KR20140087058A - 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 예를 들면, 알츠하이머병 또는 기타 신경퇴행성 장애의 예방, 치료 및 진단에 사용될 수 있는 모노클로날 항체 (예: 8F5 및 8C5)에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도{MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST AMYLOID BETA PROTEIN AND USES THEREOF}
본 발명은, 예를 들면, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 기타 신경퇴행성 장애의 예방, 치료 및 진단에 사용될 수 있는 모노클로날 항체 (예: 8F5 및 8C5)에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 인지 능력이 점차 소실되고, 특징적인 신경병리학적 특징, 예를 들면 아밀로이드 침착, 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle) 및 뇌의 여러 영역에서의 신경세포의 소실이 특징인 신경퇴행성 장애이다[참조: Hardy and Selkoe, Science 297, 353 (2002); Mattson, Nature 431, 7004 (2004)]. 아밀로이드 침착물의 주요 구성요소는 아밀로이드 베타-펩티드(Aβ)이고, 그 중에 42개 아미노산 길이인 종류 (Aβl-42)가 가장 현저하다.
특히, 아밀로이드 β(1-42) 단백질은 단백질분해 프로세싱에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 유래된 42개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 여기에는 사람 변이체 외에도, 사람 이외의 유기체, 특히, 다른 포유동물, 특히 래트에 존재하는 아밀로이드 β(1-42) 단백질의 동종형(isoform)도 포함된다. 수성 환경에서 중합체화되는 경향이 있는 상기 단백질은 매우 상이한 분자 형태로 존재할 수 있다.
불용성 단백질의 침착과 치매 장애 (예: 알츠하이머병)의 발병 또는 진행 간의 단순한 상관관계는 설득력이 없는 것으로 증명되었다[참조: Terry et al., Ann. Neurol. 30. 572-580 (1991); Dickson et al., Neurobiol. Aging 16, 285-298 (1995)]. 대조적으로, 시냅스의 소실 및 인지 지각은 가용성 형태의 Aβ(1-42)와 보다 더 관련이 있는 것 같다[참조: Lue et al., Am. J. Pathol. 155, 853-862 (1999); McLean et al., Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999)].
Aβ(l-42)에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 과거에 생산되었지만, 어떤 항체도 동물 및/또는 사람에서 심각한 부작용을 일으키지 않으면서 바람직한 치료 효과를 나타내는 것으로 입증되지 않았다. 예를 들면, 전임상 연구에서, N-말단-지시된 항-Aβ(1-42) 항체를 5개월 동안 매주 1회 투여하여 수동 면역화된 고령의 APP23 마우스에서 치료상 관련된 부작용이 나타났다. 특히, 식염수-처리한 마우스와 비교하여 상기 마우스에서 미세출혈의 발생수와 중증도가 증가하였다[참조: Pfeifer et al., Science 2002 298:1379]. 최근에 고령의(>24월령) Tg2576 및 PDAPP 마우스의 경우에도 유사한 출혈의 증가가 기술되었다[참조: Wilcock et al., J Neuroscience 2003, 23: 3745-51; Racke et al., J Neuroscience 2005, 25:629-636]. 두 마우스 계통에서 모두, 항-Aβ(1-42)를 주사한 결과, 미세출혈이 유의적으로 증가하였다. 따라서, 인체에 부정적이며 잠재적으로 치명적인 효과를 나타내지 않으면서 질병의 진행을 예방하거나 지연시키는 생물제제의 개발이 치료에 매우 필요하다. 일반인의 수명이 증가하고, 이와 함께 알츠하이머병으로 진단되는 환자의 수가 매년 증가한다는 점에서 특히 상기 필요성이 명백하다. 또한, 현재 알츠하이머병의 진단은 부검을 통해서만 확인될 수 있지만, 상기 항체는 알츠하이머병의 증상을 겪고 있는 환자에서 알츠하이머병의 정확한 진단을 가능하게 할 것이다. 또한, 항체는 이러한 쇠약성 질환의 원인이 되는 단백질 및 다른 생물학적 인자의 생물학적 특성을 규명할 수 있게 할 것이다.
본원에서 언급되는 모든 특허 및 문헌은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
발명의 요약
본 발명은 아밀로이드 베타(Aβ) 단백질 단량체에보다 아밀로이드 베타 단백질 글로불로머(globulomer)에 더 높은 특이성으로 결합하는 분리된 항체를 포함한다. 따라서, 선택적인 결합이 관찰된다. 항체는, 예를 들면, 8F5 또는 8C5와 같은 모노클로날 항체일 수 있다. 글로불로머에 대한 결합 특이성 대 단량체에 대한 결합 특이성의 비는 1.4 이상이다. 특히, 상기 비는 바람직하게는 약 1.4 이상 내지 약 16.9 이상이다 (종점을 포함한 1.0 내지 17.5의 비 뿐만 아니라 이 사이의 소수 % 비도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다. 예를 들면, 1.1, 1.2, 1.3, ..., 2.0, 2.1, 2.2, ..., 17.1, 17.2, 17.3, 17.4, 17.5 뿐만 아니라 이 사이의 모든 완전한 정수 및 %도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다). 아밀로이드 베타 단백질 단량체는, 예를 들면, Aβ(l-42) 단량체 또는 Aβ(l-40) 단량체일 수 있다.
또한, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC; American Type Culture Collection) 수탁번호가 PTA-7238인 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산된 모노클로날 항체 (본원에서 "8F5"라고 함) 뿐만 아니라, 상기 모노클로날 항체(즉, 8F5)를 생산하는 하이브리도마도 포함한다. 또한, 본 발명은 ATCC 수탁번호가 PTA-7407인 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 (본원에서 "8C5"라고 함) 뿐만 아니라, 상기 모노클로날 항체(즉, 8C5)를 생산하는 하이브리도마도 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 의해 암호화된 가변 중쇄를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2에 의해 암호화된 가변 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체도 마찬가지로 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다. 상기 항체는 서열번호 1에 의해 암호화된 가변 중쇄를 추가로 포함할 수 있고, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 3을 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 4를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다. 상기 항체는 서열번호 3을 추가로 포함할 수 있고, 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 11에 의해 암호화된 가변 중쇄를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 12에 의해 암호화된 가변 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체도 마찬가지로 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다. 상기 항체는 서열번호 11에 의해 암호화된 가변 중쇄를 추가로 포함할 수 있고, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 19를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 20을 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체는 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다. 상기 항체는 서열번호 19를 추가로 포함할 수 있고, 쥐 항체, 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 아밀로이드 베타 단백질 원섬유(fibril)에보다 아밀로이드 베타 단백질 글로불로머에 더 높은 특이성으로 결합하는 분리된 항체를 포함한다. 상기 항체는, 예를 들면 모노클로날 항체일 수 있고, ATCC 수탁번호가 PTA-7243인 하이브리도마 또는 ATCC 수탁번호가 PTA-7407인 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체일 수 있다. 이러한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 가변 중쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)이 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 가변 경쇄의 하나 이상의 CDR이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체도 포함한다. 상기 항체는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 중쇄의 하나 이상의 CDR을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 가변 중쇄의 하나 이상의 CDR이 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 가변 경쇄의 하나 이상의 CDR이 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체도 포함한다. 상기 항체는 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 중쇄의 하나 이상의 CDR을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 상기한 임의의 하나 이상의 분리된 항체를 치료 또는 예방을 달성하는데 충분한 양으로 환자에게 투여함을 포함한다.
분리된 항체는, 예를 들면, 근육내 투여, 정맥내 투여 및 피하 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 알츠하이머병을 진단하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 1) 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 2) 상기 생물학적 샘플을, 항원/항체 복합체가 형성되는데 충분한 시간 및 조건 하에서, 상기한 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 샘플 중의 항원/항체 복합체의 존재를 검출하는 단계 (복합체가 존재하면 상기 환자는 알츠하이머병 진단을 받음)를 포함한다. 항원은, 예를 들면, 글로불로머이거나, 완전한 글로불로머와 동일한 기능적 특성(예: 결합 활성)을 갖는 글로불로머의 일부 또는 단편일 수 있다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 알츠하이머병을 진단하는 다른 방법을 포함한다. 상기 방법은 1) 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 2) 상기 생물학적 샘플을, 항체/항원 복합체가 형성되는데 충분한 시간 및 조건 하에서, 항원과 접촉시키는 단계; 3) 생성된 항체/항원 복합체에, 결합된 항체에 접합체가 결합하는데 충분한 시간 및 조건 하에서, 접합체를 첨가하는 단계 (여기서, 접합체는 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 상기의 항체 중 하나를 포함한다); 및 4) 시그날 발생 화합물에 의해 발생된 시그날을 검출하여, 생물학적 샘플 중에 존재할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 단계 (시그날이 검출되면 상기 환자는 알츠하이머병 진단을 받음)를 포함한다. 항원은 글로불로머이거나, 완전한 글로불로머와 동일한 기능적 특성(예: 결합 활성)을 갖는 글로불로머의 일부 또는 단편일 수 있다.
본 발명은 알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 알츠하이머병을 진단하는 추가적인 방법을 포함한다. 상기 방법은 1) 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 2) 상기 생물학적 샘플을, 생물학적 샘플 중에 존재하는 항체를 함유하는 항-항체/항체 복합체가 형성되는데 충분한 시간 및 조건 하에서, 상기의 항체 중 하나에 대해 특이적인 항-항체와 접촉시키는 단계; 2) 생성된 항-항체/항체 복합체에, 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 결합하는 항원을 포함하는 접합체를, 결합된 항체에 상기 접합체가 결합하는데 충분한 시간 및 조건 하에서 첨가하는 단계; 및 3) 시그날 발생 화합물에 의해 발생된 시그날을 검출하는 단계 (시그날이 검출되면 상기 환자는 알츠하이머병 진단을 받음)를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기한 임의의 하나 이상의 항체 (예: 8F5 및 8C5)를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에서 알츠하이머병을 예방하거나 치료하는 다른 방법을 포함한다. 상기 방법은 바로 앞서 기술한 조성물을 예방 또는 치료를 달성하는데 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기한 하나 이상의 항체 및 약제학적으로 허용되는 애주번트를 포함하는 백신을 포함한다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에서 알츠하이머병을 예방하거나 치료하는 추가적인 방법을 포함한다. 상기 방법은 앞서 언급된 백신을 예방 또는 치료를 달성하는데 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병이 발병할 것으로 예상되는 환자를 능동 면역화시키는데 적당한 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 1) 관심대상의 하나 이상의 화합물을, 상기 하나 이상의 화합물이 항체(들)에 결합하는데 충분한 시간 및 조건 하에서 상기의 하나 이상의 항체에 노출시키는 단계; 2) 항체(들)에 결합하는 화합물을 동정하는 단계 (동정된 화합물은 알츠하이머병이 발병할 것으로 예상되는 환자를 능동 면역화시키는데 사용될 것이다)를 포함한다.
또한, 본 발명은 a) 상기한 하나 이상의 분리된 항체, 및 b) 시그날 발생 화합물에 부착된 항체를 포함하는 접합체 (여기서, 접합체 중의 항체는 분리된 항체와 상이하다)를 포함하는 키트를 포함한다. 키트는 키트의 구성요소를 사용하는 방법에 관한 지침서가 포함된 제품내 설명서를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 a) 상기한 항체 중의 하나에 대한 항-항체, 및 b) 시그날 발생 화합물에 부착된 항원을 포함하는 접합체를 포함하는 키트를 포함한다. 항원은 글로불로머이거나, 글로불로머와 동일한 기능적 특징(예: 결합 활성)을 갖는 글로불로머의 단편 또는 일부일 수 있다. 마찬가지로, 키트는 키트의 구성요소를 사용하는 방법에 관한 지침서가 포함된 제품내 설명서를 포함할 수도 있다.
도 1은 글로불로머 대 Aβ(1-42) 단량체, Aβ(1-40) 및 sAPP에 대한 8F5의 선택성을 보여준다. 8F5에 대한 선택성 인자는 EC50 값 간의 비로서 계산할 수 있다 (對 HFIP 중의 Aβ(l-42) 단랑체): 555.8/90.74 = 6.1; 對 NH4OH 중의 Aβ(l-42) 단량체): 1007/90.74 = 11.1; 對 Aβ(l-40) 단량체: 667.8/90.74 = 7.4; 對 sAPP: >100).
도 2는 원섬유-결합된 중쇄 및 경쇄 항체 (4, 6, 8번 레인(lane)) 및 상청액 중의 상응하는 비-결합된 유리 분획 (3, 5, 7번 레인)의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
도 3은 경증 인지 장애 (MCI, 상단) 또는 알츠하이머병 (AD, 하단) 환자로부터의 CSF 샘플 중의 Aβ42 및 Aβ40의 함량을 보여준다. 두 그룹에서, 표준 항체 6E10과 비교하거나, 또는 동일한 ELISA를 사용한 직접적인 샘플 분석과 비교하면, 8F5를 사용한 경우에는, Aβ(l-42)는 더 많은 양이 검출되고, Aβ(l-40)은 동일하거나 더 적은 양이 검출된다는 것을 관찰할 수 있다.
도 4는 세 그룹의 APP 유전자전이된(transgenic) 마우스 (즉, 6G1, 8F5, PBS) 및 한 그룹의 유전자 비-전이된 동복자(littermate) (야생형)에서, 미지의 물체 대 익숙한 물체의 경우 걸리는 시간에 따른 신규 물체 인지 지수(novel object recognition index)를 보여준다. 상기 동물을 (그룹당 마릿수는 그래프 아래에 제시됨) 3주 동안 매주 1회 복강내로 주사하여 모노클로날 항체 6G1 또는 8F5로 면역화시키거나 비히클 (즉, 인산염 완충 식염수; PBS, 및 야생형)로 처리하였다. 마지막으로 주사하는 날에, 신규 물체 인지 과제를 수행하였다. 본 패러다임에서 PBS 그룹과 야생형 그룹 간의 차이는 APP 유전자전이된 마우스의 인지 결핍을 나타내었다. PBS를 주사한 마우스의 수행능력은 우연 수준(chance level)이었지만 (즉, 50과 유의적인 차이가 없음), 모든 다른 마우스는 물체 인지를 보였다 (t-검정; *). 항체를 처리한 APP 유전자전이된 마우스의 수행능력을 대조군 그룹과 비교하면, PBS를 처리한 마우스에 대해서는 유의적인 차이가 나타났지만, 야생형 마우스에 대해서는 유의적인 차이가 나타나지 않아 (ANOVA 및 사후 t-검정(post-hoc t-test); ○), 항체 처리는 상기 APP 유전자전이된 마우스에서 인지 결핍을 회복시킨 것으로 나타났다.
도 5(A)는 본원에서 "8F5"라고 하는 모노클로날 항체를 암호화하는 가변 중쇄의 DNA 서열 (서열번호 1)을 나타내고, 도 5(B)는 모노클로날 항체 8F5를 암호화하는 가변 경쇄의 DNA 서열 (서열번호 2)을 나타낸다 (각각의 서열에서 상보성 결정 영역(CDR)이 밑줄로 표시되어 있다; 도 6을 참조한다).
도 6(A)는 모노클로날 항체 8F5의 가변 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 3)을 나타내고, 도 6(B)는 모노클로날 항체 8F5의 가변 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 4)을 나타낸다. 가변 중쇄의 하나의 CDR은 아미노산 서열 SYGMS (서열번호 5)로 표시된다. 가변 중쇄의 다른 CDR은 아미노산 서열 ASINSNGGSTYYPDSVKG (서열번호 6)으로 표시되고, 가변 중쇄의 또다른 CDR은 아미노산 서열 SGDY (서열번호 7)로 표시된다. 가변 경쇄의 하나의 CDR은 아미노산 서열 RSSQSLVYSNGDTYLH (서열번호 8)로 표시된다. 가변 경쇄의 다른 CDR은 아미노산 서열 KVSNRFS (서열번호 9)로 표시되고, 가변 경쇄의 또다른 CDR은 아미노산 서열 SQSTHVPWT (서열번호 10)으로 표시된다. 모든 상기 CDR은 도 6(A) 및 6(B)에서 밑줄로 표시되어 있다.
도 7은 상이한 농도에서 알츠하이머병(AD) 환자 또는 고령의 APP 유전자전이된 마우스의 신피질의 횡절편에 대한 항체의 결합을 보여준다. 특히, 도 7(A)는 APP 유전자전이된 마우스 계통 Tg2576 및 AD 환자(RZ55)에서, 아밀로이드 침착물이 콩고레드(Congo Red) 염색에 의해 뇌 조직 내의 플라크 및 뇌 혈관 내의 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)으로서 확인됨을 보여준다. 도 7(B)는 AD 환자(RZ16)에서 6G1 및 시판되는 항체인 6E10으로만 Aβ(아밀로이드 플라크)의 실질조직 침착물이 염색되고, 8F5 및 8C5로는 상당히 약하게 염색된다는 것을 보여준다. 도 7(C)는 TG2576 마우스에서 6G1 및 시판되는 항체인 6E10으로만 Aβ(아밀로이드 플라크)의 실질조직 침착물이 강하게 염색되고, 8F5 및 8C5로는 상당히 약하게 염색된다는 것을 보여준다. 도 7(D) 내지 (G)는 조직학적 이미지에서 이미지 분석을 사용한 Aβ 플라크 염색의 정량 분석을 보여준다. 광학밀도 값(0% = 염색되지 않음)은 {플라크의 그레이 스케일(gray scale) 값} - {배경 조직의 그레이 스케일 값}으로 계산하였다 (도 7(D) = Tg2576 마우스에서 0.7㎍/ml 항체의 결합; 도 7(E) = APP/L 마우스에서 0.07 내지 0.7㎍/ml 항체의 결합; 도 7(F)는 AD 환자(RZ55)에서 0.7㎍/ml 항체의 결합; 및 도 7(G) = AD 환자(RZ16)에서 0.07 내지 0.7㎍/ml 항체의 결합). 시판되는 항체인 6E10 (*) 및 4G8 (○)과 항체 6G1, 8C5 및 8F5의 염색 간의 차이를 통계적으로 평가하였다 (*/○: 대조군에 대해 p < 0.05, **/○○: p < 0.01, 및 ***/○○○: p<0.001; p<0.001로 ANOVA 분석 후에 사후 본페로니 t-검정(post-hoc Bonferroni's t-test)을 함) (도 7(D) 및 7(E)). 도 7(E) 및 7(G)에서, 항체 8C5 및 8F5는 시판되는 항체인 6E10 및 4G8보다 항상 유의적으로 낮은 염색을 보였다 (ANOVA에서 p<0.001이었고 사후 t-검정에서 p<0.05였다). 도 7(H)는 6G1 및 시판되는 항체인 6E10으로만 Aβ의 혈관 침착물(화살표)이 강하게 염색되고, 8F5 또는 8C5로는 매우 약하게 염색된 것을 보여준다. Tg2576 마우스에서 정성적으로 유사한 상태가 관찰되었다 (본원에 제시되지 않음).
도 8은 글로불로머 대 Aβ(1-42) 단량체, Aβ(1-40) 및 sAPP에 대한 8C5의 선택성을 보여준다. 8C5에 대한 선택성 인자는 EC50 값 간의 비로서 계산할 수 있다 (對 HFIP 중의 Aβ(l-42) 단랑체): 2346/568.2 = 4.1; 對 NH4OH 중의 Aβ(l-42) 단량체): >100; 對 Aβ(l-40) 단량체: >100; 對 sAPP: >100).
도 9(A)는 8C5의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 11)을 나타내고, 도 9(B)는 8C5의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 12)를 나타낸다. 도 10(A) 및 10(B)에 언급된 상응하는 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 10(A)는 모노클로날 항체 8C5의 가변 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 19)를 나타내고, 도 10(B)는 모노클로날 항체 8F5의 가변 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 20)을 나타낸다. 가변 중쇄의 하나의 CDR은 아미노산 서열 SYGMS (서열번호 13)으로 표시된다. 가변 중쇄의 다른 CDR은 아미노산 서열 SIKNNGGSTYYPDSLKG (서열번호 14)로 표시되고, 가변 중쇄의 또다른 CDR은 아미노산 서열 SGDY (서열번호 15)로 표시된다. 가변 경쇄의 하나의 CDR은 아미노산 서열 RSSQSLVHSNGDTFLH (서열번호 16)으로 표시된다. 가변 경쇄의 다른 CDR은 아미노산 서열 KVSNRFS (서열번호 17)로 표시되고, 가변 경쇄의 또다른 CDR은 아미노산 서열 SQSIHVPWT (서열번호 18)로 표시된다. 모든 상기 CDR은 도 10(A) 및 10(B)에서 밑줄로 표시되어 있다.
본 발명은 본원에서 "8F5"라고 하는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 다른 관련된 항체 (예: 8C5)에 관한 것이다. 이러한 항체는, 예를 들면, 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 장애의 진단, 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
모노클로날 항체 8F5 뿐만 아니라 모노클로날 항체 8C5는 많은 흥미로운 특성을 갖고 있어서, 매우 많은 관심을 받는 치료 후보물질일 뿐만 아니라 매우 유용한 진단 후보물질이 된다. 예를 들면, 모노클로날 항체 8F5 및 8C5는 단량체 또는 원섬유와 비교하여 Aβ(l-42) 글로불로머에 선택적으로 결합한다.
본원에서 "Aβ(X-Y)"라는 용어는 X와 Y를 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 위치 X부터 아미노산 위치 Y까지의 아미노산 서열을 말하고, 특히 아미노산 서열 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA 또는 이의 임의의 천연 변이체 (특히, A2T, H6R, D7N, A21G ("플라망(Flemish)"), E22G ("북극(Arctic)"), E22Q ("네덜란드(Dutch)"), E22K ("이탈리아(Italian)"), D23N ("아이오와(Iowa)"), A42T 및 A42V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체)의 아미노산 위치 X부터 아미노산 위치 Y까지의 아미노산 서열을 말하며, 여기서 숫자는 위치 X 및 위치 Y를 포함하여, Aβ 펩티드의 시작 위치, 또는 어떤 것도 글로불로머 형성을 방해하지 않을 수 있는 최대 3개의 추가적인 아미노산 치환을 갖는 서열과 관계가 있다. 본원에서 "추가적인" 아미노산 치환은 표준 서열에서 벗어나 자연에서 발견되지 않는 임의의 치환으로 정의된다.
보다 구체적으로, 본원에서 "Aβ(l-42)"라는 용어는 1번과 42번을 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 위치 1번부터 아미노산 위치 42번까지의 아미노산 서열을 말하고, 특히 아미노산 서열 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA (아미노산 위치 1번 내지 42번에 상응함) 또는 이의 임의의 천연 변이체의 아미노산 위치 1번부터 아미노산 위치 42번까지의 아미노산 서열을 말한다. 이러한 변이체는, 예를 들면, A2T, H6R, D7N, A21G ("플라망"), E22G ("북극"), E22Q ("네덜란드"), E22K ("이탈리아"), D23N ("아이오와"), A42T 및 A42V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체일 수 있고, 여기서 숫자는 1번 및 42번을 포함하여, Aβ 펩티드의 시작 위치, 또는 어떤 것도 글로불로머 형성을 방해하지 않을 수 있는 최대 3개의 추가적인 아미노산 치환을 갖는 서열과 관계가 있다. 마찬가지로, 본원에서 "Aβ(l-40)"이라는 용어는 1번과 40번을 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 위치 1번부터 아미노산 위치 40번까지의 아미노산 서열을 말하고, 특히 아미노산 서열 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV 또는 이의 임의의 천연 변이체의 아미노산 위치 1번부터 아미노산 위치 40번까지의 아미노산 서열을 말한다. 이러한 변이체는, 예를 들면, A2T, H6R, D7N, A21G ("플라망"), E22G ("북극"), E22Q ("네덜란드"), E22K ("이탈리아") 및 D23N ("아이오와")으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체일 수 있고, 여기서 숫자는 1번 및 40번을 포함하여, Aβ 펩티드의 시작 위치, 또는 어떤 것도 글로불로머 형성을 방해하지 않을 수 있는 최대 3개의 추가적인 아미노산 치환을 갖는 서열과 관계가 있다.
본원에서 "Aβ(X-Y) 글로불로머" ("Aβ(X-Y) 구형 소중합체(globular oligomer)"라고도 공지되어 있음)라는 용어는 균질성 및 구별되는 물리적 특징을 갖는 앞서 정의한 Aβ(X-Y) 펩티드의 가용성, 구형, 비공유적 회합을 말한다. Aβ(X-Y) 글로불로머는 음이온성 세제와 함께 항온처리하여 수득할 수 있는 Aβ(X-Y) 펩티드의 안정한, 비-원섬유성, 소중합체성 어셈블리이다. 단량체 및 원섬유와 대조적으로, 이러한 글로불로머는 서브유닛의 일정한 어셈블리 수가 특징이다 (예: PCT 국제공개공보 제WO 04/067561호에 기술된 바와 같이, 초기 어셈블리 형태, n = 3 내지 6, "소중합체 A", 및 후기 어셈블리 형태, n = 12 내지 14, "소중합체 B"). 글로불로머는 3차원의 구형 구조를 갖는다 ("몰튼 글로불(molten globule)") [참조: Barghorn et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847]. 이들은 하나 이상의 다음의 특징을 추가로 가질 수 있다:
- N-말단 아미노산 X 내지 23번이 무차별(promiscuous) 프로테아제 (예: 서몰리신(thermolysin) 또는 엔도프로테이나제 GluC)에 의해 절단되어 절두된(truncated) 형태의 Aβ(X-Y) 글로불로머가 생성될 수 있음;
- C-말단 아미노산 24번 내지 Y는 무차별 프로테아제 및 항체가 접근불가능함; 및
- 상기 절두된 형태의 Aβ(X-Y) 글로불로머가 글로불로머의 3차원 코어(core) 구조를 유지하면서, 글로불로머 입체구조에서 코어 에피토프(core epitope) Aβ(20-Y)가 더 높은 접근가능성을 갖는다.
본 발명에 있어서, 특히 본 발명의 항체의 결합 친화도를 평가하기 위하여, 본원에서 "Aβ(X-Y) 글로불로머"라는 용어는 전문이 본원에 참조로서 인용된 국제공개공보 제WO 04/067561호에 기술된 방법에 의해 수득할 수 있는 산물을 말한다. 상기 방법은 천연, 재조합 또는 합성 Aβ(X-Y) 펩티드 또는 이의 유도체를 언폴딩(unfolding)시키고; 적어도 부분적으로 언폴딩된 Aβ(X-Y) 펩티드 또는 이의 유도체를 세제에 노출시키고, 세제의 작용을 감소시켜 항온처리를 계속함을 포함한다.
펩티드를 언폴딩시키기 위하여, 수소결합 파괴제, 예를 들면 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP)을 단백질에 작용시킬 수 있다. 작용 온도가 약 20 내지 50℃, 특히 약 35 내지 40℃인 경우, 작용 시간은 수분, 예를 들면 약 10 내지 60분이면 충분하다. 이어서, 증발 건조된 잔류물, 바람직하게는 농축된 형태로 증발 건조된 잔류물을 수성 완충제 (예: 디메틸 설폭사이드 (DMSO))와 혼화가능한 적당한 유기 용매 중에 용해시키면, 이후에 사용될 수 있는 적어도 부분적으로 언폴딩된 펩티드 또는 이의 유도체의 현탁액이 된다. 필요에 따라, 현탁액 원액을 당분간 저온(예: 약 -20℃)에 보관할 수 있다.
대안으로, 펩티드 또는 이의 유도체를 약산성 용액, 바람직하게는 수성 용액, 예를 들면, 약 10mM의 수성 HCl 용액에 용해시킬 수 있다. 대략 수분 동안 항온처리한 후, 불용성 성분을 원심분리로 제거한다. 10,000g에서 수분 동안이 적당하다. 상기 단계는 바람직하게는 실온에서, 즉 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행한다. 원심분리후 수득된 상청액은 Aβ(X-Y) 펩티드 또는 이의 유도체를 함유하고, 이를 당분간 저온(예: 약 -20℃)에 보관할 수 있다.
다음 단계에서 이를 세제에 노출시키는 것은 펩티드 또는 이의 유도체를 소중합체화시켜 중간형의 소중합체 (국제공개공보 제WO 04/067561호에서 소중합체 A라고 명명함)를 수득하기 위한 것이다. 이를 위하여, 충분한 중간 소중합체가 생성될 때까지, 세제를 임의로 적어도 부분적으로 언폴딩된 펩티드 또는 이의 유도체에 작용시킨다. 이온성 세제, 특히 음이온성 세제를 사용하는 것이 바람직하다.
특정 양태에 있어서, 화학식 I의 세제를 사용한다.
[화학식 I]
R-X
상기 화학식 I에서, 라디칼 "R"은 6 내지 20개, 바람직하게는 10 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 비분지형 또는 분지형 알킬이거나, 6 내지 20개, 바람직하게는 10 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 비분지형 또는 분지형 알케닐이고; 라디칼 "X"는 산성 그룹 또는 이의 염이며, 바람직하게는 -COO-M+, -SO3 -M+ 중에서 선택되고, 가장 바람직하게는, -OSO3 -M+이며, M+는 수소 양이온이거나 바람직하게는 알칼리 금속 양이온, 알칼리성 토금속 양이온 및 암모늄 양이온으로부터 선택되는 무기 또는 유기 양이온이다. R이 비분지형 알킬인 (그 중에서도 특히, 알크-1-일 라디칼이 언급되어야 한다) 화학식 I의 세제가 가장 유용하다. 나트륨 도데실 설페이트(SDS)가 특히 바람직하다. 라우르산 및 올레산도 유용하게 사용될 수 있다. 세제 라우로일사르코신(lauroylsarcosin) (사르코실 NL-30 또는 Gardol®로도 공지되어 있음)의 나트륨염도 특히 유용하다.
세제의 작용 시간은, 특히, 소중합체화시킨 펩티드 또는 이의 유도체가 언폴딩되었는지의 여부, 그리고 언폴딩된 경우에는 어느 정도까지 언폴딩되었는지에 따라 달라진다. 만약, 언폴딩 단계에 있어서, 펩티드 또는 이의 유도체를 사전에 수소결합 파괴제 (즉, 특히 헥사플루오로이소프로판올)로 처리한 경우에는, 작용 온도가 약 20 내지 50℃, 특히 약 35 내지 40℃인 경우 작용 시간은 수시간, 유리하게는 약 1 내지 20시간, 특히 약 2 내지 10시간 범위이면 충분하다. 시작 시점에서 펩티드 또는 이의 유도체가 덜 언폴딩되거나 실질적으로 언폴딩되지 않은 경우에는, 이에 따라 작용 시간을 보다 길게 하는 것이 적절하다. 펩티드 또는 이의 유도체를, 예를 들면, HFIP 처리에 대한 대안으로서 상기의 방법에 따라 예비처리했거나, 상기 펩티드 또는 이의 유도체를 직접 소중합체화시키는 경우에는, 작용 온도가 약 20 내지 50℃, 특히 약 35 내지 40℃인 경우 작용 시간은 약 5 내지 30시간, 특히 약 10 내지 20시간 범위이면 충분하다. 항온처리한 후, 불용성 성분을 유리하게는 원심분리로 제거한다. 10,000g에서 수분 동안이 적당하다.
선택될 세제 농도는 사용되는 세제에 따라 달라진다. SDS를 사용하는 경우에는, 0.01 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 중량% 범위의 농도, 예를 들면, 약 0.2 중량%의 농도가 적당하다. 라우르산 또는 올레산을 사용하는 경우에는, 다소 높은 농도, 예를 들면, 0.05 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량% 범위의 농도, 예를 들면, 약 0.5 중량%의 농도가 적당하다. 세제는 대략적으로 생리학적 범위의 염 농도에서 작용시켜야 한다. 따라서, 특히 50 내지 500mM, 바람직하게는 100 내지 200mM의 범위, 및 보다 특히 약 140mM의 NaCl 농도가 적당하다.
후속 단계에서, 세제의 작용을 감소시키고 항온처리를 계속하는 것은 추가로 소중합체화시켜 본 발명의 Aβ(X-Y) 글로불로머 (국제공개공보 제WO 04/067561호에서 소중합체 B라고 명명함)를 수득하기 위한 것이다. 전단계에서 수득된 조성물은 일반적으로 세제 및 생리학적 범위의 염 농도를 함유하므로, 세제의 작용을 감소시키고, 바람직하게는, 염 농도도 감소시키는 것이 적절하다. 이는 예를 들면, 물 또는 저염농도의 완충액, 예를 들면, Tris-HCl (pH 7.3)으로 적절히 희석하여 세제 및 염의 농도를 감소시키는 방법으로 달성할 수 있다. 희석배수는 약 2 내지 10의 범위, 유리하게는, 약 3 내지 8의 범위, 및 특히 약 4인 것이 적당한 것으로 밝혀졌다. 상기 세제의 작용을 중화시킬 수 있는 물질을 첨가하여 세제의 작용을 감소시킬 수도 있다. 이러한 물질의 예에는 세제와 복합체를 형성할 수 있는 물질, 예를 들면 정제 및 추출 과정에서 세포를 안정화시킬 수 있는 물질, 예를 들면, 특정한 EO/PO 블록 공중합체, 특히 상표명 Pluronic® F 68의 블록 공중합체가 포함된다. Triton® X 계열, 특히 Triton® X100, 3-(3-콜아미도프로필디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트 (CHAPS®)의 에톡실화된 t-옥틸페놀과 같은 알콕실화된, 특히 에톡실화된 알킬 페놀, 또는 Tween® 계열, 특히 Tween® 20과 같은 것의 알콕실화된, 특히 에톡실화된 소르비탄 지방산 에스테르를, 마이셀(micelle)의 특정 임계농도 이상의 농도 범위에서 동등하게 사용할 수 있다.
이어서, 충분한 Aβ(X-Y) 글로불로머가 생산될 때까지 용액을 항온처리한다. 작용 온도가 약 20 내지 50℃, 특히 약 35 내지 40℃인 경우 작용 시간은 수시간의 범위, 바람직하게는, 약 10 내지 30시간의 범위, 특히 약 15 내지 25시간의 범위이면 충분하다. 이어서, 용액을 농축시키고, 존재할 수 있는 잔류물을 원심분리로 제거할 수 있다. 마찬가지로, 10,000g에서 수분 동안이 적당하다. 원심분리후 수득된 상청액은 본원에서 기술되는 Aβ(X-Y) 글로불로머를 함유한다.
최종적으로 Aβ(X-Y) 글로불로머는, 예를 들면, 한외여과, 투석, 침전 또는 원심분리로 회수할 수 있다. 이는 Aβ(X-Y) 글로불로머를 변성 조건 하에서 전기영동 (예: SDS-PAGE)으로 분리시 이중 밴드 (예: Aβ(1-42)에 대해 38/48kDa의 겉보기 분자량을 갖는 밴드)가 생성되는 경우에 보다 바람직하고, 분리 전에 소중합체를 글루타르디알데히드로 처리시 상기 2개의 밴드가 하나로 융합되는 경우에 특히 바람직하다. 이는 글로불로머의 크기 배재 크로마토그래피 결과, 단일 피크(peak) (예: Aβ(1-42)에 대해 대략 60kDa의 분자량에 상응하는 피크)가 생성되는 경우에도 바람직하다. Aβ(l-42) 펩티드에서 출발하여, 상기 방법은, 특히 Aβ(l-42) 글로불로머를 수득하는데 적당하다. 바람직하게는, 상기 글로불로머는 신경세포에 대한 친화도를 보이고, 신경조절 효과도 나타낸다. "신경조절 효과"는 신경세포에 대한 장기 지속성 억제 효과로서, 신경 가소성(neuronal plasticity)과 관련하여 신경세포의 기능이상을 일으키는 것으로 정의된다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, 본원에서 "Aβ(X-Y) 글로불로머"라는 용어는 Aβ(X-Y) 서브유닛으로 필수적으로 이루어진 글로불로머를 말하고, 이때 평균적으로 12개의 서브유닛 중 11개 이상이 Aβ(X-Y)형인 경우가 바람직하며, 10% 미만의 글로불로머가 임의의 비-Aβ(X-Y) 펩티드를 포함하는 경우가 보다 바람직하고, 제제 중의 비-Aβ(X-Y) 펩티드의 함량이 검출 역치(threshold) 미만인 경우가 가장 바람직하다. 보다 구체적으로, 본원에서 "Aβ(l-42) 글로불로머"라는 용어는 앞서 정의된 Aβ(l-42) 단위를 포함하는 글로불로머를 말하고; 본원에서 "Aβ(l2-42) 글로불로머"라는 용어는 앞서 정의된 Aβ(l2-42) 단위를 포함하는 글로불로머를 말하며; 본원에서 "Aβ(20-42) 글로불로머"라는 용어는 앞서 정의된 Aβ(20-42) 단위를 포함하는 글로불로머를 말한다.
본원에서 "가교결합된 Aβ(X-Y) 글로불로머"라는 용어는 글로불로머의 구성 단위의 가교결합에 의해, 바람직하게는 화학적 가교결합에 의해, 보다 바람직하게는 알데히드 가교결합에 의해, 가장 바람직하게는 글루타르디알데히드 가교결합에 의해, 상기의 Aβ(X-Y) 글로불로머로부터 수득가능한 분자를 말한다. 본 발명의 다른 양상에서, 가교결합된 글로불로머는 실질적으로 단위들이 비공유 상호작용으로만 결합된 것이 아니라 적어도 부분적으로 공유결합으로 연결된 글로불로머이다.
본원에서 "Aβ(X-Y) 글로불로머 유도체"라는 용어는 특히 검출을 용이하게 하는 그룹, 바람직하게는 형광단(fluorophore), 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 형광 단백질, 딕티오소마(Dictyosoma) 형광 단백질 또는 이의 임의의 조합 또는 형광 활성 유도체; 발색단(chromophore); 화학발광단(chemoluminophore), 예를 들면, 루시퍼라제, 바람직하게는 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제, 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 루시퍼라제 또는 이의 임의의 조합 또는 화학발광 활성 유도체; 효소 활성 그룹, 예를 들면, 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제와 같은 퍼옥시다제 또는 이의 효소 활성 유도체; 전자 고밀도 그룹, 예를 들면, 금 함유 그룹과 같은 중금속 함유 그룹; 합텐(hapten), 예를 들면 페놀로부터 유도된 합텐; 강력한 항원성 구조, 예를 들면, 콜라스카르(Kolaskar) 및 통가온카르(Tongaonkar)의 알고리듬에 의해서와 같이 항원성일 것으로 예측되는 펩티드 서열; 다른 분자에 대한 압타머(aptamer); 킬레이트 그룹, 예를 들면, 헥사히스티디닐; 보다 특이적인 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 천연 또는 천연-유래의 단백질 구조물, 예를 들면, fos/jun 쌍의 일원; 자성 그룹, 예를 들면, 강자성(ferromagnetic) 그룹; 또는 방사성 그룹, 예를 들면 1H, 14C, 32P, 35S 또는 125I를 포함하는 그룹 또는 이의 임의의 조합에 공유결합되어 표지된 글로불로머를 말하거나; 공유결합에 의해 또는 고-친화도 상호작용에 의한 비공유결합에 의해, 바람직하게는 불활성화, 격리(sequestration), 분해 및/또는 침전을 용이하게 하는 그룹에의 공유결합에 의해 플래깅된(flagged), 바람직하게는 생체내 분해를 촉진시키는 그룹, 보다 바람직하게는 유비퀴틴으로 플래깅된 글로불로머를 말하거나 (여기서, 상기 플래깅된 소중합체가 생체내에서 어셈블리되는 경우가 특히 바람직하다); 상기한 것의 임의의 조합에 의해 변형된 글로불로머를 말한다. 이러한 표지 및 플래깅 그룹 및 이들을 단백질에 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 표지 및/또는 플래깅은 글로불로머화 전에, 동안에 또는 후에 수행할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 글로불로머 유도체는 표지 및/또는 플래깅 반응에 의해 글로불로머로부터 수득가능한 분자이다. 따라서, 본원에서 "Aβ(X-Y) 단량체 유도체"라는 용어는 특히 글로불로머에 대해 기술된 바와 같이 표지되거나 플래깅된 Aβ 단량체를 말한다.
본원에서 "높은 친화도"라는 용어는 한쪽의 비-결합된 항체 및 비-결합된 글로불로머와 다른 한쪽의 항체-글로불로머 복합체 사이의 평형이 항체-글로불로머 복합체 쪽으로 보다 유리한 상호작용의 정도를 말한다. 마찬가지로, 본원에서 "낮은 친화도"라는 용어는 한쪽의 비-결합된 항체 및 비-결합된 글로불로머와 다른 한쪽의 항체-글로불로머 복합체 사이의 평형이 비-결합된 항체 및 비-결합된 글로불로머 쪽으로 보다 유리한 상호작용의 정도를 말한다.
본원에서 "Aβ(X-Y) 단량체"라는 용어는 Aβ(X-Y) 펩티드의 분리된 형태, 바람직하게는, 다른 Aβ 펩티드와의 비공유 상호작용이 본질적으로 부재하는 Aβ(X-Y) 펩티드의 형태를 말한다. 실제로, Aβ(X-Y) 단량체는 통상적으로 수성 용액의 형태로 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 결합 친화도를 측정하는데 사용되는 경우, 바람직하게는, 수성 단량체 용액은 0.05% 내지 0.2%, 보다 바람직하게는, 약 0.1% NaOH를 함유한다. 다른 바람직한 경우에, 수성 단량체 용액은 0.05% 내지 0.2%, 보다 바람직하게는, 약 0.1% NaOH를 함유한다. 사용시, 용액을 적당한 방법으로 희석시키는 것이 적절할 수 있다. 또한, 용액을 제조한 후 2시간 이내, 특히 1시간 이내, 특히 30분 이내에 사용하는 것이 일반적으로 적절하다.
본원에서 "원섬유"라는 용어는 비공유 결합된 개개의 Aβ(X-Y) 펩티드의 어셈블리를 포함하는 분자 구조를 말하고, 이는 전자현미경 하에서 원섬유성 구조를 나타내며, 콩고레드(Congo Red)에 결합하고, 편광 하에서 복굴절을 나타내며, X-레이 회절 패턴이 교차-β 구조이다. 원섬유는, 적당한 Aβ 펩티드가 세제의 부재 하에서 (예: 0.1M HCl 중에서) 자발적으로 중합체로 응집되게 하여 24개 이상, 바람직하게는 100개 이상의 단위의 응집체가 형성되게 함을 포함하는 방법으로 수득가능한 분자 구조로 정의할 수도 있다. 상기 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 편의상, Aβ(X-Y) 원섬유는 수성 용액의 형태로 사용된다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 수성 원섬유 용액은, Aβ 펩티드를 0.1% NH4OH 중에 용해시켜, 이를 20mM NaH2PO4, 140mM NaCl (pH 7.4)로 1:4로 희석시키고 나서, pH를 7.4로 재조절하여, 용액을 37℃에서 20시간 동안 항온처리한 후, 10000g에서 10분 동안 원심분리하고, 20mM NaH2PO4, 140mM NaCl (pH 7.4) 중에 재현탁시켜 제조한다.
본원에서 "Aβ(X-Y) 원섬유"라는 용어는 Aβ(X-Y) 서브유닛을 포함하는 원섬유를 말하고, 이때 평균적으로 90% 이상의 서브유닛이 Aβ(X-Y)형인 경우가 바람직하고, 98% 이상의 서브유닛이 Aβ(X-Y)형인 경우가 보다 바람직하며, 비-Aβ(X-Y) 펩티드의 함량이 검출 역치 미만인 경우가 가장 바람직하다.
도 1에 명시된 8F5 뿐만 아니라 8C5 (도 8)로 되돌아가서, Aβ(l-42) 글로불로머-특이적 항체인 모노클로날 항체 8F5 및 8C5는, 비-특이적 항체인 6G1 및 6E10과 대조적으로, Aβ(l-42) 글로불로머 형태를 주로 인식하며, 응집된 Aβ(l-42)를 포함하여 Aβ(l-40) 또는 Aβ(l-42) 단량체의 표준 제제는 인식하지 못한다. 특히, 8F5는 네이티브(native) PAGE-웨스턴 블롯에서만 Aβ(l-42) 글로불로머를 검출하고, SDS-PAGE 웨스턴 블롯 분석에서는 검출하지 못하여, 코어 Aβ(l-42) 글로불로머 구조 내의 보다 복잡한 세제-용해성 서브유닛간 에피토프(intersubunit epitope)에 결합한다는 것을 나타낸다. 서브유닛간 에피토프는 2개 이상의 서브유닛 상에 위치한 복잡한 비-선형 공간 통과(through space) 에피토프로 정의된다. 보다 구체적으로는, 다양한 Aβ(l-42) 및 Aβ(l-40) 표준 제제에 대한 닷-블롯(dot-blot) 분석에서, 특이적인 8F5 및 8C5의 경우에는, Aβ(l-42) 글로불로머 대 비-글로불로머 Aβ 형태 (표준 Aβ(1-40) / (1-42) 단량체 제제, 응집된 Aβ(l-42))의 인식에서 상당한 차이를 보였지만, 비-특이적 동종형(isoform) 항체인 6G1 및 6E10의 경우에는 그렇지 않았다. 8F5 및 8C5의 글로불로머 특이성은, 샌드위치(sandwich) ELISA에서 Aβ(l-42) 글로불로머, Aβ(l-42) 단량체, Aβ(l-40) 단량체 및 가용성 아밀로이드 전구체 단백질 알파 결합을 정량하여 확인되었지만, 6G1 및 6E10의 글로불로머 특이성은 확인되지 않았다. 또한, 상기 항체들은 네이티브 웨스턴 블롯팅 후에는 글로불로머에 접근하지만 SDS 웨스턴 블롯팅 후에는 접근하지 못하므로, 각각의 항체는 Aβ(l-42)의 아미노산 20번 내지 30번 영역에서 서브유닛 사이의 구조적 비-선형 에피토프를 인식하는 것 같다. 글로불로머에 대한 이러한 특이성은 중요한데, 그 이유는 글로불로머 선택적 항체 (예: 8F5 또는 8C5)로 글로불로머 형태의 Aβ를 특이적으로 표적화하면, 1) 불용성 아밀로이드 침착물이 표적화되는 것이 방지될 것이고 (불용성 아밀로이드 침착물에의 결합은 불용성 Aβ로 면역화하는 동안 관찰되는 염증 부작용의 원인일 수 있다); 2) 예지적 생리학적 기능을 갖는 것으로 보고되어 있는 Aβ 단량체 및 APP가 확보될 것이고 [참조: Plan et al., J. of Neuroscience 23:5531-5535 (2003)]; 3) 불용성 침착물에 대한 광범위한 결합을 통해 차단되거나 접근 불가능해지지 않을 것이므로 항체의 생체이용률이 증가될 것이다.
본 발명은 또한 모노클로날 항체 8F5 및 8CD의 가변 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 분리된 뉴클레오티드 서열 (또는 이의 단편) 뿐만 아니라, 이러한 암호화 뉴클레오티드 서열에 대해 약 70% 이상 (예: 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%), 바람직하게는 약 80% 이상 (예: 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%), 보다 바람직하게는 약 90% 이상 (예: 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이에 상응하거나, 이와 동일하거나, 이와 하이브리드화할 수 있거나, 이에 대해 상보적인 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 (또는 이의 단편)도 포함한다 (70% 이상 100% 이하의 모든 정수 (및 이 사이의 소수)는 % 동일성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다). 이러한 서열은 임의의 기원으로부터 유래될 수 있다 (예: 천연으로부터 분리되거나, 반합성 경로를 통해 생산되거나, 신생합성될 수 있다). 특히, 이러한 서열은 실시예에 기술된 기원 (예: 세균, 진균, 조류(algae), 마우스 또는 사람) 이외의 기원으로부터 분리되거나 유래될 수 있다.
상기한 뉴클레오티드 서열 외에도, 본 발명은 또한 모노클로날 항체 8F5 및 모노클로날 항체 8C5의 가변 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 (또는 이러한 아미노산 서열의 단편)을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 단백질의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이에 상응하거나, 이와 동일하거나, 이에 상보적인 아미노산 서열 (또는 이의 단편)도 포함한다 (마찬가지로, 70% 이상 100% 이하의 (앞서 뉴클레오티드 서열 동일성과 관련하여 열거됨) 모든 정수 (및 이 사이의 소수)도 % 동일성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다).
본 발명에 있어서, 뉴클레오티드 서열의 "단편"은 명시된 뉴클레오티드 서열의 영역에 상응하는 대략 6개 이상, 바람직하게는 약 8개 이상, 보다 바람직하게는 약 10개 이상의 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 약 15개 이상의 뉴클레오티드의 연속적인 서열로 정의된다.
"동일성"이라는 용어는 특정 비교 윈도우(window) 또는 단편에 걸쳐 뉴클레오티드 하나씩을 기준으로 한 2개의 서열의 관련성을 말한다. 따라서, 동일성은 2개의 DNA 단편 (또는 2개의 아미노산 서열)의 동일한 쇄 (센스 또는 안티센스) 간의 동일성, 상응성 또는 동등성의 정도로 정의된다. "서열 동일성의 %"는, 특정 영역에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하여, 동일한 염기 또는 아미노산이 두 서열에 모두 존재하는 위치의 수를 계산하여 매치하는 위치의 수를 얻고, 비교하는 단편 내의 위치의 총 수로 나누어, 그 결과에 100을 곱하는 방법으로 계산한다. 서열의 최적 정렬은 문헌[참조: Smith & Waterman, Appl. Math. 2:482 (1981)]의 알고리듬, 문헌[참조: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 알고리듬, 문헌[참조: Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988)]의 방법 및 관련된 알고리듬을 실행하는 컴퓨터 프로그램 [예: Clustal Macaw Pileup (http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf; Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) 또는 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI)]을 사용하여 수행할 수 있다 [참조: 미국특허 제5,912,120호].
본 발명에 있어서, "상보성"은 2개의 DNA 단편 간의 관련성의 정도로 정의된다. 이는 적당한 조건 하에서 하나의 DNA 단편의 센스 쇄가 다른 DNA 단편의 안티센스 쇄와 하이브리드화하여 이중나선을 형성하는 능력을 측정하여 판정된다. "상보체(complement)"는 주어진 서열과 표준 염기쌍형성 규칙에 따라 염기쌍을 형성하는 서열로 정의된다. 예를 들면, 한 뉴클레오티드 쇄의 A-G-T 서열은 다른 쇄의 T-C-A와 "상보적"이다.
이중나선에서, 아데닌이 한 쇄에 존재하면, 다른 쇄에는 티미딘이 존재한다. 마찬가지로, 구아닌이 한 쇄에 존재할 때마다, 다른 쇄에는 시토신이 존재한다. 2개의 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열 간의 관련성이 높을수록, 2개의 DNA 단편의 쇄 사이에 하이브리드 듀플렉스(duplex)가 형성될 수 있는 능력이 증가된다.
2개의 아미노산 서열 간의 "유사성"은 두 서열에서 일련의 동일한 아미노산 잔기 및 보존된 아미노산 잔기의 존재로 정의된다. 2개의 아미노산 서열 간의 유사성의 정도가 높을수록, 2개의 서열의 상응성, 동일성 또는 동등성이 높아진다 (2개의 아미노산 서열 간의 동일성은 두 서열에서 정확하게 같거나 불변인 일련의 아미노산 잔기의 존재로 정의된다). "상보성", "동일성" 및 "유사성"의 정의는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
"~에 의해 암호화된"이라는 표현은 폴리펩티드 서열이 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 말하고, 이때 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드로부터의 3개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 8개 이상의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 15개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 함유한다.
또한, 핵산 분자는, 일본쇄 형태의 핵산 분자가 적당한 온도 및 이온 농도 조건 하에서 다른 핵산 분자와 어닐링(annealing)할 수 있는 경우, 다른 핵산 분자와 "하이브리드화할 수 있는" 것이다[참조: Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]. 온도 및 이온 농도 조건은 하이브리드화의 "엄중성(stringency)"을 결정한다.
본원에서 사용되는 "하이브리드화"라는 용어는 일반적으로 프로브 서열 및 표적 서열의 성질에 따라 당업자에 의해 쉽게 결정될 적당한 엄중성 조건에서의 핵산의 하이브리드화를 의미하는데 사용된다. 하이브리드화 및 세척 조건은 당업계에서 익히 공지되어 있고, 목적하는 엄중성에 따라 용액의 항온처리 시간, 온도 및/또는 이온 농도를 변화시켜 쉽게 상태를 조절한다[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring harbor Press, Cold Spring harbor, N.Y., 1989 (앞서 언급되어 있고 본원에 참조로서 인용됨); Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al.; 및 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) (둘 모두 본원에 참조로서 인용됨)]. 구체적으로, 조건은 하이브리드화되는 서열의 길이, 특히 프로브 서열의 길이, 핵산의 상대적인 G-C 함량 및 허용될 미스매치(mismatch)의 양에 따라 선택된다. 낮은 엄중성 조건은 상보성 정도가 낮은 쇄 간의 부분적 하이브리드화를 원하는 경우에 바람직하다. 완전하거나 거의 완전한 상보성을 원하는 경우에는, 높은 엄중성 조건이 바람직하다. 통상적인 높은 엄중성 조건의 경우, 하이브리드화 용액은 6 X S.S.C., 0.01 M EDTA, 1x 덴하르트(Denhardt) 용액 및 0.5% SDS를 함유한다. 하이브리드화는, 클로닝된 DNA의 단편의 경우에는 약 68℃에서 약 3 내지 4시간 동안 실시하고, 전체 진핵생물 DNA의 경우에는 약 12 내지 약 16시간 동안 실시한다. 중간 엄중성의 경우에는, 3 X 염화나트륨, 시트르산 나트륨(SSC), 50% 포름아미드 (pH 7.5에서 이 완충액 중의 0.1M) 및 5 X 덴하르트 용액을 함유하는 용액으로 여과 예비하이브리드화 및 하이브리드화를 사용할 수 있다. 이어서, 37℃에서 4시간 동안 예비하이브리드화시킨 후, 37℃에서 총 3,000,000 cpm과 동등한 많은 양의 표지된 프로브로 16시간 동안 하이브리드화시키고 나서, 2 X SSC 및 0.1% SDS 용액 중에서 실온에서 각 1분씩 4회 세척하고 60℃에서 각 30분씩 4회 세척할 수 있다. 건조시킨 후, 필름에 노출시킨다. 낮은 엄중성의 경우에는, 하이브리드화 온도를 듀플렉스의 융해 온도 (Tm) 미만의 약 12℃로 낮춘다. Tm은 G-C 함량 및 듀플렉스 길이뿐만 아니라 용액의 이온 농도의 함수인 것으로 공지되어 있다.
"하이브리드화"를 위해서는 2개의 핵산이 상보적인 서열을 함유해야 한다. 하지만, 하이브리드화의 엄중성에 따라, 염기 사이에 미스매치가 존재할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 핵산의 하이브리드화에 적당한 엄중성은 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 따라 달라진다. 이러한 변수는 당업계에서 익히 공지되어 있다. 보다 구체적으로는, 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성의 정도가 높을수록, 이러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm 값이 높아진다. 길이가 100개 이상의 뉴클레오티드인 하이브리드의 경우, Tm을 계산하는 식이 유도되었다[참조: Sambrook et al., supra]. 짧은 핵산과의 하이브리드화의 경우에는, 미스매치의 위치가 더 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 이의 특이성을 결정한다[참조: Sambrook et al., supra].
본원에서 사용되는 "분리된 핵산 단편 또는 서열"은 임의로 합성, 비-천연 또는 변화된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 일본쇄 또는 이본쇄의 RNA 또는 DNA의 중합체이다. DNA의 중합체 형태의 분리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다 (특정 폴리뉴클레오티드의 "단편"은 특정 뉴클레오티드 서열의 영역과 동일하거나 이에 대해 상보적인 약 6개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 8개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 10개 이상의 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 약 15개 이상의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 약 25개 이상의 뉴클레오티드의 연속적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다). 뉴클레오티드 (일반적으로 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 다음과 같이 1문자 명명법으로 언급된다: "A"는 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트 (각각 RNA 또는 DNA의 경우), "C"는 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트, "G"는 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트, "U"는 우리딜레이트, "T"는 데옥시티미딜레이트, "R"은 퓨린 (A 또는 G), "Y"는 피리미딘 (C 또는 T), "K"는 G 또는 T, "H"는 A 또는 C 또는 T, "I"는 이노신, 그리고 "N"은 임의의 뉴클레오티드를 의미한다.
"기능적으로 동등한 단편 또는 하위단편(subfragment)" 및 "기능상 동등한 단편 또는 하위단편"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는, 단편 또는 하위단편이 활성 효소를 암호화하는지의 여부에 관계없이 유전자 발현을 변화시키거나 특정 표현형이 나타나게 하는 능력을 유지하는 분리된 핵산 단편의 일부 또는 하위서열(subsequence)을 말한다. 예를 들면, 단편 또는 하위단편은 키메릭(chimeric) 작제물의 설계에 사용되어 형질전환된 식물에서 목적하는 표현형이 나타나게 할 수 있다. 활성 효소를 암호화하는지의 여부에 관계없이, 식물 프로모터 서열에 대하여 적절한 배향으로 핵산 단편 또는 이의 하위단편을 연결시켜 키메릭 작제물을 설계하여, 공동억제 또는 안티센스에 사용할 수 있다.
"상동성", "상동", "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 상응하는"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기가 변화되어도 유전자 발현을 매개하거나 특정한 표현형이 나타나게 하는 핵산 단편의 능력이 영향을 받지 않는 핵산 단편을 말한다. 또한, 상기 용어는, 처음의 비-변형된 단편과 비교하여, 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 말한다. 그러므로 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 발명은 특정한 대표적인 서열보다 많은 것을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
"유전자"는 암호화 서열의 앞과 뒤의 조절 서열 (5' 비-암호화 서열 및 3' 비-암호화 서열)을 포함하여 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 말한다.
"천연 유전자"는 자연에서 발견되고 자신의 조절 서열을 갖고 있는 유전자를 말한다. 대조적으로, "키메릭 작제물"은 일반적으로 자연에서 함께 발견되지 않는 핵산 단편의 조합을 말한다. 따라서, 키메릭 작제물은 상이한 기원으로부터 유래된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함하거나, 동일한 기원으로부터 유래되었지만 자연에서 일반적으로 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다 ("분리된"이라는 용어는 서열이 자연 환경으로부터 이동된 것을 의미한다).
"외래" 유전자는 숙주 유기체에서는 일반적으로 발견되지 않지만 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 속으로 도입된 유전자를 말한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 또는 키메릭 작제물 속으로 삽입된 천연 유전자를 포함할 수 있다. "전이유전자(transgene)"는 형질전환 방법에 의해 게놈 속으로 도입된 유전자이다.
"암호화 서열"은 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 말한다. "조절 서열"은 암호화 서열의 상류 (5' 비-암호화 서열), 내부 또는 하류 (3' 비-암호화 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말하고, 이는 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 연결된 암호화 서열의 해독에 영향을 미친다. 조절 서열에는 프로모터, 해독 리더(leader) 서열, 인트론(intron) 및 폴리아데닐화 인식 서열이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"프로모터" 또는 "조절 유전자 서열"은 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 상기 서열은 인접한 요소 및 보다 멀리 떨어진 상류의 요소로 이루어지며, 후자를 종종 인핸서(enhancer)라고 한다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 또는 조절 유전자 서열 활성을 자극시킬 수 있는 DNA 서열이고, 이는 프로모터의 본래의 요소이거나, 프로모터의 수준 또는 조직-특이성이 향상되도록 삽입된 이종 요소일 수 있다. 프로모터 서열은 유전자의 전사되는 부분의 내부 및/또는 전사되는 서열의 하류에도 위치할 수 있다. 프로모터는 온전히 천연 유전자로부터 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성되거나, 또는 합성 DNA 단편을 포함할 수도 있다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 종류에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 점을 당업자는 이해한다. 유전자가 대부분의 숙주 세포 종류에서 대부분의 시간에 발현되게 하는 프로모터를 통상적으로 "구성적(constitutive) 프로모터"라고 한다. 식물 세포에 유용한 다양한 종류의 새로운 프로모터가 계속 발견되고 있다; 많은 예를 문헌[참조: Okamuro and Goldberg, Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989)]에서 찾을 수 있다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완전하게 정의되지 않았기 때문에, 일부 변이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 점을 또한 인식해야 한다.
"인트론(intron)"은 단백질 서열의 일부를 암호화하지 않는 유전자 내의 개재(intervening) 서열이다. 따라서, 이러한 서열은 RNA로 전사되지만, 이후에 절단되거나 해독되지 않는다. 상기 용어는 절단된 RNA 서열에 대해서도 사용된다. "엑손(exon)"은 전사되어 유전자로부터 유래된 성숙한 메신저(messenger) RNA에서 발견되는 유전자 서열의 일부이지만, 반드시 최종 유전자 산물을 암호화하는 서열의 일부분인 것은 아니다.
"해독 리더 서열"은 유전자의 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 위치한 DNA 서열을 말한다. 해독 리더 서열은 완전하게 프로세싱된 mRNA에서 해독 개시 서열의 상류에 존재한다. 해독 리더 서열은 1차 전사체의 mRNA로의 프로세싱, mRNA 안정성 또는 해독 효율에 영향을 미칠 수 있다. 해독 리더 서열의 예는 문헌[참조: Turner, R. and Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225]에 기술되었다.
"3' 비-암호화 서열"은 암호화 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 말하며, 여기에는 폴리아데닐화 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 시그날을 암호화하는 기타 서열이 포함된다. 폴리아데닐화 시그날은 일반적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에의 연속적인 폴리아네닐산의 부가에 영향을 주는 것이 특징이다. 상이한 3' 비-암호화 서열의 사용은 문헌[참조: Ingelbrecht et al., Plant Cell 1:671-680 (1989)]에 예시되어 있다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사로부터 생성되는 산물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보적 카피인 경우, 이를 1차 전사체라고 하며, 또는 RNA 전사체는 1차 전사체의 전사후 프로세싱으로부터 유래된 RNA 서열일 수도 있는데 이를 성숙한 RNA라고 한다. "메신저 RNA (mRNA)"는 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 해독될 수 있는 RNA를 말한다. "cDNA"는 mRNA 주형에 대해 상보적이고 mRNA 주형으로부터 역 전사효소를 사용하여 합성되는 DNA를 말한다. cDNA는 일본쇄이거나, DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편을 사용하여 이본쇄 형태로 전환될 수 있다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하고 세포 내에서 또는 시험관내에서 단백질로 해독될 수 있는 RNA 전사체를 말한다. "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부에 대해 상보적이고 표적 유전자의 발현을 차단시키는 RNA 전사체를 말한다[참조: 미국특허 제5,107,065호]. 안티센스 RNA는 특정 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5' 비-암호화 서열, 3' 비-암호화 서열, 인트론 또는 암호화 서열과 상보적일 수 있다. "기능성 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임(ribozyme) RNA, 또는 해독되지 않을 수 있지만 세포 과정에는 영향을 미치는 다른 RNA를 말한다. "상보체" 및 "역 상보체(reverse complement)"라는 용어는 본원에서 mRNA 전사체와 관련하여 상호교환적으로 사용되고, 이는 메시지의 안티센스 RNA를 의미한다.
"내인성 RNA"라는 용어는 천연 또는 비-천연 (즉, 재조합 방법, 돌연변이유발 등에 의해 도입됨) 여부에 관계없이, 본 발명의 재조합 작제물로 형질전환되기 전에 숙주의 게놈에 존재하는 임의의 핵산 서열에 의해 암호화된 임의의 RNA를 말한다.
"비-천연"이라는 용어는 자연에서 일반적으로 발견되는 것과 일치하지 않는 인공적인 것을 의미한다.
"작동가능하게 연결된(operably linked)"이라는 용어는 핵산 서열들이 단일 핵산 단편에 연결되어 하나의 기능이 다른 하나에 의해 조절되는 것을 말한다. 예를 들면, 프로모터가 암호화 서열의 발현을 조절할 수 있는 경우 프로모터는 상기 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 것이다 (즉, 암호화 서열이 프로모터의 전사적 조절하에 있는 것이다). 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 상보적 RNA 영역은, 직접적 또는 간접적으로, 표적 mRNA의 5'에, 또는 표적 mRNA의 3'에, 또는 표적 mRNA 내부에 작동가능하게 연결되거나, 첫번째 상보적 영역은 표적 mRNA의 5'에 존재하고 이의 상보체는 표적 mRNA의 3'에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 "발현"이라는 용어는 기능성 최종 산물의 생산을 말한다. 유전자의 발현에는 유전자의 전사, 및 전구체 또는 성숙한 단백질로의 mRNA의 해독이 포함된다. "안티센스 억제"는 표적 단백질의 전사를 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사체의 생산을 말한다. "공동억제"는 동일하거나 실질적으로 유사한 외래 또는 내인성 유전자의 발현을 억제할 수 있는 센스 RNA 전사체의 생산을 말한다[참조: 미국특허 제5,231,020호].
"성숙한" 단백질은 해독후 프로세싱된, 즉 1차 해독 산물에 존재하는 임의의 프리펩티드(pre-peptide) 또는 프로펩티드(pro-peptide)가 제거된 폴리펩티드를 말한다. "전구체" 단백질은 mRNA의 1차 해독 산물, 즉 프리펩티드 또는 프로펩티드가 여전히 존재하는 폴리펩티드를 말한다. 프리펩티드 및 프로펩티드는 세포내 위치결정(localization) 시그날일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"안정한 형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 게놈 속으로 전달하여 유전적으로 안정한 유전형질을 생성시키는 것을 말한다. 대조적으로 "일시적 형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 핵 또는 DNA 함유 세포소기관 속으로 전달하여 통합 또는 안정한 유전형질의 부재 하에서 유전자가 발현되게 하는 것을 말한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체를 "유전자전이된" 유기체라고 한다. 본원에서 사용되는 "형질전환"이라는 용어는 안정한 형질전환 및 일시적 형질전환을 모두 말한다.
본원에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 익히 공지되어 있고 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning : A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (본원에서 이후에 "Sambrook"이라고 함)]에 보다 상세히 기술되어 있다.
"재조합체"라는 용어는, 달리 분리된 2개의 서열 단편을, 예를 들면, 화학적 합성에 의해 또는 유전자 조작 기술을 사용한 분리된 핵산 단편의 조작에 의해 인공적으로 조합한 것을 말한다.
"PCR" 또는 "폴리머라제 연쇄 반응"은 특정한 DNA 단편을 대량으로 합성하는 기술로서 일련의 반복되는 사이클로 이루어진다 (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). 통상적으로, 이본쇄 DNA를 열 변성시켜, 표적 단편의 3' 경계에 대해 상보적인 2개의 프라이머를 저온에서 어닐링시키고 나서, 중간 온도에서 연장시킨다. 상기의 연속적인 3개의 단계로 이루어진 하나의 세트를 사이클이라고 한다.
폴리머라제 연쇄 반응("PCR")은 단시간에 주형을 반복적으로 복제시켜 DNA를 수 백만배 증폭시키는데 사용되는 강력한 기술이다[참조: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 51:263-273 (1986); Erlich et al., 유럽 특허원 제50,424호; 유럽 특허원 제84,796호; 유럽 특허원 제258,017호; 유럽 특허원 제237,362호; Mullis, 유럽 특허원 제201,184호; Mullis et al., 미국특허 제4,683,202호; Erlich, 미국특허 제4,582,788호; 및 Saiki et al., 미국특허 제4,683,194호]. 상기 방법은 시험관내에서 합성된 특정한 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 DNA 합성을 프라이밍(priming)한다. 프라이머의 설계는 분석될 DNA의 서열에 따라 달라진다. 상기 기술은 주형을 고온에서 융해시켜, 프라이머가 주형 내의 상보적인 서열에 어닐링되게 하고 나서, DNA 폴리머라제를 사용하여 주형을 복제하는 수회 (일반적으로 20 내지 50회)의 사이클을 통해 실시된다.
PCR 반응 산물을 아가로스 겔에서 분리시킨 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 UV 투사로 가시화시켜 분석한다. 대안으로, 방사성 dNTP를 PCR에 첨가하여 산물에 표지를 혼입시킬 수 있다. 이 경우에는 PCR 산물을 겔을 엑스-레이 필름에 노출시켜 가시화시킨다. 방사성 표지된 PCR 산물의 추가적인 장점은 개개의 증폭 산물의 수준을 정량할 수 있다는 점이다.
"재조합 작제물", "발현 작제물" 및 "재조합 발현 작제물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 당업자에게 익히 공지된 표준 방법론을 사용하여 세포의 게놈 속으로 삽입될 수 있는 유전 물질의 기능성 단위를 말한다. 이러한 작제물은 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터를 사용하는 경우, 벡터의 선택은 당업자에게 익히 공지된 바와 같이 숙주 식물을 형질전환시키는데 사용될 방법에 따라 달라진다. 예를 들면, 플라스미드가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 임의의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고 선별하고 증식하기 위하여 벡터에 존재해야 하는 유전자 요소를 익히 알고 있다. 당업자는 상이한 독립적인 형질전환 이벤트에 의해 발현 수준 및 패턴이 달라질 것이라는 사실[참조: Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol . Gen . Genetics 218:78-86], 및 따라서 다수의 이벤트를 스크리닝하여 목적하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 세포주를 수득해야 한다는 것을 또한 인식할 것이다. 이러한 스크리닝은 DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 웨스턴 분석 또는 표현형 분석으로 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"는, 상이한 항체의 혼합물을 함유하는 "폴리클로날" 항체 제제로부터의 항체와 대조적으로, 공통적인 중쇄 및 공통적인 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체를 함유하는 항체 분자의 하나의 제제를 말한다. 모노클로날 항체는 하이브리도마-유래된 항체 (예: 표준적인 콜러와 밀스타인(Kohler and Milstein) 하이브리도마 방법론 (1975, Nature 256:495-497)과 같은 하이브리도마 기술에 의해 제조된 하이브리도마에 의해 분비된 항체)로 예시되는 통상적인 방법 뿐만 아니라, 파지, 세균, 효모 또는 리보좀 디스플레이와 같은 다수의 새로운 기술에 의해서도 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 비-하이브리도마-유래된 효능성(agonistic) 항체는 비-통상적 방법론에 의해 유도되었지만 여전히 모노클로날 항체라고 한다.
본원에서 사용되는 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 말한다 (예: 글로불로머에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 글로불로머 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다). 하지만, 글로불로머에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 항원에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단하게 "항체 일부")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원 결합 기능이 전체 길이 항체의 단편에 의해 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 항체 양태는 2특이적(bispecific), 이중 특이적(dual specific) 또는 다중 특이적(multi specific) 형태 (2개 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합함)일 수도 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편 - VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 - 힌지(hinge) 영역에서 이황화결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) Fd 단편 - VH 및 CH1 도메인으로 이루어짐; (iv) Fv 단편 - 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어짐; (v) dAb 단편 [참조: Ward et al., (1989) Nature 341:544-546] - 단일 가변 도메인을 포함함; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음)를 생성시키는 합성 링커(linker)에 의해 두 도메인을 연결시킬 수 있다[참조: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 5879-5883]. 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함된다. 디아바디(diabody)와 같은 다른 형태의 단일쇄 항체도 포함된다. 디아바디는 2가, 2특이적 항체로서, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되지만, 너무 짧은 링커가 사용되어 2개의 도메인이 동일한 쇄에서 쌍을 형성할 수 없어, 도메인이 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위가 생성된다[참조: Holliger, P., et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123]. 이러한 항체 결합 부분은 당업계에 공지되어 있다[참조: Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)].
또한, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항체 또는 항체 일부가 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 공유결합 또는 비공유결합하여 생성된 큰 면역부착(immunoadhesion) 분자의 일부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예에는 스트렙타비딘 코어 영역을 사용하여 제조된 4량체 scFv 분자[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101], 및 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 제조된 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol . Immunol . 31:1047-1058]가 포함된다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 일부는 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 일부 및 면역부착 분자는 본원에서 기술되는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 "재조합 사람 항체"라는 용어는, 재조합 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 분리된 모든 사람 항체, 예를 들면, 재조합 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포 속으로 형질감염시켜 발현된 항체; 재조합 사람 항체 조합 라이브러리로부터 분리된 항체[참조: Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin . Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378]; 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자전이된 동물(예: 마우스)로부터 분리된 항체[참조: Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370]; 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)시킴을 포함하는 임의의 다른 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 분리된 항체를 포함하는 의미이다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 생식계열(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체를 시험관내에서 돌연변이유발시켜 (또는, 사람 Ig 서열에 대해 유전자전이된 동물을 사용하면 (생체내 체세포 돌연변이유발)), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련은 있지만, 생체내에서 사람 항체 생식계열 레퍼토리(repertoire) 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이 된다[참조: Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991]. 하지만, 본 발명의 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예: 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되거나 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Gold Spring Harbor Press, 1990].
"키메릭 항체"라는 용어는 사람 불변 영역에 연결된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 어느 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 말한다.
"CDR-이식 항체(CDR-grafted antibody)"라는 용어는 하나 이상의 쥐의 CDR (예: CDR3)이 사람 CDR 서열로 대체된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 어느 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체를 말한다.
본 발명의 재조합 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖고, 상기 서열로부터 유래된 불변 영역도 포함할 수 있다[참조: Kabat et al. (1991) supra]. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체를 시험관내에서 돌연변이유발시켜 (또는, 사람 Ig 서열에 대해 유전자전이된 동물을 사용하면 (생체내 체세포 돌연변이유발)), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련은 있지만, 생체내에서 사람 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이 된다. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 항체는 선택적 돌연변이유발 또는 복귀돌연변이(backmutation) 또는 둘 모두의 결과이다.
"복귀돌연변이"라는 용어는 사람 항체의 체세포 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 전부가 상동 생식계열 항체 서열로부터의 상응하는 생식계열 잔기로 대체되는 과정이다. 본 발명의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 개별적으로 VBASE 데이터베이스에 있는 생식계열 서열과 정렬시켜 상동성이 가장 높은 서열을 동정한다. VBASE는 GenBank 및 EMBL 데이터 라이브러리에 현재 발표된 것을 포함하여 공개된 서열로부터 수집된 모든 사람 생식계열 가변 영역 서열의 포괄적인 디렉토리이다. 상기 데이터베이스는 서열분석된 사람 항체 유전자의 보관소로서 기관[MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK)]에서 개발되었다 (웹사이트: http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-intro.php?menu=901). 본 발명의 사람 항체에 존재하는 차이를, 이러한 상이한 아미노산을 암호화하는 특정 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시켜 생식계열 서열로 복귀시킨다. 따라서 복귀돌연변이에 대한 후보로 확인된 각 아미노산을 항원 결합에 있어서의 직접적 또는 간접적 역할에 관하여 조사해야 하고, 돌연변이후 사람 항체의 임의의 바람직한 특징에 영향을 주는 것으로 밝혀진 임의의 아미노산은 최종 사람 항체에 포함시켜서는 안된다. 복귀돌연변이시키는 아미노산의 수를 최소화시키기 위하여, 제2의 생식계열 서열 내의 아미노산과 본 발명의 사람 항체의 서열 내의 아미노산이 10개 이상, 바람직하게는 12개 이상 동일하면서 등방향성(co-linear)인 경우에는, 가장 가까운 생식계열 서열과는 상이하지만 제2의 생식계열 서열 내의 상응하는 아미노산과는 동일한 것으로 밝혀진 이러한 아미노산 위치는 그대로 둘 수 있다. 복귀돌연변이는 임의의 항체 최적화의 단계에서 실시할 수 있다.
"표지된 결합 단백질"은 본 발명의 항체 또는 항체 일부가 유도체화되거나 다른 기능성 분자 (예: 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결된 단백질이다. 예를 들면, 본 발명의 표지된 결합 단백질은, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를, 다른 항체 (예: 2특이적 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 항체 또는 항체 일부와 다른 분자 (예: 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드와 같은 하나 이상의 다른 분자에 (화학적 연결, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해) 기능적으로 연결시켜 유도될 수 있다.
본 발명에 있어서, "글리코실화된 결합 단백질"은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 단백질을 포함한다. 초기의 생체내 단백질 생산에서, 해독후 변형이라고 공지된 추가적인 프로세싱이 일어날 수 있다. 특히, 당 (글리코실) 잔기가 효소에 의해 부가될 수 있고, 이러한 프로세싱은 글리코실화라고 공지되어 있다. 이렇게 생성된 공유결합된 올리고당 측쇄를 갖는 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로 공지되어 있다. 항체는 Fc 도메인 뿐만 아니라 가변 도메인에도 하나 이상의 탄수화물 잔기를 갖는 당단백질이다. Fc 도메인에 있는 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 효과기 기능에 대해서는 중요한 효과를 갖지만, 항원 결합 또는 항체의 반감기에 대해서는 최소한의 효과를 갖는다[참조: R. Jefferis, Biotechnol . Prog. 21 (2005), pp. 11-16]. 대조적으로, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 대한 효과를 가질 수 있다. 가변 도메인의 글리코실화는 아마도 입체적 방해(steric hindrance)로 인하여 항체 결합 친화도에 부정적인 효과를 갖거나[참조: Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367], 항원에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다[참조: Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723]. 또한, 결합 단백질의 O- 또는 N-연결된 글리코실화 부위가 돌연변이된 글리코실화 부위 돌연변이체를 만들 수 있다. 당업자는 표준적인 익히 공지된 기술을 사용하여 이러한 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 생물학적 활성을 유지하지만 결합 활성이 증가되거나 감소된 글리코실화 부위 돌연변이체도 고려된다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분의 글리코실화를 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 비-글리코실화된 항체 (즉, 글리코실화되지 않은 항체)를 제조할 수 있다. 글리코실화를 변화시켜, 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들면, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변화시켜 달성할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 글리코실화 부위를 제거시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 실시하여 상기 부위에서 글리코실화를 제거시킬 수 있다. 이러한 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 각각 전문이 본원에 참조로서 인용된 국제공개공보 제WO 03/016466A2호 및 미국특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 보다 상세하게 기술되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저-푸코실화된 항체 또는 이분(bisecting) GlcNAc 구조가 증가된 항체와 같이 글리코실화의 종류가 변화된 변형된 항체를 만들 수 있다. 이러한 변화된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들면, 변화된 글리코실화 기구(machinery)를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시켜 달성할 수 있다. 변화된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에서 기술되었고, 이를 숙주 세포로서 사용하여 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변화된 글리코실화를 갖는 항체를 생산할 수 있다[참조: Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 유럽특허 제EP 1,176,195호; 국제공개공보 제03/035835호 및 제WO 99/5434280호 (각각 전문이 본원에 참조로서 인용됨)].
단백질 글리코실화는 관심대상의 단백질의 아미노산 서열 뿐만 아니라 단백질이 발현되는 숙주 세포에 따라서도 달라진다. 상이한 유기체는 상이한 글리코실화 효소 (예: 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있고, 상이한 기질 (뉴클레오티드 당)을 사용할 수 있다. 이러한 요인으로 인하여, 특정 단백질이 발현되는 숙주 시스템에 따라 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성이 상이할 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기에는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민 및 시알산이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실화 패턴이 사람의 패턴이 되게 하는 글리코실 잔기를 포함한다.
단백질 글리코실화가 달라지면 단백질 특징이 달라질 수 있다는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모의 내인성 경로를 사용하여 글리코실화된 치료 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일한 단백질의 효능과 비교하여 감소될 수 있다. 이러한 당단백질은 사람에서 면역원성이면서 투여후 생체내에서 감소된 반감기를 나타낼 수도 있다. 사람 및 다른 동물의 특정 수용체가 특정한 글리코실 잔기를 인식하여 단백질이 혈류로부터 신속하게 제거되는 것을 촉진시킬 수 있다. 다른 역효과에는 단백질 폴딩, 용해도, 프로테아제에 대한 민감성, 트래피킹(trafficking), 이동, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식, 항원성 또는 알레르기성의 변화가 포함될 수 있다. 따라서, 특정한 글리코실화 조성 및 패턴 (예: 사람 세포 또는 의도된 대상 동물의 종-특이적 세포에서 생산되는 것과 동일하거나 적어도 유사한 글리코실화 조성 및 패턴)을 갖는 치료 단백질이 실시자에게 선호될 수 있다.
숙주 세포의 것과 상이한 글리코실화된 단백질의 발현은, 숙주 세포를 유전적으로 변형시켜 이종 글리코실화 효소를 발현시키는 방법으로 달성될 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 실시자는 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 비-천연 글리코실화 효소가 발현되도록 효모 균주를 유전적으로 변형시켜, 이러한 효모 균주에서 동물 세포, 특히 사람 세포의 것과 동일한 단백질 글리코실화를 나타내는 글리코실화된 단백질이 생산되었다[참조: 미국특허원 제20040018590호 및 제20020137134호 및 국제공개공보 제WO 05/100584 A2호].
또한, 당업자는 다양한 글리코실화 효소가 발현되도록 유전적으로 변형된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 관심대상의 단백질을 발현시켜, 라이브러리에 속한 숙주 세포가 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 관심대상의 단백질을 생산하게 할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이어서, 실시자는 특정한 새로운 글리코실화 패턴을 갖는 관심대상의 단백질을 선택하여 분리할 수 있다. 바람직하게는, 특별히 선택된 새로운 글리코실화 패턴을 갖는 단백질은 개선되거나 변화된 생물학적 특성을 나타낸다.
본 발명은 또한 사람 면역글로불린 좌를 포함하는 비-사람 유전자전이된 동물을 면역화시켜 비-사람, 비-마우스 동물로부터 본 발명의 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이러한 동물을 생산할 수 있다. 바람직한 양태에서, 비-사람 동물은 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말일 수 있다. 항체를 생산하는 불멸화된 하이브리도마는 면역화된 동물로부터 제조될 수 있다. 면역화시킨 후, 동물을 희생시켜 당업계에 익히 공지된 바와 같이 비장 B 세포를 불멸화된 골수종 세포에 융합시킨다[참조: Harlow and Lane, supra]. 바람직한 양태에서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다 (비-분비성 세포주). 융합 및 항생제 선별 후, 항원 (예: 글로불로머) 또는 이의 일부, 또는 관심대상의 항원을 발현하는 세포를 사용하여 하이브리도마를 스크리닝한다. 바람직한 양태에서, 초기 스크리닝은 효소-연결된 면역검정 (ELISA) 또는 방사면역검정 (RIA), 바람직하게는 ELISA를 사용하여 실시한다. ELISA 스크리닝의 예는 본원에 참조로서 인용된 국제공개공보 제WO 00/37504호에 제공되어 있다.
항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하여 클로닝하고, 강력한 하이브리도마 성장, 높은 항체 생산량 및 아래에 추가로 논의된 바람직한 항체 특징을 포함하는 바람직한 특징에 대해 추가로 스크리닝한다. 하이브리도마는 동계(syngeneic) 동물, 면역계가 없는 동물 (예: 누드 마우스(nude mouse))의 생체내에서, 또는 시험관내 세포 배양에서 배양시켜 확장시킬 수 있다. 하이브리도마를 선별하여 클로닝하고 확장시키는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 바람직하게는, 면역화된 동물은 사람 면역글로불린 유전자를 발현하는 비-사람 동물이며, 동일한 비-사람 동물 종으로부터 유래된 골수종 세포에 비장 B 세포를 융합시킨다.
한가지 양상에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료, 진단 및 예방에 사용될 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 마우스 하이브리도마이다. 다른 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비-사람, 비-마우스 종에서 생산된다. 다른 양태에서, 하이브리도마는 사람 비-분비성 골수종 세포를 글로불로머에 대한 항체를 발현하는 사람 세포와 융합시킨 사람 하이브리도마이다.
재조합 항체는, 미국특허 제5,627,052호, 국제공개공보 제WO 92/02551호 및 문헌[참조: Babcock, J.S. et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:7843-7848]에 기술된 바와 같이 당업계에서 SLAM (Selected Lymphocyte Antibody Method; 선별된 림프구 항체 방법)이라고 하는 방법을 사용하여 단일의, 분리된 림프구로부터 생성시킬 수 있다. 상기 방법에서, 관심대상의 항체를 분비하는 단일 세포 (예: 면역화된 동물로부터 유래된 림프구)는 항원-특이적 용혈 플라크 검정(hemolytic plaque assay)을 사용하여 스크리닝하며, 이때 항원 (예: 글로불로머) 또는 이의 단편을 비오틴과 같은 링커를 사용하여 양 적혈구에 연결시켜 이를 사용하여 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 분비하는 단일 세포를 확인한다. 관심대상의 항체 분비 세포를 확인한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 역 전사효소-PCR에 의해 세포로부터 수득하고 나서, 이러한 가변 영역을 적당한 면역글로불린 불변 영역 (예: 사람 불변 영역)과 함께 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 이어서, 생체내 선택된 림프구로부터 유래된 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포를, 예를 들면 형질감염된 세포를 패닝(panning)시켜 IL-18에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리하여, 시험관내에서 추가로 분석하고 선별할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 국제공개공보 제WO 97/29131호 및 제WO 00/56772호에 기술된 것과 같은 시험관내 친화도 성숙 방법에 의해서와 같이 시험관내에서 추가로 조작할 수 있다.
"키메릭 항체"라는 용어는 사람 불변 영역에 연결된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 어느 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 말한다.
"CDR-이식 항체"라는 용어는 하나 이상의 쥐의 CDR (예: CDR3)이 사람 CDR 서열로 대체된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 어느 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체를 말한다.
"사람화된 항체"라는 용어는 비-사람 종(예: 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부분이 변화되어 보다 "사람과 유사한", 즉 사람 생식계열 가변 서열과 보다 유사한 항체를 말한다. 사람화된 항체의 한가지 종류로는, 사람 CDR 서열을 비-사람 VH 및 VL 서열 속으로 도입시켜 상응하는 비-사람 CDR 서열을 대체한 CDR-이식 항체가 있다. 특히, "사람화된 항체"라는 용어는 관심대상의 항원에 면역특이적으로 결합하고, 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 골격(framework) (FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에서 사용되는 "실질적으로"라는 용어는 CDR이 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 말한다. 사람화된 항체는 하나 이상, 통상적으로 2개의 가변 도메인 (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 실질적으로 모두 포함하고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-사람 면역글로불린 (즉, 공여자 항체)의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 골격 영역은 사람 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 것이다. 바람직하게는, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 통상적으로 사람 면역글로불린의 Fc의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 양태에서, 사람화된 항체는 경쇄 뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인도 함유한다. 항체는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수도 있다. 일부 양태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 다른 양태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 특정 양태에서, 사람화된 항체는 경쇄의 사람화된 가변 도메인 및/또는 사람화된 중쇄만을 함유한다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 계열의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 비제한적인 임의의 동종형(isotype)으로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 하나 이상의 계열 또는 동종형으로부터의 서열을 포함할 수 있으며, 특정한 불변 도메인을 선택하고 당업계에 익히 공지된 기술을 사용하여 목적하는 효과기 기능을 최적화시킬 수 있다.
사람화된 항체의 골격 및 CDR 영역은 모(parental) 서열에 정확하게 상응할 필요는 없다 (예: 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의한 공여자 항체 CDR 또는 컨센서스 골격의 돌연변이유발로 인하여, 상기 부위에 있는 CDR 또는 골격 잔기가 공여자 항체 또는 컨센서스 골격에 상응하지 않게 될 수 있다). 하지만, 바람직한 양태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 통상적으로, 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 사람화된 항체 잔기가 모 FR 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다. 본원에서 사용되는 "컨센서스 골격"이라는 용어는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 골격 영역을 말한다. 또한, 본원에서 사용되는 "컨센서스 면역글로불린 서열"이라는 용어는 관련된 면역글로불린 서열의 계열에서 가장 높은 빈도로 존재하는 아미노산 (또는 뉴클레오티드)으로부터 형성된 서열을 말한다[참조: Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987]. 면역글로불린의 계열에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치에는 당해 계열에서 가장 높은 빈도로 존재하는 아미노산이 존재한다. 2개의 아미노산이 같은 빈도로 존재하는 경우에는, 둘 중 어느 하나를 컨센서스 서열에 포함시킬 수 있다.
"활성"라는 용어는 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도와 같은 활성을 포함한다.
"에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정기(determinant)를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정기는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하고, 특정 양태에서, 이는 특정한 3차원 구조적 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 결합되는 항원 영역이다. 특정 양태에서, 항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복잡한 혼합물 중에서 표적 항원을 선택적으로 인식하는 경우, 항원과 특이적으로 결합한다고 말한다.
본원에서 사용되는 "표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)"이라는 용어는, 예를 들면 BIAcore 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여 바이오센서 매트릭스(biosensor matrix) 내의 단백질 농도의 변화를 검출하여 실시간으로 생체특이적 상호작용을 분석할 수 있게 하는 광학적 현상을 말한다[참조: Jonsson, U., et al. (1993) Ann . Biol . Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol . Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal . Biochem. 198:268-277].
본원에서 사용되는 "Kon"이라는 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체가 항원에 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하는데 대한 "온 레이트(on rate)" 상수를 말한다.
본원에서 사용되는 "Koff"라는 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 "오프 레이트(off rate)" 상수를 말한다.
본원에서 사용되는 "Kd"라는 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 특정한 항체-항원 상호작용의 "해리 상수"를 말한다.
본원에서 사용되는 "표지된 결합 단백질"이라는 용어는 결합 단백질을 확인할 수 있게 하는 표지가 혼입된 단백질을 말한다. 바람직하게는, 표지는 검출가능한 마커, 예를 들면, 방사성표지된 아미노산의 혼입, 또는 표시된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩티드 (예: 광학 또는 비색분석 방법으로 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에의 부착이다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예에는 방사성동위원소 또는 방사성핵종(radionuclide) (예: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm); 형광 표지 (예: FITC, 로다민(rhodamine) 또는 란탄족 인광체(lanthanide phosphor)), 효소 표지 (예: 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 그룹; 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예: 류신 지퍼쌍(leucine zipper pair) 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인 또는 에피토프 태그); 및 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"항체 접합체"라는 용어는 치료제 또는 세포독성제와 같은 제2의 화학 잔기에 화학적으로 연결된 항체와 같은 결합 단백질을 말한다. 본원에서 사용되는 "제제"라는 용어는 화합물, 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 바람직하게는, 치료제 또는 세포독성제에는 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 뿐만 아니라, 이러한 제제의 유사체 및 동족체가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 "결정" 및 "결정화된"이라는 용어는 결정의 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 말한다. 결정은 물질의 고체 상태의 한가지 형태이다.
본원에서 "면역화"라는 용어는 면역 레퍼토리에 항원을 제시하는 과정으로서, 상기 레퍼토리는 유전적으로 비-변화된 천연 유기체, 또는 인공적인 사람 면역 레퍼토리를 나타내도록 변형된 유전자전이된 유기체에 존재한다. 유사하게, "면역원성 제제"는 항원의 면역원성을 향상시키는 애주번트 또는 다른 첨가제를 함유하는 항원의 제형이다. 이의 예로는 정제된 형태의 GLP-1 수용체를 프로인트(Freund) 완전 애주번트와 함께 마우스에 공동주사하는 것이 있을 것이다. 본원에서 정의되는 "과면역화"는 강력한 면역 반응을 일으키기 위한 목적으로 면역원성 제제 내의 항원을 숙주 동물에게 연속적으로 수차례 제시하는 행위이다.
항체의 결합 반응속도론을 측정하는 한가지 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이다. 본원에서 사용되는 "표면 플라즈몬 공명"이라는 용어는, 예를 들면 Biacore 시스템 (Biacore International, Upsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변화를 검출하여 실시간으로 생체특이적 상호작용을 분석할 수 있게 하는 광학적 현상을 말한다[참조: Jonsson et al. (1993) Annales de Biologie Clinique (Paris) 51:19-26; Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson et al. (1995) Journal of Molecular Recognition 8:125-131; 및 Johnnson et al. (1991) Analytical Biochemistry 198:268-277].
"약제학적으로 허용되는 담체"에는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 하나 이상의 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이의 조합이 포함된다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 항체 또는 항체 일부의 보관 수명 또는 유효성을 향상시키는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 필요한 용량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료학적 결과를 달성하는데 유효한 양을 말한다. 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료학적으로 이로운 효과가 더 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 필요한 용량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방학적 결과를 달성하는데 유효한 양을 말한다. 통상적으로, 예방학적 용량은 피험체에서 질병의 발생전 또는 질병 초기에 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
본 발명의 항체 및 항체 일부는, 예를 들면 비경구 투여에 적당한 약제학적 조성물 속에 혼입시킬 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 일부는 0.1 내지 250 mg/ml의 항체를 함유하는 주사가능한 용액으로 제조될 것이다. 주사가능한 용액은 플린트(flint) 또는 갈색 바이알, 앰플 또는 예비충전된 주사기 내의 액체 또는 동결건조된 투여형으로 구성될 수 있다. 완충액은 L-히스티딘 (1 내지 50mM)일 수 있고, 최적 농도는 5 내지 10mM, 최적 pH는 5.0 내지 7.0 (pH 6.0이 최적임)이다. 다른 적당한 완충액에는 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 0 내지 300mM의 농도에서 (액체 투여형의 경우 150mM이 최적임) 염화나트륨을 사용하여 용액의 독성을 변화시킬 수 있다. 동결건조된 투여형의 경우에는, 동결방지제, 주로 0 내지 10% 수크로스 (0.5 내지 1.0%가 최적임)를 포함시킬 수 있다. 다른 적당한 동결방지제에는 트레할로스 및 락토스가 포함된다. 동결건조된 투여형의 경우, 증량제, 주로 1 내지 10% 만니톨 (2 내지 4%가 최적임)을 포함시킬 수 있다. 액체 및 동결건조된 투여형의 경우, 안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌 (5 내지 10mM이 최적임)을 사용할 수 있다. 다른 적당한 증량제에는 글리신, 아르기닌이 포함되고, 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80 (0.005 내지 0.01%가 최적임)으로서 포함시킬 수 있다. 추가적인 계면활성제에는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 여기에는, 예를 들면, 액체 용액제 (예: 주사가능한 용액 및 주입가능한 용액), 분산액제 또는 현탁액제, 정제, 환제, 산제, 리포좀제 및 좌제와 같은 액체, 반고체 및 고체 투여형이 포함된다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 용도에 따라 달라진다. 통상의 바람직한 조성물은, 다른 항체를 사용하여 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사가능한 용액 또는 주입가능한 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 (예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 다른 바람직한 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 통상적으로 멸균상태여야 하고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적당한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능 용액은, 필요한 양의 활성 화합물 (즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요에 따라, 앞서 열거한 성분 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적당한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균시켜 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 기본 분산 매질 및 앞서 열거한 것 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 속에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 동결건조된 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 진공 건조 및 분사 건조에 의해 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 수득하는 것이다. 용액의 적당한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 흡수는, 흡수를 지연시키는 제제 (예: 모노스테아레이트 염 및 젤라틴)를 조성물 중에 포함시켜 지연시킬 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 부분은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있지만, 많은 치료학적 용도의 경우, 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 양태에서, 이식, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 활성 화합물을 화합물이 빠르게 방출되지 않게 할 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법은 특허를 받았거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다[참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화가능한(assimilable) 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다. 화합물 (및 경우에 따라, 기타 성분)을 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐 안에 넣어, 압축시켜 정제를 만들거나, 피험체의 식이 속에 직접 혼입시킬 수도 있다. 경구 투여의 경우, 화합물을 부형제와 함께 혼입시켜, 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁액제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 비경구 투여 이외의 방법으로 투여하기 위해서는, 불활성화를 방지하는 물질로 상기 화합물을 코팅하거나, 이러한 물질과 상기 화합물을 공동투여해야할 필요가 있을 수 있다.
보충 활성 화합물을 조성물 속에 혼입시킬 수도 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 알츠하이머병 또는 관련 질병 또는 상태를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 공동제형하고/하거나 공동투여한다. 예를 들면, 본 발명의 항체 중 하나 또는 이의 항체 일부를 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가적인 항체와 함께 공동제형하고/하거나 공동투여할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 반감기를 연장시키는 것으로 당업계에 공지된 비히클에 연결시킬 수 있다. 이러한 비히클에는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 임의의 목적상 본원에 참조로서 인용된 미국특허원 제09/428,082호 및 국제공개공보 제WO 99/25044호에 기술되어 있다.
앞서 기술한 방법 외에도, 실시자는 특정한 작제 조건 및 방법, 거대분자 (예: DNA 분자, 플라스미드 등)의 조작 및 분리, 재조합 유기체의 생성, 및 클론의 스크리닝 및 분리가 기술되어 있는 표준 참고문헌을 잘 알고 있다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, New York (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, New York (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, New York (1997)].
모노클로날 항체의 용도
본 발명의 모노클로날 항체 (예: 8F5 및 8CF)는 많은 중요한 유용성을 갖는다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 상기한 바와 같이 알츠하이머병의 예방, 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 또한, 항체는 항-항체의 개발에 사용될 수 있다. 또한, 각각의 항체를 생산하는 하이브리도마는 동일한 모노클로날 항체(즉, 시약)의 계속적인 공급원을 일정하게 생산할 수 있게 하여, 다양한 실험 및 치료 용도에서 항체 간의 동일성을 보장한다.
또한, 본 발명의 방법은, 알츠하이머병 치료용 모노클로날 항체 (또는 다른 항체)의 생산에 사용될 수 있는 추가적인 물질의 제조에 사용하기 위한 적당량의 출발 물질을 제조할 수 있게 한다. 상기한 바와 같이, 항체를 수동 면역화에 사용하여, 알츠하이머병, 또는 인지 장애와 같은 알츠하이머병의 증상과 동일한 증상이 특징인 다른 관련된 신경학적 상태를 예방할 수도 있다.
본 발명의 한가지 진단 양태에서, 본 발명의 항체 (예: 8F5) 또는 이의 일부는 고체상 위에 코팅된다 (또는 액체상 중에 존재한다). 이어서, 검사 샘플 또는 생물학적 샘플 (예: 전혈, 뇌척수액, 혈청 등)을 고체상과 접촉시킨다. 항원 (예: 글로불로머)이 샘플 중에 존재하면, 이러한 항원은 고체상 위의 항체에 결합하게 되고, 이를 직접적 또는 간접적인 방법으로 검출한다. 직접적 방법은 간단하게 복합체 자체의 존재를 검출함으로써 항원의 존재를 검출함을 포함한다. 간접적 방법에서는, 접합체를 결합된 항원에 첨가한다. 접합체는 시그날 발생 화합물 또는 표지에 부착된 2차 항체를 포함하고, 이는 결합된 항원에 결합한다. 결합된 항원에 2차 항체가 결합하면, 시그날 발생 화합물이 측정가능한 시그날을 발생시킨다. 이러한 시그날은 검사 샘플 중의 항원의 존재를 나타낸다.
진단 면역검정에 사용되는 고체상의 예로는 다공성 및 비-다공성 물질, 라텍스 입자, 자성 입자, 미세입자(microparticle)[참조: 미국특허 제5,705,330호], 비드(bead), 막, 미세역가 웰 (microtiter well) 및 플라스틱 관이 있다. 고체상 물질의 선택 및 접합체에 존재하는 항원 또는 항체를 표지하는 방법의 선택은, 경우에 따라, 원하는 검정 형식의 수행 특징에 따라 결정된다.
상기한 바와 같이, 접합체 (또는 지시 시약)는 시그날 발생 화합물 또는 표지에 부착된 항체 (또는 아마도, 검정에 따라, 항-항체)를 포함할 것이다. 상기 시그날 발생 화합물 또는 "표지"는 그 자체로 검출가능한 것이거나, 하나 이상의 추가적인 화합물과 반응하여 검출가능한 산물을 생성하는 것일 수 있다. 시그날 발생 화합물의 예에는 색원체(chromogen), 방사성동위원소 (예: 125I, 131I, 32P, 3H, 35S 및 14C), 화학발광 화합물 (예: 아크리디늄), 입자 (가시광선 또는 형광), 핵산, 착화제 또는 효소 (예: 알칼리성 포스파타제, 산 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 리보뉴클레아제)와 같은 촉매가 포함된다. 효소 (예: 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제)를 사용하는 경우, 색-, 형광- 또는 빛-발생 기질을 첨가하면 검출가능한 시그날이 발생된다. 시간분해 형광(time-resolved fluorescence), 전반사 형광(internal-reflection fluorescence), 증폭 (예: 폴리머라제 연쇄 반응) 및 라만 분광법(Raman spectroscopy)과 같은 다른 검출 시스템도 유용하다.
상기 면역검정으로 검사할 수 있는 생물학적 유체의 예에는 혈장, 전혈, 건조된 전혈, 혈청, 뇌척수액, 또는 조직 및 세포의 수성 또는 유기-수성 추출물이 포함된다.
본 발명은 또한 검사 샘플 중의 항체의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) 항체를 함유하는 것으로 의심되는 검사 샘플을, 항-항체/항체 복합체가 형성되는데 충분한 시간 및 조건 하에서, 환자 샘플 중의 항체에 대해 특이적인 항-항체와 접촉시키는 단계 (여기서, 항-항체는 환자 샘플 중의 항체에 결합하는 본 발명의 항체이다); (b) 생성된 항-항체/항체 복합체에, 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 항원(항-항체에 결합하는 항원)을 포함하는 접합체를 첨가하는 단계; 및 (d) 시그날 발생 화합물에 의해 발생된 시그날을 검출하여 검사 샘플 중에 존재할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 항-항체에 대한 항체를 포함하는 대조군 또는 보정물질(calibrator)을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 하나 이상의 항체 또는 이의 일부 및 약제학적으로 허용되는 애주번트 (예: 프로인트 애주번트 또는 인산염 완충 식염수)를 포함하는 백신을 포함한다.
키트도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 알츠하이머병, 또는 인지 장애가 특징인 다른 상태가 의심되는 환자에서 항원(예: 글로불로머)의 존재를 측정하기 위한 키트를 포함한다. 특히, 검사 샘플 중의 항원의 존재를 측정하는 키트는 a) 본원에서 정의된 항체 또는 이의 일부; 및 b) 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 2차 항체(항원에 대한 특이성을 가짐)를 포함하는 접합체를 포함한다. 키트는 항원에 결합하는 시약을 포함하는 대조군 또는 보정물질 뿐만 아니라, 키트의 구성요소 및 키트를 사용하는 방법이 상세히 설명된 지침서를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 검사 샘플 중의 항체를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 a) 관심대상의 항체에 대해 특이적인 항-항체 (예: 본 발명의 항-항체 중 하나), 및 b) 앞서 정의된 항원 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 항원에 결합하는 시약을 포함하는 대조군 또는 보정물질도 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 키트는 a) 항체에 대해 특이적인 항-항체 (예: 본 발명의 항-항체 중 하나), 및 b) 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 항원(예: 글로불로머)을 포함하는 접합체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 키트는 항원에 결합하는 시약을 포함하는 대조군 또는 보정물질도 포함할 수 있고, 키트의 구성요소 및 키트를 사용하는 방법이 기술된 지침서 또는 제품내 설명서도 포함할 수 있다.
키트는 미리 만들어진 고체상을 함유하는 바이알, 병 또는 스트립(strip)과 같은 하나의 용기, 및 각각의 접합체를 함유하는 다른 용기를 포함할 수도 있다. 상기 키트는 세척, 프로세싱 및 지시 시약과 같이 검정을 수행하는데 필요한 다른 시약을 함유하는 바이알 또는 용기를 함유할 수도 있다.
본 발명은 상기한 전체 길이 항체 뿐만 아니라, 이의 일부 또는 단편 (예: 이의 Fab 부분)도 포함한다는 점을 유의하여야 한다. 또한, 본 발명은, 예를 들면 결합 특이성, 구조 등의 관점에서 본 발명의 항체와 동일한 특성을 갖는 임의의 항체를 포함한다.
수탁 정보: 모노클로날 항체 8F5를 생산하는 하이브리도마 (ML5-8F5.1F2.2A2)는 부다페스트 조약에 따라 2005년 12월 1일에 ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110)에 기탁되었고, ATCC 번호 PTA-7238을 부여받았다.
모노클로날 항체 8C5를 생산하는 하이브리도마 (ML5-8C5.2C1.8E6.2D5)는 부다페스트 조약에 따라 2006년 2월 28일에 ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110)에 기탁되었고, ATCC 번호 PTA-7407을 부여받았다.
실시예
다음의 비제한적 실시예를 사용하여 본 발명을 설명할 수 있다:
실시예 I(a)
모노클로날 항체 8F5 및 8 C5 의 생산
Balb/c 마우스를 문헌[참조: Barghorn et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847]에 기술된 바와 같이 CFA[판매원: Sigma] 중의 50㎍의 A-베타(1-42) 글로불로머로 서브큐(sub-q) 면역접종하고 1개월 간격으로 2회 추가접종하였다. 비장을 수거하여 PEG 방법으로 비장 세포를 마우스 골수종 SP2/0 세포와 5:1의 비로 융합시켰다. 융합 세포를 96-웰 디쉬에서 웰 당 200ml의 아자세린/하이포크산틴 선별 배지에 2x105 세포/ml로 평판배양하였다. 콜로니 형성이 관찰되도록 세포를 성장시키고 직접 ELISA 검정으로 상청액을 A-베타 소중합체 반응성에 대해 검정하였다. A-베타 소중합체에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마를, 항체 발현이 안정적인 것으로 보일 때까지 제한희석(limiting dilution)으로 서브클로닝하였다.
실시예 II
Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42)의 단량체 제제와 비교한 8F5 및 8 C5 의 선택적인 글로불로머 결합
8F5의 선택성을 검사하기 위하여, 상이하게 용해된 2개의 Aβ(l-42) 단량체 제제 뿐만 아니라, 단량체에 대한 대용물로서 새롭게 제조한 Aβ(l-40)을 사용하였다. 두 종류의 실험을 실시하였다. 첫번째 실험에서는, 글로불로머로부터 유래되었지만 이형태체(conformer)인 비-특이적 MAb 6G1을 포획 항체(capture antibody)로서 사용하여 샌드위치-ELISA로 Aβ 글로불로머 선택성에 대해 8F5를 검사하였다[참조: S. Barghorn et al. J. Neurochemistry, 95:834 (2005)]. 비오티닐화된 8F5를 제2 및 이형태체 선택적 항체로서 사용하였다. 이 실험은 아래의 실시예 2.1에 기술되어 있다.
아래의 실시예 2.2에 기술된 두번째 예에서는, Aβ(1-42) 단량체 및 Aβ(1-40) 단량체에 대한 소중합체 선택성을 닷-블롯(dot-blot) 면역검정으로 검사하였다. 이 실험에서, 8F5는 (8F5와 유사한 영역에 매핑(mapping)되지만 선형 펩티드 Aβ(17-24)를 사용한 면역화로부터 유래된 공지된 항체인 4G8 (판매원: Abcam Ltd., Cambridge, MA)과 비교하여) Aβ(l-42) 단량체 및 Aβ(l-40) 단량체와 비교하여 Aβ(l-42) 글로불로머에 대한 선택적인 결합을 나타내었다. 8C5를 8F5와 동일한 프로토콜에서 검사하였다.
실시예 2.1: 모노클로날 항체 8F5 및 8 C5 의 소중합체 선택성
a) Aβ(l-42) 글로불로머의 제조
9mg의 Aβ(l-42)[판매원: Fa. Bachem]를 1.5ml의 HFIP (1,1,1,3,3,3-헥사플루오르-2-프로판올) 중에 용해시켜 1.5시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 용액을 SpeedVac에서 증발시키고 396㎕의 DMSO (5mM Aβ 원액) 중에 현탁시켰다. 샘플을 초음파 수조에서 20초 동안 초음파처리하고, 10분 동안 진탕한 후, 하룻밤 동안 -20℃에서 보관하였다.
샘플을 4.5ml의 PBS (20mM NaH2PO4; 140mM NaCl; pH 7.4)로 희석시키고 0.5ml의 2% 수성 SDS 용액을 첨가하였다 (0.2% SDS 함량). 혼합물을 7시간 동안 37℃에서 항온처리하고, 16ml의 H2O로 희석하여, 16시간 동안 37℃에서 추가로 항온처리하였다. 그 후, Aβ(1-42) 글로불로머 용액을 20분 동안 3000g에서 원심분리하였다. 30KDa Centriprep으로 상청액을 0.5ml로 농축시켰다. 농축액을 5mM NaH2PO4; 35mM NaCl (pH7.4)에 대해 하룻밤 동안 6℃에서 투석하였다. 이어서, Aβ(1-42) 글로불로머 농축액을 10분 동안 10000g에서 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 분취하여 -20℃에서 보관하였다.
b) HFIP 예비처리된 단량체 Aβ(1-42)의 제조
3mg의 사람 Aβ(l-42) (판매원: Bachem Inc, 카탈로그 번호 H-1368)를 1.7ml Eppendorff 관에서 0.5ml의 HFIP (6mg/ml 현탁액) 중에 용해시키고, 용액이 투명해질 때까지 1.5시간 동안 37℃에서 진탕하였다 (Eppendorff Thermo mixer, 1400 rpm). 샘플을 speed vac 농축기에서 건조시키고 (1.5 시간), 13.2㎕의 DMSO 중에 재현탁시켜, 10초 동안 진탕하고 나서, 초음파조에서 초음파처리하고 (20초), 10분 동안 진탕하였다 (예: Eppendorff Thermo mixer에서 1400 rpm으로).
6ml의 20mM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.1% Pluronic F68 (pH 7.4)을 첨가하여 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 샘플을 20분 동안 3000g에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 0.6ml의 20mM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 1% Pluronic F68 (pH 7.4) 중에 용해시켰다. 3.4ml의 물을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하고 나서, 20분 동안 3000g에서 원심분리하였다. 상청액의 8 x 0.5ml의 분취액을 -20℃에서 보관하였다.
c) NH4OH 중의 단량체 Aβ(1-42)의 제조
1mg의 Aβ(l-42) 고체 분말(판매원: Bachem Inc., 카탈로그 번호 H-1368)을 0.5ml의 0.1% NH4OH 수용액 (새롭게 제조함) 중에 용해시키고 (2mg/ml), 즉시 30초 동안 실온에서 진탕하여 투명한 용액을 얻었다. 이후의 사용을 위하여 샘플을 -20℃에서 보관하였다.
d) 단량체 Aβ(1-40)의 제조
1mg의 사람 Aβ(l-40) (판매원: Bachem Inc, 카탈로그 번호 H-1194)을 Eppendorff 관에서 0.25ml의 HFIP (4mg/ml 현탁액) 중에 현탁시켰다. 관을 1.5시간 동안 37℃에서 진탕하여 (예: Eppendorff Thermo 혼합기에서 1400rpm으로) 투명한 용액을 얻은 후, speed vac 농축기에서 건조시켰다 (1.5시간). 샘플을 46㎕의 DMSO (21.7 mg/ml 용액) 중에 재용해시키고, 10초 동안 진탕하고 나서, 초음파조에서 20초 동안 초음파처리하였다. 10분 동안 진탕한 후 (예: Eppendorff Thermo 혼합기에서 1400rpm으로), 이후의 사용을 위하여 샘플을 -20℃에서 보관하였다.
e) 항-Aβ 마우스 Mab 8F5의 비오티닐화
PBS 중의 500㎕의 항-Aβ 마우스 Mab 8F5 (0.64mg/ml)를, 수중에 새롭게 용해시킨 2㎕의 20mg/ml Sulfo-NHS-Biotin (판매원: Pierce Inc., 카탈로그 번호 21420)에 첨가하여, 30분 동안 진탕하고 (예: Eppendorff Thermo 혼합기에서 1400rpm으로), 투석관에서 500ml의 2OmM Na Pi; 14OmM NaCl (pH 7.4)에 대해 16시간 동안 6℃에서 투석하였다. 이후의 사용을 위하여 투석액을 -20℃에서 보관하였다. 마찬가지로 8C5를 비오티닐화시켰다.
f) Aβ 샘플에 대한 샌드위치-ELISA
g) 시약 목록
1. F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate (카탈로그 번호 439454)
2. 결합 항체:
PBS 중에 용해된 항-Aβ 마우스 MAb 6G1; 농도: 0.4mg/ml; -20℃에서 보관
3. 코팅 완충액:
10OmM 탄산수소나트륨; pH 9.6
4. ELISA용 차단 시약:
판매원: Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 1112589
5. PBST-완충액:
2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20; pH 7.4
6. 소 알부민 분획 V (프로테아제-무함유):
판매원: Serva, 카탈로그 번호: 11926.03; 4℃에서 보관
7. PBST + 0.5% BSA-완충액:
2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20; pH 7.4 + 0.5% BSA
8. Aβ(l-42)-글로불로머 표준 원액:
5mM NaH2PO4; 35mM NaCl (pH7.4) 중의 용액; 농도: 10.77mg/ml; -20℃에서 보관
9. HFIP 처리된 Aβ(l-42) 단량체 표준 원액:
3mM NaH2PO4; 21mM NaCl; 0.15% Pluronic F68 (pH 7.4) 중의 용액; 농도: 0.45mg/ml; -20℃에서 보관
10. NH4OH 중의 Aβ(l-42) 단량체 표준 원액:
0.1% NH4OH 중의 용액; 농도: 2mg/ml; -20℃에서 보관
11. HFIP 처리된 Aβ(l-40) 단량체 표준 원액:
DMSO 중의 용액; 농도: 21.7mg/ml; -20℃에서 보관
12. 비오티닐화된 항-Aβ 마우스 mAb 클론 8F5:
PBS 중의 용액; 농도: 0.24mg/ml; -80℃에서 보관
13. 스트렙타비딘-POD 접합체:
판매원: Fa. Roche, 카탈로그 번호 1089153
14. 염색:
TMB; 판매원: Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 92817060; DMSO 중의 42mM; 수중의 3% H2O2; 100mM 아세트산나트륨 (pH 4.9)
15. 2M 설폰산 용액을 첨가하여 염색을 정지시킴
시약의 제조:
다음의 프로토콜을 사용하였다:
1. 결합 항체
mMAb 6G1 원액을 해동시켜 코팅 완충액 중에 1:400으로 희석시킨다.
2. 차단 시약
차단 시약을 100ml의 물에 용해시켜 차단 원액을 제조하여 10ml의 분취액을 -20℃에서 보관한다. 차단시킬 각각의 플레이트에 대해 3ml의 차단 원액을 27ml의 물로 희석시킨다.
3. Aβ 표준 용액
a) Aβ(1-42)-글로불로머
- 1㎕의 Aβ(1-42)-글로불로머 표준 원액을 1076㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 10㎍/ml
- 50㎕의 10㎍/ml Aβ(1-42)-글로불로머 표준 용액을 4950㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 100ng/ml
b) HFIP 처리된 Aβ(1-42) 단량체
- HFIP 예비처리된 10㎕의 Aβ(1-42) 단량체 표준 원액을 440㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 10㎍/ml
- HFIP 예비처리된 50㎕의 10㎍/ml Aβ(1-42) 단량체 표준 용액을 4950㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 100ng/ml
c) NH4OH 중의 Aβ(1-42)
- NH4OH 중의 5㎕의 Aβ(1-42) 단량체 표준 원액을 995㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 10㎍/ml
- NH4OH 중의 50㎕의 10㎍/ml Aβ(1-42) 단량체 표준 용액을 4950㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 100ng/ml
d) HFIP 예비처리된 Aβ(1-40) 단량체
- HFIP 예비처리된 1㎕의 Aβ(1-40) 단량체 표준 원액을 49㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 430㎍/ml
- HFIP 예비처리된 10㎕의 430㎍/ml Aβ(1-40) 단량체 표준 용액을 420㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 10㎍/ml
- HFIP 예비처리된 50㎕의 10㎍/ml Aβ(1-40) 단량체 표준 용액을 4950㎕의 PBST + 0.5% BSA에 첨가한다 = 100ng/ml
표준 곡선:
Figure pat00001

1. 1차 항체: 비오티닐화된 mMAb 8F5
농축된 비오티닐화된 항-Aβ mAb 8F5를 PBST + 0.5% BSA-완충액 중에 희석시켰다. 희석배수는 1/1200 = 0.2㎍/ml이었다. 항체를 즉시 사용하였다.
2. 표지 시약
스트렙타비딘-POD 접합체 동결건조물을 0.5ml의 물에 재구성시킨다. 500㎕의 글리세롤을 첨가하고, 이후의 사용을 위하여 100㎕의 분취액을 -20℃에서 보관한다. 농축된 표지 시약을 PBST-완충액 중에 희석시킨다. 희석배수는 1/10000이다. 즉시 사용한다.
3. 염색 용액 TMB
20ml의 100mM 아세트산나트륨(pH 4.9)과 200㎕의 TMB 용액 및 29.5㎕의 3% 과산화물 용액을 혼합한다. 즉시 사용한다.
샘플 플레이트 구성 (모든 표준용액을 2중으로 사용한다는 점을 유의하여야 한다)
Figure pat00002

사용된 방법:
1. 웰 당 100㎕의 항-Aβ mMAb 6G1 용액을 가하여 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리한다.
2. 항체 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
3. 웰 당 260㎕의 차단 용액을 첨가하여 2시간 동안 실온에서 항온처리한다.
4. 차단 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
5. 표준용액을 제조한 후, 웰 당 100㎕의 표준용액을 플레이트에 가한다. 2시간 동안 실온에서 항온처리하고 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리한다.
6. 표준 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
7. 웰 당 200㎕의 비오티닐화된 1차 항체 8F5 용액을 첨가하여 1.5시간 동안 실온에서 항온처리한다.
8. 항체 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
9. 웰 당 200㎕의 표지 용액을 첨가하여 1시간 동안 실온에서 항온처리한다.
10. 표지 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
11. 각각의 웰에 100㎕의 TMB 용액을 첨가하여 실온에서 항온처리한다 (5 내지 15분).
12. 염색을 관찰하여, 배경 염색이 시작된 후에, 웰 당 50㎕의 정지 용액을 가한다.
13. 450nm에서 UV 판독한다.
14. 표준 곡선으로부터 결과를 계산한다.
15. 평가한다.
항체 8F5의 결과는 도 1에 제시되어 있고 항체 8C5의 결과는 도 8에 제시되어 있다. Log EC50 값은, 상이하게 제조된 2개의 Aβ(1-42) 단량체 (각각 2.745 및 3.003) 및 Aβ(1-40) 단량체(2.825)의 경우와 비교하여, Aβ(l-42) 글로불로머 항원의 경우 유의적으로 가장 낮았다 (1.958). 이러한 데이터는 Aβ(1-42) 글로불로머 대 Aβ(1-42) 단량체에 대한 항체 8F5의 선택성이 약 10배라는 것을 나타낸다. 항체 8C5의 경우에도 거의 동일한 결과가 얻어졌고 이는 도 8에 제시되어 있다.
실시예 2.2: 모노클로날 항체 8F5 및 8 C5 의 소중합체 선택성
- 닷-블롯(dot-blot) 방법에 의한 Aβ 글로불로머에 대한 Aβ 단량체의 차등: 8F5 및 8C5 대 4G8의 비교.
PBS 중의 Aβ(l-42) 글로불로머, Aβ(l-42) 단량체 및 Aβ(l-40) 단량체의 단계적 희석액을 100pmol/㎕ 내지 0.01pmol/㎕의 범위로 제조하였다. 각각의 샘플 중에서, 1㎕를 니트로셀룰로스막 위에 떨어뜨렸다. 마우스 모노클로날 항체 4G8 및 8F5 (0.2㎍/ml)와 함께, 알칼리성 포스파타제에 연결된 2차 항체로서의 항-마우스 IgG 및 염색 시약 NBT/BCIP[판매원: Roche Diagnostics, Mannheim]를 사용하여 검출하였다. 10pmol의 항원 농도에서 농도계(GS 800, Biorad, Hercules, CA, USA)를 통해 검출 시그날의 강도 (반사 밀도; RD = Reflective Density)를 분석하였다. 상기 농도에서 모든 Aβ 형태의 경우에, 측정된 반사 밀도는 농도계 검출의 선형 범위 내에 있었다. 다른 항체인 8C5를 유사한 프로토콜에서 사용하였다. 결과를 아래의 표 1에 제시한다:
Figure pat00003
특히, 상기 결과는 Aβ(17-24) (즉, 선형 서열)에 매핑되는 4G8에 대한 시판되는 항-Aβ(1-42) 항체와 비교하여, 8F5 및 8C5가 상이한 결합 프로파일을 보인다는 것을 나타낸다. 보다 구체적으로, 8F5 및 8C5는 Aβ42 단량체와 비교하여 글로불로머 결합에 대한 선택성을 보일 뿐만 아니라 (4열(列)을 참조; 1.4 대 1), Aβ40과 비교하여도 글로불로머 결합에 대한 선택성을 보인다 (5열을 참조; 16.9 대 4.2). 표준 4G8보다 향상된 이러한 두 결합 선택성으로 인하여, 8F5 및/또는 8C5의 사용시 상기한 부작용(예: 플라크 결합)이 더 적게 발생할 것이다.
실시예 III
Aβ(1-42) 원섬유에 대한 8F5 및 8 C5 의 결합
8F5 항체는 가용성 글로불로머에 대해 생성되었기 때문에, 8F5는 침착된 플라크 또는 원섬유 물질에는 결합하지 않을 것이라고 가설을 세웠다. 따라서, 중합된 Aβ 원섬유 현탁액에 대한 8F5의 결합을 다음의 실시예에 기술한 바와 같이 검사하였다.
Aβ(1-42) 원섬유의 제조
1mg의 Aβ(1-42) (판매원: Bachem Inc., 카탈로그 번호: H-1368)를 500㎕의 수성 0.1% NH4OH 중에 용해시키고(Eppendorff 관), 샘플을 1분 동안 실온에서 교반하고 나서, 5분 동안 10000g에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 Eppendorff 관 속으로 피펫팅하여, 브래드포드(Bradford) 단백질 농도 검정 (BIO-RAD Inc. 검정 방법)에 따라 Aβ(1-42)의 농도를 측정하였다.
상기의 새로 제조한 Aβ(l-42) 용액 100㎕를 300㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl (pH 7.4)로 중화시키고 나서, 2% HCl을 사용하여 pH 7.4로 조절하였다. 샘플을 추가로 20시간 동안 37℃에서 항온처리하고 원심분리하였다 (10분, 10000g). 상청액을 폐기하고, 1분 동안 Vortex 혼합기로 교반하면서 원섬유 펠릿을 400㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl (pH 7.4)로 재현탁시키고 나서, 원심분리하였다 (10분, 10000g). 상청액을 폐기한 후, 상기 재현탁 과정을 반복하고, 다시 원심분리하여(10분, 10000g) 최종 원섬유 현탁액을 스핀다운(spin down)시켰다. 상청액을 다시 한번 폐기하고, 최종 펠릿을 Vortex 혼합기에서 1분 동안 교반하면서 380㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl (pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 샘플의 분취액을 냉동고 안에서 -20℃에서 보관하였다.
80㎕의 원섬유 현탁액을 320㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20 (pH 7.4) 완충액과 혼합하여, 5분 동안 실온에서 교반하고 나서, 초음파처리하였다 (20초). 원심분리 (10분, 10000g) 후, Vortex 혼합기에서 교반하면서 펠릿을 190㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20 (pH 7.4)으로 재현탁시켰다.
Aβ(1-42) 원섬유에 대한 항체의 결합
상기 원섬유 현탁액의 10㎕ 분취액을,
a) 10㎕의 2OmM Na Pi; 14OmM NaCl (pH 7.4)
b) 20mM NaH2PO4; 14OmM NaCl (pH 7.4) 중의 lO㎕의 O.l㎍/㎕ mMAb 6E10 (판매원: Signet Inc., 카탈로그 번호: 9320)
c) 2OmM Na Pi; 14OmM NaCl (pH 7.4) 중의 10㎕의 0.1㎍/㎕ mMAb 4G8 (판매원: SignetInc., 카탈로그 번호: 9220)
d) 2OmM Na Pi; 14OmM NaCl (pH 7.4) 중의 10㎕의 0.1㎍/㎕ mMAb 8F5 (8C5)
와 함께 항온처리하였다.
샘플을 20시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 최종적으로 샘플을 원심분리하였다 (10분, 10000g에서). 비-결합된 항체 분획을 함유하는 상청액을 수거하여, 20㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합시켰다. Vortex 혼합기에서 1분 동안 교반하면서 펠릿 분획을 50㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl (pH 7.4) 완충액으로 세척하고 나서 원심분리하였다 (10분, 10000g). 최종 펠릿을 20㎕의 2OmM Na Pi; 14OmM NaCl; 0.025% Tween 20 (pH 7.4) 완충액 중에 재현탁시켜 20㎕의 SDS-PAGE 완충액 중에 용해시켰다.
SDS - PAGE 분석
상청액 및 재현탁된 펠릿 샘플을 5분 동안 98℃에서 가열하여, 다음의 조건 하에서 4 내지 20% 트리스(Tris)/글리신 겔 상에 로딩(loading)하였다:
SDS-샘플 완충액: 0.3g의 SDS; 0.77g의 DTT; 4ml의 1M Tris/HCl (pH 6.8); 8ml의 글리세롤; 에탄올 중의 1% 브롬페놀블루 1ml; 물을 첨가하여 50ml가 되게 함; 4 내지 20% 트리스/글리신 겔 (판매원: Invitrogen Inc., 제품번호: EC6025BOX)
전개 완충액: 7.5g의 트리스; 36g의 글리신; 2.5g의 SDS; 물을 첨가하여 2.5l가 되게 함
PAGE를 20mA에서 전개시켰다. 겔을 Coomassie Blue R250으로 염색하였다.
결과
SDS-PAGE의 Coomassie 염색 결과, 항체의 중쇄 및 경쇄는 원섬유 현탁액의 상청액 중에 주로 존재하고 (도 2의 7번 레인), 나머지 원섬유 현탁액에는 항체 물질이 거의 없는 것으로 나타났으며, 또한 4.5 kDa에서 부분적으로 해중합된 Aβ가 보였다. 8F5 및 8C5와 대조적으로, 다른 항-Aβ 항체는, 원섬유 결합된 분획 (도 2의 6번 레인)과 비교하여, 가용성 분획에서는 보이지 않거나 (6E10, 도 2의 3번 레인) 일부분만 보였다 (4G8, 도 2의 5번 레인).
원섬유형 Aβ에 대한 상대적인 결합을, 원섬유 결합된 분획 및 상청액 분획 중의 항체의 중쇄로부터 반사 밀도 값을 측정하여 SDS-PAGE 분석으로부터 평가하고 다음의 식에 따라 계산하였다:
원섬유 결합된 Ab 분획 = RD원섬유 분획 x100% / (RD원섬유 분획 + RD상청액 분획)
다음의 값을 얻었다:
Figure pat00004
상기 데이터는 표준 항체인 6E10과 비교하여, 결합된 8F5 및 8C5의 유의적인 감소를 나타낸다.
실시예 IV
Aβ(1-40)과 비교한 내인성 Aβ(1-42) 글로불로머의 선택적인 결합
Aβ의 소중합체 개념을 토대로 하여, 항-Aβ 소중합체 항체도 생체내에서, 특히, 경증 인지 장애 및 AD 환자에서 Aβ(1-40)과 비교하여, Aβ(1-42) 소중합체에 대한 선택적인 결합을 나타낼 수 있다는 것이 중요하다. Aβ(1-42) 종류를 Aβ(1-40) 보다 감소시키는 개념은 NSAID를 통한 AD 치료를 위한 치료학적 접근법에서 사용된다[참조: Weggen et al., Nature 414, 212-216 (2001)]. Aβ(l-40)과 비교하여 Aβ(l-42)를 감소시키는 NSAID는 알츠하이머병의 치료에서 가장 우수한 효능을 나타낸다고 생각된다. Aβ(1-42) / Aβ(1-40) 비는 선택적 치료법에서 뿐만 아니라 진단 목적으로도 중요하다.
알츠하이머병 환자 및 MCI 환자로부터의 CSF 샘플을 사용하여 분석을 실시하였다. 도 3에 제시되어 있고 아래에 기술되어 있는 결과로부터, 8F5는 덜 응집되는 Aβ(l-40)보다 높은 비의 Aβ(l-42)를 검출하므로 8F5는 6E10과 같은 Aβ 항체보다 중요한 장점을 갖는다고 결론을 내릴 수 있다. 이러한 장점은 MCI 및 AD 환자에서 Aβ(l-42)형 소중합체를 보다 선택적으로 진단하여 중화시킬 수 있게 할 것이다.
A) 소중합체 선택적 항-Aβ 쥐 MAb 8F5를 사용한 면역침전 후 MCI 및 AD 환자의 CSF 중의 내인성 아밀로이드 β(1-42) 및 아밀로이드 β(1-40)의 수준
CNBr -활성화된 세파로스 ( Sepharose ) 4B에의 항-Aβ mMAb 의 고정화
a) mMAb 6E10 (판매원: Signet Inc., 카탈로그 번호: 9320)
b) mMAb 8F5
0.4g의 CNBr-활성화된 세파로스 4B (판매원: Amersham Pharmacia Bio-tech AB, Uppsala, Sweden, Inc., 제품번호: 17-0430-01)를 10ml의 수성 1mM HCl에 첨가하여 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. CNBr-활성화된 세파로스 4B를 10ml의 1mM HCl로 3회 세척하고, 10ml의 100mM NaHCO3; 50OmM NaCl (pH 8.3)로 2회 세척하였다. 각각의 고정화된 항체에 대하여, 100㎕의 CNBr-활성화된 세파로스 4B 매트릭스를 lOOmM NaHCO3; 50OmM NaCl (pH 8.3) 중의 950㎕의 0.5mg/ml 항-Aβ mMAb 용액에 첨가하였다. 2시간 동안 실온에서 진탕한 후, 샘플을 5분 동안 10000g에서 원심분리하였다. 이어서, 500㎕의 10OmM 에탄올아민; 10OmM NaHCO3; 50OmM NaCl (pH 8.3) 완충액을 비드(bead)에 첨가하고, 샘플을 1시간 동안 실온에서 진탕하였다. 항-Aβ mMAb-세파로스 샘플을 5분 동안 10000g에서 원심분리하고, 500㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl (pH 7.4)로 5회 세척하였다. 6℃에서 보관하기 전, 아지드화나트륨을 첨가하여 최종 농도가 0.02%가 되게 하여 샘플을 안정화시켰다.
면역침전
a) mMAb 6E10-세파로스
b) mMAb 8F5-세파로스
200㎕의 사람 뇌척수액 샘플을 200㎕의 2OmM NaH2P04; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20 (pH 7.4)으로 희석시켰다. 상기 샘플을 2㎕의 항-Aβ mMAb-세파로스 매트릭스에 첨가하여 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 샘플을 5분 동안 10000g에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 항-Aβ mMAb-세파로스를 50㎕의 PBS로 2회 세척하여 1분 동안 교반하고 원심분리하였다 (5분, 10000g). 상청액을 폐기하고, 세파로스 비드를 50㎕의 2mM NaH2P04; 14mM NaCl (pH 7.4) 중에 현탁시키고 나서, 1분 동안 실온에서 교반하고 5분 동안 10000g에서 원심분리하였다. 다음 단계에서, 항-Aβ mMAb-세파로스 비드를 50㎕의 50% CH3CN; 0.2% TFA 수용액으로 처리하였다. 10분 동안 실온에서 진탕한 후, 샘플을 5분 동안 10000g에서 원심분리하였다. 상청액을 수거하여 1.5ml Eppendorf 관으로 이동시켰다. 샘플을 50㎕의 물과 혼합하여 Speed Vac 농축기에서 증발시켰다. 펠릿을 4㎕의 70% HCOOH 중에 재용해시켜 10분 동안 실온에서 진탕하고 76㎕의 1M 트리스 용액 및 720㎕의 2OmM NaH2P04; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20 (pH 7.4)으로 중화시켰다.
CSF 중의 Aβ(1-40); (1-42) 단량체 형태의 측정을 위한 샘플
a) 면역침전 전 CSF 샘플 중의 Aβ의 함량
158㎕의 CSF를 342㎕의 2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20 (pH 7.4)으로 희석시켰다. 이 1:3.16 희석액을 샌드위치 ELISA에 사용하였고 평가하는 동안 이 희석비를 고려하였다.
b) 면역침전 후 CSF 샘플 중의 Aβ의 함량
앞서 언급한 방법으로부터의 샘플을 분석에 사용하였다.
CSF 중의 Aβ(1-40)의 측정에 사용된 샌드위치- ELISA 프로토콜
시약 목록:
1. F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate (카탈로그 번호: 439454)
2. 결합 항체:
항-Aβ mAb 클론 6E10; 판매원: Signet, 카탈로그 번호: 9320; 농도: 0.4mg/ml Bradford (BioRad); -2O℃에서 보관
3. 결합 완충액:
10OmM 탄산수소나트륨 (pH 9.6)
4. ELISA용 차단 시약:
판매원: Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 1112589
5. PBST-완충액:
2OmM NaH2P04; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20; pH 7.4
6. Aβ (1-40) 표준:
Aβ(l-40) 고체 분말; 판매원: Bachem, 카탈로그 번호: H-1194; -20℃에서 보관
7. 1차 항체:
항-Aβ(1-40) 래빗 pAb; 친화도 정제됨; PBS 중의 용액; 농도: 0.039mg/ml; 판매원: Signet, 카탈로그 번호: 9130-005; -20℃에서 보관
8. 표지 시약:
항-래빗-POD 접합체; 판매원: Fa.Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호: 111-036-045
9. 염색:
TMB; 판매원: Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 92817060; DMSO 중의 42mM; 수중의 3% H2O2; 10OmM 아세트산나트륨 (pH 4.9)
10. 정지 용액:
2M 설폰산
시약의 제조에 사용된 프로토콜
1. 결합 항체:
항-Aβ mAb 6E10 (판매원: Signet Inc, 카탈로그 번호: 9320)을 희석시켜 최종 농도가 0.7㎍/ml가 되게 한다.
2. 차단 시약:
차단 원액의 제조를 위하여 차단 시약을 100ml의 H2O 중에 용해시켜 10ml의 분취액으로 각각 -20℃에서 보관한다. ELISA 플레이트 하나를 차단시키는데 사용하기 위하여 3ml의 차단 원액을 27ml의 H2O로 희석시킨다.
3. Aβ(1-40) 단량체 형태 표준 희석액:
A) Aβ(1-40) 단량체 표준 원액: 0.5mg의 Aβ(1-40)을 250㎕의 0.1% NH4OH 중에 용해시킴, 농도: 2mg/ml; 새롭게 제조함; 즉시 사용한다.
B) 5㎕의 Aβ(1-40) 단량체 표준 원액을 995㎕의 PBST에 첨가한다 = lO㎍/ml
C) 5㎕의 10㎍/ml Aβ(1-40) 단량체 표준 용액을 4995㎕의 PBST에 첨가한다 = 10ng/ml
표준 곡선:
Figure pat00005

샘플:
IP : 면역침전물 샘플
Figure pat00006

4. 1차 항체:
농축된 항-Aβ(1-40) pAb를 PBST 완충액 중에 희석시킨다. 희석배수는 1/200이다 = 0.2㎍/ml. 즉시 사용한다.
5. 2차 항체:
동결건조된 항-래빗-POD 접합체를 0.5ml의 H2O 중에 용해시켜 500㎕의 글리세롤과 혼합시킨다. 이어서, 항체 농축액을 100㎕의 분취액으로 -20℃에서 보관한다. 농축액을 PBST 완충액 중에 1:10,000으로 희석시킨다. 항체 용액은 즉시 사용한다.
6. TMB 용액:
20ml의 100mM 아세트산나트륨 (pH 4.9)을 200㎕의 TMB 용액 및 29.5㎕의 3% 과산화수소와 혼합시킨다. 이 용액은 즉시 사용한다.
샘플 플레이트 구성 (모든 표준용액 및 샘플을 2중으로 사용한다는 점을 유의하여야 한다)
Figure pat00007

사용된 방법
1. 웰 당 100㎕의 결합 항체 용액을 가하여 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리한다.
2. 항체 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
3. 웰 당 260㎕의 차단 용액을 첨가하여 2시간 동안 실온에서 항온처리한다.
4. 차단 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
5. 표준용액 및 샘플을 제조한 후, 웰 당 100㎕의 표준용액 및 샘플을 플레이트에 가하여 2시간 동안 실온에서 항온처리하고 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리한다.
6. 표준용액/샘플용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
7. 웰 당 200㎕의 1차 항체 용액을 첨가하여 1.5시간 동안 실온에서 항온처리한다.
8. 항체 용액을 폐기하고 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
9. 웰 당 200㎕의 표지 용액을 첨가하여 1시간 동안 실온에서 항온처리한다.
10. 표지 용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
11. 100㎕의 TMB 용액을 각각의 웰에 첨가하여 실온에서 항온처리한다 (5 내지 15분).
12. 발색이 관찰되면 웰 당 50㎕의 정지 용액을 가한다.
13. 450nm에서 판독한다.
14. 표준 곡선으로부터 결과를 계산한다.
15. 평가:
미지의 샘플로부터의 흡광값이 보정 곡선의 선형 범위 내에 있지 않으면, 적당한 샘플 희석액을 사용하여 ELISA를 반복한다.
CSF 중의 Aβ(1-42) 단량체 형태의 측정에 사용된 샌드위치- ELISA 프로토콜
시약 목록:
1. F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate (카탈로그 번호: 439454)
2. 결합 항체:
항-Aβ mAb 클론 6E10; 판매원: Signet, 카탈로그 번호: 9320; 농도: 0.4mg/ml Bradford (BioRad); -20℃에서 보관
3. 코팅 완충액:
10OmM 탄산수소나트륨 (pH 9.6)
4. ELISA용 차단 시약:
판매원: Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 1112589
5. PBST-완충액:
2OmM NaH2PO4; 14OmM NaCl; 0.05% Tween 20; pH 7.4
6. Aβ(l-42) 표준:
Aβ(l-42) 고체 분말; 판매원: Bachem, 카탈로그 번호: H-1368; -20℃에서 보관
7. 1차 항체:
항-Aβ(1-42) 래빗 pAb; 친화도 정제됨; 비오티닐화됨; 50% 글리세롤을 함유하는 PBS 중의 용액; 농도: 0.25mg/ml; 판매원: Signet, 카탈로그 번호: 9137-005; -20℃에서 보관
8. 표지 시약:
항-래빗-POD 접합체; 판매원: Fa. Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호: 111-036-045
9. 염색:
TMB; 판매원: Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 92817060;
DMSO 중의 42mM
수중의 3% H2O2
1OOmM 아세트산나트륨 (pH 4.9)
정지 용액: 2M 설폰산
시약의 제조에 사용된 방법
1. 결합 항체:
항-Aβ mAb 클론 6E10을 코팅 완충액 중에 1:400으로 희석시킨다.
2. 차단 시약:
차단 시약을 100ml의 물에 용해시켜 차단 원액을 제조하고 10ml의 분취액을 -20℃에서 보관한다. 각각의 플레이트를 차단시키는데 사용하기 위하여 3ml의 차단 원액을 27ml의 물로 희석시킨다.
3. Aβ(1-42) 단량체 형태, 표준 희석액:
Aβ(1-42) 단량체 표준 원액: 0.5mg의 Aβ(1-42)를 250㎕의 0.1% NH4OH 중에 용해시킨다; 농도: 2mg/ml; 새롭게 제조함; 즉시 사용한다.
5㎕의 Aβ(1-42) 단량체 표준 원액을 995㎕의 PBST에 첨가한다 = 10㎍/ml.
5㎕의 10㎍/ml Aβ(1-42) 단량체 표준 용액을 4995㎕의 PBST에 첨가한다 = 10ng/ml.
표준 곡선:
Figure pat00008

샘플:
IP : 면역침전물 샘플
Figure pat00009

사용된 방법:
1. 1차 항체:
농축된 항-Aβ(1-42) pAb를 PBST 완충액 중에 희석시킨다. 희석배수는 1/1250이다 = 0.2㎍/ml. 즉시 사용한다.
2. 표지 시약:
항-래빗-POD 접합체 동결건조물을 0.5ml의 물에 재구성시킨다. 500㎕의 글리세롤을 첨가하고, 이후의 사용을 위하여 100㎕의 분취액을 -20℃에서 보관한다. 농축된 표지 시약을 PBST-완충액 중에 희석시킨다. 희석배수는 1/5000이다. 즉시 사용한다.
3. TMB 용액:
20ml의 100mM 아세트산나트륨(pH 4.9)을 200㎕의 TMB 용액 및 29.5㎕의 3% 과산화물 용액과 혼합시킨다. 즉시 사용한다.
샘플 플레이트 구성 (모든 표준용액 및 샘플을 2중으로 사용한다는 점을 유의하여야 한다)
Figure pat00010

사용된 방법:
1. 웰 당 100㎕의 결합 항체 용액을 가하여 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리한다.
2. 항체 용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
3. 웰 당 260㎕의 차단 용액을 첨가하여 2시간 동안 실온에서 항온처리한다.
4. 차단 용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
5. 표준용액 및 샘플을 제조한 후, 웰 당 100㎕의 표준용액 및 샘플을 플레이트에 가한다. 2시간 동안 실온에서 항온처리하고 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리한다.
6. 표준용액/샘플용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
7. 웰 당 200㎕의 1차 항체 용액을 첨가하여 1.5시간 동안 실온에서 항온처리한다.
8. 항체 용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
9. 웰 당 200㎕의 표지 용액을 첨가하여 1시간 동안 실온에서 항온처리한다.
10. 표지 용액을 폐기하고, 웰을 250㎕의 PBST-완충액으로 3회 세척한다.
11. 100㎕의 TMB 용액을 각각의 웰에 첨가하여 실온에서 항온처리한다 (5 내지 15분).
12. 염색이 관찰되면 웰 당 50㎕의 정지 용액을 가한다.
13. 450nm에서 판독한다.
14. 표준 곡선으로부터 결과를 계산한다.
15. 평가:
미지의 샘플로부터의 흡광값이 보정 곡선의 선형 범위 내에 있지 않으면, 적당한 샘플 희석액을 사용하여 ELISA를 반복한다.
결과:
Figure pat00011

상기 결과는 다음을 나타낸다:
a. 8F5 (또는 8C5)와 같은 글로불로머 선택적 항체는, 6E10과 같은 비-글로불로머 선택적 항체와 비교하여, 질병 상태로부터 독립적인 Aβ40보다 Aβ42에 선택적으로 결합한다. 이러한 결과는 알츠하이머병의 성공적인 치료를 시사하는데, 그 이유는 Aβ40보다 Aβ42를 선택적으로 제거하는 것은, AD 치료에서, 예를 들면, Myriad Inc에서 공개한 임상 시험에서 AD 치료 효능이 증명된 R-플루비프로펜, 플루리잔(Flurizan)을 사용한 AD 치료에서 한가지 개념으로서 추구되고 있기 때문이다. 이러한 개념은 문헌[참조: S. Weggen et al. (J Biol Chem. (2003) 278 (34):31831-7]에 공개되었다. 결과는 도 3에 제시되어 있다.
b. 8F5 (또는 8C5)와 같은 글로불로머 선택적 항체는 건강한 대조군과 비교하여 환자에서 Aβ40보다 Aβ42에 더 많이 결합한다. 이러한 결과는 알츠하이머병의 성공적인 치료를 더욱 시사하는데, 그 이유는 앞서 언급한 바와 같이, Aβ40보다 Aβ42를 선택적으로 제거하는 것은 AD 치료 (예: R-플루비프로펜과 같은 비-스테로이드성 항염증 약물을 사용한 AD 치료)에서 한가지 개념으로서 추구되고 있기 때문이다 (도 3을 참조한다).
B) 글로불로머 비선택적 항체인 6 E10 과 비교하여 글로불로머 선택적 항-Aβ 쥐 mAb 8F5 또는 8C5로 면역침전시킨 후 사람 CSF 중의 내인성 아밀로이드 β(1-42) 및 아밀로이드 β(1-40)의 수준
b1) 디나비드(Dynabead) M-280 양(sheep) 항-마우스 IgG를 사용한 면역침전(IP)
Aβ-항체 용액
표준 정제 방법에 따라 하이브리도마로부터 다음의 순수한 항체를 수득하였다:
- mMab 6E10; Fa.Signet Nr.: 9320; PBS 완충액 중의 1mg/ml
- mMab 8F5; PBS 완충액 중의 1.65mg/ml
- mMab 8C5; PBS 완충액 중의 1.44mg/ml
디나비드 M-280 양 항-마우스 IgG:
양 항-마우스 IgG (판매원: Invitrogen Inc., 카탈로그 번호: 112.02)를 자성 비드 (디나비드)에 공유결합시킨다.
모노클로날 마우스 항체를 사용한 디나비드의 활성화:
- 디나비드 (디나비드 M-280 양 항-마우스 IgG, 판매원: Invitrogen; 제품번호: 112.02)의 현탁원액을 거품이 형성되지 않게 조심스럽게 진탕하였다.
- 1ml를 무균적으로 채취하여 1.5mL 반응 바이알로 이동시켰다.
- 디나비드를 1ml의 면역침전(IP) 세척 완충액 (IP 세척 완충액: PBS (20mM NaH2PO4, 140mM NaCl, pH 7.4), 0.1% (w/v) BSA)으로 5분 동안 3회 세척하였다. 세척하는 동안, 자성 분리기 스탠드(MSS; Magnetic Separator Stand)를 사용하여 디나비드를 반응 바이알의 측면에 고정화시키면서, 상청액을 조심스럽게 채취하였다.
- 세척한 디나비드를 1ml의 PBS, 0.1% (w/v) BSA 중의 40㎍의 Aβ 항체와 함께 항온처리하였다.
- 4℃에서 진탕하면서 하룻밤 동안 항온처리하여 활성화를 수행하였다.
- 활성화된 디나비드를 1ml의 IP 세척 완충액 (PBS (20mM NaH2PO4, 140mM NaCl, pH 7.4), 0.1% (w/v) BSA)으로 30분 동안 4회 세척하였다 (마찬가지로 MSS를 사용함).
- 활성화된 디나비드를 1ml의 PBS, 0.1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 아지드화나트륨으로 재현탁시켜 와동시키고 잠시 원심분리시켰다.
- 항체 활성화된 디나비드를 이후에 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
CSF 샘플 제조:
알츠하이머병 환자로부터의 400㎕의 CSF를 4㎕의 Complete Protease Inhibitor Cocktail (판매원: Roche Inc., 카탈로그 번호: 1697498, 1개의 정제가 1ml의 물에 용해됨) 및 메탄올 중에 용해된 0.8㎕의 500mM PMSF에 첨가하였다. 10분 후, 1.6ml의 20mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 (PBST)를 첨가하였다.
사람 AD-CSF로부터의 Aβ 종류의 면역침전:
제조된 CSF 샘플의 250㎕ 분취액을 25㎕의 항-Aβ-디나비드 현탁액에 첨가하였다.
- 16시간 동안 6℃에서 교반하면서 면역침전시켰다. 이어서, 비드를 5분 동안 1ml의 PBS/0.1% (w/v) BSA로 3회 세척하고, 최종적으로 3분 동안 1ml의 10mM Tris/HCl (pH 7.5) 완충액으로 1회 세척하였다. 세척하는 동안, 자성 분리기 스탠드(MSS)를 사용하여 디나비드를 반응 바이알의 측면에 고정화시키면서, 상청액을 조심스럽게 채취하였다.
최종 세척 단계 후, 잔류 상청액을 완전히 제거하였다. β-머캅토에탄올 (0.36M 비스트리스(Bistris), 0.16M 바이신(Bicine), 1% SDS (w/v), 15% (w/v) 수크로스, 0.004% (w/v) 브롬페놀블루)이 없는 25㎕의 샘플 완충액을 Eppendorff 관에 첨가하고 가열블록에서 5분 동안 95℃에서 가열하여, Aβ 펩티드 및 상응하는 항체를 디나비드로부터 제거하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 디나비드를 자성 분리기 스탠드(MSS)를 사용하여 디나비드를 반응 바이알의 측면에 고정화시키고, 상청액을 다른 Eppendorff 관으로 이동시켰다 (IP 용출액).
우레아-PAGE 후 웨스턴 블롯 방법에 의한 Aβ 면역침전물의 분석:
문헌[참조: H.W. Klafki et al., Analytical Biochemistry 237, 24-29 (1996)]에 최초로 기술되었고 이후에 문헌[참조: J. Wiltfang et al., J. of Neurochemistry 81, 481-496, 2002]에서도 사용된 방법에 따라, Aβl-40 및 Aβl-42 종류의 정량을 8M 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 시스템 및 이후의 웨스턴 블롯 분석으로 실시하였다. 실험 방법에서 두가지의 작은 변화가 있었다:
1) 스태킹(stacking) 겔 중의 SDS의 농도를 0.1% (w/v) 대신에 0.25% (w/v)로 조절하였다.
2) 웨스턴 블롯을 위하여, 1E8 항체[판매원: Senetek Drug Delivery Technologies Inc. St.Louis, MO, USA)를 항-사람 아밀로이드 β (N) (82E1) 마우스 IgG mAb (판매원: IBL, 카탈로그 번호: 10323)로 대체하였다.
면역침전된 샘플의 IP 용출액의 15㎕의 분취액을 8M 우레아 PAGE 상에 로딩하였다. 전기영동을 100V에서 수행하고(15분) 60V에서 계속 수행하였다. 전개되는 청색 샘플 로딩 염료의 맨앞이 겔 끝의 0.5cm 앞에 도달했을 때 전기영동을 중지시켰다.
웨스턴 블롯 방법:
반건조 블롯팅 챔버[판매원: BioRad Inc.] 내에서 0.45㎛의 7.5cm x 9cm 니트로셀룰로스[판매원: BioRad Inc.] 상에서 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.
블롯팅 완충액: 6g의 트리스; 28.1g의 글리신; 500ml의 메탄올; 물을 첨가하여 2.5L로 조절함.
니트로셀룰로스 블롯을 10분 동안 PBS 중에서 100℃에서 비등시켰다. 블롯을 1시간 동안 실온에서 PBST 중의 50ml의 5% (w/v) BSA로 처리하여 포화시켰다. 유체상을 제거한 후, 50ml의 TTBS (25mM Tris / HCl; 150 mM NaCl 완충액; 0.05% Tween 20; pH 7.5)로 10분 동안 실온에서 세척하고 나서, 50ml의 TBS (25mM Tris / HCl; 150 mM NaCl 완충액; pH 7.5)로 10분 동안 실온에서 세척하였다. 이후의 현상을 위하여, 최종 세척 완충액을 블롯으로부터 폐기하고, 15ml의 항체 I 용액 (0.2㎍/mL 82E1 = 15ml의 TBS 중의 3 % (w/v) 탈지분유(판매원: Lasana Inc.) 중의 1:500)을 20시간 동안 6℃에서 첨가하였다. 완충액을 제거하고 나서, 상기한 바와 같이 3회 세척하였다. 블롯을 항체 용액 II (15ml의 TBS 중의 15ml의 3% (w/v) 탈지분유 중의 항-마우스-POD의 1:10000 희석액)과 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 완충액을 제거하고 나서, 상기한 바와 같이 3회 세척하였다.
마지막 세척 완충액을 제거한 후, 2ml의 Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Enhancer 및 2ml의 과산화물 용액을 혼합하였다. 새롭게 제조한 용액을 암실 속에서 5분 동안 예비항온처리한 블롯 위에 부었다. VersaDoc 이미지화 시스템[판매원: BioRad]을 사용하여 화학발광을 기록하였다.
이미지화 변수:
- 노출 시간: 180초.
사진 기록: 30초, 60초, 120초 및 180초 후.
노출 시간을 180초로 한 사진으로부터 결과를 얻었다.
Figure pat00012
상기 결과는 8F5 또는 8C5와 같은 글로불로머 선택적 항체가, 6E10과 같은 비-글로불로머 선택적 항체와 비교하여, 사람 CSF 중의 Aβ40보다 Aβ42에 더 많이 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 알츠하이머병의 성공적인 치료를 시사하는데, 그 이유는 앞서 언급한 바와 같이, Aβ40보다 Aβ42를 선택적으로 제거하는 것은 AD 치료 (예: R-플루비프로펜을 사용한 AD 치료)에서 한가지 개념으로서 추구되고 있기 때문이다 (위를 참조한다).
실시예 V
8F5는 APP 유전자전이된 마우스에서 신규 물체 인지를 향상시킴
내부 Aβ(l-42) 글로불로머 에피토프를 항체 8F5로 중화시키는 것이 인지에 미치는 긍정적인 효과를 검사하기 위하여, APP 유전자전이된 마우스로 수동 면역화 실험을 수행하여, 예전에 경험했던 물체를 기억하는 능력에 대해 검사하였다. 물체를 처음 접하고 나서 어느 정도 시간이 지난 후 두번째로 물체를 접했을 때, APP 유전자전이된 마우스는 이미 경험했던 물체를 인지하지 못한다. 이 실험은 동물의 자연적인 호기심을 토대로 한 것이며, 이미 경험했던 물체에 대한 관심이 상당히 부족한 것은 그 물체를 인지하고 있음을 나타낸다.
실시예 V.1: 모노클로날 항체 8F5에 의한 인지 지수의 증가
동물:
FVB x C57B1 계열의 단일 유전자전이된 알츠하이머병 마우스 모델 (APP/L, ReMYND, Leuven, Belgium)의 3월령 암컷 마우스, 및 야생형 대조군으로서 FVB x C57B1 계열의 음성 동복자(littermate)를 사용하였다. 3주령일 때 모든 마우스를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 유전자형을 분석하여(genotyping) PCR 결과가 공지되면 고유한 식별 번호를 부여하였고, 연구를 시작하기 전에 PCR을 다시 실시하여 재확인하였다. 모든 마우스를 무작위화하여 연령을 매치시켰다, 즉 컴퓨터를 사용하여 모든 마우스에 임의의 수를 부여하고 무작위로 처리 그룹에 배정하였다. 연구 시작 18일 전에 동물을 처리 그룹별로 사육상자에 넣어 새로운 사육상자 환경에 익숙해지게 하였다. 예비여과 및 멸균된 식수 (UV-램프) 및 표준 마우스 식이를 자유롭게 섭취하게 하였다. 식이는 환기가 잘 되는 보관실 내에서 건조하고 시원한 상태 하에 보관하였다. 식수 및 식이의 양을 매일 확인하여 필요에 따라 공급하고 1주일에 2회 새것으로 공급하였다. 마우스를 낮/밤의 주기가 뒤바뀐 (오후 7시부터 시작하여 14시간 낮/10시간 밤) RVS T2형 표준 금속 사육상자 (면적: 540cm2) 안에서 사육하였다. 사육상자는 단단한 바닥으로 되어 있고 깔짚이 깔려있다. 사육상자 당 마우스의 수는 동물 복지에 관한 법률에 따라 제한하였다. 행동 검사 시작 5일 전, 마우스를 마크롤론(macrolon) 2형 사육상자에 넣어 실험실로 이동시켜, 행동 검사를 위한 준비로서 실험실 환경에 적응시켰다.
처리 (수동 면역화):
1, 8 및 15일에 마우스 (그룹 당 9마리 이상)에 복강내 주사 (마우스 당 240㎕ 중의 500㎍)를 투여하는 각각의 세가지 실험을 수행하였다. 마우스를 인산염 완충 식염수 중에 용해된 모노클로날 항체 6G1, 8F5 및 다른 비공개 항체, 또는 320㎕의 인산염 완충 식염수로 처리하였다.
신규 물체 인지 검사:
3차 처리 당일에 신규 물체 인지 검사를 수행하였다. 사용된 프로토콜은 문헌[참조: Dewachter et al. (Journal of Neuroscience, 2002, 22(9):3445-3453]에 기술된 방법을 따랐다. 검은 수직벽과 반투명 바닥이 있고 상자 아래에 위치한 램프로 희미하게 빛을 비춘 플렉시글라스(Plexiglas) 개방-필드 상자 (52 x 52 x 40 cm)에 마우스를 1시간 동안 익숙해지게 하였다. 다음날, 동물을 동일한 상자 안에 놓고 10분간의 습득(acquisition) 기간을 주었다. 이 기간 동안, 2개의 동일한 물체 A (±4cm의 유사한 크기의 주황색 통 또는 녹색 정육면체)가 존재하는 개방 필드에 마우스를 개별적으로 놓고, (마우스의 주둥이가 물체를 향하여 1cm 미만의 거리에서 물체의 방향으로 활발하게 냄새를 맡은 경우) 물체 A를 탐색하는 시간(timeAA) 및 빈도 (FreqAA)를 컴퓨터화된 시스템(Ethovision, Noldus information Technology, Wageningen, Netherlands)으로 기록하였다. 2.5시간 후에 10분간의 기억(retention) 기간을 주는 동안 (2차 기간)에는, 신규 물체 (물체 B, 녹색 정육면체 또는 오렌지색 통)를 익숙한 물체 (물체 A)와 함께 개방 필드 안에 넣었다 (각각 FreqA 및 FreqB 및 TimeA 및 TimeB). 두 물체를 탐색한 시간에 대한 신규 물체를 탐색한 시간의 비 [TimeB / (TimeA + TimeB) x 100]로 정의되는 인지 지수(RI)를 사용하여, 비-공간적 기억력을 측정하였다. 습득 기간 동안에 물체 A를 탐색한 시간 및 빈도 (TimeAA 및 FreqAA)를 사용하여 호기심을 측정하였다.
모든 세가지 연구로부터의 모노클로날 항체 6G1 또는 8F5 또는 인산염 완충 식염수를 투여받은 APP 유전자전이된 마우스와 인산염 완충 식염수를 투여받은 비-유전자전이된 동복자를 합하여 데이터를 분석하였다 (도 4). 기존의 물체와 신규 물체를 구별하지 못하는 마우스는 인지 지수가 50이다. 기존의 물체를 인지하고 있는 마우스는 신규 물체를 더 많이 탐색할 것이므로 인지 지수가 50을 초과하게 된다. 신규 물체만을 탐색하는 마우스는 인지 지수가 100이다. 그룹 당 평균 인지 지수를 우연 수준(chance level), 즉 50에 대해 t-검정으로 비교하였다. 모든 그룹의 평균 인지 지수를 또한 ANOVA 분석 후 사후 t-검정으로 비교하였다. 상기 패러다임에서 PBS 그룹과 야생형 그룹 간의 차이는 APP 유전자전이된 마우스의 인지 결핍을 나타내었다. PBS를 주사한 마우스의 수행능력은 우연 수준이었지만 (즉, 50과 유의적인 차이가 없음), 모든 다른 마우스는 물체 인지를 보였다 (도 4; *). 항체를 처리한 APP 유전자전이된 마우스의 수행능력을 대조군 그룹과 비교하면, PBS를 처리한 마우스에 대해서는 유의적인 차이가 나타났지만, 야생형 마우스에 대해서는 유의적인 차이가 나타나지 않아 (도 4; ○), 상기 APP 유전자전이된 마우스에서 항체 8F5의 처리로 인하여 인지 결핍이 회복된 것으로 나타났다.
실시예 VI
고령의 APP 유전자전이된 마우스 및 알츠하이머병 환자에서 아밀로이드 플라크 형태의 원섬유성 아밀로이드 베타 펩티드 및 뇌막혈관 내의 아밀로이드에 대한 항체 8F5 및 8C5의 특이적인 반응의 원위치(in situ) 분석
항체 8F5 및 8C5로는 원섬유성 Aβ 펩티드 침착물에 대한 염색이 감소되어, 이들의 치료 효과는 원섬유성 침착된 형태의 Aβ 펩티드보다는 가용성 글로불로머 형태의 Aβ 펩티드에의 결합에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 항체가 원섬유성 Aβ 펩티드에 결합하면 응집체가 빠르게 해리되어 가용성 Aβ의 농도가 증가될 수 있고, 이는 신경독성인 것으로 생각되며 미세출혈을 일으킬 수 있으므로, 단량체보다는 가용성 글로불로머에 영향을 주는 항체 치료법이 바람직하다.
방법:
본 실험을 위하여, 여러 뇌 물질 샘플을 사용하였다: 2명의 AD 환자 (RZ16 및 RZ55)로부터의 피질 조직, 및 19월령 Tg2576 마우스 (APPSWE # 001349, Taconic, Hudson, NY, USA) 또는 12월령 APP/L 마우스 (ReMYND, Leuven, Belgium)로부터의 피질 조직.
마우스는 가족성 알츠하이머병 돌연변이를 갖는 사람 APP를 과발현하여, 약 11월령일 때 뇌 실질조직 내에 β-아밀로이드 침착물이 형성되고, 약 18월령일 때 대뇌혈관 내에 β-아밀로이드 침착물이 형성된다. 동물을 깊이 마취시키고 심장을 통해 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS)를 관류시켜 혈액을 세척하였다. 이어서, 뇌를 두개골로부터 적출하여 세로로 절단하였다. 뇌 반구 중 하나는 급속동결시키고 다른 하나는 4% 파라포름알데히드 속에 침지시켜 고정시켰다. 침지 고정된 반구를 PBS 중의 30% 수크로스에 담가 동결보호(cryoprotection)시켜 동결박절기(freezing microtome)에 고정시켰다. 전뇌 전체를 40㎛ 횡절편으로 절단해서 PBS 중에 수거하여 이후의 염색 단계에 사용하였다. 알츠하이머병 환자로부터의 신피질 샘플을 동결된 조직으로서 Brain-Net(Munich, Germany)으로부터 입수하여, 해동시키는 동안 4% 파라포름알데히드 중에 침지 고정시키고 나서, 마우스 조직과 같이 처리하였다.
개개의 횡절편을 다음의 프로토콜을 사용하여 콩고레드(Congo Red)로 염색하였다:
재료:
- 아밀로이드 염료 콩고레드 키트(Sigma-Aldrich; HT-60): 알콜성 NaCl 용액, NaOH 용액 및 콩고레드 용액으로 이루어짐
- 염색 큐벳
- 현미경 슬라이드 SuperfrostPlus 및 커버글라스
- 에탄올, 크실롤, 포매 배지
시약:
- NaOH를 NaCl 용액으로 1:100으로 희석시켜 알칼리성 식염수를 수득한다
- 알칼리성 식염수를 콩고레드 용액으로 1:100으로 희석시켜 알칼리성 콩고레드 용액을 수득한다 (사용전 15분 이내에 제조함, 여과함)
- 절편을 슬라이드 위에 올려놓고 건조시킨다
- 슬라이드를 염색 큐벳에서 처음에는 30 내지 40분 동안 알칼리성 식염수 중에서 항온처리하고 나서, 30분 내지 40분 동안 알칼리성 콩고레드 용액 중에서 항온처리한다
- 새로운 에탄올로 3회 헹구어 크실롤에 포매시킨다
염색한 것을 우선 Zeiss Axioplan 현미경(Zeiss, Jena, Germany)을 사용해서 촬영하여 정성적으로 평가하였다. 적색은 플라크 형태의 아밀로이드 침착물 및 뇌막혈관 내의 아밀로이드 침착물을 나타내었다. 이후에, 항체 염색의 평가는 이러한 구조에 초점을 맞추었다.
다음의 프로토콜에 따라 절편을 0.07 내지 0.7㎍/ml의 각각의 항체를 함유하는 용액과 함께 항온처리하여 염색시켰다:
재료:
- Aqua bidest 중의 1:10 TBST 세척 용액 (Tween20을 함유하는 트리스 완충 식염수; 1Ox 농축액; DakoCytomation S3306, DAKO, Hamburg, Germany)
- 메탄올 중의 0.3% H2O2
- 당나귀 혈청 (Serotec, Dusseldorf, Germany), TBST 중의 5%, 차단 혈청으로서 사용
- TBST 중에 주어진 농도로 희석된 모노클로날 마우스-항-글로불로머 항체
- 2차 항체: 비오티닐화된 당나귀-항-마우스 항체 (Jackson Immuno / Dianova, Hamburg, Germany; 715-065-150; TBST 중에 1:500으로 희석)
- StreptABComplex (DakoCytomation K 0377, DAKO, Hamburg, Germany)
- 퍼옥시다제 기질 키트 디아미노벤지딘 (=DAB; SK-4100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)
- SuperFrost Plus 현미경 슬라이드 및 커버글라스
- 크실롤 무함유 포매 배지 (Medite, Burgdorf, Germany; X-tra Kitt)
방법:
- 부유된 절편을 빙냉 0.3% H2O2 속으로 이동시켜 30분 동안 항온처리한다
- 5분 동안 TBST 완충액 중에서 세척한다
- 당나귀 혈청/TBST와 함께 20분 동안 항온처리한다
- 1차 항체와 함께 24시간 동안 실온에서 항온처리한다
- TBST 완충액 중에서 5분 동안 세척한다
- 차단 혈청과 함께 20분 동안 항온처리한다
- TBST 완충액 중에서 5분 동안 세척한다
- 2차 항체와 함께 60분 동안 주위 온도에서 항온처리한다
- TBST 완충액 중에서 5분 동안 세척한다
- StreptABComplex와 함께 60분 동안 주위 온도에서 항온처리한다
- TBST 완충액 중에서 5분 동안 세척한다
- DAB와 함께 20분 동안 항온처리한다
- 절편을 슬라이드 위에 올려놓고 슬라이드를 공기건조시켜, 알콜로 슬라이드를 탈수시키고 슬라이드를 포매시킨다
절편을 현미경 하에서 육안으로 조사하고, 또한 ImagePro 5.0 이미지 분석 시스템을 사용하여 조직학적 이미지로부터 무작위로 선택된 10개의 플라크를 광학적으로 절제해서 평균 그레이 스케일(gray scale) 값을 계산하여, 아밀로이드 염색을 추가로 정량하였다. 광학밀도 값은 {아밀로이드 플라크의 밀도} - {염색된 물질의 평균 배경 밀도}로 계산하였다 (0%: 주변 배경 이상으로 플라크가 염색되지 않음, 100%: 투과되지 않음 / 최대 염색). 항체 6E10 / 4G8 및 6G1, 8C5 및 8F5 사이의 차이를 각각 AVOVA로 통계적 유의성에 대해 검사하였다
결과:
항체로 염색된 기술된 모든 물질은 콩고레드 친화성(congophilic) 아밀로이드 침착물인 것으로 밝혀졌다 (도 7(A)). 글로불로머 선택적 항체 8F5 및 8C5는 실질조직 및 뇌막의 콩고레드 친화성 Aβ 펩티드의 침착물을 항체 6G1 및 6E10보다 유의적으로 적게 염색시켰다 (도 7(B), (C), (H)). 실질조직의 아밀로이드 플라크 염색의 정량 분석으로, 모든 항체는 플라크에 결합하지만 (대조군 이상의 통계적으로 유의적인 밀도), 항체 8F5 및 8C5의 결합은 참조 항체 6E10 (Aβ의 N-말단 서열에 대한 항체)의 결합보다 유의적으로 낮고, 참조 항체 4G8 (Aβ의 N-말단 서열에 대한 항체)과는 동등하거나 더 낮은 것으로 나타났다 (도 7(D) 내지 도 7(G)). 항체 8F5 및 8C5는 Aβ 단량체 또는 Aβ 서열의 일부를 인식하는 항체보다 아밀로이드 침착물에 더 적게 결합한다. 원섬유성 Aβ 펩티드에 결합하는 항체를 사용한 치료법은 뇌 조직 내의 아밀로이드 플라크를 빠르게 해리시켜 가용성 Aβ의 농도를 증가 (이는 신경독성인 것으로 생각되며 미세출혈을 일으킬 수 있음)시키고/시키거나, 혈관 아밀로이드를 빠르게 해리시켜 마찬가지로 미세출혈을 일으킬 수 있다. 그러므로, 단량체보다는 가용성 글로불로머에 영향을 주는 항체 치료법이 바람직하다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) PTA-7238 20051201 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) PTA-7407 20060228
<110> Abbott Laboratories <120> Monoclonal antibodies and uses thereof <130> 8127.WO.01 <150> US 60/740,866 <151> 2005-11-30 <150> US 60/778,950 <151> 2006-03-03 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Murine <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagtggtgac 300 tactggggcc aaggctccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 2 <211> 339 <212> DNA <213> Murine <400> 2 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctagaa atcaaacgg 339 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Murine <400> 4 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 5 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Murine <400> 7 Ser Gly Asp Tyr 1 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Murine <400> 8 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 9 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 10 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gaggtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtacag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcaagt attaaaaata atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtt tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attattgtgc aagtggggat 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 12 <211> 339 <212> DNA <213> Murine <400> 12 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gagacacctt tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tatttctgct ctcagagtat acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 13 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Ile Lys Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Murine <400> 15 Ser Gly Asp Tyr 1 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Murine <400> 16 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asp Thr Phe Leu His 1 5 10 15 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 18 Ser Gln Ser Ile His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Lys Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Murine <400> 20 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ile His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg

Claims (7)

  1. 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하고 아밀로이드 베타 글로불로머에 결합하는 모노클로날 항체로서,
    a) 가변 중쇄의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)이 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7이고 가변 경쇄의 3개의 CDR이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10이거나,
    b) 가변 중쇄가 서열번호 1에 의해 암호화되는 가변 중쇄이고 가변 경쇄가 서열번호 2에 의해 암호화되는 가변 경쇄이거나,
    c) 가변 중쇄가 서열번호 3을 포함하고 가변 경쇄가 서열번호 4를 포함하는, 모노클로날 항체.
  2. 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하고 아밀로이드 베타 글로불로머에 결합하는 사람화된 항체로서, 가변 중쇄의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)이 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7이고 가변 경쇄의 3개의 CDR이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10인, 사람화된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 가변 중쇄가 서열번호 3을 포함하고 가변 경쇄가 서열번호 4를 포함하는 모노클로날 항체.
  4. 제2항에 있어서, 골격 영역 전부가 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 골격 영역에 상응하는 사람화된 항체.
  5. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC: American Type Culture Collection) 수탁번호 PTA-7238의 하이브리도마.
  6. 제5항의 하이브리도마에 의해 생성되고 아밀로이드 베타 글로불로머에 결합하는 모노클로날 항체 (8F5).
  7. (a) 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 및
    (b) 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착되고 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체와는 상이한, 제2의 Aβ 단백질 글로불로머-특이적 항체를 포함하는 접합체를 포함하는,
    알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 Aβ 단백질 글로불로머의 존재를 측정하기 위한 키트.
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