KR20120117905A - 프로테아좀 활성을 향상시키는 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
단백질병은 유해한 단백질을 제거하고 병원성 응집체의 형성을 방지하기에 충분하게 효율적으로 작용하지 않는 프로테아좀으로부터 유도된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 프로테아좀-관련된 탈유비퀴틴화효소 Usp14의 억제는 증가된 프로테아좀 효율성을 유도한다. 따라서, 본 발명은 Usp14의 억제, 프로테아좀 활성의 향상 및 단백질병의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2010년 8월 13일자 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제61/373,404호 및 2010년 1월 28일자 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제61/336,959호의 우선권을 주장하며, 이들 둘 모두의 내용을 본원에서 참조로 포함한다.
정부지원
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)의 허여 번호 GM065592호, GM66492호, 및 DK082906호 하에 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 소유한다.
배경
프로테아좀은 33개의 특정한 서브 단위를 함유하는 큰 단백질 복합체이다. 프로테아좀 복합체는 불필요하거나 잘못 접힌 단백질을 분해하는 프로테아제(protease)로서 일부 작용한다. 프로테아좀은 많은 세포 생리 양상을 조절하고, 프로테아좀 기능장애는 암 및 신경변성 질환을 포함한 다양한 질환에 연루되어 있다[Finley D., (2009), Annu. Rev. Biochem., 78, 477-513; Hoeller and Dikic, (2009), Nature, 458, 438-444; Demarto and Gillette, (2007), Cell, 129, 659-662); Dahlmann, B. (2007) BCB Biochem 8, Suppl 1, S3; Schartz AL and Ciechanover A (2009) Ann Rev Pharmacol Toxicol 49, 73-96].
전부는 아니지만 대부분의 프로테아좀 기질은 유비퀴틴(ubiquitin)이라 일컬어지는 작은 고보존(highly-conserved) 단백질의 다합체 사슬(multimeric chain)의 공유 결합을 통한 분해에 대해서 표적화된다. 더 긴 유비퀴틴 사슬은 더 짧은 사슬보다 프로테아좀과 더 강하게 상호작용하기 때문에[Thrower et al. (2000), EMBO J. 19, 94-102], 유비퀴틴 사슬 길이를 변경시키는 과정이 또한 종종 기질 분해 속도에 영향을 준다. 프로테아좀 분해에 대해서 태깅된(tagged) 기질에 결합된 유비퀴틴 사슬의 길이는 특정의 프로테아좀-관련된 탈유비퀴틴 효소(deubiquitinating enzyme) 및 유비퀴딘 리가아제(ubiquitin ligase)에 의해서 조절될 수 있다. 이들 탈유비퀴틴 효소 및 리가아제는 프로테아좀-결합된 유비퀴틴 사슬을 해체시키거나 연장시킴으로써 프로테아좀 활성을 조절하는 듯하다.
포유동물 프로테아좀은 세 가지의 주요 탈유비쿠틴 효소, 즉, Rpn11, Uch37, 및 Usp14를 함유한다[Finley D., (2009), Annu. Rev. Biochem., 78, 477-513]. Rpn11은 유비퀴틴 사슬과 기질 사이를 연접부에서 절단시킴으로써 태깅된 기질로부터 유비퀴틴을 제거한다. Rpn11-조절된 분열은 가수분해에 대한 기질의 참여 후에, 그러나, 기질 분해 전에 발생하기 때문에, Rpn11은 유비퀴틴이 기질과 함께 분해되는 것을 방지하는 것을 도우며, 그에 따라서, 세포 유비퀴틴 수준에서의 변동을 최소화한다. 추가로, 프로테아좀 기질은 프로테아좀의 격리된 단백질 분해 부위와 만나기 전에 좁은 전좌통로를 통과해야 하기 때문에, 부피가 큰 유비퀴틴 사슬의 제거가 또한 기질 전좌를 용이하게 할 수 있다. 따라서, Rpn11에 의한 유비퀴틴 사슬의 제거는 프로테아좀 경로 중의 비교적 늦은 단계에서 유비퀴틴 사슬의 en bloc 제거를 통한 기질 분해를 촉진한다[Verma et al., 2002) Science, 298, 611-615; Yao and Cohen, (2002), Nature, 419, 403-407].
Rpn11과는 대조적으로, Uch37은 프로테아좀 분해에 대한 기질의 참여 전에 작용한다. Uch37은 기질-원위 말단부(substrate-디stal tip)에서 유비퀴틴 사슬을 해체시키고[Lam et al., (1997), Nature, 385, 737-740], 이의 효소적 활성은 사슬들을 전체적으로 제거하기보다는 이들을 짧게 한다. Uch37에 의한 사슬 트리밍(chain trimming)은 긴 멀티유비퀴틴 사슬과 짧은 멀티유비퀴틴 사슬 사이를 구별하는 프로테아좀의 능력을 증가시킨다[Lam et al., (1997), Nature, 385, 737-740]. Uch37가 세포 내에서 프로테아좀 기능을 어떻게 조절할 수 있는 지에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
Usp14의 기능에 대해서 아주 약간만이 알려져 있다. 그러나, Usp14의 효모 오르토로그(yeast ortholog), 즉, Ubp6가 기질-원위 말단부에서 유비퀴틴 사슬을 해체시키기 위해서 및 프로테아좀 분해에 대한 기질의 참여 전에 작용하게 하기 위해서 제안되었다. [Hanna et ah, (2006), Cell, 127(7), 1401-1413]. Ubp6은 프로테아좀 억제제로서 작용하는 것으로 사료되며, Ubp6에 대한 이전의 연구는 비촉매적 프로테아좀 억제 방식을 보여 주였다[Hanna et al, (2006), Cell, 127(7), 1401-1413].
요약
본 발명은 Usp14의 억제, 프로테아좀 활성의 향상, 및 단백질병(proteinopathy) 및 향상된 단백질 파괴가 치료에 도움이 될 수 있는 다른 질환의 치료를 위한 신규한 조성물 및 방법을 제공한다. 단백질병 이외에, 프로테아좀 활성의 향상이 부족한 프로테아좀 활성 또는 유비퀴틴-프로테아좀 경로의 다른 성분의 부족한 활성이 특징인 어떠한 질환에 대해서, 예컨대, 폰히펠-린다우 질환(von Hippel-Lindau disease), 척수소뇌성 실조증 1(spinocerebellar ataxia 1), 앵겔만 증후군(Angelman syndrome), 거대축삭신경병(giant axon neuropathy), 골파제트병과 전두측두엽 치매를 동반하는 봉입체 근육병(inclusion body myopathy with Paget disease of bone and frontotemporal dementia: IBMPFD), 및 다른 질환(Lehman, N. L., (2009), Acta Neuropathologica, 118(3), 329-347;Weihl et al, (2007), Neuromuscular Disorders, 17, 87-87)의 치료에 도움이 될 수 있다. 프로테아좀 활성을 향상시키는 것은 또한 프로테아좀 기질이 관련되고 병리에 원인이되지만 엄격한 단백질병 정의를 충족시키지 않는 질환을 치료하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 많은 종양단백질(oncoprotein)은 프로테아좀 기질이며, 암을 촉진하는 이들의 능력은 프로테아좀 활성을 향상시킴으로써 잠재적으로 약화될 수 있다.
본 발명의 한 양태는 본원에서 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)으로 표현되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 Usp14 단백질을 IU1 또는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체와 접촉시킴을 포함하여 Usp14 단백질의 탈유비퀴틴화 활성(deubiquitination activity)을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포를 IU1 또는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체와 접촉시킴을 포함하여 세포에서의 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상자에게 IU1 또는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의 단백질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상자에게 IU1 또는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의 프로테아좀 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상자에게 IU1 또는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 또는 (VIII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의 Tau, TDP-43 또는 아탁신-3(ataxin-3)의 분해를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 효소 활성 Uch37이 결여되어 있으며 효소 활성 Usp14를 포함하는 단리된 프로테아좀에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 프로테아좀은 효소 불활성 Uch37 및/또는 비닐설폰-Uch37 부가물을 포함한다. 일부 구체예에서, 효소 활성 Usp14는 재조합 단백질이다. 특정의 구체예에서, 프로테아좀은 인간 프로테아좀 또는 쥐과 동물(murine) 프로테아좀이다.
본 발명의 또 다른 양태는 효소 불활성 Uch37을 포함하며 효소 활성 Usp14를 추가로 포함하는 프로테아좀을 생성시키는 방법으로서, Usp14이 결여되어 있지만 Uch37을 포함하는 프로테아좀을 정제하고, 정제된 프로테아좀을 탈유비퀴틴화효소(deubiquitinase) 억제제로 처리하고, 정제된 프로테아좀을 효소 활성 Usp14로 재구성시킴을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 프로테아좀은 인간 프로테아좀 또는 귀과 동물 프로테아좀이다. 일부 구체예에서, 프로테아좀은 HEK293 세포로부터 정제된다. 일부 구체예에서, 탈유비퀴틴화효소 억제제는 유비퀴틴-비닐설폰이다. 특정의 구체예에서, 활성 Usp14는 재조합적으로 생산된다.
본 발명의 또 다른 양태는 Usp14의 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, 효소적 불활성 Uch37를 포함하며 효소적 활성 Usp14를 포함하는 프로테아좀을 제공하고, 그러한 프로테아좀을 시험 화합물 및 Usp14 기질과 접촉시키고, 시험 화합물이 기질의 탈유비퀴틴화를 억제하는지를 측정함을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 기질은 탈유비퀴틴화효소에 의한 분열 후에 검출 가능하고/거나 유비퀴틴-의존성 프로테아좀 기질인 리포터에 커플링된다. 일부 구체예에서, 기질은 Ub-AMC 또는 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B이다. 특정의 구체예에서, 기질의 탈유비퀴틴화는 기질 분해의 억제에 의해서 입증된다. 일부 구체예에서, 프로테아좀은 비닐설폰-Uch37 부가물을 포함한다. 특정의 구체예에서, Usp14는 재조합 단백질이다. 일부 구체예에서, 프로테아좀은 인간 프로테아좀 또는 귀과 동물 프로테아좀이다.
본 발명의 또 다른 양태는 효소적 활성 Uch37이 결여되고 효소적 활성 Usp14를 포함하는 단리된 프로테아좀 및 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 키트는 Usp14 기질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, Usp14 기질은 Ub-AMC 및/또는 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B이다.
본 발명의 추가의 양태, 구체예 및 이점이 이하 상세히 논의된다. 또한, 상기 정보 및 하기 상세한 설명은 본 발명의 여러 양태 및 구체예에 대한 단순한 예시적 실례이며, 청구된 양태 및 구체예의 특성 및 특징의 이해를 위한 개요 또는 골격을 제공하고자 하는 것이다.
도 1의 A는 재조합 Usp14 단백질(정제된 Usp14) 또는 친화성-정제된 Usp14 결핍 인간 프로테아좀(인간 프로테아좀) 및 항-Usp14 항체를 사용하여 수행한 면역블롯(immunoblot)을 도시하고 있다. Usp14에 대응하는 밴드가 표시되어 있다.
도 1의 B는 Ub-VS로 처리되지 않거나(-VS) 처리된(+VS) Usp14-결핍 정제된 인간 프로테아좀(26S) 및 항-Uch37 항체를 사용하여 수행한 면역블롯을 도시하고 있다. Uch37에 대응하는 밴드가 표시되어 있다. 비특이적 밴드는 별표로 표시된다.
도 2의 A는 시중 구입 가능한 인간 프로테아좀(Biomol), 비처리되고 정제된 Usp14 결핍 인간 프로테아좀(-Ub-VS) 또는 Ub-VS 처리되고 정제된 Usp14 결핍 인간 프로테아좀(+Ub-VS)을 사용하여 수행하는 겔중(in-gel) suc-LLVY-AMC 염색(프로테아좀의 존재를 표시함)을 수행한 비변성 겔 분석(nondenaturing gel analysis)을 도시하고 있다.
도 2의 B는 GST tag가 있거나 없는 정제된 재조합 야생형 Usp14 (Usp14-wt) 또는 촉매적 불활성 돌연변이 Usp14 (Usp14-C114A)의 Coomassie Brilliant Blue (CBB) 염색을 GST 대조군(GST) 및 단백질 크기 마커(마커)와 함께 도시하고 있다.
도 2의 C는 겔중 suc-LLVY-AMC 염색(상부, 프로테아좀의 존재를 보이기 위해서) 또는 Coomassie Brilliant Blue(CBB) 염색으로 염색된 프로테아좀 단독(-), GST와 프로테아좀(GST), GST 태깅된 야생형 Usp14와 프로테아좀(GST-Usp14-wt), GST 태깅된 촉매적 불활성 돌연변이 Usp14와 프로테아좀(GST-Usp14-C114A), 비태깅된 야생형 Usp14와 프로테아좀(Usp14-wt) 또는 비태깅된 촉매적 불활성 둘연변이 Usp14와 프로테아좀(Usp14-C114A)의 결과를 도시하고 있다.
도 3은 Ub-VS 처리된 인간 프로테아좀의 존재하에 Usp14 활성에 대한 Ub-AMC 가수분해 검정의 결과를 도시하고 있다.
도 4의 A는 1 μΜ Ub-AMC, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Usp14에서의 Usp14 및 프로테아좀에 의한 Ub-AMC 가수분해의 초기 속도에 대한 선형 운동역학(linear kinetics)(R2 > 0.99)의 플롯을 도시하고 있다.
도 4의 B는 1 μΜ Ub-AMC, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Usp14에서 인간 프로테아좀의 존재하에 15분 동안의 Usp14-의존성 Ub-AMC 가수분해의 미카엘리스-멘텐 플롯(Michaelis-Menten plot)을 도시하고 있다.
도 4의 C는 4 nM Usp14, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Ub-AMC에서의 Usp14 및 프로테아좀에 의한 Ub-AMC 가수분해의 초기 속도에 대한 선형 운동역학(R2 > 0.99)의 플롯을 도시하고 있다.
도 4의 D는 4 nM Usp14, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Ub-AMC에서 Usp14 및 인간 프로테아좀의 존재하에 30분 동안의 농도-의존성 Ub-AMC 가수분해의 미카엘리스-멘텐 플롯을 도시하고 있다.
도 5는 사이클린 B에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있으며, 이는 또한 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClbB)를 검출하고 있다. 이러한 구체예에서, Ubn-ClbB는 26S 인간 프로테아좀 단독, 인간 프로테아좀과 야생형 Usp14(Usp14-wt) 또는 인간 프로테아좀과 촉매적 불활성 Usp14(Usp14-CA)로 처리되고, 후속하여 면역블로팅(immunoblotting)에 의해서 분석된다.
도 6의 A는 유비퀴틴-유사 도메인(UBL), 촉매 도매인(catalytic domain)(CAT), 및 엑손 4의 위치 및 Cys114의 위치를 묘사하는 인간 Usp14의 다이아그램을 도시하고 있다.
도 6의 B는 야생형 Usp14 (Usp14-wt), 촉매적 불활성 Usp14(Usp14-CA), 간단한 형태의 Usp14 (Usp14-SF) 또는 UBL 도메인 결핍 Usp14(Usp14-AUBL)와 함께 Tau를 공동-발현하며 표시된 바와 같이 Tau, Usp14 또는 액틴(Actin)에 특이적인 항체를 사용하여 염색된 인간 293 세포로부터의 세포 용해물에 대해서 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 7은 프로테아좀 친화성 정제 전(추출물) 또는 그 후(정제된 프로테아좀)의 태깅된 hRpn11과 함께 플래그-태깅된 Usp14(flag-tagged Usp14)의 표시된 형태를 공동-발현하며 항-플래그 항체를 사용하여 염색된 293 세포로부터의 세포 용해물에 대해서 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 표시된 경우에, Ub-VS는 프로테아좀 정제 전에 용해물과 함께 인큐베이션되었다. 추출물 샘플은 전체 5%를 나타낸다. 별표, 비특이적 신호. 프로테아좀 서브단위 Rpn13, 로드 컨트롤(load control). 대조 샘플, 빈 벡터(empty vector).
도 8의 A는 Usp14 촉매 억제제의 억제제를 위한 고출력 대규모 화합물 스크리닝의 통계적 플롯을 도시하고 있다.
도 8의 B는 AMC 켄칭 화합물을 측정하기 위해서 사용된 주파수 분포 곡선을 도시하고 있다(대조군=바닥부분 곡선).
도 9의 A는 Usp14 억제제 IU1의 화학적 구조를 도시하고 있다.
도 9의 B는 IU1에 의한 Usp14 로딩된 프로테아좀 (Usp14-Ptsm) 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제(왼쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 왼쪽에서 두 번째 막대 = 4 μΜ, 세 번째 막대 =8 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ) 및 IU1에 의한 AMC 형광의 켄칭의 결여(오른쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ)를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 9의 C는 IU1에 의한 Usp14 로딩된 프로테아좀 (Usp14-Ptsm) 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제(왼쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 중앙 막대 = 8 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ) 및 IU1에 의한 이소펩티다아제 T(Isopeptidase T: IsoT)의 억제의 결여(오른쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 중앙 막대 = 8 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ)를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 9의 D는 비히클(DMSO), IU1 또는 IU1C에 의해서 프로테아좀에 복합되지 않은 Usp14의 억제의 결여를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 9의 E는 비히클(DMSO) 또는 IU1에 의해서 Ub-VS로 처리되니 않은 26S 인간 프로테아좀(Ptsm)(즉, Usp14가 결여된 프로테아좀)의 억제의 결여를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 10의 A는 IU1C, 즉, IU1을 위한 불활성 대조군 화합물의 화학적 구조를 도시하고 있다.
도 10의 B는 IU1의 탈유비퀴틴화효소 억제 활성(아랫부분의 원, 아랫부분의 삼각형)을 IU1C의 탈유비퀴틴화효소 억제 활성(윗부분의 원, 윗부분의 삼각형, 사각형)과 비교하는 플롯을 도시하고 있다.
도 10의 C는 Tau 분해를 촉진하는데 있어서의 IU1C의 무력함을 도시하고 있다. 면역블롯은 Tau와 Usp14를 동시-발현하며 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ IU1C로 처리되고 Tau 또는 액틴(Actin)에 특이적인 항체로 염색된 MEF 세포의 용해물을 사용하여 수행하였다.
도 10의 D는 IU1C에 의한 표시된 탈유비퀴틴화효소의 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다(외쪽 막대들 = 0 μΜ, 오른쪽 막대들 = 17 μΜ).
도 11의 A는 표시된 농도의 IU1으로 처리된 프로테아좀 결합된 Usp14, IsoT 또는 Uch37의 탈유비퀴틴화효소 활성을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 11의 B는 IU1에 의한 표시된 탈유비퀴틴화효소의 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다(왼쪽 막대들 = 0 μΜ, 오른쪽 막대들 = 17 μΜ).
도 12의 A는 Usp14 (80 nM) 없이 또는 그와 함께 인큐베이션되고 표시된 농도의 비히클(DMSO), IU1C 또는 IU1로 처리되고 Usp14 또는 Alpha7로 염색된 정제된 26S 인간 프로테아좀 (~4 nM)의 면역블롯을 도시하고 있다. 별표(*)는 항-Usp14 항체에 의해서 생성된 비특이적 신호를 나타낸다.
도 12의 B는 약 2배 몰 과량의 Usp14가 표시된 화합물(30 μΜ)의 부재 또는 존재하에 프로테아좀과 인큐베이션됨을 제외하고는 도 12의 A에서와 같은 면역블롯을 도시하고 있다.
도 13은 비히클(대조군) 또는 IU1으로 처리되고 표시된 라운드 수의 초여과(스핀, 왼쪽 패널; 스핀 무= 왼쪽 막대, 1 x 스핀 = 중앙 막대, 3 x 스핀 = 오른쪽 막대) 또는 스핀-컬럼 겔 여과(오른쪽 패널; 대조군 = 왼쪽 막대, IU1 = 오른쪽 막대)에 주어진 프로테아좀 결합된 Usp14의 탈유비퀴틴화 활성을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 14의 A는 45분 동안 표시된 농도의 IU1로 처리된 프로테아좀 결합된 Usp14의 IC50 곡선을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 14의 B는 30분 동안 표시된 농도의 IU1으로 처리된 프로테아좀 결합된 Usp14의 IC50 곡선을 묘사하는 플롯를 도시하고 있다.
도 15는 4 nM의 26S 인간 프로테아좀 단독으로 처리되거나, 표시된 바와 같이 야생형 Usp14 (Usp14-wt), IU1, 및/또는 프로테아좀 억제제와 함께 처리된 사이클린 B 및 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClbB)에 대해 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 면역블롯은 장기노출(Long exp) 또는 단기노출(Short exp)에 주어진다.
도 16의 A는 4 nM의 26S 인간 프로테아좀 단독으로 처리되거나, 비히클 또는 IU1 (34 μΜ)에 더하여 야생형 Usp14 (60 nM)과 함께 처리된 사이클린 B 및 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClbB)에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 16의 B는 5 nM의 26S 인간 프로테아좀 단독으로 처리되거나, 비히클 또는 IU1 (75 μΜ)에 더하여 야생형 Usp14 (75 nM)과 함께 처리된 T7-태깅된 SiclPY 및 폴리유비퀴틴화된 SiclPY (Ubn-SiclPY)에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 17은 IU1로 처리되지 않았거나 (IU1 없음) IU1로 1시간 또는 24시간 동안 처리된 MEF 세포로부터의 용해물의 액체 크로마토그래피/질량 스펙트로메트리 (LC/MS) 기록의 이온 수를 묘사하는 플롯을 도시하고 있다. 하부 패널은 1 μg/mL의 IU1 표준 용액에 대한 이온 수를 묘사한다.
도 18은 다양한 농도의 lUl 표준의 LC/MS 기록의 이온 수를 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 19는 255 nm 및 305 nm에서 최대 흡수를 나타내는 IU1의 UV 스펙트럼 (왼쪽)과 300 nm에서 이어지는, 세포로의 IU1 내재화의 시간-의존성을 도시하는 HPLC 크로마토그램 (오른쪽)을 도시하고 있다.
도 20의 A는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 바와 같은 세포 수에 의한 표준화 후 MEF 세포에서 IU1 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 20의 B는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 바와 같은 세포 수에 의한 표준화 후 293 세포에서 IU1 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 21의 A는 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 Tau, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, Tau 및 Usp14를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 21의 B는 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ의 IU1로 처리된, Tau 및 Usp14를 공동-발현시키는 MEF 세포에서 Tau RNA 수준의 정량적 RT-PCR 분석 결과를 도시하고 있다.
도 22의 A는 75 μΜ의 IUl으로 지시된 시간 동안 처리되고 TDP43플래그, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, TDP43플래그 및 Usp14를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 22의 B는 0, 50 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 Atx3 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, Usp14에 더하여 Atx3-Q80 또는 Atx3-Q22를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 22의 C는 0, 25, 50 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 GFAP 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, Usp14에 더하여 야생형 GFAP (GFAP-wt), K63Q 돌연변이 GFAP (GFAP-K63Q) 또는 E210K GFAP (GFAP-E210K)를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 22의 D는 75 μΜ의 IU1로 각각의 지시된 시간 동안 처리된, TDP-43 및 Usp-14를 공동-발현시키는 MEF 세포에서 TDP-43 RNA 수준의 정량적 RT-PCR 분석 결과를 도시하고 있다.
도 23의 A는 지시된 대로, 비히클 또는 75 μΜ의 IU1와 함께 미리 인큐베이션되고 63 μΜ의 메나디온으로 처리된 MEF 세포의 DNPH-처리된 용해물 상에서 수행된 항-DNPH 또는 항-액틴 항체로 염색된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 23의 B는 IU1 (75 μΜ) 또는 프로테아좀 억제제 (20 μΜ MG132, 10 μΜ PS-341)와 함께 4 h 동안 미리 인큐베이션된 후에 메나디온 (300 μΜ)으로 60분간 처리된 HEK293 세포의 DNPH-처리된 용해물 상에서 수행된 항-DNPH 또는 항-액틴 항체로 염색된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 24는 지시된 농도의 IU1로 48시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 25의 A는 지시된 농도의 IU1로 6시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 25의 B는 지시된 농도의 IU1로 12시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 25의 C는 지시된 농도의 IU1로 24시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 26의 A는 지시된 농도의 IU1로 6시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 293 및 HeLa 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 26의 B는 지시된 농도의 IU1로 12시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 293 및 HeLa 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 26의 C는 지시된 농도의 IU1로 24시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 293 및 HeLa 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 27의 A는 100 μΜ의 IU1 또는 대조군으로 6시간 동안 처리된 TUNEL 염색된 MEF 세포의 형광 현미경 이미지를 도시하고 있다.
도 27의 B는 도 31o의 A에 묘사된 TUNEL 염색 분석의 정량화를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 28은 지시된 농도의 비히클 또는 IU1로 지시된 기간 동안 처리된 MEF 세포의 컨플루언시(confluency) 퍼센트를 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 29는 본 발명의 화합물에 대한 한 가지 접근법을 묘사한다.
도 30은 세포 생존력에 대한 MTT 검정; 특히, 산화 스트레스시에 세포 생존에 대한 IU1 효과를 도시하는 그래프를 묘사하고 있다. 실험을 HEK293 세포에서 메나디온 (용량-의존성, 4hr) 및 IU1 (50 uM, 6 hr)로 수행하였다. MEF 세포 역시 이러한 효과를 나타낸다. 메나디온의 경우 IC50에 대한 효과는 거의 4배이다.
도 31a 내지 도 31n은 일부 억제 퍼센트 및 IC50 값을 포함하는 본 발명의 선택된 화합물의 표를 묘사하고 있다. 억제 퍼센트는 IU1-1에서 IU-46까지는 8 μΜ에서, IU1-47에서 IU1-96까지는 4 μΜ에서, 그리고 C'1에서 C'9까지는 17 μΜ에서 측정되었다.
도 31o의 A는 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 tau, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, tau 및 LacZ를 공동-발현시키는 Usp14 -/-MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 31o의 B는 75 μΜ의 IUl로 지시된 시간 동안 처리되고 TDP-43플래그, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, TDP43플래그 및 LacZ를 공동-발현시키는 Usp14 -/-MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 32는 50 μΜ의 IU1과 함께 6시간 동안 인큐베이션되고 tau, cODC-EGFP 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, tau 및 Ub-독립적 프로테아좀 기질 cODC-EGFP를 공동-발현시키는 야생형 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 프로테아좀 억제제 (30 μΜ MG132, 10 μΜ PS-341)를 용해시키기 4시간 전에 첨가하였다.
도 33은 50 μΜ의 IU1과 함께 6시간 동안 인큐베이션되고 플래그-TDP-43, HA-Ub, 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, HA-태깅된 Ub 및/또는 플래그-태깅된 TDP-43을 공동-발현시키는 야생형 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 프로테아좀 억제제 (20 μΜ MG132, 10 μΜ PS-341)를 용해시키기 4시간 전에 첨가하였다. 화살표는 아마도 유비퀴틴화된 TDP-43 종들을 나타낸다. HC, 항체의 중쇄.
도 34의 A는 IU1 (0, 25, 50, 75, 또는 100 μΜ)로 6시간 동안 처리되고 Ub, 액틴, CP 서브유닛 α7, 또는 RP 서브유닛 mRPT5에 특이적인 항체로 염색된 야생형 또는 Usp14 -/- MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 34의 B는 도 34의 A에서의 유비퀴틴 수준의 정량화를 도시하고 있다. 야생형 및 Usp14 -/- MEF 세포로부터의 폴리유비퀴틴 및 모노유비퀴틴 수준을 다양한 농도의 IU1로 처리한 후에 정량하였다. Ub 신호를 내인성 액틴에 대해 표준화시켰다. 밀도계의 필름 이미지에 의해 정량을 달성하였다 (왼쪽 막대 = 폴리 UB (+/+ MEF); 왼쪽에서 두 번째 막대 = 폴리 Ub (Usp14 -/- MEF); 세 번째 막대 = 모노 Ub (+/+ MEF); 오른쪽 막대 = 모노 Ub (Usp14 -/- MEF)).
도 35의 A는 독립적으로 관찰된 Ub-AMC 농도인 USP14에 대한 IU1의 특이성을 도시하고 있다. Ub-AMC 가수분해의 검정을 도 11의 B에서와 같이 수행하였는데, 더 낮은 Ub-AMC 농도를 이용한 것이 달랐다 (왼쪽 막대 = 0 μΜ; 오른쪽 막대 = 17 μΜ).
도 35의 B는 이러한 연구에서 탈유비퀴틴화 효소의 Ub-AMC에 대한 KM 값의 개요를 도시하고 있다. 선택성 검정에 이용된 DUB의 KM 값들을 문헌으로부터 수득하였다. 지시된 대로 알려지지 않은 KM 값을 이러한 연구에서 결정하였다. 기질이 해당 효소의 KM에 비해 낮은 농도에 있을 때 DUB 검정이 억제에 가장 민감할 것이므로 이러한 값들이 유의하였다. CD, 촉매적 도메인.
도 36은 IU1이 검출가능한 유도기(lag period) 없이 프로테아좀-관련 USP14 활성을 억제함을 도시하고 있다. 2.5 nM의 인간 프로테아좀을 30 nM의 재조합 USP14 단백질과 혼합시켰다. 그 후, 1 μΜ의 Ub-AMC를 첨가함에 의해 반응을 개시하였다. 30분 후, IU1 (100 μΜ) 또는 비히클 (DMSO)을 샘플에 첨가하였다.
도 37은 도 13을 확인시켜 주는데, 연장된 인큐베이션 (5 및 8시간)이 시험되었다는 것이 다르다. USP14 활성 퍼센트를 26S 펩티다제 활성으로 표준화시켰다 (즉, LLVY-AMC 가수분해). IU1을 100 μΜ로 첨가시켰다 (왼쪽 막대 = DMSO; 오른쪽 막대 = IU1).
도 38은 ADP의 존재하에 정제된 인간 프로테아좀으로 수행되고 (ADP prep) ADP의 존재하에 검정된 시험관내 사슬 트리밍(trimming) 검정을 도시하고 있다. 인간 사이클린 B (CCNB)에 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯을 수행하였다. IU1은 Ub-AMC 가수분해 데이터로부터 예상된 대로, 약 5 μΜ에서 사슬 트리밍의 억제에 효과적이다.
도 39는 IU1이 USP14-CA의 존재하에 사이클린 B 분해에 영향을 주지 않음을 도시하고 있다. 검정은 도 5에서와 같이 수행되었다.
도 40의 A는 IU1의 1H-NMR 분광 데이터를 도시하고 있다.
도 40의 B는 IU1의 LC/MS 분석을 도시하고 있다. TIC, 총 이온 수. SPC, 지시된 체류 시간을 갖는 피크로부터 추출된 공유된 피크 수.
도 41의 A는 IU1C의 1H-NMR 분광 데이터를 도시하고 있다.
도 41의 B는 IU1C의 LC/MS 분석을 도시하고 있다. TIC, 총 이온 수. SPC, 지시된 체류 시간을 갖는 피크로부터 추출된 공유된 피크 수.
도 42의 A는 야생형 MEF 세포로부터의 내재화 IU1의 신속한 방출을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 야생형 MEF를 50 μΜ의 IU1과 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 배양 배지를 IU1이 없는 새로운 배지로 교체하였다. 내재화 IU1을 지시된 시간에 모니터링하고 그 농도를 UV 흡수 검정에 의해 검출된 세포 수에 의해 표준화시켰다.
도 42의 B는 HEK293 세포의 혈청-함유 배지에서 1시간 내지 48시간으로부터의 IU1의 비교상 농도를 도시하고 있다.
도 42의 C는 Usp14 -/- MEF 세포의 혈청-함유 배지에서 1시간 내지 48시간으로부터의 IU1의 비교상 농도를 도시하고 있다.
도 43의 A는 야생형 MEF에서 IU1 처리 후에 tau 수준의 정량적 분석을 도시하고 있다. 오딧세이 이미징 시스템을 이용하여 적외선 염료-컨쥬게이션된 이차 항체로 정량을 수행하였다. Tau 신호 세기를 내인성 액틴에 대해 표준화하였고 상대적인 양을 도시한다.
도 43의 B는 Usp14 -/- MEF에서 IU1 처리 후에 tau 수준의 정량적 분석을 도시하고 있다. 정량은 도 43의 A에서와 같이 수행되었다.
도 44의 A는 일시적으로 발현된 mCherry-NBR1의 면역형광 신호 (상부 열)가 야생형 MEF에서 자가용해소체 형성 억제제인 200 μΜ의 바필로마이신 A1 (BafA1)로 6시간 동안 처리 후에 현저하게 증가되었음을 도시하고 있다.
도 44의 B는 IU1에 의한 tau 분해의 자극이 자가포식에 의해 매개되지 않음을 도시하고 있다. 야생형 MEF 세포를 tau를 발현시키는 플라스미드로 트랜스펙션시킨 후에 200 μΜ의 BafA1 및/또는 75 μΜ의 IU1로 6시간 동안 처리하고, SDS-PAGE/면역블롯에 의해 오딧세이 적외선 이미징 시스템을 이용하여 분석하였다.
도 44의 C는 오딧세이 소프트웨어를 이용하여 도 44의 B에서 수행된 대로 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준화된 tau 단백질 수준의 정량화를 도시하고 있다 (평균 ± SD).
도 45a의 A는 IU1 처리가 프로테아좀의 통합성에 영향을 미치지 않음을 도시하고 있다. 처리 전과 6-hr IU1 처리 (100 μΜ) 후에 총 세포 추출물 (50 μg/레인)을 천연 PAGE에 의해 분해시키고, 형광원성 펩티드 기질 (LLVY-AMC)로의 겔중 활성 염색, 또는 서브유닛 α6에 특이적인 항체로의 면역블롯팅을 이용하여 프로테아좀을 가시화시켰다. RP2-CP 및 RP-CP는 26S 프로테아좀의 다른 형태를 나타낸다.
도 45a의 B는 IU1 처리가 프로테아좀 서브유닛인 Psmb5 유전자의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 뮤린 Psmb5 프로모터를 함유하는 루시페라제 리포터 유전자 (-1 kb 내지 0 kb)를 야생형 및 Usp14 -/- MEF에서 일시적으로 발현시키고, 프로모터 활성을, 25 또는 50 μΜ의 IU1를 8시간 동안 인큐베이션한 후에, 평가하였다. 루시페라제 활성의 표준화를 위해, 프로모터-없는 pGL3 플라스미드를 이용하여 대조 실험을 수행하였다. 값들은 3회의 독립적인 실험의 평균 ± SD였다. RLU, 상대적 광 유닛.
도 45b의 C는 IU1 처리가 유비퀴틴 유전자인 UbB의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 단계적 용량의 IU1과 6시간 동안 인큐베이션 후에 +/+ (왼쪽 패널) 및 Usp14 -/- MEF (오른쪽)로부터의 총 mRNA를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
도 45b의 D는 IU1 처리가 프로테아좀 서브유닛인 α6의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 단계적 용량의 IU1과 6시간 동안 인큐베이션 후에 +/+ (왼쪽 패널) 및 Usp14 -/- MEF (오른쪽)로부터의 총 mRNA를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
도 45b의 E는 IU1 처리가 프로테아좀 서브유닛인 α7의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 단계적 용량의 IU1과 6시간 동안 인큐베이션 후에 +/+ (왼쪽 패널) 및 Usp14 -/- MEF (오른쪽)로부터의 총 mRNA를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
도 46의 A는 세포 생존력에 대한 MTT 검정; 특히, 산화 스트레스시에 세포 생존에 대한 IU1C 효과를 도시하는 그래프를 묘사하고 있다. 실험을 HEK293 세포에서 메나디온 (용량-의존성, 4hr) 및 IU1C (50 uM, 6 hr)로 수행하였다.
도 46의 B는 야생형 MEF 세포에서의 내재화 IU1C 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 50 uM의 IU1C의 지시된 시간-경과 처리 후에, IU1C 수준을 LC/MS에 의해 측정하였다. 도시된 농도는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 세포 수에 의해 표준화되었다.
도 46의 C는 293 세포에서의 내재화 IU1C 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 50 uM의 IU1C의 지시된 시간-경과 처리 후에, IU1C 수준을 LC/MS에 의해 측정하였다. 도시된 농도는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 세포 수에 의해 표준화되었다.
도 46의 D는 야생형 MEF 세포로부터의 내재화 IU1C의 신속한 방출을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 실험은 도 42의 A에서와 같이 수행되었다.
도 46의 E는 293 세포로부터의 내재화 IU1C의 신속한 방출을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 실험은 도 42의 A에서와 같이 수행되었다.
도 47은 더욱 효능 있는 IU1 유도체인 0, 20, 40, 60 또는 80 μΜ의 IU1-47로 처리되고 Tau에 특이적인 항체로 염색된, Tau를 일시적으로 발현시키는 야생형 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 1의 B는 Ub-VS로 처리되지 않거나(-VS) 처리된(+VS) Usp14-결핍 정제된 인간 프로테아좀(26S) 및 항-Uch37 항체를 사용하여 수행한 면역블롯을 도시하고 있다. Uch37에 대응하는 밴드가 표시되어 있다. 비특이적 밴드는 별표로 표시된다.
도 2의 A는 시중 구입 가능한 인간 프로테아좀(Biomol), 비처리되고 정제된 Usp14 결핍 인간 프로테아좀(-Ub-VS) 또는 Ub-VS 처리되고 정제된 Usp14 결핍 인간 프로테아좀(+Ub-VS)을 사용하여 수행하는 겔중(in-gel) suc-LLVY-AMC 염색(프로테아좀의 존재를 표시함)을 수행한 비변성 겔 분석(nondenaturing gel analysis)을 도시하고 있다.
도 2의 B는 GST tag가 있거나 없는 정제된 재조합 야생형 Usp14 (Usp14-wt) 또는 촉매적 불활성 돌연변이 Usp14 (Usp14-C114A)의 Coomassie Brilliant Blue (CBB) 염색을 GST 대조군(GST) 및 단백질 크기 마커(마커)와 함께 도시하고 있다.
도 2의 C는 겔중 suc-LLVY-AMC 염색(상부, 프로테아좀의 존재를 보이기 위해서) 또는 Coomassie Brilliant Blue(CBB) 염색으로 염색된 프로테아좀 단독(-), GST와 프로테아좀(GST), GST 태깅된 야생형 Usp14와 프로테아좀(GST-Usp14-wt), GST 태깅된 촉매적 불활성 돌연변이 Usp14와 프로테아좀(GST-Usp14-C114A), 비태깅된 야생형 Usp14와 프로테아좀(Usp14-wt) 또는 비태깅된 촉매적 불활성 둘연변이 Usp14와 프로테아좀(Usp14-C114A)의 결과를 도시하고 있다.
도 3은 Ub-VS 처리된 인간 프로테아좀의 존재하에 Usp14 활성에 대한 Ub-AMC 가수분해 검정의 결과를 도시하고 있다.
도 4의 A는 1 μΜ Ub-AMC, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Usp14에서의 Usp14 및 프로테아좀에 의한 Ub-AMC 가수분해의 초기 속도에 대한 선형 운동역학(linear kinetics)(R2 > 0.99)의 플롯을 도시하고 있다.
도 4의 B는 1 μΜ Ub-AMC, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Usp14에서 인간 프로테아좀의 존재하에 15분 동안의 Usp14-의존성 Ub-AMC 가수분해의 미카엘리스-멘텐 플롯(Michaelis-Menten plot)을 도시하고 있다.
도 4의 C는 4 nM Usp14, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Ub-AMC에서의 Usp14 및 프로테아좀에 의한 Ub-AMC 가수분해의 초기 속도에 대한 선형 운동역학(R2 > 0.99)의 플롯을 도시하고 있다.
도 4의 D는 4 nM Usp14, 1 nM 프로테아좀, 및 표시된 농도의 Ub-AMC에서 Usp14 및 인간 프로테아좀의 존재하에 30분 동안의 농도-의존성 Ub-AMC 가수분해의 미카엘리스-멘텐 플롯을 도시하고 있다.
도 5는 사이클린 B에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있으며, 이는 또한 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClbB)를 검출하고 있다. 이러한 구체예에서, Ubn-ClbB는 26S 인간 프로테아좀 단독, 인간 프로테아좀과 야생형 Usp14(Usp14-wt) 또는 인간 프로테아좀과 촉매적 불활성 Usp14(Usp14-CA)로 처리되고, 후속하여 면역블로팅(immunoblotting)에 의해서 분석된다.
도 6의 A는 유비퀴틴-유사 도메인(UBL), 촉매 도매인(catalytic domain)(CAT), 및 엑손 4의 위치 및 Cys114의 위치를 묘사하는 인간 Usp14의 다이아그램을 도시하고 있다.
도 6의 B는 야생형 Usp14 (Usp14-wt), 촉매적 불활성 Usp14(Usp14-CA), 간단한 형태의 Usp14 (Usp14-SF) 또는 UBL 도메인 결핍 Usp14(Usp14-AUBL)와 함께 Tau를 공동-발현하며 표시된 바와 같이 Tau, Usp14 또는 액틴(Actin)에 특이적인 항체를 사용하여 염색된 인간 293 세포로부터의 세포 용해물에 대해서 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 7은 프로테아좀 친화성 정제 전(추출물) 또는 그 후(정제된 프로테아좀)의 태깅된 hRpn11과 함께 플래그-태깅된 Usp14(flag-tagged Usp14)의 표시된 형태를 공동-발현하며 항-플래그 항체를 사용하여 염색된 293 세포로부터의 세포 용해물에 대해서 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 표시된 경우에, Ub-VS는 프로테아좀 정제 전에 용해물과 함께 인큐베이션되었다. 추출물 샘플은 전체 5%를 나타낸다. 별표, 비특이적 신호. 프로테아좀 서브단위 Rpn13, 로드 컨트롤(load control). 대조 샘플, 빈 벡터(empty vector).
도 8의 A는 Usp14 촉매 억제제의 억제제를 위한 고출력 대규모 화합물 스크리닝의 통계적 플롯을 도시하고 있다.
도 8의 B는 AMC 켄칭 화합물을 측정하기 위해서 사용된 주파수 분포 곡선을 도시하고 있다(대조군=바닥부분 곡선).
도 9의 A는 Usp14 억제제 IU1의 화학적 구조를 도시하고 있다.
도 9의 B는 IU1에 의한 Usp14 로딩된 프로테아좀 (Usp14-Ptsm) 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제(왼쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 왼쪽에서 두 번째 막대 = 4 μΜ, 세 번째 막대 =8 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ) 및 IU1에 의한 AMC 형광의 켄칭의 결여(오른쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ)를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 9의 C는 IU1에 의한 Usp14 로딩된 프로테아좀 (Usp14-Ptsm) 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제(왼쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 중앙 막대 = 8 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ) 및 IU1에 의한 이소펩티다아제 T(Isopeptidase T: IsoT)의 억제의 결여(오른쪽)(왼쪽 막대 = 0 μΜ, 중앙 막대 = 8 μΜ, 오른쪽 막대 = 17 μΜ)를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 9의 D는 비히클(DMSO), IU1 또는 IU1C에 의해서 프로테아좀에 복합되지 않은 Usp14의 억제의 결여를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 9의 E는 비히클(DMSO) 또는 IU1에 의해서 Ub-VS로 처리되니 않은 26S 인간 프로테아좀(Ptsm)(즉, Usp14가 결여된 프로테아좀)의 억제의 결여를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 10의 A는 IU1C, 즉, IU1을 위한 불활성 대조군 화합물의 화학적 구조를 도시하고 있다.
도 10의 B는 IU1의 탈유비퀴틴화효소 억제 활성(아랫부분의 원, 아랫부분의 삼각형)을 IU1C의 탈유비퀴틴화효소 억제 활성(윗부분의 원, 윗부분의 삼각형, 사각형)과 비교하는 플롯을 도시하고 있다.
도 10의 C는 Tau 분해를 촉진하는데 있어서의 IU1C의 무력함을 도시하고 있다. 면역블롯은 Tau와 Usp14를 동시-발현하며 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ IU1C로 처리되고 Tau 또는 액틴(Actin)에 특이적인 항체로 염색된 MEF 세포의 용해물을 사용하여 수행하였다.
도 10의 D는 IU1C에 의한 표시된 탈유비퀴틴화효소의 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다(외쪽 막대들 = 0 μΜ, 오른쪽 막대들 = 17 μΜ).
도 11의 A는 표시된 농도의 IU1으로 처리된 프로테아좀 결합된 Usp14, IsoT 또는 Uch37의 탈유비퀴틴화효소 활성을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 11의 B는 IU1에 의한 표시된 탈유비퀴틴화효소의 탈유비퀴틴화효소 활성의 억제를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다(왼쪽 막대들 = 0 μΜ, 오른쪽 막대들 = 17 μΜ).
도 12의 A는 Usp14 (80 nM) 없이 또는 그와 함께 인큐베이션되고 표시된 농도의 비히클(DMSO), IU1C 또는 IU1로 처리되고 Usp14 또는 Alpha7로 염색된 정제된 26S 인간 프로테아좀 (~4 nM)의 면역블롯을 도시하고 있다. 별표(*)는 항-Usp14 항체에 의해서 생성된 비특이적 신호를 나타낸다.
도 12의 B는 약 2배 몰 과량의 Usp14가 표시된 화합물(30 μΜ)의 부재 또는 존재하에 프로테아좀과 인큐베이션됨을 제외하고는 도 12의 A에서와 같은 면역블롯을 도시하고 있다.
도 13은 비히클(대조군) 또는 IU1으로 처리되고 표시된 라운드 수의 초여과(스핀, 왼쪽 패널; 스핀 무= 왼쪽 막대, 1 x 스핀 = 중앙 막대, 3 x 스핀 = 오른쪽 막대) 또는 스핀-컬럼 겔 여과(오른쪽 패널; 대조군 = 왼쪽 막대, IU1 = 오른쪽 막대)에 주어진 프로테아좀 결합된 Usp14의 탈유비퀴틴화 활성을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 14의 A는 45분 동안 표시된 농도의 IU1로 처리된 프로테아좀 결합된 Usp14의 IC50 곡선을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 14의 B는 30분 동안 표시된 농도의 IU1으로 처리된 프로테아좀 결합된 Usp14의 IC50 곡선을 묘사하는 플롯를 도시하고 있다.
도 15는 4 nM의 26S 인간 프로테아좀 단독으로 처리되거나, 표시된 바와 같이 야생형 Usp14 (Usp14-wt), IU1, 및/또는 프로테아좀 억제제와 함께 처리된 사이클린 B 및 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClbB)에 대해 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 면역블롯은 장기노출(Long exp) 또는 단기노출(Short exp)에 주어진다.
도 16의 A는 4 nM의 26S 인간 프로테아좀 단독으로 처리되거나, 비히클 또는 IU1 (34 μΜ)에 더하여 야생형 Usp14 (60 nM)과 함께 처리된 사이클린 B 및 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClbB)에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 16의 B는 5 nM의 26S 인간 프로테아좀 단독으로 처리되거나, 비히클 또는 IU1 (75 μΜ)에 더하여 야생형 Usp14 (75 nM)과 함께 처리된 T7-태깅된 SiclPY 및 폴리유비퀴틴화된 SiclPY (Ubn-SiclPY)에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 17은 IU1로 처리되지 않았거나 (IU1 없음) IU1로 1시간 또는 24시간 동안 처리된 MEF 세포로부터의 용해물의 액체 크로마토그래피/질량 스펙트로메트리 (LC/MS) 기록의 이온 수를 묘사하는 플롯을 도시하고 있다. 하부 패널은 1 μg/mL의 IU1 표준 용액에 대한 이온 수를 묘사한다.
도 18은 다양한 농도의 lUl 표준의 LC/MS 기록의 이온 수를 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 19는 255 nm 및 305 nm에서 최대 흡수를 나타내는 IU1의 UV 스펙트럼 (왼쪽)과 300 nm에서 이어지는, 세포로의 IU1 내재화의 시간-의존성을 도시하는 HPLC 크로마토그램 (오른쪽)을 도시하고 있다.
도 20의 A는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 바와 같은 세포 수에 의한 표준화 후 MEF 세포에서 IU1 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 20의 B는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 바와 같은 세포 수에 의한 표준화 후 293 세포에서 IU1 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 21의 A는 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 Tau, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, Tau 및 Usp14를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 21의 B는 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ의 IU1로 처리된, Tau 및 Usp14를 공동-발현시키는 MEF 세포에서 Tau RNA 수준의 정량적 RT-PCR 분석 결과를 도시하고 있다.
도 22의 A는 75 μΜ의 IUl으로 지시된 시간 동안 처리되고 TDP43플래그, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, TDP43플래그 및 Usp14를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 22의 B는 0, 50 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 Atx3 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, Usp14에 더하여 Atx3-Q80 또는 Atx3-Q22를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 22의 C는 0, 25, 50 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 GFAP 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, Usp14에 더하여 야생형 GFAP (GFAP-wt), K63Q 돌연변이 GFAP (GFAP-K63Q) 또는 E210K GFAP (GFAP-E210K)를 공동-발현시키는 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 22의 D는 75 μΜ의 IU1로 각각의 지시된 시간 동안 처리된, TDP-43 및 Usp-14를 공동-발현시키는 MEF 세포에서 TDP-43 RNA 수준의 정량적 RT-PCR 분석 결과를 도시하고 있다.
도 23의 A는 지시된 대로, 비히클 또는 75 μΜ의 IU1와 함께 미리 인큐베이션되고 63 μΜ의 메나디온으로 처리된 MEF 세포의 DNPH-처리된 용해물 상에서 수행된 항-DNPH 또는 항-액틴 항체로 염색된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 23의 B는 IU1 (75 μΜ) 또는 프로테아좀 억제제 (20 μΜ MG132, 10 μΜ PS-341)와 함께 4 h 동안 미리 인큐베이션된 후에 메나디온 (300 μΜ)으로 60분간 처리된 HEK293 세포의 DNPH-처리된 용해물 상에서 수행된 항-DNPH 또는 항-액틴 항체로 염색된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 24는 지시된 농도의 IU1로 48시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 25의 A는 지시된 농도의 IU1로 6시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 25의 B는 지시된 농도의 IU1로 12시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 25의 C는 지시된 농도의 IU1로 24시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 MEF 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 26의 A는 지시된 농도의 IU1로 6시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 293 및 HeLa 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 26의 B는 지시된 농도의 IU1로 12시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 293 및 HeLa 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 26의 C는 지시된 농도의 IU1로 24시간 동안 처리시에 MTT 검정에 의해 평가된 293 및 HeLa 세포 생존력을 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 27의 A는 100 μΜ의 IU1 또는 대조군으로 6시간 동안 처리된 TUNEL 염색된 MEF 세포의 형광 현미경 이미지를 도시하고 있다.
도 27의 B는 도 31o의 A에 묘사된 TUNEL 염색 분석의 정량화를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다.
도 28은 지시된 농도의 비히클 또는 IU1로 지시된 기간 동안 처리된 MEF 세포의 컨플루언시(confluency) 퍼센트를 묘사하는 플롯을 도시하고 있다.
도 29는 본 발명의 화합물에 대한 한 가지 접근법을 묘사한다.
도 30은 세포 생존력에 대한 MTT 검정; 특히, 산화 스트레스시에 세포 생존에 대한 IU1 효과를 도시하는 그래프를 묘사하고 있다. 실험을 HEK293 세포에서 메나디온 (용량-의존성, 4hr) 및 IU1 (50 uM, 6 hr)로 수행하였다. MEF 세포 역시 이러한 효과를 나타낸다. 메나디온의 경우 IC50에 대한 효과는 거의 4배이다.
도 31a 내지 도 31n은 일부 억제 퍼센트 및 IC50 값을 포함하는 본 발명의 선택된 화합물의 표를 묘사하고 있다. 억제 퍼센트는 IU1-1에서 IU-46까지는 8 μΜ에서, IU1-47에서 IU1-96까지는 4 μΜ에서, 그리고 C'1에서 C'9까지는 17 μΜ에서 측정되었다.
도 31o의 A는 0, 25, 50, 75 또는 100 μΜ의 IU1로 처리되고 tau, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, tau 및 LacZ를 공동-발현시키는 Usp14 -/-MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 31o의 B는 75 μΜ의 IUl로 지시된 시간 동안 처리되고 TDP-43플래그, LacZ 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, TDP43플래그 및 LacZ를 공동-발현시키는 Usp14 -/-MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 32는 50 μΜ의 IU1과 함께 6시간 동안 인큐베이션되고 tau, cODC-EGFP 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, tau 및 Ub-독립적 프로테아좀 기질 cODC-EGFP를 공동-발현시키는 야생형 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 프로테아좀 억제제 (30 μΜ MG132, 10 μΜ PS-341)를 용해시키기 4시간 전에 첨가하였다.
도 33은 50 μΜ의 IU1과 함께 6시간 동안 인큐베이션되고 플래그-TDP-43, HA-Ub, 또는 액틴에 특이적인 항체로 염색된, HA-태깅된 Ub 및/또는 플래그-태깅된 TDP-43을 공동-발현시키는 야생형 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다. 프로테아좀 억제제 (20 μΜ MG132, 10 μΜ PS-341)를 용해시키기 4시간 전에 첨가하였다. 화살표는 아마도 유비퀴틴화된 TDP-43 종들을 나타낸다. HC, 항체의 중쇄.
도 34의 A는 IU1 (0, 25, 50, 75, 또는 100 μΜ)로 6시간 동안 처리되고 Ub, 액틴, CP 서브유닛 α7, 또는 RP 서브유닛 mRPT5에 특이적인 항체로 염색된 야생형 또는 Usp14 -/- MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
도 34의 B는 도 34의 A에서의 유비퀴틴 수준의 정량화를 도시하고 있다. 야생형 및 Usp14 -/- MEF 세포로부터의 폴리유비퀴틴 및 모노유비퀴틴 수준을 다양한 농도의 IU1로 처리한 후에 정량하였다. Ub 신호를 내인성 액틴에 대해 표준화시켰다. 밀도계의 필름 이미지에 의해 정량을 달성하였다 (왼쪽 막대 = 폴리 UB (+/+ MEF); 왼쪽에서 두 번째 막대 = 폴리 Ub (Usp14 -/- MEF); 세 번째 막대 = 모노 Ub (+/+ MEF); 오른쪽 막대 = 모노 Ub (Usp14 -/- MEF)).
도 35의 A는 독립적으로 관찰된 Ub-AMC 농도인 USP14에 대한 IU1의 특이성을 도시하고 있다. Ub-AMC 가수분해의 검정을 도 11의 B에서와 같이 수행하였는데, 더 낮은 Ub-AMC 농도를 이용한 것이 달랐다 (왼쪽 막대 = 0 μΜ; 오른쪽 막대 = 17 μΜ).
도 35의 B는 이러한 연구에서 탈유비퀴틴화 효소의 Ub-AMC에 대한 KM 값의 개요를 도시하고 있다. 선택성 검정에 이용된 DUB의 KM 값들을 문헌으로부터 수득하였다. 지시된 대로 알려지지 않은 KM 값을 이러한 연구에서 결정하였다. 기질이 해당 효소의 KM에 비해 낮은 농도에 있을 때 DUB 검정이 억제에 가장 민감할 것이므로 이러한 값들이 유의하였다. CD, 촉매적 도메인.
도 36은 IU1이 검출가능한 유도기(lag period) 없이 프로테아좀-관련 USP14 활성을 억제함을 도시하고 있다. 2.5 nM의 인간 프로테아좀을 30 nM의 재조합 USP14 단백질과 혼합시켰다. 그 후, 1 μΜ의 Ub-AMC를 첨가함에 의해 반응을 개시하였다. 30분 후, IU1 (100 μΜ) 또는 비히클 (DMSO)을 샘플에 첨가하였다.
도 37은 도 13을 확인시켜 주는데, 연장된 인큐베이션 (5 및 8시간)이 시험되었다는 것이 다르다. USP14 활성 퍼센트를 26S 펩티다제 활성으로 표준화시켰다 (즉, LLVY-AMC 가수분해). IU1을 100 μΜ로 첨가시켰다 (왼쪽 막대 = DMSO; 오른쪽 막대 = IU1).
도 38은 ADP의 존재하에 정제된 인간 프로테아좀으로 수행되고 (ADP prep) ADP의 존재하에 검정된 시험관내 사슬 트리밍(trimming) 검정을 도시하고 있다. 인간 사이클린 B (CCNB)에 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯을 수행하였다. IU1은 Ub-AMC 가수분해 데이터로부터 예상된 대로, 약 5 μΜ에서 사슬 트리밍의 억제에 효과적이다.
도 39는 IU1이 USP14-CA의 존재하에 사이클린 B 분해에 영향을 주지 않음을 도시하고 있다. 검정은 도 5에서와 같이 수행되었다.
도 40의 A는 IU1의 1H-NMR 분광 데이터를 도시하고 있다.
도 40의 B는 IU1의 LC/MS 분석을 도시하고 있다. TIC, 총 이온 수. SPC, 지시된 체류 시간을 갖는 피크로부터 추출된 공유된 피크 수.
도 41의 A는 IU1C의 1H-NMR 분광 데이터를 도시하고 있다.
도 41의 B는 IU1C의 LC/MS 분석을 도시하고 있다. TIC, 총 이온 수. SPC, 지시된 체류 시간을 갖는 피크로부터 추출된 공유된 피크 수.
도 42의 A는 야생형 MEF 세포로부터의 내재화 IU1의 신속한 방출을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 야생형 MEF를 50 μΜ의 IU1과 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 배양 배지를 IU1이 없는 새로운 배지로 교체하였다. 내재화 IU1을 지시된 시간에 모니터링하고 그 농도를 UV 흡수 검정에 의해 검출된 세포 수에 의해 표준화시켰다.
도 42의 B는 HEK293 세포의 혈청-함유 배지에서 1시간 내지 48시간으로부터의 IU1의 비교상 농도를 도시하고 있다.
도 42의 C는 Usp14 -/- MEF 세포의 혈청-함유 배지에서 1시간 내지 48시간으로부터의 IU1의 비교상 농도를 도시하고 있다.
도 43의 A는 야생형 MEF에서 IU1 처리 후에 tau 수준의 정량적 분석을 도시하고 있다. 오딧세이 이미징 시스템을 이용하여 적외선 염료-컨쥬게이션된 이차 항체로 정량을 수행하였다. Tau 신호 세기를 내인성 액틴에 대해 표준화하였고 상대적인 양을 도시한다.
도 43의 B는 Usp14 -/- MEF에서 IU1 처리 후에 tau 수준의 정량적 분석을 도시하고 있다. 정량은 도 43의 A에서와 같이 수행되었다.
도 44의 A는 일시적으로 발현된 mCherry-NBR1의 면역형광 신호 (상부 열)가 야생형 MEF에서 자가용해소체 형성 억제제인 200 μΜ의 바필로마이신 A1 (BafA1)로 6시간 동안 처리 후에 현저하게 증가되었음을 도시하고 있다.
도 44의 B는 IU1에 의한 tau 분해의 자극이 자가포식에 의해 매개되지 않음을 도시하고 있다. 야생형 MEF 세포를 tau를 발현시키는 플라스미드로 트랜스펙션시킨 후에 200 μΜ의 BafA1 및/또는 75 μΜ의 IU1로 6시간 동안 처리하고, SDS-PAGE/면역블롯에 의해 오딧세이 적외선 이미징 시스템을 이용하여 분석하였다.
도 44의 C는 오딧세이 소프트웨어를 이용하여 도 44의 B에서 수행된 대로 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준화된 tau 단백질 수준의 정량화를 도시하고 있다 (평균 ± SD).
도 45a의 A는 IU1 처리가 프로테아좀의 통합성에 영향을 미치지 않음을 도시하고 있다. 처리 전과 6-hr IU1 처리 (100 μΜ) 후에 총 세포 추출물 (50 μg/레인)을 천연 PAGE에 의해 분해시키고, 형광원성 펩티드 기질 (LLVY-AMC)로의 겔중 활성 염색, 또는 서브유닛 α6에 특이적인 항체로의 면역블롯팅을 이용하여 프로테아좀을 가시화시켰다. RP2-CP 및 RP-CP는 26S 프로테아좀의 다른 형태를 나타낸다.
도 45a의 B는 IU1 처리가 프로테아좀 서브유닛인 Psmb5 유전자의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 뮤린 Psmb5 프로모터를 함유하는 루시페라제 리포터 유전자 (-1 kb 내지 0 kb)를 야생형 및 Usp14 -/- MEF에서 일시적으로 발현시키고, 프로모터 활성을, 25 또는 50 μΜ의 IU1를 8시간 동안 인큐베이션한 후에, 평가하였다. 루시페라제 활성의 표준화를 위해, 프로모터-없는 pGL3 플라스미드를 이용하여 대조 실험을 수행하였다. 값들은 3회의 독립적인 실험의 평균 ± SD였다. RLU, 상대적 광 유닛.
도 45b의 C는 IU1 처리가 유비퀴틴 유전자인 UbB의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 단계적 용량의 IU1과 6시간 동안 인큐베이션 후에 +/+ (왼쪽 패널) 및 Usp14 -/- MEF (오른쪽)로부터의 총 mRNA를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
도 45b의 D는 IU1 처리가 프로테아좀 서브유닛인 α6의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 단계적 용량의 IU1과 6시간 동안 인큐베이션 후에 +/+ (왼쪽 패널) 및 Usp14 -/- MEF (오른쪽)로부터의 총 mRNA를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
도 45b의 E는 IU1 처리가 프로테아좀 서브유닛인 α7의 전사를 유도하지 않음을 도시하고 있다. 단계적 용량의 IU1과 6시간 동안 인큐베이션 후에 +/+ (왼쪽 패널) 및 Usp14 -/- MEF (오른쪽)로부터의 총 mRNA를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.
도 46의 A는 세포 생존력에 대한 MTT 검정; 특히, 산화 스트레스시에 세포 생존에 대한 IU1C 효과를 도시하는 그래프를 묘사하고 있다. 실험을 HEK293 세포에서 메나디온 (용량-의존성, 4hr) 및 IU1C (50 uM, 6 hr)로 수행하였다.
도 46의 B는 야생형 MEF 세포에서의 내재화 IU1C 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 50 uM의 IU1C의 지시된 시간-경과 처리 후에, IU1C 수준을 LC/MS에 의해 측정하였다. 도시된 농도는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 세포 수에 의해 표준화되었다.
도 46의 C는 293 세포에서의 내재화 IU1C 농도를 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 50 uM의 IU1C의 지시된 시간-경과 처리 후에, IU1C 수준을 LC/MS에 의해 측정하였다. 도시된 농도는 UV 흡수 검정에 의해 검출된 세포 수에 의해 표준화되었다.
도 46의 D는 야생형 MEF 세포로부터의 내재화 IU1C의 신속한 방출을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 실험은 도 42의 A에서와 같이 수행되었다.
도 46의 E는 293 세포로부터의 내재화 IU1C의 신속한 방출을 묘사하는 그래프를 도시하고 있다. 실험은 도 42의 A에서와 같이 수행되었다.
도 47은 더욱 효능 있는 IU1 유도체인 0, 20, 40, 60 또는 80 μΜ의 IU1-47로 처리되고 Tau에 특이적인 항체로 염색된, Tau를 일시적으로 발현시키는 야생형 MEF 세포의 용해물을 이용하여 수행된 면역블롯을 도시하고 있다.
상세한 설명
단백질병은 비정상 단백질 또는 미스폴딩된 단백질(misfolded protein)의 응집으로부터 유발되는 부류의 질환 및 장애이다. 종종 및 아마도 전형적으로, 그러한 단백질은 프로테아좀-매개된 분해를 통해서 세포로부터 제거된다. 그러나, 단백질병의 경우에, 프로테아좀이 유해한 단백질 모두를 제거하고 병원성 응집체의 형성을 방지하기에 효율적으로 충분하게 작용하지 않는다.
본원에서 입증된 바와 같이, 정상적인 성장 조건하에, 프로테아좀은 Usp14에 의해 기질-결합된 유비퀴틴 사슬의 트리밍에 의해 발생하는 지속성 억제(tonic inhibition)의 대상이다. 유비퀴틴 사슬 트리밍은 프로테아좀을 억제하는데, 그 이유는 이것이 프로테아좀에 의한 인지를 허용하는 신호 (유비퀴틴 사슬)를 프로테아좀 기질로부터 제거시켜서 프로테아좀-결합된 기질이 분해되지 않을 수 있기 때문이다. 결과적으로, Usp14에 의한 사슬 트리밍의 억제제는 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 촉진시킨다. 따라서, 이러한 억제 메커니즘의 결과로서, 포유동물 프로테아좀 경로가 Usp14에 의해 부분적으로 억제되므로 상기 경로는 원래처럼 전 효율로 동작하지 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물은 Usp14의 탈유비퀴틴화효소 활성을 억제함으로써 프로테아좀 활성을 향상시킨다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 이러한 향상된 프로테아좀 활성은 인간 질환과 연관된 단백질들을 포함한 비정상 또는 미스폴딩된 단백질을 제거하는 세포의 능력을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 프로테아좀 기능의 향상 및 단백질병의 치료에 유용하다.
정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있게 하기 위해서, 특정의 용머 및 문구가 이하 및 명세서 전체에 걸쳐서 정의되어 있다.
단수 표현은 본원에서 대상물의 하나 또는 하나 초과(즉, 하나 이상)를 나타내는 것이다. 예를 들어, "구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 초과의 구성요소를 의미한다.
본원 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 표현 "및/또는"은 그렇게 합쳐진 구성요소들 중 "하나 또는 둘 모두", 즉, 일부의 경우에 있어서 함께 존재하는 구성요소들 및 다른 경우에 있어서 분리하여 존재하는 구성요소들을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 다수의 구성요소들도 동일한 양상으로, 즉, 그렇게 합쳐진 구성요소들 중 "하나 또는 그 초과"를 나타내는 것으로 해석되어야 한다. "및/또는"에 의해서 특별히 인정되는 구성요소들과 관련이 있든지 관련이 없든지, 그러한 구성요소들이 아닌, 다른 구성요소들이 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 표현과 연관되어 사용되는 경우의 "A 및/또는 B"의 언급은, 한 가지 구체예로, A만(임의로, B가 아닌 구성요소를 포함함)을 나타낼 수 있거나; 다른 구체예로, B만(임의로, A가 아닌 구성요소를 포함함)을 나타낼 수 있거나; 또 다른 구체예로, A 및 B 둘 모두(임의로, 다른 구성요소를 포함함)를 나타낼 수 있다.
본원의 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 용어 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 지니는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 열거 목록에서 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라, 많은 구성요소 또는 일련의 구성요소 중 하나 초과 및 임의로, 추가의 열거되지 않은 항목들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 단지 하나 또는 ~ 중 정확히 하나"와 같이 달리 명확하게 명시된 단지(only) 표현들, 또는 특허청구범위에서 사용되는 경우의 "로 이루어진"은 많은 구성요소 또는 일련의 구성요소 중 정확히 하나의 구성요소를 포함함을 나타낼 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 용어 "또는"은, 배타성 용어들, 예컨대, "중 어느 하나", "중 하나", "중 단지 하나", 또는 "중 정확히 하나" 뒤에 오는 경우에, 배타적인 대체물들(즉, "둘 다가 아닌 하나 또는 다른 하나")을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 특허청구범위에서 사용되는 경우의 "으로 본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 그 통상의 의미를 지닐 것이다.
하나 이상의 구성요소들의 목록과 관련하여, 본원의 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 용어 "하나 이상"은 구성요소들의 목록 중에 있는 구성요소들 중 어느 하나 또는 그 초과로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 의미하며 구성요소들의 목록내에 특별히 열거된 각각의 구성요소 및 모든 구성요소 중 하나 이상을 반드시 포함하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 표현 "하나 이상의"가 인용하는 구성요소들의 목록 내에 특별히 인정된 구성요소들과 관련이 있든지 그러한 구성요소들과 관련이 없든지, 그러한 특별히 인정된 구성요소들이 아닌 구성요소들이 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중의 하나 이상"(또는 동등하게, "A 또는 B 중의 하나 이상", 또는 동등하게, "A 및/또는 B중의 하나 이상")은, 한 가지 구체예에서, B의 존재 없이, 임의로 하나 초과를 포함한 하나 이상의 A(및 임의로 B가 아닌 구성요소를 포함함)을 지칭하거나; 또 다른 구체예에서, A의 존재 없이, 임의로 하나 초과를 포함한 하나 이상의 B(및 임의로 A가 아닌 구성요소를 포함함)을 지칭하거나; 또 다른 구체예로, 임의로 하나 초과를 포함한 하나 이상의 A 및 임의로 하나 초과를 포함한 하나 이상의 B(및 임의로 다른 구성요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
하나 초과의 단계 또는 동작을 포함하는 본원에서 청구된 어떠한 방법에서, 달리 명백하게 표시되지 않는 한, 그러한 방법의 단계들 또는 동작들의 순서는 그러한 방법의 단계들 또는 동작들이 열거된 순서로 반드시 제한되지는 않는다는 것을 또한 이해해야 한다.
상기 명세서뿐만 아니라, 특허청구범위에서, 모든 이행구(transitional phrase), 예컨대, "포함한", "포함하는", "수행하는", "지니는", "함유하는", "갖는" 및 "구성되는" 등은 개방형인 것으로, 즉, 포함하지만 그로 제한되는 것이 아님을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 전이구 "로 이루어진" 및 "로 필수적으로 이루어진"만이 각각, United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03에 기재된 바와 같이, 폐쇄적(closed)이거나 반-폐쇄적(semi-closed)일 것이다.
임의의 구조에서 알킬, m, n 등과 같은 각각의 표현이 1회를 초과하여 정의될 때, 그 정의는 동일한 구조에 있는 다른 경우의 정의와 독립적이다.
"치환" 또는 "으로 치환"은 그러한 치환이 치환된 원자와 치환기의 허용되는 원자가에 따르고, 그러한 치환이 안정한 화합물, 예컨대, 재배열, 고리화, 제거, 또는 다른 반응에서와 같은 변형을 자발적으로 진행하지 않는 화합물을 생성시킨다는 내포된 단서를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
"치환된"이라는 용어는 또한 유기 화합물의 모든 허용할 수 있는 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 광범한 측면에서, 허용할 수 있는 치환기로는 유기 화합물의 비고리형 및 고리형, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환기가 있다. 예시적인 치환기는, 예를 들어, 하기 본원에 개시된 것들을 포함한다. 허용할 수 있는 치환기는 적합한 유기 화합물에 대해 하나 이상일 수 있고 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명을 위해, 질소와 같은 헤테로원자가 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족하는 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용할 수 있는 치환기를 지닐 수 있다. 본 발명은 어떠한 방식으로든 유기 화합물의 허용할 수 있는 치환기에 의해 제한되지 않는다.
하기 나열된 임의의 기에 추가된 "저급"이라는 용어는 해당 기가 7개 미만의 탄소 (즉, 6개 또는 그 미만의 탄소)를 함유한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, "저급 알킬"은 1-6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 지칭하며, "저급 알케닐"은 2-6개의 탄소를 함유하는 알케닐기를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "포화된"은 어떠한 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-탄소 삼중결합을 지니지 않는 화합물 및/또는 기에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "불포화된"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-탄소 삼중결합을 지니는 화합물 및/또는 기에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "지방족"은 선형 또는 분지형이지만 사이클릭이 아닌 화합물 및/또는 기(또한, "비환식" 또는 "개방-사슬"기로도 공지됨)에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "사이클릭"은 하나의 고리 또는 둘 또는 그 초과의 고리(예, 스피로, 융합된, 브릿지된 고리)를 지니는 화합물 및/또는 기에 적용된다.
용어 "방향족"은 4n+2 전자(여기서, n은 정수의 절대값이다)를 함유하는 고리형의 컨쥬게이션된 분자 부분이 특징인 평면형 또는 폴리사이클릭 구조를 칭한다. 융합되거나 결합된 고리를 함유하는 방향족 분자는 또한 바이사이클릭 방향족 고리라 지칭된다. 예를 들어, 탄화수소 고리 구조에 헤테로원자를 함유하는 바이사이클릭 방향족 고리는 바이사이클릭 헤테로아릴 고리로 지칭된다.
본원에서 사용된 용어 "탄화수소"는 전체적으로 수소와 탄소로 이루어진 유기 화합물을 칭한다.
본 발명의 목적상, 화학적 원소는 문헌[CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87]의 표지 뒷면에 있는 원소주기율표에 따라 확인된다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로원자"는 본 분야에서 인식되며 탄소 또는 수소가 아닌 어떠한 원소의 원자를 칭한다. 예시적인 헤테로원자는 붕소, 질소, 산소, 인, 황 및 셀레늄을 포함한다.
용어 "알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬의 대표적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 3차-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 2-메틸사이클로펜틸, 및 1-사이클로헥실에틸을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "치환된 알킬"은 1 내지 12개의 탄소원자를 함유하며 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 설프하이드릴, 알킬티오, 할로알킬티오, 플루오로알킬티오, 알케닐티오, 알키닐티오, 설폰산, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐, 플루오로알킬설포닐, 알케닐설포닐, 알키닐설포닐, 알콕시설포닐, 할로알콕시설포닐, 플루오로알콕시설포닐, 알케닐옥시설포닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설포닐, 황산, 알킬설피닐, 할로알킬설피닐, 플루오로알킬설피닐, 알케닐설피닐, 알키닐설피닐, 알콕시설피닐, 할로알콕시설피닐, 플루오로알콕시설피닐, 알케닐옥시설피닐, 알키닐옥시설피닐, 아미노설피닐, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 알킬설포닐옥시, 할로알킬설포닐옥시, 플루오로알킬설포닐옥시, 알케닐설포닐옥시, 알키닐설포닐옥시, 할로알콕시설포닐옥시, 플루오로알콕시설포닐옥시, 알케닐옥시설포닐옥시, 알키닐옥시설포닐옥시, 알킬설피닐옥시, 할로알킬설피닐옥시, 플루오로알킬설피닐옥시, 알케닐설피닐옥시, 알키닐설피닐옥시, 알콕시설피닐옥시, 할로알콕시설피닐옥시, 플루오로알콕시설피닐옥시, 알케닐옥시설피닐옥시, 알키닐옥시설피닐옥시, 아미노설피닐옥시, 아미노, 아미도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 아지도, 포스피닐, 포스포릴, 실릴 및 실릴옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환기로 치환된 지방족 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬렌"은 본 분야에서 인식되며 상기 정의된 바와 같은 알킬기 중의 두 개의 수소 원자를 제거함으로써 얻어진 이좌배위자 부분에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "알케닐"은 2 내지 10개의 탄소를 함유하며 두 개의 수소의 제거에 의해서 형성된 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 의미한다. 알케닐의 대표적인 예는 에테닐, 2-프로페닐, 2-메틸-2-프로페닐, 3-부테닐, 4-펜테닐, 5-헥세닐, 2-헵테닐, 2-메틸-1-헵테닐 및 3데세닐을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "알키닐"은 2 내지 10개의 탄소를 함유하며 하나 이상의 탄소-탄소 삼중결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 기를 의미한다. 알키닐의 대표적인 예는 아세틸레닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 3-부티닐, 2-펜티닐, 및 1-부티닐을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "카르보사이클릴"은 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화된 결합을 지니는 3 내지 12개의 탄소 원자를 함유한 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭(예, 바이사이클릭, 트리사이클릭, 등) 탄화수소를 의미하고, 의심의 여지를 피하기 위하여 설명하면, 불포화도는 방향족 고리 시스템(예, 페닐)을 생성시키지 않는다. 카르보사이클릴기의 예는 1-사이클로프로필, 1-사이클로부틸, 2-사이클로펜틸, 1-사이클로펜테닐, 3-사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐 및 2-사이클로펜테닐메틸을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로사이클릴"은 모노사이클릭, 바이사이클릭(예, 융합된 및 스피로사이클릭) 및 트리사이클릭 고리를 포함하지만 이로 제한되지 않는 비-방향족 고리 시스템으로서, 완전히 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있고, 의심의 여지를 피하기 위하여 설명하면, 불포화도는 방향족 고리 시스템을 생성시키지 않으며, 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 질소, 산소 또는 황을 포함하는 3 내지 12개의 원자를 지니는 비-방향족 고리 시스템을 포함한다. 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 예시 목적으로는, 헤테로사이클릭 고리의 예들은 다음과 같다: 아제핀, 아제티디닐, 모르폴리닐, 옥소피페리디닐, 옥소피롤리디닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐, 퀴뉴클리디닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로피라닐 및 테트라하이드로푸라닐. 본 발명의 헤테로사이클릴기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 설프하이드릴, 알킬티오, 할로알킬티오, 플루오로알킬티오, 알케닐티오, 알키닐티오, 설폰산, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐, 플루오로알킬설포닐, 알케닐설포닐, 알키닐설포닐, 알콕시설포닐, 할로알콕시설포닐, 플루오로알콕시설포닐, 알케닐옥시설포닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설포닐, 설핀산, 알킬설피닐, 할로알킬설피닐, 플루오로알킬설피닐, 알케닐설피닐, 알키닐설피닐, 알콕시설피닐, 할로알콕시설피닐, 플루오로알콕시설피닐, 알케닐옥시설피닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설피닐, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 알킬설포닐옥시, 할로알킬설포닐옥시, 플루오로알킬설포닐옥시, 알케닐설포닐옥시, 알키닐설포닐옥시, 할로알콕시설포닐옥시, 플루오로알콕시설포닐옥시, 알케닐옥시설포닐옥시, 알키닐옥시설포닐옥시, 알킬설피닐옥시, 할로알킬설피닐옥시, 플루오로알킬설피닐옥시, 알케닐설피닐옥시, 알키닐설피닐옥시, 알콕시설피닐옥시, 할로알콕시설피닐옥시, 플루오로알콕시설피닐옥시, 알케닐옥시설피닐옥시, 알키닐옥시설피닐옥시, 아미노설피닐옥시, 아미노, 아미도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 아지도, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 알킬렌 부분(예, 메틸렌)을 통해서 헤테로사이클릴기에 결합된 상기 치환기중 어느 치환기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환된다.
본원에서 사용된 용어 "N-헤테로사이클릴"은 본원에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릭의 일부로서, 하나 이상의 질소 원자를 지니며, 그러한 질소 원자를 통해서 N-헤테로사이클릴 부분이 모체 부분에 결합되는 헤테로사이클릴의 일부이다. 대표적인 예는 피롤리딘-1-일, 피페리딘-1-일, 피페라진-1-일, 헥사하이드로피리미딘-1-일, 모르폴린-1-일, 1,3-옥사지난-3-일 및 6-아자스피로[2.5]옥트-6-일을 포함한다. 헤테로사이클릴기와 마찬가지로, 본 발명의 N-헤테로사이클릴기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 설프하이드릴, 알킬티오, 할로알킬티오, 플루오로알킬티오, 알케닐티오, 알키닐티오, 설폰산, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐, 플루오로알킬설포닐, 알케닐설포닐, 알키닐설포닐, 알콕시설포닐, 할로알콕시설포닐, 플루오로알콕시설포닐, 알케닐옥시설포닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설포닐, 황산, 알킬설피닐, 할로알킬설피닐, 플루오로알킬설피닐, 알케닐설피닐, 알키닐설피닐, 알콕시설피닐, 할로알콕시설피닐, 플루오로알콕시설피닐, 알케닐옥시설피닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설피닐, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 알킬설포닐옥시, 할로알킬설포닐옥시, 플루오로알킬설포닐옥시, 알케닐설포닐옥시, 알키닐설포닐옥시, 할로알콕시설포닐옥시, 플루오로알콕시설포닐옥시, 알케닐옥시설포닐옥시, 알키닐옥시설포닐옥시, 알킬설피닐옥시, 할로알킬설피닐옥시, 플루오로알킬설피닐옥시, 알케닐설피닐옥시, 알키닐설피닐옥시, 알콕시설피닐옥시, 할로알콕시설피닐옥시, 플루오로알콕시설피닐옥시, 알케닐옥시설피닐옥시, 알키닐옥시설피닐옥시, 아미노설피닐옥시, 아미노, 아미도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 아지도, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 알킬렌 부분(예, 메틸렌)을 통해서 N-헤테로사이클릴기에 결합된 상기 치환기 중 어느 치환기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환된다.
본원에서 사용된 용어 "아릴"은 페닐기, 나프틸기 또는 안트라세닐기를 의미한다. 본 발명의 아릴기는 임의로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 설프하이드릴, 알킬티오, 할로알킬티오, 플루오로알킬티오, 알케닐티오, 알키닐티오, 설폰산, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐, 플루오로알킬설포닐, 알케닐설포닐, 알키닐설포닐, 알콕시설포닐, 할로알콕시설포닐, 플루오로알콕시설포닐, 알케닐옥시설포닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설포닐, 설핀산, 알킬설피닐, 할로알킬설피닐, 플루오로알킬설피닐, 알케닐설피닐, 알키닐설피닐, 알콕시설피닐, 할로알콕시설피닐, 플루오로알콕시설피닐, 알케닐옥시설피닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설피닐, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 알킬설포닐옥시, 할로알킬설포닐옥시, 플루오로알킬설포닐옥시, 알케닐설포닐옥시, 알키닐설포닐옥시, 할로알콕시설포닐옥시, 플루오로알콕시설포닐옥시, 알케닐옥시설포닐옥시, 알키닐옥시설포닐옥시, 알킬설피닐옥시, 할로알킬설피닐옥시, 플루오로알킬설피닐옥시, 알케닐설피닐옥시, 알키닐설피닐옥시, 알콕시설피닐옥시, 할로알콕시설피닐옥시, 플루오로알콕시설피닐옥시, 알케닐옥시설피닐옥시, 알키닐옥시설피닐옥시, 아미노설피닐옥시, 아미노, 아미도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 아지도, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 알킬렌 부분(예, 메틸렌)을 통해서 헤테로사이클릴기에 결합된 상기 치환기 중 어느 치환기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아릴렌"은 본 분야에서 인식되는 아릴렌이고, 상기 정의된 바와 같은 아릴 고리 중의 두 개의 수소 원자를 제거함으로써 얻어진 이좌배위자 부분에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "아릴알킬" 또는 "아르알킬"은 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기를 통해서 모체 분자 부분에 부가된 상기 정의된 바와 같은 아릴기를 의미한다. 아르알킬의 대표적인 예는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 및 2-나프트-2-일에틸을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "바이아릴"은 아릴-치환된 아릴, 아릴-치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴-치환된 아릴 또는 헤테로아릴-치환된 헤테로아릴을 의미하며, 여기서, 아릴 및 헤테로아릴이 본원에서 정의된 바와 같다. 대표적인 예는 4-(페닐)페닐 및 4-(4-플루오로페닐)피리디닐을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴"은, 이로 한정되는 것은 아니지만 모노사이클릭, 바이사이클릭 및 트리사이클릭 고리를 포함한, 방향족 고리 시스템을 포함하고, 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 질소, 산소, 또는 황을 포함한 3 내지 12개의 원자를 지닌다. 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 예시 목적으로, 헤테로아릴의 예는 다음과 같다: 아자인돌릴, 벤조(b)티에닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤즈옥사디아졸릴, 푸라닐, 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 인돌릴, 인돌리닐, 인다졸릴, 이소인돌리닐, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 푸리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피롤로[2,3-d]피리미디닐, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 트리아졸릴, 티아졸릴, 티오페닐, 테트라하이드로인돌릴, 테트라졸릴, 티아디아졸릴, 티에닐, 티오모르폴리닐, 트리아졸릴 또는 트로파닐. 본 발명의 헤테로아릴기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 설프하이드릴, 알킬티오, 할로알킬티오, 플루오로알킬티오, 알케닐티오, 알키닐티오, 설폰산, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐, 플루오로알킬설포닐, 알케닐설포닐, 알키닐설포닐, 알콕시설포닐, 할로알콕시설포닐, 플루오로알콕시설포닐, 알케닐옥시설포닐, 알키닐옥시설포닐, 아미노설포닐, 황산, 알킬설피닐, 할로알킬설피닐, 플루오로알킬설피닐, 알케닐설피닐, 알키닐설피닐, 알콕시설피닐, 할로알콕시설피닐, 플루오로알콕시설피닐, 알케닐옥시설피닐, 알키닐옥시설피닐, 아미노설피닐, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 알킬설포닐옥시, 할로알킬설포닐옥시, 플루오로알킬설포닐옥시, 알케닐설포닐옥시, 알키닐설포닐옥시, 할로알콕시설포닐옥시, 플루오로알콕시설포닐옥시, 알케닐옥시설포닐옥시, 알키닐옥시설포닐옥시, 알킬설피닐옥시, 할로알킬설피닐옥시, 플루오로알킬설피닐옥시, 알케닐설피닐옥시, 알키닐설피닐옥시, 알콕시설피닐옥시, 할로알콕시설피닐옥시, 플루오로알콕시설피닐옥시, 알케닐옥시설피닐옥시, 알키닐옥시설피닐옥시, 아미노설피닐옥시, 아미노, 아미도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 아지도, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 알킬렌 부분(예, 메틸렌)을 통해서 헤테로아릴기에 결합된 상기 치환기 중 어느 치환기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환된다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴렌"은 본 분야에서 인식되는 헤테로아릴렌이며, 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리 중의 두 개의 수소 원자를 제거함으로써 얻어진 이좌배위자 부분에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴알킬" 또는 "헤테로아르알킬"은, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 의미한다. 헤테로아릴알킬의 대표적인 예는 피리딘-3-일메틸 및 2-(티엔-2-일)에틸을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 -Cl, -Br, -I 또는 -F를 의미한다.
용어 "할로알킬"은, 하나 이상의 수소가 본원에서 정의된 바와 같은 할로겐으로 대체되는, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 할로알킬의 대표적인 예는 클로로메틸, 2-플루오로에틸, 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 및 2-클로로-3-플루오로펜틸을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "플루오로알킬"은, 모든 수소가 불소로 대체되는, 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드록시"는 -OH 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "알콕시"는, 산소 원자를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 알콕시의 대표적인 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 2-프로폭시, 부톡시, 3차-부톡시, 펜틸옥시, 및 헥실옥시를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 용어 "알케닐옥시", "알키닐옥시", "카르보사이클릴옥시", 및 "헤테로사이클릴옥시"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "할로알콕시"는, 하나 이상의 수소가 상기 정의된 바와 같은 할로겐으로 대체되는, 상기 정의된 바와 같은 알콕시기를 의미한다. 할로알콕시의 대표적인 예는 클로로메톡시, 2-플루오로에톡시, 트리플루오로메톡시, 및 펜타플루오로에톡시를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 용어 "플루오로알킬옥시"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "아릴옥시"는, 산소를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 아릴기를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴옥시"는, 산소를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴옥시"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "아릴알콕시" 또는 "아릴알킬옥시"는, 산소를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 아릴알킬기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴알콕시"가 유사하게 정의된다. 아릴옥시 및 헤테로아릴알콕시의 대표적인 예는 2-클로로페닐메톡시, 3-트리플루오로메틸-페닐에톡시, 및 2,3-디메틸피리디닐메톡시를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "설프하이드릴" 또는 "티오"는 -SH 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "알킬티오"는, 황을 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 알킬티오의 대표적인 예는 메틸티오, 에틸티오, 3차-부틸티오, 및 헥실티오를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 용어 "할로알킬티오", "플루오로알킬티오", "알케닐티오", "알키닐티오", "카르보사이클릴티오", 및 "헤테로사이클릴티오"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "아릴티오"는, 황을 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 아릴기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴티오"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "아릴알킬티오" 또는 "아르알킬티오"는, 황을 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 아릴알킬기를 의미한다. 용어 헤테로아릴알킬티오"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "설포닐"은 -S(=0)2- 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "설폰산"은 -S(=0)20H를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "알킬설포닐"은, 본원에서 정의된 바와 같은 설포닐기를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 알킬설포닐의 대표적인 예는 메틸설포닐 및 에틸설포닐을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 용어 "할로알킬설포닐", "플루오로알킬설포닐", "알케닐설포닐", "알키닐설포닐", "카르보사이클릴설포닐", "헤테로사이클릴설포닐", "아릴설포닐", "아르알킬설포닐", "헤테로아릴설포닐" 및 "헤테로아르알킬설포닐"이 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "알콕시설포닐"은, 본원에서 정의된 바와 같은 설포닐기를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 알콕시기를 의미한다. 알콕시설포닐의 대표적인 예는 메톡시설포닐, 에톡시설포닐 및 프로폭시 설포닐을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 용어 "할로알콕시설포닐", "플루오로알콕시설포닐", "알케닐옥시설포닐", "알키닐옥시설포닐", "카르보사이클릴옥시설포닐", "헤테로사이클릴옥시설포닐", "아릴옥시설포닐", "아르알킬옥시설포닐", "헤테로 아릴옥시설포닐" 및 "헤테로아르알킬옥시설포닐"이 유사하게 정의된다.
용어 트리플릴, 토실, 메실 및 노나플릴은 본 분야에서 인식되는 기이며, 각각 트리플루오로메탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐, 및 나노플루오로부탄설포닐 기들을 지칭한다. 용어 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트 및 노나플레이트는 본 분야에서 인식되는 기이고, 각각 트리플루오로메탄설포네이트 에스테르, p-톨루엔설포네이트 에스테르, 메탄설포네이트 에스테르, 및 노나플루오로부탄설포네이트 에스테르 작용기 및 상기 기들을 함유하는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "아미노설포닐"은, 설포닐기를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 아미노기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "설피닐"은 -S(=0)-기를 지칭한다. 설피닐기는 설포닐기에 대해서 상기 정의된 바와 같다. 본원에서 사용된 용어 "황산"은 -S(=0)OH을 지칭한다.
용어 "옥시"는 -O-기를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "카르보닐"은 -C(=0)-기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "티오카르보닐"은 -C(=S)-기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "포르밀"은 -C(=0)H 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "알킬카르보닐"은, 본원에서 정의된 바와 같은 카르보닐기를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 알킬카르보닐의 대표적인 예는 아세틸, 1-옥소프로필, 2,2-디메틸-1-옥소프로필, 1-옥소부틸, 및 1-옥소펜틸을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 용어 "할로알킬카르보닐", "플루오로알킬카르보닐", "알케닐카르보닐", "알키닐카르보닐", "카르보사이클릴카르보닐", "헤테로사이클릴카르보닐", "아릴카르보닐", "아르알킬카르보닐", "헤테로아릴카르보닐", 및 "헤테로아르알킬카르보닐"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "카르복시"는 -C02H 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "알콕시카르보닐"은, 상기 정의된 바와 같은 카르보닐기를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 알콕시를 의미한다. 알콕시카르보닐의 대표적인 예는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 및 3차-부톡시 카르보닐을 포함하지만, 이로 한정되는 것을 아니다. 용어 "할로알콕시카르보닐", "플루오로알콕시카르보닐", "알케닐옥시카르보닐", "알키닐옥시카르보닐", "카르보사이클릴옥시카르보닐", "헤테로사이클릴옥시카르보닐", "아릴옥시카르보닐", "아르알킬옥시카르보닐", "헤테로아릴옥시카르보닐", 및 "헤테로아르알킬옥시카르보닐"이 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "알킬카르보닐옥시"는, 산소 원자를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬카르보닐기를 의미한다. 알킬카르보닐옥시의 대표적인 예는 아세틸옥시, 에틸카르보닐옥시, 및 3차-부틸카르보닐옥시를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 용어 "할로알킬카르보닐옥시", "플루오로알킬카르보닐옥시", "알케닐카르보닐옥시", "알키닐카르보닐옥시", "카르보사이클릴카르보닐옥시", "헤테로사이클릴카르보닐옥시", "아릴카르보닐옥시", "아르알킬카르보닐옥시", "헤테로아릴카르보닐옥시", 및 "헤테로아르알킬카르보닐옥시"가 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "알킬설포닐옥시"은, 산소 원자를 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에 정의된 바와 같은 알킬설포닐기를 의미한다. 용어 "할로알킬설포닐옥시", "플루오로알킬설포닐옥시", "알케닐설포닐옥시", "알키닐설포닐옥시", "카르보사이클릴설포닐옥시", "헤테로사이클릴설포닐옥시", "아릴설포닐옥시", 아르알킬설포닐옥시", "헤테로아릴설포닐옥시", "헤테로아르알킬설포닐옥시", "할로알콕시설포닐옥시", "플루오로알콕시설포닐옥시", "알케닐옥시설포닐옥시", "알키닐옥시설포닐옥시", "카르보사이클릴옥시설포닐옥시", "헤테로사이클릴옥시설포닐옥시", "아릴옥시설포닐옥시", "아르알킬옥시설포닐옥시", "헤테로아릴옥시설포닐옥시" 및 "헤테로아르알킬옥시설포닐옥시"이 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "아미노"는 수소 중 하나 또는 둘 모두가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르보사이클릴카르보닐, 헤테로사이클릴카르보닐, 아릴카르보닐, 아르알킬카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, 헤테로아르알킬카르보닐 및 상기 정의된 설포닐 및 설피닐로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기에 독립적으로 대체되거나; (질소를 함유하는 고리를 형성하도록) 둘 모두의 수소가 알킬렌기로 대체되는 경우의 -NH2 및 이의 치환된 유도체를 지칭한다. 대표적인 예는 메틸아미노, 아세틸아미노, 및 디메틸아미노를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "아미도"는, 카르보닐을 통해서 모체 분자 부분에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 아미노기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "시아노"는 -C≡N 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "니트로"는 -N02 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "아지도"는 -N3 기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "포스피닐"은, 수소 중 하나, 둘 또는 셋이 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로아르알킬옥시, 및 아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 독립적으로 대체되는 -PH3 및 이의 치환된 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "포스포릴"은 하이드록실중 하나 또는 둘 모두가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로아르알킬옥시, 및 아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 독립적으로 대체되는 -P(=0)OH2 및 이의 치환된 유도체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "실릴"은 수소중 하나, 둘 또는 셋이 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 및 헤테로아르알킬로부터 선택된 치환기에 독립적으로 대체되는 H3Si- 및 이의 치환된 유도체를 포함한다. 대표적인 예는 트리메틸실릴 (TMS), 3차-부틸디페닐실릴 (TBDPS), 3차-부틸디메틸실릴 (TBS/TBDMS), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 및 [2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸(SEM)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "실릴옥시"는, 산소 원자를 통해서 모체 분자에 부가되는, 본원에서 정의된 바와 같은 실릴기를 의미한다.
약어 Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, 및 Ms는 각각 메틸, 에틸, 페닐, 트리플루오로메탄설포닐, 노나플루오로부탄설포닐, p-톨루엔설포닐 및 메탄설포닐을 나타낸다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 유기화학 전문가에 의해서 사용되는 약어들의 더욱 종합적인 목록이 Journal of Organic Chemistry의 각 볼륨의 첫 번째 이슈에 기재되어 있으며; 이러한 목록은 전형적으로는 명칭이 Standard List of Abbreviations인 표에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "투여하는"은 대상자에게 약제학적 작용제 또는 조성물을 제공함을 의미하며, 의료 전문가 또는 자가 투여에 의한 투여를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 표현 "신경변성 장애" 및 "신경변성 질환"은 신경병과 같은 광범위한 중추 및 말초 신경계의 질환 및/또는 장애를 지칭하며, 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD), 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 탈신경위축(denervation atrophy), 귀경화증(otosclerosis), 뇌졸중(stroke), 치매(dementia), 다발경화증(multiple sclerosis), 헌팅톤병(Huntington's disease), 후천성면역결핍 질환(acquired immunodeficiency disease: AIDS)과 연관된 뇌병(encephalopathy), 및 뉴우런 세포 독성(neuronal cell toxicity) 및 세포 치사와 연관된 그 밖의 질환을 포함하지만, 리로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 정상적인 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 그 밖의 문제 또는 합병증 없이 합리적인 이익/위험 비율로 인간과 동물의 조직과 접촉 사용하기에 적합한 작용제, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형(dosage form)을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 한 기관(organ) 또는 신체의 일부로부터 신체의 다른 기관 또는 일부로 작용제를 운반하거나 수송하는데 관련된 액체 또는 고형 충전제, 희석제, 부형제 또는 물질을 캡슐화하는 용매와 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제형 중의 다른 성분과 조화 가능한 면에서 "허용되는"이어야 하며, 환자에게 해롭지 않아야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 (1) 당, 예컨대, 락토오스, 글루코스 및 수크로오스; (2) 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오즈 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈 and 셀룰로오즈 아세테이트; (4) 분쇄된 트라가칸트; (5) 말트(malt); (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌제용 왁스; (9) 오일, 예컨대, 낙화생유, 면실유, 홍화유(safflower oil), 참기름, 올리브 오일, 옥수수 기름 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대, 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 멸균발열성물질제거수(pyrogen-free water); (17) 등장성 염수; (18) 링거액(Ringer's solution); (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; 및 (22) 약제학적 제형에 사용되는 그 밖의 비-독성의 양립성 물질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 화합물의 비교적 비-독성의 무기 및 유기 염을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질병"은 비정상 단백질 또는 미스폴딩된 단백질의 축적 및/또는 응집과 연관된 어떠한 질환을 지칭한다. 단백질병이 종종 신경변성 질환이기는 하지만, 단백질병은 또한 간, 근육 및 심장을 포함한 다른 조직의 질환을 포함하며, 일부 암을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "대상자"는 치료 또는 요법에 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "지니는 것으로 의심되는 대상자"는 질환 또는 병태의 하나 이상의 임상적 지표를 보이는 대상자를 의미한다. 특정의 구체예에서, 질환 또는 병태는 암, 신경변성 장애 또는 췌장염이다.
본원에서 사용된 용어 "이를 필요로 하는 대상자"는 본 발명의 요법 또는 치료를 필요로 하는 것으로 확인된 대상자를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "치료 유효"는 작용제에 의해서 유발된 동물, 특히, 포유동물, 더욱 특히 인간에서의 국소 또는 전신 효과를 지칭한다. 용어 "치료 유효량" 및 "유효량"은 적어도 세포의 하위 집단에서 어떠한 요망되는 효과를 생성하는 작용제의 양을 의미한다. 치료 유효량은 어떠한 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 어떠한 요망되는 국소 또는 전신효과를 생성하는 작용제의 양을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 사용된 특정의 작용제는 그러한 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율을 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 용어, 대상자에서의 질환을 "치료하는" 또는 질환을 지니거나 그러한 질환을 지니는 것으로 의심되는 대상자를 "치료하는"은 대상자에게 약제학적 치료, 예를 들어, 작용제의 투여가 주어져서, 질환의 하나 이상의 증상이 감소되거나 그러한 증상이 악화되는 것이 방지됨을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "상기 언급된 화합물 중 어느 화합물"은 화학식(I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), 및 (VIII) 중 어느 화합물이다.
Usp14
의 억제제
본 발명의 한 가지 양태는 화학식(I)로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그(prodrug), 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
R1은 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 저급 알콕시, 할로 또는 트리플루오로메틸이고;
G는 -N= 또는 -C(R2)=이고;
Z는 =C(R8)-, =C(R2)- 또는 =N-이고;
R2는 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 저급 알콕시, 할로 또는 트리플루오로메틸이거나;
G가 -C(R2)=이고 Z가 =C(R2)-인 경우, 두 개의 R2가 함께
Y가 -CH2NR3R4, -CH2(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nNH(알킬), -CH2NH(CH2)nN(알킬)2, -CH2NH(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2N(알킬)(CH2)nNH(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬)2, -CH2N(알킬)(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nO(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nO(알킬), -NR3R4, -NR5NR6R7, -NR5(N-헤테로사이클릴), 또는 -N-헤테로사이클릴이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
R3은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R4는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R5는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R7은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R8은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R9는 알킬이거나; 두 개의 R9가 이들이 결합된 질소와 함께 N-헤테로사이클릴 기이고;
R10은 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로, 트리플루오로메틸, 설폭시메틸, 설폰아미도, 아미노, 아미도, N-헤테로사이클릴, 아미노알킬, 아미도알킬, 또는 N-헤테로사이클릴알킬이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 A가 4-플루오로페닐이고, R1이 메틸이고, G가 -C(R2)=이고, R2가 메틸이고, X가 
이고, Y가 -CH2(피페리딘-1-일)인 경우에, Z가 =C((H)-이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 A가 4-메틸페닐이고, R1이 메틸이고, G가 -C(R2)=이고, R2가 메틸이고, X가 
이고, Y가 -CH2(4-메틸피페리딘-1-일)인 경우에, Z가 =C((H)-(즉, C100)이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 A가 4-클로로페닐이고, R1이 메틸이고, G가 -N=이고, X가 
이고, Y가 -NH2인 경우에, Z가 =N-(즉, C121)이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 G가 -N=인 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 G가 -C(R2)=인 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 화학식(II)로 표현되거나, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체인 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다:
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(III)으로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
Z는 =C(R2)- 또는 =N-이고;
R2는 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 저급 알콕시, 할로 또는 트리플루오로메틸이거나;
R2와 X는 함께
Y는 -CH2NR3R4, -CH2(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nNH(알킬), -CH2NH(CH2)nN(알킬)2, -CH2NH(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2N(알킬)(CH2)nNH(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬)2, -CH2N(알킬)(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)NO(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)NO(알킬), -NR3R4, -NR5NR6R7, -NR5(N-헤테로사이클릴), 또는 -N-헤테로사이클릴이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
R3은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R4는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R5는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R7은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R9는 알킬이거나; 두 개의 R9는 이들이 결합된 질소와 함께 N-헤테로사이클릴 기이고;
R10은 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로, 트리플루오로메틸, 설폭시메틸, 설폰아미도, 아미노, 아미도, N-헤테로사이클릴, 아미노알킬, 아미도알킬, 또는 N-헤테로사이클릴알킬이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C12가 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C31이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(IV)로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
R11은 수소, 알킬, 알킬카르보닐, 아르알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알콕시알킬, 트리플루오로메틸, 또는 실릴이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C73이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(V)로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
R12는 수소 또는 알킬이고;
R13은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 설폭시메틸, 설폰아미도, 아미노, 아미도, 아지도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 메틸렌 또는 에틸렌 부분을 통해서 결합된 상기 치환기 중의 어느 치환기이거나; R13 중 하나 또는 두 개와 이것이 결합된 탄소가 함께 -N=이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C106이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(VI)로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
R1은 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 저급 알콕시, 할로 또는 트리플루오로메틸이고;
R14는 수소 또는 X이고;
R15 둘 모두는 함께 
이고;
R13은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 설폭시메틸, 설폰아미도, 아미노, 아미도, 아지도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 메틸렌 또는 에틸렌 부분을 통해서 결합된 상기 치환기 중의 어느 치환기이거나; R13 중 하나 또는 두 개와 이것이 결합된 탄소가 함께 N이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C118이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(VII)로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
Y는 -CH2NR3R4, -CH2(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nNH(알킬), -CH2NH(CH2)nN(알킬)2, -CH2NH(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2N(알킬)(CH2)nNH(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬)2, -CH2N(알킬)(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nO(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nO(알킬), -NR3R4, -NR5NR6R7 또는 -NR5(N-헤테로사이클릴)이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C133이 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식(VIII)으로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
R12는 수소 또는 알킬이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 화합물이 C139가 아님을 단서로 하는 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 A가 아릴 또는 헤테로아릴인 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 설폭시메틸, 설폰아미도, 아미노, 아미도, 아지도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 메틸렌 또는 에틸렌 부분을 통해서 페닐, 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 또는 피리미딘-2-일에 결합된 상기 치환기 중 어느 치환기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 페닐, 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 또는 피리미딘-2-일인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 페닐인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 A가 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 2 위치에서 치환된(오르토 치환된) 페닐인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 3 위치에서 치환된(메타 치환된) 페닐인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 4 위치에서 치환된(파라 치환된) 페닐인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 치환기로 2 및 4 위치에서 치환된 페닐인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 4 위치에서 임의로 치환된 피리딘-2-일인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 4 위치에서 임의로 치환된 피리미딘-2-일인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 바이아릴인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 4-(페닐)펜-1-일 또는 4-(2-피리디닐)펜-1-일인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 중 어느 화합물로서, A가
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 할로알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 플루오로알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 할로메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 플루오로메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 에틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 할로에틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 플루오로에틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R2가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R2가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R2가 메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R2가 에틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 수소이고, R2가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 알킬이고, R2가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 메틸이고, R2가 메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R1이 에틸이고, R2가 에틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R8)-이고, R8이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R8)-이고, R8이 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =N-인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, X가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, X가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, X가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, X가 헤테로아릴인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, X가 피롤로[1,2-a]피라진-3-일인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R9가 알킬인 화합물에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R9가 메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 알킬인 화합물에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R4가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R4가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R4가 알콕시알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 수소이고, R4가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 알킬이고, R4가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 수소이고, R4가 알콕시알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 알킬이고, R4가 알콕시알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알콕시, 아미노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 -CH2(N-헤테로사이클릴)인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알콕시, 아미노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 -CH2(피페리딘-1-일), -CH2(피페라진-1-일), -CH2(헥사하이드로피리미딘-1-일), -CH2(모르폴린-1-일) 또는 -CH2(1,3-옥사지난-3-일)인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알콕시, 아미노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 -CH2(피페리딘-1-일) 또는 -CH2(피페라진-1-일)인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가에 -CH2NH(CH2)nNH(알킬), -CH2NH(CH2)nN(알킬)2, -CH2NH(CH2)nN(알킬렌), -CH2N(알킬)(CH2)nNH(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬)2 또는 -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬렌)인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -CH2NH(CH2)nO(알킬) 또는 -CH2N(알킬)(CH2)nO(알킬)인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, n이 1인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, n이 2인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, n이 3인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, n이 4인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R3이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R3이 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R4가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R4가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R3이 수소이고, R4가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R3이 수소이고, R4가 수소인 화합물에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR3R4이고, R3이 알킬이고, R4가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR5NR6R7 또는 -NR5(N-헤테로사이클릴)인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR5NR6R7 이고, R5가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR5NR6R7 이고, R5가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR5NR6R7 이고, R5가, R6 및 R7이 독립적으로 수소 또는 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR5(N-헤테로사이클릴)이고, R5가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 -NR5(N-헤테로사이클릴)이고, R5가 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Y가 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로 또는 트리플루오로메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소, 아미노, 아미도, N-헤테로사이클릴, 아미노알킬, 아미도알킬, 또는 N-헤테로사이클릴알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소, 할로 또는 N-헤테로사이클릴인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소, 클로로 또는 피페리딘-1-일인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소 또는 N-헤테로사이클릴알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소 또는 피페리딘-1-일메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소 또는 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R10이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R11이 수소 또는 알킬인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R11이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R11이 메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R12가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R12가 메틸인 화합물에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R13이 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 R13과 이것이 결합되는 탄소가 -N=인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R14가 수소인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, R14가 X인 화합물에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
이며, R10이 수소, 할로 또는 N-헤테로사이클릴인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께 
이며, R10이 수소, 또는 N-헤테로사이클릴알킬인 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는
본 발명의 또 다른 양태는
본 발명의 또 다른 양태는 다음 화학식 
의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 화학식 
의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는
본 발명의 또 다른 양태는 
(여기서, W는 알킬, 플루오로, 클로로, 니트로, 메톡시, 에톡시, -S02NH2 또는 -C(=0)NH2이다)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 메틸인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 플루오로인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 클로로인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 니트로인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 메톡시인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 에톡시인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 -S02NH2인 화합물에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 -C(=0)NH2인 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 
(여기서, W는 알킬, 플루오로, 클로로, 니트로, 메톡시, 에톡시, -S02NH2 또는 -C(=0)NH2이다)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물들 중 어느 화합물로서, 정확히 하나의 W가 클로로인 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는
본 발명의 또 다른 양태는
본 발명의 또 다른 양태는
본 발명의 또 다른 양태는 
본 발명의 많은 화합물들은 약제학적으로 양립 가능한 반대이온과의 염(즉, 약제학적으로 허용되는 염)으로서 제공될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은, 대상자에게 투여시에, 본 발명의 화합물 또는 이의 프로드러그를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 어떠한 비-독성 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 반대이온은 대상자에게 투여시에 염으로부터 방출되는 경우에 독성이 아닌 염의 이온성 부분이다. 약제학적으로 양립 가능한 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말레산, 석신산, 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아닌, 많은 산에 의해서 형성될 수 있다. 염은 대응하는 무 염기 형태인 수성 또는 다른 양이온성 용매 중에 더 용해성인 경향이 있다.
약제학적으로 허용되는 염을 형성시키기 위해서 통상적으로 사용되는 산은 무기산, 예컨대, 이황화수소, 염산, 하이드로브롬산, 요오드화수소산, 황산 및 인산뿐만 아니라, 유기산, 예컨대, 파라-톨루엔설폰산, 살리실산, 타르타르산, 바이타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 베실산, 푸마르산, 클루콘산, 글루쿠론산, 포름산, 글루탐산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 락트산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 카본산, 석신산, 시트르산, 벤조산, 및 아세트산 및 관련된 무기 및 유기산을 포함한다. 따라서, 그러한 약제학적으로 허용되는 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 설포네이트, 자일렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, .베타.-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말리에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 및 유사한 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 산부가 염은 염산 및 브롬산과 같은 무기산에 의해서 형성된 염 및 말레산과 같은 유기산에 의해서 형성된 염을 포함한다.
산성 작용기와 약제학적으로 허용되는 염을 형성하기에 적합한 염기는 소듐, 포타슘, 및 리튬과 같은 알칼리 금속의 수산화물; 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리토금속의 수산화물; 알루미늄 및 아연과 같은 그 밖의 금속의 수산화물; 암모니아, 및 유기 아민, 예컨대, 비치환된 또는 하이드록시-lcghks된 모노-, 디- 또는 트리알킬아민; 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸,N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-하이드록시-저급 알킬 아민s), 예컨대, 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-3차-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-디-저급 알킬-N-(하이드록시 저급 알킬)-아민, 예컨대, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민, 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 및 라이신 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특정의 화합물 및 이들의 염은 하나 이상의 결정형으로 존재할 수 있으며, 본 발명은 각각의 결정형 및 이의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정의 화합물 및 이들의 염은 또한 용매화물, 예를 들어, 수화물의 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명은 각각의 용매화물 및 이의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 함유할 수 있고, 상이한 광학 활성 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물이 하나의 키랄 중심을 함유하는 경우에, 화합물은 두 가지의 거울상이성질체 형태로 존재하며, 본 발명은 둘 모두의 거울상이성질체 형태 및 거울상이성질체의 혼합물, 예컨대, 라세미 혼합물을 포함한다. 거울상이성질체는 본 분야의 전문가에게는 공지된 방법, 예를 들어, 결정화에 의해서 분리된 수 있는 부분입체이성질체의 형성; 예를 들어, 결정화, 기체-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해서 분리될 수 있는 부분입체이성질체 유도체 또는 복합체의 형성; 거울상이성질체-특이적 시약과의 하나의 거울상이성질체의 선택적 반응, 예를 들어, 효소적 에스테르화반응; 또는 예를 들어, 키랄 지지체, 예를 들어, 결합된 키랄 리간드를 지닌 실리카상에서 또는 키랄 용매의 존재하에, 키랄 환경에서의 기체-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해서 분리될 수 있다. 요망되는 거울상이성질체가 상기 기재된 분리 과정 중 한 과정에 의해서 또 다른 화학적 물질로 전환되는 경우에, 추가의 단계가 사용되어 요망되는 거울상이성질체 형태를 생성시킬 수 있음이 자명할 것이다. 대안적으로, 특정의 거울상이성질체는 광학적 활성 시약, 물질, 촉매 또는 용매를 사용하는 비대칭 합성법에 의해서 합성되거나, 비대칭 전환에 의해서 하나의 거울상이성질체를 다른 거울상이성질체로 전환시킴으로써 합성될 수 있다.
본 발명의 화합물이 하나 초과의 키랄 중심을 함유하는 경우에, 부분입체이성질체 형태들이 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 화합물은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 또는 결정화에 의해서 분리될 수 있고, 각각의 거울상이성질체가 상기 기재된 바와 같이 분리될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 부분입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정의 화합물은 상이한 토토머 형태로 또는 상이한 기하 이성질체로서 존재할 수 있고, 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 토토머 및/또는 기하 이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정의 화합물은 분리가능할 수 있는 여러 안정한 이형태적 형태로 존재할 수 있다. 비대칭 단일결합에 대한 제한된 회전으로 인해서, 예를 들어, 입체적 장애 또는 고리 스트레인(ring strain) 때문에 발생하는 비틀림 비대칭이 여러 이형태체의 분리를 가능하게 할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 형태 이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 특정의 화합물은 쯔비터이온 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명은 본 발명의 화합물의 각각의 쯔비터이온 형태 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명은 또한 프로드러그를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "프로드러그"는 생체 내에서 어떠한 생리학적 화학 과정에 의해서 모체 약물로 전환되는 작용제를 지칭한다(예, 생리학적 pH에 주어지는 프로드러그는 요망되는 약물 형태로 전환된다). 프로드러그는 종종, 일부의 상황에서, 유용한데, 그 이유는 이들이 모체 약물에 비해서 투여하기가 더 용이할 수 있기 때문이다. 이들은, 예를 들어, 경구 투여에 의해서 생체이용가능할 수 있지만, 모체 약물는 그렇지 않다. 프로드러그는 또한 모체 약물에 비해서 약리학적 조성물에서 개선된 용해도를 지닐 수 있다. 프로드러그의 비제한적인 예는, 수용성이 유리하지 않은 세포막을 가로지른 전달을 용이하게 하기 위해서 에스테르("프로드러그")로서 투여되지만, 그 후에, 수용성이 유리한 세포 내부에서 카복실산으로 대사적으로 가수분해되는 본 발명의 화합물일 것이다. 예를 들어, 프로드러그는 최종 약물보다 더 수용성일 수 있어서, 약물의 정맥내 투여를 용이하게 할 수 있다. 프로드러그는 또한 최종 약물보다 경구 생체이용성의 수준이 더 높을 수 있다. 투여 후에, 프로그러그는 효소적으로 또는 화학적으로 분열되어 혈액 또는 조직내에 최종 약물을 전달한다.
분열시의 예시적인 프로드러그는 상응하는 유리산을 방출시키며, 본 발명의 화합물의 그러한 가수분해 가능한 에스테르-형성 잔기는 카르복실산 치환기(예, -C(0)2H 또는 카르복실산을 함유하는 부분)을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니며, 상기 카르복실산 치환기에서, 유리 수소(free hydrogen)는 (C1-C4)알킬, (C2-C12)알카노일옥시메틸, (C4-C9))1-(알카노일옥시)에틸, 5 내지 10 개의 탄소원자를 지니는 1-메틸-1-(알카노일옥시)-에틸, 3 내지 6 개의 탄소원자를 지니는 알콕시카르보닐옥시메틸, 4 내지 7 개의 탄소원자를 지니는 1-(알콕시카르보닐옥시)에틸, 5 내지 8 개의 탄소원자를 지니는 1-메틸- 1-(알콕시카르보닐옥시)에틸, 3 내지 9 개의 탄소원자를 지니는 N-(알콕시카르보닐)아미노메틸, 4 내지 10 개의 탄소원자를 지니는 1-(N-(알콕시카르보닐)아미노)에틸, 3-프탈리딜, 4-크로토노락토닐, 감마-부티로락톤-4-일, 디-N,N-(C1-C2)알킬아미노(C2-C3)알킬(예컨대, β-디메틸아미노에틸), 카르바모일-(C1-C2)알킬, N,N-디(C1-C2)-알킬카르바모일-(C1-C2)알킬 및 피페리디노-, 피롤리디노- 또는 모르폴리노(C2-C3)알킬로 치환된다.
다른 예시적인 프로드러그는 본 발명의 화합물의 알콜 또는 아민을 방출시키며, 그러한 화합물에서, 하이드록실 또는 아민 치환기의 유리 수소는 (C1-C6)알카노일옥시메틸, 1-((C1-C6)알카노일옥시)에틸, 1-메틸-1-((C1-C6)알카노일옥시)에틸, (C1-C6)알콕시카르보닐-옥시메틸, N-(C1-C6)알콕시카르보닐아미노-메틸, 석시노일, (C1-C6)알카노일, α-아미노(C1-C4)알카노일, 아릴 악틸(arylactyl) 및 α-아미노아실, 또는 α-아미노아실-α-아미노아실로 치환되고, 여기서, 상기 α-아미노아실 부분은 독립적으로 단백질에서 발견되는 천연 L-아미노산, -P(0)(OH)2, -P(0)(0(C1-C6)알킬)2 또는 글리코실(탄수화물의 헤미아세탈의 하이드록실의 탈착으로부터 생성되는 라디칼)중 어느 것이다.
본원에서 사용된 용어 "보호기"는 요망되는 화학적 변형으로부터 잠재적인 반응성 작용기를 보호하는 일시적인 치환기를 의미한다. 그러한 보호기의 예는 카르복실산의 에스테르, 알콜의 실릴 에테르, 및 각각 알데하이드 및 케톤의 아세탈 및 케탈을 포함한다. 보호기 화학 분야로는 문헌[Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991]이 검토된다. 본 발명의 화합물의 보호된 형태는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "화학적으로 보호된 형태"는 하나 이상의 반응성 작용기가 바람직하지 않은 화학적 반응으로부터 보호되는, 즉, 보호된 기 또는 보호기의 형태(마스킹된 기(masked group) 또는 마스킹 기(masking group)로도 공지됨)의 형태로 존재하는 화합물에 적용된다. 활성 화합물을 화학적으로 보호된 형태로 제조하고/거나, 정제하고/거나 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다.
반응성 작용기를 보호함으로써, 다른 보호되지 않은 반응성 작용기와 관련된 반응이, 보호된 기에 영향을 미치지 않으면서, 수행될 수 있고; 분자의 나머지 부분에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서, 보호기가, 일반적으로는 후속 단계에서, 제거될 수 있다. [참조예: Protective Groups in Organic Synthesis, T. Green and P. Wuts, Wiley, 1991), and Protective Groups in Organic Synthesis, T. Green and P. Wuts; 3rd Edition; John Wiley and Sons, 1999]
예를 들어, 하이드록시기는 에테르(-OR) 또는 에스테르(-OC(=0)R)로서, 예를 들어, t-부틸 에테르; 벤질, 벤즈하이드릴(디페닐메틸), 또는 트리틸(트리페닐메틸) 에테르; 트리메틸실릴 또는 t-부틸디메틸실릴 에테르; 또는 아세틸 에스테르(-OC(=0)CH3,-OAc)로서 보호될 수 있다.
예를 들어, 알데하이드 또는 케톤기는 각각, 카르보닐기(C(=0))가 예를 들어 일차 알콜과의 반응에 의해서 디에테르(C(OR)2)로 전환되는, 아세탈 또는 케탈로서 보호될 수 있다. 알데하이드 또는 케톤기는 산의 존재하에 아주 과량의 물을 사용하는 가수분해에 의해서 용이하게 재생된다.
예를 들어, 아민기는, 예를 들어, 아미드(-NRC(=0)R) 또는 우레탄(-NRC(=0)OR)으로서, 예를 들어, 메틸 아미드(-NHC(=0)CH3); 벤질옥시 아미드(-NHC(=0)OCH2C6H5NHCbz)로서; t-부톡시 아미드(-NHC(=0)OC(CH3)3,-NHBoc); 2-바이페닐-2-프로폭시 아미드 (-NHC(=0)OC(CH3)2C6H4C6H5NHBoc)로서, 9-플루오레닐메톡시 아미드 (-NHFmoc)로서, 6-니트로베라트릴옥시 아미드(6-nitroveratryloxy amide: -NHNvoc)로서, 2-트리메틸실릴에틸옥시 아미드 (-NHTeoc)로서, 2,2,2-트리클로로에틸옥시 아미드(-NHTroc)로서, 알릴옥시 아미드(-NHAlloc)로서, 2-(페닐설포닐)에틸옥시 아미드 (-NHPsec)로서; 또는, 적합한 경우(예, 사이클릭 아민) 있어서, 니트로옥사이드 라디칼로서 보호될 수 있다.
예를 들어, 카르복실산기는 에스테르 또는 아미드로서, 예를 들어, 벤질 에스테르; t-부틸 에스테르; 메틸 에스테르; 또는 메틸 아미드로서 보호될 수 있다.
예를 들어, 티올기는 티오에테르 (-SR)로서, 예를 들어, 벤질 티오에테르; 또는 아세트아미도메틸 에테르(-SCH2NHC(=0)CH3)로서 보호될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 Usp14의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화된, 치료 유효량의 상기 기재된 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 또 다른 양태로, 본 발명의 작용제는 그 자체로 투여될 수 있거나, 약제학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 투여될 수 있고, 또한 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 후속 화합물이 투여되는 때에, 첫 번째 투여된 화합물의 치료 효과가 완전히 사라지지 않는 병합 요법은 본 발명의 화합물의 후속 투여, 동시 투여 및 별도 투여 또는 공동 투여를 포함한다.
이하 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 하기 투여를 위해서 구성되는 것들을 포함한 고체 또는 액체 형태로 투여를 위해서 특별히 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(drench)(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어, 구강, 설하 및 전신 흡수를 목표로 하는 것들, 환제(bolus), 분제(powder), 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; (2) 비경구 투여, 예를 들어, 무균 용액 또는 현탁액, 또는 서방성 제형(sustained-release formulation)으로서의 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주입; (3) 국소 적용, 예를 들어, 크림, 연고, 또는 피부에 적용되는 방출-조절 패치로서의 적용; (4) 질내 또는 직장내 투여, 예를 들어, 페서리(pessary), 크림 또는 폼(foam)으로서의 투여; (5) 안내 투여; (7) 경피 투여; 또는 (8) 비내 투여.
상기 기재된 바와 같이, 특정의 구체예에서, 본 발명의 작용제는 염기성 작용기, 예컨대, 아미노 또는 알킬아미노를 함유하는 화합물일 수 있으며, 그에 따라서, 약제학적으로 허용되는 산과 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이들 염은 동일반응계내(in situ)에서 투여 비히클 중에 또는 용량형 제조 공정 중에 제조될 수 있거나, 유리 염기 형태로의 본 발명의 정제된 화합물의 적합한 유기 또는 무기산과의 별도의 반응 및 후속 정제과정 동안에 형성된 염의 분리를 통해서 제조될 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올리에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말리에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 라ㄷ토비오네이트, 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다[참조예: Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19].
주제 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 비독성 유기 또는 무기산으로부터의 화합물의 통상적인 비독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 그러한 통상의 비독성 염은 무기산, 예컨대, 염산, 브롬산, 황산, 설팜산, 인산, 및 질산 등으로부터 유래된 것들; 유기산, 예컨대, 아세트산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 및 이소티온산 등으로부터 제조된 염을 포함한다.
그 밖의 경우에, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 산성 작용기를 함유하는 화합물일 수 있고, 그에 따라서, 약제학적으로 허용되는 염기와의 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 유사하게, 이들 염은 동일반응계 내에서 투여 비히클 중에 또는 용량형 제조 공정 중에 제조될 수 있거나, 유리산 형태의 정제된 화합물을 적합한 염기, 예컨대, 하이드록사이드, 카보네이트, 또는 약제학적으로 허용되는 금속 양이온의 바이카보네이트와, 암모니아와, 또는 약제학적으로 허용되는 유기 일차, 이차 또는 삼차 아민과 별도로 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토금속 염은 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 및 피페라진 등을 포함한다(참조예: 상기 Berge et al의 문헌).
습윤화제, 에멀젼화제 및 윤활제, 예컨대, 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트 뿐만 아니라, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및 향료, 보존제 및 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설페이트, 및 소듐 설파이트 등; (2) 유용성(oil-soluble) 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 및 인산 등을 포함한다.
본 발명의 화합물의 제형은 단위 용량형으로 존재할 수 있으며, 약제 분야에서 잘 공지된 어떠한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 단일 용량형을 생산하기 위해서 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 처리되는 숙주 및 특정의 투여 방식에 따라서 다양할 것이다. 단일 용량형을 생산하기 위해서 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로는 치료 효과를 생성시키는 작용제의 양일 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 제형은, 사이클로덱스트린, 리포좀, 미셀 형성제(micelle forming agents), 예를 들어, 담즙산, 및 폴리머 담체, 예를 들어, 폴리에스테르 및 폴리안하이드라이드를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 부형제; 및 본 발명의 작용제를 포함한다. 특정의 구체예에서, 상기 언급된 제형은 본 발명의 작용제를 경구적인 생체이용 가능하게 한다.
이들 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 본 발명의 화합물을 담체 및 임의의 하나 이상의 보조 성분과 회합되게 하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 경구 투여를 위한 액체 용량형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르(elixir)를 포함한다. 활성 성분에 추가로, 액체 용량형은 본 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대, 물 또는 그 밖의 용매, 가용화제, 및 에멀젼화제, 예컨대, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩 기름, 옥수수 기름, 배아유, 올리브 오일, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 또한 보조제, 예컨대, 습윤화제, 에멀젼화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제, 착색제, 향료 및 보존제를 포함할 수 있다.
활성 화합물에 추가로, 현탁액은 현탁제, 예를 들어, 에톡실화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정상 셀룰로오즈, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천(agar-agar) 및 트라가칸트(tragacanth), 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 캡슐, 카세제(cachet), 알약(pill), 정제, 로젠지(풍미 물질, 일반적으로, 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 분제, 과립의 형태로, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 패스틸(pastille)(불활성 물질, 예컨대, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아를 사용함)로서, 및/또는 구강 세척액 등으로서 존재할 수 있으며, 상기 각각의 제형은 활성 성분으로서 예정된 양의 본 발명의 화합물을 함유한다. 본 발명의 화합물은 또한 환제, 연질약(electuary) 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고체 용량형(캡슐, 정제, 환제, 드라제(dragee), 분제, 및 과립 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및 하기 성분 중 어느 성분과 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대, 전분, 락토오스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로오즈, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; (3) 습윤제(humectant), 예컨대, 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대, 한천, 칼슘 카보네이트, 감자 전분 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정의 실리케이트 및 소듐 카보네이트; (5) 용액 지연제(solution retarding agent), 예컨대, 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대, 사차 암모늄 화합물; (7) 습윤화제(wetting agent), 예컨대, 세틸 알콜, 글리세롤 모노스테아레이트, 및 비-이온성 계면활성제; (8) 흡수제, 예컨대, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 환제의 경우에, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 잇다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한, 락토오스 및 유당(milk sugar)뿐만 아니라, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는, 연질 및 경질-쉘 젤라틴 캡슐에 충전제로서 사용될 수 있다.
정제는, 임으로 하나 이상의 보조 성분과 함께, 타정 또는 성형에 의해서 제조될 수 있다. 타정된 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제(예, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈), 표면활성제 또는 분산제를 사용함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 적합한 기계에서 불활성 액체 희석제로 보습된 분말화된 화합물의 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
정제, 및 본 발명의 약제학적 조성물의 그 밖의 고체 용량형, 예컨대, 드라제, 캡슐, 환제 및 과립은 임의적으로는 코팅 및 쉘(shell), 예컨대, 장용피 및 약제 제형 분야에서 잘 공지된 그 밖의 코팅에 의해서 스코어링되거나 제조될 수 있다. 이들은 또한, 요망되는 방출 특성을 제공하기 위해서 비율을 변화시키는데 있어서의 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈, 그 밖의 폴리머 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어(microsphere)를 사용함으로써 함유된 활성성분의 완만한 방출 또는 조절된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 신속한 방출을 위해서 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 동결 건조될 수 있다. 이들은 박테리아=-보유 필터를 통한 여과에 의해서 또는 살균제를 혼입함으로써 무균수 또는 사용 직전의 일부 그 밖의 무균 주입 가능한 매질 중에 용해될 수 있는 무균의 고형 조성물의 형태로 무균화될 수 있다. 이들 조성물은 또한 임의로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 위장관의 특정 부분에서, 임의로, 지연된 방식으로, 활성 성분(들) 만을 또는 그를 우선적으로 방출시키는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 조성물을 통합하는 예는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다. 활성 물질은 또한, 적절한 경우 상기 기재된 부형제 중 하나 이상과 함께, 미세캡슐화된 형태일 수 있다.
직장 또는 질내 투여를 위한 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 좌제로서 존재할 수 있으며, 그러한 좌제는 본 발명의 하나 이상의 화합물을 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함한 하나 이상의 적합한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 실온에서 고체이지만, 체온에서는 액체이고, 그에 따라서, 직장강 또는 질강에서 용융될 것이고 활성 화합물을 방출할 것이다.
질내 투여에 적합한 본 발명의 제형은 또한 본 기술분야에 적절히 공지된 바와 같은 담체를 함유하는 페서리(pessary), 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼(foam) 또는 스프레이 제형을 포함한다.
본 발명의 국소 또는 경피 투여용의 용량형은 분제, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 무균 조건하에 약제학적으로 허용되는 담체와, 그리고, 어떠한 보존제, 완충제, 또는 요구될 수 있는 경우의 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 젤은 본 발명의 활성 성분에 추가로, 부형제, 예컨대, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 징크 옥사이드 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분제 및 스프레이는, 본 발명의 화합물에 추가로, 부형제, 예컨대, 락토오스, 탈크, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가로 통상의 추진제, 예컨대, 클로로플루오로하이드로카본 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예컨대, 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.
경피 패치는 본 발명의 화합물의 신체로의 제어된 전달을 제공하는 부가의 이점을 지닌다. 그러한 용량형은 적절한 매질에 화합물을 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 흡수 향상제가 또한 피부를 가로지른 화합물의 유입을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 그러한 유입율은 유입율 조절 막을 제공함으로써 또는 폴리머 매트릭스 또는 젤 중에 화합물을 분산시킴으로써 조절될 수 있다.
안내 제형, 안연고(eye ointment), 분제, 및 용액 등이 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 무균의 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 당, 알콜, 항산화제, 완충제, 정균제(bacteriostat), 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질, 또는 현탁제 또는 증점제(thickening agent)를 함유할 수 있는, 사용 직전에 무균의 주입 가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 무균 분말과 함께, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일 및 주입 가능한 유기산 에스테르, 예컨대, 에틸 올리에이트를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우에 요망되는 입자 크기를 유지시킴으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
일부의 경우에, 약물의 효과를 지속시키기 위해서, 피하 또는 근육내 주사로부터의 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 불량한 수용성을 지니는 결정상 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 약물의 흡수 속도는 약물의 용해 속도에 좌우되며, 그러한 용해 속도는 결정의 크기 및 결정형에 좌우될 수 있다. 대안적으로, 비경구-투여된 약물형의 지연된 흡수는 오일 비히클중에 약물을 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.
주입 가능한 데포형(depot form)은 생분해성 폴리머, 예컨대, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 중에 대상 화합물의 마이크로캡슐화 캡슐 매트릭스를 형성시킴으로써 제조된다. 약물 대 폴리머의 비율, 및 사용된 특정의 폴리머의 성질에 따라서, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예를 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 데포 주입 가능한 제형은 또한 약물을 신체 조직과 양립 가능한 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 동반시킴으로써 제조된다.
본 발명의 작용제를 포함하는 예시적인 제형은, 체온에서의 화학적 안정성, 기능적 효율성 방출 시간, 독성 및 최적의 투여량을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아닌, 다양한 성질을 기준으로 하여 결정된다.
본 발명의 제제(preparation)는 경구, 비경구, 국소 또는 직장내로 주어질 수 있다. 이들은 물론 각각의 투여 경로에 적합한 형태로 주어진다. 예를 들어, 이들은 정제 또는 캡슐 형태로, 주입, 흡입, 눈 로션, 연고, 좌제; 주사, 주입 또는 흡입에 의한 투여; 로션 또는 연고에 의한 국소; 및 좌제에 의한 직장내 투여로 투여된다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화물 형태일 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 통상의 방법에 의해서 약제학적으로 허용되는 용량형으로 제형화된다.
본 발명의 치료 방법
본 발명은 단백질병 및, 신경퇴행성 질환을 포함한, 향상된 단백질 파괴가 치료일 수 있는 그 밖의 질환을 치료하는 신규한 치료 방법으로서, 대상자(예, 이를 필요로 하는 대상자)에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
이를 필요로 하는 대상자는, 예를 들어, 단백질병으로 진단된 대상자 또는, 이전의 치료에 내성이었던 대상자를 포함한, 단백질병에 대해서 치료를 받았던 대상자를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 어떠한 단백질병을 치료하기 위해서 이용될 수 있다. 그러한 단백질병의 예는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 대뇌 β-아밀로이드 혈관병(cerebral β-amyloid angiopathy), 망막신경절 세포 퇴화(retinal ganglion cell degeneration), 프리온 질병(prion diseases)(예, 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 쿠루(kuru), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 변형 크로이츠펠트-야콥 병(variant Creutzfeldt-Jakob disease), 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia)), 타우병증(tauopathy)(예, 전두측두엽치매(frontotemporal dementia), 알츠하이머 질환, 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저퇴화(corticobasal degeration), 전두측두엽 퇴행(frontotemporal lobar degeneration)), 전두측두엽 퇴행(frontemporal lobar degeneration), 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 가족성 브리티쉬 치매(familial British dementia), 가족성 대니쉬 치매(Familial Danish dementia), 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis (Iclandic)), 카다실(CADASIL: Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and lekoencephalopathy), 알렉산더병(Alexander disease), 세이피노패시(Seipinopathies), 가족성 아밀로이드 신경병(familial amyloidotic neuropothy), 노인성 전신성 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis), 세르피노패시(serpinopathies), AL 아밀로이드증(AL amyloidosis), AA 아밀로이드증(AA amyloidosis), 제 2형 당뇨병(type II diabetes), 대동맥판막 내측 아밀로이드증(aortic medial amyloidosis), ApoAI 아밀로이드증(ApoAI amyloidosis), ApoII 아밀로이드증(ApoII amyloidosis), ApoAIV 아밀로이드증(ApoAIV amyloidosis), 피니쉬 타입의 가족성 아밀로이드증(familial amyloidosis of the Finish type), 리포자임 아밀로이드증(lysozyme amyloidosis), 피브리노겐 아밀로이드증(fibrinogen amyloidosis), 투석 아밀로이드증(dialysis amyloidosis), 포함체 근육염/근육병(inclusion body myositis/myopathy), 백내장(cataract), 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 심장 심방 아밀로이드증(cardiac atrial amyloidosis), 뇌하수체 프로락틴분비종양(pituitary prolactinoma), 유전성 자각막이상증(hereditary lattice corneal dystrophy), 피부 태선 아밀로이드증(cutaneous lichen amyloidosis), 각막 락토페린 아밀로이드증(corneal lactoferrin amyloidosis), 폐포단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 치원성종양 아밀로이스(odontogenic tumor amylois), 정낭 아밀로이드(seminal vesical amyloid), 낭성섬유증(cystric fibrosis), 낫적혈구병(sickle cell disease), 위험질병 근병증(critical illness myopathy), 폰힙펠-란도우병(von Hippel-Lindau disease), 척수소뇌성 실조증 1(spinocerebellar ataxia 1), 앵겔만 증후군(Angelman syndrome), 거대축삭신경병(giant axon neuropathy), 파제트병 및 전두측두엽 치매성 포함체 근육병(inclusion body myopathy with Paget disease of bone and frontotemporal dementia: IBMPFD)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 대상 약제학적 조성물은 예방 또는 치료 처리의 일부로서 치료 유효량의 혼입된 치료제 또는 다른 물질을 환자에게 전달하기에 충분한 양으로 전달되는 물질 또는 물질들을 포함할 것이다. 작용제의 요망되는 농도는 흡수, 불활성화 및 약물의 방출 속도뿐만 아니라, 화합물의 전달 속도에 좌우될 것이다. 용량 값은 또한 완화시키고자 하는 상태의 중증도에 따라 다양할 것임을 주지해야 한다. 어떠한 특정의 대상의 경우에, 특정 용량 요법이 개별적인 필요 및 조성물의 투여를 관리하고 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라서 시간에 따라 조절되어야 함을 추가로 이해해야 한다. 전형적으로, 투약은 본 분야의 전문가에게는 공지된 기술을 이용하여 결정될 것이다.
대상 제제의 용량은 작용제의 혈장 농도를 참조로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 최대 혈장 농도(Cmax) 및 시간 0에서 무한대(AUC (0-4))까지의 혈장농도-시간 곡선 아래의 면적이 이용될 수 있다. 본 발명을 위한 용량은 Cmax 및 AUC (0-4)에 대한 상기 값을 생성시키는 것들 및 그들 파라미터에 대해서 더 크거나 더 작은 값을 생성시키는 다른 용량을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에 대한 독성 없이 특정의 환자의 요망되는 치료 반응, 조성물 및 투여 방식을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 달성하도록 변화될 수 있다.
선택된 용량 수준은 사용되는 특정의 작용제의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정의 화합물의 분비 또는 대사 속도, 치료 기간, 그 밖의 약물, 사용되는 특정의 화합물과 함께 사용되는 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 치료되는 환자의 이전의 약물 경력을 포함한 다양한 인자에 좌우될 것이며, 유사한 인자가 의료 분야에 잘 공지되어 있다.
본 기술분야에 통상의 지식을 가진 의사 도는 수의사는 유효량의 요망되는 약제학적 조성물을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 요망되는 치료 효과를 달성하고 요망되는 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시키기 위해서 요구된 수준 보다 적은 수준으로 약제학적 조성물 중에 사용된 본 발명의 작용제의 투여량을 처방하고/거나 투여할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 작용제의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 생성시키기에 효과적인 최소 투여량인 작용제의 양일 것이다. 그러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 기재된 인자에 좌우될 것이다.
요망되는 경우, 작용제의 효과적인 일일 투여량은, 임의적으로 단위용량형으로, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상의 분할 투여량으로서 개별적으로 하루에 걸쳐서 적절한 간격으로 투여될 수 있다.
주어진 환자에서의 가장 효과적인 치료를 생성시킬 어떠한 특정의 작용제의 정확한 투여 시간 및 양은 특정의 작용제의 활성, 약동학, 및 생체이용성, 환자의 생리학적 상태(연령, 성별, 질환의 형태 및 단계, 일반적인 신체 상태, 주어진 용량에 대한 반응성, 및 약물의 형태를 포함함), 및 투여 경로 등에 좌우될 것이다. 본원에서 제시된 지침은, 예를 들어, 대상자를 모니터링하고 용량 및/또는 타이밍을 조정하는 것으로 이루어지는 단지 통상의 실험을 필요로 하는 최적의 시간 및/또는 투여량을 측정함으로써, 치료를 최적화하기 위해서 이용될 수 있다.
대상자가 치료되는 동안, 대상자의 건강이 24 시간 동안 미리 결정된 시간에서 관련 지표 중 하나 이상을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 보조제, 양, 투여 시간 및 제형을 포함한 모든 치료 양태가 그러한 모니터링의 결과에 따라서 최적화될 수 있다. 환자는 동일한 파라미터를 측정함으로써 개선 범위를 측정하기 위해서 주기적으로 재평가될 수 있으며, 그러한 첫 번째 재평가는 전형적으로는 치료 개시 후 4주의 말미에서 수행되고, 후속된 재평가는 치료 동안 매 4 내지 8주 마다 수행되고, 그 후 3개월 마다 수행된다. 치료는 몇 개월 동안 또는 또한 수년 동안 계속될 수 있고, 최소 1 개월이 인간의 경우의 전형적인 치료 기간이다. 예를 들어, 투여되는 작용제의 양(들) 및 투여 시간에 대한 조정은 이들 재평가를 기초로 할 수 있다.
치료는 최적의 화합물 투여량보다 적은 용량으로 개시될 수 있다. 그 후, 용량은 최적의 치료 효과가 얻어질 때까지 소량씩 증가될 수 있다. 또한, 독립영양 관련된 유전자 생성물을 조절하는 작용제 및 제 2 작용제, 예를 들어, 자식작용-관련된 질환(autophagy-related disease)의 치료에 유용한 또 다른 작용제의 조합 사용이 어떠한 개별적인 작용제에 대한 요망되는 용량을 감소시킬 수 있는데, 그 이유는 상이한 화합물 및/또는 작용제의 효과 개시 및 기간이 상호보완적일 수 있기 때문이다.
본 발명의 한 가지 양태는 Usp14 단백질을 상기 언급된 화합물(IU1을 포함함) 중 어느 한 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체와 접촉시킴을 포함하여 Usp14 단백질의 탈유비퀴틴화 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포를 상기 언급된 화합물(IU1을 포함함) 중 어느 한 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체와 접촉시킴을 포함하여 세포에서 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상자에게 상기 언급된 화합물(IU1을 포함함) 중 어느 한 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체를 투여함을 포함하여 대상자에서의 단백질병을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 방법으로서, 단백질병이 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 대뇌 β-아밀로이드 혈관병(cerebral β-amyloid angiopathy), 망막신경절 세포 퇴화(retinal ganglion cell degeneration), 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 쿠루(kuru), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 변형 크로이츠펠트-야콥 병(variant Creutzfeldt-Jakob disease), 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia)), 전두측두엽치매(frontotemporal dementia), 알츠하이머 질환, 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저퇴화(corticobasal degeration), 전두측두엽 퇴행(frontotemporal lobar degeneration), 전두측두엽 퇴행(frontemporal lobar degeneration), 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 가족성 브리티쉬 치매(familial British dementia), 가족성 대니쉬 치매(Familial Danish dementia), 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis (Iclandic)), 카다실(CADASIL: Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and lekoencephalopathy), 알렉산더병(Alexander disease), 가족성 아밀로이드 신경병(familial amyloidotic neuropothy), 노인성 전신성 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis), 세르피노패시(serpinopathies), AL 아밀로이드증(AL amyloidosis), AA 아밀로이드증(AA amyloidosis), 제 2형 당뇨병(type II diabetes), 대동맥판막 내측 아밀로이드증(aortic medial amyloidosis), ApoAI 아밀로이드증(ApoAI amyloidosis), ApoII 아밀로이드증(ApoII amyloidosis), ApoAIV 아밀로이드증(ApoAIV amyloidosis), 피니쉬 타입의 가족성 아밀로이드증(familial amyloidosis of the Finish type), 리포자임 아밀로이드증(lysozyme amyloidosis), 피브리노겐 아밀로이드증(fibrinogen amyloidosis), 투석 아밀로이드증(dialysis amyloidosis), 포함체 근육염/근육병(inclusion body myositis/myopathy), 백내장(cataract), 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 심장 심방 아밀로이드증(cardiac atrial amyloidosis), 뇌하수체 프로락틴분비종양(pituitary prolactinoma), 유전성 자각막이상증(hereditary lattice corneal dystrophy), 피부 태선 아밀로이드증(cutaneous lichen amyloidosis), 각막 락토페린 아밀로이드증(corneal lactoferrin amyloidosis), 폐포단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 치원성종양 아밀로이스(odontogenic tumor amylois), 정낭 아밀로이드(seminal vesical amyloid), 낭성섬유증(cystric fibrosis), 낫적혈구병(sickle cell disease), 및 위험질병 근병증(critical illness myopathy)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 기재된 방법 중 어느 방법으로서, 단백질병이 알츠하이머 질환, 전두측두엽 퇴행, 근육위축가쪽경화증 또는 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease)인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 향상된 단백질 파괴가 치료일 수 있는 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 대상자에게 상기 언급된 화합물(IU1을 포함함) 중 어느 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상자에서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 방법으로서, 질환이 폰힙펠-란도우병(von Hippel-Lindau disease), 척수소뇌성 실조증 1(spinocerebellar ataxia 1), 앵겔만 증후군(Angelman syndrome), 거대축삭신경병(giant axon neuropathy),파제트병 및 전두측두엽 치매성 포함체 근육병(inclusion body myopathy with Paget disease of bone and frontotemporal dementia: IBMPFD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상자에게 상기 언급된 화합물(IU1을 포함함) 중 어느 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상자에서 프로테아좀 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상자에게 상기 언급된 화합물(IU1을 포함함) 중 어느 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상자에서의 Tau, TDP-43 또는 아탁신-3(ataxin-3)의 분해를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 방법으로서, 상기 대상자가 인간인 방법에 관한 것이다.
단리된
재구성
프로테아좀
본 발명의 특정의 양태는 효소적 활성 Uch37은 결여되어 있지만, 효소적 활성 Usp14는 포함하는 단리된 프로테아좀에 관한 것이다. 그러한 프로테아좀은 어떠한 적합한 유기체로부터의 프로테아좀일 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 프로테아좀은 포유동물 프로테아좀, 예컨대, 인간 또는 쥐 프로테아좀이다. 그러한 프로테아좀은 효소적 불활성 Uch37을 함유하거나 Uch37이 완전히 결여될 수 있다. 본 발명의 프로테아좀은, 예를 들어, Usp14의 특이적 억제제를 위한 스크리닝 방법에 유용하다. 이에 대해서는, 예를 들어, 본원에서 전체 내용이 참조로 통합되는 국제특허출원 공보 WO 2008/147536 A1를 참조할 수 있다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 프로테아좀은 효소적 불활성 Uch37을 포함한다. Uch37은, 예를 들어, 이의 효소적 부위의 돌연변이를 통해서, Uch37 특이적 억제제에 의한 처리를 통해서, 또는 비-특이적 탈유비퀴틴화효소 억제제에 의한 처리를 통해서(예, 유비퀴틴-비닐설폰에 의한 처리를 통해서)와 같은 방법을 포함한 본 기술분야에 공지된 어떠한 방법을 통해서 불활성화될 수 있다. 유비퀴틴-비닐설폰에 의한 Uch37의 처리는 탈유비퀴틴화효소 효소활성에 불활성인 비닐설폰-Uch37 부가물의 생성을 유도한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 프로테아좀을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 그러한 방법은 Usp14가 결여되었지만 Uch37을 포함하는 프로테아좀을 정제하는 단계, 정제된 프로테아좀을 탈유비퀴틴화효소 억제제로 처리하는 단계, 및/또는 정제된 프로테아좀을 효소적 활성 Usp14로 재구성시키는 단계를 포함한다.
Usp14가 결여되었지만 Uch37을 포함하는 프로테아좀의 정제는 본 기술분야에 공지된 어떠한 적합한 방법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 프로테아좀은 HTBH-태깅된 hRpnl 1을 발현하는 HEK293 세포주로부터 친화성 정제될 수 있다. 세포가 용해되며, 프로테아좀이 NeutrAvidin 한천 수지에 의해서 친화성 정제되어 Usp14가 결여되었지만 Uch37을 함유하는 프로테아좀을 생성시킬 수 있다.
Uch37 특이적 억제제 및 비특이적 탈유비퀴틴화효소 억제제(예, 유비퀴틴-비닐설폰)을 포함한 어떠한 적합한 Uch37 억제제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 프로테아좀을 재구성시키는데 사용되는 활성 Usp14는, 예를 들어, 포유동물 세포로부터 정제된 Usp14 또는 재조합 생성된 Usp14를 포함한 어떠한 적합한 공급원으로부터의 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 프로테아좀을 제공하고, 프로테아좀을 시험 화합물 및 Usp14 기질과 접촉시키고, 시험 화합물이 기질의 탈유비퀴틴화를 억제하는지를 측정함을 포함하여, Usp14의 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
기질의 탈유비퀴틴화는 어떠한 적합한 방법을 직접적으로 또는 간접적으로 이용함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정의 구체예에서, 기질은 탈유비퀴틴화효소에 의한 분열 후에 검출 가능하고/거나 유비퀴틴-의존성 프로테아좀 기질(예, Ub-AMC)인 리포터에 커플링된다. 다른 특정의 구체예에서, 기질의 탈유비퀴틴화는 기질 분해의 억제에 의해서 입증된다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 단리된 프로테아좀, 사용 지시서, 및/또는 Usp14 기질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, Usp14 기질은 Ub-AMC 및/또는 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(polyubiquitinated cyclin B)이다.
실시예
본 발명이 이하 일반적으로 기재될 것이며, 그러한 본 발명은 본 발명의 특정의 양태 및 구체예를 단지 예시하는 목적으로 포함되며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아닌 하기 기재내용을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 것이다.
실시예
1 -- 억제제의 합성
도 29는 본 발명의 피롤을 제조하는 한 가지 방법을 도시하고 있다. 피롤 대신 1,3-디아졸을 형성시킴으로써, 유사한 디아졸 화합물이 제조될 수 있다. 아릴 아민(1a)상의 고리 치환체를 변화시킴으로써 또는 알킬 아민, 헤테로아릴 아민, 아르알킬 아민 등을 치환시킴으로써, 광번위하게 다양한 화합물이 제조될 수 있다. 유사하게, 화합물(1e)가 다수의 친핵체와 반응하여 광범위하게 다양한 화합물을 제공할 수 있다. 도 29에 도시된 화합물에 상응하는 실험 과정이 이하 제공된다.
1-(4- 클로로페닐 )-2,5-디메틸피롤 (1c)의 합성. 아세트산(40mL)중의 화합물(1a) (7.65g, 60.0mmol) 및 화합물(1b) (34.2 g, 300.0 mmol)의 혼합물을 100℃에서 1 시간 동안 가열하고, 이어서, 용매를 증발시키고, 잔류물을 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 화합물(1c)(11.07 g, 수율: 89.8%)를 수득하였다.
2- 클로로 -1-[1-(4- 클로로페닐 )-2,5-디메틸피롤-3-일]에탄-1-온(1e)의 합성. 1,2-디클로로에탄(50 mL)중의 AlCl3 (7.98 g, 60.0 mmol)의 용액에 0℃의 화합물(1d)(6.78 g, 60.0 mmol)을 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 30분 동안 교반하고, 0℃의 1,2-디클로로에탄(50mL) 중의 화합물(1c)((6.17 g, 30.0 mmoL)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 2 시간 동안 실온으로 가온하고, 빙수(20mL)에 부었다. 혼합물을 디클로로메탄 (15 mL x 3)으로 추출하고, MgS04로 건조시키고, 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 화합물(1e), 3.37g 수율 39.9%를 얻었다.
1-[1-(4- 클로로페닐 )-2,5-디메틸피롤-3-일]-2- 피페리딜에탄 -1-온(1)의 합성. 아세토니트릴(10mL) 중의 화합물(1e)(85 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (61 mg, 0.6 mmol)의 용액에 화합물(1f)(28 mg, 0.33 mmol))를 첨가하였다. 1 시간 동안 환류 가열한 후에, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 디클로로메탄(30mL)에 용해시키고, 포화 NaHCO3(10 mL)로 세척하고, MgS04로 건조시키고, 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 화합물(1)(83 mg, 수율: 83.8%)을 수득하였다. LC/MS: 331.1 (M+1)+. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.45-7.49 (2H, dd), 7.10-7.13 (2H, dd), 6.39 (2H, ds), 3.56(2H, s), 2.53-2.56 (4H, m), 2.30 (3H, s), 1.98 (3H, s), 1.62-1.70 (4H, m), 1.44-1.49 (2H, m).
실시예
2 -
Usp14
는 기질
탈유비퀴틴화를
매개한다.
Usp14가 인간 프로테아좀의 효능있는 억제제인지의 여부를 시험하기 위해, 검출가능한 수준의 탈유비퀴틴화효소 Usp14가 결핍된 프로테아좀을 발생시키는 정제 절차를 개발하였다(문헌[Wang et al ., (2007), Biochemistry, 46, 3553-3565]으로부터 변형됨). 간단히, 인간 프로테아좀을 HTBH-태깅된 hRpn11을 갖는 안정적인 HEK293 세포주로부터 대규모로 친화성-정제시켰다. 세포를 프로테아제 억제제를 함유하는 용해 완충액(50 mM NaH2P04 [pH 7.5], 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mM ATP, 및 1 mM DTT)에서 다운스-균질화(Dounce-homogenization)시켰다. 용해물을 정화시킨 후, 4℃에서 밤새 NeutrAvidin 아가로오스 수지(Thermo Scientific)와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 비드를 과량의 용해 완충액으로 세척한 후, 세척 완충액(50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 1 mM MgCl2 및 1 mM ATP)으로 세척하였다. VS-프로테아좀에 대해, 1 내지 1.5 μM의 Ub-VS(Boston Biochem)를 수지에 첨가하고, 2시간 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 잔여 Ub-VS를 적어도 20 베드(bed) 부피의 세척 완충용액으로 비드를 세척함으로써 제거하였다. 26S 프로테아좀을 TEV 프로테아제(Invitrogen)를 이용한 절단에 의해 비드로부터 용리시켰다.
이러한 프로테아좀 정제 절차를 이용하여, 인간 프로테아좀을 HEK293 세포의 hRpn11-태깅된 세포주로부터 친화성-정제시켰다. Usp14가 결핍되어 있으나, 관련 탈유비퀴틴화효소 Uch37을 함유하는 프로테아좀의 정제를 항-Usp14 및 항-Uch37 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다(도 1의 A 및 도 1의 B 각각). 정제된 Usp14-비함유 프로테아좀(26S 프로테아좀으로도 기재됨)은 유비퀴틴-비닐설폰을 이용한 프로테아좀의 처리에 의해 비가역적으로 억제될 수 있는 탈유비퀴틴화 활성의 높은 수준을 유지하였다(Ub-VS, Yao et al ., (2006) Nat. Cell Biol., 8, 994-1002). Ub-VS는 티올 프로테아제 부류 탈유비퀴틴화 효소의 활성 부위에 위치하는 Cys 아미노산을 이용하여 부가물을 형성시킴으로써 기질의 탈유비퀴틴화를 억제한다. 도 1의 B에서 증명되는 바와 같이, 26S 프로테아좀으로의 Ub-VS의 첨가는 모든 검출가능한 Uch37와 함께 형성되는 효소적으로 비활성인 VS-Uch37 부가물을 발생시켰다.
순수한 재조합 Usp14 효소를 생성시키기 위해, GST-Usp14(WT 및 C114A 변이체)를 이. 콜라이(E. coli) 균주 Rosetta 2(DE3) 세포(Novagen)에서 발현시켰다. 배양물을 OD600이 0.6 내지 0.8에 도달할때까지 37℃에서 성장시키고, 실온에서 1 mM IPTG를 이용하여 밤새 발현을 유도시켰다. 이후, 세포를 프로테아제 억제제를 함유하는 PBS 중에 수거하였고, 프렌치 프레스(French press)로 용해시켰다. 정화된 용해물을 1시간 동안 4℃에서 GST 세파로오스 4B 수지(GE Healthcare)와 함께 인큐베이션시킨 후, 과량의 PBS로 세척한 후, 100 mM NaCl을 함유하는 PBS로 세척하였다. GST 모이어티(moiety)를 실온에서 3시간 동안 분해 완충액(50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 및 0.1% 2-머캅토에탄올) 중의 트롬빈에 의해 제거시켰다. 프로테아좀 결합 검정을 위한 GST-태깅된 Usp14 단백질을 용리시키고, 용리 완충액(50 mM Tris-HCl [pH 8.0] 중 10 mM 환원 글루타티온)을 이용하여 트롬빈을 분해시켰다.
Ub-VS 처리로 인해 내인성 탈유비퀴틴화 활성이 결핍된, 상기 기재된 억제된 "VS-프로테아좀"을 재조합 Usp14를 이용하여 성공적으로 재구성시켰다(도 2). Ub-AMC 가수분해 검정을 1 nM의 Ub-VS 처리된 인간 프로테아좀(VS-프로테아좀) 단독, 400nM의 Usp14 단독, 또는 4 또는 40 nM의 재조합 Usp14 단백질로 재구성된 VS-프로테아좀으로 수행하였다. 상기 기재된 바와 같이, VS-프로테아좀의 탈유비퀴틴화 활성은 거의 완전히 억제되었다(도 3). 대조적으로, 재구성된 Usp14/VS 프로테아좀은 실질적인 탈유비퀴틴화 활성을 나타내었다(도 3). 사실, Usp14/VS 프로테아좀은 분리된 Usp14 단독의 활성에 비해 Ub-AMC 가수분해 활성에서의 800배의 증가를 나타내었다(도 3). 따라서, Usp14의 효소 활성은 이의 프로테아좀과의 복합체화에 의해 증가된다. 따라서, Ub-AMC 검정은 재구성의 성공이 추적되는 것을 가능케 한다.
재구성된 Usp14-프로테아좀 복합체에 의한 Ub-AMC 가수분해의 동역학을 시험하기 위해 Ub-AMC 검정을 또한 이용하였다. 다양한 양의 Usp14로 재구성된 Usp14/VS 프로테아좀에 의한 Ub-AMC 가수분해를 30분의 기간에 걸쳐 모니터하였다(도 4). 이러한 검정의 결과의 분석은 프로테아좀에 대한 Usp14의 친화성이 약 4 nM임을 나타내었다.
실시예
3 -
Usp14
는
프로테아좀
분해를 억제한다.
유비퀴틴화된 기질의 분해에 대한 Usp14의 효과를 유비퀴틴-의존성 프로테아좀 기질 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B(Ubn-ClnB)를 이용한 시험관내 분해 검정을 이용하여 시험하였다. 이러한 실험에서, Ubn-ClnB를 야생형 또는 촉매적으로 비활성인 Usp14(60 nM)를 함유하는 인간 프로테아좀(4 nM)과 함께 인큐베이션시켰다. 이러한 검정에 이용된 촉매적으로 비활성인 Usp는 탈유비퀴틴화에 대한 Usp14의 활성 부위에서의 돌연변이를 함유하는 Usp14-C114A였다. 특히, 야생형 Usp14 및 Usp14-C114A 둘 모두는 26S 포유동물 프로테아좀에 결합할 수 있다(도 2). 도 5에서 입증된 바와 같이, Usp14는 사이클린 B의 분해를 강하게 억제하는 반면, Usp14의 활성 부위 돌연변이는 억제 효과를 거의 나타내지 않았다. 활성 부위 돌연변이에 의한 Ubn-ClnB 분해의 억제의 결핍은 야생형 Usp14의 유비퀴틴 사슬 트리밍 활성이 프로테아좀 분해의 Usp14의 억제에 필요한 것을 나타낸다. 또한, 사이클린 B로부터의 유비퀴틴 그룹의 광범위한 트리밍이 야생형 Usp14를 함유하는 샘플에서의 면역블롯 분석에 의해 명백하였으나, 촉매적으로 비활성인 Usp14가 사용된 경우에 이는 거의 제거되었다(도 5).
인간 세포에서의 Tau 분해에 대한 Usp14의 효과를 인간 세포주 HEK293에서 관찰하였다. Tau를 외인성의 야생형 또는 촉매적으로 비활성인 Usp14와 함께 공동 발현시키고, Tau 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. 야생형 Usp14의 발현은 인간 세포주에서 Tau를 안정화시켰으나, 효소적으로 비활성인 Usp14는 그렇지 않았다(도 6). 사실, HEK293 세포에서의 효소적으로 비활성인 Usp14의 발현은 Tau 분해를 촉진시켰다(도 6의 B). 이러한 현저한 음성 효과는 프로테아좀으로부터의 내인성의 야생형 Usp14의 전위를 반영할 수 있다. 이러한 가설은 N-말단 UBL 도메인이 결핍된 Usp14의 돌연변이 형태(Usp14-ΔUBL)를 이용하여 확인되었다. N-말단 UBL 도메인(도 6의 A)은 Usp14 상의 주요 프로테아좀-결합 부위이다. UBL의 결실은 현저한 음성 효과를 감쇠시켰고(도 7), 이는 프로테아좀 결합이 상기 효과의 매개에 필요한 것을 나타낸다.
Usp14의 짧은 형태(SF)는 Usp14의 N-말단 유비퀴틴-유사 도메인과 이의 촉매 도메인 사이에 접합부(junctional) 엑손(엑손 4)이 결핍된 mRA로부터 발현되는 내인성 Usp14 스플라이스이다(Wilson et al ., (2002), Nat. Genet., 32, 420-425; 도 6의 A). Usp14의 촉매적으로 비활성인 돌연변이와 마찬가지로, Usp14-SF는 HEK293 세포에서 Tau 안정성에 대한 현저한 음성 효과를 나타내었다(도 6의 A). 이는 Usp14-SF가 Usp14의 내인성 억제제일 수 있음을 암시한다. 이러한 가능성과 일치하게, Usp14-SF는 프로테아좀에 결합할 수 있으나, 야생형 효소와는 달리, 이는 프로테아좀 결합에 의해 효소적으로 활성화되지 않는다(도 7).
실시예
4 -
Usp14
의 특이적 억제제
상기 입증된 바와 같이, Usp14에 의한 프로테아좀에서의 사슬 트리밍은 유비퀴틴-의존성 단백질분해 경로에서 중요한 조절 단계이다. 따라서, 프로테아좀 기능의 인핸서를 확인하기 위해, 소분자 Usp14 억제제에 대한 고-처리량 스크린을 재조합 Usp14로 재구성된 VS-프로테아좀을 이용하여 수행하였고, Ub-AMC로 검정하였다(도 8).
화합물을 384-웰 저-부피 플레이트에서 Usp14/26S 억제에 대해 이중으로 스크리닝하였다. 로버스트 Z-스코어(robust Z-score) 방법으로 데이터 처리를 수행하였고, 각각의 화합물을 Spotfire 소프트웨어를 이용하여 플로팅하였다. Z > 5의 컷오프를 초과하는 화합물은 대부분 자가형광이었고, 따라서 계수하지 않았다. AMC 형광에만 영향을 미치는 켄칭 화합물을 배제시키기 위해, AMC 아민의 켄칭에 대해 312개의 주요 히트(hit)를 시험하였고, 순수한 켄처(quencher)를 위(false)-양성으로 스코어링하였고, 추가 분석으로부터 배제시켰다(도 8의 B). 고-처리량 스크린에서 분석된 63,052개의 화합물 중, 215개를 Usp14의 진정한 억제제로 확인하였다.
Usp14를 특이적으로 억제하나, 일반적 탈유비퀴틴화효소 억제제가 아닌 화합물을 확인하기 위해, 215개의 히트 화합물을 탈유비퀴틴화 효소의 패널에 대해 역스크리닝(counterscreen)하였다. Usp14의 활성을 억제하나, 임의의 다른 시험된 탈유비퀴틴화효소가 아닌 히트 화합물 중에서, 1-[1-(4-플루오로페닐)-2,5-디메틸피롤-3-일]-2-피롤리딘-1-일에타논(IU1, 도 9)을 추가 분석을 위해 선택하였다.
실시예
5 -
IU1
에 의한
Usp14
의 특이적 억제
특정 Usp14 억제제 IU1에 대해 추가 연구를 수행하였다(도 10). 음성 대조군으로 제공하기 위해, Usp14 탈유비퀴틴화효소를 억제하지 않거나(도 10의 B), 프로테아좀 기능을 향상시키는(도 10의 C) "IU1C"(도 9의 B)로 명명된 IU1과 구조적으로 유사한 화합물을 또한 확인하였다.
인간 기원의 8개의 탈유비퀴틴화 효소의 활성을 억제하는 능력을 시험함으로써 Usp14에 대한 IU1의 특이성을 결정하였다. 도 11 및 9의 C에서 관찰되는 바와 같이, 프로테아좀-결합된 Usp14의 효능있는 억제제임에도 불구하고, IU1은 Uch37을 포함하는 다른 시험된 탈유비퀴틴화 효소를 유의하게 억제하는데 실패하였다. 도 9의 E는 IU1이 Uch37의 프로테아좀-결합된 형태를 억제하지 않는 것을 나타낸 것을 주목하라. 또한, IU1은 프로테아좀에 로딩되지 않은 Usp14의 활성을 억제하는데 또한 실패하였고(도 9의 D), 이는 IU1이 Usp14의 프로테아좀-결합된, 활성화된 형태를 특이적으로 억제하는 것을 나타낸다.
프로테아좀에 대한 Usp14의 결합이 Usp14 활성을 향상시킴에 따라, IU1이 Usp14/프로테아좀 상호작용을 방해함으로써 Usp14 활성을 억제하는 것이 가능하였다. 따라서, 프로테아좀에 결합하는 Usp14의 능력을 방해하는 IU1의 능력을 시험하였다. 정제된 인간 프로테아좀을 다양한 농도의 IU1의 존재 또는 부재하에서 재조합 Usp14와 함께 인큐베이션하였다. 도 12에서 관찰되는 바와 같이, IU1은 Usp14의 프로테아좀과의 복합체화를 길항시키지 않았으며, 이는 IU1의 억제 활성이 Usp14/프로테아좀 복합체의 형성의 억제 결과가 아닌 것을 나타낸다.
Usp14의 IU1 억제의 가역성을 다음으로 검정하였다. Usp14/프로테아좀 복합체에 IU1을 처리한 후, 3회 이하로 Micron-YM3 필터로 원심분리시켰다. 각각의 회전 후, 단백질 복합체를 탈유비퀴틴화효소 활성에 대해 시험하였다. 도 13에서 입증되는 바와 같이, Usp14의 활성은 원심분리 후에 복귀되었고, 이는 IU1에 의한 Usp14의 억제가 신속히 가역적임을 나타낸다. 이러한 관찰과 일치하게, IU1 억제된 Usp14의 질량분석법 분석은 임의의 공유적 IU1-Usp14 부가물을 검출하는데 실패하였다.
IU1의 Usp14 억제 활성을 45분(도 14의 A) 또는 30분(도 14의 B) 동안 다양한 농도의 IU1으로 처리된 Usp14/26S 프로테아좀 복합체에 대한 2개의 독립적 IC50 곡선을 발생시킴으로써 추가로 정량하였다. 각각의 실험의 데이터 플롯을 NIH 화학 유전체학 센터(NIH Chemical Genomics Center)로부터의 지침을 기초로 하여 4개의 파라미터의 기호논리학적 모델(Hill-slope 모델)로 적합화시켰다. 이러한 실험의 결과는 IU1의 IC50 값이 2-5 μM임을 나타내었다(도 14).
실시예 3에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, 사이클린 B를 IU1이 프로테아좀 복합체에 의한 유비퀴틴 사슬의 트리밍에 영향을 미치는 지의 여부를 시험하기 위한 기질로 사용하였다. 기질 분해로부터 사슬 트리밍을 분리시키기 위해, 프로테아좀 억제제의 존재하에서 상기 검정을 수행하였다. 프로테아좀 억제제의 효과는 상기 검정에서 변형되지 않은 사이클린 B의 축적에 의해 입증된다(도 15). Usp14가 결핍된 프로테아좀을 시험하는 경우, IU1은 사이클린 B로부터의 유비퀴틴 사슬의 방출에 거의 영향을 미치지 못하거나 영향을 미치지 않았고(도 15), 이는 프로테아좀에 대한 또 다른 탈유비퀴틴화 효소 Rpn11에 의해 매개되는 것으로 보인다. 그러나, Usp14의 첨가시, 프로테아좀 복합체에 의한 사슬 트리밍은 강하게 향상되었으며, 이는 사이클린 B의 유비퀴틴화된 형태의 증가된 전기영동 이동성으로부터 명백하다. Usp14/프로테아좀 복합체로의 IU1의 추가 첨가는 상기 효과를 역전시켰고, Usp14가 결핍된 프로테아좀 복합체의 수준과 유사한 수준으로 사슬 트리밍을 감소시켰다(도 15).
IU1이 프로테아좀에 의한 기질 분해의 인핸서로 작용할 수 있는지의 여부를 다음으로 시험하였다. 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여, 시험관내 Ubn-ClnB 분해 검정을 수행하였으나, 이번에는 34 μM IU1의 존재 또는 부재하에서 수행하였다. Usp14가 결핍된 프로테아좀으로의 IU1의 첨가는 기질 분해 또는 사슬 트리밍에 영향을 미치지 않았다. 상기 기재된 결과로부터 확인되듯이, 프로테아좀 복합체로의 Usp14의 첨가는 사슬 트리밍을 향상시켰고, 기질 분해를 크게 억제하였다. IU1의 첨가는 Ub-사이클린 B 분해에서 Usp14-함유 프로테아좀의 활성을 자극하였고, 유비퀴틴 사슬 트리밍을 억제하였다(도 16).
실시예
6 -
IU1
의 세포 진입
상기 기재된 IU1 실험을 시험관내에서 수행하였다. IU1가 생체내에서 프로테아좀 분해를 향상시키기 위해, IU1이 세포로 진입할 수 있는 것이 필요하다. 이를 시험하기 위해, 세포로의 IU1의 진입을 역상 C18 컬럼을 갖는 Agilent 시리즈 1200 LC/6130 시스템을 이용하여 전기분무 질량분석법에 의해 검정하였다. IU1을 다양한 기간 동안 50 μM으로 MEF에 첨가하였다. 세포 용해물을 수거하고, 질량분석법 샘플을 제조하기 위해 에틸 아세테이트 추출을 이용하였다. 0시간, 1시간 및 24시간에서의 LC/MS 트레이스(trace)의 이온 수(301에서의 m/z)가 제시된다(도 17). 이러한 검정은 50 μM로 배지에 첨가되는 경우 IU1이 1시간까지 세포 내에서 약 19 μM의 항정-상태 농도에 도달하고, 실험 시간 경과에 걸쳐 대략 동일한 수준을 유지한 것을 나타내었다(도 17 및 18). 2일 내내 연장된 유사한 결과가 독립된 UV 흡수 검정을 이용하여 수득되었다(도 19). 또한, 적어도 2일 동안 배지에서 IU1 농도가 유지되었다. 이러한 결과는 IU1이 세포 및 표준 배지 둘 모두에서 안정적인 화합물임을 나타낸다.
실시예
7 -
IU1
에 의한
생체내
프로테아좀
분해의 향상
IU1이 살아있는 세포에서 프로테아좀 기능을 향상시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, Tau를 MEF 세포에서 발현시킨 후, 25 내지 100 μM의 농도로 IU1을 처리하였다. 특히, Tau 및 LacZV5 발현의 36시간 후, MEF 세포를 6시간 동안 0, 25, 50, 75 또는 100 μM의 IU1과 함께 인큐베이션시켰다. 도 21의 A에서 관찰되는 바와 같이, IU1은 시험된 모든 농도에서 Tau 수준을 감소시켰다. Tau mRNA 수준에 대해 효과가 관찰되지 않았다(도 21의 B).
단백독성(proteotoxic) 메커니즘과 관련된 다른 단백질을 또한 시험하였다. 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, TDP-43(전두측두엽 변성증 및 근육위축가쪽경화증과 관련됨), 아탁신(ataxin)-3(마카도-조셉병과 관련됨) 및 아교세포섬유산성단백질(GFAP, 알렉산더병과 관련됨)이 IU1 처리 후에 세포로부터 유사하게 고갈된 것을 입증하였다(도 22의 A-C). 다른 한편으로, IU1은 유비퀴틴-독립적 프로테아좀 기질인 GFP-ODC의 생체내 분해에 대해 거의 효과가 없거나 효과가 없었다. 계속하여, 이러한 결과는 유비퀴틴-매개된 프로테아좀 분해의 일반적 인핸서임을 나타낸다.
산화된 단백질은 인간 건강에서 중요한 역할을 하는 프로테아좀 기질의 또 다른 부류를 형성한다. 해로운 산화된 단백질이 노화시에 축적되고, 이는 다양한 연령-관련 질병 및 장애와 관련된다(Stadtman (2006) Protein oxidation and aging. Free Radic. Res. 40, 1250-1258; Ahmed et al. (2007) Protein oxidative modifications and replicative senescence of WI-38 human embryonic fibroblasts. Ann. NY Acad. Sci., 1119, 88-96; Moskovitz et al. (2001). Methionine sulfoxide reductase (MsrA) is a regulator of antioxidant defense and lifespan in mammals. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, 12920-12925.). 단백질 산화를 세포를 메나디온으로 처리함으로써 유도시켰고, 산화된 종을 단백질 카르보닐에 특이적인 항체를 이용하여 시각화시켰다. 특히, MEF를 4시간 동안 비히클 또는 75 μM IU1과 함께 예비인큐베이션시킨 후, 45분 동안 63 μM 메나디온으로 처리하였다. 세포를 용해시키고, 용해물을 DNPH와 함께 인큐베이션시키고, 산화된 단백질에 대한 검정을 위해 항-DNPH 항체로 면역블로팅시켰다. 미처리된 세포보다 IU1으로 처리된 세포에서 산화된 단백질의 축적이 감소되었다(도 23). 프로테아좀 억제제 PS-341이 IU1과 함께 첨가되는 경우, IU1의 효과가 제거되었고, 이는 IU1이 산화 반응을 방지하는 것이 아니라, 오히려 산화된 단백질의 프로테아좀 분해를 향상시키는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 활성산소종에 의해 손상된 단백질의 분해에 대한 Usp14-억제된 유비퀴틴-의존성 메커니즘이 존재하는 것을 나타낸다. 메나디온은 세포에 대해 독성이고, IU1 처리는 HEK293 세포에서 상기 독성을 충분히 감소시켰으며(도 30), 이는 단백질이 세포에서의 산화 손상의 중요한 표적이라는 가설을 강하게 뒷받침한다. IU1은 또한 관련되지 않은 산화제, 과산화수소의 독성을 감소시켰다(데이터는 제시되지 않음). Usp14에 대해 비활성인 IU1 변이체인 IU1C는 메나디온 세포독성을 감소시키는데 실패하였다(데이터는 제시되지 않음). 중요하게는, 이러한 실험은 IU1이 단백독성 스트레스 동안 세포 생존을 촉진시킬 수 있는 것을 나타낸다.
실시예
8 - 세포 증식 및 생활력에 대한
IU1
의 효과
세포 생활력에 대한 IU1의 효과를 MTT 검정에 의해 다음으로 시험하였다. IU1을 다양한 농도로 MEF, HEK293 및 HeLa 세포에 첨가한 후, IU1 인큐베이션 6, 12, 24 또는 48시간 후에 MTT 용액을 첨가하였다. 세포 생활력에 대한 효과는 Tau, TDP-43, 아탁신-3, 및 산화된 단백질의 분해를 향상시키는데 필요한 용량을 훨씬 초과하는 100 μM 초과의 농도에서 명백해졌다(도 21-23). 또한, IU1은 TUNEL 검정에 의해 평가시 MEF 세포에서 아폽토시스를 현저하게 유도하지 않았다(도 31a 내지 도 31n).
다양한 농도의 IU1에 노출된 MEF(도 28) 및 293 세포의 세포 증식을 실시간으로 현미경검사로 측정하였다. 이러한 검정의 결과는 120 μM에서 세포 증식에 있어서 단지 약간의 억제를 나타내었으나, 더 낮은 농도에서 명백한 억제를 나타내지 않았다(도 28). 상기 제시된 세포 생활력 검정의 결과와 함께 고려할 때, Usp14에 의한 유비퀴틴 사슬 트리밍의 IU1의 억제는 세포 기능을 총체적으로 손상시키지 않는 것을 나타낸다.
균등물
본 발명은 부분적으로 프로테아좀에 의한 단백질 전환의 향상 방법, 및 프로테아좀 기질, 유비퀴틴-프로테아좀 경로의 업스트림 구성요소 또는 프로테아좀 자체를 수반하는 질병의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예가 논의되었으나, 상기 명세서는 예시적인 것이며, 이로 제한하는 것이 아니다. 본 발명의 많은 변화는 본 발명의 명세서의 개관시 당업자에게 명백해질 것이다. 첨부된 청구항은 상기 모든 구체예 및 변화를 청구하고자 하는 것이 아니고, 본 발명의 완전한 범위는 청구항과 함께 청구항의 동등부의 완전한 범위, 및 명세서와 함께 명세서의 변화를 참조로 하여 결정되어야 한다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는, 각각의 개별적 간행물 또는 특허가 참조로서 포함되는 것으로 특별히 개별적으로 지시되는 것과 마찬가지로 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 불일치 시, 본원의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선될 것이다.
Claims (108)
- 하기 화학식(II)로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그(prodrug), 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체:
상기 식에서, 각각의 경우에 독립적으로,
A는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 또는 바이아릴이고;
R1은 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 저급 알콕시, 할로 또는 트리플루오로메틸이고;
Z는 =C(R8)-, =C(R2)- 또는 =N-이고;
R2는 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 저급 알콕시, 할로 또는 트리플루오로메틸이거나;
Z가 =C(R2)-인 경우, 두 개의 R2가 함께
또는 헤테로아릴이고;
Y가 -CH2NR3R4, -CH2(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nNH(알킬), -CH2NH(CH2)nN(알킬)2, -CH2NH(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2N(알킬)(CH2)nNH(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬)2, -CH2N(알킬)(CH2)n(N-헤테로사이클릴), -CH2NH(CH2)nO(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nO(알킬), -NR3R4, -NR5NR6R7, 또는 -NR5(N-헤테로사이클릴)이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
R3은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R4는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R5는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R7은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R8은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아르알킬이고;
R9는 알킬이거나; 두 개의 R9가 이들이 결합된 질소와 함께 N-헤테로사이클릴 기이고;
R10은 수소, 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로, 트리플루오로메틸, 설폭시메틸, 설폰아미도, 아미노, 아미도, N-헤테로사이클릴, 아미노알킬, 아미도알킬, 또는 N-헤테로사이클릴알킬이며,
단, A가 4-플루오로페닐이고, R1이 메틸이고, R2가 메틸이고, X가이고, Y가 -CH2(피페리딘-1-일)인 경우에, Z가 =C((H)-이 아니고; A가 4-메틸페닐이고, R1이 메틸이고, R2가 메틸이고, X가
이고, Y가 -CH2(4-메틸피페리딘-1-일)인 경우에, Z가 =C((H)-이 아니다.
- 제 1항에 있어서, A가 아릴 또는 헤테로아릴인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 카르보사이클릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 포르밀, 알킬카르보닐, 할로알킬카르보닐, 플루오로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 카르복시, 알콕시카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 플루오로알콕시카르보닐, 알케닐옥시카르보닐, 알키닐옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 할로알킬카르보닐옥시, 플루오로알킬카르보닐옥시, 알케닐카르보닐옥시, 알키닐카르보닐옥시, 아미노, 아미도, 아지도, 아미노설포닐, 아미노설피닐, 시아노, 니트로, 포스피닐, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 및 메틸렌 또는 에틸렌 부분을 통해서 헤테로사이클릴 기에 결합된 상기 치환기 중 어느 치환기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 페닐, 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 또는 피리미딘-2-일인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 페닐인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 2 위치에서 치환된(오르토 치환된) 페닐인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가또는
인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 3 위치에서 치환된(메타 치환된) 페닐인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가또는
인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 4 위치에서 치환된(파라 치환된) 페닐인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가
인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 치환기로 2 및 4 위치에서 치환된 페닐인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 4 위치에서 임의로 치환된 피리딘-2-일인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 4 위치에서 임의로 치환된 피리미딘-2-일인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 바이아릴인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가 알킬, 할로, 할로알킬, 플루오로알킬, 하이드록시, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알킬옥시, 아미노, 아지도, 시아노, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 4-(페닐)펜-1-일 또는 4-(2-피리디닐)펜-1-일인 화합물.
- 제 1항에 있어서, A가인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 알킬, 할로알킬 또는 플루오로알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸, 할로메틸 또는 플루오로메틸인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 에틸, 할로에틸 또는 플루오로에틸인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 알킬, 할로알킬 또는 플루오로알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 메틸, 할로메틸 또는 플루오로메틸인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 에틸, 할로에틸 또는 플루오로에틸인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 수소이고, R2가 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 알킬이고, R2가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸이고, R2가 메틸인 화합물.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 에틸이고, R2가 에틸인 화합물.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 =C(R8)-이고, R8이 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 =C(R8)-이고, R8이 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 =N-인 화합물.
- 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 =C(R2)-이고, 두 개의 R2가 함께인 화합물.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, X가인 화합물.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, X가인 화합물.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, X가
인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4이고, R4가 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4이고, R4가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 수소이고, R4가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NR3R4이고, R3이 알킬이고, R4가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, Y가
인 화합물. - 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알콕시, 아미노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 -CH2(N-헤테로사이클릴)인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알콕시, 아미노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 -CH2(피페리딘-1-일), -CH2(피페라진-1-일), -CH2(헥사하이드로피리미딘-1-일), -CH2(모르폴린-1-일) 또는 -CH2(1,3-옥사지난-3-일)인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시, 플루오로알콕시, 아미노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 치환기로 임의로 치환된 -CH2(피페리딘-1-일) 또는 -CH2(피페라진-1-일)인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가
인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NH(CH2)nNH(알킬), -CH2NH(CH2)nN(알킬)2, -CH2NH(CH2)nN(알킬렌), -CH2N(알킬)(CH2)nNH(알킬), -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬)2 또는 -CH2N(알킬)(CH2)nN(알킬렌)인 화합물.
- 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH2NH(CH2)nO(알킬) 또는 -CH2N(알킬)(CH2)nO(알킬)인 화합물.
- 제 52항 또는 제 53항에 있어서, n이 1인 화합물.
- 제 52항 또는 제 53항에 있어서, n이 2인 화합물.
- 제 52항 또는 제 53항에 있어서, n이 3인 화합물.
- 제 52항 또는 제 53항에 있어서, n이 4인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가
인 화합물. - 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4이고, R3이 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4이고, R3이 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4이고, R4가 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4이고, R4가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4이고, R3이 수소이고, R4가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR3R4이고, R3이 알킬이고, R4가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR5NR6R7 또는 -NR5(N-헤테로사이클릴)인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR5NR6R7 이고, R5가 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR5NR6R7 이고, R5가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR5NR6R7 이고, R5가, R6 및 R7이 독립적으로 수소 또는 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR5(N-헤테로사이클릴)이고, R5가 수소인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -NR5(N-헤테로사이클릴)이고, R5가 알킬인 화합물.
- 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, Y가
인 화합물.
- 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체:
상기 식에서, W는 메틸, 플루오로, 클로로, 니트로, 메톡시, 에톡시, -S02NH2 또는 -C(=0)NH2이다. - 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- Usp14 단백질을, 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체와 접촉시킴을 포함하여 Usp14 단백질의 탈유비퀴틴화 활성(deubiquitination activity)을 억제하는 방법.
- 세포를, 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체와 접촉시킴을 포함하여 세포에서의 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 향상시키는 방법.
- 대상자에게 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 제 74항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의 단백질병을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제 77항에 있어서, 단백질병이 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 대뇌 β-아밀로이드 혈관병(cerebral β-amyloid angiopathy), 망막신경절 세포 퇴화(retinal ganglion cell degeneration), 프리온 질병(prion diseases)(예, 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 쿠루(kuru), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 변형 크로이츠펠트-야콥 병(variant Creutzfeldt-Jakob disease), 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia)), 타우병증(tauopathy)(예, 전두측두엽치매(frontotemporal dementia), 알츠하이머 질환, 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저퇴화(corticobasal degeration), 전두측두엽 퇴행(frontotemporal lobar degeneration)), 전두측두엽 퇴행(frontemporal lobar degeneration), 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 가족성 브리티쉬 치매(familial British dementia), 가족성 대니쉬 치매(Familial Danish dementia), 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis (Iclandic)), 카다실(CADASIL: Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and lekoencephalopathy), 알렉산더병(Alexander disease), 세이피노패시(Seipinopathies), 가족성 아밀로이드 신경병(familial amyloidotic neuropothy), 노인성 전신성 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis), 세르피노패시(serpinopathies), AL 아밀로이드증(AL amyloidosis), AA 아밀로이드증(AA amyloidosis), 제 2형 당뇨병(type II diabetes), 대동맥판막 내측 아밀로이드증(aortic medial amyloidosis), ApoAI 아밀로이드증(ApoAI amyloidosis), ApoII 아밀로이드증(ApoII amyloidosis), ApoAIV 아밀로이드증(ApoAIV amyloidosis), 피니쉬 타입의 가족성 아밀로이드증(familial amyloidosis of the Finish type), 리포자임 아밀로이드증(lysozyme amyloidosis), 피브리노겐 아밀로이드증(fibrinogen amyloidosis), 투석 아밀로이드증(dialysis amyloidosis), 포함체 근육염/근육병(inclusion body myositis/myopathy), 백내장(cataract), 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 심장 심방 아밀로이드증(cardiac atrial amyloidosis), 뇌하수체 프로락틴분비종양(pituitary prolactinoma), 유전성 자각막이상증(hereditary lattice corneal dystrophy), 피부 태선 아밀로이드증(cutaneous lichen amyloidosis), 각막 락토페린 아밀로이드증(corneal lactoferrin amyloidosis), 폐포단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 치원성종양 아밀로이스(odontogenic tumor amylois), 정낭 아밀로이드(seminal vesical amyloid), 낭성섬유증(cystric fibrosis), 낫적혈구병(sickle cell disease), 위험질병 근병증(critical illness myopathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 77항에 있어서, 단백질 병이 알츠하이머병, 전두측두엽 퇴행, 근육위축가쪽경화증 또는 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease)인 방법.
- 대상자에게 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 제 74항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의, 증진된 단백질 분해가 치료적일 수 있는 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제 80항에 있어서, 질병이 폰 히펠-린다우 질환(von Hippel-Lindau disease), 척수소뇌성 실조증 1(spinocerebellar ataxia 1), 앵겔만 증후군(Angelman syndrome), 거대축삭신경병(giant axon neuropathy), 골파제트병과 전두측두엽 치매를 동반하는 봉입체 근육병(inclusion body myopathy with Paget disease of bone and frontotemporal dementia: IBMPFD)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 대상자에게 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 제 74항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의 프로테아좀 기능을 향상시키는 방법.
- 대상자에게 제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항의, 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 IU1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 프로드러그, 화학적으로 보호된 형태, 거울상이성질체 또는 입체이성질체, 또는 제 74항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 대상자에서의 Tau, TDP-43 또는 아탁신-3(ataxin-3)의 분해를 증가시키는 방법.
- 제 77항 내지 제 83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 인간인 방법.
- 효소 불활성 Uch37을 포함하며 효소 활성 Usp14를 추가로 포함하는, 단리된 프로테아좀.
- 제 85항에 있어서, 상기 프로테아좀이 비닐설폰-Uch37 부가물을 포함하는 프로테아좀.
- 제 85항에 있어서, 상기 Usp14가 재조합 단백질인 프로테아좀.
- 제 85항에 있어서, 상기 프로테아좀이 인간 프로테아좀 또는 귀과 동물(murine) 프로테아좀인 프로테아좀.
- 효소 활성 Usp14를 포함하고, 효소 활성 Uch37이 결여되어 있는, 단리된 프로테아좀.
- 제 89항에 있어서, 상기 Usp14가 재조합 단백질인 프로테아좀.
- 제 89항에 있어서, 상기 프로테아좀이 인간 프로테아좀 또는 귀과 동물 프로테아좀인 프로테아좀.
- 효소 불활성 Uch37을 포함하며 효소 활성 Usp14를 추가로 포함하는 프로테아좀을 생성시키는 방법으로서,
(a) Usp14이 결여되어 있지만 Uch37을 포함하는 프로테아좀을 정제하고,
(b) 상기 정제된 프로테아좀을 탈유비퀴틴화효소(deubiquitinase) 억제제로 처리하고,
(c) 상기 정제된 프로테아좀을 효소 활성 Usp14로 재구성시킴을 포함하는 방법. - 제 92항에 있어서, 상기 프로테아좀이 인간 프로테아좀 또는 귀과 동물 프로테아좀인 방법.
- 제 92항에 있어서, Usp14는 결여되어 있지만 Uch 37을 포함하는 상기 프로테아좀이 HEK293 세포로부터 정제되는 방법.
- 제 92항에 있어서, 상기 탈유비퀴틴화효소 억제제가 유비퀴틴-비닐설폰인 방법.
- 제 92항에 있어서, 상기 활성 Usp14는 재조합적으로 생산되는 방법.
- Usp14의 억제제를 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 효소적 불활성 Uch37를 포함하며 효소적 활성 Usp14를 추가로 포함하는 프로테아좀을 제공하고,
(b) 상기 프로테아좀을 시험 화합물 및 Usp14 기질과 접촉시키고,
(c) 상기 시험 화합물이 상기 기질의 탈유비퀴틴화를 억제하는지를 측정함을 포함하는 방법. - 제 97항에 있어서, 상기 기질이 탈유비퀴틴화효소에 의한 분열 후에 검출 가능한 리포터에 커플링되는 방법.
- 제 98항에 있어서, 상기 기질이 Ub-AMC인 방법.
- 제 97항에 있어서, 상기 기질이 유비퀴틴-의존성 프로테아좀 기질인 방법.
- 제 100항에 있어서, 상기 기질의 탈유비퀴틴화가 기질 분해의 억제에 의해서 입증되는 방법.
- 제 101항에 있어서, 상기 기질이 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B인 방법.
- 제 97항에 있어서, 상기 프로테아좀이 비닐설폰-Uch37 부가물을 포함하는 방법.
- 제 97항에 있어서, 상기 Usp14가 재조합 단백질인 방법.
- 제 97항에 있어서, 상기 프로테아좀이 인간 프로테아좀 또는 귀과 동물 프로테아좀인 방법.
- 제 85항 내지 제 91항 중 어느 한 항의 단리된 프로테아좀 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
- 제 106항에 있어서, Usp14 기질을 추가로 포함하는 키트.
- 제 107항에 있어서, 상기 Usp14 기질이 Ub-AMC 또는 폴리유비퀴틴화된 사이클린 B인 키트.
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