동안 교반하였다. 압타머(5´-NH2-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3´) 0.001g을 증류수 1ml에 녹여서 활성화 된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체 용액에 섞은 후 4시간 동안 반응시키고 정제필터(molecular weight cut-off size : 10,000 Da)로 옮겨서 원심분리기를 이용하여 반응에 참여하지 않은 물질을 제거하였다.
2-3.
압타머
-
폴리에틸렌글리콜
-
프탈로시아닌
접합체 제조
상기 실시예 1-3에서 수득한 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체를 이용하여 하기 반응식 3과 같은 과정으로 압타머-폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체를 얻었다.
[반응식 3]
폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체 0.015g을 핵산분해효소가 없는 증류수 0.15ml에 녹이고, 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드 0.012g과 N-하이드록시숙신이미드 0.002g을 각각 0.2ml에 녹여서 혼합한 다음 상온에서 30분 동안 교반하였다. 압타머(5´-NH2-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3´) 0.001g을 증류수 1ml에 녹여서 활성화 된 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체 용액에 섞은 후 4시간 동안 반응시키고 정제필터(molecular weight cut-off size : 10,000 Da)로 옮겨서 원심분리기를 이용하여 반응에 참여하지 않은 물질을 제거하였다.
<
실험예
1> UV-
VIS
흡광분석
상기 실시예 2에서 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 접합 여부를 확인하기 위하여, 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체와 압타머-폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체를 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5와 같이 압타머를 접합한 후, 260 nm에서 압타머의 흡광도 피크가 나타나는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 압타머-폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 제타-포텐셜(Zeta-potential) 분석
상기 실시예 2에서 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 접합 여부를 확인하기 위하여, 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체와 압타머-폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체를 제타-포텐셜 분석기기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 6과 같이 압타머 접합 전과 후의 접합체의 표면 전하가 약 20 mV 차이 나는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 음전하를 나타내는 압타머가 폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체에 도입되면서 표면 전하가 더욱 강한 음전하를 띠는 방향으로 증가된 것을 확인하였다.
<실험예 3> 일항산소 생성능 분석
상기 실시예 2에서 제조된 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 광활성 여부를 확인하기 위하여, 수상에서 광응답제와 압타머-폴리에틸렌글리콜-광응답제 접합체의 일항산소 생성능을 형광분광광도계를 이용하여 분석하였다.
일항산소를 검출할 수 있는 singlet oxygen detector로 singlet oxygen sensor green(SOSG)을 2 μM 농도로 제조한 후에 샘플과 1:1 부피비로 혼합하고, 레이저를 50초 간격으로 조사하면서 형광 spectrophotometer를 이용하여 Ex 504nm, Em 525nm에서 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 7과 같이 수상에서 기존의 광응답제는 일항산소 생성능을 나타내지 못했지만 압타머-광응답제 접합체는 레이저를 5 J/cm2까지 조사하였을 때 일항산소 생성능이 각각 6배(HP), 12.6배(Ce6) 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
프탈로시아닌의 경우 폴리에틸렌글리콜이 접합되어있는 프탈로시아닌에 카르복실기가 있는 폴리에틸렌글리콜을 도입 후 압타머 접합체를 제조하였기 때문에 대조군으로 기존 폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌을 사용하였으며, 압타머-폴리에틸렌글리콜-프탈로시아닌 접합체 제조 후에도 이전과 유사한 일항산소 생성능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
<
실험예
4>
압타머
-친수성 고분자-
광응답제
접합체 농도에 따른 세포 독성 평가
압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 세포에서 독성을 나타내지 않는 농도를 확인하기 위하여, 정상세포인 L-929(normal fibroblast)와 암세포인 MCF-7(breast cancer cell) 및 HCT 116(colon cancer cell)으로 세포독성 농도를 확인하였다.
세 종류의 세포 주를 96 well 플레이트에 하루 동안 배양한 후 광응답제 농도를 기준으로 하여 샘플을 0-10 ㎍/ml 로 2시간 동안 처리한 후 세포 생존율을 MTT 정량법을 수행하여 분석하였다.
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 정량법은 물질이 세포에 얼마나 독성을 나타내는지 확인하는 실험으로, MTT를 처리하면 살아있는 세포에서는 미토콘드리아에 있는 환원효소(reductase)에 의해 MTT가 환원되어 포르마잔(formazan) 결정을 형성하게 된다. 반면에, 죽은 세포에서는 미토콘드리아와 환원효소가 제 기능을 하지 못하므로 포르마잔도 형성될 수 없어 세포생존율에 따라 생성되는 포르마잔양이 달라지는데 이를 정량하여 세포의 생존율을 분석하였다.
그 결과, 도 8과 같이, 광응답제 농도 기준 1 ㎍/ml보다 높은 농도에서는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체에 의한 세포 독성이 나타나는 것이 확인되었다.
<실험예 5> 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 세포 내 위치 확인
본 발명에 따른 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 암세포 특이적인 세포유입을 나타내는지 확인하였다.
먼저, 정상세포인 L-929와 암세포인 MCF-7 및 HCT 116을 배양한 후, 본 발명에 따른 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 0-10 ㎍/ml의 농도로 세포에 2시간 동안 처리한 후 완충용액으로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 농도에 따른 세포 내 분포는 공초점 현미경을 이용하여 시각적으로 확인하였다.
그 결과, 도 9와 같이 정상세포인 L-929에서는 가장 높은 농도인 10 ㎍/ml에서만 약한 형광이 관찰되었고, 암세포인 MCF-7 및 HCT 116에서는 0.1 ㎍/ml 이상의 농도에서 광응답제에 의한 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 6> 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 세포 내 유입 확인
상기 실험예 4와 실험예 5의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 농도 최적화 결과로부터 세포 처리 농도를 1 ㎍/ml으로 설정하고, 본 발명에 따른 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 암세포 특이적으로 유입되는지 정량적으로 확인하기 위해, 정상세포인 L-929와 암세포인 MCF-7 및 HCT 116을 배양한 후 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 2시간 동안 처리하고 완충용액으로 세척한 후 유세포 분석기를 이용하여 세포에 따른 유입 특성을 분석하였다.
그 결과, 도 10과 같이 정상세포에서는 non-treat군과 sample군의 형광강도가 유사하게 나타난 반면, 암세포에서는 non-treat군에 비해서 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 처리한 군(sample군)의 형광강도가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 정상세포에서는 압타머에 의한 세포 유입이 일어나지 않는 것이 확인되었다.
<실험예 7> 레이저 조사량에 따른 세포 독성 평가
앞선 실험결과로부터 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 암세포 선택적 분포 양상을 확인하였으며, 추가적으로 레이저를 조사해주었을 때 정상세포 및 암세포에서의 세포 생존율의 변화를 분석하였다.
먼저, 정상세포인 L-929와 암세포인 MCF-7 및 HCT 116을 배양한 후 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 2시간 동안 처리하고 레이저를 0-5 J/cm2 세기로 조사한 후 다시 배양기에서 하루 동안 배양시켰다.
배양이 끝난 세포에 MTT 시약을 처리하여 3~4시간 동안 배양시킨 후 배양액과 MTT 시약 등을 모두 제거하고 디메틸설폭사이드를 가하여 세포에 형성된 포르마잔을 용해시켰다. 그 후 570nm에서 흡광도를 측정하여 형성된 포르마잔 양을 비교하여 세포의 생존율 및 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체의 세포 독성을 분석하였다.
그 결과, 도 11과 같이 정상세포와 암세포 모두에서 레이저를 조사하지 않은 군에서는 세포 독성이 나타나지 않았으며, 정상세포에서는 조사해준 레이저의 세기에 관계없이 세포 독성이 나타나지 않았다. 반면, 뉴클레올린이 과 발현된 암세포에서는 압타머에 의한 세포 내 유입이 일어나기 때문에 동일한 농도의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 처리하고 레이저 조사량을 늘릴수록 세포 독성이 증가하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 본 발명의 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체가 암세포 내에 효과적으로 유입되며, 이를 통하여 레이저 조사 시 효과적으로 일항산소가 생성되어 암세포에 독성을 유도함으로써 암을 치료할 수 있다는 사실이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- 압타머, 친수성 고분자, 및 광응답제로 이루어진 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 친수성 고분자 및 광응답제는 에스테르 결합하는 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 압타머는 친수성 고분자와 펩티드 결합하는 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광응답제는 포르피린계 (porphyrin) 화합물, 클로린계 (chlorin)화합물, 박테리오클로린계 (bacteriochlorin) 화합물, 프탈로시아닌계 (phthalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanine) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계 (5-aminolevulinic acid ester) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 플루로닉, 플루란, 히알루론산, 글리콜키토산, 헤파린, 콘드로이친황산, 푸코이단, 덱스트란 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 압타머는 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종 및 피부암으로 이루어진 군에 선택된 암질환의 표적항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 압타머는 압타머의 양쪽 말단 중 어느 하나에 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체.
- 광응답제를 촉매가 포함된 유기용매에 용해시키는 단계(제1단계);
친수성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계(제2단계);
상기 제1단계 용해물과 제2단계 용해물을 혼합하여 반응시키는 단계(제3단계);
상기 제3단계의 반응혼합물을 여과하여 고분자-광응답제 접합체를 수득하는 단계(제4단계);
상기 제4단계의 친수성 고분자-광응답제 접합체를 촉매가 포함된 증류수에 용해시키고 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계(제5단계); 및
상기 제5단계의 반응혼합물을 여과하고 원심분리하여 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 수득하는 단계(제6단계)를 포함하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 제조방법. - 청구항 8에 있어서, 상기 촉매는 디메틸아미노피리딘, 디사이클로헥실카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이거나 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 제조방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 유기용매는 디메틸설폭사이드, 포름아마이드 및 디메틸포름아마이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체 제조방법.
- 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 광역학 조성물.
- 압타머-친수성 고분자-광응답제 접합체를 유효성분으로 함유하는 암질환 진단용 광역학 조성물.
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| CN111195352A (zh) * | 2018-11-08 | 2020-05-26 | 国立癌症中心 | 基于岩藻多糖的诊断治疗剂组合物 |
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