KR20150124615A - 내서성 양배추 품종의 선별을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 7 및 9의 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 내서성 양배추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.

Description

내서성 양배추 품종의 선별을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primer for selecting heat-tolerant Brassica oleracea cultivar and uses thereof}

본 발명은 내서성 양배추 품종의 선별을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 7 및 9로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종 선별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 내서성 양배추 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.

천연 및 농업 조건 하에서, 식물은 끊임없이 스트레스를 견뎌내야 한다. 어떤 환경 인자(예를 들면 고온 또는 저온)는 매우 단시간 내에 많은 스트레스를 줄 수 있고, 또 다른 스트레스(예를 들면, 토양수 함유량 또는 미네랄 영양분)는 식물에 스트레스를 주는데 장시간이 소요될 수 있다. 일반적으로, 식물에 영향을 주는 환경 스트레스는 기후 관련 스트레스, 공기오염 스트레스, 화학적 스트레스 및 영양적 스트레스의 형태가 있을 수 있다.

기후 관련 스트레스의 예로는 가뭄, 홍수, 서리, 저온, 고온, 과도한 빛 및 불충분한 빛을 들 수 있다. 공기오염 스트레스는 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화황, NOx, 탄화수소, 오존, 자외선 및 산성비의 형태일 수 있다. 화학적 스트레스는 살충제, 살균제, 제초제 및 중금속의 살포로부터 초래될 수 있다. 영양적 스트레스는 비료, 미량 영양소(micronutrient) 및 다량 영양소(macromutrient)에 의하여 초래될 수 있다.

정상적으로 성장하기에는 너무 낮고 얼 정도까지는 낮지 않은 온도에서 감수성 종들은 냉해(冷害)를 입는다. 이러한 손상은 통상적으로 열대지방 또는 아열대지방 기원의 종들에게서 발생한다. 냉각되는 경우, 잎에서 탈색 현상 또는 병반 현상이 나타나게 되고, 이는 이들 잎에 수침지(water-soaked) 외관을 부여한다. 뿌리가 냉각되면, 식물이 시들 수 있다. 반면, 동결 온도 및 이에 수반되는 식물체 내에서의 얼음 결정의 형성은 얼음 결정이 원형질체로 확장되거나 장시간 동안 유지되는 경우 치명적일 수 있다.

스트레스는 또한 그 이외의 과도한 온도에 의해서도 초래될 수 있으며, 거의 모든 식물은 고온에서 생존할 수 없다. 고등 식물의 세포 또는 조직이 탈수되거나 성장하지 않은 경우, 이들 세포는 수화 세포, 영양 세포 및 성장 중의 세포들보다는 고온에서 잘 생존할 수 있다. 활발하게 성장하고 있는 조직은 45℃를 넘는 온도에서는 거의 생존이 불가능하다.

한편, 양배추는 십자화과에 속하는 식물로 잎부분을 채취하여 식용으로 사용하고 있으며, 열량이 적고 비타민 C와 칼륨, 칼슘 등의 무기질 및 식이섬유가 풍부한 식재료로, 특히 서양에서는 요구르트, 올리브와 함께 3대 장수식품이라 일컬어지고 있다. 양배추에는 다량의 유황과 염소 및 비타민 U, 비타민 K가 포함되어 위장의 점막을 강화시키고 궤양을 완화할 뿐 아니라 위암을 예방하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 위의 건강을 위하여 꾸준히 섭취하는 것이 권장되고 있다.

이러한 이유로 양배추는 전세계적으로 가장 많이 재배되고 있는 채소 작물 중 하나이지만 근래에는 세계적인 기상이상(한파, 일조시간 부족, 저온, 고온 및 잦은 강우) 및 환경의 변화로 인해 양배추 재배의 피해가 심각해졌다. 이러한 수확 감소 요인은 앞으로 더욱 발생할 확률이 높기 때문에 이에 대한 대책으로 스트레스(고온) 저항성 품종의 안정적인 확보가 시급해졌다.

한국공개특허 제2014-0043591호에서는 감자 유래 고온 스트레스 저항성 유전자 및 이를 이용하여 제조한 고온 스트레스 저항성 형질전환체가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0028277호에서는 고온 스트레스 내성을 증가시키는 고구마 IbOrange 유전자 및 이의 용도가 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 내서성 양배추 품종의 선별을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관해 기재된 바는 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 양배추 식물체에 고온 스트레스를 처리한 후 표현형 관찰을 통해 내서성 품종과 고온 민감성 품종을 구분하였으며, 고온(42℃) 스트레스 처리 후 내서성 양배추와 고온 민감성 양배추의 여러 가지 유전자 발현을 분석한 결과 내서성 양배추 품종에서 특이적으로 발현이 증가한 유전자 마커 BoHSP70를 발굴하였다. 상기 유전자 마커는 양배추의 heat shock protein 70 (BoHsp70) 유전자로 고온 스트레스 처리시 내서성 품종에서 고온 민감성 품종에 비해 유전자 발현이 4배 정도 증가함을 확인하였다. 또한 게놈 DNA 상에서 해당 유전자 마커의 프로모터 부분의 염기서열 분석을 수행한 결과, 내서성 품종과 고온 민감성 품종의 염기서열 차이를 확인하였다. 내서성/고온 민감성 품종에서 차이를 나타내는 염기서열을 바탕으로 내서성 양배추 품종 구별용 프라이머를 제작하였으며, 6개 양배추 품종을 대상으로 프라이머의 활용성을 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종 선별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 내서성 양배추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 양배추 내서성/고온 민감성 품종의 실험실 내 조건에서 고온 스트레스 처리에 의한 표현형 분석 방법을 확립하였다. 또한, 6개 양배추 품종에 대해 내서성/고온 민감성 품종의 고온 스트레스 관련 유전자 발현을 비교 분석을 통해 마커 유전자로서 BoHsp70을 선정하였으며 해당 유전자의 프로모터 염기서열 분석을 통해 게놈 DNA 상에서 내서성/고온 민감성 품종을 구별할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 따라서 본 발명을 통해서 간단한 게놈 DNA PCR법을 통해서 양배추의 내서성 관련 형질을 양배추 육종 현장에서 어린 시기에 구별할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 양배추 내서성 품종 및 고온 민감성 품종의 고온 스트레스 후 표현형을 관찰한 도면이다. 어린 유식물 상태에서 총 6개 양배추 품종의 고온 스트레스 처리(42℃, 5시간) 후 표현형 사진. NS; Non stress, 스트레스를 처리하지 않은 정상 조건(24℃)에서 자란 식물체, HS; Heat stress, 고온 스트레스 처리 후 식물체.
도 2는 내서성 품종과 고온 민감성 품종에서 BoHsp70 유전자 발현을 나타내는 결과이다. 정상 조건에서 2주 간 자란 후, 고온 스트레스를 처리(42℃, 5시간)한 식물체와 고온 스트레스를 처리하지 않은 식물체로부터 RNA를 추출하여 qPCR로 BoHsp70 유전자의 발현을 나타낸 그래프이다. 유전자 발현 값은 BoActin1 유전자 발현 값으로 정량화하였다.
도 3은 총 6개 양배추 품종의 BoHsp70 유전자 프로모터 부위의 염기서열을 분석(sequence alignment)한 결과이다. A) 양배추 게놈 DNA 상에서 BoHsp70 유전자 프로모터 부위의 간단한 도식. UP_1kb; BoHsp70 유전자 cds (coding sequence) 시작 부위의 상위 1kb. B) BoHsp70 유전자 프로모터 부위 염기서열 정렬 결과 및 내서성 품종과 고온 민감성 품종에서 차이를 보이는 염기서열의 위치를 보여주는 그림이다. Forward3; 내서성 품종 특이적 정방향 프라이머3, Forwad4; 고온 민감성 품종 특이적 정방향 프라이머4, Reverse1; 내서성/고온 민감성 특이적 역방향 프라이머.
도 4는 내서성 품종 HO와 고온 민감성 품종 EB의 BoHsp70 유전자 프로모터 부의 염기 서열을 나타낸다.
도 5는 양배추 내서성/고온 민감성 특이적 프라이머를 이용한 PCR 결과이다. 내서성 품종 HO, RK 및 401과 고온 민감성 품종 EB, JK 및 NB에서 게놈 DNA를 추출하여 내서성 품종 특이적 정방향 프라이머(Bo01g139130(pro)-F3_서열번호 7)와 역방향 프라이머(Bo01g139130(pro)-R_서열번호 9)로 PCR 수행한 결과(상단 겔 사진) 및 고온 민감성 품종 특이적 정방향 프라이머(Bo01g139130(pro)-F4_서열번호 8)와 역방향 프라이머(Bo01g139130(pro)-R_서열번호 9)로 PCR 수행한 결과(하단 겔 사진)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 7의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 9의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 더욱 바람직하게는 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명은 내서성 양배추 품종을 선별하기 위해, 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있고, 특히, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프리아머를 추가로 이용할 경우, 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 내서성 양배추 품종을 특이적으로 선별할 수 있고, 서열번호 8 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 고온 민감성 양배추 품종을 특이적으로 선별할 수 있어 이들 3개 프라이머를 동시에 이용할 경우 내서성 양배추 품종을 비교적 쉽고 정확하게 선별할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 농도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 완충용액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, 중합효소연쇄반응이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 중합효소연쇄반응 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 중합효소연쇄반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 중합효소연쇄반응 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 중합효소연쇄반응 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 중합효소연쇄반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 중합효소연쇄반응 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 중합효소연쇄반응 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 양배추 내서성/고온 민감성 품종의 고온 스트레스 표현형 확인

양배추 내서성 품종 HO, RK 및 401과 고온 민감성 품종 EB, JK 및 NB는 모두 아시아 종묘로부터 실험용 종자로 분양받아 사용하였다(표 1). 아시아 종묘로부터 분류된 내서성 표현형을 실험실 조건에서 확인하기 위하여 1주된 유식물체와 2주된 식물체를 대상으로 고온 스트레스를 처리하여 표현형을 관찰하였다. 70% 에탄올과 10% RAX를 사용하여 양배추 종자를 소독한 후, 1/2MS 아가(1/2MS, 1% 수크로스, 0.5% 피토 아가) 배지에서 파종하여 배양실 조건 (23℃, 16h 명/8h 암)에서 1주일간 키웠다. 고온 스트레스는 42℃ 생장 챔버(growth chamber)에서 5시간 처리하였으며, 스트레스 처리 후 4일 뒤 표현형을 관찰하였다. 내서성 품종인 HO, RK 및 401 식물체는 고온 스트레스 처리 후, 식물체의 떡잎(cotyledon)이 스트레스를 처리하지 않은 정상조건에 비해 크기가 줄어들었지만 잎의 형태는 정상 조건과 유사하게 회복된 반면, 고온 민감성 품종인 EB, JK 및 NB 식물체는 고온 스트레스에 의해 떡잎이 마르고 백화현상이 나타나며 정상적으로 회복하지 못하는 표현형을 나타내었다(도 1).

품종 명칭	분류
HO	내서성
RK	내서성
401	내서성
EB	고온 민감성
JK	고온 민감성
NB	고온 민감성

실시예 2. 양배추 내서성/고온 민감성 품종의 마커 유전자 ( BoHsp70 ) 발굴

총 6개의 양배추 품종에 대하여 고온 스트레스 처리시 내서성 품종과 고온 민감성 품종에서 유전자 발현에 차이가 나는 마커 유전자를 선별하고자 고온 스트레스에 관련된 여러 유전자를 qRT-PCR로 분석하였다. 2주간 배양실 조건에서 키운 6 품종의 양배추를 정상조건(NS)과 고온 스트레스 처리 조건(HS, 42℃, 5시간)에서 식물체의 잎을 채취하여 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하고 이를 qRT-PCR의 주형으로 사용하였다. 고온 스트레스 관련 여러 유전자의 발현을 확인하였으며, 그 중 BoHsp70 유전자의 발현을 보기 위해 BoHsp70(Bo01g139130) 유전자 특이적 프라이머 정방향 (BoHsp70-F, 5'-GGG AAG GCT GTC GAA GGA AGA G-3'_서열번호 2)과 역방향 (BoHsp70-R, 5'-GCC ACC AGC TCC ACC CAT ATC-3'_서열번호 3)을 사용하였다(표 2). BoActin1 유전자의 프라이머 정방향 (5'-CGA GGG TTT CTC TCT TCC ACA C-3'_서열번호 4)과 역방향 (5'-CTG CTT GGT GCA AGT GCT GTG-3'_서열번호 5)을 사용하여 qRT-PCR의 정량화를 하였다. 고온 스트레스 조건에서 내서성 품종과 고온 민감성 품종의 BoHsp70 유전자 발현을 비교 분석해 본 결과, 고온 민감성 품종인 EB, JK 및 NB에서는 상대적인 발현값이 0.5-1.0 사이인 반면 내서성 품종인 HO, RK 및 401은 3.0-4.5 사이로 고온 민감성 품종에 비해 약 4 배 정도 발현 값이 증가한 것을 확인하였다(도 2). 내서성 양배추인 3개의 품종과 고온 민감성인 3개 품종에서 공통적으로 이러한 차이를 나타냄을 근거로 하여 양배추의 내서성 관련 마커 유전자로서 BoHsp70(Bo01g139130) 유전자(서열번호 1)를 선정하였다.

프라이머 명칭	프라이머 서열(5’- 3’)(서열번호)
BoHsp70-F	GGGAAGGCTGTCGAAGGAAGAG(2)
BoHsp70-R	GCCACCAGCTCCACCCATATC(3)
Bo01g139130(pro)-F2	AGGGTGCCTCACACATTCACTGATC(6)
Bo01g139130(pro)-F3	CCTCAGTTATTTTACGTGGTTTTACG(7)
Bo01g139130(pro)-F4	TCGTTACTATGTACGGTAAAAATC(8)
Bo01g139130(pro)-R	TCGCTAACCGCGTCTAAACCG(9)

실시예 3. 내서성/고온 민감성 품종의 마커 유전자 프로모터 염기서열 분석

고온 스트레스 조건에서 내서성/고온 민감성 품종에 따라 BoHsp70 유전자의 발현 정도가 차이 나는 원인을 조사하기 위하여 BoHsp70 유전자의 프로모터 부위의 염기서열을 분석하였다. 내서성 품종인 HO, RK 및 401과 고온 민감성 품종인 EB, JK 및 NB를 대상으로 식물체를 2주 키운 뒤 식물체의 본 잎에서 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA는 식물체 잎을 액체 질소를 이용하여 파쇄한 뒤, 식물체 게놈 DNA 추출 버퍼(50mM Tris-Cl pH8.0, 100mM NaCl, 50mM EDTA, 0.5% SDS)와 페놀 추출 방법을 통해 추출하였다. 양배추 총 게놈 시퀀싱 결과를 바탕으로 BoHsp70 유전자 프로모터 염기서열 (상위 600-100bp)을 확인할 수 있는 정방향 프라이머 (Bo01g139130(pro)-F2, 5'-AGG GTG CCT CAC ACA TTC ACT GAT C-3'_서열번호 6)와 역방향 프라이머 (Bo01g139130(pro)-R, 5'-TCG CTA ACC GCG TCT AAA CCG-3'_서열번호 9)를 사용해 PCR 후, PCR 생성물의 염기서열을 분석하였다(도 4). 6개 품종에 대한 염기서열 분석 결과를 클러스터 W2 프로그램을 사용하여 정렬(mutiple sequence alignment)한 결과, 내서성 품종인 HO, RK 및 401의 서열은 모두 일치하였으며 민감성 품종인 EB, JK 및 NB는 내서성 품종의 서열과 부분적으로 다른 염기서열을 공통적으로 가지고 있는 것을 확인하였다(도 3). 위의 결과를 통해 내서성/고온 민감성 품종에서 나타나는 프로모터 염기서열 차이가 BoHsp70 유전자 발현에 영향을 주었을 것이라 추측해 볼 수 있었다. 또한 게놈 DNA 상에서 내서성/고온 민감성 품종을 선별할 수 있도록 하기 위해 내서성 품종과 고온 민감성 품종의 프로모터 염기서열 분석에서 상대적으로 많은 염기서열이 차이를 보이는 위치를 선정하여 마커 유전자에 대한 프라이머를 제작하였다.

실시예 4. 마커 유전자의 프라이머를 이용한 내서성/고온 민감성 품종 구별

마커 유전자(BoHsp70)의 프로모터 염기서열을 바탕으로 제작한 프라이머의 활용성을 검증하기 위하여 총 6개 품종을 대상으로 PCR을 수행하였다. 내서성 품종인 HO, RK 및 401과 고온 민감성 품종인 EB, JK 및 NB로부터 게놈 DNA를 추출하여 내서성 품종 특이적 정방향 프라이머 (Bo01g139130(pro)-F3, 5'-CCT CAG TTA TTT TAC GTG GTT TTA CG-3'_서열번호 7)와 역방향 프라이머 (Bo01g139130(pro)-R, 5'-TCG CTA ACC GCG TCT AAA CCG-3'_서열번호 9)로 PCR 수행한 결과, 내서성 품종인 HO, RK 및 401 품종에서만 PCR 밴드가 확인되었으며 고온 민감성 품종에서는 PCR 밴드가 확인되지 않았다. 또한 고온 민감성 품종 특이적 정방향 프라이머 (Bo01g139130(pro)-F4, 5'-TCG TTA CTA TGT ACG GTA AAA ATC-3'_서열번호 8)와 역방향 프라이머 (Bo01g139130(pro)-R, 5'-TCG CTA ACC GCG TCT AAA CCG-3'_서열번호 9)로 PCR 수행한 결과, 고온 민감성 품종인 EB, JK 및 NB에서 PCR 밴드가 확인되는 반면, 내서성 품종에서는 PCR 밴드가 확인되지 않았다(도 5). 이를 통해서 마커 유전자(BoHsp70)의 프로모터 염기서열을 바탕으로 제작한 프라이머를 양배추 내서성/고온 민감성 품종 구별에 사용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Specific primer for selecting heat-tolerant Brassica oleracea cultivar and uses thereof <130> PN14113 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2504 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 1 atggcgagta aaggcgaagg tccagcgatc ggaatcgatc tcggcactac ctactcctgc 60 gtcggcgtgt ggcagcacga ccgcgtcgaa atcatcgcca acgatcaagg caaccgcacc 120 actccttcct acgtcgcctt caccgacagc gagcgtctca tcggagacgc cgccaagaac 180 caagtcgcta tgaaccctac caacaccgtc ttcggtaagc tcttctcatc tcaaaaccac 240 gaactccgcc ttagattcca gctcttgatg taatgtttgt tcacatactg tatagctcag 300 atctgaaccg gatattcaac tctttaagtt ttaataatca gtgttctaaa attcggttta 360 aatcggttta ggcgcggtta gcaattttta caacattggg ttaaatagag ctggcggatc 420 gtgttgtttg acggttatcg gtttaaatcg gtttagacgc ggttagcgat ttttaaaaca 480 ttgtgtgaaa atagattgat ggaacagtgt tcgaaaaatc ggtttagacg cggttagcga 540 tttttaaaac attgtgtgaa aatagattga tggaacagtg ttcgaaaaat cggtttagac 600 gcggttagcg atttttaaaa cattgtgtga aaatagattg atggacgtat tgtttgacgg 660 ttatcggttt aaatcggttt agacgcggtt ggcgattttt aaaacattgt gctcaaatag 720 agtgatggaa tgaatcgtgt tgtttgacgg ttactcttaa cgtctatgca gatgctaagc 780 gtcttatcgg aagaaggttc agcgacccct ccgtccaggc ggacatgagg cactggcctt 840 tcaaggtcat ctccggccca gctgagaagc ccatgatcgt cgtcaactac aagggagagg 900 agaaacagtt ctcagctgag gagatatcct ccatggtcct cacaaagatg cgtgagatcg 960 cagaagcctt cctcggcacg tccgtcaaaa acgccgtcgt tacagtcccc gcttacttca 1020 acgactctca gcgtcaagcc acaaaggacg ccggagtcat ctcgggactc aacgtgatgc 1080 gcatcatcaa cgagccaacc gctgcggcca tcgcctacgg tctcgacaag aaggcgtcta 1140 gcgttgggga gaagaacgtg ctgatatttg acttgggagg tgggacgttc gatgtgtcgt 1200 tgctcacgat cgaggaaggg atcttcgaag tgaaggcgac ggctggtgat actcatctcg 1260 gtggtgagga ttttgataac aggatggtga accacttcgt tcaggagttt aagaggaagc 1320 acaagaagga tatcaccggg aacccgaggg cgttgaggag gctgaggacg gcgtgcgaga 1380 gagccaagag gactctctct tcgacagcgc agacgacgat tgagattgat tctctctacg 1440 agggggttga tttctacacg actatcacgc gcgcgaggtt tgaggagctg aacatggatc 1500 tgttcaggaa gtgtatggag ccggtggaga agtgtttgag ggacgcgaag atggataaga 1560 gcaatgttca tgacgttgtg ctcgttggtg ggtccactag gatccctaag gttcagcagc 1620 tgttgcagga tttttttaac gggaaggagc tttgtaagag tattaaccct gacgaggctg 1680 ttgcttacgg agcggctgtt caggccgcga ttttgagcgg ggaggggaat gagaaggttc 1740 aggacttgtt gcttcttgat gttacgcctc tgtcattggg gttggagact gctggaggtg 1800 tgatgactgt tttgattccg aggaacacga cgattccgac gaagaaggag cagatcttct 1860 cgacttattc ggacaaccag cctggtgtgt tgattcaagt ctacgaagga gagagagcga 1920 ggacgaagga caacaacctt ttggggaagt ttgagctcag cggcatcccg cctgcaccac 1980 gaggcgttcc tcagatcact gtctgttttg acatagacgc caacggtatc ctgaacgtgt 2040 cggctgaaga caagacgact ggtcagaaga ataaaatcac gatcaccaac gacaagggaa 2100 ggctgtccaa ggaagagatt gagaagatgg tacaagaagc ggagaagtac aaggcagagg 2160 atgaggaaca caagaagaag gtggatgcga agaatgctct ggagaactac gcgtacaaca 2220 tgagaaacac gatcaaggat gagaagatcg cgtctaagct tgatgcagct gacaagaaga 2280 agatcgagga tgcgatcgat caggctattg aatggttgga gggtaatcag ctggcggaag 2340 cggatgagtt tgaggataag atgaaggagc tcgagtctct ctgcaaccca atcattgcga 2400 gaatgtacca aggcggtgat atgggtggag ctggtggcat ggacgacgat gctcctgccg 2460 gtggtagcgg tggtgctgga cccaagattg aagaagttga ttaa 2504 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gggaaggctg tcgaaggaag ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gccaccagct ccacccatat c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgagggtttc tctcttccac ac 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctgcttggtg caagtgctgt g 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agggtgcctc acacattcac tgatc 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cctcagttat tttacgtggt tttacg 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcgttactat gtacggtaaa aatc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcgctaaccg cgtctaaacc g 21

Claims (8)

1. 서열번호 7의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
3. 제1항에 있어서, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 키트.
6. 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 내서성 양배추 품종을 선별하기 위한 방법.

Images