KR20140067333A - 봉독의 지용성 분획을 포함하는 항노화 화장료조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 봉독을 이용한 피부노화 개선용 화장료에 대한 것으로서, 더욱 상세하게는 봉독의 지용성 성분을 포함하여 피부주름 개선과 같은 항노화 효과를 가지는 화장료조성물에 과한 것이다. 본 발명에 따르면 지용성 용매에 의하여 분획된 봉독의 지용성분획과 수용성 용매에 의하여 분획된 수용성분획을 1:0.01~0.5의 부피비율로 포함하는 화장료조성물이 제공된다.

Description

봉독의 지용성 분획을 포함하는 항노화 화장료조성물 및 그 제조방법{Cosmetic composition for anti-aging comprising lipid soluble fraction of bee venom and method for manufacturing the same}
본 발명은 봉독을 이용한 피부노화 개선용 화장료에 대한 것으로서, 더욱 상세하게는 봉독의 지용성 성분을 포함하여 피부주름 개선과 같은 항노화 효과를 가지는 화장료조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.
꿀벌의 산란관에서 나오는 독액을 봉독(Bee Venom)이라고 한다. 봉독은 벌 복부 끝 독낭에 저장되어 봉침과 연결되어 자극 시에 분비되는 동물성 천연 생리 활성물질로서 이 봉독이 이집트, 바빌로니아에서 치료 목적으로 사용되었다는 기록이 남아 있다. 우리나라에서도 마왕퇴백서(최초의 침구학 문헌), 동의보감, 민간요법에서 생봉침을 통증 및 류마티스 관절염 치료에 이용하였다는 기록이 남아 있다.
이런 봉독은 염증 유발 동물의 부종을 감소시키고, 관절염 환자의 활막세포에 작용하여 그 주성분 멜리틴(melittin)이 NF-KB를 비활성화시킴으로써 일산화질소(Nitric Oxide; NO)의 양을 감소시키며 싸이클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2; COX-2)를 억제하여 항염증 효과를 유발하는 것으로 알려져 있다. 봉독의 성분을 분리 정제하여 치매나 암치료에 이용하는 등의 봉독 처리 효과를 확인하는 생리적 연구나 건조 봉독의 성분 분석에 대한 연구결과는 이미 보고되어 있다. 한의학에서는 염증 질환의 치료제로 오랫동안 사용되어 왔으며, 봉독의 항염증 효과와 항암효과에 대해서 연구하고 있다. 봉독을 이용한 동물의 관절염 또는 항염증 치료제 개발 연구는 이미 농진청을 비롯한 많은 정부기관에서 수행된 바 있다.
한편, 봉독을 화장품에 이용한 예도 찾아볼 수 있다. 한국 공개 특허공보 제2010-0118629호 '봉독 또는 봉독 추출물을 함유하는 화장료 조성물'에는, 봉독 또는 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 상기 봉독 추출물은 물, 유기 용매 또는 물과 에탄올의 혼합용매로 추출한 추출물인 것이 개시되어 있다. 또한 대한민국 특허공개공보 제2012-0003178호 ‘봉독 추출물을 함유하는 피부 미백 및 보습용 조성물’에는 봉독을 물, 유기 용매 또는 물과 유기 용매의 혼합 용매로 추출한 추출물이 피부미백 및 보습효과를 가진다는 것이 개시되어 있다.
본 발명자들은 봉독의 추출물의 제조에 있어서, 봉독의 지용성 분획을 수용성 분획과 일정한 비율로 혼합하여 사용하는 경우에 항염증, 피부주름개선과 같은 항노화효과가 우수하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 봉독의 지용성분획을 일정한 비율로 함유하여 피부주름개선, 탈모방지와 같은 항노화효과가 우수한 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 지용성 분획을 일정한 비율로 함유하는 항노화용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 봉독의 지용성 용매에 의하여 분획된 지용성분획과 수용성 용매에 의하여 분획된 수용성분획을 1:0.01~0.5의 부피비율로 포함하는 화장료조성물이 제공된다. 상기 지용성 용매는 에틸 아세테이트, 클로로포름, 에테르 및 부탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이다. 상기 수용성 용매는 물, 에틸 알콜 및 메틸 알콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이다. 상기 화장료조성물은 비단백질 성분으로서 시티딘(cytidine), 아데노신(adenosine), 크리신(chrysin), 11-에이코세놀(11-eicosenol) 및 피노셈브린(pinocembrin) 중에서 선택된 적어도 하나의 것을 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 단백질 성분으로서 멜리틴, 포스포리파제A-2, 엠씨디펩타이드 중에서 선택된 적어도 하나의 것을 포함한다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 유효성분으로서의 봉독 수용성분획과 지용성분획은 전체 화장료조성물의 0.001~20중량% 포함되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 화장료 조성물은 피부주름개선용 화장료이다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 봉독을 수용성 용매와 지용성용매를 이용하여 1차 분별하는 단계(S10); 분별된 1차 수용성 층에 지용성 용매를 가하여 2차 분별하는 단계(S20); 분별된 2차 수용성 층에 지용성 용매를 가하여 3차 분별하는 단계(S30); 분별된 3차 수용성 층을 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성 분획을 준비하는 단계(S40); 1차 분별된 1차 지용성 층에 2차 분별된 지용성 층과 3차 분별된 지용성 층을 합한 다음에 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성 분획을 준비하는 단계(S50); 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 0.01~0.5:1의 부피비율로 혼합하는 단계(S60); 및 상기 혼합물을 농축 및 건조하는 단계(S70)를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 봉독을 수용성 용매를 이용하여 추출하는 단계(S11); 수용성 용매를 이용하여 추출한 봉독을 원심분리하고, 수용성층을 취하고 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성분획을 준비하는 단계(S21); 원심분리한 잔사를 건조하여 수용성 용매를 제거하는 단계(S31); 상기 잔사에 대하여 지용성 용매를 가하여 추출하는 단계(S41); 지용성 용매를 이용하여 추출한 봉독에 대하여 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성 분획을 준비하는 단계(S51); 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 0.01~0.5:1의 부피비로 서로 혼합하는 단계(S61); 및 상기 혼합물을 농축 및 건조하는 단계(S71)를 포함하는 화장료 조성물의 또 다른 방법이 제공된다.
이때, 상기 지용성 용매로는 에틸 아세테이트, 클로로포름, 에테르 및 부탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 상기 수용성 용매로는 물, 에틸 알콜 및 메틸 알콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 제조방법에 따라 제조된, 봉독의 지용성 분획과 수용성 분획이 특정비율로 혼합된 봉독추출물은 피부주름 개선과 같은 항노화 활성이 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 제조공정을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 추출물의 제조공정을 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예의 시료에 따른 세포독성 시험 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 실시예의 시료에 따른 MMP-1 발현 억제 시험 결과를 나타내는 그림이다.
도 5는 본 발명의 실시예의 시료에 따른 프로콜라겐-I 합성 효과 시험 결과를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
봉독은 수용성 성분과 지용성 성분 및 불용성 성분으로 구성되어 있다. 종래의 봉독의 이용은 주로 수용성 분획 중 멜리틴 등을 주성분으로 하는 단백질 또는 펩타이드 분획에 한정되어 있었다. 본 발명은 봉독의 지용성 분획을 이용함으로써 봉독의 비단백, 비 펩타이드분획을 적절히 이용함으로써 항노화용 조성물의 원료로 사용하는 것을 기술적 특징으로 한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명 화장료조성물은 다음과 같은 방법에 의하여 제조된다(도 1).
봉독을 수용성 용매와 지용성용매를 이용하여 1차 분별하는 단계(S10); 분별된 1차 수용성 층에 지용성 용매를 가하여 2차 분별하는 단계(S20); 분별된 2차 수용성 층에 지용성 용매를 가하여 3차 분별하는 단계(S30); 분별된 3차 수용성 층을 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성 분획을 준비하는 단계(S40); 1차 분별된 1차 지용성 층에 2차 분별된 지용성 층과 3차 분별된 지용성 층을 합한 다음에 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성 분획을 준비하는 단계(S50); 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 0.01~0.5:1의 부피비율로 혼합하는 단계(S60); 및 상기 혼합물을 농축 및 건조하는 단계(S70)를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 도 1에서 확인되는 바와 같이 수용성 용매로 증류수를 사용하였으며, 지용성 용매로는 에틸아세테이트(EA)를 사용하였다.
또 다른 구체예에 의하면, 본 발명 화장료조성물은 다음과 같은 방법에 의하여 제조된다(도 2).
봉독을 수용성 용매를 이용하여 추출하는 단계(S11); 수용성 용매를 이용하여 추출한 봉독을 원심분리하고, 수용성층을 취하고 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성분획을 준비하는 단계(S21); 원심분리한 잔사를 건조하여 수용성 용매를 제거하는 단계(S31); 상기 잔사에 대하여 지용성 용매를 가하여 추출하는 단계(S41); 지용성 용매를 이용하여 추출한 봉독에 대하여 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성 분획을 준비하는 단계(S51); 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 0.01~0.5:1의 부피비로 서로 혼합하는 단계(S61); 및 상기 혼합물을 농축 및 건조하는 단계(S71)를 포함하는 화장료 조성물의 또 다른 방법이 제공된다. 이때, 상기 지용성 용매로는 클로로포름을, 상기 수용성 용매로는 증류수를 사용하였다. 일 구체예에 따르면 다음과 같은 방법에 의하여 제조될 수 있다. 봉독 1.0g을 비이커에 넣고 증류수 100 ㎖를 가하여 추출한다. 3,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 수용성층(DW층)을 분리하여 취한 다음에 필터링하여 불용성 성분을 제거하고 수용성층을 보관한다. 원심 분리한 잔사를 건조하여 미량의 남은 증류수를 제거한다. 건조한 잔사에 클로로포름 200 ㎖를 가하여 추출한 다음에 필터링하여 불용성 성분을 제거한 다음에 클로로포름 층을 준비하여 둔다. 증류수층과 클로로포름 층을 혼합한 다음에 농축 및 건조한다.
상기 제조방법에 의하여 얻어진 각 분획에 대하여 성분 프로파일(profile)을 조사하였다. 그 결과 상기 추출물에는 비단백질 성분으로서 시티딘(cytidine), 아데노신(adenosine), 크리신(chrysin), 11-에이코세놀(11-eicosenol), 피노셈브린(pinocembrin) 이 함유되어 있음을 알 수 있었다. 또한 단백질 성분으로서 멜리틴, 포스포리파제A-2, 엠씨디펩타이드가 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 유효성분으로서의 봉독 수용성분획과 지용성분획은 전체 화장료조성물의 0.001~20중량% 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 봉독 추출물을 항노화용 화장료 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 또한 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제와 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제 등이 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸올레이트와 같은 에스테르 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름이 사용될 수 있다.
[실시예]
실시예 1:지용성 분획을 포함하는 추출물의 제조
미정제 봉독(CBV) 2.5g을 비이커에 넣고 증류수(DW) 100㎖에 용해시켰다. 용해된 봉독을 분별깔때기에 넣고 증류수 150㎖로 비이커의 내벽을 씻어주면서 첨가하였다. 에틸아세테이트(Ethyl acetate; EA) 250㎖을 넣고 잘 흔들어 혼합시켰다. 이렇게 혼합된 EA와 증류수의 혼합액을 분별깔때기를 통해서 정치시키고 뚜껑을 열어 압력을 뺐다. 이렇게 두면 EA 층과 증류수 층이 성질상의 차이로 말미암아 분리된다. 이렇게 분리된 위층(EA)과 아래층(증류수) 중에서 아래층에 있는 증류수를 비이커를 통해서 받아 놓았다. 이때 위층은 따로 분리하여 받아 놓았다. 분리된 증류수 층을 분별깔때기에 넣고 EA 250㎖을 넣고 잘 혼합시키고 나서 두면, 위층과 아래 층이 분리된다. 위층(EA)을 따로 분리하여 두었다. 아래층(증류수)을 분별깔때기에 넣고 다시 EA 250㎖을 넣어 혼합시켜 분리하여 위층(EA)과 아래층(증류수)을 분리하였다. 분리하여 둔 각 EA층을 혼합한 후 불용성분을 제거하여 지용성 분획을 제조하였다. 그리고 분리된 증류수층에서 불용성분을 제거하여 수용성 분획을 제조하였다. 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 부피비로 0.5:1의 비율로 혼합한 후, 농축시키고 건조하였다.
상기 시료를 용매에 녹여 시료로 사용하였다.
실시예 2:지용성 분획을 포함하는 추출물의 제조
상기 실시예 1에서 수용성 분획과 지용성 분획을 부피비로 0.3:1의 비율로 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 추출물을 제조하였다.
실시예 3:지용성 분획을 포함하는 추출물의 제조
상기 실시예 1에서 수용성 분획과 지용성 분획을 부피비로 0.2:1의 비율로 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 추출물을 제조하였다.
실시예 4:지용성 분획을 포함하는 추출물의 제조
상기 실시예 1에서 수용성 분획과 지용성 분획을 부피비로 0.1:1의 비율로 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 추출물을 제조하였다.
실시예 5:지용성 분획을 포함하는 추출물의 제조
상기 실시예 1에서 수용성 분획과 지용성 분획을 부피비로 0.01:1의 비율로 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 추출물을 제조하였다.
상기 실시예에서 제조된 추출물을 시료로 하여 항노화 효능에 대한 시험을 하였다.
시험예 1: 세포 독성 실험
세포 증식은 EZ-cytox Enhanced Cell Viability Assay Kit(Daeil Lab, Korea)를 사용하여 측정하였고, 제조자의 지시에 따라 실험을 진행하였다. 섬유아세포(NHDF)를 48 well plate에 well당 5000 cell씩 분주하고, 1% FBS를 첨가한 DMEM(low glucose)에서 37 ℃ 하루 배양하였다. 실시예 1의 추출물(LWBV-Lipid and Water soluble bee venom)을 농도별로 처리하여 24, 48시간 배양 한 뒤 CCK assay를 수행하였다. Assay 시약을 배지의 10%가 되게 첨가하고 배양조건과 동일하게 2시간 배양 gnm microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인되는 바와 같이 LWBV는 섬유아세포에 독성을 보이지 않았다
시험예 2: MMP -1 발현억제 효과
섬유아세포(human dermal fibroblast)에 상기 실시예 1 내지 5의 봉독 추출물을 농도별로 전 처리 한 뒤 세포사멸을 일으키지 않는 농도인 200uM 과산화수소에 노출시키고 24시간 배양한 후 mRNA를 분리하여 RT-PCR 방법으로 MMP-1의 유전자 발현수준을 확인하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 과산화수소에 의해 섬유아세포의 MMP-1 발현이 증가하였으며(H200), 다양한 봉독 추출물들은 전반적으로 MMP-1 발현을 감소시켰고, 특히 실시예 1의 봉독추출물(BV1)이 우수한 효과를 보여주었다. 도 4에 있어서, HBV1-1은 상기 실시예 1의 봉독추출물을 1μg/ml의 농도로 처리 후 과산화수소에 노출한 시료를 의미한다. 마찬가지로 HBV4-0.1은 상기 실시예 4의 봉독추출물을 0.1μg/ml의 농도로 처리 후 과산화수소에 노출한 시료를 의미한다.
시험예 3:프로콜라겐-I 합성 효과
섬유아세포(human dermal fibroblast)에 상기 실시예 1 내지 5의 봉독 추출물을 농도별로 전 처리 한 뒤 200uM 과산화수소에 노출시키고 24시간 배양한 후 세포로부터 단백질을 분리하여 프로콜라겐-I의 합성량을 western blot 방법으로 확인하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 과산화수소는 섬유아세포의 콜라겐 합성을 억제하였으며 상기 실시예의 봉독 추출물들은 모두 콜라겐 합성을 증가시켰다
상기 시험예들에서 확인되는 바와 같이 본 발명 실시예의 조성물을 처리한 경우 진피의 조직 turnover가 증가하여 collagen 합성이 증진되고 콜라겐분해가 억제되는 결과를 나타내었다. 이는 본 발명 봉독추출물이 free radical을 생성하는 스트레스에 노출되어 있을 때 ECM(extracellular matrix)의 대사를 조절하는 보호효과를 가질 뿐 아니라 새로운 콜라겐의 합성을 유도하는 회춘 효과(rejuvenation effect)가 있어 항노화화장료로 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

Claims (9)

  1. 지용성 용매에 의하여 분획된 봉독의 지용성분획과 수용성 용매에 의하여 분획된 수용성분획을 1:0.01~0.5의 부피비율로 포함하는 화장료조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 지용성 용매는 에틸 아세테이트, 클로로포름, 에테르 및 부탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 수용성 용매는 물, 에틸 알콜 및 메틸 알콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 비단백질 성분으로서 시티딘(cytidine), 아데노신(adenosine), 크리신(chrysin), 11-에이코세놀(11-eicosenol) 및 피노셈브린(pinocembrin) 중에서 선택된 적어도 하나의 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 단백질 성분으로서 멜리틴, 포스포리파제A-2, 엠씨디펩타이드 중에서 선택된 적어도 하나의 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부주름개선용 화장료인 것을 특징으로 하는 화장료조성물.
  7. 봉독을 수용성 용매와 지용성용매를 이용하여 1차 분별하는 단계(S10); 분별된 1차 수용성 층에 지용성 용매를 가하여 2차 분별하는 단계(S20); 분별된 2차 수용성 층에 지용성 용매를 가하여 3차 분별하는 단계(S30); 분별된 3차 수용성 층을 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성 분획을 준비하는 단계(S40); 1차 분별된 1차 지용성 층에 2차 분별된 지용성 층과 3차 분별된 지용성 층을 합한 다음에 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성 분획을 준비하는 단계(S50); 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 0.01~0.5:1의 부피비율로 혼합하는 단계(S60); 및 상기 혼합물을 농축 및 건조하는 단계(S70)를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
  8. 봉독을 수용성 용매를 이용하여 추출하는 단계(S11); 수용성 용매를 이용하여 추출한 봉독을 원심분리하고, 수용성층을 취하고 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성분획을 준비하는 단계(S21); 원심분리한 잔사를 건조하여 수용성 용매를 제거하는 단계(S31); 상기 잔사에 대하여 지용성 용매를 가하여 추출하는 단계(S41); 지용성 용매를 이용하여 추출한 봉독에 대하여 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성 분획을 준비하는 단계(S51); 상기 수용성 분획과 지용성 분획을 0.01~0.5:1의 부피비로 서로 혼합하는 단계(S61); 및 상기 혼합물을 농축 및 건조하는 단계(S71)를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 지용성 용매로는 에틸 아세테이트, 클로로포름, 에테르 및 부탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 상기 수용성 용매로는 물, 에틸 알콜 및 메틸 알콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료조성물의 제조방법.







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