KR20130091759A - 타우병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

타우병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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리차드 엘. 왓슨
앤소니 비. 우드
그레고리 제이. 아챔보
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Abstract

염증성 신경변성 병태 또는 질환 (예를 들어, 타우병증) 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하기에 충분한 양으로 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 동전기적으로 변경된 유체 (예를 들어, 동전기적으로 변경된 기체-강화 유체 및 용액)이 제공된다. 이러한 동전기적으로 변경된 유체 또는 치료 조성물 및 방법은 임의로는 다른 치료제와 조합된 동전기적으로 변경된 이온성 수성 유체를 포함한다. 특정 측면들은 타우 단백질의 인산화 및/또는 응집을 조정하는 것 (예를 들어, 감소시키는 것)을 제공한다. 특정 측면들은 세포막 전위 및/또는 전도도, 막 단백질 예컨대 막 수용체 (G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함하지만 이에 한정되지 않음), 및 세포간 연접 (예를 들어, 치밀 연접, 간극 연접, 부착대(zona adherens) 및 데스모솜(desmosome)) 중 하나 이상의 조정에 의해 상기 염증 반응과 연관된 세포내 신호 전달을 조절 또는 조정하는 것을 제공한다. 기타 실시양태들은 이러한 동전기적으로 변경된 유체 및 치료 조성물에 대한 특정 투여 경로 또는 제제를 포함한다.

Description

타우병증의 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF TAUPATHY}
발명의 분야
특정 측면들은 일반적으로 염증성 신경변성 질환 (예를 들어, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중/대뇌 허혈, 두부 외상, 척수 손상, 헌팅톤병, 편두통, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, AIDS와 연관된 염증성 신경변성 병태, 연령-관련 인지 저하; 타우병증, 경도 인지 장애 및 포유동물에서의 프리온 질환), 더욱 특정 측면에서는 타우병증 (예를 들어, 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병), 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증)), 및 신경염증을 조절 또는 조정하는 것, 더욱 특히 본원에 개시된 바와 같은 동전기적으로 생성된 기체-강화 (예를 들어, 산소-강화) 유체가 포함되는 하나 이상의 본원에 개시된 바와 같은 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, 동전기적으로 생성된 기체-강화 유체)를 포함하는 치료 조성물을 투여하는 것에 의해 대상체에서 타우병증 또는 타우병증 질환의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 추가적인 측면들은 조합 요법에 관한 것이다.
발명의 배경
신경변성 질환은 뉴런 또는 그의 말이집의 열화를 특징으로 하는 일군의 질환이다. 이러한 뉴런 파괴는 결국 기능이상 및 신체 장애를 초래한다. 종종 염증이 신경변성 질환이 성분인 것으로 발견되고, 신경변성의 발병기전에 더해진다 (문헌 [Minagar, et al. (2002) J. Neurological Sci. 202:13-23]; [Antel and Owens (1999) J. Neuroimmunol. 100: 181-189]; [Elliott (2001) Mol. Brain. Res. 95:172-178]; [Nakamura (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:945-953]; [Whitton PS. (2007) Br J Pharmacol. 150:963-76]). 총괄적으로, 이러한 질환들은 당업계에서 인정되는 염증성 신경변성 질환을 이룬다. 신경염증은 일부 신경변성 장애에서 임의의 상당한 뉴런 상실보다 몇 년 전에 일어날 수 있다 (문헌 [Tansey et al., Fron Bioscience 13:709-717, 2008]). 대식세포, 호중구, T 세포, 성상세포, 및 소교세포를 비롯한 많은 상이한 유형의 면역 세포가 면역-관련 질환, 예컨대 다발성 경화증 (M.S.), 파킨슨병, 아밀로이드증 (예를 들어, 알츠하이머병), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리온 질환, 및 HIV-연관 치매의 병리학에 기여할 수 있다. 더욱 구체적으로, 연구 단체들은 MS에서 미엘린에 대한 손상이 염증 반응에 의해 매개된다는 것 (문헌 [Ruffini et al. (2004) Am J Pathol 164:1519-1522]) 및 백혈구가 CNS에 칩습할 때 M.S. 발병기전이 악화된다는 것 (문헌 [Dos Santos et al. (2008) J Neuroinflammation 5:49])을 주지하였다. 한 연구 단체는 CNS 염증 및 MS에서의 그의 효과를 시험하기 위한 유전학 모델을 개발하였다 (동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)을 통해). 또한, 염증유발성(pro-inflammatory) 시토카인 (특히, TNF-알파)이 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 근위축성 측삭 경화증 (ALS)에서 상승되는 것으로 확인되었다 (문헌 [Greig et al. (2006) Ann NY Acad of Sci 1035:290-315]). 따라서, 이러한 염증성 신경변성 질환들이 항-염증 약물에 의해 효과적으로 치료될 수 있다.
염증성 신경변성 질환은 다발성 경화증 (MS), 파킨슨병, 아밀로이드증 (예를 들어, 알츠하이머병), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), HIV-연관 치매, 뇌졸중/대뇌 허혈, 두부 외상, 척수 손상, 헌팅톤병, 편두통, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, AIDS, 연령-관련 인지 저하; 경도 인지 장애 및 포유동물에서의 프리온 질환을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
다발성 경화증 (MS)은 전 세계적으로 약 1,100,000명의 사람, 특히 청년이 이에 걸린 중추신경계 (CNS)의 만성 염증성 신경변성 질환이다 (문헌 [Pugliatti et al. (2002) Clin. Neurol. Neuros. 104:182-191]). MS는 병리학적으로 신경 조직의 탈수초를 특징으로 하고, 이는 임상적으로 질환 상태의 양성 내지 만성-진행성 패턴의 범위에 이르는 여러 질환 형태 중 하나를 초래한다. 더욱 구체적으로, 다발성 경화증의 5가지 주요 형태가 기술되어 있다: 1) 양성 다발성 경화증; 2) 재발-완화성 다발성 경화증 (RRMS); 3) 속발성 진행성 다발성 경화증 (SPMS); 4) 원발성 진행성 다발성 경화증 (PPMS); 및 5) 진행성-재발 다발성 경화증 (PRMS). 만성 진행성 다발성 경화증은 SPMS, PPMS, 및 PRMS을 총괄적으로 지칭하도록 사용되는 용어이다. 재발 형태의 다발성 경화증은 중첩 재발이 있는 SPMS, RRMS 및 PRMS이다.
질환 과정에 걸쳐, 축삭을 둘러싼 말이집의 진행성 파괴가 있다. 무손상 미엘린이 축삭 통합성의 보존에 필수적이기 때문에 (문헌 [Dubois-Dalcq et al., Neuron. 48, 9-12 (2005)]), 임상적으로, 조직적인 파괴는 결국 저림 및 통증, 협조 및 균형 문제, 실명, 및 일반적인 인지 장애가 포함되는 다양한 신경학적 기능이상을 초래한다. 흥미롭게도, MS 진행은 환자마다 상당히 다를 수 있어, 일부는 병에 걸린 채로 수십 년을 산 후에도 신체장애가 가벼운 한편, 다른 이들은 진단되고 나서 불과 몇 년 후에 휠체어에 의존적이게 된다.
MS의 병인학은 현재 미지이지만, 유전학 증거, 분자적 기초 및 면역학 인자를 시험하는 연구들이 질환 과정 및 탈수초가 일어나는 메카니즘을 해명하기 위해 시작되고 있다. 유전학적 분석에서, 일부 보고는 친척들이 정상 집단 (0.1％의 MS 유병률)과 비교했을 때 MS 발병률이 더 높다는 것을 가리켰다: 일란성 쌍둥이는 한 명이 MS에 걸렸을 때 다른 한 명에서 질환이 발달될 가능성이 30％이고, 이란성 쌍둥이 및 형제자매는 다른 형제자매가 MS에 걸렸을 때 가능성이 1-2％이다. 여러 단체가 이러한 유전가능성을 담당하는 유전자들을 발견하기 위해 연관 및 연합 연구를 이용하였고, MS에 걸릴 상대 위험도가 인간 백혈구 항원 (HLA)-DR2 대립유전자의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 대립유전자를 보유하는 이들에서 3-4배 더 높다는 것을 발견하였다. MS와 연관된 기타 유전자들이 확인되었지만, 위험도가 훨씬 더 낮았다. MS 감수성과 MHC 클래스 II 사이의 연관은 MS 발병기전에서의 CD4+ T-세포에 대한 역할을 강력하게 시사한다 (문헌 [Oksenberg et al., JAMA 270:2363-2369 (1993)]; [Olerup et al., Tissue Antigens 38:1-3 (1991)]).
또한, 건강한 개체와 비교하여 MS를 앓고 있는 MS 환자에서 차별적으로 발현되는 유전자들의 확인이 시도되었다. 유전자 마이크로어레이를 사용하여, 1) MS 플라크 유형 (급성 대 만성) 및 플라크 영역 (활성 대 불활성)으로부터 전사를 시험하고 (문헌 [Lock and Heller (2003)]); 2) 인터페론-β 치료를 받은 환자 및 받지 않은 환자 둘 모두로부터, 대조군에 대해 RRMS 환자에서의 말초혈 단핵구 (PBMC)를 비교하고 (문헌 [Sturzebecher et al. (2003)]); 3) MS의 동물 모델인, 마우스에서의 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)의 병기들에서 CNS 세포를 시험하였다 (문헌 [Lock et al. (2002)]). 항-염증성, 항-아폽토시스성 유전자들이 하향 조절되고 염증유발성 증식 유전자들이 상향 조절된다는 발견을 포함하여, 이러한 실험들에서 발견된 것들 중 다수가 예상되었다. 뜻밖의 결과에는 치료 용도를 위한 잠재적인 신규 표적 예컨대 오스테오폰틴 (문헌 [Chabas et al. 2001]) 및 TRAIL (문헌 [Wandinger et al. 2003])의 확인이 포함된다. 그러나, MS 환자로부터의 발현을 건강한 개체와 비교했을 때 조절이 차별적인 유전자들 중 다수가 MS 발달에서의 유의성이 미지인데, 이는 MS 감수성 및/또는 진행에 영향을 미칠 수 있는 임의의 유전자가 여전히 미지이기 때문이다.
추가적인 연구에서, 자가반응성 CD4+ T-세포에 의해 시작되는 염증 반응이 미엘린에 대한 손상을 매개할 수 있다는 것이 결정되었다 (문헌 [Bruck et al., J. Neurol. Sci. 206:181-185 (2003)]). 일반적으로, MS 에피소드 중에 말이집 및 축삭에 발생하는 손상 중 다수가 염증유발성 (예를 들어 Th1 및 Th17) 시토카인의 분비를 포함하는 염증 반응을 일으키는 자가반응성 T 세포 반응을 통해 일어나는 것으로 여겨진다 (문헌 [Prat et al., J. Rehabil. Res. Dev. 39:187-199 (2002)]; [Hemmer et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:291-301 (2002)]).
MS에 대해 현재 이용가능한 치료에는 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 나탈리주맙, 및 미톡산트론이 포함된다. 일반적으로, 이러한 약물들은 비-특이적 방식으로 면역계를 억제하고, 가까스로만 질환의 전체적인 진행을 제한한다 (문헌 [Lubetzki et al. (2005), Curr. Opin. Neurol. 18:237-244]). 따라서, MS를 더 잘 치료하기 위한 치료 전략을 개발하는 것이 요구된다.
글라티라머 아세테이트는 글루탐산, 리신, 알라닌 및 티로신으로 무작위 중합체로서 구성된다. 글라티라머 아세테이트는 유효성이 제한되고, 유의한 부작용, 예를 들어, 주사 부위에서의 혹, 오한, 열, 통증, 숨가쁨, 빠른 심장박동 및 불안이 있다. 943명의 원발성 진행성 MS 환자를 이용하는 중요한 임상 연구에서, 글라티라머 아세테이트는 신체장애 및 질환의 진행을 정지시키지 못했다 (문헌 [Wolinsky, et al. (2007) Ann Neurol 61:13-24]).
인터페론-β는 섬유모세포에 의해 생산되는 천연 발생 단백질이고, 선천 면역 반응의 일부이다. MS에 대한 약물로서, 인터페론-β는 MS 에피소드의 속도를 감소시키는 것에서 약 18-38％ 효과적이다. 부작용에는 플루-유사 증상 및 주사 부위에서의 반응과 같은 경도 부작용 및 더욱 심각한 부작용 (예를 들어, 우울증, 발작, 및 간 문제)이 포함된다.
미톡산트론은 MS에 대한 치료이다. 이는 암에 대항하는 것에서 사용하기 위한 화학요법 치료로서 개발되었고 (DNA 복구 및 합성을 방해하는 것에 의해 작용함), 암 세포에 대해 특이적이지 않다. 미톡산트론으로부터의 부작용은 꽤 중증일 수 있고, 오심, 구토, 탈모, 심장 손상, 및 면역억제가 이에 포함된다.
나탈리주맙은 세포성 부착 분자인 알파4-인테그린을 표적으로 하는 인간화 모노클로날 항체이다. 나탈리주맙은 염증을 야기하는 면역 세포를 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르지 못하게 함으로써 작용하는 것으로 여겨진다. 부작용에는 피로, 두통, 오심, 감기, 및 알레르기성 반응이 포함된다.
또 다른 염증성 신경변성 질환인 파킨슨병은 근육 강직 및 느린 신체 운동이 포함되는 운동 장애를 특징으로 한다. 파킨슨병에 대한 최근의 연구에서, 시토카인 및 HLA-DR 항원의 강화된 발현으로 인해, 면역 반응이 뉴런 손상에 기여할 것 같다는 것이 관찰되었다 (문헌 [Czlonkowska et al. (2002) Med Sci Monit 8:RA165-77]).
아밀로이드증은 특정 단백질이 구조가 변경되고 서로 결합하여 특정 조직 내에서 집결되고 정상적인 조직 기능화를 차단하는 경향이 있을 때 발달된다. 이러한 변경된 구조의 단백질이 아밀로이드로 칭해진다. 종종, 아밀로이드증은 2개의 카테고리로 나뉜다: 원발성 또는 속발성. 원발성 아밀로이드증은 면역 세포 기능이 부적절한 질병으로부터 발생한다. 속발성 아밀로이드증은 일반적으로 일부 다른 만성 감염성 또는 염증성 질환의 합병증으로부터 발생한다. 그의 예로는 알츠하이머병 및 류마티스 관절염이 포함된다. 속발성 아밀로이드증에서 기초를 이루는 문제는 염증이기 때문에, 염증 치료가 이로울 것이다.
알츠하이머병은 또 다른 유형의 염증성 신경변성 질환이다. 이는 학습 및 기억 장애가 증가하는 것에 의해 예증되지만, 이러한 질환은 변경된 인지 능력을 가리키는 다른 방식으로 스스로를 나타낼 수 있다. 이러한 질환 전반에 걸쳐, 대뇌 피질 내의 뉴런 및 시냅스의 진행성 상실은 신경 조직의 총체적인 위축을 초래한다. 알츠하이머병의 원인은 미지이지만, 많은 이들은 염증이 중요한 역할을 한다고 믿고, 염증이 이러한 질환의 발병기전에 상당히 기여하는 것으로 임상 연구에서 나타났다 (문헌 [Akiyama, et al. (2000) Neurobiol Aging. 21:383-421]).
근위축성 측삭 경화증에서, 염증과 이러한 질환 사이의 연관이 제안되었다 (문헌 [Centonze, et al. (2007) Trends Pharm Sci 28:180-7]). 또한, TNF-알파 mRNA가 근위축성 측삭 경화증에 대한 트랜스제닉(transgenic) 마우스 모델의 척수에서 발현되는 것으로 발견되었다. 흥미롭게, 이러한 전사물이 빠르게는 운동 곤란이 개시되기 전부터 ALS에 의해 사망이 야기될 때까지 검출되었다 (문헌 [Elliot (2001) Brain Res Mol Brain Res 95:172-8]).
타우병증. 타우병증은 인간 뇌 내의 신경원섬유 매듭 (NFT) 내의 타우 단백질의 병리학적 응집으로부터 초래되는 신경변성 질환 클래스이다. 타우 단백질은 미세소관 안정화에서 수반되고, 주로 중추신경계 내의 뉴런 내에 위치한다. 타우 단백질이 결손성이 되고, 따라서 더 이상 미세소관을 적절하게 안정화시키지 않으면, 이는 치매, 예컨대 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병) 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증; 신경원섬유 매듭이 적어도 DP에서 연루됨)를 초래할 수 있다. 상기 열거된 비-알츠하이머 타우병증들은 때때로 "픽 복합증(Pick's complex)"으로 함께 분류된다.
발명의 개요
특정 측면들에서, 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이고 대상체에서의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상에 대한 치료를 제공하기 위한 타우 인산화의 조정에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 동전기적으로 변경된 수성 유체의 치료 유효량을 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은, 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된다. 특정 실시양태에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 유체 내의 주요 전하-안정화 기체-함유 나노구조물 종이다. 일부 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물로서 유체 내에 존재하는 용존 산소 분자의 백분율은 0.01％ 초과; 0.1％ 초과; 1％ 초과; 5％ 초과; 10％ 초과; 15％ 초과; 20％ 초과; 25％ 초과; 30％ 초과; 35％ 초과; 40％ 초과; 45％ 초과; 50％ 초과; 55％ 초과; 60％ 초과; 65％ 초과; 70％ 초과; 75％ 초과; 80％ 초과; 85％ 초과; 90％ 초과; 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율이다. 특정 측면에서, 총 용존 산소는 실질적으로 전하-안정화 산소-함유 나노구조물 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 평균 직경은 실질적으로 90 nm; 80 nm; 70 nm; 60 nm; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; 및 5 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기 미만이다.
특정 측면에서, 이온성 수용액은 염수 용액을 포함한다.
특정 측면에서, 유체는 과산소화된다.
특정 측면에서, 유체는 용매화 전자 형태를 포함한다.
특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 변경은 유체역학적으로 유도된 국소적인 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함한다. 일부 측면에서, 국소화된 동전기적 효과에 대한 노출은 전압 펄스 및 전류 펄스 중 하나 이상에 대한 노출을 포함한다. 특정 측면에서, 유체역학적으로 유도된 국소적인 동전기적 효과에 대한 유체의 노출은 유체를 생성시키는데 사용된 장치의 동전기적 효과-유도 구조 특징에 대한 유체의 노출을 포함한다.
일부 측면에서, 타우병증은 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병), 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 타우병증은 하나 이상의 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 및 전두측두엽 변성 (픽병)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 타우병증은 전두측두엽 치매를 포함한다.
일부 측면에서, 타우병증의 하나 이상의 증상은 중추신경계 및 뇌에서의 만성 염증 및 중추신경계 및 뇌에서의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태에 관련된다.
특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 산화질소의 국소 또는 세포 수준을 조정한다. 일부 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 IL-1베타, IL-8, TNF-알파, 및 TNF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 투여 부위에서의 국소적인 감소를 촉진한다.
특정 방법 측면은 또 다른 항-염증제로 대상체를 동시에 또는 보조적으로 치료하는 것에 의한 염증의 상승작용적 또는 비-상승작용적 억제 또는 감소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 다른 항-염증제는 스테로이드 또는 글루코코르티코이드 스테로이드 (예를 들어, 부데소니드(Budesonide) 또는 그의 활성 유도체를 포함하는 글루코코르티코이드 스테로이드)를 포함한다.
특정 방법 측면은 하나 이상의 추가 치료제를 환자에게 투여하는 조합 요법을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 치료제는 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 미톡산트론, 나탈리주맙, MMP-9 및 MMP-2 억제제를 비롯한 MMP 억제제, 단기-작용 β2-효능제, 장기-작용 β2-효능제, 항콜린제, 코르티코스테로이드, 전신성 코르티코스테로이드, 비만 세포 안정화제, 류코트리엔 조절제, 메틸크산틴, β2-효능제, 알부테롤, 레발부테롤, 피르부테롤, 아르포르모테롤, 포르모테롤, 살메테롤, 이프라트로퓸 및 티오트로퓸을 비롯한 항콜린제; 베클로메타손, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손, 모메타손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손을 비롯한 코르티코스테로이드; 몬테루카스트, 자피르루카스트 및 질류톤을 비롯한 류코트리엔 조절제; 크로몰린 및 네도크로밀을 비롯한 비만 세포 안정화제; 테오필린을 비롯한 메틸크산틴; 이프라트로퓸과 알부테롤, 플루티카손과 살메테롤, 부데소니드와 포르모테롤을 비롯한 조합 약물; 히드록시진, 디펜히드라민, 로라타딘, 세티리진 및 히드로코르티손을 비롯한 항히스타민제; 타크롤리무스 및 피메크롤리무스를 비롯한 면역계 조정 약물; 시클로스포린; 아자티오프린; 미코페놀레이트모페틸; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 TSLP 및/또는 TSLPR 길항제이다 (예를 들어, TSLP 및/또는 TSLPR 길항제는 TSLP 및 TSLP 수용체에 특이적인 중화 항체, 가용성 TSLP 수용체 분자, 및 TSLP 수용체 융합 단백질 (TSLPR-이뮤노글로불린 Fc 분자 또는 1개 초과의 수용체 사슬의 성분을 코딩하는 폴리펩티드 포함)로 이루어진 군으로부터 선택된다).
일부 측면에서, 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정은 막 회합 단백질의 입체형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성 중 하나 이상의 조정을 포함하는 세포막 구조 또는 기능 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 막 회합 단백질은 수용체, 막횡단 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 막횡단 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함한다. 일부 측면에서, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 G 단백질 α 서브유닛과 상호작용한다 (예를 들어, G 단백질 α 서브유닛은 Gαs, Gαi, Gαq, 및 Gα12로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다).
특정 실시양태에서, 세포막 전도도를 조정하는 것은 전체-세포 전도도를 조정하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 전체-세포 전도도를 조정하는 것은 전체-세포 전도도의 하나 이상의 전압-의존적 기여물을 조정하는 것을 포함한다.
특정 측면에서, 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정은 칼슘 의존적 세포성 메시지 전달(messaging) 경로 또는 시스템의 조정; 포스포리파제 C 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것; 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것; 및 중추 신경 및 뇌에서의 만성 염증 및 중추 신경 및 뇌에서의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태 또는 증상과 연관된 세포내 신호 전달을 조정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함한다.
일부 측면들은 세포 네트워크 또는 층에 대한 투여를 포함하고, 추가로 그 내부에서의 세포간 연접의 조정을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포간 연접은 치밀 연접, 간극 연접, 부착대(zona adherens) 및 데스모솜(desmosome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 네트워크 또는 층은 CNS 혈관 내의 내피 세포 및 내피-성상세포 치밀 연접, 혈액-뇌척수액 치밀 연접 또는 장벽, 폐 상피-유형 연접, 기관지 상피-유형 연접, 및 장 상피-유형 연접으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소는 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 동전기적으로 변경된 유체의 전하-안정화 산소-함유 나노구조물 내에 존재하는 산소의 양은 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상이다.
일부 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 용매화 전자 형태 및 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용매화 전자 형태 또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종은 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상, 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체는 적어도 부분적으로 분자 산소에 의해 안정화된 용매화 전자를 포함한다.
특정 측면에서, 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상을 조정하는 능력이 밀폐된 기밀(gas-tight) 용기에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 또는 그를 초과하는 기간 동안 지속된다.
일부 측면에서, 막 회합 단백질은 CCR3을 포함한다.
특정 측면에서, 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하는 것은 세포내 NF-κB 발현 및/또는 활성의 조정을 포함한다.
추가적인 측면에서는, 대상체의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제를 수득하는 단계; 및 이러한 치료제를, 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이고 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 일정량의 동전기적으로 변경된 수성 유체와 조합하는 단계이며, 여기서 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제를 제제화하는 것이 제공되는 것인 단계를 포함하는, 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제를 제제화하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은, 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된다.
추가적인 측면에서는, 대상체의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제; 및 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이고 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 일정량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가적인 측면에서는 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 제약 조성물이 제공된다.
일부 측면에서, 치료는 국소, 흡입, 비강내, 경구, 정맥내 (IV) 및 복강내 (IP) 중 하나 이상에 의한 투여를 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 유체의 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 본원에 개시된 표 1 및 2로부터의 하나 이상의 염 또는 이온을 포함한다.
특정 측면에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
일부 측면에서, 치료는 타우 인산화의 조정을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 기체-강화 유체 및 탈이온 대조군 유체의 존재 하에서의 분열촉진 검정의 시토카인 프로파일을 도해한다.
도 2는 가압 용기의 산소화 유체 (1), 본 발명의 기체-강화 유체 (2), 또는 대조군 탈이온 유체 (3)의 존재 하에서 비장세포를 MOG와 접촉시키는 것의 결과를 도해한다.
도 3 a-c는 2가지 시점 (15분 (왼쪽 패널) 및 2시간 (오른쪽 패널)) 및 상이한 전압 프로토콜에서 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RNS-60 및 솔라스(Solas))의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑(patch clamping) 실험의 결과를 명시한다.
도 4 A-C는, 도 3 a-c에 관련된 실험에 관련되어, 3가지 전압 프로토콜 (A. 0 mV부터 스테핑(stepping); B. -60 mV부터 스테핑; C. -120 mV부터 스테핑) 및 2가지 시점 (15분 (흰색 원) 및 2시간 (흑색 원))에서 솔라스 전류 데이터를 RNS-60 전류 데이터에서 차감하는 것으로부터 생성되는 그래프를 나타낸다.
도 5 a-d는 상이한 외부 염 용액들을 사용하여 상이한 전압 프로토콜 (패널 A 및 C는 0 mV부터의 스테핑을 나타내고; 패널 B 및 D는 -120 mV부터의 스테핑을 나타낸다)에서 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, 솔라스 (패널 A 및 B) 및 RNS-60 (패널 C 및 D))의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과를 명시한다.
도 6 a-d는, 도 5 a-d에 관련된 실험에 관련되어, 솔라스 (패널 A 및 B) 및 레베라(Revera) 60 (패널 C 및 D)에 대해 2가지 전압 프로토콜 (패널 A 및 C: 0 mV부터의 스테핑; B 및 D: -120 mV부터의 스테핑)에서 CsCl 전류 데이터 (도 5에서 제시됨)를 20 mM CaCl2 (다이아몬드) 및 40 mM CaCl2 (흑색 사각형) 전류 데이터에서 차감하는 것으로부터 생성된 그래프를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가 다발성 경화증 (MS)의 당업계-공인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 래트 모델에서 실질적으로 효능이 있었음을 나타낸다.
도 8은 도 7에서 제시된 실험에서 사용된 EAE 유도 및 처치 요법의 개략적인 묘사를 나타낸다.
도 9A는 도 7 및 8에서 제시된 실험에서 사용된 EAE 처치 요법에 적용된 동물의 체중 (그램 단위)의 그래프식 표현이다. 도 9B는 EAE 처치 요법에 적용된 동물의 체중에서의 계산된 변화 (백분율 단위)를 나타낸다.
도 10 a-d는 도 7 및 8에서 제시된 실험에서 사용된 바와 같은 EAE 처치 요법 동안 비히클 대조군에 비교했을 때 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가 총 백혈구 (WBC), 호중구 및 림프구의 수준에 대해 거의 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 패널 A, B, C, 및 D는 각각 연구 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일의 결과를 나타낸다.
도 11 a-h (a-d)는 도 7 및 8에서 제시된 실험에서 사용된 바와 같은 EAE 처치 요법이 시작되고 나서 7일 후 (a-d) 및 18일 후 (e-h)의 시토카인 수준에 대한 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)의 효과를 나타낸다. 패널 A 및 E는 처치 후의 IL-17 수준을 나타낸다. 패널 B 및 F는 처치 후의 IL-1α 수준을 나타낸다. 패널 C 및 G는 처치 후의 IL-1β 수준을 나타낸다. 패널 D 및 H는 처치 후의 IL-4 수준을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가 마우스 소교 세포 (BV-2 소교 세포)에서의 유도성 산화질소 신타제 (iNOS) 및 인터류킨-1β (IL-1β)의 MPP+-유도 발현을 약화시키지만 대조군 생리 염수 (NS)는 그렇지 않다는 것을 나타낸다.
도 13은 RNS60이 인간 SHSY5Y 뉴런 세포의 원섬유성 Aβ(1-42)-매개 아폽토시스를 억제하지만 생리 염수 대조군 (NS)은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 분화 후, SHSY5Y 세포를 여러 농도의 RNS60 또는 NS와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 1 μM 원섬유성 Aβ(1-42) 펩티드로 공격하였다. 18시간 처리 후, 아폽토시스를 TUNEL (칼바이오켐(Calbiochem))에 의해 모니터링하였다. 대조군으로서 Aβ(42-1) 펩티드를 또한 인큐베이션하였다. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 14는 RNS60이 다발성 경화증 (MS)의 당업계-공인 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 마우스 MOG 모델에서 용량-반응성 방식으로 임상 점수를 억제하는 것에서 실질적으로 효과가 있지만 비히클 대조군 (비히클)은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. RNS-60의 고용량 및 저용량의 치료적 매일 투여 둘 모두, 뿐만 아니라 3일마다의 RNS-60의 고용량 투여 (모든 경우의 RNS-60 투여가 1차 임상 징후와 동반적으로 시작됨)가 임상 점수의 현저한 감소를 나타냈다 (백색 다이아몬드 = 비히클 대조군; 백색 사각형 = 덱사메타손 양성 대조군; 연한 "x" = 임상 징후 개시부터의 저용량 (0.09 ㎖ RNS60) 매일 투여; 진한 "x" = 임상 징후 개시부터의 3일마다의 고용량 (0.2 ㎖ RNS60) 투여; 및 백색 삼각형 = 임상 징후 개시부터의 고용량 (0.2 ㎖ RNS60) 매일 투여).
도 15 A-B는 백혈구 상에서의 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3)의 발현 수준이 생리 염수 또는 RNS-60을 사용하여 비교된 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석의 결과를 명시한다. X축은 샘플의 로그 형광을 나타내고, Y축은 샘플에서 발생한 형광 사건을 나타낸다.
도 16 A-C는 백혈구 상에서의 세포 표면 수용체 CD154 (CD40L) (패널 A); CD11B (패널 B); 및 CD3 (패널 C)의 발현 수준이 생리 염수 또는 RNS-60을 사용하여 비교된 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석의 결과를 명시한다. X축은 샘플의 로그 형광을 나타내고, Y축은 샘플에서 발생한 형광 사건을 나타낸다.
도 17 A-C는 MBP-프라이밍된(primed) T 세포에서의 NFκB 활성화에 대한 RNS60의 효과를 검사한 2가지 겔 이동 실험 (패널 A 및 B) 및 루시퍼라제 활성 (리포터 유전자) 검정 (패널 C)의 결과를 나타낸다.
도 18 a-b는 1차 뉴런에서의 원섬유성 Aβ(1-42)-매개 타우 인산화에 대한 RNS60의 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. β-튜불린 및 포스포-타우에 대한 항체들을 사용하여 이중-표지 면역형광에 의해 타우 인산화를 모니터링하였다. 베타-튜불린이 뉴런에 대한 마커로서 사용되었고, DAPI 염색이 세포의 핵을 가시화하는데 사용되었다.
발명의 상세한 설명
본원에 개시된 일부 실시양태들은 질환 부위를 신규한 동전기적으로 생성된 유체를 포함하는 치료 조성물과 접촉시키거나 또는 대상체 (예를 들어, 포유동물 또는 인간)에게 이러한 치료 조성물을 투여하는 것에 의한 타우병증 (예를 들어, 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병), 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증))을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증성 신경변성 질환의 하나 이상의 증상의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것에 관련된다. 몇몇 구체적인 실시양태에서, 동전기적으로 생성된 유체는 산소-강화 물을 포함하는 동전기적으로 생성된 기체-강화 유체를 포함한다.
타우병증은 인간 뇌 내의 신경원섬유 매듭 (NFT) 내의 타우 단백질의 병리학적 응집으로부터 초래되는 신경변성 질환 클래스이다. 타우 단백질은 미세소관 안정화에서 수반되고, 주로 중추신경계 내의 뉴런 내에 위치한다. 타우 단백질이 결손성이 되고, 따라서 더 이상 미세소관을 적절하게 안정화시키지 않으면, 이는 치매, 예컨대 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병) 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증; 신경원섬유 매듭이 적어도 DP에서 연루됨)를 초래할 수 있다. 상기 열거된 비-알츠하이머 타우병증들은 "픽 복합증"으로 함께 분류된다. 특정 측면에 따르면, 개시된 동전기적으로 생성된 유체는 비-알츠하이머 타우병증 또는 픽 복합증 (예를 들어, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병), DP 등)을 치료하는 것에 대해 실질적으로 유용하다.
호은성 과립 질환 (AGD; 브락병(Braak's disease)으로 또한 칭해짐)은 신경변성 과정을 특징으로 하는 치매의 산발성 후기 발병 형태이고, 이는 변연 구조 (예를 들어, 편도, 해마 및 내기저측(mediobasal) 측두/내비 피질)에 주로 영향을 미친다 (문헌 [Tolnay M et al. Argyrophilic grain disease: widespread hyperphosphorylation of tau protein in limbic neurons. Acta Neuropathol 1997; 93:477-84] (이의 전문이, 특히 타우 단백질의 과다인산화와 AGD의 관련에 대한 이들의 교시내용에 대해, 본원에 포함됨) 참조). 이는 4개의 미세소관-결합 반복물이 있는 비정상적으로 인산화된 타우 단백질 이소형 (4-R 타우)으로 주로 이루어지는 뉴런의 세포질 내에서 발견되는 은-염색 (호은성) 과립 또는 코일 바디(coiled body)를 따라 명명되었다 (문헌 [Togo T et al. Argyrophilic grain disease is a sporadic 4-repeat tauopathy. J Neuropathol Exp Neurol. 2002; 61:547-56]; [Togo T et al. Argyrophilic grain disease: neuropathology, frequency in a dementia brain bank and lack of relationship with apolipoprotein E. Brain Pathol. 2002; 12:45-52] (이들의 전문이, 특히 타우 단백질과 AGD의 관련에 대한 이들의 교시내용에 대해, 본원에 포함됨)). AGD의 증상에는 단기 기억 감소, 단어 찾기 곤란, 읽기 및 쓰기 곤란, 방향 상실, 행동 교란 (성격 변화, 공격성 감정 장애, 및 심술궂음)이 포함된다. 이러한 증상들은 망각에 선행 또는 후행할 수 있다. 발병 나이는 약 70세이고, 질환 기간은 4년 내지 8년이다. 뉴런 변성이 타우 단백질의 기능이상과 연관되었을 것이다. 흥미롭게, AGD는 진행성 핵상 마비 및 피질기저 변성과 같은 다른 타우병증과 공존할 수 있다 (문헌 [Dickson, Neuropathology of Non-Alzheimer Degenerative Disorders. Int J Clin Exp Pathol. 2010; 3(1): 1-23] (이의 전문이, 특히 비-알츠하이머 변성 장애의 신경병리학에 대한 그의 교시내용에 대해, 본원에 포함됨)). 현재, AGD 치료는 알츠하이머병에 대해 사용되는 것들을 포함한다.
전두측두엽 치매 (FTD)는 뇌 전두엽의 변성에 의해 야기되는 임상 증후군이고, 측두엽 뒤로 확장될 수 있다. 이는 전두측두엽 변성에 의해 야기되는 3가지 증후군 중 하나이고, 알츠하이머병에 이어서 두 번째로 가장 통상적인 조기-발병 치매이다 (문헌 [Haberland, C (2010). "Frontotemporal dementia or frontotemporal lobar degeneration--overview of a group of proteinopathies". Ideggyogyaszati szemle 63 (3-4): 87-93] (이의 전문이, 특히 전두측두엽 치매의 신경병리학에 대한 그의 교시내용에 대해, 본원에 포함됨)). 증상들은 전두엽 기능의 기초가 되는 2가지 군으로 (대략적으로) 분류될 수 있다: 행동 증상 (및/또는 성격 변화), 및 실행 기능 문제와 관련된 증상. 행동 증상은 졸음증 및 비자발성을 포함하거나, 또는 반대로 탈억제를 포함한다. 실행 기능은 계획하고 조직화하는 인지 기술이고, 따라서 환자가 복잡한 계획 또는 순서배열(sequencing)을 필요로 하는 기술을 수행할 수 없게 된다. 또한, 원발성 진행성 실어증 (PPA) 및 의미 치매 (SD)가 포함되는 FTD의 구체적인 임상 소견이 있다. 발병 연령은 약 40세 내지 50세이고, 중앙 생존 기간은 7년이다. FTD에 대한 치료가 없다.
진행성 핵상 마비 (스틸-리차드슨-올스제위스키(Steele-Richardson-Olszewsky) 증후군으로 또한 지칭됨)는 진행성 협조 결여, 목 및 몸통 경직, 눈 운동 곤란, 느린 움직임, 인지 기능이상, 및 넘어짐을 초래할 수 있는 보행 곤란을 특징으로 하는, 뇌 내의 특정 신경 세포에 대한 손상에 의해 야기되는 장애이다. PSP는 4R 타우병증 (4개의 반복물이 있는 타우 이소형의 응집)에 속한다 (문헌 [Sergeant N., Wattez A. and Delacourte A. (1999) Neurofibrillary degeneration in progressive supranuclear palsy and corticobasal degeneration: tau pathologies with exclusively exon 10 isoforms. J Neurochem 72, 1243-1249] (이의 전문이 본원에 참고로 포함됨)). PSP는 상이한 방식으로 상이한 진행 속도로 상이한 사람들이 걸리는 매우 독자적인 질환이다. '고전적인' PSP 사례에서의 초기 증상은 갑자기, 일반적으로는 뒤로, 넘어지는 경향을 수반한다. 기타 통상적인 증상에는 목의 경직 및 뒤로 굽혀짐, 및 핵심 진단 특징인 핵상 마비가 포함된다. 이는 '의지가 있는' 상향 응시 및 하향 응시, 즉 환자가 머리는 고정한 상태에서 자발적으로 눈을 위 및 아래로 움직이는 능력에서의 곤란이다. PSP 환자의 걸음걸이는 다소 비틀거리고, 보폭이 넓다. PSP는 파킨슨병과 유사한 증상 (비틀거리는 걸음걸이, 뻣뻣한 움직임 및 경도 치매가 포함됨)을 특징으로 하는 장애이다. PSP는 그의 초기 단계에서 파킨슨병으로 쉽게 오진될 수 있다. 작고 읽기 힘든 손글씨 및 약간의 성격 변화가 종종 이러한 질환의 기타 지표이다. 인지 증상에는 감소된 어휘 유창성, 주의력 결핍, 실행 기능이상, 정보 프로세싱이 느려짐, 및 복잡하고 추상적인 사고에서의 문제가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 환자는 무슨 일이 일어나고 있는지를 여전히 잘 알고 있다. 행동 변화는 감정 불안정 및 화 폭발을 포함한다. 운동 증상이 먼저 오고, 항상 인지 변화에 선행한다. 질환 진행은 5년 내지 10년 사이로 느리다. 발병 연령은 전형적으로 50세 초과이고, 질환 기간은 7년이다. 치료는 증상 제어를 목표로 한다. 진행성 핵상 마비에 대한 공지된 치유가 없다. 레보도파 및 항콜린제 투약이 일시적인 증상 감소를 제공할 수 있다.
피질기저 변성 (CBD) 또는 피질기저핵 신경절 변성 (CBGD)은 대뇌 피질 및 기저핵을 수반하는 희귀한 진행성 신경변성 질환이다. 이는 운동에서의 현저한 장애 및 인지 기능이상을 특징으로 한다. CBD의 증상이 파킨슨병 (PD) 및 진행성 핵상 마비 (PSP)와 같은 다른 질환의 증상과 종종 유사하기 때문에, 임상 진단이 어렵다. CBD는 본질적으로 산발성이다. 성상세포 및 뉴런 내의 병에 걸린 영역 내에 타우 단백질이 응집되면서, 다수의 피질하 핵에 영향을 미치고 전두 및 두정 영역 내의 신피질 내로 확산되는 변성. 유전학적 위험 인자는 타우 유전자 내의 H1H1이다. 4R 타우병증 (4개의 반복물이 있는 타우 이소형의 응집)에 속한다 (문헌 [Sergeant N., Wattez A. and Delacourte A. (1999) Neurofibrillary degeneration in progressive supranuclear palsy and corticobasal degeneration: tau pathologies with exclusively exon 10 isoforms. J Neurochem 72, 1243-1249] (이의 전문이 본원에 참고로 포함됨)). 증상에는 파키슨증의 징후 예컨대 불량한 협조, 운동불능 (운동 부재), 경직 (강제 운동에 대한 저항), 및 평형장애 (균형 손상); 및 사지 근육긴장이상 (비정상적인 근육 자세)이 포함된다. 인지 및 시공간 손상, 실행증 (익숙한, 의도가 있는 움직임을 행하는 능력의 상실), 주춤거리고 더듬거리는 말하기, 간대성 근경련, 및 연하 곤란 (삼키기 어려움)과 같은 기타 증상이 또한 일어날 수 있다. CBD는 진행성 질환이고, 1년 내지 수년의 과정에 걸쳐, CBD에 걸린 사람 대부분이 점진적으로 악화되며, 이때 증상이 상지 및 하지 및 기타 신체 영역을 수반하도록 진행된다. 발병 연령은 약 60세이다. 질환 기간은 5년 내지 10년이다. 현재, 이러한 질환의 진행을 느리게 할 수 있는 약물 또는 기타 요법이 없고, 아주 소수가 증상 완화를 제공한다. 떨림 및 간대성 근경련이 클로나제팜과 같은 약물로 다소 제어될 수 있다. 바클로펜이 경직을 다소 감소시킬 수 있다. 레보도파 및 파킨슨병에서 사용되는 기타 도파민작용성 약물은 좀처럼 이롭지 않지만, 일부 CBD 환자를 도울 수 있다.
전두측두엽 변성 (FTLD)은 두정엽 및 후두엽은 드물면서 뇌의 전두엽 및 측두엽에서의 위축과 연관된 일군의 임상적으로, 병리학적으로, 그리고 유전학적으로 이질성인 장애들에 대한 명칭이다. 65세를 초과하는 군에서, FTLD는 알츠하이머병, 루이체 치매 및 혈관 치매에 이어서 치매의 4번째로 가장 통상적인 원인일 것이다. 65세 미만인 군에서, 이는 알츠하이머병에 이어서 두 번째로 가장 통상적인 원인이다. 일부 환자에서, FTLD 및 알츠하이머병의 증상들이 겹칠 수 있다. FTLD 임상 프로파일을 담당하는 병리학적 과정들은 이질적이고, 타우 유전자 또는 타우 단백질의 상이한 기능이상 (돌연변이, 응집, 비정상적인 생산)에 주로 관련된다. 환자의 피질, 더욱 특히 전두-측두 영역에서 축적되는 여러 유형의 뇌 병변 (픽 바디(Pick body), 신경원섬유 매듭, 성상세포 플라크)에 의해 이러한 상이한 비정상적인 타우 과정들이 드러난다.
권투선수 치매 (DP)는 아마추어 또는 프로 복서, 뿐만 아니라 뇌진탕을 앓는 기타 스포츠의 운동선수가 걸릴 수 있는 신경변성 질환 또는 치매 유형이다. 이는 만성 복서 뇌병증, 외상성 복서 뇌병증, 복서 치매, 권투와 연관된 만성 외상성 뇌 손상 (CTBI-B), 및 펀치-드렁크(punch-drunk) 증후군 ('펀치(punchy)'), 뿐만 아니라 변이 형태인 만성 외상성 뇌병증으로 또한 칭해진다. DP의 증상 및 징후는 때때로 수십 년에 달하는 긴 잠복기에 걸쳐 진행성으로 발달되고, 여기서 평균 발병 시간은 권투 경력을 시작하고 나서 약 12-16년이다. 프로 복서의 약 15-20％가 이러한 병태에 걸리는 것으로 생각된다. 머리에 대한 반복된 일격을 겪은 복서에서 발생하는 이러한 병태는 치매, 또는 정신 능력 감퇴, 기억 문제, 및 파키슨증, 또는 떨림 및 협조 결여로 나타난다. 이는 말하기 문제 및 비틀거리는 걸음걸이를 또한 야기할 수 있다. DP 환자는 부적합하거나 폭발적인 행동을 하기 쉬울 수 있고, 병리학적인 질투 또는 편집증을 나타낼 수 있다. 이러한 증상들을 나타내는 개체들은 DP를 앓고 있는 개인에 대한 또 다른 용어인 "펀치"로 또한 특성화될 수 있다. DP 환자의 뇌는 퇴화되고, 예를 들어 소뇌에서, 뉴런이 상실된다. 알츠하이머병 및 파키슨증에 대해 사용되는 약물로 환자를 치료할 수 있다.
본원에서의 추가적인 실시양태는, 예를 들어 인지 손상의 증상을 경감시키는 것을 포함하여, 타우병증과 관련된 합병증을 예방하거나 경감시키기 위한 치료 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
동전기적으로 생성된 유체:
본원에서 사용된 바와 같은 "동전기적으로 생성된 유체"는 본원에서의 실시예의 목적을 위해 본원에서 상세하게 기술된 예시적인 혼합 장치에 의해 생성된 본 출원인의 발명의 동전기적으로 생성된 유체를 지칭한다 (US200802190088 및 WO2008/052143 (둘 모두 전문이 본원에 참고로 포함됨)을 또한 참조한다). 이러한 동전기적 유체는, 본원에 개시 및 제시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 종래 기술의 산소화 비-동전기적 유체 (예를 들어, 압력 용기의 산소화 유체 등)와 비교하는 것을 포함하여 종래 기술의 비-동전기적 유체와 비교하여 신규하고 근본적으로 독특한 유체를 나타낸다. 본원에서의 다양한 측면에서 개시된 바와 같이, 동전기적으로 생성된 유체는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 독특하고 신규한 물리적 및 생물학적 성질이 있다:
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이고 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 생성된 유체는 유체역학적으로 유도된 국소적인 (예를 들어, 전체적인 유체 부피와 관련하여 균일하지 않은) 동전기적 효과 (예를 들어, 전압/전류 펄스), 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 장치 특징-국소 효과의 존재 하에 생성된 유체를 지칭한다. 특정 측면에서, 상기의 유체역학적으로 유도된 국소화된 동전기적 효과는 본원에 개시 및 논의된 바와 같은 표면-관련 이중층 및/또는 유동 전류 효과와 조합된다.
특정 측면에서, 투여된 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 전하-안정화 산소-함유 나노구조물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 유체는 과산소화된다 (예를 들어, 표준 염수 내에 각각 20 ppm, 40 ppm 및 60 ppm의 용존 산소를 포함하는 RNS-20, RNS-40 및 RNS-60). 특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 유체는 과산소화되지 않는다 (예를 들어, 표준 염수 내에 10 ppm (예를 들어, 주위 수준)의 용존 산소를 포함하는 RNS-10 또는 솔라스). 일부 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체의 염도, 멸균성, pH 등이 유체의 동전기적 생산 시점에 확립되고, 멸균성 유체가 적합한 경로에 의해 투여된다. 별법적으로, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상이 유체 투여 전에 투여 경로와 생리학적으로 상용성이도록 적합하게 조정된다 (예를 들어, 멸균 염수 또는 적합한 희석제를 사용함). 바람직하게는, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상을 조정하기 위해 사용되는 희석제 및/또는 염수 용액 및/또는 완충제 조성물이 또한 동전기적 유체이거나, 또는 다른 방식으로 이와 상용성이다.
특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는, 각각의 경우에 F-, Cl-, Br-, I-, PO4-, SO4-, 및 질소를 기초로 하는 음이온을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 음이온 성분과 함께, 염수 (예를 들어, 하나 이상의 용해된 염(들); 예를 들어, 알칼리 금속을 기초로 하는 염 (Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+ 등), 알칼리 토금속을 기초로 하는 염 (예를 들어, Mg++, Ca++) 등, 또는 전이 금속을 기초로 하는 양성 이온 (예를 들어, Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn 등)를 포함한다. 특정 측면들은 다양한 조합 및 농도로, 임의적으로는 반대이온의 혼합물과 함께, 혼합 염을 기초로 하는 동전기적 유체 (예를 들어, Na+, K+, Ca++, Mg++, 전이 금속 이온(들) 등)를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는 표준 염수 (예를 들어, 약 0.9％ NaCl, 또는 약 0.15 M NaCl)를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는 0.0002 M 이상, 0.0003 M 이상, 0.001 M 이상, 0.005 M 이상, 0.01 M 이상, 0.015 M 이상, 0.1 M 이상, 0.15 M 이상, 또는 0.2 M 이상의 농도로 염수를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체의 전도도는 10 μS/㎝ 이상, 40 μS/㎝ 이상, 80 μS/㎝ 이상, 100 μS/㎝ 이상, 150 μS/㎝ 이상, 200 μS/㎝ 이상, 300 μS/㎝, 또는 500 μS/㎝ 이상, 1 mS/㎝ 이상, 5 mS/㎝ 이상, 10 mS/㎝ 이상, 40 mS/㎝ 이상, 80 mS/㎝ 이상, 100 mS/㎝ 이상, 150 mS/㎝ 이상, 200 mS/㎝ 이상, 300 mS/㎝ 이상, 또는 500 mS/㎝ 이상이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 생물학적으로 활성인 염-안정화 나노구조물 (예를 들어, 염-안정화 산소-함유 나노구조물)의 형성을 허용하는 한, 임의의 염이 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체를 제조하는데 사용될 수 있다.
특정 측면에 따르면, 유체의 이온 성분을 변경시킴으로써, 및/또는 유체의 기체 성분을 변경시킴으로써, 전하-안정화 기체-함유 나노구조물을 포함하는 본 발명의 유체 조성물의 생물학적 효과를 조정할 수 있다 (예를 들어, 증가, 감소, 조율 등).
특정 측면에 따르면, 유체의 기체 성분을 변경시킴으로써 전하-안정화 기체-함유 나노구조물을 포함하는 본 발명의 유체 조성물의 생물학적 효과를 조정할 수 있다 (예를 들어, 증가, 감소, 조율 등). 바람직한 측면에서, 산소가 본 발명의 동전기적 유체를 제조하는데 사용된다. 추가적인 측면에서, 질소, 산소, 아르곤, 이산화탄소, 네온, 헬륨, 크립톤, 수소 및 제논으로부터 선택된 하나 이상의 다른 기체와 산소의 혼합물. 상기 기술된 바와 같이, 기체 구성물(들)을 다양화하는 것과 함께를 포함하여, 이러한 이온들을 또한 다양화할 수 있다.
본원에 개시된 교시내용 및 검정 시스템 (예를 들어, 세포-기반 시토카인 검정, 패치-클램프 검정 등)을 고려하여, 당업자는 본원에 개시된 생물학적 활성을 달성하기 위해 적합한 염 및 그의 농도를 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
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본 개시내용은 당뇨병 또는 당뇨병 관련 장애의 치료에서 유용한, 기체-강화 이온성 수용액, 염수 수용액 (예를 들어, 표준 염수 수용액, 및 본원에서 논의되고 당업계에서 인지될 바와 같은 기타 염수 용액 (임의의 생리학적으로 상용성인 염수 용액 포함)), 세포 배양 배지 (예를 들어, 최소 배지, 및 기타 배양 배지)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 신규 기체-강화 유체를 기재한다. 성장에 필수적인 영양소만 함유하면 배지가 "최소" 배지로 칭해진다. 원핵생물 숙주 세포에 대해, 전형적으로 최소 배지는 탄소, 질소, 인, 마그네슘, 및 미량의 철 및 칼슘의 공급원을 포함한다 (문헌 [Gunsalus and Stanter, The Bacteria, V. 1, Ch. 1 Acad. Press Inc., N.Y. (1960)]). 대부분의 최소 배지는 글루코스를 탄소 공급원으로, 암모니아를 질소 공급원으로, 오르토포스페이트 (예를 들어, PO4)를 인 공급원으로 사용한다. 표적 단백질 생산을 억제하지 않으면서 최적의 성장을 장려하기 위해, 성장되는 특정한 원핵생물 또는 진핵 유기체(들)에 따라 배지 성분이 변화 또는 보충될 수 있다 (문헌 [Thompson et al., Biotech. and Bioeng. 27: 818-824 (1985)]).
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 내부에 용해된 리포터 용질 (예를 들어, 트레할로스)의 13C-NMR 선폭을 조정하는데 적절하다. NMR 선폭 효과는 특정 실시예에서 본원에 기술된 바와 같은 시험 유체에서 예를 들어 용질 '텀블링(tumbling)'을 측정하는 간접적인 방법이다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 하기의 것들 중 하나 이상을 특징으로 한다: -0.14V, -0.47V, -1.02V 및 -1.36V 중 어느 하나에서의 특유의 구형파 전압전류법 피크 차이; -0.9 볼트에서의 폴라로그래프 피크; 및 -0.19 및 -0.3 볼트에서의 폴라로그래프 피크의 부재 (이는 특정 실시예에서 본원에 개시된 바와 같은 동전기적으로 생성된 유체 특유의 것임).
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 세포막 전도도 (예를 들어, 본원에 개시된 패치 클램프 연구에서 측정된 바와 같은 전체-세포 전도도의 전압-의존적 기여물)를 변경시키는데 적절하다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소는 대기압에서 용존 산소 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상의 양으로 존재한다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 대기압에서 용존 산소가 15 ppm 미만이거나, 10 ppm 미만이거나, 또는 대략적으로 주위 산소 수준이다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소는 약 8 ppm 내지 약 15 ppm의 양으로 존재하고, 이러한 경우에 때때로 본원에서 "솔라스"로 지칭된다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 용매화 전자 (예를 들어, 분자 산소에 의해 안정화됨) 및 동전기적으로 변형 및/또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 일부 실시양태에서 용매화 전자 및/또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종은 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상, 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 동전기적으로 변경되지 않은 유체 대조군에 비해 차별적인 (예를 들어, 증가된 또는 감소된) 유전율을 특징으로 한다. 바람직한 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 동전기적으로 변경되지 않은 유체 대조군에 비해 차별적인 증가된 유전율을 특징으로 한다. 유전율 (ε) (미터 당 패럿)은 물질이 전기장에 의해 분극되어 물질 내부의 총 전기장을 감소시키는 능력의 척도이다. 따라서, 유전율은 물질이 전기장을 전도하는 (또는 "허용하는") 능력에 관련된다. 밀접하게 관련된 성질인 정전 용량 (C) (패럿; 볼트 당 쿨롬)은 전압이 물질을 가로질러 인가되는 경우에 물질이 전하를 보유하는 능력의 척도이다 (예를 들어, 2개의 평행한 전도성 플레이트 사이에 샌드위치된 유전층이 최적의 모델임). 전압 V가 정전 용량 C의 커패시터를 가로질러 인가되면, 커패시터가 보유할 수 있는 전하 Q는 인가된 전압 V에 직접적으로 비례하고, 여기서 정전 용량 C는 비례 상수이다. 따라서, Q = CV, 또는 C = Q/V이다. 커패시터의 정전 용량은 유전층의 유전율 ε, 뿐만 아니라 커패시터의 면적 A 및 2개의 전도성 플레이트 사이의 분리 거리 d에 좌우된다. 유전율 및 정전 용량은 하기와 같이 수학적으로 관련된다: C = ε(A/d). 사용된 유전체가 진공이면, 정전 용량 Co = εo(A/d)이고, 여기서 εo는 진공의 유전율 (8.85×10-12 F/m)이다. 유전 상수 (k), 또는 물질의 상대적인 유전율은 그의 유전율 ε 대 진공의 유전율 εo의 비이고, 따라서 k = ε/εo이다 (진공의 유전 상수는 1이다). k가 낮은 유전체는 유전율이 낮거나 또는 분극되거나 전하를 보유하는 능력이 낮은 유전체이다. 반면에, k가 높은 유전체는 유전율이 높다. k가 높은 유전체가 전하 보유를 잘하기 때문에, 커패시터에 대한 바람직한 유전체이다. k가 높은 유전체는 전하의 형태로 디지털 데이터를 저장하는 메모리 셀에서 또한 사용된다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 세포내 신호 전달의 조정을 제공하는데 충분하도록 세포막 구조 또는 기능을 변경시키는데 적절하고 (예를 들어, 막 회합 단백질의 입체형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성을 변경시킴), 여기서 특정 측면에서 막 회합 단백질은 수용체, 막횡단 수용체 (예를 들어, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), TSLP 수용체, 베타 2 아드레날린성 수용체, 브라디키닌 수용체 등), 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질, 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 일부 측면에서, 영향을 받은 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 G 단백질 α 서브유닛 (예를 들어, Gαs, Gαi, Gαq, 및 Gα12)과 상호작용한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 칼슘 의존적 세포성 메시지 전달 경로 또는 시스템의 조정 (예를 들어, 포스포리파제 C 활성의 조정, 또는 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정)을 포함하여, 세포내 신호 전달을 조정하는데 적절하다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원의 실시예 및 다른 곳에서 기술된 다양한 생물학적 활성 (예를 들어, 시토카인, 수용체, 효소 및 기타 단백질 및 세포내 신호전달 경로의 조절)을 특징으로 한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 글라티라머 아세테이트 인터페론-β, 미톡산트론, 및/또는 나탈리주맙과 상승작용을 나타낸다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원의 실시예에서 제시된 바와 같이 기관지 상피 세포 (BEC)에서의 DEP-유도 TSLP 수용체 발현을 감소시킨다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원의 실시예에서 제시된 바와 같이 기관지 상피 세포 (BEC)에서의 DEP-유도 세포 표면-결합 MMP9 수준을 억제한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 생물학적 효과는 디프테리아 독소에 의해 억제되고, 이는 본원의 실시예에서 제시된 바와 같이 베타 차단, GPCR 차단 및 Ca 채널 차단이 동전기적으로 변경된 수성 유체의 활성 (예를 들어, 조절성 T 세포 기능에 대한 활성)에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 물리적 및 생물학적 효과 (예를 들어, 세포내 신호 전달의 조정을 제공하는데 충분하도록 세포막 구조 또는 기능을 변경시키는 능력)가 밀폐된 용기 (예를 들어, 밀폐된 기밀 용기)에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 또는 그보다 긴 기간 동안 지속된다.
따라서, 추가적인 측면들은 상기 동전기적으로 생성된 용액, 및 상대적인 움직임 상태에 있고 표면들 사이의 혼합 부피를 규정하는, 간격이 있는 2개의 표면 사이에 유체 물질의 유동을 제공하고, 여기서 유동 유체 물질이 혼합 부피 내에서, 그리고 혼합 부피를 통해 1회 통과하는 체류 시간(dwell time)이 0.06초 초과 또는 0.1초 초과인 단계; 및 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 60 ppm 이상의 산소를 물질 내로 용존시키는데, 그리고 유체 또는 용액을 동전기적으로 변경시키는데 적절한 조건 하에 산소 (O2)를 혼합 부피 내의 유동 유체 물질 내로 도입하는 단계를 포함하는, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 100밀리초 미만, 200밀리초 미만, 300밀리초 미만, 또는 400밀리초 미만 내에 산소가 물질 내로 주입된다. 특정 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비는 12 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상이다.
추가적인 측면은 표면들 사이의 혼합 부피를 규정하는, 간격이 있는 2개의 표면 사이에 유체 물질의 유동을 제공하는 단계; 및 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 60 ppm 이상의 산소를 100밀리초 미만, 200밀리초 미만, 300밀리초 미만, 또는 400밀리초 미만 내에 물질 내로 주입하는데 적절한 조건 하에 산소를 혼합 부피 내의 유동 물질 내로 도입하는 단계를 포함하는, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 혼합 부피 내의 유동 물질의 체류 시간은 0.06초 초과 또는 0.1초 초과이다. 특정 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비는 12 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상이다.
추가적인 실시양태는 제1 물질 및 제2 물질을 혼합함으로써 출력 혼합물을 생성시키기 위한 혼합 장치를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 장치가 제1 물질을 제1 물질 공급원으로부터 전달받도록 구성된 제1 챔버; 고정자(stator); 고정자의 내부에 배치되고 내부의 회전축을 따라 회전하도록 구성된, 회전축이 있는 회전자 (여기서, 회전자와 고정자 중 하나 이상에 다수의 스루홀(through-hole)이 있음); 회전자와 고정자 사이에 한정된 혼합 챔버이며, 제1 챔버와 유체 소통하고 그로부터 제1 물질을 전달받도록 구성되고, 제2 물질이 회전자와 고정자 중 하나 내에 형성된 다수의 스루홀을 통해 혼합 챔버 내로 제공되는 것인 혼합 챔버; 혼합 챔버와 유체 소통하고 그로부터 출력 물질을 수신하도록 구성된 제2 챔버; 및 제1 챔버 내부에 수용되고, 제1 물질을 제1 챔버로부터 혼합 챔버 내로 펌핑하도록 구성된 제1 내부 펌프를 포함하는 것인, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 제1 내부 펌프는 제1 물질이 혼합 챔버 내에 진입하기 전에 제1 물질 내로 원주 속도를 부여하도록 구성된다.
추가적인 실시양태는 제1 물질 및 제2 물질을 혼합함으로써 출력 혼합물을 생성시키기 위한 혼합 장치를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 장치가 고정자; 고정자의 내부에 배치되고 내부의 회전축을 따라 회전하도록 구성된, 회전축이 있는 회전자; 회전자와 고정자 사이에 한정된 혼합 챔버이며, 제1 물질이 그를 통해 혼합 챔버에 진입하는 개방형 제1 말단 및 출력 물질이 그를 통해 혼합 챔버에서 나가는 개방형 제2 말단이 있고, 제2 물질이 회전자와 고정자 중 하나 이상을 통해 혼합 챔버에 진입하는 것인 혼합 챔버; 혼합 챔버의 개방형 제1 말단의 적어도 대다수 부분과 소통하는 제1 챔버; 및 혼합 챔버의 개방형 제2 말단과 소통하는 제2 챔버를 포함하는 것인, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다.
추가적인 측면은 상기 방법들 중 어느 하나에 따라 제조된 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 제공한다. 특정 측면에서, 투여된 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 전하-안정화 산소-함유 나노구조물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 유체는 과산소화된다 (예를 들어, 표준 염수 내에 각각 20 ppm, 40 ppm 및 60 ppm의 용존 산소를 포함하는 RNS-20, RNS-40 및 RNS-60). 특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 유체는 과산소화되지 않는다 (예를 들어, 표준 염수 내에 10 ppm (예를 들어, 대략적으로 주위 수준)의 용존 산소를 포함하는 RNS-10 또는 솔라스). 일부 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체의 염도, 멸균성, pH 등이 유체의 동전기적 생산 시점에 확립되고, 멸균성 유체가 적합한 경로에 의해 투여된다. 별법적으로, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상이 유체 투여 전에 투여 경로와 생리학적으로 상용성이도록 적합하게 조정된다 (예를 들어, 멸균 염수 또는 적합한 희석제를 사용함). 바람직하게는, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상을 조정하기 위해 사용되는 희석제 및/또는 염수 용액 및/또는 완충제 조성물이 또한 동전기적 유체이거나, 또는 다른 방식으로 이와 상용성이다.
본 개시내용은 기체-강화 이온성 수용액, 염수 수용액 (예를 들어, 표준 염수 수용액, 및 본원에서 논의되고 당업계에서 인지될 바와 같은 기타 염수 용액 (임의의 생리학적으로 상용성인 염수 용액 포함)), 세포 배양 배지 (예를 들어, 최소 배지, 및 기타 배양 배지)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 신규 기체-강화 유체를 개시한다.
염증
염증은 외래 물질, 특히 미생물 기원의 물질이 대상체를 침습하는 것에 대한 방어 반응으로서 발생할 수 있다. 추가적으로, 기계적인 외상, 독소, 및 신생물이 염증 반응을 유도할 수 있다. 백혈구의 축적 및 이어지는 활성화가 대부분의 염증 형태의 발병기전에서의 중심 사건이다. 염증 결핍은 숙주를 손상시켜, 숙주에서 감염 또는 외상이 악화되기 쉽게 한다. 과도한 염증, 예컨대 장기간의 염증 반응은 당뇨병, 동맥경화증, 백내장, 만성 피부 장애, 재관류 손상 및 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증성 질환, 감염후 증후군 예컨대 감염성 수막염, 류마티스성 열, 및 류마티스 질환 예컨대 전신 홍반성 루푸스 및 류마티스 관절염을 초래할 수 있다. 이러한 질환들은 세계적으로 매년 수백만 명에 영향을 미치고, 증가된 사망률 및 이환률을 초래한다. 이러한 다양한 질환 과정에서의 염증 반응의 공통성은 그의 조절을 인간 질환의 예방 또는 치료에서의 주요 요소로 만든다.
염증유발성 시토카인의 과다생산이 수많은 염증성 및 자가면역 질환의 발병기전에서 연루되었다. TNFα 분비는 염증성 케스케이드 개시에서의 주요 사건이고 (문헌 [Brennan F. M., et al. Lancet, 1989, 2:244-7]; [Haworth C, et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579]), 이러한 질환들의 개시 및 유지에 직접적으로 기여한다. 인터류킨 1β (IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 산화질소 (NO), IFN-γ, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 IL-10을 비롯한 기타 시토카인 또한 역할을 한다. 이러한 시토카인들 중 몇몇 (예를 들어 IL-8)은 염증 반응을 증가 또는 악화시킬 수 있는 한편, 다른 것들 (예를 들어 IL-10)은 염증 반응을 감소 또는 경감시킬 수 있다.
면역계 세포, 특히 대식세포는 활성화 자극에 반응하여 이러한 시토카인 중 다수를 분비한다. 시토카인의 표적 세포는 임의의 신체 구획 내에 위치할 수 있고 장거리 메카니즘을 통해 작용할 수 있거나, 또는 이웃 세포 상에 작용할 수 있다. 따라서, 시토카인은 국소화 또는 전신 방식으로 염증을 조절할 수 있다.
메탈로프로테이나제
메탈로프로테이나제는 예를 들어 문헌 [N. M. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994]에 기술된 바와 같이 패밀리 및 서브패밀리로 분류되는 프로테이나제 (효소)의 수퍼패밀리이다. 메탈로프로테이나제의 예로는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 예컨대 콜라게나제 (MMP1, MMP8, MMP13), 젤라티나제 (MMP2, MMP9), 스트로멜리신 (MMP3, MMP10, MMP II), 매트릴리신 (MMP7), 메탈로엘라스타제 (MMP12), 에나멜리신 (MMP19), MT-MMP (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17); 레프롤리신 또는 아다말리신 또는 MDC 패밀리 (세크레타제 및 쉐다제(sheddase) 예컨대 TNF 전환 효소 (ADAM10 및 TACE) 포함); 아스타신 패밀리 (프로콜라겐 프로세싱 프로테이나제 (PCP)와 같은 효소 포함); 및 기타 메탈로프로테이나제 예컨대 아그레카나제(aggrecanase), 엔도텔린 전환 효소 패밀리 및 안지오텐신 전환 효소 패밀리가 포함된다. 총괄적으로, 메탈로프로테이나제는 광범위한 매트릭스 기질 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸 및 피브로넥틴을 절단하는 것으로 공지되어 있다. 메탈로프로테이나제는 생물학적으로 중요한 세포 매개물, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF)의 프로세싱 또는 분비; 및 생물학적으로 중요한 막 단백질, 예컨대 저-친화도 IgE 수용체 CD23의 번역후 단백질분해 프로세싱 또는 쉐딩(shedding)에 연루되어 있다 (예를 들어, 문헌 [N. M. Hooper et al., Biochem. J. 321:265-279, 1997] 참조).
따라서, 놀랍지 않게, 조직 재형성을 수반하는 다수의 생리학적 질환 과정 (예를 들어, 배아 발달, 골 형성, 월경 동안의 자궁 재형성 등)에서 메탈로프로테이나제가 중요한 것으로 여겨진다. 또한, 이러한 질환 및 병태, 예를 들어, 다양한 염증성 및 알레르기성 질환 예컨대 관절의 염증 (특히, 류마티스 관절염, 골관절염 및 통풍), 위장관의 염증 (특히 염증성 장 질환, 궤양성 결장염 및 위염), 피부의 염증 (특히 건선, 습진, 피부염); 종양 전이 또는 침습; 세포외 매트릭스의 제어되지 않은 분해와 연관된 질환 예컨대 골관절염; 골 재흡수 질환 (예컨대 골다공증 및 파제트병); 비정상적인 혈관신생과 연관된 질환; 당뇨병, 치주 질환 (예컨대 치은염), 각막 궤양, 피부 궤양, 수술후 병태 (예컨대 만성 문합) 및 피부 상처 치유와 연관된 강화된 콜라겐 재형성; 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환 (예컨대 다발성 경화증); 알츠하이머병; 심혈관 질환 예컨대 재협착 및 아테롬성동맥경화증에서 관찰되는 세포외 매트릭스 재형성; 천식; 비염; 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPED)에서 하나 이상의 메탈로프로테이나제의 활성의 억제가 충분히 이로울 수 있다.
대식세포 엘라스타제 또는 메탈로엘라스타제로 또한 공지된 MMP12는 처음에 마우스에서 클로닝되었고 (문헌 [Shapiro et al., Journal of Biological Chemistry 267: 4664, 1992]), 1995년에 동일한 집단에 의해 인간에서 또한 클로닝되었다. MMP12는 활성화된 대식세포에서 우선적으로 발현되고, 흡연자로부터의 폐포 대식세포 (문헌 [Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824])로부터, 뿐만 아니라 아테롬성동맥경화성 병변 내의 포말 세포 (문헌 [Matsumoto et al, Am. J. Pathol. 153: 109, 1998])에서 분비되는 것으로 나타났다. COPD의 마우스 모델은 마우스에 일주일에 6일로 하루에 2개의 담배의 담배 연기를 6개월 동안 챌린지하는 것을 기초로 한다. 이러한 처치 후 야생형 마우스에서 폐 기종이 발달되었다. MMP12 녹-아웃(knock-out) 마우스를 이러한 모델에서 시험했을 때, 이들에서 유의한 기종이 발달되지 않았고, 이는 MMP12가 COPD 발병기전에서 핵심 효소라는 것을 강하게 시사한다. COPD (기종 및 기관지염)에서의 MMP12와 같은 MMP의 역할이 문헌 [Anderson and Shinagawa, 1999, Current Opinion in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38]에서 논의되었다. 흡연이 인간 경동맥 플라크에서 대식세포 침윤 및 대식세포-유래 MMP-12 발현을 증가시킨다는 것이 최근에 발견되었다 (문헌 [Matetzky S, Fishbein M C et al., Circulation 102:(18), 36-39 Suppl. S, Oct. 31, 2000]).
MMP9 (젤라티나제 B; 92 kDa-IV형 콜라게나제; 92 kDa 젤라티나제)는 1989년에 최초로 정제된 후 클로닝되고 서열이 분석된 분비형 단백질이다 (문헌 [S. M. Wilhelm et al., J. Biol. Chem. 264 (29): 17213-17221, 1989]; 공개된 오류 정정 문헌 [J. Biol. Chem. 265 (36): 22570, 1990]) (이러한 프로테아제에 대한 상세한 정보 및 참고문헌의 리뷰를 위해, 문헌 [T. H. Vu & Z. Werb (1998) Matrix Metalloproteinases, 1998, W. C. Parks & R. P. Mecham ed., pp. 115-148, Academic Press. ISBN 0-12-545090-7]을 참조한다). 일반적으로 MMP9의 발현은 영양막, 파골세포, 호중구 및 대식세포를 비롯한 소수의 세포 유형에 한정된다 ([Vu & Werb, 상기 문헌]). 그러나, 성장 인자 또는 시토카인에 대한 세포의 노출을 비롯한 여러 매개물에 의해 이와 동일한 세포 및 기타 세포 유형에서 발현이 유도될 수 있다. 이들은 염증 반응을 개시하는 것에서 종종 관련되는 것과 동일한 매개물이다. 다른 분비형 MMP와 같이, MMP9는 불활성 효소전구체(Pro-enzyme)로서 방출되고, 이어서 효소전구체가 절단되어 효소적으로 활성인 효소를 형성한다. 생체 내에서 이러한 활성화에 요구되는 프로테아제는 공지되어 있지 않다. 활성 MMP9 대 불활성 효소의 균형은 천연 발생 단백질인 TIMP-1 (메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제)과의 상호작용에 의해 생체 내에서 추가로 조절된다. TIMP-1은 MMP9의 C-말단 영역에 결합하여, MMP9의 촉매 도메인의 억제를 초래한다. 프로(pro)-MMP9의 발현 유도와 프로-MMP9의 활성 MMP9로의 절단과 TIMP-1의 존재의 균형이 조합되어 국소 부위에 존재하는 촉매적으로 활성인 MMP9의 양을 결정한다. 단백질분해적으로 활성인 MMP9는 젤라틴, 엘라스틴, 및 천연 IV형 및 V형 콜라겐을 포함하는 기질을 공격한다; 이는 천연 I형 콜라겐, 프로테오글리칸 또는 라미닌에 대해서는 활성이 없다. 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 MMP9의 역할이 관련된다는 것을 나타내는 데이터가 증가하고 있다. 생리학적 역할에는 배아 이식의 초기 단계에서의 자궁 상피를 통한 배아 영양막의 침습; 골의 성장 및 발달에서의 일부 역할; 및 혈관구조로부터 조직 내로의 염증성 세포의 이동이 포함된다.
효소 면역검정을 사용하여 측정된 MMP9 방출은 다른 집단으로부터의 것들과 비교하여 미치료 천식환자로부터의 유체 및 AM 상청액에서 유의하게 강화되었다 (문헌 [Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol., 5:583-591, 1997]). 또한, 강화된 MMP9 발현이 일부 기타 생리학적 병태에서 관찰되었고, 이는 MMP9를 질환 과정 예컨대 COPD, 관절염, 종양 전이, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 및 아테롬성동맥경화증에서의 플라크 파열 (급성 관상동맥 병태 예컨대 심근 경색을 초래함)에 연루시켰다 (본원에 참고로 포함된 WO07087637A3을 또한 참조한다).
최근, MMP-9 수준이 건강한 대조군 대상체와 비교하여 안정적인 천식에 걸린 환자에서 유의하게 증가되고, 급성 천식 환자에서는 더욱 더 높다는 것이 입증되었다. MMP-9는 기도 염증성 세포의 침윤 및 기도 과민성의 유도에서 결정적인 역할을 하는데, 이는 천식의 유도 및 유지에서 MMP-9가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 가리킨다 (문헌 [Vignola et al., Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998]; [Hoshino et al., Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999]; [Simpson et al., Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005]; [Lee et al., A murine model of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001]; 및 [Lee et al., Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284]).
MMP 억제제:
다수의 메탈로프로테이나제 억제제가 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Beckett R. P. and Whittaker M., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3):259-282]; 및 [Whittaker M. et al, 1999, Chemical Reviews 99(9):2735-2776]에 의한 MMP 억제제의 리뷰 참조). WO 02/074767에는 MMP 억제제, 특히 강력한 MMP12 억제제로서 유용한 화학식의 히단토인 유도체가 개시되어 있다. 미국 특허 출원 일련 번호 11/721,590 (20080032997로 공개됨)에는 메탈로프로테이나제의 억제제이고 MMP12 및 MMP9와 같은 MMP를 억제하는 것에서 특히 흥미로운 히단토인 유도체들의 추가적인 군이 개시되어 있다. MMP12 및 MMP9와 같은 MMP를 억제하기 위한 신규 트리아졸론 유도체가 미국 특허 출원 일련 번호 10/593543 (20070219217로 공개됨)에 개시되어 있다. 추가적인 MMP12 및 MMP9 억제제들은 11/509,490 (20060287338로 공개됨)에 개시되어 있다 (10/831265 (20040259896으로 공개됨)를 또한 참조한다).
추가적으로, 4-(4-페녹시페닐술포닐)부탄-1,2-디티올 (1) 및 5-(4-페녹시페닐술포닐)펜탄-1,2-디티올 (2)인 2개의 화합물이 MMP-2 및 MMP-9에 선택적으로 결합하고 이를 강력하게 억제하는 것으로 나타났다 (문헌 [Bernardo, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:11201-11207]). 이러한 2개의 화합물은 MMP-2 및 -9를 억제하고 따라서 염증을 약화시키는 임상에서의 유의한 용도가 있을 수 있다. 또한, 준-항생제 수준으로 특정 테트라사이클린 항생제 (예를 들어, 미노사이클린(Minocycline) 및 독시사이클린(Doxycycline))를 사용하는 것이 MMP 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 본 발명의 일부 측면은 본 발명의 유체를 MMP를 억제하는데 유용한 준-항생제 수준과 조합하여 사용하는 것을 포함한다.
치료 방법
용어 "치료하는"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하고, 이를 포함하며, "치료" 및 "치유적"은 본원에서 정의된 바와 같은 치료하는 작용을 지칭한다.
"치료 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 화합물 중 임의의 것의 임의의 양이다.
본원에서의 일부 실시양태는 일부 병태 또는 질환, 예컨대 염증성 신경변성 질환과 연관된 염증의 하나 이상의 증상을 예방하거나 경감시키는 것에 의한 대상체에 대한 치료 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 치료 조성물 및/또는 방법은 다발성 경화증 (MS), 파킨슨병, 아밀로이드증 (예를 들어 알츠하이머병), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리온 질환, 및 HIV-연관 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태 또는 질환을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
염증과 연관된 다수의 병태 또는 질환이 스테로이드, 메토트렉세이트, 면역억제 약물 (시클로포스파미드, 시클로스포린, 아자티오프린 및 레플루노미드 포함), 비-스테로이드성 항-염증제 예컨대 아스피린, 아세트아미노펜 및 COX-2 억제제, 금 작용제 및 항-말라리아 치료로 치료된 바 있다. 이러한 약물들은 다양한 단점, 및 주사 부위 반응, 발진, 상부 호흡기 감염, 자가면역 장애 및 감염에 대한 감수성 증가를 비롯한 유해 반응이 있다. 또한, 많은 항-염증 제약 약물은, 더욱 편리하고 순응적인 경구 또는 국소 피부 경로와 대조적으로, 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여를 요한다. 따라서, 염증에 관련된 병태 및 질환에 대한 신규 의약 및 치료 방법의 개발이 여전히 요구된다.
MS에 대한 현재의 치료에는 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 미톡산트론, 및 나탈리주맙이 포함된다. 글라티라머 아세테이트는 글루탐산, 리신, 알라닌 및 티로신으로 무작위 중합체로서 구성된다. 글라티라머 아세테이트는 유효성이 제한되고, 유의한 부작용, 예를 들어, 주사 부위에서의 혹, 오한, 열, 통증, 숨가쁨, 빠른 심장박동 및 불안이 있다. 943명의 원발성 진행성 MS 환자를 이용하는 중요한 임상 연구에서, 글라티라머 아세테이트는 신체장애 및 질환의 진행을 정지시키지 못했다 (문헌 [Wolinsky, et al. (2007) Ann Neurol 61:13-24]).
인터페론-β는 섬유모세포에 의해 생산되는 천연 발생 단백질이고, 선천 면역 반응의 일부이다. MS에 대한 약물로서, 인터페론-β는 MS 에피소드의 속도를 감소시키는 것에서 약 18-38％ 효과적이다. 부작용에는 플루-유사 증상 및 주사 부위에서의 반응과 같은 경도 부작용 및 더욱 심각한 부작용 (예를 들어, 우울증, 발작, 및 간 문제)이 포함된다.
미톡산트론은 MS에 대한 치료제이다. 이는 암에 대항하는 것에서 사용하기 위한 화학요법 치료로서 개발되었다. 이는 DNA 복구 및 합성을 방해하는 것에 의해 작용하고, 암 세포에 대해 특이적이지 않다. 미톡산트론으로부터의 부작용은 다소 심각할 수 있고, 이에는 오심, 구토, 탈모, 심장 손상, 및 면역억제가 포함된다.
나탈리주맙은 세포성 부착 분자인 알파4-인테그린을 표적으로 하는 인간화 모노클로날 항체이다. 나탈리주맙은 염증을 야기하는 면역 세포를 혈액 뇌 장벽을 가로지르지 못하게 함으로써 작용하는 것으로 여겨진다. 부작용에는 피로, 두통, 오심, 감기, 및 알레르기성 반응이 포함된다.
일반적으로, 이러한 약물들은 비-특이적 방식으로 면역계를 억제하고, 가까스로만 질환의 전체적인 진행을 제한한다 (문헌 [Lubetzki et al. (2005), Curr. Opin. Neurol. 18:237-244]). 따라서, MS를 더 잘 치료하기 위한 치료 전략을 개발하는 것이 요구된다.
조합 요법:
추가적인 측면은 하나 이상의 추가 치료제를 환자에게 투여하는 조합 요법을 추가로 포함하는 본원에 개시된 본 발명의 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 치료제는 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 미톡산트론, 및 나탈리주맙 및/또는 MMP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
동전기적으로 생성된 기체-강화 유체 및 용액의 항-염증 활성:
본 발명의 몇몇 측면에 따르면, 본원에 개시된 기체-강화 유체 및/또는 용액은 항-염증 성질 및 효과가 있고, 염증성 신경변성에 관련된 질환 또는 장애에 걸린 대상체의 치료를 위한 항-염증제로서 사용될 수 있다. 도 1은 건강한 혈액 공여자로부터의 자극받은 림프구에서의 시토카인 프로파일의 실험 결과를 나타낸다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 산소-강화 유체 (물)은 특정 시토카인, 특히 IL-6, IL-8, 및 IL-1β의 하향 조절에 영향을 미쳤다.
염증유발성 시토카인의 생산 증가가 수많은 염증성 및 자가면역 질환의 발병기전에서 연루되었다. TNFα 분비는 염증성 케스케이드 개시에서의 1차 사건이고 (문헌 [Brennan F. M., et al. Lancet, 1989, 2:244-7]; [Haworth C, et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579]), 염증성 및 자가면역 질환의 개시 및 유지에 직접적으로 기여한다. 인터류킨 1β (IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 산화질소, IFN-γ 및 GM-CSF를 비롯한 기타 염증유발성 시토카인 또한 역할을 하는 한편, IL-10과 같은 항-염증성 시토카인은 질환을 감소시킬 수 있다. 면역계 세포, 특히 대식세포는 활성화 자극에 반응하여 이러한 시토카인 중 다수를 분비한다.
다양한 세포 유형이 염증 과정에서 수반된다. 단핵구, 대식세포 및 기타 면역 세포에 의한 TNFα의 과다생산이 다수의 질환의 발병기전에서의 핵심 요소이다. 특히 대식세포 및 T-세포가 면역 반응의 개시 및 유지에서 중추적인 역할을 한다. 일단 병리학적 또는 면역원성 자극에 의해 활성화되면, TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-12, 산화질소 (NO), IL-6, GM-CSF, G-CSF, M-CSF 등을 비롯한 다수의 시토카인을 방출하는 것에 의해 대식세포가 반응한다. T-세포는 IL-2, IL-4, INF-γ, 및 기타 염증성 시토카인을 방출한다. 이러한 시토카인들이 다른 면역 세포를 활성화시키고, 일부는 독립적인 세포독성제로서 또한 작용할 수 있다. 대식세포 및 T-세포에서 유래된 염증성 매개물의 과도한 방출은 특히 정상 세포 및 주변 조직의 손상을 초래할 수 있다.
염증유발성 시토카인이 HIV-AIDS, 및 시토메갈로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 헤르페스 바이러스 패밀리를 비롯한 기타 바이러스성 감염에 연루되었다. TNFα는 인간 시토메갈로바이러스의 주요 극초기 인핸서/프로모터의 기저 활성을 강화하고, 단핵구 전구체에서 후기 HCMV 감염의 재활성화에서 역할을 할 수 있다 (문헌 [Prosch S., et al. Virology 1995, 208:197-206]).
추가적으로, 다수의 염증성 시토카인이 패혈증 또는 내독소성 쇼크를 앓고 있는 환자에서 사망률에 기여한다. 예를 들어, TNFα 및 IL-1β는 패혈증, 패혈성 쇼크 및 내독소성 쇼크에서 잘 확립된 중추적인 역할이 있다. 포스포리파제 A2 (문헌 [Gronich J., et al. J. Clin. Invest. 1994, 93:1224-1233]) 및 NO 신타제에 대한 유전자 발현의 유도와 함께, 이러한 시토카인들의 수준 증가가 열, 저혈압 및 쇼크와 연관된다 (문헌 [Smith J. W. et al. J. Clin. Oncol. 1992, 10:1141-1152]; [Chapman P. B., et al. J. Clin. Oncol. 1987, 5:1942-1951]).
평활근 세포로부터의 NO의 유도가 패혈성 쇼크 동안 감소된 평균 동맥압 및 전신성 혈관 저항을 매개하고, 이는 NO에 대한 기본적인 역할을 시사한다. 따라서, IL-8, IL-1β, 및 NO에 대한 하향 조절 효과를 표적으로 하는 요법들이 패혈증, 패혈성 쇼크 및 내독소성 쇼크가 포함되는 염증성 질환 또는 장애의 치료에서 이로울 수 있다.
TNFα의 과다생산이 수많은 자가면역 질환 예컨대 당뇨병 및 류마티스 관절염의 임상 특징에 기여한다. 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또한 증가된 IL-1β 및 TNFα 수준에 의해 재촉된다. 루푸스 환자에서, 혈청 C-반응성 단백질, IL-1베타 및 TNFα 수준이 대조군에서보다 더 높았고, 이는 증가된 염증 반응이 이러한 질환에서 역할을 한다는 것을 시사한다 (문헌 [Liou L. B. Clin. Exp. Rheumatol. 2001, 19:515-523]). SLE의 한 형태인 신경정신 홍반성 루푸스 (NPLE) 환자의 연구는 TNFα에 대한 mRNA를 발현하는 말초 혈액 단핵 세포의 개수, 뿐만 아니라 NO 대사물질의 뇌척수액 수준이 NPLE 질환 중증도와 상호관련되었음을 나타냈다 (문헌 [Svenungsson E., et al. Ann. Rheum. Dis. 2001, 60:372-9]).
IL-1 및 TNFα는 동물 모델에서 다양한 급성 반응, 뿐만 아니라 만성 반응에서 중추적인 역할을 한다. 추가적으로, IL-11, IFNα 및 IFNβ가 염증 반응을 또한 상향 조절할 수 있다. 반대로, 몇몇 시토카인은 염증 반응의 하향 조절에서 수반될 수 있다 (즉, 특히 IL-4, IL-10, IL-13). 실시예 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 기체-강화 유체와 접촉된 세포는 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 T3 항원으로의 IFN-γ 수준에서의 증가를 나타낸 한편, IL-8은 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 본 발명의 기체-강화 배양 배지 + T3 항원에서 더 낮았다. 추가적으로, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 수준은 대조군 배지 + PHA에서보다 본 발명의 기체-강화 배지 + PHA에서 더 낮았던 한편, IL-1β 수준은 대조군 배지 + PHA와 비교했을 때 본 발명의 기체-강화 유체 + PHA에서 더 낮았다. 본 발명의 기체-강화 배지 단독에서, IFN-γ 수준이 대조군 배지에서보다 더 높았다. 이러한 결과들은 항-염증성 미세환경과 일관된다.
NO는 염증 반응의 매개물 및 조절인자로서 인지된다. 이는 병원체에 대한 세포독성 성질을 지니지만, 대상체 자신의 조직에 대한 해로운 효과가 또한 있을 수 있다 (문헌 [Korhonen et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(4): 471-9, 2005]). NO는 가용성 구아닐레이트 시클라제와 반응하여 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP)를 형성하고, 이것이 NO의 효과 중 다수를 매개한다. 또한 NO는 분자 산소 및 수퍼옥시드 음이온과 상호작용하여, 다양한 세포 기능을 개질시킬 수 있는 반응성 산소 종을 생산할 수 있다. NO의 이러한 간접적인 효과들이 염증에서의 유의한 역할이 있고, 여기서 NO는 유도성 NO 신타제 (iNOS)에 의해 높은 양으로 생산되고, 반응성 산소 종은 활성화된 염증성 세포에 의해 합성된다.
NO는 각질세포, 섬유모세포, 내피 세포, 및 기타 가능한 것들에 의해 생산될 수 있다. NO의 혈관 작용 중 일부에는 혈관확장, 혈관 내피에 대한 혈소판 부착의 억제, 혈관 내피에 대한 백혈구 부착의 억제, 및 수퍼옥시드의 소거가 포함된다 (문헌 [Shah et al., Env. Health Persp. v. 106 (5): 1139-1143]).
또한, NO 합성의 억제는 상처 수축을 지연시키고, 콜라겐 조직화를 변경시키며, 신생표피의 두께를 변경시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Amadeu and Costa, J. Cutan. Pathol. 33: 465-473, 2006]). 상처에서의 혈관신생 및 비만 세포 이동 또한 NO 억제에 영향을 받는다 (동일 문헌). 어떠한 특정 메카니즘 이론에도 한정되지 않으면서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 기체-강화 유체는, 본원에 개시된 실시예 섹션에서 설명된 상처 치유 효과의 범위와 일관되게, 국소성 및/또는 세포성 NO 생산, 또는 분해를 조정할 수 있다. 다양한 조절 경로로 인해, 일부 실시양태에서는 본 발명의 기체-강화 유체가 NO 생산을 증가시킬 수 있고/있거나 NO 분해를 지연시킬 수 있는 한편, 다른 일부 실시양태에서는 본 발명의 기체-강화 유체가 NO 생산을 감소시키고/시키거나 NO 분해를 촉진할 수 있다.
구체적으로, 본원의 실시예 9에 기재된 바와 같이, 산소-강화 염수 용액으로 처치된 상처는 제4일 내지 제11일에 상처 치유에서의 증가를 나타냈고, 제3일 내지 제11일에, 산소-강화 염수 용액으로 처치된 상처의 새로운 표피가 생리 염수 용액으로 처치된 상처의 표피보다 2배 내지 4배 빠르게 이동하였다. 이러한 연구는 제15일 내지 제22일에, 더욱 성숙한 표피 층이 더 일찍 형성되는 것에 의해 증명되는 바와 같이, 산소-강화 염수 용액으로 처치된 상처가 더욱 빠른 속도로 분화하였음을 또한 나타냈다. 모든 단계에서, 일반적 치유와 연관되어 표피에서 발생하는 비후가 산소-강화 염수 용액으로 처치된 상처에서 발생하지 않았다.
따라서, 상처 치유 효과의 이러한 범위에 따라, 그러나 어떠한 특정 이론에도 한정되기를 원치 않으면서, 산소-강화 염수 용액이 상처 내의 NO의 국소성 및/또는 세포성 수준을 조정할 수 있는 것으로 여겨진다. NO는 상처 치유에서 성장 인자, 콜라겐 침착, 염증, 비만 세포 이동, 표피 비후 및 신생혈관형성을 조정한다. 또한, 산화질소는 산소에 의해 조절되는 유도성 효소에 의해 생산된다.
비만 세포 이동의 경우, 산소-강화 용액에 대해 초기 및 후기 이동에서 차이가 또한 발생하였다. 이는 NO 합성의 억제에 관하여 당업계에 공지된 것과 일관된다 (문헌 [Amadeu and Costa, J. Cutan Pathol 33: 465-473, 2006]).
염증 과정의 처음 2개의 단계에서, 이물질이 파괴되거나 (예를 들어, 이물질이 유기체인 경우), 또는 이물질 주변의 조직이 느슨해진다 (예를 들어, 이물질이 파편인 경우). 치유 단계에서, 염증이 진정되기 시작한다; 개별적인 혈관 및 혈관 패턴이 다시 정상으로 되고, 상처 복구가 시작된다. 복구 과정에서의 3가지 주요 사건은 (1) 증식성 섬유모세포에 의한 새로운 결합 조직의 형성; (2) 상피 재생; 및 (3) 새로운 모세혈관의 증식(outgrowth)이다.
염증이 진정되기도 전에, 섬유모세포가 주변의 정상 조직 (일반적으로 섬유모세포가 휴면 상태로 존재함)으로부터 손상 영역 내로 이동하기 시작한다. 이는 피브린 가닥들을 따라 아메바모양 운동에 의해 이동하고, 치유 영역 전반에 걸쳐 분포된다. 손상 조직 내의 위치 내로 고정되면, 이는 콜라겐을 합성하여 이러한 단백질을 분비하기 시작하며, 이러한 단백질은 섬유로 배열된다. 이러한 섬유는 그의 세로축을 따라 최대 스트레스의 방향으로 배향된다. 콜라겐 다발이 견고하게 성장함에 따라, 섬유모세포가 점진적으로 퇴화하고, 다발에 밀접하게 부착되며, 손상 영역이 반흔 조직으로 전환된다.
반흔 조직 형성과 동시에, 상처 가장자리 상의 무손상 표피 세포가 손상 영역의 중심을 향해 하나의 시트로서 증식 및 이동하기 시작한다. 염증이 진정됨에 따라, 직접적인 혈액 공급에 대한 요구가 일어나고, 혈관신생이 상처 부위에서 발생한다.
염증은 여러 세포 유형을 수반하는 복합적인 과정이다. 예를 들어, 비만 세포는 혈관확장의 초기 단계를 유발하는 매개물을 방출하고, 내피 세포의 분리 및 내피하층 내의 콜라겐 섬유의 노출이 이에 동반된다. 혈관 내에 형성된 세포간 간극 내의 섬유는 혈소판을 포획하고, 이러한 세포로부터 매개물의 방출을 유발한다.
혈소판에 더하여, 노출된 콜라겐 섬유는 혈액-응고 케스케이드, 증가된 혈관확장, 증가된 혈관 투과성 및 화학주성의 유발 인자를 비롯한, 확장된 혈관벽의 구멍을 통해 여과되는 혈장 단백질과 또한 상호작용한다.
추가적으로, 보체 케스케이드가 여러 자극에 의해 활성화될 수 있다: 손상된 혈관, 손상된 세포가 방출하는 단백질분해성 효소, 임의의 참여 박테리아의 막 성분, 및 항원-항체 복합체. 활성화된 보체 성분들 중 일부는 염증 영역 내로의 백혈구의 유입을 담당하는 화학주성 인자로 작용하는 한편, 다른 것들은 식세포작용을 촉진하고 세포 용해에 참여한다.
또한, 본 발명의 기체-강화 유체 또는 용액이 염증의 하나 이상의 측면에서 수반되는 하나 이상의 시토카인을 또한 조절할 수 있는 것으로 여겨지고, 이러한 시토카인(들)에는 MAF (대식세포 활성화 인자), MMIF (대식세포 이동 억제 인자), MCF (대식세포 화학주성 인자), LMIF (백혈구 이동 억제 인자), HRF (히스타민 방출 인자), TF (전달 인자), 인터류킨 (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 등), TNF-α, TNF-β, 인터페론 (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ζ, IFN-δ 등), G-CSF (과립구 콜로니 자극 인자), GM-CSF (과립구-대식세포 CSF), M-CSF (대식세포 CSF), 멀티-CSF (IL-3), 섬유모세포 성장 인자 (aFGF, bFGF), EGF (표피 성장 인자), NGF (신경 성장 인자), PDGF (혈소판-유래 성장 인자), VEGF (혈관 내피 성장 인자), 전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β 등), NAP-2 (호중구-활성화 단백질 2), PF-4 (혈소판 인자 4), 트롬보글로불린, MCP-1 (단핵구 화학유인 단백질 1), MCP-3, MIP-1α, MIP-1β-+ (대식세포 염증 단백질), RANTES (활성화시 조절되고, 정상적으로 T 세포에 의해 발현되며, 아마도 분비형인 케모카인), HSP (열 충격 단백질), GRP (글루코스-조절 단백질), 유비퀴틴 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 기체-강화 유체 및/또는 치료 조성물은 항-염증성 분자 또는 시토카인의 생산 및/또는 분비를 증가시키거나 항-염증성 분자 또는 시토카인의 분해를 감소시킴으로써, 염증 및/또는 염증성 신경변성의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 예방할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 기체-강화 유체 및/또는 치료 조성물이 염증유발성 분자 또는 시토카인의 생산 및/또는 분비를 감소시키거나 염증유발성 분자 또는 시토카인의 분해를 증가시킴으로써, 염증 및/또는 염증성 신경변성의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 예방할 수 있다.
류마티스 관절염의 인간 자가면역 장애에 대한 동물 모델 시스템인 EAE (실험적 자가면역 뇌척수염)의 악화 및 탈수초의 증대에서의 항-MOG 항체의 결정적인 역할이 기존의 연구에서 나타났다 (문헌 [Linington, et al. 1992. J. Neuroimmunol. 40:219-224]). 추가적으로, MOG에 대한 항체가 다발성 경화증의 발병기전에서 연루되었다 (문헌 [Berger et al. N. Engl. J. Med. 2003 Jul 10;349(2):139-45]).
도 2 및 실시예 3에 기재된 바와 같이, 본 발명의 기체-강화 유체는 동물에 이전에 프라이밍된 항원에 대한 림프구 반응을 증폭시킨다. 도 2에 지시된 바와 같이, 가압된 산소화 유체 (압력 용기) 또는 탈이온 유체 대조군과 비교했을 때, 용매화 전자를 포함하는 본 발명의 기체-강화 유체로 재구성된 유체에서 배양되는 경우에 MOG 챌린지에 대한 반응에 대해 림프구 증식이 더 컸다.
예시적인 관련된 분자성 상호작용:
통상적으로, 양자 성질은 10-10 미터 미만의 기본 입자에 속하는 것으로 생각되는 한편, 일상 생활의 거시적 세계는 뉴턴의 운동 법칙에 따라 행동한다는 점에서 고전적으로 지칭된다.
최근, 분자들이 희석으로 크기가 증가하는 클러스터를 형성하는 것으로 기술되었다. 이러한 클러스터는 직경이 수 마이크로미터이고, 희석으로 크기가 비-선형으로 증가하는 것으로 보고되었다. 직경이 100 나노미터인 양자 결맞음(coherent) 도메인이 순수에서 발생하는 것으로 가정되었고, 궁극적으로 이러한 결맞음 도메인에서의 물 분자의 집단 진동이 전자기장 변동에 대해 잠긴 위상이 될 수 있어, 물에서의 안정적인 진동을 제공하고, 물의 집단 구조를 변화시키고, 차례로 이는 발달되는 특이적 결맞음 진동을 결정할 수 있는 물 내의 용해된 물질에 대해 특이적인 오래 지속되는 결맞음 진동의 여기 형태의 '메모리' 형태를 제공한다. 이러한 진동이 자기장 위상 커플링에 의해 안정화되는 경우, 물이 희석시 '시드(seed)' 결맞음 진동을 여전히 보유할 수 있다. 분자들의 클러스터가 크기가 증가함에 따라, 그의 전자기 시그너처가 상응하게 증폭되어, 물이 보유하는 결맞음 진동을 강화한다.
물의 미세한 미시적 구조 및 용해된 분자의 클러스터 크기에서의 변경에도 불구하고, 결맞음 진동의 특이성이 존재할 수 있다. 물의 성질에서의 변화를 고려하는 한 모델은 결정화에서 수반되는 고려사항들을 기초로 한다.
나노규모의 케이지(cage)를 형성하는 단순화된 양성자화 물 클러스터가 본 출원인의 기존의 특허 출원인 WO 2009/055729에서 제시되었다. 양성자화 물 클러스터는 전형적으로 H+(H2O)n의 형태를 취한다. 일부 양성자화 물 클러스터는 천연적으로, 예컨대 이온층에서 발생할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 의해서도 한정되지 않으면서, 그리고 특정 측면에 따르면, 본 발명의 출력 물질에 부여된 안정화된 전자 및 산소를 포함하는 구조물이 포함되는, 기타 유형의 물 클러스터 또는 구조물 (클러스터, 나노케이지(nanocage) 등)이 가능하다. 초래된 구조물에 산소 원자가 포획될 수 있다. 반-결합 나노케이지의 화학작용이 산소 및/또는 안정화된 전자가 장기간 동안 계속 용해되어 있게 한다. 기타 원자 또는 분자, 예컨대 의약 화합물이 지속 전달 목적을 위해 케이징(caging)될 수 있다. 용액 물질 및 용해된 화합물의 특이적 화학작용은 이러한 물질들의 상호작용에 좌우된다.
혼합 장치에 의해 프로세싱된 유체는 클러스터 구조의 맥락에서의 유체의 분석과 일관되는 상이한 구조적 특징을 나타내는 것으로 기존에 실험을 통해 나타났다. 예를 들어, WO 2009/055729 참조.
전하-안정화 나노구조물 (예를 들어, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물):
출원인의 WO 2009/055729의 "이중층 효과", "체류 시간", "주입 속도" 및 "기포(bubble) 크기 치수"에서 기존에 기술된 바와 같이, 동전기적 혼합 장치는 수 밀리초 내에 복합적인 동적 난류로 제1 물질과 제2 물질의 독특한 비-선형 유체 동적 상호작용을 생성시켜, 본원에 기술된 신규 동전기적 효과를 제공하는, 효과적으로 거대한 표면적 (장치 및 100 nm 미만의 이례적으로 작은 기체 기포의 표면적 포함)과 접촉된 복합 혼합을 제공한다. 추가적으로, 절연된 회전자 및 고정자 특징을 포함하는 특수하게 디자인된 혼합 장치를 사용하여 특징-국소화 동전기적 효과 (전압/전류)가 입증되었다.
당업계에 주지된 바와 같이, 전하 재분포 및/또는 용매화 전자는 수용액 내에서 고도로 불안정한 것으로 공지되어 있다. 특정 측면에 따르면, 출원인의 동전기적 효과 (예를 들어, 전하 재분포이며, 특정 측면에서는 용매화 전자가 포함됨)가 출력 물질 (예를 들어, 염수 용액, 이온 용액) 내에서 놀랄 만큼 안정화된다. 실제로, 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60 또는 솔라스)의 생물학적 활성 및 성질의 안정성이 기밀 용기에서 수 개월 동안 유지될 수 있어, 본 발명의 용액의 성질 및 활성을 생성 및/또는 유지시키고/시키거나 매개하는 것을 돕는 것에서 용존 기체 (예를 들어, 산소)가 수반되는 것을 가리킨다. 유의하게, 전하 재분포 및/또는 용매화 전자는, 유체에 의해 살아있는 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)에 접촉했을 때 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 본 발명의 동전기적 이온성 수성 유체에서 안정적으로 배열된다 (예를 들어, WO 2009/055729의 실시예 23 및 본원에 개시된 바와 같은 세포 패치 클램프 참조).
본원에서 "분자 상호작용" 하에 기술된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, 동전기적 염수 용액)의 안정성 및 생물학적 상용성을 설명하기 위해, 출원인은 물 분자와 물에 용해된 물질 (예를 들어, 산소)의 분자 사이의 상호작용이 물의 집단 구조를 변화시키고, 본 발명의 출력 물질에 부여된 산소 및/또는 안정화된 전자를 포함하는 나노구조물이 포함되는 나노규모 케이스 클러스터를 제공한다는 것을 제안하였다. 메카니즘에 한정되지 않으면서, 특정 측면에서의 나노구조물의 배열은 나노구조물이 (적어도 형성 및/또는 안정성 및/또는 생물학적 활성을 위해) 용존 기체 (예를 들어, 산소)를 포함하고; 나노구조물이, 세포막 또는 그의 관련 구성성분과 접촉 시, 동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60 또는 솔라스 염수 유체)가 전하 및/또는 전하 효과를 조정 (예를 들어, 부여 또는 수여)하게 하며; 특정 측면에서는 나노구조물이 생물학적으로 관련된 형태의 용매화 전자의 안정화 (예를 들어, 보유, 내포(harboring), 포획)을 제공하도록 하는 것이다.
특정 측면에 따르면, 그리고 본 개시내용에 의해 지지되는 바와 같이, 이온성 또는 염수 (예를 들어, 표준 염수, NaCl) 용액에서, 본 발명의 나노구조물은 전하-안정화 수화 쉘(shell) 내에 하나 이상의 용존 기체 분자 (예를 들어, 산소)를 포함할 수 있는 전하-안정화 나노구조물 (예를 들어, 평균 직경 100 nm 미만)을 포함한다. 추가적인 측면에 따르면, 전하-안정화 수화 쉘은 하나 이상의 용존 기체 분자 (예를 들어, 산소)가 내포된 케이지 또는 공극(void)을 포함할 수 있다. 추가적인 측면에 따르면, 적절한 전하-안정화 수화 쉘의 제공에 의해, 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소 함유 나노구조물이 용매화 전자 (예를 들어, 안정화된 용매화 전자)를 추가적으로 포함할 수 있다.
메카니즘 또는 특정 이론에 한정되지 않으면서, 본 발명의 우선일 이후에, 주위 (대기) 기체와 평형 상태에 있는 수성 액체 내의 이온에 의해 안정화된 전하-안정화 미세기포(microbubble)가 제안되었다 (문헌 [Bunkin et al., Journal of Experimental and Theoretical Physics, 104:486-498, 2007]; 전문이 본원에 참고로 포함됨). 본 발명의 특정 측면에 따르면, 출원인의 신규 동전기적 유체는 신규한 생물학적으로 활성인 형태의 전하-안정화 산소-함유 나노구조물을 포함하고, 이같은 구조물의 신규 어레이, 클러스터 또는 회합물을 추가로 포함할 수 있다.
전하-안정화 미세기포 모델에 따르면, 물 구조의 짧은 범위의 분자 질서가 기체 분자의 존재에 의해 파괴되어 (예를 들어, 초기에 비-흡착성 이온과 복합체를 형성한 용존 기체 분자가 짧은 범위의 질서의 결함을 제공함), 이온성 액적의 응축을 제공하고, 여기서 이러한 결함이 물 분자의 제1 및 제2 배위권(coordination sphere)에 둘러싸이고, 이는 배위권 내에 각각 6개 및 12개의 공격자점을 차지하는 흡착성 이온 (예를 들어, 전자 이중층을 형성하기 위한 Na+ 이온의 스크리닝 쉘의 획득) 및 비-흡착성 이온 (예를 들어, 제2 배위권을 차지하는 Cl- 이온)으로 교대로 충전된다. 불충분한 포화 상태의 이온 용액 (예를 들어, 불충분한 포화 상태의 염수 용액)에서, 이러한 수화 '핵'이 제1 및 제2 배위권에 각각의 6개의 흡착성 이온 및 5개의 비-흡착성 이온이 충전될 때까지 계속 안정적이고, 이어서 쿨롬 폭발(explosion)이 진행되어 기체 분자를 함유하는 내부 공극이 생성되며, 이때 흡착성 이온 (예를 들어, Na+ 이온)은 생성된 공극의 표면에 흡착되는 한편, 비-흡착성 이온 (또는 그의 일부분)은 용액 내로 확산된다 ([Bunkin et al., 상기 문헌]). 이러한 모델에서, 나노구조물 내의 공극은 그의 표면에 흡착된 이온들 (예를 들어, Na+ 이온들) 사이의 쿨롬 반발에 의해 붕괴가 방지된다. 공극-함유 나노구조물의 안정성은 공극/기포 표면 상으로의 유사한 전하의 용해된 이온들의 선택적 흡착 및 용존 기체와 기포 내부의 기체 사이의 확산 평형에 기인하는 것으로 가정되고, 여기서 초래된 전기 이중층에 의해 발휘되는 음성 (외향) 정전 압력이 표면 장력에 대한 안정적인 보상을 제공하고, 기포 내부의 기체 압력이 주위 압력에 의해 균형을 이룬다. 이러한 모델에 따르면, 이같은 미세기포의 형성은 이온성 성분을 필요로 하고, 일부 측면에서는 입자들 간의 충돌-매개 회합이 더 큰 차수의 클러스터 (어레이)의 형성을 제공할 수 있다 (동일 문헌).
전하-안정화 미세기포 모델은 입자들이 기체 미세기포일 수 있다는 것을 제안하지만, 주위 공기와 평형 상태에 있는 이온 용액에서의 이같은 구조물의 오직 자발적인 형성이 산소가 이같은 구조를 형성할 수 있는지 여부에 대해 특성화되지 않고 침묵하며, 마찬가지로 용매화 전자가 이같은 구조에 의해 회합 및/또는 안정화될 수 있는지 여부에 대해 침묵한다는 것만을 생각한다.
특정 측면에 따르면, 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물을 포함하는 본 발명의 동전기적 유체는 신규하고, 미세기포 모델에 따른 가정되는 비-동전기적, 대기성 전하-안정화 미세기포 구조물과 근본적으로 상이하다. 유의하게, 적어도 부분적으로, 대조군 염수 용액에는 본원에 개시된 생물학적 성질이 없는 반면 출원인의 전하-안정화 나노구조물은 신규한, 생물학적으로 활성인 형태의 전하-안정화 산소-함유 나노구조물을 제공한다는 사실로부터 유도되어, 이러한 결론이 불가피하다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 출원인의 신규한 동전기적 장치 및 방법은 공기와 평형 상태에 있는 이온성 유체 또는 임의의 동전기적으로 생성되지 않은 유체에서 자발적으로 발생할 수 있는 또는 그렇지 않을 수 있는 임의의 양을 초과하여 유의한 양의 전하-안정화 나노구조물을 포함하는 신규한 동전기적으로 변경된 유체를 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화 나노구조물은 전하-안정화 산소-함유 나노구조물을 포함한다. 추가적인 측면에서, 전하-안정화 나노구조물이 모두 또는 실질적으로 모두 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이거나, 또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이 동전기적 유체 내의 주요 전하-안정화 기체-함유 나노구조물 종이다.
추가적인 측면에 따르면, 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 용매화 전자를 포함하거나 내포할 수 있고, 이에 의해 신규한 안정화된 용매화 전자 운반체를 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 신규 유형의 전자화물(electride) (또는 반전 전자화물)을 제공하고, 이는 단일한 유기적으로 배위된 양이온이 있는 통상적인 용질 전자화물과 대조적으로 오히려 공극 또는 산소 원자를 함유하는 공극 주변에 안정적으로 배열된 다수의 양이온이 있으며, 이때 배열된 나트륨 이온들에 유기 분자보다는 물 수화 쉘이 배위된다. 특정 측면에 따르면, 용매화 전자는 물 분자의 수화 쉘에 의해 수용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 모든 양이온 전반에 걸쳐 분포된 나노구조물 공극 내에 수용된다. 일부 측면에서, 배열된 다중 나트륨 양이온에 걸친 용매화 전자의 분포/안정화를 제공할 뿐만 아니라, 공극 내의 케이징된 산소 분자(들)와 용매화 전자의 회합 또는 부분적인 회합을 제공함으로써 본 발명의 나노구조물은 용액 내의 신규한 '수퍼 전자화물' 구조를 제공한다 - 용매화 전자가 하나 이상의 산소 원자 및 나트륨 원자들의 배열에 걸쳐 분포된다. 따라서, 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 유체와 연관되어 본원에서 개시된 바와 같은 '용매화 전자'는 물 분자에 의한 직접적인 수화를 포함하는 전통적인 모델에서 용매화되지 않을 수 있다. 별법적으로, 건조된 전자화물 염과 제한적으로 유사하게, 본 발명의 동전기적 유체 내의 용매화 전자가 다중 전하-안정화 나노구조물에 걸쳐 분포되어, 수용액 내의 더 높은 차수의 어레이를 안정화하는 '격자 접착제'를 제공할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 세포막 또는 그의 구성성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 특정 측면에서, 용매화 전자가 내포된 본 발명의 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 세포막 또는 그의 구성성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 전하 및/또는 전하 효과 공여체 (전달)로서 및/또는 전하 및/또는 전하 효과 수용체로서 세포막 또는 그의 구성성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 특정 측면에서, 용매화 전자가 내포된 본 발명의 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 전하 및/또는 전하 효과 공여체로서 및/또는 전하 및/또는 전하 효과 수용체로서 세포막과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 본 발명의 동전기적 유체의 관찰된 안정성 및 생물학적 성질과 일관되고 이를 설명하며, 추가로 이온성 수용액 (예를 들어, 염수 용액, NaCl 등) 내의 안정화된 용매화 전자를 제공하는 신규 전자화물 (또는 반전 전자화물)을 제공한다.
특정 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 전하-안정화 산소-함유 나노기포(nanobubble)를 실질적으로 포함하거나, 그의 형태를 취하거나, 또는 이를 발생시킬 수 있다. 특정 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 클러스터는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 상대적으로 더 큰 어레이, 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노기포 또는 그의 어레이의 형성을 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 소수성 표면과의 접촉시 소수성 나노기포의 형성을 제공할 수 있다.
특정 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 실질적으로 1개 이상의 산소 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 실질적으로 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 또는 그를 초과하는 개수의 산소 분자를 포함한다. 특정 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은 약 20 nm × 1.5 nm의 나노기포 (예를 들어, 소수성 나노기포)를 포함하거나 이를 발생시키고, 약 12개의 산소 분자를 포함한다 (예를 들어, 산소 분자의 크기 (약 0.3 nm × 0.4 nm), 이상 기체의 가정, 및 n=PV/RT [식 중, P=1 atm, R=0.082057 l.atm/mol.K; T=295K; V=pr2h=4.7×10-22 L (여기서, r=10×10-9 m, h=1.5×10-9 m, 및 n=1.95×10-22 몰)]의 적용을 기초로 함).
일부 측면에서, 이온성 수성 유체 내의 전하-안정화 배열을 지니는 이같은 나노구조물 또는 그의 어레이 내에 있는 유체 내에 존재하는 산소 분자의 백분율은 0.1％ 초과; 1％ 초과; 2％ 초과; 5％ 초과; 10％ 초과; 15％ 초과; 20％ 초과; 25％ 초과; 30％ 초과; 35％ 초과; 40％ 초과; 45％ 초과; 50％ 초과; 55％ 초과; 60％ 초과; 65％ 초과; 70％ 초과; 75％ 초과; 80％ 초과; 85％ 초과; 90％ 초과; 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 양이다. 바람직하게는, 이러한 백분율은 약 5％ 초과, 약 10％ 초과, 약 15％ 초과, 또는 약 20％ 초과이다. 추가적인 측면에서, 이온성 수성 유체 내의 전하-안정화 배열을 지니는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물 또는 그의 어레이의 실질적인 크기는 100 nm 미만; 90 nm 미만; 80 nm 미만; 70 nm 미만; 60 nm 미만; 50 nm 미만; 40 nm 미만; 30 nm 미만; 20 nm 미만; 10 nm 미만; 5 nm 미만; 4 nm 미만; 3 nm 미만; 2 nm 미만; 및 1 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기이다. 바람직하게는, 이러한 크기는 약 50 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 20 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만이다.
일부 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체는 용매화 전자를 포함한다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체는 용매화 전자(들); 및 독특한 전하 분포 (극성, 대칭성, 비대칭성 전하 분포) 중 하나 이상을 포함하는, 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물, 및/또는 그의 어레이를 포함한다. 일부 측면에서, 전하-안정화 나노구조물 및/또는 전하-안정화 산소-함유 나노구조물, 및/또는 그의 어레이는 상자성 성질이 있다.
대조적으로, 본 발명의 동전기적 유체에 비해, 대조군인 압력 용기 산소화 유체 (비-동전기적 유체) 등은 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상을 조정할 수 있는, 이같은 생물학적으로 활성인 동전기적으로 생성된 전하-안정화 나노구조물 및/또는 생물학적으로 활성인 전하-안정화 산소-함유 나노구조물 및/또는 그의 어레이를 포함하지 않는다.
기체-강화 유체 제조를 위한 시스템
이전에 출원인의 WO 2009/055729 특허 출원에 개시된 바와 같은 시스템 및 방법은 기체 (예를 들어 산소)가 수동 상실이 최소이면서 높은 농도로 안정적으로 강화되게 한다. 이러한 시스템 및 방법은 광범위한 기체를 높아진 백분율로 광범위한 유체 내로 강화시키는데 효과적으로 사용될 수 있다. 오직 예로서, 전형적으로 용존 산소의 수준이 약 2-3 ppm (백만분율)인 실온의 탈이온수가 개시된 시스템 및/또는 방법을 사용하여 약 5 ppm 이상, 약 10 ppm 이상, 약 15 ppm 이상, 약 20 ppm 이상, 약 25 ppm 이상, 약 30 ppm 이상, 약 35 ppm 이상, 약 40 ppm 이상, 약 45 ppm 이상, 약 50 ppm 이상, 약 55 ppm 이상, 약 60 ppm 이상, 약 65 ppm 이상, 약 70 ppm 이상, 약 75 ppm 이상, 약 80 ppm 이상, 약 85 ppm 이상, 약 90 ppm 이상, 약 95 ppm 이상, 약 100 ppm 이상, 또는 그보다 크거나 그 사이인 임의의 값 범위의 용존 산소 수준에 도달할 수 있다. 특정한 예시적인 실시양태에 따르면, 산소-강화 물은 용존 산소 약 30-60 ppm의 수준으로 생성될 수 있다.
표 3은 산소-강화 염수 용액 (표 3)으로 처치된 치유 중인 상처 및 본 발명의 기체-강화 산소-강화 염수 용액의 샘플에서 취해진 다양한 부분압 측정치를 나타낸다.
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투여 경로 및 형태
특정한 예시적인 실시양태에서, 치료 조성물이 염증의 하나 이상의 증상을 예방하거나 경감시키도록 본 발명의 기체-강화 유체가 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 치료 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물 제제는 담체, 아주반트, 유화제, 현탁화제, 감미제, 향미제, 향료 및 결합제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 작용제를 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "제약상 허용되는 담체" 및 "담체"는 일반적으로 임의 유형의 비-독성의 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제제 보조물을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 당 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트 분말; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원 비함유 물; 등장성 염수; 링거(Ringer) 용액; 에틸 알콜, 및 포스페이트 완충 용액, 뿐만 아니라 기타 비-독성 상용성 윤활제 예컨대 라우릴황산나트륨 및 스테아르산마그네슘이고, 뿐만 아니라 조제자의 판단에 따라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미, 향미 및 방향 작용제, 보존제 및 항산화제가 조성물 내에 또한 존재할 수 있다. 특정 측면에서, 이같은 담체 및 부형제가 본 발명의 기체-강화 유체 또는 용액에 있을 수 있다.
본원에 기술된 제약상 허용되는 담체, 예를 들어, 비히클, 아주반트, 부형제 또는 희석제는 당업자에게 주지되어 있다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체는 치료제에 대해 화학적으로 불활성이고, 사용 조건 하에 해로운 부작용 또는 독성이 없다. 제약상 허용되는 담체는 중합체 및 중합체 매트릭스, 나노입자, 미세기포 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 치료적 기체-강화 유체에 더하여, 치료 조성물은 불활성 희석제 예컨대 추가적인 비-기체-강화 물 또는 기타 용매, 용해제 및 유화제 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 오일, 배아 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 특정 치료 조성물의 신규하고 개선된 제제, 신규 기체-강화 치료 유체, 및 신규 기체-강화 치료 유체를 전달하는 신규 방법은 하나 이상의 불활성 희석제를 동일하거나 유사하거나 상이한 조성의 기체-강화 유체로 교체함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 기체-강화 유체를 제공하도록 산소를 물 또는 탈이온수 내로 혼합함으로써 생산된 기체-강화 유체로 통상적인 물을 교체하거나 보완할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 기체-강화 유체는 하나 이상의 치료제와 조합될 수 있고/있거나 단독으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 기체-강화 유체를 혼입시키는 것은 당업계에 공지된 하나 이상의 용액, 예컨대 탈이온수, 염수 용액 등을 하나 이상의 기체-강화 유체로 교체하여 대상체에게 전달하기 위한 개선된 치료 조성물을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 본 발명의 기체-강화 유체, 제약 조성물 또는 기타 치료제 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 하나 이상의 제약 담체 또는 희석제를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 상기 질환 또는 병태의 예방 및 치료에서, 그리고 상기 언급된 바와 같은 요법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 담체는 제약상 허용되어야 하고, 조성물 내의 다른 성분들과 상용성이어야 하며, 즉 이에 대한 해로운 효과가 없어야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있고, 바람직하게는 단위 용량 제제, 예를 들어, 0.05 내지 95 중량％의 활성 성분을 함유할 수 있는 정제로서 제제화된다.
가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 협측, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 수조내, 방광내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 질내, 안구내, 이내, 비내, 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입이 포함된다.
투여 경로
특정 대상체에 대한 가장 적절한 투여 수단은 치료되는 질환 또는 병태의 성질 및 중증도 또는 사용되는 요법의 성질, 뿐만 아니라 치료 조성물 또는 추가 치료제의 성질에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 경구 또는 국소 투여가 바람직하다.
경구 투여에 적절한 제제는 각각 예정된 양의 활성 화합물을 함유하는 불연속적인 단위, 예컨대 정제, 캡슐, 카쉐(cachet), 시럽, 엘릭시르, 츄잉 검, "막대사탕" 제제, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 로젠지, 또는 겔-코팅 앰플이며; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 내의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로서 제공될 수 있다.
다양한 유형의 계량 용량 가압 에어로졸, 애터마이저(atomizer), 분무기(nebulizer), 또는 통기기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 분진 또는 미스트를 포함하도록 경구 투여에 적절한 추가적인 제제가 제공될 수 있다. 특히, 치료제의 분말 또는 기타 화합물이 본 발명의 기체-강화 유체에 용해 또는 현탁될 수 있다.
설하 또는 협측 투여에 의한 것과 같은 경점막 방법에 적절한 제제에는 활성 성분을 포함하고 당 및 아카시아 또는 트라가칸트와 같은 향미 기제를 전형적으로 포함하는 로젠지, 패치, 정제 등, 및 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 아카시아와 같은 불활성 기제 내의 활성 화합물을 포함하는 향정이 포함된다.
비경구 투여에 적절한 제제는 예정된 농도의 활성 기체-강화 유체를 함유하고 가능하게는 또 다른 치료제를 함유하는 멸균성 수용액을 전형적으로 포함한다; 이러한 용액은 바람직하게는 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이다. 비경구 투여에 적절한 추가적인 제제에는 생리학적으로 적절한 공-용매 및/또는 착화제 예컨대 계면활성제 및 시클로덱스트린을 함유하는 제제가 포함된다. 수중유 에멀젼이 기체-강화 유체의 비경구 투여용 제제에 또한 적절할 수 있다. 이같은 용액들은 바람직하게는 정맥 내로 투여되지만, 피하 또는 근육내 주사에 의해 또한 투여될 수 있다.
요도, 직장 또는 질 투여에 적절한 제제에는 겔, 크림, 로션, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 용해가능한 고체 물질, 관주제 등이 포함된다. 바람직하게는 이러한 제제는 좌제 기제를 형성하는 하나 이상의 고체 담체, 예를 들어, 코코아 버터 내에 활성 성분을 포함하는 단위-용량 좌제로서 제공된다. 별법적으로, 본 발명의 기체-강화 유체가 있는 결장 세척제가 결장 또는 직장 투여용으로 제제화될 수 있다.
국소, 안구내, 이내 또는 비내 적용에 적절한 제제에는 연고, 크림, 페이스트, 로션, 페이스트, 겔 (예컨대 히드로겔), 스프레이, 분산성 분말 및 과립, 에멀젼, 유동 추진체를 사용하는 스프레이 또는 에어로졸 (예컨대 리포솜성 스프레이, 점비제, 비강 스프레이 등) 및 오일이 포함된다. 이같은 제제를 위한 적절한 담체에는 석유 젤리, 라놀린, 폴리에틸렌글리콜, 알콜, 및 이들의 조합물이 포함된다. 비강 또는 비내 전달은 계량 용량의 이러한 제제 중 임의의 것 등을 포함할 수 있다. 유사하게, 이내 또는 안구내 제제는 점적제, 연고, 관류액 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제제는 임의의 적절한 방법에 의해, 전형적으로는 기체-강화 유체를 임의적으로는 활성 화합물과 함께 액체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 요구되는 비율로 균일하게 및 균질하게 혼합하고, 이어서 필요하다면 생성된 혼합물을 원하는 형상으로 성형함으로써 제조될 수 있다.
예를 들어, 활성 성분의 분말 또는 과립 및 하나 이상의 임의적인 성분, 예컨대 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 또는 계면활성 분산제를 포함하는 균질 혼합물을 압축함으로써, 또는 분말화된 활성 성분 및 본 발명의 기체-강화 유체의 균질 혼합물을 성형함으로써 정제를 제조할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위한 적절한 제제에는 다양한 유형의 계량 용량 가압 에어로졸, 애터마이저, 분무기 또는 통기기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 분진 또는 미스트가 포함된다. 특히, 치료제의 분말 또는 기타 화합물이 본 발명의 기체-강화 유체에 용해 또는 현탁될 수 있다.
입을 통한 폐 투여를 위해, 분말 또는 액적의 입자 크기는 기관세지 내로의 전달을 확실히 하도록 전형적으로 0.5-10 ㎛ 범위, 바람직하게는 1-5 ㎛이다. 비강 투여를 위해, 10-500 ㎛ 범위의 입자 크기가 비강에서의 유지를 확실히 하는데 바람직하다.
계량 용량 흡입기는 액화 추진체 내의 치료제의 현탁액 또는 용액 제제를 전형적으로 함유하는 가압 에어로졸 분배기이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 기체-강화 유체가 표준 액화 추진체에 더하여 또는 이를 대신하여 사용될 수 있다. 사용 동안, 이러한 장치는 치료제 및 기체-강화 유체를 함유하는 미세 입자 스프레이를 생산하기 위해 계량된 부피, 전형적으로는 10 내지 150 ㎕를 전달하도록 개조된 밸브를 통해 제제를 배출한다. 적절한 추진체에는 몇몇 클로로플루오로카본 화합물, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 이들의 혼합물이 포함된다.
제제는 하나 이상의 공-용매, 예를 들어, 에탄올 계면활성제, 예컨대 올레산 또는 소르비탄 트리올레에이트, 항산화제 및 적절한 향미제를 추가적으로 함유할 수 있다. 분무기는 좁은 벤추리(venturi) 구멍을 통한 압축 기체 (전형적으로는 공기 또는 산소)의 가속화에 의해 또는 초음파 진탕에 의해 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 치료용 에어로졸 미스트로 전환시키는 시판 장치이다. 분무기에서 사용하기 위한 적절한 제제는 기체-강화 유체 내에 있고 제제의 40％ w/w 이하, 바람직하게는 20％ w/w 미만을 이루는 또 다른 치료제로 이루어진다. 또한, 기타 담체, 예컨대 증류수, 멸균수, 또는 묽은 알콜 수용액을 이용할 수 있고, 바람직하게는, 이는 염화나트륨과 같은 염의 첨가에 의해 체액과 등장성이게 된다. 임의적인 첨가제는 보존제를 포함하고 (특히 제제가 멸균성으로 제조되지 않은 경우), 메틸 히드록시-벤조에이트, 항산화제, 향미제, 휘발성 오일, 완충제 및 계면활성제를 포함할 수 있다.
통기에 의해 투여를 위한 적절한 제제에는 통기기에 의해 전달될 수 있거나 코로 들이마시는 방식으로 비강 내로 취입될 수 있는 미세하게 분쇄된 분말이 포함된다. 통기기에서, 구멍이 뚫렸거나 원위치에서 열리는 캡슐 또는 카트리지 (전형적으로 젤라틴 또는 플라스틱으로 제조됨) 내에 분말이 함유되고, 흡입 시 장치를 통해 들이쉬어진 공기에 의해 또는 수동으로 작동되는 펌프에 의해 분말이 전달된다. 통기기에서 사용되는 분말은 단독으로 활성 성분으로 또는 활성 성분, 적절한 분말 희석제, 예컨대 락토스 및 임의적인 계면활성제를 포함하는 분말 블렌드로 이루어진다. 활성 성분은 전형적으로 제제의 0.1 내지 100 w/w를 이룬다.
상기에서 구체적으로 언급된 성분들에 더하여, 당해 제제의 유형을 고려하여, 본 발명의 제제는 당업자에게 공지된 기타 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적절한 제제는 향미제를 포함할 수 있고, 비내 투여에 적절한 제제는 향료를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 개별적인 치료제로서 또는 치료제들의 조합물에서 제약 약물과 함께 사용하기 위해 이용가능한 임의의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있다.
물론, 투여되는 투여량은 공지된 요인, 예컨대 특정 작용제의 약역학적 특징 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도; 동반 치료의 종류; 치료 빈도; 및 원하는 효과에 따라 변할 것이다. 활성 성분의 일일 투여량은 체중 1 킬로그램 (㎏) 당 약 0.001 내지 1000 밀리그램 (㎎)인 것으로 예상될 수 있고, 바람직한 용량은 0.1 내지 약 30 ㎎/㎏이다. 몇몇 측면에 따르면, 활성 화합물의 일일 투여량은 0.001 리터 내지 10 리터일 수 있고, 바람직한 용량은 약 0.01 리터 내지 1 리터이다.
투여 형태 (투여에 적절한 조성물)는 단위 당 약 1 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 이러한 제약 조성물에서, 활성 성분은 보통 조성물의 총 중량을 기초로 약 0.5-95 중량％의 양으로 존재할 것이다.
연고, 페이스트, 포말, 흡장제, 크림 및 겔 또한 부형제, 예컨대 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 실리콘, 벤토나이트, 실리카산, 및 활석, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이 또한 부형제 예컨대 락토스, 활석, 실리카산, 수산화알루미늄, 및 규산칼슘, 또는 이러한 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 에어로졸 제약을 제조하는데 일상적으로 사용되는 공지된 수단들 중 임의의 것에 의해 나노결정질 항균 금속의 용액이 에어로졸 또는 스프레이로 전환될 수 있다. 일반적으로, 이같은 방법은 용액의 용기를 일반적으로는 불활성 담체 기체로 가압하거나 또는 가압하기 위한 수단을 제공하는 단계, 및 가압된 기체를 소형 구멍을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 스프레이는 통상적인 추진체, 예컨대 질소, 이산화탄소 및 기타 불활성 기체를 추가적으로 함유할 수 있다. 또한, 치료 화합물을 대상체에게 투여하는데 요구되는 경로 중 임의의 것에서 마이크로스피어 또는 나노입자를 본 발명의 기체-강화 치료 조성물 또는 유체와 함께 사용할 수 있다.
주사용 제제는 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에서 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액체 부형제 또는 기체-강화 유체의 첨가만을 필요로 하면서 냉동-건조 (동결건조) 조건에서 보관될 수 있다. 멸균성 분말, 과립 및 정제로부터 즉석 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 주사가능한 조성물을 위한 효과적인 제약 담체에 대한 요건이 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, Eds., 238-250 (1982)] 및 [ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., 622-630 (1986)] 참조.
국소 투여에 적절한 제제에는 본 발명의 기체-강화 유체를 포함하고 추가 치료제 및 향미제, 일반적으로는 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 임의적으로 포함하는 로젠지; 불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 내에 기체-강화 유체 및 임의적인 추가 치료제를 포함하는 향정; 및 적절한 액체 담체 내에 기체-강화 유체 및 임의적인 추가 치료제를 포함하는 구강 세척액 또는 구강 세정액; 뿐만 아니라 크림, 에멀젼, 겔 등이 포함된다.
추가적으로, 직장 투여에 적절한 제제가 다양한 기제 예컨대 유화 기제 또는 수용성 기제와 혼합함으로써 좌제로서 제시될 수 있다. 질 투여에 적절한 제제는 적합한 것으로 당업계에 공지된 바와 같은 담체를 활성 성분에 더하여 함유하는 페서리(pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말, 또는 스프레이 제제로서 제시될 수 있다.
적절한 제약 담체가 이러한 분야에서의 표준 참고문헌인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company]에 기술되어 있다.
본 발명의 맥락에서 대상체, 특히 동물, 그 중에서도 인간에게 투여되는 용량은 합당한 기간에 걸쳐 동물에서 치료 반응을 초래하는데 충분하여야 한다. 당업자는 투여량이 동물의 상태, 동물의 체중, 뿐만 아니라 치료되는 병태가 포함되는 다양한 요인에 좌우될 것임을 인지할 것이다. 적절한 용량은 원하는 반응에 영향을 미치는 것으로 공지된 대상체에서의 치료 조성물의 농도를 초래할 용량이다.
용량의 크기는 투여 경로, 시기 및 빈도, 뿐만 아니라 치료 조성물의 투여 및 원하는 생리학적 효과에 동반될 수 있는 임의의 불리한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 또한 결정될 수 있다.
조합물의 화합물이 (1) 공동-제제 내의 화합물들의 조합에 의해 동시에, 또는 (2) 교대에 의해, 즉 화합물들을 별도의 제약 제제에서 연속적으로, 순차적으로, 병행으로, 또는 동시에 전달하는 것에 의해 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 교대 요법에서, 제2의 활성 성분 및 임의로 제3의 활성 성분을 투여하는 것에서의 지연이 활성 화합물들의 조합물의 상승작용적 치료 효과의 이점을 잃도록 하지 않아야 한다. 투여 방법 (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 의한 일부 실시양태에 따르면, 이상적으로는 가장 효과적인 결과를 달성하도록 조합물이 투여되어야 한다. 투여 방법 (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 의한 일부 실시양태에서, 이상적으로는 각각의 활성 성분의 피크 혈장 농도를 달성하도록 조합물이 투여되어야 한다. 조합 공동-제제의 투여에 의한 하루에 1번 환제 1개의 요법이 염증성 신경변성 질환을 앓고 있는 일부 환자에게 편리할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 조합물의 활성 성분들의 효과적인 피크 혈장 농도는 약 0.001 내지 100 μM의 범위일 것이다. 특정 환자에 대해 처방된 제제 및 투여 요법에 의해 최적의 피크 혈장 농도가 달성될 수 있다. 본 발명의 유체, 및 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙, 또는 이들 중 어느 하나의 생리학적으로 기능성인 유도체가, 동시에 제시되든지 또는 순차적으로 제시되든지, 개별적으로, 다중으로, 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 일반적으로, 교대 요법 (2) 동안에는 유효 투여량의 각각의 화합물이 연속적으로 투여되고, 공동-제제 요법 (1)에서는 유효 투여량의 2개 이상의 화합물이 함께 투여된다.
본 발명의 조합물은 단일 투여 형태의 제약 제제로서 편리하게 제시될 수 있다. 편리한 단일 투여량 제제는 각각 1 ㎎ 내지 1 g의 임의의 양, 예를 들어, 10 ㎎ 내지 300 ㎎이지만 이에 한정되지 않는 양으로 활성 성분들을 함유한다. 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙과 조합된 본 발명의 유체의 상승작용적 효과가 광범위한 비, 예를 들어 1:50 내지 50:1 (본 발명의 유체:글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙)에 걸쳐 실현될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 비는 약 1:10 내지 10:1 범위일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 공동-제제화된 조합 투여 형태, 예컨대 환제, 정제, 캐플릿(caplet) 또는 캡슐 내의 본 발명의 유체 대 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙의 중량/중량 비는 약 1일 것이고, 즉, 본 발명의 유체와 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙의 양이 대략적으로 동일할 것이다. 다른 예시적인 공동-제제에서, 더 많거나 더 적은 본 발명의 유체 및 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙이 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 단독으로 사용될 때 항-염증성 활성을 나타내는 양으로 각각의 화합물이 조합물에서 사용될 것이다. 상기 조합물의 화합물들의 기타 비 및 양이 본 발명의 범주 내에서 구상된다.
단일 투여 형태는 본 발명의 유체 및 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙, 또는 이들 중 어느 하나의 생리학적으로 기능성인 유도체, 및 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
당업자는 치료에서 사용하기 위해 요구되는 본 발명의 조합물 내의 활성 성분들의 양이 치료되는 병태의 성질 및 환자의 연령 및 상태를 비롯한 다양한 요인에 따라 변할 것이고, 궁극적으로는 주치 의사 또는 건강 관리 실무자의 재량일 것임을 이해할 것이다. 고려될 요인에는 투여 경로 및 제제의 성질, 동물의 체중, 연령 및 전반적인 상태, 및 치료될 질환의 성질 및 중증도가 포함된다.
활성 성분 중 임의의 2가지를 제3 활성 성분과의 동시 또는 순차 투여를 위해 단일 투여 형태로 조합하는 것이 또한 가능하다. 이러한 3부 조합물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합물은 2회 또는 3회 투여로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 유체 및 글라티라머 아세테이트, 인터페론-베타, 미톡산트론 및/또는 나탈리주맙의 3부 조합물은 임의의 순서로 투여될 수 있다.
하기의 실시예는 설명적인 것으로만 의도되고, 어떠한 방식으로도 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
미세기포 크기
기체 미세기포 크기 한계를 결정하기 위해 본 발명의 확산기를 사용함으로써 기체-강화 유체로 실험을 수행하였다. 기체-강화 유체를 0.22 및 0.1 마이크로미터 필터에 통과시킴으로써 미세기포 크기 한계가 확립되었다. 이러한 시험의 수행에서, 다량의 유체가 본 발명의 확산기를 통과하였고, 기체-강화 유체가 생성되었다. 이러한 유체 60 ㎖를 60 ㎖ 주사기 내로 배수시켰다. 그 후, 주사기 내의 유체의 용존 산소 수준을 윙클러(Winkler) 적정에 의해 측정하였다. 주사기 내의 유체를 0.22 마이크로미터 밀리포어 밀렉스(Millipore Millex) GP50 필터를 통과하여 50 ㎖ 비커 내로 주입하였다. 그 후, 50 ㎖ 비커 내의 물질의 용존 산소 비율을 측정하였다. 이러한 실험을 3회 수행하여, 하기 표 4에 설명된 결과가 달성되었다.
Figure pct00008
알 수 있듯이, 확산된 물질을 0.22 마이크로미터 필터를 통과시키는 것에 의해 주사기 내에서 측정된 용존 산소 수준과 50 ㎖ 비커 내의 용존 산소 수준이 유의하게 변화되지 않았고, 이는 유체 내의 용존 기체의 미세기포가 0.22 마이크로미터 이하라는 것을 암시한다.
염수 용액 배치(batch)가 본 발명의 확산기로 강화되었고, 출력 용액의 샘플이 미여과 상태로 수집된 제2 시험을 수행하였다. 미여과 샘플의 용존 산소 수준은 44.7 ppm이었다. 0.1 마이크로미터 필터를 사용하여 본 발명의 확산기로부터의 이러한 산소-강화 용액을 여과하였고, 2개의 추가적인 샘플을 취했다. 제1 샘플에 대해서는, 용존 산소 수준이 43.4 ppm이었다. 제2 샘플에 대해서는, 용존 산소 수준이 41.4 ppm이었다. 마지막으로, 필터를 제거하고, 미여과 용액으로부터 최종 샘플을 취했다. 이러한 경우에, 최종 샘플의 용존 산소 수준은 45.4 ppm이었다. 이러한 결과들은 밀리포어 0.22 마이크로미터 필터가 사용된 것과 일관되었다. 따라서, 염수 용액 내의 대다수의 기체 기포 또는 미세기포의 크기는 대략적으로 0.1 마이크로미터 미만이다.
실시예 2
(시토카인 프로파일을 결정하였다)
혼합된 림프구들을 단일한 건강한 자원 공여자로부터 수득하였다. 백혈구 연층 샘플을 표준 절차에 따라 세척하여, 혈소판을 제거하였다. 림프구를 본 발명의 기체-강화 유체 또는 증류수 (대조군)로 희석된 RPMI 배지 (+ 50 mm HEPES) 내에 플레이트 당 2×106개의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 1 마이크로그램/㎖ T3 항원, 또는 1 마이크로그램/㎖ 식물성 적혈구응집소 (PHA) 렉틴 (팬(pan)-T 세포 활성화제)로 자극하거나, 또는 자극하지 않았다 (음성 대조군). 24시간 인큐베이션 후, 세포를 생존력에 대해 점검하고, 상청액을 추출하여 동결시켰다.
상청액을 해동시키고, 원심분리하고, XMAP® (루미넥스(Luminex)) 비드 라이트(bead lite) 프로토콜 및 플랫폼을 사용하여 시토카인 발현에 대해 시험하였다.
2백만개의 세포를 24웰 플레이트의 6개의 웰 내로 본 발명의 산소-강화 유체 (물) (웰 1, 3 및 5) 또는 증류수 (2, 4 및 6)와 함께 완전 RPMI + 50 mm Hepes 내에 플레이팅하였다 (10× RPMI를 물에 희석하여 1×로 만듦). 세포를 1 ㎍/㎖ T3 항원 (웰 1 및 2) 또는 PHA (웰 3 및 4)로 자극하였다. 대조군 웰 5 및 6은 자극하지 않았다. 24시간 후, 세포를 생존력에 대해 점검하고, 상청액을 수집하여 동결시켰다. 다음으로, 상청액을 해동시키고, 8,000g에서 회전시켜, 펠릿화하였다. 청정화된 상청액을 루미넥스 비드 라이트(LUMINEX BEAD LITE)™ 프로토콜 및 플랫폼을 사용하여 열거된 시토카인들에 대해 검정하였다. 수치 데이터가 표 5에서 표로 작성되어 있고, 상응하는 막대 그래프가 도 1에서 도시되어 있다. 현저하게, IFN-γ 수준은 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 본 발명의 기체-강화 배양 배지 + T3 항원에서 더 높았던 한편, IL-8은 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 본 발명의 기체-강화 배양 배지 + T3 항원에서 더 낮았다. 추가적으로, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 수준은 대조군 배지 + PHA에서보다 본 발명의 기체-강화 배지 + PHA에서 더 낮았던 한편, IL-1β 수준은 대조군 배지 + PHA와 비교했을 때 본 발명의 기체-강화 유체 + PHA에서 더 낮았다. 본 발명의 기체-강화 배지 단독에서, IFN-γ 수준이 대조군 배지에서보다 더 높았다.
Figure pct00009
실시예 3
미엘린 핍지교세포 당단백질 ( MOG )
도 2에 기재된 바와 같이, MOG 항원성 펩티드에 반응한 림프구 증식이 가압 산소화 유체 (가압 용기) 또는 탈이온 대조군 유체와 비교하여 본 발명의 기체-강화 유체의 존재 하에 배양했을 때 증가되었다. 따라서, 본 발명의 기체-강화 유체는 세포에 이전에 프라이밍된 항원에 대한 림프구 증식성 반응을 증폭시킨다.
공지된 마우스 서열에 상응하는 미엘린 핍지교세포 당단백질 펩티드 35-55 (MOG 35-55) (M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-O-V-H-L-Y-R-N-G-K) (서열 1; 이러한 서열 1을 위한 것을 포함하여 본원에 참고로 포함된 미국 공개 20080139674 참조)를 합성하였다. 다음으로, 5×105개의 비장 세포를 미리 MOG로 면역화시킨 MOG T 세포 수용체 트랜스제닉 마우스로부터 제거하고, 본 발명의 기체-강화 유체, 가압 산소화 물 (가압 용기 물) 또는 대조군 탈이온수로 재구성된 0.2 ㎖ TCM 유체에서 배양하였다. 비장세포를 MOG p35-55와 함께 각각 48시간 또는 72시간 동안 배양하였다. 배양물에 1Ci [3H]-티미딘을 펄싱(pulsing)하고, 16시간 후에 수거하였다. 평균 [3H] 티미딘 혼입 cpm을 삼중 배양물에 대해 계산하였다. 결과가 도 2에서 제시된다.
실시예 4
시토카인 발현
특정 측면에서, 인간의 혼합된 림프구들을 대조군 유체 또는 본 발명의 동전기적 유체 내의 T3 항원 또는 PHA로 자극하고, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-17, 에오탁신, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1β, MCP-1, G-CSF, FGFb, VEGF, TNF-α, RANTES, 렙틴, TNF-β, TFG-β, 및 NGF에서의 변화를 평가하였다. 도 1에서 알 수 있듯이, 시험된 염증유발성 시토카인 (IL-1β, TNF-α, IL-6, 및 GM-CSF), 케모카인 (IL-8, MIP-1α, RANTES, 및 에오탁신), 염증성 효소 (iNOS, COX-2, 및 MMP-9), 알레르겐 반응 (MHC 클래스 II, CD23, B7-1, 및 B7-2), 및 Th2 시토카인 (IL-4, IL-13, 및 IL-5)이 대조군 유체에 비해 시험 유체에서 감소된었다. 대조적으로, 시험된 항-염증성 시토카인 (예를 들어, IL1R-α, TIMP)은 대조군 유체에 비해 시험 유체에서 증가되었다.
이러한 데이터를 부연하기 위해, 출원인은 알레르기성 과민 반응을 평가하기 위해 오브알부민 감작을 수반하는 당업계-공인 모델 시스템을 사용하였다. 연구된 종점은 이러한 반응의 특정한 세포학적 및 세포성 성분, 뿐만 아니라 단백질 및 LDH의 혈청학적 측정이었다. 에오탁신, IL-1A, IL-1B, KC, MCP-1, MCP-3, MIP-1A, RANTES, TNF-A, 및 VCAM의 분석을 포함하여 시토카인 분석을 수행하였다.
간략하게, 수컷 브라운 노르웨이(Brown Norway) 래트에게 수산화알루미늄 (Al(OH)3) (200 ㎎/㎖)을 함유하는 용액 (2.0 ㎎/㎖) 내의 V등급 오브알부민 (OVA) (A5503-1G, 시그마(Sigma)) 0.5 ㎖를 제1일, 제2일 및 제3일에 각각 1번 복강 내로 주사하였다. 연구는 무작위화된 2×2 계승 배열 처치 (4개의 군)였다. 면역 반응이 일어나도록 2주 동안 기다린 후, 래트를 1주일 동안 RDC1676-00 (레발레시오(Revalesio) 특허 장치로 프로세싱된 멸균 염수) 또는 RDC1676-01 (레발레시오 특허 장치로 프로세싱되고 추가적으로 산소가 첨가된 멸균 염수)에 노출시키거나 또는 이들로 처치하였다. 하루에 한번씩 1주일 동안 처치한 후, 2개의 군을 반으로 나누고, 각각의 군 내의 래트의 50％에게 흡입에 의해 염수 또는 OVA 챌린지를 제공하였다.
구체적으로, 최초 감작 14일 후에, 12마리의 래트를 연속 7일 동안 매일 30분 동안의 흡입에 의해 RDC 1676-00에 노출시켰다. 시스템의 기류 속도는 10 리터/분으로 설정하였다. 분무되는 물질이 애어로넵(Aeroneb)의 12개의 하위-챔버에 진입하고 균일하게 분배되게 하는 단일 포트(port)가 있는 파이(pie) 챔버 내에 총 12마리의 래트를 정열하였다.
최초 감작 15일 후에, 12마리의 래트를 연속 7일 동안 매일 30분 동안 초음파 분무에 의해 RDC 1676-01에 노출시켰다. 동일한 분무기 및 챔버를 사용하여, 기류를 또한 10 리터/분으로 설정하였다. RDC 1676-00을 먼저 분무하였고, 에어로넵 챔버를 완전히 건조시킨 후 RDC 1676-01을 분무하였다.
최종 분무 처치로부터 약 2시간 후, RDC 1676-00 군으로부터의 래트 6마리에 펜 센츄리 마이크로스프레이어(Penn Century Microsprayer) (모델 1A-1B)를 사용하여 기관내 점적주입에 의해 전달된 OVA (염수 내 1％)를 다시 챌린지하였다. RDC 1676-00 군으로부터의 나머지 래트 6마리에는 대조군으로서 기관내 점적주입에 의해 전달된 염수를 챌린지하였다. 다음 날, RDC 1676-01 군으로 절차를 반복하였다.
다시 챌린지하고 나서 24시간 후, 나트륨 펜토바르비탈을 과다 투여하여 각각의 군 내의 모든 래트를 안락사시켰다. 하대 정맥으로부터 전혈 샘플을 수집하고, 2개의 다른 혈액 수집 튜브 내에 두었다: 퀴아젠(Qiagen)의 팍스진(PAXgene)™ 혈액 RNA 튜브 및 퀴아젠의 팍스진™ 혈액 DNA 튜브. 폐 장기를 프로세싱하여, 이러한 모델에서 폐 염증과 연관된 것으로 공지된 시토카인 발현 마커의 변화를 평가하기 위한 RT-PCR용으로 기관지폐포 세척액 (BAL) 및 폐 조직을 수득하였다. 폐의 오른쪽 상의 4개의 엽의 온전성을 보존하기 위해 편측 세척 기술을 사용하였다. 왼쪽의 "대형" 엽을 세척한 한편, 오른쪽의 4개의 엽은 묶어서 즉각적으로 트리-졸(TRI-zol)™ 내에 놓고, 균질화시키고, 추가적인 프로세싱을 위해 실험실로 보냈다.
BAL 분석. 폐 세척액을 수집하고, 4℃에서 10분 동안 600-800 g에서 원심분리하여, 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 신선한 튜브로 옮기고, -80℃에서 동결하였다. 기관지 세척액 ("BAL")을 2개의 분취량으로 분리하였다. 제1 분취량을 회전 침강시키고, 상청액을 분쇄된 드라이 아이스 상에서 급속 동결시키고, -80℃에 두고, 추가적인 프로세싱을 위해 실험실로 보냈다. 존재하는 단백질 및 LDH의 양은 각각 혈액 혈청 단백질 (이러한 단백질은 이러한 실험에서와 같이 챌린지된 경우에 막을 통해 누출되는 혈청 성분이다) 및 세포 사멸의 수준을 가리킨다. 특허 시험 측은 대조군보다 약간 덜한 단백질을 나타냈다.
기관지 세척액의 제2 분취량을 총 단백질 및 LDH 함량에 대해 평가하였고, 뿐만 아니라 세포학적 검사에 적용하였다. 처치군은 염수 대조군보다 더 큰 총 세포를 나타냈다. 추가로, 대조군에 비해 처치군에서 호산구가 약간 증가하였다. 또한 대조군 측에 비해 처치군에 대해 약간 상이한 다형핵 세포가 있었다.
혈액 분석. 1.2-2.0 ㎖ 혈액을 튜브 내로 옮기고 30분 이상 동안 응고되게 하여 전혈을 분석하였다. 나머지 혈액 샘플 (약 3.5-5.0 ㎖)은 트리-졸™ 또는 팍스진™을 사용하여 RNA 추출용으로 저장하였다. 이어서, 응고된 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 1200 g에서 원심분리하였다. 혈청 (상청액)을 제거하고, 2개의 신선한 튜브 내에 두고, 혈청을 -80℃에서 보관하였다.
트리-시약(Tri-Reagent) (TB-126, 몰레큘러 리서치 센터, 인크.(Molecular Research Center, Inc.))을 사용하는 RNA 추출을 위해, 0.2 ㎖의 전혈 또는 혈장을 전혈 또는 혈장 0.2 ㎖ 당 5N 아세트산 20 ㎕가 보충된 트리 시약 BD 0.75 ㎖에 첨가하였다. 튜브를 진탕시키고, -80℃에서 보관하였다. 팍스진™을 이용하여, 튜브를 약 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 튜브를 옆으로 놓고, -20℃ 냉동기에서 24시간 동안 보관한 후, 장기 보관을 위해 -80℃로 옮겼다.
루미넥스 분석. 루미넥스 플랫폼에 의해, 발광도 단위로 판독되고 정량 표준물과 비교될 수 있는 항체-관련 결합 반응에 대한 기판으로서 마이크로비드 분석을 이용하였다. 각각의 혈액 샘플은 2개의 샘플로서 동반적으로 실행되었다. 측정 단위는 발광도 단위였고, 군들을 OVA 챌린지된 대조군, OVA 챌린지된 처치군, 및 염수 챌린지된 처치군 + 특허 유체로 나눴다.
애질런트(Agilant) 유전자 어레이 데이터 생성을 위해, 폐 조직을 단리하고, 트리 시약 (TR118, 몰레큘러 리서치 센터, 인크.)에 함침시켰다. 간략하게, 약 1 ㎖의 트리 시약을 각각의 튜브 내의 50-100 ㎎의 조직에 첨가하였다. 글래스-테플론(glass-Teflon)™ 또는 폴리트론(Polytron)™ 균질화기를 사용하여, 샘플을 트리 시약에서 균질화시켰다. 샘플을 -80℃에서 보관하였다.
요약하면, 공지된 감작에 대한 염증 반응의 이러한 표준 검정은, 적어도 혈액 샘플에서, 현저한 임상 및 혈청학적 효과를 일으켰다. 추가적으로, 이러한 프로세스에서 유의한 수의 대조군 동물이 생리학적으로 스트레스를 받았고, 거의 죽어가고 있었던 반면, RDC1676-01 처치군은 이같은 임상 스트레스 효과를 나타내지 않았다. 그 후, 이는 시토카인의 순환 수준에서 반영되었는데, 여기서 RDC1676-01-처치군과 OVA 챌린지 군의 RDC1676-01-처치군 간에 약 30％ 차이가 있었다. 대조적으로, RDC1676-01-처치군과 OVA로 챌린지되지 않은 군의 RDC1676-01-처치군 간에 시토카인의 세포성 및 혈액학적 프로파일에서의 변화가 작았고 충분히 무의미하였고, 이는 아마 단지 유체 자체의 최소 기준선 변화를 나타낼 것이다.
실시예 5
(조절성 T-세포 검정을 사용하여 조절성 T-세포 검정에서의 T-세포 증식 및 시토카인 ( Il -10) 및 기타 단백질 (예를 들어, GITR , 그랜자임 ( Granzyme ) A, XCL1 , pStat5, 및 Foxp3 ))의 동화, 예를 들어, PBMC 내의 트립타제(tryptase)의 조정에서의 본 발명의 동전기적 으로 생성된 유체의 효과를 나타냈다)
항원 제시 세포에 방사선을 조사하고 항원 및 T 세포를 도입하는 것에 의해 T 세포를 조절하는 본원에 개시된 특정 실시양태의 능력을 연구하였다. 전형적으로, 이러한 자극된 T 세포들은 증식한다. 그러나, 조절성 T 세포의 도입시, 일반적인 T 세포 증식은 억제된다.
방법:
간략하게, 분류에서 사용된 FITC-접합 항-CD25 (ACT-1) 항체를 다코사이토메이션(DakoCytomation) (일리노이주 시카고)에서 구입하였다. 사용된 기타 항체들은 하기와 같았다: CD3 (가용성 상태에 대한 HIT3a), GITR (PE-접합), CD4 (Cy-5 및 FITC-접합), CD25 (APC-접합), CD28 (CD28.2 클론), CD127-APC, 그랜자임 A (PE-접합), FoxP3 (바이오레전드(BioLegend)), 마우스 IgG1 (이소형 대조군), 및 XCL1 항체. 모든 항체를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
CD4+ T 세포를 말초 전혈로부터 CD4+ 로제트 키트(Rosette Kit) (스템셀 테크놀러지즈(Stemcell Technologies))로 단리하였다. CD4+ T 세포를 항-CD127-APC, 항-CD25-PE 및 항-CD4-FITC 항체와 함께 인큐베이션하였다. FACS 아리아(Aria)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 세포를 CD4+CD25hiCD127lo/nTreg 및 CD4+CD25- 반응체 T 세포로 분류하였다.
둥근바닥 96웰 미량역가 플레이트에서 억제 검정을 수행하였다. 3.75×103개의 CD4+CD25neg 반응체 T 세포, 3.75×103개의 자가 T reg, 3.75×104개의 방사선 조사된 동종 CD3-고갈 PBMC를 지시된 바와 같이 첨가하였다. 모든 웰에 항-CD3 (5.0 ㎍/㎖의 클론 HIT3a)을 보충하였다. T 세포를 10％ 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 7일 동안 37℃에서 배양하였다. 인큐베이션을 끝내기 16시간 전에, 1.0 mCi의 3H-티미딘을 각각의 웰에 첨가하였다. 톰텍(Tomtec) 세포 수거기를 사용하여 플레이트를 수거하고, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 섬광 계수기를 사용하여 3H-티미딘 혼입을 측정하였다. 항원 제시 세포 (APC)는 스템셉(StemSep) 인간 CD3+ T 세포 고갈 (스템셀 테크놀러지즈)에 이어지는 40 Gy의 방사선 조사를 사용하여 T 세포가 고갈된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 이루어졌다.
조절성 T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 조건으로 자극한 후, 라이브/데드 레드(Live/Dead Red) 생존력 염료 (인비트로젠((Invitrogen)), 및 표면 마커 CD4, CD25 및 CD127로 염색하였다. 세포를 라이즈/픽스 포스플로우(Lyze/Fix PhosFlow)™ 완충제에서 고정시키고, 변성 펌버퍼(Permbuffer) III®에서 투과성이게 만들었었다. 그 후, 세포를 각각의 특정한 선택된 분자에 대한 항체로 염색하였다.
그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 양측성(two-tailed) 비대응(unpaired) 스튜던트 t-시험을 사용하여 2개의 군을 비교하였다. 3개의 군 간의 비교는 1원 ANOVA를 사용하여 행하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다 (양측성). r 값이 0.7 초과 또는 -0.7 미만이면 스피어만(Spearman) 상관계수를 통해 2개의 군 간의 상관 관계를 통계적으로 유의한 것으로 결정하였다 (양측성).
요약하면, 데이터는 대조군 유체 (Rev 아님, 솔라스 아님) 내의 PM에 비해 PM 및 Rev의 존재 하에 감소된 증식을 나타냈고, 이는 이러한 검정에서의 상대적으로 감소된 증식에 의해 제시된 바와 같이 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 Rev가 조절성 T-세포 기능을 개선시켰음을 시사한다. 또한, 본 실시예의 증거는 베타 차단, GPCR 차단 및 Ca 채널 차단이 Treg 기능에 대한 레베라의 활성에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.
실시예 6
(본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 ( RNS -60 및 솔라스 )로 관류된 Calu -3 세포 상에서 수행된 패치 클램프 분석에서 (i) RNS -60 및 솔라스에 대한 노출이 전체 세포 전도도에서의 증가를 초래하였고, ( ii ) RNS -60에 대한 세포 노출이 15분 인큐베 이션 시간에 명백한 비-선형 전도도의 증가를 일으켰으며, ( iii ) RNS -60에 대한 세포 노출이 칼슘 투과성 채널에 대한 RNS -60 염수의 효과를 일으켰다는 것이 밝혀졌 다)
개관. 본 실시예에서, 패치 클램프 연구를 수행하여, 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 본원에 기술된 바와 같은 유용성 (전체 세포 전류를 조정하는 유용성이 포함됨)을 추가로 확증하였다. 2가지 실험 세트를 수행하였다.
제1 실험 세트의 데이터의 요약은 솔라스 염수로 수득된 전체 세포 전도도 (전류 대 전압 관계)가 두 인큐베이션 시간 모두 (15분, 2시간) 및 모든 전압 프로토콜에 대해 고도로 선형이라는 것을 가리킨다. 그러나, 솔라스와의 더 긴 인큐베이션 (2시간)이 전체 세포 전도도를 증가시켰음이 명백하다. RNS-60에 대한 세포 노출은 델타 전류 (Rev-Sol 차감)에서 나타난 바와 같이 비-선형 전도도에서의 증가를 일으켰고, 이는 15분 인큐베이션 시간에서만 명백하였다. 2시간 인큐베이션 시간에서는, 이러한 비-선형 전류에 대한 RNS-60의 효과가 사라지고 대신 고도로 선형이다. 앞서 관찰된 바와 같이, 비-선형 전체 세포 전도도의 기여는, 모든 전압 프로토콜에서 존재하긴 하지만, 전압 민감성이다.
제2 실험 세트의 데이터의 요약은 비-선형 전류에 대한 RNS-60 염수의 효과가 있다는 것을 가리키고, 이는 외부 용액 내의 고칼슘으로 명백해졌다. 비-선형 전체 세포 전도도의 기여는, 전압 민감성이긴 하지만, 두 전압 프로토콜 모두에서 존재하였고, 이는 칼슘 투과성 채널에 대한 RNS-60 염수의 효과를 가리킨다.
제1 실험 세트 (전도도의 증가; 및 비-선형 전압의 활성화가 전도도를 조절하였다)
물질 및 방법:
기관지 상피 세포주 Calu-3을 패치 클램프 연구에서 사용하였다. Calu-3 기관지 상피 세포 (ATCC #HTB-55)를 실험 시간까지 유리 커버슬립 상에서 햄(Ham) F12와 10％ FBS가 보충된 DMEM 배지의 1:1 혼합물에서 성장시켰다. 간략하게, 전체 세포 전압 클램프 장치를 사용하여, 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RNS-60; 60 ppm 용존 산소를 포함하는 동전기적으로 처리된 생리 염수; 때때로 본 실시예에서 "약물"로 지칭됨)에 노출된 Calu-3 세포에 대한 효과를 측정하였다.
패치 클램핑 기술을 이용하여, 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 시험 물질 (RNS-60)의 효과를 평가하였다. 구체적으로, 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 및 10 mM HEPES (N-메틸 D-글루카민으로 pH가 7.4로 조정됨)로 이루어진 베이딩(bathing) 용액 내의 기관지 상피 세포주 Calu-3 상에서 전체 세포 전압 클램프를 수행하였다. 기저 전류를 측정한 후, RNS-60을 세포 상에 관류시켰다.
더욱 구체적으로, 패치 파이펫을 붕규산염 유리 (가너 글래스 컴패니(Garner Glass Co), 캘리포니아주 클레어몬트)로부터 2단계 나리시게(Narishige) PB-7 수직 인장기(puller)로 인장한 후, 나리시게 MF-9 마이크로포지(microforge) (나리시게 인터내셔널(Narishige International) USA, 뉴욕주 이스트 미도우)로 6-12 Mohm의 저항으로 가열-연마(fire-polish)하였다. 피펫에 135 KCl, 10 NaCl, 5 EGTA, 10 Hepes (mM 단위)를 함유하는 세포내 용액을 채우고, pH를 NMDG (N-메틸-D-글루카민)로 7.4로 조정하였다.
배양된 Calu-3 세포를 135 NaCl, 5 KCl, 1.2 CaCl2, 0.5 MgCl2 및 10 Hepes (유리 산) (mM 단위)의 세포외 용액을 함유하는 챔버 내에 놓고, pH를 NMDG로 7.4로 조정하였다.
올림푸스(Olympus) IX71 현미경 (올림푸스 인크.(Olympus Inc.), 일본 동경)의 40× DIC 대물렌즈를 사용하여 세포를 검시하였다. 세포-부착 기가실(gigaseal)이 확립된 후, 부드러운 흡인을 적용하여, 전체 세포 형상에 침입하고 이를 달성하였다. 침입 즉시, -120, -60, -40 및 0 mV에서 세포의 전압을 클램핑하고, 세포를 ±100 mV 사이의 전압 스텝으로 자극하였다 (500 ms/스텝). 대조군 조건에서 전체 세포 전류를 수집한 후, 동일한 세포에 상기 대조군 유체와 세포외 용질 및 pH가 동일한 시험 유체를 배스(bath)를 통해 관류시키고, 상이한 유지 전위(holding potential)에서의 전체 세포 전류를 동일한 프로토콜로 기록하였다.
전기생리학적 데이터를 액손 패치(Axon Patch) 200B 증폭기로 취득하고, 10 kHz에서 로-패스(low-pass)로 필터링하고, 1400A 디지데이터(Digidata) (액손 인스트루먼츠(Axon Instruments), 캘리포니아주 유니온 시티)로 디지털화하였다. pCLAMP 10.0 소프트웨어 (액손 인스트루먼츠)를 사용하여 데이터를 취득하고 분석하였다. 전류 (I)-대-전압 (V) 관계 (전체 세포 전도도)를 스텝 내로의 약 400 msec에서의 실제 전류 값 대 유지 전위 (V)를 플롯팅(plotting)함으로써 수득하였다. I/V 관계의 기울기가 전체 세포 전도도이다.
약물 및 화학물질. 지시될 때마다, 8-Br-cAMP (500 mM), IBMX (이소부틸-1-메틸크산틴, 200 mM) 및 포르스콜린 (10 mM)을 함유하는 cAMP 자극 칵테일로 세포를 자극하였다. cAMP 유사체인 8-Br-cAMP (시그마 켐. 컴퍼니(Sigma Chem. Co.))를 H2O 용액 내의 25 mM 모액으로부터 사용하였다. 포르스콜린 (시그마) 및 IBMX (시그마)는 10 mM 포르스콜린 및 200 mM IBMX 모액 둘 모두를 함유하는 DMSO 용액으로부터 사용하였다. 수득된 데이터는 5-9개의 세포에 대한 평균 ± SEM 전체 세포 전류로서 표현된다.
결과:
도 3 a-c는 2가지 시점 (15분 (왼쪽 패널) 및 2시간 (오른쪽 패널)) 및 상이한 전압 프로토콜 (a, 0 mV부터 스테핑; b, -60 mV부터 스테핑; 및 c, -120 mV부터 스테핑)에서 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RNS-60 및 솔라스)의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과를 나타낸다. 결과는 RNS-60 (흑색 원)이 솔라스 (백색 원)보다 전체-세포 전도도에 대한 효과가 더 크다는 것을 가리킨다. 이러한 실험에서, 유사한 결과가 3가지 전압 프로토콜에서, 그리고 15분 및 2시간 인큐베이션 시점 둘 모두에서 나타났다.
도 4 A-C는 3가지 전압 프로토콜 (A. 0 mV부터 스테핑; B. -60 mV부터 스테핑; C. -120 mV부터 스테핑) 및 2가지 시점 (15분 (흰색 원) 및 2시간 (흑색 원))에서 솔라스 전류 데이터를 RNS-60 전류 데이터에서 차감하는 것 ("델타 전류")으로부터 생성되는 그래프를 나타낸다. 이러한 데이터는 15분 시점 + RNS-60에 비-선형 전압-의존적 성분이 있고, 이는 2시간 시점에 부재한다는 것을 가리킨다.
이전의 실험에서와 같이, "생리" 염수로의 데이터는 기준물로 사용되는, 매우 일관되고 시간에 의존적이지 않은 전도도를 제공하였다. 군들을 솔라스 또는 RNS-60 염수에 매칭시킴으로써 본 결과를 수득하였고, 이는 더 짧은 인큐베이션 시간 (15분)에서의 전압-조절 전도도의 활성화와 일관되게, 기초 조건 (cAMP, 또는 임의의 다른 자극이 없음) 하에서의 RNS-60 염수에 대한 Calu-3 세포의 노출이 시간-의존적 효과(들)을 일으킨다는 것을 가리킨다. 이러한 현상은 2시간 인큐베이션 시점에서 그렇게 명백하지 않았다. 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, cAMP "칵테일"로의 자극에 의해 전도도가 증가될 때 선형 성분이 더욱 명백하다. 그럼에도 불구하고, 2시간 인큐베이션 시간은 RNS-60 및 솔라스 염수 둘 모두에 대해 더 높은 선형 전도도를 나타냈고, 이러한 경우에, RNS-60 염수는 솔라스 단독과 비교하여 전체 세포 전도도를 배가시켰다. 이러한 증거는 전체 세포 전도도에 대한 2가지 이상의 기여물, 즉 비-선형의 전압-조절 전도도 및 선형 전도도의 활성화가 RNS-60 염수에 의해 영향을 받는다는 것을 가리키고, 이는 더 긴 인큐베이션 시간에서 더욱 명백하다.
제2 실험 세트 (칼슘 투과성 채널에 대한 효과)
제2 실험용 방법:
일반적인 패치 클램프 방법에 대해서는 상기를 참조한다. 그러나, 하기의 제2 실험 세트에서, 0 mV 또는 -120 mV 유지 전위부터 스테핑되는 프로토콜로, 기초 조건 하에 Calu-3 세포를 사용하여, 전체 세포 전류를 조정하는 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 유용성을 추가로 확증하기 위해 추가적인 패치 클램프 연구를 수행하였다.
각각의 경우의 전체-세포 전도도를 어느 한쪽 염수와 함께 15분 동안 인큐베이션된 세포로부터 수득된 전류-대-전압 관계로부터 수득하였다. 전체 세포 전도도에 대한 칼슘 투과성 채널의 기여가 있는지 여부 및 전체 세포 전도도의 이러한 부분이 RNS-60 염수와의 인큐베이션에 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해, 인큐베이션 기간 후에 세포를 생리 염수에서 패치시켰다 (NaCl의 농도가 높은 외부 용액을 필요로 하는 한편, 내부 용액은 고농도의 KCl을 함유함). 그 후, 외부 염수를 NaCl이 CsCl로 교체된 용액으로 교체하여, 주요 외부 양이온을 교체하는 것에 의한 전도도에서의 변화가 있는지 여부를 결정하였다. 이러한 조건 하에, 칼슘 진입 단계가 더욱 명백해지도록, 이어서 동일한 세포를 증가되는 농도의 칼슘에 노출시켰다.
결과:
도 5 a-d는 상이한 외부 염 용액을 사용하여 상이한 전압 프로토콜 (패널 A 및 C는 0 mV부터의 스테핑을 나타내는 한편, 패널 B 및 D는 -120 mV부터의 스테핑을 나타낸다)에서 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, 솔라스 (패널 A 및 B) 및 RNS-60 (패널 C 및 D))의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과를 나타낸다. 이러한 실험들에서, 1개의 시점인 15분을 사용하였다. 솔라스 (패널 A 및 B)에 대해, 결과는 1) 외부 용액으로서 NaCl 대신 CsCl (사각형 기호)를 사용하는 것이 대조군 (다이아몬드 기호)과 비교했을 때 선형 거동으로 전체 세포 전도도를 증가시켰고, 2) 20 mM CaCl2 (원 기호) 및 40 mM CaCl2 (삼각형 기호) 둘 모두의 CaCl2가 비-선형 방식으로 전체 세포 전도도를 증가시켰다는 것을 가리킨다. RNS-60 (패널 C 및 D)에 대해, 결과는 1) 외부 용액으로서 NaCl 대신 CsCl (사각형 기호)를 사용하는 것이 대조군 (다이아몬드 기호)과 비교했을 때 전체 세포 전도도에 대한 효과가 거의 없었고, 2) 40 mM의 CaCl2 (삼각형 기호)가 비-선형 방식으로 전체 세포 전도도를 증가시켰다는 것을 가리킨다.
도 6 a-d는 솔라스 (패널 A 및 B) 및 RNS-60 (패널 C 및 D)에 대해 2가지 전압 프로토콜 (패널 A 및 C: 0 mV부터의 스테핑; B 및 D: -120 mV부터의 스테핑)에서 CsCl 전류 데이터 (도 5에서 제시됨)를 20 mM CaCl2 (다이아몬드 기호) 및 40 mM CaCl2 (사각형 기호) 전류 데이터에서 차감하는 것으로부터 초래된 그래프를 나타낸다. 이러한 결과는 솔라스 및 RNS-60 용액 둘 모두가 칼슘-유도 비-선형 전체 세포 전도도를 활성화시켰음을 가리킨다. 이러한 효과는 RNS-60으로 더 컸고 (투여량 반응성을 가리킴), RNS-60으로는 더 높은 칼슘 농도에서만 증가되었다. 또한, 더 높은 칼슘 농도에서의 비-선형 칼슘 의존적 전도도가 전압 프로토콜에 의해 또한 증가되었다.
이러한 제2 실험 세트의 데이터는 Calu-3 세포에서 수득된 전체 세포 전도도 데이터에 대한 RNS-60 염수 및 솔라스 염수의 효과를 추가로 가리킨다. 이러한 데이터는 어느 한쪽 염수와의 15분 인큐베이션이 전체 세포 전도도에 대한 명료한 효과를 일으키고, 이는 RNS-60으로, 그리고 외부 칼슘이 증가되었을 때 가장 명백하다는 것을 가리키고, RNS-60 염수가 전체 세포 전도도의 칼슘-의존적 비-선형 성분을 증가시킨다는 것을 추가로 가리킨다.
축적된 증거는 기저 세포 전도도에 상이하게 기여하는 이온 채널들의 레발레시오 염수에 의한 활성화를 시사한다.
출원인의 다른 데이터 (예를 들어, 출원인의 다른 실시예의 데이터)와 함께, 본 발명의 특정 측면은 본 발명의 동전기적으로 생성된 용액을 사용하여 GPCR 및/또는 g-단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 막 구조물 (예를 들어, 막 및/또는 막 단백질, 수용체 또는 기타 막 성분)에서의 전기화학적 변화 및/또는 형태 변화를 제공하는 것을 포함하는, 막 구조, 막 전위 또는 막 전도도, 막 단백질 또는 수용체, 이온 채널, 지질 성분, 또는 세포에 의해 교환될 수 있는 세포내 성분 (예를 들어, 신호전달 경로, 예컨대 칼슘 의존적 세포성 신호전달 시스템) 중 하나 이상의 조정을 포함하여 세포내 신호 전달을 조정하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 추가적인 측면에 따르면, 이러한 효과들은 유전자 발현을 조정하고, 예를 들어 개별적인 메시지 전달 성분의 반감기 등에 의존하여, 지속될 수 있다.
실시예 7
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증 ( MS )의 당업계 -공인 급성 실험적 알레르기성 (자가면역) 뇌척수염 ( EAE ) 래트 MBP 모델에서 용량-반응성 방식으로 실질적으로 효능이 있는 것으로 나타났다)
개관:
본 실시예에서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60을 당업계에 공인된, 미엘린 염기성 단백질 MBP에 의해 유도된 급성 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 래트 모델에서 예방 및 치료 투여 요법 둘 모두로 2가지 용량에서 평가하였다. 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 용량-반응성 방식으로 실질적으로 효과가 있는 것으로 나타났다. 치료적 (MBP 주사와 동반적으로 시작된 RNS-60의 매일 투여) 및 예방적 (MBP를 주사하기 7일 전에 시작된 RNS-60의 매일 투여) RNS-60 투여량 요법 둘 모두가 임상 점수의 현저한 감소, 뿐만 아니라 지연된 개시 (고용량 군에서)를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-공인 래트 모델에서 EAE의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다. 따라서, 본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 병에 걸린 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 MS의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 동전기적 조성물은 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 가로지르고, 따라서 중추신경계의 염증성 병태를 치료하기 위한 신규 방법을 제공하였다.
다발성 경화증 ( MS ). 다발성 경화증 (MS)은 중추신경계 (CNS)의 탈수초성 질환이고, 청년에서 가장 통상적인 무능화 신경학적 질환 중 하나이다. 이러한 질환의 주요 특징은 국소 면적의 탈수초 및 염증이다. 질환 과정이 예측불능성이고, 평생이며, 남성보다 여성이 더욱 통상적으로 이 질환에 걸린다. 이러한 질환의 병인학은 유전적 및 환경적 요인에 의존적인 것으로 보인다. 말초에서, MCH II를 통해 항원 제시 세포 (APC)가 항원에 결합한다. Th0 세포가 항원에 결합하고, 활성화 및 분화를 겪는다. 부착 분자 및 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)가 Th1 세포가 혈액-뇌 장벽 (BBB)에 결합하고 이를 투과하는 것을 돕는다. CNS 내로 BBB를 가로지르면, Th1 세포가 항원-MHC 복합체를 동원하고, 염증유발성 시토카인을 생산하여, CNS에 대한 손상을 초래한다. 자가면역 시스템은 미엘린 단백질을 외래 물질로 인지하고, 공격하기 시작한다. 역사적으로는 Th1 세포가 이러한 질환의 병리학에서 우세한 역할을 하는 것으로 생각되지만, 최근의 증거는 Th17 세포, IL-6 및 TGF-β의 염증유발성 케스케이드가 EAE 및 MS의 발병기전에서 결정적인 역할을 한다는 것을 가리킨다.
실험적 자가면역 뇌척수염 ( EAE ). 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) (실험적 알레르기성 뇌척수염으로 또한 칭해짐)은 다발성 경화증 (MS)의 비-인간 동물 모델이다. MS는 아니지만, 상이한 형태 및 병기의 EAE가 다양한 형태 및 병기의 MS와 다수의 방식으로 매우 밀접하게 유사하다. 더욱 구체적으로, EAE는 급성 또는 만성-재발성, 후천성, 염증성 및 탈수초성 자가면역 질환이다. 신경 세포 (뉴런)을 둘러싸는 절연초인 미엘린을 구성하는 다양한 단백질 (예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 단백질지질 단백질 (PLP), 및 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG))의 일부분 또는 전체를 동물에 주사하여, 인간에서의 MS와 밀접하게 유사한 동물 자신의 미엘린에 대한 자가면역 반응을 유도한다. 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 마카크(macaque), 붉은털 원숭이 및 마모셋(marmoset)을 비롯한 다수의 상이한 동물 종에서 EAE가 유도되었다. 면역학적 도구의 개수, 동물의 입수가능성, 수명 및 다산성, 및 유도된 질환의 MS에 대한 유사성을 비롯한 다양한 이유로, 마우스 및 래트가 가장 통상적으로 사용되는 종이다. 급성 래트 EAE 모델은 강력한 염증성 성분이 있고, 따라서 모델에서 MS에서의 면역 사건을 표적으로 하는 작용제의 치료 잠재력을 조사하기 위한 적합한 모델이다.
MBP -유도 EAE. 단일 용량 후의 루이스(Lewis) 래트에서의 MBP는 뒷발 마비를 주로 특징으로 하는 재발에 이를 것이다. 루이스 래트에 제0일에 MBP 주사를 적용한다. 질환은 제12일 내지 제16일에 발달되고, 완전한 질환 회복은 제18일 내지 제21일에 발생한다. 이러한 모델은 자가-제어식이고, 탈수초를 나타내지 않는다.
물질 및 방법:
시험 유체 ( RNS -60)의 생산 및 특성화. 필터 여과된 RNS-60이 US2008/0219088 (2008년 9월 11일 공개), US2008/0281001 (2008년 11월 11일 공개) 및 WO2008/052143 (2008년 5월 2일 공개)에 기술된 방법에 따라 출원인에 의해 제조되었고, 상기 특허 모두는 전문이, 특히 출원인의 본 발명의 동전기적 유체를 제조하기 위한 기구 및/또는 방법에 관련된 모든 측면에 대해, 본원에 참고로 포함된다. 윙클러 적정 검정 (문헌 [Y.C. Wong & C.T. Wong. New Way Chemistry for Hong Kong A-Level Volume 4, Page 248]. 또는 [Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - 20th Edition ISBN 0-87553-235-7])에 의해 결정된 바와 같이, 사용된 RNS-60의 용존 산소 (DO) 함량은 59 ppm이었다. RNS-60 유체를 시험 아이템 (TI) 번호, 수령일, 보관 조건 및 유효 기간으로 표지하였다. 시험하는 동안 시험 시설에서의 안정성을 확실히 하도록 RNS-60의 보관 조건 및 취급은 출원인의 설명서를 따랐다. 사용하지 않을 때는 유체를 2-8℃에서 냉장시켰다. 유체를 함유하는 바이알은 1회용 용기로서 사용되었다.
비히클 대조군 유체. 비히클 대조군 유체는 호스피라(Hospira)로부터의 주사용 생리 염수 (0.9％)였다.
덱사메타손. 시그마에서 덱사메타손을 구입하였다 (카탈로그 번호 D1756; 로트 번호 096K1805). 투여를 위해, 덱사메타손 (백색 분말)을 1 ㎎/㎖의 농도를 달성하도록 에탄올에서 희석한 후, 0.1 ㎎/㎖의 용량 농도를 달성하도록 다시 증류수에서 희석하였다.
EAE 유도 아이템:
MBP 항원성 작용제. MBP는 기니 피그로부터의 미엘린 염기성 단백질 (Des-Gly-77, Des-His-78)-MBP (68-84); 카탈로그 번호 H-6875; 엠디 바이오사이언스(MD Bioscience) 제공)이었다. MBP를 생리 염수에 2 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다;
CFA 감작제. 완전 프로인트 아주반트 (CFA)는 모웰 디아그노스틱스 게엠베하(Morwell Diagnostics GmbH)의 엠디 바이오사이언스 부문으로부터의 것이었다 (카탈로그 번호 IMAD-4). 열처리로 죽은 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium Tuberculosis) H37 Ra를 4 ㎎/㎖의 농도로 함유하는 CFA 현탁액을 공급된 대로 사용하였다;
MBP / CFA 에멀젼 (항원성/감작제). 연구 제0일에 수행된 단일 접종 전에, 100 ㎕/동물의 총 용량 부피와 동일하도록 에멀젼성 혼합물을 철저하게 혼합하기 위해 루어(Luer) 피팅(fitting)에 의해 연결된 2개의 주사기를 사용함으로써 1 부피의 MBP 용액을 동일한 부피의 4 ㎎/㎖의 CFA와 혼합하였다. 이러한 용량을 2×50 ㎕ 피하 (SC) 양측 주사로서 발바닥내 발 영역 내로 주사하였다.
시험 동물; 래트. 60마리의 암컷 루이스 래트 (연구를 시작할 때 6-7주령)를 할란 래버러토리즈 이스라엘, 리미티드(Harlan Laboratories Israel, Ltd.)로부터 수득하였다. 처치 시작 시점의 동물의 체중 변동은 평균 체중의 20％를 초과하지 않아야 한다. 이러한 연구에서 사용된 동물의 건강 상태를 동물이 도착했을 때 시험하였다. 건강이 양호한 동물만 실험 조건에 순응시키고, 연구에서 사용하였다. 연구에 진입하기 전에, 동물을 5일 이상 동안 순응시켰다. 순응 동안 및 연구 기간 전반에 걸쳐, 동물을 접근이 제한된 설치류 시설에서 거주시켰고, 단단한 바닥이 설비되고 멸균 대팻밥이 침구 물질로 충전된 폴리프로필렌 우리 내에 최대 5마리의 래트의 군으로 사육하였다. 동물에게 시판되는 설치류 사료를 마음대로 제공하였고, 동물이 스테인레스 스틸 빨대가 있는 폴리에틸렌 병을 통해 각각의 우리에 공급되는 식수에 자유롭게 접근하였다. 연구에서 사용된 사료 배치의 급식 로트 분석이 연구 데이터와 함께 아카이브에 포함되었다. 물을 주기적으로 모니터링하였다. 자동으로 제어되는 환경 조건을 연구실 내에 20-24℃의 온도와 30-70％의 상대 습도 (RH), 12시간:12시간 밝음:어두움 주기 및 15-30회의 공기 교체/hr를 유지하도록 설정하였다. 온도 및 RH를 매일 모니터링하였다. 기준 시계로 밝음 주기를 모니터링하였다. 꼬리 마크를 사용하여 독특한 동물 식별물을 동물에게 제공하였다. 이러한 번호는 각각의 우리의 앞면 상에서 보이는 우리 카드 상에 또한 나타났다. 우리 카드는 연구 및 군 번호, 투여 경로, 성별, 계통, 및 처치 군에 관한 모든 기타 관련 상세사항을 또한 함유하였다.
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급성 EAE 뮤린 모델의 시험 절차 및 원리. 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)의 임상 및 병리학적 특징 중 다수를 모방하는 중추신경계 (CNS) 자가면역 탈수초성 질환이다. 이러한 급성 래트 모델은 연구의 제0일에 완전 프로인트 아주반트 (CFA)에 유화된 미엘린 염기성 단백질 (MBP)의 단일 피하 (SC) 주사에 의해 유도된 감작 기간으로 이루어진다.
EAE 유도 및 처치 요법의 개략적인 묘사가 도 8에서 제시된다.
EAE 유도:
MBP / CFA . 도 8의 개략적인 설명에서 제시된 바와 같이, 모든 동물을 연구일 제0일 (연구 시작)에 MBP 및 CFA의 균질한 에멀젼성 혼합물로 이루어지는 단일 접종물 주사에 적용하였다 (MBP/CFA 뇌염유발 에멀젼성 접종물 (100 ㎍ MBP/200 ㎍ CFA)을 100 ㎕/동물의 총 용량 부피로 주사하였고, 2×50 ㎕ 피하 (SC) 양측 주사로서 발바닥내 발 영역 내로 주사하였다).
처치:
처치 요법 및 절차. 동물을 채점하는 사람과는 다른 사람이 모든 화합물을 매일 신선하게 제조하였다. 동물을 채점한 사람은 군 번호만 표지된 바이알을 받았고, 처치를 알지 못했다.
투여 경로: (i) RNS-60 (IV); (ii) 비히클 대조군: (IV); 및 (iii) 양성 대조군: (IP).
용량 수준 및 부피 투여량: (i) RNS-60: 350 g에 대해 저용량 2 ㎖; 350 g에 대해 고용량 4 ㎖; (ii) 비히클 대조군: 0; 및 (iii) 양성 대조군 (덱사메타손): 1 ㎎/㎏.
지지 관리. 연구 과정 동안 결정되지 않는 한, 일단 EAE 실험 효과가 예상 및/또는 관찰되면 (단일 뇌염유발성 접종으로부터 약 8-12일 후), 또는 동물이 이전 측정으로부터 15％를 초과하는 체중 감소 또는 최초 체중 측정치의 20％를 초과하는 감소를 나타내고 있을 때, 사례별 기준으로 적합한 지지 관리를 수행하였다.
급식 및 급수. 식수에 함침된 조각 펠릿(chipped pellet) 또는 굵은 가루의 설치류 사료로 이루어진 추가적인 물 공급원을 우리 바닥 및 기는/움직이지 않는 동물의 앞에 놓았다.
탈수. 체중이 최초 측정의 10％ 이내로 돌아올 때까지 매일 2회 이상, 2 ㎖/동물/일 이하로 덱스트로스 5％ 용액으로의 피하 (SC) 보충 유체 요법을 동물에 적용할 수 있다.
소변보기. 배뇨를 보조하고 동물이 방광을 비울 수 있는지 여부를 관찰하기 위해 동물 복부의 촉진을 수행하였다.
기타 특수 관리. 동물의 항문 주변 영역 및 뒷다리를 필요에 따라 젖은 거즈 패드로 세정하였다.
관찰 및 검사:
임상 징후. 21일 연구 전체에 걸쳐, EAE 임상 채점 및 평가 (하기 참조)에 더하여 면밀한 임상 검사를 수행하고 매일 1회 이상 기록하였다. 관찰은 피부, 털, 눈, 점막, 분비물 및 배설물 (예를 들어, 설사) 및 자율 활성 (예를 들어, 눈물흘림, 침흘림, 털세움, 동공 크기, 일반적이지 않은 호흡 패턴)의 발생, 걸음걸이, 자세, 및 취급에 대한 반응에서의 변화, 뿐만 아니라 일반적이지 않은 행동, 떨림, 경련, 수면 및 혼수의 존재를 포함한다.
체중. 체중 감소는 질환 시작의 첫 번째 징후일 수 있는 한편, 갑작스러운 현저한 체중 증가는 EAE 증상의 완화를 동반하는 경향이 있다. 따라서, 동물의 개별적인 체중을 연구 제0일의 EAE 유도 (연구 시작) 직전에 측정하였고, 그 후 21일 관찰 기간 전체에 걸쳐 매일 측정하였다.
EAE 임상 채점 및 평가. 처음에, 모든 동물을 임의의 신경학적 반응 및 증상의 징후에 대해 EAE 유도 (연구 제0일) 전에 시험하였고, 그 후 21일 관찰 기간 전체에 걸쳐 매일 시험하였다. 실험 편향을 방지하기 위해, 적용된 구체적인 처치를 알지 못하는 스탭 구성원에 의해, 가능한 한, 맹검 방식으로 EAE 반응을 결정한다. 표 7에 제시된 바와 같이 중증도의 오름 차순의 고전적인, 당업계에 공인된 통상적인 0-5 등급에 따라 EAE 반응을 채점하고 기록하였다:
중증도의 오름 차순의 고전적인, 당업계에 공인된 통상적인 0-5 등급에 따라 EAE 반응을 채점하고 기록하였다.
등급 징후/증상
0 이상 없음
0.5 꼬리 허약, 원위 절반
1 꼬리 허약, 근위 절반
1.5 뒷발 허약, 발 1개
2 뒷발 허약, 발 2개
2.5 앞발 허약, 발 1개
3 앞발 허약, 발 2개
4 완전 마비
5 사망
혈액 샘플. 연구 종료일 (제21일)에, 주사 1시간 후 모든 동물에서 채혈하였다. 연구 제0일 (예방군만), 제7일, 제14일 및 제21일에 샘플을 수집하였다. 헤파린처리 바이알에 혈장을 수집하고, -20℃에서 유지시켰다. 혈구 계수용으로 300 ㎕ 부피를 보관하였고, 100 ㎕를 루미넥스(Luminex) 기술을 통한 추가적인 시토카인 분석용으로 보관하여 사용하였다. 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일에 대해 혈구 계수를 분석하였다.
조직 수집. 연구 종료 시에, 동물에 4％ PFA를 관류시켰다. 뇌 및 척수를 수집하고, 4％ PFA에서 유지시켰다.
인도적인 종점. 빈사 상태로 확인되는 동물 및/또는 중증 통증을 나타내고 중증 고통의 징후를 견디는 동물을 인도적으로 안락사시켰다.
통계/데이터 평가:
평가는 모든 처치군에서 수득된 절대값, 백분율 (％) 변화 및 평균 군 값 대 비히클 대조군에서의 이러한 것들로 표현되는, 신경학적 증상 및 체중 둘 모두에서의 상대적인 기록된 변화를 주로 기초로 하였다. 적합한 통계 방법에 의해 데이터 분석을 적용하여 처치 효과의 유의성을 결정하였다.
동물 관리 및 사용 선언:
연구가 기재된 규칙 및 규정을 준수하였다는 적합한 <실험 동물의 관리 및 사용에서의 윤리적 관리 위원회(Committee for Ethical Conduct in the Care and Use of Laboratory Animals)>에 제출된 신청서의 승인 후에 이러한 연구가 수행되었다.
결과:
연구 결과가 도 7에서 제시되고, 여기서 시간 (MBP 주사후 일수)이 X축에 제시되고, "임상 점수" (상기 "물질 및 방법" 참조)가 Y축에 제시된다.
도 7은 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가 다발성 경화증 (MS)의 당업계-공인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 래트 모델 (상기 "물질 및 방법" 참조)에서 실질적으로 효과가 있었음을 나타낸다.
구체적으로, 17일 기간에 걸쳐 비히클 대조군 (흑색 다이아몬드)에 비교하여, 치료적 (MBP 주사와 동반적으로 시작된 RNS-60의 매일 투여) 및 예방적 (MBP를 주사하기 7일 전에 시작된 RNS-60의 매일 투여) RNS-60 투여량 요법 둘 모두가 임상 점수의 현저한 감소, 뿐만 아니라 지연된 개시 (고용량 군에서)를 나타냈다.
저용량 (매일 1 cc 주사) RNS-60 치료군의 임상 점수는 대략적으로 비히클 대조군의 2분의 1 (1/2)이었던 한편, 고용량 (매일 2 cc 주사) RNS-60 치료군의 임상 점수는 대략적으로 비히클 대조군의 5분의 1 (1/5) 내지 10분의 1 (1/10)이었을 뿐만 아니라 지연된 개시를 또한 나타냈다.
저용량 (매일 1 cc 주사) RNS-60 예방군의 임상 점수는 대략적으로 비히클 대조군의 3분의 1 (1/3)이었던 한편, 고용량 (매일 2 cc 주사) RNS-60 예방군의 임상 점수는 제16일까지 0 (검출가능한 임상 점수가 없음)이었고, 이에 의해 실질적으로 지연된 개시를 나타냈을 뿐만 아니라, 제17일에 관찰가능했을 때 동일한 시점의 비히클 대조군의 10분의 1 (1/10) 미만이었다.
따라서, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-공인 래트 모델에서 EAE의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 8
(본 발명의 동전기적 유체가 다발성 경화증 (MS)의 당업계-공인 급성 실험적 알레르기성 (자가면역) 뇌척수염 ( EAE ) 래트 MBP 모델에서 래트의 체중을 유지시키는 것에서 효과적인 것으로 나타났다)
개관:
본 실시예는 실시예 7에 기술된 실험에 적용된 래트의 체중 변화를 개시한다. 체중 감소는 질환 시작의 첫 번째 징후일 수 있는 한편, 갑작스러운 현저한 체중 증가는 EAE 증상의 완화를 동반하는 경향이 있다. 따라서, 동물의 개별적인 체중을 연구 제0일의 EAE 유도 (연구 시작) 직전에 측정하였고, 그 후 21일 관찰 기간 전체에 걸쳐 매일 측정하였다. 체중에 대한 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60의 효과가 EAE 래트 모델에 적용된 래트의 체중을 유지시키는 것에서 효과적인 것으로 나타났다 (도 9).
체중 데이터:
도 9는 그램 단위 (패널 A) 및 100 그램을 기초로 하는 백분율 (패널 B)로 체중을 나타낸다. 이러한 실시예에서 처치된 동물의 평균 체중의 약간의 감소 후에, 연구를 종료할 때까지 평균 체중이 증가하기 시작하였다. 연구 종료 시, 비히클 처치 군 (군 1F)에서 평균 체중 증가는 20％였다. 연구 전반에 걸쳐, 연구 제0일에 시작하여 투여된 덱사메타손 처치 군 (군 2F)은 연구 동안 평균 체중 감소가 10％였다. 연구 종료 시, 덱사메타손으로 처치된 동물은 평균 체중의 2％가 감소되었다. 예방적 저용량 처치 군 (군 3F)은 연구 제1일-제3일에 4％ 이하의 평균 체중 감소를 나타낸 후, 연구 종료일까지 평균 체중의 23％가 증가되었다. 예방적 고용량 처치 군 (군 4F)은 연구 제1일-제3일에 5％ 이하의 평균 체중 감소를 나타낸 후, 연구 종료일까지 평균 체중의 28％가 증가되었다. 치료적 저용량 처치 군 (군 5F)은 연구 제1일-제3일에 4％ 이하의 평균 체중 감소를 나타낸 후, 연구 종료일까지 평균 체중의 21％가 증가되었다. 치료적 고용량 처치 군 (군 6F)은 연구 제1일-제3일에 4％ 이하의 평균 체중 감소를 나타낸 후, 연구 종료일까지 평균 체중의 19％가 증가되었다.
따라서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 EAE 래트 모델에 적용된 래트의 체중을 유지시키는 것에서 효과적인 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-공인 래트 모델에서 EAE의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 9
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증 ( MS )의 당업계 -공인 급성 실험적 알레르기성 (자가면역) 뇌척수염 ( EAE ) 래트 MBP 모델에 적용된 래트로부터 취해진 혈액 샘플 내의 백혈구, 호중구 및 림프구 수준에 대한 효과가 거의 없는 것으로 나타났 다)
개관:
본 실시예는 실시예 7에 기술된 바와 같은 실험 동안 래트로부터 취해진 혈액 샘플 내의 백혈구, 호중구 및 림프구의 수준을 개시한다. 시토카인 수준에서의 변화가 백혈구에서의 전반적인 변화로 인한 것이었는지 여부를 결정하기 위해, 출원인은 EAE 실험에 적용된 래트로부터 실험 전반에 걸쳐 혈액 샘플을 취하였다.
백혈구, 호중구 , 및 림프구의 수준:
도 10 a-d는 EAE 실험 전반에 걸쳐 수집된 혈액 샘플 내의 백혈구, 호중구, 및 림프구의 수준을 나타낸다.
연구 제0일 (패널 A), 제7일 (패널 B), 제14일 (패널 C) 및 제21일 (패널 D)에 시험 아이템을 투여하고 나서 1시간 후에 백혈구 (WBC), 호중구 및 림프구를 계수하였다. 연구 제7일에 비히클로 동물을 처치하고 나서 1시간 후의 최대 WBC 수는 8.23±0.36 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 2.46±0.38 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 저용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 5F)는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 9.59±0.46 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.1). 고용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 6F)는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 10.84±0.88 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05).
연구 제14일에 비히클로 동물을 처치하고 나서 1시간 후의 최대 WBC 수는 6.34±0.28 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 3.79±0.69 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 예방적 처치 (군 4F)는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 7.83±0.51 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 저용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 5F)는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 7.65±0.52 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 6F)는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 8.05±0.43 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 연구 제21일에 비히클로 동물을 처치하고 나서 1시간 후의 최대 WBC 수는 9.09±0.75 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 WBC 수를 5.12±0.57 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05).
연구 제7일에 비히클로 동물을 처치하고 나서 1시간 후의 최대 호중구 수는 26.20±1.62 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 호중구 수를 65.38±4.62 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 예방적 처치 (군 4F)는 비히클에 비해 평균 호중구 수를 31.90±0.96 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 6F)는 비히클에 비해 평균 호중구 수를 33.90±2.79 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05).
연구 제14일에 비히클로 동물을 처치하고 나서 1시간 후의 최대 호중구 수는 33.00±2.58 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 호중구 수를 73.10±3.15 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05).
연구 제21일에 비히클로 동물을 처치하고 나서 1시간 후의 최대 호중구 수는 41.40±2.32 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 호중구 수를 89.33±1.97 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 6F)는 비히클에 비해 평균 호중구 수를 34.60±3.08 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.1).
연구 제7일에 비히클로 처치하고 나서 1시간 후의 최대 림프구 수는 73.20±1.95 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 림프구 수를 30.63±1.31 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 예방적 처치 (군 4F)는 비히클에 비해 평균 림프구 수를 68.30±1.42 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.1). 고용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 6F)는 비히클에 비해 평균 림프구 수를 64.80±3.00 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05).
연구 제14일에 비히클로 처치하고 나서 1시간 후의 최대 림프구 수는 66.10±2.53 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 림프구 수를 26.80±3.23 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05).
연구 제21일에 비히클로 처치하고 나서 1시간 후의 최대 림프구 수는 57.50±2.09 포인트였다. 덱사메타손으로의 처치는 비히클에 비해 평균 림프구 수를 10.11±2.08 포인트로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 고용량의 시험 아이템으로의 치료적 처치 (군 6F)는 비히클에 비해 평균 림프구 수를 66.20±2.74 포인트로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05).
따라서, 고용량으로 예방적으로 및 치료적으로 투여된 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 연구 제7일에 비히클에 비해 유의하게 호중구 수를 증가시켰고 유의하게 림프구 수를 감소시켰다. 고용량으로 예방적으로, 그리고 두 용량 모두로 치료적으로 투여된 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 연구 제14일에 비히클에 비해 유의하게 WBC 수를 증가시켰다. 고용량으로 치료적으로 투여된 시험 아이템 RNS60은 연구 제21일에 비히클에 비해 유의하게 호중구 수를 감소시켰고 림프구 수를 증가시켰다. 따라서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 WBC, 호중구 및 림프구의 전반적인 수준에 대한 효과가 거의 없는 것으로 확인되었다.
실시예 10
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증 ( MS )의 당업계 -공인 급성 실험적 알레르기성 (자가면역) 뇌척수염 ( EAE ) 래트 MBP 모델에 적용된 래트로부터 취해진 혈액 샘플 내의 특정 시토카인의 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났다)
개관:
본 실시예는 실시예 7에 기술된 바와 같은 실험 동안 래트로부터 취해진 혈액 샘플에서 발견된 시토카인의 수준을 개시한다. 실시예 7에 기술된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60을 치료적 투여 요법에서 평가하였다. 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 EAE 래트 모델에 적용된 래트로부터 취해진 혈액 샘플 내의 특정 시토카인의 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
특정 시토카인들이 다발성 경화증에서의 역할이 있는 것으로 나타났다. 특히, CTLA-8 또는 IL-17A로 또한 공지된 인터류킨 17 (IL-17)이 급성 및 만성 EAE에서 중추신경계에서의 수준이 상승된 것으로 입증되었다 (문헌 [Hofstetter, H. H., et al., Cellular Immunology (2005), 237:123-130]). IL-17은 다양한 비-면역 세포로부터의 광범위한 다른 시토카인의 분비를 자극하는 염증유발성 시토카인이다. IL-17은 섬유모세포, 각질세포, 상피 및 내피 세포와 같은 부착 세포에 의한 IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 및 G-CSF의 분비를 유도할 수 있고, 방사선조사 섬유모세포의 존재 하에 공동 배양되는 경우에 ICAM-1 표면 발현, T 세포 증식, 및 CD34+ 인간 전구체의 호중구로의 성장 및 분화를 또한 유도할 수 있다 (문헌 [Fossiez et al., 1998, Int.Rev.Immunol. 16, 541-551]). IL-17은 활성화된 메모리 T 세포에 의해 주로 생산되고, 편재성으로 분포된 세포 표면 수용체 (IL-17R)에 결합함으로써 작용한다 (문헌 [Yao et al., 1997, Cytokine, 9, 794-800]). 염증 반응을 조절하는 것에서 유사한 역할 및 별개의 역할 둘 모두가 있는, IL-17의 다수의 상동체가 확인되었다. IL-17 시토카인/수용체 패밀리의 리뷰를 위해, 문헌 [Dumont, 2003, Expert Opin. Ther. Patents, 13, 287-303]을 참조한다.
IL-17은 비정상적인 면역 반응에 의해 매개되는 다수의 질환, 예컨대 류마티스 관절염 및 기도 염증, 뿐만 아니라 장기 이식 거부 및 항종양 면역에 기여할 수 있다. IL-17 활성의 억제제들이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 IL-17R:Fc 융합 단백질이 콜라겐-유도 관절염에서의 IL-17의 역할을 입증하는데 사용되었고 (문헌 [Lubberts et al., J.Immunol. 2001,167, 1004-1013]), 폴리클로날 중화 항체가 복막 유착 형성을 감소시키는데 사용되었다 (문헌 [Chung et al., 2002, J.Exp.Med., 195, 1471-1478]). 모노클로날 중화 항체는 시판된다 (R&D 시스템즈(R&D Systems) UK).
따라서, IL-17이 MS의 발병기전에서 하는 역할을 기초로, 출원인은 EAE 연구에서 래트로부터 취해진 혈액 샘플에서의 IL-17 수준에 대한 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60의 효과를 시험하였다.
시토카인 데이터:
연구 동안 혈액 내의 다양한 시토카인의 수준을 분석하였다. 간략하게, 모든 동물에서 주사하고 나서 1시간 후에 채혈하였고, 혈장을 헤파린처리 바이알에 수집하였다. 동일한 샘플로부터 다중 시토카인을 동시에 측정할 수 있게 하는 루미넥스 기술 (파노믹스(Panomics)로부터의 프로카르타(Procarta) 래트 시토카인 검정 키트 PC4127을 사용함)에 의해 100 ㎕ 샘플을 다양한 염증성 시토카인에 대해 분석하였다. 비-가우시안으로 분포된 데이터 및 때때로 있는 검정 검출 역치 미만의 결과로 인해, 중도절단(censored) 데이터에 대한 비-모수적 콕스 회귀 모델을 개조하여 상이한 유체들을 비교하였다. 도 11 a-h에 제시된 바와 같이, RNS60의 두 치료적 처치 용량 모두 (고용량 및 저용량)에 의해 IL1a, IL1b 및 IL17의 수준이 가장 명백하게 감소되었다. MBP-유도 EAE의 임상 소견은 대략 제10일에 시작하고, 대략 제18일에 피크이다. 따라서, 본 발명자들은 제7일 (질환 소견 직전) 및 제18일 (대략적인 질환 피크)을 시토카인 분석을 위한 가장 중요한 시점으로 간주하였다. 10마리의 동물/군으로부터의 제7일 및 제18일의 IL1a, IL1b 및 IL17의 전신 수준이 도 11 a-h에서 제시된다.
IL-1은 주요 염증유발성 시토카인 중 하나이고, 선천 면역 반응의 상류 매개물이다. IL-1은 다양한 성장 및 영양 인자, 염증성 매개물, 부착 분자 및 기타 시토카인의 생산을 직접적으로 및 간접적으로, 뿐만 아니라 양성 피드백 루프를 사용하여 유도한다 (문헌 [A. Basu et al., The type 1 interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury, J. Neurosci. 22 (2002), pp. 6071-6082]; [P.N. Moynagh, The interleukin-1 signaling pathway in astrocytes: a key contributor to inflammation in the brain, J. Anat. 207 (2005), pp. 265-269]). 이들에는 중요한 조정인자 예컨대 NGF, ICAM 1, IL6, TNFa, CSF 등이 포함된다. MS 진행은 말초에서의 자가 항원-반응성 T 세포의 활성화에 이어지는 CNS 내로의 침습을 수반한다. 미엘린-특이적 T 세포 활성화에 참여할 뿐만 아니라, 또한 말초에서의 대식세포 활성화의 주요 매개물을 나타내기 때문에, IL-1은 MS의 발달에서 결정적이다 (문헌 [R. Furlan et al., HSV-1-mediated IL-1 receptor antagonist gene therapy ameliorates MOG(35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, Gene Ther. 14 (2007), pp. 93-98]). MS에 대한 EAE 모델에서, IL-1α 및 IL-1β 둘 모두가 염증성 과정의 매개물인 것으로 나타났다. IL-1β의 말초 수준이 임상 과정과 상호관련되고, IL-1β 반응성이 EAE 동안 CNS-침윤 대식세포 및 정주 소교세포에서 나타났다 (문헌 [C.A. Jacobs et al., Experimental autoimmune encephalomyelitis is exacerbated by IL-1 alpha and suppressed by soluble IL-1 receptor, J. Immunol. 146 (1991), pp. 2983-2989]). 따라서, IL-1이 EAE 및 MS에서의 적절한 치료 표적이다. IL-1의 비-선택적 억제 메카니즘이 MS에 대한 기존의 치료제들에서 나타났다; 즉, 인터페론 베타, 항-염증성 글루코코르티코이드, 면역억제제, 아토르바스타틴 및 오메가-3 다중불포화 지방산 (문헌 [F.L. Sciacca et al., Induction of IL-1 receptor antagonist by interferon beta: implication for the treatment of multiple sclerosis, J. Neurovirol. 6 (Suppl. 2) (2000), pp. S33-S37]; [R. Pannu et al., Attenuation of acute inflammatory response by atorvastatin after spinal cord injury in rats, J. Neurosci. Res. 79 (2005), pp. 340-350]; [A.P. Simopoulos, Omega-3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases, J. Am. Coll. Nutr. 21 (2002), pp. 495-505]). 도 11 c-f에 입증된 바와 같이, RNS60의 IV 투여가 IL1α 및 IL1β 둘 모두의 전신 수준을 효과적으로 저하시켰다. IL1α의 경우, RNS60 처치가 혈액 수준을 비히클 처치 군과 비교하여 유의하게 저하시켰고, 이러한 시점에 덱사메타손만큼 효과적이었다. 그러나, 18일 시점에, 처치는 IL1α 전신 수준에 대한 유의한 효과가 없었다. IL1β의 전신 수준 또한 7일의 RNS60의 IV 처치 후 어떠한 독성 부작용의 징후도 없이 덱사메타손 처치 군에 필적하는 수준으로 유의하게 감소되었다. 동일한 경향이 18일 시점에 주목되었지만, 대조군에 비교했을 때 차이가 통계적으로 유의하지 않았다. IL-17은 강력한 염증유발성 효과가 있는 또한 결정적인 이펙터 시토카인이다. 이는 다른 염증유발성 시토카인 예컨대 종양 괴사 인자-α 및 케모카인의 발현을 유도하고, 호중구성 백혈구를 유인하며, 수지상 세포의 성숙을 강화한다 (문헌 [Kolls JK, Linden A. Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity. 2004 Oct;21(4):467-76]). IL-17-생산 세포는 콜라겐-유도 관절염, 결장염, 건선 및 EAE와 같은 자가면역 질환에서 필수적인 염증 매개물인 것으로 생각된다. EAE에서의 T 헬퍼17 세포는 CD4+ 세포이고, 이는 EAE에서 면역 말초 및 염증이 있는 중추신경계 양쪽에 존재한다. 또한, IL-17의 중화는 임상 질환을 호전시키고, 이러한 발견은 IL-17-결핍 동물에서의 감소된 EAE 중중도에 부합한다 (문헌 [Gold and Luehder, Interleukin-17-Extended Features of a Key Player in Multiple Sclerosis Am J Pathol. 2008 January; 172(1): 8-10]). RNS60으로의 7일 IV 처치는 다시 한번 덱사메타손 처치 동물과 유사한 수준으로 혈액 내의 IL17 수준에서의 유의한 감소를 야기하였다. 18일 처치 후에도 동일하게 계속되었지만, 결과는 통계적으로 유의하지 않았다. 21일의 IV 주사 후에도 현저한 독성 부작용 없이, IL1 수준뿐만 아니라 EAE에서의 2개의 주요 시토카인인 IL1 및 IL17의 조합을 저하시키는 것에서 RNS60이 효과적이라는 것을 주목하는 것이 중요하다.
IL1 및 IL17에 더하여, 신경계의 염증에서 중대한 역할을 하는 다수의 다른 분자가 RIS60에 의해 또한 조정된다. 여기에는 란테스(Rantes), KC, NGF 및 ICAM이 포함된다 (데이터는 제시되지 않음).
따라서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 EAE 연구에서 래트로부터 취해진 혈액 샘플 내의 IL-17 수준에 대한 유의한 효과가 있었다. 또한, IL-17이 IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 및 G-CSF의 분비를 자극하기 때문에, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60이 혈액 내의 이러한 시토카인들의 수준에 대한 유의한 효과가 있을 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-공인 래트 모델에서 EAE의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 11
(형광 활성화 세포 분류 ( FACS ) 분석에 의해 RNS -60이 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3); CD154 ( CD40L ); CD11B ; 및 CD3 의 발현에 대한 뚜렷한 효과가 있는 것으로 나타났다)
개관. 출원인은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 사용하여, 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60) 또는 생리 염수 대조군 유체와 함께 인큐베이션된 백혈구 상에서의 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD11B; 및 CD3의 발현 수준을 비교하였다.
방법:
피콜-하이팩(Ficoll-hypaque)으로 분리된 PBMC (성분채집술 - 모든 세포)를 RNS60의 30％ 용액 또는 생리 염수 (NS)에서 약 1시간 예비인큐베이션하고;
PBMC를 2 ㎍/㎖의 PHA-L로 24시간 또는 40시간 동안 활성화시키고;
세포를 수집하고, 차단/염색 완충제 내로 세정하고, 염색하고, 고정시키고;
세포를 유동 세포측정법으로 분석하였다.
결과:
CD193 (CCR3)에 관하여, 생리 염수 대조군에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 실질적으로 하향 조절되었다. 이러한 하향 조절은 MAPK p38의 인산화에 영향을 미쳤고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 차례로 에오탁신을 하향 조절하였으며 (예를 들어, 출원인의 특허 출원 공개 WO2009/055729 (2009년 4월 30일 공개)의 실시예 13 및 도 57 참조), 이는 차례로 IL 5를 하향 조절하였고, 또한 호산구 수를 변경시켰으며, 이는 이러한 실시예에서 기관지수축 반응을 변경시키는 인자들 중 하나였다.
오브알부민 챌린지 모델의 맥락에서 출원인의 특허 출원 공개 WO2009/055729 (2009년 4월 30일 공개)의 실시예 13에서 논의된 바와 같이, RNS-60은 생리 염수의 효과에 비교했을 때 OVA 챌린지 군에서 혈청 에오탁신 수준을 감소시켰다. 따라서, 특정 측면에 따르면, RNS-60은 리간드 에오탁신 및 그의 수용체 CCR3 둘 모두를 감소시키는 잠재력이 있다.
CD154 (CD40L)에 관하여, 생리 염수에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 하향 조절되었다.
CD11B에 관하여, 생리 염수에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 하향 조절되었다.
CD3에 관하여, 생리 염수에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 하향 조절되었다.
특정 측면에 따르면, 그리고 본원의 실시예에서 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 조성물은 염증을 감소시키는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다. 메카니즘에 속박되지 않으면서, 예를 들어, 그리고 본원에서 다른 곳에서 논의된 바와 같이, IL7R은 시토카인 수용체-유사 인자 2 유전자 (CRLF2)와 이량체화하여 TSLP 수용체를 형성한다 (문헌 [Al Shami et al. (2004) J. Exp. Med. 200:159-168]). TSLP는 시험관 내에서 미성숙 B 세포 발달을 구동시키는 IL7-유사 시토카인이고, 골수성 수지상 세포에서, 나이브(naive) CD4+ T 세포를 제2형 T 헬퍼 (Th2) 표현형으로 분화하도록 촉진할 수 있으며, CD4+ Th2 메모리 세포의 확장을 촉진할 수 있다 (문헌 [Huston et al. (2006) Curr. Allergy Asthma Rep. 6:372-376]). TSLP는 수지상 세포-매개 Th2-유형 염증 반응을 유발하는 것으로 생각되고, 알레르기성 염증에 대한 마스터 스위치로 간주되며 (문헌 [Koyama et al. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 357:99-104]), 이는 MS의 병인학에 관련된다 (예를 들어, 2007년 7월 29일에 온라인에서 공개되었고, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Gregory et al. Nature Genetics, 39:1083-1091] 참조; IL7Rα 대립유전자와 M.S.의 연관). 추가적인 측면에서, 본 발명의 동전기적 조성물은 매트릭스 메탈로프로테이나제 9 (MMP-9)를 조정하는 것 (예를 들어, 저하)에 대한 실질적인 유용성이 있다. 다발성 경화증 (MS)에서, 조직 내의 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 활성은 MMP와 그의 조직 억제제 (TIMP) 간의 균형의 결과이다. MMP-9는 급성 MS 병변에서 우세하고 TIMP-1에 의해 억제되는 한편, MMP-2는 예컨대 만성 질환에서 세포외 매트릭스 (ECM)의 재형성에 참여하는 것 같고, TIMP-2에 의해 억제된다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Avolio et al., J NeuroImmunol, 136:46-53, 2003] 참조).
본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 따라서, 본 발명의 동전기적 조성물은 병에 걸린 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 MS의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 M.S. 치료제와 함께 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 병에 걸린 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 염증성 신경변성 질환 (예를 들어, 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 알츠하이머, 파킨슨, 아밀로이드증 유형 장애)의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 12
(본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, RNS60 )는 소교 세포에서 용량-의존적 방식으로 iNOS 및 IL -1β 둘 모두의 발현을 억제하는 것으로 나타났다)
개관:
본원에 기술된 바와 같은 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 유체는 파킨슨병 (PD)을 치료하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
파킨슨병 (PD)은 인간에서 가장 파괴적인 신경변성 장애 중 하나이다. PD는 임의의 연령에서 나타날 수 있지만, 30세 미만의 사람들에서는 통상적이지 않다. 임상적으로, PD는 떨림, 운동완만증, 경직 및 자세 불안정을 특징으로 한다. 병리학적으로, 이는 흑색질 치밀부 (SNpc) 내의 세포질내 함유체 (루이체)의 존재와 연관된 도파민작용성 뉴런의 진행성 변성 및 교세포증에 의해 지시된다. 사후 PD 뇌에서, 죽어가는 뉴런이 세포 수축, 염색질 응축 및 DNA 단편화가 포함되는 아폽토시스의 형태학적 특징을 나타내는 것으로 보고되었다. 따라서, 질환 진행을 정지시키기 위한 효과적인 신경보호 치료 접근법의 개발이 최고로 중요하다. MPTP 마우스 모델은 PD에 대한 치료 접근법을 시험 및 확인하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
소교세포 활성화는 파킨슨병 (PD), 뿐만 아니라 기타 신경변성 장애의 발병기전에서 중요한 역할을 한다. PD의 특정 특징들이 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP)-중독 동물에서 모델링된다. MPTP의 신경독성 효과는 그의 MPP+로의 전환에 의존적이다. 신경교 세포에서, 모노아민 옥시다제 B (MAO-B)가 MPTP를 MPP+로 전환시킨 후, MPP+가 신경교 세포를 활성화시키고, 최근에는, MPP+가 소교세포에서 염증유발성 분자들의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
본 실시예에서, MPP+-자극 소교 세포에서 염증유발성 분자들의 발현을 조정하는 RNS60의 능력을 확증하였다.
물질 및 방법:
간략하게, 마우스 BV-2 소교 세포를 여러 농도의 RNS60 및 생리 염수 (NS)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 무혈청 조건 하에 2 μM MPP+로 자극하였다.
결과:
도 12에서 반-정량적 RT-PCR 분석에 의해 명시되는 바와 같이, MPP+ 단독이 마우스 BV-2 소교세포에서 유도성 산화질소 신타제 (iNOS) 및 인터류킨-1β(IL-1β) mRNA의 발현을 유도하였다. 유의하게, RNS60이 소교세포에서 용량-의존적 방식으로 iNOS 및 IL-1β 둘 모두의 발현을 억제하였다 (도 12). 반면에, 유사한 실험 조건 하에, 생리 염수 대조군 (NS)은 이러한 2개의 염증유발성 유전자의 발현에 대한 효과가 없었고 (도 12), 이는 이러한 효과의 특이성을 가리킨다.
구체적으로, 도 12는 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가 마우스 소교세포에서의 유도성 산화질소 신타제 (iNOS) 및 인터류킨-1β (IL-1β)의 MPP+-유도 발현을 약화시키지만 대조군 생리 염수 (NS)는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 무혈청 배지에서 1시간 동안 여러 농도의 RNS60 및 생리 염수 (NS)와 함께 예비인큐베이션된 BV-2 소교세포를 MPP+ (파킨슨병 독소)로 자극하였다. 6시간 자극 후, 전체 RNA를 단리하고, iNOS 및 IL-1β의 mRNA 발현을 반-정량적 RT-PCR로 분석하였다. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다.
따라서, 특정 측면에 따르면, MPP+는 파킨슨병 독소이기 때문에, 이러한 결과들은 RNS60이 파킨슨병의 당업계-공인 MPTP-유도 마우스 모델에서 보호 효과가 있다는 것을 가리킨다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 유체는 파킨슨병 (PD)을 치료하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 13
(본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, RNS60 )는 아밀로이드-β 독성으로부터 뉴런을 보호하는 것으로 나타났다)
개관:
본원에 기술된 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 유체는 알츠하이머병 (AD)을 치료하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
알츠하이머병 (AD)은 진행성 뉴런 사망 및 기억 상실을 초래하는 신경변성 장애이다. 사후 AD 뇌에서의 증가된 TUNEL 염색은 AD 환자의 뇌 내의 뉴런이 아폽토시스를 통해 사망한다는 것을 가리킨다. 원섬유성 아밀로이드-β 펩티드가 AD의 병리생리학에 참여한다. 신경병리학적으로, 이러한 질환은 인산화된 타우 및 β-아밀로이드 (Aβ) 단백질 (아밀로이드 전구체 단백질로부터 유래된 아미노산 40-43개의 단백질분해성 단편)의 응집체로 구성된 신경염성 플라크 및 신경원섬유 매듭을 특징으로 한다. 트랜스제닉 마우스에서 세포 내에서 Aβ 펩티드가 과다발현되는 것이 염색질 분절화, 응축 및 증가된 TUNEL 염색을 야기하는 것으로 확인되었다. 세포 배양 연구 또한 Aβ 펩티드가 뉴런 세포에 대해 아폽토시스성 및 세포독성이라는 것을 나타냈고, 원섬유성 Aβ1-42 펩티드가 뉴런 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있는 것으로 나타냈다.
추가적으로, 연구들이 염증과 AD 사이의 연관을 특성화하는 것을 점점 더 향하고 있고, 광범위한 신경교세포 활성화가 플라크 및 매듭 주변에서 확인되었다
본 실시예에서, 인간 SHSY5Y 신경 세포에서 Aβ(1-42)-유도 아폽토시스를 차단하는 것에서의 RNS60의 효과가 확증되었다.
물질 및 방법:
칼바이오켐으로부터의 시판 키트 (TdT FragEL™)를 사용하여, 원섬유성 Aβ1-42에 반응하여 생성된 DNA 단편의 3'-OH 끝부분의 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (TdT)-매개 결합에 의해 SHS5Y 인간 뉴런 세포의 단편화된 DNA를 원위치에서 검출하였다. 간략하게, 커버슬립을 20 ㎍/㎖ 프로테이나제 K로 15분 동안 실온에서 처리하고, 세정한 후, TdT로 염색하였다.
결과:
도 13에 나타난 바와 같이, 원섬유성 Aβ1-42 펩티드는 뉴런 세포에서 아폽토시스체(apoptotic body)의 형성을 현저하게 유도하였다. 본 발명자들은 Aβ1-42 처리 후 뉴런 프로세싱의 상실을 또한 관찰하였다 (2번째 줄; 도 13). 대조적으로, 반전 펩티드 Aβ42-1은 뉴런 아폽토시스 및 프로세스 상실을 유도할 수 없었다 (3번째 줄; 도 13). 유의하게, 시험된 여러 용량의 RNS60이 현저하게 Aβ(1-42)-유도 아폽토시스를 차단하였고 뉴런 세포에서의 프로세스를 보존시켰다 (4번째, 5번째 & 6번째 줄; 도 13). 대조적으로, 생리 염수 대조군 유체 (NS)는 Aβ(1-42)-유도 아폽토시스 및 프로세스 상실에 대한 효과가 없었다 (7번째 & 8번째 줄; 도 13).
구체적으로, 도 13은 RNS60이 인간 SHSY5Y 뉴런 세포의 원섬유성 Aβ(1-42)-매개 아폽토시스를 억제하지만 생리 염수 대조군 (NS)은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 분화 후, SHSY5Y 세포를 여러 농도의 RNS60 또는 NS와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 1 μM 원섬유성 Aβ(1-42) 펩티드로 공격하였다. 18시간 처리 후, 아폽토시스를 TUNEL (칼바이오켐)에 의해 모니터링하였다. 대조군으로서 Aβ(42-1) 펩티드를 또한 인큐베이션하였다. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다.
이러한 결과는 AD의 병인성 시약 (원섬유성 Aβ1-42)이 RNS60-민감성 경로를 통해 뉴런에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 가리킨다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 유체는 알츠하이머병 (AD)을 치료하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 14
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증 ( MS )의 당업계 -공인 마우스 MOG 모델에서 용량-반응성 방식으로 임상 점수를 억제하는 것에서 실질적으로 효과가 있는 것 으 로 나타났다)
개관:
본 실시예에서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60을 다발성 경화증 (MS)의 당업계-공인 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 마우스 MOG 모델에서 치료적 투여 요법으로 2가지 용량에서 평가하였다.
물질 및 방법:
실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)의 임상 및 병리학적 특징 중 다수를 모방하는 중추신경계 (CNS) 자가면역 탈수초성 질환이다. MOG 뮤린 모델은 연구 제0일에 완전 프로인트 아주반트 (CFA)에 유화된 MOG의 단일 피하 (SC) 주사에 의해 유도된 감작 기간 (200 ㎕/동물의 총 용량 부피로 주사된 200 ㎍ MOG / 300 ㎍ CFA가 허리주변 영역에 걸쳐 2 × 100 ㎕ 피하 양측 주사로서 전달됨); 이어지는, 연구 제0일의 EAE 유도 시점에 1회, 48시간 후 연구 제2일에 다시 한번의 복강내 (IP) 주사를 통한 20 ㎍/㎏ (약 400 ng/마우스)의 백일해 독소 (PT)로의 복강내 (IP) 보충 면역자극으로 이루어진다 (문헌 [Gilgun-Sherki Y. et al., Neurosciences Research 47:201-207, 2003]). 그 후, 도 14에 지시된 바와 같이 동물들을 RNS60 IV 주입으로 처치하였다. 사용된 동물은 할란 래버러토리즈 이스라엘, 리미티드로부터의 암컷 C57BL/6J 마우스였다 (10 마리/군); 청년기; 연구 시작시 8-9주령.
모든 동물을 EAE 유도 전 (연구 제0일)에 신경학적 반응 및 증상의 징후에 대해 검사하였고, 그 후 35일 관찰 기간에 걸쳐 매일 검사하였다. 중증도의 오름 차순인, 당업계에 공인된 0-15 등급에 따라 EAE 반응을 채점하고 기록하였다. 각각의 섹션의 점수를 합계함으로써 임상 점수를 결정하였다 (예를 들어, 문헌 [Weaver et al., FASEB 2005; The FASEB Journal express article 10.1096/fj.04-2030fje.] (2005년 8월 4일 온라인 공개) 참조).
결과:
도 14는 RNS60이 다발성 경화증 (MS)의 당업계-공인 마우스 MOG 모델에서 용량-반응성 방식으로 임상 점수를 억제하는 것에서 실질적으로 효과가 있지만 비히클 대조군 (비히클)은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. RNS-60의 고용량 및 저용량 둘 모두의 치료적 매일 투여, 뿐만 아니라 3일마다의 RNS-60의 고용량 투여 (모든 경우의 RNS-60의 투여가 1차 임상 징후와 동반적으로 시작됨)가 임상 점수의 현저한 감소를 나타냈다 (백색 다이아몬드 = 비히클 대조군; 백색 사각형 = 덱사메타손 양성 대조군; 연한 "x" = 임상 징후 개시부터의 저용량 (0.09 ㎖ RNS60) 매일 투여; 진한 "x" = 임상 징후 개시부터의 3일마다의 고용량 (0.2 ㎖ RNS60) 투여; 및 백색 삼각형 = 임상 징후 개시부터의 고용량 (0.2 ㎖ RNS60) 매일 투여).
상기의 본원의 실시예의 MBP 모델과 비교하여, 이러한 마우스 MOG 모델은 MBP 모델이 나타내지 않는 MS의 특징적인 축삭 손상을 모방하는 능력에 대해 당업계에 공지되어 있고, 관찰된 치료 효능을 더 긴 기간에 걸쳐 확장한다 (MBP 모델로의 21일에 비교하여 28-30일). 추가적인 측면에 따르면, RNS60은 이러한 마우스 MOG 모델에서 축삭 손상을 감소시키는 것에서 실질적으로 효과가 있지만 비히클 대조군 (비히클)은 그렇지 않다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-공인 마우스 모델에서 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다. 본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 조성물은 병에 걸린 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 MS의 증상을 치료하는 것 (경감 및 예방 포함)에 대한 실질적인 유용성이 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명의 동전기적 조성물은 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 가로지르고, 따라서 중추신경계의 염증성 병태를 치료하기 위한 신규 방법을 제공한다.
실시예 15
(형광 활성화 세포 분류 ( FACS ) 분석에 의해 RNS -60이 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3); CD154 ( CD40L ); CD11B ; 및 CD3 의 발현에 대한 뚜렷한 효과가 있는 것으로 나타났다)
개관. 출원인은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 사용하여, 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60) 또는 생리 염수 대조군 유체와 함께 인큐베이션된 백혈구 상에서의 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD11B; 및 CD3의 발현 수준을 비교하였다.
방법:
피콜-하이팩으로 분리된 PBMC (성분채집술 - 모든 세포)를 RNS60의 30％ 용액 또는 생리 염수 (NS)에서 약 1시간 예비인큐베이션하고;
PBMC를 2 ㎍/㎖의 PHA-L로 24시간 또는 40시간 동안 활성화시키고;
세포를 수집하고, 차단/염색 완충제 내로 세척하고, 염색하고, 고정시키고;
세포를 유동 세포측정법으로 분석하였다.
결과:
CD193 (CCR3)에 관하여, 도 15 B에 제시된 바와 같이, 생리 염수 대조군에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 실질적으로 하향 조절되었다. 이러한 하향 조절은 MAPK p38의 인산화에 영향을 미쳤고 (데이터는 제시되지 않음), 이는 차례로 에오탁신을 하향 조절하였으며 (예를 들어, 실시예 4 참조), 이는 차례로 IL 5를 하향 조절하였고 (데이터는 제시되지 않음), 또한 호산구 수를 변경시켰으며 (예를 들어, 실시예 4 참조), 이는 이러한 실시예에서 기관지수축 반응을 변경시키는 인자들 중 하나였다.
오브알부민 챌린지 모델의 맥락에서 실시예 4에서 상기에서 논의된 바와 같이, RNS-60은 생리 염수의 효과에 비교했을 때 OVA 챌린지 군에서 혈청 에오탁신 수준을 감소시켰다. 따라서, 특정 측면에 따르면, RNS-60은 리간드 에오탁신 및 그의 수용체 CCR3 둘 모두를 감소시키는 잠재력이 있다.
CD154 (CD40L)에 관하여, 도 16 A에 제시된 바와 같이, 생리 염수에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 하향 조절되었다.
CD11B에 관하여, 도 16 B에 제시된 바와 같이, 생리 염수에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 하향 조절되었다.
CD3에 관하여, 도 16 C에 제시된 바와 같이, 생리 염수에서의 수용체 발현 수준과 비교했을 때 RNS-60의 존재 하에 수용체가 하향 조절되었다.
실시예 16
(RNS60 은 MBP - 프라이밍 T 세포에서 NF κB의 활성화를 약화시키지만 생리 염수 (NS)는 그렇지 않았다)
개관. NF-κB 키나제는 염증-매개 병태 및 질환에서 염증 반응을 매개하는 것으로서 당업계에서 널리 인지되는 키나제이다.
본 실시예는 RNS60은 MBP-프라이밍 T 세포에서 NFκB의 활성화를 약화시켰지만 생리 염수 (NS)는 그렇지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체는 당뇨병 및 관련 대사 장애, 인슐린 저항성, 신경변성 질환 (예를 들어, M.S., 파킨슨병, 알츠하이머병 등), 천식, 낭성 섬유증, 혈관/관상동맥 질환, 망막 및/또는 황반 변성, 소화 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병 등)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증 및 염증-매개 병태 및 질환을 치료하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
방법. 도 17 A 및 17 B에 제시된 실험을 위해, MBP로 면역화된 마우스로부터 단리된 T 세포를 MBP로 다시 프라이밍하고, 24시간 후, 세포에게 여러 농도의 RNS60 및 NS를 제공하였다. 2시간 처리 후, NF-κB의 DNA-결합 활성을 핵 추출물에서 전기영동 이동도 변화 검정 (EMSA)에 의해 모니터링하였다.
도 17 C에 제시된 실험을 위해, MBP로 면역화된 마우스로부터 단리된 T 세포를 NF-κB 의존적 리포터 구축물인 PBIIX-Luc로 형질감염시킨 후, MBP로 다시 프라이밍하였다. 24시간의 MBP 프라이밍 후, 세포를 여러 농도의 RNS60 및 NS로 2시간 동안 처리하고 나서, 루시퍼라제 검정 키트 (프로메가(Promega))에 의한 전체 세포 추출물 내의 루시퍼라제 활성의 검정이 이어졌다. 다른 경우에는, MBP-프라이밍 T 세포를 또한 30 nM PMA로 1시간 동안 자극하였다. 이러한 경우에, RNS60 및 NS로의 1시간 예비처리 후에 PMA를 첨가하였다. 결과는 3회의 상이한 실험의 평균 + SD이다.
결과. 도 17 A-C는 RNS60은 MBP-프라이밍 T 세포에서 NF-κB 활성화를 약화시켰지만 생리 염수 (NS)는 그렇지 않았다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 도 17 A 및 17 B는 RNS60 (도 17 A 및 124 B의 가운데의 3개의 레인 참조)은 용량-반응성 방식으로 MBP-프라이밍 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰지만 NS (도 17 A 및 17 B의 가장 오른쪽의 레인 참조)는 그렇지 않았다는 것을 나타낸다.
유사하게, 도 17 C의 막대 그래프는 RNS60 (도 17 A 및 17 B의 두 번째, 세 번째 및 네 번째 막대 참조)은 용량-반응성 방식으로 MBP-프라이밍 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰고, 따라서 전체 세포 추출물에서 형질감염된 NF-κB-의존적 리포터 구축물 (PBIIX-Luc)로부터의 루시퍼라제 활성을 또한 약화시켰지만, NS (도 17 A 및 17 B의 다섯 번째 막대 참조)는 그렇지 않았다는 것을 나타낸다.
따라서, 특정 측면에 따르면, 개시된 동전기적으로 생성된 유체는 당뇨병 및 관련 대사 장애, 인슐린 저항성, 신경변성 질환 (예를 들어, M.S., 파킨슨병, 알츠하이머병 등), 천식, 낭성 섬유증, 혈관/관상동맥 질환, 망막 및/또는 황반 변성, 소화 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병 등)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증 및 염증-매개 병태 및 질환을 치료하는 것에 대한 실질적인 유용성이 있다.
실시예 17
(RNS60 은 1차 뉴런에서 원섬유성 Aß1-42 펩티드에 의해 유도된 타우 인산화를 약화시키지만 생리 염수 ( NS )는 그렇지 않았다)
개관. 타우병증은, 당업계에서 인지되는 바와 같이, (예를 들어, 대상체의 뉴런에서) 타우 단백질의 증가된 인산화를 나타내는 것을 특징으로 한다. 타우병증에는 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병), 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 특정 측면은 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이고 대상체에서의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상에 대한 치료를 제공하기 위한 타우 인산화의 조정에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 동전기적으로 변경된 수성 유체를 치료 유효량으로 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물은, 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된다.
도 18 a-b는 생리 염수 (NS) 대조군과 비교하여 1차 뉴런에서의 원섬유성 Aβ(1-42)-매개 타우 인산화에 대한 RNS60의 효과를 시험하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. β-튜불린 및 포스포-타우에 대한 항체들을 사용하여 이중-표지 면역형광에 의해 타우 인산화를 모니터링하였다. 베타-튜불린이 뉴런에 대한 마커로서 사용되었고, DAPI 염색이 세포의 핵을 가시화하는데 사용되었다. "(p)-타우"로 표지된 열의 위에서 세 번째 및 네 번째 패널은 타우 인산화가 RNS60에 의해 용량-의존적 방식으로 억제된 반면, 대조군 생리 염수 ("NS")는, 10％의 고용량에서도, 효과가 없었음을 나타낸다 ("(p)-타우"로 표지된 열의 맨 밑의 패널 참조).
실시예 18
(RNS60 은 IκBα의 1A형 포스파티딜이노시톨 -3 키나제 ( PI -3K)-매개 상향조절 및 NF-κB 활성화의 억제를 통해 신경교 세포에서 염증유발성 분자의 발현을 억제하였지만, 생리 염수 ( NS )는 그렇지 않았다)
개관. 신경염증은 타우병증이 포함되는 다양한 신경변성 장애의 발병기전의 밑바탕이 된다. 집중적인 연구에도 불구하고, 효과적인 요법이 그의 발병을 정지시키거나 그의 진행을 중지시키는데 이용가능하지 않다. 본원에서 논의된 바와 같이, RNS60은 생리 염수를 상승된 산소 압력 하에 테일러-쿠에트-푸아죄유(Taylor-Couette-Poiseuille) 유동에 적용함으로써 생성된, 전하-안정화 나노구조물을 함유하는 0.9％ 염수 용액이다. 본 실시예는 RNS60이 IκBα의 1A형 포스파티딜이노시톨-3 키나제 (PI-3K)-매개 상향조절 및 NF-κB 활성화의 억제를 통해 신경교 세포에서 염증유발성 분자의 발현을 억제한다는 것을 나타낸다. 일관되게, RNS60 처치는 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP)-중독 마우스의 흑색질 치밀부 (SNpc)에서 생체 내에서 IκBα 수준을 증가시켰고, NF-κB의 활성화를 억제하였으며, 유도성 산화질소 신타제 (iNOS)의 발현을 약화시켰다. 이러한 발견들은 도파민작용성 뉴런 보호, 표준화된 선조체 신경전달물질, 및 MPTP-중독 마우스의 개선된 운동 기능과 부합하였다. 이러한 결과들은, 총괄적으로, RNS60의 신규한 항-염증성 성질을 서술하고, 인간 타우병증 및 기타 신경변성 장애 (예를 들어, 파킨슨병)에서의 이러한 화합물의 치료적 역할을 시사한다.
방법:
1차 마우스 소교세포 및 성상세포 의 단리. 본 출원인들이 기존에 기술한 바와 같은 변형 (문헌 [Roy et al., 2006]; [Jana et al., 2007])이 있는 줄리앙(Giulian) 및 베이커(Baker) (문헌 [Giulian and Baker, 1986])의 절차에 따라 소교세포를 혼합형 신경교세포 배양물로부터 단리하였다. 간략하게, 제9일에, 혼합형 신경교세포 배양물을 둘베코 변형 이글 배지/F-12로 3회 세척하고, 회전식 진탕기 상에서 37℃에서 2시간 동안 240 rpm으로 진탕시켰다. 부유 세포를 세척하고, 플라스틱 조직 배양 플라스크 상에 시딩(seeding)하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 부착된 세포를 추가적인 연구를 위해 새로운 플레이트 상에 시딩하였다. 90 내지 95％의 세포가 Mac-1에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 제11일에, 혼합형 신경교세포 배양물을 세척하고, 다시 회전식 진탕기 상에서 180 rpm으로 18시간 동안 진탕시켰다. 부유 세포를 제거하고, 나머지 세포를 트립신처리하고, 실험을 위해 새로운 플레이트 상에 시딩하였다. 96％를 초과하는 세포가 GFAP에 대해 양성이었다. 마우스 BV-2 소교세포 (페루자 대학(University of Perugia)의 버지니아 보치니(Virginia Bocchini)로부터의 친절한 기증)를 또한 유지시켰고, 상기 지시된 바와 같이 유도하였다.
동물 및 MPTP 중독. 6주 내지 8주령 C57BL/6 마우스를 할란 (인디애나주 인디애나폴리스)으로부터 구입하였다. 동물 관리 및 실험은 국립보건원(National Institute of Health) 지침을 따랐고, 러시 대학교 메디컬 센터(Rush University of Medical Center)의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use committee (IACUC))에서 승인되었다. 급성 MPTP 중독을 위해, 염수 내의 MPTP-HCl (18 ㎎/유리 염기 ㎏; 시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co.), 미주리주 세인트 루이스)의 복강내 (i.p.) 주사를 마우스에 2시간 간격으로 4회 제공하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Ghosh et al., 2009]). 대조군 동물에게는 염수만 제공하였다.
RNS60 처치. 마우스를 MPTP 중독 2일 전부터 복강내 (i.p.) 주사를 통해 RNS60 및 NS (300 ㎖/마우스/일)로 처치하였다.
NO 합성에 대한 검정. 이전에 기술된 바와 같은 그리스(Griess) 시약을 사용하여, NO와 분자 산소의 안정적인 반응 생성물인 아질산염에 대한 배양 상청액의 검정에 의해 NO 합성을 결정하였다.
p85a -회합 (1A형) 및 p101 -회합 (1B형) PI 3- 키나제의 검정. 자극 후, 세포를 1％ v/v 노니데트(Nonidet) P-40, 100 mM NaCl, 20 mM 트리스(Tris) (pH 7.4), 10 mM 아이오도아세트아미드, 10 mM NaF, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 1 mM 페닐메틸술포닐 클로라이드, 1 ㎍/㎖ 류펩틴, 1 ㎍/㎖ 안티페인, 1 ㎍/㎖ 아프로티닌, 및 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A를 함유하는 빙냉 용해 완충제로 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 13,000×g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 단백질 G-세파로스 비드 (바이오래드(Biorad))로 1시간 동안 4℃에서 예비-청정화한 후, 1 ㎍/㎖ p85a 또는 p101 모노클로날 항체를 첨가하였다. 4℃에서 2시간 인큐베이션한 후, 단백질 G-세파로스 비드를 첨가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 4℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 면역침전물을 용해 완충제로 2회, 포스페이트-완충 염수로 1회, 0.5 M LiCl 및 100 mM 트리스 (pH 7.6)로 1회, 물에서 1회, 그리고 키나제 완충제 (5 mM MgCl2, 0.25 mM EDTA, 20 mM HEPES (pH 7.4))에서 1회 세척하였다. 20 mM HEPES (pH 7.0) 및 1 mM EDTA 내의 초음파처리에 의해 분산된 100 ㎕의 0.1 mg/㎖ PI 및 0.1 mg/㎖ 포스파티딜세린의 지질 혼합물을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 PI 3-키나제 활성을 결정하였다. 반응이 20 μCi의 [g-32P]ATP (3,000 Ci/mmol; NEN) 및 100 μM ATP의 첨가에 의해 시작되었고, 15분 후에 80 ㎕의 1 N HCl 및 200 ㎕의 클로로포름:메탄올 (1:1)의 첨가에 의해 종결되었다. 인지질을 TLC에 의해 분리하고, 아이오딘 증기에의 노출 및 자가방사선술 (REF)에 의해 가시화하였다. 유사하게, p110a- 및 p110b-회합 PI-3 키나제 활성을 모니터링하기 위해, 상청액을 p110a 및 p110b에 대한 항체로 면역침전시킨 후, 상기 기술된 바와 같은 면역복합체 지질 키나제 검정이 이어졌다.
PI -3 키나제의 여러 돌연변이체 구축물의 발현. 클래스 IA PI 3-키나제는 110 kDa의 촉매성 서브유닛 (p110) 및 85 kDa의 조절성 서브유닛 (p85)으로 이루어진다. p85a의 우성-음성 형태에서, PI 3-키나제의 p110a/b 서브유닛에 결합하는데 중요한, 야생형 p85a의 잔기 479-513으로부터의 인터(inter)-SH2 영역 내의 35개의 아미노산이 결실되고, 2개의 다른 아미노산 (Ser-Arg)이 이러한 결실된 위치에 삽입된다. 구축물의 조작 및 이러한 단백질들의 발현을 구동하는 벡터의 설명이 이전에 공개되었다. 한편, p110a/b의 구성적으로 활성인 돌연변이체 (p110*)에서는 p85의 인터-SH2 도메인이 p110의 NH2-말단에 결찰되는 반면, p110a/b의 키나제-결핍 돌연변이체 (p110-kd)에서는 ATP 결합 부위가 돌연변이된다. 12웰 플레이트에 플레이팅된 미세아교 세포를 리포펙타민-플러스(Lipofectamine-Plus) (인비트로젠)를 사용하여 이전에 기술된 바와 같은 제조사의 프로토콜을 사용하여 0.2 내지 0.25 ㎎의 상이한 플라스미드들로 형질감염시켰다.
전기영동 이동도 변화 검정 ( EMSA ). 이전에 기술된 바와 같이 핵 추출물을 제조하고 EMSA를 수행하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Saha et al., 2007]; [Brahmachari et al., 2009]). 간략하게, LI-COR 바이오사이언시즈(LI-COR Biosciences) (네브라카다주 링컨)에서 NF-κB에 대한 컨센서스(consensus) 결합 서열을 함유하는 IRDye™ 적외선 염료 말단-표지올리고뉴클레오티드를 구입하였다. 6 ㎍의 핵 추출물을 결합 완충제 및 IR-표지 프로브와 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 0.25× TBE 완충제 (트리스 보레이트-EDTA) 내의 6％ 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 오디세이 적외선 영상화 시스템(Odyssey Infrared Imaging System) (LI-COR 바이오사이언시즈)에 의해 분석하였다.
NF - kB 의 전사 활성. NF-kB의 전사 활성을 이전에 기술된 바와 같이 검정하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Saha et al., 2007]; [Brahmachari et al., 2009]).
반-정량적 RT - PCR 분석. 울트라스펙(Ultraspec)-II RNA 시약 (바이오텍엑스 래버러토리즈 인크.(Biotecx Laboratories, Inc.), 텍사스주 휴스턴)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 배쪽 중뇌로부터 전체 RNA를 단리하였다. 임의의 오염성 게놈 DNA를 제거하기 위해, 전체 RNA를 DNase로 소화시켰다. RT-PCR 키트 (클론텍(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 RT-PCR을 수행하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Brahmachari et al., 2009]; [Ghosh et al., 2009]).
실시간 PCR 분석. 택맨 유니버설 마스터 믹스(TaqMan Universal Master mix) 및 최적화된 농도의 FAM-표지 프로브 및 프라이머를 사용하여 ABI-프리즘(Prism)7700 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)에서 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Brahmachari et al., 2009]; [Ghosh et al., 2009]). ABI 서열 검출 시스템(Sequence Detection System) 1.6 소프트웨어를 사용하여 데이터를 프로세싱하였다.
면역조직화학 및 정량적 형태학. MPTP 중독 7일 후에, 마우스를 희생시키고, 그의 뇌를 고정시키고, 매립하고, 티로신 히드록실라제 (TH) 및 티오닌 염색을 위해 이전에 기술된 바와 같이 프로세싱하였다 (문헌 [Benner et al., 2004]; [Ghosh et al., 2007]; [Ghosh et al., 2009]). SNpc 내의 TH-양성 뉴런의 총 개수를 광학 분류기를 사용하여 스테레오 인베스티게이터(STEREO INVESTIGATOR) 소프트웨어 (마이크로브라이트필드(MicroBrightfield), 버몬트주 윌리스턴)로 입체해석학적으로 계수하였다. 선조체 TH 면역염색의 정량을 기술된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Benner et al., 2004]; [Ghosh et al., 2007]; [Ghosh et al., 2009]). 디지털 영상 분석(사이언(Scion), 메릴랜드주 프레더릭)에 의해 광학 밀도 측정치를 수득하였다. 선조체 TH 광학 밀도는 도파민작용성 섬유 신경분포를 반영하였다. 신선한 동결 절편 상에서의 면역형광 염색을 위해, 래트 항-마우스 CD11b (1:100), 염소 항-마우스 GFAP (1:100), 토끼 항 NF-κB p65 (1:100), 염소 항-NF-κB p65 (1:100), 토끼 항 포스포-p65 (1:100), 및 토끼 항-마우스 iNOS (1:250)를 사용하였다. 샘플을 마운팅(mounting)하고, 바이오-래드의 MRC1024ES 공초점 레이저 주사 현미경 하에 관찰하였다.
HPLC 분석. 도파민, DOPAC (3,4-디히드록시페닐아세트산) 및 HVA (호모바닐산)의 선조체 수준을 이전에 기술된 바와 같이 정량하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Ghosh et al., 2009]; [Roy et al., 2010]). 간략하게, 마우스를 MPTP 중독으로부터 7일 후에 경추 탈구에 의해 희생시키고, 그의 선조체를 수집하고, 즉각적으로 드라이 아이스에서 동결시키고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 분석일에, 이소프로테레놀을 함유하는 0.2M 과염소산 내에서 조직을 초음파처리하고, 생성된 균질화물을 20,000×g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. pH 조정 및 여과 후, 10 ㎕의 상청액을 에이콤팩(Eicompak) SC-3ODS 칼럼 (JM 사이언스 인크.(JM Science Inc.) (뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터의 컴플리트 스탠드-얼론(Complete Stand-Alone) HPLC-ECD 시스템 EiCOMHTEC-500) 상에 주입하고, 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다.
MPP+를 이전에 기술된 바와 같이 측정하였다. 간략하게, 마지막 MPTP 주사로부터 3시간 후 마우스로부터 수집된 흑색질을 0.2 M 과염소산에서 균질화시키고 상기와 같이 프로세싱하였다. 그 후, 0.15 ㎖/분의 유량으로 이동상 A (18 mΩ 물 + 0.01 M H3PO4) 및 이동상 B (아세토니트릴 + 0.01 M H3PO4) (1:4)로 이루어진 등용매 구배로 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 분리 칼럼 (250×4.6 ㎜; 280-nm UV 파장)을 사용하여 워터스(Waters) 2695 분리 모듈 HPLC 시스템에서 상청액을 분석하였다.
행동 분석. 2가지 유형의 행동 실험을 수행하였다. 이는 이전에 기술된 바와 같은 발 움직임에 대한 로타로드(rotarod) 실험 및 운동 활성에 대한 야외 실험을 포함하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Ghosh et al., 2009]; [Roy et al., 2010]). 디지스캔 모니터(Digiscan Monitor) (옴니테크 일렉트로닉스 인크.(Omnitech Electronics, Inc.), 오하이오주 컬럼버스)에서 마지막 MPTP 주사 용량으로부터 7일 후에 운동 활성을 측정하였다. 이러한 디지스캔 모니터는 선조체에 의해 직접적으로 제어되는 행동인 상동증 및 뒷발로 서기, 뿐만 아니라 기타 기본적인 운동 파라미터, 예컨대 수평 활성, 이동한 총 거리, 움직임 횟수, 움직임 시간, 휴식 시간, 평균 거리, 평균 시간, 및 중심 시간을 기록한다. 임의의 공격 또는 처치 전에, 마우스를 연속 3일 동안 매일 10분 동안 디지스캔 적외선 활성 모니터(Digiscan Infra-red Activity Monitor) 내에, 그리고 매일 10분 동안 로타로드 상에 놓아, 이들을 훈련시키고 이들의 기준선 값을 기록하였다. 간략하게, 동물을 이들의 우리로부터 직접적으로 제거하고, 부드럽게 먼저 코를 야외 장치의 특정 코너 내로 놓고, 방출 후에, 데이터 취득을 매 5분 간격으로 시작하였다. 디지스캔(DIGISCAN) 소프트웨어를 사용하여 수평 및 수직 활성 데이터를 분석 및 저장하였고, 이는 적외선 광선에 의해 자동으로 모니터링되었다. 로타로드에서는, 마우스의 발 움직임을 여러 속도에서 관찰하였다. 스트레스 및 피로를 없애기 위해, 마우스에게 5분 휴식 간격을 제공하였다. 그 후, 최종 MPTP 용량 7일 후에, 야외 검정 및 로타로드 시험을 별도로 각각의 마우스 상에서 6시간 간격으로 2회 수행하였다 (문헌 [Ghosh et al., 2007]; [Ghosh et al., 2009]; [Roy et al., 2010]). 기준선 값 비교 후에 운동 활성 측정치를 평가하였다.
통계. 모든 값은 평균 ± SEM으로 표현된다. 활성화된 소교세포에서의 iNOS, IL-1b 및 IkBa의 mRNA 발현에 대한 RNS60의 용량-의존적 효과를 분석하는 동안 1원 ANOVA를 수행하였다. 다른 경우에는, 스튜던트 t-시험을 사용하여 2개의 군 (예를 들어, 대조군 대 MPTP, MPTP 대 RNS60 등) 간의 결과를 비교하였다.
결과:
RNS60이 활성화된 마우스 소교세포 및 성상세포에서 염증유발성 분자의 발현을 약화시킨다: 활성화된 소교세포 및 성상세포는 도파민작용성 뉴런을 손상시킬 가능성이 있는 과도한 양의 NO 및 염증유발성 시토카인을 생산하는 것으로 공지되어 있다. MPTP의 신경독성 효과는 그의 MPP+로의 전환에 의존적이다. 신경교 세포에서, 모노아민 옥시다제 B가 MPTP를 MPP+로 전환시킨 후, 이는 신경교세포 활성화를 초래한다 (REF). 따라서, 본 발명자들은 RNS60이 소교세포에서 iNOS 및 IL-1β의 MPP+-유도 발현을 억제할 수 있는지 여부를 먼저 조사하였다. RNS60은 BV-2 소교세포에서 iNOS 및 IL-1β의 mRNA 발현을 용량-의존적으로 억제하였다. 이러한 효과는 RNS60에 대해 특이적이었는데, 동일한 배치로부터의 프로세싱되지 않은 NS는 이같은 억제 효과가 없었기 때문이다. MPP+에 더하여, 마우스 소교세포를 비롯한 여러 세포 유형 내의 다양한 염증유발성 분자의 원형(prototype) 유도인자인 LPS가 포함되는 다수의 기타 자극이 신경교 세포를 활성화할 수 있다. RNS60 및 NS와 함께 2시간 동안 예비인큐베이션된 1차 마우스 소교세포를 LPS로 자극하였다. 예상대로, LPS가 1차 소교세포에서 iNOS 단백질의 발현을 유도하였다. RNS60은 소교세포에서 iNOS의 LPS-유도 발현을 현저하게 억제하였지만, NS는 그렇지 않았다.
소교세포에 더하여, CNS 내에 다른 신경교 세포들이 있다. 예를 들어, 성상세포는 CNS 내의 주요 신경교 세포이고, 성상세포 활성화는 여러 신경변성 질환의 발병기전에 참여한다. 기존에, 본 발명자들은 IL-1β가 성상세포 내의 iNOS의 강력한 유도인자라는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 IL-1β로 자극된 1차 성상세포에서 iNOS의 발현에 대한 RNS60의 효과를 시험하였다. 소교세포와 유사하게, RNS60은, 이러한 경우에도, 1차 마우스 성상세포에서 IL-1β로 자극된 iNOS를 현저하게 억제한 한편, NS는 이같은 효과가 없었다. (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 결과는 RNS60이 어떠한 시험 농도에서도 소교세포 또는 성상세포에 독성이지 않았음을 나타냈고, 이는 iNOS의 신경교세포 발현에 대한 RNS60의 억제 효과가 세포 생존력에서의 임의의 변화에 기인하지 않았음을 시사한다.
RNS60이 NF-κB의 소교세포 활성화를 억제한다: LPS 및 기타 염증성 자극 (MPP+ 포함)은 NF-κB의 활성화를 통해 iNOS 발현을 유도하는 것으로 공지되어 있다. RNS60이 신경교 세포에서 iNOS의 발현을 약화시켰기 때문에, 본 발명자들은 NF-κB 활성화에 대한 RNS60의 효과를 시험하였다. NF-κB 활성화를 NF-κB의 DNA 결합 및 전사 활성 둘 모두에 의해 모니터링하였다. LPS로의 BV-2 소교세포 자극은 NF-κB의 DNA 결합 활성의 유도를 초래하였다. 그러나, RNS60이 소교세포에서 NF-κB의 LPS-유도 DNA 결합 활성을 억제하였다. 그 후, 본 발명자들은 NF-κB의 전사 활성에 대한 RNS60의 효과를 시험하였다. 예상대로, LPS는 루시퍼라제의 NF-κB-의존적 전사를 유도하였다. NF-κB의 DNA 결합 활성에 대한 RNS60의 효과와 일관되게, RNS60은 LPS-자극 소교세포에서 NF-κB의 전사 활성을 또한 억제하였다. NS는 이같은 억제 효과가 없었기 때문에, 이러한 결과들이 특이적이었다. 이러한 결과들은 RNS60이 NF-κB 활성화를 억제하는 것에 의해 iNOS 발현을 약화시킨다는 것을 가리킨다.
RNS60 이 신경교 세포에서 IκBα를 상향 조절한다. 항-염증성 분자가 NF-κB 활성화를 억제할 수 있는 다중 메카니즘이 있지만, 휴지 세포에서, 고전적인 p65:p50 이종이량체가 IκBα에 의해 불활성 복합체로서 세포질 내에 억류된다. 새롭게 합성된 IκBα 단백질이 세포질 내에, 뿐만 아니라 핵 내에 축적되고, 여기에서 NF-κB 결합을 감소시킨다는 것이 또한 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 고전적인 NF-κB 이종이량체의 활성화를 억제하기 위해 RNS60이 IκBα를 상향 조절할 수 있다고 가정하였다. 흥미롭게, NS는 그렇지 못했지만, RNS60은 시간-의존적 방식으로 소교세포에서 IκBα 단백질을 현저하게 상향 조절하였다. RNS60 처치로부터 30분 이내에만 IκBα 단백질에서의 유의한 증가가 관찰되었다. RNS60이 RelA p65의 발현을 상향조절하지 않았기 때문에 이러한 효과가 특이적이었다. 실시간 PCR 데이터 또한 RNS60에 의한 IκBα mRNA에서의 현저한 시간-의존적 증가를 나타냈지만, NS는 그렇지 않았다. 유사하게, 또한 RNS60은 IκBα의 발현을 용량-의존적으로 증가시켰지만, p65 및 p50은 아니였다. 이러한 IκBα 상향조절을 다른 각도에서 확증하기 위해, 본 발명자들은 이중-표지 면역형광을 또한 수행하였다. RNS60은 CD11b-양성 1차 소교세포에서 IκBα의 발현을 현저하게 증가시켰지만, NS는 그렇지 않았다. RNS60에 의한 IκBα 상향조절이 세포-유형 특이적인지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 1차 성상세포를 RNS60으로 처리하였다. 소교세포에서의 그의 효과와 유사하게, RNS60은 GFAP-양성 성상세포에서 IκBα을 또한 상향 조절하였다.
RNS60 에 의한 소교세포에서의 포스파티딜이노시톨 -3 ( PI -3) 키나제의 활성화. 다음으로, 본 발명자들은 RNS60이 IκBα의 상향조절을 위해 신호를 전달할 수 있는 메카니즘을 조사하였다. RNS60은 세포막과 상호작용할 가능성이 있는 전하-안정화 나노구조물을 함유한다. 이중 단백질 및 지질 키나제인 PI-3 키나제의 활성화가 세포막과 밀접하게 관련되어 발생하기 때문에, 본 발명자들은 PI-3 키나제 활성화에 대한 RNS60의 효과를 조사하였다. 수용체 티로신 키나제에 의해 조절되는 클래스 IA PI-3 키나제는 조절성 85-kDa 서브유닛 및 촉매성 110-kDa 서브유닛의 이종이량체로 이루어진다 (p85:p110α/β). 반면에, 클래스 IB PI-3 키나제는 101-kDa 조절성 서브유닛 및 p110γ 촉매성 서브유닛의 이량체로 이루어진다 (p101/p110γ). 흥미롭게, 본 발명자들은 지질 키나제 활성에 의해 증명되는 바와 같이 RNS60이 처리로부터 15분 이내에 p85α-회합 PI-3 키나제의 활성화를 현저하게 유도하였지만 NS는 그렇지 않았다는 것을 관찰하였고, 이는 RNS60이 클래스 IA PI-3 키나제의 활성화를 유도한다는 것을 시사한다. 그러나, RNS60은 p101-회합 PI-3 키나제 활성을 활성화하지 않았고, 이는 RNS60이 클래스 IB PI-3 키나제를 활성화할 수 없다는 것을 시사한다. 다음으로, 본 발명자들은 이러한 지질 키나제 활성에서 수반되는 클래스 IA PI-3 키나제의 촉매성 서브유닛을 확인하려고 시도하였다. 조절성 서브유닛 p85α는 p110α 및/또는 p110β 둘 모두와 스스로 회합할 수 있다. 면역-복합체 지질 키나제 검정에 의해, 본 발명자들은 PI-3 키나제의 RNS60-유도 활성화가 p110α 및 p110β 둘 모두에 기인하였음을 관찰하였다.
RNS60 에 의한 소교세포에서의 Akt 의 활성화. PI 3-키나제가 다양한 군의 세포 기능에 연관되었고, 이러한 기능들 중 다수는 단백질 키나제 B (PKB; Akt로 또한 공지됨)를 활성화시키는 클래스 I PI 3-키나제의 능력에 관련된다. 따라서, 본 발명자들은 RNS60이 소교세포에서 Akt를 활성화시킬 수 있는지를 시험하였다. PI-3 키나제의 활성화와 유사하게, RNS60은, 총 Akt의 수준을 증가시키지 않으면서, 포스포-Akt의 면역블롯 분석으로부터 명백한 바와 같이 자극으로부터 30분 및 60분에 Akt의 활성화를 현저하게 유도하였다. NS는 Akt 인산화에 대한 이같은 효과가 없었다. RNS60-처리 소교세포의 포스포-Akt 및 총 Akt의 면역형광 분석이 RNS60이 소교세포에서 Akt의 활성화를 유도하지만 NS는 그렇지 않다는 발견을 또한 확증하였다.
RNS60이 PI-3 키나제-Akt 신호전달 경로의 활성화를 유도하였기 때문에, 본 발명자들은 RNS60이 그의 항-염증성 활성을 나타내는데 이러한 경로를 이용하고 있었는지의 가능성을 조사하였다. 본 발명자들은 RNS60-매개 항-염증성 효과에 대한 PI-3 키나제 억제제인 LY294002 및 Akt 억제제인 AktI의 효과를 시험하였다. 예상대로, 박테리아 LPS는 소교세포에서 NO 생산 및 iNOS 단백질 발현을 유도하였다. 또한 RNS60이 LPS-자극 소교세포에서 NO 생산 및 iNOS 단백질 발현을 현저하게 억제하였다. 그러나, LY294002 및 AktI 둘 모두가 LPS-자극 소교세포에서의 iNOS 유도에 대한 RNS60의 억제 효과를 폐지시켰고, 이는 RNS60-매개 iNOS 억제에서 PI-3 키나제-Akt 경로가 수반된다는 것을 가리킨다. 다음으로, 본 발명자들은 IκBα 발현의 상향 조절 및 NF-κB 활성화의 억제를 위해 RNS60이 PI-3 키나제-Akt 경로를 또한 필요로 하였는지를 조사하였다. iNOS 조절과 유사하게, LPS-자극 소교세포에서 LY 및 AktI 둘 모두가 마찬가지로 IκBα 단백질 및 mRNA의 RNS60-매개 상향 조절을 폐지시켰고 NF-κB 활성화의 RNS60-매개 억제를 제거하였다.
이러한 관찰을 추가로 확증하기 위해, 본 발명자들은 BV-2 소교세포를 p85α의 우성-음성 돌연변이체로 형질감염시켰다. p110α/β 서브유닛의 결합에 필요한 인터-SH2 영역이 파괴된 p85α의 우성-음성 돌연변이체의 발현은 C6 신경교 세포 및 BV-2 신경교 세포를 비롯한 여러 세포 유형에서 PI 3-키나제 활성의 억제를 초래하고, 이는 과다발현된 p85α의 우성-음성 돌연변이체 단백질이 PI 3-키나제의 촉매성 서브유닛과 회합하지 않았다는 것을 가리킨다. 웨스턴 블롯 분석 및 실시간 PCR에 의해 증명된 바와 같이, RNS60은 빈 벡터로 형질감염된 소교세포에서 IκBα 단백질 및 mRNA의 발현을 유도하였지만, p85α로 형질감염된 소교세포에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과들은 RNS60이 PI-3 키나제-Akt 신호전달 경로를 통해 소교세포에서 IκBα를 상향 조절하고 그의 항-염증성 효과를 발휘한다는 것을 시사한다.
다음으로, 본 발명자들은 PI-3 키나제의 단독 활성화가 소교세포에서 IκBα의 발현을 유도하는데 충분하였는지를 조사하였다. p110* (p110α/β의 구성적으로 활성인 돌연변이체)의 발현이 지방세포에서 Glut 4 전위를 촉진하는데 충분하지만 p110-kd (키나제 불활성(dead) 돌연변이체)는 그렇지 않다는 것이 보고되어 있다. 따라서, p110α/β의 활성을 증가시키기 위해, 마우스 소교세포를 p110*로 형질감염시켰다. 이전에, 본 발명자들은 p110*의 발현이 인간 성상세포에서 PI 3-키나제의 지질 키나제 활성을 증가시키지만 p110-kd는 그렇지 않다는 것을 입증하였다. p110*의 과다발현이 IκBα의 mRNA 및 단백질 발현을 증가시킬 수 있었지만 빈 벡터는 그렇지 않았다. 반면에, p110-kd는 IκBα 발현에 대한 효과가 없었다. 이러한 결과들은 PI-3 키나제 활성화가 IκBα의 소교세포 발현을 유도하는데 충분하다는 것을 가리킨다.
RNS60이 시험관 내에서 소교세포 및 성상아교세포에서 항-염증성 분자 IκBα의 수준을 증가시켰기 때문에, 본 발명자들은 RNS60이 생체 내에서 MPTP-공격 마우스의 흑색질에서 IκBα 수준을 증대시킬 수 있었는지 여부를 조사하였다. 증가된 GFAP 및 CD11b로부터 명백한 바와 같이 MPTP 중독이 생체 내에서 SNpc에서 소교세포증 및 성상교세포증을 현저하게 유도하였지만, 본 발명자들은 MPTP 공격 후 IκBα 발현에서의 근소한 감소를 관찰하였다. 그러나, 배양된 성상세포 및 소교세포에서의 그의 효과와 유사하게, RNS60 처치는 생체 내에서 MPTP-중독 마우스의 SNpc에서 GFAP-양성 성상세포 및 CD11b-양성 소교세포 둘 모두에서 IκBα 수준을 유의하게 증가시켰다.
RNS60 처치가 NF-κB의 특이적 억제제인 IκBα를 상향조절하였기 때문에, 본 발명자들은 RNS60 처치가 생체 내에서 MPTP-공격 마우스의 SNpc에서 NF-κB 활성화를 억제할 수 있는지를 시험하였다. 마지막 MPTP 주사 7일 후에 SNpc에서 NF-κB를 모니터링하였다. MPTP 중독은 염수 처치와 비교하여 SNpc에서의 RelA p65의 현저한 감소를 초래하였다. 이중-표지 면역형광 분석은 p65가 GFAP-양성 성상세포 및 CD11b-양성 소교세포에서 주로 발현되었음을 가리켰다. NF-κB의 자극-유도 핵 전위에 더하여, p65의 자극-유도 인산화가 핵 전위 후 전사 활성화에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 따라서, 포스포-p65 수준이 염수로 처치된 마우스와 비교하여 MPTP-중독 마우스의 SNpc에서 또한 현저하게 더 높았고, 이는 MPTP-손상 마우스의 SNpc에서의 생체 내에서의 NF-κB 활성화를 확증한다. 그러나, RNS60이 생체 내에서 MPTP-중독 마우스의 SNpc에서 전체적인 p65, 뿐만 아니라 포스포-p65의 유도를 강하게 억제하였다. 유사한 조건 하에, NS는 p65 유도 및 p65 인산화를 억제하지 않았다.
PD 및 그의 동물 모델에서의 도파민작용성 뉴런의 상실에서 염증이 역할을 한다. RNS60이 신경교 세포에서 iNOS 발현을 억제하였고 생체 내에서 MPTP-중독 마우스의 흑색질에서 NF-κB 활성화를 억제하였기 때문에, 본 발명자들은 RNS60이 생체 내에서 MPTP-공격 마우스의 SNpc에서 iNOS 발현을 억제할 수 있는지를 시험하였다. 배쪽 중뇌 절편에서의 iNOS에 대한 면역형광 분석은 MPTP 중독이 흑색질 iNOS 단백질 발현에서의 현저한 증가를 초래하였다는 것과 iNOS가 GFAP-양성 성상세포 및 CD11b-양성 소교세포와 공동으로 국소화되었다는 것을 나타냈다. 그러나, RNS60으로의 마우스 처치가 생체 내에서 흑색질에서 iNOS의 현저한 억제를 초래하였지만, NS는 그렇지 않았다.
RNS60 이 MPTP -유도 신경변성에 대해 보고하였다. MPTP 주사 2일 전부터 복강내 주사를 통해 마우스를 매일 RNS60 및 NS로 처치하였고, 마지막 MPTP 주사 7일 후에, TH 면역염색을 사용하는 선조체 내의 돌출 도파민작용성 섬유의 정량 및 SNpc 내의 도파민작용성 세포체의 정량을 위해 동물들을 프로세싱하였다. MPTP-중독은 염소가 주사된 대조군과 비교하여 대략적으로 SNpc TH-양성 뉴런의 70％ 상실 및 선조체 TH OD의 75％ 감소를 초래하였다. 그러나, RNS60으로 처치된 MPTP-주사 마우스에서는, SNpc TH-양성 뉴런 및 선조체 TH OD에서의 감소가 더 적게 관찰되었다. 반면에, NS로 처치된 MPTP-중독 마우스에서는 이같은 보호 효과가 나타나지 않았다. 다음으로, RNS60이 MPTP에 의해 야기되는 생화학적 결핍에 대해 보호하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 MPTP 처치 7일 후 선조체 내의 도파민 (DA) 수준을 정량하였다. MPTP 중독은 염수가 주사된 마우스의 선조체와 비교하여 선조체 DA의 약 80％ 감소를 초래하였다. 대조적으로, RNS60이 제공된 MPTP-중독 동물은 선조체 도파민에서의 50％ 감소를 나타낸 반면, NS 처치의 경우에는 이같은 보호가 나타나지 않았다.
RNS60 이 MPTP -중독 마우스에서 운동 기능을 개선하였다. 신경보호의 궁극적인 치료 목표는 기능 손상을 감소시키는 것이다. 따라서, RNS60이 구조적 및 신경전달물질 손상에 대해서만이 아니라, MPTP에 의해 야기되는 기능 결핍에 대해서도 보호하는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 운동 및 야외 활성을 모니터닝하였다. MPTP 주사는 로타로드 성능, 움직임 시간, 움직임 횟수, 수평 활성, 총 거리, 뒷발로 서기, 및 상동증에서 현저한 감소를 야기하였다. 반면에, MPTP는 휴식 시간을 증가시켰다. 그러나, RNS60이 MPTP-유도 운동저하(hypolocomotion)를 유의하게 개선시켰지만, NS는 그렇지 않았다.
RNS60에 의해 나타나는 신경보호는 신경교세포에 의해 MPTP가 MPP+로 전환되는 것의 억제에 또한 기인할 수 있다. 이러한 가능성을 다루기 위해, 본 발명자들은 최종 MPTP 주사 3시간 후에 흑색질에서 MPP+ 수준을 측정하였다. NS는 MPP+의 흑색질 수준에 대한 효과가 없었지만, 뜻밖에도, RNS60이 흑색질에서 MPP+의 가용성을 6배만큼 증가시켰다. 총괄적으로, 이러한 결과들은 흑색질 내의 MPP+의 가용성을 현저하게 증가시키는 것에도 불구하고, RNS60이 MPTP-공격 마우스에서 흑색선조체를 보호한다는 것을 나타낸다.
요약하면, 본 발명자들은 RNS60이 IκBα의 (클래스 IA PI-3K-Akt)-매개 상향 조절 및 NF-κB 활성화의 억제를 통해 항-염증성 효과를 나타낸다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 MPTP-중독 마우스에서 RNS60이 SNpc에서 IκBα를 상향 조절하고 NF-κB 활성화를 차단하고, iNOS의 흑색질 발현을 억제하고, 흑색질 도파민작용성 뉴런의 상실을 보호하고, 선조체 TH 섬유 및 신경전달물질을 보존하며, 행동 기능을 개선시킨다는 것을 또한 입증하였다. 이러한 결과들은 RNS60의 신규한 생물학적 성질을 강조하고, RNS60이 1차 또는 보조 요법으로서 타우병증 및 기타 신경변성 장애의 치료적 개입을 위해 사용될 수 있다는 것을 가리킨다.
참고로 포함됨. 본 명세서에서 지칭되고/되거나 출원인의 데이터 시트에서 열거된 상기 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원의 도면 및 상세한 설명은 제한적인 방식보다는 설명적인 방식으로 간주되어야 하고, 본 발명을 개시된 특정 형태 및 예에 한정하도록 의도되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 반면에, 본 발명은 하기의 청구항에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 당업자에게 명백한 임의의 추가적인 변형, 변화, 재배열, 치환, 대안, 디자인 선택, 및 실시양태를 포함한다. 따라서, 하기의 청구항이 모든 추가적인 이같은 변형, 변화, 재배열, 치환, 대안, 디자인 선택, 및 실시양태를 포괄하는 것으로 해석되도록 의도된다.
상기 기술된 실시양태들은 상이한 다른 성분들 내에 함유된 상이한 성분들 또는 상이한 다른 성분들과 연결된 상이한 성분들을 서술한다. 이같은 서술된 구조들이 단지 예시적이라는 것과, 실제로는, 동일한 기능성을 달성하는 다수의 다른 구조가 실행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 개념적인 의미에서, 동일한 기능성을 달성하기 위한 성분들의 임의의 배열이 원하는 기능성이 달성되도록 효과적으로 "연합"된다. 따라서, 특정 기능성을 달성하도록 조합된 본원에서의 임의의 2가지 성분이, 구조 또는 중간 성분과 관계없이, 원하는 기능성이 달성되도록 서로 "연합"된 것으로 보일 수 있다. 유사하게, 이렇게 연합된 임의의 2개의 성분이 원하는 기능성을 달성하도록 서로에 대해 "작동가능하게 연결"되거나 "작동가능하게 커플링"된 것으로 또한 보일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태가 제시 및 기술되었지만, 본원에서의 교시를 기초로, 본 발명을 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 본 발명의 더 넓은 측면, 그리고 이에 따라, 첨부된 청구항들이 이들의 범주 내에 모든 이같은 변화 및 변형을 본 발명의 진정한 취지 및 범주 내에 있는 것처럼 포함하여야 한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명이 첨부된 청구항에 의해서만 정의된다는 것을 이해하여야 한다. 당업자는, 일반적으로, 본원에서, 특히 첨부된 청구항 (예를 들어, 첨부된 청구항의 본문)에서 사용된 용어가 일반적으로 "열린" 용어로 의도된다는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "~을 포함하는"은 "~을 포함하지만 이에 한정되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "~이 있는"은 "적어도 ~이 있는"으로 해석되어야 하며, 용어 "~을 포함하다"는 "~을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다"로 해석되어야 함 등). 특정 숫자의 도입된 청구항 인용이 의도되는 경우, 이같은 의도는 이러한 청구항에서 명시적으로 인용될 것이고, 이같은 인용의 부재 시에는 이같은 의도가 존재하지 않는다는 것을 당업자는 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 하기의 첨부된 청구항들은 청구항 인용을 도입하기 위해 "적어도 하나" 및 "하나 이상"이라는 도입 구절의 어법을 포함할 수 있다. 그러나, 이같은 구절의 사용은 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 인용의 도입이 이같은 도입된 청구항 인용을 함유하는 임의의 특정 청구항을, 동일한 청구항이 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"라는 도입 구절 및 "a" 또는 "an"과 같은 부정 관사를 포함하는 경우에도, 오직 1개의 이같은 인용을 함유하는 발명에 한정한다고 암시하는 것으로 해석되지 않아야 한다 (예를 들어, "a" 및/또는 "an"은 전형적으로 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다); 이는 청구항 인용을 도입하기 위해 사용된 정관사의 사용에 대해서도 유효하다. 또한, 특정 숫자의 도입된 청구항 인용이 명시적으로 인용된 경우에도, 전형적으로 이같은 인용이 적어도 인용된 숫자를 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 것을 당업자는 인지할 것이다 (예를 들어, 다른 수식어 없이 단순히 "2개의 인용"이라는 인용은 전형적으로 적어도 2개의 인용 또는 2개 이상의 인용을 의미한다). 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의한 것을 제외하고는 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> REVALESIO CORPORATION <120> METHODS OF WOUND CARE AND TREATMENT <130> 83535-57 <150> 60/862,953 <151> 2006-10-25 <150> 60/862,959 <151> 2006-10-25 <150> 60/862,955 <151> 2006-10-25 <150> 60/862,904 <151> 2006-10-25 <150> 60/982,387 <151> 2007-10-24 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 taatacgact cactataggg 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOG 35-55 <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = Ornithine <400> 2 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Xaa Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys 20

Claims (56)

  1. 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 동전기적으로 변경된 수성 유체의 용도이고, 여기서 유체가 평균 직경이 대부분 약 100 나노미터 미만이고 대상체에서의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상에 대한 치료를 제공하도록 타우 인산화 및/또는 응집을 조정하는데, 바람직하게는 타우 인산화 및/또는 응집을 감소시키는데 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 것인 용도.
  2. 제1항에 있어서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이, 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 것인 용도.
  3. 제1항에 있어서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이 유체 내의 주요 전하-안정화 기체-함유 나노구조물 종인 용도.
  4. 제1항에 있어서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물로서 유체 내에 존재하는 용존 산소 분자의 백분율이 0.01％ 초과; 0.1％ 초과; 1％ 초과; 5％ 초과; 10％ 초과; 15％ 초과; 20％ 초과; 25％ 초과; 30％ 초과; 35％ 초과; 40％ 초과; 45％ 초과; 50％ 초과; 55％ 초과; 60％ 초과; 65％ 초과; 70％ 초과; 75％ 초과; 80％ 초과; 85％ 초과; 90％ 초과; 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율인 용도.
  5. 제1항에 있어서, 총 용존 산소가 실질적으로 전하-안정화 산소-함유 나노구조물 내에 존재하는 것인 용도.
  6. 제1항에 있어서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이 대부분 90 nm; 80 nm; 70 nm; 60 nm; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; 및 5 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기 미만의 평균 직경을 갖는 것인 용도.
  7. 제1항에 있어서, 이온성 수용액이 염수 용액을 포함하는 것인 용도.
  8. 제1항에 있어서, 유체가 과산소화된 것인 용도.
  9. 제1항에 있어서, 유체가 용매화 전자 형태를 포함하는 것인 용도.
  10. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 변경이 유체역학적으로 유도된 국소적인 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함하는 것인 용도.
  11. 제10항에 있어서, 국소적인 동전기적 효과에 대한 노출이 전압 펄스 및 전류 펄스 중 하나 이상에 대한 노출을 포함하는 것인 용도.
  12. 제10항에 있어서, 유체역학적으로 유도된 국소적인 동전기적 효과에 대한 유체의 노출이 유체를 생성시키는데 사용된 장치의 동전기적 효과-유도 구조 특징에 대한 유체의 노출을 포함하는 것인 용도.
  13. 제1항에 있어서, 타우병증이 알츠하이머병, 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 전두측두엽 변성 (픽병), 및 권투선수 치매 (DP) (일명 복서 치매, 만성 복서 뇌병증)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  14. 제13항에 있어서, 타우병증이 호은성 과립 질환, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 및 전두측두엽 변성 (픽병) 중 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 타우병증이 전두측두엽 치매를 포함하는 것인 용도.
  16. 제1항에 있어서, 타우병증의 하나 이상의 증상이 중추신경계 및 뇌에서의 만성 염증 및 중추신경계 및 뇌에서의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태에 관련된 것인 용도.
  17. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산화질소의 국소 또는 세포 수준을 조정하는 것인 용도.
  18. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 IL-1베타, IL-8, TNF-알파 및 TNF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 투여 부위에서의 국소적인 감소를 촉진하는 것인 용도.
  19. 제1항에 있어서, 치료가 염증의 상승작용적 또는 비-상승작용적 억제 또는 감소를 위한 또 다른 항-염증제의 동시 또는 보조 사용을 추가로 포함하는 것인 용도.
  20. 제19항에 있어서, 상기 다른 항-염증제가 스테로이드 또는 글루코코르티코이드 스테로이드를 포함하는 것인 용도.
  21. 제20항에 있어서, 글루코코르티코이드 스테로이드가 부데소니드(Budesonide) 또는 그의 활성 유도체를 포함하는 것인 용도.
  22. 제1항에 있어서, 치료가 하나 이상의 추가 치료제를 환자에게 투여하는 조합 요법을 추가로 포함하는 것인 용도.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 미톡산트론, 나탈리주맙, MMP-9 및 MMP-2 억제제를 비롯한 MMP 억제제, 단기-작용 β2-효능제, 장기-작용 β2-효능제, 항콜린제, 코르티코스테로이드, 전신성 코르티코스테로이드, 비만 세포 안정화제, 류코트리엔 조절제, 메틸크산틴, β2-효능제, 알부테롤, 레발부테롤, 피르부테롤, 아르포르모테롤, 포르모테롤, 살메테롤, 이프라트로퓸 및 티오트로퓸을 비롯한 항콜린제; 베클로메타손, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손, 모메타손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손을 비롯한 코르티코스테로이드; 몬테루카스트, 자피르루카스트 및 질류톤을 비롯한 류코트리엔 조절제; 크로몰린 및 네도크로밀을 비롯한 비만 세포 안정화제; 테오필린을 비롯한 메틸크산틴; 이프라트로퓸과 알부테롤, 플루티카손과 살메테롤, 부데소니드와 포르모테롤을 비롯한 조합 약물; 히드록시진, 디펜히드라민, 로라타딘, 세티리진 및 히드로코르티손을 비롯한 항히스타민제; 타크롤리무스 및 피메크롤리무스를 비롯한 면역계 조정 약물; 시클로스포린; 아자티오프린; 미코페놀레이트모페틸; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
  24. 제22항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 TSLP 및/또는 TSLPR 길항제인 용도.
  25. 제24항에 있어서, TSLP 및/또는 TSLPR 길항제가 TSLP 및 TSLP 수용체에 특이적인 중화 항체, 가용성 TSLP 수용체 분자, 및 TSLP 수용체 융합 단백질 (TSLPR-이뮤노글로불린 Fc 분자 또는 1개 초과의 수용체 사슬의 성분들을 코딩하는 폴리펩티드 포함)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
  26. 제2항에 있어서, 치료가 막 회합 단백질의 입체형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성 중 하나 이상의 조정을 포함하는 세포막 구조 또는 기능 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함하는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
  27. 제26항에 있어서, 막 회합 단백질이 수용체, 막횡단 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  28. 제27항에 있어서, 막횡단 수용체가 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함하는 것인 용도.
  29. 제28항에 있어서, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)가 G 단백질 α 서브유닛과 상호작용하는 것인 용도.
  30. 제29항에 있어서, G 단백질 α 서브유닛이 Gαs, Gαi, Gαq, 및 Gα12로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 G 단백질 α 서브유닛이 Gαq인 용도.
  32. 제2항에 있어서, 치료가 전체-세포 전도도를 조정하는 것을 포함하는 세포막 전도도의 조정을 포함하는 것인 용도.
  33. 제32항에 있어서, 치료가 전체-세포 전도도의 하나 이상의 전압-의존적 기여물을 조정하는 것을 포함하는 전체-세포 전도도의 조정을 포함하는 것인 용도.
  34. 제2항에 있어서, 치료가 칼슘 의존적 세포성 메시지 전달 경로 또는 시스템의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함하는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
  35. 제2항에 있어서, 치료가 포스포리파제 C 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함하는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
  36. 제2항에 있어서, 치료가 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함하는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
  37. 제2항에 있어서, 치료가 중추 신경 및 뇌에서의 만성 염증 및 중추 신경 및 뇌에서의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태 또는 증상과 연관된 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함하는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
  38. 제1항에 있어서, 치료가 세포 네트워크 또는 층에 대한 투여를 포함하고, 추가로 그 내부에서의 세포간 연접의 조정을 추가로 포함하는 것인 용도.
  39. 제38항에 있어서, 세포간 연접이 치밀 연접, 간극 연접, 부착대(zona adherens) 및 데스모솜(desmosome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  40. 제38항에 있어서, 세포 네트워크 또는 층이 CNS 혈관 내의 내피 세포 및 내피-성상세포 치밀 연접, 혈액-뇌척수액 치밀 연접 또는 장벽, 폐 상피-유형 연접, 기관지 상피-유형 연접, 및 장 상피-유형 연접으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  41. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소가 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상의 양으로 존재하는 것인 용도.
  42. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 유체의 전하-안정화 산소-함유 나노구조물 내에 존재하는 산소의 양이 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상인 용도.
  43. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 용매화 전자 형태 및 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
  44. 제43항에 있어서, 용매화 전자 형태 또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종이 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상, 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재하는 것인 용도.
  45. 제43항에 있어서, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체가 적어도 부분적으로 분자 산소에 의해 안정화된 용매화 전자를 포함하는 것인 용도.
  46. 제2항에 있어서, 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상을 조정하는 능력이 밀폐된 기밀(gas-tight) 용기에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 또는 그를 초과하는 기간 동안 지속되는 것인 용도.
  47. 제26항에 있어서, 막 회합 단백질이 CCR3을 포함하는 것인 용도.
  48. 제1항에 있어서, 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료가 세포내 NF-κB 발현 및/또는 활성의 조정, 바람직하게는 NF-κB 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것을 포함하는 것인 용도.
  49. 대상체의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제를 수득하는 단계; 및
    이러한 치료제를, 평균 직경이 대부분 약 100 나노미터 미만이고 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 일정량의 동전기적으로 변경된 수성 유체와 조합하는 단계이며, 여기서 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제 또는 조합물을 제제화하는 방법이 제공되는 것인 단계
    를 포함하는, 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제 또는 조합물을 제제화하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이, 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 것인 방법.
  51. 대상체의 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료에서 사용하기에 적절한 치료제; 및 평균 직경이 대부분 약 100 나노미터 미만이고 타우병증 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 일정량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를 포함하는 제약 조성물.
  52. 제49항의 방법에 의해 제조된 제약 조성물.
  53. 제1항에 있어서, 치료가 국소, 흡입, 비강내, 경구, 정맥내 (IV) 및 복강내 (IP) 중 하나 이상에 의한 투여를 포함하는 것인 용도.
  54. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 유체의 전하-안정화 산소-함유 나노구조물이 본원에 개시된 표 1 및 2로부터의 하나 이상의 염 또는 이온을 포함하는 것인 용도.
  55. 제1항에 있어서, 대상체가 포유동물, 바람직하게는 인간인 용도.
  56. 제1항에 있어서, 치료가 타우 인산화 및/또는 응집을 감소시키는 것을 포함하는 것인 용도.
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