KR20160022667A - Composition for promoting vascularization comprising adult stem cells derived from human skin dermis - Google Patents
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Abstract
Description
본 명세서에는 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 신규한 용도와 줄기세포의 혈관 생성 능력을 탐지하는 방법이 개시된다.Disclosed herein are novel uses of human dermal-derived adult stem cells and methods for detecting the angiogenic potential of stem cells.
다분화 기능(pluripotent)을 소유하는 성체 줄기세포를 조직으로부터 분리하려는 노력은 최근 몇 년 전부터 줄곧 진행되어 왔다. 이런 성체 줄기세포는 배아줄기세포의 전분화기능(totipotent)에 비해 조직 내의 모든 세포로 분화하지 못하는 단점이 있으나, 배아줄기세포에서 문제시될 수 있는 윤리적인 문제에서는 자유로울 수 있다는 점에서 연구 및 활용의 의미가 있다. 그러나, 성체 줄기 세포는 배아줄기세포와 달리 성체 조직에서 발굴/동정할 수 있는 성체 줄기세포의 수(해당 조직의 약 1~5% 미만으로 추정)가 매우 적어서, 연구에 어려움이 있다.Efforts to separate pluripotent adult stem cells from tissues have been ongoing in recent years. These adult stem cells have the disadvantage that they can not differentiate into all the cells in the tissue as compared with the totipotent of embryonic stem cells, but they can be free from the ethical problems that may arise in embryonic stem cells. It has meaning. However, unlike embryonic stem cells, adult stem cells are difficult to study because the number of adult stem cells (estimated to be less than about 1 to 5% of the tissues) can be excavated / identified in adult tissues.
그러나, 최근 본 발명자들은 인간 진피로부터 유래한 줄기세포 (human dermal stem/progenitor cells, hDSPCs)를 분리하는 데 성공하였고, 중간엽 계통의 지방세포, 골세포, 연골세포, 그리고 외배엽 계통의 신경 세포까지 분화할 수 있는 줄기세포 다분화 기능을 보유하고 있음을 확인하였다. 추가적으로 이 줄기세포 배양액의 성분이 광에 의해서 손상되어 노화를 겪는 섬유아세포를 건강한 상태로 회복시키는 데 기여를 함을 증명함으로써, 항노화 효과를 가지는 것을 확인하였다.However, recently, the present inventors have succeeded in isolating human dermal stem / progenitor cells (hDSPCs) derived from human dermis, and have succeeded in separating adipocytes, osteocytes, chondrocytes, And it was confirmed that it possessed stem cell differentiation function capable of differentiation. In addition, it was confirmed that the components of the stem cell culture fluid had an anti-aging effect by proving that it contributes to restore the fibroblasts undergoing aging by the light to a healthy state.
한편, 표피에는 혈관이 없으므로 진피에서 영양분 공급받게 되는 데, 노화에 따라 피부 혈관의 크기와 수가 감소하게 되는 노화 현상을 겪게 되어 피부로의 혈액 공급이 줄어들게 되며, 피부가 차가워지고, 햇빛을 쪼여도 잘 붉어지지 않게 되며, 영양공급 감소하여 상처치유가 늦게 된다. 피부의 적이라고 할 수 있는 광노화의 경우에는 자연노화된 피부에 비하여 혈관의 크기가 나이에 따라 더 심하게 감소하게 되는 데, 혈관의 크기가 감소, 혈관의 수도 감소되어 결과적으로는 진피 내에서 혈관이 차지하는 총 넓이는 약 70%가 감소하게 되며, 약 70% 정도 피부로 공급되는 혈액이 줄어들게 되어 피부의 노화를 촉진하게 된다.On the other hand, since there are no blood vessels in the epidermis, nutrients are supplied from the dermis. As the aging causes aging phenomenon which causes decrease in the size and number of skin blood vessels, blood supply to the skin is reduced, and the skin becomes cold and sunlight It is not well reddened, and the nutritional supply is reduced, and the wound healing is delayed. In the case of photoenalysis, which is considered to be the enemy of skin, the size of blood vessels is more severely decreased according to age than natural aged skin. The size of blood vessels decreases and the number of blood vessels decreases. As a result, The total area occupied is reduced by about 70%, and about 70% of the blood supplied to the skin is reduced, thereby promoting aging of the skin.
이에 본 발명자들은 피부에서의 혈관의 중요성을 인지하고, 본 발명의 진피 유래 성체 줄기세포가 혈관 생성 능력을 보유함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors recognized the importance of blood vessels in the skin, and confirmed that the dermal-derived adult stem cells of the present invention possessed angiogenic ability, and completed the present invention.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 진피 유래 성체 줄기세포의 혈관 생성 촉진 용도를 제공하는 것이다.In one aspect, an object of the present invention is to provide an application for promoting angiogenesis of dermal-derived adult stem cells.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 피부의 혈관 생성을 촉진하는 것이다.In another aspect, the object of the present invention is to promote angiogenesis of the skin.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 피부의 혈관 생성을 통해 피부 노화를 개선 또는 억제하는 것이다.In another aspect, the object of the present invention is to improve or inhibit skin aging through angiogenesis of the skin.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은 줄기 세포의 혈관 생성 능력을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.In another aspect, an object of the present invention is to provide a method for detecting angiogenic ability of stem cells.
일 측면에서, 본 발명은 진피 유래 성체 줄기세포, 상기 줄기세포의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관 생성 촉진용 조성물을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a composition for promoting angiogenesis, comprising dermal-derived adult stem cells, a culture of the stem cells or an extract of the culture as an active ingredient.
다른 측면에서, 본 발명은 또한, 줄기세포를 마트리겔(matrigel)로 코팅된 배양접시에서 배양하는 단계; 및 상기 배양접시 내의 신생 혈관을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 줄기세포의 혈관 생성 능력을 탐지하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention also provides a method for producing a stem cell, comprising culturing stem cells in a matrigel-coated culture dish; And comparing the angiogenesis in the culture dish with a control. The present invention also provides a method for detecting an angiogenic ability of stem cells.
일 측면에 있어서, 본 발명의 인간 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells, 이하 hDSPCs)을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 혈관 생성 능력을 보유하고 있다. 이에, 상기 조성물은 피부에 건강한 혈관을 공급해줄 수 있어 유용하다. 구체적으로, 상기 조성물은 피부에 건강한 혈관을 공급해줌으로써, 광노화 또는 내인성 노화와 같은 피부 노화시에 나타나는 현상인 혈관 감소, 혈관 분포 이상으로 인한 영양분 공급 부족 및 혈행 능력 감퇴를 개선하여 피부 노화 개선 또는 억제의 효과를 가지고, 피부 상처 치유, 탈모 개선 또는 피부 혈행 개선의 효과를 가질 수 있다. In one aspect, the composition containing human dermal stem / progenitor cells (hDSPCs) of the present invention as an active ingredient of the present invention has an angiogenic ability. Accordingly, the composition is useful because it can supply healthy blood vessels to the skin. Specifically, the composition provides healthy blood vessels to the skin, thereby improving blood vessel decline, lack of nutrients due to abnormal distribution of blood vessels and deterioration in blood circulation ability, which are phenomena that appear during aging of the skin such as photoaging or endogenous aging, And can have an effect of skin wound healing, hair loss improvement, or skin blood circulation improvement.
도 1은 일반 진피 섬유 아세포를 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 배양한 경우(A) 및 마트리겔로 코팅된 배양접시에서 배양한 경우(B)의 혈관 형성 정도를 관찰한 것이다. 또한, 진피 유래 성체 줄기세포를 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 배양한 경우(C) 및 마트리겔 배지로 코팅된 배양접시에서 배양한 경우(D)의 혈관 형성 정도를 관찰한 것이다.FIG. 1 is a graph showing the degree of angiogenesis in the case of culturing the general dermal fibroblast in a gelatin-coated culture dish (A) and culturing in a culture dish coated with Matrigel (B). In addition, the degree of angiogenesis of cultured dermal-derived adult stem cells in a culture dish coated with gelatin (C) and in a culture dish coated with Matrigel culture (D) was observed.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 일 관점에서, 진피 유래 성체 줄기세포, 상기 줄기세포의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates, in one aspect, to a composition for promoting angiogenesis, comprising an adult stem cell derived from dermis, a culture of said stem cell, or an extract of said culture as an active ingredient.
본 명세서에서, "피부 진피 유래 성체 줄기세포" 는 피부 진피를 구성하는 섬유아세포로부터 유래된 성체 줄기 세포를 의미할 수 있다. 예컨대, 0.1~1% 젤라틴 또는 10~30ug/ml의 제 4형 콜라겐을 배양접시에 넣고 16~24시간 동안 코팅 하고, 인간 진피 유래 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 트립신을 이용하여 배양접시로부터 분리한 뒤, 원심분리하여 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 후 세포를 현탁하고, 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 피부 섬유아세포를 5분간 배양하였을 때, 초기 5분 내에 배양접시에 붙은 세포(RA; Rapidly Adhering)를 포함할 수 있다.In the present specification, "skin dermis-derived adult stem cells" may refer to adult stem cells derived from fibroblasts constituting skin dermis. For example, 0.1 to 1% gelatin or 10 to 30 ug / ml of type 4 collagen is placed in a culture dish and coated for 16 to 24 hours. Human dermal fibroblasts (NHDF) are cultured using trypsin After separating from the dish, the cells were centrifuged to allow the cells to settle. After the culture solution was removed, the cells were suspended, and the skin fibroblasts were incubated for 5 minutes in a culture dish coated with gelatin or type 4 collagen. And may include cells (RA: Rapidly Adhering) attached to a culture dish.
또한, 본 명세서에서, "진피 유래 성체 줄기세포의 배양물"은 진피 유래 섬유아세포를 배양하여 수득한 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물을 의미할 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서, "진피 유래 성체 줄기세포의 배양물"은 진피 유래 성체 줄기세포를 분리한 후, 세럼이 없는 DMEM 배지 상태에서 2일간 CO2배양기에서 37℃ 5% CO2조건하에서 부유배양한 후 확보한 배양액을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서, "진피 유래 성체 줄기세포의 배양물의 추출물"은 상기 진피 유래 성체 줄기세포 배양물의 여과액, 원심분리한 후의 상등액 또는 상기 배양물을 초음파 처리하거나 상기 배양물에 용해효소(lysozyme)을 처리하여 수득한 상기 세포 파쇄액 등을 포함하는 것을 의미할 수 있고, 세포내 성분을 함유할 수 있다.In the present specification, the term "culture of dermal-derived adult stem cells" may mean a culture of dermal-derived adult stem cells obtained by culturing dermal-derived fibroblasts. For example, in the present specification, "culture of the dermis-derived adult stem cell water" is suspended cultured in the dermis-derived adult After separation of stem cells for 2 days 37 ℃ in a CO 2 incubator in DMEM medium without the serum 5% CO 2 conditions And a culture obtained after incubation. In the present specification, the term "an extract of a cultured stem cell of a dermis-derived adult stem cell" refers to a solution obtained by subjecting the above dermis-derived adult stem cell culture filtrate, supernatant after centrifugation or the above culture to ultrasonication or lysozyme ), And the like, and may contain an intracellular component.
또한, 본 명세서에서, "혈관 생성" 은 혈관 신생(angiogenesis)과 혈관 형성(vasculogenesis) 등을 포함하는 것을 의미할 수 있다.Further, in the present specification, "angiogenesis" may mean including angiogenesis and vasculogenesis.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 혈관 생성은 혈관 신생(angiogenesis) 또는 혈관 형성(vasculogenesis)을 포함한다.In one aspect of the invention, angiogenesis involves angiogenesis or vasculogenesis.
본 명세서에서, 혈관 신생(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 혈관 내피세포가 출아하여 조직에 침입하는 형태로 모세혈관이 뻗어나가는 혈관 형성을 의미할 수 있다.In the present specification, angiogenesis may mean angiogenesis in which capillary blood vessels extend in a form in which vascular endothelial cells originate from existing blood vessels and invade tissues.
아울러, 본 명세서에서, 혈관 형성(vasculogenesis)은 혈관아세포가 조혈관세포집단을 형성하여 그 융합 및 관강 형성에 의해 혈관총을 형성하는 것을 의미할 수 있다.In addition, in the present specification, vasculogenesis may mean that blood vessel cells form a group of blood vessel cells to form a blood vessel gun by fusion and lumen formation.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 진피 유래 성체 줄기세포는 인간의 진피 유래 성체 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포 KCTC11995BP는 본 발명의 발명자들이 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 동정 및 수득율을 높이는 방법을 고안하는 과정 중, 이를 바탕으로 완성한 발명이다. 상기와 같은 관점에서 상기 줄기세포 2.5×104개를 젤라틴 또는 마트리겔로 코팅된 배양접시에서 배양할 수 있으며, 상기 배양한 줄기세포를 위상차 현미경으로 관찰한 결과, 신생 혈관이 크게 증가함을 확인할 수 있었다. In a composition according to one aspect of the present invention, the dermal-derived adult stem cell may be a human dermal-derived adult stem cell, specifically, a stem cell of accession number KCTC11995BP. The stem cell KCTC11995BP is an invented invention based on the inventors of the present invention in the process of devising a method for enhancing the identification and yield of human dermal-derived adult stem cells. From the above viewpoint, it is possible to cultivate 2.5 x 10 4 of the stem cells in a culture dish coated with gelatin or matrigel, and observing the cultured stem cells with a phase contrast microscope, it is confirmed that the neovascularization is greatly increased I could.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 혈관 생성 인자를 포함할 수 있다. 상기와 같은 관점에서, 상기 혈관 생성 인자는 bFGF(basic fibroblast growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(endothelial growth factor), TGF-β(transforming growth factor β), PIGF(placenta growth factor), PDGF(platelet derived growth factor) 및 VPF(vascular permeability factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 인자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one aspect of the invention, the composition may comprise an angiogenic factor. The angiogenic factor may be selected from the group consisting of basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), endothelial growth factor (EGF), transforming growth factor beta (TGF-beta), placenta growth factor , A platelet derived growth factor (PDGF), and a vascular permeability factor (VPF). However, the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 단백분해효소를 포함하여 혈관 내피 세포를 이동시키는 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백분해효소는 혈관 내피 세포의 기저막과 세포 외 기질(extracelluar matrix)을 분해하고, 이때 생긴 틈새로 내피세포가 이동하여 증식하게 됨으로써, 혈관을 생성할 수 있다.In one aspect of the present invention, the composition may be a composition for transferring vascular endothelial cells including proteolytic enzymes. Specifically, the proteolytic enzyme decomposes the basal membrane and extracellular matrix of vascular endothelial cells, and the endothelial cells migrate and propagate in the gap formed at this time, thereby generating blood vessels.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 단백분해효소(protease)는 헤파라나아제(heparanase), 내생 글리코시드 가수분해효소(endoglycosidase), 콜라게나아제(collagenase), 세린 프로테아제(serine protease) 및 MMP(matrix metalloproteinase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 조성물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In one aspect of the present invention, the protease is selected from the group consisting of heparanase, endoglycosidase, collagenase, serine protease, and MMP a matrix metalloproteinase, and the like, but is not limited thereto.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 혈관 내피 세포를 피부내에 부착시키는 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물에 의하여 혈관 내피 세포가 피부내 조직(진피 또는 진피 내의 혈관 외피 세포)에 부착함으로써, 혈관을 생성할 수 있다.In one aspect of the present invention, the composition may be a composition that adheres vascular endothelial cells to the skin. Specifically, the blood vessel can be produced by attaching vascular endothelial cells to the skin tissue (vascular epithelial cells in the dermis or dermis) by the above composition.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 피부노화 개선 또는 억제, 피부 상처 치유, 탈모 개선 또는 피부 혈행 개선 용도를 갖는 조성물일 수 있다. 본 발명의 일 관점인 조성물은 노화된 피부, 피부의 상처 부위, 두피 등에 새로운 혈관을 생성해줌으로써, 혈관 감소, 혈관분포 이상으로 인한 영양분 공급 부족을 개선하여 피부노화를 예방 또는 억제할 수 있으며, 상처 치유 속도를 개선하고, 탈모를 개선하거나 피부 혈행을 개선시킬 수 있다.In a composition according to one aspect of the present invention, the composition may be a composition having an application for improving or inhibiting skin aging, for treating skin wounds, for improving hair loss, or for improving skin circulation. The composition, which is one aspect of the present invention, can prevent or inhibit skin aging by improving the lack of supply of nutrients due to reduction of blood vessels and vascular distribution by generating new blood vessels in aged skin, wound area of skin, scalp, Improve wound healing rates, improve hair loss, or improve skin blood circulation.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 피부노화는 광노화 또는 내인성노화일 수 있다.In one aspect of the invention, the skin aging may be photoaging or endogenous aging.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 주사제일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 약학 또는 미용 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 주사용 제형은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 그러나, 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 본 발명의 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 특정 부위에 직접 투여할 수 있다. 이때, 조성물의 주입은 주사기를 이용하여 이루어질 수 있다. 유효성분의 실제 투여량은 분화 및 증식시키고자 하는 세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 예컨대 1회 투여량에 포함되는 진피 유래 성체 줄기세포는 2×104내지 3.5×104개 일 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.In one aspect of the present invention, the composition may be an injecting agent. Specifically, the composition may be formulated into a unit dosage form suitable for administration to a patient in the body according to a conventional method in the pharmaceutical or cosmetic field. As a formulation suitable for such purpose, an injectable preparation or a preparation for topical administration is preferably used as the parenteral administration preparation. The injectable formulations are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions. However, at this time, diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like may be used together. The thus prepared preparation of the present invention can be administered parenterally according to a conventional method, for example, directly to a specific site. At this time, the composition may be injected using a syringe. It should be understood that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of various relevant factors such as the amount of cells to be differentiated and proliferated, the route of administration, the weight of the patient, age and sex, Derived adult stem cells may be 2 x 10 4 to 3.5 x 10 4 cells. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 국소 투여용인 조성물일 수 있다.In one aspect of the invention, the composition may be a composition for topical administration.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 2×104내지 3.5×104개의 진피 유래 성체 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one aspect of the present invention, the composition may include 2 x 10 4 to 3.5 x 10 4 dermal-derived adult stem cells, but is not limited thereto.
본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 구체적으로, 화장료 조성물로는 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. In one aspect of the invention, the composition may be a cosmetic composition. Specifically, the cosmetic composition may be, for example, a basic cosmetic composition, a makeup cosmetic composition, a hair cosmetic composition, a body cosmetic composition or the like, and the formulation is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 로션, 바디로션, 영양 크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 패치, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료, 립스틱, 메이크업베이스 또는 파운데이션 등의 색조 화장료, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 치약 또는 구강 청정제 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있다. For example, the cosmetic composition can be formulated into a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, But is not limited thereto. More specifically, the present invention relates to a cosmetic composition, which comprises at least one of a softening agent, a nutritional lotion, a lotion, a body lotion, a nutritional cream, a massage cream, a moisturizing cream, a hand cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, Shampoos, rinses, body cleansers, toothpastes or mouthwashes, hair tonics, cosmetics, cosmetics, cosmetics, cosmetics, cosmetics, Gel or mousse, or a hair cosmetic composition such as a hair dye or a hair dye.
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.The cosmetic composition contains a cosmetically acceptable medium or base. It may be in any form suitable for topical application, for example as a solution, a gel, a solid or a paste anhydrous product, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in water, a suspension, a microemulsion, a microcapsule, a microgranule or an ionic form (liposome) and / In the form of a non-ionic follicle dispersing agent, or in the form of creams, skins, lotions, powders, ointments, sprays or conical sticks. These compositions may be prepared according to conventional methods in the art.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. In the case of a spray, in particular, / Propane or dimethyl ether.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cosmetic composition may further contain an enhancer. The thickening agent included in the cosmetic composition of the present invention may be selected from the group consisting of methylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylhydroxyguanine, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxyvinyl polymer, polyquaternium, cetearyl alcohol, Carrageenan, and the like. Among them, at least one of carboxymethyl cellulose, carboxyvinyl polymer, and polyquaternium can be used, and most preferably, it can be a carboxyvinyl polymer.
본 발명의 일 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the cosmetic composition may contain various bases and additives as appropriate, and the kind and amount of these components can be easily selected by the inventors. The composition may contain an additive that is acceptable according to need, and may further include components such as preservatives, pigments, and additives customary in the art.
방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.The preservative may specifically be phenoxyethanol or 1,2-hexanediol, and the perfume may be an artificial perfume or the like.
그리고, 본 발명의 일 실시태양에서 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.And, in one embodiment of the present invention, the cosmetic composition may comprise a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymer peptides, polymeric polysaccharides, sphingolipids and seaweed extracts. Examples of the compounding ingredients that may be added include organic solvents such as a preservative component, a moisturizer, an emollient, a surfactant, an organic and inorganic pigment, an organic powder, an ultraviolet absorbent, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a plant extract, a pH adjuster, A blood circulation promoter, a cold agent, a restriction agent, and purified water.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.The components to be added in addition to these components are not limited thereto, and any of the above components can be compounded within a range that does not impair the objects and effects of the present invention.
본 발명은 다른 관점에서, 줄기세포를 마트리겔(matrigel)로 코팅한 배양접시에서 배양하는 단계; 및 상기 배양접시 내의 신생 혈관을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 줄기세포의 혈관 생성 능력을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 줄기세포를 마트리겔로 코팅한 배양접시에서 배양하였을 때, 젤라틴으로 코팅한 배양접시에서 배양하는 경우보다, 더 많은 혈관이 생성됨을 확인할 수 있었다. 상기 마트리겔 코팅은 '100 내지 250 ul/35mm 배양접시'로 코팅할 수 있다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for culturing stem cells comprising culturing stem cells in a matrigel-coated culture dish; And comparing the angiogenesis in the culture dish with a control. The present invention also relates to a method for detecting an angiogenic ability of stem cells. When the stem cells were cultured in a matrigel coated culture dish, it was confirmed that more blood vessels were produced than when cultured in a gelatin-coated culture dish. The matrigel coating may be coated with a 100-250 ul / 35 mm culture dish.
본 발명의 일관점인 줄기세포의 혈관 생성 능력을 탐지하는 방법에 있어서, 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있으며, 상기와 같은 관점에서, 줄기세포는 진피 유래 성체 줄기세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the method of detecting the angiogenic ability of stem cells, which is one aspect of the present invention, the stem cells may be adult stem cells. In view of the above, the stem cells may be dermal-derived adult stem cells, no.
본 발명의 일관점인 줄기세포의 혈관 생성 능력을 탐지하는 방법에 있어서, 마트리겔 코팅량은 100 내지 250 ul/35mm 배양접시일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In the method of detecting the angiogenic ability of stem cells, which is an aspect of the present invention, the amount of matrigel coating may be 100-250 ul / 35 mm culture dish, but is not limited thereto.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the following examples are provided for illustrative purposes only in order to facilitate understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.
[실시예 1] 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양조건[Example 1] Culture conditions of human dermis-derived adult stem cells
인간 진피 유래 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 론자(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511)에서 구입하였다. 상기 인간 진피 유래 섬유아세포를 75 ㎠ T-flask에 계대배양을 하여, CO2배양기(CO2 Incubater)에서 37℃, 5% CO2조건하에서 배양하였다. 2번째 계대 배양 및 3번째 계대 배양한 상태의 세포로부터 진피 유래 성체 줄기세포를 분리하였다.Human dermal fibroblasts (NHDF) were purchased from Lonza, Inc. (Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511). The human dermis-derived fibroblasts were subcultured in a 75 cm 2 T-flask and cultured in a CO 2 incubator (CO 2 Incubater) at 37 ° C and 5% CO 2 . Dermal-derived adult stem cells were isolated from the cells in the second subculture and the third subculture.
20㎍의 제 4형 콜라겐 (Sigma Adrich Co., C7521-5MG) 을 100mm 배양접시에 5ml씩 넣고, 4℃에 16시간동안 코팅하였다. 인간 진피 유래 섬유아세포를 0.25% 트립신(Trypsin-EDTA)으로 100mm 배양접시로부터 분리한 뒤 1200rpm에서 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 뒤에 5ml의 DMEM배지를 넣어주어 세포를 현탁하고, 제 4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 5분간 배양하여 붙은 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 분리하여, 이하 각 실시예에서 사용하였다. 본 발명에서 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 한국생명공학연구원(KRIBB:Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)내의 KCTC(미생물자원센터:Korean Collection for Type Cultures)에 2011년 8월 8일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11995BP이다.
20 의 of type-IV collagen (Sigma Adrich Co., C7521-5MG) was added to a 100 mm culture dish in an amount of 5 ml, and the mixture was coated at 4 캜 for 16 hours. The human dermis-derived fibroblasts were separated from a 100-mm culture dish with 0.25% trypsin-EDTA, and then the cells were allowed to settle at 1200 rpm for 5 minutes. After removing the culture medium, the cells were suspended in 5 ml of DMEM medium, Human collagen-coated adult stem cells were cultured in a culture dish coated with collagen for 5 minutes and then used in each of the following examples. Human dermal-derived adult stem cells isolated from the present invention were deposited at KCTC (Korean Collection for Type Cultures) in Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on Aug. 8, 2011 , The deposit number is KCTC11995BP.
[실시예 2] 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양액 및 추출물의 확보[Example 2] Securing culture medium and extract of human dermis-derived adult stem cells
실시예 1에서와 같이 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 분리한 후, 세럼이 없는 DMEM배지 상태에서 2일간 CO2배양기(CO2 Incubater)에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 부유배양한 후 배양액만을 파이펫 에이드를 이용하여 확보하였다.
Human dermal dermis-derived adult stem cells were separated as in Example 1, and then cultured for 2 days in serum-free DMEM medium in a CO 2 incubator (CO 2 37 ℃ in Incubater), 5% CO 2 And the culture solution was secured by pipetting.
[실시예 3] 인간 진피 유래 섬유아세포 및 진피 유래 성체 줄기세포의 혈관 생성 능력 확인[Example 3] Confirmation of vascular capacity of human dermis-derived fibroblast and dermis-derived adult stem cells
인간 진피 유래 섬유아세포 및 진피 유래 성체 줄기세포의 혈관 생성 능력을 확인하기 위해 하기의 실험을 진행하였다.The following experiments were conducted to confirm the vascularity of human dermis-derived fibroblasts and dermis-derived adult stem cells.
대조군 1은 인간 진피 섬유아세포(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511)를 젤라틴(Sigma-Aldrich, G1393) 코팅한 배양접시에 넣고 배양한 군, 대조군 2는 상기 진피 섬유아세포를 마트리겔(BD Bioscience, Cat No. 354234)) 코팅한 배양접시에 넣고 배양한 군으로 하였다. 구체적으로, 상기 대조군 1은 젤라틴 0.1%로 코팅한 배양접시에 진피 유래 섬유 아세포를 2.5×104개의 세포를 넣고, 상기 대조군 2는 '100 ul/35mm 배양접시'의 마트리겔로 코팅한 배양접시에 대조군 1과 동일한 갯수의 세포를 넣었다.Control group 1 was cultured in a culture dish coated with human dermal fibroblast (Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511) coated with gelatin (Sigma-Aldrich, G1393) Was cultured in a culture dish coated with dermal fibroblast (Matrix gel (BD Bioscience, Cat No. 354234)). Specifically, in the control group 1, 2.5 × 10 4 cells of dermis-derived fibroblasts were placed in a culture dish coated with 0.1% of gelatin, and the control group 2 was cultured in a culture dish coated with a matrigel of a 100 μl / 35 mm culture dish The same number of cells as the control group 1 was added.
또한, 실험군 1은 실시예 1에서 수득한 상기 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 상기 대조군 1과 동일한 조건으로, 실험군 2는 실시예 1에서 수득한 상기 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 상기 대조군 2와 동일한 조건으로 넣었다.In Experiment Group 1, the human dermis-derived adult stem cells obtained in Example 1 were subjected to the same conditions as the control group 1, and in Experimental Group 2, the human dermis-derived adult stem cells obtained in Example 1 were treated under the same conditions as the control group 2 .
이후, 상기 대조군 및 실험군을 CO2 Incubator에서 5% CO2및 37 ℃의 조건하에서 약 1시간 동안 DMEM 배지 조건하에서 배양시킨 후, 24 시간 후 각 세포의 혈관 생성 여부를 위상차 현미경(Phase contrast microscopy)을 통하여 관찰하였다.Then, the control and experimental groups were treated with CO 2 Incubator was cultured in DMEM culture medium for about 1 hour under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. After 24 hours, the angiogenesis of each cell was observed by phase contrast microscopy.
그 결과, 대조군 1 및 2에서는 신생 혈관이 거의 관찰되지 않았으나, 실험군 1 및 2에서는 신생 혈관이 관찰되었으며, 실험군 1보다 실험군 2에서 더 많은 신생 혈관이 관찰되었다. 따라서, 인간 진피 유래 섬유아세포는 혈관 생성 능력이 거의 없는 반면, 인간 진피 유래 성체 줄기세포는 우수한 혈관 생성 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이러한 혈관 생성 능력은 마트리겔로 코팅된 배양접시에서 상기 줄기세포를 배양함으로써 더욱 효과적으로 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
As a result, neovascularization was not observed in control groups 1 and 2, but neovascularization was observed in experimental groups 1 and 2, and more neovascularization was observed in experimental group 2 than experimental group 1. Thus, it has been confirmed that human dermis-derived fibroblasts have almost no angiogenesis ability, whereas human dermis-derived adult stem cells have excellent angiogenesis ability, and this angiogenic ability is enhanced in the culture dish coated with Matrigel, It can be confirmed more effectively.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (16)
Dermis-derived adult stem cells, cultures of said stem cells, or extracts of said cultures as effective components.
상기 혈관 생성은, 혈관 신생(angiogenesis) 또는 혈관 형성(vasculogenesis)인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein said angiogenesis is angiogenesis or vasculogenesis.
상기 진피 유래 성체 줄기세포는, 인간의 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells : 이하 hDSPCs)인 조성물.
The method according to claim 1,
The dermal-derived adult stem cells are human dermal stem / progenitor cells (hDSPCs).
상기 진피 유래 성체 줄기세포는, 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포인 조성물.
The method of claim 3,
Wherein said dermal-derived adult stem cells are stem cells of Accession No. KCTC 11995BP.
상기 조성물은, 혈관 생성 인자를 포함하는 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition comprises an angiogenic factor.
상기 조성물은, 혈관 내피 세포를 피부 내에 부착시키는 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition adheres vascular endothelial cells to the skin.
상기 조성물은,
피부노화 개선 또는 억제, 피부 상처 치유 또는 피부 혈행 개선 용도를 갖는 조성물.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
The composition may comprise,
Improving or inhibiting skin aging, healing skin wounds or improving skin circulation.
상기 피부노화는, 광노화 또는 내인성 노화인 조성물.
8. The method of claim 7,
Wherein said skin aging is photoaging or endogenous aging.
상기 조성물은, 주사제인 조성물.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
Wherein the composition is an injection.
상기 조성물은, 국소 투여용인 조성물.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
Wherein said composition is for topical administration.
상기 조성물은,
2×104내지 3.5×104개의 진피 유래 성체 줄기세포를 포함하는 조성물.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
The composition may comprise,
2 × 10 4 to 3.5 × 10 4 of the dermis-derived composition containing the adult stem cells.
상기 조성물은, 화장료 조성물인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition is a cosmetic composition.
상기 배양접시 내의 신생 혈관을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는
줄기세포의 혈관 생성능력을 탐지하는 방법.
Culturing the stem cells in a culture dish coated with Matrigel; And
Comparing the angiogenesis in the culture dish with a control group
A method for detecting the angiogenic potential of stem cells.
상기 줄기세포는, 성체 줄기세포인 방법.
14. The method of claim 13,
Wherein said stem cells are adult stem cells.
상기 줄기세포는, 진피 유래 성체 줄기세포인 방법.
15. The method of claim 14,
Wherein said stem cells are dermal-derived adult stem cells.
상기 마트리겔 코팅량은, 100 내지 250 ul/35 mm 배양접시인 방법.The method according to any one of claims 13 to 15,
Wherein the amount of the matrigel coating is 100 to 250 ul / 35 mm culture dish.
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