KR20130134118A - 히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 - Google Patents
히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20130134118A KR20130134118A KR1020120057399A KR20120057399A KR20130134118A KR 20130134118 A KR20130134118 A KR 20130134118A KR 1020120057399 A KR1020120057399 A KR 1020120057399A KR 20120057399 A KR20120057399 A KR 20120057399A KR 20130134118 A KR20130134118 A KR 20130134118A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- primer set
- pcr
- hyacinth
- xanthomonas
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/64—Xanthomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 히아신스황색썩음병균 진단용 키트 및 이를 이용한 히아신스황색썩음병균 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 히아신스황색썩음병균에 특이적인 유전자 서열을 가지므로, 히아신스황색썩음병균의 진단 및 검출에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 히아신스황색썩음병균 검출용 PCR 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히아신스황색썩음병균의 23S rRNA 유전자 일부 서열에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 프라이머 Xan23S-F73(서열번호 1)과 Xan23S-R71(서열번호 2) 세트 또는 이들과 상보적인 염기서열로 이루어진 프라이머 세트, 상기 2 세트 중 어느 하나를 포함하는 히아신스황색썩음병균 검출용 키트 및 이를 이용한 히아신스황색썩음병 검출 방법에 관한 것이다.
식물 병원세균의 유전자 진단방법으로는 Dot-blot, 중합효소 연쇄반응(PCR) 등의 방법이 이용된다. 특히 PCR은 Dot-blot 방법보다 시간, 노력, 인력 등이 경제적이기 때문에 최근 널리 사용되고 있는 방법이다. PCR(중합효소 연쇄반응, polymerase chain reaction) 진단 방법은 10~20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스 젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 및 은 염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이다. 현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 진단법은 인체나 동물의 세균성 질병을 진단에 주로 이용되나, 최근에는 식물 병원균을 진단할 수 있도록 PCR 진단법이 개발되어 병의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다. 또한, PCR 진단 방법은 다른 방법에 비해 소요되는 시간이 짧고, 진단에 소요되는 비용이 저렴하며 또한, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다. 이에 최근에는 잔토모나스(Xanthomonas) 검출방법 중에서 유전물질인 핵산을 증폭하는 PCR 진단 방법이 가장 선호되고 있다.
히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)이 잎에 침입하면 입맥을 따라 가늘고 긴 수침상의 병반이 생겨 연한 황색으로 되며 심하면 갈색의 줄무늬로 변한다. 잎 전면에 퍼지면 잎은 갈변하여 시들어 죽는다. 구근에서는 유관속을 통하여 발병하고 구근은 부패하여 황색의 점액상 물질이 생긴다.
기존의 잔토모나스 속 미생물 중, 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 세균성점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 십자화과 흑부병원균(Xanthomonas campestris pv. campestris), 감귤류 궤양병 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 및 콩불마름병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 등 다양한 미생물의 검출에 사용되는 개별적인 PCR 프라이머에 대한 연구는 이루어졌으나, 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)에 대하여는 아직까지 연구된 바 없다.
이에 본 발명의 발명자들은 히아신스황색썩음병균의 검출에 사용될 수 있는 PCR 프라이머 세트를 설계하기 위하여, 히아신스황색썩음병균에 특이적인 염기서열을 검색하던 중, 23S rRNA의 염기서열이 종 보존적임을 확인하고, 히아신스황색썩음병균에만 특이적인 23S rRNA 의 일부 서열을 발견하여, 그를 이용한 프라이머 세트를 발명하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 ‘프라이머’는 상보적인 서열과 염기쌍을 형성할 수 있고, 상보적인 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 명세서에서 용어 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 PCR에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트에 관한 것이다.
미생물 유전자에 특이적인 중합효소 연쇄반응 프라이머의 제작에는 rRNA, 하우스키핑(house keeping) 유전자 등 다양한 유전자들이 사용되고 있으며, 특히 rRNA 유전자 중 16S rRNA와 23S rRNA는 진화에 안정적이고 같은 종 혹은 종 하위 분류군내 유전적 변이가 드물기 때문에 병원세균 진단용 중합효소 연쇄반응 프라이머로 이상적이다. 본 발명에서 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 세트는 히아신스황색썩음병균 게놈의 유전자 서열 중에서 종(species) 보존적인 23S rRNA의 특이적 영역을 표적으로 하였기 때문에 히아신스황색썩음병균 이외의 미생물 유전자와는 특이적인 결합을 하지 않으며, 히아신스황색썩음병균만을 특이적으로 검출할 수 있는 것에 특징이 있다.
본 발명의 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트는 잔토모나스(Xanthomonas) 속에 속하는 다른 미생물과 비교했을 때, 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)에만 존재하는 특이적인 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 공지된 잔토모나스 속 균들의 23S rRNA 유전자와 히아신스황색썩음병균의 23S rRNA 유전자를 비교분석하여, 사탕수수잎 마름병균에만 특이적인 프라이머 세트(Xan23S-F73<전방향, 서열번호 1> & Xan23S-R71<역방향, 서열번호 2>)를 선발하였다(실시예 1 참조). 선발한 프라이머 세트가 히아신스황색썩음병균에만 특이성을 갖는 지 검증하기 위하여, 히아신스황색썩음병균을 포함한 잔토모나스(Xanthomonas) 속 26종에 속하는 90 strains들의 gDNA를 분리하여, 상기 프라이머 세트와 함께 PCR 반응시킨 후, 전기영동을 한 결과([도 1]에 기재)를 보면, 히아신스황색썩음병균의 DNA가 다른 균들에 비해서 현저히 많이 증폭된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2에 상보적인 서열을 갖는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 히아신스황색썩음병균 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다. 상기 본 발명의 프라이머 세트들은 히아신스황색썩음병균의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다.
본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 히아신스황색썩음병균 진단용 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 히아신스황색썩음병균을 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 보다 상세하게는 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드 (dimethylsufoxide (DMSO)), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아미이드 및 소혈청 알부민(bovine serum albumine (BSA))이 추가로 포함될 수 있다.
또한 상기 키트에는 상기 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위하여 DNA 중합효소 및 상기 조성의 PCR 반응 완충 용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 히아신스황색썩음병균 검출방법을 제공한다.
중합효소 연쇄반응(PCR)은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 끝단에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 방법이다. 이와 같은 PCR을 이용하여 식물에 감염된 미생물을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 본 발명에서는 히아신스황색썩음병균을 검출하기 위하여, 상기 PCR을 포함하는 검출 방법을 이용하였다.
이를 단계별로 살펴보면, 상기 (a) 단계에서 DNA의 분리는 상기 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)으로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 히아신스황색썩음병균의 23S rRNA의 유전자를 증폭해낼 수 있다. 본 단계는 ⅰ) 변성(denaturation) 단계, ⅱ) 프라이머의 대상 핵산결합(annealing) 단계 및 ⅲ) 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 "사이클"은 표적 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않으나, 바람직하게는 (i) 90 내지 98℃에서 55 내지 65초간의 변성(denaturation) 과정, (ii) 60 내지 70℃에서 55 내지 65초간의 어닐링(annealing) 및 (ⅲ) 65 내지 75℃에서 170 내지 190초 신장(elongation)과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복 수행하는 단계 및 (ⅳ) 70 내지 75℃에서 5 내지 10분을 추가 신장 단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
(c) 단계는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물을 DNA크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행하여야 한다. PCR증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용한다.
본 발명은 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트 중 어느 하나를 포함하는 히아신스황색썩음병균 진단용 키트 및 이를 이용한 히아신스황색썩음병균 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 히아신스황색썩음병균에 특이적인 유전자 서열을 가지므로, 히아신스황색썩음병균의 진단 및 검출에 효과적이다.
도 1은 본 발명의 PCR 프라이머 세트의 히아신스황색썩음병균에 대한 특이성을 나타내는 전기영동 결과이다.(레인 설명 : M-size marker(1kb), 1~90: [표 2]의 번호를 나타내는 것으로, 그에 상응하는 균들에 대한 전기영동 결과이다.)
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
히아신스황색썩음병균
(
Xanthomonas
hyacinthi
) 검출용
프라이머
쌍의 설계
<1-1> 특이적 염기서열의 정보 탐색
히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)의 특이적인 염기가 존재하는 핵산을 선발하기 위하여 PCR 프라이머 개발에 많이 사용되는 rRNA 및 하우스키핑 유전자 중, 히아신스황색썩음병균 게놈 서열 중 진화에 안정적이고 같은 종 혹은 하위 분류군 중 변이가 드물어 종 보존적이고 병원 세균 진단용 PCR 프라이머에 이상적인 23S rRNA 영역을 표적으로 하였다. 본 발명에서는 유전자은행(GenBank)에 등록되어 전체 염기서열이 분석된 잔토모나스(Xanthomonas) 속 식물병원세균들의 23S rRNA 유전자를 BioEdit 프로그램 (Version7.0.9.0)에 설치되어 있는 ClustalW 다중 정렬 프로그램을 이용하여 히아신스황색썩음병균의 23S rRNA 유전자와 비교 분석하였다.
그 결과, 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)의 23S rRNA의 염기 서열 중, 일부 서열이 상기 미생물에만 특이적으로 존재함을 확인하였다.
<1-2> 특이 서열 증폭을 위한
프라이머
쌍의 제작
상기 실시예 <1-1>에서 특이성이 확인된 23S rRNA 유전자를 이용하여 하기 [표 1]과 같이 히아신스황색썩음병균에 특이적인 중합효소연쇄반응의 전방향 및 역방향 프라이머 쌍을 제조하였다.
서열번호 | 프라이머 | 염기서열 | 길이(mer) | 방향 |
1 | Xan23S-F73 | CATACACGGTCCCCGATCCGGATT | 24 | Forward |
2 | Xan23S-R71 | GAAGCTTGGGGTGCATCGCGT | 21 | Reverse |
<실시예 2>
제조된 프라이머 쌍의 특이성 조사
상기 실시예 1의 프라이머 세트의 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)에 대한 특이성을 조사하고자, PCR 반응을 실시하였다. 하기 [표 2]에 나열한 잔토모나스(Xanthomonas) 속 26종에 속하는 90 strains들의 전체 DNA들을 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Cat.No. 69504)을 이용하여 분리하였다. PCR 반응액은 총 50㎕가 되도록 10mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 200uM dNTP, 10 pmole primer Xan23S-F73, 10 pmole primer Xan23S-R71, 2U Taq DNA polymerase를 넣고, 증류수로 그 양을 맞췄다. 이 반응액을 95℃ 1분-68℃ 1분-72℃ 3분으로 30회 증폭시킨 후, 72℃ 7분간 처리하였다. 상기 PCR 산물은 agarose gel로 전기영동 한 결과를 [도 1]에 기재하였다.
[도 1]에서 보듯이, 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi)에 대해서만 밴드가 나타났고, 나머지 잔토모나스 속 미생물에서는 밴드가 나타나지 않았다. 따라서 상기 <실시예 1>의 프라이머 세트가 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 만을 특이적으로 검출한다는 것을 알 수 있다.
균번호 | 병원균 이름 | 다른 균번호 | 기주 | 분리지역 | |
1 | 622 | hyacinthi | LMG739T | Hyacinthus orientalis | 네덜란드 |
2 | 2205 | alfalfae subsp.alfalfae | ICMP5718T | Medicago sativa | 인도 |
3 | 2935 | alfalfae subsp.citrumelonis | ICMP15808t | Citrus sp. | 미국 |
4 | 2616 | arboricola pv.celebennsis | CFBP3523t | Musa acuminata | 뉴질랜드 |
5 | 2579 | arboricola pv.corylina | CFBP1159t | Corylus maxima | 미국 |
6 | 2633 | arboricola pv.fragariae | CFBP6771t | Fragaria X ananassa | 이탈리아 |
7 | 608 | arboricola pv.juglandis | LMG747T | Jugans regia | 뉴질랜드 |
8 | 2673 | arboricola pv.poinsettiicola | ICMP6274t | Euphorbia pulcherrima | 뉴질랜드 |
9 | 2615 | arboricola pv.populi | CFBP3123t | Populus x canadensis cv.Robusta | 네덜란드 |
10 | 609 | arboricola pv.pruni | LMG852t | Prunus salicina | 뉴질랜드 |
11 | 610 | axonopodis pv.axonopodis | LMG982T | Axonopus scoparius | 콜롬비아 |
12 | 2523 | axonopodis pv.bauhiniae | ICMP5720t | Bauhinia racemosa | 인도 |
13 | 2600 | axonopodis pv.begoniae | CFBP2524t | Begonia sp. | 뉴질랜드 |
14 | 2634 | campestris pv. aberrans | CFBP6865t | Brassica oleracea L.var.capitataL . | 호주 |
15 | 2563 | axonopodis pv.cassavae | LMG8049 | Manihot esculenta | 니제르 |
16 | 2551 | axonopodis pv.cassiae | LMG675t | Cassia tora | 인도 |
17 | 2572 | axonopodis pv.clitoriae | LMG9045t | Clitoria biflara | 인도 |
18 | 2552 | axonopodis pv.coracanae | LMG686t | Eleusine coracana | 인도 |
19 | 2553 | axonopodis pv.cyamopsidis | LMG691t | Cyamopsistetragonolobus | 인도 |
20 | 2554 | axonopodis pv.desmodii | LMG692t | Desmodiumdichotomum | 인도 |
21 | 2555 | axonopodis pv.desmodiigangetici | LMG693t | Desmodium gangeticum | 인도 |
22 | 2573 | axonopodis pv.desmodiilaxiflori | LMG9046t | Desmodium laxi-orum | 인도 |
23 | 2556 | axonopodis pv.desmodiirotundifolii | LMG694t | Desmodium styracifolium | 인도 |
24 | 2557 | axonopodis pv.dieffenbachiae | LMG695t | Anthurium sp. | 브라질 |
25 | 2558 | axonopodis pv.erythrinae | LMG698t | Erythrina variegata | 인도 |
26 | 2196 | axonopodis pv.glycines | ICMP5732t | Glycine max | 수단 |
27 | 2560 | axonopodis pv.lespedezae | LMG757t | Lespedeza sp. | 미국 |
28 | 2959 | axonopodis pv.manihotis | ICMP5741T | Glycine max | 수단 |
29 | 615 | axonopodis pv.nakataecorchori | LMG786t | Corchorus aestuans | 인도 |
30 | 2564 | axonopodis pv.patelii | LMG811t | Crotalaria juncea | 인도 |
31 | 2603 | axonopodis pv.phaseoli | CFBP2534t | Phaseolus vulgaris | 루마니아 |
32 | 2565 | axonopodis pv.phyllanthi | LMG844t | Phyllanthus niruri | 수단 |
33 | 2566 | axonopodis pv.physalidicola | LMG845t | Physalis alkekengi | 일본 |
34 | 2961 | axonopodis pv.poinsettiicola | ICMP5779T | Euphorbia pulcherrima | 인도 |
35 | 2562 | axonopodis pv.rhynchosiae | LMG8021t | Rhynchosia memnonia | 수단 |
36 | 2568 | axonopodis pv.ricini | LMG861t | Ricinus communis | 에티오피아 |
37 | 2522 | axonopodis pv.sesbaniae | ICMP367t | Sesbania sesban | Unknown |
38 | 2576 | axonopodis pv.tamarindi | LMG955t | Tamarindus indica | 인도 |
39 | 2962 | axonopodis pv.vasculorum | ICMP5757T | Saccharum officinarum | 모리셔스 |
40 | 2574 | axonopodis pv.vignaeradiatae | LMG936t | Vigna radiata | 수단 |
41 | 2570 | axonopodis pv.vignicola | LMG8752t | Vigna unguiculata | 미국 |
42 | 2610 | axonopodis pv.vitians | CFBP2538t | Lactuca sp. | 미국 |
43 | 618 | bromi | LMG947T | Bromus carinatus | 프랑스 |
44 | 2550 | axonopodis pv. cajani | LMG558t | Cajanus cajan | 인도 |
45 | 2204 | campestris pv. viticola | ICMP3867t | Vitis sp. | 인도 |
46 | 2936 | fuscans subsp.aurantifolii | ICMP15806t | Citrus limon | 아르헨티나 |
47 | 2588 | translucens pv.graminis | CFBP2053t | Dactylisglomerata | 스위스 |
48 | 2559 | campestris pv.fici | LMG701t | Ficus religiosa | 인도 |
49 | 2621 | melonis | CFBP4644T | Cucumis melo | 브라질 |
50 | 2549 | campestris pv.mori | ICMP13199t | Morus alba | 인도 |
51 | 2561 | campestris pv.nigromaculans | LMG787t | 일본 | |
52 | 2630 | campestris pv.paulliniae | CFBP5862t | Paullinia cupana var.sorbilis | 브라질 |
53 | 2636 | perforans | NCPPB4321T | Lycopersicon esculentum | 미국 |
54 | 2201 | campestris pv.sesami | ICMP621t | Sesamum indicum | 수단 |
55 | 2617 | campestris pv.armoracieae | CFBP3838t | Iberis sp. | 탄자니아 |
56 | 620 | cassavae | LMG673T | Manihot esculenta | 말라위 |
57 | 2934 | citrisubsp.citri | ICMP15804T | Citrus aurantiifolia | 미국 |
58 | 2958 | citri subsp.malvaceaerum | ICMP217T | Gossypium sp. | 미국 |
59 | 2622 | codiaei | CFBP4690T | Codiaeum variegatum | 미국 |
60 | 621 | cucurbitae | LMG690T | Cucurbita maxima | 뉴질랜드 |
61 | 2619 | cynarae | CFBP4188T | Cynara scolymus | 프랑스 |
62 | 2674 | euvesicatoria | ICMP109T | Capsicum frutescens | 미국 |
63 | 2598 | fragariae | CFBP2157T | Fragaria ananassa | 미국 |
64 | 2960 | fuscans pv.fuscans | ICMP239T | Phaseolus vulgaris | 카나다 |
65 | 2628 | campestris pv.barbareae | CFBP5825t | Barbarea vulgaris | 미국 |
66 | 2635 | gardneri | NCPPB88T | Lycopersicon esculentum | 유고 |
67 | 2625 | hortorum pv.carotae | CFBP4997t | Daucus carota var.sativa | 헝가리 |
68 | 2624 | hortorum pv.hederae | CFBP4925T | Hedera helix | 미국 |
69 | 2602 | hortorum pv.pelargonii | CFBP2533t | Pelargonium sp. | 뉴질랜드 |
70 | 2606 | hortorum pv.taraxaci | CFBP410t | Taraxacum kok-sahgyz | 미국 |
71 | 2575 | hortorum pv.vitians | LMG938 | Lactuca sativa | 짐바브와 |
72 | 619 | campestris pv.campestris | LMG568T | Brassica oleracea var.gemmifera | 영국 |
73 | 2601 | campestris pv.incanae | CFBP2527t | Matthiola sp. | 미국 |
74 | 2203 | oryzae pv.oryzae | ICMP3125T | Oryza sativa | 인도 |
75 | 623 | oryzae pv.oryzicola | LMG797t | Oryza sativa | 필리핀 |
76 | 2629 | campestris pv.raphani | CFBP5827t | Raphanus sativus | 미국 |
77 | 2200 | pisi | ICMP570T | Pisum sativum | 일본 |
78 | 625 | populi | LMG5743T | Populus canadensis | 프랑스 |
79 | 2620 | sacchari | CFBP4641T | Saccharum officinarum | 과들르프 |
80 | 2623 | theicola | CFBP4691T | Camellia sinensis | 일본 |
81 | 2591 | translucens pv.arrhenatheri | CFBP2056t | Arrhenatherum elatius | 스위스 |
82 | 2612 | translucens pv.cerealis | CFBP2541t | Bromus inermis | 카나다 |
83 | 2593 | translucens pv.phlei | CFBP2062t | Phleum pratense | 노르웨이 |
84 | 2611 | translucens pv.phleipratensis | CFBP2540t | Phleum pratense | 미국 |
85 | 2592 | translucens pv.poae | CFBP2057t | Poa trivialis | 스위스 |
86 | 2605 | translucens pv.secalis | CFBP2539t | Secale cereale | 카나다 |
87 | 2589 | translucens pv.translucens | CFBP2054T | Hordeum vulgare | 미국 |
88 | 2963 | translucens pv.undulosa | ICMP5755T | Triticum sp. | 카나다 |
89 | 2613 | vasicola pv.holcicola | CFBP2543T | Sorghum vulgare | 뉴질랜드 |
90 | 626 | vesicatoria | LMG911T | Lycopersicon esculentum | 이태리 |
본 발명은 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 PCR 프라이머 세트에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트 중 어느 하나를 포함하는 히아신스황색썩음병균 진단용 키트 및 이를 이용한 히아신스황색썩음병균 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 히아신스황색썩음병균에 특이적인 유전자 서열을 가지므로, 히아신스황색썩음병균의 진단 및 검출에 사용할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Rural Development Administration (Republic of korea)
<120> Primer set for detection of Xanthomonas hyacinthi and diagnostic
kit using the same
<130> NP12-0013
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
catacacggt ccccgatccg gatt 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
gaagcttggg gtgcatcgcg t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
gtatgtgcca ggggctaggc ctaa 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
cttcgaaccc cacgtagcgc a 21
Claims (4)
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 프라이머 세트.
- 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 프라이머 세트.
- 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출용 키트.
- (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 분리된 DNA를 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 히아신스황색썩음병균(Xanthomonas hyacinthi) 검출 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120057399A KR101424094B1 (ko) | 2012-05-30 | 2012-05-30 | 히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120057399A KR101424094B1 (ko) | 2012-05-30 | 2012-05-30 | 히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20130134118A true KR20130134118A (ko) | 2013-12-10 |
KR101424094B1 KR101424094B1 (ko) | 2014-07-28 |
Family
ID=49981789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020120057399A KR101424094B1 (ko) | 2012-05-30 | 2012-05-30 | 히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101424094B1 (ko) |
-
2012
- 2012-05-30 KR KR1020120057399A patent/KR101424094B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101424094B1 (ko) | 2014-07-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20120053792A (ko) | 잔토모나스 속 미생물 검출용 pcr 프라이머 쌍 및 이를 이용한 잔토모나스 속 미생물 검출 방법 | |
KR20140007575A (ko) | 십자화과 흑부병원균의 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
KR101334853B1 (ko) | 우엉세균점무늬병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 | |
KR101424094B1 (ko) | 히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 | |
KR100560996B1 (ko) | 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이표지인자 | |
KR101359497B1 (ko) | 히아신스황색썩음병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 | |
DE69631413T2 (de) | Nachweis einer bakterie der pectinatus gattung | |
KR101149437B1 (ko) | 벼흰잎마름병균의 유전자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 레이스 판별 방법 | |
Lee et al. | Development of molecular biological methods to analyze bacterial species diversity in freshwater and soil ecosystems | |
KR101953823B1 (ko) | 딸기세균모무늬병균 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단용 키트 | |
KR101413123B1 (ko) | 벼잎줄무늬병원균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
KR101273270B1 (ko) | 참깨 세균잎마름병균 검출용 pcr 프라이머 쌍 및 이를 이용한 참깨 세균잎마름병균 검출 방법 | |
KR20150074846A (ko) | Xanthomonas axonopodis pv. nakataecorchori 검출용 프로브 또는 프라이머 제조 방법 | |
KR20120053831A (ko) | 비단향꽃무 세균마름병균 검출용 pcr 프라이머 쌍 및 이를 이용한 비단향꽃무 세균마름병균 검출 방법 | |
JPH06253847A (ja) | 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 | |
KR20150074845A (ko) | Xanthomonas campestris pv. lespedezae 검출용 프로브 또는 프라이머 제조 방법 | |
KR101367996B1 (ko) | 곡류세균병균 검출용 프라이머 세트 | |
KR101367997B1 (ko) | 차나무세균궤양병 원인세균 검출용 프라이머 세트 | |
Yasmin et al. | RFLP-based relationship of Pakistani isolate of Banana bunchy top virus with South Pacific virus group | |
KR101444237B1 (ko) | 배추과 세균병균 검출용 프라이머 세트 | |
KR101359531B1 (ko) | 펙토박테리움 와사비에 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
KR101424144B1 (ko) | 산토모나스 디에이 동정방법 | |
KR20120053790A (ko) | 잔토모나스 속 미생물 검출용 pcr 프라이머 쌍 및 이를 이용한 잔토모나스 속 미생물 검출 방법 | |
JP3448639B2 (ja) | オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法 | |
CN112322750A (zh) | 烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基V101I突变及其在桃蚜抗性检测中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |