KR20160015526A - 부작용이 억제된 암치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제에 의하여 유발된 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는 암치료 보조용 약학 조성물, 상기 PLA2 및 항암제를 포함하여, 부작용이 억제되어 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물, 및 상기 PLA2를 유효성분으로 포함하는 신장독성 또는 신경병증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 PLA2는 다양한 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 나타내는 항암활성을 경감시키지 않으면서도, 상기 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 유발되는 부작용을 감소시킬 수 있으므로, 플라틴계 항암제를 사용한 안전한 암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

부작용이 억제된 암치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer reducing side effect}

본 발명은 부작용이 억제된 암치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 항암제에 의하여 유발된 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는 암치료 보조용 약학 조성물, 상기 PLA2 및 항암제를 포함하여, 부작용이 억제되어 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물, 및 상기 PLA2를 유효성분으로 포함하는 신장독성 또는 신경병증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

최근 전체 사망원인 중 암으로 사망하는 원인은 4명 중 1명 꼴로 이는 계속 증가하는 추세에 있다. 이와 같이 사망원인의 대부분을 차지하는 암의 치료방법으로는 외과수술, 방사선 요법, 생물요법 및 화학요법등이 있다. 이 중에서도, 암치료를 위한 대부분의 화학요법제(chemotherapeutics)는 빠르게 분열, 증식하는 암세포를 사멸시키지만, 분열하는 세포의 DNA 합성과정에 영향을 미치기 때문에 암세포는 물론 골수, 면역세포 및 장상피에 독성을 나타낸다. 특히, 골수독성은 조혈기능 소실로 빈혈의 원인이 되며, 면역세포 독성은 면역력 감퇴를, 그리고 장관손상은 영양결핍, 탈수 및 감염에 대한 이환율 상승으로 사망의 주요 원인이 된다. 예를 들어, 시스플라틴(Cisplatin)을 포함하는 플라틴계열의 항암제는 중심에 백금(platinum II)을 함유한 대표적인 백금 착화 항암제로서, 다양한 종양 치료에 사용되고 있는 광범위 화학요법제의 하나로 비교적 우수한 항암효과를 나타내왔다. 그러나, 소화관 내에 존재하는 내분비세포 세포의 세로토닌 합성 및 세로토닌 5-HT3 수용체를 활성화시켜, 위장관의 손상과 함께 위배출능을 현저히 억제하여, 음식물의 위내 정체를 초래하는 등의 다양한 위장관 독성과 함께, 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 등의 신장독성 부작용 또는 냉이질통, 기계적 이질통 등의 신경병증 부작용, 혈액순환 저해 및 이로 인한 부종 등의 심혈관성 부작용, 청신경 마비, 난청 유발 등의 이독성 등을 나타내는 것으로 알려져 있다.

이에 따라, 플라틴계열의 항암제를 사용한 암치료시에는, 다양한 부작용을 억제하는 것이 상기 약물의 강력한 항암효과를 활용하는데 매우 중요한 관점이 되고 있다. 예를 들어, 한국특허등록 제697212호에는 황기 및 당귀의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는, 항암제 투여에 의해 유발되는 부작용 치료용 조혈 촉진제가 개시되어 있고, 한국특허등록 제1133837호에는 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장독성 억제용 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1350143호에는 반하 및 황금 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 부작용의 경감용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이들 대부분의 부작용 억제효과는 항암제의 항암활성에 간섭하여, 상기 항암활성을 일정부분 감소시킨다는 문제점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기 항암제의 항암활성을 경감시키지 않으면서도 항암제에 의하여 유발되는 부작용을 예방 또는 치료하여, 보다 안전한 암치료를 도모할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 꿀벌의 봉독으로부터 유래된 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)가 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 유발되는 신장독성 및 신경병증을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는, 암치료 보조용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항암제와 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 포함하는, 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인지질분해효소(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는, 신장독성 또는 신경병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 시스플라틴을 이용한 암치료시에 발생되는 부작용을 감소시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 벌의 독이 시스플라틴의 투여에 의하여 발생되는 부작용의 하나인 신장독성을 경감시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나, 벌의 독에는 생체에 유용한 다양한 성분이 포함되어 있으므로, 상기 벌의 독에 포함된 시스플라틴의 부작용을 억제할 수 있는 유효성분이 무엇인지를 규명하고자 추가적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 벌의 독에 포함된 인지질분해효소(phospholipase 2, PLA2)가 시스플라틴의 투여에 의하여 발생되는 부작용을 억제하는 유효성분임을 규명하였다. 상기 PLA2가 처리된 비장세포에서는 조절성 T 세포(Regulatory T cells, Treg)와 IL-10의 수준이 증가하고, 상기 PLA2는 세포막에 포함된 만노스 수용체인 CD206에 결합하여 세포내 신호전달을 유발시킴을 규명하였다. 이를 통하여, 상기 PLA2가 시스플라틴의 부작용을 억제하기 위하여는, Treg, CD206 및 IL-10가 필수적으로 요구됨을 확인하였고, 상기 PLA2에 의하여 시스플라틴의 투여로 인하여 발생되는 부작용이 억제되지만, 시스플라틴의 항암활성에는 어떠한 영향도 미치지 않음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 이러한 효과는 시스플라틴 이외의 다양한 플라틴계 항암제의 투여시에도 유사하게 나타남을 확인하였다.

따라서, PLA2는 플라틴계 항암제를 사용한 안전한 암치료에 사용될 수 있으며, 이러한 연구결과는 종래의 어떠한 연구결과로부터도 나타나지 않은 새로운 효과이며, 이는 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는, 암치료 보조용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "인지질분해효소2(phospholipase2; PLA2)는 글리세롤을 두번째 탄소위치에서 가수분해하여 지방산을 생성하는 기능을 촉매하는 효소를 의미하는데, 인지질의 sn-2 아실 결합을 특이적으로 인식하여 가수분해 활성을 촉매하여 아라키돈산과 라이소인지질(lysophospholipid)을 생성한다.

본 발명에 있어서, 상기 PLA2는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 박테리아, 곤충이나 뱀독뿐만 아니라 포유류의 조직에서 발견된 것이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 꿀벌(Apis mellifera)의 봉독으로부터 유래된 것이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것이 될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지된 꿀벌의 독으로부터 유래된 PLA2에 대한 유전자로부터 발현가능한 총 아미노산 서열이며(GenBank ID: ABQ28728.1), 실질적으로 분비되는 형태 즉, 분비형 PLA2는 N-말단의 리더서열이 제거된 형태이고, 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다(서열번호 1의 34 내지 167번의 아미노산으로 구성).

본 발명의 용어 "리더서열"이란, 상기 PLA2가 분비형 PLA2로 성숙되는 과정에서 제거되는 서열로서, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 33번 아미노산에 해당하는 서열일 수 있고, 구체적으로 서열번호 3의 서열일 수 있다. 본 발명에서 리더서열이 제외된 PLA2는 성숙형이라고 불리기도 한다.

본 발명에서 리더서열이 제외된 PLA2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 상기 리더서열이 제외된 PLA2 아미노산 서열의 C-말단부위 및/또는 N-말단부위에 추가적으로 아미노산 서열을 더 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 추가적인 아미노산 서열은 재조합 발현된 단백질의 정제를 위한 태그를 포함할 수 있다.

본 발명의 리더서열이 제외된 PLA2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 봉독으로부터 공지된 방법에 의해 분리하여 제조하거나, 재조합 발현에 의해 제조하거나, 시중에서 이용 가능한 것을 구입하여 사용하거나, 합성하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 PLA2는 항암제의 투여에 의하여 유발되는 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내므로, 상기 PLA2는 통상적인 항암제와 함께 또는 항암제의 투여 이전에 암환자에게 투여되어, 항암제로 인한 부작용을 발생을 예방, 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 PLA2에 의하여 부작용의 발생이 억제되는 항암제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 부작용을 나타내는 모든 항암제가 포함될 수 있고, 바람직하게는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 테트라플라틴(tetraplatin), 헵타플라틴(heptaplatin), 파라플라틴(paraplatin), 카보플라틴(carboplatin), 나노플라틴(nanoplatin) 등의 플라틴계 항암제가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 시스플라틴 또는 옥살리플라틴이 될 수 있다.

또한, 항암제의 투여에 의하여 유발되어 본 발명의 PLA2에 의하여 억제되는 부작용은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는, 개체의 사망, 위장관 독성, 신장독성, 신경병증, 심혈관성 부작용, 이독성 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 개체의 사망; 위장관의 손상과 함께 위배출능을 현저히 억제하여, 음식물의 위내 정체를 초래하는 등의 다양한 위장관 독성; 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 등의 신장독성; 냉이질통, 기계적 이질통 등의 신경병증; 혈액순환 저해 및 이로 인한 부종 등의 심혈관성 부작용; 청신경 마비, 난청 유발 등의 이독성 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는, 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 등의 신장독성; 또는, 냉이질통, 기계적 이질통 등의 신경병증이 단독으로 또는 중복되어 나타나는 부작용이 될 수 있다.

따라서, 본 발명의 PLA2는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 테트라플라틴(tetraplatin), 헵타플라틴(heptaplatin), 파라플라틴(paraplatin), 카보플라틴(carboplatin), 나노플라틴(nanoplatin) 등의 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 발생할 수 있는 개체의 사망; 위장관의 손상과 함께 위배출능을 현저히 억제하여, 음식물의 위내 정체를 초래하는 등의 다양한 위장관 독성; 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 등의 신장독성; 냉이질통, 기계적 이질통 등의 신경병증; 혈액순환 저해 및 이로 인한 부종 등의 심혈관성 부작용; 청신경 마비, 난청 유발 등의 이독성 등이 단독으로 또는 중복으로 나타나는 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "암치료 보조"란, 암치료용 약학 조성물의 투여에 의하여 유발될 수 있는 부작용을 예방 또는 치료하여, 보다 안전한 암치료를 도모할 수 있는 효과를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 암치료 보조는 PLA2의 투여에 의하여 수행되므로, 상기 PLA2는 항암 보조제로 작용하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명에서는 상기 PLA2가 항암 보조제로 작용할 수 있는지에 관하여 다양한 효능 및 관점에서 이를 확인하였다.

먼저, 이처럼 항암 보조제로 작용하는 PLA2의 기본적인 효과는 항암제의 투여로 인하여 유발되는 부작용을 억제하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 시스플라틴에 의해 유발되는 부작용을 PLA2가 억제할 수 있는지의 여부를 확인하고자 다양한 투여량의 PLA2를 투여한 마우스의 비장세포에서 Treg의 세포수를 분석한 결과, PLA2의 처리농도가 증가할 수록, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg)의 수가 증가하고(도 1a), 생체내에서도 PLA2의 처리농도가 증가할 수록, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg)의 수가 증가하며(도 1b), 시스플라틴이 투여된 마우스에서 부작용으로 인한 마우스의 사망율을 PLA2를 처리하여 감소시킬 수 있고(도 1c), 시스플라틴이 투여된 마우스에서 부작용으로 인한 신장조직의 손상을 PLA2를 처리하여 감소시킬 수 있으며(도 1d), 시스플라틴이 투여된 마우스에서 부작용으로 인한 신장기능장애를 PLA2를 처리하여 감소시킬 수 있음(도 1e 및 1f)을 확인하였다. 또한, 시스플라틴의 투여시 증가하는 전염증성 사이토카인과 대식구 세포에 대한 PLA2의 효과를 분석한 결과, 정상 마우스에서는 시스플라틴의 투여시 증가하는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준과 대식세포인 F4/80 양성 세포의 수준이 PLA2의 처리에 의하여 감소된 반면, Treg를 결핍시킨 마우스에서는 시스플라틴의 투여시 증가하는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준과 대식세포인 F4/80 양성 세포의 수준이 PLA2의 처리에 의하여 감소되지 않았다(도 3a 내지 3c). 아울러, 플라틴계에 속하는 다른 항암제인 옥살리플라틴의 투여에 의해 발생되는 신경병증성 부작용인 냉이질통 및 기계적 이질통의 발생을 PLA2를 투여하여 억제시킬 수 있음을 확인하였다(도 8a 및 8b).

즉, 본 발명의 PLA2는 항암제에 의해 발생될 수 있는 다양한 부작용을 경감시키는 효과를 가짐으로써, 항암 보조제로서의 기능을 나타냄을 확인하였다.

상기 항암 보조제의 추가적인 효과는 항암제 자체의 효능에 문제를 일으키지 않아야 한다는 것이다. 즉, 본 발명의 PLA2는 항암제의 항암활성을 경감시키지 않고, 오히려 항암활성을 향상시키는 가능성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 시스플라틴의 항암활성에 PLA2가 어떠한 영향을 미칠것인지를 분석한 결과, 림프종 세포에 대한 시스플라틴의 항암활성에 대하여 PLA2는 어떠한 영향도 미치지 않을 뿐만 아니라, 오히려 항암 활성을 증가시킬 수 있는 가능성을 나타냄을 확인하였다(도 7a 내지 7c).

한편, 본 발명의 PLA2는 다양한 항암제의 부작용에 대하여 이를 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 플라틴계에 속하는 하나의 항암제인 시스플라틴이 투여된 마우스에서 부작용으로 인한 마우스의 사망율을 PLA2를 처리하여 감소시킬 수 있고(도 1c), 시스플라틴이 투여된 마우스에서 부작용으로 인한 신장조직의 손상을 PLA2를 처리하여 감소시킬 수 있으며(도 1d), 시스플라틴이 투여된 마우스에서 부작용으로 인한 신장기능장애를 PLA2를 처리하여 감소시킬 수 있음(도 1e 및 1f)을 확인하였을 뿐만 아니라, 플라틴계에 속하는 다른 항암제인 옥살리플라틴의 투여에 의해 발생되는 신경병증성 부작용인 냉이질통 및 기계적 이질통의 발생을 PLA2를 투여하여 억제시킬 수 있음을 확인하였다(도 8a 및 8b).

아울러, 본 발명자들은 상술한 PLA2의 다양한 효과가 PLA2의 신호전달에 의해 나타날 것으로 예측하고, 상기 PLA2의 신호전달에는 조절 T 세포(regulatory T cell; Treg), CD206 및 IL-10이 필수적으로 관여하므로, 상기 PLA2의 효과는 Treg, CD206 및 IL-10에 의존적임을 규명하였다.

본 발명의 용어 "조절 T 세포(regulatory T cell; Treg)"란, 억제 T 세포(suppressor T cell)라고도 불리는 헬퍼 T 세포(helper T cell; Th)의 일종을 의미한다. 다른 백혈구의 분화 및 활성화를 촉진하여 체액성 면역 촉진효과를 보이는 다른 헬퍼 T 세포와 달리, 면역을 억제하여 면역관용을 유지하여 항상성을 가지게 한다. 이는 정상 면역반응 동안 생성되는 Tr1 및 Th3 세포를 포함하는 적응(adaptive) Treg와 자연발생(naturally occuring) Treg로 분류할 수 있다. 자연발생 Treg는 흉선(thymus)에서 발생하며 CD4, CD25 및 Foxp3에 대해 양성의 표현형을 가지며 세포 내 분자인 Foxp3의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별된다.

본 발명에 있어서, 상기 Treg는 PLA2의 처리에 의하여 비장세포내에서 발현이 증가되며, 상기 PLA2의 효과를 구현하기 위한 필수구성요소로 사용되는 것으로 규명되었다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, Treg를 결핍시킨 마우스에서 시스플라틴의 부작용에 대한 PLA2의 효과를 분석한 결과, Treg를 결핍시킨 마우스에서는 시스플라틴의 부작용에 의한 마우스의 사망율(도 2a), 신장조직손상(도 2b) 및 신장기능장애(도 2c 및 2d)에 대하여 PLA2가 개선효과를 나타내지 못함을 확인하였다.

따라서, 상기 Treg는 PLA2의 신호전달에 관여하는 성분인 것으로 예상되었다.

본 발명의 용어 "CD206"이란, 대식구 세포 및 수지상 세포의 표면에 존재하고, 만노스의 수용체 활성을 나타내는 C형 렉틴의 일종인 당단백질을 의미한다. 상기 CD206은 세포내재화성 수용체(endocytic receptors)로서, 세포의 표면에서 만노스와 결합하고, 이를 세포내부로 유입시키는 역할을 수행한다.

본 발명에 있어서, 상기 CD206은 PLA2와 결합하여 상기 PLA2를 세포내부로 유입시키는 매개체(수용체)로서 사용되며, 상기 상기 PLA2의 효과를 구현하기 위한 필수구성요소로 사용되는 것으로 규명되었다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 세포에서 PLA2가 무엇을 통해 시스플라틴의 부작용을 억제하는 활성을 나타내는지를 분석한 결과, PLA2는 만노스의 수용체인 CD206에 결합하여 시스플라틴의 부작용을 감소시키는 효과를 나타냄을 확인하였고(도 4a 내지 4c), 이를 확인하기 위하여, CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리로 인하여 유발된 부작용에 대한 PLA2의 효과를 분석한 결과, 정상 마우스에서는 Treg 세포의 수준이 PLA2의 처리에 의해 증가하고, 시스플라틴의 투여시 유발되는 신장조직손상 및 신장기능장애가 PLA2의 처리에 의하여 감소된 반면, CD206 결핍 마우스 모델에서는 Treg 세포의 수준, 시스플라틴의 투여시 유발되는 신장조직손상 및 신장기능장애가 PLA2의 처리에 의하여 변화되지 않음을 확인하였다(도 5a 내지 5d).

따라서, 상기 CD206은 PLA2의 신호전달의 개시에 관여하는 역할을 수행할 것으로 예상되었다.

본 발명의 용어 "인터루킨 10(interleukin 10, IL-10)"이란, 대식세포/ 모노사이트 및 T-세포 림프구 복제 및 염증성 사이토카인(IL1, TNFA, TGFB, IL6, IL8 및 IL12)의 분비를 억제하는 기능을 발휘하는 림프구 세포에 의해 생성되는 강력한 면역억제성 Th-2 세포 사이토카인을 의미한다. 상기 IL-10은 다른 사이토카인의 활성을 억제하기 위하여 신호전달에 관여하는 분자를 조절할 수 있는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 IL-10은 PLA2의 처리에 의하여 비장세포에서 발현되어 분비되며, 상기 PLA2의 효과를 구현하기 위한 필수구성요소로 사용되는 것으로 규명되었다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, PLA2가 처리된 비장세포에서는 IL-10가 분비되므로(도 6a), 상기 IL-10가 PLA2의 효과에 어떠한 영향을 나타내는지 확인하고자, IL-10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리로 인하여 유발된 부작용에 대한 PLA2의 효과를 분석한 결과, 정상 마우스에서는 시스플라틴의 투여시 유발되는 신장조직손상 및 신장기능장애가 PLA2의 처리에 의하여 감소된 반면, IL-10 결핍 마우스 모델에서는 시스플라틴의 투여시 유발되는 신장조직손상 및 신장기능장애가 PLA2의 처리에 의하여 변화되지 않음을 확인하였다(도 6b 내지 6d).

따라서, 상기 IL-10은 PLA2의 신호전달에 관여하는 분자를 조절하는 역할을 수행할 것으로 예상되었다.

따라서, 상기 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 PLA2는 시스플라틴 또는 옥살리플라틴을 포함하는 다양한 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 나타내는 항암활성에 대하여는 어떠한 영향도 미치지 않으면서도, 상기 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 유발되는 부작용을 감소시킬 수 있으므로, 플라틴계 항암제를 사용한 안전한 암치료에 널리 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물에 포함된 상기 PLA2의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물은 부작용을 유발할 수 있는 항암제와 동시에 또는 상기 항암제의 투여 이전 또는 이후에 개별적으로 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 항암제의 부작용을 억제할 수 있는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 0.1 내지 500 mg/체중 kg으로 투여함이 바람직하다. 본 발명의 암치료 보조용 약학 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 항암제와 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 포함하는, 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 상기 PLA2는 항암제의 투여에 의하여 유발되는 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내므로, 상기 부작용 유발이 우려되는 항암제와 PLA2를 동시에 포함하는 복합적 암치료용 약학 조성물은 항암제에 의한 부작용의 발생이 억제될 수 있어, 보다 안전한 암치료에 활용될 수 있다. 이때, 사용되는 PLA2는 항암제에 의하여 유발되는 부작용을 억제하여 암치료를 보조하는 역할을 수행하는 항암 보조제로 해석될 수 있다.

이때, 상기 항암제, PLA2 등은 상술한 바와 동일하고, 상기 암치료용 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제 역시 상술한 바와 동일하며, 상기 약학 조성물에 포함되는 항암제 및 PLA2의 함량은 상술한 바와 같이, 암환자에게서 발병된 암질환의 종류, 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 암치료 보조용 약학 조성물 또는 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 PLA2는 항암제의 부작용을 예방 또는 치료할 수 있으므로, 상기 PLA2를 포함하는 암치료 보조용 약학 조성물을 항암제와 개별적으로 환자에게 투여하거나 또는 항암제와 PLA2를 동시에 포함하는 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물을 환자에게 투여함으로써, 보다 안전하게 암질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란 암질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 암질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 PLA2가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 인지질분해효소(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는, 신장독성 또는 신경병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 PLA2는 항암제의 항암활성에 간섭하지 않고서도, 항암제의 투여에 의하여 발생할 수 있는 부작용인 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 등의 신장독성 또는 냉이질통, 기계적 이질통 등의 신경병증을 예방 또는 치료할 수 있다. 이는 상기 PLA2가 항암제의 처리와는 독립적으로 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 등의 신장독성 또는 냉이질통, 기계적 이질통 등의 신경병증을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타냄을 암시하는 것으로 분석되었으므로, 항암제의 처리와는 상관없이 PLA2를 단독으로 사용하여 상술한 증상을 나타내는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

이때, 상기 항암제, PLA2 등은 상술한 바와 동일하고, 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제 역시 상술한 바와 동일하며, 본 발명에서 제공하는 신장독성 또는 신경병증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함된 PLA2의 함량 역시 상술한 바와 동일하다.

또한, 상기 약학 조성물은 신장독성 또는 신경병증이 발병된 개체에게 약제학적으로 유효한 양으로 투여함으로써, 신장독성 또는 신경병증을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있는데, 이때, 상기 약학 조성물의 투여경로 역시 상술한 바와 동일하다.

본 발명에서 제공하는 PLA2는 다양한 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 나타내는 항암활성을 경감시키지 않으면서도, 상기 플라틴계 항암제의 투여에 의하여 유발되는 부작용을 감소시킬 수 있으므로, 플라틴계 항암제를 사용한 안전한 암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 실험실적 조건에서 PLA2의 처리농도에 따른, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 생체내 조건에서 PLA2의 처리여부에 따른, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포수의 변화여부를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 PLA2의 전처리 여부에 따른 마우스의 생존율변화를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 1e는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 마우스의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1f는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 마우스의 혈액에 포함된 BUN(blood urea nitrogen)의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 Treg 결핍 마우스 모델에서 PLA2의 전처리 여부에 따른 마우스의 생존율변화를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 2c는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 Treg 결핍 마우스의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2d는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 Treg 결핍 마우스의 혈액에 포함된 BUN의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 정상 마우스 및 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여하고, 이로부터 얻어진 신장조직에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α의 수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 정상 마우스 및 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여하고, 이로부터 얻어진 신장조직에서 전염증성 사이토카인인 IL-6의 수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 정상 마우스 및 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여하고, 이로부터 얻어진 신장조직에서 대식구 세포인 F4/80 양성세포의 수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 재조합 인간 CD206의 처리농도 증가에 따른, Dynabead에 결합된 PLA2와 CD206의 복합체의 수준변화를 나타내는 면역블럿 사진이다.
도 4b는 재조합 인간 CD206에 대한 Dynabead에 결합된 PLA2의 결합활성에 있어서, 순수 PLA2 또는 만노스-BSA의 경쟁효과를 나타내는 면역블럿 사진이다.
도 4c는 수지상 세포에서 PLA2와 CD206의 위치를 면역형광염색 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5a는 정상 마우스와 CD206^-/- 마우스에서 PLA2의 처리농도에 따른 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 5c는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 CD206 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이ek.
도 5d는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 CD206 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 BUN의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 PLA2의 처리농도에 따른 비장세포에서 분비된 IL-10의 수준변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 IL-10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진이다.
도 6c는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 IL-10 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 IL-10 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 BUN의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 그룹 I(대조군), 그룹 II(시스플라틴 단독) 및 그룹 III(PLA2 + 시스플라틴)에서 적출된 종양을 비교한 사진이다..
도 7b는 그룹 I(대조군), 그룹 II(시스플라틴 단독) 및 그룹 III(PLA2 + 시스플라틴)에서 마우스 사육시간의 경과에 따른 종양의 크기변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 그룹 I(대조군), 그룹 II(시스플라틴 단독) 및 그룹 III(PLA2 + 시스플라틴)에서 적출된 종양의 중량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 옥살리플라틴을 처리하여 제작한 신경병증성 통증 마우스 모델에서 발생하는 냉이질통에 대한 PLA2의 효과를 7일 동안 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 옥살리플라틴을 처리하여 제작한 신경병증성 통증 마우스 모델에서 발생하는 기계적 이질통에 대한 PLA2의 효과를 7일 동안 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 시스플라틴의 부작용에 미치는 PLA2 의 효과분석

시스플라틴에 의해 유발되는 부작용을 PLA2가 억제할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.

실시예 1-1: 실험실적 조건에서 Treg 의 세포수에 미치는 PLA2 의 효과

웅성 Foxp3^GFP 마우스(C. Cg-Foxp3tm2Tch/J, 5-6 주령)를 12시간의 명암조건을 나타내는 특정 병원균이 없는 조건에서 순응시킨 다음, 상기 마우스를 희생시키고, 이로부터 비장을 적출하고, 상기 적출된 비장으로부터 비장세포를 수득하였다.

상기 수득한 비장세포에 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖의 PLA2를 3일동안 처리하고 배양한 다음, 항-CD4 항체 및 항-CD25 항체를 사용하여 염색하였다. 상기 염색된 세포를 FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 적용하여 유세포분석을 수행하고, 이로부터 얻어진 데이터를 CellQuest Pro(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석함으로써, CD4⁺ T 세포 중에서 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg)의 수를 계수하고 이를 비교하였다(도 1a).

도 1a는 실험실적 조건에서 PLA2의 처리농도에 따른, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, PLA2의 처리농도가 증가할 수록, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg)의 수가 증가함을 알 수 있었다.

실시예 1-2: 생체내 조건에서 Treg 의 세포수에 미치는 PLA2 의 효과

상기 웅성 Foxp3^GFP 마우스에 5일 동안 하루에 한번씩 PLA2(0.2 mg/kg) 또는 동일부피의 PBS를 주사하면서 사육하고, 사육이 종료된 후, 상기 각 마우스로부터 비장세포를 수득한 다음, CD4⁺ T 세포 중에서 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포의 수를 계수하고 이를 비교하였다(도 1b).

도 1b는 생체내 조건에서 PLA2의 처리여부에 따른, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포수의 변화여부를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 생체내 조건에서도 PLA2의 처리에 따라, CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg)의 수가 증가함을 알 수 있었다.

실시예 1-3: 시스플라틴이 투여된 마우스의 생존율에 미치는 PLA2 의 효과

18~20 g의 웅성 C57BL/6 마우스(5-6 주령, Korea Biolink, 한국)에 1일기준 체중 1kg당 0.2 mg의 PLA2를 복강주사하는 것을 5일 동안 수행하였고, 대조군에는 동일 부피의 PLA2 대신 PBS를 주사하였다. PLA2 또는 PBS를 최종투여하고 2일이 경과된 후, 모든 마우스에 1 mg/㎖의 농도로 PBS에 용해된 시스플라틴을 체중 1kg당 25 mg의 투여량으로 주사하였으며, 이를 10일 동안 사육하면서, 6시간 마다 살아있는 마우스를 계수하고, 이로부터 마우스의 생존율을 산출하였다(도 1c).

도 1c는 PLA2의 전처리 여부에 따른 마우스의 생존율 변화를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 시스플라틴이 투여된 마우스 중에서, PBS를 전처리한 대조군의 마우스는 시스플라틴 투여후 약 144시간이 경과된 시점에서 모두 사망하였으나, PLA2가 전처리된 실험군의 마우스는 시스플라틴을 투여하고 10일이 경과한 후에도 약 33.33%가 생존함을 확인하였다.

따라서, PLA2의 전처리는 시스플라틴이 마우스에 나타내는 부작용을 감소시킬 수 있는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 1-4: 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2 의 효과

상기 실시예 1-3에서 수득한 PBS와 시스플라틴을 투여한 마우스의 신장조직과 PLA2와 시스플라틴을 투여한 마우스의 신장조직을 각각 적출하고, 이를 4% PFA(paraformaldehyde)로 1일 동안 고정시킨 다음, 파라핀에 포매시켰다. 상기 파라핀 포매시료를 5 ㎛ 두께의 박편으로 세절한 다음, 시료로부터 파라핀을 제거하고, 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하였다. 상기 염색된 신장조직시료를 현미경하에서 관찰하고, 이들 조직의 신장손상점수(renal damage score)를 부여하였다(도 1d). 이때, 대조군으로는 시스플라틴을 투여하지 않은 마우스의 신장조직을 사용하고, 신장손상점수는 0(손상없음); 1(<10%); 2(10-25%); 3(25-75%); 또는 4(> 75 %)로 표시하였다.

도 1d는 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 1d에서 보듯이, 시스플라틴이 단독으로 투여된 마우스의 신장조직은 조직세포가 붕괴되어 정상조직의 비율이 낮은 수준을 나타내었으나, PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 신장조직은 조직세포가 훨씬 적게 손상됨을 확인하였다.

따라서, PLA2의 전처리는 시스플라틴에 의한 신장조직손상을 감소시킬 수 있는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 1-5: 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2 의 효과

상기 실시예 1-3에서 수득한 PBS와 시스플라틴을 투여한 마우스 및 PLA2와 시스플라틴을 투여한 마우스에서, 시스플라틴을 투여한 후 72시간이 경과된 시점에서, 혈액시료를 각각 수득하고, 상기 수득한 혈액시료를 1시간 동안 실온에서 방치한 다음, 1000 g로 10분동안 원심분리하여 각각의 혈장시료를 수득하였다. 상기 수득한 각 혈장시료를 FUJI DRI-CHEM 3500i instrument(FUJI PHOTO FILM LTD., Tokyo, Japan)에 적용하여, 크레아티닌과 BUN(blood urea nitrogen)의 수준을 측정하였다(도 1e 및 1f). 이때, 대조군으로는 시스플라틴을 투여하지 않은 마우스의 혈액시료를 사용하였다.

도 1e는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 마우스의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1f는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 마우스의 혈액에 포함된 BUN(blood urea nitrogen)의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1e 및 1f에서 보듯이, 시스플라틴이 단독으로 투여된 마우스의 혈액에는 크레아티닌과 BUN이 높은 농도로 포함되어 있으나, PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 혈액에는 크레아티닌과 BUN의 농도가 감소됨을 확인하였다.

따라서, PLA2의 전처리는 시스플라틴에 의한 신장기능장애 수준을 감소시킬 수 있는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 2: Treg 결핍이 PLA2 의 작용에 미치는 효과 분석

상기 실시예 1의 결과로부터 PLA2의 처리에 의하여 Treg의 수준이 증가함을 확인하였으므로, 상기 Treg 결핍이 PLA2의 작용에 미치는 효과를 분석하고자 하였다.

실시예 2-1: Treg 결핍 마우스 모델의 제작

항-마우스 CD25 랫트 IgG1(anti-CD25; clone PC61) 항체를 ATCC로부터 분양받은 하이브리도마 세포에서 생산하고, 상기 생산된 항-마우스 CD25 항체를 매일 0.1 mg의 투여량으로 웅성 Foxp3^GFP 마우스에 투여하여 Treg 결핍 마우스 모델(CD25⁺Foxp3⁺)을 제작하였다.

실시예 2-2: Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 투여된 마우스의 생존율에 미치는 PLA2 의 효과

상기 실시예 2-1에서 제작한 Treg 결핍 마우스 모델을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로, Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 투여된 마우스의 생존율에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 2a).

도 2a는 Treg 결핍 마우스 모델에서 PLA2의 전처리 여부에 따른 마우스의 생존율변화를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, Treg 결핍 마우스 모델에서는 시스플라틴을 단독으로 투여한 마우스와 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스 모두 시스플라틴을 투여하고 약 100시간이 경과된 시점에서 모두 사망함을 확인하였다.

따라서, Treg가 결핍되면, 시스플라틴의 부작용을 감소시키는 PLA2의 효과가 나타나지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2-3: Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2 의 효과

상기 실시예 2-1에서 제작한 Treg 결핍 마우스 모델을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3 및 1-4와 동일한 방법으로, Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 2b).

도 2b는 Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 2b에서 보듯이, Treg 결핍 마우스 모델에서는 시스플라틴을 단독으로 투여한 마우스의 신장조직과 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 신장조직 모두 세포가 붕괴되어 정상조직의 비율이 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

따라서, Treg가 결핍되면, 시스플라틴에 의한 신장조직손상을 감소시키는 PLA2의 효과가 나타나지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2-4: Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2 의 효과

상기 실시예 2-1에서 제작한 Treg 결핍 마우스 모델을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-5와 동일한 방법으로, Treg 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 2c 및 2d).

도 2c는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 Treg 결핍 마우스의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2d는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 Treg 결핍 마우스의 혈액에 포함된 BUN(blood urea nitrogen)의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2c 및 2d에서 보듯이, 시스플라틴이 단독으로 투여된 마우스의 혈액과 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 혈액 모두 크레아티닌과 BUN이 높은 농도로 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 실시예 2-1 내지 2-4의 결과를 종합하면, Treg가 결핍된 마우스에는 PLA2를 처리하여도, 이의 신호전달에 관여하는 매개체로 예상되는 Treg가 존재하지 않아서, 시스플라틴에 의해 발생되는 부작용을 예방하는 효과를 나타내지 못함을 알 수 있었다.

실시예 3: 전염증성 사이토카인에 대한 PLA2 의 효과분석

PLA2의 처리가 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준에 어떠한 효과를 나타내는지를 분석하고자 하였다.

실시예 3-1: 전염증성 사이토카인 수준에 대한 PLA2 의 효과

상기 실시예 1에서 사용된 웅성 Foxp3^GFP 마우스 및 실시예 2에서 사용된 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3의 방법을 사용하여, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여한 마우스를 수득하고, 상기 각 마우스로부터 신장을 적출하였다. 상기 적출된 신장조직을 신장조직을 단백질 추출액(PRO-PREP; Intron biotechnology, Sungnam, Korea)에 넣어 분쇄하고, 얼음에서 30분 동안 냉각시킨 다음, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액을 BCATH Protein Assay Kit(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 적용하여, 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준을 측정하고 비교하였다(도 3a 및 3b).

도 3a는 정상 마우스 및 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여하고, 이로부터 얻어진 신장조직에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α의 수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 정상 마우스 및 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여하고, 이로부터 얻어진 신장조직에서 전염증성 사이토카인인 IL-6의 수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3a 및 3b에서 보듯이, 정상 마우스에 시스플라틴을 단독으로 처리할 경우에는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준이 증가하고, 상기 증가된 TNF-α 및 IL-6의 수준은 PLA2의 투여에 의하여 감소되었으나, Treg 결핍 마우스 모델에서는 PLA2의 처리여부에 상관없이 시스플라틴을 처리할 경우에는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준이 증가함을 확인하였다.

실시예 3-2: 대식구세포 수준에 대한 PLA2 의 효과

시스플라틴이 투여된 후의, 신장내로의 대식구 침습수준을 평가하기 위하여, 파라핀에 포매된 신장에서 대식구세포를 대상으로 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 구체적으로, 슬라이드 글라스에 항-마우스 F4/80 항체(dilution 1:50; Serotec, Oxford, UK)를 처리하고 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 이어, Vectastain ABC Elite Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 및 3,3'-diaminobenzidine substrate-chromogen solution(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 반응시킨 다음, Harris hematoxylin을 사용하여 대조염색하였다. 상기 염색된 시료를 200배 확대된 조건하에, 슬라이드당 5개 영역에서 양성염색된 세포의 수를 계수하여, 각 시료의 F4/80-양성 세포의 수를 산출하였다(도 3c).

도 3c는 정상 마우스 및 Treg 결핍 마우스 모델을 대상으로, 시스플라틴을 단독으로 또는 PLA2와 함께 투여하고, 이로부터 얻어진 신장조직에서 대식구 세포인 F4/80 양성세포의 수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, 정상 마우스에 시스플라틴을 단독으로 처리할 경우에는 대식구 세포의 수준이 증가하고, 상기 증가된 대식구 세포의 수준은 PLA2의 투여에 의하여 감소되었으나, Treg 결핍 마우스 모델에서는 PLA2의 처리여부에 상관없이 시스플라틴을 처리할 경우에는 대식구 세포의 수준이 증가함을 확인하였다.

상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과를 종합하면, 시스플라틴이 처리된 마우스에서는 신장독성에 관여하는 전염증성 사이토카인과 대식구 세포의 수준이 증가하는데, PLA2는 이러한 전염증성 사이토카인과 대식구 세포의 수준증가를 억제하는 효과를 나타내고, 이러한 PLA2의 효과를 나타내기 위하여는 Treg가 필수적임을 알 수 있었다.

실시예 4: PLA2 의 작용경로 분석

세포에서 PLA2가 무엇을 통해 시스플라틴의 부작용을 억제하는 활성을 나타내는지를 분석하고자 하였다.

실시예 4-1: PLA2 와 CD206 의 결합활성 분석

4℃의 회전반응기를 사용하여, 바이오틴이 결합된 PLA2 50㎍ 또는 PLA2 50㎍과 바이오틴이 결합된 PLA2 50㎍의 혼합물을 스트렙타비딘이 코팅된 Dynabead 20 ㎕에 고정시켰다. 대량의 PBST(0.1%)를 사용하여 결합되지 않은 PLA2를 제거하고, 5% BSA를 포함하는 PBST를 Dynabead에 가하고, 실온에서 1시간 동안 처리하여 블로킹하였다. 0.1, 0.5, 1 또는 1.5㎍의 재조합 인간 CD206와 1% BSA를 포함하는 PBST 450 ㎕를 고정된 PLA2에 가하고, 실온에서 60분 동안 반응시켰다. Dynabead에 고정된 PLA2를 1 ㎖ PBST에 가하고, 자석위에서 3회 세척하였다. 결합된 중합체를 SDS-PAGE 분석에 적용하고, mini-trans-blot electrophoretic transfer cell(Bio-Rad) 내에서, SDS-PAGE 분석을 통해 얻어진 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이시켰다. 상기 멤브레인을 5% 탈지분유를 포함하는 PBS에 가하고 4℃에서 하룻밤동안 반응시켜서 블로킹하였다. 상기 멤브레인에 항-만노스 수용체 항체를 가하고 4℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음, TBST(0.1%)로 세척하고, 항-마우스 IgG 이차항체를 가하여 1시간 동안 반응시켰다. ECL reagents (Amersham Pharmacia Biotech)를 가하여 X-선 필름을 사용하여 밴드를 검출하였다(도 4a).

도 4a는 재조합 인간 CD206의 처리농도 증가에 따른, Dynabead에 결합된 PLA2와 CD206의 복합체의 수준변화를 나타내는 면역블럿 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 재조합 인간 CD206의 처리농도가 증가할 수록 Dynabead에 결합된 PLA2와 CD206의 복합체의 수준이 증가함을 확인하였다.

실시예 4-2: PLA2 와 CD206 의 결합활성에 대한 만노스의 효과

상기 Dynabead에 결합된 PLA2와 재조합 인간 CD206(0.1 또는 1㎍)의 결합시에, 순수 PLA2 또는 만노스-BSA를 가하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, 상기 재조합 인간 CD206와의 결합에 대하여 상기 PLA2와 경쟁분석을 수행하였다(도 4b).

도 4b는 재조합 인간 CD206에 대한 Dynabead에 결합된 PLA2의 결합활성에 있어서, 순수 PLA2 또는 만노스-BSA의 경쟁효과를 나타내는 면역블럿 사진이다. 도 4b에서 보듯이, 순수 PLA2 또는 만노스-BSA가 처리되지 않은 경우에는, 재조합 인간 CD206의 처리양이 증가함에 따라, Dynabead에 결합된 PLA2와 CD206의 복합체의 수준이 증가하였으나, 순수 PLA2 또는 만노스-BSA가 함께 처리되면, 상기 복합체의 수준이 감소함을 확인하였다.

상기 결과로부터, PLA2는 만노스의 수용체인 CD206에 결합할 수 있으며, 상기 CD206에 만노스와 PLA2가 경쟁적으로 결합활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4-3: 수지상 세포에서 PLA2 와 CD206 의 결합활성 분석

상기 실시예 4-2의 결과로부터 PLA2는 만노스의 수용체인 CD206에 결합함을 확인하였으므로, 수지상 세포에서 상기 PLA2와 CD206의 결합여부를 확인하고자 하였다.

먼저, 얼음온도의 RPMI 1640에서 경골(tibiae)과 대퇴골(femurs)로부터 골수를 짜내고 70㎛ 크기의 세포분리기를 사용하여 분해시켜서, 골수세포를 수득하였다. 상기 골수세포를 0.85% NH₄를 포함하는 Tris-HCl 완충액에 가하여 오염된 적혈구를 용혈시켜서 제거하였다.

이어, 10% FBS(fetal bovine serum), 20 ng/㎖ GM-CSF, 50 IU/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에 골수세포를 현탁시키고, 6웰 플레이트에 1 × 10⁶세포수/㎖의 밀도로 접종하고 배양하였으며, GM-CSF를 포함하는 배양액을 사용하여 4일마다 배지를 교체하였다. 배양 후 7일이 경과된 시점에서, 부유세포를 수집하고, 자성분리비드(CD11c+ cell isolation kit; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 정제함으로써, 미성숙 수지상 세포집단을 수득하였다.

상기 미성숙 수지상 세포집단에 PLA2를 처리하고, 수지상 세포 마커인 CD11c를 검출할 수 있는 항-CD11c 항체, CD206을 검출할 수 있는 항-CD206 항체 및 PLA2를 검출할 수 있는 항-PLA2 항체를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다(도 4c).

도 4c는 수지상 세포에서 PLA2와 CD206의 위치를 면역형광염색 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4c에서 보듯이, PLA2와 CD206의 세포내 위치가 서로 일치함을 확인하였다.

따라서, 세포내에서 PLA2는 만노스의 수용체인 CD206에 결합하여, 시스플라틴의 부작용 발생을 예방하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

상기 실시예 4-1 내지 4-3의 결과를 종합하면, 시스플라틴의 처리에 의하여 유발된 부작용을 억제하는 PLA2의 효과를 나타내기 위하여는, 상기 PLA2가 목적하는 세포의 표면에서 만노스의 수용체인 CD206에 결합하는 과정이 필수적으로 수행되어야 함을 알 수 있었다.

실시예 5: CD206 결핍 마우스 모델에서 PLA2 의 효과분석

상기 실시예 4의 결과로부터, 세포내에서 PLA2는 만노스의 수용체인 CD206에 결합하여, 시스플라틴의 부작용 발생을 예방하는 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 CD206이 결핍된 상태에서 PLA2가 어떠한 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다.

실시예 5-1: CD206 결핍 마우스 모델에서 Treg 세포의 수준 분석

CD206^-/- 마우스(B6.129P2-Mrc1tm1Mnz/J)를 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 입수하고, 상기 웅성 Foxp3^GFP 마우스 또는 CD206^-/- 마우스를 대상으로 사용하고, 0, 0.01, 0.1 및 1 ㎍/㎖의 PLA2를 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법을 수행하여, CD4⁺ T 세포 중에서 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수의 변화를 비교하였다(도 5a).

도 5a는 정상 마우스와 CD206^-/- 마우스에서 PLA2의 처리농도에 따른 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, 정상 마우스에서는 PLA2의 처리농도가 증가할 수록 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수가 증가하였으나, CD206^-/- 마우스에서는 PLA2의 처리농도에 상관없이 CD25⁺Foxp3⁺ T 세포(Treg) 수가 변화되지 않음을 확인하였다.

실시예 5-2: CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2 의 효과

웅성 Foxp3^GFP 마우스 또는 CD206^-/- 마우스를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3 및 1-4와 동일한 방법으로, CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 5b).

도 5b는 CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 5b에서 보듯이, CD206 결핍 마우스 모델에서에서는 시스플라틴을 단독으로 투여한 마우스의 신장조직과 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 신장조직 모두 세포가 붕괴되어 정상조직의 비율이 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 5-3: CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2 의 효과

CD206^-/- 마우스를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-5와 동일한 방법으로, CD206 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 5c 및 5d).

도 5c는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 CD206 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5d는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 CD206 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 BUN(blood urea nitrogen)의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5c 및 5d에서 보듯이, CD206^-/- 마우스에서는 시스플라틴이 단독으로 투여된 마우스의 혈액과 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 혈액 모두 크레아티닌과 BUN이 높은 농도로 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 실시예 5-1 내지 5-3의 결과를 종합하면, CD206가 결핍된 마우스에는 PLA2를 처리하여도, 이의 수용체가 존재하지 않아서, 시스플라틴에 의해 발생되는 부작용을 예방하는 효과를 나타내지 못함을 알 수 있었다.

실시예 6: IL -10 결핍 마우스에서 PLA2 의 효과분석

실시예 6-1: PLA2 의 투여량에 따른 IL -10의 분비수준 변화분석

웅성 Foxp3^GFP 마우스로부터 수득한 비장세포에 0, 1 및 10 ㎍/㎖의 PLA2를 3일동안 처리하고 배양한 다음, 배양액을 수득하고, 이에 포함된 IL-10의 수준을 측정하였다(도 6a).

도 6a는 PLA2의 처리농도에 따른 비장세포에서 분비된 IL-10의 수준변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6a에서 보듯이, PLA2를 처리할 경우, 비장세포에서 분비된 IL-10의 수준이 증가함을 확인하였다.

따라서, PLA2의 효과에 IL-10가 어떠한 영향을 나타낼 것으로 예상되었다.

실시예 6-2: IL -10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2 의 효과

대조군인 웅성 C57BL/6 마우스 또는 실험군인 IL-10^-/- 마우스(BXSB.129P2(B6)-Il10tm1Cgn/DcrJ; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3 및 1-4와 동일한 방법으로, IL-10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장조직손상에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 6b).

도 6b는 IL-10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 신장손상에 대한 PLA2의 효과를 나타내는 사진이다. 도 6b에서 보듯이, IL-10 결핍 마우스 모델에서는 시스플라틴을 단독으로 투여한 마우스의 신장조직과 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 신장조직 모두 세포가 붕괴되어 정상조직의 비율이 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 6-3: IL -10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2 의 효과

IL-10^-/- 마우스를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-5와 동일한 방법으로, IL-10 결핍 마우스 모델에서 시스플라틴의 처리에 의한 신장기능장애에 미치는 PLA2의 효과를 평가하였다(도 6c 및 6d).

도 6c는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 IL-10 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 크레아티닌의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 시스플라틴 또는 시스플라틴과 PLA2가 처리된 IL-10 결핍 마우스 모델의 혈액에 포함된 BUN(blood urea nitrogen)의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6c 및 6d에서 보듯이, IL-10^-/- 마우스에서는 시스플라틴이 단독으로 투여된 마우스의 혈액과 PLA2를 전처리하고 시스플라틴을 투여한 마우스의 혈액 모두 크레아티닌과 BUN이 높은 농도로 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 실시예 6-2 내지 6-3의 결과를 종합하면, IL-10가 결핍된 마우스에는 PLA2를 처리하여도, 시스플라틴에 의해 발생되는 부작용을 예방하는 효과를 나타내지 못함을 알 수 있었다.

실시예 7: 종양모델에서 시스플라틴의 항암활성에 미치는 PLA2 의 효과분석

KCLB(Seoul, Korea)에서 마우스의 EL4 림프종 세포를 입수하고, 10 % FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 접종한 다음, 37℃ 및 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다.

또한, C57BL/6 마우스를 3개의 그룹(그룹 I, PBS; 그룹 II, PBS + 시스플라틴; 그룹 III, PLA2 + 시스플라틴)으로 설정하고, 상기 배양된 EL4 림프종 세포(2 × 10⁶ cells in 0.1 ㎖)를 동일부피의 마트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)과 함께 모든 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다.

PLA2(0.2 mg/kg) 또는 PBS는 5일이 경과된 시점에서 한번 공급하였고, 시스플라틴은 그룹 II 및 그룹 III에 5 mg/kg의 투여량으로 11일, 14일 및 17일이 경과된 시점에서 3회 복강투여하였다. 이때, 대조군은 동일부피의 PBS를 투여하였다.

20일이 경과된 시점에서 모든 마우스를 희생시키고, 종양을 적출한 다음, 3개 그룹별로 비교하였다(도 7a).

도 7a는 그룹 I(대조군), 그룹 II(시스플라틴 단독) 및 그룹 III(PLA2 + 시스플라틴)에서 적출된 종양을 비교한 사진이다. 도 7a에서 보듯이, PLA2의 투여여부에 상관없이 시스플라틴이 처리된 마우스에서 항암활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 상기 각 그룹별 종양의 크기를 3일마다 총 6회 측정하고, 측정된 결과를 비교하였다(도 7b).

도 7b는 그룹 I(대조군), 그룹 II(시스플라틴 단독) 및 그룹 III(PLA2 + 시스플라틴)에서 마우스 사육시간의 경과에 따른 종양의 크기변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7b에서 보듯이, PLA2의 투여여부에 상관없이 6일이 경과된 시점에서 시스플라틴이 처리된 마우스의 종양크기가 감소됨을 확인하였다.

끝으로, 상기 20일후 적출된 종양의 중량을 비교하였다(도 7c).

도 7c는 그룹 I(대조군), 그룹 II(시스플라틴 단독) 및 그룹 III(PLA2 + 시스플라틴)에서 적출된 종양의 중량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7c에서 보듯이, 대조군에 비하여, 시스플라틴이 단독으로 처리된 그룹 II에서는 종양의 중량이 감소하였고, 시스플라틴과 PLA2가 병용처리된 그룹 III에서는 종양의 중량이 그룹 II 보다도 더욱 감소됨을 확인하였다.

상기 도 7a 내지 7c의 결과로부터, PLA2는 시스플라틴의 항암활성을 저해하지 않고, 오히려 상기 시스플라틴의 항암활성을 향상시킬 가능성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 8: 옥살리플라틴의 부작용에 대한 PLA2 의 효과

상기 실시예 1 내지 7의 결과를 통해, PLA2가 시스플라틴의 항암활성에 영향을 미치지 않으면서도, 그의 부작용을 감소시킬 수 있음을 확인하였으므로, 플라틴계에 속하는 다른 항암제에 대하여도 그의 부작용이 PLA2를 사용하여 억제될 수 있는지를 확인하고자 하였다.

실시예 8-1: 옥살리플라틴의 투여에 의하여 유발되는 신경병증성 통증 마우스 모델의 제작

6-8주령 C57BL/6 수컷 마우스에 5% 글루코스 용액으로 희석한 옥살리플라틴을 6mg/kg 농도로 복강내 주사하여, 신경병증성 통증 마우스 모델을 제작하였다.

실시예 8-2: 옥살리플라틴의 투여에 의하여 유발되는 냉이질통( cold allodynia)에 대한 PLA2 의 효과분석

상기 실시예 8-1에서 제작된 신경병증성 통증 마우스 모델에 옥살리플라틴을 주사한 날 부터 5일동안 PBS에 희석한 PLA2 0.2mg/kg를 매일 복강투여하고, 냉이질통의 행동학적 평가를 수행하였다. 구체적으로, 마우스를 철망 바닥(mesh floor) 위, 투명 플라스틱 박스 안에 넣고, 30분간 적응시킨 후 주사기를 이용하여 아세톤(acetone) 한 방울을 뒷발바닥에 점적한 다음, 유발된 냉이질통으로 인하여 마우스가 발바닥을 ?거나(licking) 발바닥을 강하게 흔드는(shaking) 횟수(frequency)를 30초간 계수하고, 이를 3회 반복하여 평균값을 측정하였다(도 8a). 이때, 음성대조군으로는 옥살리플라틴 대신에 PBS로 희석된 5% 글루코스 용액을 투여한 마우스를 사용하고, 양성대조군으로는 신경병증성 통증 마우스 모델에 PLA2 대신에 동일부피의 PBS를 투여한 마우스를 사용하였다.

도 8a는 옥살리플라틴을 처리하여 제작한 신경병증성 통증 마우스 모델에서 발생하는 냉이질통에 대한 PLA2의 효과를 7일 동안 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8a에서 보듯이, 신경병증성 통증 마우스 모델은 음성대조군에 대하여 유의하게 증가된 냉이질통의 발병수준을 나타내었으나, PLA2가 투여된 마우스는 상기 발병된 냉이질통의 발병수준이 저하됨을 확인하였다.

실시예 8-3: 옥살리플라틴의 투여에 의하여 유발되는 기계적 이질통( mechanical allodynia )에 대한 PLA2 의 효과분석

상기 실시예 8-1에서 제작된 신경병증성 통증 마우스 모델에 옥살리플라틴을 주사한 날 부터 5일동안 PBS에 희석한 PLA2 0.2mg/kg를 매일 복강투여하고, 기계적 이질통의 행동학적 평가를 수행하였다. 구체적으로, 마우스를 철망 바닥(mesh floor) 위, 투명 플라스틱 박스 안에 넣고, 30분간 적응시킨 후 0.6g vending force를 갖는 von Frey hair를 뒷발바닥에 3초 간격으로 10번 자극한 다음, 유발된 기계적 이질통으로 인하여 발바닥을 회피하는 반응(withdrawal response)의 횟수를 카운트하여 10회를 100%로 했을 때 몇 %의 반응값을 가지는지 산출하였다(도 8b). 이때, 음성대조군으로는 옥살리플라틴 대신에 PBS로 희석된 5% 글루코스 용액을 투여한 마우스를 사용하고, 양성대조군으로는 신경병증성 통증 마우스 모델에 PLA2 대신에 동일부피의 PBS를 투여한 마우스를 사용하였다.

도 8b는 옥살리플라틴을 처리하여 제작한 신경병증성 통증 마우스 모델에서 발생하는 기계적 이질통에 대한 PLA2의 효과를 7일 동안 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8b에서 보듯이, 신경병증성 통증 마우스 모델은 음성대조군에 대하여 유의하게 증가된 기계적 이질통의 발병수준을 나타내었으나, PLA2가 투여된 마우스는 상기 발병된 기계적 이질통의 발병수준이 저하됨을 확인하였다.

상기 도 8a 및 8b의 결과를 종합하면, PLA2는 플라틴계에 속하는 다른 항암제인 옥살리플라틴의 투여에 의해 발생되는 신경병증성 부작용인 냉이질통 및 기계적 이질통의 발생을 억제시킬 수 있으므로, 다른 플라틴계 항암제의 투여로 인하여 유발되는 다양한 부작용을 억제하는데 사용될 수 있을 것으로 분석되었다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Pharmaceutical composition for treating cancer reducing side effect <130> KPA140229-KR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant Apis mellifera PLA2 1-167 <400> 1 Met Gln Val Val Leu Gly Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Thr Ser 1 5 10 15 His Gly Trp Gln Ile Arg Asp Arg Ile Gly Asp Asn Glu Leu Glu Glu 20 25 30 Arg Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser 35 40 45 Ser Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys 50 55 60 Arg Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys 65 70 75 80 His Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys 85 90 95 Asp Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser 100 105 110 Ser Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys 115 120 125 Tyr Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly 130 135 140 Arg Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln 145 150 155 160 Trp Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 165 <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant Apis mellifera PLA2 34-167 <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg 20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr 85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg 100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp 115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 130 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant Apis mellifera PLA2 1-33 <400> 3 Met Gln Val Val Leu Gly Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Thr Ser 1 5 10 15 His Gly Trp Gln Ile Arg Asp Arg Ile Gly Asp Asn Glu Leu Glu Glu 20 25 30 Arg

Claims (15)

1. 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는, 암치료 보조용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 인지질분해효소2는 봉독으로부터 유래된 것인 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 인지질분해효소2는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 인지질분해효소2는 항암제의 투여로 인하여 발생되는 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 것인 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 항암제는 플라틴계 항암제인 것인 약학 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 플라틴계 항암제는 시스플라틴(cisplatin) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)인 것인 약학 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 부작용은 개체의 사망, 위장관 독성, 신장독성, 신경병증, 심혈관성 부작용, 이독성 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 부작용인 것인 약학 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 신장독성은 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 증상을 나타내는 것인 약학 조성물.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 신경병증은 냉이질통 또는 기계적 이질통인 것인 약학 조성물.
   
10. 항암제 및 인지질분해효소2(phospholipase 2, PLA2)를 포함하는, 안전성이 증가된 암치료용 약학 조성물.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 항암제는 플라틴계 항암제인 것인 약학 조성물.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 플라틴계 항암제는 시스플라틴(cisplatin) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)인 것인 약학 조성물.
    
13. 인지질분해효소(phospholipase 2, PLA2)를 유효성분으로 포함하는, 신장독성 또는 신경병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
14. 제13항에 있어서,
    상기 신장독성은 신장조직 손상, 신장기능장애, 전염증성 사이토카인 증가, 대식구 세포증가 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 증상을 나타내는 것인 약학 조성물.
    
15. 제13항에 있어서,
    상기 신경병증은 냉이질통 또는 기계적 이질통인 것인 약학 조성물.
    

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