KR20160147055A - Sustained release angiogenesis modulating compositions and methods for induction and modulation of angiogenesis - Google Patents

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유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크.
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본 개시내용은 인간 태반 추출물 및 생분해성 미세입자를 포함하는 조성물, 서방형 혈관신생 조절용 조성물, 일정 기간 동안에 걸쳐 태반 추출물을 표적으로 방출하기 위한 조성물 및 방법, 및 혈관신생을 유도 및/또는 조절하고, 혈관신생의 조절 인자를 확인하는 방법을 제공한다. The present disclosure is the human placenta extract and biodegradable microporous composition comprising particles, sustained release angiogenesis regulating composition, a composition for emitting placenta extract target over a period of a period of time and method, and induces angiogenesis and / or control, and provides a method to identify modulators of angiogenesis. 본 개시내용은 또한 혈관신생을 유도 및/또는 조절할 수 있는 태반 추출물을 포함하는 조성물을 제조하는 방법도 제공한다. The present disclosure also provides a method for preparing a composition comprising placenta extract that can induce and / or to control angiogenesis.



관련 출원에 대한 상호 참조 Cross-reference to related applications

본 출원은 2014년 5월 8일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 61/990,256(발명의 명칭: "혈관신생의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관신생 조절자를 확인하기 위한 방법 및 분석(Compositions and Methods for Induction and Modulation of Angiogenesis and Methods and Assays for Identifying Angiogenesis Modulators)") (상기 가출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 대한 우선권 주장한다. This application, filed May 8, 2014, U.S. Provisional Application Serial Number 61/990 256 (Invention Name of "methods and assays to determine those compositions and methods, and angiogenesis control for the induction and regulation of angiogenesis (Compositions and Methods for Induction and Modulation of Angiogenesis and Methods and Assays for Identifying Angiogenesis Modulators) ") (the provisional application claims priority in its entirety of which is incorporated herein by reference).

연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 언급 Statements regarding federal government support research or development

본 발명은 미국 국립 보건원이 수여한 보조금 번호 HL088207 하에 정부 지원으로 이루어졌다. This invention was made with government support under grant number HL088207 awarded by the National Institutes of Health. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다. The Government has certain rights in the invention.

혈관신생은 상처 치유에서부터 암에 이르기까지 생리학적 및 병리학적 상태에서 혈관을 형성할 수 있다. Angiogenesis can form blood vessels in the physiological and pathological conditions, ranging from wound healing to cancer. 혈관신생 조절은 위치 및 자극, 둘 모두에 의존하며, 각 경우에 조절 분자의 고유한 조합을 수반할 수 있다. Angiogenesis regulation may involve a unique combination of location and stimulation, both dependent on both, control molecules in each case.

조작된 기관에서 혈관화하고, 경색 부위에서 재혈관화할 수 있는 능력이 없다는 것은 성공적인 재생 의학 요법을 임상에 적용하는 데 있어 주된 걸림돌이 되어왔다. Vascularization in engineered organs, and it is that ability that can be re-vessels in the infarct area have to apply the successful regenerative medicine therapies in clinical been the main stumbling block. 한정적인 방식으로 혈관신생을 조절할 수 있는 능력은 정상 및 병리학적 혈관 생리, 조직/기관의 재생, 상처 치유, 경색 조직 수복 및 암의 억제를 한정하는 것으로부터 광범위한 임상 적용에 있어 상당한 영향을 준다. Limiting manner, the ability to regulate the angiogenic gives a considerable impact on a wide range of clinical applications from as limiting the normal and pathological vascular physiology of the tissue / organ regeneration, wound healing, infarct tissue repair, and suppression of cancer. 직접적인 세포 시딩 (단일 배양 또는 공동 배양), 줄기 세포 사용, 및 인간 유래 조절 인자/성장 인자의 조합을 비롯한, 여러 다양한 접근법이 혈관신생을 개시하고, 더 큰 혈관 형성을 유도하는 데 고려되어 왔다. Direct cell seeding (single culture or co-culture), stem cells, and including a combination of human-derived regulatory factor / growth factor, discloses a number of different approaches are angiogenesis and has been considered to lead to greater vascularization. 현재까지, 전형적으로 비인간 동물 화합물을 이용하는 상기와 같은 시험관내 접근법은 그들의 개별적인 단백질 구성, 비인간 유래, 종양 유래, 또는 유전자 발현을 제어하는 방법인 경우, 유전적 조절의 결여로 인해 임상으로 전환시키는 데에서는 거의 성공을 거두지 못하였다. Up to now, for which typically vitro approaches such as the use of non-human animal the compound is due to the case of a method of controlling their individual protein structure, non-human-derived, tumor-derived, or gene expression, and lack of genetic control switch to clinical in nearly it filled without success.

시험관내 혈관신생을 유도하는 현행 방법은 인간 유래 조절 인자의 단순한 조합으로 구성되며, 이는 동물 유래 자극 인자를 사용하거나, 평가를 위해 살아있는 동물을 사용하는 것에 전적으로 의존하고 있다. The current method of inducing angiogenesis in vitro consists of the simple combination of human-derived regulatory elements, which relies heavily on the use of live animals for evaluation using animal-derived-stimulating factor, or. 잠재성이 있는 혈관신생 억제 약물을 시험하기 위하여 인간 유래 및/또는 동물 유래 조절 인자의 단순한 조합으로 이루어진 상기와 같은 현행 시험관내 모델을 이용하는 것은 광범위한 인간 생체내 분자 상호 작용 세트를 나타내지 못하기 때문에 스크리닝 공정에 제약을 준다. Screening because of the potential is The use of the blood vessel existing in vitro models as described above consisting of a simple combination of human origin and / or animal-derived control parameters to test the new inhibitory drugs to not represent the broad range of human in vivo molecular interactions set It gives a constraint on the process. 혈관신생의 조절은 많은 대사 경로의 유도를 요구하기 때문에, 유일하게 선택된 분자 경로의 조절 또한 조작된 기관을 전혈관화하기 위한 시도에 제약을 준다. Control of angiogenesis is because it requires the induction of many metabolic pathways, gives the only adjustment of the selected path to molecules also constrained in an attempt to vascularization around the engine operation. 또한, 현재, 가장 일반적이고, 성공적인 접근법은 엔젤브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터 유래된 물질인 마트리겔(Matrigel)™을 이용하는 것인데, 이는 인간 요법에는 부적절한 것으로 간주되고 있다. In addition, at present, the most common and successful approach angel breath-Holm-Swarm (Engelbreth-Holm-Swarm) geotinde using the substance Matrigel (Matrigel) ™ derived from mouse sarcoma cells, which human therapy has been deemed inappropriate have. 따라서, 혈관신생을 유도하고, 조절하는 방법으로서, 개선된 인간 기반의 방법이 약학 개발 및 재생 의학, 둘 모두의 원동력이 될 수 있다. Therefore, as a method to induce and regulate angiogenesis, a human being of an improved based method to be a cause of both pharmaceutical development and regenerative medicine, both.

요약 summary

간략하게 기술하면, 본 개시내용의 실시양태는 인간 태반 추출물을 포함하는 인간 태반 추출물 조성물, 서방형 혈관신생 조절용 조성물, 혈관신생 유도 방법, 및 항염증성 조성물 및 방법을 제공한다. When briefly described, embodiments of the present disclosure provides a human placenta extract, composition, sustained-angiogenic composition adjustment, angiogenesis-inducing method, and anti-inflammatory compositions and methods including a human placenta extract.

본 개시내용은, 생체내 또는 시험관내에서 세포에의 노출 후 인간 태반 추출물이 미세입자로부터 방출될 수 있도록 생분해성 미세입자에 커플링된 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다. The present disclosure is, after exposure of the cells in vivo or in vitro provides a composition comprising the coupling of human placenta extract in biodegradable microparticles to be released from the human placenta extract microparticles. 인간 태반 추출물은 혈액 및 고형물이 상기 추출물로부터 실질적으로 제거된 인간 태반 샘플로부터 수득되고, 추출물은 태반 샘플 중에 존재하는 사이토카인 및 성장 인자를 비롯한 태반 단백질을 포함한다. Human placenta extract the blood and a solid is obtained from the human placenta samples substantially removed from the extract, the extract comprises a placental protein, including cytokines and growth factors present in the placenta sample.

본 개시내용의 혈관신생을 유도하는 방법의 실시양태는 세포를 서방형 혈관신생 조절용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 서방형 혈관신생 조절용 조성물은 생체내 또는 시험관내에서 미세입자의 세포에의 노출 후 일정 기간 동안에 걸쳐 인간 태반 추출물이 미세입자로부터 방출될 수 있도록 본 개시내용의 인간 태반 추출물에 커플링된 생분해성 미세입자를 포함한다. Embodiment of the method for inducing angiogenesis according to the present disclosure comprises the step of contacting the cells with sustained release angiogenesis regulating composition, wherein the sustained release angiogenic adjusting the composition of the microparticles cells in vivo or in vitro after the exposure and a human placenta extract the biodegradable microparticles coupled to human placental extract of the present disclosure to be released from the microparticles over a period of a period of time. 실시양태에서, 본 방법은 서방형 혈관신생 조절용 조성물을 생체물질에 커플링시켜 생체물질의 혈관화를 유도하는 단계를 추가로 포함한다. In embodiments, the method is to couple the angiogenesis-regulating sustained release composition to biological material further comprises the step of inducing vascularization of a biological material.

본 개시내용은 또한 염증 치료를 필요로 하는 피험체에게 본 개시내용의 인간 태반 추출물 및/또는 본 개시내용의 서방형/인간 태반 추출물 조성을 투여함으로써 피험체에서 염증을 감소시키는 방법을 제공한다. The present disclosure also provides a method of reducing inflammation in a subject by administering the sustained release / human placenta extract composition of the human placenta extract and / or the teachings of the present disclosure to a subject in need of treatment of inflammation.

본 개시내용의 다른 방법, 조성물, 특징, 및 이점은 하기 도면 및 상세한 설명의 검토시 당업자에게 명백하거나, 명백화될 것이다. Alternatively, the compositions, features of the present disclosure, and advantages will be apparent or whitening persons to those skilled in the art upon review of the following drawings and detailed description. 상기의 모든 추가의 조성물, 방법, 특징 및 이점은 본 기술 내에 포함되고, 본 개시내용의 범주 내에 포함시키고자 한다. All of the further composition, methods, features and advantages be included within the art, and intended to be included within the scope of this disclosure.

도면의 간단한 설명 Brief Description of the Drawings
본 개시내용의 추가 측면은 첨부되는 도면이 함께 제공되는 경우, 하기에 기술되는 그의 다양한 실시양태에 관한 상세한 설명을 검토할 때 더욱 쉽게 이해될 것이다. The additional disclosure of the side will be more readily appreciated when considering the following detailed description of its various embodiments described below, when supplied with the accompanying drawings.
도 1a-1k는 인간 태반 추출물(hPE: human placental extract) (이는 또한 본원에서 인간 태반 매트릭스 또는 h PM(human placenta matrix)으로도 지칭된다)의 형성, hPE 박막의 특성화, 및 hPE 박막 상에서 형성된 혈관신생 네트워크의 특성화를 도시한 것이다. Figure 1a-1k are human placenta extract (hPE: human placental extract) vessels formed on the formation, characterized in hPE thin film, and hPE thin film (which is also a human placenta matrix or h PM (also referred to as the human placenta matrix) herein) It shows the characterization of the new network. 도 1a는 태반 ECM을 균질화한 후, 우레아 가용화 및 투석함으로써 hPM을 수득하는 단계에 관한 실시양태를 도시한 것이다. Figure 1a shows an embodiment of a step for obtaining a homogenized placental ECM, hPM by urea solubilization and dialysis. 도 1b-1c는 hPE의 표면 형태를 보여주는 SEM 영상이고, 도 1d-1e는, HUVECS를 h Pm 박막 상에 4x10 4 개의 세포/㎠로 시딩하고, 3일 동안 배양하였을 때의, 혈관생성 네트워크 형성의 SEM 영상이다. Fig 1b-1c is a SEM image showing the surface morphology of hPE, Fig. 1d-1e are, angiogenesis network formed when seeded HUVECS to 4x10 4 cells / ㎠ on h Pm thin film, and of culture for 3 days is the SEM image. 도 1f는 태반 추출물 상에서 1일 후에 혈관신생 발아 과정 동안 분지된 세포 사상위족을 보여주는 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin)("적색"--회색 분지 경로로 표시) 및 DAPI("청색"--분지 경로 내에 더 옅은 회색 점으로 표시)를 나타낸다. Figure 1f is 1 day rhodamine palroyi Dean (Rhodamine Phalloidin) showing the cells spirit wijok basin for angiogenic sprouting process on placenta extracts ( "red" shown in gray branched path) and DAPI ( "blue" - branched It shows a display with more light gray points) in the path. 도 1g는 3일 후 광범위하게 세포 코딩(cording)이 이루어진 성숙한 혈관신생 네트워크를 보여주는 로다민 팔로이딘("적색"--회색 분지 경로로 표시) 및 DAPI("청색"--분지 경로 내에 더 옅은 회색 점으로 표시)를 나타낸다. Figure 1g is a wide range of cell coding rhodamine palroyi Dean (cording) shows the mature angiogenesis network of the three days later ( "red" shown in gray branched path) and DAPI ( "blue" light in the further branch path It shows a display with gray dots). 도 1h는 태반 추출물 상에서 1일 후 초기 단계 세포 코딩 및 혈관신생 네트워크 형성 과정 동안 칼세인(Calcein)("녹색"--회색 분지로 표시) 및 DAPI("청색"--분지 내에 더 옅은 회색 점으로 표시) 염색된 HUVEC을 보여주는 것이다. Figure 1h is a knife-old (Calcein) during the initial phase encoding cells and angiogenesis network formation after 1 day on a placenta extract ( "green" - shown in gray branched) and DAPI ( "blue" - The light gray points in the basin display) it will show the stained HUVEC. 도 1i는 태반 추출물 상에서 3일 후에 HUVEC의 세포 코딩을 보여주는 DAPI("청색"―회색 파선 경로로 표시) 염색을 도시한 것이다. Figure 1i is three days after DAPI shows the coding of HUVEC cells on placenta extracts - shows a ( "blue" is displayed as a gray dashed line path) staining. 도 1j는 4x10 4 개의 세포/㎠로 조직 배양 플레이트에 시딩되고, 3일 동안 내피 세포 배지에서 배양된 HUVEC을 도시한 것이다. Fig 1j are seeded in tissue culture plates with 4x10 4 cells / ㎠, shows the HUVEC cultured in endothelial cell medium for three days. 도 1k는 100 ㎕ PE/㎠로 조직 배양 플레이트의 표면에 부착된 태반 추출물 상에 4x10 4 개의 세포/㎠로 시딩된 후, 내피 세포 배지에서 3일 동안 배양된 HUVEC에 의해 형성된 혈관신생 네트워크를 도시한 것이다. Figure 1k is 100 ㎕ PE / ㎠ after the organization of the phase placenta extract attached to the surface of the culture plate 4x10 seeded into four cells / ㎠, showing the angiogenesis-network formed by the HUVEC cultured for 3 days in endothelial cell medium one will.
도 2a-2c는 hPE의 생화학적 분석 및 hPE 상에 시딩된 HUVEC의 유전자 분석을 도시한 것이다. Figure 2a-2c shows the genetic analysis of HUVEC seeded on a biochemical analysis and the hPE hPE. 도 2a는 샌드위치 기반의 인간 혈관신생 항체 어레이를 이용하여 수행된 사이토카인 분석을 도시한 막대 그래프이다; Figure 2a is a bar graph showing the analysis of cytokines performed using a sandwich based on human angiogenesis antibody array; 데이터는 음성 대조군 값(0%)에서부터 양성 대조군 값(100%) 범위의 스케일로 정규화되었다(데이터는 3회의 생물학적 반복 실험을 대표한다). Data were normalized to a scale of the positive control value range (100%) from the negative control value (0%) (data represent the biological replicates three times). 도 2b 및 2c는 LC-MS/MS를 이용하여 측정된 면역 관련된(2b) 및 혈관신생 관련된(2c) BM 관련 단백질의 정규화된 스펙트럼 존재비 인자(%)를 도시한 막대 그래프이다. 2b and 2c are LC-MS / immune-related (2b) and angiogenesis associated (2c) measured using a BM-related MS is a graph illustrating the normalized spectrum abundance ratio factor (%) bar graph of the protein. 피브리노겐 정규화된 스펙트럼 존재비 인자 값은 FGA와 FGG 값의 합으로 제시되고, 라미닌은 LAMA2, LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2, LAMB3, 및 LAMC1 값의 합으로 제시되어 있다. Fibrinogen normalized spectrum abundance factor values ​​are presented as a sum of FGA and FGG value, laminin is given by the sum of LAMA2, LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2, LAMB3, LAMC1, and value. 도 2d는 100 ㎕ PE/㎠ 상에 80,000개의 세포/㎠인 밀도로 시딩된 HUVEC에서 3일 동안 수행된 유전자 분석을 도시한 것이다. Figure 2d shows the genetic analysis performed during the seeded in a 80,000 cell / ㎠ density on 100 ㎕ PE / ㎠ HUVEC 3 days. VEGFA를 비롯한, 용해물에 존재하지 않는 일부 혈관신생 관련 단백질은 hPE 상에 시딩되었을 때에는 HUVEC에 의해 상향 조절되었다. Some angiogenic-related proteins, including the VEGFA, that does not exist in the melt is the time when seeded onto hPE was adjusted upward by HUVEC. 데이터는 4회의 생물학적 반복 실험을 대표한다. Data are representative of the four biological replicates. P 값은 대조군과 처리군에서 각 유전자에 대해 반복 실험된 2^(-델타 Ct) 값의 스튜던트 t 검정을 이용하여 계산된 값이다. Is a value calculated by using the Student's t-test value - P value is repeated the experiment 2 ^ for each gene in the control group and the treatment group (delta Ct).
도 3a-3d는 는 hPE와 마트리겔 코팅된 조직 배양 플라스크 상에 형성된 시험관내 혈관신생 네트워크를 도시한 것이다. Figure 3a-3d is depicts the in vitro angiogenesis network formed on hPE and Matrigel-coated tissue culture flasks. 도 3a는 1d, 3d, 및 5d 후의 다양한 세포 시딩 밀도에서 hPE 및 마트리겔 상의 칼세인 염색된 HUVECS를 도시한 것이다. Figure 3a shows a 1d, 3d, and a variety of cell and Matrigel hPE knife-old dyed HUVECS on in seeding density after 5d. 1 ㎟당 세관 개수가 최대가 될 때까지의 소유 시간으로서 정의되는, 혈관신생 네트워크의 성숙 속도는 세포 시딩 밀도를 변화시킴으로써 hPE 샘플에서 조절하였다. , Maturation rate of angiogenesis network is defined as a reserved time until the customs number per 1 ㎟ be up was adjusted at hPE sample by changing the cell seeding density. 정량적 분석 결과, 40,000개의 세포/㎠일 때, 혈관신생 네트워크가 그의 최대 세관 밀도(세관/㎟)에 도달하는 데에는 3일째까지 소요되었지만, 80,000개의 세포/㎠일 때, 네트워크는 1일 경과 후 그의 최대 세관 밀도에 도달한 것으로 나타났다(데이터를 나타내지 않음). Quantitative analysis, when 40,000 cells / ㎠, when angiogenesis network, but it takes up to three days There reaching its maximum customs density (customs / ㎟), 80,000 cells / ㎠, the network is then passed 1 day his It appeared to have reached the maximum density customs (not shown data). 마트리겔 샘플에서, 혈관신생의 네트워크는 1일째 이후에 윤곽이 뚜렷하지 않았다. In the Matrigel samples of angiogenesis network it did not outline clear after the first day. 스케일 막대, 200 ㎛. Scale bar, 200 ㎛. 도 3b는 WPMY-1 근섬유모세포는 태반 추출물 상에 시딩되었을 때에는 혈관신생 형성을 보이지 않았지만(도 3b. i), 마트리겔 상에 시딩되었을 때에는 혈관신생 형성을 보였다(도 3b. ii)는 것을 도시한 것이다. Figure 3b WPMY-1 muscle fiber cells are the time when seeded on placenta extracts but not angiogenesis formed (Fig. 3b. I), the time was seeded on Matrigel showed angiogenesis formed (Fig. 3b. Ii) shows that one will. 도 3c는 평균 세관 길이(mm), 세관 밀도, 분기점 개수, 메쉬 개수, 및 세관 너비를 비롯한, 혈관신생 네트워크 파라미터를 측정하는 정량적 영상 분석(마스킹)을 도시한 것이다. Figure 3c shows the average customs length (mm), customs density, the number of branch point, quantitative image analysis (masked) to a mesh including the number, width and customs, measuring angiogenesis network parameters. 도 3c는 hPE 및 마트리겔® 유도성 혈관생성 네트워크 파라미터의 비교를 보여주는 막대 그래프 시리즈로서, 이는 80,000개의 세포/㎠로 시딩된 샘플에서는 마트리겔 샘플이 1일째까지는 그의 최대 평균 세관 길이, 세관 밀도, 분기점, 및 메쉬 개수에 도달하였고, 3일째까지는 아폽토시스성 볼 형성이 이루어진 반면, hPM 네트워크 파라미터는 5일간의 배양 동안에 걸쳐 더욱 안정적이라는 것을 보여주는 것이다. Figure 3c hPE and Matrigel ® induced angiogenesis as a histogram series shows a comparison of network parameters, which the samples are seeded with 80,000 cells / ㎠ Matrigel sample until the first day of its maximum average customs length, customs density, reached a branch point, and the mesh number,, hPM network parameters while until day 3 consisting of a ball forming property apoptosis is to show that the more stable over a period of five days of culture.
도 4a-4c는 hPE 기반 혈관신생 스크리닝 검정법을 이용한 항-항혈관신생 종양 억제 단백질 트롬보스폰딘 1의 스크리닝을 도시한 것이다. Figure 4a-4c wherein is used a screening hPE based angiogenesis assay - wherein the blood vessel shows the screening of thrombospondin 1 new tumor suppressor protein. 도 4a는 배양 배지에의 TSP-1의 첨가가 이루어진 후, 칼세인 AM을 이용하여 염색된 hPE, 마트리겔, 및 대조군 배양 플라스크(코팅되지 않음) 상에 1일 동안 시딩된 HUVEC를 도시한 것이다. Figure 4a shows a after the addition of TSP-1 in the culture media comprising, seeding the HUVEC for one day on a dyed using a knife-old AM hPE, matrigel, and the control culture flasks (not coated) . 스케일 막대, 200 ㎛. Scale bar, 200 ㎛. 도 4b의 그래프는 hPE 코팅된 플라스크에서, 평균 총 세관 길이[mm] 및 평균 분기점 개수, 둘 모두 TSP-1 농도가 증가함에 따라 선형으로 감소하였다는 것을 보여주는 것이다. The graph of Figure 4b is to show that the decreased linearly as in the flask hPE coating, the average total customs length [mm], and an average number of branch point, both TSP-1 concentration. 도 4c의 그래프는 정규화된 혈관신생 네트워크 도달 면적 감소율(%) 비교를 도시한 것이다; The graph of FIG. 4c shows a normalized new blood vessels compared to network coverage area reduction ratio (%); hPE 코팅된 배양 플레이트는 마트리겔 코팅된 배양 플레이트보다 TSP-1 농도에 대한 감수성이 유의적으로 더 높았으며, 여기서, R 2 값은 각각 0.97 및 0.36이었다. hPE coated culture plate was higher significant sensitivity to TSP-1 concentration than the Matrigel-coated culture plates ever, where, R 2 values are respectively 0.97 and 0.36.
도 5a-5c는 3D 조직 구조물 상에서의 시험관내 혈관신생을 도시한 것이다. Figure 5a-5c illustrate the in vitro angiogenesis on the 3D tissue structures. 도 5a는 시딩하고, 3일 동안 배양한 후 hPE 침지된 (인간 제정맥) 바이오스캐폴드에서 시험관내 혈관신생을 유도하는 태반 유래 세포, 스캐폴드, 및 사이토카인을 도시한 개략적인 도면이다. Figure 5a is a seeded, and 3 days after the immersion hPE (human claim vein) BIOS cache schematic diagram illustrating the in vitro placenta-derived cells, scaffolds, and cytokines that induce angiogenesis at the fold incubated. 도 5b는 hPE에 침지시키지 않은 HUVEC 시딩된 조직 스캐폴드가 혈관신생 네트워크를 형성하지 못하였다는 것을 도시한 것이다. Figure 5b shows that the not immersed in a non hPE HUVEC seeded tissue scaffold was not form a network angiogenesis. 도 5c는 배양 3일 후 혈관신생의 발아 및 장 중첩적 기전, 둘 모두가 일어난 것을 도시한, hPE 침지된 바이오스캐폴드의 대표적인 영상 시리즈를 이미지를 보여주는 것이다. Figure 5c is showing an exemplary series of images of the BIOS cache fold immersion illustrated, hPE that both culture 3 days after germination and field of angiogenesis mechanisms superposed manner, both the image takes place. 20,000개의 세포/㎠의 HUVEC 세포 시딩 밀도에서, 발아 혈관신생이 가장 우세하였다(도 5c.i.-5c.ii). HUVEC cells are seeded in a density of 20,000 cells / ㎠, sprouting new blood vessels was the most predominant (Fig 5c.i.-5c.ii). 40,000개의 세포/㎠의 시딩 밀도에서, 발아 및 장 중첩적 혈관신생, 둘 모두가 발생한 것이 관찰된 반면(도 5c.iii.-5c.iv.), 60,000개의 세포/㎠의 밀도에서(도 혈관신생 세관은 장 중첩을 통해 형성되었다. In the 40,000 cells / ㎠ seeding density, it is both germination and field superposed manner angiogenesis, two occurring while observing (Fig 5c.iii.-5c.iv.), (Figure 5c at a density of 60,000 cells / ㎠ angiogenesis customs was formed through the overlapping section.
도 6a-6b는 hPE 인큐베이션된 바이오스캐폴드에서의 생체내 혈관신생의 실례를 나타낸 것이다. Figure 6a-6b illustrate an example of the in vivo angiogenesis in hPE incubated BIOS cache fold. 도 6a는 근막과 근육 층 사이로의 래트 모델로의 이식 전 2 hr 동안 PE, 마트리겔, 또는 포스페이트 완충처리된 염수(대조군)에서 인큐베이션된, 세포가 제거된 HUV 스캐폴드를 도시한 개략적 도면이다. Figure 6a is a schematic view showing the HUV scaffold with an incubation at transplantation before 2 hr for PE, Matrigel, or phosphate buffered treatment saline (control) in a rat model of between fascia and muscle layers, the cells are removed. 도 6b는 이식 후 5 일(d)째 분석을 위해 제거된 스캐폴드를 도시한 영상 시리즈를 보여주는 것이다. Figure 6b is showing a series of images showing the scaffold in order to remove the second analysis 5 days (d) after implantation. hPE 인큐베이션된 스캐폴드와 비교하였을 때, 대조군 및 마트리겔 인큐베이션된 바이오스캐폴드에서 유의적으로 더 많은 섬유화 캡슐 형성이 이루어졌다(도 6b.i.-6b.iii.). hPE when compared to the incubation scaffold, a significantly more fibrous capsule formation in the BIOS cache control and folding back the matrigel incubation was conducted (Fig. 6b.i.-6b.iii.). 반투명한 바이오스캐폴드 시트의 전두면을 통해 포착된 명시야 영상은 대조군과 비교하였을 때, 마트리겔 및 hPE 인큐베이션된 스캐폴드(도에서 유의적으로 개선된 모세혈관 네트워크 형성이 이루어졌고, hPE 스캐폴드에서 가장 성숙한 모세혈관상이 나타났으며, 이는 세동맥에서 모세혈관, 이어서, 세정맥으로의 혈류가 연결된 혈관 구조의 형성을 보여주는 것이다(도파선형 동그라미로 표시)). The semitransparent BIOS cache the bright-field image captured through the entire sheet will leave the fold as compared to a control, matrigel and incubated hPE scaffold improved significantly (Figure Moses the vascular network formation was done, hPE was born the most mature capillary blood vessel displayed on the scaffold, which is showing the formation of vascular structures in the blood flow to the capillaries, then, is connected in arterioles venules (Fig (linear wave represented by the circle)). 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과, 대조군 및 마트리겔 스캐폴드와 비교하였을 때, hPE 인큐베이션된 스캐폴드(도에서 스캐폴드 리모델링이 가장 많이 이루어진 것으로 나타났다. Hematoxylin and eosin staining showed that consisting, hPE incubating the scaffold (FIG. Most remodeling in the scaffold when compared to the control group and the Matrigel scaffold. 대조군 스캐폴드(도에서는 그의 원래의 섬유 방향의 리모델링이 거의 일어나지 않았고, 또한 HUV의 바이오폴드 내강 밖 표면으로부터 스캐폴드로의 세포 이동이 가장 적게 일어났다(이탤릭체 ' l '로 표시). The control scaffold (Figure did not take place in substantially the renovation of his original fiber orientation, and movement of cells into the scaffold from the bio-fold lumen outside surface of the HUV occurred the least (italics shown as 'l') . 마트리겔 인큐베이션된 스캐폴드에서는 hPE 스캐폴드와 비교하였을 때, HUV의 내강 밖 표면으로부터의 세포 이동이 약간 더 적게 일어났다(도 6b.vii.-6b.ix.); In Matrigel incubated scaffold when compared to the hPE scaffold, the cells move from the lumen out of the surface of the HUV slightly occurred less (Fig 6b.vii.-6b.ix.); 대조군과 비교할 때, 마트리겔 인큐베이션된 스캐폴드에서는 또한 새로운 콜라겐 섬유 방향과 더욱 균일한 세포 분포를 보인 hPE 인큐베이션된 스캐폴드보다 세포 분포가 덜 균일하고, 스캐폴드 리모델링은 더 적었다. Compared to the control, matrigel in the incubation scaffold In addition, a new collagen fiber orientation and further showing a uniform distribution of cells than cells incubated hPE scaffold distribution less homogeneous, and the scaffold remodeling is more low.
도 7a-7e는 동적 세포 배양 조건을 이용하여 배양된 인간 제정맥 스캐폴드(HUV: human umbilical vein)에서의 혈관신생 네트워크 형성에 대한 실시양태를 도시한 것이다. Figure 7a-7e are dynamic cells cultured using the culture conditions, the human vein scaffold: shows an embodiment for the formation of a neovascular network from (HUV human umbilical vein). 도 7a 및 7b의 개략적 도면에 도시된 바와 같이, 관상 HUV 스캐폴드를 세포 시딩 전 2시간 동안 태반 추출물 중에서 인큐베이션시키고, 구조물을 표준 세포 배양 조건하에 이중관류 생물반응기에서 5일 동안 배양하였다. As illustrated in the schematic diagram of Figure 7a and 7b, tubular HUV scanner and the folding cells incubated in placenta extract for 2 hours before seeding, the cells were cultured in a dual-structure perfusion bioreactor under standard cell culture conditions for five days. 세포는 스캐폴드 내강에 그대로 남아있었고, 이동은 없었다(도 7c). Cells remained as a scaffold lumen, there was no movement (Fig. 7c). 세관형성의 초기 단계인 세포 코딩은 산발적이었다(도 7d 및 7e). The initial phase of the cell coding for customs formed was scattered (Fig. 7d and 7e).
도 8은 PE 상에서의 성장을 보이는 관 및 세포 네트워크에 관한 원 크기의 영상(좌측) 및 상기 영역의 줌 영상(우측)을 도시한 것이다. Figure 8 illustrates an image (left) and a zoom image (right) of the area of ​​the original size of the growth of the tube, and a visible cell network on PE. 줌 확대 영상은 각 세관(점선)을 어떻게 확인하고, 측정하였는지를 보여주는 것이다. Zoom-up image is to show how to identify each customs (dotted line), and whether measured. 우측 영상에서 동그라미 표시는 분기점을 나타내는 것으로, 이는 화살표로 나타낸 영상 상의 넘버링된 점으로 확인된다. Circle at right images is to indicate the branch point, which is identified as numbered points on the image shown by the arrow. 세관의 각 육각형 배열에 의해 메쉬(점선형 동그라미)가 확인된다. By each of the hexagonal array of Customs it is confirmed mesh (point linear circle).
도 9a-b는 PE의 혈관신생 잠재성을 도시한 영상 시리즈(도 9a) 및 막대 그래프(도 9b)이다. Figure 9a-b is a series of images (Fig. 9a) and a bar graph (Fig. 9b) shows the angiogenic potential of PE. 도 9a의 패널은 조직 배양 플레이트 상에 시딩된 HUVEC와의 비교로 나타낸, PE 상에 시딩되고, 1, 3, 및 5일 동안 배양된 HUVEC에 의해 형성된 미세혈관 세관의 세포 형태를 보여주는 것이다. Figure 9a of the panel is shown in comparison with the HUVEC seeded onto tissue culture plates, are seeded onto PE, to show the micro-cell type of the blood vessel formed by the customs HUVEC incubated for 1, 3 and 5 days. 모세혈관 네트워크는 1일째 형성되기 시작하였고, 3일째 더욱 성숙한 형태에 도달하였다(우측 하단의 확대 영상 참조). Capillary networks was started to form the first day, the third day and reached a more mature form (see the enlarged image on the lower right). 5일째, 네트워크는 퇴행하였다: 메쉬 개수가 감소하였고, 일부 단리 세포(흰색 점 표시)가 존재하였다. Day 5, data was regressed: decreased mesh number, and there are some isolated cells (display white point). 도 9b의 그래프는 배양의 1, 3, 및 5일 이후 PE 상에 형성된 세관 유사 네트워크의 형태학적 및 국소 해부학적 특징을 보여주는 것이다. The graph of Fig. 9b is to show the topographical and morphological characteristics similar to the network formed on the customs after 1, 3, and 5 days of culture PE. 1, 3 및 5일째 사이의 세관 길이, BP 개수 및 메쉬 개수를 비교하였다. 1, we compared the customs length, BP number and mesh count of between 3 and 5 days. 1일째 세포와 5일째 세포 사이에 3가지 파라미터 모두에서 통계학적인 차이(별표로 표시)가 있는 것으로 나타났다. In all three parameters between day 1 and day 5 cell cells showed that (indicated by an asterisk) statistically significant difference. p<0.05로 이분산과 함께 이중 양측 t 검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행되었다. p <0.05 using the black double t both sides with a dispersion was carried out for statistical analysis.
도 10a-9b는 조직 배양 플레이트 상에 시딩된 HUVEC(대조군)와의 비교로 나타낸, PE 상에 시딩되고, 5일 동안 배양된 HUVEC에 의해 형성된 미세혈관 네트워크의 세포 형태를 도시한 것이다. Figure 10a-9b is indicated by the comparison with the HUVEC (control) seeded onto tissue culture plates, are seeded onto PE, it illustrates the cell types of the microvascular network formed by the HUVEC culture for 5 days. 대조군은 도 10a의 영상 우측 상단 코너에 삽도 영상으로 제시되어 있으며; The control group and are presented in the video image sapdo the upper right corner of Figure 10a; 좌측 상단에서부터 1일째에 PE 단 1회 접종, 1일 및 3일째 2회 접종, 및 1, 3, 및 4일째 3회 접종. Day 1 PE only once from the upper left corner of inoculation, 1 day and 3 days after 2 doses, and 1, 3, and 4 days after 3 doses. (1회에서부터 3회까지) 접종 횟수가 증가함에 따라 모세혈관 네트워크는 더욱 성숙하고, 장기간 지속된 형태로 진화하였다는 것을 관찰할 수 있다. As (from the 1st to the 3rd) inoculation number of times the increase can be observed that the capillary network was more mature and evolve into a long-lasting form. 1일째와 5일째 사이의 세관 길이, BP 개수 및 메쉬 개수 비교는 도 10b의 히스토그램에서 이루어져 있다. Customs length, BP number and mesh count between day 1 and day 5 comparison is made in the histogram of Figure 10b. 1회 접종을 받은 세포(1회 접종)와 3회 접종을 받은 세포(3회 접종) 사이에 3가지 파라미터 모두에서 통계학적인 차이(별표로 표시)가 있는 것으로 나타났다. One was found with the cell (single inoculation) received the vaccination and three times (indicated by an asterisk) significant difference in all three parameters between cells receiving the vaccination (3 doses). p<0.05로 이분산과 함께 이중 양측 t 검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행되었다. p <0.05 using the black double t both sides with a dispersion was carried out for statistical analysis.
도 11은 PE와 함께 3일 동안 배양된 HUVEC를 1일부터 최대 20일까지 37℃ 습윤화된 CO 2 인큐베이터에서 보관하였을 때를 도시한 영상 시리즈를 보여주는 것이다. Figure 11 shows a series of images showing the when stored at 37 ℃ the wetting CO 2 incubator and the cultured HUVEC from 1 for 3 days up to 20 days with PE. 각 영상에서 숫자는 인큐베이션 기간(일수)을 나타낸다. Number in each image indicates the incubation period (days). PE는 심지어 15일간의 인큐베이션 이후에도 혈관신생을 유도할 수 있는 그의 능력을 유지하였다. PE even after 15 days of incubation and maintained his ability to induce angiogenesis.
도 12a-12b는 젤라틴 미세입자의 특징을 도시한 것이다. Figure 12a-12b illustrate a feature of gelatin microparticles. 도 12a에서, 윗줄은 크기가 대략 40 ㎛인 블랭크 입자의의 SEM 영상을 보여주는 것이다. In Figure 12a, the top row has a size to show the SEM images of the particles of the blank about 40 ㎛. 이는 규칙적인 형상 및 매끈한 표면을 가진다. It has a regular shape and a smooth surface. 도 12a의 아랫줄은 PE가 적재된 입자의 SEM 영상을 보여주는 것이다. The lower line in Figure 12a is showing the SEM image of the PE is loaded particles. 표면 형태 변화, 및 크기 증가는 PE 수착에 기인하는 것일 수 있다. Surface morphology, and size increase may be due to the PE sorption. 도 12b의 그래프는 광학 현미경 검사법에 의한 젤라틴 미세입자의 크기 분포 분석을 보여주는 것이다. The graph of Fig. 12b is to show the size distribution analysis of the gelatinous microscopic particles by optical microscopy.
도 13은 비가교결합된 미세입자의 분해 프로파일을 보여주는 것이다. 13 is showing the dissolution profile of microparticles of the non-crosslinked binding. 시험관내 비가교결합된 미세입자의 누적 분해율(%)이 상기 미세입자의 건식 중량의 함수로서 제시되어 있다. It may accumulate degradation rate (%) of fine particles in vitro non-crosslinked binding is presented as a function of the dry weight of the microparticles. 20일 후 전체 누적 분해율(%)은 18.65%±0.09였다. Total cumulative decomposition rate (%) was 18.65% ± 0.09 after 20 days. 삽도 그래프는 6시간 인큐베이션 이후의 분해를 보여주는 것이다(6.45%±0.12). Sapdo graph is to show the decomposition of incubation after 6 hours (6.45% ± 0.12). 오차 막대는 평균±표준 편차(n=3)를 나타낸다. Error bars represent the mean ± SD (n = 3).
도 14a-14b는 블랭크 미세입자 및 적재된 미세입자의 단백질 방출 동역학적 성질을 도시한 것이다. Figure 14a-14b illustrates a protein release dynamics properties of the blank, the fine particles and the loaded microparticles. 도 14a는 시험관내 블랭크 미세입자(PE 없음) 및 적재된 (PE) 미세입자로부터의 누적 방출율(%)을 각각 상기 입자의 건식 중량 및 적재된 중량의 함수로서 도시한 것이다. Figure 14a shows the cumulative release rate (%) from the in vitro blank microparticles (no PE) and loaded (PE) fine particles as each of the dry weight and function of the loaded weight of the particles. 22일 후 전체 누적 방출률(%)은 각각 4.65%±0.11 및 4.65%±0.07이었다. 22 days total cumulative release rate (%) after each was 4.65% ± 0.11 and 4.65% ± 0.07. 오차 막대는 평균±표준 편차(n=3)를 나타낸다. Error bars represent the mean ± SD (n = 3). 도 14b는 적재된 미세입자와 블랭크 미세입자 사이의 시험관내 방출 차이(%)를 도시한 것이다. Figure 14b shows the in vitro release differences (%) between the loaded microparticles and the blank microparticles. 첫번째 피크는 입자 표면으로부터의 PE 방출을 나타내는 것인 반면, 두번째 피크는 벌크 부식에 기인하는 것일 수 있다. The first peak, on the other hand would represent the PE emitted from the particle surface, and the second peak may be due to bulk erosion.
도 15는 젤라틴 미세입자를 이용한 PE 전달을 도시한 것이다. Figure 15 shows the PE transfer using gelatin microparticles. 영상은 블랭크 미세입자가 시딩된 HUVEC(대조군)와 비교하였을 때, 배양 5일 후(D5)의, 20,000개의 세포/㎠인 밀도로 시딩된 HUVEC의 PE가 적재된 미세입자에 대한 반응을 보여주는 것이다. Image is to display the response to the compared with HUVEC (control) which the blank fine particle seeding, the culture 5 days (D5), of the HUVEC seeded with 20,000 cells / ㎠ density PE loaded microparticles . 화살표는 상이한 상태의 세포를 나타내는 것으로: 이는 형상 차이를 도시한 것이다. The arrow indicates the status of the different cells: This shows a difference in shape. PE가 적재된 입자와의 배양 5일 후, 일부 발아가 존재하였지만, 네트워크 형성은 관찰되지 않았다. After 5 days of culture and the PE is loaded particle, but some germination present, network formation was not observed. 더 큰 구체가 미세입자이다. The larger the specific microparticles.
도 16a-16g는 hPE의 연속 전달이 HUVEC에 미치는 효과를 도시한 것이다. Figure 16a-16g illustrate the effect of continuous delivery of hPE on the HUVEC. 도 16a는 HUVEC가 혈관신생 배지 중에서 20,000개의 세포/㎠로 배양된 대조군을 도시한 것이고; Figure 16a is a HUVEC depicts a control culture to 20,000 cells / ㎠ in angiogenesis medium; 도 16b-16d는 각각 1일째 hPM의 단일 접종이 이루어진 HUVEC(도 16b), 1 및 3일째 2회에 걸쳐 접종이 이루어진 HUVEC(도 16c), 및 1, 3, 및 5일째 3회에 걸쳐 접종이 이루어진 HUVEC(도 16d)를 도시한 것이다. Figure 16b-16d are inoculated over a period of 1 day hPM single inoculation is made of HUVEC (Fig. 16b), first and third day 2 doses is made HUVEC (Fig. 16c) across a, and 1, 3, and 5 days three times each illustrates a is made HUVEC (Fig. 16d). 도 16e-16g는 염색 후에 도 16b-16d의 영상에 대하여 수행된 혈관신생 정량화를 나타낸 막대 그래프이다. FIG. 16e-16g is a bar graph showing the angiogenesis-quantification performed on the image after dyeing FIG 16b-16d. 결과는 각 조건에 대한 3중 샘플의 측정값 사이의 평균값±평균 표준 오차로서 제시되어 있다. The results are shown as mean ± standard mean error between three measurements of samples for each condition.
도 17a-17f는 미세입자 평가를 도시한 것이다. Figure 17a-17f illustrates a fine particle assessment. 도 17a-17c는 평가된 3가지 프로토콜: 단일(2 min) 균질화(도 17a), 이중(2 min/1 min) 균질화(도 17b), 및 이중(2 min/20 sec) 균질화(도 17c)에 대한 광학 현미경 영상을 도시한 것이다. Figure 17a-17c are evaluated three protocols: Single (2 min) homogenizer (Fig. 17a), the double (2 min / 1 min) homogenizer (Fig. 17b), and the double (2 min / 20 sec) homogenizer (Fig. 17c) It shows an optical microscope image of the. 도 17d-17f의 히스토그램은 각각의 3가지 프로토콜에서 각각 형성된 입자에 대한 크기(㎛) 분포를 도시한 것이다(각 배치는 3중으로 제조된 것이다). The histogram of FIG. 17d-17f are (is each batch prepared in triplicate), size (㎛) shows the distribution for each particle is formed in each of the three protocols.
도 18a-18f는 3가지 프로토콜: 단일(도 18a, 18d), 2/1 이중(도 18b, 18e), 및 2/20 이중(도 18c, 18d), 각각의 hPM이 적재된 PLGA 미세입자의 시차 주사 현미경(SEM: scanning electronic microscope) 영상이다. Figure 18a-18f are the three protocols: single (Fig. 18a, 18d), 2/1 double (Fig. 18b, 18e), 2/20 and double (Fig. 18c, 18d), each of the PLGA fine particles are loaded hPM differential scanning microscopy: a (SEM scanning electronic microscope) image. 도 18a-18c는 미세입자 형상을 도시한 것이고, 도 18d-18f는 표면 다공성을 도시한 것이다. Figure 18a-18c will showing the fine particle-like, FIG. 18d-18f shows a porous surface.
도 19a 및 19f는 각 프로토콜(P2: 단일, P3: 2/1 이중, 및 P4 2/20 이중)에 대한 적재율 표(도 19a) 및 입자로부터의 방출 속도 평가에 관한 그래프(도 19b)를 제공하는 것이다. Figure 19a and 19f are each protocol provides a deposition rate graph table (Fig. 19b) on (FIG. 19a) and the release rate from the particles for the evaluation of (P2: double 2/1, 2/20 and P4 double: single, P3) to. 곡선은 각 프로토콜에 대한 최대 21일째까지의 누적 방출 속도를 나타낸다. Curves represent the cumulative release rate for up to 21 days for each protocol.
도 20은 미세입자의 상청액의 SDS 페이지 분석을 도시한 것이다. Figure 20 shows the SDS page analysis of the microparticles the supernatant. 영상은 BSA가 적재된 및 hPM이 적재된 미세입자 상청액 중의 정질 단백질 함량 및 미세입자 제조 동안 적재된 상대적인 초기 함량을 보여주는 염색 이후의 겔 영상이다. Image is a picture of the gel after staining showing the amorphous protein content, and the relative initial content of the fine particles produced during the loading of the microparticles the supernatant of the BSA is loaded and loaded hPM.
도 21은 순수한 hPM을 알기네이트 매트릭스에 첨가하였을 때(맨 윗줄) 대 매트릭스에 포매된 PLGA 미세입자로부터의 hPM의 지속적인 방출이 이루어질 때의, 혈관신생 네트워크 안정성 차이를 평가하기 위해 7, 14, 21, 및 28일 배양 후 칼세인 AM으로 염색된 내피 세포를 도시한 영상 시리즈이다. 21 is the addition to know the pure hPM carbonate matrix (top row) versus when sustained release of the hPM from the PLGA fine particles embedded in a matrix made, 7 in order to evaluate the difference between angiogenic network stability, 14, 21 , and it is a series of images showing the endothelial cells stained with knife-old AM after 28 days incubation. 맨 아랫줄은, 하나는 알기네이트 매트릭스에 블랭크 PLGA 미세입자가 포매되어 있는 것이고, 두번째 것은 미세입자가 없는 것인, 2개의 대조군을 나타낸 것이다. Bottom line is: one that is embedded know blank PLGA microparticles in carbonate matrix, the second one shows the two control group will not have fine particles. HUVEC는 두 대조군 모두에 대하여 전 시점 모두에서 일반적으로 고리형 형상을 그대로 유지하였다. HUVEC was generally maintained as an annular shape on both the former time with respect to both the control group.

설명 Explanation

본 개시내용을 더욱 상세하게 기술하기 이전에, 본 개시내용은 기술되는 특정 실시양태로 한정되는 것이 아니며, 따라서, 이는 물론 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. Prior to describing in detail the present disclosure, this disclosure is not limited to the particular embodiment described, therefore, it should be understood that there may of course vary. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니라는 것 또한 이해하여야 한다. As used herein, the term is merely for describing the specific embodiments, it is not intended to limit it should also be understood.

값을 범위로 제공하는 경우, 상기 범위의 상한과 하한 사이에 있는 각 중간 값, 문맥상 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 하한 단위의 1/10까지, 및 상기 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 중간 값은 본 개시내용 범위에 포함된다. When providing a value within a range, to the tenth of the lower limit unless otherwise unit to each of the intermediate value, the context otherwise clearly between the upper and lower limits of the range, and any other stated in the above-mentioned range or intermediate values ​​are within the scope of this disclosure. 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로, 언급된 범위 내에서 구체적으로 배제된 임의의 한계에 따라 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 이 또한 본 개시내용 범위에 포함된다. Upper and lower limits of the range, the smaller can be included in the smaller ranges in accordance with any limitation of the specifically excluded within the Independently, stated range, it is also included in the scope of this disclosure. 언급된 범위가 한쪽 한계 또는 양쪽 한계 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 한쪽 또는 양쪽 모두를 제외한 범위 또한 본 개시내용 범위에 포함된다. When the stated range includes both limit one or both limits, except for one or both of the included limits it is also included in the scope of this disclosure. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 숙련가가 보편적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 가진다. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as those that are skilled in the art to which the present disclosure universally understood. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 이제 기술한다. Although a similar or of any methods and materials equivalent to those disclosed herein also may be used in the practice or testing of this disclosure, now describe the preferred methods and materials.

참조로 포함된, 본 명세서에서 인용되는 임의의 공개 문헌 및 특허는 인용된 공개 문헌과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고, 기술하기 위해 본원에서 참조로 포함된다. Referenced, any publications and patents cited herein are incorporated by is incorporated by reference herein to disclose a method and / or material associated with the quoted publications, and technical. 임의의 공개 문헌을 인용하는 것은 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대한 것이며, 이러한 인용이, 본 개시내용은 선행 개시내용에 의해 상기 공개 문헌을 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. To quote any of the publications will for his disclosure prior to the filing date, these people, this disclosure should not be construed as an admission that there is no qualified prior to the publication by the start of the preceding information. 추가로, 제공된 공개일은 실제 공개일과 상이할 수 있으며, 이는 독립적으로 확인이 필요할 수 있다. In addition, the public may be different from what the public actually work provided, it may be necessary to verify independently.

본 개시내용을 읽을 때, 당업자에게는 자명한 바와 같이, 본원에 기술되고, 예시된 각각의 개별 실시양태들은 본 개시내용의 범주 또는 정신으로부터 벗어남 없이 수개의 다른 실시양태 중 임의의 것의 특징으로부터 쉽게 분리될 수 있거나, 또는 그와 함께 조합될 수 있는 개별 성분 및 특징을 가진다. When reading the present disclosure, as apparent to those skilled in the art, and described herein, the individual embodiments of the example, respectively are readily separated from the features of any of several different embodiments without departing from the scope or spirit of the disclosure It may be, or have the individual components and features which may be combined therewith. 언급된 임의의 방법은 언급된 사건 순서대로, 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서대로 수행될 수 있다. Any of the methods described can be performed in any other order as possible, or logical sequence of events as stated.

본 개시내용의 실시양태는 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 의학, 생화학, 분자 생물학, 생물학, 약리학 기술 등을 이용할 것이다. Embodiments of the present disclosure will use the medicine, biochemistry, molecular biology, biology, pharmacology techniques such as in the skill in the art unless otherwise specified. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. This technique is described in detail in the literature.

명세서 및 첨부된 실시양태에서 사용되는 바, 단수 형태인 "한"("a," "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의하여야 한다. As used in the embodiments of the specification and drawings, it is called the singular form of "a" ( "a," "an"), and "the" as that which includes a plurality of referents unless stated explicitly otherwise contextually care should be taken. 따라서, 예를 들어, "한 세포"라고 언급한 것은 복수 개의 세포를 포함한다. Thus, for example, it includes a plurality of cells referred to as "cells." 하기의 본 명세서 및 실시양태에서 언급되는 많은 용어들은 다른 의도가 명백하지 않는 한, 하기 의미를 가지는 것으로 정의되어야 한다. To a number of terms referred to herein, and embodiments are to be defined as having a one, it means that do not clear an idea.

다양한 실시양태를 기술하기 전에, 하기 정의를 제공하며, 이는 달리 명시되지 않는 한, 사용되어야 한다. , To provide the defined before describing the various embodiments, which should be used which, unless stated otherwise.

정의 Justice

개시된 주제를 기술함에 있어서, 하기 용어는 하기에 기술되는 정의에 따라서 사용될 것이다. In the technology disclosed the subject, the following terms will be used in accordance with the definitions described below.

본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 펩티드 결합을 통해 연결된 연속 어레이 형태의 3개 이상의 아미노산으로 이루어진 아미노산 중합체를 의미한다. As used herein, the term "polypeptide" and "protein" refers to amino acid polymers consisting of three or more consecutive amino acids of the array pattern is connected via a peptide bond. "폴리펩티드"라는 용어는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩티드 등을 포함한다. The term "polypeptide" includes proteins, protein fragments, protein analogues, oligopeptides and the like. "폴리펩티드"라는 용어는 핵산에 의해 코딩되고, 재조합 기술을 통해 제조되거나 (예컨대, 조류와 같은 적합한 공급원으로부터 단리되거나), 또는 합성된 상기에 정의된 폴리펩티드를 고려한다. The term "polypeptide" is coded by a nucleic acid, or to prepare (e. G., Isolated from a suitable source, such as a bird or), or taking into account the polypeptide defined in the synthesized via recombinant techniques. "폴리펩티드"라는 용어는 또한 화학적으로 변형된 아미노산 또는 표지 리간드에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 아미노산을 포함하는 상기에 정의된 폴리펩티드를 추가로 고려한다. The term "polypeptide" is also considered to add the polypeptide as defined above comprising the amino acid linked covalently or non-covalently to an amino acid or the labeled ligand is chemically modified.

"폴리뉴클레오티드," "올리고뉴클레오티드," 및 "핵산 서열"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 코딩 서열(적합한 조절 또는 제어 서열의 제어하에 배치되어 있을 때, 시험관내 또는 생체내에서 전사 및 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드(들) 또는 핵산 서열(들)); "Polynucleotide," "oligonucleotide," and "nucleic acid sequence" as used herein, when used interchangeably herein, which have been placed under the control of the coding sequence (suitable for the control or control sequences, transcription in vitro or in vivo and (s) a polynucleotide which is translated into a polypeptide or nucleic acid sequence (s)); 제어 서열(예컨대, 번역 시작 및 정지 코돈, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 인자 결합 부위, 전사 종료 서열, 상류 및 하류 조절 도메인, 인핸서, 사일런서 등); Control sequences (e. G., Translation start and stop codons, promoter sequences, ribosome binding sites, polyadenylation signals, transcription factor binding sites, transcription termination sequences, upstream and downstream regulatory domain, enhancers, silencers, etc.); 및 조절 서열(전사 인자(들)이 그에 결합하고, 유전자의 프로모터 활성을 양성적으로 (유도) 또는 음성적으로 (억제) 변경하는 DNA 서열)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. And regulatory sequences including, (a transcription factor (s) are bonded thereto, and, DNA sequences to change the promoter activity of the gene as positively to (Induction) or negative (inhibitory)), and the like. 길이 또는 합성 기원에 대한 어떤 제한도 본원에서 기술된 용어에 의해 제안되지 않는다. Length or any restriction on the origin of synthesis is also not suggested by the terms described herein.

본원에서 사용되는 바, "유전자" 또는 "유전자들"이라는 용어는 전체 RNA, 전체 단백질, 또는 상기 전체 RNA 또는 전체 단백질의 임의 부분을 합성하기 위한 유전 정보를 코딩하는 핵산 서열(RNA 또는 DNA, 둘 모두 포함)을 의미한다. As used herein, the term "gene" or "genes" is total RNA, total proteins, or the total RNA or total any portion genetic code the nucleic acid sequences (RNA or DNA encoding for the synthesis of the protein, both both means included). "유전자"는 전형적으로 염색체상 특정 위치를 차지하고, 유기체 내에서 특징(들) 또는 형질(들)에 대한 유전적 지시를 포함하는 DNA 서열에 상응하는 유전적인 단위를 의미한다. "Gene" is typically accounts for a particular chromosomal location, means a genetic unit that corresponds to the DNA sequence containing the genetic instructions for the feature (s) or trait (s) in the organism. "유전자 생성물"이라는 용어는 유전자에 의해 코딩되는 RNA 또는 단백질을 의미한다. The term "gene product" refers to the RNA or protein encoded by the gene.

"치료하다," "치료하는," 및 "치료"라는 용어는 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. The term "treat," "treating" and "treatment" is an approach for obtaining beneficial or desired clinical results. 구체적으로, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 검출가능 여부와는 상관없이, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화 (예컨대, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 저속화, 질환 확산의 실질적인 예방, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해(부분적 또는 완전 관해)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Specifically, beneficial or desired clinical results can be detected whether and is, relief of symptoms, the disease degree of decrease of the stabilizing (not e.g., not worsening) of disease, irrespective of, delay or slowing of disease progression, substantial prevention of diseases spread , improvement or alleviation of the disease state, and about one comprises a (partial or complete response), and the like. 추가로, "치료하다," "치료하는," 및 "치료"는 또한 질환 및/또는 질환에 기인될 수 있는 부작용의 부분적인 또는 완전한 치유라는 점에서 치료적일 수 있다. Additionally, "treat," "," and "treatment" of treatment may also jeokil treatment in terms of a partial or complete healing of the side effects that may be caused by diseases and / or disorders. 본원에서 사용되는 바, "예방적으로 치료하다," 또는 "예방적으로 치료하는"이라는 용어는 숙주에서 질환/병태 또는 그의 하나 이상의 증상을 완전하게, 실질적으로 또는 부분적으로 예방하는 것을 의미한다. As used herein, the term "treat prophylactically," or "prophylactic treatment with" are completely disease / condition or its one or more symptoms in a host, substantially or partly meant to prevention. 유사하게, "병태 발병의 지연" 또한 "예방적으로 치료하는" 것에 포함될 수 있고, 병태에 잘 걸리는 환자에서 병태가 실제로 발병되기 이전에 그 시간을 연장시키는 행위를 의미한다. Similarly, the "delay the onset of the condition" also refers to behaviors that can be included as "a preventive treatment" extend the time before the condition is actually endemic in good condition in a patient takes. 의 실제 개시 전에 시간을 증가시키는 행위를 나타낸다. It represents the action that will increase the time before the actual start.

"투여"란 본 개시내용의 화합물을 피험체 내로 도입하는 것을 의미하며; "Administration" means, and means for introducing into the blood of a compound of this disclosure the specimens; 이는 또한 본 개시내용의 조성물을 (예컨대, 처방에 의해) 피험체에게 제공하는 행위를 의미할 수 있다. It may also mean the act of providing to a subject a composition of the present disclosure (e.g., by a prescription).

"유기체," "피험체," 또는 "숙주"라는 용어는, 인간, 포유동물(예컨대, 고양이, 개, 말, 마우스, 래트, 돼지, 수퇘지, 암소 및 다른 소), 조류(예컨대, 닭), 및 치료를 필요로 하는 다른 살아있는 종을 비롯한, 치료를 필요로 하는 모든 살아있는 실체를 의미한다. "Organism," "subject," or "host" as used herein is human mammals (eg, cats, dogs, horses, mice, rats, pigs, boars, cows and other cows), birds (eg, chicken) that, and the treatment requires a therapy including other living species that require a means any living entity. 특히, "숙주"라는 용어는 인간을 포함한다. In particular, the term "host" includes humans. 본원에서 사용되는 바, "인간 숙주" 또는 "인간 피험체"라는 용어는 일반적으로 인간 숙주를 지칭하는 데 사용된다. As used herein, the term "human host" or "human a subject" is generally used to refer to a human host. 본 개시내용에서, "숙주"라는 용어는 전형적으로 인간 숙주를 나타내는 바, 이에 본 개시내용에서 단독으로 사용될 경우, "숙주"라는 단어는 문맥상 비인간 숙주를 명시하고자 하는 의도가 명백하게 제시되지 않는다면, 이는 인간 숙주를 의미한다. In this disclosure, when the bar, to be used In the sole in this disclosure representing a human host term is typically a "host", the word "host" is unless indicated intended to indicate the context non-human host obviously, This means the human host. 병태(들)에 "잘 걸리는" 숙주는 상기 하나 이상의 병태의 명백한 증상을 보이지는 않지만, 유전적으로, 생리적으로, 또는 다른 방식으로 하나 이상의 상기 병태로 발전할 위험이 있는 숙주로서 정의될 수 있다. The condition (s) to host "susceptible" does not show obvious symptoms of the one or more conditions can be defined as a host at risk to develop into one or more of the conditions entirely, physiological, or otherwise oil.

본원에서 사용되는 바, "발현"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드를 생산하는 구조 유전자에 이루어지는 과정을 기술한다. As used herein, the term "expression", describes a process consisting of a structural gene to produce a polynucleotide. 발현은 전사와 번역의 조합이다. Expression is a combination of transcription and translation. 발현은 일반적으로 폴리뉴클레오티드를 생산하는 핵산의 "발현"을 의미하지만, 이는 또한 일반적으로는 폴리뉴클레오티드의 "발현"을 의미하는 것으로도 허용되며, 이는 폴리뉴클레오티드가 상응하는 핵산의 발현을 통해 생산되는 것을 나타낸다. Expression generally refers to "expression" of a nucleic acid to produce a polynucleotide but which also typically is permitted to mean "expression" of a polynucleotide, which is produced through the expression of the nucleic acid is a polynucleotide corresponding It indicates that.

"혈관신생"은 새로운 혈관의 성장을 포함하는 생리학적 과정이다. "Angiogenesis" is the physiological process involving the growth of new blood vessels. 혈관신생은 예컨대, 성장 및 발생, 상처 치유, 배아발생 등과 같은 생물학적 과정의 중요한 부분이다. An important part of biological processes such as angiogenesis, for example, growth, and generating, wound healing and embryonic development. 과도한 혈관신생은 이환된 세포가 천연 혈관신생 억제제의 효과를 압도하는 비정상적인 양의 혈관신생의 성장 인자를 생산할 때에 발생할 수 있다. Excessive angiogenesis is the affected cells can occur when producing an abnormal amount of growth factor in the angiogenesis to overwhelm the effects of the natural neovascularization inhibitor. 혈관신생의 성장 인자와 혈관신생 억제제의 생산 사이의 불균형은 혈관의 성장 또는 억제를 부적절하게 조절할 수 있다. Imbalance between the angiogenic growth factors and production of the angiogenic inhibitor may inappropriately adjust the growth or inhibition of blood vessel. 혈관신생 의존적 또는 관련된 질환은 새로운 혈관이 과도하거나 불충분하게 성장할 때 일어날 수 있다. Angiogenesis dependent or associated diseases can occur when new blood vessels grow excessively, or insufficiently. 혈관신생 관련 질환으로는 암, 전암성 조직, 종양, 심근경색, 및 뇌졸중을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. To angiogenesis-related diseases including cancer, pre-cancerous tissue, tumors, myocardial infarction, and stroke, but it is not limited to: 과도한 혈관신생은 암, 당뇨성 실명, 연령 관련 황반 변성, 류마티스성 관절염, 건선, 및 70가지가 넘는 다른 병태를 포함할 수 있다. Excessive angiogenesis may include cancer, diabetic blindness, age-related macular degeneration, rheumatoid arthritis, psoriasis, and more than 70 kinds of different conditions. 불충분한 혈관신생은 관상동맥 질환, 뇌졸중, 및 상처 치유의 지연을 포함할 수 있고, 이는 또한 본 개시에서 더욱 상세하게 논의되는 조직 공학에 있어 인자이다. Insufficient angiogenesis can include a delay of coronary heart disease, stroke, and wound healing, which is also a factor in tissue engineering are discussed in detail in this disclosure.

본원에서 사용되는 바, "조절하다" 및/또는 "조절 인자"라는 용어는 일반적으로 세포/유기체에서 특정 기능 및/또는 형질을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진/활성화/유도/증가시키거나, 또는 방해/억제/감소시키는 행위를 의미한다. To As used herein, the term "control is" and / or "regulatory elements" generally cell / organism specific function and / or plasma directly or indirectly promote / activate / induce / increase in, or interfere with means / suppress / reduce behaviors that. 일부 경우에, 조절 인자는 그의 자연 상태에 비해, 또는 일반적으로 기대되는 활성의 평균 수준에 비해 특정 활성 또는 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있다. In some cases, the adjustment factor may increase or decrease the specific activity or function compared to the mean level of, or in general activity is expected as compared to its natural state. 조절은 (예컨대, 펩티드의 발현을 상향조절 또는 하향조절하는 작용에 의해) 펩티드의 과다발현 또는 발현부족을 일으키는 것을 포함하거나, 또는 활성을 증가 및/또는 감소시키는 대상 펩티드와 직접적으로 상호작용할 수 있다. Adjustment (for example, by the action of up-regulation or regulation downstream the expression of a peptide) may be included to cause the over-expression or expression of a lack of a peptide, or to interact directly with the target peptide to increase and / or decrease the activity . 조절은 또한 특정 생물학적 활성 또는 생물학적 현상, 예컨대, 혈관신생 또는 혈관신생과 관련된 생물학적 현상을 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다. Adjustment also involves a particular biological activity or biological phenomena, such as increase or decrease in biological phenomena associated with neovascularization or angiogenesis.

본원에서 사용되는 바, "상향조절하다"라는 것은 단백질 또는 다른 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 행위를 의미한다. As used herein, a "is up-regulated" means any method used to increase the expression and / or activity of a protein or other gene product. "하향조절"은 단백질 또는 다른 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것을 의미한다. "Down regulation" means to reduce the expression and / or activity of a protein or other gene product.

본원에서 사용되는 바, "단리된 세포 또는 세포 집단"이라는 용어는 조직으로부터 절개되거나, 조직 배양 기술에 의해 시험관내에서 성장시킨 단리된 세포 또는 복수 개의 세포를 의미한다. As used herein, the term "an isolated cell or cell population" is either cut from the tissue, means a cell or a plurality of isolated cells grown in vitro by tissue culture techniques. "세포 또는 세포 집단"이라는 용어는 상기에 기술된 단리된 세포를 의미할 수 있거나, 또한 동물 또는 인간 조직의 생체내 세포를 의미할 수 있다. The term "cell or cell population" is either an isolated cell can mean a described above, can also mean an animal cell or in vivo of human tissue.

"조직"이라는 용어는 일반적으로 협력하여 생물학적 기능을 수행하고/거나, 예컨대, 유기체 내에서 기관의 전체 또는 그 일부를 형성하는 것과 같은 생물학적 목적의 역할을 하도록 조직화된 세포 집단(예컨대, 결합 조직, 내피 조직)을 의미한다. "Tissue" as used herein is generally cooperate to perform a biological function and / or, for example, an organization to act as a biological purposes, such as to form the whole or part of the institutions within the organism cell populations (eg, connective tissue, It refers to the endothelial tissue). "조직"은 일반적으로 유사 세포 집단, 또는 모두 동일한 유형의 세포 집단을 포함하고, 조직은 또한 세포 집단이 대개 공통 목적의 역할을 하는 경우 1 초과의 유형으로 이루어진 세포를 포함할 수 있다. "Organization" generally includes a similar population of cells, or all of the population of cells of the same type, the tissue may also comprise a cell made of a type of 1 than when the population of cells that typically acts as a common purpose.

본원에서 사용되는 바, "생체적합성"이라는 용어는 생물학적 물질 또는 시스템에 과도한 스트레스, 독성, 또는 부작용을 일으키지 않으면서, 살아있는 생물학적 물질 및/또는 생물계(예컨대, 세포, 세포 구성 요소, 살아있는 조직, 기관 등)과 공존할 수 있는 능력을 의미한다. As used herein, "biocompatible" as used herein, biological material, or without causing excessive stress, toxicity, or side effects to the system on, the living biological substance and / or biological systems (e.g., cells, cell components, living tissues, organs refers to the ability, etc.) can coexist with.

"바이오스캐폴드"라는 용어는 살아있는 생물학적 물질(예컨대, 살아있는 세포)의 성장을 지원하는 데 충분한 구조적 안정성을 가진 임의의 생체적합성 기질(자연 유래, 또는 합성)을 의미한다. "BIOS cache fold" the term means a sufficient structural stability of any biocompatible substrate with a (naturally occurring or synthetic) to support the growth of the living biological matter (e. G., Live cells). 본 개시내용의 실시양태에서, 생체적합성 스캐폴드 물질은 자연 유래 기질(예컨대, 살아있는 유기체로부터 획득되지만, 추가 프로세싱 및 처리를 받을 수 있거나; 또는 자연 공급원으로부터 유래된 물질로부터 생산), 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 세포가 제거된 인간 제정맥 스캐폴드이다. In embodiments of the present disclosure, the biocompatible scaffold material is naturally occurring substrate (e. G., But obtained from a living organism, or can be an additional processing and treatment; production from the resulting material to or from a natural source), for example, limited to Although not a human vein claim scaffold cells are removed. 실시양태에서, 본 개시내용의 바이오스캐폴드는 살아있는 세포의 3차원 성장을 지원하기 위해 (평면의 2차원 구조보다는) 3차원 구조를 가진다. In embodiments, the BIOS cache of the present disclosure, Fold has a three-dimensional structure (rather than two-dimensional structure of the plane) to support the three-dimensional growth of living cells.

본원에서 사용되는 바, "생분해성"이라는 용어는 자연 환경에서(예컨대, 살아있는 유기체 또는 살아있는 배양물 내에서) 시간이 경과함에 따라 용해되고, 약화되거나, 또는 다르게는 분해되고, 그의 구조 완전성을 상실하고, 그의 원래 구조 형태로 존재하기를 중단하는 물질을 의미한다. As used herein, the term "biodegradable" is dissolved, as in the natural environment (e.g., within a living organism or live cultures), over time, weaken, or, or, alternatively, is decomposed, it loses its structure integrity and it refers to a substance which ceased to exist in their original form structure. 본 개시내용의 실시양태에서, 생분해성 물질은 숙주 유기체 내에서 시간이 흐르면서 용해되고 분해된다. In an embodiment of the disclosure, the biodegradable material is dissolved over time in the host organism is decomposed.

본원에서 사용되는 바, "조작된"이라는 용어는 조작되는 대상이 인간에 의해 생산되고/거나, 변경된다는 것을 나타낸다. The term bar, the "operation" as used herein indicates that the target to be operated that are produced by human and / or change. 조작된 대상은 자연 유래 물질을 포함할 수 있지만, 대상 그 자체는 인간의 개입 및 디자인에 의해 어느 방식으로든 변경된다. The operation target, but can include naturally occurring substances, the target itself is altered in any way by human intervention and design.

본원에서 사용되는 바, "시험 화합물"이라는 용어는 살아있는 세포 또는 유기체에 영향을 줄 수 있는 펩티드, 펩티드모방체, 소분자, 핵산 서열 또는 다른 화합물을 포함할 수 있다. As used herein, the term "test compound" may include peptides, peptide mimetics, small molecules, nucleic acid sequences or other compounds that can affect living cells or organisms. 일부 실시양태에서, "시험 화합물"은 생물학적 활성, 기능 또는 또 다른 화합물에 대한 반응에 대해 조절 효과를 갖는 것으로 의심되는 화학물질 또는 펩티드와 같은 화합물일 수 있다. In some embodiments, the "test compound" can be a compound such as a chemical or a peptide suspected of having a regulatory effect on the response to biological activity, function, or other compounds. 예를 들어, 본 개시내용에서, "시험 화합물"은 예컨대, 혈관신생 활성을 증가시키고/거나, 혈관신생 활동을 감소시키고/거나, 상이한 혈관신생 조절 인자의 효과를 조절하는 것과 같이 혈관신생에 조절 효과를 가지는 것으로 의심되는 화합물일 수 있다. For example, in the present disclosure, the "test compound" includes, for example, control angiogenesis such as to increase the angiogenic activity and / or reduce the angiogenic activity and / or adjust the effect of different angiogenesis regulators It may be a compound that is suspected to have the effect.

본원에서 사용되는 바, "제거된" 또는 "실질적으로 제거된"이라는 용어는 일정량의 물질 또는 화합물이 또 다른 조성물과 분리된 것을 나타내지만, 잔류 조성물에는 모든 미량의 제거된 물질도 절대적으로 존재하지 않고, 이로써, 이로써, 제거된 물질이 완전히 검출불가능하여야 하는 것은 아니다. As used herein, the term "removed" or "substantially removed" is only shown that a certain amount of a substance or compound also separated from other compositions, the residual composition is not present in an absolutely even a material removed all traces of rather, this, thus, that the removed material is not to be not completely detected. 예를 들어, 혈액이 조성물로부터 "제거된," 또는 "실질적으로 제거된 경우라면, 이는 조성물 중 상당 비율의 혈액이 제거되었지만, 일부 혈액 또는 혈액 구성 성분은 철저한 스크리닝시에 여전히 미량으로 검출될 수 있다는 것을 나타낸다(예컨대, "실질적으로 제거된"은 조성물이 "제거된" 구성 성분을 100% 함유하지 않아야 하는 것은 아니며; 대신, 조성물 또는 물질은 "제거된" 구성 성분을 약 99% 무함유, 약 95% 무함유, 또는 약 90% 무함유, 또는 상기 제시된 임의의 비율 또는 예시적인 비율 내의 범위로 무함유일 수 있다). For example, in case the blood is from a composition "removed," or "substantially removed, which was the in the equivalent ratio of blood removal composition, a part of blood or blood components can still be detected in a very small amount at the time of thorough screening shows that (for example, "substantially removed" is a composition of the "removed" components not intended to must not contain 100%; instead, composition or material is about 99% of the component "removed"-free, about 95%-free, or only one may be) in the range from about 90% to muham-free, or the ratio of any given or exemplary ratio.

논의 Argument

본 개시내용의 실시양태는 혈관신생을 유도하기 위한 방법 및 조성물, 및 혈관신생을 조절하기 위한 방법 및 조성물, 및 혈관신생을 조절하기 위한 조성물의 제조 방법을 포함한다. Embodiments of the present disclosure includes a method of producing a composition for regulating the methods and compositions, and the angiogenesis to control the method and composition, and the angiogenesis to induce angiogenesis. 본 개시내용은 또한 혈관신생 조절 인자의 확인 방법 및 혈관신생 조절 인자를 확인하기 위한 검정법을 포함한다. The present disclosure also includes assays to determine the verification method and angiogenesis regulators of angiogenesis regulators. 본 개시내용의 실시양태는 혈관신생을 조절하기 위한 조성물을 전달하기 위한 방법 및 조성물을 추가로 포함한다. Embodiments of the present disclosure further includes methods and compositions for delivery of the composition for regulating angiogenesis. 실시양태에서, 본 개시내용은 조직 구조물에서 및/또는 자연 조직에서 시험관내 및/또는 생체내 혈관 형성을 유도하고/거나, 조절하는 데 사용될 수 있는 태반 추출물 및 조직 구조물에서 및/또는 자연 조직에서 태반 추출물을 세포에 전달하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. In embodiments, the present disclosure is directed at the tissue structure and / or in natural tissue in vitro and / or in vivo induced vascular formation and / or in the placenta extract and in tissue structure / or natural tissue, which can be used to control includes methods and compositions for delivery of the placenta extract the cell. 본 개시내용은 또한 혈관신생을 조절하는 화합물을 확인하는 검정법에 사용될 수 있는 태반 추출물을 포함한다. The present disclosure also includes a placenta extract which can be used in assays to identify compounds that modulate angiogenesis. 추가로, 본 개시내용은 혈관신생을 유도하는 생체내 또는 시험관내 세포 집단으로 추출물을 방출 조절형 방식으로 방출하기 위한 태반 추출물이 적재된 전달 비히클 조성물을 포함한다. In addition, the present disclosure includes a placenta extract is loaded delivery vehicle composition for emitting extract in vivo or in vitro population of cells to induce angiogenesis in controlled release manner.

혈관신생은 위치 및 자극 두 가지 모두에 의존적인 복합적인 과정으로, 각 경우에 상기 과정을 조절할 수 있는 능력은 조절 분자의 복합적인 조합을 포함할 수 있다. Angiogenesis is a complex process dependent on both the position and magnetic poles, and the ability to control the process in each case may include a complex combination of the control molecules. 혈관 형성 제어는 상이한 형성 기전으로 추가로 복잡해지게 되는데, 가장 잘 이해되고 있는 두 형성 기전은 장 중첩과 발아이다. Angiogenesis control becomes complicated, there is further formed with a different mechanism, is a two forming mechanism which is best understood in Chapter overlap the germination. 장 중첩 기존 혈관의 내강으로 간질 세포 칼럼이 삽입되는 것을 특징으로 하며, 발아는 이전에 미세혈관이 없는 조직에서 혈관신생 자극에 대해 내피 세포가 발아하는 것을 특징으로 한다. Chapter overlap existing and being into the lumen of the blood vessel is inserted into the column stromal cells, germination is characterized by endothelial cells for angiogenesis stimulated germination in tissue without the prior microvascular. 많은 분자가 혈관신생을 조절하는 것으로 밝혀졌으며, 이들은 좀 더 연구되어야 할 것으로 보인다. Many molecules have been found to regulate angiogenesis, which seems to be a little more research. 이러한 혈관신생 유도 인자의 다양성으로 인해 혈관 발생의 연구, 약물 스크리닝 및 재생 의학 요법에 사용하기 위한 혈관신생 조절 인자를 지속적으로 연구 개발해왔다. Due to the diversity of angiogenesis inducers it has continued research and development of angiogenesis modulators for use in the study of blood vessels occurs, drug screening and regenerative medicine therapies.

혈관신생을 연구하기 위한 종래 모델은 동물 유래된 자극인자를 이용하거나, 평가를 위해 살아있는 동물의 사용에 전적으로 의존하고 있다. Conventional model to study angiogenesis is entirely dependent on the use of live animals for evaluation using a stimulating factor of animal origin, or. 생체내 동물 연구는 인간 혈관의 형성 과정 동안에 일어나는 생체분자 경로 및 기전의 복합성을 비교하기 위한 더 정확한 모델을 제공한다. In vivo animal studies it should provide a more accurate model, for comparing the complexity of the biomolecule path and mechanisms taking place during the formation of human blood vessels. 표준 생체내 혈관신생 모델은 토끼 각막 신생 혈관화 어세이, 생체내/시험관내 병아리 융모 요막 어세이, 및 래트 장간막 창 어세이를 포함한다. Standard in vivo angiogenesis model includes a control rabbit cornea vascularization New assays, in vivo / in vitro chick chorionic yomak Assay, and the rat mesentery window assay. 가능할 경우, 시험관내 혈관신생 모델은 복합한 생물학적 현상을 더 잘 제어하기 위해 선택된다; If possible, in vitro angiogenesis model is chosen in order to better control the complex biological phenomenon; 그러나, 이는 대개 제한된 수의 분자 종, 예컨대, VEGF에 대한 연구를 제한한다. However, this typically limits the study of the molecular species, for example, a limited number of VEGF. 더 복합적이거나 다인성 "믹스"가 충분한 혈관화를 촉진시키는 데 필요할 수 있는 경우, 상기 복잡한 케스케이드를 위한 단일 분자(또는 수개의 분자)를 이용하는 결과는 그 자체가 제한적일 수 있다. If more complex or that it may be necessary for toughness "mix" that promote adequate vascularization, as a result of using a single molecule (or molecules) for the complex cascade it may be limited in itself.

시험관내 혈관신생 모델의 경우, 뮤린 유래된 기저막 매트릭스(BMM: basement membrane Matrix) 또는 '마트리겔' 어세이가 바람직한 모델이 되어 왔는데, 그 이유는 생체내 복잡도를 시험관내 모델에 야기하고, 결과가 생체내 결과와 더욱 유사한 것으로 보이기 때문이다. For the in vitro angiogenesis model, murine derived from basement membrane matrix: got a (BMM basement membrane Matrix) or "matrigel" Assay is a preferred model, the reason is to cause in vivo complexity in vitro model, the result is because that looks more similar to the in vivo results. 그러나, 이 모델은 엔젤브레스-홀름-스웜 (EHS) 마우스 육종 세포로부터 유래되었고, 많은 수의 동물의 희생이 요구되기 때문에 임상 용도로는 적합하지 않다 11 . However, this model is Angel Breath-Holm-Swarm (EHS) was derived from mouse sarcoma cells, because the demands at the expense of large numbers of animals are not suitable for clinical purposes 11. 다수의 시험관내 인간 유래 조절 인자가 혈관신생 모델을 만드는데 사용되어 왔다. A number of in vitro human-derived regulatory elements have been used to create a model angiogenesis. 역사적으로, 이들은 단일 조절 인자(FGF, TGF-β, VEGF)를 기초로 하였고, 천연의 생체내에 존재하는 다양한 사이토카인 및 화학적 구배를 포함하지 않는다 12 . Historically, these single adjustment factor (FGF, TGF-β, VEGF) were based on the, it does not include the various cytokines and chemical gradient existing in the living body in a natural 12. 동물 유래된 모델과 연관된 종간 차이 13 , 14 및 인간 재조합 단백질로부터 다중 단백질 제제를 유도하는 복합성을 고려해 볼 때, 확실한 인간 유래된 접근법(생리학적 비에 근접한 비율로 다중의 단백질로 이루어진 더 복잡한 믹스를 포함)은 기계적 연구, 혈관신생 약물의 스크리닝, 및 재생 의학 요법의 임상적 전환을 증진시킬 수 있는 잠재성에 큰 영향을 줄 것이다. Species differences associated with the animal derived models 13, 14, and in view of the complexity of inducing multiple protein preparations from human recombinant protein, a more complex mix consisting of multiple proteins in a certain human-derived approach (approximate ratio in physiological ratio included) will have a major impact on the potential that can improve the clinical conversion of mechanical research, screening for angiogenesis drugs, and regenerative medicine therapies. 추가로, 상이한 형성 기전 및 단계를 나타내는 혈관신생 과정을 조절할 수 있는 능력은 혈관화 과정에서 중요한 분자 및 분자 경로를 특성화하는 개선된 플랫폼을 제공할 것이다. In addition, the ability of the angiogenic process represents a different mechanism of formation and phase can be adjusted will provide an enhanced platform that characterize relevant molecules and molecular pathways in the vascularization process.

본 개시내용은 시험관내 및 생체내에서 혈관신생을 유도하고 조절하는 방법을 제공한다. The present disclosure provides a method for inducing and regulating angiogenesis in vitro and in vivo. 시험관내 및 생체내 혈관형성을 유도하는 것 이외에도, 이 모델은 미세혈관 네트워크의 성숙화 속도를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 발아 및 장 중첩적 혈관신생의 선택적인 모델링을 가능하게 한다. In addition to induction of angiogenesis in vitro and in vivo, a model, as well as to control the maturation rate of the microvascular network, it enables the selective modeling of germination and field superposed manner angiogenesis. 생체내에서 인간 태반 추출물(PE)은 투여된 콜라겐 기반의 바이오스캐폴드를 이용하여 섬유화를 제거하면서, 모세혈관 형성을 현저히 증진시키는 것으로 나타났다. In vivo human placenta extract (PE) is removed and the fiber formation by the BIOS cache folds of the administration of collagen-based, been shown to significantly enhance the capillary formation.

본 개시내용은 인간 태반에서 유래된, 조정 가능한, 완전한 인간 생체분자로 이루어진 복합 세트를 이용하여 시험관내 및 생체내 혈관신생을 유도하고 조절하는 방법을 기술한다. The present disclosure is directed to a composite set of the, adjustable, fully human biomolecules derived from human placenta is described a method for inducing and controlling the in vitro and in vivo angiogenesis. 본 접근법은 인간 태반으로부터 단리된 활성 인간 생체분자의 복합체를 얻기 위해 지정된 분별법 및 분리 기술을 이용한다. This approach is used in the fractionation and separation techniques specified in order to obtain a complex of the activated human biomolecule isolated from human placenta. 시험관내 혈관신생 및 생체내 형관신생을 유도하고 조절하는 것 이외에도, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 미세혈관 네트워크 성숙화 속도를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 발아 및 장 중첩적 혈관신생의 선택적인 모델링을 가능하게 한다. In vitro In addition to inducing and controlling angiogenesis and in vivo hyeonggwan neovascularization, the methods and compositions of the present disclosure is not only to control the microvascular network maturation speed, enables the selective modeling of germination and field superposed manner angiogenesis It makes. 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 화합물은 또한 중합체 및 생체외 유래된 조직 스캐폴드, 둘 모두에서 혈관신생을 유도하고 조절한다. In embodiments, the methods and compounds of the present disclosure is also derived and regulate angiogenesis in both the tissue scaffold, two-derived polymers and other living body. 이들 방법은 미세혈관 네트워크 성숙화 속도를 조절할 수 있다. These methods can control the microvascular network maturation rate. 생체내에서 본 개시내용의 인간 태반 추출물은 투여된 콜라겐 기반의 바이오스캐폴드를 이용하여 섬유화를 제거하면서, 모세혈관 형성을 현저히 증진시키는 것으로 나타났다. While human placenta extract of the present disclosure in vivo to remove the fiber formation by the BIOS cache folds of the administration of collagen-based, been shown to significantly enhance the capillary formation.

혈관신생에 영향을 주는 성장 인자의 지속적인 전달 또한 조직 조작 접근법을 위해 혈관화를 촉진하는 혈관신생을 성공적으로 조절하는 데 있어 직면하게 되는 도전 과제이다. Continuous delivery of a growth factor that affects angiogenesis are also challenges to be faced to successfully adjust the angiogenesis to promote vascularization for tissue manipulation approach. 본 개시내용은 또한 시험관내 및 생체내, 둘 모두에서 혈관신생을 조절하기 위해 본 개시내용의 조성물을 방출 조절형 방식으로 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. The present disclosure also provides a method and compositions for regulating the in vitro and in vivo, the compositions of the present disclosure to control angiogenesis information on both a controlled release manner.

인간 태반 추출물 Human Placenta Extract

본 개시내용은 인간 태반 추출물(PE 또는 hPE)을 포함하는 혈관신생 유도 및/또는 조절을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. The present disclosure provides compositions and methods for inducing angiogenesis and / or control including a human placenta extract (PE or hPE). 본 개시내용의 실시양태에서, PE는 인간 태반으로부터 샘플을 수득하고, 태반 샘플로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물(조 PE)을 제조하고, 조 PE를 우레아 또는 다른 단백질 가용화제와 혼합하여 추출물 중에 존재하는 단백질을 가용화하고, 조추출물로부터 잔류 고체를 제거하고; While in the embodiments of the present disclosure, PE is to obtain a sample from the human placenta, removing blood from the placenta samples were prepared placenta crude extract (crude PE), mixed with a crude PE urea or other protein solubilizing agents, and the extract solubilizing the present protein, and removing remaining solids from the crude extract; 우레아 태반 추출물 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 상당량의 우레아를 제거하여 인간 PE를 제조함으로써 제조된다. Dialysis urea placenta extract mixture by removing a significant amount of urea from the mixture and is produced by preparing a human PE. 인간 PE는 매트릭스 유사 화합물이고, 이는 종종 본원에서 인간 태반 매트릭스(hPM)로서 지칭된다. Human PE is a matrix-like compounds, which often is referred to as the human placenta matrix (hPM) herein.

실시양태에서, 인간 PE의 제조 공정은 약 -86℃ 내지 약 5℃의 온도에서 수행된다. In embodiments, a manufacturing process of a human PE is carried out at a temperature of about -86 to about ℃ 5 ℃. 실시양태에서, 인간 태반 추출물은 약 4℃ 이하의 온도에서 제조된다. In embodiments, a human placenta extract is prepared at a temperature of less than about 4 ℃.

실시양태에서, 태반 샘플로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 제조하는 공정은 인간 태반 샘플을 완충제로 균질화시키는 단계, 균질화된 샘플을 원심분리하는 단계 및 혈액을 함유하는 상청액을 폐기하는 단계를 포함한다. In embodiments, the process for preparing the placenta crude extract by removing the blood from the placenta sample comprises the steps of discarding the supernatant containing the step, and the blood to centrifugation step, the homogenized sample to homogenize the human placenta samples with Buffer . 조 PE를 제조하기 위해 상기 공정은 실질적으로 모든 혈액이 샘플로부터 제거될 때까지(예컨대, 샘플에 혈액의 약 99%가 없는, 혈액의 약 95%가 없는, 혈액의 약 90% 등이 없다) 다회에 걸쳐(예컨대, 2, 3회 이상) 반복될 수 있다. To produce the crude PE said process substantially all of the blood until it is removed from the sample (e.g., there is no such not does not have a sample of about 99% of the blood, about 95% of the blood, about 90% of blood) throughout the tea party (e. g., two, three times or more) may be repeated. 한 실시양태에서, 완충제는 염화나트륨 용액(NaCl)이다. In one embodiment, the buffer is sodium chloride (NaCl).

실시양태에서, 태반 조추출물 중 단백질은 태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합함으로써 가용화시킨다. In embodiments, the protein of the placenta crude extract was then solubilized by mixing with protein solubilizers the placenta crude extract. 실시양태에서, 단백질 가용화제는 단백질을 영구적으로 파괴시키지 않거나, 또는 다르게는 단백질을 영구적으로 불활성인 상태로 만들지 않으면서 단백질을 가용화시킬 수 있는(예컨대, 변성시킬 수 있는) 임의의 화합물 또는 화합물 혼합물일 수 있다(예컨대, 가용화는 단백질을 가역적으로 변성시켜야 하며, 이로써, 단백질은 예컨대, 단백질 가용화제가 제거되었을 때 리폴딩될 수 있다). In embodiments, the protein solubilizing agent are either not destroy the protein permanently, or alternatively may help without making a state inert protein permanently solubilizing the protein (e. G., Which may be modified) any compound or compound mixture It may be (e.g., solubilization and the need to denature the protein in a reversible, so that, for example proteins, can be refolded when the protein solubilizing agent removed). 실시양태에서, 단백질 가용화제는 제한하는 것은 아니지만, 우레아, 구아니딘-HCl, 또는 다른 유사 화합물일 수 있다. In embodiments, a protein solubilizing agent may be but are not limited to, urea, guanidine -HCl, or other similar compounds. 실시양태에서, 단백질 가용화제는 우레아이고, 조추출물을 우레아로 균질화함으로써 조추출물을 우레아 조성물과 혼합한다. In embodiments, the protein solubilizing agent is urea, and the urea are mixed with the crude extract composition by homogenisation and the crude extract to the urea. 실시양태에서, 우레아를 약 12 내지 약 36시간의 기간 동안 조추출물과 혼합한다. In embodiments, the urea over a period of about 12 to about 36 hours then mixed with the crude extract. 실시양태에서, 우레아를 약 24시간 동안 조추출물과 혼합한다. In embodiments, the urea for about 24 hours and then mixed with the crude extract. 실시양태에서, 우레아 용액은 우레아 농도가 약 0.5 M 이상인 우레아 완충제이다. In embodiments, the urea solution is a urea urea buffer concentration greater than or equal to about 0.5 M. 실시양태에서, 우레아는 약 2 M 이상, 우레아는 약 4 M 이상, 최대 약 15 M 이다. In embodiments, urea is at least about 2 M, of urea is about 4 M or higher, up to about 15 M. 실시양태에서, 우레아 용액은 농도가 약 0.5 M 내지 약 15 M이 될 수 있다. In embodiments, the urea solution has a concentration that can be about 0.5 M to about 15 M. 다른 실시양태에서, 단백질 가용화제는 농도가 약 0.5 M 내지 약 15 M인 구아니딘-HCl이다. In other embodiments, the protein solubilizing agent is a guanidine -HCl concentration of from about 0.5 M to about 15 M. 실시양태에서, 구아니딘-HCL은 농도가 약 6 M이다. In embodiments, guanidine -HCL is a concentration of about 6 M. 비록 하기에 기술된 방법 및 조성물은 가용화제로서 우레아를 이용하는 것으로 기술되기는 하지만, 다른 적합한 가용화제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 상기 논의된 것이 우레아를 대신할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. The methods and compositions described below, although it is to be understood that it is possible to replace Although techniques, but other suitable solubilizing agent, such as, but not limited to, the above discussion that the use of urea to the urea as a solubilizing agent.

실시양태에서, 우레아, 또는 다른 단백질 가용화제와 혼합한 후, 고체는 가용화된 단백질-조 추출물 혼합물(예컨대, 우레아-조 추출물 혼합물)로부터 제거된다. In embodiments, after mixing with the urea or other protein solubilizing agents, it is solid solubilized protein - and removed from - (crude extract mixture, for example, urea), crude extract mixture. 실시양태에서, 고체는 PE 혼합물을 원심분리하고, (고체를 함유하는) 펠릿을 폐기함으로써 제거된다. In embodiments, the solid is removed by destroying centrifuged PE mixture (containing solid) pellets. 본 단계는 다회에 걸쳐 반복될 수 있다. This step can be repeated over a multidose. 고체를 제거한 후, PE 혼합물(예컨대, 상청액)을 투석하여 태반 추출물로부터 우레아, 또는 다른 단백질 가용화제를 제거한다. After removal of the solid, by dialysis the PE mixture (e.g., the supernatant) to remove urea, or other proteins from the solubilizing agent placenta extract. 실시양태에서, 투석액은 TBS이다. In an embodiment, the dialysis solution is TBS. 실시양태에서, 일정 시간(예컨대, 1시간, 2시간, 3시간 등)이 경과한 후 투석액을 교환하고, 다회(예컨대, 2, 3, 4회 등)에 걸쳐 투석을 반복하여 PE로부터 실질적으로 모든 우레아를 제거한다(예컨대, 태반 추출물에는 우레아의 약 99%가 없고, 우레아의 약 95% 등이 없다). In embodiments, the exchange after a predetermined time (e.g., 1 hour, 2 hours, 3 hours) has elapsed dialysis solution, and repeating the dialysis across the tea party (e. G., Two, three, and four times) substantially from the PE remove all the urea (for example, placental extract has no about 99% of urea, there is not such as about 95% of urea). 실시양태에서, PE를 다시 원심분리하여 잔류 고체(예컨대, 중합화된 단백질 등)를 제거한다. In embodiments, the PE again centrifuged to remove the solid residue (e.g., the polymerization of the protein, etc.). 실시양태에서, 잔류 PE는 투명 내지 분홍색을 띠는 점성 물질이다. In embodiments, the residual PE are transparent to an pink band is a viscous material. 본 개시내용의 태반 추출물을 제조하는 본 개시내용의 공정의 실시양태에 관한 추가의 상세한 설명은 하기 실시예에서 살펴볼 수 있다. Additional detailed description of the embodiments of the process of the present disclosure for preparing placenta extracts of the present disclosure may be obtained at the following Examples.

따라서, 본 개시내용의 실시양태는 또한 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 PE를 포함한다. Thus, embodiments of the present disclosure also includes a PE produced by the method of the present disclosure. 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 태반 샘플로부터 수득된 샘플로부터 혈액을 제거하여 조 PE를 제조하고; In embodiments, the present disclosure is made in the crude PE by removing the blood from the sample obtained from the human placenta sample; 태반 조추출물을 단백질 가용화제(예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 우레아, 구아니딘-HCl 등)와 혼합하여 조추출물 중의 단백질을 가용화시키고; Protein solubilizers the placenta crude extract (which is for example, but not limited to, urea, guanidine -HCl, etc.) and by mixing and solubilizing the protein in the crude extract; 가용화된 단백질-PE 혼합물로부터 고형 물질을 분리하고; Separating the solid matter from the solubilized protein -PE mixture; PE 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제(예컨대, 우레아)를 제거하여 인간 PE를 제조함으로써 제조된 PE를 포함한다. PE dialysis the mixture to remove the protein solubilizing agent (e.g., urea) from the mixture comprises a PE prepared by preparing the human PE.

따라서, 본 개시내용은 혈액 및 고형물이 실질적으로 제거되고, 태반 샘플에 존재했던 태반 단백질(일부 또는 모두)을 보유하는 인간 태반으로부터(예컨대, 인간 태반 샘플로부터) 수득된 추출물을 비롯한 인간 태반 추출물을 포함한다. Accordingly, the present disclosure is blood, and the solids are substantially removed, placental protein was present in the placenta sample of human placenta extract, including the (or all) obtained (e.g., from human placenta samples) from human placenta having an extract It includes. 실시양태에서, 태반 단백질은 사이토카인 및 성장 인자를 포함한다. In embodiments, placental proteins include cytokines and growth factors.

본 개시내용의 PE의 분석 결과, PE는 사이토카인 및 성장 인자를 비롯한, 많은 단백질을 포함하는 것으로 밝혀졌다. In the PE analysis of the present disclosure, PE has been shown to include many proteins, including cytokines and growth factors. 본 개시내용의 태반 추출물의 실시양태에서, 추출물은 20개 이상의 상이한 사이토카인을 포함한다. In embodiments of the placenta extract of the present disclosure, the extract comprises more than 20 different cytokines. 일부 실시양태에서, 최대 40개의 상이한 사이토카인을 함유한다. In some embodiments, it contains a maximum of 40 different cytokines. 다른 실시양태는 50개 이상의 사이토카인을 포함한다. Other embodiments include 50 or more cytokines. 본 개시내용의 PE에 존재할 수 있는 일부 사이토카인은 하기 실시예에 열거된 것들을 포함한다. Some cytokines which may be present in the PE of the present disclosure include those listed in the Examples below. 예를 들어, 본 개시내용의 PE에 존재할 수 있는 사이토카인 중 일부는 안지오게닌, Acrp30Ag, IGFBP-1, NAP-2, 및 Fas/TNFGSF6, 및 RANTES, 및 MIF를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. For example, some of the cytokines that may be present in the PE of the present disclosure will come J Nin, Acrp30Ag, IGFBP-1, NAP-2, and Fas / TNFGSF6, and RANTES, and including, MIF, but are not limited to .

본 개시내용의 태반 추출물에 존재하는 사이토카인 및 성장 인자 및 다른 태반 화합물은 내피 세포 배양물, 조직, 조직 구조물, 조작된 바이오스캐폴드 등에서 혈관신생을 유도할 수 있다. Cytokines and growth factors and other compounds present in the placenta, the placenta extract of the present disclosure may lead to endothelial cell culture, tissue, tissue structure, the operation BIOS cache angiogenesis etc. fold. 본 개시내용의 태반 추출물은 시험관내 및 생체내에서 혈관신생을 유도할 수 있다. Placenta extract of the present disclosure can induce angiogenesis in vitro and in vivo. 본 개시내용의 태반 추출물은 내피 세포의 성장을 자극시킬 수 있다. Placenta extract of the present disclosure may stimulate the growth of endothelial cells. 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 PE는 혈관신생을 조절할 수 있다. In embodiments, human PE of the present disclosure can control angiogenesis. 혈관신생을 유도하는 데 사용되는 통상의 다른 화합물, 예컨대, BMM(단일 정제된 혈관신생 조절 인자(예컨대, 정제된 VEGF-알파 또는 SDF-1) 및 정제된 피브린을 포함하는 화합물)과 비교하여, 본 개시내용의 PE는 BMM에 비해 내피 세포의 혈관신생의 성장(예컨대, 세관 및 네트워크 형성)의 증가 및 근섬유모세포의 혈관신생형 성장(예컨대, 세관 형성)의 감소를 자극시킨다. As compared to (a compound containing a single purified angiogenesis regulator (e.g., the purified VEGF- alpha or SDF-1) and purified fibrin) other conventional compounds, for example, BMM that is used to induce angiogenesis, PE according to the present disclosure causes a reduction in the stimulation of angiogenesis-type increases and muscle cell growth (for example, customs form) of growth of the angiogenic endothelial cells as compared to BMM (for example, customs and network formation). 본 개시내용의 PE는 또한 BMM에 비해 다양한 세포주(예컨대, 줄기 세포, 평활근 세포 등)에 대해 상이한 성장 및/또는 분화 패턴을 자극시킴으로써, 이로써, 상기 세포의 성장/분화 패턴은 BMM을 이용한 성장과는 구별될 수 있다. By PE of the present disclosure is also a variety of cell lines than in BMM (e.g., stem cells, smooth muscle cells) stimulate different growth and / or differentiation pattern for, thus, growth / differentiation pattern of the cells are grown using the BMM and It can be distinguished.

본 개시내용의 PE는 또한 PE 부재하에서 성장된 내피 세포와 비교하였을 때, 내피세포에서 다양한 유전자를 상향조절할 수 있다. PE according to the present disclosure is also compared with the endothelial cell growth under the PE element can be raised to adjust the various genes in endothelial cells. 일부 상기 유전자로는 혈관신생 관련 유전자, 세포외 매트릭스 리모델링 유전자, 및 혈관 발생 유전자를 포함한다. Portion thereof and wherein the gene comprises an angiogenesis-related genes, extracellular matrix remodeling gene, and vascular gene occurs. 일부 혈관형성 관련 유전자로는 ANGPTL4, CXCL3, 인간 성장 인자(HGF: human growth factor), ANGPT2, PGF, TYMP, VEGFA, HIF1A, 및 FGF1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. In some angiogenic-related gene ANGPTL4, CXCL3, human growth factor (HGF: human growth factor), ANGPT2, PGF, TYMP, VEGFA, including, HIF1A, and FGF1, not limited to this. 본 개시내용의 태반 추출물에 의해 유도될 수 있는 일부 세포외 매트릭스 리모델링 유전자로는 MMP2, MMP9, COL4A3, 및 LAMA5를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. In some extracellular matrix remodeling gene which can be induced by the placenta extract of the present disclosure, including, MMP2, MMP9, COL4A3, and LAMA5, it not limited to this. 혈관 발생 유전자로는 CDH2, HAND2, LECT1, 및 MDK를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. A blood vessel caused by gene comprises CDH2, HAND2, LECT1, and MDK, not limited to this.

혈관신생 조절 방법 Angiogenesis regulation method

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 인간 태반 추출물의 존재하에서 내피 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 세포 배양물에서 혈관신생을 유도하는 방법을 포함한다. The present disclosure also includes a method of inducing angiogenesis in a cell culture which comprises the growth of endothelial cells in the presence of human placenta extract of the present disclosure. 실시양태에서, 세포 배양물을 혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 우레아와 혼합되고, 우레아를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 샘플로부터 얻은 본 개시내용의 태반 추출물의 존재하에서 성장시키게 되며, 여기서, 태반 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함한다. In embodiments, the cells are treated to remove the culture the blood and a solid, is mixed with urea and, and thereby growth in the presence of a placenta extract of the present disclosure was obtained from the human placenta samples dialyzed to remove the urea, wherein placenta extract include placenta protein containing the cytokines and growth factors. 실시양태에서, 내피 세포는 인간 내피 세포이다; In embodiments, the endothelial cells are human endothelial cells; 또 다른 실시양태에서, 세포는 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)이다. In another embodiment, the cell is a human vein endothelial cells: a (HUVEC human umbilical vein endothelial cell). 세포 배양물에서 혈관신생을 유도하는 방법의 실시양태에서, 세포는 약 40,000개 이상의 세포/㎠의 밀도로 시딩된다. In the exemplary cell of the method for inducing angiogenesis in culture aspect, cells are seeded at a density of at least about 40,000 cells / ㎠. 실시양태에서, 세포는 약 80,000개 이상의 세포/㎠의 밀도로 시딩된다. In embodiments, cells are seeded at a density of at least about 80,000 cells / ㎠. 실시양태에서, 세포 배양물을 성장 배지 및 본 개시내용의 태반 추출물을 포함하는 플레이트 상에서 성장시킬 수 있다. In embodiments, the cells may be grown on the culture plate containing growth medium, and placenta extract of the present disclosure.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물 중에서 생체물질을 인큐베이션시키는 단계, 및 숙주에 생체물질을 이식하는 단계를 포함하는, 생체내 생체물질의 혈관화를 유도하는 방법을 포함한다. The present disclosure also includes a method of inducing vascularization of the present disclosure, human placenta comprising: incubating the biological material from the composition comprising the extract, and a host comprising the step of transplanting the biological material, in vivo substances do. 실시양태에서, 생체물질은 자연 유래된 물질 및/또는 세포를 포함한다. In embodiments, the biological material comprises a naturally occurring substances and / or cells. 실시양태에서, 생체물질은 인간 유래된 매트릭스 물질을 포함하는 조작된 바이오스캐폴드를 포함한다. In embodiments, the biological material comprises a cache operation BIOS folds comprising a human-derived the matrix material. 실시양태에서, 조작된 바이오스캐폴드는 인간 제정맥 스캐폴드를 포함한다. In embodiments, the BIOS cache operation comprises a folding back the human vein scaffold. 실시양태에서, 인간 제정맥 스캐폴드는 세포가 제거된 것이다. In embodiments, the human vein scaffold is a cell is removed. 일부 실시양태에서, 생체 물질에 내피 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 인간 내피 세포(예컨대, HUVEC)가 시딩된다. In some embodiments, it is to endothelial cells in a biological material, such as, but not limited to, are the seeding human endothelial cells (e.g., HUVEC). 본 개시내용의 실시양태에서, 생체물질은 HUVEC가 시딩된 인간 제정맥 스캐폴드를 포함하는 조작된 스캐폴딩 물질을 포함한다. In embodiments of the present disclosure, the biological material is a malformed scaffolding materials, including the human vein scaffold is seeded with HUVEC. 일부 실시양태에서, HUVEC는 약 40,000개 이상의 세포/㎠ 상의 세포 밀도로 바이오스캐폴드 상에 시딩된다. In some embodiments, HUVEC will cache BIOS into the cell density on the at least about 40,000 cells / ㎠ is seeded on the folds. 실시 양태에서, HUVEC는 약 80,000개 이상의 세포/㎠ 이상의 밀도로 시딩된다. In embodiments, HUVEC are seeded in at least about 80,000 cells / ㎠ or more density. 실시양태에서, 생체물질은 약 2시간 이상 태반 추출물 중에서 인큐베이션된다. In embodiments, the biological material is incubated in a placenta extract more than about 2 hours.

생체물질 및 조작된 바이오스캐폴드의 Of the biological material and a capping operation BIOS fold 혈관화 Vascularization

본 개시내용은 또한 조작된 생체물질, 자연 유래된 생체물질, 및 숙주에 이식되는 다른 생체물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 생체물질을 혈관화하는 방법을 포함한다. The present disclosure also includes other biological material to be transplanted to the operation biological material, nature-derived biomaterials, and the host comprises a method for the vascularization one, the biological material is not limited to this. 생체물질의 혈관화 이외에도, 본 개시내용의 태반 추출물로 생체물질을 처리하는 것은 또한 생체 수용성에 도움을 주며, 염증을 감소시키고, 거부 및 흉터형성을 감소시키는 등의 위해 생체내 이용을 위해 생체물질을 전처리하는데 사용될 수 있다. Biomaterials for in vivo use for such which in addition to vascularization of a biological material, is to process the biological material to a placenta extract of the present disclosure also gives the help bio-soluble, reduces inflammation and reduces rejection and scarring the can be used for pretreatment. 따라서, 본 개시내용의 태반 추출물 및 본 개시내용의 태반 추출물을 포함하는 조성물은 상기 이식의 결과를 향상시키기 위해 임의의 많은 생체물질을 "투여"하는 데 사용될 수 있다. Accordingly, the composition comprising a placenta extract, placental extract, and the disclosure of the present disclosure may be used to "administration" any number of the biological material to improve the outcome of the transplant.

본 개시내용은 또한 구체적으로, 본 개시내용의 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물 중에서 인큐베이션된 인간 유래된 기질 물질을 비롯한, 조작된 생체물질, 예컨대, 이식가능한, 조작된 바이오스캐폴드를 포함한다. The present disclosure also includes a detail, including the human-derived the matrix material are incubated in a composition comprising a human placenta extract of this disclosure, engineered biological material, for example, implantable, the operation BIOS cache fold. 본 개시내용의 바이오스캐폴드는 포유동물, 예컨대, 인간에 이식될 수 있다. BIOS cache folds of the present disclosure may be transplanted into mammals, e.g., humans. 본 개시내용의 바이오스캐폴드는 숙주에 이식하는 데 적합한 임의의 생체물질을 포함할 수 있다. BIOS cache folds of this disclosure may comprise any of the biological material suitable for implantation into a host. 본 개시내용에서의 사용을 위한 바이오스캐폴드의 예로는 조직, 매트릭스 물질, 임의 개수의 자연 유래된 생체물질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. BIOS cache Examples of folding for use in the present disclosure include, organization, matrix materials, naturally derived biomaterials and so on of any number, and the like. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 2D 또는 3D 바이오스캐폴드이다. In embodiments, the BIOS cache fold is a 2D or 3D BIOS cache fold. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 인간 유래된 기질 물질을 포함한다. In embodiments, the BIOS cache folds comprises a human-derived the substrate material. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 세포가 제거된 인간 제정맥 스캐폴드를 포함한다. In embodiments, the BIOS cache folds comprises a human vein claim scaffold cells are removed. 실시양태에서, 바이오스캐폴드에 세포, 제한하는 것은 아니지만, 인간 세포, 인간 내피 세포(예컨대, 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)), 줄기 세포, 다른 다분화능 세포 등이 시딩된다. In embodiments, such as the BIOS cache cell to fold, but are not limited to, human cells, human endothelial cells (e.g., human claim vein endothelial cells (HUVEC)), stem cells, the multipotent cells are seeded other.

하기 실시예에 기술되는 바와 같이, 본 개시내용의 태반 추출물 중에서 인큐베이션된 본 개시내용의 바이오스캐폴드는 혈관신생 유도 화합물 BMM 또는 대조군 화합물 중에서 인큐베이션된 바이오스캐폴드보다 더 많은 혈관화(예컨대, 혈관신생) 및 더 적은 섬유화를 유도한다. As will be described in the following Examples, the BIOS cache folds of the present disclosure the incubation from the placental extract in the present disclosure is more vascularized than the BIOS cache fold incubated in angiogenesis-inducing compound BMM or a control compound (e. G., Angiogenesis ) and induce less fibrosis. 본 개시내용의 태반 추출물 중에서 인큐베이션된 바이오스캐폴드는 또한 BMM 또는 대조군 중에 인큐베이션된 바이오스캐폴드와 대조적으로, 면역 억제 및 혈관신생유발 양성 대식세포(예를 들어, CD205(M2)) 대 염증유발 양성 대식세포, 예컨대, (CD86(M1))을 더 높은 비율로 가졌다. The BIOS cache fold incubated in placenta extract of the present disclosure is also in contrast to the BIOS cache fold incubated in BMM or control, immunosuppression and blood phagocytes positive for start-induced (e.g., CD205 (M2)) for inflammatory positive macrophages, for example, had a (CD86 (M1)) at a higher rate.

혈관신생 스크리닝 검정법 Angiogenesis assays for screening

본 개시내용의 태반 추출물이 세포 배양물에서 혈관신생을 유도하기 때문에, 혈관신생 조절 인자의 확인 및 스크리닝을 위한 우수한 검정법을 제공한다. Because the placenta extract of the present disclosure to induce angiogenesis in cell culture, and provides a superior assay for the identification and screening of angiogenesis regulators. 따라서, 본 개시내용은 또한 혈관신생 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 검정법을 포함한다. Thus, the present disclosure also includes a method and assay for identifying an angiogenesis regulator.

실시양태에서, 본 방법은 본 개시내용의 인간 태반 추출물을 포함하는 화합물의 존재하에서 인간 내피 세포의 배양물을 배양하는 단계 및 인간 내피 세포 배양물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. In embodiments, the method includes the step of contacting step and human endothelial cell culture to cultivate the cultures of human endothelial cells in the presence of a compound including a human placenta extract of the present disclosure and the test compound. 태반 추출물이 세포 배양물에서 혈관신생을 유도하기 때문에, 혈관신생이 예상한 것보다 더 적거나 많은 경우, 시험 화합물은 혈관신생 조절 인자인 것으로 확인될 수 있다. Because the placenta extract to induce angiogenesis in cell culture, if fewer or more than one angiogenesis expected, the test compound may be found to be angiogenic regulators. 따라서, 본 방법은 또한 배양물 중 혈관신생의 양을 측정하는 단계 및 세포 배양물 중 혈관신생 양이 시험 화합물 부재하에서 성장된 배양물 중의 혈관신생 양보다 더 많거나 더 적을 경우, 시험 화합물을 혈관신생 조절 인자로서 확인하는 단계를 포함한다. Therefore, when the method is also incubated the angiogenic amount of the step of measuring the amount of angiogenesis and cell culture of water more or less than the angiogenic amount of a culture growing under the test compound member, blood vessel and the test compound and a step to determine a new adjustment factor. 실시양태에서, 시험 화합물 부재하에서 성장된 배양물 대비 혈관신생 양의 증가는 시험 화합물이 혈관신생을 유도한다는 것을 나타낸다. In embodiments, the culture compared to the increase of angiogenesis like growth under the test compounds member indicates that the test compound induced angiogenesis. 시험 화합물 부재하에서 성장된 배양물 대비 혈관신생 양의 감소는 시험 화합물이 혈관신생을 억제한다는 것을 나타낸다. The culture vessels reduces contrast of the new amount of growth under the test compounds member indicates that the test compound inhibits angiogenesis. 하기 실시예에 기술되는 바와 같이, 본 개시내용의 방법에 따라 화합물 트롬보스폰딘 1(TSP-1)은 스크린을 통해 화합물이 혈관신생의 억제제인 것으로 확인되었다. As will be described in the following Examples, the compounds thrombospondin 1 (TSP-1) according to the method of the present disclosure was found to be the compound is an inhibitor of angiogenesis through the screen. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 인간 태반 추출물의 존재하에서 성장된 내피 세포 배양물을 포함하는, 혈관신생 조절 인자를 확인하기 위한 시험 화합물 스크리닝 검정법을 제공한다. The present disclosure also provides assays for screening test compounds to determine, angiogenesis modulators, including the endothelial cell cultures grown in the presence of human placenta extract of the present disclosure. 본 개시내용의 검정법은 혈관신생 조절 인자를 확인하는 본 개시내용의 방법과 함께 이용될 수 있다. Assay of the present disclosure may be used with the method of this disclosure to determine the angiogenesis regulator.

지속적 전달 방법 및 조성물 Continuous transmission methods and compositions

태반 추출물의 혈관신생 효과는 생체내에서 또는 생체물질(예컨대, 조직, 세포 배양물, 바이오스캐폴드 등)에서 장기간 동안 지속될 수 없기 때문에, 본 개시내용의 PE의 서방형 조성물 및 지속적인 방출 방법 또한 본 개시내용에서 제공된다. Angiogenic effect of the placenta extract is because it can not last for a long period of time in a living body or a biological material (e.g., tissue, cell culture, BIOS cache folds, etc.), sustained release composition and sustained release method of the PE of the present disclosure also present It is provided in the disclosure.

본 개시내용의 실시양태는 서방형/인간 PE 조성물을 제공하도록 생분해성 미세입자에 커플링된 본 개시내용의 인간 PE(hPE)를 포함하는 조성물을 포함한다. Embodiments of the present disclosure includes a composition comprising a sustained release / biodegradable to provide human PE composition St. human PE of the coupling of this disclosure the microparticles (hPE). PE 적재된 생분해성 미세입자가 서방형 혈관신생 조절용 조성물을 제공한다. The PE is loaded biodegradable microparticles provide sustained release angiogenic composition adjustment. 따라서, 실시양태에서, 서방형 혈관신생 조절용 조성물은 인간 PE가 미세입자로부터 방출될 수 있도록 미세입자에 인간 PE가 커플링되어 있는, 본 개시내용의 인간 PE 및 생분해성 미세입자를 포함한다. Thus, in embodiments, the sustained-release composition comprises an angiogenesis regulating human PE and biodegradable microparticles of the present disclosure, in the micro-particles are human PE is coupled to a human PE can be released from the microparticles. 실시양태에서, 인간 PE는 인간 태반 샘플로부터 수득되고, 혈액 및 고형물이 상기 추출물로부터 실질적으로 제거되고, 여기서, 상기 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 비롯한, 태반 샘플 중에 존재한 단백질을 포함한다. In embodiments, human PE is obtained from human placenta samples, blood, and the solids are substantially removed from the extract, wherein said extract comprises a protein present in the placenta sample, including cytokines and growth factors. 서방형 혈관신생 조절용 조성물에서 사용되는 인간 PE는 상기 기술된 바와 같은 인간 PE의 임의의 실시양태일 수 있다. Human PE used in the sustained-angiogenic composition adjustment may yangtaeil any embodiment of the human PE as described above.

실시양태에서, 인간 PE는 생체내 또는 시험관내에서 세포에의 노출시 미세입자로부터 방출된다. In embodiments, human PE is discharged from the fine particles upon exposure of the cells in vivo or in vitro. 실시양태에서, 생분해성 미세입자가 생체내에서 숙주에 있을 때, 또는 시험관내에서 세포 배양물 또는 세포가 시딩된 바이오스캐폴드와 접촉하고 있을 때, 생분해성 미세입자는 시간이 경과함에 따라 PE를 분해하고, 주변 세포, 조직 등으로 방출하기 시작한다. In embodiments, the biodegradable when fine particles is in contact with when in a host in vivo or in vitro cell culture or BIOS cache fold the cells are seeded in biodegradable microparticles is a PE with time It begins to decompose and release the peripheral cells, tissues, and the like. 실시양태에서, 생분해성 미세입자는 PE의 초기 버스트를 방출한 후, 지속적인 기간에 걸쳐(예컨대, 수일, 수일 등) PE를 천천히 방출한다. In embodiments, the biodegradable microparticles after the initial burst release of the PE, the release over a sustained period of time (e.g., days, days, etc.) PE slowly. 미세입자의 방출 프로파일은 미세입자의 크기, 및 가교결합도를 달리함으로써 조절될 수 있다. Release profile of the microparticles can be adjusted by varying the diameters of the produced microparticles and degree of crosslinking. 실시양태에서, 미세입자는 가교결합된 미세입자이고, 입자의 방출 파라미터를 변형시키기 위해 가교결합도는 조절될 수 있다. In embodiments, the fine particle is a fine-particle cross-linking, degree of crosslinking in order to modify the release parameters of the particles can be controlled.

실시양태에서, 생분해성 미세입자는 젤라틴으로 제조된다. In embodiments, the biodegradable microparticles are made of gelatin. 젤라틴 생분해성 미세입자의 실시양태에 관한 추가의 상세한 설명은 하기 실시예 2에서 기술된다. Additional details regarding embodiments of gelatin biodegradable microparticles are described in Example 2. 실시양태에서, 생분해성 미세입자는 상이한 크기의 미세입자로 이루어진 혼합물을 포함한다. In embodiments, the biodegradable microparticles containing a mixture consisting of fine particles of different sizes. 상이한 크기의 입자가 다른 속도로 PE를 방출하는 바, 이에, 다양한 크기의 미세입자를 포함하는 것이 PE를 지속적으로 방출할 수 있을 것으로 간주된다. Bar which is of a different size particle discharge the PE at different speeds, to, and is therefore considered to include fine particles of various sizes can be continuously released into the PE.

실시양태에서, 생분해성 미세입자는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세입자이다. In embodiments, the biodegradable microparticles is poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles. 실시양태에서, hPE는 PLGA 미세입자에 적재된다(예컨대, 그에 캡슐화된다). In embodiments, hPE is loaded in the PLGA fine particles (e.g., encapsulated thereby). 실시양태에서, 본 개시내용의 hPE가 적재된 PLGA 미세입자의 평균 입자 크기는 약 10 내지 약 1,000 ㎛이다. In embodiments, the average particle size of the PLGA fine particle loading hPE of this disclosure is from about 10 to about 1,000 ㎛. 실시양태에서, PLGA 미세입자는 이중 균질화 단계를 포함하는 수중유 에멀젼 공정에 의해 제조된다. In embodiments, PLGA fine particles are produced by oil-in-water emulsion process comprising a double homogenization step. 실시양태에서, PLGA 미세입자는 PLGA 오일 용액을, 본 개시내용의 hPE를 포함하는 제1 수용액(W1)과 혼합하고, 제1 균질환 단계에서 PLGA 및 W1을 균질화하여 제1 에멀젼을 제거하고, 제1 에멀젼을, 물 중 용매(예컨대, 및 알콜, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 폴리비닐 알콜)를 포함하는 제2 수용액(W2)에 첨가하여 제2 에멀젼(수중유중수 에멀젼)을 형성한 후, 상기 용매는 증발시킴으로써 제조된다. In embodiments, PLGA microparticles are PLGA oil solution mixed with the first aqueous solution (W1) containing hPE of this disclosure, and by homogenizing the PLGA and W1 in the first fungus disease step removal of the first emulsion, and first after the first emulsion, the solvent in water (It is, for example, and alcohols, such as, but not limited to, polyvinyl alcohol) was added to the second aqueous solution (W2) containing form the second emulsion (oil-in-water emulsion) , the solvent is prepared by evaporation. 실시양태에서, 제2 에멀젼을 균질화하는 데 제2 균질화 단계가 사용된다. In embodiments, the second homogenization step to homogenize the second emulsion is used. 실시양태에서, 제1 균질화는 약 1 내지 약 2분 소요된다. In embodiments, a first homogenization takes about two minutes from about 1 to. 일부 실시양태에서, 어떤 다른 균질환 단계도 사용되지 않는다. In some embodiments, the bacteria do not use any other disease stage. 다른 실시양태에서, 제2 균질화 단계가 첨가된다. In another embodiment, the second homogenization step is added. 실시양태에서, 제2 균질화는 약 20초 내지 약 1분 소요된다. In embodiments, the second homogenization is approximately 20 seconds to about 1 minute. hPE가 적재된 PLGA 미세입자를 제조하는 방법의 실시양태에 관한 추가의 상세한 설명은 하기 실시예 3에서 제공한다. Additional detailed description of the embodiments of the method for manufacturing the PLGA fine particles hPE is loaded is provided in Example 3. 실시양태에서, 단일 균질화 단계로 제조된, hPE가 적재된 PLGA 미세입자의 크기는 직경이 약 100 내지 약 1,000 ㎛인 크기이다. In embodiments, the size of, the PLGA microparticles is loaded hPE made of a single homogenization step is a size having a diameter of about 100 to about 1,000 ㎛. 실시양태에서, 단일 균질화 단계가 약 2분 소요되는 경우, 생성된 미세입자의 크기는 직경이 약 50 내지 약 500 ㎛ 범위이고, 직경이 평균 약 260 내지 약 290 ㎛인 크기이다. In embodiments, when a single homogenization step takes about 2 minutes, the size of the resulting fine particles having a diameter of a range from about 50 to about 500 ㎛, a size of a mean diameter from about 260 to about 290 ㎛. 실시양태에서, 약 1 min의 제2 균질화 단계로 제조된, hPE가 적재된 PLGA 미세입자의 크기는 직경이 약 20 ㎛ 미만 내지 약 100 ㎛ 범위이고, 직경이 평균 약 36 내지 약 40 ㎛이다. In embodiments, the size of the, PLGA microparticles with hPE is loaded made of a second homogenization step of about 1 min is a diameter of a range less than about 20 ㎛ to about 100 ㎛, from about 36 to about 40 ㎛ diameter average. 실시양태에서, 약 20 sec의 제2 균질화 단계로 제조된, hPE가 적재된 PLGA 미세입자의 크기는 20 ㎛ 미만 내지 약 200 ㎛ 범위이고, 직경이 평균 약 85 내지 약 95 ㎛이다. In embodiments, wherein the, hPE the load size of the PLGA fine particle is less than 20 ㎛ to range from about 200 ㎛ made of the second homogenization step of about 20 sec, about 85 to about 95 ㎛ diameter average.

본 개시내용은 또한 PE의 지속적 방출을 위해 상기 기술된 서방형 혈관신생 조절용 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. The present disclosure also includes a method of using the above-described sustained release angiogenesis regulating composition for continuous release of PE. 실시양태에서, 본 방법은 시간이 경과함에 따라 생체내 또는 시험관내에서 인간 PE를 지속적으로 방출할 수 있도록, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 생체내 또는 시험관내에서 인간 PE를 생체물질(예컨대 , 세포 배양물, 조직, 조직 구조물, 바이오스캐폴드 등)로 지속적으로 방출할 수 있도록 하는 서방형 조성물을 사용하는 것을 포함한다. In embodiments, so that the method can be continuously released into the human PE in vivo or in vitro over time, for example, but are not limited to, the biological material of human PE in vivo or in vitro (e. G., Cells that allows for continuous release to the culture, tissue, tissue structures, BIOS cache folds, etc.) involves the use of a sustained release composition. 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 세포(예컨대, 배양물 중 세포, 생체내 세포, 생체물질 중 세포 또는 조작된 생체물질과 접촉하고 있는 세포 등)를, 본 개시내용의 태반 추출물에 커플링된 생분해성 미세입자를 포함하는 상기 기술된 서방형 혈관신생 조절용 조성물과 접촉시켜, 미세입자의 세포에의 노출 이후 일정 기간 동안에 걸쳐 인간 태반 추출물이 미세입자로부터 생체물질로 방출되도록 하는 단계를 포함한다. In embodiments, the method of the present disclosure of the cells (e.g., cells, biological cells, cells in contact with the cell or manipulated biological material of the biological material, etc. of the culture), coupled to the placenta extract of the present disclosure brought into contact with the biodegradable micro above-described sustained release angiogenesis regulating composition comprising a particle, and over a period of exposure after a period of time of the microparticles cells comprising such release by the biological material is human placenta extract from the fine particles . 실시양태에서, 세포는 내피 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)이다. In embodiments, the cells The endothelial cells, such as, but not limited to, a human claim vein endothelial cells (HUVEC).

실시양태에서, 서방형 혈관신생 조절용 조성물은 생체물질에 커플링된 것이다. In embodiments, the sustained release angiogenic composition adjustment is coupled to the biological substance. 실시양태에서, 생체물질은 세포 배양물이다. In embodiments, the biological material is a cell culture. 실시양태에서, 생체물질은 세포 배양물을 포함하는 조직 구조물 및/또는 조직 매트릭스이다. In embodiments, the biological material is a tissue structure and / or tissue matrix, including cell culture. 실시양태에서, 생체물질은 알기네이트 매트릭스에 포매되어 있는 세포(예컨대, 인간 세포, 예컨대, HUVEC)를 포함하는 알기네이트 매트릭스이고, 서방형 혈관신생 조절용 조성물(예컨대, hPE가 적재된 생분해성 미세입자) 또한 알기네이트 매트릭스에 포매되어 있거나, 또는 그와 접촉하고 있다. In embodiments, the biological material is alginate cells which are embedded in a matrix (e. G., Human cells, for example, HUVEC) alginate matrix, and the sustained release angiogenesis regulating composition (for example, the biodegradable microparticles of hPE is loaded containing the ) also it has or is embedded in the alginate matrix, or in contact with it. 실시양태에서, 서방형 혈관신생 조절용 조성물에 커플링된 생체물질은 피험체에 이식되고, 생체물질의 혈관화를 유도한다. In embodiments, the biological material is coupled to the slow release angiogenesis regulating composition is implanted in a subject, it leads to vascularization of a biological material. 실시양태에서, 생체물질은 인간 유래 기질 물질을 포함하는 조작된 바이오스캐폴드, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 인간 내피 세포가 시딩된, 세포가 제거된 인간 제정맥 스캐폴드이다. In embodiments, the biological material is the operation of the BIOS cache folds, for example, but are not limited to, human endothelial cells are seeded, the cell is removed, the human vein scaffolds containing human-derived substrate material. 실시양태에서, 피험체는 포유동물이다; In embodiments, a subject is a mammal; 실시양태에서, 피험체는 인간이다. In embodiments, a subject is a human. 본 개시내용의 서방형 혈관신생 조절용 조성물을 이용하여 혈관신생을 유도하는 다른 변형 방법도 가능하며, 본 방법의 예시적인 실시양태는 하기 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다. Using a slow release angiogenesis regulating composition of the present disclosure, and can also be further modification of the method for inducing angiogenesis, exemplary embodiments of the method are described in further detail in the Examples below.

항염증성 조성물 및 사용 방법 Antiinflammatory composition and method of use

하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 본 개시내용의 인간 PE 및 본 개시내용의 서방형/인간 PE 조성물이 주변 세포 및 조직에 항염증성 효과를 발휘하였다는 것 또한 밝혀졌다. As will be described in the Examples below, it has been found that this sustained release / human PE PE composition of the human and the disclosure of the present disclosure was exert anti-inflammatory effects on the surrounding cells and tissues as well. 따라서, 본 개시내용의 조성물은 또한 본 개시내용의 인간 PE 또는 서방형/인간 PE 조성물을 포함하는 항염증성 조성물을 포함한다. Thus, the compositions of the present disclosure also includes an anti-inflammatory composition comprising a human or sustained-PE / human PE composition of this disclosure. 본 개시내용의 방법은 또한 피험체 또는 조직을 본 개시내용의 인간 PE 또는 서방형 인간/PE 조성물에 노출시킴으로써 피험체에서, 또는 피험체의 조직에서 염증을 치료하는 방법(예컨대, 감소시키는, 호전시키는, 중화시키는, 예방하는 등의 방법)을 제공한다. The method of the present disclosure is further improved to a subject or a method by exposing the tissue to the present disclosure human PE or sustained-human / PE composition for the treatment of inflammation in a subject, or of a subject tissue (e.g., reduced provides that, neutralization method, such as to prevent that).

본 개시내용의 시험 및 방법에 관한 추가의 상세한 설명은 하기 실시예에서 제공된다. Additional detailed description of the tests and methods of the present disclosure is provided in the Examples below. 하기의 구체적인 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어느 경우에서든 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것이 아닌 것으로 해석되어야 한다. To specific examples are to be construed as not to limit the remainder of the disclosure illustrative only, in any case. 추가의 노력 없이도, 당업자는 본원의 기술 내용에 기초하여 본 개시내용을 최대한으로 이용할 수 있을 것으로 본다. With no additional effort, one of ordinary skill in the art are considered to be able to take advantage of the present disclosure on the basis of the description of the present application as possible. 본원에서 인용된 모든 공개 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. All publications cited herein are hereby incorporated herein by reference.

본 개시내용의 실시양태, 특히, 임의의 "바람직한" 실시양태는 단지 개시내용의 원리를 명백하게 이해하기 위해 기술된 것으로서, 단지 실행 가능한 예시라는 것이 강조되어야 한다. As the embodiment, particularly, any "preferred" embodiments in this disclosure are only techniques to clearly understand the principles of the disclosure, it should be emphasized that only a possible execution examples. 본 개시내용의 정신 및 원리로부터 실질적으로 벗어남 없이 상기에 기술된 본 개시내용의 실시양태(들)에 대해 많은 변형 및 수정이 이루어질 수 있다. For the embodiment (s) of the present disclosure described above without materially departing from the spirit and principles of the present disclosure may be made many variations and modifications. 상기의 모든 변형 및 수정은 본원에서 본 개시내용의 범주 내에 포함되고, 하기 실시양태에 의해 보호되도록 한다. All variations and modifications of the above will be protected by the embodiments below, it is included within the scope of the disclosure herein.

하기 실시예는 당업계의 숙련가에게 본 방법을 수행하고, 본원에 개시된 조성물 및 화합물을 이용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되는 것이다. The following examples are to be performed and the method to one skilled in the art and set forth in order to provide a complete disclosure and description of how to use the compositions and compounds disclosed herein. 수치와 관련하여(예컨대, 양, 온도 등) 정확도를 보장하기 위해 노력해 왔지만, 약간의 오차 및 편차에 대해 해명되어야 한다. In relation to the value it came try to ensure (e.g., amounts, temperatures, etc.), accuracy, and should be sheds for some errors and deviations. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 섭씨 온도(℃)이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가까운 압력이다. And a, parts are parts by weight unless otherwise specified, temperature is in degrees C (℃), the pressure is atmospheric pressure or a pressure close to atmospheric pressure. 표준 온도 및 압력은 20℃ 및 1기압으로 정의된다. Standard temperature and pressure are defined as 20 ℃ and 1 atmosphere.

비, 농도, 양, 및 다른 수치 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현될 수 있다는 것에 주의하여야 한다. Ratio, concentrations, amounts, and other numerical data is to be noted that the range can be expressed in form herein. 이러한 범위 형식은 편의상 간결하게 하기 위해 사용되는 것이며, 따라서, 범위의 한계로서 명확하게 언급된 수치값을 포함할 뿐만 아니라, 마치 각각의 수치값 및 하위범위가 명확하게 언급된 것과 같이 상기 범위 내에 포함되어 있는 모든 개별 수치값 또는 하위범위도 포함하는 유연한 방식으로 해석되어야 함을 이해하여야 한다. Such range format is included in the will be used for brevity sake of convenience, therefore, not only including the numerical values ​​explicitly stated as limits of the range, the range as if the are each numerical value and sub-range explicitly stated It is all the individual numerical values ​​or sub-ranges that shall be also understood that it should be interpreted in a flexible manner to include. 예시로서, "약 0.1% 내지 약 5%"인 농도 범위는 약 0.1 wt% 내지 약 5 wt%로 명확하게 언급된 농도를 포함할 뿐만 아니라, 명시된 범위 내의 개별 농도(예컨대, 1%, 2%, 3%, 및 4%) 및 하위범위(예컨대, 예컨대, 0.5%, 1.1%, 2.2%, 3.3%, 및 4.4%)도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. By way of example, "about 0.1% to about 5%," the concentration ranges from about 0.1 wt% to not only include the explicitly stated concentration of about 5 wt%, the individual concentrations (e.g., 1% in a specified range, and 2% , 3%, and 4%) and the sub-ranges (e.g., for example, should be construed to include 0.5%, 1.1%, 2.2%, 3.3%, and 4.4%). 한 실시양태에서, "약"이라는 용어는 수치값의 유효 숫자에 따라 전통적인 반올림을 포함할 수 있다. In one embodiment, the term "about" may include a conventional round-off in accordance with the significant digits of the numerical value.

실시예 Example

이제까지는 본 개시내용의 실시양태를 일반적으로 기술하였으며, 하기 실시예는 본 개시내용의 일부 추가적인 실시양태를 기술한다. So far was described in the general embodiment of the present disclosure, the following Examples describe some additional embodiments of the present disclosure. 본 개시내용의 실시양태는 하기 실시예 및 해당 본문 및 도면과 관련하여 기술되지만, 본 개시내용의 실시양태를 상기 기술 내용으로 제한하고자 하지는 않는다. Embodiments of the present disclosure and the following examples, but described in relation to the body, and drawing, but is not intended to limit the embodiments of the present disclosure with the above-described information. 그에 반해, 본 개시내용의 실시양태의 정신 및 범위 내에 포함되는 모든 대체물, 변형 및 등가물을 포함하는 것으로 한다. On the other hand, it is to cover all alternatives, modifications and equivalents included within the spirit and scope of embodiments of the present disclosure.

실시예 1 Example 1

태반 유래된 추출물을 이용한 생체외 In vitro using extracts derived from placenta 유래된 Derived 바이오스캐폴드에서의 혈관신생 유도 및 조절 Induction and regulation of angiogenesis in the BIOS caching fold

도입 Introduced

본 실시예는 복합 인간 태반 추출물(PE)을 이용한 혈관화를 유도하는 방법을 기술한다. This Example describes a method of inducing vascularization by using a composite of human placenta extract (PE). PE는 인간 태반에서 유래되며, 2D 및 3D 시험관내 모델에서뿐 아니라, 생체조작된 조직 이식체 내의 생체내 혈관신생을 유도할 수 있다. PE is derived from human placenta, as well as 2D and 3D in vitro model, it is possible to induce in vivo angiogenesis in vivo engineered tissue implants. 본 실시예는 또한 태반 추출물을 이용하여 현재 시험관내 모델에 비해 감수성이 증가된 혈관신생 억제 단백질로서 트롬보스폰딘 1을 효과적으로 스크리닝하는 것을 기술한다. This embodiment is also described that effectively screened thrombospondin 1 as an angiogenesis inhibiting protein the sensitivity is increased compared to the current in vitro model using a placental extract. 특히, 본 모델은 혈관신생의 속도 및 유형(장 중첩 대 발아)에 대한 조절을 가능하게 하고, 통상의 접근법에 비해 많은 이점 뿐만 아니라, 재생 의학 및 약학 분야에 폭넓은 적용을 제시한다. In particular, the present model presents a wide application range in regenerative medicine and pharmacy as well as a number of advantages, as compared with the conventional approach and enables the control, of the speed and type of angiogenesis (Chapter overlap for germination).

조직 내에서 물질 전달의 한계는 효과적인 생체물질을 제조하는 데 하나의 장애가 된다. Limit of the mass transfer in the tissue is a failure to manufacture an effective biological material. 인간 바이오스캐폴드 내에서 세포 이동을 개선시켜 이러한 장애를 일시적으로 극복할 수 있다 하더라도, 효과적인 맥관 구조의 생성은 장기간에 걸쳐 두껍고, 세포가 조밀한 물질에 영양을 제공하는 중요한 목표가 여전히 남아 있다. Even improves the cell migration in human BIOS caching folds can be temporarily overcome these barriers, the creation of effective vasculature is an important goal to provide nutrition to the thick, dense materials cells over a long period of time remains. 성인에서, 새로운 혈관은 궁극적으로 영양이 풍부한 혈관 네트워크를 형성하는 혈관신생의 생리학적 과정을 통해 주로 생성된다 47 . In the adult, the new blood vessels are primarily generated by the physiological processes of angiogenesis, which ultimately forms a nutrient-rich vascular network 47. 본 실시예는 혈관신생이 인간 제정맥(HUV) 혈관 이식편에서 유도될 수 있으고, 장기간 영양 전달 시스템을 가져올 수 있다는 것을 증명하였다. This embodiment is demonstrated that angiogenesis is and be able to be derived from the human vein (HUV) vascular graft, can bring long-term nutritional delivery system.

혈관신생 조절 인자를 통하여 조작된 기관의 성공적인 혈관화 및 경색 조직의 생체내 수복은 성공적인 제생 의학 요법을 임상으로 전달하는 데 있어 주된 장애가 되어 왔다. In vivo successful restoration of vascularization and infarct tissue engineered organs through angiogenesis regulatory factor has been the main obstacle here to deliver a successful therapy in clinical medicine jesaeng. 직접적인 세포 시딩(단일 및 공동 배양), 줄기 세포, 및 인간 유래 조절 인자/성장 인자의 조합을 포함하는 여러 가지 다양한 접근법이 혈관신생을 개시하고, 더 큰 혈관 형성을 유도하는 데 동원되었다. Direct cell seeding (single or co-culture), stem cells, and a number of different approaches including a combination of human-derived regulatory factor / growth factor was mobilized to initiate angiogenesis and induce greater vascularization. 지금까지, 전형적으로 비인간 동물 화합물을 이용하는 시험관내 접근법을 임상으로 전환하는 데에는 거의 성공을 거두지 못하였다. So far, without success There was hardly a typical transition in vitro approaches using non-human animals, the compounds in clinical.

본 분야의 중요한 쟁점은 가장 일반적이고/성공적인 접근법(마트리겔 또는 기저막 매트릭스)이 엔젤브레스-홀름-스웜 마우스 육종 세포로부터 유래되고, 이로써 인간 요법에는 부적절하다는 것이다. Important issues in this field are the most common / successful approaches (or Matrigel basement membrane matrix) Angel Breath-Holm-Swarm mouse sarcoma cells are derived from, and thus that there is inadequate human therapy. 따라서, 시험관내 및 생체내 시스템, 둘 모두에서 혈관 형성을 활발하게 촉진하는 인간 기반 물질을 이용하는 접근법 또는 기전은 상당한 영향을 미칠 것이다. Accordingly, approaches or mechanisms both in vitro and in vivo systems, both using a human-based material which actively promotes angiogenesis will have a significant effect. 본 실시예는 2D 및 3D 시험관내 모델에서뿐 아니라, 생체조작된 조직 이식체 내에서 혈관신생을 유도할 수 있는 인간 태반 추출물(hPE)을 제공한다. The present embodiment provides a 2D and 3D test human placental extracts as well as in vitro models, can induce angiogenesis in vivo, engineered tissue implant (hPE). PE는 활성 인간 생체분자의 복합체이고, 본 실시예는 생체외 유래된 인간 제정맥 혈관 이식편에서 생체내 및 시험관내 혈관신생을 유도하는 것 이외에, 이 모델이 혈관신생의 속도 및 단계를 조절할 수 있다는 것을 증명한다. PE is a composite of the active human biological molecule, and that this embodiment in addition to induce in vivo and in vitro angiogenesis in a human claim vein grafts derived from in vitro, this model is to control the speed and phase of angiogenesis It proves that. 본 실시예는 또한 PE가 투여된 콜라겐 기반 바이오스캐폴드를 이용하여 섬유화를 감소시키면서 모세혈관 형성을 개선시킨다는 것을 증명한다. This example also demonstrates that of improving the capillary formation while reducing the fibrillation using a collagen-based BIOS cache fold the PE was administered.

방법 Way

태반 추출물 유도 . Placenta extract derived. 만삭 태반을 UF 헬쓰 쉔즈 하스피탈(UF Health Shands Hospital: 미국 플로리다주 게인즈빌)에서 출산 12시간 이내에 수집하였다. It was collected at birth within 12 hours: a full-term placenta UF health swenjeu Haas Hospital (Florida, Gainesville UF Health Shands Hospital). 제대 및 태아막을 제거하고, 태반을 2 cm 큐브로 절개하여 냉동하였다. Remove umbilical and fetal membrane, which was then frozen and cut into 2 cm cubes the placenta. 1℃/min의 속도로 -86℃까지 점진적으로 냉동시키고 12시간 후에, 태반 큐브를 4℃로 유지되는 냉각실로 옮겨 나머지 과정을 완료하였다. 1 ℃ / min at a rate of progressively freezing and after 12 hours up to -86 ℃, the placenta cubes were transferred to complete the rest of the process is maintained in the cooling chamber 4 ℃. 4℃에서, 100 그램의 조직을 150 mL 냉 3.4 M NaCl 완충제(1 L 증류수 중 198.5 g NaCl, 12.5 ml 2 M 트리스, 1.5 g EDTA, 및 0.25 g NEM)과 혼합하였다. At 4 ℃, was mixed with 100 grams of tissue 150 mL cold 3.4 M NaCl buffer (1 L of distilled water of 198.5 g NaCl, 12.5 ml 2 M Tris, 1.5 g EDTA, and 0.25 g NEM). NaCl 완충제/조직 혼합물을 티슈텍 호모게나이저(Tissuetek Homogenizer)를 이용하여 3200 RPM으로 페이스트로 균질화한 후, 7000 RPM으로 15분 동안 원심분리하여 상청액으로부터 분리하였다. After the NaCl to the buffer / tissue mix using a Tissue Tek homogenizer (Homogenizer Tissuetek) homogenized into a paste with 3200 RPM, it was isolated from the supernatant by centrifugation for 15 minutes with 7000 RPM. 상기 NaCl 세척 공정을 추가 2회 반복하고, 매회 상청액을 폐기하여 혈액을 제거하였다. Add 2 times with the NaCl wash step and thereby remove the blood and discarding the supernatant each time.

이어서, 펠릿을 100 mL의 4 M 우레아 완충제(1 L 증류수 중 240 g 우레아, 6 g 염기, 및 9 g NaCl)에서 균질화하고, 자석 교반 플레이트에서 24시간 동안 교반한 후, 14,000 RPM으로 20분간 원심분리하였다(소발 RC6+ 센트리퓨즈(Sorvall RC6+ Centrifuge), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific: 미국 노스캐롤라이나주). 상청액을 제거하고, 멸균을 위한 2.5 ml 클로로포름 및 1 L의 TBS(1 L 증류수 중 6 g 트리스 염기 및 9 g NaCl) 중 8000 MW 투석관(스펙트럼 라보라토리즈, 인크.(Spectrum Laboratories, Inc.; 미국 캘리포니아주)을 이용하여 투석하였다. 완충제를 2시간 간격으로 신선한 TBS로 4회 이상 교체하였다. 최종적으로, 투석관의 내용물을 3000 RPM으로 15분간 원심분리(알레그라 X-12R 센트리퓨즈(Allegra X-12R Centrifuge), 베크만 쿨터, 인크.(Beckman Coulter, Inc.: 미국 캘리포니아주))하여 중합된 단백질을 제 Then, a homogenization of the pellet in 100 mL of 4 M urea buffer (1 L 240 g of urea, 6 g base of purified water, and 9 g NaCl) and stirred for 24 hours in a magnetic stir plate and then for 20 minutes and centrifuged at 14,000 RPM separation was (Nassau RC6 + sentry fuse (Sorvall RC6 + Centrifuge), Thermo Scientific (Thermo Scientific:., NC, USA), the supernatant removed, and of 2.5 ml of chloroform and 1 TBS (1 L of distilled water L for sterilization 6 g tris the with a base, and 9 g NaCl) of 8000 MW dialysis tubing (spectrum Labo gelato Leeds, Inc.. (spectrum Laboratories, Inc .; CA, USA) and dialyzed using a fresh TBS buffer for every 2 hours was replaced with four or more times finally, centrifuge for 15 minutes the contents of the dialysis tubing to remove 3000 RPM (Allegra X-12R Sentry fuse (Allegra X-12R centrifuge), Beckman Coulter, Inc.. (Beckman Coulter, Inc .: Calif.)) by polymerization the cost protein 하고, 상청액(분홍색 점성 용해액)을 수집하고, 사용할 때까지 -86℃에서 보관하였다. , And collecting the supernatant (pink viscous lysate) was stored at -86 ℃ until use.

생체분자 조성물 분석. Biomolecule composition analysis. 레이바이오테크, 인크.(Ray Biotech, Inc)로부터의 샌드위치 면역검정법 어레이(휴먼 사이토카인 안티바디 어레이 C 시리즈 1000(Human Cytokine Antibody Array C Series 1000, Inc: 미국 조지아주 GA, USA를 이용하여 상대적인 사이토카인 수준을 측정하였다. 화학발광은 포토/애널리스트 루미나리fx 워크스테이션(Foto/Analyst Luminaryfx Workstation)(포토다인 인코포레이티드(Fotodyne Incorporated: 미국 위스콘신주))을 이용하여 검출하고, 신호 강도는 토탈랩(TotalLab) 100 소프트웨어(넌리니어 다이나믹스 리미티드(Nonlinear Dynamics, Ltd: 영국))를 이용하여 측정하였다. 기저막 생체분자의 상대 존재비는 오비트랩 벨로스 프로(Orbitrap Velos Pro)(써모피셔(ThermoFisher: 미국 매사추세츠주 월섬))에 접속된 워터스 나노어퀴티 HPEC(NanoAcquity HPEC)(워터스(Waters: 미국 매사추세츠주 밀포드)) 시스템이 구비된 Ray Biotech, Inc. (Ray Biotech, Inc) sandwich immunoassays array (human cytokine Anti Body Array C Series 1000 (Human Cytokine Antibody Array C Series 1000, from Inc: United States, Georgia, GA, use the USA relative to Saito the cytokine levels were measured chemiluminescence is picture / analyst Lu buttercup fx workstation (Foto / analyst Luminaryfx workstation) (picture Dyne, Inc. (Fotodyne Incorporated: Wisconsin)) detected by the, the signal strength total rap (TotalLab) 100 software (Nonlinear Dynamics Ltd. (Nonlinear Dynamics, Ltd: UK)) and was a relative abundance of the basement membrane biomolecules Oviedo trap bellows Pro (Orbitrap Velos Pro) (Thermo Fisher (ThermoFisher measured using: Massachusetts U.S. Milford, MA)), the system comprising: a Waters nano control kwiti HPEC (NanoAcquity HPEC) (Waters (Waters connected to Waltham)) 나노 LC/MS/MS를 이용하는 MS바이오웍스(MSBioworks)(미국 미시간주 앤 아버)로 수행하였다. 단백질은 마스코트(Mascot) 데이터베이스 검색 엔진(미국 매사추세츠주 보스톤)을 이용하여 1차 서열 데이터 베이스로부터 확인하였다. Was performed by nano-MS Bio Works (MSBioworks) (United States, Michigan, Ann Arbor) using LC / MS / MS. Protein is using Mascot (Mascot) database search engine (Massachusetts Boston) check from primary sequence databases It was.

hPL 유도성 혈관신생의 네트워크로부터의 세포의 RT- PCR 분석 . hPL inductive RT- PCR analysis of cells from the network of angiogenesis. 상대적인 혈관신생의 유전자 발현은 384 웰의 RT 2 휴먼 안지오제네시스 RT 2 프로파일러 PCR 어레이(RT 2 Human Angiogenesis RT 2 Profiler PCR Arrays)(PAHS-024A: 미국 캘리포니아주 퀴아젠)를 이용하여 측정하였다. Gene expression relative angiogenesis is not RT 2 Human 384 wells Geo Genesis RT 2 Profiler PCR Arrays (RT 2 Human Angiogenesis RT 2 Profiler PCR Arrays) (PAHS-024A: State Qiagen, California) was measured using. EC를 아큐타아제(Accutase)(이노베이티브 셀 테크놀러지즈(Innovative Cell Technologies: 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 이용하여 배양 플레이트로부터 떼어내고, 100 ㎕의 RNA 레이터 (RNA later )에 즉시 보관하였다. Get the Accu EC kinase (Accutase) (Innovative Cell Technologies's Bay Creative (Innovative Cell Technologies: San Diego, Calif.)) Using the pay off from culture plates were immediately stored at (RNA later) of 100 ㎕ RNA concentrator. RNA를 RN이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(퀴아젠: 미국 캘리포니아주)를 이용하여 추출하고, 게놈 DNA를 RN아제-프리 DN아제 키트(RNase-Free DNase kit)(퀴아젠: 미국 캘리포니아주)를 이용하여 분해하였다. The RNA RN Easy Mini kit (RNeasy Mini Kit): Extraction using (Qiagen, Calif.), And genomic DNA RN Azay-free DN kinase Kit (RNase-Free DNase kit) (QIAGEN: California, USA) using a was digested. 정제된 RNA를 42℃에서 15분간 인큐베이션시킨 후, 이어서, 반응을 정지시키기 위해 95℃에서 5분간 인큐베이션시키는 RT 2 퍼스트 스트랜드 키트(RT 2 First Strand Kit)(SA 바이오사이언시스(SA Biosciences: 미국 텍사스주))를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. After the purified RNA was at 42 ℃ incubated for 15 minutes, then, RT 2 first-strand kit of from 95 ℃ incubated for 5 minutes to stop the reaction (RT 2 First Strand Kit) ( SA Bio Cyan System (SA Biosciences: Texas use the Note)) was reverse transcribed into cDNA. 이어서, cDNA를 RT 2 SYBR 그린 마스터믹스(RT SYBR Green Mastermix)(SA 바이오사이언시스: 미국 텍사스주)와 혼합하고 384 웰 휴먼 안지오제네시스 PCR 어레이스(Human Angiogenesis PCR Arrays)에 적재하였다. Subsequently, the Green Master Mix the cDNA RT 2 SYBR (RT SYBR Green Mastermix): were loaded on (SA Bio Scientific System State Texas, USA) and mixed Geo Genesis PCR Air Race (Human Angiogenesis PCR Arrays) not human 384 wells. 바이오 래드(Bio Rad) CFX384 리얼-타임 시스템(Real-Time System)(바이오 래드: 미국 캘리포니아주)을 이용하여 적재된 어레이 플레이트를 95℃에서 10 min 동안 변성화 사이클, 60℃에서 30 sec 어닐링/신장 사이클을 40회 거치고, 최종적으로 초당 ℃인 속도로 60℃에서 95℃로 램핑하여 용융 곡선을 얻었다. Bio-Rad (Bio Rad) CFX384 real-time system (Real-Time System) (Bio-Rad: California, USA) In the stacked array plate at 95 ℃ for 10 min denaturation Tuesday cycle, 60 ℃ by 30 sec annealing / go through 40 times the elongation cycle, finally obtaining a melting curve by ramping from 60 ℃ to 95 ℃ to ℃ per second rate. 데이터를 ΔΔC t 방법 및 RT 2 프로파일러 PCR 어레이 데이터 애널리시스 템플리트(RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template) v4.0 소프트웨어 패키지(퀴아젠: 미국 캘리포니아주)를 이용하여 분석하였다. The data ΔΔC t method and RT 2 Profiler PCR Arrays data aeneolrisiseu template (RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template) v4.0 software package, was analyzed by (Qiagen, California, USA).

인간 제정맥 내피 세포 단리 및 근섬유모세포 세포 배양 . The human venous endothelial cells, muscle stem cells isolated and cell culture. 내피 세포는 포스페이트 완충처리된 염수 중의 소 I형 콜라게나제 1 mg/ml 용액(기브코(Gibco), 인비트로겐(Invitrogen: 미국 뉴욕주))을 이용하여 혈관 벽으로부터 떼어낸 인간 제정맥(UF 헬쓰 쉔즈 하스피탈(미국 플로리다주 게인즈빌)로부터 수지)에서부터 얻었다. Endothelial cells of claim 1 mg / ml solution of bovine type I coke in phosphate saline treatment buffered collagenase (Gibco (Gibco), Invitrogen (Invitrogen: New York, USA)), the human claim vein using a removed from the blood vessel wall (UF Fitness swenjeu Haas Hospital from gained from the resin (note Gainesville, Florida)). 1차 유래된 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)는 모든 실험을 위해 1 내지 3회 계대접종물을 사용하였다. Primary human derived claim vein endothelial cells (HUVEC) was used as the inoculum passaged 1 to 3 times for all experiments. 증식을 위해, 세포를 완전 바스큐라이프 베이살 메디아(VascuLife Basal media)(바스큐라이프 VEGF 미디움 컴플리트 키트(VascuLife VEGF Medium Complete Kit), 라이프라인(Lifeline: 미국 메릴랜드주))를 이용하여 배양하였다. For proliferation, cell fully Bath queue Life Bay-year-old media (VascuLife Basal media) (Bath queue Life VEGF Medium Complete Kit (VascuLife VEGF Medium Complete Kit), Lifeline (Lifeline: Maryland, USA)) was incubated with. 혈관신생 실험을 위해, 내피 세포 배지는 500 mL에 25 ml의 글루타민, 0.5 ml의 하이드로코르티손, 0.5 ml의 아스코르브산, 10 ml의 FBS, 및 1.25 ㎕ bFGF를 포함하는 바스큐라이프 베이살 메디아(바스큐라이프 VEGF 미디움 컴플리트 키트, 라이프라인(미국 메릴랜드주))를 이용하여 제조하였다. To angiogenesis experiments, endothelial cell culture medium of 25 ml to 500 mL glutamine, 0.5 ml of hydrocortisone, ascorbic acid, 10 ml of 0.5 ml containing FBS, and 1.25 ㎕ bFGF years old Bath queue life bay media (Bath Life queue VEGF was prepared using Medium Complete kit Lifeline (Maryland)). 인간 근섬유 모세포(CRL 2854)는 5 내지 10회 계대접종물로 사용하였으며(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스), 10% FBS 보충된 낮은 글루코스 DMEM을 사용하여 배양하였다. Human muscle cells (CRL 2854) was used as the inoculum passaged 5-10 times and incubated with the (ATCC, Manassas, Virginia, USA), low glucose DMEM supplemented with 10% FBS.

태반 추출물 유래된 혈관신생 어세이의 제조 . Manufacture of placenta extract derived angiogenesis assay. 달리 언급하지 않는 한, 32 ㎕ 태반 추출물을 해동시키고, 96 웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하였다. One, was thawed and 32 ㎕ placenta extract, unless otherwise indicated, were pipetted into each well of a 96 well plate. 회전형 진탕기를 이용하여 1분 동안 30 RPM으로 추출물을 각 웰의 바닥 위에 고르게 코팅하였다. Times by using a typical shaker was coated evenly on the extract at 30 RPM for one minute on the bottom of each well. 이어서, 코팅된 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. Then, the coated plate was incubated at 37 ℃ for 30 minutes. 이어서, HUVEC을 20,000개의 세포/㎠, 40,000개의 세포/㎠, 또는 80,000개의 세포/㎠로 직접 피펫팅하여 플레이팅하였다. Then, the HUVEC were plated and plated directly pipette to 20,000 cells / ㎠, 40,000 cells / ㎠, or 80,000 cells / ㎠. 1일, 3일, 및 5일을 포함하여 여러 시점을 각 농도에서 조사하였다. 1, the different points in time, including 3 days, and 5 days were investigated at each concentration. 트롬보스폰딘 1을 내피 세포 배지에 희석된 최종 농도 0, 5, 10, 20, 및 35 ㎍/㎕를 이용하여 혈관신생 억제 약물로서 시험하였다. Using a thrombospondin the final concentration diluted 1 in endothelial cell medium 0, 5, 10, 20, and 35 ㎍ / ㎕ was tested as an angiogenesis inhibitory drug.

혈관신생 네트워크의 형태학적 특성화. Vascular morphological characterization of the new network. 내피 세포 배양 배지를 2 ㎍/mL 농도의 칼세인 AM(인비트로겐-라이프 테크놀로지즈(Invitrogen-Life Technologies: 미국 뉴욕주))으로 염색한 후 네트워크 형성을 분석하였다. Endothelial cell culture medium 2 ㎍ / mL concentration of the knife-old AM (Invitrogen-Life Technologies (Invitrogen-Life Technologies: New York, USA)) and then stained with the analyzed network formation. 암실에서, 염색된 세포를 37℃, 5% CO 2 에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 자이스 악시오버트 200 인버티드 플루오레센스 마이크로스코프(Zeiss Axiovert 200 Inverted Fluorescence Microscope)(자이스(Zeiss: 미국 뉴욕주 쏜우드))를 사용하여 영상을 촬영하였다. In the dark, and then the stained cells were incubated for 37 ℃, 30 min at 5% CO 2, then Zeiss Ill Make butt 200 Inverted fluorenyl sense microscope (Zeiss Axiovert 200 Inverted Fluorescence Microscope) ( Zeiss (Zeiss: USA the images were taken using a wood shot, NY)). 이미지J(ImageJ) 1.45s(NIH: 미국 메릴랜드주 베세즈다)를 이용하여 이미지를 분석하여 세관 길이, 세관 너비, 분기점, 및 다른 메쉬워크 특성화를 측정하였다. Image J (ImageJ) 1.45s (NIH: Maryland bay SEZ c) to analyze the image using the length of Customs, Customs width, branches, and other mesh work characterization was measured. 분기점을 분지가 만나거나, 세관의 발아가 이루어지는 모든 마디가 있는 위치로서 수동 지정하고, 세관 길이를 분기점에서부터 연결된 분기점까지의 곡선 길이를 측정하여 평가하였다. A branch point branched met or was manually specified as a position in which all nodes are germinated in customs made, and evaluated by measuring the length of a curve connected to the branch point from the branch point length customs. 세관 너비는 세관당 다른 세 구역, 시작과 끝으로부터 각각 10 ㎛씩인 두 구역 및 곡선 길이의 중앙부의 한 구역에서 측정하였다. Customs width was measured in a section of the central portion of 10 ㎛ ssikin two sections and curved lengths each from the other three zones, the start and end per customs. 도달 면적(%)은 이미지J 함수 "binary>>convert to mask"를 이용하여 영상을 프로세싱한 후, "평균"을 측정함으로써 측정하였다. Reached the area (%) was determined by measuring the after-processing an image using the image function J ">> convert binary to mask", "average". TSP-1 실험에서, 최종 값은 투여하지 않은 샘플에 대해 정규화하였고, 픽셀 값의 전체 계수에 상대적으로 "1" 값의 비율로서 계산하고 "도달 면적(%)"으로 제시하였다. TSP-1 in the experiment, the final values ​​were normalized to the non-administration sample was calculated as the relative ratio of the value "1" to the total count of the pixel values ​​and presented in a "reach areas (%)."

형태의 시차 주사 현미경 검사법 분석을 위해, 유리 슬라이드 사에서 성장시킨 미세혈관 네트워크를 2.5% 글루타르알데히드에 고정시키고, PBS 중에서 세척하고, 1% 사산화오스뮴 용액에 고정시키고, 25%, 50%, 75%, 85%, 95%, 및 3x100% 에탄올 용액 중에서 점진적으로 탈수시켰다. For the form of a differential scanning microscopy analysis, were fixed in 2.5% of the microvascular network grown in slide four glass glutaraldehyde, washed, and fixed in 1% four oxidation osmium solution in PBS, 25%, 50%, from 75%, 85%, 95%, and 3x100% ethanol solution was gradually dehydrated. 이어서, 샘플을 임계점에서 건조시키고, 금/팔라듐으로 코팅시키고, 히타치 S-4000 FE-SEM(Hitachi S-4000 FE-SEM)을 이용하여 영상화하였다. It was then imaged and the sample dried in a critical point, and coated with gold / palladium, using a Hitachi S-4000 FE-SEM (Hitachi S-4000 FE-SEM).

인간 제정맥 스캐폴드 유도 및 태반 추출물 인큐베이션 . The human venous scaffold derived placental extract and incubated. 태반을 UF 헬쓰 쉔즈 하스피탈플로리다(미국 플로리다주 게인즈빌)로부터 수집하고, 앞서 기술된 바와 같은 자동화 방법을 이용하여 HUV를 절개하였다. Collected from the placenta UF health swenjeu Haas Hospital Florida (Gainesville, Florida, USA), which was cut to HUV using the automated method as described above. 32 절개된 HUV 샘플을 용매/조직 질량 20:1(w:v)로 1% SDS(써모 사이언티픽, 미국 일리노이주 로크포드) 용액 중에서 세포를 제거하였다. 32 cut the HUV sample solvent / tissue mass 20: was removed: (v w) cells in 1% SDS (Thermo Scientific, IL, USA lock Ford) was added to 1. 샘플을 회전형 진탕기 플레이트 상에서 100 RPM으로 24시간 동안 세포를 제거하고, 이어서, PBS로 세척한 후, 37℃에서 밤새도록 PBS 중의 70 U/mL DN아제 I 용액(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스)) 중에서 인큐베이션시켰다. With 100 RPM the sample times on typical shaker plate for 24 hours to remove the cells, and subsequently, after washing with PBS, 70 U / mL DN kinase I solution in PBS overnight at 37 ℃ (Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich : incubation from St. Louis, Missouri, USA)). 샘플을 최종적으로 0.2% 과산화아세트산/4% 에탄올(시그마-알드리치: 미국 미주리주 세인트 루이스) 용액을 이용하여 2시간 동안 멸균시키고, 마지막으로 PBS를 사용하여 pH 평형을 맞추었다(7.4). Finally, the 0.2% peroxide, acetic acid / 4% ethanol samples: using (Sigma Aldrich St. Louis, Missouri, USA) solution was sterilized for 2 hours, and finally with PBS was adjusted to pH equilibrium (7.4). 세포 제거 후에, 스캐폴드를 1.5 cm x 1.5 cm x 0.075 cm 시트로 절단하고, -85℃로 미리 냉동시킨 후, 이어서, 밀락(Millrock) 벤치 탑 매니폴드 냉동 건조기(미국 뉴욕주 킹스턴)를 이용하여 10 mT 진공하에 -85℃에서 24시간 동안 동결 건조시켰다. After cell removal, cutting the scaffold into 1.5 cm x 1.5 cm x 0.075 cm sheet, and then pre-frozen at -85 ℃, then, using the milrak (Millrock) Benchtop freeze dryer manifold (Kingston, NY, USA) 10 mT and lyophilized for 24 hours at -85 ℃ vacuo. 세포 시딩 직전에, 스캐폴드를 2시간 동안 hPE, 마트리겔, 또는 PBS(대조군)에 침지시키고, 시딩하였다. Just before the cell seeding, the scaffold was immersed for 2 hours in hPE, Matrigel, or PBS (control group) and was seeded.

동물 이식 재혈관화 연구 . Animal studies vascularized implants. 수컷 스프라그-돌리(Male Sprague-Dawley) 래트(6개월령, 200 g)을 찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories)(미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 구입하였고, 모든 절차는 플로리다 대학(University of Florida) IACUC(UF#201207728)에 의해 허가받았다. Male Sprague - were purchased from Dolly (Male Sprague-Dawley) rats (6 months of age, 200 g) of the Charles River Labo gelato Leeds (Charles River Laboratories) (Massachusetts, Wilmington), all procedures University in Florida (University of Florida ) it was approved by the IACUC (UF # 201207728). 생물학적 후드에서, 최종 멸균된 HUV 스캐폴드를 5 mL의 hPE, 마트리겔, 또는 PBS(대조군)에서 각각 2시간 동안 인큐베이션시켰다. In a biological hood, it was the final sterilized HUV scaffolds incubated for 2 hours at 5 mL each of hPE, Matrigel, or PBS (control). 이소플루란 흡입을 이용해 동물을 마취시키고, 가위로 무딘 방식의 제조에 의해 등 좌측 및 우측에 피하 주머니를 만들었다. Isoflurane inhalation using anesthetized animal, created a subcutaneous pocket in the left and right such as by the production method of the blunt scissors. 한 스캐폴드를 각 피하 주머니에 삽입하고, 피부를 4-0 봉합사(코비덴(Coviden: 미국 매사추세츠주 맨스필드)))를 이용하여 봉합하였다. Insert the scaffold on each subcutaneous pocket, and suture the skin 4-0 (Kobe Den (Coviden: Mansfield, Massachusetts)) were sealed using). 이식 5일 후, 동물을 안락사시키고, 분석을 위해 샘플을 제거하였다. 5 days after the transplantation, the animals were euthanized, the sample was removed for analysis.

모세혈관 네트워크 형성을 분석하기 위해, 동물로부터 제거 후 즉시, 섬유화 캡슐을 메스로 절개하고, HUV 샘플을 유리 슬라이드 위에 놓았다. In order to analyze the capillary network formed, cut immediately, fibrotic capsule was removed from the animal with a scalpel, and placed the sample on the glass slide HUV. 악시오캠(Axiocam) HRm 디지털 카메라(자이스: 독일 오버코헨)가 장착된 이미저(Imager) M2 광학 현미경(자이스: 독일 오버코헨)을 이용하여 반투명 스캐폴드 시트의 하향식 영상을 촬영하였다. Ill Make cam (Axiocam) HRm camera (Zeiss: Germany over Cohen) is equipped with an imager (Imager) M2 optical microscope was taken by using a (Zeiss, Germany over Cohen) a top-down image of the translucent sheet scaffold. 세포 이동 및 스캐폴드 리모델링을 정량화하기 위하여, 조직 샘플을 Neg-50 냉동 절편 매질에 표매시키고, 7 ㎛ 절편(마이크로 HM550(Microm HM550) 크라이오스탯, 써모 사이언티픽: 미국 매사추세츠주 월섬)으로 절단하고, 표준 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(리차드-알란 사이언티픽(Richard-Alan Scientific: 미국 미시간주 칼라마주))을 이용하여 염색하였다. To quantify cell migration and scaffold remodeling, pyomae tissue samples in Neg-50 frozen sections medium and, 7 ㎛ fragment (micro HM550 (Microm HM550) cryo stats, Thermo Scientific: US Waltham, Mass) was cut with a standard hematoxylin and eosin (H & E) staining (Richard-Allan Scientific (Richard-Alan Scientific: Kalamazoo, Michigan, USA)) was dyed using.

통계 . Statistics. 결과는 평균 ± 표준 편차로 기록한다. The results are recorded as mean ± standard deviation. 선형 회귀는 SPSS(IBM: 미국 뉴욕주 소머스)를 이용하여 수행하였다. Linear regression SPSS: was carried out using the (IBM Somers, New York, USA). Rt-PCR 데이터는 RT 2 프로파일러 PCR 어레이 데이터 애널리시스 소프트웨어 v3.2(SA바이오사이언시스(SABiosciences: 미국 캘리포니아주 발렌시아))를 이용하여 분석하였다. Rt-PCR data is RT 2 Profiler PCR Arrays data aeneolrisiseu v3.2 software (Bio SA Cyan System (SABiosciences: Valencia, California)) were analyzed by.

관류 생물반응기 배양 및 HUV Perfusion bioreactor cultures and HUV 바이오스캐폴드에서 혈관신생 유도 . BIOS caching induced angiogenesis in the fold. 세포가 시딩된 관상 구조물을 이중 관류 생물반응기(도 7)에서 5일 동안 60 펄스/min으로 내강 유속 4 mL/min으로 배양하였다. A tubular structure the cells are seeded for 5 days in a dual-perfusion bioreactor (Figure 7) were incubated at 60 pulse / min to the lumen flow rate 4 mL / min. 혈관 벽에 전단 응력은 배지 흐름이 정상 상태이고, 층류 및 혈관은 비탄력적이고, 원통형이며, 일직선이라는 가정하, 하겐-포아즈(Haagen Poisseuille) 방정식을 이용하여 계산하였다: 134 And the shear stress on the blood vessel wall is a medium steady state flow, laminar flow, and blood vessels are inelastic and, a cylindrical, a straight line of home and, Hagen - was calculated according to the poise (Haagen Poisseuille) equation: 134

Figure pct00001

여기서, Q는 평균 부피 유속이고, μ 는 37℃에서의 물의 유동성 점도(0.000692 kg/(m*s))이다. Here, Q is the mean volumetric flow rate, μ is the viscosity of water fluidity (0.000692 kg / (m * s )) at 37 ℃. 134 전단 응력은 각 펄스 동안 0 다인/㎠ 내지 0.04 다인/㎠ 주기로 사이클링하였다. 134 shear stress cycling period was 0 dynes / ㎠ to 0.04 dynes / ㎠ during each pulse. 환경은 37℃ 및 5% CO 2 의 표준 세포 배양 조건하에 유지시켰다. Environment was maintained under standard cell culture conditions at 37 ℃ and 5% CO 2. 시스템 내의 압력은 내강 밖과 내강 흐름 순환 두 가지 모두에서 무시할 수준(<2 mmHg)으로 유지되어 스캐폴드를 가로지르는 압력 구배는 존재하지 않았다. The pressure in the system is the pressure gradient across the scaffold is maintained at a level (<2 mmHg) negligible in both the lumen and outside the lumen of the flow circulation is not present. 생물반응기 내에서 배양 배지는 2일마다 한번씩 보충하였다. Within the bioreactor culture medium it was supplemented once every two days. 관류 배양 5일 후, 10 cm 길이의 관상 스캐폴드를 조직학적 분석을 위해 링렛(ringlet)로 절개하였다. After 5 days perfusion cultivation, and cutting a tubular scaffold of 10 cm length in ringret (ringlet) for histological analysis.

결과 result

인간 태반 추출물의 유도 및 특성화 Induction and characterization of human placental extract

초기 기계적 균질화 및 원심분리 후, hPE 유도 기술은 우레아 단계를 이용하여 분자를 선형화하고 가용화하였다. After the initial mechanical homogenization and centrifugation, hPE induction technique was linearized molecules by using a urea-phase and solubilized. 이어서, 투석 분리하여 우레아를 제거하고, 생체분자가 원래 입체형태로 재폴딩하도록 하였다(도 1a). It was then isolated by dialysis to remove the urea, and the biomolecule to the folding member to the original three-dimensional shape (Fig. 1a). 유도의 모든 단계는 4℃ 냉각실에서 수행하였다. All of the steps of induction was carried out at 4 ℃ cooling chamber. PE의 최종 용액은 반투명하고, 점성이 높았으며, 8 kD 내지 868 kD 사이의 생체분자로 이루어졌다. The final solution of the PE were translucent and the viscosity was higher, consisted of a biomolecule between 8 kD to about 868 kD.

hPE를 생체물질에 침지실 수 있거나, 또는 조직 배양 어세이를 위해 박막으로제조할 수 있었다. Or may hPE chamber immersed in the biological material, or for tissue culture assays it was possible to produce a thin film. n¼3개의 hPE 배치(각 배치는 3명의 개별 기증자로부터 얻은 동일 질량의 조직을 사용하여 생성) 중의 전체 단백질 함량의 표준 편차를 분석함으로써 hPE의 재현성을 평가하였고, 이는 마트리겔®과 유사한 재현성 및 단백질 함량을 가지는 것으로 밝혀졌다. n¼3 of hPE arrangement (each batch is three generated using the same mass of tissue obtained from an individual donor) by analyzing the standard deviation of the total protein content in were evaluated for reproducibility of hPE, which is similar to the reproducibility and protein content and Matrigel ® It has been shown to have. 시차 주사 현미경 검사법 영상은 hPE의 표면 형태(도 1b-1c) 및 HUVEC를 hPE 박막 상에 4 x 10 4 개의 세포/㎠로 시딩하고, 3일 동안 배양하였을 때의 혈관신생 네트워크 형성(도 1d-1e)을 보여준다. Differential scanning microscopy imaging angiogenesis network formed when seeding the surface form (Fig. 1b-1c) and the HUVEC hPE to 4 x 10 4 cells / ㎠ hPE on the thin film and, for 3 days of culture (Fig. 1d- 1e) it shows.

인간 태반 추출물(hPE)의 혈관신생 잠재성은 초기에는 hPE로 코팅된 조직 배양 플레이트(TCP: tissue culture plate) 위에 1차 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)를 시딩함으로써 하여 특성화되었다. It was characterized by the seeding of the primary human vein endothelial cells (HUVEC) on: (tissue culture plate TCP) angiogenic potential of human placenta extract (hPE) castle initially coated with hPE tissue culture plate. 조기 단계의 세포 코딩 및 발아는 세포 시딩 후 1시간 이내에 육안으로 관찰되었고(데이터를 나타내지 않음), 혈관신생 네트워크는 3 일(d)째 실험 종료시까지 계속해서 성숙한 상태 그대로 유지되었다(도 1f-1g). Cells coding and germination of early stage cells was observed with the naked eye within after seeding 1 hour (not shown in the data), angiogenesis network has been retained by intact mature state until the end of the experiment at 3 il (d) (Fig. 1f-1g ). 개별 세포 코드(다세포)의 길이는 시딩 후 1일째(도 1c) 내지 3일째(도 1i) 사이에 유의적으로 증가하였다. The length of the individual cord cells (multicellular) was significantly increased between the first day after the seeding (Fig. 1c) to the third day (Fig. 1i). 배양 3일 후, 세포는 대조군 샘플에 비해 광범위한 혈관신생 네트워크를 형성하였다(도 1j, 1k). After the 3 day culture, the cells formed an extensive networks angiogenesis compared to the control sample (Fig. 1j, 1k).

태반 추출물의 생체분자 특성화 Biomolecular characterization of the placenta extract

평가된 120가지의 사이토카인 중, 54개의 혈관신생 관련 사이토카인이 태반 용해물에서 검출되었다(도 2a). Evaluation of the 120 kinds of cytokines, the 54 angiogenic related cytokines were detected in placental lysates (Fig. 2a). 가장 일반적인 혈관신생 관련 케모카인은 새로운 혈관 형성의 강력한 자극인자인 안지오게닌이었다 16 . Was the most common angiogenesis-related chemokines brought J, a powerful stimulating factor of formation of new blood vessels Nin 16. 간세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor), 섬유모세포 성장 인자-4(FGF4: fibroblast growth factor-4), 렙틴(LEP), ICAM-1, ICAM-2 및 TIMP-2를 포함하나, 이에 한정되지 않는 중요한 혈관신생유발 케모카인이 검출되었다. Hepatocyte growth factor (HGF: hepatocyte growth factor), fibroblast growth factor -4 (FGF4: fibroblast-growth factor 4), leptin (LEP), one containing the ICAM-1, ICAM-2, and TIMP-2, are not limited to this does not cause significant angiogenic chemokines were detected. LC-MS/MS 결과, 아넥신(ANXA1, ANXA2, ANXA4, 및 ANXA5), 호중구 디펜신(DEFA1), 인터류킨 인핸서 결합 인자(ILF2 및 ILF3), IL27, ITBG1, 및 MRC1을 비롯한 면역 관련 단백질이 존재하는 것으로 나타났다(도 2b). LC-MS / MS results, annexin (ANXA1, ANXA2, ANXA4, and ANXA5), neutrophil defensin (DEFA1), interleukin enhancer binding factor (ILF2 and ILF3), immune-related proteins, including IL27, ITBG1, and MRC1 is present showed that (Fig. 2b). LC-MS/MS를 사용하여 라미닌(LAMA2, LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2, LAMB3, 및LAMC1), 피브로넥틴(FN1), 헤파린 술페이트(HSPG2) 및 4형 콜라겐(COL4A1, COL4A2, 및 COL4A3)(도 2c)를 포함하는 혈관신생 관련 기저막(BM) 단백질 또한 검출되었으며(도 2c), 이들은 각각 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. LC-MS / using MS laminin (LAMA2, LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2, LAMB3, and LAMC1), fibronectin (FN1), heparin sulfate (HSPG2) and type IV collagen (COL4A1, COL4A2, and COL4A3) ( Fig. 2c) angiogenesis associated basement membrane (BM) protein was also detected, including a (Fig. 2c), which showed that each play an important role in angiogenesis. 17-20 17-20

hPE 유도성 혈관신생의 네트워크 내에서의 내피 세포 유전자 발현 hPE induced endothelial cell gene expression in the new network

케모카인 분석과 함께, HUVEC 유전자 분석으로 태반 추출물의 혈관신생 특징을 추가로 확인하였다. With chemokine analysis was confirmed by additional angiogenesis characteristic of placental extracts in HUVEC genetic analysis. RT-PCR 분석 결과, 3 일(d) 동안 hPE에 시딩된 내피 세포는 간세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 및 태반 성장 인자를 비롯한 광범위한 필수 혈관신생유발 유전자를 발현한 것으로 나타났다(도 2d). RT-PCR analysis, 3 (d) endothelial cells were seeded in hPE that express a wide range of essential genes induced angiogenesis, including hepatocyte growth factor, epidermal growth factor and placental growth factor for (Fig. 2d). 상향조절된 추가의 유전자로는 MMP2 및 MMP9를 포함하는데, 이들은 내피 세포 뿐만 아니라, ECM 리모델링과 연관된 다른 세포의 이동을 촉진시키기 위해 주변 세포외 매트릭스의 분해를 돕는 단백질 분해 효소이다 21 . In addition to the up-regulation of the gene comprises a MMP2 and MMP9, which, as well as endothelial cells, a protease to help the decomposition of the other surrounding extracellular matrix to promote the movement of the other cells 21 is associated with the ECM remodeling. 미세혈관계를 성숙화시키는 데 있어 기저막의 형성과 연관된 IV형 콜라겐 또한 상향조절되었다 22 . It crystallized to mature the microvasculature were adjusted also type IV collagen is associated with the formation of the base film 22 upward.

시험관내에서의 모세혈관 발생 및 형태 조절 Capillaries occur, and the form of the control of in vitro

지금까지, 시험관내 분석법은 혈관신생의 속도 및 단계를 거의 또는 전혀 조절하지 못하고 있다. So far, in vitro assays may fail with little or no regulation of the speed and phase of angiogenesis. 9 본 데이터는 시험관내 hPE 기반 혈관신생 어세이가 초기 세포 시딩 밀도를 변화시킴으로써 혈관신생 네트워크 형성의 성숙 및 형태를 제어하도록 조절될 수 있다는 것을 보여준다. 9 shows that the data can be controlled by an in vitro angiogenesis assay based hPE change the initial cell seeding density and shape so as to control the maturation of angiogenesis network formation. 1일 후, 40,000개의 세포/㎠의 밀도로 시딩된 HUVEC는 80,000개의 세포/㎠의 밀도로 시딩된 것과 비교하였을 때, 윤곽이 더욱 뚜렷한 세관을 형성하였지만, 5일째까지 두 밀도 모두로 시딩된 세포는 윤곽이 뚜렷한 세관을 가졌다(도 3a). After 1 day, seeded at a density of 40,000 cells / ㎠ HUVEC is compared to that seeding at a density of 80,000 cells / ㎠, although the outline is to form a more distinct customs, the cells are seeded into two density both by day 5 (Fig. 3a) had a well-defined customs. 이러한 결과는 세포 시딩 밀도를 달리함으로써 배양물을 hPE에 노출시킬 때, 네트워크 형성의 성숙화 단계가 제어될 수 있다는 것을 보여준다. This result, when exposing the culture to hPE by varying the cell seeding density, and shows that the maturation stage of network formation can be controlled. 예를 들어, 모세혈관 네트워크(평균 세관 길이[mm], 세관 밀도[#/㎟], 분기점[#/㎟], 메쉬[#/㎟], 및 평균 세관 너비[mm])의 정량적 영상 분석 결과(도 3c)는, 시딩 밀도가 높을수록 네트워크 성숙화 속도는 저속화된 것을 나타내었고(최장의 평균 세관 길이 및 최다 메쉬 개수/㎟에 도달하는 데까지 기간이 연장됨), 이는 네트워크 형성 기간이 연장될 수 있기 때문에 더욱 상세한 분석을 가능하게 한다. For example, the capillary network (average customs length [mm], customs density [# / ㎟], the branch point [# / ㎟], mesh [# / ㎟], and the average customs width [mm]) Quantitative image analysis of the (Fig. 3c) is, the higher the seeding density network maturation rate showed that the slowing (this time as far as to the average customs length and largest mesh number / ㎟ the longest reach extended), which may extend the period of the network formation because it allows for more detailed analysis. 유사하게, 세포 밀도가 낮을수록 성숙화 속도는 더 빨랐는데, 이는 (예컨대) 암 요법을 위한 혈관신생 차단제의 유효성을 시험하는 신속한 스크리닝 접근법에 더 많은 도움을 줄 수 있을 것이다. Similarly, the cell density is low, the more mature I speed more faster, this will give you more help in the rapid screening approach to test the effectiveness of angiogenesis blockers for (for example) cancer therapy.

시험관내 혈관신생 어세이를 위한 역사상 우수한 표준으로서 마트리겔 유도성 혈관신생 네트워크를 hPE 유도성 네트워크와 비교하였다(도 3d). In vitro tests were compared to control angiogenesis Matrigel-induced angiogenesis as a network history excellent standard for the assay and hPE inductive network (Fig. 3d). 먼저 세포 배양물을 마트리겔 또는 hPE에 노출시키고, 칼세인 AM을 이용하여 내피 세포 모세혈관 네트워크의 형태를 분석하여 생존능 및 네트워크 구조를 측정하였다. First exposing the cell culture to the Matrigel or hPE, by analyzing endothelial cells in the form of capillary network using a knife-old AM viability was measured, and network structure. 시딩 후 1일째, 마트리겔 코팅된 플레이트에서는 HUVEC가 윤곽이 뚜렷한 혈관신생 세관 네트워크를 형성한 것으로 나타났지만, 3 일(d) 후, 네트워크 구조는 아폽토시스성 세포의 구형 볼로 붕괴하였다(도 3a, 3d). In the first day after seeding, Matrigel coated plate natjiman revealed that HUVEC form an angiogenesis customs network, well-defined, 3 days (d) after, a network structure was collapsed ball sphere of apoptosis sex cells (Fig. 3a, 3d ). hPE 유도성 네트워크에서 일부 세포 사멸이 관찰되기는 하였지만, 5 일(d)의 연장된 기간이 경과한 후에는 어떤 아폽토시스성 볼 형성도 관찰되지 않았다. Although Although some cell death observed in hPE inductive network, after the lapse of a prolonged period of 5 days (d) was not observed to form ball which apoptotic properties.

혈관신생의 후기 단계 과정에서, EC는 모세혈관 네트워크가 성숙화됨에 따라, 혈관을 안정화시키기 위해 평활근 세포(SMC: smooth muscle cell)를 동원한다. In the later stages of the process of angiogenesis, EC, the smooth muscle cells in order to stabilize the blood vessel as the capillary network is maturation: mobilizes the (SMC smooth muscle cell). 따라서, 평활근 세포 형태에 대해 hPE 및 마트리겔이 미치는 효과를 평가하였다. Therefore, to evaluate the effects of hPE and matrigel on for smooth muscle cell types. 흥미롭게도, HUVEC이 없는 경우, 마트리겔에 시딩된 SMC는 1 d 후에 세관을 형성하였지만(도 3b.i), hPE 코팅된 플레이트에서는 전형적인 '힐 앤드 밸리(hill and valley)' 형성을 유지하였으며(도 3b.ii), 이는 세포 유형 사이의 분자 신호 전달 경로에 있어 상당한 차이가 있다는 것을 나타낸다. Interestingly, the absence of HUVEC, the SMC are seeded on Matrigel are formed but the customs after 1 d (Fig 3b.i), hPE the coated plate was maintained at a typical "hill-and-valley (hill and valley), to form ( FIG 3b.ii), which indicates that there is a significant difference in the molecular signaling pathway between cell types. SMC는 미세혈관 형성의 초기 단계에서 세관을 형성하다는 것으로는 알려져 있지 않은 바, 따라서, 상기 결과는 hPE 기반 혈관신생이 더 정확하게 정상적인 생리를 나타낼 수 있다는 것을 시사하는 것일 수 있다. SMC is a bar, and therefore, the results that are not known to be formed that the customs at an early stage of the fine angiogenesis may be to suggest that may indicate a normal physiological hPE based angiogenesis is more accurate.

약물 스크리닝 적용을 위한 hPE 유도성 혈관신생의 분석 HPE inductive analysis of drug screening for angiogenesis apply

재생 의학에서의 그의 역할 외에도, 인간 태반 추출물(hPE)에 의해 유도된 혈관신생을 시험관내에서 혈관신생 관련 약물을 스크리닝할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험하였다. In addition to his role in regenerative medicine, the drug-related angiogenesis angiogenesis induced by the human placenta extract (hPE) in vitro was tested on his ability to screening. 마트리겔을 대조군으로서 사용하였다. The matrigel was used as a control. 마트리겔 및 hPE 기반한 혈관신생 어세이를 신생 혈관화에 대해 강력한 억제 활성을 가지는 당단백질인 트롬보스폰딘 1(TSP-1)에 대해 스크리닝하였다. The matrigel and hPE based angiogenesis assay was screened for proteins, thrombospondin 1 (TSP-1) each having an inhibitory activity against new vascularization. TSP-1은 고형 종양의 항혈관신생 치료를 위한 모델 약물을 대표한다 23 . TSP-1 is typical of a model drug for the antiangiogenic therapy of solid tumors 23. 배양 1 d 후, 조직 배양 플레이트 상에 직접 시딩된 대조군 HUVEC는 TSP-1에는 어떤 영향도 받지 않았고, 세포는 전형적인 조약돌 형태를 형성하였다. After the culture 1 d, seeded directly onto tissue culture plates are TSP-1, the control HUVEC did not have any effect, the cells formed a typical cobblestone morphology. 그에 반해, hPE 처리된 배양 플레이트에서 배양된 HUVEC는 혈관신생 네트워크 형성을 현저히 감소시켰다(도 4a). On the other hand, hPE cultured HUVEC in the treated culture plates is significantly reduced angiogenesis network is formed (Fig. 4a). 결과에 따르면, 전체 세관 길이 및 분기점이 TSP-1 농도의 함수로서 선형으로 감소한다는 것을 나타낸다(도 4b). According to the results, indicating that the overall length and customs branch point linearly decreases as a function of the concentration of TSP-1 (Figure 4b). 중요하게는, 이러한 연구는 hPE 기반 어세이가 마트리겔 기반 어세이에 비해 약물 농도에 더 감수성이라는 것을 나타낸다. Importantly, this study shows that the hPE based assay is more sensitive to the drug concentration compared to the Matrigel-based assays. 이는 TSP-1 농도와, R 2 값이 각각 0.97 및 0.36인, 혈관신생 네트워크의 도달 면적의 감소율(%) 사이에 더 높은 상관관계로 표현된다(도 4c). This is represented by the higher correlation between the concentration of TSP-1 and, respectively, the R 2 value of 0.97 and 0.36, decrease of the reach area of angiogenesis network (%) (Fig. 4c). 네트워크 형성 억제는 비공지 스트레스 반응 이외의 실제 혈관 형성을 추가로 입증한다. Network formation inhibition is demonstrated by adding the actual angiogenesis other than unknown stress response. 추가적으로, hPE는 인간에서 유래되기 때문에, 비인간 시스템을 이용하는 스크리닝으로 인해 발생할 수 있는 종간에 기초한 부정확성은 피한다 13, 14 . Additionally, since the hPE is derived from human, inaccuracy based on the species that is caused by screening using a non-human system avoids 13,14.

3D 바이오스캐폴드 내에서의 시험관내 혈관신생의 네트워크 형성 3D BIOS cavity formation in vitro angiogenesis in the folded network

조작된 기관에서 성공적으로 혈관화하는 과정은 성공적인 재생 의학 요법을 발전시키는 데 주된 걸림돌이 되어왔기 때문에 24 , hPE가 생체외 유래된 바이오스캐폴드에서 혈관신생을 유도할 수 있는 잠재성을 분석하였다. The process of successfully vascularization in engineered organs were analyzed for 24, hPE the potential to induce angiogenesis in the BIOS caching fold-derived in vitro because they have been the main obstacle to developing a successful regenerative medicine therapies. 본 연구 결과, 조작된(세포가 제거된) 인간 제정맥(HUV) 바이오스캐폴드에서 hPE가 혈관신생 네트워크의 형성을 유도한 것으로 나타났다(도 5a). This study showed that the (the cells have been removed) that the operation was hPE in the human vein (HUV) BIOS cache fold leads to the formation of a neovascular network (Fig. 5a). 2D 배양 플레이트에서의 어세이와 일관되게, 바이오스캐폴드 상에 시딩된 내피 세포(EC)는 다세포 코드로 연결된 장방형 형태로 발달하여 서로 연결된 복합 네트워크를 형성하였다. Consistent with the assay in 2D culture plate, BIOS cache endothelial cells (EC) are seeded on a fold has formed a complex network that is connected to each other to develop into a rectangular form connected in multi-cellular code.

생체내 혈관신생은 다양한 기전, 가장 흔하게는 발아 또는 장 중첩에 의해 일어난다. In vivo angiogenesis takes place by various mechanisms, the most common are germinated or long overlap. 이 데이터는, hPE와 함께 인큐베이션되었을 때, 발아 대 장 중첩적 혈관신생이 시험관내에서 세포 밀도를 달리함으로써 조절될 수 있다는 것을 보여준다. This data shows that at, for germination sheet superposed manner angiogenesis in vitro time, was incubated with hPE can be adjusted by varying the cell density. 더 낮은 세포 밀도(2x10 4 개의 세포/㎠)에서 hPE 인큐베이션된 스캐폴드에서 네트워크 형태는 발아 혈관신생을 보였고(도 5c.i, 5C.ii), 중간 밀도(4x10 4 개의 세포/㎠)에서 네트워크 형태는 발아 및 장 중첩적 혈관신생의 조합을 보였고(도 5c.iii, 5C.iv), 더 높은 밀도(6x10 4 개의 세포/㎠)에서 네트워크 형태는 장 중첩적 혈관신생에 더 가깝운 유사성을 보였다(도 5c.v, A lower cell density on the network hPE in the incubation scaffold network type showed the sprouting angiogenesis (FIG 5c.i, 5C.ii), medium density (4x10 4 cells / ㎠) in (2x10 4 cells / ㎠) type showed a germination sheet superposed manner, and the combination of angiogenesis (Fig. 5c.iii, 5C.iv), a higher density networks in the form of (6x10 4 cells / ㎠) is closer to the cloud similarity sheet superposed manner angiogenesis It showed (Fig 5c.v, 발아는 일반적으로 모세혈관이 없는 낮은 세포 밀도 영역에서 혈관신생의 조기 단계에서 일어나기 때문에, 세포 밀도와 혈관신생의 특이적 기전 사이의 상관관계는 생체내 모세혈관 및 네트워크 형성에 대해 현재 이해되고 있는 내용을 지지한다. Germination is generally due to occur in an early stage of angiogenesis in a low cell density region where the capillaries, cells, correlation between the density and the specific mechanism of angiogenesis is information that is currently understand the in vivo capillary blood vessel and network formation It supports the. 그에 반해, 장 중첩은 모세혈관 및 내피 세포가 이미 존재하는 더 높은 세포 밀도 영역에서 일어난다 25, 26 . On the other hand, Chapter overlap occurs at a higher cell density and area for capillary endothelial cells is already present 25,26.

생체내 혈관신생의 유도 Induction of angiogenesis in vivo

피하 래트 모델을 이용하여(도 6a), 투여된 스캐폴드(마트리겔 및 hPE)에 대한 혈관신생 반응을 이식 후 5일째에 평가하였다. The angiogenic response of the rats to avoid using the model (Fig. 6a), the administration of a scaffold (Matrigel and hPE) were evaluated on the fifth day after implantation. 대조군 및 마트리겔 인큐베이션된 스캐폴드 두 가지 모두 스캐폴드 주변에 상당한 섬유화를 보인 반면, hPE 투여된 스캐폴드에서는 이식체 주변에 식별가능한 섬유화는 없었다(도 6b.i-6b.iii.). Control and Mart while Rigel incubated scaffolds, both showed a significant fiber formation around the scaffold, the hPE administered scaffold was not identifiable in the fibrosis surrounding the implant (FIG. 6b.i-6b.iii.). hPE 샘플에서 섬유화 방지는 LC-MS/MS로 검출된 바와 같이, 항염증성 아넥신(ANXA1, ANXA2, ANXA4, 및 ANXA5) 27 , 항미생물성 디펜신 펩티드, 예컨대, DEFA1- 28 , 및 MRC1(이는 바이러스 및 박테리아를 비롯한 잠재적인 병원체에 결합하는 것으로 공지되어 있다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 면역 관련 분자로부터 생성되는 것으로 간주된다. In hPE samples prevent fibrosis as detected by LC-MS / MS, antiinflammatory annexin (ANXA1, ANXA2, ANXA4, and ANXA5) 27, defensin antimicrobial peptides, for example, DEFA1- 28, and MRC1 (which including, including viruses and bacteria are known to bind to a potential pathogen), and is therefore considered to be produced from, but not limited to, immune-related molecules.

명시야 현미경 검사법으로 나타난 바와 같이, 마트리겔 및 hPE 인큐베이션된 스캐폴드 두 가지 모두 대조군과 비교하였을 때, 신생 혈관화가 현저히 증가한 것으로 나타났다(도 Name as represented by field microscopy, Mart when hPE matrigel and incubated scaffolds, both compared with the control, showed significantly increased upset neovascularization (Fig 전체 혈관화는 유사하게 보였지만, hPE 처리는 성숙화 모세혈관상의 형성을 보인 반면, 마트리겔 샘플은 성숙화 모세혈관상 형성에 관한 증거는 없이, 덜 구조화된 것으로 보였다. Full vascularization is looked analogy, hPE process, whereas the formation of mature capillary, Matrigel sample is evidence of the maturation capillary blood vessel formation showed that, the less structured without. H&E 염색된 절편은 세포가 hPE에서 인큐베이션된 스캐폴드로 및 그 전역에 걸쳐 이동한 것으로 나타난 반면, 마트리겔 인큐베이션된 샘플에서는 세포 침윤이 감소되었고, 대조군 샘플 내의 세포는 스캐폴드 주변으로 국한되어 있는 것으로 나타났다(도 6b.vii.-6b.ix.). H & E stained sections are cells, while shown as a scaffold incubated at hPE and to go over its entire, matrigel in the incubated sample cell infiltration is decreased, the cells in the control sample is to be located is limited by the surrounding scaffold found (Fig 6b.vii.-6b.ix.). 마트리겔 및 hPE 인큐베이션된 샘플 두 가지 모두에서 세포 이동이 개선된 것은 스캐폴드 구조로 흡착된 화학주성 및 성장 인자 신호의 결과였다. The Matrigel and the cells move in hPE improve both the two kinds of incubated samples it was the result of chemotaxis and growth factor signal adsorbed to the scaffold structure. 대조군에 비해 hPE 및 마트리겔 투여된 스캐폴드 두 가지 모두에서 세포 이동이 개선되었음에도 불구하고, 세포 리모델링은 샘플 군 사이에서 편차를 보였다. Although cell migration is improved in both of hPE and matrigel administered scaffold compared to the control, and cell remodeling showed a variation between the sample group. 마트리겔 인큐베이션된 샘플에서 세포 조밀 영역은, 거의 완전히 리모델링된 것처럼 보이는, 이로써, 더욱 조직화된 섬유 및 세포 구조를 나타내는 hPE 인큐베이션된 스캐폴드와 비교하였을 때, 정질적으로 더 무정형인 일반적인 구조를 가지는 원래의 HUV 섬유의 잔유물을 보였였다(도 6b.vii.-6b.ix.). Density area cells in the matrigel incubation sample, that appear almost completely renovated, whereby, when compared to the hPE incubated scaffolds representing the fiber and cell structure a more organized, information originally having the general structure qualitatively the more amorphous It was observed in the residue of the HUV fibers (Fig 6b.vii.-6b.ix.).

논의 Argument

조직 재생, 경색 조직 및 허혈성 상처 복구는 상처 회복 또는 조직 대체를 위한 개선된 전략이 임상적으로 상당한 영향을 주는 3가지 임상 분야이다. Tissue regeneration, tissue infarction and ischemic injury recovery There are three clinical areas with improved strategies for wound healing or tissue to replace a significant impact in clinical practice. 출생 전후 조직이 상당한 임상적 전망을 보인다는 것을 시사하는 증거가 늘어나면서, 지난 5년간 다양한 적용 분야에서 양막 및 융모막의 사용이 크게 증가하였다 29-32 . With the increasing evidence to suggest that the organization after birth seems significant clinical outlook, over the last five years was a significant increase in the chorionic membranes and the use of various applications 29-32.

본원에서 결과는 혈관신생 및 조직 리모델링의 인간 유래된 강력한 자극 인자의 생리학적 비율을 집중적으로 다루고, 이를 전달하는 신규 접근법을 상세하게 기술한다. Herein it results intensively dealing with a physiological ratio of powerful stimulating factor in the angiogenesis and tissue remodeling human-derived, and particularly describes a novel approach for delivering it. 본 데이터는 모세혈관 형성(시험관내 및 생체내)을 개시하고, 성장 또는 성숙 동적 성질을 조절할 수 있는 능력을 가지고 혈관신생 과정 동안 EC 표현형을 조절하고, 생체내 조직 섬유화의 상당한 감소로의 개선된 세포 활성을 보여준다. This data is the start of the capillary formation (in vitro and in vivo), and has the ability to control the growth or maturation dynamic property controlling the EC phenotype during angiogenesis process, and improved to a significant reduction in the in vivo tissue fibrosis It shows the cell activity.

모세혈관 네트워크 형성의 시험관내 성숙화 속도를 조절하고, 발아의 발생 및 장 중첩적 혈관신생의 네트워크 형태를 제어할 수 있는 능력은 상처 치유 및 조직 재생 과정에서 조절 경로를 더 많이 이해할 수 있는 유용한 플랫폼을 제공할 수 있다. The ability to regulate the in vitro maturation rate of capillary network formation and control the generation and chapter network in the form of superposed manner angiogenesis germination is a useful platform to understand more of the adjustment path in the healing and tissue regeneration wounds It can provide. 마트리겔과의 비교에 기초하여, hPE가 세포를 자극하는 기전은 근본적으로 다른 것으로 보인다. Based on the comparison of the matrigel, mechanisms hPE stimulates cell is essentially appears to the other. 마트리겔과 인큐베이션된 SMC는 모세혈관 유사 형성을 개시하였지만, hPE에 노출된 SMC는 그의 전형적인 힐 앤 밸리 형태를 유지하였으며, 이와 같이 인간 유래 hPE는 더욱 복잡한 모델에서 생리학적 혈관신생을 더욱 잘 나타내는 모델을 제공할 수 있다. Although initiate the SMC incubated with Matrigel are formed similar to capillaries, the SMC was maintained his typical hill-and-valley shape, and thus the human-derived hPE is physiologically better represent model angiogenesis in more complex models exposed to hPE It can provide.

현재의 많은 방법은 단일의 혈관신생 조절 인자 또는 그의 개별적인 조합에 의존하는 인간 유래된 (재조합) 조절 인자에 기반한다 33 . Many of the current methods are based on the human-derived (recombinant) modulators that rely on a single angiogenic regulators or a combination of the individual 33. 개별 조합은 변이를 제어하고, 다양한 접근법에 내재하는 복합성을 감소시키지만, 이들은 스크리닝 공정에 제약을 주고, 항혈관신생, 종양 억제 약물의 잠재성을 시험할 때 중요할 수 있는 광범위한 세트의 인간 생체내 분자 상호작용을 나타내지 못한다. Individual combination reduces the complexity of controlling the variation, and inherent in the various approaches, all of which are to give a constraint on the screening process, the anti-angiogenesis, the human living body and it could have a wide range set when testing the potential of a tumor inhibitory drug in It does not indicate molecular interactions.

hPE 기반 모델에 내재하는 복합성은 종양 억제 약물을 위한 것으로 더 효과적인 스크리닝 접근법을 제공함으로써 약학 산업에 진보를 가져올 수 있다. Complexity inherent in hPE based model can lead to advances in the pharmaceutical industry by providing a more effective approach to screening for antitumor drugs. 현행 기술에 비해, hPE에의 인간 EC의 노출은 검출 한도가 더 낮은 혈관신생 억제 약물 농도(TSP-1)에 대한 감수성이 증가된 것으로 보였다. Compared to current technology, by exposure of the human EC hPE showed that the detection limit is lower for the new blood vessels are susceptible inhibitory drug concentration (TSP-1) increases.

hPE 기반 모델은 근접한 생리학적 비율로 광범위한 세트의 인간 유래 분자를 이용하여 혈관신생을 유도한다. hPE based model induced angiogenesis using the human-derived molecules of the extensive set as close to the physiological ratio. 생체내 혈관 형성이 다양한 대사 경로의 유도를 요구하기 때문에, 오직 선택된 분자 경로만의 조절이 신규 항혈관신생 약물을 개발하기 위한 시도를 국한시킬 것으로 생각된다 34 , 35 . Since the in vivo blood vessel formation requires the induction of various metabolic pathways, it is considered that only the adjustment of only the selected path to molecules limited the attempts to develop a new anti-angiogenic drugs 34,35. 이와 같이, 약물은 이러한 많은 경로 중 임의의 것과의 상호작용을 통해 혈관신생을 조절할 수 있지만, 국소 환경이 복합적이지 않을 경우, 충분한 혈관신생을 유도하는 효과는 거의 보이지 않을 수도 있다. In this way, the drug can be adjusted angiogenesis through the interaction of any of these as many paths, if the local environment is not complex, the effect of inducing sufficient neovascularization may not be observed. 본 실시예에서의 생체내 분석 결과는 복합 PE가 많은 생화학적 경로에 영향을 주어 광범위한 효과를 초래할 수 있다는 증거를 추가로 제시한다. In vivo analysis of the present embodiment it is provided further evidence that the composite PE can result in a wide range of effects will have an effect on many biochemical pathways. 데이터에 따르면, hPE는 혈관신생 특성을 개선시킬 뿐만 아니라, hPE 투여된 바이오스캐폴드에서 섬유화를 감소시킨 것으로 보인 바와 같이, 면역 감소 특성을 보였다. According to the data, hPE is as shown by reducing fibrosis in the BIOS cache folds, as well as to improve the angiogenic properties, hPE administration, showed a reduced immune properties. 혈관신생과 면역학적 분자 경로 사이의 복합적인 상호연결을 고려해 볼 때 36 , hPE의 분자 조성물은 중요한 면역학적 염증 반응 없이 모세혈관 형성을 유도하는 임상적으로 적용될 수 있는 기술을 개발하기 위한 적절한 기반을 제공한다. A suitable base for the development of angiogenic and immunologic molecular pathways complex interconnecting consider 36, hPE of the molecular composition is important immuno-inflammatory response capillary technique that can clinically be applied to induce the formation without as viewed between to provide.

상기 기술된 연구의 긍정적인 결과는 PE 내의 중요한 성장 인자(GF)와 유전자 조절 인자가 존재한다는 것 뿐만 아니라, 그들이 생리학적 비율로 존재한다는 것과도 연관되는 것으로 보인다. Positive results of the above-described study is not only important that the growth factor (GF) and gene regulatory elements in a PE exists, they appear to be associated also to those that present in a physiological ratio. 예를 들어, VEGF는 hPE 유도성 EC에서 상향조절되었지만, hPE 용액은 검출가능한 수준을 포함하지 않았다. For instance, VEGF has been upregulated in hPE inductive EC, hPE solution did not contain detectable levels. 이는 표준 버전 및 GFR 버전(성장 인자가 감소된 버전: growth factor reduced) 두 가지 모두에서 VEGF를 활성 농도로 포함하는 마트리겔(BMM)과 대조된다. This is the standard version, and GFR version: in contrast to the Matrigel (BMM) containing the active VEGF levels in both (the growth factor is reduced version of growth factor reduced). 본원의 결과에서는 더욱 성숙한 모세혈관상이 형성되는 것으로 나타났는데, VEGF의 존재는 단지 많은 기여 인자 중 하나이고, 다른 조절 인자의 존재는 가능하게는 혈관 발생에서 중요한 역할을 할 수 있다. The results of the present application was shown to be a more mature capillary blood vessel formation, the presence of VEGF is the only one of the contributing factors, the presence of other regulatory factors may be an important role in the blood vessel can be generated. 유사하게, 혈관신생을 개시하는 데 사용되는 인간 재조합 단백질과 비교하여, 이들은 고도로 농축된(전형적으로) 단일 GF에 의존한다 37 -39 . Similarly, compared with the human recombinant protein, which is used to initiate angiogenesis, these highly concentrated (typically) depends on a single GF 37 -39. 단일의 높은 반응성의 GF가 임상적으로 적용되어 바람직하지 않은 효과를 초래하였다는 문제점이 보고되었다 40-42 . Results in undesirable is that the single high reactivity of GF applied to the clinical effect has been the problem was reported 40-42.

hPE 혈관신생 모델은 2D 및 3D 시험관내 모델뿐 아니라, 생체내 생체조작된 조직 이식체 내에서 입증되었으며, 다양한 임상 또는 약학적 용도로 쉽게 적용될 수 있다. hPE angiogenesis models as well as 2D and 3D in vitro model, has proven in the in vivo tissue implant operation can be readily applied in a variety of clinical or pharmaceutical use. 본 모델이 그의 혈관신생 및 면역 감소 특성과 조합된 생리학적으로 건강한 인간 혈관상으로부터 유도되었다는 사실은 현재 혈관신생 모델 중에서 그를 고유한 것으로 만든다. The fact that this model is derived from healthy human blood vessel with a combination of physiological angiogenesis and his immune and reduction characteristic that makes him unique among current angiogenesis model. 본원에서 제시된 데이터는 대안적이고, 더 성공적인 접근법에 대한 요구가 임상적으로 우선되는 많은 중요한 임상적 사안에서 hPE가 중심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. The data presented herein showed that the demand for alternative and more successful approach that a number of important clinical issues a central role in that hPE first clinically.

실시예 Example 1에 대한 참고 문헌 References for 1

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실시예 2 Example 2

혈관신생 자극을 위한 태반 추출물의 조절형 전달 Controlled delivery of placenta extract form for stimulating angiogenesis

도입 Introduced

조직 조작은 아픈 환자 내로 이식하기 위해 시험관내에서 스크래치로부터 조직 및 기관을 구축하는 것을 목표로 한다. Organization operation is in vitro, which aims to build tissues and organs from scratch to transplantation into ill patients. 그러나, 이식에 대한 이와 같이 혁신적인 대안은 이식된 이식편에 시딩된 세포에 산소 및 영양을 공급하는 데 적합한 맥관 구조를 형성하지 못함에 따라 후순위에 있다. However, in this manner an innovative alternative to transplantation is in accordance with the subordinated does not form a right vasculature to supply oxygen and nutrients to the cells seeded in the transplanted graft. 따라서, 조직 조작된 구조물에서 혈관신생을 유도하는 데 효과적인 방법이 절실히 요구되고 있다. Thus, an effective way to induce angiogenesis in tissue engineered structures are urgently required.

현재까지, 조작된 생성물에서 혈관화를 촉진시키기 위해 시도된 모든 방법들은 만족스럽지 못한 결과를 이루어왔다. Until now, all the way to the attempts to promote vascularization in engineered products have achieved the unsatisfactory results. 본 개시내용은, 상기 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 혈관신생의 초기 단계를 유도하고, 조절하는 것으로 밝혀진 혈관신생유발 추출물을 인간 태반으로부터 얻는 프로토콜을 제공한다. The present disclosure is directed, as described in the above embodiment, there is provided a protocol for obtaining the extract induced angiogenesis have been found to induce and adjust the initial phase of neovascularization from the human placenta.

본 실시예는 모세혈관 네트워크의 형성을 촉진시키고, 시간 경과에 따라 그를 지속시키는 3D 시험관내 혈관신생 어세이를 기술한다. This Example describes the 3D vitro angiogenesis assays to facilitate the formation of the capillary network and, sustained him over time. 이러한 목적을 위해, 시간 경과에 따른 태반 추출물의 혈관신생 잠재성 및 그의 생체활성을 분석하였다. For this purpose, we analyzed the angiogenic potential and its bioactive extracts of the placenta over time. 이러한 연구 결과, 추출물의 빈번한 투여가 성숙하고, 오래 지속되는 모세혈관 네트워크의 형성을 촉진시키는 것으로 나타났다. These studies showed that mature to frequent administration of the extract, and promote the formation of a capillary network that is long-lasting. 따라서, 추출물의 도입 및 조절형 방출을 위한 생분해성 젤라틴 미세입자를 제조하였고, 그의 분해 동역학적 성질을 연구하였다. Thus, it was produced a biodegradable gelatin microparticles for the introduction and Adjustable release of the extract, was investigated for its degradation kinetic properties. 마지막으로, 3D 시험관내 혈관신생 어세이를 개발하였다. Finally, we developed a 3D in vitro angiogenesis assay. 태반 추출물이 적재된 미세입자를, HUVEC가 시딩된 I형 콜라겐 하이드로겔 스캐폴드에 포매시키고, 매르틱스 내에서의 미세혈관 형성의 초기 단계에 대한 증거를 입증하였다. Fine particles of a placenta extract loaded, HUVEC that were embedded in the type I collagen hydrogel scaffold seeded, demonstrated evidence of the initial stage of the formation of the microvessel in maereu ticks.

현대 사회에서는 기관 또는 조직의 손실 또는 부전이 가장 심각하고, 가장 많은 비용이 드는 인간 건강상의 문제 중 하나이다. In modern society, the loss or dysfunction of organs or tissues most severely, and one of the most costly health problems in humans. 이러한 문제를 해결하기 위한 방안으로서, 외과적 재건술, 약물 요법, 인공 보철, 기계 장치, 및 이식을 비롯한 많은 접근법이 시도되어 왔다. As a way to solve this problem, and has surgical reconstruction, medication, prostheses, machinery, and many approaches, including transplantation it is attempted. 장기적으로 볼 때, 이러한 접근법은 손실된 기관 또는 조직의 기능을 완전하게 대체하지 못하거나 2 , 이식인 경우에는 기관 수요 건수는 많고, 기증자 수는 충분하지 않기 때문에, 흔히 실패하게 된다. In the long run, this approach if not completely replace the function of the missing organ or tissue, or 2, the number of organ transplants there are many demands, so donors can do is not enough, it will often fail.

한 해결책은 조작된 기관 또는 조직을 개발하는 것이 될 것이다. One solution would be to develop the operations organ or tissue. 그러나, 현행 조직 조작 접근법은 부분적으로는 두꺼운 바이오스캐폴드를 통과하는 데 발생하는 영양상의 장벽에 기인하여 제한된 성공만을 거두어 왔다. However, the current organizational operations approach is partly due to barriers on nutrition caused to pass through the thick folds BIOS caching has taken only limited success. 두꺼운 (>200 ㎛) 조직 구조물을 조작하는 데 있어 큰 장애물은 산소 확산이 전형적으로 조직 조작된 스캐폴드에서 150 내지 200 ㎛인 거리로 제한되며, 이로 인해 3D 조직 구조물 내에서 세포 성장 및 생존능이 손상된다는 점이다 6 ,7 . Thick (> 200 ㎛) big obstacle to manipulating the tissue structure is oxygen diffusion is typically a tissue from the operated scaffold is limited to 150 to 200 ㎛ distance, resulting in cell growth and viability are damaged within a 3D tissue structures is that 6,7. 산소는 세포 생존에 중요한 영양이며, 산소가 없다면, 스캐폴드 내의 세포는 죽게 된다. Oxygen is an important nutrient in cell survival, there is no oxygen, the cells in the scaffold are killed. 또한, 수송 조건이 불량할 경우, 대개는, 세포에 의해 분비되는 섬유화 캡슐이 형성되게 된다. Further, when the poor transport conditions, usually, a fibrotic capsule secreted by the cells are to be formed. 상기 캡슐 형성은 스캐폴드 내의 영양 물질 전달을 결여시키고, 결국에는 낮은 세포 밀도를 초래하게 된다. The capsule formation and the lack of nutrient delivery in the scaffold, will eventually result in a lower cell density. 따라서, 장기간 지속 가능한 조직을 조작하는 것은 3D 조직 구조물에 시딩된 세포에 산소 및 영양을 전달하는 것을 촉진시키는 방법으로부터 이익을 얻게 될 것이다. Therefore, to operate a long-term sustainable organization will benefit from the process of promoting the transfer of oxygen and nutrients to the cells seeded on the 3D tissue structure. 본 개시내용의 태반 추출물 및 방법은 스캐폴드 내에서 영양이 풍부한 모세혈관계가 신속하게 발생될 수 있도록 유도하는 것을 포함하는, 산소 및 영양 결핍을 극복하는 접근법을 제공한다. Placenta extracts and methods of the present disclosure provides an approach to overcome, oxygen and nutrient deficiency, which comprises inducing the capillary vascular system so that it can be quickly generated in the nutrient-rich scaffold. 구조물의 변연부 뿐만 아니라, 중심부에도 상기 필수 영양소를 공급할 수 있는 실행 방법은 섬유화 캡슐의 형성을 막는 데 도움이 될 것이다. As well as the margin of the structure, execution methods that can supply the essential nutrients to the heart will help prevent the formation of a fibrous capsule.

혈관신생은 조직 발생 및 유지에 중요하며, 혈관신생이 성공적으로 조절될 때, 이식된 이식편의 확립된 혈관 네트워크가 조절 방식으로 형성되는 것이 촉진된다. Angiogenesis is promoted to be important for tissue generation and maintenance, angiogenesis this time the controlled successfully, the blood vessel network, the establishment of the transplanted graft is formed in a controlled manner. 여러 생물학적 인자 및 분자 경로가, 아직도 여전히 부분적으로는 알려져 있지 않은 상기와 같이 복잡한 과정을 조절하는 데 관여한다. The number of biological factors and molecular pathways, yet still partly involved in regulating a complex process as described above is not known. 혈관 성장을 개시하고, 조절하는 분자 기전을 더욱 잘 이해할 수 있도록 하기 위해, 연구는 간소화되고, 한정되고, 조절되는 조건하에 시험관내 또는 생체내에서 혈관신생의 최종 요소를 재생하는 세포 배양 시스템인 혈관신생 어세이를 개발하는 데 주력해 왔다. To help to better understand the molecular mechanisms that initiate vascular growth, control, research has been simplified, limited and, for reproducing the final element of angiogenesis in vitro or in vivo under conditions which control the cell culture system of vascular It has focused on developing new assays. 시험관내 혈관신생을 촉진시키는 데 각종의 상이한 접근법들이 사용되어 왔지만, 현재까지 그를 임상 실시로 해석하는 데 있어서는 거의 성공을 거두지 못하였다. Has been used in vitro to a variety of different approaches in promoting angiogenesis, it was not met with little success when it comes to interpret him to date in clinical practice. 대부분의 혈관신생 모델이 가지는 한계는 동물 유래이거나(예컨대, 마트리겔 기반인 것), 또는 살아있는 동물(예컨대, 병아리 융모 요막 및 토끼 각막 미세포켓)의 사용에 전적으로 의존한다는 점이다. Limits the majority of angiogenesis model has is that it relies entirely on the use of (those where e. G., Matrigel-based), or animal origin, or live animals (e.g., chicken and rabbit cornea micro-pocket chorionic yomak). 또한, 여기에는 천연의 생체내에 존재하는 다양한 사이토카인 및 화학적 구배가 없다 . Further, this does not have a variety of cytokines and chemical gradient existing in the living body in a natural. 결과적으로, 상기 검정법의 결과는 장기간 지속되는 혈관 형성이 없다는 이유에서 대개 실망스러운 정도였다. As a result, the results of the assay was often disappointing about the reason that the blood vessel formation that lasts an extended period of time. 따라서, 확실한 인간 기원의 시험관내 모델이 기계론적 연구 및 인간용 혈관신생 약물을 스크리닝하는 데 유용할 것이다. Therefore, in vitro models of certain human origins will be useful in screening for mechanistic studies and angiogenesis drug for humans.

태반은 쉽게 이용할 수 있는 조직이고, 혈관 조직 및 혈관신생 관련 성장 인자의 풍부한 공급원이라는 점을 고려하여, 본 연구에서는 앞서 상기 기술된 바와 같이, 및 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 혈관신생을 촉진시키는, 사이토카인 및 혈관신생 관련 성장 인자가 풍부한, 점성 단백질 화합물인 다중 단백질 인간 태반 추출물 또는 매트릭스(hPE 또는 hPM)를 얻는 데 그를 사용하였다. And placenta tissue readily available, in view of the fact that blood vessel tissue and a rich source of angiogenic related growth factors, as this study, described in, and Example 1 As noted above, promotes angiogenesis to, cytokines and angiogenesis-related growth factor-enriched, protein is a multi-viscosity protein compound to obtain the human placenta extract or matrix (hPE or hPM) was used him. hPE는 제한된 기간 동안 시험관내에서 혈관신생의 초기 단계를 유도하고, 조절할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. hPE has been found that can induce the early stages of angiogenesis in vitro for a limited period of time, and adjust. 추가로, hPE는 또한 섬유화를 유의적으로 감소시키는 것으로 밝혀져 있다. Further, hPE has also been shown to reduce fibrosis significantly.

본 실시예는 hPE 내의 성장 인자가 성숙한 모세혈관 네트워크의 형성을 가능하게 하는 데 충분히 긴 기간 동안 기능성인 상태 그대로 유지될 수 있도록 hPE를 지속적으로 전달하는 방법을 제공한다. This embodiment provides a method for continuous delivery of hPE to be growth factor is keeping of mature capillary functionality for a sufficiently long period to enable the formation of the vascular network in the state as hPE. 이러한 목적을 위해, 미세입자는 장기간 동안에 걸쳐 일정한 속도로 폴리펩티드를 효율적으로 캡슐화하고, 그를 방출할 수 있는 그의 능력에 기인하고, 그의 다재다능성에 기인하여 전달 시스템으로서 개발되었다 22 . For this purpose, the fine particles have been developed as a delivery system encapsulating the polypeptide efficiently at a constant speed and, due to his ability to release him and, due to his gender versatility over a period of 22 long-term.

미세입자는 크기가 1 내지 1,000 ㎛ 범위이고, 표면 대 부피 비가 큰, 거의 구형에 가까운 고체 입자이다 23 . Fine particle size is in the range of 1 to 1,000 ㎛, surface to a near solid particles in a volume large, nearly spherical ratio is 23. 이는 상이한 기술, 예컨대, 고온 용융 압출, 분무 건조 또는 용매 제거를 사용하고, 천연(예컨대, 전분, 검) 및 합성(예컨대, 폴리락트산 및 폴리글리콜산) 물질 둘 모두인 수개의 상이한 물질을 이용하여 제조될 수 있다 24 . This is a different technology, for example, hot-melt extrusion, a spray drying or solvent removal, and natural (e. G., Starch, and gum) and synthesized by using a (for example, polylactic acid and polyglycolic acid) material both be in all different materials 24 can be prepared. 미세입자의 방출 속도는 그의 크기에 변화를 줌으로써 조절될 수 있는데: 입자 크기가 작을수록, 그의 표면 대 부피 비가 증가함에 따라 큰 입자보다 더 빠른 속도로 용해된다. The release rate of the fine particles may be controlled by giving a difference in their size: the smaller the particle size, are dissolved at a faster rate than the larger particles, as their surface-to-volume ratio increases. 이러한 이유에서, 크기가 다른 입자를 조합함으로써 전달 속도를 조절할 수 있다 25 . For this reason, the size can change the transfer rate by combining the different particles 25. 미세입자로부터의 약물 또는 단백질 방출은 보통 간단한 매트릭스 생체부식에 의해 일어난다. Drug or protein release from the fine particles takes place by the usual simple matrix biological corrosion. 상기 과정은 입자 표면의 부식, 이어서, 벌크 부식 및 방출 매질의 입자 공극으로의 유입을 포함한다 26 ,27 . The process includes the introduction of the particle surface corrosion, then bulk erosion and particle pores of the release media 26, 27.

본 실시예에서는 생분해성 젤라틴 미세입자를 제조하고, 이를 사용하여 3D 시험관내 혈관신생 어세이를 수행하였다. In this embodiment, producing a biodegradable gelatin microparticles, and uses it to perform a 3D was in vitro angiogenesis assay. 혈관신생 어세이는 간소화되고, 한정되고, 조절되는 조건하에 시험관내 또는 생체내에서 혈관신생의 최종 요소를 재생하는 세포 배양 시스템이다 28 . Angiogenesis assay is a cell culture system that is simplified, and only reproduces the final element of angiogenesis in vitro or in vivo under conditions which are modulated 28. 이는 2차원 또는 3차원일 수 있다. This may be 2D or 3D. 3D 시험관내 3D in vitro 어세이에서, EC는 기질 표면 상에 존재하고, 보통 바이오겔로 구성된 주변 매트릭스로 침입하는 관상 구조를 발생시킨다 13 . In the assay, EC is then present on the substrate surface and generating a tubular structure which enters the space surrounding matrix usually consists of bio-gel 13.

본 실시예는 이식된 이식편 내에서 장기간 지속되는 혈관 네트워크의 형성을 촉진시키는 3D 시험관내 The present embodiment is a 3D test to facilitate the formation of the long-standing within the transplanted graft vascular network in vitro 혈관신생 어세이의 실시양태를 제공한다. It provides an embodiment of the angiogenesis assay. 본 실시양태에서, 어세이는 콜라겐 I형 매트릭스에 PE가 적재된 미세입자와 함께 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)를 포매시킴으로써 제조된다. In this embodiment, the assay is prepared by embedding a second human vein endothelial cells (HUVEC) together with the fine PE is loaded into the collagen type I matrix particles. 이어서, 다른 인큐베이션 시점에 HUVEC의 혈관신생 반응을 분석하였다. Subsequently, we analyzed the angiogenic response of HUVEC to different incubation time.

실험 방법 Experimental Method

내피 세포 단리 및 배양 . Endothelial cell isolation and culture. (Jaffe) 등(문헌 [Culture of Human Endothelial Cells Derived from Umbilical Veins. 52 , 2745-2756;1973](HUVECS의 단리 및 배양과 관련하여 본원에서 참조로 포함된다))에 의해 기술된 바와 같이 인간 제정맥으로부터 미리 단리되고, 미리 배양된 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)를 아큐타제(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 사용하여 플라스크로부터 떼어내고, 5분 동안 1,000 rpm으로 원심분리하였다. (Jaffe), etc. (as described in [Culture of Human Endothelial Cells Derived from Umbilical Veins 52, 2745-2756;. 1973] ( with respect to the isolation and culture of HUVECS it is incorporated by reference herein)) in a human, as described by the is previously isolated from the vein, and out by using the Accu hydratase (Fisher Scientific (Fisher Scientific)) and the cultured human claim vein endothelial cells (HUVEC) previously removed from the flasks, centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes. 세포 펠릿을 배지(500 ml의 바스큐라이프 베이살 메디아에 25 ml의 글루타민, 0.5 ml의 하이드로코르티손, 0.5 ml의 아스코르브산, 10 ml의 FBS, 1.25 ㎕의 VEGF, 및 1.25 ㎕의 bFGF 첨가됨)에 재현탁시키고, 혈구계를 이용하여 HUVEC를 계수하였다. (The bath queue life bay live of 25 ml glutamine in media, hydrocortisone, ascorbic acid, VEGF, and bFGF addition of 1.25 ㎕ of 10 ml FBS, 1.25 ㎕ of 0.5 ml in 0.5 ml of 500 ml) and the cell pellet culture medium resuspended in, HUVEC were counted using a haemocytometer.

시간 함수에 따른 hPM HPM according to a function of time 혈관신생성 분석 . Generating new blood vessels analysis. hPE 인큐베이션 시간이 HUVEC 혈관신생 반응에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해, 세포를 hPE 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하고, hPE와 함께 1일, 3일 또는 5일 동안 인큐베이션시켰다. hPE incubation time was incubated for how to evaluate the impact on HUVEC How angiogenic response, playing the cells on tissue culture plates coated hPE marketing, and one day with hPE, 3 days or 5 days. 간략하면, 상기 실시예에 기술된 단리 방법을 사용하여 태반 매트릭스를 제조하였다. In short, the placenta matrix was prepared using the isolated process described in the above embodiment. 추출물을 함유하는 바이알을 해동시키고, 96 웰 플레이트의 웰에 피펫팅(100 ㎕/㎠)하였다. Thaw the vial containing the extract and was pipetted (100 ㎕ / ㎠) in wells of a 96 well plate. 세포 용액을 20,000개의 세포/㎠로 직접 피펫팅하여 플레이팅함으로써 HUVECS를 제조하였다. The cell solution was plated directly pipette to 20,000 cells / ㎠ by plated was prepared HUVECS. 혈관신생 배지를 제조된 각 플레이트 샘플에 첨가하고(200 ㎕/㎠), 상기 후자의 것을 37℃에서 습윤화된 5% CO 2 인큐베이터에 놓았다. Was added to each plate sample prepared angiogenesis and medium (200 ㎕ / ㎠), placed on the wetting of the latter in the incubator 37 ℃ 5% CO 2.

hPE가 시간이 경과함에 따라 어떻게 생체활성을 유지하는지 측정하기 위해, 20일, 15일, 9일, 7일, 5일, 3일 및 1일을 비롯한 다른 기간 동안 (37℃ 및 5% CO 2 인큐베이터에서) 보관하였다. hPE how over time to determine that maintain biological activity, 20 days, 15 days, 9 days, 7 days, 5 days, 3 days, and during other periods, including a one-day (37 ℃ and 5% CO 2 It was kept in an incubator). 이어서, 각 시점으로부터 얻은 필름 hPE를 상기 기술된 바와 같이 조직 배양용 96 웰 플레이트 상에 코팅하고, HUVEC를 시딩하였다. Then, the film was hPE obtained from each time point as described above coated on a 96-well plate for tissue culture, and seeding the HUVEC. 세포를 3일 동안 배양하고, 혈관신생 네트워크를 정질적으로 특성화하였다. Cells were incubated for 3 days, which was characterize angiogenesis network to normal quality.

접종 횟수 함수에 따른 hPE HPE according to the number of inoculated function 혈관신생성 분석 . Generating new blood vessels analysis. hPE 접종 횟수에 대한 HUVEC의 반응 또한 분석하였다. HUVEC in response to vaccination hPE number was also analyzed. 1일째 먼저 세포를 hPE 상에 시딩하고, hPE를 1일째 이후에 hPE 투여를 위해 배양 배지와 함께 혼합하였다. The first day of the first seeding cells onto hPE, and hPE was mixed with the culture medium for hPE administered after the first day. 세포를 5일 동안 배양하였는데, 일부 샘플 군은 1일째(시딩 당일날) 단 한번의 hPE 접종을 받았고, 다른 샘플 군은 1 및 3일째 2회 접종을 받았고, 다른 샘플 군은 1, 3, 및 4일째 3회 접종을 받았다. Were the cells incubated for five days, some of the sample group received hPE inoculation of a single day 1 (seeding date on the day), another sample group received one and three days after 2 doses, different sample groups 1, 3, and day 4 were vaccinated three times.

젤라틴 미세입자 제조 . Producing gelatin microparticles. (Tabata) 등 (젤라틴 미세입자의 제조와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다) 33 에 의해 기술된 방법을 사용하여 젤라틴 미세입자를 제조하였다. (Hereby incorporated by reference herein in relation to the manufacture of gelatin microparticles) (Tabata), etc. to prepare a gelatin microparticles using the method described by 33. 사용된 모든 시약은 피셔 사이언티픽으로부터 입수하였다. All reagents used were obtained from Fisher Scientific. 간략하면, 1 g의 젤라틴을 9 mL의 탈이온수에 첨가함으로써 10% wt B형 젤라틴 수용액을 제조하였다. In short, the addition of gelatin of 1 g of deionized water was prepared in 9 mL of 10 wt% aqueous solution of B-type gelatin. 온도를 45℃로 승온시키고, 용액을 400 rpm으로 일정하게 교반하면서, 시린지 및 21 G 니들을 통해 375 ml의 가온(45℃) 올리브 오일에 적가하였다. The temperature was raised to 45 ℃, while stirring the solution constant at 400 rpm, it was dropped through a syringe and 21 G needle into the heated (45 ℃) olive oil 375 ml. 10 min 후, 에멀젼 온도를 15℃로 감온시키고, 30 min 동안 계속해서 교반함으로써 겔화를 유도하였다. 10 min later, and the heat-sensing the emulsion temperature to 15 ℃, it continued for 30 min to induce gelation by stirring. 100 mL의 냉 아세톤을 첨가하고, 에멀젼을 1시간 동안 교반하였다. Cold acetone was added to a 100 mL, which was then stirred for an hour an emulsion. 진공 여과에 의해 미세입자를 제거하고, 아세톤으로 세척하고, 건조시켰다. Removing the fine particles by vacuum filtration, washed with acetone, and dried. 일단 건조되고 나면, 이를, 0.1% wt의 트윈(Tween) 80 및 0.5% wt의 글루타르알데히드를 함유하는 수용액에 놓았다. Once it is dry, set them, the aqueous solution containing Tween (Tween) 80 and glutaraldehyde in 0.5 wt% of a 0.1% wt. 용액을 4℃에서 15시간 동안 125 rpm으로 일정하게 교반하여 미세입자의 가교결합을 촉진시켰다. The solution was stirred for 15 hours at 4 ℃ constant at 125 rpm to promote the crosslinking of the microparticles. 진공 여과에 의해 가교결합된 미세입자를 수집하고, 탈이온수 중에서 세척한 후, 100 mL의 10 mM 글리신 수용액 중에서 교반하여 임의의 비반응 글루타르알데히드를 차단하였다. After collecting the fine particles crosslinked by vacuum filtration, washed in deionized water, and stirred in a 10 mM aqueous glycine solution was 100 mL of blocking any unreacted glutaraldehyde. 1시간 후, 여과에 의해 다시 미세입자를 수집하고, 탈이온수 중에서 세척하고, 냉동 건조시켰다. After 1 h, and collecting the fine particles again by filtration, washed in deionized water and freeze-dried. 미세입자 1 mg당 100 ㎕의 순수한 hPM을 인큐베이션시켜 가교결합된 냉동 건조시킨 젤라틴 미세입자를 적재하였다. By incubating the pure hPM of microparticles 1 100 ㎕ per mg it was loaded into gelatin microparticles were freeze-dried crosslinked. 혼합물을 최대 속도로 와동시키고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 흡착될 수 있게 하였다. The mixture was vortexed at full speed, and able to be adsorbed by incubation overnight at 4 ℃.

시험관내에서의 In vitro hPE가 적재된 미세입자로부터의 방출 동역학적 성질 . release kinetic properties of the microparticles from the hPE is loaded. 젤라틴 미세입자의 분해 동역학적 성질을 평가하기 위해, 37℃에서 10 mg (건식 중량)의 비가교결합된 블랭크 미세입자를 1 ml의 포스페이트 완충제 염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)(pH 7.4) 중에서 인큐베이션시키고, 단백질 검정용 키트를 사용하여 단백질 방출 동역학적 성질을 hPE가 적재된 가교결합된 미세입자 및 hPE가 적재되지 않은 가교결합된 미세입자로부터의 방출을 비교하였다. In order to evaluate the degradation kinetic properties of gelatin microparticles, non-crosslinked combination of blank microparticles of phosphate buffer saline in 1 ml in 37 ℃ 10 mg (dry weight) (PBS: Phosphate Buffer Saline) are incubated in a (pH 7.4) and, by using the kit for protein test compared the release of the protein from the same release fine mechanical properties combined with a crosslinking hPE that the loaded cross-linked microparticles and hPE is not loaded particles. 간략하면, 각 표본의 상청액을 주기적으로 수집하고(1, 2, 3, 및 6시간 후, 및 이어서, 매일), 새 PBS로 교체하였다. Briefly, the supernatant was collected for each sample, and periodically (1, 2, 3, and 6 hours later, and then every day), and replaced with new PBS. 마이크로 BCA 어세이 키트(Micro BCA Assay Kit) (써모 사이언티픽: 미국 매사추세츠주 월섬)를 이용하여 플레이트 판독기(바이오 테크 시너지 2(Bio Teck Sinergy 2) 플레이트 판독기, 바이오 테크 인스트루먼트, 인크.(Bio Teck Instrument, Inc.: 미국 버몬트주 위누스키))로 562 nm에서 측정된 흡광도를 통해 상청액 중 단백질을 정량화하였다. Micro-BCA assay kit (Micro BCA Assay Kit): The plate reader used (Thermo Scientific, Massachusetts Waltham) (Biotech Synergy 2 (Bio Teck Sinergy 2) plate reader, Bio-Tek Instruments, Inc. (Bio Teck Instrument. , Inc .: quantified protein of the supernatant was measured at 562 nm absorbance by the US VT winu ski)). 단백질 농도를, 농도가 200 내지 0.5 ㎍/mL 범위인, 새로 제조된 소 혈청 알부민 표준과 비교하였다. Of the protein concentration, the concentration is from 200 to 0.5 ㎍ / mL range, and a new comparison with the production of bovine serum albumin standard. 최종 값은 실험 시작으로부터의 전체 단백질 방출량으로서 제시하고, 비가교결합된 블랭크 미세입자 건식 중량의 함수로서, 또는 실험 시작 전의 습식 중량 추정치의 함수로서 정규화한다. The final value is presented as the total discharge amount of the protein from the start of the experiment and, as a function of the normalized non-crosslinked as a function of the combined dry weight of blank microparticles, or the start of the experiment prior to the wet weight estimate. 흡광도 값을 포스페이트 완충처리된 염수(pH 7.4)의 값으로 정규화한다. It normalizes the absorbance values ​​to a value of phosphate buffered saline treatment (pH 7.4). 어세이의 선형 작용 범위는 2-40 ㎍/mL이고, 검출 한계는 0.1 ㎍/mL였다. Linear working range of the assay is 2-40 ㎍ / mL and the detection limit is 0.1 ㎍ / mL was. 각 실험은 3회 반복 수행하였다. Each experiment was performed three times.

3D 시험관내 혈관신생 어세이 제조. 3D vitro vascular manufacture new assay. HUVEC 및 PE가 적재된 미세입자가 포매된 콜라겐 I형 매트릭스를 이용하여 비평면형 3D 시험관내 Using HUVEC and the PE of the fine particles are embedded load collagen type I matrix in vitro non-planar 3D 혈관신생 어세이를 제조하였다. It was prepared in the angiogenesis assay. 8 mL의 냉 비트로겐(Vitrogen) 콜라겐, 1 mL의 멸균 PBS 및 1.166 mL의 0.1 M NaOH 용액을 혼합하여 콜라겐 하이드로겔 매트릭스를 제조하였다. A mixture of cold bits Gen (Vitrogen) 0.1 M NaOH solution of collagen, sterilization of 1 mL PBS and 1.166 mL of 8 mL was prepared in the collagen hydrogel matrix. 용액의 색상이 적색에서 보라색으로 변하는 색 전이가 pH 변화를 나타내었다. The color of the solution turned purple color transition from red exhibited a pH change. 용액의 pH를 pH 종이로 체크하고, 0.1 M NaOH 또는 0.1 M HCl 용액 몇 방울을 적가하여 pH 7.4로 조정하였다. Check the pH of the solution to pH paper and was adjusted to pH 7.4 by dropwise addition of 0.1 M NaOH or 0.1 M HCl solution, a few drops. 앞서 기술된 바와 같이 17 , 겔화 전, 용액 중 3 mL의 HUVEC를 40,000개의 세포/mL의 농도로 첨가하고, 2 mg의 적재된 미세입자를 첨가하였다. 17, as described above, before gelling, the addition of HUVEC in 3 mL of the solution was 40,000 cells / mL concentration of which was added to the loaded microparticles in 2 mg. 이어서, 콜라겐/세포/미세입자 용액을 균질화될 때까지 피펫팅하여 혼합하고, 500 ㎕를 48 웰 플레이트의 각 웰로 피펫팅하였다. Subsequently, the collagen / cell / micro-pipetting and mixed, and 500 ㎕ was pipetted into each well of a 48-well plate until homogenize the particle solution. 콜라겐 겔화를 유도하기 위해, 배양 플레이트를 37℃ 오븐에 30분 동안 높았다. To induce collagen gel was higher for 30 minutes, the culture plate at 37 ℃ oven. 콜라겐 하이드로겔의 최종 두께는 6.6 mm였다. The final thickness of the collagen hydrogel was 6.6 mm. 최종적으로, 100 ㎕/㎠의 혈관신생 배지를 (세포가 시딩되고, 겔화되고, 미세입자 포매된 하이드로겔을 함유하는) 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 습윤화된 5% CO 2 인큐베이터에 놓았다. Finally, 100 ㎕ / ㎠ vascular a new medium of (the cells being seeded and gelation, the fine particles containing the embedded hydrogel) was added to each well, wetting the plates at 37 ℃ Chemistry 5% CO 2 incubator put on.

분석 방법 Analysis Method

칼세인 AM을 이용한 형광 염색 . Fluorescent dye-old with a knife AM. 라이브-데드 어세이(Live-Dead Assay)(인비트로겐-라이프 테크놀로지즈: 미국 뉴욕주)를 이용하여 칼세인 AM 염색을 수행하였다. Live-Dead assay (Live-Dead Assay) -: using (Invitrogen Life Technologies, New York, USA) was performed year-old Carl AM staining. 간략하면, 칼세인 AM을 최종 농도 2 ㎍/ml로 배양 웰에 존재하는 배지에 직접 피펫팅하였다. In short, the knife-old AM to 2 ㎍ / ml final concentration were pipetted directly into the medium present in the culture well. 염색된 세포를 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후, 도립 형광 현미경(자이스 악시오버트 200 인버티드 플루오레센스 마이크로스코프)을 이용하여 관찰하였다. After the stained cells was incubated for 30 min at 37 ℃, it was observed using an inverted fluorescence microscope (Zeiss Ill Make butt 200 Inverted sense fluorescein microscope).

정질적 및 정량적 네트워크 형성 분석. Positive qualitative and quantitative analysis of network formation. 이전 연구에서 수개의 반정량적 및 정량적 방법(이들은 각각 본원에서 참조로 포함된다) 34-37 으로 혈관신생의 시험관내 모델에서 실험 조건에 대한 세포 반응 분석을 수행하였다. Several semi-quantitative and quantitative methods in a previous study (each of which is incorporated by reference herein) were performed with the cell response analysis of the experimental conditions in vitro model of angiogenesis 34-37. 형태학적 파라미터(평균 세관 길이) 및 국소 해부학적 파라미터(분기점 개수 및 메쉬 개수), 이 둘 모두를 고려하였는데, 그 이유는 모세혈관 유사 네트워크 중 EC의 공간 조직의 특성화를 가능하게 하기 때문이다. Were considered both morphological parameters (average customs length) and local anatomic parameters (number of branch point and mesh number), the two, since they enable the characterization of the spatial organization of the network of capillary blood vessels. Similar EC.

세포 염색 후, 각 샘플에 대해 선택된 시야를 사진 촬영하였다. After the stained cells were taken the view selected photos for each sample. 획득한 영상을 분석하였다. The acquired image was analyzed. 이미지J 1.45s(웨인, 라브밴드(Wayne, Rasband) - 미국 국립 보건원(National Institutes of Health: 미국))를 이용하여 획득한 영상을 분석하였다. Image J 1.45s (Wayne, Rab band (Wayne, Rasband) - National Institutes of Health (National Institutes of Health: the United States)) to analyze the acquired image using.

분지가 만나거나, 그로부터 세관의 발아가 이루어지는 마디인 분기점(BP: branch point)을 확인하고, 계수하였다. Met or branched, the branch point node the germination of customs made therefrom: check (BP branch point), and was counted. 또한, 세포 네트워크의 메쉬는 육각형으로 배열된 혈관으로 둘러 싸여져 있는 무혈관 구역으로 확인되었고 38 , 이를 수동으로 계수하였다. In addition, the mesh of the network cell has been identified as avascular zone in a wrapped around the blood vessels arranged in hexagons and counted 38, this manually. 마지막으로, 각 세관을 따라 선(도 8의 줌 영상에서 흰색 점선)을 그림으로써 세관 길이를 평가하고, 상기 선의 측정 길이는 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되었다. Finally, along each line by the customs (the zoom image of Fig white dotted line). Figure evaluate customs length, and the line length measurement has been automatically calculated by the software.

시차 주사 현미경 검사법( SEM : Scanning Electron Microscopy). Differential scanning microscopy (SEM: Scanning Electron Microscopy). 시차 주사 현미경 검사법(S-4000 FE-SEM, 히타치 하이 테크놀러지즈(Hitachi High Technologies: 미국 텍사스주))에 의해 미세입자 표면 구조를 조사하였다. Differential scanning microscopy (S-4000 FE-SEM, Hitachi High Technology's (Hitachi High Technologies: Texas, USA)), the fine particle surface by the structure was examined. 냉동 건조된 샘플을 양면 흑연 테이프를 이용하여 알루미늄 스터브에 탑재하고, 살포기(데스크V(deskV), 덴톤 배큠(Denton Vacuum))를 이용하여 금 및 팔라듐으로 코팅하였다. With the frozen dried sample on an aluminum stub using a double-faced tape and graphite, using spreaders (desk V (deskV), Denton Vacuum (Denton Vacuum)) was coated with gold and palladium. 히타치 S-4000 FE-SEM(미국 텍사스주)을 이용하여 샘플의 영상을 촬영하였다. Using a Hitachi S-4000 FE-SEM (Texas, USA) was taken an image of the sample.

통계학적 분석 . Statistical analysis. 실험은 3중으로 반복 수행하였다. The experiment was repeated in triplicate. 그래프 데이터 및 표로 작성된 데이터는 모두 평균±표준 편차로 제시되었다. Graph data and table data is created were all presented as mean ± SD. SPSS(IBM: 미국 뉴욕주 소머스)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. SPSS (IBM: Somers, New York) was used to perform data analysis. 유의도 검정은 이분산과 함께 독립, 양측, 스튜던츠 t 검정을 이용하여 계산하였다. Significance test was calculated according to the independent, bilateral, stew deoncheu t-test with the variance. 유의 수준을 p < 0.05로 설정하였다. The significance level was set at p <0.05.

결과 result

PE의 혈관신생 잠재성 . Angiogenic potential of PE. 수집된 데이터는 HUVEC의 PE에의 혈관신생 반응 정도는 인큐베이션 시간 및 제공된 PE 접종 횟수에 크게 영향을 받는다는 것을 나타낸다. The data collected by PE degree angiogenic response of HUVEC indicates that maven a significant effect on the incubation time and the number of PE provided inoculation.

인큐베이션 시간의 경우, PE와 함께 인큐베이션된 HUVEC는 인큐베이션 시간의 함수로서 혈관신생 유사 네트워크를 형성하였고, 그의 형태는 달랐다(도 9a-b). If the incubation time, the HUVEC was incubated with PE to form a network similar to angiogenesis as a function of the incubation time, it is different from its shape (Fig. 9a-b). 시딩 후 1일째, HUVEC는 아직 윤곽이 뚜렷한 네트워크를 형성하지 못했다(도 9a, 1일째). 1 day after seeding, HUVEC did not yet form a well-defined network (Fig. 9a, the first day). 메쉬는 많았고(102.67±3.52개), 작았으며, 짧은 세관이 관찰되었다(평균 세관 길이: 78.85±3.24 ㎛). The mesh was followed (102.67 ± 3.52 pieces), it was small, a short customs was observed (mean customs length: 78.85 ± 3.24 ㎛). 또한, 분기점 개수(BP)는 많았지만(105±9.85개), 일부 세포 클러스터의 존재하에서는 확인하기가 어려웠다. Also, the fork has only were many number (BP) (105 ± 9.85 pieces), it was difficult to determine the presence of some of the cell cluster. 배양 3일째(도 9a에서 3일째), 잘 형성된 네트워크가 출현하였다. Culture day 3 (Figure 9a on the third day), and emerge in a well defined network. 이는 또한 더 적은 BP 개수(71±6.25개), 더 긴 세관(평균 길이: 136.43±15.23 ㎛)에 의해, 및 더 넓고, 더 적은 개수의 메쉬(61.33±8.02개)의 존재에 의해 확인된다. It is also less BP number (71 ± 6.25 pieces), the longer customs (average length: 136.43 ± 15.23 ㎛) is confirmed by the presence of, and broader, less the number of meshes (61.33 ± 8.02 dog) by. 배양 5일째(도 9a, 5일째), 네트워크가 여전히 육안으로 관찰되기는 하였지만, 분해되기 시작하였으며: 세관의 길이는 더 길지만(170.56±16.51 ㎛), 개수는 더 적고, 더 가늘었다. Although observation but cultured for 5 days (Fig. 9a, day 5), the network is still the eye, and began to decompose length of Customs it is long, but more (170.56 ± 16.51 ㎛), the number is no less, were more thin. 메쉬는 확인이 어려웠고, 그 개수는 감소되었다(36.33±6.02개). The mesh was confirmed difficult and decreases the number (36.33 ± 6.02 pieces). BP의 경우, 그 개수는 약간 감소하였다(63±4개). In the case of BP, the number was decreased slightly (63 ± 4 pieces). 네트워크 분해는 PE에 함유되어 있는 혈관신생 분자를 세포가 이미 소진하였기 때문일 수도 있다. Network decomposition may be due hayeotgi cells are already used up the angiogenic molecules contained in PE. 대조군 플레이트에서는 어떤 세관 형성도 관찰되지 않았으며(각 영상에서 우측 상단 코너), 이는 세포 형태의 변화는 스트레스 또는 다른 외부 원인에 기인하는 것이 아니라는 것을 시사한다. It was also not observed any customs formed in the control plate (upper right corner in each image), which change the cellular morphology suggest that it is not due to stress or other external causes.

HUVEC의 공간 조직의 반정량적 분석은 도 9b에 히스토그램으로 제시되어 있다. Semi-quantitative analysis of the spatial organization of HUVEC is shown in the histogram in Fig. 9b. 막대는 평균 세관 길이, BP 개수 및 메쉬 개수를 나타낸다. Bars represent the mean length of customs, BP number and mesh count. 고려된 3가지 파라미터 모두에서 1일째와 5일째 사이에 통계학적 차이가 발견되었다는 점에 주목할 수 있다. In consideration of all the three parameters between day 1 and day 5 it may be noteworthy that the statistical difference found.

본 연구에서, 모세혈관 유사 네트워크 형성이 PE 접종 회수에 영향을 받았다(도 10a-b). In this study, the capillaries similar network formation was influenced by PE inoculation number of times (FIG. 10a-b). 평균 세관 길이는 1회 접종받은 세포에서 3회 접종받은 세포로 증가한 반면, BP 개수 및 메쉬 개수, 이 둘 모두는 감소하였다(도 10a 및 10b). The average length of customs, on the other hand, up to three cells inoculated in cell inoculated once, BP number and mesh number, both of which decreased (Figs. 10a and 10b). PE 1회 접종 후, 윤곽이 뚜렷한 네트워크 형성은 없었고: 메쉬는 많았지만(76.67±19.74개), 평균 세관 길이(129.71±12.88 ㎛)에 의해서도 또한 확인되는 바와 같이 확산되지는 않았다(도 10a, 첫번째 패널). After PE 1 doses, there was a network forming well-defined: only were many mesh (76.67 ± 19.74 dog), was not also spread as confirmed by the average customs length (129.71 ± 12.88 ㎛) (Fig. 10a, the first panel). 또한, 수개의 BP(110.78±15.40개) 및 세포 클러스터가 존재하였고, 따라서, 이는 세포가 잘 연결되어 있지는 않았다는 것을 시사한다. In addition, the number of BP (110.78 ± 15.40 dog), and cell cluster was present, and thus suggesting that the cells did itjineun is secure. 2회 접종받은 세포는 네트워크를 형성하였지만, 일부 클러스터는 여전히 존재하였다(도 10a, 두번째 패널). Twice inoculated cells but form a network, some of the cluster was still present (Fig. 10a, second panel). 이는 네트워크가 완전하게 성숙된 상태는 아니었다는 것을 제안하는 것일 수 있다. This may be to suggest that the network is not fully mature state. 그러나, 평균 세관 길이는 증가한 반면(139.91±8.93 ㎛), 메쉬 개수 및 분기점 개수는 감소하였으며(각각 52.67±19.74개 및 84.33±11.86개), 따라서, 이는 네트워크가 윤곽이 더욱 뚜렷한 구조로 변할 가능성이 있었다는 것을 나타낸다. However, the average customs length is increased, whereas (139.91 ± 8.93 ㎛), mesh count, and the branch point number was reduced (each 52.67 ± 19.74 dog and 84.33 ± 11.86 pieces), therefore, this network has the contour potential change to a more pronounced structure It indicates that there was. 3회 접종받은 세포는 더 넓지만, 더 적은 개수의 메쉬(43.89±6.52개), 및 감소된 개수의 BP(80.67±11.92개)를 가졌다(도 10a, 세번째 패널). Three inoculated cells are only more wide, had an (improved 43.89 ± 6.52) less the number of the mesh, and a reduced number of BP (80.67 ± 11.92 dog) (Fig. 10a, the third panel). 세관 길이가 증가하였는데(153.89±8.54 ㎛), 이는 세관이 함께 연결됨으로써 네트워크가 구조가 향상되었다는 것을 제안한다. Were the customs length increase (153.89 ± 8.54 ㎛), which suggests that the network structure is enhanced by being connected with the customs. 상기 경우에서도 또한 대조군 플레이트에서는 어떤 세관 형성도 관찰되지 않았다(각 패널에서 우측 상단 코너). It was not observed any customs formed in the control plate also in the case (upper right corner in each panel).

도 10b의 막대 그래프는 HUVEC의 공간 구조의 반정량적 분석을 나타낸 것이다. The histogram in Fig. 10b shows a semi-quantitative analysis of the spatial structure of the HUVEC. 평균 세관 길이, BP 개수 및 메쉬 개수를 나타내는 막대는 PE를 받은 접종 횟수에 따라 3개 군으로 나뉜다(1, 2, 또는 3군). The average length of customs, a bar indicating the number of BP and mesh number are divided into three groups according to the number of times that the inoculation PE (1, 2, or 3 groups). 데이터는 평균 세관 길이가 1회 접종받은 세포(129.71 ±12.88 ㎛)에서 3회 접종받은 세포(153.89±8.54 ㎛)로 증가하였다는 것을 나타내며, 이는 세포가 더욱 성숙한 네트워크로 조직화되었다는 것을 제안한다. Data indicates that the average length of the customs at once inoculated cells (129.71 ± 12.88 ㎛) received increased in cells (153.89 ± 8.54 ㎛) inoculated three times, which suggests that the cells are organized into a more mature networks. 이러한 관찰 결과는 또한 메쉬 개수(76.67±19.74개에서 43.89±6.52개로), 및 BP 개수(110.78±15.40개에서 80.67±11.92개로), 둘 모두가 감소하였다는 관찰 결과를 통해 지지된다. This observation is further supported by the observation result is a mesh number (from 76.67 ± 19.74 43.89 ± 6.52 two pieces), and the number of BP (110.78 ± 15.40 80.67 ± 11.92 in the two open-circuit), both are decreased. 수행된 통계학적 분석 결과, 1회 접종받은 세포와 3회 접종받은 세포 사이에 3가지 파라미터 모두에서 차이가 발견되었다. The statistical analyzes performed result, differences were found in all three parameters between the first cell and the doses received 3 doses received cells.

추출물의 생체활성 유지와 관련하여, 이는 37℃에서 습윤화된 5% CO 2 인큐베이터에서의 보관 15일째까지 그의 혈관신생 잠재성을 유지한다(도 11). With regard to maintaining bioactivity of the extract, which retains its angiogenic potential of up to 15 days storage in wetting a 5% CO 2 incubator at 37 ℃ (Fig. 11). 보관 1일째내지 7일째 사이에는 어떤 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. Any significant differences between storage day 1 to day 7 was not observed. PE의 상기 특징들 모두를 고려하였을 때, 이는 시간 경과에 따라 일정하고, 지속적으로 방출하는 데 적합한 것으로 간주되었다. When considering all of the features of the PE, which was considered to be suitable for constant and continuous release as with the lapse of time.

젤라틴 미세입자의 특성화 . Characterization of the gelatin microparticles. 여러 제제의 젤라틴 미세입자의 크기 분포 분석 결과, 그의 크기 범위가 20.886±3.53 내지 124.083±13.01 ㎛인 것으로 나타났다. Of gelatin microparticles of various formulations size distribution analysis showed that his size range of from 3.53 to 20.886 ± 124.083 ± 13.01 ㎛. 그의 거의 80%의 직경은 20-80 ㎛ 범위였다(도 12b). The diameter of its almost 80% was 20-80 ㎛ range (Fig. 12b). 미세입자를 SEM으로 검사하였을 때, 도 12a에 도시된 바와 같이, 블랭크 미세입자와 적재된 미세입자 사이에는 표면 형태상의 차이가 있는 것으로 나타났다. When checking the fine particles by SEM, between the, fine-particle loaded with blank microparticles, as shown in Figure 12a it is shown that there is a difference in surface morphology. 블랭크 미세입자(윗줄)는 매끈한 표면 및 규칙적인 형상을 나타내었다. Blank microparticles (upper line) exhibited a smooth surface and a regular shape. 적재 후(아랫줄), 입자의 크기는 더 컸고, 불규칙적인 표면을 가졌다. After the loading (bottom row), the size of the particles is more loud, and had an irregular surface. 이는 (i) PE의 표면에의 부착(흡착), 및 (ii) PE의 입자 내부로의 침투(흡수)라는 2가지 측면을 암시한다 27 . This suggests the two terms of (i) adhering to the surface of the PE (adsorption), and (ii) infiltration (absorption) of the particles inside the PE 27.

도 13은 비가교결합된 미세입자의 분해 프로파일을 보여주는 것이다. 13 is showing the dissolution profile of microparticles of the non-crosslinked binding. 본 실험은 PBS 중 젤라틴의 분해 동역학적 성질을 평가하기 위해 오직 블랭크 미세입자만을 사용하여 수행하였다. This experiment was carried out using only the blank only fine particles in order to evaluate the degradation kinetic properties of gelatin in PBS. 초기 버스트가 관찰되었는 데: 6시간 후, 누적 방출률(%)은 6.45%±0.12였다(도 13, 삽도). Doeeotneun having an initial burst observed after 6 hours, is 6.45% cumulative release rate (%) was 0.12 ± (13, sapdo). 이어서, 버스트 후, 저속화된 방출이 이루어졌다. Then, after the burst, the slowing release was done. 20일 후, 전체 누적 방출률은 18.65%±0.09였다(도 13, 주요 그래프). 20 days later, the total cumulative release rate was 18.65% ± 0.09 (Fig. 13, the main graph).

도 14a는 블랭크 미세입자의 시험관내 분해(검은색, PE 없음) 및 PE가 적재된 미세입자의 시험관내 방출(회색 PE)을 보여주는 것이다. Figure 14a is showing the in vitro degradation (black, PE N) and PE are in vitro release of the micro-loading particles (gray PE) of the blank microparticles. 상기 두 경우 모두에서, 작은 초기 버스트가 관찰되었다. In both cases the two, a small initial burst was observed. 48시간 후, 적재된 미세입자로부터의 누적 방출률(%)은 1.03%±0.08인 반면, 블랭크 미세입자의 경우에는 0.76%±0.05였으며, 상기 두 경우 모두에서, 그 이후에는 방출이 거의 일정하게 일어났다. After 48 hours, the cumulative release rate (%) from the loading fine particles is 1.03% ± 0.08 On the other hand, in the case of the blank, the fine particles was 0.76% ± 0.05, in both cases the two, after which happened to emit a substantially constant . 22일 후, 그래프에서도 또한 강조 표시되어 있는 바와 같이, 각각 각각 4.65%±0.07 및 4.65%±0.11로, 적재된 미세입자 및 블랭크 미세입자로부터의 누적 방출률(%)은 거의 동일하였다. 22 days later, as is also highlighted in the graph, respectively, and 4.65% ± 0.07 4.65% ± 0.11, respectively, the cumulative release rate (%) from the loaded microparticles and the blank microparticles was substantially the same. 23일째, 블랭크 미세입자로부터의 방출이 적재된 입자로부터의 것보다 약간 더 컸다(각각 5.18±0.05 및 4.92±0.09). 23 days after, the blank slightly greater than that of the discharge from the loading of particles from the fine particles (respectively 5.18 ± 0.05 and 4.92 ± 0.09). PE 대부분이 방출되었다는 증거에 기초하여, 본 실험을 종결지었다. Based on the evidence that most PE was released, it smiled terminate this experiment.

도 14b는 적재된 미세입자와 블랭크 미세입자 사이의 시험관내 방출률 차이(%)를 보여주는 것이다. Figure 14b is to show the in vitro release rate difference (%) between the loaded microparticles and the blank microparticles. 처음 1시간째부터 5일째까지에서 첫번째 피크, 및 5일째부터 22일째까지에서 두번째 피크인, 2개의 피크를 관찰할 수 있다. The first peak from the first in at 1 hour to 5 days, and the second peak at from day 5 to day 22, one can observe two peaks. 첫번째 피크는 입자 표면에 결합되어 있던 PE가 처음에 내지 단시간 경과 후에 방출되었다는 것을 나타낸다. The first peak indicates that the PE which has been bonded to the surface of the particles to that in the initial release after a short time lapse. 가능하게는 입자의 벌크 부식에 기인하는 것일 수 있는 두번째 피크는 더 긴 시간 동안 지속되고, 전체 누적 방출률은 더 크다. Possibly a second peak which could be attributed to corrosion of bulk particles is continued for a longer period of time, total cumulative release rate is greater. 이는 PE가 방출 매질에 의해 형성된 미세입자 중의 공극 또는 채널로부터 점진적으로 방출된다는 것을 나타내는 것이다. This indicates that PE is gradually released from the pores or channels in the fine particles formed by the release medium.

초기 "버스트"가 존재함에도 불구하고, 여과를 거쳐 수득된 미세입자로부터 나타난 방출 동역학적 성질은 0차 프로파일에 가까운데, 이는 방출이 거의 일정하게 일어난다는 것을 의미한다. Although the initial "burst" is present, and the release kinetic properties indicated from the fine particles obtained by the filtration was gakkaunde to the zero order profile, which means that the release is substantially constant occurs. 이는 같은 샘플 중에 크기가 다른 입자들이 공존하기 때문에 일어날 수 있다고 본 발명자들은 주장하고 있다. This present inventors that the size of the sample can occur due to other particles coexist argue. 방출 속도는 입자 크기에 의해 영향을 받는데, 정확하게는, 표면적 대 부피 비의 증가의 결과로서, 더 작은 미세입자가 더욱 크게 방출된다. The release rate is influenced by the particle size, precisely, is released as a result of the increase in the surface area to volume ratio, the more the smaller fine particles even larger. 이러한 현상은 거의 0차에 가까운 조절형 방출 프로파일을 달성하기 위해 약물 또는 단백질 방출을 조절하는 데 이미 사용되어 오고 있다 25 . This phenomenon has been already used to control the drug release or proteins in order to achieve close control type in almost zero-order release profile of 25.

블랭크 미세입자 및 적재된 미세입자, 둘 모두로부터 방출되는 전체 누적 방출량은 보통 20% 초과인 것으로 문헌상에 보고된 값보다 다소 더 낮다 39 ,40 . Blank microparticles and loaded microparticles, total accumulated emission amount emitted from the both is usually 20% greater than that of slightly lower than the values reported in the literature 39,40. 이는 가교결합도가 높은 것에 기인할 수 있다. This may be due to a high degree of crosslinking.

3D 시험관내 혈관신생 어세이 . 3D in vitro angiogenesis assays. 최적의 세포 밀도 및 PE 부피를 결정한 후, 상기 방법에 기술된 바와 같이 혈관신생 어세이를 제조하였다. After determining the optimal cell density and volume of PE, as described in the method to prepare the angiogenesis assay. 배양 3일 후, 관형성에 관한 어떤 징후도 없었고, HUVEC가 시딩되고, PE가 적재된 미세입자와 대조군 사이에는 어떤 차이도 관찰할 수 없었다(결과는 나타내지 않음). There was no indication about 3 days after incubation, the tube is formed, the HUVEC was able to be seeded, observed no differences between microparticles the PE is loaded with the control (results not shown). 배양 5일 후, 비록 모세혈관 유사 네트워크가 아직 형성되지는 않았지만, 세포 형태 변화 및 발아가 관찰되었다(도 15). After 5 day culture, although the capillary network is similar, although not yet formed, cell morphological changes, and germination was observed (Fig. 15). 발아는 혈관신생의 초기 단계인 바, 따라서, 배양 5일 후, 발아가 존재한다는 것은 HUVEC로부터의 혈관신생 반응을 입증하는 것이다 41 . Germination is that after 5 days thus the bar and the early stages of angiogenesis, culture, germination is present to demonstrate the angiogenic response 41 from HUVEC. 시딩 후 3일 경과 후에도 네트워크는 형성되지 않았기 때문에, 입자에 의해 방출되는 PE 방출량이 관찰되는 기간에 혈관신생을 촉진시키는 데에는 충분하지 않을 수도 있다. Since seeding after the network did not form even after 3 days, may not be sufficient There to promote angiogenesis in the period PE emission amount emitted by the particles is observed. 그러나, 발아 형성은 PE가 방출되었고, 혈관신생 반응이 개시되었다는 것을 시사하는 것이다. However, germination was formed PE is released, to suggest that the start of the angiogenic response. 미세입자의 방출 속도는 더욱 짧은 기간에 세관 형성을 촉진시키도록 최적화될 수 있다. The release rate of the fine particles may be optimized to facilitate customs formed in a shorter period of time.

논의 & 결론 Discussion and conclusions

본 실시예는 관찰 결과는 HUVEC의 혈관신생 반응이 인큐베이션 시간 뿐만 아니라, 받는 PE 접종 횟수에 의해서도 영향을 받는다는 것을 나타낸다. This embodiment observations as well as the angiogenic response incubation time of HUVEC, indicates that affected by the receiving PE number inoculated. 특히, 초기 실험에서, 모세혈관 네트워크는 시딩 후 1일째 형성되기 시작하여 3일 후에는 윤곽이 뚜렷해졌고, 5일 후에는 분해되기 시작하였다. Specifically, in the initial experiments, the capillary network is started to form after seeded on day 1 is outlined became apparent after 3 days, 5 days later, and started to decompose. HUVEC는 PE를 1회 초과로 받았을 때, 더욱 성숙한 모세혈관 네트워크를 형성한 것으로도 나타났다. HUVEC were also that when receiving the PE in greater than 1 times to form a more mature capillary networks. 추가로, 본 실시예에서, 네트워크는 상기 논의된 실험에서와 같이 5일 경과 후 분해되지는 않았다. Further, in this embodiment, the network was not decomposed after 5 days as in the experiments discussed above. 마지막으로, 추출물은 보관 15일째까지는 그의 혈관신생 잠재성을 유지한다. Finally, the extract is maintained his angiogenic potential of up to 15 days storage. PE의 상기 특징들 모두를 고려하였을 때, 이는 시간 경과에 따라 일정하고, 지속적으로 방출하는 데 적합한 것으로 간주될 수 있다. When considering all of the above characteristics of PE, it may be considered suitable for constant and continuous release as with the lapse of time. 따라서, 혈관신생을 유도하고, 조절할 수 있는 PE의 능력을 개선시키는 것을 목표로 생체활성을 추가로 보존하고, hPE의 방출을 조절하고 연장시키기 위해 생분해성 젤라틴 미세입자를 이용하는, 다중 단백질 혼합물용의 약물 전달 방법이 개발되었다. Thus, for induction of angiogenesis, and aims to improve the ability of the PE that can be adjusted to preserve further the bioactivity, using a biodegradable gelatin microparticles in order to control the release of hPE extending, multi-protein mixture the drug delivery methods have been developed.

이러한 목적을 위해, PE를 위한 전달 시스템으로서 생분해성 젤라틴 미세입자를 제조하였다. For this purpose, as a delivery system for the PE was prepared in a biodegradable gelatin microparticles. SEM 검사에 의해, 및 시험관내 방출 동역학적 성질 분석에 의해 hPE의 젤라틴 입자로의 흡수 및 흡착을 평가하였다. By SEM examination, and the same in vitro release were evaluated for absorption and adsorption of the gelatin particles of hPE by the mechanical properties analysis. SEM 분석 결과, 적재된 입자 및 블랭크 입자 사이에 크기 증가 및 형태 변화가 있는 것으로 나타났는데, 이는 hPE의 표면에의 부착(흡착), 및/또는 입자 내로의 침투(흡수)의 결과이다. SEM analysis, was shown between the loaded particles and the blank particles that increase in size and shape changes, which are the result of infiltration (absorption) into the mounting (adsorption), and / or particles in the surface of hPE. 방출 동역학적 성질은 2개의 피크를 보였는데, 첫번째 피크는 미세입자 표면에 결합되어 있던 단백질 방출의 결과인 것으로 간주되며, 이 피크는 두번째 피크보다 더 작고, 더욱 짧은 기간 동안에 걸쳐 발생하였다. Release kinetic properties beam 2 was a single peak, the first peak is considered to be the result of protein released was bonded to the fine particle surface, the peak occurred over a period of smaller and shorter duration than the second peak. 두번째 피크는 벌크 부식의 결과인 것으로 간주되었는데, 그 이유는 더 긴 기간 동안에 걸쳐 더 높은 전체 누적 방출률을 보였기 때문이다. The second peak was considered to be the result of a bulk erosion, since it seemed a higher total cumulative release rate over a period longer period. 초기 "버스트"에도 불구하고, 방출 동역학적 성질은 1일째 이후, 0차 프로파일에 가까웠다. Despite the initial "burst", and the release kinetic properties was close after the first day, the zero-order profile. 본 분석 결과, 입자는 3D 시험관내 혈관신생 어세이에서 추출물의 지속적인 방출을 위한 비히클로서 사용하는 데 적합하였다는 것으로 나타났다. The analysis results, the particle was found to have been suitable for use as a vehicle for sustained release of the extract in the 3D in vitro angiogenesis assay.

본 연구는 또한 3D I형 콜라겐 매트릭스 내로 도입되었을 때, hPE가 적재된 젤라틴 미세입자는 배양 5일 후 세포를 장방형 형태로 유도하였고, 일부 세포 발아와 함께 세관 형성의 초기 단계를 유도하였다는 것을 나타낸다(도 15, 우측). This study also shows that was hPE is loaded gelatin microparticles was induced after 5 days incubation the cells in a rectangular form, induced an initial stage of the customs formed with some cells germination when introduced into the 3D I collagen matrix (Figure 15, right). 발아가 혈관신생의 초기 단계이기 때문에, 발아 존재가 HUVEC로부터의 혈관신생 반응을 암시한다. Because of the germination is the early stages of angiogenesis, are present germination suggests angiogenic response from HUVEC. 23일 후 관찰되는, 블랭크 미세입자 및 적재된 미세입자, 둘 모두로부터의 방출되는 전체 누적 방출률은 거의 5%였고, 이는 젤라틴 미세입자로부터 단일 단백질이 방출될 때의 값인, 문헌상에 보고된 20-30%인 값보다 유의적으로 더 낮은 값이다. The 23, the blank microparticles and a total cumulative release rate that is released from the loaded microparticles, both observed and then was nearly 5%, which is reported to the value, the literature of the time the release is a single protein from gelatin microparticles 20 a lower value significantly higher than the 30% value. 누적 방출률이 낮음에도 불구하고, 입자에 의해 방출되는 hPE 농도는 콜라겐 하이드로겔 내에서 혈관신생 반응을 일으키는 데 충분할 정도로 여전히 높았다. Despite the cumulative release rate is low and, hPE density emitted by the particles is still high enough to collagen in the hydrogel causes the angiogenic response. 따라서, 콜라겐 하이드로겔에 포매된, hPE가 적재된 젤라틴 미세입자는 항혈관신생 암 약물 스크린에서부터 세관 및 혈관신생 네트워크 형성에 관한 기계론적 연구에 이르는 범위에서의 사용을 포함하는 시험관내 혈관신생 어세이에서 잠재적으로 적용된다. Thus, the gelatin microparticles the hPE is loaded and embedded in collagen hydrogel is air vitro angiogenesis comprising the use of the range from a mechanistic study on the customs and angiogenesis network formed from anti-angiogenesis cancer drug screen assay in potentially apply.

전반적으로, 본 실시예는 생분해성 젤라틴 미세입자가 3D 혈관신생 어세이에서 다중 단백질 hPE의 지속적인 방출을 위한 비히클로서 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. Overall, this example demonstrated that gelatin biodegradable microparticles can be used as a vehicle for sustained release of a multi-protein hPE the 3D angiogenesis assay. 세포 발아는 hPE가 적재된 젤라틴 미세입자를 사용하였을 때, 배양 5일 후에 관찰되었지만, 서로 연결된 모세혈관 네트워크는 형성되지 않았다. Cell germination when using a gelatin fine particles hPE is loaded, the culture was observed after five days, did not form capillary networks are connected to each other. 입자에 의해 방출되는 hPM 방출량 증가 또는 배양 시간 연장이 더욱 많이 서로 연결된 모세혈관 네트워크의 형성을 촉진시킬 수 있다. Increases hPM emission amount emitted by the particles or extending the incubation time may promote formation of capillary networks more and more connected to each other.

실시예 Example 2에 대한 참고 문헌 References for the two

Figure pct00006

Figure pct00007

Figure pct00008

실시예 3 Example 3

혈관신생을 조절하기 위한 PLGA 미세입자로부터의 태반 추출물 방출 Placenta extract release from PLGA microparticles for regulating angiogenesis

도입 Introduced

상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, 본 개시내용의 인간 태반 추출물의 단일 투여는 시험관내 및 생체내 혈관신생의 초기 단계를 유도하고, 조절하는 것으로 밝혀졌다. As described in Example 1 above, it was found to single administration of the human placenta extract of the present disclosure is induced in vitro and in vivo early stages of angiogenesis, and control. 시간 경과에 따른 hPM의 다중 투여가 추가의 모세혈관 네트워크 발생을 촉진시키는 것으로 나타났으며, 따라서, 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이, 조절형 전달이 장기간 동안에 걸쳐 네트워크 형성을 추가로 안정화시킨다는 가설이 제기되었다. Was found to be a multiple dose of hPM over time to facilitate the additional capillary network occurs, and thus, as described in Example 2, the hypotheses are adjustable transmission sikindaneun additional stabilization to the network formed over a period of long-term this was raised. 본 실시예에서는, 방출 기간을 연장시키기 위해, hPE를 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세입자에 캡슐화하였다. In this embodiment, in order to extend the release period, the hPE was encapsulated in poly (lactic-glycolic acid-co) (PLGA) microparticles. 미세입자 제제를 hPE 적재를 위해 최적화하고, 형태학적 특징(크기, 캡슐화 효율, 다공성)을 특성화하고, 단백질 방출을 프로파일링하였다. Microparticles formulation optimized for hPE loading and characterize the morphological features (size, encapsulation efficiency, porosity), and profile the protein release.

이식된 조직 또는 조직 구조물의 경우 혈관신생을 유도하는 데 있어 상기 확인된 문제점들을 극복하기 위해, 본 개시내용의 방법에서는 인간 태반을 사용하여 상기 실시예에 기술된 바와 같이, 모세혈관 네트워크 형성을 유도할 수 있고, 혈관신생 및 면역조절 단백질을 함유하는, 본 실시예에서는 인간 태반 매트릭스(hPM)로 지칭되는 인간 태반 추출물을 얻었다. In the case of the transplanted tissue or tissue structures I to induce angiogenesis in order to overcome the identified problems, the method of the present disclosure, as described in the above embodiment using the human placenta, leading to capillary network formation can have, in the embodiment containing angiogenic and immunomodulatory protein, in this example to obtain a human placenta extract, it referred to as the human placenta matrix (hPM). 시험관내에서 hPM 상에 시딩된 내피 세포(HUVEC)는 상기에서 혈관신생 유전자의 상향조절과 함께 혈관신생 네트워크를 형성하는 것으로 나타났고, 생체내에서 매트릭스는 조직 섬유화는 억제시키면서, 투여된 바이오스캐폴드 내에서 혈관 형성을 유도하는 것으로 나타났다. The endothelial cells (HUVEC) are seeded in vitro in the hPM folded appeared to form the angiogenesis network with up-regulation of the angiogenic genes at the, in vivo, the matrix is ​​tissue fibrosis while inhibiting the administration BIOS caviar It has been shown to induce angiogenesis in the. 추가로, 일정한 시점(배양 1일째, 3일째 및 5일째) 다회에 걸쳐 hPM 접종을 받은 내피 세포는, 그의 네트워크가 5일 후에는 분해되기 시작하는 단 1회의 접종만을 받은 세포와 비교하였을 때, 더욱 안정적이고, 더 오랫 동안 지속되는 혈관신생 네트워크를 형성하였다. In addition, the constant time (culture day 1, day 3 and day 5), endothelial cells received hPM inoculated over a multidose, when his network is compared with received only a single one time of inoculation to start degradation after five days the cells, and more reliable to form the angiogenesis network that lasts for longer. 따라서, 더 오랫 동안 지속되고, 더욱 안정적인 모세혈관 네트워크가 형성될 수 있도록 하기 위해 시간 경과에 따라 매트릭스를 조절형으로 전달하기 위한 접근법을 연구하였다. Thus, continued for longer, an approach for communicating the control matrix type were studied over time to a more stable so that the capillary network may be formed.

h PM의 복합적이고, 이종성인 성질이 조절형 방출의 기전을 복잡하게 만들 수 있다. This complex and, heterologous nature of h PM may complicate the mechanism of controlled release form. 예를 들어, 조절형 방출에 사용되는 물질과의 상반 상호작용 및 상호작용 때문에, 단백질의 상이한 전하 및 쇄 특성이 적재율에 영향을 미칠 수 있다. For example, because of conflicting interaction and interaction with the material used for the controlled release type, the different charge characteristics of the protein chain, and it can affect the deposition rate. 천연 및 합성 미세입자 물질, 둘 모두, 단백질을 캡슐화할 수 있는 그의 잠재성에 대하여 조사하였다. Natural and synthetic fine particulate matter, both, were investigated for their potential gender that can encapsulate the protein. 천연 물질, 예컨대, 콜라겐, 키토산, 및 알기네이트는 생체적합성 및 비공격적인 캡슐화 기술을 제공하고, 그의 분해 속도는 약 7 내지 10일인데, 이는 어느 정도의 지속적인 방출을 허용하기는 하지만, 보다 장기간 동안 단백질을 지속적으로 방출하는 데 사용하는 것은 제한할 수 있다 11 , 12, 13 . Natural materials, such as collagen, chitosan, and alginate is a biocompatible and non-inde provide aggressive encapsulation technology, and about 7 to 10 days, its decomposition rate, which is to allow a degree of sustained release of, but for a more extended period of time it may limit 11, 12, 13 used to continuously release the protein. 화학적 또는 광화학적 가교결합이 상기 미세입자의 분해를 저속화시킬 수 있다 9 , 14 . A chemical or photochemical cross-linking can be slowing the degradation of the fine particles 9 and 14.

PLA-공중합체는 생체의학적 적용에서 단백질 캡슐화를 위해 사용되어 왔고, 이는 FDA의 승인을 받은 생체적합성 합성 물질이다 15 ,16,17 . PLA- copolymers have been used to encapsulate proteins in vivo medical applications, which is a biocompatible synthetic materials that are approved by the FDA in the 15, 16 and 17. 상기 중합체는 장기 지속적인 조절 방식으로 단백질을 방출할 수 있고, 복합물 및 다층 미세입자를 생성하는 데 사용될 수 있다 15 ,18 . The polymer may be released protein in the long run continuous adjustment method may be used to create a complex and multi-layered fine particles 15 and 18. 이러한 물질들 중에서, PLGA 또는 폴리(락틱-코-글리콜산)이 특정 성장 인자 (예컨대, BMP, VEGF, bFGF)의 조절형 방출을 위해 사용된다 19 , 20, 21 . Among these materials, or a PLGA poly (lactic-co-glycolic acid) it is used for the controlled release of the type-specific growth factors (e.g., BMP, VEGF, bFGF) 19 , 20, 21.

많은 연구들을 통해 단일 단백질의 PLGA 캡슐화가 평가되었고, 여러 연구들은 다중 단백질의 공동 캡슐화에 대하여 조사해 왔지만 22 , 23 어떤 연구에서도 단백질로 이루어진 복합 이종성 혼합물의 캡슐화에 대해 평가한 바는 없다. Through a number of studies were evaluated PLGA encapsulation of a single protein, several studies have not examined came against the co-encapsulated 22 and 23 bar in a review for the encapsulation of complex heterogeneous mixture of proteins in any study of multiple proteins. 본 실시예는 PLGA 미세입자를 사용하는 hPM에 대한 조성 및 캡슐화 기술을 설명하고, 내피 세포의 3D 배양물에서의 상기 혼합물의 조절형 방출의 효과를 평가한다. This example illustrates the composition and encapsulation techniques for the hPM using the PLGA microparticles, and evaluate the effectiveness of the adjustable discharge of the mixed substance in the 3D cultures of endothelial cells.

hPM이 이종성 조성물임을 고려하여, 본 실시예에 기술되는 본 실시양태에서는 다중 단백질 hPM 방출을 세포 배양물에서의 적용에 맞게 적합화하기 위해 PLGA 합성 프로토콜을 최적화하였다. Considering that hPM the heterologous compositions, according to the present embodiment will be described with the present embodiment were optimized PLGA synthesis protocol to adapted for a multi-protein hPM emission on the application of the cell culture. 고려 사항으로는 (재생 의학 적용에 적합한) 미세입자 크기 최적화, 높은 적재율 및 캡슐화 효율, 낮은 초기 버스트, 및 조절형 방출 프로파일을 포함하였다. It was considerations comprises a fine particle size optimization, a high deposition rate and encapsulation efficiency, low initial burst, and adjustable release profile (suitable for the regenerative medicine application). 추가로, hPM이 내피 세포를 사용하여 혈관신생을 유도하는 적절한 농도로 미세입자로부터 방출되었다는 것을 확인하였다. In addition, it was confirmed that the hPM is emitted from the fine particles to the appropriate concentration using endothelial cells to induce angiogenesis. 미세입자 합성 및 적재 후, 캡슐화 공정이 hPM 단백질에 선택적인지 여부를 평가하는 분석을 수행하였다. After synthesis and loaded microparticles, the encapsulation process was carried out for analysis to evaluate whether a selective hPM protein. HUVEC가 시딩된 알기네이트 기반 하이드로겔로 포맷된 hPM이 적재된 미세입자를 포함하는 3D 배양 시스템을 사용하여 hPM의 조절형 방출이 혈관신생 유도에 미치는 효과를 평가하였다. HUVEC is formatted with the alginate-based hydrogel seeding hPM using this 3D culture system containing the stack of the fine particles of controlled hPM-type emission is evaluated for effects on angiogenesis induced. 28일 동안 특정 시점에 세포 거동을 평가하여 배양 전 기간 동안에 걸쳐 PLGA 미세입자로부터 조절 방식으로 hPM을 투여받은 세포와의 비교로 hPM을 1일째 단일의 직접 접종으로 받은 세포 사이의 반응을 평가하였다. For 28 days to evaluate the reaction between the specific and the time of evaluating the cell behavior culture entire period during over PLGA micro-cells received hPM the first direct inoculation of day single in comparison with the cells treated with hPM a controlled manner from the particles.

방법 Way

다중 볼루스 Multiple bolus hPM 접종이 미치는 효과 . Effect of vaccination on hPM. 피펫핑하고, 1분 동안 30 rpm으로 회전형 진탕기를 이용하여 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰을 고르게 코팅함으로써 시험관내에서 HUVEC를 사용하여 혈관신생 네트워크 형성 동안 hPM 투약 프로파일의 효과 분석을 확인하였다. Pipette tang, using the HUVEC in vitro by evenly coating the well of a 96 well tissue culture plates by using a rotary shaker at 30 rpm for 1 min to determine the effect analysis of hPM dosage profile for angiogenesis network formation. 이어서, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 hPM을 가온시켰다. Then, the plate was incubated at 37 ℃ for 30 minutes then allowed to warm to hPM. HUVEC를 혈관신생 배지에 현탁시키고, hPM 상부에 피펫팅한 후, 37℃에서 습윤화된 6% CO 2 인큐베이터에 놓았다. HUVEC were suspended in medium and angiogenesis and placed on hPM after pipetting in the top, 37 ℃ wetted with 6% CO 2 in an incubator. 대조군의 경우, HUVEC를 혈관신생성 배지에 20,000개의 세포/㎠로 배양하였다. For the control group, was incubated with 20,000 HUVEC cells / ㎠ to generate new blood vessels medium. hPM 접종의 3가지 상이한 프로파일: 1) hPM을 오직 1일째(시딩 당일)에만 접종, 2) 1) hPM을 1 및 3일째 접종, 및 3) 1) hPM을 1, 3, 및 5일째 접종한 것을 비교하였다. Three different profiles of hPM inoculation: 1) only the first day of the hPM (only inoculation, second seeded the same day)) 1) hPM 1 and 3 days after immunization, and 3) 1) a hPM 1, 3, and 5 days after vaccination the compared to. 세포를 7일 동안 배양하고, 3 및 5일째 배지를 교체하였다. Cells were incubated for 7 days, followed by replacing the third and fifth day the medium. 대조군으로서, 세포를 플레이트의 바닥에 직접 같은 밀도로 직접 시딩하였고, 배지를 2일마다 교체하였다. As a control, cells were seeded directly into direct same density in the bottom of the plate, the medium was replaced every two days. 세포를 7일째 염색하고, 형광 현미경으로 영상화하고, "혈관신생 정량화" 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 영상을 분석하여 혈관신생을 정량화하였다. Staining the cells on day 7, and imaged with a fluorescence microscope, and analyzing the image as described in "quantify angiogenesis" section were quantified angiogenesis.

PLGA 미세입자 제조 . Manufacturing PLGA microparticles. 수중유중수 에멀젼(프로토콜 1) (듀렉트(Durect: 미국 캘리포니아주 쿠퍼티노))을 이용하여 PLGA(폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)) 미세입자를 제조하였다. The oil-in-water emulsion (protocol 1) (dew collected (Durect: California Cupertino)) using the PLGA (poly (DL- lactide-co-glycolide)) microparticles were prepared. 앞서 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 hPM 단백질 혼합물을 사용하여 한 수용액(W1)을 제조하고, 나머지 다른 한 수용액(W2)은 100 mL의 DI 수에 2 g의 폴리비닐 알콜(wt 30,000-70,000, 87-90% 가수분해, 시그마-알드리치: 미국 미주리주 세인트 루이스)을 용해시켜 제조하였다. Above in Example 1 as described in use hPM protein mixture to prepare an aqueous solution (W1), and the other an aqueous solution (W2) is polyvinyl alcohol and 2 g of a number of 100 mL DI (wt 30,000-70,000 , 87-90% hydrolyzed, Sigma-Aldrich was prepared by dissolving in St. Louis, Missouri, USA). 오일 용액(O)은 상기 용액이 투명하게 보일 때까지 3 mL의 클로로포름 중에 90 mg의 PLGA를 용해시킴으로써 수득하였다. Oil solutions (O) was obtained by dissolving 90 mg of PLGA in 3 mL of chloroform until the solution looks transparent. W1을 O에 첨가하고, 1분 동안 20,000 rpm으로 균질화하였다. W1 was added to O, and the mixture was homogenized with 20,000 rpm for 1 minute. 300 rpm으로 교반하면서, 마이크로피펫을 사용하여 수득한 1차 에멀젼을 W2에 적가하였다. With stirring at 300 rpm, using a micropipette it is added dropwise a primary emulsion obtained in W2. 1차 에멀젼을 모두 첨가하였을 때, 생성된 2차 에멀젼을 느슨하게 알루미늄 호일로 덮고, 흄 후드에서 밤새도록 교반(300 rpm)되도록 하여 용매를 증발시켰다. When all was added to the first emulsion, the second emulsion loosely generated is covered with aluminum foil, and the solvent was evaporated and allowed to stir (300 rpm) overnight in the fume hood. 이어서, 2차 에멀젼을 10분 동안 1,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, DI 수로 2회 초과로 미세입자를 세척하였다. Then, the washed microparticles by centrifugation a second emulsion of 10 minutes and 1,000 rpm while, the supernatant was removed, and the excess DI water twice. 경화된 미세입자를 DI 수에 현탁시키고, 48시간 동안 냉동 건조시킨 후, 필요시까지 4℃에서 보관하였다. After the hardened microparticles were suspended in DI can, freeze-dried for 48 hours and stored at 4 ℃ until needed. 대조군의 경우, W1을 제조하는 데 hPM(시그마-알드리치: 미국 미주리주 세인트 루이스) 대신 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin)으로 치환하여 단일 단백질이 적재된 PLGA 미세입자를 생성하였다. For the control group, to prepare a W1 hPM -: bovine serum albumin instead of (Sigma Aldrich St. Louis, Missouri, USA) was substituted with (BSA bovine serum albumin), generating the PLGA microparticles with a single protein is loaded.

hPM 혼합물의 이종성인 성질에 기인하여, 캡슐화가 PLGA 미세입자로부터의 조절형 방출의 도전적인 요소를 나타낸다. Due to the heterologous nature of hPM mixture, encapsulated shows a conductive element of adjustable release from the PLGA microparticles. 따라서, 프로토콜 수정이 크기 및 방출에 미치는 영향을 분석하였다. Therefore, we analyzed the effect of modifying the protocol on the size and release. 먼저, 제1 단계인 균질화의 장기화가 미치는 효과를 평가하였다(프로토콜 2: 1분 대신 2분). First, to evaluate the effect is prolonged in step homogenization on (Protocol 2, two minutes instead of one minute). 이어서, 2차 수중유중수 에멀젼의 형성 후 및 용매 제거 이전에 도입된 추가의 균질화 단계가 미치는 효과를 조사하였다(프로토콜 3: 1분의 추가의 균질화; 프로토콜 4: 20초의 추가의 균질화). Then, the second number was examined on the effect of an additional homogenization step prior to the introduction and removal of the solvent after formation of the oil-in-water emulsion (Protocol 3: Add homogenization for 1 minute; Protocol 4: Add homogenization of 20 sec). 각 수정 후, 최적화 공정으로 진행하기 이전에, 미세입자 형태학적 특징 및 연관된 방출 속도를 평가하고, 비교하였다. Before proceeding after each modification, the optimization process, and the comparative evaluation of fine particles and morphological characteristics associated with the release rate, and.

PLGA 미세입자 형태학적 특성화 . PLGA microparticles morphological characterization. 현미경 검사법을 사용하여 PLGA 미세입자의 형태학적 특징을 평가하였다. Using microscopy was evaluated for morphological features of PLGA fine particles. 컬러 디지털 카메라가 부착된 도립 광학 라이카 현미경(라이카(Leica) DM IL LED, 라이카 마이크로시스템즈 인크.(Leica Microsystems Inc.: 미국 일리노이주))을 이용하여 미세입자의 평균 크기를 평가하였다. Using a color digital camera is attached to a Leica inverted optical microscope (Leica (Leica) DM IL LED, Leica Microsystems Inc.. (Leica Microsystems Inc .: Illinois, USA)) was evaluated in the average size of the fine particles. 무상 소프트웨어 이미지J 1.45s(웨인, 라브밴드 - 미국 국립 보건원(미국)-를 이용하여 촬영 영상을 분석하였다. Free software Image J 1.45s (Wayne, Rab Band - National Institutes of Health (USA) - using the analyzed images. 입자를 수동으로 추적한 후, 라이카 LAS 소프트웨어(독일 베츨라어)를 사용하여 자동으로 측정함으로써 각 입자의 직경을 측정하였다. After tracking the particles manually, by automatically measured using a Leica LAS software (Wetzlar, Germany) to determine the diameter of each particle.

시차 주사 현미경 검사법(SEM)(S-4000 FE-SEM, 히타치 하이 테크놀러지즈: 미국 텍사스주)을 사용하여 미세입자의 표면 형태 및 다공성을 특성화하였다. Differential scanning microscopy (SEM): using a (S-4000 FE-SEM, Hitachi High Technologies America's TX) to characterize the surface of a fine particle form and porosity. 형상 및 표면 분석을 위해, 냉동 건조된 샘플을 양면 흑연 테이프를 이용하여 알루미늄 스터브에 탑재하고, 살포기(데스크V, 덴톤 배큠)를 이용하여 금 및 팔라듐으로 코팅하였다. To the shape and surface analysis, with the frozen dried sample on an aluminum stub using a double-faced tape and graphite, using spreaders (desk V, Denton Vacuum) it was coated with gold and palladium. 이어서, 코팅된 샘플을 2 kV의 가속 전압으로 조사하고, 평균 크기 및 형상을 평가하기 위해 저배율을 이용하여 사진 촬영하고, 다공성 및 형태 특징 변화를 평가하기 위해 고배율을 이용하여 사진 촬영하였다. It was then taken photos with a high magnification to evaluate the pictures taken, and the porosity and the form of the feature changed by using a low magnification to evaluate the irradiation of the coated sample with accelerating voltage of 2 kV, and the average size and shape.

적재율 . Load factor. 미세입자 용해 후 캡슐화된 단백질을 직접 측정하여 PLGA 미세입자 중의 hPM 적재율을 측정하였다. By direct measurement of the fine particles after melting the encapsulated protein was measured hPM deposition rate of PLGA fine particles. 문헌 [Ravi., et al., Development and characterization of polymeric microspheres for controlled release protein loaded drug delivery system . Document [Ravi., Et al., Development and characterization of polymeric microspheres for controlled release protein loaded drug delivery system. 70, (2008)] 및 [Igartua, M. et al., Stability of BSA encapsulated into PLGA microspheres using PAGE and capillary electrophoresis. 70, (2008)] and [Igartua, M. et al., Stability of BSA encapsulated into PLGA microspheres using PAGE and capillary electrophoresis. International Journal of Pharmaceutics 169, 45-54 (1998)](상기 두 문헌 모두 가수분해 기술에 대하여 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 가수분해 기술을 개조하여 수행하였다. International Journal of Pharmaceutics 169, was performed by converting 45 to 54 (1998) the hydrolysis technique described in the (all of the two documents is incorporated by reference herein with respect to the hydrolysis technique). 간략하면, 15 mg의 동결 건조된 미소구를 5 mL의 0.1 M NaOH 함유 5% w/v SDS로 분해하고, 투명한 용액을 수득할 때까지 실온에서 15 h 동안 진탕기 상에서 가수분해하였다. When briefly, which was hydrolyzed at room temperature over until the decomposition of the lyophilized microspheres 15 mg in 5 mL of 0.1 M NaOH containing 5% w / v SDS, and give a clear solution for 15 h shaker. 이어서, 생성된 투명한 용액에 1 M HCl을 첨가하여 pH 7로 중화시키고, 10 min 동안 5,000 rpm으로 원심분리하였다. Then, by the addition of 1 M HCl to the resulting solution was clear, neutralized to pH 7, it was centrifuged at 5,000 rpm for 10 min. 이어서, 상청액 중의 단백질 농도를 피어스(Pierce) BCA 표준 단백질 검정법과 함께, UV-가시광선 분광광도계(UV-Visible Spectrophotometer)를 이용하여 562 nm에서 3중으로 분석하였다. Then, the protein concentration in the supernatant with the Pierce (Pierce) standard BCA protein assay, using a UV- visible light spectrophotometer (UV-Visible Spectrophotometer) at 562 nm were analyzed 3 into. 캡슐화 효율은 실제 단백질 함량 대 이론상의 단백질 함량의 비로 표시하였다. Encapsulation efficiency was calculated by expressing the actual protein content for a theoretical ratio of the protein content.

시험관내 In vitro hPM 방출 특성화. hPM release characterization. PLGA 미세입자로부터의 hPM의 방출을 특성화하기 위해, 10 mg의 적재된 미세입자를 1 mL의 포스페이트 완충제 염수(PBS) 중에 현탁시켰다. To characterize the release of hPM from the PLGA microparticles was suspended in a loaded microparticles of 10 mg in 1 mL of phosphate buffer saline (PBS). 관을 진탕기 인큐베가터에서 인큐베이션시키고, 샘플 3개를 각 프로토콜에 대하여 평가하였다. Incubating the tubes in a group Kyubey garter shaken, and was evaluated for the three samples for each protocol. 2일마다 관을 5분 동안 5,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 수집하고, 동량의 새 PBS를 관에 첨가하였다. The tube every two days centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected and added to an equal volume of PBS in a new tube. 분광광도계를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 정량화하였다. By measuring the absorbance at 562 nm using a spectrophotometer it was quantified for protein concentration. 표준 피어스 BSA 검정법으로부터 얻은 결과와 마이크로단백질 BSA 검정법으로부터 얻은 결과를 비교하여 시험된 모든 시점에서 방출된 단백질을 더욱 신뢰가능한 방식으로 평가할 수 있었다. The release time of the protein in all tests as compared to the results obtained from the results and protein micro-BSA assay obtained from Pierce, BSA standard assay could be evaluated in a more reliable manner. 측정값은 3중 반복으로 수집하였다. Measurements were collected by repeated of the three. 단백질 농도를, 200 내지 0.5 ㎍/mL 범위인, 새로 제조된 표준과 비교하였다. Of the protein concentration, 200 to 0.5 ㎍ / mL range, and a new comparison with the prepared standards. 표준 PBS의 평균 흡광도를 모든 측정값에서 감산하였다. The average absorbance of the standard PBS was subtracted from all measurements. 각 샘플 중의 단백질 양을 각각의 이전 시점에 얻은 양과 합산하여 누적 방출 곡선을 작성하였다. The amount of protein in each sample the sum obtained in each of the previous time to prepare a cumulative release curve.

hPM은, 성장 인자, 세포외 매트릭스 단백질, 및 다양한 전하 및 특성을 특징으로 하는 생체분자를 포함하는 복합 단백질 혼합물이기 때문에, 본 연구는 hPM이 적재된 미세입자로부터의 단백질 방출을 분석하여 캡슐화가 선택적으로 이루어졌는지 여부를 측정하였다. hPM is, growth factors, extracellular matrix proteins, and because the complex protein mixture comprising a biomolecule, characterized by different electric charges and characteristics, the present study was encapsulated selective analyzes of protein released from the microparticles the hPM is loaded whether it made of whether measured. 밤새도록 교반한 후 수집된 상청액에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. For the supernatant was collected and then stirred overnight it was performed SDS-PAGE analysis. hPM이 적재된 미세입자 및 BSA가 적재된 미세입자 뿐만 아니라, 미세입자 적재시 사용된 농도와 동일한 농도의, PVA 중 hPM 및 BSA(50 mL DI 수 중 10 mg BSA 및 5 mL DI 수 중에 희석된 50 ㎕ hPM)를 포함하는 4가지 용액을 분석하였다. The hPM the the fine particles and BSA is loaded loading, as well as microparticles, diluting the fine particles having the same concentration and the concentration used for loading, PVA of hPM and BSA (number of 10 mg BSA and 5 mL DI underwater 50 mL DI four solution containing 50 ㎕ hPM) were analyzed. 단백질 표준을 사용하여 검출되는 단백질의 분자량을 평가하였다. Using a protein standard to evaluate the molecular weight of the protein to be detected. BIO-RAD 전기영동 시스템(미국 캘리포니아주 허큘리스)을 이용하여 SDS-page를 수행하였다. Using the BIO-RAD electrophoresis system (Hercules, Calif.) Was performed SDS-page. 전기영동 후, 연속 진탕시키면서, 폴리아크릴아미드 겔을 1시간 동안 쿠마시 블루로 염색하였다. After electrophoresis, while continuously shaking, were stained polyacrylamide gels with Coomassie blue for one hour. 이어서, 4:1:5 메탄올: 아세트산: DI 수용액 중에서 겔을 탈염색하여 단백질 밴드를 증강시켰다. Then, 4: 1: 5 methanol: acetic acid to de-staining the gel in a DI solution was augmented the protein bands. 최종 겔을 DI 수에서 세척하고, 영상화하였다. The final gel was washed in DI water, and imaged.

알기네이트 Alginate 하이드로겔 기반 3D 배양물 . Hydrogel-based 3D-culture. hPM의 조절형 방출을 위한 적용을 평가하기 위해 적재된 미세입자를 사용하여 혈관신생 어세이를 생성하였다. Using microparticles loaded in order to evaluate the application for the controlled release of hPM-type, generating an angiogenesis assay. 인간 제정맥 내피 세포( HUVEC) 를 시딩하고, hPM이 적재된 미세입자가 포매된 3D 알기네이트 겔(1.5% 알기네이트)에서 배양하였다. The human venous seeded endothelial cells (HUVEC) and, 3D know which the microparticles are loaded with hPM embedded carbonate gel (1.5% alginate) and cultured in. 샘플 군은 순수한 hPM을 함유하는 알기네이트에 현탁된 세포, 포매된 hPM이 적재된 미세입자를 함유하는 알기네이트에 현탁된 세포, 미세입자가 없는 알기네이트에 현탁된 세포, 및 블랭크 미세입자를 포함하는 알기네이트에 현탁된 세포를 포함하였다. Sample group including the cell, and the blank microparticles suspended in knowing there is no cell, the fine particles suspended in the alginate containing alginate cells, the the embedded hPM is loaded microparticles suspended in containing pure hPM carbonate know which contained the cell suspension in the alginate. 모든 샘플 군에 대하여, HUVEC를 배지에 현탁시키고, 중합화 이전에 0.054 M 염화칼슘 용액을 피펫팅함으로써 알기네이트 매트릭스에 온화하게 현탁시켰다. For all the sample group, it was see gently suspended in carbonate matrix by HUVEC was suspended in culture medium, plated polymerization pipette previous 0.054 M calcium chloride solution. 알기네이트 세포 현탁액을 15분 동안 중합화가 일어날 수 있도록 안정 상태 그대로 유지시킨 후, 겔을 PBS로 세척하고, 배양 배지를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 습윤화된 6% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. After the alginate cell suspension was kept steady state as to cause polymerization is for 15 minutes, washed with PBS and the gel, the addition of culture medium and incubated in a 6% CO2 incubator for wetting the plates at 37 ℃.

hPM을 매트릭스에 직접 첨가한 경우의 조건과, hPM이 미세입자로부터 방출된 조건 사이에 유사한 결과를 수득하기 위해, 각각의 겔에서 혼합된 hPM의 농도는 21일 후에 포매된 미세입자로부터 방출된 단백질 농도(78 ㎍의 단백질/㎠)와 같았다. In order to obtain comparable results between the conditions and, hPM when added directly to the matrix is ​​released from the microparticles conditions hPM, the concentration of hPM mixed in each of the gel is a protein released from microparticles embedded after 21 days concentration was as (78 ㎍ protein / ㎠ a). 칼세인 AM(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드))을 이용하여 염색된 겔 내의 세포 네트워크의 형태학적 특성화에 따르면, 미세입자로부터의 hPM의 지속적인 조절형 방출의 효과는 7, 14, 21 및 28일째 hPM의 볼루스 접종과 유사하였다. Knife-old AM (Life Technologies (Life Technologies: NY Grand Island)) effects of the according to the morphological characterization of the cellular network in the gel stained with, and continuous adjustment of hPM from fine particulate emissions. 7, 14 were similar to bolus doses of 21 and 28 days hPM.

혈관신생 정량화 . Quantify angiogenesis. 이미지J 1.45s(NIH: 미국 메릴랜드주 베세즈다)를 이용하여 혈관신생 결과를 정량화하였다. Image J 1.45s (NIH: The Maryland bay SEZ) were quantified using an angiogenesis results. 도립 형광 현미경을 사용하여 촬영된 5X 배율의 영상을 프로세싱하고, 하기 파라미터: 실시예 1에 기술된 시간 동안 HUVEC에 의해 형성된 메쉬 개수, 분기점 개수 및 세관 유사 구조의 길이를 평가하고, 정량화하였다. Processing an image of a 5X magnification taken using an inverted fluorescence microscope, and parameters: evaluation was performed for the length of time the mesh number, branch number and customs like structure formed by HUVEC for as described in example 1, and quantified.

통계학적 분석 . Statistical analysis. 미세입자 및 3D 배양물, 둘 모두에 대한 실험은 3중으로 반복 수행하였다. Microparticles and 3D cultures, the experiment for both was repeated in triplicate. 그래프 데이터 및 표로 작성된 데이터는 모두 평균±표준 표준 오차로 제시되었다. Graph data and table data is created were all presented as mean ± standard error. 엑셀(Excel)(마이크로소프트 오피스(Microsoft Office)) 및 미니탭 15(Minitab 15)(미니탭: 미국 펜실베이니아주 스테이트 칼리지)를 이용하여 분석을 수행하였다. Excel (Excel) (Microsoft Office (Microsoft Office)) and Minitab 15 (Minitab 15): an analysis using (Minitab Pennsylvania State College) was performed. 2 초과의 조건을 평가할 경우, ANOVA 검정을 이용하여 유의도를 계산하고, 사후 검정을 이용하여 특정 차이를 평가하였다. When evaluating the condition of greater than 2, and calculates the significance using the ANOVA test, evaluating the specific differences using the post-test. 오직 2가지 조건만이 유사한 경우에는, 이분산과 함께 독립, 양측, 스튜던츠 t 검정을 이용하였다. If only similar to the man, the two conditions, was used as a stand, on both sides, stew deoncheu t-test with the variance. 유의 수준을 * p < 0.05로 설정하였다. The significance level was set at * p <0.05.

결과 result

다중 볼루스 Multiple bolus hPM 접종이 미치는 효과 . Effect of vaccination on hPM. HUVEC의 혈관신생 네트워크로의 형성은 시간이 경과함에 따라 hPM을 투여받은 횟수에 영향을 받았다(도 16a-16d). The formation of a network of HUVEC Angiogenesis has been affected to the number treated with hPM over time (Fig. 16a-16d). 도 16e에 제시된 바와 같이, 세관 길이는 접종 횟수의 함수로서 증가하였다. As shown in Fig 16e, customs length was increased as a function of the number of immunization. 비록 메쉬 개수 및 분기점 개수에 있어서는 어떤 유의적인 차이도 없었지만(도 16f-16g), 접종 횟수의 함수로서 성숙한 메쉬는 증가하고, 더 많아지는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. Although it has been observed that there is a tendency that in the mesh number and the number of branch point eopeotjiman no significant difference (Figs. 16f-16g), is increased mature mesh as a function of the number inoculated, and even more. 성숙한 혈관신생은 긴 세관 및 분기점 및 메쉬 개수 감소를 특징으로 하는 바, 상기 결과는 hPL의 연속 투여가 내피 세피가 안정적인 네트워크로 조직화하는 데 도움을 준다는 것을 확인시켜 준다. Mature angiogenesis is the result of a bar, which features a long Customs and the branch point and the mesh number gives reduced by the sequential administration of hPL confirmed that it helps to the endothelial sepia organized in a reliable network.

초기 PLGA 미세입자 제조 : 프로토콜 1. 프로토콜 1로부터 생성된 PLGA 미세입자의 평균 크기는 447±32 ㎛이고, 크기의 정규 분포 범위는 100 내지 1,000 ㎛였다. Initial PLGA microparticles prepared: Protocol 1. The average size of the PLGA fine particles generated from the protocol 1 is 447 ± 32 ㎛, and the normal distribution range of the size was 100 to 1,000 ㎛. 동일 조건하에서 3개의 미세입자 배치를 제조하였고, 반복가능한 분포가 입증될 수 있었다. Was prepared in three microparticles placed under the same conditions, there is a repeatable distribution can be demonstrated. PLGA 미세입자 중 hPM의 적재율은 64±4%였다(데이터를 나타내지 않음). Deposition rate of PLGA microparticles hPM was 64 ± 4% (not shown in data).

시험관내 방출 분석 결과, 초기 버스트는 낮게 나타났는데, 이는 캡슐화된 단백질 총량의 10%에 상응하는 값(21.38±0.83 ㎍/mL)이었고, 21일 후에는 초기 캡슐화된 단백질 중 51.23±0.19%(134.56±0.50 ㎍/mL)가 PLGA 미세입자로부터 방출되었다(데이터를 나타내지 않음). In vitro release analysis, initial burst was shown low, which corresponds to 10% of the encapsulated protein, total value (21.38 ± 0.83 ㎍ / mL) was, after 21 days of the initial encapsulated protein 51.23 ± 0.19% (134.56 It is ± 0.50 ㎍ / mL) was released from the PLGA microparticles (not shown data). 방출 속도 프로파일은 평가된 21일 전 기간 동안에 걸쳐 선형이고, 일정한 것으로 보였지만, 평가 기간 종료시 미세입자로부터 방출된 hPM 방출량은 (상기 기술된 바와 같이) 혈관신생 반응을 유도하는 데 hPM의 볼루스 주사를 사용하는 경우(500 ㎍/mL)와 비교하였을 때, 그 농도는 유의적으로 더 낮았다. The release rate profile is linear and constant as showed, evaluation period at the end of the hPM emission amount emitted from the fine particles (the above-described as) hPM bolus injection of having to induce the angiogenic response over a period of 21 days before the trial period when using as compared with (500 ㎍ / mL), the concentration is significantly lower.

대조군인 BSA가 적재된 PLGA 미세입자의 평균 크기는 239.60±9.45 ㎛이고, 크기의 정규 분포는 50 내지 400 ㎛였고, 여기서, 미세입자 중 70%는 150 내지 350 ㎛ 범위였다. The average size of the PLGA fine particles with a control group of BSA loaded 239.60 ± 9.45 ㎛, and the normal distribution of the size was 50 to 400 ㎛, where 70% of the fine particles was 150 to 350 ㎛ range. BSA가 적재된 PLGA 미세입자의 적재율은 초기에 적재된 단백질 총량의 76±3%였다. Deposition rate of PLGA fine particles is loaded BSA was 76 ± 3% of the total protein loaded in the initial. 시험관내 방출 분석 결과, 캡슐화된 BSA 총량의 20%(51.52±1.76 ㎍/mL)인 hPM이 적재된 미세입자와 비교하였을 때, 초기 버스트는 더 높은 것으로 나타난 반면, 21일 후에는 초기에 캡슐화된 단백질의 66.7±9.55%(166.74±23.8 ㎍/mL)가 PLGA 미세입자로부터 방출되었다(데이터를 나타내지 않음). In vitro release analysis showed that the 20% of encapsulated BSA total volume (51.52 ± 1.76 ㎍ / mL) when hPM is compared with the loaded microparticles, while the initial burst is shown to be higher, and 21 days after encapsulation in the initial is 66.7 ± 9.55% (166.74 ± 23.8 ㎍ / mL) of protein was released from the PLGA microparticles (not shown data). 방출 속도 프로파일은 평가된 21일 전 기간 동안에 걸쳐 선형이고, 일정한 것으로 보였다. The release rate profile is linear over a period of 21 days before the trial period, it showed to be constant. hPM이 적재된 PLGA 미세입자와 BSA가 적재된 PLGA 미세입자 사이에 관찰되는 결과상 차이는 방출 동역학적 성질이 제조 및 적재 프로토콜의 최적화를 통해 개선될 수 있다는 것을 제안한다. The resulting difference is observed between the loading hPM the PLGA microparticles with the BSA is loaded PLGA microparticles suggests that the release kinetic properties can be improved through optimization of the manufacturing and handling protocol.

PLGA 미세입자 크기 최적화 및 형태의 특성화 . PLGA fine particle size and shape characterization of optimization. 1차 에멀젼을 2분 동안 균질화시키는 (프로토콜 1보다 추가로 1분 더 균질화시킴) 프로토콜 2를 사용하여 생성된 미세입자로부터의 크기 분석 결과, 평균 직경이 276.78±13.41 ㎛(도 17a, 17d)인 것으로 나타났다. To homogenize for 2 minutes, a primary emulsion (Sikkim 1 minutes more homogenized further than Protocol 1) The size analysis results from the microparticles generated using Protocol 2, the average diameter of 276.78 ± 13.41 ㎛ (Fig. 17a, 17d) of It showed. 2차 에멀젼 제조 단계에 1분의 균질화 단계가 추가된, 프로토콜 3을 사용하여 생성된 미세입자의 평균 크기는 37.79±1.30 ㎛인 반면(도 17b, 17e), 2차 에멀젼에 20초 균질화 단계가 추가된, 프로토콜 4를 사용하여 생성된 미세입자의 평균 크기는 91.85±2.92 ㎛였다(도 17c, 17f). The second emulsion in the production stage the homogenisation step of 1 minute, the average size of the micropores created by using the protocol 3 particles 37.79 ± 1.30 ㎛, while (Fig. 17b, 17e), 20 cho homogenization step the second emulsion is the average size of the fine particles produced by using the added, protocol 4 was 91.85 ± 2.92 ㎛ (Fig. 17c, 17f).

SEM 분석으로부터 얻은 결과는 상이한 프로토콜 사이의 표면 다공성에 있어서의 어떤 유의적인 차이도 보이지 않았다. Results from SEM analysis did not show any significant difference in the surface porosity between different protocols. 기술된 상이한 변형법을 사용하여 수득된 미세입자의 표면들은 모두 균질한 표면을 가진 둥근 형성을 보였다(도 18a-18f). The surface of the microparticles obtained using the described method are all different variants showed a rounded form with a uniform surface (Fig. 18a-18f). 도 18a-18c는 미세입자 형상을 보여주는 것이고, 도 18d-f는 각각 프로토콜 2, 3, 및 4에 의해 제조된 입자의 미세입자 표면 다공성을 보여주는 것이다. Figure 18a-18c will show the fine particle-like, FIG. 18d-f is to show the fine particle surface of the porous particles produced by each protocol 2, 3 and 4.

적재율 . Load factor. 캡슐화 효율은 미세입자의 크기와 선형 관계가 있는 것으로 보이지 않았다(도 19a). (Fig. 19a) encapsulation efficiency was not observed that there is a linear relationship between the size and the fine particle. 캡슐화 효율은 프로토콜 2의 경우, 73±4%로 증가하였고, 프로토콜 3에서 크기가 유의적으로 감소된 경우에는 63±3%로 감소한 것으로 나타났다. If the encapsulation efficiency in the case of protocol 2 and increased to 73 ± 4%, on the protocol 3, the size is significantly reduced showed decreased to 63 ± 3%. 프로토콜 4의 경우, 초기의 전체 단백질 적재 중 캡슐화된 단백질의 79±9%에 해당되는 값으로, 가장 높은 캡슐화 효율을 얻었다. For protocol 4, as corresponding to 79 ± 9% of the encapsulated protein in the initial total loading of the protein value, to obtain the highest encapsulation efficiency.

최적화된 hPM이 적재된 미세입자로부터의 hPM의 Of hPM from the Optimized hPM loaded microparticles 시험관내 방출 . In vitro release. 최적화된 프로토콜을 사용하여 생성된 미세입자로부터의 hPM의 방출 속도는 크기 및 적재율 차이에 따른 직접적인 결과였고, 균질화 단계의 변형으로 수득된 방출 프로파일 경향은 유사한 것으로 보였다. The release rate of hPM from the microparticles generated using the optimized protocol was a direct result of differences in size and deposition rate, the release profile trend obtained by variation of the homogenization step is shown to be similar. 초기 버스트가 1차 에멀젼 균질화 단계의 지속 기간 변형에 따라 유의적으로 변하지는 않았고, 프로토콜 1에서의 8.14±0.31%(21.38±0.83 ㎍ 단백질/mL) (데이터를 나타내지 않음)로부터 프로토콜 2에서의 6.42±2.07%(18.88±6.11 ㎍ 단백질/mL)로 상승하였다. Were the initial burst is changed to the first note in accordance with the duration variation of the primary emulsion homogenization step small, 8.14 in Protocol 1 ± 0.31% (21.38 ± 0.83 ㎍ protein / mL) 6.42 in the protocol from the second (not shown data) It rose to ± 2.07% (18.88 ± 6.11 ㎍ protein / mL). 2차 에멀젼의 균질화를 도입하였을 때, 버스트 방출이 유의적으로 증가한 것이 관찰되었다: 프로토콜 4의 경우, 27.72±3.73%(106.33±14.33 ㎍/mL)인 것과 비교하였을 때, 프로토콜 3의 경우, 캡슐화된 전체 단백질(60.82±1.03 ㎍/mL)의 23.75±0.40%가 처음 1일 이내에 방출되었다(도 19b). When introducing the homogenization of the secondary emulsion, to a burst release increased significantly observed: when the protocol 4, 27.72 compared to that of ± 3.73% (106.33 ± 14.33 ㎍ / mL), when the protocol 3, the encapsulated a 23.75 ± 0.40% of the total protein (60.82 ± 1.03 ㎍ / mL) was released within the first 1 day (FIG. 19b).

21일 후 누적 방출은 미세입자 크기와 상관관계가 있었는데, 미세입자가 작을수록 검정 기간에 방출되는 hPM의 방출량은 더 많았다. After 21 days the cumulative release was correlated with the fine particle size, the smaller the amount of emission of fine particles emitted hPM the black period was more. 방출 21일 후, 프로토콜 2로부터 미세입자는 캡슐화된 전체 단백질의 64.09±1.70%(188.43±5 ㎍/mL)를 방출한 반면, 프로토콜 3으로부터의 MP는 98.62±1.40%(252.48±3.6 ㎍/mL)를 방출하였고, 프로토콜 4로부터의 MP는 87.60±1.12%(335.98±4.72 ㎍/mL)를 방출하였다(도 19b). After release 21, from the protocol 2 fine particles is emitted to 64.09 ± 1.70% (188.43 ± 5 ㎍ / mL) of the encapsulated total protein, whereas, MP from protocol 3 is 98.62 ± 1.40% (252.48 ± 3.6 ㎍ / mL ) was released, MP from the protocol 4 was released to 87.60 ± 1.12% (335.98 ± 4.72 ㎍ / mL) (FIG. 19b). 연장된 기간에 걸친 P3 및 P4 방출 프로파일을 비교하는 추가 분석 결과, 30일 후, 프로토콜 3으로부터의 미세입자는 완전히 분해되었고, hPM의 방출은 더 이상 이루어지지 않은 반면, 프로토콜 4로부터의 미세입자는 캡슐화된 전체 단백질의 최대 93.12±0.2%(357±4.09 ㎍/mL)까지 방출하였다. Comparing the P3 and P4 release profile over an extended period of time for further analysis results, after 30 days, the fine particles from the Protocol 3 was completely decomposed, while the release of hPM is not made any more, the fine particles from the protocol 4 release was up to 93.12 ± 0.2% (357 ± 4.09 ㎍ / mL) of the encapsulated total protein.

SDS page로부터의 결과는 수집되고, 분석된 상청액에 함유되어 있는 단백질의 농도가 낮은 것에 기인하여 제한되어 있다. Results from the SDS page are collected and, contained in the supernatant was analyzed by restriction due to the low concentration of protein. 그러나, 분석 결과, PLGA 미세입자에서 hPM의 캡슐화는 균일하게 일어났고, 특정 단백질에 대한 선택적인 캡슐화에 관한 증거는 없었다. However, the analysis, encapsulated in PLGA microparticles hPM woke up evenly, and there was no evidence of selective encapsulation for a particular protein. BSA가 적재된 미세입자 및 hPM이 적재된 미세입자, 둘 모두, 미세입자 경화 이후에 수집된 상청액 분석 결과, 농도가 더 낮은 경우에 단백질 함량은 유사한 것으로 나타났다(도 20). The BSA is collected in the fine particles and the loaded hPM loaded microparticles, both, since the microparticles hardened supernatant analysis results, the protein content in the case where a lower concentration was found to be similar (Fig. 20).

알기네이트 Alginate 하이드로겔 기반 3D 배양물 . Hydrogel-based 3D-culture. 혈관신생 어세이로부터 얻은 결과는 hPM의 조절형 방출이 내피 세포가 시딩된 매트릭스에서 모세혈관 유사 구조의 안정성을 개선시킬 수 있다는 것을 나타내었다. Results from angiogenic assays showed that there is a controlled release of hPM-type endothelial cells that can improve stability of the capillary-like structures in a seeded matrix. 도 21은 배양 7일 후, hPM이 적재된 미세입자가 포매된 알기네이트 하이드로겔에서 배양된 HUVEC에서 단지 몇개의 발아 및 관상 구조가 관찰된 반면(성숙한 네트워크는 관찰되지 않았다), 순수한 hPM을 함유하는 매트릭스에서의 혈관신생 형성은 같은 기간에 비교적 더욱 성숙한 상태였고, 여기서, 평균 세관 길이 = 207.90±15.31 ㎛, 1.27±0.84개의 메쉬/mm 2 , 및 9.60±0.70개의 분기점/㎟인 것을 도시한 것이다. 21, while only with a few of the germination and the tubular structure observed in the HUVEC culture after seven days culture, see the fine particles hPM is loaded embedded carbonate hydrogel (mature network was not observed), containing pure hPM neovascular formation in the matrix, which was relatively more mature state during the same period, in which, to the average customs length = 207.90 ± 15.31 illustrates that ㎛, of 1.27 ± 0.84 of the mesh / mm 2, and 9.60 ± 0.70 of the branch point / ㎟ . 그러나, 배양 14일 후, hPM이 적재된 MP가 포매된 알기네이트 겔은 평균 길이 = 137.41±9.77 ㎛ 및 6.66±0.47개의 분기점/㎟로 1차 세관을 조직화하기 시작한 반면, 순수한 hPM을 함유하는 매트릭스에서는 분해된 혈관신생 네트워크가 나타났고, 메쉬가 관찰되지 않고, 평균 길이가 226.58±25.64 ㎛인 단리된 세관만이 있었다. However, cultured 14 days, while hPM to know with a MP is embedded stacked carbonate gel has an average length = 137.41 ± 9.77 ㎛ and 6.66 ± 0.47 of the fork begins to organize the primary Customs / ㎟, matrix containing the pure hPM appeared in the decomposition angiogenesis networks, without the mesh is not observed, the average length was only 226.58 ± 25.64 ㎛ in the isolated customs. 21일째, MP가 포매된 겔은 미숙한 메쉬 형성을 보였고, 평균 세관 길이는 204.07±12.75 ㎛이고, 평균 분기점 개수는 11±1.25개의 분기점/㎟였다. The 21 day, MP-embedded gel showed the formation of immature mesh, average customs length 204.07 ± 12.75 ㎛ and an average number of branch point of the branch point 11 ± 1.25 / ㎟ was. 전반적으로, 배양 21일 후, 형성된 혈관신생 네트워크는 안정한 상태 그대로 유지되었고, 단지 분기점 개수/㎟에서만 소량의 변화가 있었다(도 21). Overall, after 21 days incubation, the angiogenesis network formed was kept stable as it is, there was only a small amount of change in only the branch point number / ㎟ (Fig. 21). 배양 28일 후, 평균 세관 길이는 168.88±10.31 ㎛이고, 평균 분기점 개수는 12.93±1.61개의 분기점/㎟이고, 평균 메쉬 개수는 3.17±0.93개/㎟였다. After 28 days incubation, average customs length 168.88 ± 10.31 ㎛ and an average number of branch point, and 12.93 ± 1.61 of the branch point / ㎟, a mean mesh count is 3.17 ± 0.93 pieces / ㎟.

논의 Argument

PLGA 미세입자를 사용하여 캡슐하된 단백질이 성장 인자의 조절형 방출을 위한 약물 전달 시스템이며, 보편적으로 사용되는 제조 기술은 수중유중수 방법이다. The PLGA fine drug delivery system to the capsule to a protein used for the controlled release of growth factor-type particles, a manufacturing technique how the oil-in-water heavy water is commonly used. 19, 20, 21 본 연구에서, 2,600여종 초과의 혈관신생 및 항섬유화 단백질을 함유하는 복합 인간 유래 다중 단백질 혼합물(태반 매트릭스 또는 hPM)을 PLGA 미세입자로 캡슐화하였다. At 19, 20, 21 In this study, a compound derived from human multiple protein mixture (matrix or placenta hPM) containing angiogenic and antifibrotic protein of more than 2,600 species it was encapsulated in PLGA microparticles. 결과에 따르면, hPM이 적재된 PLGA 미세입자를 사용하였을 때, 혈관신생유발 단백질 및 섬유화 단백질을 함유하는 다중 단백질 융합물의 방출은 시간 경과에 따라 지속되고, 조절될 수 있다. According to the results, when using the PLGA fine particles hPM are loaded, multiple fusion proteins containing water release angiogenesis and fibrosis induced protein protein can be continued with time, adjustment. 시험관내 배양 동안 내피 세포와 함께 사용될 때, hPM이 적재된 PLGA 미세입자는 안정한 혈관신생 네트워크가 형성될 수 있게 한다. When used in conjunction with in vitro cultured endothelial cells during, PLGA microparticles with hPM is loaded enables the stable angiogenesis network can be formed.

본 연구 결과, hPM이 PLGA 적재 및 복합체로부터 생성되는 미세입자 형태인 다중 단백질 조성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. The results, it was found that hPM affects the multi-protein composition of fine particle form is produced from the loading and PLGA conjugate. 단일 단백질(BSA) 캡슐화와 비교하였을 때, hPM이 적재된 미세입자의 평균 크기는 BSA가 적재된 것보다 유의적으로 더 큰 것으로 나타났다. Single Protein (BSA) when compared to the encapsulation, hPM the average size of the fine particle loading was found to significantly greater than that BSA is loaded. 이는 가능하게는 hPM 중 단백질과 PLGA 중합체 상이의 복잡한 상호작용의 결과일 수 있으며, 이로써, BSA가 적재된 미세입자와 비교하였을 때, 상이한 분자 전하, pH, 및 크기로 이루어진 광범위한 어레이를 가질 수 있다. This possibly can be a protein and the results of the PLGA polymer different from complex interactions of hPM, Thereby, as compared with fine particles of BSA are loaded, it can have a wide array consisting of different molecular charge, pH, and the size . SDS-PAGE 분석 결과, hPM이 적재된 PLGA 미세입자로부터 방출되는 단백질의 농도가 낮음에도 불구하고, 조성이 희석된 hPM과 유사한 상청액 중에서 광범위한 분포를 관찰할 수 있다. Despite the SDS-PAGE analysis showed that the concentration of the protein is loaded hPM the PLGA released from the microparticles and low, it is possible to observe a wide distribution in the supernatant is similar to the composition is diluted hPM. 이러한 결과는 단백질 혼합물의 캡슐화는 특정 단백질에 대하여 선택적이지 않으며, 균질하고, 미세입자 제조 동안 hPM의 단백질 조성이 영향을 받지 않는다는 것을 제안하였다. These results suggested that encapsulation of the protein mixture does not does not selective for a specific protein, homogeneous and protein composition of hPM during production, fine particles are affected.

균질화 단계의 지속 기간 및 속도, 이 둘 모두는 앞서 미세입자 크기에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. The duration of the homogenization step and speed, both of which were found to affect the particle size of the fine before. 17 27 본 실시예에서는 hPM이 적재된 PLGA 미세입자 크기와 시험관내 방출 속도 사이에 상관관계가 있다는 것이 밝혀졌다. 17 27 It has been found that a correlation between the present embodiment, the loading hPM the PLGA fine particle size and the in vitro release rate. 비록 1차 에멀젼 단계의 균질화를 최적화함으로써 원하는 조절형 방출 특징을 가지는 미세입자를 생성하기는 하였지만, 이들 입자 중의 hPM의 적재율은 평가되는 다른 제조 프로토콜에 비해 다소 낮았다. Even by optimizing the first homogenization step of the emulsion but it is to produce fine particles having a desired adjustable release characteristics, deposition rate of hPM of these particles is rather low compared to other manufacturing protocols to be evaluated. 1차 에멀젼 단계의 균질화를 최적화함으로써 단백질 용액의 캡슐화가 (최대 78%로) 증가되고, 크기 범위가 원하는 크기 범위인 미세입자를 수득하였다. By optimizing the homogenization of the first stage emulsion is increased (up to 78%) encapsulation of the protein solution, to give a fine particle size range of the desired size range. 흥미롭게도, 캡슐화 효율은 미세입자의 크기와는 상관관계가 없었지만, 대시 2차 에멀젼의 균질화 기간에 영향을 받았으며, 이는 가능하게는 이종성 단백질 혼합물과 중합체 사이의 상호작용에 의해 유발된 단편화된 불완전 입자의 형성의 결과일 수 있다. Interestingly, the encapsulation efficiency is I did not have any of the fine particles to the size relationship, influenced the homogenization period of the dash secondary emulsion, which is possibly a fragmented incomplete particles caused by interactions between heterologous protein mixture with the polymer of the form may be the result.

(비최적화된 프로토콜과 비교하였을 때, 더 높은 hPM 캡슐화 효율, 최적화된 미세입자 크기 및 30일 동안에 걸친 선형 방출을 허용하는) 상기 기술된 최적화된 PLGA 미세입자 합성 프로토콜을 사용하여, hPM이 적재된 미세입자를 알기네이트 기반 혈관신생 어세이에 도입하여 시간 경과에 따른 hPM의 조절형 방출에 대한 내피 세포(HUVECS) 반응을 평가하였다. By using a (as compared to the non-optimized protocol, higher hPM encapsulation efficiency, allowing for linear release over during the optimization fine particle size, and 30) the above-described optimization PLGA microparticles synthesis protocol, the hPM is loaded see the fine particles introduced into the carbonate-based angiogenesis assay was evaluated in endothelial cells (HUVECS) reaction of the adjustable discharge of hPM over time. 비용면에서 효과적인 가공성 및 전반적으로 세포외 물질로서 우수한 특성에 기인하여, 어세이에 대한 기초로서 선택된 알기네이트 겔 내로 hPM이 적재된 미세입자를 포매시킴으로써 3D 혈관신생 어세이를 생성하였다. By due to the excellent properties as an extracellular substance in an efficient and general workability in terms of cost, the embedded microparticles is loaded into the hPM alginate gel selected as the basis for the assay were generated 3D angiogenesis assay. 30, 31 배양 21일 후, 비록 미세입자로부터 전달되는 단백질의 총량(78 ㎍/㎠)이은 볼루스 주사를 사용하는 이전 2D 혈관 신생 연구에서 전달되는 농도(263 ㎍/㎠)보다 낮기는 하지만, HUVECS는 포매된 hPM이 적재된 PLGA 미세입자에 가까운 영역 중에 겔 내에서 혈관신생 세관을 형성하였다. 30, but is lower than 31 after the culture 21, although concentration (263 ㎍ / ㎠) that it passes from the previous 2D angiogenesis studies using total (78 ㎍ / ㎠) followed by bolus injection of a protein that is passed from the fine particles, HUVECS were formed angiogenesis customs in the gel in the region close to the the embedded hPM loaded PLGA microparticles. 알기네이트 매트릭스와 직접 혼합된 hPM의 볼루스 투여와 비교하였을 때, hPM이 적재된 미세입자를 사용함으로써 28일 동안에 걸쳐 장기간 동안 지속적인 혈관신생 네트워크 형성을 달성할 수 있었다. See as compared with bolus administration of the hPM mixed directly with the carbonate matrix, by using the fine particles of hPM the loading was possible to attain sustained angiogenesis network formation for a long period of time over a period of 28 days. 세포는 hPM과 직접 혼합된 알기네이트 겔 중에서 더욱 빠르게 혈관신생 네트워크를 형성하였지만, 이 네트워크는 hPM이 적재된 미세입자를 사용하는 겔과 비교하였을 때, 더 빠르게 분해되었다. Cells but more rapidly in the alginate gel and the mix directly hPM form the angiogenesis network, the network when compared to the gel using a hPM microparticles are loaded, was decomposed faster. 28일 후, 미세입자로부터의 hPM 방출은 거의 0차였지만, 혈관신생 메쉬의 새 형성도 여전히 관찰할 수 있었으며, 이는 PLGA 미세입자로부터의 hPM의 조절형 방출이 혈관신생 네트워크 형성의 안정성을 개선시켰다는 것을 제안하는 것이다. After 28 days, hPM release from the fine particles, but almost zero-order, were also still be able to observe the new formation of angiogenesis mesh, which is adjustable release of hPM from PLGA microparticles sikyeotdaneun improve the stability of angiogenesis network formation to propose that.

전반적으로, 본 실시예는 낮은 초기 버스트 및 높은 캡슐화 효율로 복합, 다중 단백질 혼합물을 전달하는 적용을 위한 PLGA 미세입자 합성 프로토콜의 최적화를 기술한다. Overall, this Example describes the optimization of the PLGA fine particle synthetic protocol for the application to pass a complex, multi-protein mixture at a low initial burst and high encapsulation efficiency. 이어서, 여기서 개발된 본 방법을 적용하여 신규한 혈관신생 어세이를 개발하였고, 이를 통해 알기네이트 매트릭스 내에서 혈관신생 네트워크를 지속적으로 형성할 수 있었다. Then, here, we developed a novel method developed by applying the present angiogenesis assays, it was possible to continuously form the angiogenesis network within the alginate matrix via them. 중요하게는, 개발된 기술은 임의의 복합 혈청 및 단백질 혼합물 전달에 적용될 수 있고, 이는 광범위한 조직 조작 및 재상 의학 시스템에서 적용될 수 있다. Importantly, the technique is applicable to any complex mixture of serum and protein delivery, which may be applied in a wide range of tissue manipulation and regenerative medicine system. 본 기술은 개선된 시험관내 혈관신생 어세이를 개발하는 데, 및 세포가 시딩된 매트릭스 내의 지속적인 혈청 전달에 의해 이루어지는 역할에 관해 더욱 잘 이해할 수 있도록 하는 데, 혈청이 적재된 PLGA 입자가 포매된 상이한 물질(예컨대, 콜라겐, 피브린, 라미닌)에 적용될 수 있다. The techniques to improve the in vitro angiogenesis air for developing assays, and the cells are seeded the to allow a better understanding about the role carried out by the continuous serum transfer in the matrix, the serum is loaded the PLGA particles a different embedded material (e. g., collagen, fibrin, laminin) can be applied to.

결론 conclusion

본 실시예는 hPM 캡슐화 방법의 실시양태를 기술하고, 혈관신생 구조 형성은 알기네이트 기반 혈관신생 어세이를 이용함으로써 관찰되었다. The present embodiment was observed by techniques and know forms angiogenesis structure using the carbonate-based angiogenesis assay the embodiments of hPM encapsulation method. 21일간의 장기간에 걸친 지속적인 혈관신생 반응이 3D 하이드로겔 배양 시스템 내에서 관찰되었다. The ongoing angiogenic response over a long period of time of 21 days was observed in a 3D hydrogel culture system. 이를 통해 모세혈관 네트워크의 형성 및 유지를 가이드하는 hPM의 조절형 방출 접근법의 유효성을 확인할 수 있었다. This confirmed the effectiveness of hPM adjustable discharge approach for guiding the formation and maintenance of a capillary network.

실시예 Example 3에 대한 참고 문헌 Notes on three documents

Figure pct00009

Figure pct00010

Figure pct00011

Claims (20)

  1. 인간 태반 샘플로부터 수득된 인간 태반 추출물로서, 여기서, 혈액 및 고형물이 상기 추출물로부터 실질적으로 제거되었으며, 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 비롯한 태반 단백질을 포함하고, 여기서 태반 단백질은 태반 샘플에 존재하였던 것인, 인간 태반 추출물, 및 As the human placenta extract obtained from human placenta samples, where the blood and the solids have been substantially removed from the extract, the extract comprises placental proteins, including cytokines and growth factors, wherein the placental protein is that existed in the placenta sample the human placenta extract, and
    생분해성 미세입자를 포함하는 조성물로서, A composition comprising a biodegradable microparticles,
    여기서, 인간 태반 추출물은, 생체내 또는 시험관내에서 세포에의 노출 후 일정 기간 동안에 걸쳐 인간 태반 추출물이 미세입자로부터 방출될 수 있도록 미세입자에 커플링되어 있는 것인 조성물. Here, the human placenta extract, with which it is coupled to the fine particles so that the in vivo, or human placenta extract over a period after exposure of the cells to a period of time in vitro, can be released from the microparticle composition.
  2. 제1항에 있어서, 태반 추출물이, The method of claim 1, wherein a placenta extract,
    인간 태반 샘플로부터 수득된 샘플로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 제조하고; Removing the blood from the sample obtained from the human placenta samples to prepare a crude placental extract;
    태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 조추출물 중의 단백질을 가용화하고; Solubilizing the protein in the crude extract of placenta crude extract is mixed with a protein solubilizing agent, and;
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물로부터 고형 물질을 분리하고; The solubilized protein - separating the solid matter from the mixture, and placenta extract; 그리고 And
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물에 대해 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제를 제거하여 인간 태반 추출물을 제조함으로써 제조되는 것인 조성물. The protein solubilization-in and dialyzed against placenta extract mixture to remove the protein solubilizing agent from the mixture would be produced by preparing a human placenta extract composition.
  3. 제1항에 있어서, 태반 추출물이 20종 이상의 상이한 사이토카인을 포함하는 것인 조성물. According to claim 1, wherein the placenta extract is it comprises different cytokines over 20 compositions.
  4. 제2항에 있어서, 단백질 가용화제가 우레아인 것인 조성물. The method of claim 2, wherein the protein solubilizing agent in the composition of urea would.
  5. 제1항에 있어서, 태반 추출물이 혈관신생을 조절할 수 있는 것인 조성물. According to claim 1, wherein the placenta extract to be able to control the angiogenic composition.
  6. 제1항에 있어서, 생분해성 미세입자가 폴리(DL-락티드- -글리콜리드)(PLGA) 미세입자를 포함하는 것인 조성물. The method of claim 1, wherein the biodegradable microparticles of poly (DL- lactide-co-glycolide) (PLGA) comprises a fine particle composition.
  7. 제7항에 있어서, PLGA 미세입자에 인간 태반 추출물(hPE)이 적재되고, 여기서, hPE가 적재된 PLGA 미세입자는 이중 균질화를 포함하는 수중유 공정으로 제조되는 것인 조성물. The method of claim 7 wherein the human placenta extract (hPE) is loaded into the PLGA microparticles, wherein, hPE is in the loaded PLGA fine particles will be prepared by oil-in-water process, comprising a double homogenised composition.
  8. 제1항에 있어서, 생분해성 미세입자가 젤라틴 미세입자를 포함하는 것인 조성물. According to claim 1, wherein the biodegradable microparticles comprising a gelatin fine grain composition.
  9. 제1항에 있어서, 생분해성 미세입자가 상이한 크기의 미세입자를 포함하는 것인 조성물. According to claim 1, wherein to the biodegradable microparticles containing the fine particles of different size composition.
  10. 세포를 서방형 혈관신생 조절용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 혈관신생의 유도 방법으로서, A method of inducing angiogenesis comprising the step of contacting the cell with a sustained-angiogenic composition adjustment,
    상기 서방형 혈관신생 조절용 조성물은, The sustained-angiogenic composition adjustment,
    생분해성 미세입자, 및 The biodegradable microparticles, and
    생체내 또는 시험관내에서의 미세입자의 세포에의 노출 후, 일정 기간 동안에 인간 태반 추출물이 미세입자로부터 방출될 수 있도록 미세입자에 커플링되어 있는 인간 태반 추출물을 포함하는 것이고, 여기서 태반 추출물은 인간 태반 샘플로부터 수득된 추출물을 포함하고, 여기서 혈액 및 고형물이 상기 추출물로부터 실질적으로 제거되었으며, 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 비롯한 태반 단백질을 포함하고, 여기서 태반 단백질은 태반 샘플에 존재하였던 것인 혈관신생의 유도 방법. It is to include the human placenta extract, which is coupled to the fine particles so that the human placenta extract can be released from the microparticles during the following exposure of the microparticles cell, during a predetermined period of time in an in vivo or in vitro, wherein the placental extract human which comprises an extract obtained from the placenta sample, wherein the blood and solid has been substantially removed from the extract, the extract comprising the placental proteins, including cytokines and growth factors, wherein the placental protein is that existed in the placenta sample vessel induction of new methods.
  11. 제10항에 있어서, 세포가 내피 세포인 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of claim 10, wherein the induction of angiogenesis way that the cells are endothelial cells.
  12. 제10항에 있어서, 태반 추출물이, 11. The method of claim 10, a placenta extract,
    인간 태반 샘플로부터 수득된 샘플로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 제조하고; Removing the blood from the sample obtained from the human placenta samples to prepare a crude placental extract;
    태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 조추출물 중의 단백질을 가용화하고; Solubilizing the protein in the crude extract of placenta crude extract is mixed with a protein solubilizing agent, and;
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물로부터 고형 물질을 분리하고; The solubilized protein - separating the solid matter from the mixture, and placenta extract;
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물에 대해 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제를 제거하여 인간 태반 추출물을 제조함으로써 제조되는 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of inducing angiogenesis would be produced by the placenta extract dialyzed against the mixture to remove the protein solubilizing agent from the mixture to prepare a human placenta extract - the solubilized protein.
  13. 제12항에 있어서, 단백질 가용화제가 우레아인 것인 혈관신생의 유도 방법. 13. The method of claim 12, wherein the protein solubilizing agent inducing method of angiogenesis would urea.
  14. 제10항에 있어서, 서방형 혈관신생 조절용 조성물을 생체물질에 커플링시키는 단계를 더 포함하는 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of claim 10, wherein the induction of angiogenesis method further comprises the step of coupling a sustained release composition in vivo angiogenesis-regulating substance.
  15. 제14항에 있어서, 피험체에서 생체물질을 이식시킴으로써 생체내에서 생체물질의 혈관화를 유도하는 단계를 더 포함하는 것인 혈관신생의 유도 방법. 15. The method of claim 14, wherein the induction of angiogenesis by further comprising the step of inducing vascularization of a biological material in vivo by a biological material transplanted in a subject.
  16. 제14항에 있어서, 생체물질이 인간 유래 기질 물질을 포함하는 조작된 바이오스캐폴드(engineered bioscaffold)인 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of claim 14, wherein the biological material is derived The method of one of the cache operation BIOS fold (engineered bioscaffold) angiogenesis including human-derived substrate material.
  17. 제14항에 있어서, 바이오스캐폴드가, 인간 내피 세포가 시딩된, 세포 제거된 인간 제정맥 스캐폴드(decellularized human umbilical vein scaffold)를 포함하는 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of claim 14 wherein the BIOS cache fold, induction of angiogenesis method comprises a human endothelial cell seeding the human claim vein scaffold (human umbilical vein decellularized scaffold) the removed cells.
  18. 제17항에 있어서, 인간 내피 세포가 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)인 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of claim 17, wherein the human endothelial cells are human claim vein endothelial cells (HUVEC) the induction method of angiogenesis will.
  19. 제15항에 있어서, 피험체가 인간인 것인 혈관신생의 유도 방법. The method of claim 15 wherein the method of inducing angiogenesis body piheom to a human.
  20. 피험체에게, 인간 태반 샘플로부터 수득된 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 혈액 및 고형물이 상기 추출물로부터 실질적으로 제거되었고, 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 비롯한 태반 단백질을 포함하고, 여기서 태반 단백질은 태반 샘플에 존재하였던 것인, 피험체에서의 염증 감소 방법. To a subject, comprising administering a composition comprising a human placenta extract obtained from human placenta samples, in which the blood and the solids were substantially removed from the extract, extract of placental proteins, including cytokines and growth factors including, where placental proteins method for reducing inflammation in a, to a subject that existed in the placenta sample.
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