KR20110078038A - 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 활성 증가 변이체 - Google Patents

인간 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 활성 증가 변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 활성 증가 변이체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생리활성 단백질의 체내 혈액 중의 안정성 및 활성을 증가시키기 위해 인간 과립구 콜로니 자극인자의 특정 부위에 Asn-X-Ser/Thr (N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 당쇄화가 일어나도록 아미노산이 변형된 인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 변이체 및 당쇄화된 인간 과립구 콜로니 자극 인자에 관한 것이다.
인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 변이체, 당쇄화

Description

인간 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 활성 증가 변이체{Mutant C-CSF production with increased biological activity}
본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생물학적 활성 증가 변이체에 관한 것이다.
콜로니 자극 인자(Colony Stimulating Factor, CSF)는 HPC(hemopoietic progenitor cell)의 생존, 증식, 분화에 관여하는 성장인자로, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte Macrophage CSF, GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage CSF, M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte CSF, G-CSF), 인터루킨 3(Interleukin 3, IL-3), 이 4가지 형태로 나뉜다. 그 중 G-CSF는 골수세포로부터 호중구성 과립구(neutrophilic granulocyte) 콜로니 생성을 촉진하며, 분화에 관여한다.
인간 G-CSF는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해서 2 종류의 전사체(transcripts)를 형성하여 각각 207개 아미노산(G-CSFa)과 204개 아미노산(G-CSFb) 두 가지 형태를 나타낸다[Nagata et al. 1986b]. G-CSF의 mRNA의 N-말단 30개의 아미노산은 분비를 위한 서열(Leader peptide)로 성숙된 단백질은 각각 177개 아미노산과 174개 아미노산 두 가지 형태가 나타난다. 이 두 가지 형태 모두 생체 내에서 활성을 띄지만 G-CSFb가 G-CSFa 보다 발현이 더 잘 되며 활성도 더 높다고 알려져 있다[Nagata et al. 1986b]. G-CSFa는 35번째 아미노산부터 3개의 아미노산(Valine-Serine-Glutamic acid)을 더 가지고 있다.
현재까지 G-CSF는 3가지 형태로 시판되고 있다. 대장균(E. coli)에서 생산한 필그라스팀(Filgrastim)은 암젠(Amgen)에서 NEUPOGEN이라는 이름으로 시판되고 있으며, 이 필그라스팀의 N-말단에 PEG(polyethylene glycol)를 붙여 만든 Pegfilgrastim은 역시 암젠에서 Neulasta라는 이름으로 판매가 되고 있다. 그리고 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에서 생산된 레노그라스팀(Lenograstim)은 Granocyte라는 이름으로 일본 제약회사 Chugai Pharmacia에서 판매되고 있다. 레노그라스팀은 133번째 트레오닌에 O-당쇄화가 한 군데 이루어져 있으며 N-당쇄화는 가지고 있지 않다. 그러나, 생체 내의 G-CSF와 가장 유사한 형태인 Granocyte는 혈청 내의 반감기가 3-4 시간 정도로 매우 짧아 환자들에게 자주 주사해야 하는 단점이 있다.
일반적으로 당 단백질의 경우, 당쇄 부위가 그 단백질의 분비, 면역학적 보호, 구조, 및 안정성 등을 포함한 생물학적 활성을 조절한다고 알려져 있다[Cumming 1991]. 특히, N-당쇄화는 해당 단백질의 안정성을 증가시킨다고 알려져 있다[Plihal et al. 2004].
G-CSF의 구조를 살펴보면, 4개의 알파 나선 구조(a-helical structure)를 가지고 있으며, 5개의 시스테인 잔기를 가지고 있다. 이 중, 4개의 시스테인으로 2개의 이황화(Cys36-Cys42와 Cys64-Cys74) 결합을 갖는다.
G-CSF는 G-CSF 수용체(receptor)에 결합한 후, 세포 내에서 크게 두 가지 신호전달 과정을 겪는다. 하나는 Ras/MAPK 경로이고 또 다른 하나는 G-CSF 수용체의 타이로신 인산화(tyrosine phosphorylation)에 의한 JAK 키나제의 인산화로 STAT3(signal transducers and activators 3)의 활성화이다. 이 JAK/STAT 경로는 G-CSF 의존 세포주인 AML193 세포에서 G-CSF가 그 수용체에 결합한 후 이 경로를 활성화시킨다고 알려졌다[Tian et al. 1994]. 또한, G-CSF에 의한 JAK/STAT 경로의 활성화가 HL60 세포에서 STAT3에 의해 CCAAT/Enhancer binding protein (C/EBPa)을 핵 내로 가져와 MAD1 유전자의 프로모터에 결합하여 전사 효율(transcription efficiency)을 증가시킨다고 알려져 있다[Jiang et al. 2008].
이에, 본 발명자들은 기존의 형태보다 생물학적 활성이 높은 인간 과립구 콜로니 자극인자의 특정 부위에 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 당쇄화가 일어나도록 아미노산이 변형된 인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 변이체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극인자의 특정 부위에 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 당쇄화가 일어나도록 아미노산 변형된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 변이체를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은
G-CSFa 또는 G-CSFb의 하기 1) 내지 3)의 아미노산 잔기에서 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 N-glycosylation이 일어나도록 아미노산 변형된 인간 과립구 자극 인자의 변이체를 그 특징으로 한다;
1) T1-P10 (T1-P-L-Q-P-A-S-S-L-P10);
2) K40-Q70 (K40-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q70);
3) L124-S142 (L124-G-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142).
본 발명에 따른 G-CSFa 및 G-CSFb 변이체는 기존의 G-CSF와 비교하였을 때 보다 높은 생물학적 활성을 지니고 있어 이를 필요로 하는 환자에게 보다 적은 투여 횟수 또는 낮은 투여량으로 경제적 효과를 줄 수 있다
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 생리활성 단백질의 체내 혈액 중의 안정성 및 활성을 증가시키기 위해 인간 과립구 콜로니 자극인자의 특정 부위에 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 당쇄화가 일어나도록 아미노산이 변형된 인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 변이체 및 당쇄화된 인간 과립구 콜로니 자극 인자에 관한 것이다.
본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극 인자의 변이체가 기존의 형태보다 생물학적 활성이 높다는 것을 MTT 분석 및 G-CSF에 의해서 활성화 되는 MAD1 유전자의 RT-PCR 방법을 통해 확인하였다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극 인자의 변이체 및 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 핵산 및 이를 이용한 약제학적 조성물을 일컫는다.
본 발명에서의 변이체란 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 이 변이체는 야생형과 달리 부가적으로 당쇄화(glycosylation)될 수 있다.
상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이나, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열 상의 변이와 당쇄화에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질이다.
본 발명에서, 인간 과립구 콜로니 자극 인자의 변이체는 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다.
화학적으로 합성하여 제조하는 경우에는, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 이 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체가 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 회수하는 과정 으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학적 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
상기한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.
보다 바람직한 양태로서, 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 재조합 벡터에 삽입되어 발현된다.
본 발명에서 '벡터'란 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 말한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 조절될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 암호화 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도적 일 수 있다. 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택적 마커를 포함하고 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 삽입될 수 있다.
본 발명에서 사용된 벡터는 사이토메갈로 바이러스(CMV) 유래의 강력한 발현을 주는 프로모터를 지니고 있어 목적 단백질을 높은 수준으로 발현시키는 Stratagene 사의 pCMV-Taq4 벡터를 사용하였다. 이 벡터는 클로닝 부위의 C-말단에 flag 표지 유전자가 삽입되어 있어 G-CSF를 클로닝하여 발현시켰을 때, G-CSF의 C-말단에 flag이 융합되어 단백질이 발현되도록 디자인되어 있다.
본 발명에서 사용된 아미노산의 문자는 생화학 분야에서 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다
A: 알라닌 R: 아르기닌 N: 아스파라긴, D: 아스파르트산
C: 시스테인 E: 글루탐산 Q; 글루타민 G: 글라이신
H: 히스티딘 I: 이소루신 L: 류신 K: 라이신
M: 메티오닌 F: 페닐알라닌 P: 프로린 S: 세린
T: 쓰레오닌 W: 트립토판 Y: 티로신 V: 발린
본 발명에서 '아미노산 문자-아미노산 위치-아미노산 문자'로 표기된 것은 인간 과립구 콜로니 자극인자의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된 것을 의미한다.
본 명세서에서 '당쇄화'란 해당 단백질이 DNA에서 RNA로 전사된 뒤, 이 RNA가 다시 단백질이 되는데, 이 단백질이 세포 내 소기관인 골지체와 소포체를 거치면서 하나 이상의 올리고당이 첨가되는데 이러한 현상을 '당쇄화'라 일컫는다. 일반적으로 당쇄화가 일어난 당단백질은 해당 단백질의 활성을 조절한다고 알려져 있 다.
당쇄화는 해당 아미노산의 특정 위치에서 일어나는데, O-형과 N-형 두 가지가 있다. O-형은 당쇄화는 세린이나 트레오닌 잔기의 OH 기에 올리고당이 결합하는 것이고, N-형 당쇄화는 아스파라긴 잔기의 NH 기에 올리고당이 결합하는 형태이다. N-형 당쇄화는 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)와 같은 특정 아미노산 서열이 올 때 Asn 잔기에 당쇄화가 일어난다고 알려져 있다.
본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극 인자의 생체 내 안정성과 그의 생물학적 활성을 증대시키기 위해 해당 아미노산의 특정 부위에 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열을 생성시켜 이 부위에 N-형 당쇄화가 일어나도록 변이체를 개발한 것이다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 하기 아미노산 잔기 위치에서 N-형 당쇄화가 일어나도록 변형한 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 포함한다.
-G-CSFb의 경우
1) P5N (5번 프로린을 아스파라긴으로 치환)
2) L6N (6번 류신을 아스파라긴으로 치환)
3) G51N (51번 글라이신을 아스파라긴으로 치환)
4) P60N (60번 프로린을 아스파라긴으로 치환)
5) L61N (61번 류신을 아스파라긴으로 치환)
6) F140N (140번 페닐알라닌을 아스파라긴으로 치환)
-G-CSFa의 경우
1) P5N (5번 프로린을 아스파라긴으로 치환)
2) L6N (5번 프로린을 아스파라긴으로 치환)
3) G54N (54번 글라이신을 아스파라긴으로 치환)
4) P63N (63번 프로린을 아스파라긴으로 치환)
5) L64N (64번 류신을 아스파라긴으로 치환)
6) F143N (143번 페닐알라닌을 아스파라긴으로 치환)
더욱 바람직한 양태로서, G-CSFb의 140번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형시킨 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 포함한다.
본 발명은 첨가된 당쇄화 자리를 갖도록 인간 과립구 콜로니 자극 인자를 암호화하는 DNA 서열상에, N-형 당쇄화가 일어나도록 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변형시킨 후, 이를 당쇄화를 일으키는 진핵 세포에 도입하여 발현시킴으로써 부가적인 N-형 당쇄화가 일어나도록 하는 것이다. 따라서 본 발명에서 N-형 당쇄화가 일어난 인간 과립구 콜로니 자극 인자는 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 생기도록 DNA 서열을 변형시킴으로써 달성된다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 아미노산 잔기 위치에서 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열을 형성시켜 이 부위에서 N-형 당쇄화가 일어나도록 변형된 인간 과립구 콜로니 자극 인자를 암호화하는 유전자를 포함한다.
더욱 바람직한 양태로서, G-CSFb의 140번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형시킨 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체 유전자를 포함한다.
인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체 단백질의 발현 벡터 또는 발현 벡터로 형질 전환된 세포를 주입함으로써 형질전환 동물을 제작할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 이용한 형질전환 세포 또는 형질전환 동물을 포함한다.
이 형질전환 동물은 그 발현 벡터의 프로모터에 따라 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 생산하는 바이오리액터(bioreactor)로서 활용될 수 있다.
여기서 얻어진 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체를 대량 생산 및 정제하여 환자에 적용될 수 있으며, 또한 기존의 제품보다 활성이 높은 변이체의 개발로 환자에게 보다 경제적으로 적용될 수 있다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극 인자 변이체의 치료 목적으로 쓰이는 약제학적 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 과립구 콜로니 자극인자의 발현 벡터 제조
당원에서 보유하고 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자 cDNA (G-CSFa)를 다음의 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 이용하여 증폭하였다.
G-CSF F: 5'- ATTCGCCCTTGTGATATCATGGCTGGAC-3' (underlined EcoRV)
G-CSF R: 5'- TTTCCTCCTCGAGGGGCTGGGCAA-3' (underlined XhoI)
이 PCR 산물을 T-벡터인 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝한 후, 동물세포 발현 벡터인 pCMV-Taq4 벡터에 EcoRV와 XhoI 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 여기 에 동물세포에서의 발현율을 더 높이기 위해, 코작 서열(Kozak sequence)을 첨가하는 작업을 다음의 프라이머를 이용하여 PCR하여 증폭시켰다.
G-CSF F (Kozak): 5'- GGAATTCGCGATATCGCCACCATGGC-3' (underlined Kozak sequences)
G-CSF R: 5'- TTTCCTCCTCGAGGGGCTGGGCAA-3' (underlined XhoI)
이 PCR 산물 역시, EcoRV와 XhoI 제한효소를 이용하여 pCMV-Taq4 벡터에 클로닝하였다.
G-CSFa 뿐만 아니라, G-CSFb에 대한 클론도 얻기 위하여 pCMV-Taq4 벡터에 클로닝된 G-CSFa 플라스미드를 주형으로 하여 G-CSFa의 VSE 부위를 제거하는 PCR을 수행하였다. PCR은 다음의 프라이머를 이용하여 수행되었으며, Stratagene 회사의 QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit를 이용하여 제작되었다.
G-CSF F (removal VSE): 5'-cgctccaggagaagctgtgtgccacctacaagc-3'
G-CSF R (removal VSE): 5'-gcttgtaggtggcacacagcttctcct ggagcg-3'
실시예 2 : 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체의 선정
인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 선정을 위해 NetNGlyc 1.0 program을 활용하였다. N-당쇄화가 일어날 수 있는 위치는 Asn(N)-X-Ser/Thr(S/T) 이다. 따라서, Ser/Thr 이 있는 부위를 우선적으로 선별한 결과, 야생형 G-CSF의 경우 14개의 Ser(S)과 7개의 Thr(T)이 존재하였고, 이 중 Ser12, Ser76, Ser80, Ser155, Ser159, Ser164, Thr38, Thr102, Thr105, Thr115, 및 Thr 116은 네 개의 알파-헬릭 스 구조 상에 위치하였다. 알파-헬릭스 구조 상에서 당쇄화가 일어날 경우, G-CSF 본연의 구조에 영향을 미칠 수 있을 가능성을 배제하기 위해, 이들 후보들은 변이체 선정에서 제외되었다. 그 결과, 6개의 변이체가 선정되었다.
실시예 3 : 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체의 제작
N-당쇄화가 첨가된 변이체는 G-CSF 야생형을 주형으로 하여 당쇄화가 일어나도록 올리고데옥시뉴클레오타이드를 프라이머로 PCR을 수행하여 얻을 수 있었다. 이 PCR에 사용된 프라이머는 다음 표 1에 나타내었다.
부가적인 N-당쇄화가 일어나도록 한 부위는 도 1에 나타낸 바와 같이, P5번, A6번, G51번, P60번, L61번 및, F140번으로, 5번째 프로라인을 아스파라긴으로, 6번째 알라닌을 아스파라긴으로, 51번째 글라이신을 아스파라긴으로, 60번째 프로라인을 아스파라긴으로, 61번째 루신을 아스파라긴으로, 140번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형하였다. 이들 위치는 G-CSFb에 대한 아미노산 서열이다. G-CSFa에 대한 변이체 역시 제작되었는데, 그에 대한 아미노산 위치는 P5번, A6번, G54번, P63번, L64번 및 F143번이다.
[표 1]
Figure 112009081877622-PAT00001
변이체의 제작은 Stratagene 회사의 QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit를 이용하여 제작되었다.
상기 프라이머를 사용하여 G-CSFa 및 G-CSFb에 대한 변이체 6개가 각각 제작되었다. 따라서, 모두 12개의 변이체가 생성되었다.
상기 제작된 발현 벡터 중, G-CSFa에 대한 변이체는 각각 pG-CSFa-1, pG-CSFa-2, pG-CSFa-3, pG-CSFa-4 pG-CSFa-5, pG-CSFa-6으로 명명하고, G-CSFb에 대한 변이체는 G-CSFb-1, pG-CSFb-2, pG-CSFb-3, pG-CSFb-4 pG-CSFb-5, pG-CSFb-6으로 명명하였다[도 2, 3].
실시예 4 : CHO 세포에서 G- CSFa 와 G- CSFb 의 변이체의 발현
전날, 12-웰 플레이트에 CHO 세포를 well 당 2.5 × 105 세포를 배양하여 다음 날, 형질전환 하였다. 형질전환은 WelGENE 사의 WelFect를 이용하였다. 각각의 플라스미드(pG-CSFa와 G-CSFa 변이체인 pG-CSFa-1/a-2/a-3/a-4/a-5/a-6 및 pG-CSFb와 G-CSFb 변이체인 pG-CSFb-1/b-2/b-3/b-4/b-5/b-6) 5 ㎍ 과 Opti-MEM 배지 50 ㎕를 혼합하고, Enhancer-Q 시약 4 ㎕를 Opti-MEM 배지 50 ㎕를 혼합하고, WelFect 시약 7 ㎕를 Opti-MEM 배지 50 ㎕를 혼합한 후, 플라스미드(pG-CSFa와 G-CSFa 변이체인 pG-CSFa-1/a-2/a-3/a-4/a-5/a-6 및 pG-CSFb와 G-CSFb 변이체인 pG-CSFb-1/b-2/b-3/b-4/b-5/b-6)와 Enhancer-Q 혼합물을 섞은 후, 실온에서 10분간 반응시켰다. 이 후, 이 반응액과 WelFect 혼합물을 섞은 후, 역시 실온에서 10분간 반응시켰다. 이를 각각의 웰에 처리하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 4시간 배양 후, 300 ㎕ Opti-MEM 배지로 교환한 후, 다시 37℃ 5% CO2 배양기에서 42시간 배양하였다. 이 배양액을 모은 후, Bradford 방법으로 단백질 정량한 후, G-CSFa의 경우 10 ㎍, G-CSFb의 경우 0.1 ㎍을 각각 ELISA 실험에 사용하였다. ELISA는 IBL사의 human G-CSF assay kit를 사용하였다.
그 결과, 도 4와 도 8에서 보는 바와 같이, 야생형의 경우, G-CSFa가 전체 단백질 10 ㎍ 당 G-CSF가 약 1.1 ng 발현되었고, G-CSFb에서는 약 80 ng 발현되었다. 이로써, G-CSFb가 CHO 세포에서 훨씬 많은 발현율을 보이고 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 5와 도 9에서 웨스턴 블랏 실험에서도 G-CSFb가 G-CSFa 보다 더 발현이 잘 됨을 알 수 있다. 그 실험과정은 전날, 100 ㎜ 페트리 디쉬에 3.0 × 106 세포를 배양한 후, 다음 날 20 ㎍의 플라스미드(pG-CSFa와 G-CSFa 변이체인 pG-CSFa-1/a-2/a-3/a-4/a-5/a-6 및 pG-CSFb와 G-CSFb 변이체인 pG-CSFb-1/b-2/b-3/b- 4/b-5/b-6)를 트랜스펙션시켜 4시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션 과정은 위의 WelFect를 이용한 방법과 동일이다. 배양 후, 혈철 유리 배지인 Opti-MEM 배지 4 ㎖로 교환한 후, 37℃ 5% CO2 배양기에서 42시간 배양하였다. 이를 각각의 플라스미드(pG-CSFa와 G-CSFa 변이체인 pG-CSFa-1/a-2/a-3/a-4/a-5/a-6 및 pG-CSFb와 G-CSFb 변이체인 pG-CSFb-1/b-2/b-3/b-4/b-5/b-6) 마다 8개의 페트리 디쉬를 사용하였으며, 8개의 디쉬로부터 배지를 모은 후, Millipore 사의 centri-prep(Amicon Ultra, Ultracel 3k)을 이용하여 배지를 1 ㎖까지 농축시켰다. G-CSFa의 경우, G-CSF가 클로닝된 pCMV-Taq4 벡터의 C-말단의 표지 서열(sequence tag)인 flag을 이용하여 면역 침전(immunoprecipitation, IP)하였다. IP를 한 시료를 SDS-PAGE 및 p23 항체(SantaCruz)를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과, G-CSFa 변이체 3번 4번 및 6번에서 N-당쇄화가 됐다고 생각되는 upper band가 관찰되었다. G-CSFb의 경우는, IP를 하지 않고 centri-prep으로 농축된 시료만으로 웨스턴 블랏하여 그 결과를 확인할 수 있었다(도 9). 도 9의 B 그림은 A에 대한 밴드 강도를 농도계(densitometer)를 이용하여 표로 나타낸 것이다.
실시예 5 : G- CSFa 와 G- CSFb 변이체의 N- 당쇄화 확인
상기 실시예 4의 웨스턴 블랏 실험 결과에 나와 있는 upper band가 N-당쇄화된 G-CSF가 맞는지 확인하기 위하여 N-글리코시다제를 처리하였다. 6 ㎎의 G-CSFa 및 G-CSFb 변이체 3번, 4번, 6번 단백질을10 unit N-글리코시다제(Roche)와 20 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. G-CSFa 및 G-CSFb 야생형은 10 unit sialydase(Roche)와 1시간 동안 배양한 후, 30 mU의 O-글리코시다제를 첨가하여 20시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 그 결과, 도 6과 도 10에 나타낸 것처럼, 변이체 3번, 4번, 6번의 upper band가 야생형의 경우와 같은 크기로 밴드가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이로서, 변이체 3번, 4번, 6번이 N-당쇄화가 일어났음을 알 수 있었다.
실시예 6 : G- CSFa 와 G- CSFb 변이체의 세포 생존능 확인
G-CSF 변이체의 세포 생존능(cell viability)은 MTT assay를 통해 이루어졌다. 도 7, 도 11, 도 12 및 도 13에서 보는 바와 같이 G-CSFa 및 G-CSFb의CHO 세포에서의 crude extract로부터 ELISA를 통해 G-CSF 양을 정량한 후, 500 pg과 1000 pg을 G-CSF 의존 세포주인 AML193과, G-CSF 민감 세포주(susceptible cell line)인 HL60와 U937 세포에 처리하였다. AML193 세포의 경우, 전날 96-웰 플레이트에 웰당 4.0 × 103 세포를 배양하여 G-CSF crude extract를 처리한 후, 4일 동안 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. HL60와 U937 세포의 경우, 전날 96-웰 플레이트에 웰당 2.0 ×103 세포를 배양하여 G-CSF crude extract를 처리한 후, 2일 동안 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이 배양 플레이트의 각각의 well에 10 ㎕의 MTT-라벨링 시약을 처리하여, 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 100 ㎕의 가용화(solubilization) 시약을 처리하여 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 16시간 동안 배양하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Reference filter로는 655 nm를 사용하였으며, 이들에 대한 흡광도의 차이를 계산한 다음, 이를 다시 Mock, 즉, empty vector를 처리한 구에 대한 비율로 나누어 도 7, 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다.
실시예 7 : G- CSFb 변이체에 의한 MAD1 유전자의 전사효율 확인
HL60 세포를 6-웰에 웰당 5.0 × 105 세포를 배양한 후, 여기에 G-CSFb 변이체 6번의 조 추출액(crude extract)을 10 ng/㎖ 비율로 0, 0.5, 1, 및 2시간 별로 처리하여 각각의 처리 군의 세포로부터 RNA를 Qiagen사의 RNeasy Mini Kit를 이용하여 얻었다. 각각의 RNA 1 ㎍을 RT(reverse transcriptase)-PCR의 주형으로 사용되었으며, cDNA 합성은 Roche사의 First strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV)를 이용하여 수행되었다. 합성된 cDNA를 다음의 프라이머를 이용하여 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR)이 수행되었다. 실시간 RT-PCR은 Roche 사의 LightCycler FastStart DNA Master SYBR greenⅠkit를 이용하였다.
Mad1-f: 5'-GAGAAGCTGGGCATTGAGAG-3'
Mad1-r: 5'-ACGTCGATTTCTTCCCTGTC-3'
Mad1 유전자 전사효율에 대한 내부 대조구(internal control)로서 b-Gus (Glucuronidase)가 사용되었다. 그 프라이머는 아래와 같다.
Gus-f: 5'-CTCATTTGGAATTTTGCCGATT-3'
Gus-r: 5'-CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA-3'
실험 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 1시간 경과한 시료에서 G-CSFb 변이체 6번이 야생형보다 Mad1 발현이 더 높게 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
도 1은 인간 과립구 형성인자의 단백질 서열을 나타낸 것이다. 174개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 인간 과립구 콜로니 자극인자 a의 경우에는 붉은색 글씨로 표시한 VSE(valine, serine, glutamic acid) 3개의 아미노산을 더 함유하고 있다. 분홍색으로 나타낸 것이 알파-헬릭스 구조를 나타내며, 초록색으로 나타낸 부분은 당쇄화가 일어난 부분을 말한다. 인간 과립구 콜로니 자극인자의 야생형은 133번째 트레오닌에 O-당쇄화가 되어 있으며, 변이체들은 N-당쇄화가 되도록 총 6개를 제작하였으며, 빨간색 원형으로 나타내었다
도 2는 본 발명에 따른 G-CSFa 및 G-CSFb에 대한 야생형의 발현벡터 pG-CSFa 및 pG-CSFb의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 G-CSFa 및 G-CSFb 야생형 발현벡터로부터 변이체의 발현벡터 pG-CSFa-1/a-2/a-3/a-4/a-5/a-6 및 pG-CSFb-1/b-2/b-3/b-4/b-5/b-6를 제작하는 과정과 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 G-CSFa 6개 변이체의 CHO cell에서의 발현을 ELISA 방법으로 나타낸 것이다
도 5는 G-CSFa 6개 변이체의 CHO 세포에서의 발현을 면역침전 (Immunoprecipitation) 웨스턴 블랏 방법으로 나타낸 것이다. 화살표로 나타낸 밴드가 N-당쇄화된 밴드를 나타낸다.
도 6은 G-CSFa 변이체 3번, 4번, 6번의 upper band(*)가 N-당쇄화가 된 것을 확인하기 위해 N-당쇄화를 처리하여 upper band가 down(^) 되는 것을 확인한 실험 이다.
도 7은 G-CSFa 변이체의 세포 생존능(cell viability)을 G-CSF dependent cell line인 AML193 세포에서 확인한 실험이다. G-CSFa의 야생형 및 변이체의 CHO 세포에서 발현시킨 조 추출액(crude extract)을 500 pg(white bar)과 1000 pg(black bar)을 처리하였다.
도 8은 G-CSFb 변이체의 CHO 세포에서의 발현을 ELISA로 나타낸 것이다
도 9는 G-CSFb 변이체의 CHO 세포에서의 발현을 웨스턴 블랏으로 나타낸 것이다(A). (B)는 웨스턴 블랏 밴드를 dot quantitation 방법을 통해 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 G-CSFb 변이체의 N-글리코시다제 처리를 통해 N-당쇄화를 확인한 실험이다.
도 11은 G-CSFb 변이체의 세포 생존능(cell viability)을 G-CSF dependent cell line인 AML193 세포에서 확인한 실험이다.
도 12는 G-CSFb 변이체의 세포 생존능(cell viability)을 HL60 세포에서 확인한 실험이다.
도 13은 G-CSFb 변이체의 세포 생존능(cell viability)을 U937 세포에서 확인한 실험이다.
도 14는 G-CSFb 변이체에 의한 HL60 세포에서 MAD1 유전자의 발현율을 나타낸 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Mutant C-CSF production with increased biological activity <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF F <400> 1 attcgccctt gtgatatcat ggctggac 28 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF R <400> 2 tttcctcctc gaggggctgg gcaa 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF F (Kozak) <400> 3 ggaattcgcg atatcgccac catggc 26 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF F (removal VSE) <400> 4 cgctccagga gaagctgtgt gccacctaca agc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF R (removal VSE) <400> 5 gcttgtaggt ggcacacagc ttctcctgga gcg 33 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 1 F <400> 6 aagccacccc cctgggcaat gccagctccc t 31 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 1 R <400> 7 agggagctgg cattgcccag gggggtggct t 31 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 2 F <400> 8 acccccctgg gccctaatag ctccctgccc caga 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 2 R <400> 9 tctggggcag ggagctatta gggcccaggg gggt 34 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 3 F <400> 10 gagctggtgc tgctcaatca ctctctgggc atc 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 3 R <400> 11 gatgcccaga gagtgattga gcagcaccag ctc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 4 F <400> 12 gcatcccctg ggctaatctg agcagctgcc cca 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 4 R <400> 13 tggggcagct gctcagatta gcccagggga tgc 33 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 5 F <400> 14 atcccctggg ctcccaatag cagctgcccc a 31 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 5 R <400> 15 tgggcagctg ctattgggag cccaggggat 30 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 6 F <400> 16 ggtgccatgc cggccaatgc ctctgctttc ca 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF mutant 6 R <400> 17 tggaaagcag aggcattggc cggcatggca cc 32 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mad1-f <400> 18 gagaagctgg gcattgagag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mad1-r <400> 19 acgtcgattt cttccctgtc 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gus-f <400> 20 ctcatttgga attttgccga tt 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gus-r <400> 21 ccgagtgaag atcccctttt ta 22

Claims (9)

  1. G-CSFa 또는 G-CSFb의 하기 1) 내지 3)의 아미노산 잔기에서 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 N-glycosylation이 일어나도록 아미노산 변형된 것을 특징으로 하는 인간 과립구 자극 인자의 변이체;
    1) T1-P10 (T1-P-L-Q-P-A-S-S-L-P10);
    2) K40-Q70 (K40-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q70);
    3) L124-S142 (L124-G-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142).
  2. 제 1 항에 있어서, G-CSFb의 경우, 5번째 프로라인을 아스파라긴으로, 6번째 알라닌을 아스파라긴으로, 60번째 프로라인을 아스파라긴으로, 61번째 루신을 아스파라긴으로, 140번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형된 것을 특징으로 하는 인간 과립구 자극 인자의 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, G-CSFa의 경우, 5번째 프로라인을 아스파라긴으로, 6번째 알라닌을 아스파라긴으로, 63번째 프로라인을 아스파라긴으로, 64번째 루신을 아스파라긴으로, 143번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형된 것을 특징으로 하는 인 간 과립구 자극 인자의 변이체.
  4. 청구항 1의 아미노산 잔기 위치에서 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 서열이 하나 이상 형성되어 이 부위에서 N-당쇄화가 일어나도록 아미노산 변형된 것을 특징으로 하는 인간 과립구 자극 인자의 변이체를 암호화하는 유전자.
  5. 제 4 항에 있어서, G-CSFb의 경우, 5번째 프로라인을 아스파라긴으로, 6번째 알라닌을 아스파라긴으로, 60번째 프로라인을 아스파라긴으로, 61번째 루신을 아스파라긴으로, 140번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형된 것을 특징으로 하는 인간 과립구 자극 인자의 변이체를 암호화하는 유전자.
  6. 제 4 항에 있어서, G-CSFa의 경우, 5번째 프로라인을 아스파라긴으로, 6번째 알라닌을 아스파라긴으로, 63번째 프로라인을 아스파라긴으로, 64번째 루신을 아스파라긴으로, 143번째 페닐알라닌을 아스파라긴으로 변형된 것을 특징으로 하는 인간 과립구 자극 인자의 변이체를 암호화하는 유전자.
  7. 청구항 4 내지 6 중에서 선택된 어느 한 항의 G-CSF 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  8. 청구항 7의 발현벡터로 형질 전환 또는 형질 감염된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  9. 청구항 1 내지 3 중에서 선택된 어느 한 항의 인간 과립구 자극 인자 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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