KR20120046018A - Real time pcr detection of single nucleotide polymorphisms - Google Patents

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KR20120046018A
KR20120046018A KR20110100028A KR20110100028A KR20120046018A KR 20120046018 A KR20120046018 A KR 20120046018A KR 20110100028 A KR20110100028 A KR 20110100028A KR 20110100028 A KR20110100028 A KR 20110100028A KR 20120046018 A KR20120046018 A KR 20120046018A
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제이슨 옵디케
존 하비
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삼성테크윈 주식회사
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Abstract

PURPOSE: A real-time PCR detection method for single nucleotide polymorphism is provided to ensure quick and accurate detection. CONSTITUTION: A real-time PCR detection method for polymorphism in a target DNA comprises: a step of providing a test sample to test the target DNA with polymorphism; a step of providing amplification primer and annealing a first primer to the upstream of location of polymorphism and a second primer to the downstream of location of polymorphism; a step of proving a probe containing detectable label, DNA, and RNA nucleic acid sequence.

Description

단일 뉴클레오티드 다형성의 실시간 PCR 검출{Real time PCR detection of single nucleotide polymorphisms} Real-time PCR detection of single nucleotide polymorphisms {Real time PCR detection of single nucleotide polymorphisms}

본 특허출원은 2010년 10월 7일자로 제출된, 미국 가특허출원 제61/390,701호 및 2011년 6월 13일자로 제출된, 미국 특허출원 제13/158,593호에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 참조에 의해 전체로서 본 명세서에 삽입된다. This patent application claims priority to US Patent Application No. 13 / 158,593 No. submitted submitted on October 7, 2010. US Patent Application No. 61 / 390,701 calls and June 2011, 13, and his content of which is inserted herein in its entirety by reference.

본 개시는 SNP-특이적 CataCleaveTM 프로브를 사용한 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 실시간 PCR 검출을 기술한다. This disclosure describes the real-time PCR detection of single nucleotide polymorphisms (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) using the SNP- specific probes CataCleaveTM.

인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project, HGP)의 완성은 특정한 인간 개체군 내에서의 유전적 다양성, 및 다양성이 유전적 질환(genetic disease)의 발병 또는 소인(predisposition)과 어떻게 관련되는지에 대한 보다 우수한 이해를 가능하게 하였다. The completion of the Human Genome project (Human Genome Project, HGP) has an excellent understanding of how genetic diversity, and diversity within specific human populations how related to the onset or predisposition (predisposition) of genetic diseases (genetic disease) It made possible. 예를 들면, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)로 지칭되는, 개체들 간의 단일 뉴클레오티드 차이는, 일부 상황에서는 누가 특정한 질환을 앓을 것인지, 또는 누가 상기 질환에 대한 특별한 치료에 반응할 것인지를 예측할 수 있는, 표현형에 있어서의 극적인 차이에 대한 원인일 수 있다. For example, a single nucleotide difference between the object, referred to as single nucleotide polymorphisms (SNP) are, in some situations, who will suffer a particular disease, or who can predict whether or not to respond to a particular treatment for the disease phenotype dramatic may be the reason for the difference in the. 약물유전체학(pharmacogenomics)의 범위는 의학적 치료가 환자의 유전적 구성(genetic make-up)에 맞춤화되는 신속한 접근방법이다. Range of pharmacogenomics (pharmacogenomics) is a rapid approach to medical treatment that is tailored to the genetic makeup (genetic make-up) of the patient. 환자의 DNA에서 유전적 돌연변이의 신속하고 신뢰할 만한 검출은, 의사의 임상적 진단 및 의학적 치료의 선택의 지침을 제공할 수 있다. Rapid and reliable detection of interest in the genetic mutations in the DNA of patients, can provide guidance in the selection of clinical diagnosis and medical attention. 이는 발암 유전자(oncogene)의 코딩 영역(coding region) 내의 분리 돌연변이(discrete mutation)의 존재가 암 감수성(susceptibility) 및 예후의 강력한 예측자일 수 있는, 종양학(oncology)에서 특히 사실이다. This is especially true in the presence of mutations in the coding region separated (discrete mutation) may Giles strong predictor of cancer susceptibility (susceptibility) and Prognosis, Oncology (oncology) in (coding region) of the cancer gene (oncogene).

예를 들면, BRCA 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene) 내 유해한 돌연변이의 존재에 대한 유전자 검사는, 이제 대부분의 의료 행위에 있어서 통상적이다. For example, a genetic test for the presence of a harmful mutation BRCA tumor suppressor genes (tumor suppressor gene), now used is generally in most medical care. 유해한 BRCA-1 돌연변이는, 낮은 연령에서는 (폐경 전) 여성의 유방암 및.또는 난소암의 발병 위험, 및 자궁경부암, 자궁암, 췌장암, 및 대장암의 발병 위험을 크게 증가시킬 수 있다. Harmful BRCA-1 mutation, the younger (premenopausal) can greatly increase the risk of breast cancer in women and in or at risk of developing ovarian cancer, and cervical cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, and colon cancer. 유해한 BRCA2 돌연변이는 추가적으로 췌장암, 위암, 담낭암 및 담도암, 및 흑색종의 위험을 증가시킬 수 있다. Harmful BRCA2 mutations can increase the risk of further cancer, stomach cancer, gallbladder and bile duct cancer, and melanoma. TP53 , PTEN , STK11 / LKB1 , CDH1 , CHEK2 , ATM , MLH1 , 및 MSH2 를 포함하는, 여러 다른 유전자들의 돌연변이가 유전성(hereditary) 유방 종양 및/또는 난소 종양과 관련이 있었다. TP53, PTEN, STK11 / LKB1, CDH1, CHEK2, a mutation of the ATM, several different genes, including the MLH1, MSH2, and was associated with genetic (hereditary) breast cancer and / or ovarian tumor.

핵산 증폭의 출현으로, 임의의 DNA 서열 중 단일 분자만큼 작은 것이라도, SNP 서열 분석을 가능하게 하기에 충분한 횟수로 복제될 수 있다. With the advent of nucleic acid amplification, would also as little as a single molecule in any of the DNA sequences may be replicated a sufficient number of times to enable the SNP sequence analysis. SNP는 DNA 서열분석(DNA sequencing), 형광 프로브 검출(fluorescent probe detection), 질량 분광분석(mass spectrometry) 또는 DNA 마이크로어레이 혼성화(DNA microarray hybridization) (예를 들면, 미국 등록특허 제5,885,775호; 제6,368,799호)와 같은, 다양한 기법들에 의해 검출될 수 있다. SNP is a DNA sequence analysis (DNA sequencing), the fluorescent probe detection (fluorescent probe detection), mass spectrometry (mass spectrometry), or a DNA microarray hybridization (DNA microarray hybridization) (e.g., U.S. Patent No. 5,885,775 - Ho; claim 6,368,799 such as a call), it can be detected by a variety of techniques. 이 방법들 중 다수가, 전반적인 불량한 민감도(sensitivity), 비용, 시간 지출 또는 후-PCR 처리(post-PCR processing)의 필요성으로 인해, 높은 출원 처리량에도 불구하고 불충분한 상태이다. This is how a number of the overall due to the poor sensitivity (sensitivity), cost, the need to spend time or -PCR treatment (post-PCR processing) after a sufficient, even though the high throughput application state. 현존하는 SNP 검출 방법은 또한, 허용할 수 없는 높은 수준의 위양성(false positive) 및/또는 위음성(false negative) 결과를 나타낸다. Existing SNP detection method further shows an unacceptable high level of false positives (false positive) and / or false negative (false negative) results.

전술한 이유들로 인해, DNA 증폭과 동시에 수행되는, SNP의 정확한 실시간 검출에 대한 충족되지 않은 요구가 당해 기술분야에 존재한다. Because of the aforementioned reasons, the unmet needs for accurate, real-time detection of the SNP, are performed at the same time as DNA amplification are present in the art.

DNA 및 RNA 서열를 포함하는 특이적 프로브를 사용하는, 실시간 PCR 동안 SNP의 신속한 검출을 위한 방법 및 키트가 개시된다. The DNA and RNA containing specific seoyeolreul using the probe, a method for the rapid detection of the SNP for a real-time PCR, and kits are provided. 상기 방법은 비용 효율이 높고 신뢰할만한 방법으로, 단일 PCR 단편 상의 하나 이상의 SNP의 고처리율 검출(high throughput detection)을 촉진하도록 보장한다. A remarkable way the method is highly reliable, cost-effective, and ensures to facilitate high-throughput detection (high throughput detection) of at least one SNP on a single PCR fragment.

일 구체예에서, 다형성을 갖는 타겟 DNA의 존부에 대해 시험할 샘플을 제공하는 단계, 제1 증폭 프라이머가 상기 다형성 위치(position of the polymorphism)의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 상기 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인, 상기 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머(amplification primer) 쌍을 제공하는 단계, 검출가능한 표지(label), 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 타겟 DNA서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고(entirely complementary), 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인(substantially complementary) 것인 단계, 상기 프로브 내의 RNA 서열이, 다형성을 포함하는 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA In one embodiment, the step of providing a sample to be tested for the presence or absence of the target DNA having a polymorphic, the first amplification primer that are annealed to an upstream side of the polymorphic position (position of the polymorphism), the second amplification primer comprises the polymorphic position a phosphorus to anneal to the downstream, providing the amplification primers capable of annealing to the target DNA (amplification primer) pairs, a detectable label (label), and DNA and RNA nucleic acid sequences by the steps of: providing a probe including , RNA nucleic acid sequences of the probes are targeted completely complementary (entirely complementary) to a selected portion of the DNA sequence containing the polymorphism, DNA nucleotide sequence of the probe is substantially complementary to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the target DNA sequence (substantially complementary) to the step, the RNA sequence within the probe, complementary RNA and DNA sequences in the PCR fragment containing the polymorphism :DNA 이형이중가닥(heteroduplex)을 형성할 수 있는 조건 하에서, 증폭 폴리머라제(amplifying polymerase) 활성, 증폭 완충액(amplification buffer); : Under conditions capable of forming a double-stranded DNA releasing (heteroduplex), the amplifying polymerase (amplifying polymerase) activity, a buffer amplifier (amplification buffer); RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 사이의 PCR 단편을 증폭시키는 단계, 및 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 신호의 증가는 타겟 DNA 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출을 위한 방법이 개시된다. Under RNase H present in the active and the probe, comprising the step, and the step of detecting the real-time increase in the signal emitted from the marker on the probe to amplify a PCR fragment between the first and second amplification primers, the increase in the signal It is disclosed a method for real-time detection of a target DNA within a polymorphism that indicates the presence of a polymorphism in the target DNA.

일 양태에서, 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가는 상기 RNA:DNA 이형이중가닥 내의, 프로브의 RNA 서열의 RNase H 절단에 기인한다. Due to, RNase H cleavage of the RNA sequence of the probe in the double stranded DNA release: In one aspect, the real-time increase in the signal emitted from the label on the probe the RNA.

또다른 구체예에서, 다형성을 갖는 타겟 DNA의 존부에 대해 시험할 샘플을 제공하는 단계, 제1 증폭 프라이머가 상기 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 상기 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인, 상기 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계, 검출가능한 표지, 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 다형성 위치에서 야생형(wild type) DNA 서열을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계, 상기 프로브 내의 RNA 서열이, 다형성을 포함하는 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조 In still other embodiments, the step of providing a sample to be tested for the presence or absence of the target DNA having a polymorphic, and the first amplification primer annealing upstream of the polymorphic position, the second amplification primer that anneals downstream of the polymorphic position that is, the method comprising: providing an amplification primer pair capable of annealing to the target DNA, a detectable label, and the DNA and a step of providing a probe comprising a RNA nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequence of the probe is in the polymorphic position wild-type (wild type) and completely complementary to a selected region of the target DNA sequence comprising a DNA sequence, DNA nucleotide sequence of the probe is substantially complementary to the phase, the probe to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the target DNA sequence tank capable of forming a double-stranded DNA release: in the RNA sequence complementary to the DNA sequences and RNA in, PCR fragment containing the polymorphism 하에서, 증폭 폴리머라제 활성, 증폭 완충액; Under, the amplifying polymerase activity, an amplification buffer; RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 사이의 PCR 단편을 증폭시키는 단계, 및 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 감소를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 신호의 감소는 타겟 DNA 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출을 위한 방법이 개시된다. Under RNase H present in the active and the probe, a decrease in detecting a first and a second amplification stage for amplifying a PCR fragment between the primers, and real-time reduction of the signal emitted from the marker on the probe, and the signal It is disclosed a method for real-time detection of a target DNA within a polymorphism that indicates the presence of a polymorphism in the target DNA.

또다른 구체예에서, RNA 타겟을 제공하는 단계, 상기 RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로, 제1 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 하류에 어닐링하는 것인 단계; In still other embodiments, the step of providing a RNA target, a method comprising: providing an amplification primer pair capable of annealing to the cDNA of the RNA target, the first amplification primer and the annealing upstream of the polymorphic sequence position, the second amplification primer the step is to anneal downstream of the polymorphic sequence position; 검출가능한 표지, 및 상기 RNA 타겟의 cDNA에 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 예상(suspected) SNP 서열 위치의 상응하는 cDNA 서열에 완전히 상보적인 것인 단계; Detectable label, and the corresponding cDNA sequence of the RNA by the method comprising: providing a probe which substantially comprises a complementary DNA and RNA nucleic acid sequences in the cDNA of the target, RNA nucleic acid sequence of the probe was estimated (suspected) SNP sequences located completely complementary will step; 역전사 효소(reverse transcriptase) 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액, 부위-특이적(site-specific) RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 및 상기 프로브 내의 RNA 서열이, RT-PCR DNA 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 사이의 역전사 효소-PCR 단편을 증폭시키는 단계; RT enzyme (reverse transcriptase) activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase buffer -PCR, site-specific (site-specific) The RNase H activity and RNA sequences in the presence of a probe, and the probe, the RT-PCR DNA fragment complementary DNA sequences and RNA within comprises: under the conditions capable of forming a double-stranded DNA releasing, reverse transcriptase -PCR amplification the fragment between the first and second amplification primers; 및 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 신호의 증가는 RNA 타겟의 cDNA 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, RNA 타겟 내 다형성의 실시간 검출을 위한 방법이 개시된다. And a step of detecting the real-time increase in the signal emitted from the marker on the probe, an increase of the signal is the start for a, Real-time Detection of polymorphic RNA target would indicate the presence of polymorphisms in the RNA target cDNA do.

일 양태에서, 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가는, 상기 RNA:DNA 이형이중가닥 내의, 프로브의 RNA 서열의 RNase H 절단에 기인한다. In one aspect, the real-time increase in the signal emitted from the label on the probe, the RNA: DNA and release due to, RNase H cleavage of the RNA sequence of the probe in the double strand.

또다른 구체예에서, 다형성을 갖는 RNA 타겟에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계, 상기 RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인 단계, 검출가능한 표지, 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 cDNA의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계, 역전사 효소 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액, RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 및 상기 프로브 내의 RNA 서열이, 다형성 위치에서 야생형 DNA In yet another embodiment, a method comprising: providing a sample to be tested for RNA target having the polymorphism, the method comprising: providing an amplification primer pair capable of annealing to the cDNA of the RNA target, the upstream of the first amplification primer comprises the polymorphic position annealing, and the second amplification primer comprises a step of providing a probe comprising the steps of to anneal downstream of the polymorphic site, a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequences, RNA nucleic acid sequences of the probes are wild type at the polymorphic position and completely complementary to a selected region of the cDNA, DNA nucleotide sequence of the probe is substantially complementary to the phase, reverse transcriptase activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the cDNA containing the DNA sequence -PCR in the presence of a buffer, RNase H activity and the probe, and the RNA sequence within the probe, the wild-type DNA at the polymorphic position 열을 포함하는 RT-PCR DNA 단편 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 사이의 역전사 효소-PCR 단편을 증폭시키는 단계, 및 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 감소를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 신호의 감소는 RNA 타겟 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, RNA 타겟 내 다형성의 실시간 검출을 위한 방법이 개시된다. Complementary sequence and the RNA in the RT-PCR DNA fragment containing the open: under conditions capable of forming a double-stranded DNA releasing the step of amplifying the reverse transcriptase -PCR fragment between the first and second amplification primers, and the detecting a reduction in the real-time signal from the release of the cover on the probe, and the decrease of the signal is a method for the, real-time detection of a polymorphism in RNA target would indicate the presence of a polymorphism in the target RNA is disclosed.

또다른 구체예에서, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인, 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍, 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브, 및 증폭 폴리머라제 활성, 증폭 완충액; In another embodiment, the first amplification primer and the annealing upstream of the polymorphic position, the second amplification primer polymorphic in to anneal downstream of the location, the amplification primers capable of annealing to a target DNA, a detectable label and a DNA and a probe comprising a RNA nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the target DNA sequence comprising a polymorphism, DNA nucleotide sequence of the probe is a DNA sequence adjacent to a selected portion of the target DNA sequence in substantially complementary to the probe, and the amplifying polymerase activity, an amplification buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출을 위한 키트(kit)가 개시된다. The kit (kit) for real-time detection of a polymorphism in the target DNA, including and RNase H activity are provided.

또다른 구체예에서, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인, 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍, 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브, 및 증폭 폴리머라제 활성, 증폭 완충액; In another embodiment, the first amplification primer and the annealing upstream of the polymorphic position, the second amplification primer polymorphic in to anneal downstream of the location, the amplification primers capable of annealing to a target DNA, a detectable label and a DNA and a probe comprising a RNA nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the target DNA sequence containing the wild-type DNA sequence at the polymorphic position, DNA nucleotide sequence of the probe is selected in the target DNA sequence substantially complementary to the probe to the DNA sequence adjacent to the region, and amplifying polymerase activity, an amplification buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출을 위한 키트가 개시된다. The RNase H activity and the target DNA Kit for Real-Time Detection of polymorphisms, including starts.

또다른 구체예에서, 제1 증폭 프라이머는 다형성 서열(polymorphic sequence) 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 하류에 어닐링하는 것인, RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍, 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 cDNA의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브, 및 역전사 효소 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액; In another embodiment, the first amplification primer comprises the polymorphic sequence (polymorphic sequence) anneals to the upstream of the position, and the second amplification primer which, amplification can be annealed to the cDNA of the RNA target to anneal downstream of the polymorphic sequence position primer pairs, a detectable label and a DNA and a probe comprising a RNA nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the cDNA including the polymorphism, DNA nucleotide sequence of the probe is selected portion of the cDNA substantially complementary to the probe, and reverse transcriptase activity, an amplification polymerase activity in the DNA sequence adjacent to, reverse transcriptase -PCR buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, RNA 타겟 내의 다형성의 실시간 검출을 위한 키트가 개시된다. And an RNase H activity, kits for real-time detection of a polymorphism in RNA target containing a is started.

또다른 구체예에서, 제1 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 하류에 어닐링하는 것인, RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍, 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 cDNA의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브, 및 역전사 효소 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액; In another embodiment, the first amplification primer and the annealing upstream of the polymorphic sequence position, the second amplification primer which, amplification primers capable of annealing to the cDNA of the RNA target to anneal downstream of the polymorphic sequence position detection a probe including the possible covers, and DNA and RNA nucleic acid sequences, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected portion of the cDNA containing the wild-type DNA sequence at the polymorphic position, DNA nucleotide sequence of the probe is selected in the cDNA substantially complementary to the probe to the DNA sequence adjacent to the site, and reverse transcriptase activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase -PCR buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, RNA 타겟 내의 다형성의 실시간 검출을 위한 키트가 개시된다. And an RNase H activity, kits for real-time detection of a polymorphism in RNA target containing a is started.

상기 다형성은 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)일 수 있다. The polymorphism may be a single nucleotide polymorphism (single nucleotide polymorphism, SNP).

상기 타겟 DNA는 게놈 DNA(genomic DNA)일 수 있다. The target DNA may be a genomic DNA (genomic DNA). 상기 타겟 RNA는 게놈 RNA 또는 mRNA 전사체(transcript)일 수 있다. The target RNA can be genomic RNA or mRNA transcript (transcript).

상기 프로브의 DNA 및 RNA 서열은 공유 결합될 수 있다. DNA and RNA sequence of the probe can be covalently attached.

상기 프로브 상의 검출가능한 표지는 FRET 쌍과 같은, 형광 표지(fluorescent label)일 수 있다. A detectable label on the probe may be a FRET pair, such as, a fluorescent label (fluorescent label). 상기 PCR 단편 또는 프로브는 고체 지지체(solid support) 상에 결합된 것일 수 있다. The PCR fragment or probe can be bound to a solid support (solid support).

상기 증폭 폴리머라제 활성은, 열안정성 DNA 폴리머라제일 수 있고, 상기 부위-특이적 RNase H 활성은 열안정성 RNase H의 활성 또는 핫 스타트(hot start) 열안정성 RNase H 활성일 수 있다. The amplified polymerase activity is thermostable DNA polymerase may be the best, the site-may be a specific RNase H activity of the active or hot start (hot start) of a thermostable RNase H thermostable RNase H activity.

특정한 구체예에서, 상기 역전사 효소 및 증폭 폴리머라제 활성은 동일한 분자에서 발견된다. In certain embodiments, the reverse transcriptase and amplifying the polymerase activity is found in the same molecule.

전술된 구체예들은, 타겟 핵산에서 실시간으로 SNP의 존재를 검출하는 능력을 포함한, 다수의 이점을 갖는다. The above-described embodiments are, including the ability to detect the presence of a SNP in a target nucleic acid in real time, and has a number of advantages. 상기 검출 방법은 신속하고, 정확하며, 고처리율(high throughput) 적용에 적합하다. The detection method is quick, accurate, and is suitable for applying high-throughput (high throughput). 상이한 유전자좌(genetic loci)에서의 SNP 검출을 위한, 편리하고, 사용하기 쉽고, 신뢰할만한 진단 키트(diagnostic kit)가 또한 개시된다. Different loci (genetic loci) easy to use and convenient, for SNP detection, and at, the trusted diagnostic kit worth (diagnostic kit) is also disclosed.

숙련된 기술자는 하기 설명된 도면들은 단지 예시의 목적이라는 것을 이해할 것이다. The figures are explained to the skilled technician will appreciate that the purpose of illustration only. 상기 도면들은 어떠한 방식으로든지 본 교시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. The drawings are not intended to in any way whatsoever to limit the scope of the present teachings.
도 1은 살모넬라 ( Salmonella ) invA 유전자에서 야생형 타겟의 등온적 검출(isothermal detection)을 도시한다. Figure 1 in the Salmonella (Salmonella) invA gene showing the isothermal detection (isothermal detection) of the wild-type target. 정확하게 짝지어진 경우 (야생형 프로브 : 야생형 타겟) 형광 강도의 증가가 관찰되나, 부정확하게 짝지어진 경우 (야생형 프로브 : SNP 포함 타겟) 형광 강도의 증가는 관찰되지 않는다. If correctly paired (wild-type probe: target wild-type), but the observed increase in fluorescence intensity, if built incorrectly paired (wild-type probes comprising SNP target) increase in fluorescence intensity was not observed.
도 2는 살모넬라 invA 유전자에서 SNP 타겟 (T에서 G 염기로의 변화)의 등온적 검출을 도시한다. Figure 2 shows the isothermal detection of SNP target (change to a G base in the T) in the Salmonella invA gene. 정확하게 짝지어진 경우 (SNP 프로브 : SNP 타겟) 형광 강도의 증가가 관찰되나, 부정확하게 짝지어진 경우 (SNP 프로브 : 야생형 타겟) 형광 강도의 증가는 관찰되지 않는다. If correctly paired (SNP probe: target SNP) when built in, but the observed increase in fluorescence intensity, incorrectly paired (SNP probe: target wild-type), an increase in fluorescence intensity was not observed.
도 3은 살모넬라 invA 유전자에서 야생형 타겟의 멀티플렉스 실시간 검출(multiplex real time detection)을 도시한다. Figure 3 illustrates a real-time multiplex detection (multiplex real time detection) of the wild-type target from the invA gene of Salmonella. 동형접합(homozygous) 야생형 타겟 또는 이형접합(heterozygous) 야생형-SNP 타겟의 존재시 형광 강도의 증가가 관찰된다. The homozygous (homozygous) increase in fluorescence intensity in the presence of wild type target or heterozygous (heterozygous) -SNP wild-type target is observed. 동형접합 SNP 타겟의 존재시, 형광 강도의 증가는 관찰되지 않는다. In the presence of homozygous SNP target, the increase in fluorescence intensity was not observed.
도 4는 SNP 감지용 프로브(SNP sensing probe)를 사용한, 살모넬라 invA 유전자에서 SNP 타겟의 멀티플렉스 실시간 검출을 도시한다. Figure 4 SNP detection probe (SNP sensing probe), showing the multiplex real-time detection of the SNP in the target Salmonella invA gene used for the. 동형접합 SNP 타겟 또는 이형접합 SNP-야생형 타겟의 존재시, 형광 강도의 증가가 관찰된다. The homozygous or heterozygous SNP target SNP- presence of, an increase in the fluorescence intensity of wild-type target is observed. 동형접합 야생형 타겟의 존재시, 형광 강도의 증가는 관찰되지 않는다. In the presence of a homozygous wild-type target, the increase in the fluorescence intensity is not observed.
도 5는 A1 b 카제인(casein)의 등온적 검출을 도시한다. Figure 5 shows the isothermal detection of A1 b-casein (casein). 정확하게 짝지어진 경우 (A1 프로브 : A1 타겟) 형광 강도의 증가가 관찰되나, 부정확하게 짝지어진 경우 (A1 프로브 : A2 타겟) 형광 강도의 증가는 관찰되지 않는다. If correctly paired (A1 probe: target A1), but if observing the increase in the fluorescence intensity, was built incorrectly match (A1 probe: A2 targets) increase in fluorescence intensity it is not observed.
도 6은 A2 b 카제인의 등온적 검출을 도시한다. Figure 6 shows the isothermal detection of b-casein A2. 정확하게 짝지어진 A2 프로브 : A2 타겟에서 형광 강도의 증가가 관찰되나, 부정확하게 짝지어진 A2 프로브 : A1 타겟의 경우 형광 강도의 증가가 관찰되지 않는다. Correctly paired probe A2: A2 target an increase in fluorescence intensity, but observed, which was built incorrectly paired probe A2: does case of A1 target an increase in fluorescence intensity is observed.
도 7은 A1 감지용 프로브를 사용한, A1 b 카제인의 멀티플렉스 실시간 검출을 도시한다. Figure 7 illustrates a real-time multiplex detection of A1 b-casein, with the A1 sensing probe. 동형접합 A1 타겟 또는 이형접합 A1-A2 타겟의 존재시 형광 강도의 증가가 관찰된다. Is homozygous or heterozygous target A1 A1-A2 increase in fluorescence intensity in the presence of the target is observed. 형광 강도의 증가는 동형접합 A2 타겟의 존재시에는 관찰되지 않는다. Increase of fluorescence intensity was not observed when the presence of a homozygous A2 targets.
도 8은 A2 감지용 프로브를 사용한, A2 b 카제인의 멀티플렉스 실시간 검출을 도시한다. Figure 8 illustrates a real-time multiplex detection of b-casein A2, using the probe for detection A2. 동형접합 A2 타겟 또는 이형접합 A1-A2 타겟의 존재시 형광 강도의 증가가 관찰된다. Is homozygous or heterozygous target A2 A1-A2 increase in fluorescence intensity in the presence of the target is observed. 형광 강도의 증가는 동형접합 A1 타겟의 존재시에는 관찰되지 않는다. Increase of fluorescence intensity was not observed when the presence of a homozygous A1 target.
도 9는 도면 및 실시예에서 사용된, 모든 PCR 프라이머, 프로브, 및 타겟을 기술한 표이다. 9 is a technical cost, all the PCR primers, probes, and targets used in the figures and examples displayed. SNP의 위치들이 밑줄로 표시되어 있다. Location of the SNP are indicated as underlined.
도 10은 파이로코커스 푸리오시스( Pyrococcus FIG. 10 is a pie Caucus Puri Osis (Pyrococcus furiosis ), furiosis), 파이로코커스 호리코시( Pyrococcus Caucus No. pie Rico City (Pyrococcus horikoshi ), 써모코커스 코다카렌시스 ( Thermococcus kodakarensis), 아르케오글로부스 프로푼두스 ( Archeoglobus horikoshi), Thermo Lactococcus coder Karen sheath (Thermococcus kodakarensis), Douce (Archeoglobus booth Pro extracted with ahreuke Ogle profundus ), 아르케오글로부스 풀기디스( Archeoglobus profundus), solve booth to display ahreuke Ogle (Archeoglobus fulgidis ), 써모코커스 셀레르 ( Thermococcus celer ) 및 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus fulgidis), Thermococcus celer (Thermococcus celer) and Thermococcus litoralis (Thermococcus litoralis ) RNase HII 폴리펩티드 서열들 간의 서열 배치(sequence alignment)를 도시한다. litoralis) RNase HII is shown a sequence alignment (sequence alignment) between the polypeptide sequence.
도 11은 해모필러스 인플루엔자( Haemophilus Figure 11 is a brush to Russ influenza (Haemophilus influenzae ), 써머스 써모필러스( Thermus influenzae), Thermo sseomeoseu filler's (Thermus thermophilis ) , 써머스 아쿠아티쿠스( Thermus thermophilis), sseomeoseu aqua tee Syracuse (Thermus acquaticus ), 살모넬라 엔테리카( Salmonella acquaticus), Salmonella Entebbe Rica (Salmonella enterica ) 및 아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ) RNase HI 폴리펩티드 서열들 간의 서열 배치를 도시한다. shows a sequence alignment between enterica) and Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens) RNase HI in the polypeptide sequence.

본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 경우, 당해 기술분야 내의 통상의 분자 생물학적 기법을 사용한다. The practice of the present invention, unless otherwise noted, the use of conventional molecular biological techniques in the art. 그와 같은 기법들은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. Techniques such are well known to the skilled artisan and are fully described in the literature. 예를 들면, Ausubel 등에 의한, 모든 보조자료(supplement)를 포함한, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2008); For example, all the auxiliary data (supplement), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2008), including due to Ausubel; Sambrook 등에 의한, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)을 참조한다. Caused by Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, see NY (1989).

달리 정의되지 않는 경우, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. If not defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by the skilled in the art. 본 명세서는 또한 본 출원의 개시내용 및 청구범위의 해석을 돕기 위한, 용어들의 정의를 제공한다. This specification also provides a definition of a, the terms to assist the interpretation of the disclosure and claims of the present application. 이 정의가 다른 곳에서의 정의와 일치하지 않는 경우, 본 출원에서 제시된 정의가 우선할 것이다. If this definition is not consistent with the definition of elsewhere, it will be the definitions given in the present application takes precedence.

용어 "다형성(polymorphism)"은 서로 다른 게놈(genome) 또는 개체 간에, 또는 상기 개놈 또는 개체들 중에서, 둘 이상의 대안적 게놈 서열(genomic sequence) 또는 대립 유전자(allele)의 존재를 지칭한다. The term "polymorphism (polymorphism)" are together referred to the presence of another genome (genome), or between the object, or the object or the Bikers from two or more alternative genomic sequences (genomic sequence) or allele (allele).

용어 "다형성의(polymorphic)"는 개체군 내에서 특정한 게놈 서열의 둘 이상의 변이체(variant)가 발견되는 상태를 지칭한다. The term "(polymorphic) of polymorphism" refers to the state in which the detected two or more mutant (variant) of a specific genomic sequence in the population.

용어 "다형성 부위(polymorphic site)"는 상기 변이가 발생하는 좌위(locus)를 의미한다. The term "polymorphic site (polymorphic site)" refers to a locus (locus) in which the mutation occurs. 다형성 부위는 일반적으로 둘 이상의 대립 유전자를 가지며, 각각은 선택된 개체군 내에서 유의한 빈도로 발생한다. Polymorphic site will generally have at least two alleles, each of which occur at a significant frequency in the selected population. 다형성 좌위(polymorphic locus)는 하나의 염기쌍만큼 작을 수 있으며, 이 경우 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)으로 지칭된다. Polymorphic loci (polymorphic locus) may be as small as one base pair, in this case is referred to as single nucleotide polymorphisms (single nucleotide polymorphism, SNP). 최초로 동정된 대립유전자 형태가 임의로 기준(reference), 야생형(wild-type), 일반(common) 또는 다수(major) 형태로 명명되고, 다른 대립유전자 형태들은 대안적(alternative), 소수(minor), 희귀(rare) 또는 변이체(variant) 대립유전자로 명명된다. Based on the allele type identifying first optionally (reference), the wild-type (wild-type), common (common), or are named in the form number (major), different allelic forms are alternatively (alternative), a small number (minor), It is called a rare (rare) or mutant (variant) allele.

용어 "유전자형(genotype)"은 개체 또는 샘플 중에 포함된 유전자의 대립유전자(allele)들에 대한 기술을 지칭한다. The term "genotype (genotype)" refers to the description of the alleles (allele) of a gene contained in the object or the sample.

용어 "단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism)" ("SNP")은 대립유전자들 간에 달리하는 하나의 뉴클레오티드 부위를 지칭한다. The term "single nucleotide polymorphisms (single nucleotide polymorphism)" ( "SNP") refers to a nucleotide region having different between alleles. 단일 뉴클레오티드는 변화되거나 (치환), 폴리뉴클레오티드 서열에 제거(결실) 또는 부가(삽입)될 수 있다. Single nucleotide changes, or (optionally substituted), may be a polynucleotide sequence removed (deleted) or added (inserted) in the. 삽입 또는 결실 SNP는 번역 프레임시프트(translational frameshift)를 야기할 수 있다. Insertion or deletion SNP may cause a translation frame shift (translational frameshift). 단일 뉴클레오티드 다형성은 유전자의 코딩 서열(coding sequence), 유전자의 비-코딩 영역(non-coding region), 또는 유전자 사이의 유전자간 영역(intergenic region)에 속할 수 있다. A single nucleotide polymorphism is the coding sequence of the gene (coding sequence), the ratio of the gene may be in the coding region (non-coding region), or the region between the gene between genes (intergenic region). 코딩 서열 내의 SNP는, 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 생산되는 단백질의 아미노산 서열을 반드시 변화시키지는 않을 것이다. SNP in the coding sequence, due to the degeneracy (degeneracy) of the genetic code, it will not necessarily change the amino acid sequence of the protein produced. 두 형태가 모두 동일한 폴리펩티드 서열을 야기하는 SNP는, 동의적(synonymous) (때때로, 침묵 돌연변이로 지칭됨)으로 명명되나, 상이한 폴리펩티드 서열이 생산되는 경우, 이들은 비동의적(nonsynonymous)이다. SNP that both forms lead to the same polypeptide sequence is a synonymous (synonymous) if but named (sometimes referred to as silent mutation), the production of the different polypeptide sequences, and these asynchronous uniquely (nonsynonymous). 비동의적 변화는 미스센스(missense) 또는 논센스(nonsense)일 수 있고, 미스센스 변화는 상이한 아미노산을 생성시키는 반면, 논센스 변화는 조기 스톱 코돈(premature stop codon)을 야기한다. Asynchronous change is uniquely miss sense (missense), or may be a nonsense (nonsense), Miss sense changes, while nonsense changed to produce a different amino acid causes premature stop codon (premature stop codon). "기능적 SNP(functional SNP)"는 유전자 발현, 또는 유전자 산물의 발현 또는 기능에 변화를 유발하는 SNP이며, 따라서 가능한 임상적 표현형에 대해 대부분 예측성이 있다. "Functional SNP (functional SNP)" is a SNP that leads to changes in gene expression, or the expression or function of the gene product and, therefore, the most predictive for the clinical phenotype possible. 기능적 SNP에 의한 유전자 기능의 변화는 코딩된 폴리펩티드의 변화, mRNA 안정성, DNA 또는 RNA에 대한 전사 인자 또는 번역 인자 결합성의 변화 등을 포함할 수 있다. Changes in gene function by the functional SNP may include a change in the coded polypeptide, mRNA stability, translation or transcription factors or DNA binding factor sex changes in RNA or the like. 단백질-코딩 영역에 있지 않은 SNP는, 유전자 스플라이싱(splicing), 전사 인자 결합, 또는 비-코딩 RNA의 서열에 대해 결과를 나타낼 수 있다. Protein-SNP is not in the coding region, the gene splicing (splicing), transcription factor binding, or non-may represent the results for the sequence of the coding RNA.

일 구체예에 따르면, 숙련된 기술자는 SNP가, 각각 염색체 내에 존재할 수 있는 뉴클레오티드에 해당하는, 두개의 대안적 대립 유전자를 갖는다는 것을 이해할 것이다. According to embodiments, the skilled artisan will appreciate that the SNP is, it has two alternative alleles, corresponding to the nucleotides that may be present in each chromosome. 따라서, SNP는 4개의 뉴클레오티드 (A, C, G, T) 중 2개의 뉴클레오티드에 의해 특징지워진다. Thus, SNP is characterized by two nucleotides of the four nucleotides (A, C, G, T). 그의 예는 각각의 염색체 상의 주어진 위치에서, 대립형질(allele) C 또는 대립형질 T를 갖는 SNP일 것이다. Examples thereof will be in a given location on each chromosome, SNP with allele (allele) or the C allele T. 이는 C>T 또는 C/T로 표시된다. This is indicated by C> T or C / T. 보다 흔하게 발생하는 대립형질이 처음에 표시되고 (이 경우, C), 다수, 일반 또는 야생형 대립형질이라고 부른다. The allele that occurs more frequently is displayed at the first time (in this case, C), referred to as a number, normal or wild-type allele. 보다 덜 흔하게 발생하는 대안적 대립형질 (이 경우, T)을 소수, 희귀 또는 변이체 대립형질이라 부른다. Alternatively, alleles that are less frequently than the higher (in this case, T) to a small number, referred to as rare or mutant alleles. 야생형 및 변이체 대립형질은 각각 일반 대립형질 및 희귀 대립형질로 지칭될 수 있다. Wild-type and mutant alleles may be referred to as a normal allele, and rare alleles, respectively. 사람은 각각의 염색체가 2개의 사본으로 존재하는 것을 의미하는, 이배체 유기체이기 때문에, 각각의 개체는 하나의 SNP에서 두 개의 대립형질을 갖는다. Because people, diploid organisms, which means that each chromosome present in two copies, each individual has two alleles in a single SNP. 이 대립형질들은 동일한 대립형질의 2개의 사본일 (CC 또는 TT)이거나, 또는 서로 다른 대립형질(CT)일 수 있다. This allele may be in day 2 copies of the same allele (CC or TT) or, or of different alleles (CT). 상기 CC, CT 및 TT를 유전자형이라고 부른다. The CC, CT and TT is called genotype. 이들 중에서, CC 및 TT는 동일한 대립형질의 2개의 사본을 갖는 것을 특징으로 하며, 동형접합성(homozygous) 유전자형으로 지칭된다. Among these, TT and CC are characterized by having two copies of the same allele, it is referred to as homozygous (homozygous) genotype. 유전자형 CT는 각각의 염색체 상에 상이한 대립형질을 가지며, 이형접합성 유전자형이다. CT genotype has a different alleles on each chromosome, a heterologous bonding genotype. 동형접합체 또는 이형접합체 유전자형을 갖는 개체들은 각각, 동형접합성 및 이형접합성으로 지칭된다. Homozygous or objects having a heterozygous genotype are respectively referred to as homozygous and a release bonding properties.

SNP 의 선택 Selection of SNP

일 구체예는 임의의 표적 핵산 서열 내의 하나 이상의 SNP를 검출하기 위한, 신규한 방법을 제공한다. One embodiment provides a novel method for detecting at least one SNP in any of the target nucleic acid sequence. 목적 유전자 중 SNP의 위치의 결정은 SNP에 대한 생물정보 데이터베이스를 참고함으로써 매우 용이하게 수행된다. Determination of the position of the SNP of the target gene is carried out very easily by reference to biological information database for SNP. dbSNP는 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)로부터 제공되는 SNP 데이터베이스이다. dbSNP SNP database is provided by the Bioinformatics Center (National Center for Biotechnology Information, NCBI). SNPedia는 병합 조직으로부터 제공되는 위키-양식(wiki-style) 데이터베이스이다. SNPedia wiki is available from the merged organization - a form (wiki-style) database. OMIM 데이터베이스는 다형성과, 예를 들면, 질병 간의 관련성을 문서 형태로 개시하는 반면, HGVbaseG2P는 실질적인 요약-수준의 관련 데이터를 시각적으로 질의할 수 있게 한다. OMIM database, for polymorphisms and, for example, while the start of the relevance of the disease as a type of document, HGVbaseG2P substantial summary - makes it possible to visually query a class-specific data.

SNP에 대한 유용한 정보는 인간 게놈 전체에 걸쳐, 약 5 kb 마다 하나의 정보성 SNP의 유전자형을 규명하기 위한 국제 하프맵 프로젝트(International HapMap Project)에서도 찾을 수 있다. Useful information about the SNP can be found in the International Harp map project (International HapMap Project) to identify the genotype of one informative SNP approximately every 5 kb across the entire human genome. 인간 DNA 서열 변이 (단상형(haplotype))의 일반적인 패턴을 결정하고, 이러한 정보를 공중 영역에서 자유롭게 이용가능하도록 하기 위해, 나이제리아, 유럽 및 중국/일본에서 유래한 조상을 갖는 개체군들의 유전자형을 분석하였다. Analyzed the genotype of a human DNA sequence variation population determines the general pattern of the (single-phase-type (haplotype)), and for this information to be freely available in the public domain, having the derived ancestors in Nigeria, European and Chinese / Japanese . 이 정보는 흔한 질병 및 약학적 반응에 영향을 미치는 서열 변이체들의 발견을 용이하게 할 것이다. This information will facilitate the discovery of sequence variants affecting common disease and a pharmaceutically reaction. 인간 반상평 지도의 제작은 맞춤형 의약(personalized medicine)을 위한 중요한 단계이다. Production of anti-human Changping map is an important step toward personalized medicine (personalized medicine).

유전자형 분석을 위한 프라이머의 선택 The choice of primers for genotyping

유전자 및 관련 SNP가 선택되면, 타겟 핵산 서열의 유전자형 분석(genotyping)을 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 프로브를 준비한다. When the gene and associated SNP is selected, to prepare a primer and oligonucleotide probes for genotype analysis (genotyping) of the target nucleic acid sequence.

"타겟 DNA 또는 타겟 RNA(target DNA or target RNA)" 또는 "타겟 핵산(target nucleic acid)" 또는 "타겟 핵산 서열(target nucleic acid sequence)"은 분석되어야 할, 및 관심있는 다형성 부위를 포함하는, 핵산의 영역을 지칭한다. "Target DNA or target RNA (target DNA or target RNA)" or "target nucleic acid (target nucleic acid)" or "target nucleic acid sequence (target nucleic acid sequence)" comprises a polymorphic site in, and points of interest that need to be analyzed, It refers to a region of the nucleic acid. 타겟 핵산 서열은 PCR 반응 및 역전사 효소-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로서 사용된다. Target nucleic acid sequence is used as template for amplification in the PCR reaction and the reverse transcriptase -PCR reaction. 타겟 핵산 서열은 천연 및 합성 분자를 모두 포함할 수 있다. Target nucleic acid sequence can include both natural and synthetic molecules. 예시적인 핵산 서열은, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. An exemplary nucleic acid sequence, including, genomic DNA or genomic RNA, but are not limited thereto.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산(nucleic acid)"은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있거나, 또는 변형된 염기를 포함할 수 있다. , The term "nucleic acid (nucleic acid)" as used herein, oligonucleotides refers to oligonucleotides or polynucleotides, oligo-nucleotide or the polynucleotide can comprise a may be deformed, or modified base. 올리고뉴클레오티드는 2개 내지 60개의 뉴클레오티드를 포함하는, 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체이다. Oligonucleotide is single-stranded nucleotide polymer, containing from 2 to 60 nucleotides. 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 중합체이다. Polynucleotide is a nucleotide polymer comprising two or more nucleotides. 폴리뉴클레오티드는, 제2 가닥이 제1 올리고뉴클레오티드의 역방향 상보 서열(reverse complement sequence)를 갖는 올리고뉴클레오티드인 것인, 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함한 이중가닥 DNA, 데옥시티민을 포함하는 단일가닥 핵산 중합체, 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA 또는 RNA/DNA 이형이중가닥(heteroduplex)일 수 있다. Polynucleotides, a single strand nucleic acid polymers which second strand comprises a first oligonucleotide of the oligonucleotide having the reverse complementary sequence (reverse complement sequence) of the nucleotide to the oligonucleotide, annealed duplexes, including nucleotide DNA, deoxy thymidine, It may be a single-stranded RNA, double stranded RNA or RNA / DNA duplexes release (heteroduplex). 핵산은, 게놈 DNA, cDNA, hnRNA, snRNA, mRNA, rRNA, tRNA, 핵산 단편(fragmented nucleic acid), 미토콘드리아 또는 염록체와 같은 세포이하 소기관(subcellular organelle)으로부터 얻어지는 핵산, 및 생물학적 샘플 중에 존재할 수 있는 미생물, DNA 또는 RNA 바이러스로부터 얻어지는 핵산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Nucleic acid is genomic DNA, cDNA, hnRNA, snRNA, mRNA, rRNA, tRNA, nucleic acid fragments (fragmented nucleic acid), nucleic acid obtained from subcellular organelles (subcellular organelle), such as mitochondria or salt rokche, and which may be present in the biological sample comprising a nucleic acid obtained from a microorganism, DNA or RNA viruses, but are not limited to this. 핵산은 예를 들면, RNA 및 DNA의 경우에서와 같은, 단일 형태의 당 모이어티, 또는 예를 들면, RNA/DNA 키메라(chimera)의 경우에서와 같은, 상이한 당 모이어티의 혼합물로 구성될 수 있다. Nucleic acid, e.g., RNA and the like in the case of DNA, moieties per single form of tea, or for instance, RNA / DNA chimeric For (chimera) can be composed of a mixture of the moieties per different, such as in have.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 "프라이머(primer)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 호환적으로 사용된다. "Oligonucleotide (oligonucleotide)", the term as used herein, is used interchangeably with "primer (primer)" or "polynucleotides (polynucleotide)," enemy. 상기 용어 "프라이머"는 PCR 반응에서 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. The term "primer" is a PCR reaction on the oligonucleotide to act as a starting point for DNA synthesis refers to a nucleotide. 프라이머는 통상적으로, 약 14 내지 약 35 뉴클레오티드의 길이이고, 타겟 서열의 상보적인 영역에 혼성화한다. Primer is typically a length of about 14 to about 35 nucleotides, and hybridizes to a complementary region of the target sequence.

올리고뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 (화학적 합성과 같은) 임의의 적합한 방법에 의해 합성 및 제조된다. The oligonucleotide is synthesized and prepared by any suitable method of (such as chemical synthesis) known to those skilled in the art. 올리고뉴클레오티드는 또한 상업적 공급처를 통해 편리하게 이용가능하다. The oligonucleotides also can be used from a convenient commercial source. 숙련된 기술자는 PCR 반응에서 목적 다형성 부위의 측면에 배치되는(flank) 프라이머를 용이하게 최적화하고 식별할 수 있을 것이다. Skilled technician will be able to readily optimize (flank) the primer is disposed on the side of the target polymorphic sites in a PCR reaction, and identified. 상업적으로 이용가능한 프라이머가 특정한 SNP에 대해 특정한 목적 유전자를 증폭시키는데 사용될 수 있다. There are commercially available primers may be used to amplify a specific gene of interest for a particular SNP. 다수의 컴퓨터 프로그램 (예를 들면, Primer-Express)이 최적의 프라이머 세트를 디자인하기 위해 용이하게 사용될 수 있다. A plurality of computer programs (for example, Primer-Express) may be used to facilitate to design the optimal set of primers. 제공된 (또는 등록 번호로 공중에 의해 이용가능한) 핵산 정보에 기초한 프라이머 및 프로브가 그에 따라 제조될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. The presence of the primers and probes based on the (possible use by the public or by the registration number) information provided nucleic acid can be produced accordingly will be apparent to those skilled in the art.

용어 "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 호환적으로 사용되며, 이중가닥, 삼중가닥, 또는 기타 고차 구조의 형태를 초래하는, 핵산과 또다른 핵산의 염기쌍 상호작용을 의미한다. The term "annealed (annealing)" and "hybridization (hybridization)" are used interchangeably, means a double-stranded, triple-stranded, or any other higher order that the structure results in a form of, a nucleic acid and also base-pair interactions with other nucleic acids. 특정한 구체예에서, 일차적 상호작용은 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴형 수소 결합(Hoogsteen-type hydrogen bonding)에 의한, 염기 특이적 상호작용, 예를 들면 A/T 및 G/C이다. In certain embodiments, the primary interaction Watson / Crick (Watson / Crick) and hugeu sustaining form a hydrogen bond (Hoogsteen-type hydrogen bonding), base-specific interactions by, for example, A / T and G / C . 특정한 구체예에서, 염기-중첩(base-stacking) 및 소수성 상호작용이 이중가닥 안정성에 또한 기여할 수 있다. In certain embodiments, the base-overlapping (base-stacking) and hydrophobic interactions may also contribute to the stable double-stranded. "실질적으로 상보적인(substantially complimentary)"은 어닐링하여 안정한 이중가닥을 형성하기에 충분히 상보적인 서열의 두 핵산 가닥을 지칭한다. Refers to two nucleic acid strands of sufficiently complementary sequence to "substantially complementary (substantially complimentary)" is to form a stable double-stranded by annealing.

당업자는 목적 다형성 부위의 측면에 배치되는 PCR 프라이머를 어떻게 디자인하는지 알 것이다. Those skilled in the art would know how to design PCR primers that are placed on the side of the target polymorphism. 합성 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 약 55도의 녹는점 (T M )을 갖는, 20 내지 26 염기쌍의 길이이다. Synthetic oligonucleotide is generally from about 55 degrees melting point (T M) for having a length of 20-26 base pairs. 프라이머 디자인을 위한 측면 서열(flanking sequence)은 국제 하프맵 프로젝트에 의해 제작된 배치 파일(allocation file)에서 찾아볼 수 있다. Side sequences for primer design (flanking sequence) can be found in a batch file, produced by the International Harp map project (allocation file). 이 파일은 관찰된 대립형질 및 각각의 측면 핵산 주형 제조를 위한, 100 bp의 NCBI에 의해 감춰진(NCBI-masked) 서열을 포함하는, 각각의 SNP에 대한 풍부한 정보를 포함한다. This file contains a wealth of information for each SNP, including the observed alleles and for each nucleic acid template produced side, hidden by a 100 bp NCBI (NCBI-masked) sequence.

일부 구체예에서, 샘플은 정제된 핵산 주형 (예를 들면, mRNA, rRNA, 및 이들의 혼합물)을 포함한다. In some embodiments, the sample comprises a purified nucleic acid template (e.g., mRNA, rRNA, and a mixture thereof). 샘플로부터의 RNA 추출 및 정제 과정은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. RNA extracted from the sample and purification procedures are well known in the art. 예를 들면, RNA는 TRIzol™ 시약(Invitrogen) 추출법을 사용하여 세포로부터 분리할 수 있다. For example, RNA may be isolated using TRIzol ™ reagent (Invitrogen) extraction from the cells. 그 다음, 예를 들면, Nanodrop TM 분광광도계(spectrophotometer) 및 Agilent 2100 바이오애널라이저(bioanalyzer)를 사용하여, RNA의 양과 질을 결정한다. Then, for example, by using the TM Nanodrop spectrophotometer (spectrophotometer) and Agilent 2100 Bio Analyzer (bioanalyzer), determines the quantity and quality of RNA.

다른 구체예에서, 상기 샘플은 pH 약 6 내지 약 9의 용해 완충액(lysis buffer), 약 0.125% 내지 약 2%의 농도를 갖는 양쪽성이온 세제(zwitterionic detergent), 약 0.3 내지 약 2.5 mg/mL의 농도를 갖는 아자이드(azide) 및 프로티나아제 K(proteinase K)와 같은 프로테아제(약 1 mg/mL)를 사용하여 세포를 용해시켜 제조된 세포 용해물(cell lysate)이다. In other embodiments, the sample pH from about 6 to lysis buffer of about 9 (lysis buffer), about 0.125% to zwitterions detergent having a concentration of about 2% (zwitterionic detergent), about 0.3 to about 2.5 mg / mL of the azide (azide), and dehydratase proteinase K (proteinase K) with protease (about 1 mg / mL) of cell lysate (cell lysate) it is prepared by dissolving the cells for using such a concentration. 55 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후에, 95 ℃에서 10분 동안 상기 프로티나아제 K를 불활성화시켜, 고효율 PCR(high efficiency PCR) 또는 역전사 PCR(reverse transcription PCR) 분석과 상용성이 있는, 단백질이 실질적으로 제거된 용해물을 얻는다. At 55 ℃ After incubation for 15 minutes, with from 95 ℃ for 10 min to inactivate the proteinase Kinase K, efficient PCR (high efficiency PCR) or reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) analysis, and compatible with the protein is to obtain a melt for the substantially removed.

일 구체예에서, 1 x 용해 시약은 12.5 mM 트리스(tris) 아세테이트 또는 트리스-HCl 또는 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) (pH=7-8), 0.25% (w/v) CHAPS, 0.3125 mg/ml 소듐 아자이드 및 1 mg/mL의 프로티나아제 K를 함유한다. In one embodiment, 1 x lysis reagent is 12.5 mM Tris (tris), acetate or Tris -HCl or HEPES (4- (2- hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulfonic acid) (pH = 7-8), 0.25 % and containing (w / v) CHAPS, 0.3125 mg / ml sodium azide and 1 mg / mL of proteinase K kinase.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "용해물(lysate)"은, 용해된 세포 잔해물 및 핵산을 포함하는 액체 상을 지칭한다. , The term "lysate (lysate) for" as used herein, refers to a liquid containing the soluble cell debris and nucleic acids.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "단백질이 실질적으로 제거된(substantially protein free)"은 대부분의 단백질이 프로테아제(protease)에 의한 단백질 분해에 의해 불활성화된 용해물을 지칭한다. , The term "protein is substantially removed (substantially free protein)" as used herein refers to a majority of lysate protein is inactivated by the protein degradation by proteases (protease). 프로테아제는 프로티나아제 K를 포함할 수 있다. Protease may comprise a proteinase K kinase. 세포 용해 중 프로티나아제 K의 첨가는, 불활성화되지 않을 경우 표적 핵산을 분해할 수 있는, 뉴클레아제(nuclease)를 신속하게 불활성화시킨다. Cytolytic addition of proteinase K dehydratase is to activate the fire quickly to disassemble the target nucleic acids, nuclease (nuclease) when not inactivated. 용어 "단백질이 실질적으로 제거된"은 불활성화된 단백질을 제거하기 위한 처리를 받거나, 또는 받지 않을 수 있다. The term "protein is substantially removed" may not receive treatment for the removal of proteins inactivated or not.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포(cell)"는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭한다. , The term "cell (cell)" as used herein, refers to a prokaryotic or eukaryotic cell.

일 구체예세서, 상기 용어 "세포:는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 항산성(acid-fast) 박테리 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 미생물을 지칭한다. 특정한 구체예에서, 상기 시험될 "세포"는 표면의 스왑 샘플채취(swap sampling)을 사용하여 수집할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 :"세포"는 병원성 유기체들을 지칭한다./ One embodiment processor, the term "cells: are Gram-positive bacteria, gram negative bacteria, wherein the acid (acid-fast) foil include, such as terry, refers to a microorganism that is not limited to, in certain embodiments, be the test "cells" may be gathered using a swap sampling (sampling swap) of the surface in another embodiment, the: "cell" refers to a pathogenic organism ./

다른 구체예에서, 샘플은 바이러스 핵산, 예를 들면 레트로바이러스 핵산을 포함한다. In other embodiments, the sample is, for viral nucleic acid, for example, comprises a retroviral nucleic acid. 특정한 구체예에서, 상기 샘플은 HIV-1 또는 HIV-2와 같은, 렌티바이러스 핵산을 함유할 수 있다. In certain embodiments, the sample may contain, lentivirus nucleic acid such as HIV-1 or HIV-2.

본 명세서에서 사용되는, "양쪽성이온 세제(zwitterionic detergent)"는 CHAPS, CHAPSO 및 바인 유도체(bine derivative), 예를 들면, 바람직하게는 상품명 Zwittergent ® (Calbiochem, San Diego, CA) 및 Anzergent ® (Anatrace, Inc. Maumee, OH) 하에 시판되는, 술포바인(sulfobine)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 양쪽성이온 특성을 나타내는 (예를 들면, 순 전하를 갖지 않고, 전기전도성(conductivity) 및 전기영동성(electrophoretic mobility)을 갖지 않으며, 이온 교환 수지에 결합하지 않고, 단백질-단백질 상호 작용을 파괴하는) 세제를 지칭한다. , "Zwitterion detergent (zwitterionic detergent)" are CHAPS, CHAPSO and bar derivative (bine derivative), as used herein, e.g., preferably a trade name Zwittergent ® (Calbiochem, San Diego, CA) and Anzergent ® ( Anatrace, Maumee Inc., which, as marketed under the sake poba OH) (including, sulfobine), but not limited to, (for example representing a zwitterion properties, without having a net charge, electrical conductivity (conductivity) and does not have the same sex electrophoresis (electrophoretic mobility), does not bind to an ion exchange resin, protein-refers to destroy the protein interaction) detergent.

일 구체예에서, 상기 양쪽성이온 세제는 하기 구조: In one embodiment, the amphoteric ionic detergents are the following structures:

Figure pat00001

를 갖는, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트의 약어인, CHAPS (CAS 번호: 75621-03-3; SIGMA-ALDRICH에서 입수가능, 상품번호 C3023-1G) (미국 등록특허 제4,372,888호에 보다 상세하게 기술됨)이다. Having a 3 - [(3-Cola shown propyl) dimethyl ammonium O] is an abbreviation for 1-propanesulfonate, CHAPS (CAS Number: 75621-03-3; available from SIGMA-ALDRICH, Product number C3023-1G ) it is (as in detail described in my U.S. Patent 4,372,888).

추가적인 구체예에서, CHAPS는 총 조성물 중 약 0.125% 내지 약 2% 중량/부피 (w/v)의 농도로 존재한다. In a further embodiment, CHAPS is present in a concentration of about 0.125% to about 2% weight / volume (w / v) of the total composition. 추가적인 구체예에서, CHAPS는 총 조성물 중 약 0.25% 내지 약 1% w/v의 농도로 존재한다. In a further embodiment, CHAPS is present at about 0.25% to about 1% w / v concentration in the total composition. 또다른 구체예에서, CHAPS는 총 조성물 중 약 0.4% 내지 약 0.7% w/v의 농도로 존재한다. In another embodiment, CHAPS is present in about 0.4% to about 0.7% w / v concentration in the total composition.

다른 구체예에서, 상기 용해 완충액은 노니뎃(Nonidet), 트윈(Tween) 또는 트리톤 X-100(Triton X-100)와 같은, 다른 비-이온성 세제를 포함할 수 있다. In other embodiments, the lysis buffer is say det (Nonidet), Tween, such as other non-(Tween) or Triton X-100 (Triton X-100) - can include an ionic detergent.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "용해 완충액"은 25 ℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa를 갖는, pH 값을 6 내지 9로 효과적으로 유지시킬 수 있는 조성물을 지칭한다. As used herein, the term "lysis buffer" as used refers to a composition that can be maintained effectively in a 25 ℃, pH value having from about 6 to about 9 of pKa of 6 to 9. 본 명세서에서 기술되는 완충액은 일반적으로, 효소 활성의 기능과 양립가능하고, 생물학적 거대분자들이 그의 본래의 물리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 하는, 생리학적으로 적합한(physiologically compatible) 완충액이다. Buffer solution described herein is generally, it can function as both the enzyme activity and, as appropriate, so that they can maintain a physiologically in their original physical and biochemical features biological macromolecules (physiologically compatible) buffer.

용해 완충액에 첨가되는 완충액의 예는, HEPES ((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산 (트리신(Tricine)), 트리스(히드록시메틸)메틸아민산 (트리스(Tris)), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 완충액(K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 ) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Examples of the buffer solution to be added to the lysis buffer is, HEPES ((4- (2- hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid), MOPS (3- (N- morpholino) propanesulfonic acid), N- tris (hydroxymethyl) methyl glycine acid (tree Shin (Tricine)), tris (hydroxymethyl) methylamine acid (tris (tris)), piperazine -N, N'- bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) and acetate or phosphate-containing buffer (K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4) one and the like, but is not limited thereto.

본 명세서에서 사용되는 용어 "아자이드(azide)"는 화학식 -N 3 으로 대표된다. As used herein, "azide (azide)" it is represented by the formula -N 3. 일 구체예에서, 상기 아자이드는 일반적인 살균제로 작용하는, 소듐 아자이드 NaN 3 (CAS 번호 26628-22-8; SIGMA-ALDRICH에서 구입 가능, 제품번호: S2002-25G)이다. In one embodiment, the azide is sodium azide NaN 3 which acts as a general disinfectant;: I (CAS No. 26628-22-8 available from SIGMA-ALDRICH, product number S2002-25G).

본 명세서에서 사용되는, 용어 "프로테아제(protease)"는 펩티드 결합을 가수분해하는 (프로테아제 활성을 갖는) 효소이다. , The term "protease (protease)" as used herein, is an enzyme (with a protease activity) to hydrolyze the peptide bond. 프로테아제는 또한, 예를 들면, 펩티다아제(peptidase), 프로티나아제(proteinase), 펩티드 가수분해효소(peptide hydrolase), 또는 단백질 분해 효소(proteolytic enzyme)로도 지칭된다. Proteases are also, for example, it is also referred to as peptidase (peptidase), proteinase kinase (proteinase), peptidase (peptide hydrolase), or protease (proteolytic enzyme). 본 발명에 따른 용도를 위한 프로테아제는 폴리펩티드 사슬에 내부적으로 작용하는 엔도-형(endo-type) (엔도펩티다아제(endopeptidase))일 수 있다. Protease for use according to the present invention that act internally in polypeptide chains endo - may be the type (endo-type) (endopeptidase (endopeptidase)). 일 구체예에서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제인, 프로티나아제 K(proteinase K) (EC 3.4.21.64; Roche Applied Sciences에서 입수 가능, 재조합 프로티나아제 K 50 U/ml ( Pichia In one embodiment, the protease is a serine protease, proteinase kinase K (proteinase K) (EC 3.4.21.64 ; available from Roche Applied Sciences, recombinant proteinase Kinase K 50 U / ml (Pichia pastoris 에서 유래) Cat. derived from pastoris) Cat. No. No. 03 115 887 001)일 수 있다. 03 may be a 115 887 001).

프로티나아제 K는 단백질을 소화시키고, 핵산 제제(nucleic acid preparation)로부터 오염물질을 제거하는데 사용된다. Proteinase K dehydratase is digesting the protein, are used to remove contaminants from nucleic acid preparations (nucleic acid preparation). 핵산 제제로의 프로티나아제 K의 첨가는, 불활성화되지 않는 경우 정제 중에 DNA 또는 RNA를 분해할 수 있는, 뉴클레아제를 신속하게 불활성화시킨다. Pro addition of Tina Kinase K of the nucleic acid formulations are, activates a fire quickly, nuclease capable of degrading the DNA or RNA during purification if not inactivated. 상기 효소는 단백질을 변성시키는 화학물질의 존재 하에서도 활성을 나타내고, 약 95 ℃의 온도에서 약 10분 동안 처리시 불활성화될 수 있으므로, 본 출원에 매우 적합하다. The enzyme is because the presence of the chemical modification of a protein can also be shown active, inactivated during processing for about 10 minutes at a temperature of about 95 ℃, is well suited for this application.

일 구체예에서, 리스테리아( Listeria ) 살모넬라( Salmonella ) 및 대장균( E. Coli )과 같은, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의 용해도 프로티나아제 K(1 mg/ml)를 포함하는 용해 시약(lysis reagent)을 필요로 한다. In one embodiment, the Listeria monocytogenes (Listeria) Salmonella (Salmonella) and Escherichia coli (E. Coli) and the like, gram-positive and gram-negative bacteria solubility proteinase kinase K (1 mg / ml) dissolved in a reagent containing the (lysis reagent) need. 세포 용해물 중의 단백질은 55 ℃에서 15분 동안 프로티나아제 K를 처리하고, 뒤이어 95 ℃에서 10분 동안 프로티아나제 K를 불활성화시킴으로써 소화시킬 수 있다. Protein in the cell lysate can be from 55 ℃ handle azepin proteinase K for 15 minutes, followed by a second digestion at 95 ℃ for 10 min Pro tiahna K by inactivating. 냉각 후에, 단백질이 실질적으로 제거된 용해물은 고효율 PCR 증폭에 적합하다. After cooling, protein lysates that the substantially removed is suitable for efficient PCR amplification.

프로티나아제 K와 함께, 또는 상기 효소 대신에, 용해 시약은 트립신(trypsin), 카이모트립신(chymotrypsin), 엘라스타아제(elastase), 섭틸리신(subtilisin), 스트렙토그리신(streptogrisin), 테르미타아제(thermitase), 아쿠아라이신(aqualysin), 플라스민(plasmin), 쿠쿠미신(cucumisin), 또는 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) A, D, C, 또는 Y와 같은, 세린 프로테아제를 포함할 수 있다. With proteinase Kinase K, or in place of the enzyme, soluble reagents trypsin (trypsin), chymotrypsin (chymotrypsin), elastase dehydratase (elastase), Sup Tilly new (subtilisin), streptomycin draw new (streptogrisin), Terre Mita dehydratase (thermitase), aqua-lysine (aqualysin), plasmin (plasmin), may Cuckoo myth include, serine proteases, such as (cucumisin), or carboxy peptidases (carboxypeptidase) a, D, C, or Y. 세린 프로테아제 외에, 상기 용해 용액은 파파인(papain), 칼파인(calpain), 또는 클로스트리파인(clostripain)과 같은 시스테인 프로테아제; In addition to the serine protease, wherein the lysis solution is a cysteine ​​protease such as papain (papain), the kalpa (calpain), or Claus pine tree (clostripain); 펩신, 카이모신(chymosin), 또는 카텝신(cathepsin)과 같은 산 프로테아제; Acid protease, such as pepsin, chi-thymosin (chymosin), or a cathepsin (cathepsin); 또는 프로나아제(pronase), 테르모라이신(thermolysin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), 아미노펩티다아제(aminopeptidase) 또는 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) A, B, E/H, M, T, 또는 U와 같은, 메탈로프로테아제(metalloprotease)를 포함할 수 있다. Or pro claim (pronase) better, Terre Mora, who (thermolysin), collagenase (collagenase), di-SPA kinase (dispase), aminopeptidase (aminopeptidase) or carboxy peptidases (carboxypeptidase) A, B, E / H, M, T, U or the like, can include protease (metalloprotease) to metal. 프로티나아제 K는 광범위한 pH에 걸쳐서(pH 4.0 - 10.0) 안정하고, 양쪽성이온 세제를 포함하는 완충액에서 안정하다. Proteinase K kinase is over a wide range of pH (pH 4.0 - 10.0) is stable, and stable in the buffer containing the zwitterion detergent.

타겟 핵산 서열의 PCR 증폭 PCR amplification of the target nucleic acid sequence

프라이머가 제조된 후, 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), 및 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification, RCA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있다. After the primer is prepared, the nucleic acid amplification is polymerase chain reaction (polymerase chain reaction, PCR), nucleic acid sequence-based amplification (nucleic acid sequence based amplification, NASBA), ligase chain reaction (ligase chain reaction, LCR), and rolling circle include, amplified (rolling circle amplification, RCA), but not limited to, it can be made by a variety of methods. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 특이적인 타겟 DNA 서열의 증폭에 가장 흔히 사용되는 방법이다. Polymerase chain reaction (PCR) is a method commonly used in the amplification of specific target DNA sequences.

중합효소 연쇄 반응 또는 PCR은, 일반적으로 원하는 뉴클레오티드 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭시키는 방법을 지칭한다. Polymerase chain reaction or PCR is, typically refers to a method for amplifying in vitro (in vitro) the desired nucleotide sequence. 일반적으로, PCR방법은 원하는 타겟 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에, 2 이상의 신장가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 몰 과량을 도입하는 것으로 이루어지며, 상기 프라이머들은 이중가닥 타겟 서열의 반대 가닥에 상보적이다. In general, PCR method is done by introducing a desired target sequence (s) molar excess of the reaction mixture, an oligonucleotide primer capable of two or more height, including the primers are complementary to opposite strands of the double stranded target sequence . 상기 반응 혼합물을 대상으로, DNA 폴리머라제의 존재 하에 열주기(thermal cycling) 프로그램을 실시하여, DNA 프라이머가 측면에 부착된 원하는 타겟 서열을 증폭시킨다. The reaction mixture was subject to, by performing a heat cycle in the presence of a DNA polymerase (thermal cycling) program, DNA primers to amplify the desired target sequence attached to the side.

PCR 기법은 PCR: A Practical Approach, MJ McPherson 등, IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis 등, Academic Press (1990), 및 PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, HA Erlich, Stockton Press (1989)을 포함한, 다수의 문헌에 개시되어 있다. PCR technique PCR: A Practical Approach, MJ McPherson, etc., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, etc., Academic Press (1990), and PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, HA including Erlich, Stockton Press (1989), it is disclosed in numerous documents. PCR은 또한, 미국 등록특허 제4,683,195호; PCR is also, U.S. Patent No. 4,683,195 - Ho; 제4,683,202호; No. 4,683,202 call; 제4,800,159호; No. 4,800,159 call; 제4,965,188호; No. 4,965,188 call; 제4,889,818호; No. 4,889,818 call; 제 5,075,216호; No. 5,075,216 call; 제5,079,352호; No. 5,079,352 call; 제5,104,792호; No. 5,104,792 call; 제5,023,171호; No. 5,023,171 call; 제5,091,310호; No. 5.09131 million call; 및 제5,066,584호를 포함한 다수의 미국 특허에서도 개시되며, 이들 각각은 참조에 의해 본 명세서에 삽입된다. And it is disclosed in a number of U.S. Patent No. 5,066,584, including the first, each of which is incorporated herein by reference.

용어 "샘플(sample)"은 핵산 물질을 포함하는 임의의 물질을 지칭한다. The term "sample (sample)" refers to any material containing the nucleic acid material.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "PCR 단편(PCR fragment)" 또는 "역전사 효소-PCR 단편(reverse transcriptase-PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)"은 특정한 타겟 핵산의 증폭 결과 생산되는 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 총칭하여 복수의 분자들)를 지칭한다. , The term "PCR fragment (PCR fragment)", as used herein, or "reverse transcriptase -PCR fragment (reverse transcriptase-PCR fragment)" or "amplicon (amplicon)" is a polynucleotide molecule that is produced resulting amplification of specific target nucleic acid It refers to (or collectively the plurality of molecules). PCR 단편은 항상은 아니나 통상적으로, DNA PCR 단편이다. PCR fragment is always include, but are not conventional, PCR DNA fragment. PCR단편은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 또는 임의의 농도 비율을 갖는 이들의 혼합물일 수 있다. PCR fragment can be a mixture thereof having a single-stranded or double-stranded, and may be, or any concentration ratio. PCR 단편 또는 RT-PCT는 약 100 내지 약 500 nt 또는 그 이상의 길이일 수 있다. PCR fragments or RT-PCT may be from about 100 to about 500 nt or more in length.

"완충액(buffer)"은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분들의 안정성, 활성, 및/또는 지속성(longevity)을 변화시키는, 증폭 반응에 첨가되는 화합물이다. "Buffer solution (buffer)" is a compound that by adjusting the pH of the amplification reaction in addition, an amplification reaction for changing the stability, activity, and / or persistence (longevity) of one or more components of the amplification reaction. 본 발명의 완충제(buffering agent)는 PCR 증폭 및 부위-특이적 RNase H 절단 활성(site-specific RNase H cleavage activity)과 양립가능하다. Buffering agents of the present invention (buffering agent) are PCR amplification and site-specific RNase H cleavage activity it is possible (site-specific cleavage RNase H activity) and both. 일부 완충제들이 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 트리스, 트리신, MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), 및 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. And some buffers are well known in the art, tris, tri Shin, MOPS (3- (N- morpholino) propanesulfonic acid), and HEPES (4- (2- hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid ) one including, but not limited thereto. 또한, PCR 완충액은 일반적으로 최대 약 70 mM KCl 및 약 1.5 mM 이상의 MgCl 2 , 약 50-200 mM의 각각의 뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함한다. In addition, the PCR buffer typically contains up to about 70 mM KCl, and at least about 1.5 mM MgCl 2, each oligonucleotide of about 50-200 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP. 본 발명의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화하기 위한 첨가물질들을 포함할 수 있다. Buffer of the present invention may comprise an additive material for optimizing the effective reverse transcriptase -PCR reaction or PCR.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 리보오스(ribose), 아라비노오스(arabinose), 자일로오스(xylose) 및 피라노오스(pyranose)와 같은 당, 및 이들의 당 유사체의, C-1' 탄소에 결합된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 화합물을 지칭한다. , The term "nucleotide (nucleotide)" as used herein in, and their analogs per sugar such as ribose (ribose), arabinose (arabinose), in xylene agarose (xylose) and pyrano agarose (pyranose), C-1 'refers to a compound comprising a nucleotide bases bonded to the carbon. 용어 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. The term oligonucleotide also comprises a nucleotide analog. 상기 당은 치환 또는 비치환된 것일 수 있다. The sugar can be a substituted or unsubstituted. 치환된 리보오스 당은, 탄소 원자들 중 하나 이상, 예를 들면, 2'-탄소 원자가 동일하거나 상이한, Cl, F, -R, -OR, -NR 2 (상기 각각의 R은 독립적으로 H, C 1 -C 6 알킬 또는 C 5 -C 14 아릴이다) 또는 할로겐 기 중 하나 이상으로 치환된 것인 리보오스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Substituted ribose sugars, one or more of the carbon atoms, for example, 2'-carbon atom is the same or different, Cl, F, -R, -OR , -NR 2 ( wherein R a each is independently H, C 1 -C 6 alkyl or C 5 -C 14 aryl is a), or one including the halogen group will be substituted with one or more of the ribose, but is not limited thereto. 예시적인 리보오스는, 2'-(C1-C6)알콕시리보오스, 2'-(C5-C14)아릴옥시리보오스, 2',3'-디데하이드로리보오스, 2'-데옥시-3'-할로리보오스, 2'-데옥시-3'-플루오로리보오스, 2'-데옥시-3'-클로로리보오스, 2'-데옥시-3'-아미노리보오스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알킬리보오스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알콕시리보오스 및 2'-데옥시-3'-(C5-C14)아릴옥시리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 2',3'-디데옥시리보오스, 2'-할로리보오스, 2'-플루오로리보오스, 2'-클로로리보오스, 및 2'-알킬리보오스, 예를 들면, 2'-O-메틸, 4'-α-아노머(anomeric) 뉴클레오티드, 1'-α-아노머 뉴클레오티드, 2'-4'- 및 3'-4'-결합된(linked) 및 기타 "고정된(locked)" 또는 "LNA", 이환식 당 변형체(bicyclic sugar modification)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (예를 들면, PCT 공개 출원 WO 98/22489, WO 98/39352 및 WO 99/14226; 및 미국 등록특 Exemplary ribose is 2 "- (C1-C6) alkoxy ribose, 2 '- (C5-C14) aryloxy-ribose, 2', 3'-dideoxy dihydro-ribose, 2'-deoxy-3'-halo ribose, 2'-deoxy-3'-fluoro-ribose, 2'-deoxy-3'-chloro-ribose, 2'-deoxy-3'-amino-ribose, 2'-deoxy -3 '- (C1-C6 ) alkyl-ribose, 2'-deoxy -3 '- (C1-C6) alkoxy-ribose and 2'-deoxy -3' - (C5-C14) aryloxy-ribose, ribose, 2'-deoxy-ribose, 2 & apos; , 3'-dideoxy-ribose, 2'-halo-ribose, 2'-fluoro-ribose, 2'-chloro-ribose, and 2'-alkyl ribose for example, 2'-O- methyl, 4'-α- anomer (anomeric) nucleotides, 1'-α- anomeric nucleotides, 2'-4'- and 3'-4'-linked (linked), and other "fixed (locked)" or "LNA", bicyclic sugar one contains the elastic element (bicyclic sugar modification), but are not limited to (e. g., PCT published application WO 98/22489, WO 98/39352 and WO 99/14226; and US Patent registration 제6,268,490호 및 제6,794,499호를 참조한다). Article refers to 6.26849 million) and (No. 6,794,499).

첨가물질은 조성물 중 하나 이상의 성분의 안정성, 활성, 및/또는 지속성을 변화시키는, 조성물에 첨가되는 화합물이다. The additive material is a compound added to the composition to vary the stability, activity, and / or duration of one or more components of the composition. 특정한 구체예에서, 상기 조성물은 증폭 반응 조성물이다. In certain embodiments, the composition is an amplification reaction composition. 특정한 구체예에서, 첨가물질은 오염성 효소를 불활성화시키고, 단백질 접힙(protein folding)을 안정화하고, 및/또는 응집을 감소시킨다. In certain embodiments, the additive material and the inactivating enzyme stain resistance, thereby stabilizing the protein creases (protein folding), and / or reduced aggregation. 증폭 반응에 포함될 수 있는 예시적인 첨가물질은, 바인(bine), 포름아미드, KCl, CaCl 2 , MgOAc, MgCl 2 , NaCl, NH 4 OAc, NaI, Na(CO 3 ) 2 , LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로오스(trehalose), 데미에틸술폭시드(demiethylsulfoxide, "DMSO"), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(dithiothreitol, "DTT"), (테르모플라스마 아시도필룸( Thermoplasma Exemplary addition that may be included in the amplification reactants, columbine (bine), formamide, KCl, CaCl 2, MgOAc, MgCl 2, NaCl, NH 4 OAc, NaI, Na (CO 3) 2, LiCl, MnOAc, NMP to be, trehalose (trehalose), Demi ethyl sulfoxide (demiethylsulfoxide, "DMSO"), glycerol, ethylene glycol, dithiothreitol (dithiothreitol, "DTT"), ( Terre parent plasma also know pilrum (Thermoplasma acidophilum ) 무기 파이로포스파타아제("TAP")를 포함하나, 이에 제한되지 않는) 파이로포르파타아제(pyrophosphatase), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, "BSA"), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드(glycinamide), CHES, Percoll TM , 아우린트리카르복시산(aurintricarboxylic acid), 트윈(Tween) 20, 트윈 21, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 85, Brij 30, NP-40, 트리톤 X-100, CHAPS, CHAPSO, 매커늄 (Mackernium), LDAO (N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, 대장균 SSB, RecA, 니킹 엔도뉴클레아제(nicking endonuclease), 7-데아자 G, dUTP, UNG, 음이온성 세제, 양이온성 세제, 비이온성 세제, 양극성이온 세제(zwittergent), 스테롤, 삼투물질(osmolyte), 양이온, 및 증폭 효율을 변화시킬 수 있는, 임의의 다른 화학 물질, 단백질 또는 보조인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. acidophilum) including, an inorganic pie phosphatase ( "TAP"), as non-limiting) pi The formate Zapata dehydratase (pyrophosphatase), BSA (bovine serum albumin, "BSA"), propylene glycol, glycine amide ( glycinamide), CHES, Percoll TM, aurin tricarboxylic acid (aurintricarboxylic acid), tween (tween) 20, tween 21, tween 40, tween 60, tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO , every keonyum (Mackernium), LDAO (N- dodecyl -N, N- dimethylamine oxide -N-), Zwittergent 3-10, 3-14 Xwittergent, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32 , E. coli SSB, RecA, niking endonuclease (nicking endonuclease), having 7- aza G, dUTP, UNG, anionic detergents, cationic detergents, nonionic detergents, ionic detergents bipolar (zwittergent), sterols, osmotic material ( osmolyte), cation, and amplification efficiency that can change, and any other chemicals, including, proteins or co-factors, not limited to this. 특정한 구체예에서, 둘 이상의 첨가물질이 증폭 반응에 포함된다. In certain embodiments, more than one additive material is included in the amplification reaction. 본 발명에 따르면, 첨가물질들은 RNase H의 활성을 간섭하지 않는 경우, 프라이머 어닐리의 선택성을 개선할 목적으로 첨가될 수 있다. According to the invention, the additive material may be added for the purpose of improving the selectivity of the primer nilri air does not interfere with the activity of RNase H.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "열안정성(thermostable)"은 효소에 적용되는 경우, 승온 조건 (예를 들면 55 ℃ 또는 그 이상)에서, 그의 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복된 주기 후에 그의 생물학적 활성을 유지하는 효소를 지칭한다. , As used herein, "thermal stability (thermostable)" is the repetition period of the temperature increase conditions (e.g. 55 ℃ or higher), maintaining their biological activity, or heating and cooling when applied to the enzyme after it refers to the enzyme to maintain its biological activity. 열안정성 폴리뉴클레오티드 폴리머라제는 PCR 증폭 반응에서 특히 유용하다. Thermostable polynucleotide polymerase is particularly useful in PCR amplification reactions.

본 명세서에서 사용되는 "증폭 폴리머라제 활성(amplifying polymerase activity)"은 데옥시리보뉴클레오티드의 중합화를 촉매하는 효소 활성을 지칭한다. "Amplified polymerase active (amplifying polymerase activity)" as used herein, refers to an enzyme activity that catalyzes the polymerization of ribonucleotides oxy. 일반적으로, 상기 효소는 핵산 주형 서열에 어닐링된 프라이머의 3'-말단에서 합성을 개시할 것이며, 상기 주형 가닥의 5'-말단 방향으로 진행할 것이다. Generally, the enzyme will initiate synthesis at the 3'-end of the primer annealed to a template nucleic acid sequence, it will proceed to the 5'-end direction of the template strand. 특정한 구체예에서, "증폭 폴리머라제 활성"은 열안정성 DNA 폴리머라제이다. In certain embodiments, the "amplification polymerase activity" is cyclase thermostable DNA polymerase.

본 명세서에서 사용되는, 열안정성 폴리머라제는 열에 비교적 안정한 효소이며, 각각의 PCR 사이클 전에 효소를 첨가할 필요성을 제거한다. , Thermostable polymerase, as used herein, removes a relatively stable enzyme, it need be added to the enzyme prior to each PCR cycle heat.

열안정성 DNA 폴리머라제의 비제한적인 예는, 호열성 박테리아 써머스 아쿠아티쿠스( Thermus Non-limiting examples of thermostable DNA polymerase, thermophilic bacteria sseomeoseu aqua tea kusu (Thermus aquaticus ) (Taq 폴리머라제), 써머스 써모필러스( Thermus thermophilus )(Tth 폴리머라제), 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus aquaticus) (Taq polymerase), Thermococcus sseomeoseu pillar's (Thermus thermophilus) (Tth polymerase), Thermococcus litoralis (Thermococcus litoralis ) (Tli 또는 VENT TM 폴리머라제), 파이로코커스 푸리오수스( Pyrococcus litoralis) (Tli or VENT polymerase TM), Pyro Lactococcus Puri's sewage (Pyrococcus furiosus ) (Pfu 또는 DEEPVENT TM . 폴리머라제), 파이로코커스 우시이( Pyrococcus furiosus), (Pfu or DEEPVENT TM. polymerase), Rhodococcus woosiyi (Pyrococcus Pyro woosii )(Pwo 폴리머라제) 및 기타 파이로코커스 종들, 바실러스 스테아로써모필러스( Bacillus stearothermophilus) (Bst 폴리머라제), 술포로부스 아시도칼다리우스( Sulfolobus acidocaldarius )(Sac 폴리머라제), 써모플라스마 아시도필룸( Thermoplasma acidophilum )(Tac 폴리머라제), 써머스 러버( Thermus woosii) know (Pwo polymerase), and a brush Russ (Bacillus stearothermophilus) Other pie as Lactococcus species, Bacillus stearate (Bst polymerase), alcohol captive booth know sword Darius (Sulfolobus acidocaldarius) (Sac polymerase), Thermococcus plasma also pilrum (Thermoplasma acidophilum) (Tac polymerase), sseomeoseu rubber (Thermus rubber )(Tru 폴리머라제), 써머스 브로키아누스( Thermus rubber) (Tru polymerase), sseomeoseu bromo Keanu's (Thermus brockianus )(DYNAZYME TM brockianus) (DYNAZYME TM 폴리머라제)i(Tne 폴리머라제), 써모토가 마리팀( Thermotoga Polymerase) i (Tne polymerase), a motto written Maritim (Thermotoga maritime )(Tma) 및 써모토가( Thermotoga ) 속의 기타 종들(Tsp 폴리머라제), 및 메타노박테리움 써모오토트로피쿰( Methanobacterium thermoautotrophicum )(Mth 폴리머라제)로부터 분리된 폴리머라제들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. maritime) (Tma), and writing the motto is (Thermotoga) in the other species (Tsp polymerase), and meta-Novak Te Solarium Thermo auto trophy glutamicum (Methanobacterium thermoautotrophicum) (one comprising a polymerase isolated from the Mth polymerase), limited to no. PCR 반응은 타겟 서열의 보다 효율적인 증폭을 야기하는, 상호보완적인 특성을 갖는 하나 이상의 열안정성 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. PCR reaction may include one or more thermally stable polymerase enzyme having a complementary nature to cause efficient than amplification of the target sequence. 예를 들면, 높은 진행도(processivity) (큰 뉴클레오티드 단편을 복제하는 능력)를 갖는 뉴클레오티드 폴리머라제를, 교정(proofreading) 능력 (타겟 핵산 서열의 신장 중 오류를 교정하는 능력)을 갖는 또다른 뉴클레오티드 폴리머라제로 보완시킴으로써, 긴 타겟 서열을 높은 정확도(fidelity)로 복제할 수 있는 PCR 반응을 제작할 수 있다. For example, another nucleotide polymer having a high conducted also (processivity) ability to nucleotide polymerases, correction (proofreading) having (the ability to duplicate a large nucleotide fragments) (the ability to correct the errors in the height of the target nucleic acid sequence) by complementary La zero, it can be prepared a PCR reaction to replicate long target sequences with a high degree of accuracy (fidelity). 상기 열안정성 폴리머라제는 그의 야생형 형태로 사용될 수 있다. The thermostable polymerases may be used in its wild-type form. 대안적으로, PCR 반응을 촉진시키기 위해, 상기 폴리머라제를 효소의 단편을 포함하거나, 또는 유익한 특성을 제공하는 돌연변이를 포함하도록 변형시킬 수 있다. Alternatively, it can be modified to include mutations, including, fragments of the enzyme to the polymerase in order to facilitate the PCR reaction, or provide or beneficial properties. 일 구체예에서, 상기 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. In one embodiment, the thermostable polymerases may best be referred to Taq polymerase. 향상된 특성을 갖는 다수의 Taq 폴리머라제 변이체들이 공지되어 있으며, AmpliTaq TM , AmpliTaq TM , 스토펠(Stoffel) 단편, SuperTaq And a plurality of Taq polymerase variants with improved properties are known, AmpliTaq TM, AmpliTaq TM, testosterone pel (Stoffel) fragment, SuperTaq TM , SuperTaq TM plus, LA Taq TM, TM SuperTaq plus, LA Taq TM , LApro Taq TM, LApro Taq TM 및 EX Taq TM and EX Taq TM 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Include, TM, it is not limited thereto. 또다른 구체예에서, 본 발명의 멀티플렉스 증폭 반응에 사용되는 열안정성 폴리머라제는 AmpliTaq 스토펠 단편이다. In another embodiment, the thermostable polymerase used in the multiplex amplification reaction of the present invention are testosterone AmpliTaq pel fragment.

RNA RNA 타겟 핵산 서열의 역전사 효소- PCR 증폭 Reverse transcriptase enzyme of the target nucleic acid sequence - PCR amplification

유전자 발현 연구를 위해 가장 널리 사용되는 기법들 중 하나는, PCR에 의한 증폭용 주형으로서 mRNA 서열(들)에 대한 제1-가닥 cDNA(first-strand cDNA)를 사용한다. One of the techniques most widely used for gene expression studies, and used as a template for amplification by PCR of first-strand cDNA (first-strand cDNA) of the mRNA sequence (s).

용어 "역전사 효소 활성(reverse transcriptase activity)" 및 "역전사(reverse transcription)"는 주형으로서 RNA 가닥을 사용하여, DNA 가닥 (즉, 상보적 DNA, cDNA)을 합성할 수 있는, RNA-의존적 DNA 폴리머라제로서의 특징을 갖는 폴리머라제 종류의 효소 활성을 지칭한다. The term "reverse transcriptase activity (reverse transcriptase activity)", and "RT (reverse transcription)", using the RNA strand as a template, DNA strands can be synthesized (i.e., complementary DNA, cDNA), RNA- dependent DNA polymerase It refers to a polymerase having a type characterized as a cyclase enzyme activity.

"역전사 효소-PCR(reverse transcriptase-PCR)" 또는 "RNA PCR"은 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 프라이머 신장의 다중 사이클 전에, 우선 단일가닥 DNA 분자를 생산하기 위해, RNA 주형 및 역전사 효소, 또는 역전사 효소 활성을 갖는 효소를 사용하는 PCR 반응이다. "Reverse transcriptase -PCR (reverse transcriptase-PCR)" or "RNA PCR" is a DNA- dependent DNA polymerase prior to multiple cycles of primer extension, first, to produce single-stranded DNA molecules, RNA template and the reverse transcriptase or reverse transcriptase PCR is a reaction using an enzyme having activity. 멀티플렉스 PCR은 통상적으로 단일 반응 내에 2개 이상의 프라이머를 포함시켜, 단일 반응에서 한 종류 이상의 증폭 산물을 생성하는 PCR 반응을 지칭한다. Multiplex PCR is to typically include two or more primers in a single reaction, refers to a PCR reaction to produce more than one type of amplification products in a single reaction.

예시적인 역전사 효소는, 미국 등록특허 제4,943,531호에 개시된, 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, M-MLV) RT, 미국 등록특허 제5,405,776호에 개시된, M-MLV-RT의 돌연변이 형태, 소 백혈병 바이러스(bovine leukemia virus, BLV) RT, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) RT, 조류 골수아구증 바이러스(Avian Myeloblastosis Virus, AMV) RT 및 미국 등록특허 제7,883,871호에 개시된 역전사 효소들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Exemplary reverse transcriptase is US registered disclosed in Patent 4,943,531 call, mole Ronnie rodent leukemia virus (Moloney murine leukemia virus, M-MLV) RT, U.S. Patent No. disclosed in 5,405,776 arc, mutant forms of M-MLV-RT, bovine leukemia virus comprising (bovine leukemia virus, BLV) RT, Rous sarcoma virus (Rous sarcoma virus, RSV) RT, avian bone marrow ah vera virus (avian Myeloblastosis virus, AMV) RT, and U.S. Patent No. 7,883,871 RT enzyme disclosed in one, but not limited thereto.

종점(end-point) 또는 실시간(real-time) 분석에 의해 수행되는, 역전사 효소-PCR 과정은 두 가지 별개의 분자 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; The end point (end-point) or real-time (real-time), reverse transcriptase -PCR procedure performed by the analysis comprises two distinct molecular synthesis: (i) the synthesis of cDNA from the RNA template; 및 (ii) PCR 증폭을 통한, 상기 새로 합성된 cDNA의 복제. And (ii), the replication of the newly synthesized cDNA through PCR amplification. 역전사 효소-PCR과 종종 관련된 기술적 문제들을 처리하기 위한 시도로서, 상기 과정의 3가지 기본적인 단계를 고려한, 다수의 프로토콜이 개발되었다: (a) RNA의 변성 및 역방향 프라이머의 혼성화; In an attempt to address the technical problems often associated with the reverse transcriptase -PCR, 3 gaji considering the basic steps, a number of protocols have been developed in the above process: (a) hybridizing the modified and the reverse primer of the RNA; (b) cDNA의 합성; (B) synthesis of cDNA; 및 (c) PCR 증폭. And (c) PCR amplification. 소위 "커플링되지 않은(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정 (예를 들면, 2단계 역전사 효소-PCR)에서, 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적의 완충 조건을 사용한 독립적인 단계로서 수행된다. In the so-called "non-coupled (uncoupled)" Reverse transcriptase -PCR process (e.g., step 2 reverse transcriptase -PCR), reverse transcription is performed as an independent step using the optimal buffer condition for reverse transcriptase activity. cDNA 합성에 뒤이어, 반응물을 희석시켜 Taq DNA 폴리머라제 활성에 최적인 조건으로 MgCl 2 및 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 농도를 감소시키고, 표준 조건에 따라 PCR을 수행한다 (미국 등록특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호를 참조한다). The Following cDNA synthesis, followed by the reaction was diluted Taq DNA polymerase reduce the MgCl 2 and deoxy ribonucleotide triphosphate (dNTP) concentrations to the optimum condition in the active and, performing PCR according to standard conditions (US Patent No. 4,683,195 the call reference to the No. 4,683,202). 반대로, "커플링된(coupled)" RT PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성에 최적화된 통상의 완충액을 사용한다. In contrast, "coupled (coupled)" RT PCR methods use a conventional buffer that is optimized for reverse transcriptase and Taq DNA polymerase activity. 일 태양에서, 역방향 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 전에 수행되는 독립된 단계이고, 그 다음 단일 반응 용기로 첨가된다. In one embodiment, the annealing of reverse primer is a separate step carried out prior to the addition of the enzyme, it is then added in a single reaction vessel. 또다른 태양에서, 상기 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 한 성분이다. In yet another embodiment, the reverse transcriptase activity is a component of the thermostable Tth DNA polymerase. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn 2 + 존재 하에서 수행되고, 그 다음 PCR은 킬레이트화제(chelating agent)에 의해 Mn 2 + 를 제거한 뒤, Mg 2 + 의 존재 하에서 수행된다. Annealing and cDNA synthesis are performed in the Mn + 2 is present, then PCR is carried out in the presence of an after removing the Mn + 2 by chelating agents (chelating agent), Mg 2 + . 마지막으로 "연속적(continuous)" 방법 (예를 들면, 1단계 역전사 효소-PCR)은 상기 3개의 역전사 효소-PCR 단계를 하나의 연속적 반응으로 통합하여 구성성분 또는 효소의 첨가를 위해 반응 용기를 여는 것을 피할 수 있게 한다. Finally, the "continuous (continuous)" method (e.g., step 1 reverse transcriptase -PCR) is to open the reaction vessel for the addition of the constituents enzyme or by integrating the three reverse transcriptase -PCR step as a continuous reaction It should be able to avoid. 연속적 역전사 효소-PCR은 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 및 Tth 폴리머라제의 역전사 효소 활성을 사용하는 단일 효소 시스템, 및 초기 온도가 65 ℃인, AMV RT 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 2 효소 시스템으로 기술되어 왔다. Continuously -PCR RT enzyme is described as thermostable Taq DNA polymerase enzyme and a single system, and an initial temperature of 65 ℃, 2 enzyme system using AMV RT and Taq DNA polymerase using the reverse transcriptase activity of Tth polymerase It has been. RNA 변성 단계는 생략할 수 있다. RNA denaturation step may be omitted.

특정한 구체예에서, 하나 이상의 프라이머를 표지화할 수 있다. In certain embodiments, it can be at least one labeled primer. 본 명세서에서 호환가능하게 사용되는, 용어 "표지(label)", "검출가능한 표지(detectable label)", 또는 "마커(marker)" 또는 "검출가능한 마커(detectable marker)"는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 폴리머, 또는 핵산 결합 인자(nucleic acid binding factor)에 부착하는 임의의 화학적 모이어티를 지칭하며, 상기 부착은 공유적 또는 비공유적 결합에 의한 것일 수 있다. Are used interchangeably herein, the term "cover (label)", "detectable label (detectable label)", or "marker (marker)" or "detectable marker (detectable marker)" is a nucleotide, a nucleotide polymer, or a nucleic acid binding factor, and refers to any chemical moiety attached to the (nucleic acid binding factor), the attachment may be by binding covalently or non-covalently. 바람직하게는, 상기 표지는 검출가능하고, 본 발명의 실시자로 하여금 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 폴리머를 검출가능하게 한다. Preferably, the label is detectable and, and give the practice of the invention enables detecting a nucleotide or a nucleotide polymer. 검출가능한 표지는 발광(luminescent) 분자, 화학발광(chemiluminescent) 분자, 형광 색소, 유색 분자, 방사성 동위원소 또는 섬광체(scintillant)를 포함한다. Detectable label comprises a light-emitting (luminescent) molecule, chemiluminescent (chemiluminescent) molecules, fluorescent pigments, colored molecules, radioisotopes or scintillator (scintillant). 검출가능한 표지는 또한, (바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, HRP, 단백질 A(protein A), 단백질 G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni 2 + , FLAG 태그, myc 태그와 같은) 임의의 유용한 링커 분자, 중금속, 효소(예로서, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제 및 루시퍼라아제를 포함한다), 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 색소 및 비색 기질(calorimetric substrate)을 포함한다. Detectable label is further (biotin, avidin, streptavidin, HRP, protein A (protein A), protein G, an antibody or a fragment thereof, Grb2, polyhistidine, Ni 2 +, such as the FLAG tag, myc tag) any useful linker molecules, heavy metals, enzymes (e. g., include alkaline phosphatase, peroxidase and luciferase), the electron donor / acceptor, acridinium ester (acridinium ester), pigments and colorimetric substrate (calorimetric substrate) It includes. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)의 경우에서와 같이, 질량의 변화가 검출가능한 표지로서 고려될 수 있을 것으로 예상된다. In addition, the plastic surface, as in the case of driven 0 people (surface plasmon resonance), is expected to be viewed as a possible sign change of mass is detected. 숙련된 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지들을 용이하게 인식할 것이다. Skilled technician will easily recognize useful detectable label that are not mentioned above, which can be used in the practice of the invention.

1단계 역전사 효소-PCR은 커플링되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 여러 이점을 제공한다. Step 1 reverse transcriptase -PCR provides several advantages over uncoupled RT enzyme -PCR. 1단계 역전사 효소-PCR은 커플링되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 취급을 덜 필요로 하고 (예를 들면, 두 반응 단계 사이에 구성성분 또는 효소의 첨가를 위해 반응 용기를 여는 것), 따라서 보다 덜 노동집약적이며, 공수 요구량(required number of person hour)을 감소시킨다. The first stage is treated in the reverse transcriptase -PCR reaction mixture reagents and nucleic acid products than uncoupled RT enzyme -PCR and require less (for example, a reaction vessel for the addition of the constituents enzyme or between the two reaction steps it is less labor intensive), and therefore more open, reducing airborne requirements (required number of person hour). 1단계 역전사 효소 -PCR은 또한 보다 적은 시료를 필요로 하고, 오염 위험을 감소시킨다. Step 1 reverse transcriptase thereby -PCR also requires less sample, and reduces the risk of contamination. 1단계 역전사 효소-PCR의 민감성 및 특이성은, 주어진 샘플 중 하나 내지 여러 유전자들의 발현 수준 연구, 또는 병원성 RNA의 검출에 매우 적합한 것으로 나타났다. Sensitivity and specificity of the reverse transcriptase step is -PCR, was very suitable for the study of the expression levels one to several genes in a given sample, or the detection of pathogenic RNA. 통상적으로, 이 과정은 cDNA 합성을 개시하기 위한 유전자-특이적 프라이머의 사용에 제한되었다. Typically, the procedure is the gene for initiating cDNA synthesis - was limited to the use of specific primers.

이러한 역전사 효소-PCR 기법과 조합된, 온-라인 검출에 의한 PCR 반응의 동력학 측정 능력은, 높은 민감도로 RNA 사본수의 정확하고 정밀한 정량화를 가능하게 하였다. The reverse transcriptase -PCR technique and the combined, on-kinetics measuring capability of the PCR reaction by the line detection, and enables the accurate and precise quantification of the number of RNA copies with a high sensitivity. 이는 하기에서 논의되는, 5' 형광 뉴클레아제 분석(fluorogenic nuclease assay) ("TaqMan TM ") 또는 엔도뉴클레아제 분석(endonuclease assay) ("CataCleave TM ")과 같은 형광 이중-표지 혼성화 프로브(fluorescent dual-labeled hybridization probe) 기술에 의한, 증폭 과정 중의 형광 모니터링 및 PCR 산물의 측정을 통하여 역전사 효소-PCR 산물을 검출함으로써 가능해졌다. It to, the 5 'fluorescent nuclease analysis discussed in (fluorogenic nuclease assay) ( "TaqMan TM") or endo New assay nuclease (endonuclease assay) Fluorescent double-like ( "CataCleave TM") - labeled hybridization probe (fluorescent by a dual-labeled hybridization probe) technique, by measuring the fluorescence and monitor amplification of the PCR product was made possible by detecting the RT enzyme -PCR products.

CataCleave TM CataCleave TM 프로브를 사용한 실시간 PCR Real-time PCR with probes

증폭 후 앰플리콘 검출은 힘들고 장시간이 소요된다. After amplification amplicon detection is difficult and takes a long time. PCR 과정 중에 증폭을 모니터링하기 위해 실시간 방법이 개발되었다. This method has been developed for real-time monitoring during the PCR amplification process. 이 방법들은 일반적으로, 새롭게 합성된 DNA에 결합하는 형광 표지된 프로브, 또는 이중 가닥 DNA 사이에 삽입되는 경우 형광 방출이 증가하는 색소를 사용한다. These methods are generally, when it is inserted between the fluorescent label which binds to newly synthesized DNA probe, or a double-stranded DNA, use of the dye to the fluorescent emission increases. 실시간 검출 방법은 게놈 DNA 또는 게놈 RNA 중 SNP의 PCR 검출에 적용가능하다. Real-time detection method is applicable to the detection of the PCR of the genomic DNA or genomic RNA SNP.

상기 프로브는 일반적으로, 두 발색단 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 타겟의 부재시 공여자(donor) 방출이 소광되도록 디자인된다. The probe generally, the design is such that the absence of the donor (donor) emission quenching of the target by a fluorescence resonance energy transfer between two chromophores (fluorescence resonance energy transfer, FRET). 공여 발색단은, 여기 상태에서, 수용 발색단과 가까운 거리에 있는 경우 수용 발색단에 에너지를 전이시킬 수 있다. Donor chromophore in an excited state, the chromophore can accommodate and transfer the energy to accommodate the chromophore if at close range. 이러한 전이는 항상 비-방사성이고, 쌍극자-쌍극자 커플링을 통해 발생한다. This transition is always non-radioactive and, dipole-dipole coupling occurs through. 두 발색단 사이의 거리를 충분하게 증가시키는 모든 과정은, FRET 효율을 감소시켜 공여 발색단 방출이 방사에 의해(radiatively) 검출될 수 있도록 할 것이다. All to sufficiently increase the distance between the chromophores process, will enable to reduce the efficiency of FRET can be detected by the donor chromophore emits radiation (radiatively). 통상적인 공여 발색단은, FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 텍사스 레드(Texas Red.)를 포함한다. A typical donor chromophore, and a FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, Texas Red, and (. Texas Red). 수용 발색단은 그의 여기 스펙트럼이 공여자의 방출 스펙트럼과 중첩되도록 선택된다. Receiving the chromophore is selected so that their excitation spectrum overlapping the emission spectrum of the donor. 그와 같은 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. An example of such a pair is a FAM-TAMRA. 또한, 다양한 공여자를 소광시킬 수 있는 비 형광성 수용자들이 존재한다. In addition, there are a non-fluorescent quencher capable of prisoners various donors. 공여자-수용자 FRET 쌍의 다른 적절한 예들이 당업자에게 공지되어 있을 것이다. Donor-recipient will be other suitable examples of FRET pairs are known to those skilled in the art.

PCR의 실시간 검출에 사용될 수 있는 통상적인 FRET 프로브의 예는 분자 비콘(molecular beacon) (예를 들면, 미국 등록특허 제5,925,517호), TaqMan TM 프로브 (예를 들면, 미국 등록특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CataCleave TM 프로브 (예를 들면, 미국 등록특허 제5,763,181호)를 포함한다. Examples of conventional FRET probes that can be used for real-time detection of PCR are molecular beacon (molecular beacon) (e. G., U.S. Patent No. 5,925,517 No.), TaqMan TM probes (e. G., U.S. Patent No. 5,210,015 and No. and a No. 5,487,972), and CataCleave TM probes (e. g., U.S. Patent No. 5,763,181 No.). 상기 분자 비콘은 비결합 상태에서는 프로브가, 공여자 및 수용자 발색단이 근접한 거리에 있고 공여자 방출이 감소하는 2차 구조를 형성하도록 디자인된 것인, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. The molecular beacon is in the disengaged state is the one of a single-stranded oligonucleotide nucleotides designed to form a secondary structure in which the probe is, donor and recipient chromophore this donor emission decrease be in close proximity. 적절한 반응 온도에서, 상기 비콘은 펼쳐지며, 앰플리콘에 특이적으로 결합한다. At a suitable reaction temperature, the beacon is pyeolchyeojimyeo be coupled to the specific amplicon. 펼쳐진 후에는, 공여자 및 수용자 발색단 사이의 거리가 증가하여 FRET이 반전되고, 특수 기기를 사용하여 공여자 방출을 모니터링할 수 있다. Once expanded, the increase in the distance between the donor and recipient chromophore FRET is inverted, it is possible to use special equipment to monitor the donor emission. TaqMan TM 및 CataCleave TM 기술은, 공여자 및 수용자 발색단이 FRET을 반전시킬 정도로 충분히 분리되도록 하기 위해, 사용되는 FRET 프로브가 절단된다는 점에서 분자 비콘과 다르다. TaqMan TM and TM CataCleave technology, the donor and the recipient is a chromophore to allow it to separate enough to reverse the FRET, different from the molecular beacon in that the cutting FRET probes used.

TaqMan TM 기술은 5' 말단이 공여 발색단으로 표지되고, 3' 말단이 수용 발색단으로 표지된, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. TaqMan TM technology "is labeled with a terminal donor chromophore, the 3 'terminal oligonucleotide 5 is a single-stranded labeled with chromophores receiving uses a nucleotide probe. 증폭에 사용되는 DNA 폴리머라제는 5'→ 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가져야 한다. DNA polymerase used for amplification must have a 5 '→ 3' exonuclease activity. TaqMan TM 프로브는 프라이머가 결합하는 것과 동시에 앰플리콘의 한 가닥에 결합한다. TaqMan TM probe while at the same time binding to a single strand of the amplicon for the primer combination. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키면서, 상기 폴리머라제는 결국 결합되어 있는 TaqMan TM 프로브와 마주칠 것이다. DNA polymerase I, while elongating the primer, the polymerase will run into the TaqMan TM probes that are coupled in the end. 이 시점에, 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단에서부터 순차적으로 TaqMan TM 프로브를 분해할 것이다. At this point, the exonuclease activity of polymerase will decompose the TaqMan TM probes from the 5 'end by one. 프로브가 분해되면, 상기 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드는 반응 완충액 내로 방출된다. When the probe is decomposed, mono-nucleotide containing the probe is discharged into the reaction buffer. 공여자는 수용자로부터 멀어지고, FRET은 반전된다. Donor is moving away from the audience, FRET is reversed. 프로브 절단을 확인하기 위해 공여자로부터의 방출을 모니터링한다. To determine the cut probe monitors the emission from the donor. TaqMan TM 이 작용하는 방식 때문에, 특정한 앰플리콘은 PCR의 매 사이클에 대해 단 1회만 검출될 수 있다. Since TaqMan manner that TM acts, specific amplicons may be detected only once for every cycle of the PCR. TaqMan TM TaqMan TM 타겟 부위를 통한 프라이머의 신장은 이중가닥 산물을 생성시켜, 앰플리콘이 후속 PCR 주기에서 변성될 때까지 TaqMan TM 프로브의 추가적인 결합을 막는다. Elongation of the primers with the target area will prevent further binding of TaqMan TM probe until to produce a double-stranded product, the amplicon is to be modified in the subsequent PCR cycles.

그의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 삽입되는, 미국 등록특허 제5,763,181호는, ("CataCleave TM "으로 지칭되는) 또다른 실시간 검출 방법을 개시한다. Its contents are to be inserted herein by reference, U.S. Patent No. 5,763,181 discloses, discloses a further real-time detection method (referred to as "CataCleave TM"). CataCleave TM CataCleave TM 기술은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성을 갖지 않는 제2 효소에 의해 달성된다는 점에서 TaqMan TM 와 구별된다. Technique is distinct from the TaqMan TM in that it is achieved by a second enzyme cutting of the probe does not have a polymerase activity. CataCleave TM 프로브는 예를 들면, 제한 효소 또는 RNase와 같은, 엔도뉴클레아제의 타겟인 분자 내 서열을 갖는다. CataCleave TM probes, for example, has a target sequence within the molecule, such as a restriction endonuclease or the RNase. 한 예에서, CataCleave TM 프로브는 상기 프로브의 5' 및 3' 말단이 DNA로 구성되고, 절단 부위는 RNA를 포함하는 키메라(chimeric) 구조를 갖는다. In one example, CataCleave TM probes are 5 'and 3' ends of the probe is composed of DNA, cleavage sites have the chimera (chimeric) structure containing RNA. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은 양 말단 또는 내부가, FRET 쌍으로 표지된다. The DNA sequence portion of the probe is a positive terminal or internal, is labeled with a FRET pair. PCR 반응은 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단시킬, RNase H 효소를 포함한다. The PCR reactions included an RNase H enzyme to cut the RNA sequence portion of the RNA-DNA double strand to specifically. 절단 후에, 상기 프로브의 2개의 절반은 반응 온도에서 타겟 앰플리콘으로부터 해리되고, 반응 완충액으로 확산된다. After cutting, the two halves of the probe is dissociated from the target amplicon in the reaction temperature, and is diffused into the reaction buffer. 공여자 및 수용자가 분리됨에따라, FRET은 TaqMan TM 프로브와 마찬가지의 방식으로 반전되고, 공여자 방출을 모니터링할 수 있다. Depending on the donor and recipient are separated, FRET is reversed to the TaqMan TM probes with a similar manner, it is possible to monitor the donor emission. 절단 및 해리는 추가적인 CataCleave TM 결합을 위한 부위를 재생시킨다. Cutting and Harry regenerates a site for additional bonding CataCleave TM. 이러한 방법으로 단일 앰플리콘은, 프라이머가 CataCleave TM 프로브 결합 부위를 통해 신장될 때까지 타겟으로서, 또는 다수회 프로브 절단을 위해 사용될 수 있다. A single amplicon in this way, the primers can be used for, or a plurality of times cut probe as a target until it extends through the probe CataCleave TM binding site.

CataCleave TM CataCleave TM 프로브의 표지화 Labeling of the probe

용어 "프로브(probe)"는 특이적 핵산 서열, 예를 들면, 타겟 핵산 서열의 상보적인 영역에 서열 특이적으로 혼성화하도록 고안된, 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. The term "probe (probe)" includes a polynucleotide containing a specific nucleic acid sequence, for designed, specific portions to hybridize to the example, the specific sequences on the complementary region of the target nucleic acid sequence ever. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. In one embodiment, the oligonucleotide probe has a length of 15-60 nucleotides. 보다 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. More preferably, the oligo-nucleotide probe has a length of 18 to 30 nucleotides. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 구체적인 서열 및 길이는 그가 결합하는 타겟 폴리뉴클레오티드의 성질에 부분적으로 의존한다. Specific sequences and the length of the oligonucleotide of the present invention the probe depends in part on the nature of the target polynucleotide he combined. 결합 위치 및 길이는 특별한 구체예에 있어서 적절한 어닐링 및 용융 특성을 달성하도록 변화시킬 수 있다. Binding location and length may be varied to achieve appropriate annealing and melting properties in the particular embodiment. 그와 같은 디자인 선택을 위한 지침은, 그의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 삽입되는, 미국 등록특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에 개시된 TaqMan TM 분석 또는 CataCleave TM 을 설명하는 다수의 참조문헌에서 찾아볼 수 있다. Guidelines for the design choice such, the number of which its content is described a TaqMan TM analysis or CataCleave TM disclosed herein to be inserted in, U.S. Patent No. 5,763,181, 1 - 6,787,304 arc, and the 7,112,422 call by reference reference can be found in the literature.

특정한 구체예에서, 상기 프로브는 타겟 핵산 서열에 대해 "실질적으로 상보적"이다. In certain embodiments, the probe is "substantially complementary" to a target nucleic acid sequence.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은, 어닐링하여 안정한 이중가닥을 형성할 수 있을 정도로 서열에 있어서 충분히 상보적인, 두 핵산 가닥을 지칭한다. , The term "substantially complementary (substantially complementary)" as used herein, in the annealing so to be able to form a stable double-stranded sequences of sufficiently complementary, refers to two nucleic acid strands. 상보성은 완전할 필요는 없다; Complementarity need not be perfect; 예를 들면, 두 핵산 사이에, 임의의 수의 매칭되지 않는 염기쌍이 존재할 수 있다. E.g., between two nucleic acid, there may be a non-matching base pairs of random numbers. 그러나, 미스매치의 수가 너무 많아서 가장 스트린전시가 낮은(the least stringent) 혼성화 조건에서조차 혼성화가 이루어지지 않는 경우, 상기 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. However, if the number of mismatches is so great the host Lin display that does not hybridize is achieved even at low (the least stringent) hybridization conditions, the sequence is not a substantially complementary sequence. 본 명세서에서, 두 서열이 "실질적으로 상보적인" 것으로 지칭되는 경우, 이는 상기 서열들이 선택된 반응 조건 하에서 혼성화하기에 상호 간 충분히 상보적이라는 것을 의미한다. In this specification, when the two sequences are referred to as "substantially complementary", which means that sufficiently complementary between each other to hybridize under the reaction conditions to the sequences selected. 핵산 상보성, 및 특이도 달성에 충분한 혼성화의 스트린전시(stringency) 간의 관계는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. Relationship between complementary nucleic acids, and host-specific lean display (stringency) of hybridization sufficient to achieve is well known in the art. 실질적으로 상보적인 두 가닥은, 예를 들면, 완전히 상보적이거나, 또는 혼성화 조건이 예를 들면, 쌍합(pairing) 서열 및 비쌍합(non-pairing) 서열의 구별을 가능하게 하기에 충분한 한, 하나 내지 다수의 미스매치를 포함할 수 있다. Substantially complementary to the two strands may be, for example, for a fully complementary, or hybridization conditions such as ssanghap (pairing) sufficient one, one to enable the sequence and the non-ssanghap (non-pairing) distinction of the sequence to may include a number of mismatches. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중가닥 영역에서, 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50 % 또는 그 미만, 또는 상기 범위 사이의 임의의 %의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 지칭할 수 있다. Thus, "substantially complementary" sequence is a sequence in a double-stranded region, having a base pair complementarity of 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, any% between 50% or less, or the range It can be referred to.

본 명세서에서 사용되는 "선택된 영역(selected region)"은 프로브의 RNA 서열에 어닐링하는 타겟 DNA 또는 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "Selected area (selected region)," as used herein refers to a polynucleotide sequence of the target DNA or cDNA that anneals to the RNA sequence of the probe. 일 구체예에서, 타겟 DNA 또는 cDNA의 :"선택된 영역"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. In one embodiment, the target DNA or cDNA: "selected area" is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, may have 25 or more nucleotides in length.

본 명세서에서 사용되는, 부위-특이적 RNase H 절단은 타겟 DNA 서열에 완전히(entirely) 상보적이며, 그와 혼성화하여 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성하는, Catacleave TM 프로브 중 RNA 모이어티의 절단을 지칭한다. , Region As used herein-specific RNase H cleavage is complementary to a completely (entirely) in a target DNA sequence by hybridizing with the RNA: forming a DNA releasing double stranded, cleavage of the RNA moiety of Catacleave TM probes It refers.

상기 Catacleave TM The Catacleave TM 프로브 중 RNA 모이어티가 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하고, 표적 DNA 서열이 상기 다형성의 위치에 야생형 서열을 포함하는 경우, Catacleave TM 프로브와 야생형 타겟 DNA 서열 간 RNA:DNA 이형이중가닥의 형성은 상기 다형성 위치에서 단일 뉴클레오티드 미스매치를 초래하며, 이는 RNase H에 의한 Catacleave TM 프로브 중 RNA 모이어티의 절단을 막는다. When the RNA moiety of the probes include a wild-type sequence containing a single nucleotide polymorphism, and the target DNA sequence of the polymorphic position, Catacleave TM probe and the wild-type target DNA between the sequences RNA: Formation of DNA release duplexes is the polymorphic position resulting in a single nucleotide mismatch at, which prevents the cleavage of Catacleave TM probes of RNA by RNase H moiety.

마찬가지로, 타겟 DNA 서열이 SNP 서열을 포함하고, Catacleave TM Similarly, a target DNA sequence containing the SNP sequence, Catacleave TM 프로브의 RNA 모이어티가 다형성 위치에 야생형 서열을 포함하는 경우, Catacleave TM If the RNA moiety of the probe, including the wild-type sequence in the polymorphic position, Catacleave TM 프로브와 SNP 서열을 포함하는 야생형 타겟 DNA 서열 간의 RNA:DNA 이형이중가닥의 형성은 상기 다형성 위치에서 단일 뉴클레오티드 미스매치를 초래하며, 이는 RNase H에 의한 Catacleave TM RNA between the wild-type target DNA sequence comprising the probe and the SNP sequence: and results in a single nucleotide mismatch is formed at the polymorphic position of the double-stranded DNA releasing, which Catacleave by RNase H TM 프로브 중 RNA 모이어티의 절단을 막는다. It inhibits the cleavage of RNA moiety of the probe.

본 명세서에서 사용되는, Catacleave TM As used herein, Catacleave TM 프로브의 "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 상기 프로브에 공유적 또는 비공유적 수단에 의해 부착된 형광색소(fluorochrome) 화합물을 포함하는 임의의 표지를 지칭한다. "Cover (label)" or "detectable label (detectable label)" of a probe refers to any marker comprising a fluorescent dye (fluorochrome) compound attached by a covalent or non-covalent means to the probe.

본 명세서에서 사용되는, "형광색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기된 후 빛을 방출하는, 형광 화합물을 지칭한다. , "Fluorescent dye (fluorochrome)" as used herein refers to a fluorescent compound which emits light after being excited by light of a shorter wavelength than the emitted light. 용어 "형광 공여자(fluorescent donor 또는 fluorescence donor)"는, 본 발명에서 기술되는 분석시험에서 측정되는 빛을 방출하는 형광색소를 지칭한다. The term "fluorescent donor (donor fluorescent or fluorescence donor)" is refers to a fluorescent dye that emits light which is measured in the assay described herein. 보다 특별하게는, 상기 형광 공여자는 형광 수용자에 의해 흡수되는 빛을 제공한다. More particularly, the fluorescent donor and provides the light that is absorbed by the fluorescent recipient. 용어 "형광 수용자(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여자로부터 방출되는 빛을 흡수하는 제2 형광색소 또는 켄쳐(quencher) 분자를 지칭한다. The term "fluorescent recipient (fluorescent acceptor or acceptor fluorescence)" refers to the second fluorescent dye or quencher (quencher) molecule that absorbs light emitted from a fluorescent donor. 제2 형광색소는 형광 공여자로부터 방출되는 빛을 흡수하고, 상기 형광 공여자로부터 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. A second fluorescent dye absorbs the light emitted from a fluorescent donor, and emits light of a longer wavelength than the light emitted from the fluorescent donor. 켄쳐 분자는 형광 공여자로부터 방출되는 빛을 흡수한다. Quencher molecule absorbs light emitted from a fluorescent donor.

Alexa Fluor TM 350, Alexa Fluor TM 430, Alexa Fluor TM 488, Alexa Fluor TM 532, Alexa Fluor TM 546, Alexa Fluor TM 568, Alexa Fluor TM 594, Alexa Fluor TM 633, Alexa Fluor TM 647, Alexa Fluor TM 660, Alexa Fluor TM Alexa Fluor TM 350, Alexa Fluor TM 430, Alexa Fluor TM 488, Alexa Fluor TM 532, Alexa Fluor TM 546, Alexa Fluor TM 568, Alexa Fluor TM 594, Alexa Fluor TM 633, Alexa Fluor TM 647, Alexa Fluor TM 660, Alexa Fluor TM 680, 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 플루오레세인(Fluorescein), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 514, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 로다민 X, 텍사스 레드 색소(Texas Red dye), QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 6501665, BODIPY 680, 7-diethylamino-coumarin-3-carboxylic acid, fluorescein (Fluorescein), Oregon Green (Oregon Green) 488, Oregon Green 514, tetramethyl rhodamine (Tetramethylrhodamine), rhodamine X, Texas Red dye (Texas Red dye), QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노쿠마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu 3 + )-AMCA 및 TTHA(Eu 3 + )AMCA를 포함한, 임의의 발광 분자, 바람직하게는 형광색소 및/또는 형광 켄쳐(fluorescent quencher)가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. TMR-X, BODIPY TR-X , dialkylamino coumarin, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3 , DTPA (Eu 3 +) -AMCA and TTHA (Eu + 3), any of the light-emitting molecules, including AMCA, It is preferably a fluorescent dye and / or a fluorescence quencher (fluorescent quencher) may be used in the practice of the invention.

일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 말단 뉴클레오티드는 블로킹되거나, 또는 핵산 폴리머라제에 의한 신장이 불가능하도록 처리된다. In one embodiment, the oligonucleotide probe 3 'terminal nucleotide is the blocking, or, or is treated to possible elongation of a nucleic acid polymerase. 그와 같은 블로킹은 편리하게는, 프로브의 말단 3' 위치에 리포터 또는 켄쳐 분자를 부착시킴으로써 수행된다. Such blocking is performed by Conveniently, attaching a reporter or quencher molecule to the terminal 3 of the probe position.

일 구체예에서, 리포터 분자는 연결 모이어티(linking moiety)에 의해 프로브의 말단 3' 또는 말단 5'에 부착하도록 유도된 형광 유기 색소이다. In one embodiment, the reporter molecule is a fluorescent organic dye derived for attachment to the terminal 3 'end or 5' of the probe by a connecting moiety (linking moiety). 바람직하게는, 켄쳐 분자들은 또한, 본 발명의 구체예에 따라 형광성 또는 비형광성인 유기 색소이다. Preferably, quencher molecules are also a fluorescent or non-formation of light-organic pigments in accordance with an embodiment of the present invention. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 켄쳐 분자는 형광성이다. For example, in a preferred embodiment of the invention, the quencher molecule is fluorescent. 일반적으로, 켄쳐 분자가 형광성인지 또는 비-방사 붕괴(non-radiative decay)에 의해 리포터로부터 전이된 에너지를 단순히 방출하는지 여부와 무관하게, 켄쳐의 흡수 밴드는 리포터 분자의 형광 방출 밴드와 실질적으로 중첩되어야 한다. Generally, the quencher molecule is fluorescent or a non-radiation collapse (non-radiative decay) to the absorption band of the quencher, regardless of whether it is simply emit the transferred energy from the reporter by the fluorescence emission band and substantially overlaps with the reporter molecule It should be. 여기된 리포터 분자로부터 에너지를 흡수하나, 에너지를 방사적으로 방출하지 않는 비-형광 켄쳐 분자는 본 출원에서 발색 분자(chromogenic molecule)로 지칭한다. One absorb energy from excited reporter molecules, that does not release energy in a radially non-fluorescent quencher molecules are referred to as color-developing molecules (chromogenic molecule) in the present application.

예시적인 리포터-켄쳐 쌍은 플루오레세인을 포함한, 잔틴(xanthene) 색소 및 로다민(rhodamine) 색소로부터 선택될 수 있다. Exemplary reporter-quencher pairs may be selected from, xanthine (xanthene) dyes and rhodamine (rhodamine) dyes, including fluorescein. 올리고뉴클레오티드에 부착하기 위한 결합 부위 또는 결합 작용기로서 사용될 수 있는, 그의 페닐 모이어티 상에 치환체를 갖는, 상기 화합물들의 다수의 적합한 형태들이 널리 시판되고 있다. Oligonucleotide has binding sites or having a substituent on its phenyl moiety, which can be used as the binding functional group, and a number of suitable forms of such compounds are widely commercially available for attachment to a nucleotide. 또다른 형광 화합물의 군은, 알파 또는 β위치에 아미노 기를 갖는, 나프틸아민(naphthylamine)이다. In another group of fluorescent compounds are the alpha or naphthylamine (naphthylamine) having the amino groups in β position. 그와 같은 나프틸아미노 화합물에 포함되는 것으로는 1-디메틸아미노나프틸-5-술포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 술포네이트 및 2-p-투이디닐-6-나프탈렌 술포네이트가 있다. To be included in the naphthylamino compounds, such as those have a 1-Dimethylamino-naphthyl-5-sulfonate, 1-Reno not-8-naphthalene sulfonate and 2-p--to Edie carbonyl-6-naphthalene sulfonate . 기타 색소들은, 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지와 같은, 아크리딘(acridine), N-(p-(2-벤족사졸릴)페닐)말레이미드, 벤족사디아졸(benzoxadiazole), 스틸벤(stylbene), 파이렌(pyrene) 등을 포함한다. Other pigments include, 3-phenyl-7-isocyanato coumarin, 9-isothiocyanate when Ana Toa acridine and acridine, such as orange, acridine (acridine), N- (p- (2- benzoxazolyl ) phenyl) comprises a maleimide, benzoxazolyl oxadiazole (benzoxadiazole), stilbene (stylbene), pyrene (pyrene), and the like.

일 구체예에서, 리포터 및 켄쳐 분자는 플루오로세인 및 로다민 색소로부터 선택된다. In one embodiment, the reporter and quencher molecules are selected from hexanes and rhodamine dye fluoro.

하기 참조문헌에 의해 예시되는, 상기 리포터 또는 켄쳐 분자들을 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 부착시키기 위한 다수의 연결 모이어티 및 방법들이 존재한다: Eckstein 편집, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); To raise them, the reporter or quencher molecule is illustrated by the reference exists a plurality of connecting moieties, and methods for attaching the 5 'or 3' end of the oligonucleotide are: Eckstein editing, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman 등에 의한, Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (올리고뉴클레오티드상의 3' 티올 기); Due to Zuckerman, Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (based on oligo-nucleotide 3 'thiol); Sharma 등에 의한, Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3' 술피드릴(sulfhydryl)); Due Sharma, Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3 'sulfinyl drill (sulfhydryl)); Giusti 등에 의한, PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) 및 Fung 등에 의한, 미국 등록특허 제4,757,141호 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.에서 입수가능한, Aminolink.TM.Ⅱ에 의한 5' 포스포아미노 기) Stabinsky에 의한, 미국 등록특허 제4,739,044호 (3' 아미노알킬포스포릴 기); Due to Giusti, PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung, U.S. Patent No. 4,757,141 No. (Applied Biosystems, Foster City, Calif available, by Aminolink.TM.Ⅱ 5 'in due. phospho-amino group) by Stabinsky, U.S. Patent No. 4,739,044 No. (3 'aminoalkyl phosphoryl group); Agrawal 등에 의한, Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (포스포라미데이트 연결에 의한 부착); Caused by Agrawal, Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (attachment of the phosphonate lamina date connection); Sproat 등에 의한, Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5' 머캅토 기); 4837 (1987) (5 'mercapto group);:, Nucleic Acids Research, 15 due to Sproat Nelson 등, Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' 아미노 기) 등. Nelson et al, Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194, such as (1989) (group 3 'amino).

로다민 및 플루오로세인 색소는 또한 편리하게는, 포스포라미다이트 모이어티를 포함하는 색소 유도체에 의한 고체상 합성, 예를 들면, Woo 등에 의한, 미국 등록특허 제5,231,191호; Rhodamine and fluoro-old dye also Conveniently, the phosphine Fora midayi agent to solid phase synthesis by the pigment derivative containing the moiety, for example, due to Woo, U.S. Patent No. 5,231,191 - Ho; 및 Hobbs, Jr.에 의한, 미국 등록특허 제 4,997,928호의 마지막 단계에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록시기에 부착된다. And Hobbs, in by Jr., United States Patent No. 4,997,928 registered final step of heading oligonucleotide is attached to the 5 'hydroxyl of the nucleotide.

고체 지지체로의 CataCleave TM CataCleave to a solid support TM 프로브의 부착 Attachment of the probe

일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. In one embodiment, the oligonucleotide probe may be immobilized on a solid support. 상이한 프로브들이 상기 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 샘플 중에 존재하는 상이한 타겟 서열의 동시 검출에 사용될 수 있다. Different probes can be attached to the solid support, it can be used for the simultaneous detection of different target sequences present in the sample. 상이한 형광 파장을 갖는 리포터 분자가 상기 상이한 프로브에 사용될 수 있고, 그에 따라 독립적으로 검출될 상이한 프로브와의 혼성화를 가능하게 한다. Reporter molecules having different fluorescence wavelengths can be used on the different probes, to enable hybridization of the different probes to be detected independently accordingly.

올리고뉴클레오티드 프로브의 고정화를 위한 바람직한 고체 지지체 종류의 예는, 제어된 다공성 유리, 유리 플레이트, 폴리스티렌, 아비딘이 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 제어된 다공성 유리(controlled pore glass, CPG), 유리 플레이트 및 고도 가교 폴리스티렌(high cross-linked polystyrene)을 포함한다. The oligonucleotide Examples of preferred solid support type for the immobilization of the oligonucleotide probe, a controlled porous glass, glass plates, polystyrene, avidin coated polystyrene beads cellulose, nylon, acrylamide gel and activated dextran, controlled porous glass (controlled include pore glass, CPG), glass plates and high cross-linked polystyrene (high cross-linked polystyrene). 이 고체 지지체들은 그의 화학적 안정성, 작용기화의 용이성, 및 잘 정의된 표면적으로 인해, 혼성화 및 진단 연구에 바람직하다. The solid support are due to their chemical stability, ease of functionalization and well-defined surface areas, are preferred for hybridization and diagnostic studies. 제어된 다공성 유리(500 Å, 1000 Å) 및 비팽윤성(non-swelling) 고도 가교 폴리스티렌 (1000 Å)과 같은 고체 지지체들이, 그의 올리고뉴클레오티드 합성과의 상용성에 비추어 특히 바람직하다. Solid support such as controlled porous glass (500 Å, 1000 Å) and non-swellable (non-swelling) highly cross-linked polystyrene (1000 Å) are raised his is especially preferred in view of miscibility with the synthetic oligonucleotide.

올리고뉴클레오티드 프로브는 다양한 방식으로 고체 지지체에 부착될 수 있다. The oligonucleotide probe may be immobilized on a solid support in a variety of ways. 예를 들면, 프로브는, 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드가 상기 고체 지지체에 부착함으로써 고체 지지체에 부착될 수 있다. For example, a probe, a 3 'or 5' terminal nucleotide of the probe can be immobilized on a solid support by attachment to the solid support. 그러나 프로브는, 상기 프로브를 고체 지지체로부터 거리를 두게 하는 링커(linker)에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. However, the probe, by a linker (linker), which put the distance the probe from the solid support may be immobilized on a solid support. 상기 링커는 30 원자 이상의 길이를 갖는 것이 가장 바람직하며, 보다 바람직하게는 50 원자 이상의 길이를 갖는 것이 바람직하다. The linker, and most preferably having at least 30 atoms in length, preferably has a length more preferably at least 50 atoms.

고체 지지체에 고정화되는 프로브의 혼성화는, 일반적으로 상기 프로브가 고체 지지체로부터 30 원자 이상, 보다 바람직하게는 50원자 이상 분리되어 있을 것을 필요로 한다. Hybridization of the probes to be immobilized on a solid support, generally requires that the probe be separated from the more than 30 atoms from the solid support, more preferably at least 50 atoms. 이러한 분리를 달성하기 위해, 링커는 바람직하게는 상기 링커와 3' 뉴클레오시드 사이에 배치된, 스페이서(spacer)를 포함한다. To achieve this separation, the linker preferably comprises a spacer (spacer) arranged between the linker and the 3 'nucleoside. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 상기 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 해리시키기 위해, 링커 팔(arm)은 염기성 시약으로 분해될 수 있는 에스테르 결합에 의해 상기 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다. Oligonucleotide for nucleotide synthesis, the oligonucleotide to dissociate the oligonucleotide from the solid support, the linker arm (arm) is attached by an ester linkage which can be decomposed by a basic reagent to the 3'-OH of the 3 'nucleoside.

올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 부착시키기 위해 사용되는 다양한 링커들이 당해 기술분야에 공지되어 있다. Various oligonucleotide linker used to attach the oligonucleotide to a solid support are known in the art. 상기 링커는, 고체 지지체에 부착된 프로브와 표적 서열의 혼성화를 현저하게 간섭하지 않는, 임의의 화합물로 구성될 수 있다. The linker does not significantly interfere with the hybridization of the probe and the target sequence is immobilized on a solid support can be composed of any compound. 링커는 자동화된 합성에 의해 상기 링커에 용이하게 부가될 수 있는 호모폴리머 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. The linker by automated synthesis oligonucleotide homopolymer which can be easily attached to the linker may be formed of a nucleotide. 대안적으로, 작용기화 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머들이 링커로서 사용될 수 있다. Alternatively, polymers such as functionalized polyethylene glycol can be used as a linker. 그와 같은 폴리머는, 프로브와 타겟 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 현저하게 간섭하지 않기 때문에, 호모폴리머 올리고뉴클레오티드에 비해 바람직하다. Such polymer, oligonucleotide probe and the target because it does not significantly interfere with the hybridization of the nucleotide, oligonucleotide homopolymer is preferred as compared to the nucleotide. 폴리에틸렌 글리콜은 상업적으로 이용가능하고, 유기성 및 수성 매질 모두에 용해가능하며, 작용기화가 용이하고, 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성-후 조건에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다. Is particularly preferred because it completely stable in the conditions after-polyethylene glycol, and commercially available, soluble in both organic and aqueous media, and a functional group easily upset, and oligonucleotide synthesis and synthetic.

고체 지지체, 링커 및 프로브 간의 결합은 바람직하게는, 고온의 염기성 조건 하에서 염기 보호기를 제거하는 동안, 절단되지 않는다. A solid support, a bond between the linker and the probe are preferably, during removal of base protecting groups under basic conditions of high temperature, and is not cut. 바람직한 결합의 예는, 카르바메이트(carbamate) 및 아마이드 결합을 포함한다. Examples of preferred combination, includes the carbamate (carbamate), and amide bond. 프로브의 고정화는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 당업자는 고정화 조건을 결정할 수 있다. Immobilization of a probe are well known in the art, one of ordinary skill in the art can determine the immobilization conditions.

상기 방법의 일 구체예에 따르면, CataCleave TM 프로브를 고체 지지체에 고정화시킨다. According to one embodiment of the method, the immobilized CataCleave TM probes to a solid support. 상기 CataCleave TM 프로브는 검출가능한 표지, 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하며, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적이다. The CataCleave TM probes is a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid comprising a sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the target DNA sequence comprising a polymorphism, DNA nucleic acid sequence is the target of the probe It is substantially complementary to the DNA sequence adjacent to a selected region of the DNA sequence. 그 다음, 상기 프로브를, 프로브 내의 RNA 서열이 상기 다형성을 포함하는 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, RNase H의 존재 하에 핵산 샘플과 접촉시킨다. Then, the probe, the RNA sequences in the probes complementary to the DNA sequences and RNA in a PCR fragment containing the polymorphism: is contacted under conditions capable of forming a DNA release double-stranded, the nucleic acid sample in the presence of RNase H. 상기 RNA:DNA 이형이중가닥 내 RNA 서열의 RNase H 절단은, 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 실시간 증가를 야기하며, 상기 신호의 증가는 타겟 DNA 내의 다형성의 존재를 나타낸다. The RNA: RNase H cleavage of the RNA sequence within the double-stranded DNA releasing is, causes a real-time increase in the signal emitted from the marker on the probe, an increase in the signal indicates the presence of a polymorphism in the target DNA.

상기 방법의 또다른 구체예에 따르면, 고체 지지체에 고정화된 CataCleave TM 프로브는, 검출가능한 표지, 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하고, 상기 프로브의 RNA ogrtks서열은 다형성 위치에 야생형 DNA 서열을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적이다. According to another embodiment of the method, the CataCleave TM probes immobilized on a solid support, comprising a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequences, and, RNA ogrtks sequence of said probe comprises a wild-type DNA sequence in the polymorphic position and completely complementary to a selected region of the target DNA sequence, DNA nucleotide sequence of the probe is substantially complementary to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the target DNA sequence. 그 다음, 상기 프로브를, 프로브 내의 RNA 서열이 상기 다형성을 포함하는 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, RNase H의 존재 하에 핵산 샘플과 접촉시킨다. Then, the probe, the RNA sequences in the probes complementary to the DNA sequences and RNA in a PCR fragment containing the polymorphism: is contacted under conditions capable of forming a DNA release double-stranded, the nucleic acid sample in the presence of RNase H. 상기 타겟 DNA 서열이 다형성을 포함하는 경우, 상기 RNA:DNA 이중가닥 내의 다형성 위치에서의 미스매치는 상기 RNA:DNA 이형이중가닥 내의 RNA 서열의 RNase H 절단을 저해하고, 이는 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 실시간 감소를 야기하며, 상기 신호의 감소는 타겟 DNA 내의 다형성의 존재를 나타낸다. Those containing the said target DNA sequence polymorphisms, the RNA: mismatch at the polymorphic positions in the DNA double strand is the RNA: inhibit the RNase H cleavage of the RNA sequences in DNA release double-stranded, which emitted from the marker on the probe cause a reduction in the real-time signal, and the reduction of the signal indicates the presence of a polymorphism in the target DNA.

프로브의 고체 지지체로의 고정화는, 상기 프로브에 혼성화된 타겟 서열이 샘플로부터 용이하게 분리될 수 있게 한다. Immobilized to the solid support of a probe, enables the target sequence hybridized to the probe can be easily separated from the sample. 후기 단계에서, 상기 분리된 타겟 서열을 고체 지지체로부터 분리하고, 연구자의 구체적인 필요에 따라 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 가공 (예를 들면, 정제, 증폭)할 수 있다. At a later stage, the separated target sequence can be processed (e.g., purified, amplified) according to the process separate from the solid support, and the art according to the specific needs of the researcher is well known in the art.

Catacleave TM Catacleave TM 프로브의 Probe RNase H 절단 RNase H cleavage

RNase H는 RNA-DNA 혼성체 내의 RNA를 가수분해한다. RNase H will decompose the RNA in the RNA-DNA hybrid singer. 송아지 흉선에서 최초로 동정된, RNase H는 뒤이어 다양한 유기체에서 발견되었다. The first identified in calf thymus, RNase H was subsequently found in a variety of organisms. 정말로, RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에서 보편적으로 나타난다. Indeed, RNase H activity appears to be common in eukaryotes and bacteria. RNase H는 다양한 분자량 및 핵산분해(nucleolytic) 활성을 갖는 단백질 과(family)를 구성함에도 불구하고, 기질 요건은 다양한 이소타입(isotype)에 있어서 유사하게 나타난다. RNase H is despite constituting the protein and (family) having a different molecular weight and a nucleic acid degradation (nucleolytic) activity and substrate requirements appear to be similar in various isotypes (isotype). 예를 들면, 지금까지 연구된 대부분의 RNase H는, 엔도뉴클레아제로서 기능하고, 5' 포스페이트 및 3' 히드록시 말단을 갖는 분해 산물을 생성하기 위해 2가 양이온 (예를 들면, Mg 2 + , Mn 2 + )를 필요로 한다. For example, most RNase H studies so far, function as an endonuclease, and the second to produce a decomposition product having a 5 'phosphate and 3' hydroxyl terminus, for the cation (e.g., Mg 2 + and it requires a Mn 2 +).

원핵 생물에서, RNase H는 클로닝되었으며, 널리 그 특성이 규명되었다 (Crooke 등, (1995) Biochem J, 312 (Pt 2), 599-608; Lima 등, (1997) J Biol Chem, 272, 27513-27516; Lima 등, (1997) Biochemistry, 36, 390-398; Lima 등, (1997) J Biol Chem, 272, 18191-18199; Lima 등, (2007) Mol Pharmacol, 71, 83-91; Lima 등, (2007) Mol Pharmacol, 71, 73-82; Lima 등, (2003) J Biol Chem, 278, 14906-14912; Lima 등, (2003) J Biol Chem, 278, 49860-49867; Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8587-8591을 참조한다). In prokaryotes, RNase H has been cloned, has been widely identified that characteristics (such as Crooke, (1995) Biochem J, 312 (Pt 2), 599-608; Lima, etc., (1997) J Biol Chem, 272, 27513- 27516; Lima et al., (1997) Biochemistry, 36, 390-398; Lima et al., (1997) J Biol Chem, 272, 18191-18199; Lima et al., (2007) Mol Pharmacol, 71, 83-91; Lima et al., (2007) Mol Pharmacol, 71, 73-82; Lima, etc., (2003) J Biol Chem, 278, 14906-14912; Lima, etc., (2003) J Biol Chem, 278, 49860-49867; Itaya, M., Proc . Natl. the Acad. Sci., see USA, 1990, 87, 8587-8591). 예를 들면, 대장균 RNase HII는 213 아미노산의 길이를 가지며, RNase HI은 155 아미노산 길이를 갖는다. For example, E. coli RNase HII has a length of 213 amino acids, RNase HI has the 155 amino acids in length. 대장균 RNase HII는 대장균 RNase HI와 단지 17%만의 상동성을 갖는다. E. coli RNase HII has an E. coli RNase HI and only 17% homology to the bay. S,타이피무리움( S. typhimurium )으로부터 클로닝된 RNase H는 대장균 RNase HI와 단지 11개 위치만이 다르며, 155 아미노산의 길이를 가졌다 (Itaya, M. 및 Kondo K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4443-4449). . S, Thai blood bunch RNase H cloned from Titanium (S. typhimurium) is E. coli RNase HI and only differs in 11 positions, only, it had a length of 155 amino acids (Itaya, M. and Kondo K., Nucleic Acids Res, 1991, 19, 4443-4449).

다수의 바이러스, 기타 박테리아 및 효모로부터, RNase H 활성을 나타내는 단백질이 또한 클로닝 및 정제되었다 (Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). A number of viruses, from other bacteria and yeast, the protein represents an RNase H activity has also been cloned and purified (Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). 다수의 경우에서, RNase H 활성을 갖는 단백질들은 RNase H가 또다른 효소, 흔히 DNA 또는 RNA 폴리머라제의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된, 융합 단백질인 것으로 나타났다. In many cases, RNase H protein having activity are found to be a, a fusion protein fused to the amino or carboxy terminus of RNase H is another enzyme, often a DNA or RNA polymerase. 상기 RNase H 도메인은 대장균 RNase HI와 높은 수준의 상동성을 갖는 것으로 일관되게 밝혀졌으나, 다른 도메인들이 상당히 다양하기 때문에, 융합 단백질의 분자량 및 다른 특성들은 광범위하게 달라진다. The RNase H domain has jyeoteuna consistently found to have a high degree of homology with E. coli RNase HI, because the other domains vary substantially, the molecular weight and other characteristics of the fusion proteins vary widely.

고차 진핵생물에서, 분자량, 2가 양이온의 효과, 술피드릴 작용제(sulfhydryl agent)및 면역학적 교차-반응성의 차이에 기반하여 두 종류의 RNase H가 정의되었다 (Busen 등, Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203-208). In higher order eukaryotes, molecular weight, effects of divalent cation, a sulfinyl drill agonist (sulfhydryl agent) and immunological cross-reactivity was defined based on the difference between the two kinds of RNase H (such as Busen, Eur J. Biochem,.. 1977, 74, 203-208). RNase HI 효소는 68-90 kDa 범위의 분자량을 가지며, Mn 2 + 또는 Mg 2 + 에 의해 활성화되고, 술피드릴 작용제에 둔감한 것으로 보고되었다. RNase HI enzyme was reported to have a molecular weight of 68-90 kDa range, be activated by Mn 2 + or Mg 2 +, insensitive to the sulfinyl drill agent. 대조적으로, RNase HII 효소는 31-45 kDa 범위의 분자량을 갖고, Mg 2 + 를 필요로 하며, 술피드릴 작용제에 매우 민감하고, Mn 2 + 에 의해 억제되는 것으로 보고되었다 (Busen, W., 및 Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179-190; Kane, CM, Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7106-7108). In contrast, RNase HII enzyme was reported to have a molecular weight of 31-45 kDa range, require a Mg 2 +, and very sensitive to the sulfinyl drill agonists and inhibited by Mn 2 + (Busen, W., and Hausen, P., Eur J. Biochem, 1975, 52, 179-190;.. Kane, CM, Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196;.. Busen, W., J. Biol Chem, 1982, 257, 7106-7108).

RNase HII 특성을 갖는 효소들은 또한, 사람 태반으로부터, 가까운 동종성으로 정제되었다 (Frank 등, Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5247-5254). RNase HII enzyme having characteristics also been refined to near homogeneity from human placenta (Frank, etc., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5247-5254). 이 단백질은 약 33 kDa의 분자량을 가지며, pH 6.5-10의 범위, 최적 pH 8.5-9에서 활성을 갖는다. This protein has a molecular weight of about 33 kDa, has a pH range of 6.5-10, the optimum activity at pH 8.5-9. 이 효소는 Mg 2 + 를 필요로 하며, Mn 2 + 및 n-에틸 말레이미드에 의해 억제된다. The enzyme requires a Mg + 2, is inhibited by Mn 2 + and n- ethyl maleimide. 절단 반응의 산물은 3' 히드록시 및 5' 포스페이트 말단을 갖는다. Products of the cleavage reaction was 3 has a terminal phosphate, hydroxy and 5 '.

다양한 종에서 분리된 RNase의 상세한 비교는 Ohtani N, Haruki M, Morikawa M, Kanaya S. J Biosci Bioeng. Detailed comparison of separate RNase in a variety of species Ohtani N, Haruki M, Morikawa M, Kanaya S. J Biosci Bioeng. 1999;88(1):12-9에 보고되어 있다. 1999; 88 (1): 12-9 is reported.

본 구체예에서 사용될 수 있는 RNase H 효소의 예는, 파이로코커스 푸리오수스( Pyrococcus Examples of RNase H enzymes that can be used in the present embodiments, a pie Lactococcus Puri's sewage (Pyrococcus furiosus ), 파이로코커스 호리코시( Pyrococcus furiosus), Caucus, No. pie Rico City (Pyrococcus horikoshi ), 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus horikoshi), Thermococcus litoralis (Thermococcus litoralis ) 또는 써머스 써모필러스( Thermus thermophilus )와 같은, 호열성 유기체로부터 분리된 열안정성 RNase H 효소들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. It includes litoralis) or sseomeoseu Thermo filler's (a thermostable RNase H enzyme separated from thermophilic organisms such as Thermus thermophilus), but are not limited to this.

본 구체예에서 사용될 수 있는 다른 RNase H 효소들이 예를 들면, Uemori에 의한 미국 등록특허 제7,422,888호 또는 Walder에 의한, 미국 특허출원 공개 제2009/0325169호에 개시되어 있으며, 그의 내용은 참조에 의해 본 명세서에 삽입된다. Other RNase H enzymes that can be used in the present embodiment are, for example, is disclosed in U.S. Patent No. 7,422,888 by call or by Uemori Walder, U.S. Patent Application Publication No. 2009/0325169 call, by its contents, see and inserted into the present specification.

일 구체예에서, 상기 RNase H 효소는 하기 표시된, Pfu RNase HII (서열번호 13)의 아미노산 서열과 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는, 열안정성 RNase H이다. In one embodiment, the RNase H enzyme to marked, Pfu RNase HII (SEQ ID NO: 13) of an amino acid sequence with 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99% of the of having the Same, is a thermostable RNase H.

MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKD SKQLTPHERK NLFSQITSIA 60 MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKD SKQLTPHERK NLFSQITSIA 60

DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER 120 DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER 120

RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL 180 RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL 180

EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP (서열번호 13) EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP (SEQ ID NO: 13)

상동성은 예를 들면, 컴퓨터 프로그램 DNASIS-Mac (Takara Shuzo), 컴퓨터 알고리즘 FASTA (version 3.0; Pearson, WR 등, Pro. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988) 또는 컴퓨터 알고리즘 BLAST (version 2.0, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 사용하여 결정할 수 있다. Homology, for example, a computer program DNASIS-Mac (Takara Shuzo), a computer algorithm FASTA (version 3.0; such as Pearson, WR, Pro Natl Acad Sci, 85:.... 2444-2448, 1988) or a computer algorithm BLAST ( version 2.0, Altschul, etc., Nucleic Acids Res 25:. 3389-3402, can be determined using a 1997).

또다른 구체예에서, RNase H 효소는 서열번호 13의 5-20, 33-44, 132-150, 및 158-173 위치에 해당하는, 하나 이상의 상동성 부위(homology region) 1-4를 갖는, 열안정성 RNase H이다. In another embodiment, having an RNase H enzyme of SEQ ID NO: 13 5-20, 33-44, 132-150, and 158-173 positions, one or more of the homology regions (homology region) that corresponds to the 1-4, a thermostable RNase H. 이 상동성 부위는 파이로코커스 푸리오시스( Pyrococcus This homology region is caucus as pie Puri Osis (Pyrococcus furiosis ), 파이로코커스 호리코시( Pyrococcus furiosis), Caucus, No. pie Rico City (Pyrococcus horikoshi ), 써모코커스 코다카렌시스( Thermococcus kodakarensis), 아르케오글로부스 프로푼두스 ( Archeoglobus horikoshi), Thermo Lactococcus coder Karen sheath (Thermococcus kodakarensis), Douce (Archeoglobus booth Pro extracted with ahreuke Ogle profundus ), 아르케오글로부스 풀기디스 ( Archeoglobus profundus), solve booth to display ahreuke Ogle (Archeoglobus fulgidis ), 써모코커스 셀레르( Thermococcus celer ) 및 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus fulgidis), Thermococcus celer (Thermococcus celer) and Thermococcus litoralis (Thermococcus litoralis ) RNase HII 폴리펩티드 서열의 서열 배치에 의해 정의된다 (도 10을 참조한다). is defined by the litoralis) RNase HII sequence alignment of the polypeptide sequence (see Fig. 10).

상동성 부위 1: GIDEAG RGPAIGPLVV (서열번호 20; 서열번호 13의 5-20 위치에 해당) Homology region 1: GIDEAG RGPAIGPLVV (SEQ ID NO: 20; corresponding to positions 5-20 of SEQ ID NO: 13)

상동성 부위 2: LRNIGVKD SKQL (서열번호 21; 서열번호 13의 33-44 위치에 해당) Homology region 2: LRNIGVKD SKQL (SEQ ID NO: 21; corresponding to positions 33-44 of SEQ ID NO: 13)

상동성 부위 3: HKADAKYPV VSAASILAKV (서열번호 22; 서열번호 13의 132-150 위치에 해당) Homology region 3: HKADAKYPV VSAASILAKV (SEQ ID NO: 22; corresponding to 132-150 position of SEQ ID NO: 13)

상동성 부위 4: KLK KQYGDFGSGY PSD (서열번호 23; 서열번호 13의 158-173 위치에 해당) Homology region 4: KLK KQYGDFGSGY PSD (SEQ ID NO: 23; corresponding to 158-173 position of SEQ ID NO: 13)

일 구체예에서, RNase H 효소는 서열번호 20, 21, 22 또는 23의 폴리펩티드 서열과 50%, 60%. In one embodiment, RNase H enzyme SEQ ID NO: 20, 21, 22 or 23 of the polypeptide sequence with 50%, 60%. 70%, 80%, 90%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 상동성 부위 중 하나 이상을 포함하는, 열안정성 RNase H이다. 70%, 80%, comprising at least one of the homology region having a sequence identity (sequence identity) of 90%, the thermal stability RNase H.

또다른 구체예에서, RNase H 효소는 하기 표시된, 써머스 써모필러스 RNase HI의 아미노산 서열 (서열번호 25)과 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 열안정성 RNase H이다. In still other embodiments, RNase H enzyme to marked, sseomeoseu Thermo filler's amino acid sequence of RNase HI (SEQ ID NO: 25) with 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99 a thermostable RNase H having a% homology.

MNPSPRKRVA LFTDGACLGN PGPGGWAALL RFHAHEKLLS GGEACTTNNR MELKAAIEGL MNPSPRKRVA LFTDGACLGN PGPGGWAALL RFHAHEKLLS GGEACTTNNR MELKAAIEGL

KALKEPCEVD LYTDSHYLKK AFTEGWLEGW RKRGWRTAEG KPVKNRDLWE ALLLAMAPHR KALKEPCEVD LYTDSHYLKK AFTEGWLEGW RKRGWRTAEG KPVKNRDLWE ALLLAMAPHR

VRFHFVKGHT GHPENERVDR EARRQAQSQA KTPCPPRAPT LFHEEA (서열번호 25) VRFHFVKGHT GHPENERVDR EARRQAQSQA KTPCPPRAPT LFHEEA (SEQ ID NO: 25)

또다른 구체예에서, RNase H 효소는 상기 서열번호 25의 23-48, 62-69, 117-121 및 141-152 위치에 해당하는 상동성 부위 5 내지 8 중 하나 이상을 포함하는 열안정성 RNase H이다. In still other embodiments, RNase H enzyme is a thermostable RNase H containing a homologous region of 5 to one or more of the eight corresponding to 23-48, 62-69, 117-121 and 141-152 positions of the SEQ ID NO: 25 to be. 이 상동성 부위들은 서열 배치에 의해 정의된다. The homologous regions are defined by sequence alignment.

해모필러스 인플루엔자( Haemophilus To a brush Russ influenza (Haemophilus influenzae ), influenzae), 써머스 써모필리스 (Thermus thermophilis ),써머스 아쿠아티쿠스 ( Thermus Sseomeoseu Thermo Phillies (Thermus thermophilis), sseomeoseu aqua tee Syracuse (Thermus acquaticus ), 살모넬라 엔테리카( Salmonella acquaticus), Salmonella Entebbe Rica (Salmonella enterica ) 및 아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ) RNase HI 폴리펩티드 서열의 서열 배치에 의해 정의된다 (도 11을 참조한다). It is defined by the enterica) and Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens) RNase HI sequence alignment of the polypeptide sequence (see Fig. 11).

상동성 부위 5: K*V*LFTDG*C*GNPG*GG*ALLRY (서열번호 29; 서열번호 25의 23-48 위치에 해당) Homology region 5: K * V * LFTDG * C * GNPG * GG * ALLRY (SEQ ID NO: 29; corresponding to positions 23-48 of SEQ ID NO: 25)

상동성 부위 6: TTNNRMEL (서열번호 30; 서열번호 25의 62-69 위치에 해당) Homology region 6: TTNNRMEL (SEQ ID NO: 30; corresponding to positions 62-69 of SEQ ID NO: 25)

상동성 부위 7: KPVKN (서열번호 31; 서열번호 25의 117-121 위치에 해당) Homology region 7: KPVKN (SEQ ID NO: 31; corresponding to 117-121 position of SEQ ID NO: 25)

상동성 부위 8: FVKGH*GH*ENE (서열번호 32; 서열번호 25의 141-152 위치에 해당) Homology region 8: FVKGH * GH * ENE (SEQ ID NO: 32; corresponding to 141-152 position of SEQ ID NO: 25)

또다른 구체예에서, 상기 RNase H 효소는 서열번호 29, 30, 31 또는 32의 폴리펩티드 서열과 50%, 60%. In yet another embodiment, the RNase H enzyme is SEQ ID NO: 29, 30, 31 or 32 of the polypeptide sequence with 50%, 60%. 70%, 80%, 90%의 서열 동일성을 갖는 상동성 부위 4 내지 8 중 하나 이상을 포함하는, 열안정성 RNAse H이다. 70%, 80%, comprising at least one of the homologous region from 4 to 8 having a sequence identity of 90%, the thermal stability RNAse H.

본 명세서에서 사용되는 "서열 동일성(sequence identity)"은 비교 범위에 걸쳐 아미노산 대 아미노산을 기준으로, 동일하거나 또는 기능적 또는 구조적으로 유사한 서열의 범위를 지칭한다. "Sequence identity (sequence identity)" as used herein is based on the amino acid for the amino acid over a comparison range, refers to the range of the same or functionally or structurally similar to the sequence. 따라서, "서열 동일성의 백분율(percentage of sequence identity)"은, 예를 들면, 비교 범위에 걸쳐 최적으로 배열된 두 서열을 비교하는 단계, 양 서열에서 동일한 아미노산이 존재하는 위치의 수를 결정하여 매치되는 위치의 수를 얻는 단계, 매치되는 위치의 수를 비교 범위 내의 전체 위치 수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하는 단계에 의해 계산될 수 있다. Thus, the "percentage of sequence identity (percentage of sequence identity)" is, for example, determining a step of comparing two sequences aligned optimally over the comparison range, and the number of locations that have the same amino acid in both sequences present match obtaining a number of positions, the number of matching positions the total number of positions in the comparison range (i.e., range of size) dividing into, and multiplying by 100 the result can be calculated by calculating the percentage of sequence identity have.

특정한 구체예에서, RNase H를 변형시켜 핫 스타트 "유도성(inducible)" RNase H를 제조할 수 있다. In certain embodiments, the variant of RNase H to be possible to manufacture a hot-start "inducible (inducible)" RNase H.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "변형된 RNase H(modified RNase H)"는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 상실을 초래하는 억제 인자에 역으로 커플링하거나 또는 역으로 결합하는 RNase H일 수 있다. , The term "modified RNase H (modified RNase H)" as used herein may be the RNase H binding to endonuclease loss couples back to the inhibitor that results in the activation ring, or the inverse of RNase H . 상기 RNase H로부터 억제인자의 방출 또는 탈커플링(decoupling)은 상기 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성을 완전히 또는 적어도 부분적으로 회복시킨다. Released or de-coupling (decoupling) of the inhibitor from the RNase H is so reinstate the endonuclease activity of RNase H to a whole or at least in part. 순수 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성 중 약 30 내지 100%이면 충분할 수 있다. Of pure RNase H endonuclease may be sufficient in about 30 to 100% of the activity. 상기 억제 인자는 리간드 또는 화학적 변형체일 수 있다. The inhibitor may be a ligand or chemical modifiers. 상기 리간드는 항체, 앱타머(aptamer), 수용체, 보조인자(cofactor), 또는 킬레이트화제일 수 있다. The ligand may be an antibody, aptamer (aptamer), receptor, cofactor (cofactor), or chelating agents. 상기 리간드는 RNase H 효소의 활성 부위에 결합하여, 그에 의해 효소 활성을 억제하거나, 또는 상기 RNase의 활성 부위로부터 멀리 떨어진 부위에 결합할 수 있다. The ligands may bind to the active site of the RNase H enzyme, be bonded to the remote site from active site of inhibition, or the RNase enzymatic activity thereby. 일부 구체예에서, 리간드는 구조적 변화를 유도할 수 있다. In some embodiments, the ligand may lead to structural changes. 상기 화학적 변형은 (예를 들면, 포름알데히드에 의한) 가교화 또는 아실화일 수 있다. The chemical modification may be crosslinked or acyl file (for example, by formaldehyde). RNase H로부터 억제 인자의 방출 또는 탈커플링은 샘플 또는 커플링된 RNase H(불활성)를 약 65 ℃ 내지 약 95 ℃ 이상의 온도로 가열하는 단계 및/또는 상기 혼합물 또는 샘플의 pH를 약 7.0 이하로 낮추는 단계에 의해 달성될 수 있다. Released or de-coupling of the inhibitor from the RNase H is the pH of the stage and / or the mixture or the sample to heat the sample or the coupled RNase H (inactive) to about 65 ℃ to at least about 95 ℃ temperature below about 7.0 by reducing steps it can be achieved.

본 명세서에서 사용되는 핫 스타트 "유도성(inducible)" RNase H 활성은 리간드와의 연관에 의해 조절될 수 있는 엔도뉴클레아제 효소 활성을 갖는, 본 명세서에서 기술되는 변형된 RNase H를 지칭한다. Hot Start "inducible (inducible)" RNase H activity as used herein, having an endonuclease enzymatic activity that can be modulated by association of a ligand, refers to a modified RNase H described herein. 완화된 조건에서, RNase H 엔도뉴클레아제 효소 활성은 활성화되는 반면, 복제가 허용되지 않는(non-permissive) 조건에서, 이 효소 활성은 억제된다. In the relaxed condition, in a RNase H endonuclease activity, while being activated, that is replicated is not allowed (non-permissive) conditions, the enzyme activity is inhibited. 일부 구체예에서, 변형된 RNase H의 효소 활성은 역전사를 수행할 수 있는 온도, 즉 약 42 ℃에서 억제될 수 있고, PCR 반응에서 관찰되는 보다 상승된 온도, 즉 약 65 ℃ 내지 95 ℃에서는 활성화될 수 있다. In some embodiments, the enzymatic activity of the modified RNase H can be suppressed in temperature, that is about 42 ℃ capable of performing the reverse transcription, the more elevated temperatures, i.e. from about 65 ℃ to 95 ℃ observed in the PCR reaction activation It can be. 이러한 특성들을 갖는 변형된 RNase H는 "열 유도성(heat inducible)"인 것으로 불린다. The RNase H strain having such properties is referred to as being "heat inducible (heat inducible)".

다른 구체예에서, 변형된 RNase H의 효소 활성은 상기 효소를 함유하는 용액의 pH를 변화시킴으로써 조절될 수 있다. In another embodiment, the enzymatic activity of the modified RNase H can be controlled by changing the pH of the solution containing the enzyme.

본 명세서에서 사용되는, "핫 스타트(hot start)" 효소 조성물은 복제가 허용되지 않는 온도, 즉 약 25 ℃ 내지 약 45 ℃에서 억제되고, PCR 반응에 적합한 온도, 예를 들면 약 55 ℃ 내지 약 95 ℃에서 활성화된다. , "Hot start (hot start)" enzyme composition as used herein is the temperature that replication is not allowed, that is suppressed in about 25 ℃ to about 45 ℃, suitable temperature, for example to about 55 ℃ about the PCR reaction It is activated at 95 ℃. 특정한 구체예에서, "핫 스타트" 효소 조성물은 당해 기술분야에 공지된, '핫 스타트' RNase H 및/또는 '핫 스타트' 열안정성 DNA 폴리머라제를 가질 수 있다. In certain embodiments, a "hot start" enzyme composition may have a 'hot start' RNase H and / or a "hot-start" thermostable DNA polymerases known in the art.

RNase H 효소의 가교화는 예를 들면, 포름알데히드를 사용하여 수행될 수 있다. Cross-linking of RNase H enzyme is, for example, may be performed using formaldehyde. 일 구체예에서, 열안정성 RNase H는 포름알데히드를 사용한, 제어되고 제한된 가교화를 거칠 수 있다. In one embodiment, the thermostable RNase H may be subjected to use formaldehyde, controlled and limited cross-linking. 활성 상태인 변형된 RNase H를 포함하는, 증폭 반응 조성물을 연장된 시간, 예를 들면 약 15분 동안 약 95 ℃ 또는 그 이상으로 가열함으로써, 가교화는 반전되고 RNase H 활성이 회복된다. By extending the active variant, an amplification reaction composition comprising an RNase H time, for example, heating to about 95 ℃ or higher for about 15 minutes, cross-linking is inverted and restored the RNase H activity.

일반적으로, 가교화도(degree of crosslinking)가 낮을수록, 가교화 반전 후에 상기 효소의 엔도뉴클레아제 활성이 높다. In general, the lower the degree of crosslinking (degree of crosslinking) is low, it is highly crosslinked after inversion endonuclease activity of the enzyme. 가교화도는 포름알데히드의 농도 및 가교화 반응의 지속시간을 변화시킴으로써 제어할 수 있다. Cross-linking degree can be controlled by varying the concentration and the duration of the crosslinking reaction of the formaldehyde. 예를 들면, RNase H 효소를 가교시키기 위해 약 0.2% (w/v), 약 0.4% (w/v), 약 0.6% (w/v), 또는 약 0.8% (w/v)의 포름알데히드를 사용할 수 있다. For example, from about 0.2% to cross-link the RNase H enzyme (w / v), about 0.4% (w / v), about 0.6% (w / v), or form about 0.8% (w / v) aldehydes It can be used. 0.6% 포름알데히드를 사용한 약 10분의 가교화 반응이, 파이로코커스 푸리오수스에서 유래한 RNase HII를 불활성화시키기에 충분할 수 있다. 0.6% about 10 minutes cross-linking reaction with the formaldehyde, may be sufficient for the RNase HII derived from Rhodococcus Puri sewage's Pyro to the deactivation.

가교화된 RNase H는 약 37 ℃에서, 측정가능한 엔도뉴클레아제 활성을 나타내지 않는다. Crosslinked RNase H are not shown in the about 37 ℃, measurable endonuclease activity. 일부 경우에, 가교화된 RNase H의 측정가능한 부분적 재활성화가, PCR 열변성 온도보다 낮은, 약 50 ℃의 온도에서 발생할 수 있다. In some cases, crosslinking the measurable partial reactivation of RNase H is, lower than the PCR thermal denaturation temperature, it may occur at a temperature of about 50 ℃. 그와 같은 효소의 의도치 않은 재활성화를 막기 위해, 변형된 RNase H를 재활성화 전까지, 50 ℃ 미만의 온도에서 보관 및 유지하는 것이 요구될 수 있다. In order to prevent a reactivation of the enzyme intended that values ​​such that, prior to re-enable the modified RNase H, may be required to be stored and maintained at a temperature of less than 50 ℃.

일반적으로, PCR은 이중가닥 타겟 서열을 열변성시키기 위해, 각 사이클마다 증폭 조성물을 약 95 ℃까지 가열해야 하며, 이는 또한 RNase H로부터 불활성화 인자(inactivating factor)를 방출시켜, 효소의 활성을 부분적으로, 또는 완전히 회복시킬 것이다. In general, PCR is partially a double-stranded target to heat denature the sequence, must be heated in each cycle of amplification the composition up to about 95 ℃, which is also, the activity of the enzyme to release the inactivated factor (inactivating factor) from the RNase H , or it will recover completely.

RNase H는 또한 상기 효소를 아실화제, 예를 들면, 디카르복시산에 의해 라이신 잔기를 아실화시켜 변형시킬 수 있다. RNase H is also, for the acylating agent the enzyme, for example, can be modified by acylating the lysine residue by the dicarboxylic acids. RNase H의 아실화는, 아실화 완충액 중 RNase H의 용액에 시스-아코니트산 무수물(cis-aconitic anhydride)을 첨가하고, 및 얻어진 혼합물을 약 1 내지 20 ℃에서 5 내지 30 시간 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 수행될 수 있다. Acylation of RNase H is, of acylation buffer, a solution of RNase H cis-Acre to which was added a knitted anhydride (cis-aconitic anhydride) and, and incubating the resulting mixture in about 1 to 20 ℃ for 5 to 30 hours by can be carried out. 일 구체예에서, 상기 아실화는 약 3 내지 8 ℃에서 18 내지 24시간 동안 실시될 수 있다. In one embodiment, the acylation may be carried out in about 3 to 8 ℃ 18 to 24 hours. 아실화 완충액의 종류는 특별히 제한되지 않는다. Type of acylation buffer is not particularly limited. 일 구체예에서, 상기 아실화 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.0을 갖는다. In one embodiment, the acylation buffer has a pH from about 7.5 to about 9.0.

아실화된 RNase H의 활성은 증폭 조성물의 pH를 약 7.0 미만으로 저하시킴으로써 회복시킬 수 있다. Activity of the acylated RNase H can be recovered by lowering the pH of the amplification composition in less than about 7.0. 예를 들면, 완충제로서 트리스 완충액이 사용되는 경우, 상기 조성물을 약 95 ℃까지 가열하여, pH를 약 8.7 (25 ℃)에서 약 6.5 (95 ℃)로 낮출 수 있다. For example, when a Tris buffer is used as buffer, heating the composition to about 95 ℃, it can lower the pH at about 8.7 (25 ℃) to about 6.5 (95 ℃).

증폭 반응 조성물에서 가열 단계의 지속시간은 변형된 RNase H, PCR에서 사용된 완충액 등에 따라 달라질 수 있다. The duration of the heating step in the amplification reaction composition can vary depending on the buffer used in the altered RNase H, PCR. 그러나, 일반적으로는, 증폭 조성물을 95 ℃에서 약 30초 내지 4분 동안 가열하면 RNase H 활성의 회복에 충분할 수 있다. However, in general, when an amplification composition is heated at 95 ℃ for about 30 seconds to about 4 minutes may be sufficient for restoration of the RNase H activity. 일 구체예에서, 상업적으로 이용가능한 완충액 및 하나 이상의 비이온성 세제는 사용했을 때, 2분의 가열 후에 파이로코커스 푸리오수스 RNase HII의 완전한 활성이 회복된다. In one embodiment, a commercially available buffer solution used, and one or more non-ionic detergent is a complete activity, when used, in a pie Lactococcus Puri's sewage RNase HII After heating for approximately two minutes are recovered.

RNase H 활성은 당해 기술분야에 잘 알려진 방법들을 사용하여 결정될 수 있다. RNase H activity can be determined using methods well known in the art. 예를 들면, 제1 방법에 따르면, 단위 활성(unit activity)은 정해진 분석 조건에서, 몰당량의 폴리타이미딜산(polythymidylic acid)의 존재 하에, 일정한 몰수의 방사성 표지된 폴리아데닐산의 산-가용화로서 정의된다 (Epicentre Hybridase thermostable RNase HI를 참조한다). For example, according to the first method, the unit activity (unit activity) is determined from the analysis conditions, the molar equivalent of poly Tymee dilsan in the presence of (polythymidylic acid), radiation of a certain number of moles labeled polyadenylation acid acid-solubilized is defined as a (refer to Epicentre Hybridase thermostable RNase HI). 제2 방법에서, 상기 단위 활성은 몰당량의 프로브 및 상보적 주형 DNA를 함유하는 반응물의 상대 형광 강도의 특이적 증가로서 정의된다. In the second method, the unit of activity is defined as a specific increase in the relative fluorescence intensity of a reaction containing the probe and a complementary DNA template of a molar equivalent.

SNP 의 실시간 검출 Real-time detection of a SNP

타겟 핵산 중 SNP의 실시간 검출을 위한 프로브로서, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용할 수 있다. As a probe for real-time detection of the SNP of the target nucleic acid, oligonucleotide-labeled oligonucleotide probes can be used.

CataCleave TM 올리고뉴클레오티드 프로브는, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 포함하는 PCR 앰플리콘 내에서 발견되는 서열에 상보적인, DNA 및 RNA 서열을 사용하여 최초로 합성되었다. CataCleave TM oligonucleotide probes, using the complementary, DNA and RNA sequences in the sequence found in the PCR amplicon containing a single nucleotide polymorphism (SNP) were synthesized first. 상기 프로브는, 예를 들면, FRET 쌍, 예를 들면 프로브의 한 말단에 플루오레세인(fluorescein) 및 다른 말단에 로다민(rhodamine) 켄쳐 분자를 사용하여 합성될 수 있다. The probe, for example, FRET pair, for example, at a distal end of the probe may be synthesized using a rhodamine (rhodamine) a quencher molecule fluorescein (fluorescein) and the other end. 상기 프로브는, 선택된 SNP의 위치를 포함하는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적이 되도록 합성될 수 있다. The probe, can be synthesized substantially complementary to the target nucleic acid sequence containing the position of the chosen SNP.

특정한 구체예에서, 상기 프로브의 RNA 서열은 야생형 서열에 상보적인 서열을 갖도록 조작할 수 있다. In certain embodiments, RNA sequence of the probe can be operated so as to have a sequence complementary to the wild-type sequence.

다른 구체예에서, 상기 프로브의 RNA 서열은 SNP 서열에 상보적인 서열을 갖도록 조작할 수 있다. In other embodiments, RNA sequence of the probe can be operated so as to have a sequence complementary to the SNP sequence.

일 구체예에서, 실시간 핵산 증폭은 열안정성 핵산 폴리머라제, RNase H 활성, SNP를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 PCR 증폭 프라이머 쌍, 및 표지된 CataCleave TM 올리고뉴클레오티드 프로브의 존재 하에, 타겟 폴리뉴클레오티드에 대해 수행된다. In one embodiment, the real-time nucleic acid amplification is a thermostable nucleic acid polymerase, RNase H activity, PCR amplification primers capable of hybridizing to a target polynucleotide containing a SNP, and labeled CataCleave TM oligonucleotide in the presence of an oligonucleotide probe, the target Poly It is performed on the oligonucleotide. 실시간 PCR 반응 동안, CataCleave TM 올리고뉴클레오티드 프로브와 PCR 앰프리콘 내에 존재하는 SNP 간에 형성된, RNA:DNA 이형이중가닥 프로브의 RNase H 절단은 형광 켄쳐로부터 형광 공여자를 분리시키며, PCR 앰플리콘, 및 그에 따른 타겟 DNA 중 SNP의 실시간 검출에 상응하는, 프로브 형광의 실시간 증가를 초래한다. During real-time PCR reaction, CataCleave TM oligonucleotide formed between a SNP present in the oligonucleotide probes and PCR Amplifier silicon, RNA: DNA RNase H cleavage of releasing a double-stranded probe isolates the fluorescence donor from the fluorescence quencher, PCR amplicon, and thus the target according corresponding to the real-time detection of DNA of the SNP, resulting in a real-time increases in fluorescence probe.

특정한 구체예에서, 상기 프로브의 RNA 모이어티는, 타겟 DNA 서열 내 SNP 위치에 야생형 서열을 포함한다. In certain embodiments, RNA moiety of the probe, includes the wild-type sequence in the target DNA sequence in SNP position. 따라서, SNP를 포함하는 PCR 앰플리콘과 프로브의 혼성화 후에, SNP 위치에서 단일 뉴클레오티드 미스매치를 갖는, RNA:DNA 이형이중가닥 형태는 RNase H에 의해 절단될 수 없다. Therefore, after hybridization of the PCR amplicon and probe comprising the SNP, with a single nucleotide mismatch at the SNP position, RNA: DNA double-stranded form of the release can not be cleaved by the RNase H.

다른 구체예에서, 상기 프로브의 RNA 모이어티는 타겟 DNA 서열 내 SNP의 위치에서 상보적인 SNP 서열을 포함한다. In another embodiment, the RNA moiety of the probe comprises a sequence complementary to the SNP in the position of the SNP in the target DNA sequence. 따라서, 상기 SNP를 포함하는 PCR 앰플리콘과 상기 프로브의 혼성화 후에, RNase H 활성에 의해 절단될 수 있는 SNP 위치에서 미스매치를 갖지 않는, RNA:DNA 이형이중가닥이 형성된다. Therefore, after hybridization of the PCR amplicon and the probe containing the SNP, which does not have a mismatch at the SNP position that can be cleaved by RNase H activity, RNA: DNA duplexes are formed the mold release.

키트 Kits

본 명세서의 개시는 또한, 타겟 핵산 내 SNP의 실시간 검출을 위한 하나 이상의 시약을 갖는 패키지 단위를 포함하는 키트 형태를 제공한다. The teachings of the present disclosure also provides a kit form comprising a package unit having one or more reagents for real-time detection of the SNP in the target nucleic acid. 상기 키트는 또한 하기 아이템 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 완충액, 사용설명서 및 양성 또는 음성 대조물질. The kit may also include one or more of the items to: buffer, manuals, and positive or negative control substance. 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 실시하기에 적합한 비율로 혼합된 시약들이 담긴 용기를 포함할 수 있다. The kit may include a vessel containing the reagent are mixed in suitable proportions for performing the methods described herein. 시약 용기는 바람직하게는, 대상 방법을 실시할 때, 측정 단계를 생략하기 위한 단위 함량(unit quantity)으로 상기 시약들을 포함한다. Reagent containers preferably, comprises the reagent, the unit content to skip the measuring step (unit quantity) when performing the subject methods.

또한, 키트는 열안정성 폴리머라제, RNase H, SNP 위치를 포함하는 부위를 증폭하기 위해 선택된 프라이머, 및 실시간 PCR 산물에 어닐링하여 본 명세서에 기술된 방법에 따라 SNP를 검출할 수 있도록 하는, 표지된 CataCleave TM 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 실시간 PCR용 시약들을 포함할 수 있다. In addition, the kit of which can detect a SNP according to the process described herein with annealing the selected primers, and real-time PCR product to amplify the region containing a thermostable polymerase, RNase H, SNP position, the cover CataCleave TM oligonucleotide, including, the nucleotide probe, that is not limited to this, and may include a reagent for real-time PCR. 키트는 단일 유전자 내의 SNP 또는 2 이상의 유전자 가운데 SNP의 좌위를 검출하기 위한 시약들을 포함할 수 있다. The kit may comprise reagents for detecting the SNP loci of the center or two or more genes within a single gene SNP. 또다른 구체예에서, 상기 키트 시약들은 생물학적 샘플로부터 게놈 DNA 또는 RNA를 추출하기 위한 시약을 추가적으로 포함한다. In yet another embodiment, the reagent kit may further include a reagent for extracting the genomic DNA or RNA from a biological sample. 키트 시약은 또한, 적용가능한 경우, 역전사 효소-PCR 분석을 위한 시약들을 포함할 수 있다. Reagent kit can also, if applicable, may comprise reagents for reverse transcriptase -PCR analysis.

본 명세서에서 명시된, 임의의 특허, 특허 출원, 문헌 또는 기타 개시 내용은 참조에 의해 전체로서 본 명세서에 삽입된다. Set forth herein, any of the patents, patent applications, documents, or other disclosure of which is incorporated herein in its entirety by reference. 참조에 의해 본 명세서에 삽입되는 것으로 지시되었으나, 본 명세서에서 제시된 기존의 정의, 설명, 또는 기타 개시 내용과 상충되는 임의의 내용 또는 그의 일부는 상기 통합되는 내용과 본 개시 내용 간에 상충이 발생하지 않는 범위로만 통합된다. Although instructions to be inserted herein by reference, the old definition set forth in this disclosure, description, or other disclosure any information or a portion thereof that is in conflict with the contents is not a conflict occurs between the content and the disclosure that the integrated It is incorporated only in ranges.

실시예 Example

하기 실시예들은 본 발명에 따른, RNase H 효소 조성물을 사용하는 방법을 제시한다. The following examples are presented to the use of, RNase H enzyme composition according to the invention. 이 실시예들에서 기술된 방법의 단계들은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. The steps of a method described in these embodiments are not intended to be limiting. 상기 언급된 것들 외의 본 발명의 추가적인 목적 및 이점들은, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예들로부터 자명해질 것이다. Additional objects and advantages of the present invention other than the above-mentioned ones are, will become apparent from the following examples that are not intended to limit the scope of the invention.

살모넬라 invA 유전자에서 합성 SNP 등온적 검출 Isothermal detection of the SNP in the synthesis Salmonella invA gene

타겟 DNA 서열 내에서 단일 뉴클레오티드 서열 차이를 구별하는 CataCleave TM 프로브의 능력을 검정하기 위해, 살모넬라의 invA To test the ability of TM CataCleave probe to distinguish single nucleotide sequence differences within the target DNA sequence, the Salmonella invA 유전자 (서열번호 33) 내에 합성 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 제조하였다. The synthetic gene in a (SEQ ID NO: 33), single nucleotide polymorphism (SNP) was prepared. 상기 단일 뉴클레오티드 변화는 살모넬라 invA 코딩 서열 (서열번호 33)의 116번 위치에서 T를 G로 전환시켰다. The single nucleotide change was converted to the G to T in the 116 position of Salmonella invA coding sequence (SEQ ID NO: 33). FRET 쌍을 생성하기 위해 각각 이중 표지화한, 두 개의 유사한 19 뉴클레오티드 CataCleave TM 프로브를, 상기 SNP 뉴클레오티드를 포함하는 A respective double-labeled to produce a FRET pair, two similar 19 nucleotides CataCleave TM probes, including the SNP nucleotide invA 부위를 가로질러 염기쌍을 형성하도록 디자인하였다. invA across the region were designed to form a base pair. 야생형 특이적 프로브 inv-CCProbe2 (서열번호 1)은 invA의 야생형에 대해 완벽한 상보성을 가졌으며, SNP 특이적 프로브 inv-CCProbe2-2C (서열번호 2)는 invA 의 돌연변이 형태와 완벽한 상보성을 가졌다. Wild-type-specific probe CCProbe2 inv (SEQ ID NO: 1) were held perfectly complementary to the wild-type of invA, SNP-specific probe CCProbe2-2C inv (SEQ ID NO: 2) had a mutant form with perfect complementarity of invA. 상기 프로브들을, CataCleave TM 프로브의 4개의 RNA 염기들 중 2번째 (프로브의 5' 말단 기준으로)가 SNP 뉴클레오티드 위치에서 염기쌍을 형성하도록 디자인하였다. Of the probe (the probe of the 5 'end basis) four RNA bases of the second of the CataCleave TM probes were designed to form a base pair at the SNP nucleotide positions. 2가지 DNA 올리고뉴클레오티드, 야생형 특이적 invA 프로브에 상보적인 inv2-Target1 (서열번호 3), 및 SNP 특이적 invA 프로브에 상보적인 inv2-Target8 (서열번호 4)를 합성하였다. 2 kinds of DNA oligonucleotides were synthesized nucleotide, the wild-type-specific probes complementary invA inv2-Target1 (SEQ ID NO: 3), and the complementary SNP-specific invA inv2-Target8 the probe (SEQ ID NO: 4). 상기 두 프로브의, 단일 뉴클레오티드 미스매치를 식별하는 능력을 평가하기 위해, 등온적 처리 반응(isothermal processing reaction)을 수행하였다. Two of the probes, in order to evaluate the ability to identify a single nucleotide mismatch, was carried out isothermally processing reaction (isothermal reaction processing). 반응에서 각 구성성분들의 최종 농도는, 200 nM 프로브, 0.4 nM 타겟 올리고뉴클레오티드, 10 mM 트리스 아세테이트 pH 8.6, 50 mM 포타슘 아세테이트, 2.5 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT 및 2.5 u 하이브리다아제 열안정성 RNase GI(Hybridase thermostable RNase HI)(Epicentre)와 같았다. The final concentration of each component in the reaction, 200 nM probe, 0.4 nM target oligonucleotide, 10 mM Tris-acetate pH 8.6, 50 mM potassium acetate, 2.5 mM magnesium acetate, 1 mM DTT and 2.5 u hybridizes azepin thermostable RNase GI like a (Hybridase thermostable RNase HI) (Epicentre). 상기 반응물을 55 ℃에서 60분 동안 인큐베이션하면서, 매분 형광 데이터를 수집하였다. While the reaction was incubated at 55 ℃ for 60 minutes, fluorescence data was collected every minute. 도 1은 inv-CCProbe2 (서열번호 1)가 inv2-Target1 (서열번호 3) 또는 inv2-Target8 (서열번호 4)와 반응했을 때 생성되는 형광 신호를 보여준다. Figure 1 shows the fluorescent signal generated CCProbe2-inv (SEQ ID NO: 1) is inv2-Target1 (SEQ ID NO: 3) or inv2-Target8 when (SEQ ID NO: 4) with the reaction. inv-CCProbe2를 inv2-Target1과 인큐베이션시킨 경우, 형광 신호는 직선형으로 증가하여, RNase HI가 올리고뉴클레오티드와 완벽하게 쌍을 형성한 프로브를 인식 및 절단했다는 것을 나타냈다. If incubation the inv-CCProbe2 and inv2-Target1, the fluorescent signal is increased in a straight line, indicating that the RNase HI oligonucleotides that recognize and cut a perfect form a pair with a nucleotide probe. inv-CCProbe2를 inv2-Target8과 인큐베이션시킨 경우, 형광 신호는 거의 생성되지 않았으며, 이는 미스매치된 올리고뉴클레오티드가 RNase HI에 대해 거의 타겟으로 작용하지 않았다는 것을 시사한다. The case where the inv-CCProbe2 incubation and inv2-Target8, were the fluorescent signal is not substantially generated, which implies that an oligonucleotide mismatch nucleotides did not act in much the target for RNase HI.

도 2는 inv-CCProbe2-2C (서열번호 2)를 inv2-Target1 (서열번호 3) 또는 inv2-Target8 (서열번호 4)와 반응시켰을 때 생성된 형광 신호를 보여준다. Figure 2 shows the inv-CCProbe2-2C (SEQ ID NO: 2) the inv2-Target1 (SEQ ID NO: 3) or inv2-Target8 fluorescence signal produced when (SEQ ID NO: 4) and reacted. 형광의 증가로 나타한, 완벽하게 짝지어진 inv2-Target8과 인큐베이션시켰을 때, RNase HI에 의해 Inv-CCProbe2-2C이 절단되었다. One represented by the increase in fluorescence when incubated with sikyeoteul perfectly paired inv2-Target8 built, and Inv-CCProbe2-2C was cut by RNase HI. 야생형 invA 타겟과 인큐베이션했을 때 형광 신호는 거의 관찰되지 않았으며, 이는 미스매치된 쌍에 대한 불량한 프로브 절단을 나타낸다. It was a fluorescent signal is not substantially observed when incubated with the wild-type target invA, which indicates poor cutting probe to the mismatched pair.

살모넬라 invA Salmonella invA 유정자 중 합성 SNP 의 실시간 PCR 검출 Real-time PCR detection of the SNP of synthetic yujeongja

야생형 또는 (전술된) 돌연변이형 염기를 포함하는, 267 뉴클레오티드의 invA 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 합성하였다. The plasmid DNA were prepared containing, invA sequence of 267 nucleotides containing the mutant type or the wild type nucleotide (above). 40 pg의 야생형 플라스미드, 돌연변이체 플라스미드, 또는 상기 두 플라스미드의 혼합체를, 야생형 서열 또는 돌연변이 서열에 상보적인, 다르게 표지화된 프로브들을 포함한 멀티플렉스 실시간 PCR 반응의 주형으로서 사용하였다. 40 pg of a mixture of the wild-type plasmid, mutant plasmid, or the two plasmids, the wild-type sequence or the mutant sequence was used as a template of complementary, multiplex real-time PCR reaction including a differently labeled probes. 각각의 구성성분들의 최종 농도는 800 nM 순방향 프라이머 살모넬라-F1 (서열번호 5), 800 nM 역방향 프라이머 sal-invR2 (서열번호 6), 200 nM 야생형 특이적 프로브 inv-CCProbe2 (서열번호 1), 200 nM SNP 특이적 프로브 inv-CCProbe2-2C (서열번호 2), 80 uM 각각의 dNTP, 10 mM 트리스 아세테이트 pH 8.6, 50 mM 포타슘 아세테이트, 2.5 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 2.5 u 플라티넘 Taq DNA 폴리머라제(Life Technologies) 및 2.5 u 하이브리다아제 열안정성 RNase HI(Epicentre)와 같았다. The final concentration of each of the constituents is 800 nM forward primer Salmonella -F1 (SEQ ID NO: 5), 800 nM reverse primer sal-invR2 (SEQ ID NO: 6), 200 nM wild-type-specific probe CCProbe2 inv (SEQ ID NO: 1), 200 nM SNP-specific probe CCProbe2-2C inv (SEQ ID NO: 2), 80 uM each dNTP, 10 mM tris-acetate pH 8.6, 50 mM potassium acetate, 2.5 mM magnesium acetate, 1 mM DTT, 2.5 u Platinum Taq DNA polymerase cyclase (Life Technologies) and 2.5 u hybridizes Ajay was like a thermostable RNase HI (Epicentre). 상기 PCR 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 인큐베이션시켜 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 활성화시킨 후에, 95 ℃에서 10초, 및 60 ℃에서 20초의 사이클을 40회 수행하였다. The PCR reaction was incubated at 95 ℃ for 2 minutes after activating the Hot Start DNA polymerase, a cycle of 20 seconds at 95 ℃ in 10 seconds, and 60 ℃ was carried out 40 times. 도 3은 FAM 표지된 inv-CCProbe2 (서열번호 1)로부터 PCR 동안 생성된 형광 신호를 보여주며, 도 4는 TYE665 표지된 inv-CCProbe2-2C (서열번호 2)로부터 PCR 동안 생성된 형광 신호를 나타낸다. Figure 3 shows the fluorescent signal generated during PCR from FAM labeled CCProbe2-inv (SEQ ID NO: 1), Figure 4 shows the fluorescent signal generated during PCR from TYE665 labeled CCProbe2-2C-inv (SEQ ID NO: 2) . 이 PCR 반응에 대한 형광 곡선은 각각의 프로브가, 완전하게 상보적인 타겟의 증폭을 검출할 수 있고, 하나의 미스매치를 포함하는 타겟의 증폭은 검출하지 않았다는 것을 나타낸다. Fluorescence curves for the PCR reactions indicate that each probe, it is possible to completely detect the amplification of a complementary target, amplification of a target containing one mismatch was not detected.

소 b 카제인 유전자의 A1 및 A2 대립유전자의 등온적 검출 Cow b isothermal detection of the A1 and A2 alleles of the casein gene

젖소의 우유 중에는, A2 및 A1 b 카제인으로 불리는, b 카제인 단백질의 2가지 완전한 천연 변이체 또는 형태가 존재한다. During the cow's milk, known as A1 and A2 b-casein, b, there are two natural variants or complete the form of a casein protein. A1과 A2 b 카제인 간의 차이는 67번 위치에 있는 단일 아미노산이다. The difference between A1 and A2 b-casein is a single amino acid in the 67-position. A1 변이체에서, 염기는 T이고, A2 변이체에서 상기 염기는 G이다. In the A1 variant, the base is T, and the nucleotide at the A2 variant G. 우유 중의 A1 변이체 b 카제인은, 상기 위치에서 히스티딘 아미노산을 갖는다는 점에서 모든 포유동물의 b 카제인 중에서 유일하다. A1 mutant b-casein in milk, it is unique among all the b-casein of a mammal in that it has the amino acid histidine at the position. 다른 종들의 젖은, 그의 b 카제인 사슬의 동일한 위치에서 프롤린 아미노산을 갖는 점에서, A2 유사체로 생각될 수 있는 b 카제인을 함유한다. Wet, in other species in that it has a proline amino acid in the same position of his b casein chain, contains a b-casein, which can be thought of as analogs A2. 물소, 야크, 염소 및 사람의 젖은 모두, A2 유사 형태의 b 카제인을 함유한다. Buffalo, yaks, goats and people of both wet and contains a b-casein A2 of similar type.

본 실시예에서는, 각각 FRET 쌍을 생성하기 위해 이중으로 표지된 2가지 유사한 19 뉴클레오티드 CataCleave TM 프로브를, 소 b 카제인 유전자의 A1/A2 SNP 뉴클레오티드 위치를 가로질러 염기쌍을 형성하도록 디자인하였다. In this embodiment, each of the FRET pair double the two kinds of similar 19-nucleotide probe labeled with CataCleave TM to produce, and designed to form a base pair across the A1 / A2 SNP nucleotide position of the bovine b-casein gene. A1-CCProbe2-RC (서열번호7)는 A1 대립유전자와 완전하게 염기쌍을 형성하고, A2-CCProbe1-RC (서열번호 8)는 A2 대립유전자와 완전하게 염기쌍을 형성한다. A1-CCProbe2-RC (SEQ ID NO: 7) will form a base pair are completely and A2 allelic form a base pair perfectly with the A1 allele, A2-CCProbe1-RC (SEQ ID NO: 8). A1-CCProbe2-RC은 상기 CataCleave TM 프로브의 4개의 RNA 염기 중 첫번째 (프로브의 5' 말단 기준으로)가 SNP 뉴클레오티드 위치에서 염기쌍을 형성하도록 디자인되었다. A1-CCProbe2-RC are designed to form a base pair at the SNP nucleotide positions (to the 5 'end of the probe based) four RNA bases of the first of said probe CataCleave TM. A1 대립유전자를 나타내는, A1-Target-RC (서열번호 9) 및 A2 대립유전자를 나타내는 A2-Target-RC (서열번호 10)의 2가지 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. Representing the A1 allele, two kinds of oligonucleotide DNA of A1-Target-RC (SEQ ID NO: 9), and A2-Target-RC (SEQ ID NO: 10) representing the A2 allele were synthesized oligonucleotide. 상기 두 프로브의, 단일 뉴클레오티드 차이를 식별하는 능력을 평가하기 위해, RNAse HI를 사용하여 등온 처리 반응을 수행하였다. Two of the probes, in order to evaluate the ability to identify single nucleotide differences, using the RNAse HI was carried out isothermal reaction process. 반응물 중 각각의 구성 성분들의 최종 농도는 200 nM 프로브, 0.4 nM 타겟 올리고뉴클레오티드, 10 mM 트리스 아세테이트 pH 8.6, 50 mM 포타슘 아세테이트, 2.5 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT 및 2.5 u 하이브리다제 열안정성 RNase HI (Epicentre)와 같았다. The final concentration of the respective components of the reaction product is 200 nM probe, 0.4 nM target oligonucleotide, 10 mM Tris-acetate pH 8.6, 50 mM potassium acetate, 2.5 mM magnesium acetate, 1 mM DTT and 2.5 u hybridizes claim thermostable RNase HI like a (Epicentre). 상기 반응물을 55 ℃에서 60분 동안 인큐베이션하면서, 매 분마다 형광 데이터를 수집하였다. The reaction was incubated for 60 minutes while at 55 ℃ was collected fluorescence data every minute. 도 5는 A1-CCProbe2-RC (서열번호 7)가 A1-Target-RC (서열번호 9) 또는 A2-Target-RC (서열번호 10)와 반응했을 때 생성되는 형광 신호를 보여준다. 5 shows an A1-CCProbe2-RC (SEQ ID NO: 7) The A1-Target-RC (SEQ ID NO: 9) or A2-Target-RC fluorescence signal produced when (SEQ ID NO: 10) and reaction. A1-CCProbe2-RC를 A1-Target-RC와 인큐베이션시켰을 때 형광 신호는 직선형으로 증가하여, RNase HI가 완전하게 쌍을 형성한 올리고뉴클레오티드를 인식하고 절단하였다는 것을 나타냈다. Fluorescent signal when the A1-CCProbe2-RC sikyeoteul incubated with A1-Target-RC is increased in a straight line, indicating that the oligonucleotide by the RNase HI completely form a pair recognizes the nucleotide, which was cut. A1-CCProbe2-RC를 A2-Target-RC와 인큐베이션시킨 경우, 형광 신호는 거의 생성되지 않았으며, 이는 미스매치된 올리고뉴클레오티드가 RNase HI에 대한 불량한 타겟이라는 것을 시사한다. If incubation the A1-A2 and CCProbe2-RC-Target-RC, was fluorescent signal is not substantially generated, suggesting that the oligonucleotide mismatch nucleotide a poor target for RNase HI. 도 6은 A2-CCProbe1-RC (서열번호 8)를 A1-Target-RC (서열번호 9) 또는 A2-Target-RC (서열번호 10)과 반응시켰을 때 발생하는 형광 신호를 보여준다. 6 shows a fluorescent signal generated A2-CCProbe1-RC (SEQ ID NO: 8), the A1-Target-RC (SEQ ID NO: 9) or A2-Target-RC (SEQ ID NO: 10) and when reacted. RNase HI에 의한 A2-CCProbe1-RC 절단은, A2-CCProbe1-RC를 A2-Target-RC와 인큐베이션시켰을 때 이루어졌으나, A1-Target-RC와 인큐베이션시켰을 경우 절단은 발생하지 않았다. A2-CCProbe1-RC cleavage by RNase HI has been made when the A2-CCProbe1-RC sikyeoteul incubated with A2-Target-RC, when cutting sikyeoteul incubated with A1-Target-RC did not occur.

소 b 카제인 유전자의 A1 및 A2 대립유전자의 실시간 PCR 검출 B bovine real-time PCR detection of the A1 and A2 alleles of the casein gene

CataCleave TM 기반 SNP 검출을 이용한 유전자형 분석을 위해, 3가지 세트의 젖소(dairy bull) DNA를 사용하였다. For the genotyping analysis using CataCleave TM-based SNP detection, used was a set of three cows (dairy bull) DNA. 상기 3가지 DNA는 사전에 서열분석에 의해 유전자형을 분석하였으며, b 카제인 유전자의 3가지 가능한 유전자형, A1/A1, A2/A2 및 A1/A2를 나타내는 것으로 알려졌다. The three DNA were analyzed for the genotype by sequence analysis in advance, b 3 possible genotypes casein gene, known to represent the A1 / A1, A2 / A2 and A1 / A2. Heyen 등에 의해 사전에 개시된 바에 따라, 황소 정액으로부터 DNA를 추출하였다. In advance, as disclosed by Heyen, DNA was extracted from bull sperm. 200 ng의 A1/A2 유전자형, A2/A2 유전자형 또는 A1/A2 유전자형의 게놈 DNA를, 다르게 표지한 A1-CCProbe2-RC (서열번호 7) 및 A2-CCProbe1-RC (서열번호 8)을 모두 함유하는, 멀티플렉스 실시간 PCR 반응물의 주형으로서 사용하였다. Of 200 ng A1 / A2 genotype, A2 / A2 genotype or A1 / A2 genotype of the genomic DNA for alternatively labeled A1-CCProbe2-RC (SEQ ID NO: 7) and A2-CCProbe1-RC containing both a (SEQ ID NO: 8) It was used as template for multiplex real-time PCR reaction. 각각의 구성성분의 최종 농도는, 800 nM 순방향 프라이머 A2D-F (서열번호 11), 800 nM 역방향 프라이머 A2D-R-150 (서열번호 12), 200 nM A1-CCProbe2-RC (서열번호 7), 200 nM A2-CCProbe1-RC (서열번호 8), 80 uM 각각의 dNTP, 10 mM 트리스 아세테이트 pH 8.6, 50 mM 포타슘 아세테이트, 2.5 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, 2.5 u 플래티넘 Taq DNA 폴리머라제 (Life Technologies) 및 2.5 u 하이브리다제 열안정성 RNase HI (Epicentre)와 같았다. The final concentration of each component is, 800 nM forward primer A2D-F (SEQ ID NO: 11), 800 nM reverse primer A2D-R-150 (SEQ ID NO: 12), 200 nM A1-CCProbe2-RC (SEQ ID NO: 7), 200 nM A2-CCProbe1-RC (SEQ ID NO: 8), 80 uM each dNTP, 10 mM tris-acetate pH 8.6, 50 mM potassium acetate, 2.5 mM magnesium acetate, 1 mM DTT, 2.5 u Platinum Taq DNA polymerase (Life Technologies ) and 2.5 u hybridization was as the thermostable RNase HI (Epicentre). 상기 PCR 반응물을 95 C에서 2분 동안 인큐베이션시켜, 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 활성화한 뒤에, 95 ℃에서 10초 및 60 ℃에서 30초의 사이클을 40회 수행하였다. The PCR reaction was incubated for 2 min at 95 C, it was carried out 40 times a hot start DNA polymerase after the activation, 10 second and 30 second cycle at 60 ℃ in 95 ℃. 도 7은 TYE563 표지된 A1-CCProbe2-RC (서열번호 7)로부터 PCR 동안 발생한 형광 신호를 나타내고, 도 8은 TYE665 표지된 A2-CCProbe1-RC (서열번호 8)로부터 PCR 동안 발생한 신호를 나타낸다. 7 is TYE563 labeled A1-CCProbe2-RC represents the fluorescent signal generated during PCR from (SEQ ID NO: 7), Figure 8 shows a signal generated during PCR from TYE665 labeled A2-CCProbe1-RC (SEQ ID NO: 8). 상기 PCR 반응에 대한 형광 곡선은, 각각의 프로브가 완벽하게 상보적인 타겟의 증폭을 검출할 수 있고, 단일 미스매치를 포함하는 타겟의 증폭은 검출하지 않는다는 것을 시사한다. Suggesting that fluorescence curve for the PCR reaction, the respective probes and to fully detect the amplification of a complementary target, amplification of a target containing a single mismatch does not detect.

본 명세서에서 명시된 임의의 특허, 특허 출원, 문헌 또는 기타 개시 내용은 참조에 의해 전체로서 본 명세서에 삽입된다. Any patents, patent applications, documents, or other disclosure set forth herein, is inserted into the specification as a whole by reference. 본 명세서에 참조에 의해 통합되나 본 명세서에서 제시된 기존의 정의, 설명 또는 기타 개시내용과 상충되는 임의의 내용, 또는 그의 일부는, 통합된 내용 및 본 개시 내용 간에 상충이 발생하지 않는 범위에서만 통합된다. Existing definitions set forth in this disclosure herein, but incorporated by reference, describe, or other disclosure arbitrary content that is inconsistent with the content, or a portion thereof is incorporated only in the integrated information, and the range that a conflict occurs between this disclosure .

첨부된 서열목록(서열번호 1 내지 33)을 참조한다. Refer to the attached list of sequence (SEQ ID NO: 1 to 33).

<110> Samsung Techwin Co. <110> Samsung Techwin Co. Ltd. Ltd. <120> REAL TIME PCR DETECTION OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS <130> PN089052 <150> US61/390,701 <151> 2010-10-07 <150> US13/158,593 <151> 2011-06-13 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5' 6-carboxyfluorescein donor chromophore <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 56-FAM: 5' 6-carboxyfluorescein donor chromophore <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> RNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(19) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> 3IABlkFQ: 3' Iowa Black FQ Quencher <400> 1 cgatcaggaa atcaaccag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5' TYE563 fluorescent dye <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <120> REAL TIME PCR DETECTION OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS <130> PN089052 <150> US61 / 390,701 <151> 2010-10-07 <150> US13 / 158,593 <151> 2011-06-13 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5 '6-carboxyfluorescein donor chromophore <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 56-FAM: 5 '6-carboxyfluorescein donor chromophore <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (7) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (8) .. (11) <223> RNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12) .. (19) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> 3IABlkFQ: 3 'Iowa Black FQ Quencher <400> 1 cgatcaggaa atcaaccag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5 'TYE563 fluorescent dye <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (7) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (8) .. (11) <223> RNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(19) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> 3' IABlkFQ: 3" Iowa Black FQ quencher <400> 2 cgatcaggca atcaaccag 19 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 cacactggtt gatttcctga tcgcaca 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 cacactggtt gattgcctga tcgcaca 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 tcgtcattcc attacctacc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 tactgatcga taatgccaga cgaa 24 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5TYE563; <223> RNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12) .. 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(8) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (9) .. (12) <223> RNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (13) .. (18) <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> 3IAbRQSp: 3 'Iowa Black RQ-Sp Dark Quecher <220> <221> misc_RNA <222> (11) <223> n is uracil <400> 7 ggcccatcca naacagcc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5TYE665: 5 'TYE665 fluorescent dye <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (9) <223> DNA sequence < 220> <221> misc_feature <222> (10) .. (13) <223> RNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (14) .. (18) <223> DNA sequence <220> <221 > misc_feature <222> (18) <223> 3IAbRQSp: 3 'Iowa Black RQ-Sp Dark Quencher <220> <221> misc_RNA <222> (11) <223> n is uracil <400> 8 ggcccatccc naacagcc 18 <210 > 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gagaggctgt ta tggatggg ccgaga 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 gagaggctgt tagggatggg ccgaga 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 gatgaactcc aggataaaat ccacc 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 tacttcaggc tgaaggaaag g 21 <210> 13 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 13 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys 20 25 30 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro His Glu 35 40 45 Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala Asp Asp Tyr Lys 50 55 60 Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn Arg Ser Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu Ala Leu Asn Ser Leu Gln 85 90 95 Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn 100 105 110 Arg Ph tggatggg ccgaga 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 gagaggctgt tagggatggg ccgaga 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 gatgaactcc aggataaaat ccacc 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 tacttcaggc tgaaggaaag g 21 <210> 13 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 13 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys 20 25 30 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro His Glu 35 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Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile Glu Arg 20 25 30 Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Gly Gln 35 40 45 Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu Asp Asp Tyr Tyr 50 55 60 Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu Arg His His Ser Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val e Ala Ser Leu Ile Glu Arg Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr 165 170 175 Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile 195 200 205 Lys Ala Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 210 215 220 <210> 14 <211> 220 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshi <400> 14 Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile Glu Arg 20 25 30 Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Gly Gln 35 40 45 Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu Asp Asp Tyr Tyr 50 55 60 Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu Arg His His Ser Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val Ala Leu Asn Ser Leu Arg 85 90 95 Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Gln Lys Tyr Gly Glu Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Lys Glu Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe 195 200 205 Arg Lys Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys 210 215 220 <210> 15 <211> 228 <212> PRT <213> Thermococcus kodakarensis <400> 15 Met Lys Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Asn Ser Leu Pro Lys 20 25 30 Leu Glu Glu Leu Lys Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Lys Leu Phe Asn Glu Ile Leu Gly Val Leu Asp Asp Tyr Val 50 55 60 Ile Val Ala Leu Asn Ser Leu Arg 85 90 95 Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Gln Lys Tyr Gly Glu Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Lys Glu Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe 195 200 205 Arg Lys Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys 210 215 220 <210> 15 <211> 228 <212> PRT <213> Thermococcus kodakarensis <400> 15 Met Lys Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Asn Ser Leu Pro Lys 20 25 30 Leu Glu Glu Leu Lys Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Lys Leu Phe Asn Glu Ile Leu Gly Val Leu Asp Asp Tyr Val 50 55 60 Ile Leu Glu Leu Pro Pro Asp Val Ile Gly Ser Arg Glu Gly Thr Leu 65 70 75 80 Asn Glu Phe Glu Val Glu Asn Phe Ala Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Glu Glu 100 105 110 Arg Phe Ala Arg Glu Leu Gly Glu Arg Leu Asn Phe Glu Ala Glu Val 115 120 125 Val Ala Lys His Lys Ala Asp Asp Ile Phe Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Val Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Glu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Arg Ala Phe Leu Glu Asn Tyr Tyr Arg Glu His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Lys Gly Trp Lys Thr Leu Lys Lys Ile Ala Glu Lys Val 195 200 205 Glu Ser Glu Lys Lys Ala Glu Glu Arg Gln Ala Thr Leu Asp Arg Tyr 210 215 220 Phe Arg Lys Val 225 <210> 16 <211> 211 <212> PRT <213> Archaeoglobus profundus <400> 16 Met Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val Ile Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Ile Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu Tyr Leu 20 25 30 Lys Ser Leu Glu Leu Pro Pro Asp Val Ile Gly Ser Arg Glu Gly Thr Leu 65 70 75 80 Asn Glu Phe Glu Val Glu Asn Phe Ala Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Glu Glu 100 105 110 Arg Phe Ala Arg Glu Leu Gly Glu Arg Leu Asn Phe Glu Ala Glu Val 115 120 125 Val Ala Lys His Lys Ala Asp Asp Ile Phe Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Val Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Glu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Arg Ala Phe Leu Glu Asn Tyr Tyr Arg Glu His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Lys Gly Trp Lys Thr Leu Lys Lys Ile Ala Glu Lys Val 195 200 205 Glu Ser Glu Lys Lys Ala Glu Glu Arg Gln Ala Thr Leu Asp Arg Tyr 210 215 220 Phe Arg Lys Val 225 <210> 16 <211> 211 <212> PRT <213> Archaeoglobus profundus <400> 16 Met Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val Ile Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Ile Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu Tyr Leu 20 25 30 Lys Ser Val Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Asp Arg Arg Lys Arg 35 40 45 Glu Glu Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Ser Leu Cys Lys Val Lys Val Leu 50 55 60 Lys Ile Ser Val Glu Asp Leu Asn Arg Leu Met Glu Tyr Met Ser Ile 65 70 75 80 Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Val Glu Ile Ile Arg Ser Leu Met 85 90 95 Pro Lys Val Val Tyr Ile Asp Cys Pro Asp Ile Asn Val Glu Arg Phe 100 105 110 Lys His Glu Ile Glu Glu Arg Thr Gly Val Glu Val Phe Ala Ser His 115 120 125 Lys Ala Asp Glu Ile Tyr Pro Ile Val Ser Ile Ala Ser Ile Val Ala 130 135 140 Lys Val Glu Arg Asp Phe Glu Ile Asp Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Gly 145 150 155 160 Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Leu Arg Thr Ile Glu Phe Leu 165 170 175 Arg Ser 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Asp 1 5 10 15 <210> 24 <211> 174 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 24 Met Phe Asn Leu Ser Leu Ser Ile Lys Ile Pro Ala Ile Leu His Asn 1 5 10 15 Asn Leu Phe Val Met Gln Lys Gln Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser Ile 20 25 30 Leu Cys Asn Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Val Leu Arg Tyr 35 40 45 Lys Gln His Glu Ly s Met Leu Ser Lys Gly Tyr Phe Lys Thr Thr Asn 50 55 60 Asn Arg Met Glu Leu Arg Ala Val Ile Glu Ala Leu Asn Thr Leu Lys 65 70 75 80 Glu Pro Cys Leu Ile Thr Leu Tyr Ser Asp Ser Gln Tyr Met Lys Asn 85 90 95 Gly Ile Thr Lys Trp Ile Phe Asn Trp Lys Lys Asn Asn Trp Lys Ala 100 105 110 Ser Ser Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Glu Ser Ile Gln Arg His Lys Ile Asn Trp Gln Trp Val Lys Gly His 130 135 140 Ala Gly His Arg Glu Asn Glu Ile Cys Asp Glu Leu Ala Lys Lys Gly 145 150 155 160 Ala Glu Asn Pro Thr Leu Glu Asp Met Gly Tyr Phe Glu Glu 165 170 <210> 25 <211> 166 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 25 Met Asn Pro Ser Pro Arg Lys Arg Val Ala 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Thr Asn Asn 35 40 45 Arg Met Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Arg Glu 50 55 60 Pro Cys Gln Val His Leu His Thr Asp Ser Gln Tyr Leu Lys Arg Ala 65 70 75 80 Phe Ala Glu Gly Trp Val Glu Arg Trp Gln Arg Asn Gly Trp Arg Thr 85 90 95 Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Gln Ala Leu Leu 100 105 110 L 70 75 80 Ala Phe Thr Glu Gly Trp Leu Glu Gly Trp Arg Lys Arg Gly Trp Arg 85 90 95 Thr Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Arg Asp Leu Trp Glu Ala Leu 100 105 110 Leu Leu Ala Met Ala Pro His Arg Val Arg Phe His Phe Val Lys Gly 115 120 125 His Thr Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg 130 135 140 Gln Ala Gln Ser Gln Ala Lys Thr Pro Cys Pro Pro Arg Ala Pro Thr 145 150 155 160 Leu Phe His Glu Glu Ala 165 <210> 26 <211> 161 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 26 Met Ser Leu Pro Leu Lys Arg Val Asp Leu Phe Thr Asp Gly Ala Cys 1 5 10 15 Leu Gly Asn Pro Gly Pro Gly Gly Trp Ala Ala Leu Leu Arg Tyr Gly 20 25 30 Ser Gln Glu Lys Leu Leu Ser Gly Gly Glu Pro Cys Thr Thr Asn Asn 35 40 45 Arg Met Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Arg Glu 50 55 60 Pro Cys Gln Val His Leu His Thr Asp Ser Gln Tyr Leu Lys Arg Ala 65 70 75 80 Phe Ala Glu Gly Trp Val Glu Arg Trp Gln Arg Asn Gly Trp Arg Thr 85 90 95 Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Gln Ala Leu Leu 100 105 110 L ys Ala Met Glu Gly His Glu Val Ala Phe His Phe Val Glu Gly His 115 120 125 Ser Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg Gln 130 135 140 Ala Lys Ala Gln Pro Gln Val Pro Cys Pro Pro Lys Glu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Phe <210> 27 <211> 146 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 27 Met Leu Lys Gln Val Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ala Ile Leu Arg Tyr Arg Gly His Glu 20 25 30 Lys Thr Phe Ser Glu Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu 35 40 45 Leu Met Ala Ala Ile Val Ala Leu Glu Ala Leu Lys Glu His Cys Glu 50 55 60 Val Thr Leu Ser Thr Asp Ser Gln Tyr Val Arg Gln Gly Ile Thr Gln 65 70 75 80 Trp Ile His Asn Trp Lys Lys Arg Gly Trp Lys Thr Ala Glu Lys Lys 85 90 95 Pro Val Lys Asn Val Asp Leu Trp Lys Arg Leu Asp Ala Ala Leu Gly 100 105 110 Gln His Gln Ile Lys Trp Val Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro 115 120 125 Glu Asn Glu Arg Cys Asp Glu Leu Ala Arg Ala Ala Ala Met Asn Pro 130 135 140 Thr Gln 145 <210> 28 <211> 146 ys Ala Met Glu Gly His Glu Val Ala Phe His Phe Val Glu Gly His 115 120 125 Ser Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg Gln 130 135 140 Ala Lys Ala Gln Pro Gln Val Pro Cys Pro Pro Lys Glu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Phe <210> 27 <211> 146 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 27 Met Leu Lys Gln Val Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ala Ile Leu Arg Tyr Arg Gly His Glu 20 25 30 Lys Thr Phe Ser Glu Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu 35 40 45 Leu Met Ala Ala Ile Val Ala Leu Glu Ala Leu Lys Glu His Cys Glu 50 55 60 Val Thr Leu Ser Thr Asp Ser Gln Tyr Val Arg Gln Gly Ile Thr Gln 65 70 75 80 Trp Ile His Asn Trp Lys Lys Arg Gly Trp Lys Thr Ala Glu Lys Lys 85 90 95 Pro Val Lys Asn Val Asp Leu Trp Lys Arg Leu Asp Ala Ala Leu Gly 100 105 110 Gln His Gln Ile Lys Trp Val Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro 115 120 125 Glu Asn Glu Arg Cys Asp Glu Leu Ala Arg Ala Ala Ala Met Asn Pro 130 135 140 Thr Gln 145 <210> 28 <211> 146 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 28 Met Lys His Val Asp Ile Phe Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Trp Gly Ala Val Leu Arg Tyr Gly Glu Thr Glu Lys 20 25 30 Glu Leu Ser Gly Gly Glu Ala Asp Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Asn Ala Leu Lys Ser Pro Cys Glu Val 50 55 60 Asp Leu Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr Val Lys Asp Gly Ile Thr Lys Trp 65 70 75 80 Ile Phe Gly Trp Lys Lys Lys Gly Trp Lys Thr Ala Asp Asn Lys Pro 85 90 95 Val Lys Asn Val Glu Leu Trp Gln Ala Leu Glu Ala Ala Gln Glu Arg 100 105 110 His Lys Val Thr Leu His Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Ala Asp Glu Leu Ala Arg Lys Gly Met Glu Pro Phe Lys 130 135 140 Arg Arg 145 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Lys Xaa Val Xaa Leu Phe Thr Asp Gly Xaa Cys Xaa Gly Xaa Pro Gly 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Tyr 20 25 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence < <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 28 Met Lys His Val Asp Ile Phe Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Trp Gly Ala Val Leu Arg Tyr Gly Glu Thr Glu Lys 20 25 30 Glu Leu Ser Gly Gly Glu Ala Asp Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Asn Ala Leu Lys Ser Pro Cys Glu Val 50 55 60 Asp Leu Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr Val Lys Asp Gly Ile Thr Lys Trp 65 70 75 80 Ile Phe Gly Trp Lys Lys Lys Gly Trp Lys Thr Ala Asp Asn Lys Pro 85 90 95 Val Lys Asn Val Glu Leu Trp Gln Ala Leu Glu Ala Ala Gln Glu Arg 100 105 110 His Lys Val Thr Leu His Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Ala Asp Glu Leu Ala Arg Lys Gly Met Glu Pro Phe Lys 130 135 140 Arg Arg 145 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Lys Xaa Val Xaa Leu Phe Thr Asp Gly Xaa Cys Xaa Gly Xaa Pro Gly 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Tyr 20 25 < 210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence < 220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 31 Lys Pro Val Lys Asn 1 5 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 32 Phe Val Lys Gly His Xaa Gly His Xaa Glu Asn Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 1950 <212> DNA <213> Salmonella enterica <400> 33 aacagtgctc gtttacgacc tgaattactg attctggtac taatggtgat gatcatttct 60 atgttcgtca ttccattacc tacctatctg gttgatttcc tgatcgcact gaatatcgta 120 ctggcgatat tggtgtttat ggggtcgttc tacattgaca gaatcctcag tttttcaacg 180 tttcctgcgg tactgttaat taccacgctc tttcgtctgg cattatcgat cagtaccagc 240 cgtcttatct tgattgaagc cgatgccggt gaaattatcg ccacgttcgg gcaattcgtt 300 attggcgata gcctggcggt gggttttgtt gtcttctcta ttgtcaccgt ggtccagttt 360 atcgttatta ccaaaggttc agaacgcgtc gcggaagtcg cggcccgatt ttctctggat 420 ggtatgcccg gtaaacagat gagtattgat gccgatttga aggccggtat tattgatgcg 480 gatgctgcgc gcgaacggcg aagc 220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 31 Lys Pro Val Lys Asn 1 5 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 32 Phe Val Lys Gly His Xaa Gly His Xaa Glu Asn Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 1950 <212> DNA <213> Salmonella enterica <400> 33 aacagtgctc gtttacgacc tgaattactg attctggtac taatggtgat gatcatttct 60 atgttcgtca ttccattacc tacctatctg gttgatttcc tgatcgcact gaatatcgta 120 ctggcgatat tggtgtttat ggggtcgttc tacattgaca gaatcctcag tttttcaacg 180 tttcctgcgg tactgttaat taccacgctc tttcgtctgg cattatcgat cagtaccagc 240 cgtcttatct tgattgaagc cgatgccggt gaaattatcg ccacgttcgg gcaattcgtt 300 attggcgata gcctggcggt gggttttgtt gtcttctcta ttgtcaccgt ggtccagttt 360 atcgttatta ccaaaggttc agaacgcgtc gcggaagtcg cggcccgatt ttctctggat 420 ggtatgcccg gtaaacagat gagtattgat gccgatttga aggccggtat tattgatgcg 480 gatgctgcgc gcgaacggcg aagc gtactg gaaagggaaa gccagcttta cggttccttt 540 gacggtgcga tgaagtttat caaaggtgac gctattgccg gcatcattat tatctttgtg 600 aactttattg gcggtatttc ggtggggatg acccgccatg gtatggattt gtcctccgct 660 ctgtctactt ataccatgct gaccattggt gatggtcttg tcgcccagat ccccgcattg 720 ttgattgcga ttagtgccgg ttttatcgtg actcgcgtaa atggcgatag cgataatatg 780 gggcggaata tcatgacgca gctgttgaac aacccatttg tattggttgt tacggctatt 840 ttgaccattt caatgggaac tctgccggga ttcccgctgc cggtatttgt tattttatcg 900 gtggttttaa gcgtactctt ctattttaaa ttccgtgaag caaaacgtag cgccgccaaa 960 cctaaaacca gcaaaggcga gcagccgctt agtattgagg aaaaagaagg gtcgtcgttg 1020 ggactgattg gcgatctcga taaagtctct acagagaccg taccgttgat attacttgtg 1080 ccgaagagcc ggcgtgaaga tctggaaaaa gctcaacttg cggagcgtct acgtagtcag 1140 ttctttattg attatggcgt gcgcctgccg gaagtattgt tacgcgatgg cgagggcctg 1200 gacgataaca gcatcgtatt gttgattaat gagatccgtg ttgaacaatt tacggtctat 1260 tttgatttga tgcgagtggt aaattattcc gatgaagtcg tgtcctttgg tattaatcca 1320 acaatccatc agcaaggtag cagtcagtat ttctggg gtactg gaaagggaaa gccagcttta cggttccttt 540 gacggtgcga tgaagtttat caaaggtgac gctattgccg gcatcattat tatctttgtg 600 aactttattg gcggtatttc ggtggggatg acccgccatg gtatggattt gtcctccgct 660 ctgtctactt ataccatgct gaccattggt gatggtcttg tcgcccagat ccccgcattg 720 ttgattgcga ttagtgccgg ttttatcgtg actcgcgtaa atggcgatag cgataatatg 780 gggcggaata tcatgacgca gctgttgaac aacccatttg tattggttgt tacggctatt 840 ttgaccattt caatgggaac tctgccggga ttcccgctgc cggtatttgt tattttatcg 900 gtggttttaa gcgtactctt ctattttaaa ttccgtgaag caaaacgtag cgccgccaaa 960 cctaaaacca gcaaaggcga gcagccgctt agtattgagg aaaaagaagg gtcgtcgttg 1020 ggactgattg gcgatctcga taaagtctct acagagaccg taccgttgat attacttgtg 1080 ccgaagagcc ggcgtgaaga tctggaaaaa gctcaacttg cggagcgtct acgtagtcag 1140 ttctttattg attatggcgt gcgcctgccg gaagtattgt tacgcgatgg cgagggcctg 1200 gacgataaca gcatcgtatt gttgattaat gagatccgtg ttgaacaatt tacggtctat 1260 tttgatttga tgcgagtggt aaattattcc gatgaagtcg tgtcctttgg tattaatcca 1320 acaatccatc agcaaggtag cagtcagtat ttctggg taa cgcatgaaga gggggagaaa 1380 ctccgggagc ttggctatgt gttgcggaac gcgcttgatg agctttacca ctgtctggcg 1440 gtgaccgtgg cgcgcaacgt caatgaatat ttcggtattc aggaaacaaa acatatgctg 1500 gaccaactgg aagcgaaatt tcctgattta cttaaagaag tgctcagaca tgccacggta 1560 caacgtatat ctgaagtttt gcagcgttta ttaagcgaac gtgtttccgt gcgtaatatg 1620 aaattaatta tggaagcgct cgcattgtgg gcgccaagag aaaaagatgt cattaacctt 1680 gtagagcata ttcgtggagc aatggcgcgt tatatttgtc ataaattcgc caatggcggc 1740 gaattacgag cagtaatggt atctgctgaa gttgaggatg ttattcgcaa agggatccgt 1800 cagacctctg gcagtacctt cctcagcctt gacccggaag cctccgctaa tttgatggat 1860 ctcattacac ttaagttgga tgatttattg attgcacata aagatcttgt cctccttacg 1920 tctgtcgatg tccgtcgatt tattaagaaa 1950 taa cgcatgaaga gggggagaaa 1380 ctccgggagc ttggctatgt gttgcggaac gcgcttgatg agctttacca ctgtctggcg 1440 gtgaccgtgg cgcgcaacgt caatgaatat ttcggtattc aggaaacaaa acatatgctg 1500 gaccaactgg aagcgaaatt tcctgattta cttaaagaag tgctcagaca tgccacggta 1560 caacgtatat ctgaagtttt gcagcgttta ttaagcgaac gtgtttccgt gcgtaatatg 1620 aaattaatta tggaagcgct cgcattgtgg gcgccaagag aaaaagatgt cattaacctt 1680 gtagagcata ttcgtggagc aatggcgcgt tatatttgtc ataaattcgc caatggcggc 1740 gaattacgag cagtaatggt atctgctgaa gttgaggatg ttattcgcaa agggatccgt 1800 cagacctctg gcagtacctt cctcagcctt gacccggaag cctccgctaa tttgatggat 1860 ctcattacac ttaagttgga tgatttattg attgcacata aagatcttgt cctccttacg 1920 tctgtcgatg tccgtcgatt tattaagaaa 1950

Claims (27)

  1. a) 다형성(polymorphism)을 갖는 타겟 DNA의 존재에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계; a) providing a sample to be tested for the presence of a target DNA having a polymorphic (polymorphism);
    b) 상기 타겟 DNA에 어닐링(anneal)할 수 있는 증폭 프라이머(amplication primer) 쌍을 제공하는 단계로, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치(location of polymorphism)의 상류(upstream)에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 위치의 하류(downstream)에 어닐링하는 것인 단계; b) a step of providing the target can be annealed (anneal) amplification primers (amplication primer) in the DNA pair, and the first amplification primer is annealed to the upper (upstream) of the polymorphic position (location of polymorphism), the second amplifier a step primer is to anneal in the downstream (downstream) of the polymorphic site;
    c) 검출가능한 표지(label), 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 다형성을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 영역에 완전히 상보적이고(entirely complementary), 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인(substantially complimentary) 것인 단계; c) a detectable label (label), and the DNA and a step of providing a probe comprising a RNA nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected area of ​​the target DNA sequence containing the polymorphism (entirely complementary ), the DNA nucleotide sequence of the probe is substantially complementary to the (substantially complimentary) to the DNA sequence adjacent to the selected area of ​​the target DNA sequence step;
    d) 상기 프로브 내의 RNA 서열이, 상기 다형성을 포함하는 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥(heteroduplex)을 형성할 수 있는 조건 하에서, 증폭 폴리머라제(amplifying polymerase) 활성, 증폭 완충액(amplification buffer); d) the RNA sequence within the probe, complementary to the DNA sequences and RNA in a PCR fragment containing the polymorphism: under conditions capable of forming a DNA releasing double stranded (heteroduplex), the amplifying polymerase (amplifying polymerase) activity, an amplification buffer, (amplification buffer); RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 간의 PCR 단편(fragment)을 증폭시키는 단계; Under the presence of RNase H activity and a probe, the method comprising: amplifying a PCR fragment (fragment) between the first and second amplification primers; And
    e) 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가(real-time increase)를 검출하는 단계를 포함하고, e) includes the step of detecting the real-time increase (real-time increase) of the signal emitted from the marker on the probe,
    상기 신호의 증가는 타겟 DNA 내 다형성의 존재를 나타내는 것인, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출 방법. Increase of the signal is a real-time method for detecting a polymorphism in the target DNA would indicate the presence of a polymorphic target DNA.
  2. a) 다형성을 갖는 타겟 DNA의 존재에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계; a) providing a sample to be tested for the presence of a target DNA having a polymorphic;
    b) 상기 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 상기 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인 단계; b) a step of providing a pair of amplification primers capable of annealing to the target DNA, the first amplification primer that is annealed to and upstream of the polymorphic position, the second amplification primer annealed downstream of the polymorphic site;
    c) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계; c) a detectable label and DNA and providing a probe comprising a RNA nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the target DNA sequence containing the wild-type DNA sequence at the polymorphic position, the the nucleic acid sequence of the DNA probe is substantially complementary to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the target DNA sequence step;
    d) 상기 프로브 내의 RNA 서열이 상기 다형성을 포함하는 PCR 단편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, 증폭 폴리머라제 활성, 증폭 완충액; d) the complementary DNA and RNA sequences in the PCR fragments to the RNA sequence within the probe comprising the polymorphic: under conditions capable of forming a double-stranded DNA releasing, amplifying polymerase activity, an amplification buffer; RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭시키는 단계; Under the presence of RNase H activity and a probe, the method comprising: amplifying a PCR fragment between the first and second amplification primers; And
    e) 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 감소를 검출하는 단계를 포함하고, e) and detecting a decrease in the real-time signal emitted from the marker on the probe,
    상기 신호의 감소는 상기 타겟 DNA 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출 방법. Decrease of the signal is a real-time method for detecting a polymorphism in the target DNA would indicate the presence of a polymorphism in the target DNA.
  3. a) 다형성을 갖는 타겟 RNA의 존재에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계; a) providing a sample to be tested for the presence of a target RNA having the polymorphism;
    b) 상기 RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 상기 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인 단계; b) a step to anneal downstream of the RNA to the step of providing the amplification primer pair capable of annealing to the cDNA of the target, the first amplification primer and the annealing upstream of the polymorphic position, the second amplification primer comprises the polymorphic position .;
    c) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 cDNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계; c) providing a probe comprising a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequences, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the cDNA sequence containing the polymorphism, DNA nucleotide sequence of the probe is the substantially complementary to the phase DNA sequence adjacent to the selected site of the cDNA sequence;
    d) 역전사 효소(reverse transcriptase) 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액; d) a reverse transcriptase (reverse transcriptase) activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase -PCR buffer; RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 및 상기 프로브 내의 RNA 서열이, 상기 다형성을 포함하는 RT-PCR DNA 단편 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 간의 역전사 효소-PCR 단편을 증폭시키는 단계; Under RNase H present in the active and the probe, and a sequence complementary to the RNA in the RNA sequence within the probe, the RT-PCR DNA fragment containing the polymorphic: under conditions capable of forming a DNA release double-stranded, the first and the step for amplifying the reverse transcriptase -PCR fragment between the two amplification primers; And
    e) 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고, e) it includes the step of detecting the real-time increase in the signal emitted from the marker on the probe,
    상기 신호의 증가는 상기 RNA 타겟 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, RNA 타겟 내 다형성의 실시간 검출 방법. Increase of the signal is a real-time method for detecting a polymorphism in RNA target would indicate the presence of a polymorphism in the target RNA.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 프로프 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가는 상기 RNA:DNA 이형이중가닥 내 프로브의 RNA 서열의 RNase H 절단으로부터 야기되는 것인 방법. The method of releasing a double-stranded DNA resulting from RNase H cleavage of the RNA sequence within the probe: according to claim 1 or 3, wherein the real-time increase in the signal emitted from the marker on the prop is the RNA.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 내의 다형성에 상보적인 것인 방법. The method of claim 1, wherein the RNA nucleotide sequence of the probe is the complementary of the polymorphism in the target DNA.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 다형성은 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)인 것인 방법. 3. A method according to claim 1 or 3, wherein the polymorphism is a method that a single nucleotide polymorphism (single nucleotide polymorphism, SNP).
  7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 프로브의 DNA 및 RNA 서열은 공유 결합되어(covalently linked) 있는 것인 방법. According to claim 1 or 3, wherein the DNA and the RNA sequence of the probe is coupled to share (covalently linked).
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 프로브 상의 검출가능한 표지는 형광 표지(fluorescent label)인 것인 방법. 3. A method according to claim 1 or 3, wherein the detectable label on the probe to a fluorescent label (fluorescent label).
  9. 제8항에 있어서, 상기 형광 표지는 FRET 쌍을 포함하는 것인 방법. 10. The method of claim 8, wherein said fluorescent label comprises a FRET pair.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 PCR 단편은 고체 지지체에 결합되어 있는 것인 방법. According to claim 1 or 3, wherein the PCR fragment is coupled to a solid support.
  11. 제3항에 있어서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 타겟 RNA 내의 다형성 위치의 cDNA에 상보적인 RNA 서열을 포함하는 것인 방법. The method of claim 3, RNA nucleic acid sequences of the probes comprises a sequence complementary to the RNA to cDNA of the polymorphic position in the target RNA.
  12. 제3항에 있어서, 상기 RNA 타겟은 mRNA 전사체(transcript)인 것인 방법. The method of claim 3, wherein said target RNA is an mRNA transcript (transcript).
  13. 제3항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트(hot start), 열안정성(thermostable RNase H)의 활성인 것인 방법. The method of claim 3, wherein said RNase H activity is the activity of a hot start (hot start), thermal stability (thermostable RNase H).
  14. a) 다형성을 갖는 RNA 타겟의 존재에 대해 시험될 샘플을 제공하는 단계; a) providing a sample to be tested for the presence of RNA target with a polymorphism;
    b) 상기 RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로, 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 상기 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인 단계; b) a step to anneal downstream of the RNA to the step of providing the amplification primer pair capable of annealing to the cDNA of the target, the first amplification primer and the annealing upstream of the polymorphic position, the second amplification primer comprises the polymorphic position .;
    c) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 cDNA의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계; c) providing a probe comprising a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequences, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected portion of the cDNA containing the wild-type DNA sequence at the polymorphic position of the probe the step DNA nucleic acid sequence is substantially complementary to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the cDNA;
    d) 역전사 효소 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액; d) reverse transcriptase activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase -PCR buffer; RNase H 활성 및 프로브의 존재 하에, 및 상기 프로브 내의 RNA 서열이, 상기 다형성을 포함하는 RT-PCR DNA 단편 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 이형이중가닥을 형성할 수 있는 조건 하에서, 상기 제1 및 제2 증폭 프라이머 간의 역전사 효소-PCR 단편을 증폭시키는 단계; Under RNase H present in the active and the probe, and a sequence complementary to the RNA in the RNA sequence within the probe, the RT-PCR DNA fragment containing the polymorphic: under conditions capable of forming a DNA release double-stranded, the first and the step for amplifying the reverse transcriptase -PCR fragment between the two amplification primers; And
    e) 상기 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 감소를 검출하는 단계를 포함하고, e) and detecting a decrease in the real-time signal emitted from the marker on the probe,
    상기 신호의 감소는 상기 RNA 타겟 내의 다형성의 존재를 나타내는 것인, RNA 타겟 내 다형성의 실시간 검출 방법. Decrease of the signal is a real-time method for detecting a polymorphism in RNA target would indicate the presence of a polymorphism in the target RNA.
  15. a) 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인, 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍; a) a first amplification primer which, amplification primers capable of annealing to a target DNA a second amplification primer annealing upstream of the polymorphic site, and is to anneal downstream of the polymorphic site;
    b) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브; b) a detectable label and DNA and RNA with a probe comprising a nucleic acid sequence, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the target DNA sequence comprising a polymorphism, DNA nucleic acid sequence of the probe, the target DNA sequence of substantially complementary to the probe to the DNA sequence adjacent to a selected site;
    c) 증폭 폴리머라제 활성, 증폭 완충액; c) amplifying polymerase activity, an amplification buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출을 위한 키트. And RNase H, the target DNA Kit for Real-Time Detection of polymorphism comprising the active.
  16. a) 제1 증폭 프라이머는 다형성 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 위치의 하류에 어닐링하는 것인, 타겟 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍; a) a first amplification primer which, amplification primers capable of annealing to a target DNA a second amplification primer annealing upstream of the polymorphic site, and is to anneal downstream of the polymorphic site;
    b) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 서열의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브; b) by including a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequence probes, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the target DNA sequence containing the wild-type DNA sequence at the polymorphic position, DNA nucleotide sequence of the probe It is substantially complementary to the probe to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the target DNA sequence;
    c) 증폭 폴리머라제 활성, 증폭 완충액; c) amplifying polymerase activity, an amplification buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, 타겟 DNA 내 다형성의 실시간 검출을 위한 키트. And RNase H, the target DNA Kit for Real-Time Detection of polymorphism comprising the active.
  17. a) 제1 증폭 프라이머는 다형성 서열(polymorphic sequence) 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 하류에 어닐링하는 것인, RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍; a) a first amplification primer comprises the polymorphic sequence (polymorphic sequence) anneals to the upstream of the position, and the second amplification primer which, amplification primers capable of annealing to the cDNA of the RNA target to anneal downstream of the polymorphic sequence position;
    b) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성을 포함하는 cDNA의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브; b) by including a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequence probes, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected region of the cDNA including the polymorphism, DNA nucleic acid sequence of the probe to a selected portion of the cDNA adjacent substantially complementary to the probe in the DNA sequences; And
    c) 역전사 효소 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액; c) reverse transcriptase activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase -PCR buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, RNA 타겟 내 다형성의 실시간 검출을 위한 키트. And RNase H, kits for real-time detection of a polymorphism within a target RNA that contains the active.
  18. 제15항에 있어서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 타겟 DNA 내 다형성에 상보적인 서열을 포함하는 것인 키트. The method of claim 15, wherein the RNA nucleotide sequence of the probe will comprise a sequence complementary to the target DNA polymorphism within the kit.
  19. 제15항 또는 제17항에 있어서, 상기 다형성은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)인 것인 키트. Claim 15 or claim 17, wherein the polymorphism is a single nucleotide polymorphism (SNP) kit.
  20. 제15항 또는 제17항에 있어서, 상기 프로브의 DNA 및 RNA 서열은 공유 결합되어 있는 것인 키트. Claim 15 according to any one of claims 17, wherein the DNA and the RNA sequence of the probe is coupled to share the kit.
  21. 제15항 또는 제17항에 있어서, 상기 프로브 상의 검출가능한 표지는 형광 표지인 것인 키트. Claim 15 or claim 17, wherein the detectable label on the probe is a fluorescent label would the kit.
  22. 제21항에 있어서, 상기 형광 표지는 FRET 쌍인 것인 키트. The method of claim 21, wherein the fluorescent label is a FRET pair, one of the kit.
  23. 제15항에 있어서, 상기 프로브 또는 PCR 단편은 고체 지지체에 결합된 것인 키트. 16. The method of claim 15, wherein the probe or PCR fragment is a kit that is bound to a solid support.
  24. 제17항에 있어서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 타겟 RNA 내의 다형성 위치의 cDNA에 상보적인 서열을 포함하는 것인 키트. The method of claim 17, wherein the RNA nucleotide sequence of the probe comprises a sequence complementary to the cDNA of the polymorphic position in the target RNA kit.
  25. 제17항에 있어서, 상기 프로브 또는 역전사 효소-PCR 단편은 고체 지지체에 결합된 것인 키트. 18. The method of claim 17, wherein the probe or reverse transcriptase -PCR fragment is a kit that is bound to a solid support.
  26. 제17항에 있어서, 상기 역전사 효소 활성 및 증폭 폴리머라제 활성은 동일한 분자에서 발견되는 것인 키트. 18. The method of claim 17 wherein the reverse transcriptase activity and amplifying the polymerase activity is found in the same molecule kit.
  27. a) 제1 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 상류에 어닐링하고, 제2 증폭 프라이머는 다형성 서열 위치의 하류에 어닐링하는 것인, RNA 타겟의 cDNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍; a) a first amplification primer is annealed to sequence upstream of the polymorphic site, and the second amplification primer which, amplification primers capable of annealing to the cDNA of the RNA target to anneal downstream of the polymorphic sequence position;
    b) 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브로, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 다형성 위치에서 야생형 DNA 서열을 포함하는 cDNA의 선택된 부위에 완전히 상보적이고, 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 cDNA의 선택된 부위에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 프로브; b) by including a detectable label, and DNA and RNA nucleic acid sequence probes, RNA nucleic acid sequences of the probes, fully complementary to a selected portion of the cDNA containing the wild-type DNA sequence at the polymorphic position, DNA nucleotide sequence of the probe is the substantially complementary to the probe to the DNA sequence adjacent to a selected portion of the cDNA; And
    c) 역전사 효소 활성, 증폭 폴리머라제 활성, 역전사 효소-PCR 완충액; c) reverse transcriptase activity, an amplification polymerase activity, reverse transcriptase -PCR buffer; 및 RNase H 활성을 포함하는, RNA 타겟 내 다형성의 실시간 검출을 위한 키트. And RNase H, kits for real-time detection of a polymorphism within a target RNA that contains the active.
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