KR20110026054A

KR20110026054A - 약배양과 여교잡 기술을 이용한 우량 벼 형질전환체의 단기생산법

Info

Publication number: KR20110026054A
Application number: KR1020090083779A
Authority: KR
Inventors: 정지웅; 강경호; 전용희; 신영섭; 최인배
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2009-09-07
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2011-03-15
Anticipated expiration: 2029-09-07
Also published as: KR101212058B1

Abstract

본 발명은 약배양과 여교잡 기술을 이용한 형질전환 벼를 단기간에 생산방법 에 관한 것으로서 더욱 상세하게는, 벼의 약으로부터 유도된 반수체 캘러스를 형질전환하여 재분화하고 원품종과의 여교잡을 통하여 채세포변이인자를 제거하여 단기간에 안정된 형질전환 벼를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 약으로부터 유도된 반수체 캘러스를 형질전환하여 재분화하는 형질전환 벼 제조방법은 형질전환 당대에서 유전적으로 고정된 개체를 확보하며 여교잡을 통하여 불량체세포변이인자를 제거하여 안정된 형질전환 벼 확립에 소요되는 시간과 경비를 획기적으로 절감할 수 있어 벼의 새로움 품종 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

약배양, 형질전환, 벼, 여교잡, 품종개량

Description

약배양과 여교잡 기술을 이용한 우량 벼 형질전환체의 단기생산법{Method for short term production of elite transgenic rice lines by using anther culture and backcross}

본 발명은 약배양과 여교잡 기술을 이용한 형질전환 벼 생산방법에 관한 것으로서 더욱 상세하게는, 벼의 약으로부터 유도된 반수체 캘러스를 형질전환하여 재분화하고 원품종과의 여교잡을 통하여 채세포변이인자를 제거하여 단기간에 안정된 형질전환 벼를 생산하는 방법에 관한 것이다.

식물에 외래유전자를 도입하여 새로운 유전현상을 유발하는 형질전환기술은 특정유전자의 기능규명을 위한 연구기법의 하나이나, 최근에는 신기능 품종을 창출하여 경제적 이익을 극대화 할 수 있는 핵심연구수단으로 인식되고 있다. 종, 속간 교잡장벽 극복 및 도입대상 유전자위에 연관되어 있는 열악형질 제거에 많은 시간과 노력이 필요한 전통교잡육종법에 비해, 형질전환기술은 하나의 유전자에만 연구를 집중할 수 있다. 또한 육성된 신기능품종에 대한 지적소유권침해 대응이 상대적으로 용이하다. 이러한 이유로 그동안 다양한 작물에 대해 형질전환기술이 확립되 어 왔으며, 이미 실용화된 형질전환작물의 경제적 파급효과는 매년 가파르게 상승하고 있다. 벼에 있어서도 형질전환기술을 활용한 증산 및 불량환경에 대한 적응성 향상과 신기능성 물질을 생산하는 새로운 품종을 확립하고자 하는 경쟁이 치열한 추세이다.

생육기간이 짧고 기내에서 생활상을 유지할 수 있는 애기장대에 비하여 벼는 생육기간이 상대적으로 길며, 시장성이 최우선시 되는 ‘작물’이기 때문에 기내실험만으로 형질전환계통의 우수성을 부각시키기에는 많은 무리가 따른다. 또한 이배체인 종실캘러스로의 형질전환 당대에는 (T0) 도입유전자들이 헤테로 상태이므로 자기수정에 의해 작성된 T1개체들에 대한 별도의 검정을 통해서만 호모 상태의 형질전환체들이 확보될 수 있다.

식물계에서는 염색체의 특정부위에 도입유전자를 정확히 이입하는 기술과(gene targeting), retro-element의 활성화(예: Tos-17)등 조직배양과정에서 야기될 수 있는 체세포변이(somaclonal variation)를 억제할 수 있는 기술 등은 아직 확립되지 않았다. 그러므로 유전적으로 고정된 형질전환체들의 표현형발현은 도입된 외래유전자의 수(copy number), 염색체상의 위치(positional effect), 그리고 조직배양과정에서 무작위로 유발된 체세포변이 등에 의해서 크게 달라질 수 있다. 이러한 문제점들로 인하여 원품종의 작물학적 상품성을 온전히 견지하며, 도입된 유전자가 목표형질을 안정적으로 발현하는 벼 형질전환계통을 확보하기 위해서는 방대한 규모의 형질전환체 육성과 검정을 다년간에 걸쳐서 수행해야 한다.

벼 형질전환체를 이용하여 신품종을 창출하려는 노력은 오래전부터 꾸준히 시도되어 왔다. 그러나 기내에서 많은 개체를 전개하는 것이 현실적으로 어렵고, 상대적으로 긴 생육기간으로 인하여 유전적으로 고정된 형질전환체를 확보하는데 오랜 시일이 소요되는 문제점이 있다. 더 나아가 외래유전자가 건실히 발현되어도 출수기, 수량성 등의 작물학적 특성은 독립계통(event) 별로 상이하게 관찰되는 경우가 많다. 이입된 외래유전자의 위치효과를 고려해 볼 수 있으나, 조직배양과정 중 야기된 체세포변이에 의한 표현형이상(abnormal phenotype)의 가능성도 배재 할 수 없다. 그러므로 벼 형질전환체 육성의 효율은 1) 유전적으로 고정된 계통확보에 소요되는 시간과 2) 조직배양 중 야기되는 체세포변이의 억제 혹은 제거유무에 크게 지배된다. 형질전환당대에서 유전적으로 고정될 수 있으며, 체세포변이를 적절한 수단으로 제거할 수 있다면 벼 형질전환체육성에 소요되는 시간과 경비를 획기적으로 절감할 수 있고, 경제성이 겸비된 우량 신기능성 품종을 창출 할 수 있다.

본 발명자들은 형질전환 벼 제조에 있어 유전적인 고정을 조기에 이루어 벼 품종개발에 걸리는 시간을 단축할 방법과 조직배양에서 나타나는 체세포변이의 제거방법에 관하여 연구하던 중 벼의 약에서 유래된 캘러스를 형질전환하여 이를 벼로 재분화하는 경우 유전적인 고정이 조기에 이루어지는 것과 이때 발생하는 채세포변이를 여교잡 기술을 이용하여 제거하는 방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 (a) 캘러스 유도 배지에서 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 유도된 반수체 캘러스에 목적유전자를 형질전환 하는 단계 및 (c) 재분화 배지에서 상기 형질전환된 캘러스로부터 형질전환 벼를 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 벼의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 캘러스 유도 배지에서 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 유도된 반수체 캘러스에 목적유전자를 형질전환 하는 단계 및 (c) 재분화 배지에서 상기 형질전환된 캘러스로부터 형질전환 벼를 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 벼의 제조방 법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 캘러스 유도 배지에서 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 유도된 반수체 캘러스에 목적유전자를 형질전환 하는 단계 및 (c) 재분화 배지에서 상기 형질전환된 캘러스로부터 형질전환 벼를 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 벼의 제조방법을 제공한다.

(a) 단계에서는 캘러스 유도 배지에서 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도한다. 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 식물조직 또는 세포덩어리를 말한다. 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도하는 과정은 벼의 이삭에서 약을 분리하여 캘러스 유도 배지에 치상하여 배양하는 방법으로 이루어진다. 약을 분리할 벼의 이삭은 바람직하게는 엽이간장이 4 내지 8cm 범위의 개체일 수 있다.

벼 이삭으로부터 약을 분리하기 전 채취된 벼 이삭에 대해 암조건하에서 저온처리를 실시 할 수 있다. 본 발명의 암조건하에서의 저온처리는 당업계에 알려진 벼 약배양 조건에 따라 완전 밀봉된 벼 이삭에 대해 암조건에서 4도 내지 20도의 온도범위 내에서 4일에서 20일 간 실시할 수 있다. 바람직하게는 완전 밀봉된 벼 이삭에 대해 암조건에서 8도 내지 16도 온도범위 내에서 4일에서 12일간 저온처리 를 실시할 수 있으며 더욱 바람직하게는 완전 밀봉된 벼 이삭에 대해 12도 암조건에서 8일간 처리할 수 있다.

약을 치상 한 후 배양하는 과정은 당업계에 알려진 벼 캘러스 유도 조건에 따라 배양 할 수 있으며 바람직하게는 25℃ 내지 27℃의 항온실에서 하루 16시간씩 2,500Lux 조명을 제공하는 조건일 수 있다.

본 발명의 캘러스유도는 당업계에 알려진 캘러스유도 방법으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 캘러스유도배지는 당업계에 알려진 캘러스 유도배지 조성에 따라 조성될 수 있으며 배지구성성분으로 배지구성 성분으로 0.1g/L 내지 5g/L 농도의 Yeast extract, 0.1mg/L 내지 5mg/L 농도의 1-나프탈렌아세트산 (1-Naphtaleneacetic acid; NAA), 0.05mg/L 내지 0.5mg/L 농도의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid; 2,4-D), 1g/L 내지 50g/L 농도의 아가 및 7g/L 내지 300g/L 농도의 수크로스를 포함한다. 본 발명의 캘러스유도 배지는 바람직하게는 0.5g/L 내지 2g/L 농도의 Yeast extract, 0.3mg/L 내지 3mg/L 농도의 1-나프탈렌아세트산 (1-Naphtaleneacetic acid; NAA), 0.05mg/L 내지 0.3mg/L 농도의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid; 2,4-D), 5g/L 내지 20g/L 농도의 아가 및 20g/L 내지 150g/L 농도의 수크로스를 포함한 N6 배지(Chu et al., (1975) Sci. Sin. vol.18, pp.659-668)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1g/L 농도의 Yeast extract, 1mg/L 농도의 NAA, 0.2mg/L 농도의 2,4-D, 10g/L 농도의 아가 및 70g/L 농도의 수크로스를 포함한 N6 배지일 수 있다.

(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 유도된 반수체 캘러스에 목적유전자를 형질전환한다.

형질전환은 약치상 후 15일 내지 60일 사이에, 바람직하게는 약치상 후 20일 내지 40일 사이에, 가장 바람직하게는 약치상 후 20일 내지 25일 사이에 직경이 1mm 내지 2mm인 부정배 캘러스를 대상으로 이루어질 수 있다.

조직배양기간이 상기 기간보다 짧은 경우 형질전환용 캘러스를 충분히 확보할 수 없으며, 조직배양기간이 상기 기간보다 길어지는 경우 반수체에서 이배체로 자연배가되는 개체의 빈도와 체세포 변이의 빈도가 함께 높아진다.

형질전환 방법은 당업계에 알려진 식물체의 형질전환 방법으로 실시할 수 있으며, 예를 들면, 이에 한정되지는 아니하나 아그로박테리움을 이용한 방법(Ti plasmid), 바이오리스틱스(Biolistics; Particle bombardment), 미세주입법(microinjection), 거대주입법(macroinjection), 리포좀을 이용한 방법, 전기충격법(electroporation) 및 폴리에틸렌글리콜을 이용한 방법일 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움에 목적유전자를 포함하는 발현벡터를 도입한 후 캘러스와 함께 공동배양(co-culture)하는 아그로박테리움을 이용한 방법 일 수 있다.

상기 발현벡터를 도입하는 아그로박테리움은 재조합 유전자를 포함하는 형질전환 벡터를 식물세포로 도입시키기 위한 매개체로, 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404(Hoekema, A. et al., 1983, Nature, 303, 179-181)를 사용하는 것이 바람직하다.

목적유전자란 본 발명의 방법에 의하여 만들어질 형질전환 벼에서 안정적으 로 발현되기를 희망하는 유전자로 식물체에서 발현가능한 유전자는 어떠한 것이나 가능하다.

형질전환 후 형질전환체를 판별은 당업계에 알려진 통상의 형질전환체 선별 방법에 의할 수 있으며 바람직하게는 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(bar)를 벡터에 포함시킨 후 형질전환체 배양시 배양액에 포스피노트리신을 첨가하는 방법일 수 있다.

(c) 단계에서는 재분화 배지에서 상기 형질전환된 캘러스로부터 형질전환 벼를 재분화한다.

본 발명의 재분화는 당업계에 알려진 캘러스 재분화 방법으로 이루어질 수 있다. 재분화 배지는 당업계에 알려진 재분화 배지조성에 따라 제조될 수 있으며 배지구성성분으로 0.1mg/L 내지 5mg/L 농도의 NAA, 0.4mg/L 내지 20mg/L 농도의 2,4-D, 10mg/L 내지 100mg/L 농도의 아데닌 설페이트, 1mg/L 내지 10mg/L 농도의 키네틴, 2g/L 내지 40g/L 농도의 아가 및 3g/L 내지 300g/L 농도의 수크로스를 포함한다. 본 발명의 재분화 배지는 바람직하게는 0.5mg/L 내지 3mg/L 농도의 NAA, 1mg/L 내지 10mg/L 농도의 2,4-D, 20mg/L 내지 80mg/L 농도의 아데닌 설페이트, 2mg/L 내지 8mg/L 농도의 키네틴, 6g/L 내지 30g/L 농도의 아가 및 10g/L 내지 100g/L 농도의 수크로스를 포함하는 MS 배지일 수 있으며 더욱 바람직하게는 1mg/L 농도의 NAA, 4mg/L 농도의 2,4-D, 40mg/L 농도의 아데닌 설페이트, 4mg/L 농도의 키네틴, 12g/L 농도의 아가 및 30g/L 농도의 수크로스를 포함한 MS 배지일 수 있다. 형질전환이 된 캘러스만을 재분화하기 위하여 상기 (b) 단계에서와 같이 형질전환이 된 식물을 선택적으로 발육시키게 하는 물질을 배지성분으로 추가할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의하여 형질전환 벼를 제조하는 경우 형질전환 개시 후 30개월 이내에 유전적으로 고정된 형질전환 벼를 안정적으로 확보할 수 있다. 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도하여 목적 유전자로 형질전환 한 후 이를 재분화하여 형질전환 벼를 확보하는 기술은 본 발명에서 처음 제공되는 것이다.

한편 본 발명의 형질전환 벼의 제조방법은 재분화된 형질전환 벼에서 호모 이배체 벼를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 호모 이배체 벼란 목적유전자가 상동염색체쌍에 모두 삽입되어 있는 벼를 말하는 것으로 반수체 상태의 캘러스에 목적유전자가 형질전환 된 후 조직배양 중 자연배가 되어 이배체로 전환된 벼를 지칭한다. 이배체 벼를 선별하는 방법은 당업계에 알려진 방법에 의하여 염색체의 수를 확인하거나 토양에 이식된 개체들의 외관특성에 의거하여 선별할 수 있다. 외관특성에 의하는 경우 반수체의 벼에 비하여 이배체 벼는 개체의 크기가 매우 크며 특히 출수 후 이삭과 낱알의 크기에 의해 확연히 구분된다(도 5 참조). 상기 선별된 배수체 벼 중에서 호모 이배체를 선별은 상기 선별된 배수체 벼의 낱알을 수확하고 재배하여 모든 후대개체들의 DNA에 목적유전자가 들어있는지 여부를 판단하는 방법으로 이루어진다. 목적유전자 존재를 검정하는 방법은 당업계에 알려진 유 전자 검출방법에 의하여 가능하며 바람직하게는 목적유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 PCR 방법에 의할 수 있다.

또한 본 발명의 형질전환 벼의 제조방법은 형질전환 벼 제조과정에서 나타나는 체세포변이인자를 제거하기 위하여 상기 선별된 호모 이배체 형질전환 벼를 원품종의 벼와 여교잡을 하여 체세포변이인자를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

형질전환 식물체 제조과정에서 나타나는 표현형적 왜곡현상은 1) 외래유전자와 원품종의 유전자들간의 상호작용, 2) 염색체 내로의 외래유전자 삽입이 특정 ORF 영역내로 일어난 ‘gene-knockout’또는 3) 조직배양 과정에서 유발된 체세포변이가 주된 원인으로 알려져 있다.

본 발명의 발명자들은 이 중 조직배양 과정에서 유발된 체세포변이는 대부분의 경우 열성유전인자이므로 여교잡 방법에 의하여 원품종의 표현형으로 회복될 것이나 형질전환체 생산에 사용되는 벡터의 프로모터들은 상시 발현되는 것들(universal promotor)로 여교잡에 의하여서도 그 발현이 제한되지 않는다는 점에 착안하여 여교잡에 의한 체세포변이인자를 제거하는 단계가 추가된 형질전환 벼 제조방법을 발명하였다. 본 발명의 벼의 약에서 유도된 반수체캘러스에 대해 현질전환을 실시한 후 자연배가되어 유전적으로 고정된 이배체 형질전환 벼를 원품종의 벼와 여교잡을 하여 체세포변이인자를 제거하는 단계를 포함하는 형질전환 벼 제조 방법은 본 발명에 의하여 처음으로 공개된 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 벼는 안정적으로 목적 유전자를 발현하여 목적하는 효과를 낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 출수 전 엽이간장이 4 내지 8cm의 화성벼 이삭을 취하여 밀봉상태로 12도 암조건에서 8일간 저온처리를 실시하여 살균한 후 약(anther)을 분리하여 CM6배지(N6 기본배지, 1g/L yeast extract, 1mg/L NAA, 0.2mg/L 2,4-D, 10g/L 아가, 70g/L 수크로스, pH 5.8)에 치상하여 25℃ 내지 27℃의 항온실에서 하루 16시간씩 2,500Lux 조명 하에서 배양하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 곰팡이병 저항성기작에 관여한다고 보고된 야생벼 O.minuta의 유전자를 유비퀴틴 프로모터와, PinII 터미네이터, 35S 프로모터, 및 포스피노트리신(phosphinothricin; PPT, 상표명: 바스타)에 저항성을 발현하는 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(bar)를 지니고 있는 식물 형질전환용 바이너리 벡터인 pMJU에 클로닝하여 아그로박테리움 LBA4404에 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움 LBA4404를 약치상 후 20~25일 이내에 유기된 캘러스들 중 직경이 1~2mm 정도의 부정배 캘러스(embryogenic callus)와 공동배양 하는 방법으로 캘러스를 형질전환한 후 포스피노트리신이 첨가된 선별배지에서 형질전환이 된 캘러스를 선별하고 6mg/L의 PPT가 첨가된 재분화 배지 RM3-2(MS 기본배지, 1mg/L NAA, 4mg/L 2,4-D, 40mg/L 아데닌 설페이트, 4mg/L 키네틴, 12g/L 아가, 30g/L 수 크로스, pH 5.8)에서 배양하였다. 그 결과 PPT가 첨가된 배지에서 살아남은 57개의 형질전환 벼 분화체를 획득하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 재분화 된 형질전환 벼를 근군발달 및 경화처리 후 토양에 이식하여 육모하였다. 성장한 벼를 외관특성에 의거하여 이배체만을 선별한 후 수확된 개체를 1수-1열법에 의거하여 논에 이앙하여 재배하고 최고분얼기에 무작위로 8개체씩을 선정하여 DNA를 추출하여 PCR을 통하여 호모 이배체 형질전환 벼를 선별하였다. 그 결과 17개 계통의 이배체를 획득하였으며 이중 9개 계통이 외래유전자가 반수체 상태에서 삽입된 후 자연배가가 일어난 호모 이배체 형질전환 벼임을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 선별된 호모 이배체 형질전환 벼 중 외관특성이 원품종과 상이한 형질전환 벼(키가 작음, 높은 불임)를 대상으로 원품종(wild type)과 여교잡을 하였다. 그 결과 체세포변이에 의해 표현형 왜곡현상이 나타난 키가 작은 계통의 벼는 여교잡에 의하여 키가 원품종과 동일하게 정상으로 돌아오는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 육성 과정을 통하여 형질전환을 시작하여 우량 형질전환체를 확립하기까지 36개월이 걸리는 것을 확인하였다. 이는 4~6년 이상 소요되는 기존의 형질전환 벼 제조과정을 획기적으로 단축시킨 것임을 알 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 일반적인 벼 육종과 관련된 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 다음 문헌에 기재되어 있다(최해춘 「벼육종 길잡이」(2006) 농촌진흥청; 박순직 등 「재배식물육종학」 (2002) 한국방송통신대학교 출판부).

따라서, 본 발명은 약으로부터 유도된 반수체 캘러스를 형질전환하여 재분화하는 형질전환 벼 제조방법을 제공한다. 본 발명의 약으로부터 유도된 반수체 캘러스에 외래유전자를 형질전환하고 재분화하는 형질전환 벼 제조방법은 형질전환 당대에서 유전적으로 고정된 개체를 확보하며 여교잡을 통하여 불량체세포변이인자를 제거하여 안정된 형질전환 벼 확립에 소요되는 시간과 경비를 획기적으로 절감할 수 있어 벼의 새로움 품종 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

벼 형질전환에 사용될 벡터 및 검정용 프라이머 제작

곰팡이병 저항성기작에 관여한다고 보고된 야생벼 O.minuta의 유전자 ‘omfi-147’의 ORF(open reading frame)를 (GenBank accession number: CD347676; Shim et al. Plant Cell Rep 2004. 22:599-607) 유비퀴틴 프로모터와, PinII 터미네이터, 35S 프로모터, 그리고 포스피노트리신(phosphinothricin; PPT, 상표명: 바스타)에 저항성을 발현하는 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene; bar)를 지니고 있는 식물 형질전환용 바이너리 벡터인 pMJU에 클로닝하였다(도 1 참조). 제초제 PPT를 이용하는 형질전환 개체선발과는 별도로 genomic DNA 검정과 RT-PCR 수행을 위한 두개의 PCR 프라이머 조합을 제작하였다.

형질전환 검정용 프라이머쌍

서열번호	이름	염기서열	비고
1	Bar_S	GTCTGCACCATCGTCAACC	genomic DNA 검정을 위한 PCR 프라이머 조합
2	Bar_AS	GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC	genomic DNA 검정을 위한 PCR 프라이머 조합
3	Om147_ORF_S	TCGATGAGGGCTCAACTACCAACG	RT-PCR 수행을 위한 PCR 프라이머 조합
4	PIN II_AS	GTGATTAGCATGTCACTATGTGTGCATCC	RT-PCR 수행을 위한 PCR 프라이머 조합

<실시예 2>

벼 형질전환 효율향상을 위한 저온처리, 배지조성개선 및 캘러스선발

약배양 재료로는 화성벼를 이용하였다. 출수 전 엽이간장이 4~8cm 범위의 개체로부터 이삭을 취하여 밀봉상태로 12도 암조건에서 8일간 전처리하였다. 저온처리 된 이삭은 증류수와 하이드로클로라이드(상표명 락스) 4:1 용액으로 살균하였다. 진공멸균 약치상 기구를 이용하여 페트리디쉬당 100~150개 정도의 밀도로 약을 치상하였다(도 2 참조). 캘러스 유도 배지로는 CM6배지(N6 기본배지, 1g/L yeast extract, 1mg/L NAA, 0.2mg/L 2,4-D, 10g/L 아가, 70g/L 수크로스, pH 5.8)을 사용하였으며, 약치상 후 26℃± 1℃의 항온실에서 하루 16시간씩 2,500Lux 조명 하에서 배양하였다.

조직배양기간이 길어질수록 반수체에서 이배체로 자연배가(spontaneous doubling)된 개체의 빈도가 높아지나, 체세포변이의 빈도도 함께 높아진다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 약치상 후 20~25일 이내에 유기된 캘러스들 중 직경이 1~2mm 정도의 부정배 캘러스(embryogenic callus)만을 선발하여 형질전환에 사용하였다(도 3A 참조).

캘러스 유도 및 식물체 재분화를 위한 기본배지 조성

성분	N6 (캘러스 유도)	MS (식물체 재분화)
성분	수량 (mg/L)	수량 (mg/L)
NH₄NO₃	-	1,650
(NH₄)₂SO₄	463	-
KNO₃	2,830	1,900
CaCl₂2H₂O	166	440
KH₂PO₄	400	170
MgSO₄7H₂O	185	370
MnSO₄4H₂O	4.4	22.3
ZnSO₄7H₂O	1.5	8.6
H₃BO₃	0.8	6.2
Kl	0.8	0.83
CuSO₄5H₂O	-	0.025
Na₂MoO₄2H₂O	-	0.25
CoCl₂6H₂O	-	0.25
FeSO₄7H₂O	27.85	27.85
Na₂EDTA	37.25	37.25
Inositol	-	100
Glycine	-	2.0
Nicotinic acid	0.5	0.5
Pyridoxine-HCl	0.5	0.5
Thiamine-HCl	1.0	0.1

<실시예 3>

형질전환, 재분화식물체 유도 및 벼 형질전환체 육성

<실시예 1>에서 제작한 omfi-147이 클로닝 된 벡터를 아그로박테리움 LBA4404(Hoekema et al. 1983, Nature 303:179-180)에 전기충격법(Sambrook et al. 1989, Molecular cloning : A laboratory mannual. 2nd Edn.)으로 도입하고, <실시예 2>에서 선별된 화성벼 약에서 유도된 캘러스와 공동배양(co-culture)하는 방법으로 형질전환을 실시하였다(Hiei et al. (1997) Plant Mol Biol. 35:205-218; Nishimura A et al. (2006) Nat Protoc. 1:2796-2802).

항생제가 첨가된 배지를 이용하여 캘러스 표면에 잔류하는 아그로박테리움을 세척제거한 후, CM6 배지에 3mg/L의 PPT가 함유된 선별배지로 옮겨 형질전환 된 캘러스만이 유도되도록 하였다(도 3B 참조).

2주 간격으로 2회 계대배양을 실시하면서 성장이 확인되는 캘러스들을 식물체재분화 배지인 RM3-2(MS 기본배지, 1mg/L NAA, 4mg/L 2,4-D, 40mg/L 아데닌 설페이트, 4mg/L 키네틴, 12g/L 아가, 30g/L 수크로스, pH 5.8)에 6mg/L의 PPT가 첨가된 선별배지로 옮겨 배양 식물체를 유도하였다(도 3C 참조). 계대배양은 2주 간격으로 3회 까지만 실시하면서 순차적으로 유도된 57개의 분화체들을 MS기본배지로 옮겨 기내 순화(in vitro acclimation)하였다(도 4A 참조).

<실시예 4>

분화식물체의 경화처리, 토양이식 및 이배체식물체 선별

기내식물체가 3~4엽기로 발육했을 때 수경재배로 전환하여 근군발달을 유도하면서 경화처리를 실시하였다(도 4B 참조). 수경액은 요시다(Yoshida) 용액을 사용하였고 3~4일 간격으로 총 5회간 교체하였다. 충분히 경화된 개체들은 1주씩 토양에 이식하여 육묘하였다.

약배양을 통해 확립된 개체들은 반수체와 이배체가 혼재하게 되는데, 약 60~70%를 차지하는 반수체식물체는 이배체식물체에 비해 매우 작으며 특히 출수 후 이삭과 영(낱알)의 크기에 의해 확연히 구분된다(도 5 참조). 최종적으로 17(32.7%) 개체가 이배체로 판정되어 수확되었다.

요시다 용액 조성

성분 요소	시약 (AR급)	투입량 (g/L)
N	NH₄NO₃	91.4
P	NaH₂PO₄2H₂O	0.3
K	K₂SO₄	71.4
Ca	CaCl₂	88.6
Mg	MgSO₄7H₂O	324.0
Mn	MnCl₂4H₂O	1.5
Mo	(NH₄:)₆Mo₇O₂₄4H₂O	0.074
B	H₃BO₃	0.934
Zn	ZnSO₄7H₂O	0.035
Cu	CuSO₄5H₂O	0.031
Fe	FeCl₃6H₂O	7.7
	Citric acid (monohydrate)	11.9

<실시예 5>

유전적으로 고정된 계통 확인 및 표현형 선발

형질전환에 약캘러스를 이용하는 목적은 형질전환 당대에서 유전적으로 고정된 벼 형질전환체를 확보하기 위함이다. 체세포변이가 적고 유전적으로 고정된 형질전환체의 빈도를 높이기 위해 약캘러스 육성기간을 최소함은 물론, 아그로박테리움과의 공동배양에 사용된 캘러스는 1~2mm로 제한하였다. 그러나 공동배양 당시 모든 약캘러스들의 자연배가현상이 완벽히 억제되었다고 단언할 수 없으므로, 자연배가가 일어난 캘러스로 외래유전자가 이입되어 헤테로 상태의 형질전환체가 발생할 수 있다. PPT가 함유된 선별배지는 외래유전자의 발현에 의한 표현형적 선발은 가능하나 헤테로와 호모 상태의 형질전환체들을 명확히 구분하기 어렵다.

이러한 문제점들을 극복하면서 형질전환체의 작물학적 특성을 면밀히 관찰하기 위해 이배체로 확인되어 수확된 17개체의 종자들을 20개체씩 하나의 event에서 형성된 종자를 1열로 이앙하는 1수-1열법에 의거 논에 이앙하여 통상의 재배 방법으로 관리하였다(도 6A 참조). 최고분얼기에 이르러 각 계통별로 무작위로 8 개체를 선정하고 일부 변형된 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammoniumbromide, CTAB)방법(Murray and Thompson (1980), Nucleic Acids Res. 8: 4321-4326)으로 DNA를 추출하였다.

<실시예 1>에서 제작한 벡터염기서열 특이 프라이머조합을 이용하여 PCR 검정을 실시하였다. PCR 증폭의 용액조성은 20ng 의 DNA, 각각 10pmole의 프라이머, 각각 250 uM의 dNTP, 0.5 unit 의 Taq polymerase(Nurotics, Deajon, Korea)등을 2.5 ul의 10X 반응버퍼와 혼합한 후 총량 25ul 가 되도록 증류수를 보충하였다. PCR 반응은 Double Engine Thermal cycler (MJ Research Inc. USA)를 이용하여 denaturation을 94도에서 30초, annealing을 55도에서 30초, extension을 72도에서 1분으로 총 35 cycle을 실시하였다. PCR 산물은 1.5%의 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다.

전 개체에서 외래유전자가 탐지되는 경우 해당계통의 형질전환이 반수체상태에서 일어난 것으로 판정하였다(도 6B 참조). 최종적으로 9개 계통들이(52.8%) 외래유전자가 반수체 상태에서 삽입된 후 자연배가 된 것으로 판명되었다. 1개 계통은 유의한 불임이 관찰되었고(sterile), 1개 계통은 키가 매우 작았으나(dwarf), 나머지 7개 계통의 외관특성은 원품종인 화성벼 유사하였다.

<실시예 6>

원품종(Wild Type)과의 여교잡을 통한 체세포변이인자의 제거

각 형질전환계통들은 간장, 수장, 수수, 지엽장 등 외관특성이 조금씩 상이하였으며(event-to-event variation), 특히 2개 계통에서는 왜성과 불임 등 원품종에 비해 심한 ‘표현형적 왜곡현상’이 관찰되었다. 왜곡현상의 이유로 1) 외래유전자와 원품종의 유전자들간 상호작용과, 2) 염색체내로의 외래유전자 삽입이 특정 ORF 영역내로 일어난 ‘gene-knockout' 등을 고려해 볼 수 있다. 그러나 왜곡현상이 외래유전자의 삽입과는 별도로 조직배양 중 유발된 체세포변이에 의해 야기되었을 가능성도 배제할 수 없다. 이 경우 체세포변이에 의해 형질전환체의 경제성이 상실되는 것이나, 현실적으로는 그 진위를 판정하기가 매우 어렵다. 그러므로 형질전환체에서 관찰되는 열악형질이 체세포변이에 의한 것인지를 판정할 수 있고, 적절한 방법으로 제거할 수 있다면 형질전환체 개발의 효율성과 경제성을 동시에 극대화 할 수 있다.

형질전환체 생산에 사용된 벡터의 프로모터들은 상시 발현되는 것들로 (universal promoter) 유전학적으로 ‘우성유전인자’이다. 그러나 체세포변이에 의한 돌연변이의 대부분은 ‘열성유전인자’로 알려져 있다. 그러므로 체세포변이에 의한 왜곡현상의 경우 원품종으로의 여교잡 후대에서 외래유전자를 보유하면서도 외관특성이 원품종과 유사한 개체가 확인될 것이나, 외래유전자의 삽입에 의한 왜곡현상은 해당유전자가 확인되지 않는 여교잡 후대에 제한되어 개선효과가 관찰될 것이라는 점에 착안하였다.

총 4개 형질전환계통들을 부본으로 원품종인 화성벼를 모본으로 사용하여 절영법을 이용한 인공교배를 이용하여 여교잡을 실시하였다(도 7 참조). 절영법을 이용한 인공교배를 위하여 수분하기 전날 오후에 모본의 영화 끝을 가위로 자르고 약을 제거한 후 파라핀종이봉투를 씌워 자연교잡을 방지하였다. 다음날 부본의 이삭이을 취하여 물이 든 시험관에 꽂아둔 후 완전히 개화하였을 때 제웅된 모본의 이삭에 수분시켰다. 수분을 실시한 후 다시 파라핀종이봉투를 씌워 추가적인 자연교잡을 방지하였다. 수분 후 30~40일 후 완전히 여문 교배립(F1 종자)을 수확하였다. 일부 F1 종자들을 파종하여 육성하여 상기방법에 의거 BC1F1 종자를 작성하였다.

원품종인 화성벼로 여교잡 된 총 4개의 형질전환계통들 중 두 계통은 그 외관특성이 원품종과 유사하나, 1개 계통은 높은 불임, 나머지 1개 계통은 키가 작은 계통이었다. 포장에 전개된 원품종(wild type)과 형질전환체 사이의 교잡을 통해 만들어진 F1에서는 부본(형질전환계통)들에 비해 화성벼 표현형으로 회귀되는 경향이 뚜렷하였으며, 상기 F1과 원품종(wild type)을 교배한 BC1F1계통들은 화성벼와 거의 유사한 외관특성을 발현하였다. 불임이 높은 계통은 F1과 BC1F1 세대에서도 외래유전자의 존재와 불임이 고도의 정상관이었다(도 7B 참조).

그러나 키가 작은 계통은 F1에서 화성벼와 거의 동일한 키로 회귀되었으며(도 7A 참조), 외래유전자가 확인되는 BC1F1 개체들에서도 정상 간장을 회복하였다(도 8A 참조). 따라서 불임이 높은 계통은 외래유전자의 이입에 의해, 그리고 키가 작은 계통은 체세포변이에 의해 왜곡현상이 야기된 것을 확인하였으며 체세포변이에 의한 왜곡현상은 여교잡에 의하여 성공적으로 제거되었음을 확인하였다.

<실시예 7>

우량 형질전환체 확립

외래유전자가 확인되는 유망 BC1F1들을 자가수정하여 BC1F2 종자를 생산하였다(도 8B 참조). 각 BC1F2 계통내 개체들은 외래유전자에 대해 분리하게 된다. 유전적으로 고정된 유망 형질전환체를 확정하기 위해 1) 계통당 20개체에 대해 외래유전자가 존재여부를 확인하기 위한 PCR검정을 실시한 후, 2) 외관특성이 화성벼와 매우 유사한 개체들의 자가수정 종자(BC1F3)를 수확하고, 3) 6mg/L의 PPT가 첨가된 MS 선별배지에서 육묘하여 검정된 모든 개체가 생존하는 계통만을 선발하였다(도 9 참조).

본 발명의 육성 과정을 정리하면 표 4에서 보는 바와 같이 형질전환을 시작하여 우량 형질전환체를 확립하기까지 36개월이 소요되는 것을 확인하였다. 관행적으로 수행되는 벼 형질전환계통 육성과정은 외래유전자가 유전적으로 고정되어 발현되는 개체를 확인하는데 2년 이상이 소요된다. 더 나아가 원품종의 작물학적 특성이 견지되는 우량계통을 확보하기 위해서는 형질전환체를 대규모로 육성해야함은 물론, 유전적으로 고정되어 외래유전자가 안정적으로 발현되는 분리후대계통들의 조사 및 선발에 적어도 3년 이상의 기간이 추가로 요구되는 것을 감안하면 본 발명의 형질전환 벼 제조방법은 안정된 우량 형질전환 벼를 제조하는 시간을 획기적으로 단축시킨 것임을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 약으로부터 유도된 반수체 캘러스를 형질전환하여 재분화하는 형질전환 벼 제조방법을 제공한다. 본 발명의 약으로부터 유도된 반수체 캘러스를 형질전환하여 재분화하는 형질전환 벼 제조방법은 형질전환 당대에서 유전적으로 고정된 개체를 확보하며 여교잡을 통하여 불량체세포변이인자를 제거하여 안정된 형질전환 벼 확립에 소요되는 시간과 경비를 획기적으로 절감할 수 있어 벼의 새로움 품종 개발에 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

도 1은 야생벼 유전자 ‘Om147'이 삽입된 재조합벡터의 주요부 및 형질전환체 검증에 사용된 PCR 프라이머 조합에 의해 표지되는 부위를 나타낸 것이다(Ubi-pro: 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter); Ubi-Intron: 유비퀴틴 인트론(ubiquitin intron); PinII: 감자 pretenase inhibitorII의 전사 종결 서열; 35Spro: 꽃양배추바이러스 CaMV 35S 프로모터; bar^r: 제초제(바스타; 포스피노트리신) 저항성 유전자).

도 2의 A는 벼의 약을 캘러스 유도배지에 치상하는 과정의 사진이다. 도 2의 B는 캘러스유도배지 CM6에 치상된 화성벼의 약의 사진이다.

도 3의 A는 약치상후 20~25일 이내에 캘러스유도배지 CM6상에서 유도된 캘러스들로 형질전환에 사용하기 위하여 직경 1~2mm 정도의 부정배 캘러스만을 선발하는 과정을 보여주는 사진이다. 도 3의 B는 아그로박테리움 공동배양 직후 PPT(6mg/L)가 함유된 CM6 선별배지에 치상된 캘러스들이다. 도 3의 C는 식물체재분화배지 RM3-2 (3mg/L PPT 함유)에서의 형질전환체의 재분화 과정을 보여주는 사진이다.

도 4의 A는 MS 기본배지에서의 분화체 순화과정 사진이며, 도 4의 B는 수경재배 (Yoshida 수경액 사용)를 통한 형질전환체의 근군발달 유도 및 경화처리과정을 보여주는 사진이다.

도 5는 약배양에 의해 분체개체에서 혼재되어있는 반수체와 이배체를 비교한 사진이다. 반수체는 이배체에 비해 식물체 크기가 작고 (도 5의 A), 이삭도 작으며 불임을 띄어 (도 5의 B) 이배체와 쉽게 구분될 수 있다.

도 6은 외래유전자에 대해 유전적으로 고정된 형질전환체를 선발하는 과정을 설명하는 그림으로, 도 6의 A는 이배로 확인된 형질전환 개체들의 자가수정에 의한 종자들을 각 계통별로 포장에 전개한 모습의 사진이며, 도 6의 B는 각 계통내에서 무작위로 선정된 개체들의 gDNA와 RNA를 이용하여 자연배가가 일어난 시점을 판단하는 PCR 검정결과이다.

도 7은 원품종으로의 여교잡을 이용한 체세포변이인자의 제거 절차에 관한 그림이다. 도 7의 A는 원품종(WT)과 키가작은 형질전환체(TR) 및 이들 사이의 교잡을 통해 작성된 F1 식물체를 비교해주는 사진으로, 형질전환체에 비해 원품종과의 교잡을 통해 작성된 F1 식물체의 키가 원품종으로 회복되었음을 보여주고 있다. 도 7의 B는 도 7의 A에 제시된 F1 개체들이 원품종과 (키가 작은) 형질전환체간의 교잡에 의해 작성된 후대들임을 증명하기 위한 PCR 검정결과이다. 도 7의 C는 여교잡에 의해서도 형질전환체가 보이는 ‘표현형왜곡현상’이 개선되지 않았던 특정 형질전환 계통의 여교잡 후대를 보여주는 사진이다.

도 8의 A는 원품종으로의 여교잡을 통하여 형질전환계통에서 관찰되었던 ‘표현형왜곡현상’이 거의 제거되어 원품종인 화성벼(WT)와 거의 유사한 외관특성을 지닌 BC1F1 여교잡 후대계통들의 사진이다. 도 8의 B는 도 8의 A에서 주요 농업형질에 의거하여 선발된 BC1F1개체들의 후대(BC1F2)들의 균일성을 보여주는 사진으로, 형질전환이 실시된 후 33개월경에 표현형적으로 원품종인 화성벼와 거의 유사 하며 외래유전자가 안정적으로 발현되고 있는 벼 형질전환체들이다.

도 9는 외래유전자에 대해 유전적으로 완전 고정된 유망 형질전환 여교잡후대를 최종 선별하는 사진이다. 외래유전자의 발현이 확인되며 여교잡을 통해 체세포변이인자를 제거한 농업형질이 우수한 BC1F2 개체(도 8의 B 참고)에서 수확된 종자(BC1F3)를 MS선별배지(6mg/L PPT)에 치상하여 외래유전자의 분리유무를 확인한 결과이다(WT: 원품종 벼; Homo Line: 목적유전자가 두벌의 염색체(2n)에 모두 들어 있는 벼; Hetero Line: 목적유전자가 두벌의 염색체 중 한쪽에만 들어 있는 벼).

<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> Method for short term production of elite transgenic rice lines by using anther culture and backcross <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bar_S : forward primer for bar <400> 1 gtctgcacca tcgtcaacc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bar_AS : reverse primer for bar <400> 2 gaagtccagc tgccagaaac 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Om147_ORF_S : forward primer for detecting omfi-147 <400> 3 tcgatgaggg ctcaactacc aacg 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIN II_AS : reverse primer for detecting omfi-147 <400> 4 gtgattagca tgtcactatg tgtgcatcc 29

Claims

(a) 캘러스 유도 배지에서 벼의 약으로부터 반수체 캘러스를 유도하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 유도된 반수체 캘러스에 목적유전자를 형질전환 하는 단계; 및

(c) 재분화 배지에서 상기 형질전환된 캘러스로부터 형질전환 벼를 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 벼의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 반수체 캘러스는 약치상 후 15일 내지 60일에 유도된 캘러스인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 반수체 캘러스는 약치상 후 20일 내지 40일에 유도된 캘러스인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 반수체 캘러스는 약치상 후 20일 내지 25일에 유도된 캘러스인 방법.
제1항에 있어서, 상기 캘러스 유도 배지는 Yeast extract, 1-나프탈렌아세트산, 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 수크로스를 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재분화 배지는 1-나프탈렌아세트산, 2,4-디클로로페녹시아세트산, 아데닌 설페이트, 키네틴 및 수크로스를 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 형질전환 벼의 제조 방법에 있어서, 상기 재분화된 형질전환 벼에서 호모 이배체 벼를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 형질전환 벼의 제조방법.
제7항의 형질전환 벼의 제조 방법에 있어서, 상기 이배체 형질전환 벼를 원품종의 벼와 여교잡을 하여 체세포변이인자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 형질전환 벼의 제조방법.