KR20090113325A - 흑색종에서의 ｇｎａｑ 돌연변이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진단 및 예후의 목적으로 멜라닌 세포성 신생물에서의 Gnaq 유전자에서 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 돌연변이된 Gnaq 유전자의 활성을 조절함으로써 상기 멜라닌 세포 신생물을 처리하는 방법을 제공한다.

Description

흑색종에서의 ＧＮＡＱ 돌연변이{GNAQ MUTATIONS IN MELANOMA}
관련 출원의 교차 참조
본 원은 2007년 2월 8일자로 출원된 U.S. 가출원 60/900,479호를 우선권으로 주장하며, 이의 개시는 본 원에서 참조 인용된다.
정부 보조 연구 또는 개발 하에 형성된 발명의 권리에 대한 언급
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여받은 승인 번호 P01 CA 025874-25-A1 하에 정보 보조에 의해 형성되었다. 정부는 본 원에서 특정 권리를 가진다.
흑색종 형성의 현 모델은 주요 흑색종 유전자에서의 돌연변이 축적에 의한 정상 상태에서의 악성 상태로 멜라닌 세포가 진행하는 것이다. 문헌[Meier, F., et al. (1998) Frontiers in Bioscience 3:D1005-1010] 참조. 흑색종은 자발적으로, 또는 기존 모반 또는 사마귀 내에서 발생할 수 있다. 모반은 기지의 흑색종 유전자에 돌연변이를 포함하고, 따라서 흑색종을 발전시키는 위험 인자이다. 예를 들어, 문헌[Pollock, P.M., et al, (2003) Nat. Genet. 33(1): 19-20; Kumar, R. et al, (2004) J. Invest. Dermatol. 122(2):342-348; Chin, L., (2003) Nat. Rev. Cancer 3(8):559-570] 참조.
대부분의 인간 흑색종 및 멜라닌 세포성 모반은 BRAF, NRAS, C-KIT 또는 HRAS 유전자 내에 활성화 돌연변이를 보유하는 것으로 확인되었다. 더욱이, 최근 연구에서 흑색종은 MAP-키나제 경로 활성의 빈도에서 확연히 다른 유전적으로 별개인 군에 속하는 것으로 확인되었다. 문헌[Curtin, J.A., et al, (2005) N Engl J Med. 353(20):2135-47] 참조. 한 범주, 포도막 흑색종은 눈의 맥락얼기 내의 멜라닌 세포로부터 발생하고 특징적인 세포유전학적 변질에 의한 피부 흑색종과는 생물학적으로 구분된다. 문헌[Horsman et al. (1993) Cancer 71(3):811] 참조. 다른 범주로는 진피내 멜라닌 세포성 증식이 있으며, 이는 선천적이거나 후천적이며, 결막 및 안구주위 피부(Ota의 모반), 어깨(Ito의 모반) 및 등 하부(몽골반)에 영향을 미치는 개별의 청색을 띤 사마귀(청색 모반)에서 큰 청회색 패치에 이르는 다양한 방식으로 존재한다. 문헌[Zembowicz, et al. (2004) Histopathology 45(5):433] 참조. 이들 진피내 멜라닌 세포성 증식은 BRAF 또는 NRAS 돌연변이를 함유하지 않으며, 따라서 다른 모반 및 흑색종에 비해 고유한 병인론을 보유한다. 문헌[Ariyanayagam-Baksh SM, et al , (2003) Am J Dermatopathol. 25(1): p. 21-7] 참조. 포도막 흑색종은 MAP-키나제 활성을 나타내나(문헌[Zuidervaat et al. (2005) British J. Cancer 92(11):2032) 참조] 전형적으로 BRAF, NRAS 또는 KIT에서 돌연변이를 보유하지 않는다. 미국에서 포도막 흑색종은 연당 백만당 4.3∼6개의 사건의 비율로 진단되지만, 포도막 흑색종을 갖는 1250명의 백인의 이전 연구에서 안구 또는 눈피부 멜라닌세포증을 갖는 단지 17명의 환자를 확인하였다. 문헌[Gonder J.R., et al., (1982) Ophthalmology, 89(8): 953-60] 참조. 진피내 멜라닌 세포성 신생물 및 포도막 흑색종 간의 잠재적인 관련성은 Ota의 모반이 포도 막 흑색종의 위험 인자이고 상기 2가지 병태의 조직형태학적 특성이 중첩된다는 것으로 제안되며, 상기 두 병태는 함께 발생하는 것으로 보고되어 있다. 문헌[Lopez, M. T., et al, (1998) Am J Dermatopathol. 20: 109-110; Singh, A.D., et al. (1998) Opthamol. 105(1): 195] 참조.
최근, 마우스 중 대형 돌연변이 생성 스크린으로 몇몇 검은 피부 (Dsk) 돌연변이를 확인하였다. 문헌[Van Raamsdonk CD, et al, (2004) Nat Genet. 36: 961-968] 참조. 이들 돌연변이 중 일부는 진피내 멜라닌 세포 유사형 청색 모반의 세포 증식이 희박한 멜라닌 세포성 표현형을 가졌다. 상기 돌연변이는 G-단백질 α-서브유닛에서의 돌변변이체의 결과인 것으로 나타났다.
G 단백질은 알파(α), 베타(β) 및 감마(γ) 서브 유닛으로 구성된 포유류에서 발견되는 이종삼량체 단백질의 대량군을 나타낸다. 문헌[Wettschureck, N. A. O. S., (2005) Physiol. Rev. 85(4): 1159-1204] 참조. G-αq는 GTP의 결합 및 가수분해를 통해 포스포리파제 Cβ의 자극을 매개하는 다양한 G-알파 서브유닛 중 하나이다. 문헌[Markby, D.W., et al, (1993) Science 262(1541): 1895-1901] 참조. G-αq의 활성이 진피 중 멜라닌 세포의 생존을 촉진한다는 것이 가정되어 왔다. 문헌[Van Raamsdonk, C. D., et al, (2004)] 참조. 이는, G-αq의 과잉활성이 진피에 이의 유사 분열 속도를 증가시킴 없이 이동하면서 멜라닌 아세포, 미성숙 멜라닌 세포의 수를 증가시킨다는 마우스 내의 관찰과 일치한다. 문헌[Van Raamsdonk, C. D., et al., (2004)] 참조.
마우스 중 Gαq에서의 생식선 과형태 돌연변이는 상피 착색의 변화 없이 피 부의 과착색을 유발한다. 예를 들어, Gnag Dsk1 및 Gnag Dsk10 돌연변이는 이들이 GTP아제 활성에 필수적인 아미노산에서 발생하지 않고 엔도텔린 B 수용체에 결합된 작용성 G 단백질에 의존적으로 남기 때문에 구조적이라기 보다는 과잉활성인 것으로 사료된다. 문헌[Van Raamsdonk, C.d., et al.,(2004)] 참조. 특히, Gnag Dsk1 및 Gnag Dsk10 마우스는 종양을 발전시키지 않는다. 문헌[Van Raamsdonk, CD., et al (2004)] 참조. 그러나, 임계 아미노산의 치환을 통한 GTP아제 활성의 차단은 구조적 활성화를 유도할 수 있다. 문헌[Markby, D.W., et al. (1993)] 참조. 예를 들어, Gαs(Gnas)에서의 Q227의 돌연변이는 인간 뇌하수체 종양에서 구조적인 활성을 유도한다. 문헌[Landis, C.A., et al. (1989) Nature 340(6236):692-696] 참조.
멜라닌 세포에서 G-단백질 커플링된 수용체 Grm-1을 정규 장소 외에서 발현시키는 이식 유전자 마우스는 진피 과착색 및 큰 멜라닌 세포성 종양 둘 모두를 보유한다. 문헌[Pollock, P.M., et al. (2003) Nat. Genet. 34(1): 108-112] 참조. 더욱이, 구조적 활성의 Gnaq 변형된 NIH3T3 세포를 가슴샘 없는 누드 마우스에 주사하여 주사 1 주일 내에 종양을 유도하였다. 문헌[Kaqlinec G. et al. (1992) Mo/. Cell Biol. 12(10):4687-4693] 참조.
Gnaq에서의 한 돌연변이가 흑색종 샘플 내에 존재하는 것으로 보고되어 있다. 상기 돌연변이는 암 내 체세포 돌연변이의 생어 위원회 카탈로그[Sanger Institute Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC)] 웹 사이트, http://www.sanger.ac.uk/cosmic에 기술되어 있다. 문헌[Bamford et al (2004) Br J Cancer, 91:355-358] 참조. COSMIC 샘플 확인 번호: 753546 (샘플명 CP66-MEL)에 기술되어 있는 돌연변이(돌연변이 확인 번호 182000)는 보전적 아미노산 치환(V359I)를 유도하는 미스센스 치환 돌연변이이다. CP66-MEL에서 Gnaq의 V359I 보존적 미스센스 돌연변이가 Gnaq 활성 상에 어떠한 영향을 준다는 교시는 없다.
본 발명은 Gnaq에서의 돌연변이, 예를 들어 Gnaq를 구조적으로 활성화시키는 돌연변이로부터 발생하는 활성화된 Ga 서브유닛이 멜라닌 세포성 신생물, 예를 들어 청색 모반, 예컨대 Ota의 모반; 악성 청색 모반, 청색 모반으로부터 발생하는 희귀한 유형의 흑색종(문헌[Granter, S.R., et al., (2001) Am. J. Surg. Pathol. 25(3):316-323] 참조); 포도막 및 특정 피부 흑색종, 예를 들어 악성 흑자 흑색종 또는 만성 일광 노출(CSD 흑색종)에 의해 손상받은 피부로부터의 흑색종에 존재한다는 발견을 부분적으로 기반으로 한다.
발명의 개요
본 발명은 생물학적 샘플에서 흑색종 또는 모반 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자로부터의 의심되는 흑색종 세포 또는 모반을 포함하는 생물학적 샘플에서의 Gnaq 유전자에서 활성 서열 돌연변이를 검출하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 Gnaq 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩된 생성물에서의 돌연변이의 존재를 검출함으로써, 또는 Gnaq의 과다발현을 검출함으로써 흑색종, 예를 들어 포도막, 악성 청색 모반 또는 CSD 흑색종(악성 흑자 흑색종 포함)을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 진단적 및 예후적 징후에, 및 다양한 치료 요법, 예를 들어 G-알파 길항제, 또는 하류 신호 전달 성분, 예컨대 단백질 키 나제 C 억제제에 반응성이거나 반응성이기 쉬운 흑색종 환자를 확인하는 데 이용할 수 있다. 본 발명은 또한 Gnaq 유전자에서의 돌연변이로부터 발생하는 흑색종, 예를 들어 포도막 흑색종, 악성 청색 모반 또는 CSD 흑색종을 갖는 환자에게 Gnaq 억제제를 투여하는 것을 포함하는 흑색종의 치료 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 환자, 예를 들어 흑색종을 보유하거나 보유하는 것으로 의심받는 환자로부터의 흑색종 세포를 포함하는 생물학적 샘플, 예를 들어 피부 또는 눈 샘플에서 멜라닌 세포성 신생물을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생물학적 샘플에 존재하는 흑색종 또는 모반 세포에서 Gnaq의 서열 돌연변이를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 Gnaq의 활성화 돌연변이가 존재한다는 것은 멜라닌 세포성 신생물의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 세포성 신생물은 포도막 흑색종, 만성 일광 노출에 의해 유발되는 손상을 가진 피부 상에서 발생하는 흑색종, 예를 들어 악성 흑자 흑색종 또는 모반에서 발생하는 흑색종, 예를 들어 악성 청색 모반이다. 또다른 실시양태에서, 멜라닌 세포성 신생물은 선단 흑자성 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 결합조직형성 흑색종 또는 선천성 모반 또는 전이체에서 발생하는 흑색종일 수 있다. 또다른 실시양태에서, Gnaq 돌연변이는 모반, 예컨대 청색 모반, Ota의 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 뉴로크리스틱 과오종(neurocristic hamartoma) 또는 특정 진단이 없는 청색 모반의 징후이다. 다른 실시양태에서, 모반은 선천적인 모반 또는 심부 관통성 모반일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 검출 단계는 핵산, 예를 들어 mRNA 또는 게놈 DNA에서의 Gnaq 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 전형적인 실시양태에서, 이러한 검출 단계는 증폭 반응, 예컨대 PCR 또는 RT-PCR, 인시츄 혼성화 또는 전기영동 핵산 분리[예를 들어, 노던 또는 서던 블롯팅(northern or Southern blotting)]을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 검출 단계는 Gnaq 단백질 내 돌연변이를 검출하는 것, 예를 들어 Gnaq 활성 및/또는 발현의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 전형적인 실시양태에서, 이러한 검출 단계는 항체의 사용(면역세포화학) 및/또는 전기영동 단백질 분리[예를 들어, 웨스턴 블롯(western blot)]를 포함한다. 일부 실시양태에서, Gnaq 돌연변이는 Gln 209 ∼ Leu(예를 들어, CAA ∼ CTA 또는 CAA ∼ TTA)인 반면에, 다른 실시양태에서, Gnaq 돌연변이는 Gln 209 ∼ Pro (CAA ∼ CCA)이다. 일부 실시양태에서, Gnaq 돌연변이는 GIn 209 ∼ Arg (CAA ∼ CGA)이다. 또다른 실시양태에서, Gnaq 돌연변이는 GIn 209 ∼ Tyr (CAA ∼ TAT)이다.
전형적으로, 검출 단계는 Gnaq에서의 서열 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 이는 흔히, 예를 들어 생물학적 샘플로부터 핵산 샘플을 분석함으로써 실시한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 샘플일 수 있다. 상기 DNA 샘플은 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있거나, 또는 게놈 DNA일 수 있다. 흔히, 돌연변이를 검출하게 위한 검출 단계는 증폭 반응을 포함한다. 돌연변이의 존재 또는 부재는, 예를 들어 증폭된 핵산에 의한 서열 분석에 의해 또는 대립 유전자 특이성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 이용하는 방법에 의해 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 흑색종, 예를 들어 포도막 흑색종, 일광 손상된 피부 상의 흑색종 또는 악성 청색 모반 또는 변이체를 갖거나 갖는 것으 로 의심되는 환자로부터의 샘플이다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 모반, 예를 들어 전형적인 청색 모반, Ota의 모반, Ito의 모반, 몽고반점, 비전형적인 청색 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 뉴로크리스틱 과오조을 갖는 청색 모반, 특정 진단이 없는 청색 모반, 선천성 모반 또는 심부 관통 모반을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 환자로부터의 샘플이다.
본 발명은 또한 Gnaq에서의 돌연변이로부터 발생하는 흑색종의 치료 요법을 받는 환자에서의 흑색종의 진전을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에서 유래하는 생물학적 샘플에서의 Gnaq에서 돌연변이를 보유하는 세포수의 변화를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 돌연변이를 갖는 세포수의 변화는 요법에 대한 환자의 반응 징후이다.
일부 실시양태에서, Gnaq 유전자에서의 돌연변이로부터 흑색종이 발생하는 환자에서 흑색종의 진전을 모니터링하는 것은 생물학적 샘플로부터 핵산 중 돌연변이를 검출함으로써 실시한다. 다른 실시양태에서, Gnaq에서의 돌연변이로부터 발생하는 흑색종의 진전은 생물학적 샘플에 존재하는 Gnaq 단백질을 평가함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 안구 또는 피부로부터의 샘플이다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 림프절, 간, 부신 또는 골로부터의 샘플이다.
전형적으로, 본 발명에 따라 흑색종의 진전을 모니터링하는 데 있어서, 치료제에 노출되기 전의 환자로부터 수취한 생물학적 샘플에서의 Gnaq 돌연변이를 갖는 세포의 수에 비해서, 제제에 의해 처리된 후의 환자로부터 수취한 생물학적 샘플에 서의 Gnaq 돌연변이를 갖는 세포의 수가 감소된다는 것은 치료제에 대한 긍정적인 치료 반응의 징후이다.
본 발명의 모든 검출 방법에서, 생물학적 샘플은 원발성 또는 전이성 흑색종 세포를 함유하는 것으로 의심되는 신체에서의 임의의 공급원으로부터의 샘플일 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플은 피부, 예를 들어 선단 피부; 만성 일광 노출로부터의 손상 받은 피부, 안구, 예를 들어 포도막, 결막 또는 점막으로부터의 샘플일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 샘플을 혈액, 혈청, 림프절로부터의 조직, 또는 내장 기관으로부터의 조직으로부터의 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 흑색종의 진전을 모니터링하는 데 있어서, 상기 샘플은 혈액과 같이 용이하게 수득할 수 있는 조직이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 흑색종 환자가 직접적으로, 또는 Gα에 의해 활성화되는 단백질을 억제함으로써 Ga 서브유닛의 활성을 억제하는 요법을 받는 지원자인지를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 흑색종 세포가 Gnaq에서 활성화 돌연변이를 보유하는지를 결정하는 것을 포함한다. 상기 측정은 본 원에서 기술되는 검출 방법에 따라 실시된다. 따라서, 상기 검출 단계는 mRNA, DNA 또는 단백질에서 돌연변이를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 검출 단계는 흑색종 또는 모반으로부터의 핵산 샘플에서 Gnaq 돌연변이의 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있는 반면에, 또다른 실시양태에서, 상기 검출 단계는 멜라닌 세포성 신생물로부터의 단백질 샘플로부터의 단계이다. 핵산 샘플은 멜라닌 세포성 신생물 샘플로부터의 RNA 또는 DNA, 예를 들어 RNA로부터 형성된 게놈 DNA 또는 cDNA 일 수 있다. 흔히, 상기 검출 단계는 증폭 반응, 예컨대 RCR 또는 RT-PCR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 흑색종은 포도막 흑색종, 악성 청색 모반, CSD 흑색종, 예를 들어, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑색종, 점막 흑색종 또는 표재 확장성 흑색종이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 Gnaq에서 체세포 돌연변이로부터 발생하는 모반 또는 흑색종 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법으로서, Gnaq 길항제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. Gnaq 길항제는, 예를 들어 소분자, 예컨대 에델포신, 단백질 키나제 C 억제제 또는 스타우로스포린 동족체 CPG41251; 항체; 펩티드; 또는 핵산일 수 있다. 전형적으로, 모반 또는 흑색종 세포는, 예를 들어 포도막 흑색종, CSD 흑색종, 예를 들어 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 결합조직형성 흑색종, 전이성 흑색종, 모반으로부터 발생하는 흑색종, 예를 들어 청색 모반 (악성 청색 모반), 예컨대 Ota의 모반, Ito의 모반, 몽골반, 비전형적인 청색 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 뉴로크리스틱 과오종을 갖는 청색 모반, 특정 진단이 없는 청색 모반, 재발 세포성 청색 모반으로부터 발생하는 흑색종으로부터의 세포이다. 또한, 상기 흑색종 세포는 선천성 모반 또는 심부 관통 모반으로부터 발생할 수 있다.
본 발명은 또한 모반의 흑색종으로의 진전 위험성을 측정하는 방법으로서, 모반으로부터의 생물학적 샘플에서 Gnaq 유전자에서의 서열 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 돌연변이의 존재는 모반의 흑색종으로의 진전 위험성이 증가한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 서열 돌연변이는 Gnaq의 Gln 209을 인코팅하는 코돈이다. 일부 실시양태에서, 모반은 청색 모반, 예컨대 Ota의 모반, 비전형적인 청색 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 청색 모반 뉴로크리스틱 과오종 또는 특정 진단이 없는 청색 모반이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 평가하여 검출한다.
도면의 간단한 설명
도 1a∼1c는 hTERT/CDK4R24C/p53DD에 의한 불멸화된 멜라닌 세포 상의 돌연변이체 및 야생형 GNAQ의 발현의 효과는 나타내는 예시적 데이타를 제공한다. a. GNAQ<Q209L>은 NRASQ61R와 대등한 효능으로 TPA 독립적인 방식으로 부착 독립적 성장 hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포를 유도함. b. a에서 도시된 실험의 군체 수 및 크기(mm)의 정량 분석. c. 형태학적으로 비정상인 핵을 갖는 세포의 백분율.
도 2a∼2b는 GNAQQ209L가 인간 멜라닌 세포에서 MAP 키나제 활성을 유도한다는 것을 나타내는 예시적 데이타는 제공한다. a. hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포는 단지 GNAQWT 또는 벡터에 비해 GNAQQ209L에 의한 안정한 트랜스펙션 후에 증가된 수준의 pERK 및 시클린 D1을 발현시킴; 세포당 평균 픽셀 형광 강도의 누적 분포도(p 값: GNAQQ209L 대 벡터 대조군), b. GNAQWT 또는 벡터 대조군에 의해 트랜스펙션 처리된 세포와 비교한, Flag 태그된 GNAQQ209L를 발현시키는 293 세포에서의 pAKT가 아닌 증 가된 pERK 수준을 나타내는 웨스턴 블롯. 시클로필린 B는 로딩 대조군으로서 나타낸다.
도 3a∼3c는 포도막 흑색종 세포계, Mel202에서의 GNAQ의 siRAN 매개된 녹다운(knock-down)을 나타낸다. a. siRNA에 대한 반응에서의 포스포-ERK의 감소된 수준을 나타냄, b. GNAQ siRNA에 대한 반응에서 세포수의 감소를 나타냄, c. GNAQ siRNA에 대한 반응에서 대조군 세포에 비해 Mel202 세포의 아폽토시스의 증가를 나타냄.
본 발명은 예후적 용도를 위한 암 세포의 검출을 위한, 및 흑색종 및 모반의 치료를 위한 방법, 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명은 Gnaq에서의 체세포 돌연변이, 즉, 변이체 G-α 서브유닛의 GTP 가수분해 활성의 손실 또는 감소를 초래하는 돌연변이의 활성화로부터 많은 흑색종 및 모반이 발생한다는 발견을 부분적으로 기반으로 한다. Gnaq 돌연변이를 갖는 예시적 멜라닌 세포 신생물은 포도막 흑색종, CSD 흑색종(악성 흑자 흑색종 포함), 악성 청색 모반, 통상의 청색 모반, Ota의 모반, 비전형적인 청색 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 청색 모반 뉴로크리스틱 과오종 및 특정 진단이 없는 청색 모반을 포함한다.
G-α는 척추 동물에서 2개의 하위군을 형성하는 이종삼량체 GTP 결합 단백질, Gnaq 및 Gnal1을 포함하는 널리 발현되는 Gα-q 군, 및 더욱 제한되는 발현을 나타내는 Gnal4 및 Gnal5 군 중 하나의 알파 하위단위이다. Gα-q 군은 비스포스포이노시티드(PIP2)의 이노시티드 트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤(DAG)로의 가수분해를 유도하는 포스폴리파제 Cα의 자극을 매개한다. IP3는 하류 칼슘 의존성 신호 전달을 유도하는 소포체(ER)에서의 세포내 저장으로부터의 칼슘 방출을 자극할 수 있다. 또한, DAG는 단백질 키나제 C(PKC)를 활성화시킬 수 있고, 이어서, 경로 둘 모두는 미토겐 활성화된 단백질 키나제(MAPK) 캐스케이드로 공급될 수 있다. 문헌[Corbit, K.C., et al, (200O) Mol. Cell Biol. 20:5392-5403; Sato, M. et al, (2006) Ann. Rev. Pharm. Toxicol. 46: 151-187] 참조.
본 발명자는 Gnaq에서의 활성화 돌연변이, 예를 들어 Gnaq의 Q209의 이형접합성 체세포 치환 돌연변이가 모반, 예컨대 통상의 청색 모반, Ota의 모반, 비전형적인 청색 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 뉴로크리스틱 과오종을 갖는 청색 모반 및 특정 진단이 없는 청색 모반을 포함하는 몇몇 유형의 멜라닌 세포 신생물에 존재한다. 흥미롭게는, 다른 흑색종 유전자가 청색 모반에서 돌연변이되지 않는 것으로 이미 보고되어 있으며, 이는 그 청색 모반이 다른 모반에 비해 고유한 병인론을 갖는다는 것을 제시한다. 문헌[Ariyanayagam-Baksh, S. M., et al, (2003) Am. J. Dermatopathol. 25(l):21-27] 참조. 활성화 돌연변이, 예를 들어 Gnaq 중 Q209의 이형성 체세포 치환 돌연변이가 또한 포도막 흑색종, 악성 청색 모반, CSD 흑색종 및 피부 흑색종의 약 4∼15%를 차지하는 피부 흑색종인 악성 흑자 흑색종을 비롯한 다양한 흑색종에 존재하며, 노령의 개인의 일광 노출 부위에서 형성하는 경향이 있다(문헌[Chin L., (2003) Nat. Rev. Cancer. 3(8):559-570] 참조).
일부 실시양태에서, Gnaq 활성화 돌연변이는 Gnaq 핵산 및 폴리펩티드 서열의 과다발현을 유도하는 돌연변이가다. 따라서, Gnaq 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열의 수준을 검출하는 방법을 또한 사용하여 Gnaq가 과다발현하는 모반, 예를 들어 청색 모반, 예컨대 Ota의 모반, 및 본 원에서 기술된 흑색종 세포를 검출할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, Gnaq를 활성화시키는 Gnaq에서의 체세포 돌연변이를 검출함으로써 모반 및/또는 흑색종을 검출하는 능력은 임의의 다수의 용도에서 유용하다. 예를 들어, 다른 진단 방법과 함께 환자에서의 흑색종 또는 특정 유형의 흑색종을 진단하는 ep 이용할 수 있다. 이는 또한 G-단백질 또는 포스폴리파제 Cβ 또는 Gnaq에 의해 조절되는 경로의 다른 하류 성분을 표적으로 하는 치료제와 같은 치료제에 감응성인 특정 흑색종을 확인하는 데 사용할 수 있다.
Gnaq에서의 체세포 활성화 돌연변이의 검출을 이용하여 흑색종 치료의 효능을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 항암 치료 후의 Gnaq 활성, 예를 들어 Gα 활성, 또는 Ga 활성 또는 Gnaq에서의 서열 돌연변이를 갖는 멜라닌 세포의 수에 의존적인 포스폴리파제 Cβ와 같은 활성의 수준은 상기 치료 전의 수준과 비교될 수 있다. 상기 치료 후 Gnaq 활성, 예를 들어 포스폴리아제 Cβ 활성의 수준의 감소, 또는 돌연변이된 Gnaq를 갖는 흑색종 세포 수의 감소는 효과적인 치료를 나타낸다.
Gnaq 활성의 수준 및/또는 Gnaq에서 체세포 돌연변이를 갖는 세포 수의 변화는 특정 항흑색종 요법의 효능 또는 관찰된 예후적 결과와 통계적으로 상호관련되며, 이로써 통계 기반의 예후 상의 데이타베이스의 확장 또는 가장 효과적인 치료의 선택이 Gnaq 돌연변이의 특정 수준의 활성 또는 진단적 존재의 관점에서 가능하다.
Gnag에서 활성화 돌연변이를 갖는 세포의 검출은 환자 내의 흑색종 세포의 수 또는 위치를 모니터링하는 데, 예를 들어 시간에 따른 암의 진전을 모니터링하는 데 유용할 수 있다.
Gnaq에서 활성화 돌연변이가 존재한다는 것은 또한 돌연변이체 Gnaq를 표적으로 하는 치료제에 반응하기 쉬운 흑색종을 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 Gnaq에 활성화 돌연변이를 갖는 멜라닌 세포 신생물, 예를 들어 포도막 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 악성 청색 모반 또는 만성 일광 손상을 갖는 피부 상의 흑색종을 Gα 길항제, 예를 들어 항체, 펩티드, 소분자 억제제, 예컨대 L-트레오-디히드로스핀고신(PKC 특이적 억제제) 또는 기타 소분자 억제제, Gnaq의 핵산 억제제 및 포스폴리파제 Cβ를 투여하여 치료하는 방법, 또는 Gnaq에 의한 조절되는 하류 경로를 제공한다. 이러한 멜라닌 세포 신생물은 본 원에서 기술되는 방법을 이용하여 활성화 돌연변이의 존재를 분석함으로써 확인할 수 있다.
모반 내 Gnaq에서의 활성화 돌연변이의 존재는 흔히 흑색종 진전의 위험이 있는 모반, 예를 들어 통상 유형의 청색 모반 및 Ota의 모반을 의미한다. 따라서, 환자로부터의 모반은 본 원에서 기술된 방법을 이용하여 활성화 돌연변이의 존재에 대해 평가할 수 있다.
정의
용어 'Gnaq'란 구아닌 누클레오티드 결합 단백질(G 단백질)의 알파 서브유닛을 의미한다. 상기 용어는 핵산 및 폴리펩티드 다형 변이체, 대립 유전자, 돌연변이 및 Gnaq의 단편을 포괄한다. 이러한 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 인간 Gnaq 서열은 NCBI 뉴클레오티드 데이타베이스(뉴클레오티드 서열)의 참조 서열 NM_002072 및 접속 번호 NP_002063.2(폴리펩티드 서열) 하에서 이용가능하다. 서열 NM_002072는 예시적 뉴클레오티드 서열로서 서열 확인 번호: 1로 제공된다. 예시적 폴리펩티드 서열은 서열 확인 번호: 2에 제시되어 있다.
본 원과 관련하여 사용되는 'Gnaq 의존성 흑색종'은 돌연변이를 갖지 않는 멜라닌 세포에 비해 Gnaq를 활성시키는 Gnaq 내의 결함('돌연변이'라고도 일컬음)을 갖고, 즉, '활성' 돌연변이를 갖고, 변이체 Gα 서브유닛의 GTP 가수분해 활성을 손실시키거나 감소시키는 흑색종 세포를 포함하는 멜라닌 세포 신생물을 의미한다. Gnaq 내의 상기 결함은 단백질의 구조적 활성을 유도하는 돌연변이, 예를 들어 치환 돌연변이를 포함할 수 있다. 'Gnaq 의존성 흑색종 세포'는 1 이상의 이러한 돌연변이를 가질 수 있고, 예를 들어 상기 세포는 Q209을 포함하는 체세포 치환 돌연변이를 가질 수 있다. 본 발명의 'Gnaq 의존성 흑색종'은, 예를 들어 일광 노출된 피부 부위, 모반(예를 들어, 청색 모반) 또는 안구(예를 들어, 포도막)로부터 발생할 수 있다. 'Ganq 의존성 흑색종'은 또한 Gnaq 이외에 유전자에서 돌연변이를 가질 수 있다.
본 발명의 내용에서, '선단 흑색종'이란 손바닥 또는 발바닥의 또는 손톱 하의 털을 갖지 않는 피부 상에서 발생하는 흑생종을 의미한다. 선단 흑색종의 하위집단이 '선단 흑자성 흑색종'이다.
용어 '점막 흑색종'은 점막 상에서 발생하는 종양을 의미하고; 본 원에서 사용되는 '안구 흑색종'은 눈으로부터 발생하는 흑색종이다. '안구 흑색종'은 포도막 및 결막 흑색종을 포함한다. '결막 흑색종'은 결막 상에서 발생하는 흑색종을 의미하는 반면에, '포도막 흑색종'은 눈의 착색된 관의 흑색종을 의미한다.
본 원에서 사용되는 'CDS 흑색종'은 만성적 일광 유도 손상을 갖는 피부로부터 발생하는 흑색종을 의미하고; 본 원에서 사용되는 'NCDS 흑색종'은 만성 일광 유도된 손상이 없는 피부로부터 발생하는 흑색종을 의미한다. 본 원에서의 'CSD' 및 'NCSD' 군 사이의 구분은 흑색종 주위의 진피의 현저한 일광 탄력섬유증의 존재 또는 부재의 현미경 측정을 기반으로 한다. 모든 그러나 일부 경우에서, 만성적인 일광 유도된 손상(CSD)과 관련된 흑색종은 얼굴 및 말단 사지, 예컨대 팔뚝, 손등, 정강이 및 종아리 상에서 발생한다. 이들 흑색종은 전형적으로 50 세 이상의 개인에서 발생하고, 미시적으로는 멜라닌 세포가 소(nest)보다는 단독의 유닛으로서 배열되는 상피내 성분을 가진다. 또한, 상기 흑색종은 망상 돌기(rete ridge)가 제거된 위축성 상피를 갖는 경향이 있다. CSD 흑색종의 하위군은 악성 흑자 흑생종이다. 대조적으로, 만성 일광 유도된 손상(NCSD)와 관련되지 않은 흑색종은 몸통 및 인접 말단, 예컨대 넓적 다리 및 상박 상에서 발생한다. NCSD 흑색종은 전형적으로 멜라민 세포가 단독 유닛보다는 소로서 배열되는 상피내 성분을 나타내고 상당한 상향 산란(upward scatter)(파젯형 분산(pagetoid spread))을 나타낸다. 많은 NCSD 흑색종은 표재 확장성 흑색종이다.
만성 일광 유도된 손상은 CSD 2보다 높은 CSD 스코어를 갖는 것으로서 정의된다. 상기 스코어는 하기 시스템을 이용하여 100∼200x 배율에서 상기 흑색종 주위의 정상 피부의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 부분 상의 일광 탄력섬유증의 정도를 측정하여 수득하며(Landi et at, Science 2006), 이의 예는 도 1에 제공된다:
CSD 0: 탄성 섬유의 부재 ; CSD 0+: 200x 배율에서만 식별가능한 드문 탄성 섬유;
CSD 1: 콜라겐 다발 사이에 부셸(bushel)로서가 아닌 개별 단위로서 위치하는 산란된 탄성 섬유; '-' 또는 '+' 분류자를 사용하여 탄성 섬유가 거의 없거나 밀도 있게 산란되어 있는지를 나타내었다.
CSD 2: 개별단위로서보다는 부셸로서 주로 분포된 밀도 있게 산란되어 있는 탄성 섬유; '-' 분류자를 사용하여 부셸이 존재하나 탄성 섬유가 개별 단위로서 우세하게 분산되어 있다는 것을 나타내며; '+' 분류자는 부셸의 보다 큰 응집체가 형성되나 비결정질 침착물의 형성 대신에 개별적인 부셸의 외형이 보존되는 경우에 사용하였다;
CSD 3: 섬유 직물이 손실된 청회색 물질의 비결정질 침착물; '-' 비결정질 침착물의 초점만 형성; '+' 분산 호기성 물질의 매우 큰 응집체.
본 원에서 사용되는 바와 같이, 부위, 예를 들어 선단 피부, 점막, 포도막, 결절 또는 만성 일광 유도된 손상을 갖는 피부로부터 용어 '흑색종이 발생한다는 것을 측정하는 것'은 흑색종의 발생 부위를 확인하는 것을 의미한다. 이러한 측정은 환자를 육안 검사하거나 흑색종을 병리학적으로 평가하여 실시할 수 있다.
동물에서의 용어 '종양' 또는 '암'은 특성, 예컨대 비제어된 증식, 불멸, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도 및 특정 특징적인 형태 특성을 비롯한 비전형적인 성장 또는 형태를 갖는 세포의 존재를 의미한다. 흔히, 암 세포는 종양의 형태로 존재하게 되지만, 이러한 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수 있다. '종양'은 양성 및 악성의 신생물 둘 모두를 포함한다. 용어 '신생의'란 양성 및 악성의 비전형적인 성장 둘 모두를 의미한다.
본 원에서 사용되는 바와 같은 용어 '멜라닌 세포 신생물'은 주위 조직에 비해 과다착색된 영역을 의미한다. 멜라닌 세포 신생물은 모반 및 원발성 흑색종뿐만 아니라 체내 임의의 장소로 전이된 흑색종을 포함한다. 전형적으로, 멜라닌 세포 신생물은 피부, 점막 및 눈에 발생한다. 비한정적인 예의 멜라닌 세포 신생물은 흑색종, 예를 들어 선단 흑자성 흑색종, CSD 흑색종, NCSD 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 결체조직 흑색종, 포도막 흑색종, 결막 흑색종, 재발성 세포 청색 모반, 선천성 모반, 악성 청색 모반 및 전이에서 발생하는 흑색종을 포함할 수 있다. 본 원에서 사용되는 멜라닌 세포 신생물은 또한 모반을 포함한다. 예를 들어, 본 원에서 사용되는 멜라닌 세포 신생물의 비한정적인 예로는 선천성 모반, 작은 혹을 갖는 선천성 모반, 결제 조직 반응을 갖는 선천성 모반, 비정형 증식을 갖는 큰 선천성 모반, 작은 혹을 갖는 큰 선천성 모반, 특정 진단이 없는 선천성 모반, 청색 모반, 비전형적인 청색 모반, 비전형적인 세포성 청색 모반, 뉴로크리스틱 과오종을 갖는 청색 모반, 특정 진단이 없는 청색 모반 및 특정 진단이 없는 심부 관통 모반을 들 수 있다.
본 원에서 사용되는 바와 같은 용어 '청색 모반' 또는 '청색 모반'은 진피 내, 즉, 피부의 진피층 내의, 모반이 전형적으로 청색을 띄도록 증가된 착색을 나타내는 멜라닌 세포성 증식을 의미한다. 선천적이거나 후천적일 수 있는 청색 모반은 개별 청색을 띄는 사마귀(청색 모반)에서 결막 및 안구주위 피부(Ota의 모반), 어깨(Ito의 모반) 및 등 하부(몽골반)에 영향을 미치는 큰 청회색 패치까지의 다양한 방식으로 존재할 수 있다.
본 원에서 사용되는 '생물학적 샘플'이란 흑색종를 갖는 것으로 의심되거나 이를 갖는 환자로부터 얻은 샘플을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 조직 생체 검사일 수 있으며, 이는 임의 유형의 생체 검사, 예컨대 바늘 생체 검사, 미세 바늘 생체 검사, 수술 검사 등을 의미한다. 상기 샘플을 전형적으로 신생물 또는 의심되는 신생물질을 보유하는 피부 조직 샘플을 포함하는 반면에, 생물학적 샘플은 또한 다른 부위, 예를 들어 흑색종이 전이할 수 있는 부위로부터 또는 혈액으로부터 유도될 수 있다. 일부 경우에서, 생물학적 샘플은 또한 신생물 또는 의심되는 신생물에 인접하는 부위로부터 존재할 수 있다.
'생물학적 샘플을 제공함'이란 본 발명에서 기술된 방법에서 사용하기 위한 생물학적 샘플을 얻는다는 것을 의미한다. 가장 흔히, 이는 환자로부터 세포의 샘플을 제거함으로써 실시하게 되지만, 또한 이미 단리된 세포(예를 들어, 다른 시간에 및/또는 다른 목적으로 다른 사람에 의해 단리됨)를 이용하거나, 또는 생체 내에서 본 발명의 방법을 실시함으로써 이룰 수 있다. 치료 또는 성과 이력을 갖는 기록 조직을 이용할 수 있다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 '동일한' 또는 백분율 '동일율'이란 하기 기술되는 초기 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리듬을 이용하거나, 또는 정렬 또는 육안 검사(예를 들어, NCBI 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)에 의해 측정하여 동일하거나 동일한(즉, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸친 최대 상호 반응에 대해서 비교되거나 정렬되는 경우에 특정 부위에 걸친 동일율이 약 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상임) 아미노산 잔류물 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 가지는 2 이상의 서열 또는 후속서열을 의미한다. 이어서, 이러한 서열은 '실질적으로 동일하다'라고 언급된다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 완료를 의미하거나 또는 이에 적용될 수 있다. 상기 정의는 또한 삭제 및/또는 첨가를 갖는 서열뿐만 아니라, 치환뿐만아니라 자연적으로 발생하는, 예를 들어 다형 또는 대립 유전자 변이체 및 인조 변이체를 갖는 것을 포함한다. 하기 기술되는 바와 같이, 바람직한 알고리듬은 갭 등에 대해 설명할 수 있다. 바람직하게는 동일성은 길이 약 25개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 부위, 더욱 바람직하게는 길이 50∼100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 부위에 걸쳐 존재한다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 핵산 프로브는 서열 확인 번호: 1의 인접 부위에 대한 서열 동일율이 85%, 전형적으로 90% 또는 95% 이상일 수 있다.
서열 비교를 위해 전형적으로 1 서열이 참조 서열로서 역할하며, 이에 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리듬을 이용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 서열 위치를 지정하며, 서열 알고리듬 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게는, 초기 프로그램 파라미터를 사용할 수 있고, 또는 대안적인 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 상기 서열 비교 알고리듬은 프로그램 파라미터를 기준으로 참조 서열과 관련하여 시험 서열에 대한 백분율 서열 동일율을 계산한다.
본 원에서 사용되는 '비교 윈도우'는 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 인접 위치의 동일 수의 참조 서열과 서열을 비교하는 20∼600, 일반적으로 약 50 ∼ 약 200, 더욱 일반적으로 약 100 ∼ 약 150으로 구성된 군으로부터 선택되는 인접 위치의 수 중 하나의 부분에 대한 참조를 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부 상동성 알고리듬에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리듬에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat 7. Acad. Sa. USA 85:2444 (1988)]의 유사도 방법에 대한 연구에 의해, 상기 알고리듬들(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터화된 실시에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 실시할 수 있다.
백분율 서열 동일율 및 서열 유사도를 측정하는 데 적합한 알고리듬의 바람직한 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이 있으며, 이는 문헌[Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) and Altschul et al, J. MoL BwI. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, BLAST 및 BLAST 2.0은 초기 파라미터와 사용하여 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 백분율 서열 동일율을 측정한다. BLAST 분석 실행을 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)를 통해 공개적으로 이용가능하다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열)은 초기값으로서 단어길이(W) 11, 기대값(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=-4 및 스트랜드 둘 모두의 비교를 이용한다. 아미노산(단백질) 서열, BLASTP 프로그램은 초기값으로서 단어길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조)를 이용한다. 본 발명의 목적을 위해, BLAST2.0 알고리듬을 초기 파라미터로 필터 없이 사용한다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 명시는, 하기 기술되는 바와 같이 제1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대향하여 발생하는 항체와 면역학적으로 교차반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는, 예를 들어 2개의 펩티드가 단지 보존 치환에 의해서 다른 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 것이 전형적이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 명시는 하기 기술되는 바와 같이 2개의 분자 또는 이의 보체가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일한 또다른 명시는 동일한 프라이머가 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있다는 것이다.
용어 '단리된', '정제된' 또는 '생물학적으로 순수한'이란 원 상태에서 발견되었을 대 일반적으로 동반하는 성분이 상당히 또는 실질적으로 없는 물질을 의미한다. 순도 및 균일도는 전형적으로 분석 화학 기법, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 측정한다. 제조 시 존재하는 주된 화학종 단백질 또는 핵산이 상당히 정제된다. 특히, 단리된 핵산은 유전자를 자연적으로 프랭킹 처리하고, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질 이외에 단백질을 인코딩하는 일부 개방형 판독 프레임으로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 용어 '정제된'이란 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 한 밴드를 발생시킨다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 이는 핵산 또는 단백질이 순도가 85% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 99% 이상이라는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서 '정제하다' 또는 정제'는 정제되는 조성물로부터 1 이상의 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 이와 관련해서, 정제는 정제된 화합물이 균일하다는, 예를 들어 100% 순도라는 것을 요구하지 않는다.
용어 '폴리펩티드', '펩티드' 및 '단백질'은 본 원에서 상호교환적으로 사용되어 아미노산 잔류물의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1 이상의 아미노산 잔류물이 상응하는 자연 발생 아미노산의 인조 화학 의태제인 아미노산 중합체뿐만 아니라, 자연 발생의 아미노산 중합체, 개질된 잔류물을 함유하는 것, 및 비자연 발생의 아미노산 중합체에 적용한다.
용어 '아미노산'은 자연 발생 및 합성 아미노산분만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사하게 작용하는 아미노산 동족체 및 아미노산 의태체를 의미한다. 자연 발생의 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 것뿐만 아니라 이후 개질되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 동족체는 자연 발생의 아미노산과 동일한 염기성 화학 구조체, 예를 들어 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 이러한 동족체는 개질된 R 기(예를 들어, 노르루신) 또는 개질된 펩티드 주쇄를 가질 수 있으나, 자연 발생의 아미노산과 동일한 염기성 화학 구조를 유지한다. 아미노산 의태체는 아미노산의 일반적이 화학 구조와는 상이한 구조를 가지나 자연 발생의 아미노산과 유사한 작용을 하는 화학적 화합물을 의미한다.
아미노산은 이의 일반적으로 알려진 3개의 문자 기호에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천된 1개의 문자 기호에 의해 본 원에서 언급될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 이의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 언급될 수 있다.
'보전적으로 개질된 변이체'는 아미노산 및 핵산 서열에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 개질된 변이체는 동일하거나 실질적으로 동일한 아민노산 서열을 인코팅하거나, 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우에 동일하거나 관련된, 예를 들어 자연적으로 인접하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 퇴화로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 대부분의 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 모두 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특이적이게 되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩티드의 변경 없이 기술된 상응하는 코돈의 또다른 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 개질된 변이 중 하나의 종류인 '사일런트(silent) 변이'이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본 원의 모든 핵산 서열은 핵산의 사일런트 변이를 기술한다. 당업자라면 특정 내용에서 핵산 중 각각의 코돈(일반적으로 메티오닌을 위한 유일한 코돈인 AUG 및 일반적으로 트립토판을 위한 유일한 코돈인 TGG 제외)은 개질되어 기능적으로 동일한 분자를 산출할 수 있다. 따라서, 흔히 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 사일런트 변이는 실질적인 프로브 서열과 관련하지 않고 발현 생성물과 관련하여 기술된 서열에 내재된다.
아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 인코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경, 추가 또는 삭제하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 삭제 또는 추가는 상기 변경이 화학적으로 유사한 아미노산의 치환을 유도하는 '보존적인 개질된 변이'이라는 것을 인지하게 된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 테이블은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 개질된 변이는 본 발명의 서로간의 전형적인 보존적 치환의 다형적 변이체, 이종간 동족체 및 대립 유전자 이외의 것이며 이를 배제하지 않는다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소루신 (I), 루신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
본 원에서 사용되는 '핵산' 또는 '올리고뉴클레오티드' 또는 '폴리뉴클레오티드' 또는 문법적 동등물은 서로 공류결합된 2 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레오티드의 길이가 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상에서 약 100 이하이다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 보다 긴 길이, 예를 들어 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000 등을 포함하는 임의의 길이의 중합체이다. 본 발명의 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하게 되나, 일부 경우에서 대안적인 주쇄, 예컨대 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 O-메틸포포로아미다이트 결합(문헌[Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press] 참조); 및 펩티드 핵산 주쇄 및 결합을 가질 수 있는 핵산 동족체가 포함된다. 또다른 동족체 핵산은 양성 주쇄; 비이온성 주쇄 및 비리보스(non-ribose) 주쇄를 갖는 것, 예컨대 U.S. 특허 5,235,033호 및 5,034,506호 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.]에서 기술된 것을 포함한다. 1 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산은 또한 핵산의 한 정의 내에 포함된다. 리보스-포스페이트 주쇄의 개질은 다양한 이유에서, 예를 들어 생리학적 환경에서의 이러한 분자의 또는 바이오칩 상의 프로브로서의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 실시할 수 있다. 자연 발생 핵산과 동족체의 혼합물이 제조될 수 있으며; 대안적으로 상이한 핵산 동족체들의 혼합물 및 자연 발생 핵산과 동족체의 혼합물이 제조될 수 있다.
다양한 참조물이 이러한 핵산 동족체, 예컨대 포스포라미데이트(Beaucage et al, Tetrahedron 49(10): 1925 (1993) and references therein; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); and Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 91986)), 포스포로티오에이트(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); and U.S. Patent No. 5,644,048), 포스포로디티오에이트(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989), 0-메틸포포로아미다이트 결합(문헌[Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press] 참조), 및 펩티드 핵산 주쇄 및 결합(문헌[Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)] 참조, 이들 모두는 참조 인용됨)를 개시한다. 다른 동족체 핵산은 양성 주쇄(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)); 비이온성 주쇄(U.S. 특허 5,386,023호, 5,637,684호, 5,602,240호, 5,216,141호 및 4,469,863호; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) 및 비리보스 주쇄, 예컨대 U.S. 특허 5,235,033호 및 5,034,506호 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook]에 기술된 것을 포함하는 것을 포함한다. 1 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 한 정의 내에 포함된다(문헌[Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176] 참조). 다수의 핵산 동족체가 문헌[Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35]에 기술되어 있다. 이들 참조문헌 모두는 본 원에서 특히 참조 인용된다.
다른 동족체는 펩티드 핵산 동족체인 펩티드 핵산(PNA)를 포함한다. 이들 주쇄는 자연 발생 핵산의 높게 하전된 포스포디에스테르 주쇄와 대조적으로 중성 조건 하에서 실질적으로 비이온성이다. 이는 2가지 이점을 유도한다. 우선, PNA 주쇄는 향상된 혼성화 역학을 나타낸다. PNA는 매칭되지 않은 염기쌍 대 완전히 매칭되는 염기쌍에 대한 융점(Tm)에서 큰 변화가 있다. DNA 및 RNA는 전형적으로 내부 비매칭에 있어서 Tm이 2∼4℃ 하강함을 나타낸다. 비이온성 RNA 주쇄에 있어서, 상기 강하는 7∼9℃에 가깝다. 유사하게는, 이의 이온성 특성으로 인해, 상기 주쇄에 결합된 염기의 혼성화는 염 농도에 대해서 상대적으로 덜 감응성이다. 또한, PNA는 세포 효소에 의해 분해되지 않으며, 따라서 더욱 안정할 수 있다.
핵산은 명시되는 바와 같이 단일 또는 이중 스트랜드 처리될 수 있거나, 이중 또는 단일 스트랜드 처리된 서열 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다. 당업자에게 이해되게 되는 바와 같이, 단일 스트랜드의 묘사는 상보적 스트랜드의 서열을 정의하며; 따라서 본 원에서 기술되는 서열은 또한 서열의 보체를 제공한다. 달리 명시되지 않는 경우, 특정 핵산 서열이 또한 이의 보존적으로 개질된 변이체(예를 들어, 저감된 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명백히 명시된 서열을 내재적으로 포괄한다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 모두, RNA 또는 잡종일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 우데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 히포크산틴, 이소시토신, 이소구아닌 등을 비롯한 염기들의 조합을 함유할 수 있다. '전사'는 전형적으로 자연 발생 RNA, 예를 들어 예비 mRNA, hnRNA 또는 mRNA를 의미한다. 본 원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '뉴클레오시드'는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 동족체 및 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 아미노 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 또한, '뉴클레오시드'는 비자연적 발생 동족체 구조를 포함한다. 따라서, 예를 들어 각각 염기를 함유하는 펩티드 핵산의 개별 단위가 본 원에서 뉴클레오시드라고 언급된다.
'라벨' 또는 '검출이능한 부분'이란 적외선분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 화학 또는 기타 물리적 방법에 의해 검출할 수 있는 조성물이다. 예를 들어, 유용한 라벨은 32P, 형광 염료, 고전자밀도 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 일반적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌 또는 합텐 및 단백질 또는 예를 들어 라디오라벨을 펩티드에 일체화시킴으로써 검출이능하게 하거나, 펩티드에 특이적으로 반응하는 항체를 검출하는 데 사용할 수 있는 기타 실체를 포함한다. 상기 라벨은 임의의 위치의 KIT 핵산, 단백질 및 항체에 일체화될 수 있다. 항체를 라벨에 컨쥬게이트화시키는 것에 대해서 당업계에 공지된 임의의 방법은, 예를 들어 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego]에 기술된 방법을 사용하여 적용할 수 있다.
'라벨 처리된 핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드'는 프로브의 존재가 프로브에 결합된 라벨의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있도록 라벨에 결합 또는 화학적 결합을 통해 공유 결합으로, 또는 이온성, 반 데르 발스, 정전기 또는 수소 결합을 통해 비공유 결합으로 결합되는 것이다. 대안적으로, 고친화도의 상호 반응을 이용한 방법은 결합 파트너의 중 하나, 예를 들어 비오틴, 스트렙타비딘이 서로 결합하는 경우의 동일한 결과를 달성할 수 있다.
본 원에서 사용되는 바와 같이, '핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드'는 1 이상의 유형의 화학 결합을 통해, 일반적으로 상보적 염기쌍을 통해, 일반적으로 수소 결합 형성을 통해 상보적 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 핵산으로서 정의된다. 본 원에서 사용되는 바와 같이, 프로브는 중성(즉, A, G, C 또는 T) 또는 개질된 염기(7-데아자구아노신, 이노신 등)을 포함할 수 있다. 또한, 프로브 중의 염기는 혼성화에 기능적으로 개재하지 않는 한 포스포디에스테르 결합 이외의 결합에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로브는 구성 염기가 포스포디에스테르 결합보다는 펩티드 결합에 의해 결합되는 펩티드 핵산일 수 있다. 당업자라면 상기 프로브는 혼성화 조건의 엄격성에 의존하는 프로브 서열과의 상보성이 완벽하지 않은 표적 서열과 결합할 수 있다. 상기 프로브는 동위원소, 발색단, 루미포어, 색소원과와 같이 직접 라벨 처리되거나, 스트렙타비딘 착물이 후에 결합될 수 있는 비오틴과와 같이 간접적으로 라벨 처리되는 것이 바람직하다. 프로브의 존재 또는 부재를 분석함으로써, 선택 서열 또는 후속 서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 진단 또는 예후는 게놈 수준 또는 RNA 또는 단백질 발현의 수준에서 기준 처리될 수 있다.
예를 들어, 세포 또는 핵산 단백질 또는 벡터에 참조하여 사용되는 경우의 용어 '재조합형'이란 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 기존 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 개질되었거나, 세포가 상기와 같이 개질된 세포로부터 유도된다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어 재조합형 세포는 세포의 기존(비재조합형) 형태 내에서 확인되지 않는 유전자를 발현시키거나, 다른 경우에 비정상적으로 발현되거나, 저발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 기존 유전자를 발현시킨다. 상기 용어에 의해, '재조합형 핵산'은 본 원에서 일반적으로, 예를 들어 자연에서 정상적으로 확인되지 않는 형태의 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 이용하여 핵산을 조작함으로써 시초에 시험관 내에서 형성되는 핵산을 의미한다. 유사하게는, '재조합형 단백질'은 재조합형 기술을 이용하여, 즉, 상기 기술된 바와 같이 재조합형 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다.
문구 '선택적으로 (또는 특이적으로) 혼성화시킨다'는 것은 분자를 특정 뉴클레오티드 서열로 그 서열이 혼합물로 존재하는 경우의 엄격한 혼성화 조건(예를 들어, 총 세포성 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA, 증폭 반응) 하에 결합시키거나 중복화시키거나 혼성화시켜 특정 뉴클레오티드 서열로의 분자의 결합이 혼합물 중의 뉴클레오티드 서열의 존재의 결정 요인이 되도록 한다는 것을 의미한다.
문구 '엄격한 혼성화 조건'이란 다른 서열이 아니 핵산의 착물 혼합물에서 전형적으로 이의 표적 서열을 프로브가 혼성화시키게 되는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며, 상이한 상황에서 상이하게 된다. 보다 긴 서열이 특히 보다 높은 온도에서 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 추가적인 지침은 문헌[Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of Nucleic acid assays" (1993)]에서 확인된다. 일반적으로 엄격한 조건은 한정된 이온성 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm)보다 약 5∼10℃ 낮게 되도록 선택된다. 상기 Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가가 평형에서 표적 서열로 혼성화되는(표적 서열이 과량으로 존재하는 경우, Tm에서 프로브의 50%가 평형에 해당됨) 온도이다(한정된 이온성 강도, pH 및 핵산 농도 하에서임). 엄격한 조건은 pH 7.0∼8.3에서 염 농도가 나트륨 이온 농도로 약 1.0 M 이하, 전형적으로 약 0.01∼1.0 M이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들어 10∼50 뉴클레오티드)에 대해서 약 30℃이고, 긴 프로브(예를 들어 50 뉴클레오티드 초과)에 대해서 약 60℃인 것이 된다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제를 첨가하여 달성할 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해서, 양성 신호는 2회 이상, 바람직하게는 10 회의 백그라운드 혼성화가다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5x SSC 및 1% SDS, 42℃에서의 항온 처리, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서의 항온 처리, 65℃의 0.2x SSC 및 0.1% SDS에서 세척 동반. PCR를 위해서, 약 36℃의 온도가 낮은 엄격한 증폭에 전형적이지만, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 및 48℃에서 변할 수 있다. 높은 언중도의 PCR 중폭을 위해서, 약 62℃의 온도가 전형적이지만, 높은 엄격도의 어닐링 온도는 프라이머의 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ ∼ 약 65℃의 범위에 있을 수 있다. 높은 엄격도의 및 낮은 엄격도의 증폭 둘 모두를 위한 전형적인 조건은 30 초 ∼ 2 분 동안 90∼95℃의 변성 상태, 30 초 ∼ 2 분 동안 지속되는 어닐링 상태 및 1∼2 분 동안 약 72℃의 신장 상태를 포함한다. 낮은 엄격도 및 높은 엄격도의 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 지침이, 예를 들어 문헌[Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications , Academic Press, Inc. N.Y.]에서 제공된다.
엄격한 조건 하에서 서로 혼성화하지 않는 핵산은 인코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우에 여전히 실질적으로 동일하다. 이는, 예를 들어 핵산의 복제가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴화의 이용으로 생성되는 경우에 발생한다. 이러한 경우, 핵산은 전형적으로 적당히 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화한다. 예시적인 '적당히 엄격한 혼성화 조건'은 37℃에서의 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충액 및 45℃에서의 IX SSC의 세척액에서의 혼성화를 포함한다. 양성의 혼성화는 2회 이상의 백그라운드이다. 당업자라면 대안적인 혼성화 및 제척 조건을 이용하여 유사한 엄격도의 조건을 제공할 수 있다는 것을 용이하게 인지하게 된다. 혼성화 파라미터를 결정하는 데 추가적인 지침은 다양한 참조 문헌, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.]에 제공되어 있다.
Gnaq 단백질의 활성을 억제하는 화합물의 시험을 위한 분석과 관련한 문구 '기능적 효과'는 Gnaq 단백질 또는 핵산의 영향, 예를 들어 기능적, 물리적 또는 화학적 효과, 예컨대 종양 형성을 감소시키거나 GTP 가수 분해 효과 활성을 변경하는 능력 하에 간접적 또는 직접적인 파라미터의 측정을 포함한다. Gnaq의 활성 또는 기능적 효과는 단백질-단백질 상호반응 작용, 예를 들어 항체 또는 기타 단백질을 이들이 상호반응하는 것과 결합시키는 Gnaq의 능력; GTP 가수 분해 효소 활성, GTP 및/또는 GDP를 결합시키는 Gnaq의 능력; 성장의 접착 억제 및 밀도 제한; 세포 증식; 세포 변형; 착색 변화; 성장 인자 또는 혈청 의존성; 종양 특이정 마커 수준; Matrigel으로의 침투성; 모델 시스템에서의 종양 성장 및 종양 '수취'의 측정을 포함하는 생체 내 종양 성장 및 전이; 전이 및 암 세포의 기타 특성을 거치는 것을 포함하는 세포에서의 mRNA 및 단백질 발현을 포함할 수 있다. '기능적 효과'는 시험관 내, 생체 내 및 생체 외 활성을 포함한다.
본 원에서 사용되는 바와 같이, Gnaq의 '억제제' 또는 '길항제'(예를 들어, 'Gnaq 길항제')란, 예를 들어 결합되거나, 일부 또는 전부 활성을 차단하거나, 활성화를 감소, 방지, 지연시키거나, Gnaq 단백질, 포스폴리파제 Cβ, 또는 Gnaq에 의해 조절되는 하류 분자, 예를 들어 단백질 키나제 C(PKC)의 활성 또는 발현을 비활성화, 감감응화 또는 하향 조절하는 조절 분자 또는 화합물을 의미한다. 억제제는 siRNA 또는 안티센스 RNA Gnaq 단백질의 유전적으로 개질된 형태, 예를 들어 변경된 활성뿐만 아니라 자연 발생 및 합성 Gnaq 길항제, 항체, 화학적 소분자 등을 갖는 형태를 포함할 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 Gnaq 억제제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명과 사용하는 데 적합한 비한정적인 예시적 억제제는 PKC의 억제제, 예를 들어 상대적으로 비특이적인 PKC 억제제 스타우로스포린, 스타우로스포린 동족체 CPG41251, 브리오스타틴-1, KAI-9803, 7-히드록시스타우로스포린, L-트레오-디히드로스핀고신(사핀골), 비선택적 PKC 억제제 (PKC412), 일모포신 (BM 41 440), PKCμ를 포함하는 통상의 PKC 이소폼의 더욱 특이적인 억제제인 인돌카르바졸 Goe796, PKC-알파 안티센스 억제제 LY900003, 및 PKC-베타 억제제 LY333531, LY317615(엔자스타우린)을 포함할 수 있다. PKC-알파 mRNA 저감에 사용하는 데 적합한 예시적인 안티센스 분자로는 5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3 '(서열 확인 번호: 3)가 있다. 포스폴리파제 Cβ의 비한정적인 예시적 억제제는 에델포신 및 플루비루신 B[2]를 포함할 수 있다. 기타 억제제를 확인하기 위한 분석은 시험관 내 또는 생체 내, 예를 들어 세포, 또는 세포막에서 시험 억제제 화합물을 적용한 후, 상기 기능적 효과를 활성 상에서 측정함으로써 실시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 잠재적인 억제제에 의해 처리된 Gnaq 단백질을 포함하는 샘플 또는 분석은 상기 억제제가 없는 대조 샘플과 비교하여 활성 상의 효과를 검사한다. 전형적으로 Gnaq 전이를 갖고 억제제에 의해 미처리된 대조 샘플, 예를 들어 흑색종 세포는 상대적인 단백질 활성 값이 100%으로 정해진다. Gnaq의 억제는 대조군에 대한 활성 값이 적어도 20%, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 75∼100% 또는 그 이상으로 변하는 경우에 달성된다. 일부 실시양태에서, 억제제는 특정 활성, 예컨대 GTP 가수분해를 활성화시키게되나, 순수 효과는, 예를 들어 활성화된 Gnaq를 깆는 대조군에 비해 Gnaq의 활성은 감소하게 된다.
문구 '세포 성장의 변화'는 시험관 내 또는 생체 내에서의 세포 성장 및 증식 특성의 임의의 변화, 예를 들어, 병소 형성, 부착 독립성, 반고체 또는 연질 우무 성장, 성장의 접촉 억제 및 일도 제한에서의 변화, 성장 인자 또는 혈성 요건의 손실, 세포 형태의 변화, 불멸화 수득 또는 상실, 종양 특이적 마커의 수득 또는 상실, 적합한 동물 숙주에 주사시 종양 형성 또는 억제 능력, 및/또는 세포의 불멸화를 의미한다. 문헌[Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 (3rd ed. 1994)] 참조.
본 원에서 사용되는 바와 같이, '항체'는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자의 참조를 포함하고, 다클론성 및 단일클론성 항체 둘 모두를 포함한다. 상기 용어는 또한 유전적으로 엔지니어링 된 형태, 예컨대 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 마우스 항체) 및 이종컨쥬게이트 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 포함한다. 용어 '항체'는 또한 항원 결합능을 갖는 단편을 포함하는 항체의 항원 결합형을 포함한다(예를 들어, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rlgG). 또한, 예를 들어 문헌[Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998)] 참조. 상기 용어는 또한 재조합형 단일 사슬 Fv 단편(scFv)를 의미한다. 용어 항체는 또한 2가 또는 이중특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 2가 또는 이중특이성 분자는 문헌[Kostelny et al.. (1992) J Immunol 148: 1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31: 1579, Hollinger et al, 1993, supra, Gruber et al. (1994) J Immunol :5368, Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781, Hu et al. (1996) Cancer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026, and McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301]에 기술되어 있다.
특정 항원과 면역학적으로 반응성인 항체는 파지(phage) 또는 유사한 벡터에서의 재조합형 항체의 라이브러리의 선택과 같은 재조합 방법에 의해(문헌[Huse et al, Science 246: 1275-1281 (1989); Ward et al, Nature 341:544-546 (1989); and Vaughan et al, Nature Biotech. 14:309-314 (1996)] 참조), 또는 상기 항원 또는 상기 항원을 인코딩하는 DNA에 의해 동물을 면역시킴으로써 생성할 수 있다.
전형적으로, 면역글로부린은 중쇄 및 경쇄를 사진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정 영역 및 가변 영역을 함유한다(상기 영역은 또한 '도메인'이라 알려짐). 경쇄 및 중쇄 가변성 영역은 소위 상보성 결정 영역(CDR)이라 일컬어지는 3개의 초가변성(hypervariable) 영역에 의해 중단되는 4개의 골격 영역을 함유한다.
'VH' 또는 'VH'에 대한 참조는 Fv, scFv 또는 Fab의 중쇄를 포함하는 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변성 영역을 의미한다. 'VL' 또는 'VL'에 대한 참조는 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 경쇄를 포함하는 면역글로불린 경쇄의 다변성 영역을 의미한다.
'키메라 항체'는 (a) 일정 영역 또는 이의 일부가 변경, 대체 또는 교환되어 항원 결합 부위(가변성 영역)이 상이하거나 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전혀 다른 분자, 예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등의 일정 영역에 결합되거나; 또는 (b) 가변성 영역 또는 이의 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 보유하는 가변성 영역에 의해 변경, 대체 또는 교환되는 면역글로불린 분자이다.
'인간화된 항체'는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 분자이다. 인간화된 항체는 수용체의 상보적 결정 영역(CDR)로부터의 잔류물이 소정의 특이성, 친화성 및 수용성을 갖는 비인간종(기여체 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 래빗으로부터의 잔류물에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔류물을 상응하는 비인간 잔류물에 의해 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용체 항체 또는 개입된 CDR 또는 골격체 서열에서 확인되는 잔류물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로 둘의 가변성 도메일의 실질적으로 모두를 포함하게 되며, 여기서 상기 CDR 영역의 모두 또는 실질적인 모두가 비인간성 면역글로불린의 것에 해당하며, 상기 골격(FR) 영역의 모두 또는 실질적인 모두가 인간 면역글로불린 공통 배열의 것이다. 인간화된 항체는 최적으로는 또한 면역글로부린 일정 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함하게 된다(Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). 인간화는 인간 항체의 해당 서열에 대해서 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 Winter 및 공동작업자의 방법을 따라 실질적으로 실시할 수 있다(Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 이러한 인간화된 항체는 키메라 항체이고(U.S. 특허 4,816,567호), 여기서 실질적으로 적은 온전한 인간 가변성 도메인이 비인간종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다.
용어 '완전한 인간 항체'란 인간 골격 및 일정 영역 이외에서 인간 초가변성 영역을 포함하는 면역글로불린을 의미한다. 이러한 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 방법은 박테리오파지 상에서 나타나는 인간 항체 단편의 재조합형 라이브러리(예를 들어, McCafferty et al, 1990, Nature 348:552-554; Hoogenboom & Winter, J. MoI. Biol. 227:381 (1991); and Marks et al, J. MoI Biol. 222:581 (1991)), 이스트균(Boder and Wittrup, 1997, Nat Bwtechnol 15:553-557) 또는 리보솜(Hanes and Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sa USA 94:4937-4942)의 사용을 포함한다. 유사하게는, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자 좌를 유전자 이식된 동물, 예를 들어 내생 면역글로불린 유전자가 일부 또는 전부 비활성화된 마우스에 도입함으로써 제조할 수 있다. 시도 시에, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 관점에서 인간에서 보여지는 것과 매우 유사한 인간 항체 제조가 관찰된다. 이러한 접근은, 예를 들어 U.S. 특허 6,150,584호, 5,545,807호; 5,545,806호; 5,569,825호; 5,625,126호; 5,633,425호; 5,661,016호 및 하기 과학 공개 문헌[예를 들어, Jakobavits, Adv Drug Dehv Rev. 31:33-42 (1998), Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]에 기술되어 있다.
'에피토프' 또는 '항원 결정기'는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 단백질의 3차 접음에 의해 병렬되는 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성되는 에피토프는 변성 용매에 노출될 시에 전형적으로 유지되는 반면에, 3차 접음에 의해 형성되는 에피토프는 변성 용매에 의해 처리될 시에 전형적으로 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 구조에서 3개 이상, 일반적으로 그 이상, 5개 이상 또는 8∼10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 구조를 결정하는 방법은, 예를 들어 x 선 결정학 및 2 차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)] 참조.
일반적인 재조합 방법
본 발명은, 예를 들어 스크린 분석과 같은 분석에서 사용될 수 있는 Gnaq 폴리펩티드의 제조를 위한 또는 Gnaq 검출에서 사용되는 방법을 위한 재조합 유전학 분야에서의 통상적인 기법 상의 일부에 의존한다. 본 발명에서의 일반적인 사용 방법을 개시하는 기본 원문은 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)]을 포함한다. 예를 들어, Gnaq 또는 이의 단편이 제조되게 되는 용도, 예를 들어 억제제를 검출하는 분석에 사용하기 위해서, 통상의 발현 프로코콜을 적용한다.
환자로부터의 샘플에서의 Gnaq 서열의 확인
본 발명의 한 양태에서, 활성화 돌연변이, Gnaq 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA 또는 게놈 DNA의 존재, 또는 Gnaq 단백질의 증가된 활성 및/또는 Gnaq 단백질에서의 서열 돌연변이의 존재는 모반 및/또는 흑색종 세포를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 측정된다.
일부 실시양태에서, Gnaq 핵산에서의 활성화 돌연변이가 측정된다. 주지되는 바와 같이, 인간 Gnaq 서열은 공지되어 있다. 9q21 및 mRNA 전사에 대한 Gnaq 유전자 지도는 2.188 kb이고, 이는 359 아미노산 단백질을 인코딩한다.
본 원에서 사용되는 '서열 돌연변이'는 단백질 활성의 변화를 유도하는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변화를 의미한다. 돌연변이는 뉴클레오티드 치환, 예컨대 단일 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 삭제일 수 있다. 본 발명의 멜라닌 세포 신생물의 Gnaq 돌연변이는 전형적으로 Gnaq 활성의 구조적 활성화에 이르는 활성화 돌연변이가다. 이론에 얽매임 없이, 구조적 활성은 돌연변이 Gnaq 단백질에서의 GTP 가수분해효소의 결핍으로부터 발생한다고 생각된다.
현 발명은 멜라닌 세포 신생물에 존재하는 이종 체세포 활성화 돌연변이, 예를 들어 청색 모반, Ota의 모반, 악성 청색 모반, 포도막 흑색종 및 CSD 흑색종(예를 들어, 악성 흑자 흑색종)의 발견을 부분적으로 기반으로 한다. 돌연변이는 상기 돌연변이가 Gnaq의 활성을 유도하는 Gnaq 유전자의 임의의 일부에 존재할 수 있다. 일반적인 서열 돌연변이 부위는 Q209에 존재한다. 본 원에서 확인할 수 있는 예시적 돌연변이는 표 2에 기재되어 있다. 이들 돌연변이는 CAA∼CTA, 및 CAA∼TTA(이들 둘 모두는 Q209L 치환을 유도함), CAA∼CCA(Q209P 치환 유도함), CAA∼CGA(Q209R 치환 유도함) 및 CAA∼TAT(Q209Y 치환 유도함)를 포함한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 특정 돌연변이는 핵산 서열에서의 돌연변이로부터 발생하는 아미노산 서열의 변화에 의해 일반적으로 언급된다.
본 발명에서, Gnaq 활성의 변화 수준 및/또는 Gnaq에서의 서열 돌열변이는 멜라닌 세포 신생물의 진단(또는 예후 징후)를 위해, 예를 들어 흑색종의 하위유형, 예컨대 포도막, 선단, CSD 및 악성 청색 모반뿐만 아니라, 양성 청색 모반 및 Ota의 모반의 진단을 위해 검출된다. 따라서, 멜라닌 세포 신생물을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 수득한 생물학적 샘플은 Gnaq mRNA 또는 단백질의 서열에서의 돌연변이에 대해서 분석할 수 있다. 돌연변이의 존재는 RNA, DNA 및 단백질의 샘플을 이용하여 용이하게 분석한다.
Gnaq에서의 서열 돌연변이의 검출
한 실시양태에서, Gnaq에서의 서열 돌연변이의 진단 및 예후 검출은 Gnaq에서 서열 돌연변이를 갖는 생물학적 샘플에서의 세포의 수를 측정함으로써 실시한다. 특정 유전자의 서열을 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 특히 혼성화 및 증폭 기반의 분석을 포함한다. 본 발명의 Gnaq에서의 서열 돌연변이는 돌연변이 서열로 선택적으로 혼성화시키는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서의 Gnaq 서열 돌연변이는 인시츄 혼성화, 예를 들어 형광 인시츄 혼성화에 의해 측정한다. 계내 혼성화 분석을 공지되어 있다(예를 들어, Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649). 이러한 용도에 사용되는 프로브는 돌연변이를 함유하는 Gnaq 서열의 영역으로 특이적으로 혼성화한다. 바람직한 프로브는, 업중한 조건 하에서 표적 핵산(들)과 특이적으로 혼성화하기 위해서, 충분하게 긴, 예를 들어 약 10, 15 또는 20개의 뉴클레오티드 내지 약 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다.
다수의 다른 혼성화 기반의 분석 중 임의의 것을 사용하여 생물학적 샘플의 세포 중 Gnaq에서의 서열 돌연변이를 검출할 수 있다. 예를 들어, 도트 블롯, 정렬 기반의 분석 등을 사용하여 Gnaq 서열 돌연변이를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 증폭 기반의 분석을 사용하여 Gnaq에서의 서열 돌연변이를 검출하거나 Gnaq 전사의 수준을 측정한다. 이러한 분석에서, Gnaq 핵산 서열은 증폭 반응에서 주형(template)으로서 작용한다(예를 들어, 폴리머라제 사슬 반응 또는 PCR). 예시적 증폭 기반의 분석은 당업자에게 공지된 RT-PCR 방법을 포함할 수 있다(예를 들어, Ausubel et al. , supra 참조). 정량 증폭 방법을 비롯하여 DNA 및 RNA의 PCR을 위한 상세한 프로토콜은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.; and Ausubel and Russell & Sambrook, both supra] 참조). Gnaq에 대한 공지된 핵산 서열(예를 들어, 서열 확인 번호: 1 참조)는 당업자가 유전자의 임의의 부분을 증폭하도록 프라이머를 통상적으로 선택할 수 있기에 충분하다. 특정 서열의 증폭을 위한 적합한 프라이머는 당업계에 공지된 원칙을 이용하여 고안할 수 있다(예를 들어, 문헌[Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)] 참조).
기타 적합한 증폭 방법은 비한정적으로 리가제 사슬 반응(LCR)(문헌[Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren et al. (1988) Science 241 : 1077, and Barringer et al. (1990) Gene 89: 117] 참조), 전사 증폭(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), 자기 부양 서열 복제(Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sa. USA 87: 1874), 도트 PCR 및 결합제 수용체 PCR 등을 포함한다.
Gnaq DNA 또는 RNA 서열에서의 돌연변이의 존재는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대립 유전자 특이성 올리고뉴클레오티드 혼성화가 이용될 수 있으며, 이는 돌연변이 또는 정상 핵산 서열로 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 정상 핵산 서열과 돌연변이를 구분하는 것에 의존한다. 상기 방법은 전형적으로 정상 또는 돌연변이 대립 유전체로 상이하게 혼성화하도록 고안된, 길이가 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 15∼20개의 뉴클레오티드를 적용한다. 이러한 프로브를 고안하는 지침은 당업계에서 이용가능하다. 돌연변이 대립 유전자의 존재는 샘플로 혼성화하는 대립 유전자 특이성 올리고뉴클레오티드의 양을 측정하여 결정한다.
샘플 내 프로브 및 표적 핵산 서열 사이에 형성된 잡종을 검출하기 위한 적합한 분석 포맷은 당업계에 공지되어 있으며, 불멸화 표적 (도트-블롯) 포맷 및 불멸화 프로브 (역 도트-블록 또는 라인 블록) 분석 포맷을 포함한다. 도트 블롯 및 역 도트 블롯 분석 포맷은 U.S. 특허 5,310,893호; 5,451,512호; 5,468,613호; 및 5,604,099호 기술되어 있다.
또다른 실시양태에서, 정상 또는 돌연변이 Gnaq 핵산의 존재(또는 양)는 대립 유전자 특이성 증폭 또는 프라이머 확장 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 이들 반응은 전형적으로 프라이머의 제3 말단에서의 비매칭을 통해 정상 또는 돌연변이 대립 유전자를 특정하게 표적으로 하여 고안된 프라이머의 용도를 포함한다. 비매칭 효과가 존재한다는 것은 폴리머라제가 오류 수정 작용이 없는 경우에 프라이머를 확장하는 폴리머라제의 능력에 영향을 미친다. 증폭된 생성물의 양은 프로브를 이용하거나 반응에 존재하는 DNA의 양을 직접 측정하여 결정할 수 있다.
U.S. 특허 5,210,015호; 5,487,972호; 및 5,804,375호; 및 문헌[Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280]에 기술된 바와 같이, Gnaq 핵산 수준, 예를 들어 정상 및/또는 돌연변이 Gnaq 폴리뉴클레오티드의 수준, 또는 Gnaq 돌연변이의 존재의 검출은 정량 분석, 예컨대 5'-뉴클레아제 활성(또한, "TaqMan®" 분석이라고도 일컬음)을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 분석에서, 증폭된 영역 내에서 혼성화하는 라벨 처리된 검출 프로브는 증폭 반응 중에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 혼성화 프로브는 정상 또는 돌연변이 대립 유전자를 분별하는 대립 유전자 특이성 프로브일 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 증폭된 생성물에 결합된 라벨 처리된 프로브 및 대립 유전자 특이성 프라이머를 이용하여 실시할 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로브는 돌연변이 및 정상 대립 유전자를 분별하지 않을 수 있다.
또다른 실시양태에서, 돌연변이 Gnaq 대립 유전자는 DNA 시퀀싱, 예컨대 피로시퀀싱 또는 다른 공지된 시퀀시 기법을 이용하여 용이하게 측정할 수 있다. 다른 검출 방법은 단일 스트랜드 처리된 형태 다형체 또는 제약 단편 길이 다형체 검출 방법 및 변성 구배 겔 전기영동 분석을 포함한다.
상기 명시한 바와 같이, 일부 실시양태에서, Gnaq RNA의 수준이 검출된다. 핵산 혼성화 기법을 이용한 Gnaq 유전자 전사(이로부터 생성된 mRNA 또는 cDNA)의 수준을 검출 및/또는 정량하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Gnaq의 발현 수준은 예를 들어 대립 유전자 특이성 프라이머 또는 프로브, 도트 블롯, 인시츄 혼성화, RN아제 보호, 프로빙 DNA 마이크로칩 분석 등을 이용한 실시간 RT-PCR을 이용한 기법, 예컨대 RT-PCR에 의해 또한 분석할 수 있다.
Gnaq의 과다발현, 돌연변이된 서열 또는 정상 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열을, 상기 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 정량적인 서열을 이용하여 검출할 수 있다. 과다 발현은 대조군, 예를 들어 정상 조직 또는 정상 멜라닌 세포를 참조하여 측정하였다.
Gnaq 폴리펩티드 서열의 검출
변경된 Gnaq 발현 및/또는 활성은 또한 Gnaq 단백질 또는 활성을 검출하여 검출할 수 있다. 예를 들어, Gnaq 단백질 활성 및 돌연변이를 갖는 Gnaq 단백질의 존재의 검출은 진단 목적으로 또는 스크린 분석에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플에서의 Gnaq의 수준 또는 정상 또는 돌연변이 Gnaq 폴리펩티드의 존재는 면역학적 분석을 이용하여 용이하게 측정한다. 또다른 실시양태에서, Gnaq 활성을 이용하여 생물학적 샘플 내의 Gnaq의 활성화 돌연변이의 존재를 측정할 수 있다. 하기 부분에서 Gnaq의 면역학적 검출을 논의한다. 상기 부분은 또한, 예를 들어 치료적 용도에서 사용될 수 있는 항체의 발생 및 엔지니어링에 관한 것이다.
면역학적 검출 Gnaq
항체는 Gnaq를 검출하는 데 사용될 수 있거나, Gnaq를 억제하는 작용을 위한 본 발명의 방법에서 평가될 수 있다. Gnaq의 검출 및/또는 정량은 다수의 공지된 면역학적 결합 분석 중 임의의 것을 사용하여 실시할 수 있다. 적용가능한 기술의 일반적인 검토를 문헌[Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) and Harlow & Lane, Using Antibodies (1999)]에서 확인할 수 있다. 다른 공급원은 또한 문헌[Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991, and Current Protocols in Immunology (Coligan, et al. Eds, John C. Wiley, 1999-present)]을 참조할 수 있다. 면역학적 결합 분석은 다중콜론 또는 단일콜론 항체를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 Gnaq 분자를 특이적으로 검출하는 항체를 사용할 수 있다.
일반적으로 사용되는 분석은 비경쟁적 분석(예를 들어, 샌드위치 분석) 및 경쟁적 분석을 포함한다. 경쟁적 분석에서, 샘플에 존재하는 Gnaq의 양은 샘플에 존재하는 미지의 Gnaq에 의해 항 Gnaq 항체로부터 교체된(경쟁 방식) 기지의 첨가된(외인성) Gnaq의 양을 측정하여 간접적으로 측정한다. 일반적으로 이용되는 분석 포맷은 면역 블롯을 포함하며, 이를 사용하여 샘플 내 단백질의 존재를 검출하고 정량화시킨다. 다른 분석 포맷은 리포솜 면역분석(LIA)을 포함하고, 이는 특정 분자(예를 들어 항체)를 결합하도록 고안된 리포솜을 사용하며, 캡슐 처리된 시약 또는 마커를 방출하고, 이어서 이는 표준 기법에 따라 검출된다(문헌[Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41 (1986)] 참조).
면역분석은 또한 흔히 항체 및 항원에 의해 형성된 착물에 특이적으로 결합하고, 이를 라벨 처리하는 라벨 처리제를 사용한다. 상기 라벨 처리제는 그 자체가 항체/항원 착물을 포함하는 부분들 중 하나일 수 있다. 대안적으로, 상기 라벨 처리제는 항체/항원 착물에 특이적으로 결합하는 제3 부분, 예컨대 제2 항체일 수 있다(제2 항체는 제1 항체가 유도되는 화학종의 항체에 특이적인 것이 전형적임). 면역글로불린 일정 영역을 특이적으로 결합시킬 수 있는 다른 단백질, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G가 또한 라벨 처리제로서 사용될 수 있다. 상기 라벨 처리제는 검출이능한 부분, 예컨대 비오틴에 의해 개질시킬 수 있고, 이에 다른 분자, 예컨대 스트렙타비딘을 특이적으로 결합시킬 수 있다. 다양한 검출이능한 부분이 당업자에게 공지되어 있다.
분석에서 사용되는 특정 라벨 또는 검출이능한 기는 상기 분석에서 사용되는 항체의 특이적 결합에 상당히 개재하지 않는 한 본 발명의 중요한 관점이 아니다. 상기 검출이능한 기는 검출이능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 검출이능한 라벨은 면역분석의 분야에서 잘 개발되어 왔으며, 일반적으로 이러한 방법에서 유용한 대부분의 임의의 라벨을 본 발명에 적용할 수 있다. 따라서, 라벨은 적외선분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학 수단에 의해 검출이능한 임의의 조성물이다. 본 발명에서 유용한 라벨은 자성 비드(예를 들어, DYNABEADSTM), 형광 화합물(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, Texas 레드, 로다민, 플루오레세인 등), 라디오라벨, 효소(예를 들어, 호스 라디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 일반적으로 ELISA에서 사용되는 다른 것), 스트렙타비딘/비오틴, 및 색도계 라벨, 예컨대 콜로이드성 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)을 포함한다. 화학발광 화합물(Chemilumine scent compound)을 또한 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 다양한 라벨 처리 또는 신호 생성 시스템을 확인하기 위해, U.S. 특허 4,391,904호를 참조할 수 있다.
Gnaq에 대한 항체는 시판되고 있다(예를 들어, 제네시스 바이오텍, 인코포레이티드(Genesis Biotech, Inc). 타이완 타이페이 카운티 소재). 일부 실시양태에서, Gnaq로의 돌연변이는 돌연변이 형태를 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출할 수 있으며, 따라서 면역분석을 이용하여 돌연변이 Gnaq 단백질을 또한 검출할 수 있다.
Gnaq 또는 이의 단편, 예를 들어 서열 돌연변이를 흔히 함유하는 펩티드의 일부를 사용하여 Gnaq에 특이적으로 반응성인 항제를 생성할 수 있다. 예를 들어, 재조합형 Gnaq 또는 이의 항원 단편이 단리된다. 재조합형 단백질은 단일콜론 또는 다중콜론 항체를 생성하는 데 바람직한 면역원이다. 대안적으로, 본 원에서 개시된 서열로부터 유도되고 담체 단백질에 컨쥬게이트화되는 합성 펩티드는 면역원으로서 사용될 수 있다. 천연 발생 단백질은 또한 순수하거나 불순한 형태로 사용될 수 있다. 이어서, 생성물을 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다.
Gnaq와 특이적으로 반응하는 다중클론 및 단일클론 항체을 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(Coligan; Harlow & Lane, both supra). 상기 기법은 파지 또는 유사한 벡터에서의 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체를 선택하여 항체를 제조하는 것뿐만 아니라, 토끼 또는 마우스를 면역화시킴으로써 다중클론 및 단일클론 항체를 제조하는 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)] 참조). 이러한 항체는 진단 또는 예후 용도로, 예를 들어 흑색종의 탐색 또는 Gnaq의 증가된 발현 또는 활성을 나타내는 기타 암의 검출에서 사용할 수 있다.
전형적으로, 역가가 104 또는 그 이상인 다중클론 항혈청이 선택되고, 경쟁적 결합 면역분석을 이용하여 비Gnaq 단백질 또는 다른 유기체로부터의 다른 관련 단백질에 대향하는 교차 반응성에 대해서 시험한다. 특정 다중클론 항혈청 및 단일클로 항체가 약 0.1 mM, 더욱 일반적으로 약 1 μM 이상, 임의로 적어도 약 0.1 μM 또는 그 이상, 임의로 0.01 μM 또는 그 이상의 Kd로 일반적으로 결합하게 된다.
일부 실시양태에서, Gnaq 항체가 치료적 용도를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 항체를 사용하여 하기 기술된 바와 같이 Gnaq의 생물학적 기능을 감소시키거나 제거할 수 있다. 즉, 멜라닌 세포 신생물(또는, 암 세포를 함유하는 세포 개체)로의 항 Gnaq 항체(다중클론 또는 바람직하게는 단일클론)을 첨가하여 상기 신생물을 감소시키거나 제거할 수 있다. 일반적으로, 활성, 성장, 크기 등에서 25% 이상의 감소가 바람직하며, 약 50% 이상이 특히 바람직하며, 약 95∼100% 감소가 특별히 바람직하다.
흔히, 치료적 용도를 위한 Gnaq 단백질로의 항체는 인간화된 항체이다(예를 들어, 제네렉스 바이오사이언스(Xenerex Biosciences), 메데렉스, 인코포레이티드(Mederex, Inc.), 앱제닉스, 인코포레이티드(Abgenix, Inc.), 프로틴 디자인 랩스 인코포레이티드(Protein Design Labs,Inc)). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조할 수 있다(Hoogenboom & Winter, J. MoI. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. MoL Biol. 222:581 (1991)). Cole 등 및 Boerner 등의 기술은 또한 인간 단일클론 항체의 제조에 이용가능하다(Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77 (1985) and Boerner etal., J. Immunol. 147(l):86-95 (1991)). 유사하게는, 인간 항체는 인간 면역글로불린의 유전자 좌를 유전자 이식된 동물, 예를 들어 내생의 면역글로불린 유전자가 일부 또는 전부 비활성화되는 마우스에 투입하여 생성할 수 있다. 시도 시, 인간 항체 생성이 관찰되고, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 관점에서 인간에서 나타내는 것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근은, 예를 들어 U.S. 특허 5,545,807호; 5,545,806호; 5,569,825호; 5,625,126호; 5,633,425호; 5,661,016호 및 하기 화학 공개 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10:779- 783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]에 기술되어 있다.
활성 검출
당업자에 의해 이해되게 되는 바와 같이, Gnaq 활성을 검출하여 발현 수준을 평가하거나 활성의 억제제를 확인할 수 있다. GTP 및 GDP 결합 활성, GTP 가수분해 효소 활성 또는 포스폴리파제 Cβ의 측정을 비롯한 활성은 다양한 시험관 내 및 생체 내 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, Gnaq 활성은 추가적인 종말점, 예를 들어 변형 또는 착색과 관련된 것을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석은 추가적인 Gnaq 억제제를 확인하는 방법을 상술하는 실시예 및 부분에서 더욱 자세하게 기술된다. 전형적으로, Gnaq 활성은 단백질을 이것이 상호작용하는 것, 예를 들어 항체, 리간드 또는 다른 단백질, 예컨대 신호 전달 분자에 결합시키는 능력을 측정하여 결정한다.
질환 진단/예후
Gnaq 핵산 및 폴리펩티드 서열은 환자 내의 멜라닌 세포 신생물을 진단 또는 예후하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, 환자로부터의 멜라닌 세포 신생물 샘플 중 Gnaq의 서열, 수준 또는 활성을 측정할 수 있으며, 여기서 변경, 예를 들어 Gnaq의 발현 또는 활성 또는 Gnaq에서의 서열 돌연변이의 수준의 증가는 멜라닌 세포 신생물의 존재 또는 가능성을 나타낸다.
본 발명의 방법을 사용하여 암을 갖는 환자의 치료의 최적 과정을 결정할 수 있다. 예를 들어, Gnaq 중 서열 돌연변이의 존재는 특정 치료제, 예컨대 Gnaq, 포스폴리파제 Cβ, 또는 Gnaq에 의해 조절되는 하류 경로를 표적으로 하는 것이 상기 환자에게 이롭게 된다는 것을 나타낸다. 또한, Ganq에서의 결점 또는 서열 돌연변이의 존재와 한 또는 또다른 항흑색종 제제의 상대적인 효율 간의 상호관계를 용이하게 성립시킬 수 있다. 이러한 분석을, 예를 들어 소급식으로, 즉, 1 이상의 유형의 항암 치료, 예를 들어 G 단백질 또는 포스폴리파제 Cβ, 또는 Gnaq에 의해 조저되는 하류 경로를 표적으로 하는 치료를 이후 실질적으로 겪게 되는 환자로부터 이미 수집된 샘플에성의 Gnaq 결합 또는 서열 돌연변이에 대한 분석 및 상기 결점을 존재를 상기 치료의 기지 효과와 서로 관련시킴으로써 실시할 수 있다.
흔히, 이러한 방법을 추가적인 진단 방법, 예를 들어 다른 흑색종 징후, 예를 들어 세포 형태 등의 검출와 함께 적용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 종양으로부터의 흑색종 세포를 함유하는 것으로 알려진 조직 샘플을 Gnaq 결점에 대해 분석하여 암에 대한 정보, 예를 들어 Gnaq, 또는 Gnaq에 의해 조절되는 하류 경로를 표적으로 하는 치료와 같은 특정 치료의 효능을 측정하게 된다.
일부 실시양태에서, Gnaq 결함 또는 서열 돌여변이체의 존재에 대한 흑색종 세포의 분석을 이용하여 흑색종을 갖는 환자의 예후를 측정하거나, 상기 질환의 진행을 측정할 수 있다. '진단적 존재'는 증가된 Gnaq mRNA 또는 단백질의 수준 및/또는 활성, 및/또는 기능을 변경시키는 Gnaq 중의 서열 돌연변이의 존재일 수 있다.
흑색종 세포를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 생물학적 샘플을 평가하여 진전을 측정할 수 있다. 예를 들어, 내장 기관, 혈액, 림프절 등으로부터 조직을 Gnaq 서열 돌연변이 및/또는 증가된 수준의 Gnaq 활성에 대해서 분석할 수 있다.
Gnaq의 억제제 또는 조절제를 위한 스크린 처리
또다른 양태에서, 본 발명은 과다발현하고 및/또는 Gnaq에서의 돌연변이를 이를 갖는 흑색종을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법을 억제제 또는 Gnaq 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 억제제 및 Gnaq 길항제가 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명과 사용하기에 적합한 비한정적인 예시적 억제제는 PKC 및 다양한 PKC 이소폼, 예컨대 PKCμ 및 PKCε의 특이적 및 비특이적 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명과 사용하는 데 적합한 예시적인 비한정 억제제로는 스타우로스포린, 스타우로스포린 동족체 CPG41251, 브리오스타틴-1, KAI-9803, 7-히드록시스타우로스포린, L-트레오-디히드로스핀고신(사핀골), 비선택성 PKC 억제제(PKC412), 일모포신(BM 41 440), G56976(PCKμ를 비롯한 PKC의 전형적인 이소폼을 더욱 특이적으로 억제하는 인돌카르바졸임), PKC-알파 안티센스 억제제 LY900003 및 PKC-베타 억제제 LY333531, LY317615 (엔자스타우린)를 들 수 있다. 포스폴리파제 Cβ의 비한정적인 예시적 억ㅈ제로는 에델포신 및 플루비루신 B[2]를 포함할 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 사용에 적합하다.
기타 억제제는 항체, 펩티드, 핵산 등과 같은 억제제를 포함한다. 본 원에서 사용되는 바와 같이, Gnaq 억제제는 Gnaq 핵산 발현 및/또는 Gnaq 단백질 활성 또는 Gnaq에 의해 조절되는 하류 경로를 조절하는 분자일 수 있다. 예를 들어, PKC-알파 mRNA 감소에 사용하기에 적합한 비한정적인 예시적 안티센스 분자는 5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3'(서열 확인 번호:3)가 있다.
화합물의 조절제에 대한 스크린 처리 방법은, 예를 들어 Gnaq가 과다발현되거나 돌연변이된 흑색종 세포를 이용할 수 있다. 이러한 조절제는 후보 Gnaq GTP 가수분해 효소 조절제일 수 있다.
추가적인 Gnaq 억제제를 Gnaq 활성, 예를 들어 GTP 결합 또는 GTP 가수분해 효소 활성에 대해 분석함으로써 확인할 수 있다. 이러한 분석은 기지의 Gnaq 서열 또는 단편, 예를 들어 Gnaq의 구아닌 결합 도메인 또는 이의 변이체를 사용한다. 이러한 분석에서 사용될 수 있는 예시적 인간 Gnaq 폴리펩티드 서열이 서열 확인 번호:2에 제공되어 있다.
활성 분석을 이용하여 치료제로서 사용될 수 있는 억제제, 예를 들어 Gnaq에 대한 항체 및 Gnaq 활성의 길항제를 확인한다. Gnaq 활성의 억제제를 재조합형 또는 자연 발생의 Gnaq 폴리펩티드를 사용하여 시험하였다. 세포 내에서 발현된, 조직 또는 동물 내에서 발형된 재조합형 또는 자연 발생의 단백질을 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 변형된 세포를 사용할 수 있다. 본 원에서 기술된 시험관 내 또는 생체 내 분석들 중에서 하나를 이용하여 조절을 시험한다. 활성을 또한 다른 단배질, 예를 들어 포스폴리파제 Cβ 또는 GTP에 결합된 Gnaq 단편을 이용하여 가용성 또는 고체 사애의 반응에 의해 시험관 내에서 조사할 수 있다.
또다른 실시양태에서, mRNA 및/또는 단백질 발현 수준을 측정하여 Gnaq 발현 수준 상의 시험 화합물의 효과를 평가하였다. Gnaq르 발현시키는 숙주 세포를 충분한 시간 동안 시험 화합물과 접촉시켜 임의의 상호반응을 실시한 후, mRNa 또는 단백질의 수준을 측정하였다. 이러한 상호반응을 실시하는 시간의 양은, 예컨대 시간 과정을 거쳐 시간의 함수로 발현의 수준을 측정하여 경험적으로 결정할 수 있다. 발현의 양은 적합하게 되는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
이어서, 상기 발현의 양은 시험 화합물의 부재 하의 발현의 양과 비교된다. 실질적으로 동일한 세포가 재조합형 세포가 제조되나 이종 DNA의 도입으로 개질되지 않은 동일한 세포로부터 유도될 수 있다. 발현의 양의 차이는 시험 화합물이 일정 방식으로 Gnaq 수준을 변경시켰다는 것을 나타낸다.
Gnaq 억제제를 확인하는 일부 분석에서, 잠재적인 억제제로 처리된 샘플을 대조 샘플과 비교하여 조절의 정도를 결정한다. 돌연변이가 없고 후보 억제제로 처리되지 않은 대조 샘플을 상대 활성값 100으로 할당한다. Gnaq의 억제는 대조군에 대한 활성 값이 약 80%, 임의로 50%, 임의로 25∼0%인 경우에 성취된다.
Gnaq의 억제제로서 시험되는 화합물은 이의의 작은 화학적 화합물, 또는 생물학적 실체, 예를 들어 거대분자, 예컨대 단백질, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 대안적으로, 조절제는 Gnaq의 유전학적으로 변경된 형태일 수 있다. 전형적으로 시험 화합물은 화학적 소분자 및 펩티드 또는 항체이게 된다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 분자량이 1,500 달톤 미만, 일부 경우에서 1,000, 800, 600, 500 또는 400 달톤이다. 상대적으로 작은 크기의 제제가 바람직한데, 이는 보다 작은 분자가 고분자량의 제제보다 우수한 약동학적 특성, 예컨대 경구 흡수성과 상용할 수 있는 물리화학적 특성을 가질 보다 높은 가능성을 보유하기 때문이다. 예를 들어, 투과성 및 가용성을 기준으로 약물로서 덜 성공적일 것 같은 제제가 하기와 같이 Lipinski 등에 의해 기술되었다: H 결합 기여제가 5 이상임(OH 및 NH의 합으로서 표현); 분자량이 500 이상임; LogP가 5 이상임(또는 MLogP가 4.15 이상임); 및/또는 H 결합 수용체가 10 이상임(N 및 O의 합으로 표현). 문헌[Lipinski et al. Adv Drug Delivery Res 23:3-25 (1997)] 참조. 생물학적 운반체를 위한 기재인 화합물 부류는 전형적으로 상기 규칙에 예외이다.
실질적으로 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 분석에서 잠재적인 조절제 또는 리간드로서 사용될 수 있다. 가장 흔히, 화합물이 수성 또는 유기(특히, DMSO를 주성분으로 하는) 용액에 용해될 수 있다. 상기 분석은 분석 단계를 자동화시켜 큰 화학적 라이브러리를 스크린 처리하도록 고안되며, 상기 단계는 전형적으로 병렬로 작동한다(예를 들어, 로봇 분석에서 미세적정 플레이트 상의 미세적정 포맷에서). 화학적 화합물의 많은 공급자, 예컨대 Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland) 등이 존재한다는 것이 이해되게 된다.
발현 분석
특정 스트린 처리 방법은 Gnaq의 발현을 조절하는 화합물에 대해 스크린 처리하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 일반적으로 시험 화합물이 1 이상의 세포 발현 Gnaq와 접촉하는 세포계 분석을 실시한 후, 발현(전사 또는 번역 생성물)의 감소를 검출하는 것을 포함한다.
발현은 많은 상이한 방법으로 검출할 수 있다. 본 원에서 기술되는 바와 같이, 세포 중 단백질의 발현 수준은 Gnaq 전사(또는 이로부터 유도된 상보적 핵산)와 특이적으로 혼성화하는 프로브로 세포에서 발현된 mRNA를 프로브 처리하여 측정할 수 있다. 대안적으로, 세포 용해물을 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 프로브 처리하는 면역학적 방법을 이용하여 단백질을 검출할 수 있다.
다른 세포계 분석은 단백질을 발현하지 않는 세포에 의해 실시되는 리포터 분석이다. 흔히, 이러한 분석은 검출이능한 생성물을 인코딩하는 리포터 유전자에 실시가능하게 결합하는 촉진체를 포함하는 이종 핵산 구성체에 의해 실시된다.
흑색종 치료 및 약학적 및 백신 조성물의 투여
Gnaq의 억제제를 Gnaq에서 서열 돌연변이를 갖는 멜라민 세포 신생물의 치료를 위해 환자에 투여할 수 있다. 하기 자세히 기술되는 바와 같이, 억제제는 임의로 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 임의의 적합한 방식으로 투여한다. 일부 실시양태에서, PKC 또는 포스폴리파제 Cβ의 억제제를 투여한다. 억제제를 투여하는 프로토콜은 공지되어 있으며, 약리학 업계에서 공지된 원칙을 기준으로 흑색종 환자에거 더욱 최적화될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).
상기 억제제는 멜라닌 세포 신생물을 예방, 치료 또는 제어하는 데 치료적으로 유효한 투약량으로 환자에 투여할 수 있다. 상기 화합물을 환자에 유효한 예방 또는 치료 반응을 도출하기에 충분한 양으로 환자에 투여한다. 유효한 치료 반응은 질환의 증상 또는 합병증을 적어도 부분적으로 정지시키거나 늦추는 반응이다. 이를 달성하는 데 충분한 양은 '치료적으로 유효량 투약량'으로서 정의된다. 상기 투약량은 사용된 특정 Gnaq 억제제 효능 및 대상체의 병태뿐만 아니라 체중 또는 치료하게 되는 면적의 표면적에 의해 결정하게 된다. 상기 투약량의 크기는 또한 특정 대상태에 특정 화합물을 투여하는 동반하는 임의의 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정되게 된다.
이러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약물 절차에 의해, 예를 들어 LD50(개체의 50%이 치사에 이르는 투약량) 및 ED50(개체의 50%에 치료적으로 효과적인 투약량)을 측정함으로써 측정할 수 있다. 독성 및 치료적 효과 간의 투약량 비율은 치료 지수이며, 비율 LD50/ED50로서 표현할 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내느 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용하는 동안에는, 영향을 받는 조직의 부위로의 상기 화합물을 표적으로 하는 전달 시스템이 정상 세포로의 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키도록 주의하여 고안해야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득한 데이타를 사용하여 인간에서의 사용을 위한 투약량 범위를 정형화할 수 있다. 이러한 화합물의 투약량은 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 순화 농도의 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 이러한 투약량은 사용되는 제형 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다를 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대해서, 치료적으로 유효한 투약량은 세포 배양 분석으로부터 처음 추정할 수 있다. 투약량은 동물 모델에서 정형화하여 세포 배양에서 측정되는 바와 같은 IC50(증상의 반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정조는 사용하여 인간에서 유용한 투약량을 더욱 정확하게 측정할 수 있다. 혈장 내의 농도를, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 조절제의 선량당량은 전형적인 대상체에서 약 1 ng/kg ∼ 10 mg/kg이다.
본 발명에서 사용하기 위한 약학 조성물은 1 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용한 표준 기법에 의해 제형화시킬 수 있다. 상기 화합물 및 이의 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매화물은 임의의 적합한 경로, 예컨대 흡입, 국부, 경비, 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내, 복강내, 방광내 또는 포막내) 또는 직장으로 투여하기 위해 제형화할 수 있다.
경구 투여를 위해, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 결합제, 예를 들어 예비겔라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 충전제, 예를 들어 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘; 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 탈크 또는 실리카; 또는 붕해제, 예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트; 또는 습윤제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트와 함께 통상의 방법으로 제조된, 예를 들어 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 이들은 사용 전 물 또는 기타 적합한 비히클과의 구조화를 위한 건조 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 통상의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어 현탁제, 예를 들어 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방; 유화제, 예를 들어 레시틴 또는 아카시아; 비수성 비히클, 예를 들어 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 정제된 식물성 오일; 및 보존제, 예를 들어 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산과 함께 제조할 수 있다. 상기 제제는 또한 적절한 경우 완충제 염, 향미제, 착색제 및/또는 감미제를 함유할 수 있다. 필요한 경우, 경구 투여를 위한 제제를 활성 화합물의 제어 방출을 제공하도록 적절히 제형화시킬 수 있다.
흡입에 의해 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하여 가압된 팩 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 분사 형태로 용이하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적합한 분말 베이스, 예를 들어 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
화학물을 주사에 의한, 예를 들어 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화시킬 수 있다. 주사를 위한 제형은 단위 제형으로, 예를 들어 앰플 또는 다중 투여량 용기 내에서 첨가된 보존제와 함께 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클에서 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화 제제, 예를 들어 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원 제거수와 함께 구조화하기 위한 분말 형태로 존재할 수 있다.
상기 화합물을 또한, 예를 들어 통상의 좌약 베이스, 예를 들어 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드를 함유하는 직장용 조성물, 예를 들어 좌약 또는 정체 관장으로 제형화될 수 있다.
더욱이, 화합물은 저장 제제(depot preparation)로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어 조성물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일 중 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지에 의해, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
상기 조성물은, 요망되는 경우, 활성 성분을 함유하는 1 이상의 단위 제형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배 장치에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어 금속 또는 플라스틸 호일, 예를 들어 블리스터 팩(blister pack)을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투약을 위한 지침이 동반될 수 있다.
진단 및/또는 예후 용도에서의 사용을 위한 키트
본 발명은 또한 진단 또는 치료 용도를 위한 키트를 제공한다. 진단/예후 용도를 위해, 이러한 키트는 분석 시약, 완충액, Gnaq 프로브, 프라이머, 항체 등 중 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 본 발명의 방법을 실행하기 이한 지시(즉, 프로토콜)을 함유하는 지침 물질을 포함할 수 있다. 상기 기침 물질은 전형적으로 작성되거나 인쇄된 물질을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 지침물을 저장하고 이를 최종 사용자와 소통할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에서 숙고되었다. 이러한 매체는 비한정적으로 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테입, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함할 수 있다. 이러한 매체는 이러한 지시물을 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수 있다.
실시예 1 - Gnaq 서열 돌연변이의 존재에 대한 흑색종 및 모반 샘플의 검사
Gnaq가 인간 멜라닌 세포 신생물에서 역할을 하는지에 대해 측정하기 위해서, Gnaq의 코딩 영역을 광범위한 양성 및 악성 멜라닌 세포 종양에서 시퀀싱하였다. 대조군으로서, Gnaq 코딩 영역을 또한 선택된 생체 검사로부터의 정상 주위 조직에서 스퀀싱 처리하였다.
생물학적 샘플
흑색종 및 모반 샘플로부터의 DNA를 앞선 연구(문헌[Curtin, J.A., et at., (2005) N EnglJ Med, 353(20):2135-47] 참조)로부터 수득하거나 UCSF 및 스탠포드의 미국 임상시험 심사 위원회(institutional review board)의 승인 하에서 샌프란시스코 및 독일에서의 수집으로부터의 기록용 파라핀 침전된 생체 검사물로부터 수득하였다. 모든 상기 샘플은 진피로부터 단리된 일부 손상 조직을 함유하였는데, 이는 상피에서만 위치하는 손상이 분석을 위한 충분한 DNA를 제공하지 않기 때문이다.
시퀀싱
DNA를 앞서 기술한 바와 같이 파라핀 블럭으로부터 추출하였다. 문헌[Bastian, et al, (1998) Cancer Res. 58(10): 2170-2175] 참조. 샘플 DNA를 PCR 을 이용하여 증폭시키고, PCR 정제 칼럼을 이용하여 정제한 후, 시퀀싱 반응을 위한 주형으로서 사용하며, 이는 두 모두의 방향으로 실시하였다. 둘 모두의 시퀀시 방향으로 돌연변이에 의해 확인된 샘플을 2회 이상 복제하고, 제한 단편 길이 다형성(RELP) 분석에 의해 확인하였다. 시퀀싱을 위한 반응 조건은 0.25 mM의 각각의 dNTP, 0.4X BSA (뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)), 1 U Hotstar Taq (퀴아젠(Qiagen)), IX Hotstar Taq buffer (퀴아젠), 및 0.5 uM의 각각의 프라이머, 5'-cccacaccctactttctatcatttac-3'(서열 확인 번호:4) 및 5'-ttttccctaagtttgtaagtagtgc-3'(서열 확인 번호:5)(GNAQ 엑손 5에 대해서). GNAQ 및 GNAl1에 대한 다른 프라이머 서열은 필요시 이용가능하다. PCR은 95 도(30 초), 58 도(1 분) 및 72 도(1 분)의 35 사이클로 구성되었다. PCR 반응물을 칼럼을 이용하여 정제한 후, Big Dye (ABI)를 이용하여 시퀀싱 반응을 위한 템플레이트로서 사용하였으며, 이는 둘 모두의 방향으로 실시하였다. 둘 모두의 시퀀싱 반응에서 돌연변이에 의해 확인되는 샘플은 2회 복제하였다. 돌연변이 1∼3(표 2)를 RELP 분석에 의해 확인하였다. 돌연변이 1 및 2는 Eco0109I 제한 영역을 생성한 반면에, 돌연변이 3(둘 모두의 변경된 염기쌍이 돌일한 대립 유전자에 존재하는 경우) AflII 제한 영역을 생성하였다. 따라서, 시퀀싱 분석에 의해 돌연변이 3를 나타내는 샘플은 AflII에 의해 절달될 수 있으나, 단, 직렬 염기상 변경이 단일 대리 유전자 내에 존재해야 한다.
혼합 세포 개체에서의 Q209 돌연변이 검출을 위한 감응성 분석
펩티드 핵산 (PNA), Ac-tctctgacctttggc-CONH2(서열 확인 번호:6)를 50% DMF에 재현탁시키고, 25 ul 반응 중 2 ng 주형 DNA에 대해 4 uM의 최종 농도에서 사용하였다. 반응 조건은 0.25 mM dNTP, 6X BSA, 2 U Hotstar Taq, Ix Hotstar Taq 완충액 및 0.5 uM의 각각의 프라이머, 5'-ttttccctaagtttgtaagtagtgc-3(서열 확인 번호:5); 및 5'-atccattttcttctctctgacc-3'(서열 확인 번호:7)이었다. PCR은 95 도(1 분), 73 도(1 분), 57 도(45 초) 및 72 도(1 분)의 40 사이클로 구성되었다. 상기 샘플이 돌연변이 대립 유전자를 함유하는 것을 확인하기 위해, 샘플을 야생형 서열을 절단하지 않는 AflII 및 Eco0109I에 의해 증해시켰다.
결과
Gnaq에서의 Q209의 이형 체세포 치환 돌연변이가 상이한 조직 병리학적 성장 패턴을 나타내는 청색 모반의 83%에서 확인되었다(표 1, 표 2). 생식 계열 초형태(germline hypermorphic) Gnaq 대립 유전자가 마우스에서 진피내 과착색을 유도한다는 앞선 관찰(Van Raamsdonk et al. (2004))과 함게 청색 모반에서의 Ganq의 체세포 구조적 활성화 돌연변이의 높은 전이는 이것이 상기 유형의 손상 형성에 대한 주요 경로라는 것을 제시한다. 드물지만, 청색 모반은 '악성 청색 모반'이라고 일컬어지는 악석 흑색종을 발생시킬 수 있다. Gnaq-Q209 돌연변이는 분석된 2개의 '악성 청색 모반' 샘플 중 하나에서 확인되었다.
포도막 흑색종 생체 검사는 또한 루신 또는 프롤린에 대한 체세포(주변 정상 조직에 존재하지 않음), 이형 돌연변이를 갖는 48개의 샘플 중 22개(46%)에서 Gnaq-Q209의 돌연변이를 나타내었으며, 이는 Gnaq가 포도막 흑색종 형성에서 중추적인 역할을 한다는 것을 나타낸다.
흑색종 및 모반 샘플에서 검출되는 5개의 Gnaq 돌연변이 각각은 표 2에서 확인되는 바와 같이 루신(66%), 프롤린(30%), 아르기닌(2%) 또는 티로신(2%)으로의 글루타민 209의 비동의적 치환을 예보한다. 상기 돌연변이들 각각은 RELP 분석을 이용하여 확인하였다(데이타 나타내지 않음).
흑색종 및 모반 생체 검사 샘플에서의 Gnaq 돌연변이의 발병율
진단 % 돌연변이 N
피부 및 점막 흑색종 만성 일광 유도된 손상이 없는 피부 상의 흑색종 (비-CSD) 0% 15
만성 일광 유도된 손상이 있는 피부 상의 흑색종 (SD) 4% 27
선단 흑색종 0% 15
점막 흑색종 0% 14
'악성 청색 모반' 50% 2
선천성 모반에서 발생하는 흑색종 0% 3
스피츠형(Spitzoid) 흑색종 0% 2
합계 78
모반 청색 모반 83% 29
Ota의 모반 6% 17
선천적 모반 0% 7
심부 관통 모반 0% 16
큰 선천적 모반에서의 증식성 결절 0% 7
스피츠 모반 0% 8
합계 84
안구 흑색종 포도막 흑색종 46% 48
포도막 흑색종 세포계 27% 15
결막 흑색종 0% 11
합계 74
총합계 236
흑색종 및 모반 샘플 중 코돈 209에성의 3개의 Gnaq 돌연변이
돌연변이를 갖는 샘플으 수
진단 1: CAA(Q)∼CTA(L) 2: CAA(Q)∼CCA(P) 3: CAA(Q)∼TTA(L) 4: CAA(Q)∼CGA(R) 5: CAA(Q)∼TAT(Y)
CSD 흑색종 1 0 0 0 0
'악성 청색 모반' 1 0 0 0 0
청색 모반 17 4 4 0 0
포도막 흑색종 10 10 0 1 1
포도막 흑색종 세포계 2 2 0 0 0
합계 31(58%) 16(30%) 4(8%) 1(2%) 1(2%)
실시예 3. Q209L 돌연변이 변형 멜라닌 세포를 갖는 GNAQ
인간 멜라닌 세포 상의 GNAQQ209L 효과를 평가하기 위해, 본 발명자는 정상 및 유전적으로 개질된 인간 멜라닌 세포를 트랜스펙션하는 에피토프 태그된 렌티 바이러스 발현 구조를 수립하였으며, 상기 후자는 연장된 수명을 보유하나 여전히 성장(hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포)을 위한 추가적인 인자(cAMP, TPA)를 필요로 한다. 문헌[Garraway, L. A. et al. , Nature 436(7047): 117 (2005)] 참조. 원발성 인간 멜라닌 세포로의 GNAQ<Q209L>의 안정한 트랜스펙션은 부착 비의존성 성장을 유도하기에 불충분하다(데이타 나타내지 않음). 대조적으로, NRAS<Q61R>에 의한 트랜스팹션과 대등하거나 약간 높은 효능을 갖는 부착 의존성 성장을 hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포로의 GNAQQ209L의 트랜스펙션이 유도한다(도 1a-b). 더욱이, GNAQQ209L는 멜라닌 세포에서 매우 변형된 형태를 유도하였다(도 1c).
플라스미드
GNAQQ209L의 전체 GNAQ 코딩 영역을 갖는 플라스미드를 UMR cDNA 자원 세터에서 수득하였다. 야생형 상대부분을 코돈 209의 부위 특이성 전이에 의해 생성하였다. 구조체 둘 모두의 코딩 영역을 N 말단 Flag 태그에 의해 에피토프 태크 처리하고 렌티바이러스 발현 벡터 FG12로 복제하였다. 모든 구조체는 확인을 위해 시퀀싱 처리하였다.
세포 배양
hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포는 Dr. David Fisher(다나 파버 암 연구소(Dana Farber Cancer Institute))로부터의 제공물이며, p53 및 pl6/CDK4/레티노블라스토마 단백질 경로가 텔로머라제(hTERT) 발현과 함께 비활성화되는 인간 멜라닌 세포이다. hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포는 7% FBS, 50 ng/ml TPA, 0.1 mM IBMX, 10 μM Na3VC4, 1 mM dbcAMP가 보충된 Ham's F12을 함유하는 글루타민에서 배양하였다. 원발성 정상 멜라닌 세포는 Dr. Meenhard Herlyn(위스타 연구소(Wistar Institute))로부터의 제공물이며 20% FBS, 2% 킬레이트화 FBS, 5 μg/ml L-글루타민, 15 μg/ml 콜레라 독소, 0.5 ng/ml bFGF, 100 nM ET3 및 1.68 mM SCF가 보충된 MCDB153에서 배양하였다. 세포계 Mel202 및 293T는 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI에서 배양하였다.
렌티바이러스 감염
바이러스 상청액을 10 μg의 플라스미드 및 적절한 렌티바이러스 팩키징 프랄스미드로 트랜스펙션 처리된 293T 세포를 이용하여 생성하였다. 매질은 트랜스펙션 16 시간 후에 교체하고, 바이러스는 40∼56 시간 후에 수집하였다. 인간 원발성 및 불명화된 멜라닌 세포를 감염시키고 감염 효능을 GFP 발현 세포의 백분율에 의해 추정하였다.
일시적 감염
293T 세포를 RPMI/10% FCS에 의해 웰당 1 x lO6 세포로 6 웰 플레이트에 접종하였다. 트랜스펙션을 Lipofectamine 2000 (인비트로겐(Invitrogen)) 및 2 μg 플라스미드 pcDNA(TM)6.2/V5-DEST® Gateway 벡터 (인비트로겐)을 단독으로 사용하거나 각각 GNAQQ209L 또는 GNAQWT에 대한 완전 코딩 영역을 함유하여 실시하였다. 세포를 트랜스팬션 48 시간 후에 용해시키고 단백질 함량에 대해서 분석하였다.
세포 증식 분석
관련 세포수를 96 웰 플레이트를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라서 CyQUANT® 세포 (인비트로겐) 증식 분석 키트에 의해 정량화하였다. 7.5 x 103 Mel202 세포를 미처리된 채로 놓아두거나 비표적 siRNA, GNAQ siRNA, 20 μM MEK 억제제 UO 126(프로메가(Promega))에 의해 트랜스펙션 처리하고, 72 시간 후에 형광 밀도를 판독하였다. DMSO에 의한 모의 트랜스 팩션 및 처리를 갖는 세포를 대조군으로서 사용하였다.
실시예 3. 인간 멜라닌 세포 및 포도막 흑색종 세포에서의 MAP 키나제 경로 활성에 기여하는 DNAQQ209L
GNAQ 하류의 신호 전달 경로는 포스폴리파제 Cβ에 의한 디아실글리세롤(DAG)의 방출을 통한 단백질 키나제 C 군 일원의 활성화를 포함한다. 일정하게, GNAQQ209L 변형된 멜라닌 세포는 TPA, 합성 DAG 동족체의 부재 하에 연질 우무에서 성장하였다(도 1a-b). PKC activation by way of GNAQ activation can activate the MAP-kinase pathway in other cell types
GNAQ 활성에 의한 PKC 활성은 다른 세포 유형에서 MAP 키나제 경로를 활성화시킬 수 있다(문헌[Hubbard, K. B. and Hepler, J. R., Cell Signal 18 (2): 135 (2006); Goldsmith, Z. G. and Dhanasekaran, D. N., Oncogene 26 (22):3122 (2007)] 참조). 포도막 흑색종은 MAP 키나제 활성을 나타내지만(문헌[Zuidervaart, W. et al., Br J Cancer 92 (11):2032 (2005)] 참조), 다른 연구에서와 마찬가지로 본 연구에서의 포도막 흑색종 어느 것도 BRAF 또는 NRAS에서의 돌연변이를 나타내지 않았다(예를 들어, 문헌[Saldanha, G. et al., Int J Cancer 111 (5), 705 (2004); Cruz, F., 3rd et al, Cancer Res 63 (18):5761 (2003) 참조).
따라서, 본 발명자는 GNAQQ209L이 인간 멜라닌 세포 및 포도막 흑색종 세포에서의 MAP 키나제 경로 활성에 기여하는지에 대해서 시험하였다. 도 2a 및 b에 도시되는 바와 같이, hTERT/CDK4R24C/p53DD 멜라닌 세포로의 GNAQ<Q209L>의 트랜스팬션은 야생형 GNAQ (GNAQWT) 또는 빈 벡터(Vector)에 의해 트랜스펙션 처리된 대조군 세포에 비해 포스포-ERK 및 시클린 D1 발현의 수준이 증가되게 한다. 유사한 결과가 원발성 인간 멜라닌 세포 및 293T로의 GNAQQ209L 트랜스펙션에 의해 수득되었다.
포도막 흑색종 세포는 또한 GNAQ를 표적으로 하는 siRNa에 의해 처리하였다. 상기 결과는 GN4<2-<Q209L> 돌연변이를 내포하는 포도막 흑색종 세포계, Mel202에서의 GNAQ의 siRNA 매개된 녹다운이 포스포 ERK 수준을 감소시킨다는 것을 나타내었다(도 3a). 또한, Mel202 세포에서의 GNAQ 녹다운은 세포수의 실질적인 감소(표 3b) 및 대조군 세포에 비해 아폽토시스의 현저한 증가(도 3c) 둘 모두를 유도한다. GNAQ 돌연변이 흑색종 세포에서의 포스포-PKCμ의 높은 수준은 또한 GNAQ siRNAd의 두개의 상이한 풀(pool)에 의한 처리 시에 감소하는 반면에, 포스포-PKCα/βⅡ의 수준은 영향을 받지 않았다. 따라서, 상기 데이타는 PKCμ가 포도막 흑색종에서의 역할을 한다는 것을 나타낸다. 유전자 이식 마우스 모델로부터의 데이타는 PKCε(10)를 나타낸다.
면역형광법
인간 원발성 및 hTERT/CDK4<R24C>/p53<DD> 멜라닌 세포는 6 웰 플레이트에서 커버 슬립 상에서 배양하였고, GNAQQ209L GNAQWT를 함유하는 렌티바이러스 벡터 또는 대조군으로서 빈 벡터에 의해 감염시켰다. 감염 5 일 후에, PBS 중 4% 포름알데히드에 의해 실온에서 10 분 동안 고정시키고, PBS 중 0.2 % Triton XlOO에 의해 실온에서 10 분 동안 투과시키며, 블로킹 단계로서 3% 소 혈청 알부민에 의해 실온에서 10 분 동안 항온 처리하였다. pERK (E-4, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), 시클린 D1(M-20, 산타 크루즈 바이오테크놀로지) 및 GNAQ(C-19, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 대한 항체를 Alexa Fluor 594 및 532 (Molecular Probes)에 의해 라벨 처리된 제2 항체를 이용하여 검출하였다. 회색 눈금 M4+CL 카메라 및 Isis software(메타시스템스(Metasystems), 독일 소재)가 구비된 Axio Image Ml 현미경(짜이즈(Zeiss), 독일 소재)에 의해 고정된 노출을 얻었다. 개별 세포의 형광 밀도는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량화하고, 평균 픽셀 강도는 마이크로소프트 엑셀 및 데이타 데스크를 이용한 통계 분석을 위해 이용하였다.
연질 우무 분석
GNAQQ209L, GNAQWT, NRASQ61R 또는 벡터 대조군을 안정하게 발현하는 인간 원발성 멜라닌 세포(10 x 104) 및 hTERT/CDK4R24C/p53DD를 0.35% 우무를 함유하는 완전 매질에 현탁시키고, 6 웰 플레이트 중 0.5% 우무의 낮은 층 상에 플레이팅하였다. 28 일 후, 세포를 0.005%의 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 군체로부터의 이미지를 600 dpi에서 평판 스캐너를 이용하여 캡쳐링하였다. 군체 수 및 크기는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다.
세포 주기 분석
siRNA에 의해 트랜스펙션 처리된 Mel202 세포를 트립신화시키고, 저온 PBS에 의해 세척하고, 70% 에탄올로 고정시켰다. 고정된 세포를 RN아제 염색 완충액(BD Pharmingen) 중 요오드화프로피듐에 의해 염색시켰다. 세포 주기 측정은 최소 20,000 사건으로 FACSCalibur(BD Biosciences) 상에서 실시하였으며, Flow Jo 및 ModFit을 이용하여 프로파일을 분석하였다.
siRNA 트랜스펙션
Mel202를 RPMI/10% FCS로 6 웰 또는 96 웰 플레이트에서 각각 웰당 1.5 x lO5 또는 5 x 103 세포로 플레이팅 처리하였다. 2개의 상이한 풀이 비교되며; 각각 4개의 siRNA 중복 부위(디하마콘(Dharmacon))를 포함한다(풀 1: 5'-CAAUAAGGCUCAUGCACAAUU-S'(서열 확인 번호:8), 5'-CGACGAGAAUAUCAAUUAUUU-3'(서열 확인 번호:9), 5'-GCAAGAGUACGUUUAUCAAUU-S'(서열 확인 번호:10), 5'-UAGUAGCGCUUAGUGAAUAUU-3'(서열 확인 번호:11); 풀 2: 5'-AUGCACAAUUAGUUCGAGAUU-S'(서열 확인 번호:12), 5'-UAUGAUAGACGACGAGAAUUU-S'(서열 확인 번호:13), 5'-CAGACAAUGAGAACCGAAUUU-S'(서열 확인 번호:14), 5'-CGCCACAGACACCGAGAAUUU-3'(서열 확인 번호:15)). 대조군 siRNA는 항시클로필린 B 및 비표적 siRNA(둘다 디하마콘)을 포함하였다. 모든 트랜스펙션은 100 nM의 최종 농도에서 Lipofectamine RNAiMax (1 μl/pmol siRNA)을 사용하여 실시하였다. siRNA 착물은 Optimem에서 형성되었다. 세포는 트랜스펙션 72∼96 시간 후에 분석을 위해 용해시켰다.
웨스턴 블롯 분석
세포를 빙냉 PBS에 의해 2회 세척하고, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제 칵테일 및 EDTA (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnologies))가 보충된 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.8, 1% NP-4O, 10% 글리세롤, 15O mM NaCl, 1 % 데옥시콜린산나트륨, 1% 황산도데실나트륨)에서 용해시켰다. 세포 용해물의 단백질 함량은 BCA 단백질 분석 시약(피어스 바이오테크놀로지)에 의해 측정하였다. 5∼20 μg의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 면역검출을 위해 Immobilon-P 멤브레인(밀리포어(Millipore)) 상으로 이송하였다. 사용된 원발성 항체는 pERK(E-4, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 시클린 D1(M-20, 산타 크루즈 바이오테크놀로지) 및 GNAQ(C-19, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), Phospho-Akt(736E11, 세포 신호 전달), Cyclophilin B (에이빔(Abeam)), 항-FLAG M2(시그마(Sigma)), 항-ERK 1/2 pAb (프로메가) 및 β-액틴(시그마)이었다. 호스 라디쉬 퍼옥시다제 라벨 처리된 염소 항-마우스 또는 항-토끼(업스테이트(Upstate)를 제2 항체로서 사용하였다.
통계 분석
면역형광 데이타 및 CyQUANT 측정은 스튜던트의 t 검정을 이용하여 분석하였다. 피셔의 정확 검정을 사용하여 비전형적인 세포의 비율을 비교하였다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개 문헌, 특히 접속 번호 및 특허 공개는 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허 출원이 참조 인용되는 것으로 특정적이고 개별적으로 명시되는 바와 같이 본 원에서 참조 인용된다.
상기 발명이 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 자세하게 기술되었지만, 본 발명의 교시를 고려하여 당업자라면 임의의 변경예 및 수정예가 첨부된 청구의 범위의 사상 또는 범위를 벗어남 없이 본 원에서 이행될 수 있다는 것을 용이하게 이해하게 된다.
예시적 GNAQ 서열:
서열 확인 번호:1 접속 번호 NM 002072 인간 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질) q (GNAQ), mRNA
1 agggggtgcc ggcggggctg cagcggaggc actttggaag aatgactctg gagtccatca
61 tggcgtgctg cctgagcgag gaggccaagg aagcccggcg gatcaacgac gagatcgagc
121 ggcagctccg cagggacaag cgggacgccc gccgggagct caagctgctg ctgctcggga
181 caggagagag tggcaagagt acgtttatca agcagatgag aatcatccat gggtcaggat
241 actctgatga agataaaagg ggcttcacca agctggtgta tcagaacatc ttcacggcca
301 tgcaggccat gatcagagcc atggacacac tcaagatccc atacaagtat gagcacaata
361 aggctcatgc acaattagtt cgagaagttg atgtggagaa ggtgtctgct tttgagaatc
421 catatgtaga tgcaataaag agtttatgga atgatcctgg aatccaggaa tgctatgata
481 gacgacgaga atatcaatta tctgactcta ccaaatacta tcttaatgac ttggaccgcg
541 tagctgaccc tgcctacctg cctacgcaac aagatgtgct tagagttcga gtccccacca
601 cagggatcat cgaatacccc tttgacttac aaagtgtcat tttcagaatg gtcgatgtag
661 ggggccaaag gtcagagaga agaaaatgga tacactgctt tgaaaatgtc acctctatca
721 tgtttctagt agcgcttagt gaatatgatc aagttctcgt ggagtcagac aatgagaacc
781 gaatggagga aagcaaggct ctctttagaa caattatcac atacccctgg ttccagaact
841 cctcggttat tctgttctta aacaagaaag atcttctaga ggagaaaatc atgtattccc
901 atctagtcga ctacttccca gaatatgatg gaccccagag agatgcccag gcagcccgag
961 aattcattct gaagatgttc gtggacctga acccagacag tgacaaaatt atctactccc
1021 acttcacgtg cgccacagac accgagaata tccgctttgt ctttgctgcc gtcaaggaca
1081 ccatcctcca gttgaacctg aaggagtaca atctggtcta attgtgcctc ctagacaccc
1141 gccctgccct tccctggtgg gctattgaag atacacaaga gggactgtat ttctgtggaa
1201 aacaatttgc ataatactaa tttattgccg tcctggactc tgtgtgagcg tgtccacaga
1261 gtttgtagta aatattatga ttttatttaa actattcaga ggaaaaacag aggatgctga
1321 agtacagtcc cagcacattt cctctctatc ttttttttag gcaaaacctt gtgactcagt
1381 gtattttaaa ttctcagtca tgcactcaca aagataagac ttgtttcttt ctgtctctct
1441 ctctttttct tttctatgga gcaaaacaaa gctgatttcc cttttttctt cccccgctaa
1501 ttcatacctc cctcctgatg tttttcccag gttacaatgg cctttatcct agttccattc
1561 ttggtcaagt ttttctctca aatgatacag tcaggacaca tcgttcgatt taagccatca
1621 tcagcttaat ttaagtttgt agtttttgct gaaggattat atgtattaat acttacggtt
1681 ttaaatgtgt tgctttggat acacacatag tttctttttt aatagaatat actgtcttgt
1741 ctcactttgg actgggacag tggatgccca tctaaaagtt aagtgtcatt tcttttagat
1801 gtttaccttc agccatagct tgattgctca gagaaatatg cagaaggcag gatcaaagac
1861 acacaggagt cctttctttt gaaatgccac gtgccattgt ctttcctccc ttctttgctt
1921 ctttttctta ccctctcttt caattgcaga tgccaaaaaa gatgccaaca gacactacat
1981 taccctaatg gctgctaccc agaacctttt tataggttgt tcttaatttt tttgttgttg
2041 ttgttcaagc ttttcctttc ttttttttct tagtgtttgg gccacgattt taaaatgact
2101 tttattatgg gtatgtgttg ccaaagctgg ctttttgtca aataaaatga atacgaactt
2161aaaaaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa
서열 확인 번호:2 접속 번호 NP 002063.2 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질), q 폴리펩티드[호모 사피엔스]
1 mtlesimacc lseeakearr indeierqir rdkrdarrel kllllgtges gkstfikqmr
61 nhgsgysde dkrgftklvy qniftamqam iramdtlkip ykyehnkaha qlvrevdvek
121 vsafenpyvd aikslwndpg lqecydrrre yqlsdstkyy lndldrvadp aylptqqdvl
181 rvrvpttgn eypfdlqsvi frmvdvggqr serrkwihcf envtsimflv alseydqvlv
241 esdnenrmee skalfrtnt ypwfqnssvi lflnkkdlle ekimyshlvd yfpeydgpqr
301 daqaarefil kmfvdlnpds dkiiyshftc atdtenirfv faavkdtilq lnlkeynlv
SEQUENCE LISTING <110> Bastian, Boris C. Van Raamsdonk, Catherine D. Barsh, Gregory S. The Regents of the University of California The University of British Columbia The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University <120> Gnaq Mutations in Melanoma <130> 02307O-177810PC <140> WO PCT/US08/53484 <141> 2008-02-08 <150> US 60/900,479 <151> 2007-02-08 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2188 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> guanine nucleotide binding protein (G protein) q polypeptide (GNAQ, GAQ, G-alpha-q, Galphaq) cDNA <220> <221> CDS <222> (42)..(1121) <223> Gnaq <400> 1 agggggtgcc ggcggggctg cagcggaggc actttggaag aatgactctg gagtccatca 60 tggcgtgctg cctgagcgag gaggccaagg aagcccggcg gatcaacgac gagatcgagc 120 ggcagctccg cagggacaag cgggacgccc gccgggagct caagctgctg ctgctcggga 180 caggagagag tggcaagagt acgtttatca agcagatgag aatcatccat gggtcaggat 240 actctgatga agataaaagg ggcttcacca agctggtgta tcagaacatc ttcacggcca 300 tgcaggccat gatcagagcc atggacacac tcaagatccc atacaagtat gagcacaata 360 aggctcatgc acaattagtt cgagaagttg atgtggagaa ggtgtctgct tttgagaatc 420 catatgtaga tgcaataaag agtttatgga atgatcctgg aatccaggaa tgctatgata 480 gacgacgaga atatcaatta tctgactcta ccaaatacta tcttaatgac ttggaccgcg 540 tagctgaccc tgcctacctg cctacgcaac aagatgtgct tagagttcga gtccccacca 600 cagggatcat cgaatacccc tttgacttac aaagtgtcat tttcagaatg gtcgatgtag 660 ggggccaaag gtcagagaga agaaaatgga tacactgctt tgaaaatgtc acctctatca 720 tgtttctagt agcgcttagt gaatatgatc aagttctcgt ggagtcagac aatgagaacc 780 gaatggagga aagcaaggct ctctttagaa caattatcac atacccctgg ttccagaact 840 cctcggttat tctgttctta aacaagaaag atcttctaga ggagaaaatc atgtattccc 900 atctagtcga ctacttccca gaatatgatg gaccccagag agatgcccag gcagcccgag 960 aattcattct gaagatgttc gtggacctga acccagacag tgacaaaatt atctactccc 1020 acttcacgtg cgccacagac accgagaata tccgctttgt ctttgctgcc gtcaaggaca 1080 ccatcctcca gttgaacctg aaggagtaca atctggtcta attgtgcctc ctagacaccc 1140 gccctgccct tccctggtgg gctattgaag atacacaaga gggactgtat ttctgtggaa 1200 aacaatttgc ataatactaa tttattgccg tcctggactc tgtgtgagcg tgtccacaga 1260 gtttgtagta aatattatga ttttatttaa actattcaga ggaaaaacag aggatgctga 1320 agtacagtcc cagcacattt cctctctatc ttttttttag gcaaaacctt gtgactcagt 1380 gtattttaaa ttctcagtca tgcactcaca aagataagac ttgtttcttt ctgtctctct 1440 ctctttttct tttctatgga gcaaaacaaa gctgatttcc cttttttctt cccccgctaa 1500 ttcatacctc cctcctgatg tttttcccag gttacaatgg cctttatcct agttccattc 1560 ttggtcaagt ttttctctca aatgatacag tcaggacaca tcgttcgatt taagccatca 1620 tcagcttaat ttaagtttgt agtttttgct gaaggattat atgtattaat acttacggtt 1680 ttaaatgtgt tgctttggat acacacatag tttctttttt aatagaatat actgtcttgt 1740 ctcactttgg actgggacag tggatgccca tctaaaagtt aagtgtcatt tcttttagat 1800 gtttaccttc agccatagct tgattgctca gagaaatatg cagaaggcag gatcaaagac 1860 acacaggagt cctttctttt gaaatgccac gtgccattgt ctttcctccc ttctttgctt 1920 ctttttctta ccctctcttt caattgcaga tgccaaaaaa gatgccaaca gacactacat 1980 taccctaatg gctgctaccc agaacctttt tataggttgt tcttaatttt tttgttgttg 2040 ttgttcaagc ttttcctttc ttttttttct tagtgtttgg gccacgattt taaaatgact 2100 tttattatgg gtatgtgttg ccaaagctgg ctttttgtca aataaaatga atacgaactt 2160 aaaaaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2188 <210> 2 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> guanine nucleotide binding protein (G protein) q polypeptide (Gnaq, GAQ, G-alpha-q, Galphaq) <400> 2 Met Thr Leu Glu Ser Ile Met Ala Cys Cys Leu Ser Glu Glu Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Arg Arg Ile Asn Asp Glu Ile Glu Arg Gln Leu Arg Arg Asp 20 25 30 Lys Arg Asp Ala Arg Arg Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly 35 40 45 Glu Ser Gly Lys Ser Thr Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Ser Asp Glu Asp Lys Arg Gly Phe Thr Lys Leu Val Tyr 65 70 75 80 Gln Asn Ile Phe Thr Ala Met Gln Ala Met Ile Arg Ala Met Asp Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Pro Tyr Lys Tyr Glu His Asn Lys Ala His Ala Gln Leu 100 105 110 Val Arg Glu Val Asp Val Glu Lys Val Ser Ala Phe Glu Asn Pro Tyr 115 120 125 Val Asp Ala Ile Lys Ser Leu Trp Asn Asp Pro Gly Ile Gln Glu Cys 130 135 140 Tyr Asp Arg Arg Arg Glu Tyr Gln Leu Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Tyr 145 150 155 160 Leu Asn Asp Leu Asp Arg Val Ala Asp Pro Ala Tyr Leu Pro Thr Gln 165 170 175 Gln Asp Val Leu Arg Val Arg Val Pro Thr Thr Gly Ile Ile Glu Tyr 180 185 190 Pro Phe Asp Leu Gln Ser Val Ile Phe Arg Met Val Asp Val Gly Gly 195 200 205 Gln Arg Ser Glu Arg Arg Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Thr 210 215 220 Ser Ile Met Phe Leu Val Ala Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Val Leu Val 225 230 235 240 Glu Ser Asp Asn Glu Asn Arg Met Glu Glu Ser Lys Ala Leu Phe Arg 245 250 255 Thr Ile Ile Thr Tyr Pro Trp Phe Gln Asn Ser Ser Val Ile Leu Phe 260 265 270 Leu Asn Lys Lys Asp Leu Leu Glu Glu Lys Ile Met Tyr Ser His Leu 275 280 285 Val Asp Tyr Phe Pro Glu Tyr Asp Gly Pro Gln Arg Asp Ala Gln Ala 290 295 300 Ala Arg Glu Phe Ile Leu Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser 305 310 315 320 Asp Lys Ile Ile Tyr Ser His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn 325 330 335 Ile Arg Phe Val Phe Ala Ala Val Lys Asp Thr Ile Leu Gln Leu Asn 340 345 350 Leu Lys Glu Tyr Asn Leu Val 355 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:antisense RNA for depleting protein kinase C (PKC) alpha mRNA <400> 3 gttctcgctg gtgagtttca 20 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic GNAQ exon 5 PCR primer <400> 4 cccacaccct actttctatc atttac 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic GNAQ exon 5 PCR primer, Gnaq Q209 mutation PCR primer <400> 5 ttttccctaa gtttgtaagt agtgc 25 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic peptide nucleic acid (PNA) for detecting Gnaq Q209 mutations <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> peptide nucleic acid (PNA), phosphodiester backbone replaced by peptide backbone <220> <221> modified_base <222> (1) <223> t modified by acetyl (Ac) group <220> <221> modified_base <222> (15) <223> c modified by amide group (-CONH-2) <400> 6 tctctgacct ttggc 15 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic Gnaq Q209 mutation PCR primer <400> 7 atccattttc ttctctctga cc 22 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 1 siRNA <400> 8 caauaaggcu caugcacaau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 1 siRNA <400> 9 cgacgagaau aucaauuauu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 1 siRNA <400> 10 gcaagaguac guuuaucaau u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 1 siRNA <400> 11 uaguagcgcu uagugaauau u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 2 siRNA <400> 12 augcacaauu aguucgagau u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 2 siRNA <400> 13 uaugauagac gacgagaauu u 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 2 siRNA <400> 14 cagacaauga gaaccgaauu u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic pool 2 siRNA <400> 15 cgccacagac accgagaauu u 21

Claims (37)

  1. 환자에서 유래하는 생물학적 샘플에서 멜라닌 세포성 신생물 세포를 검출하는 방법으로서, 상기 생물학적 샘플에서 Gnaq 유전자에 활성화 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 돌연변이의 존재는 생물학적 샘플에 멜라닌 세포성 신생물 세포가 존재함을 나타내는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열 돌연변이는 Gnaq의 Gln 209를 인코딩하는 코돈에 존재하는 것인 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 돌연변이는 Q209L 또는 Q209P 치환인 것인 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출 단계는 생물학적 샘플로부터의 핵산 샘플에서의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 것인 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출 단계는 Gnaq 유전자에 선택적으로 혼성화하는 프로브와 상기 핵산 샘플을 접촉시키는 것 및 상기 혼성화된 프로브의 존재를 검출하여 서열 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는 것인 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 접촉 단계는 인시츄 혼성화로 실시하는 것인 검출 방 법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 검출 단계는 증폭 반응을 포함하는 것인 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, Gnaq 유전자의 돌연변이된 영역의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 검출 단계는 유전자에 의해 인코딩된 단백질에서의 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는 것인 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 안구 샘플 또는 피부 샘플인 것인 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 림프절, 폐, 간, 부신, 연조직 또는 골에서 유래하는 것인 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 흑색종 환자에서 유래하는 것인 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 흑색종은 포도막으로부터 발생하는 것인 검출 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 흑색종은 청색 모반으로부터 발생하는 것인 검출 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 흑색종은 만성 일광 손상 피부로부터 발생하는 것인 검출 방법.
  16. 치료 중인 환자에서 흑색종의 진전을 모니터링하는 방법으로서, 상기 환자에서 유래하는 생물학적 샘플에서 Gnaq 유전자에 서열 돌연변이를 갖는 세포의 숫적 변화를 검출하는 단계를 포함하며, Gnaq 돌연변이를 갖는 세포수의 변화는 상기 치료에 대한 환자의 반응을 나타내는 것인 모니터링 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 안구 또는 피부에서 유래하는 것인 모니터링 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 림프절, 간, 부신 또는 골에서 유래하는 것인 방법.
  19. 흑색종 환자에게 Gnaq 길항제를 투여하는 것을 포함하는, GNAQ에 활성화 돌연변이를 갖는 흑색종 세포의 증식을 억제하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Gnaq 길항제는 소분자인 것인 억제 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 Gnaq 길항제는 단백질 키나제 C 억제제인 것인 억제 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 Gnaq 길항제는 포스폴리파제 Cβ의 억제제인 것인 억제 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 Gnaq 길항제는 항체인 것인 억제 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 Gnaq 길항제는 siRNA인 것인 억제 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 흑색종 세포는 포도막 흑색종에서 유래하는 것인 억제 방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 흑색종 세포는 청색 모반으로부터 발생하는 것인 억제 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 흑색종 세포는 만성 일광 손상된 피부에서 유래하는 것인 억제 방법.
  28. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이는 Gnaq의 Gln 209을 인코딩하는 코돈에 존재하는 것인 억제 방법.
  29. Gnaq 억제제로 치료할 후보자인 흑색종 환자를 확인하는 방법으로서, 상기 환자에 존재하는 흑색종에서 유래하는 생물학적 샘플에서 Gnaq 유전자에 서열 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 돌연변이의 존재는 Gnaq 억제제로 치료할 후보자인 흑색종 환자를 나타내는 것인 확인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 돌연변이는 Gnaq의 Gln 209를 인코딩하는 코돈에 존재하는 것인 확인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 흑색종은 포도막 흑색종, 악성 청색 모반 또는 만성 일광 손상을 갖는 피부 상의 흑색종인 것인 확인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 검출 단계는 유전자에 의해 인코딩된 단백질에서 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는 것인 확인 방법.
  33. 모반이 흑색종으로 진전할 위험성을 측정하는 방법으로서, 모반에서 유래하 는 생물학적 샘플에서 Gnaq 유전자에 서열 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 돌연변이의 존재는 모반이 흑색종으로 진전될 위험성이 증가된 것을 나타내는 것인 측정 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 서열 돌연변이는 Gnaq의 Gln 209를 인코딩하는 코돈인 것인 측정 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 모반은 청색 모반인 것인 측정 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 모반은 Ota의 모반인 것인 측정 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 검출 단계는 유전자에 의해 인코딩된 단백질에서 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는 것인 측정 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PA8849001A1 (es) * 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
JP5855462B2 (ja) 2008-12-10 2016-02-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＧＮＡＱを標的としたｄｓＲＮＡ組成物および発現を阻害するための方法
MX2012004905A (es) * 2009-10-30 2012-07-23 Univ British Columbia Mutaciones gna11 en melanoma.
US9540620B2 (en) 2012-05-03 2017-01-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modulating G-alpha-Q signaling
US10544461B2 (en) 2013-04-16 2020-01-28 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic test for sturge-weber syndrome, klippel-trenaunay-weber syndrome, and port-wine stains (PWSS)
DK3087182T3 (da) * 2013-12-23 2019-06-24 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af cancer ved hjælp af aktivstoffer på basis af peptidnukleinsyrer
JO3589B1 (ar) 2014-08-06 2020-07-05 Novartis Ag مثبطات كيناز البروتين c وطرق استخداماتها

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2504903A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Sequenom, Inc. Method for identifying risk of melanoma and treatments thereof
WO2005047542A1 (en) 2003-10-16 2005-05-26 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Treatments for inhibiting development and progression of nevi and melanoma having braf mutations
EP1541695A1 (en) * 2003-12-09 2005-06-15 Nanogen Recognomics GmbH Use of a mutation in the BRAF gene for the determination of the malignancy of melanoma cells

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