KR20070085644A

KR20070085644A - 펩티드 보론산 화합물의 리포솜 제제

Info

Publication number: KR20070085644A
Application number: KR1020077012434A
Authority: KR
Inventors: 새뮤얼 잘립스키; 프랜시스 마틴
Original assignee: 앨자 코포레이션
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2007-08-27
Also published as: CN101094648A; AR051759A1; AU2005304880A1; NZ554951A; MX2007005497A; EA200701005A1; EP1807053A1; CN101094649A; KR20070085642A; CA2586348A1; WO2006052734A1; AU2005304881A1; JP2008519041A; ZA200705017B; UY29191A1; EP1807052A1; JP2008519040A; IL182967A0; WO2006052733A1; NI200700120A

Abstract

리포솜에 봉입된 펩티드 보론산 프로테아솜 저해제 화합물을 갖는 리포솜으로 구성되는 리포솜 조성물이 개시되어 있다. 보론산 화합물은 리포솜에 봉입된 폴리올과의 상호작용 후에, 보로네이트 에스테르 형태로 리포솜에 봉입된다. 일실시형태에 있어서, 리포솜은 친수성 폴리머쇄의 외부 코팅을 가지며, 대상의 악성 종양을 치료하는데 사용된다.

Description

펩티드 보론산 화합물의 리포솜 제제 {LIPOSOMAL FORMULATION OF PEPTIDE BORONIC ACIDS COMPOUNDS}

본 발명은 보론산 화합물을 포함하는 리포솜 조성물에 관한 것으로, 특히 보로네이트 에스테르 형태의 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포솜 조성물에 관한 것이다.

리포솜 또는 지질 이중층 소포는 수상을 캡슐화하는 동심원상으로 정리된 지질 이중층으로 구성되는 구형 소포이다. 리포솜은 수상 또는 지질 이중층에 포함된 치료제/진단제 전달 비히클 (delivery vehicle)로서 작용한다. 리포솜에 봉입된 형태의 약물의 전달에 의해, 약물에 따라, 예를 들면, 약물 독성 저하, 약물 동태 변경, 또는 약물 용해도 개선을 비롯한 다양한 이점을 제공할 수 있다. 친수성 폴리머쇄의 표면 코팅을 포함하도록 제형화된 경우의 리포솜, 소위 스틸스 (Stealth)^® 또는 장기 순환 리포솜은 부분적으로는 단핵식세포계에 의한 리포솜의 제거 저하로 인한 긴 혈액 순환 기간의 추가 이점을 제공한다. 종종 리포솜이 순서에 따라 주사 부위로부터 원하는 타겟 영역 또는 세포에 이르도록 장기간의 라이프타임을 요한다.

이상적으로, 이러한 리포솜은 (i) 고 로딩 효율, (ii) 고농도의 봉입된 화합 물, (iii) 안정한 형태, 즉 보관시에 화합물 누출이 거의 없는 봉입된 치료 또는 진단 화합물을 포함하도록 제조될 수 있다.

봉입할 화합물이 리포솜에 수동적으로 로딩되는 조건하에서 리포솜을 형성하는 방법이 공지되어 있다. 통상, 건조된 지질 박막은 수상 매질로 수화되어, 리포솜 생성시에 화합물을 수동적으로 봉입하는 다중막 소포를 형성한다. 화합물은 건조된 지질 박막에 포함된 친유성 화합물 또는 수화 매질에 함유된 수용성 화합물일 수 있다. 수용성 화합물에 대해서는 이러한 방법은 다소 양호하지 못한 캡슐화 효율을 가져오는데, 통상 최종 리포솜 현탁액 중의 전체 화합물 5 내지 20% 만이 캡슐화 형태로 되어 있다. 소포가 추가로 처리, 즉 압출에 의해 처리되는 경우에는 추가의 화합물이 손실되어, 작고 훨씬 더 균일한 크기로 된 리포솜이 얻어질 수 있다. 양호하지 못한 캡슐화 효율로 인해, 리포솜으로 로딩될 수 있는 화합물의 양이 제한되어, 제조시에 고가의 화합물 회수 비용을 가져올 수 있다.

용매 주입법 및 역 증발 상 접근법을 비롯한, 화합물이 로딩된 리포솜을 형성하기 위한 각종 다른 수동적 봉입 방법이 문헌에 제안되어 있다 [참조문헌: Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198, (1978)]. 상기 방법은 비교적 양호하지 못한 로딩 효율 및/또는 상이한 용매 처리 문제에 부딪힌다.

또한, 화합물이 비교적 가용성을 나타내는 고온에서 화합물을 미리 형성된 리포솜과 인큐베이션함으로써 화합물을 리포솜으로 수동적으로 로딩하여, 화합물이 이 온도에서 리포솜으로 평형을 이룬 다음, 리포솜의 온도를 저하시켜 리포솜 내에 화합물을 침전시키는 것이 제안되어 있다. 이러한 방법은 수동적 로딩 방법의 특성인 비교적 양호하지 못한 캡슐화 효율로 인해 제한된다. 또한, 화합물은 고온, 예를 들면 체온에서 리포솜으로부터 빠르게 손실될 수 있다.

인사이드 투 아웃사이드 (inside-to-outside) pH 또는 전기화학적 리포솜 구배에 대한 화합물 로딩은 이온화 화합물을 리포솜으로 로딩하는데 유용한 것으로 입증되었다. 이론적으로는, 매우 높은 로딩 효율은 적절한 구배, 예를 들면 2 내지 4 유닛의 pH 구배를 사용하고, 초기 로딩 조건을 적절히 선택함으로써 달성될 수 있다 [참조문헌: Nichols and Deamer, D., Biochim. Biophys. Acta 455: 269-171, (1976)]. 이러한 방법을 이용하면, 리포솜으로부터의 화합물 누출에 이어서, 리포솜으로부터의 이온 구배의 손실을 가져올 것이다. 따라서, 화합물은 이온 구배가 유지되는 한에서만 리포솜으로 캡슐화된 형태로 안정하게 보유될 수 있다.

이러한 구배 안정성 문제는 착수되어, 화합물 로딩을 위한 암모늄염 구배를 이용함으로써, 적어도 부분적으로 해결되었다 (참조문헌: Haran, G. et al., Biochim. Biophys. Acta 1151: 201-215, (1993)). 리포솜의 프로톤의 공급원으로서 작용하는 과량의 암모늄염은 보존시에 손실된 프로톤을 보충하는 배터리로서 작용함으로써, 프로톤 구배의 라이프타임을 증가시키므로, 리포솜으로부터의 누출속도를 감소시킨다. 상기 방법은 이온화 아민 화합물에 한정되어 있다.

구배 안정성 문제는 리포솜에 이온화 포획제를 포함시킴으로써 착수되어, 이온화 화합물에 대한 반대 이온으로 작용하고, 이들 간에 이온화 착물 및 침천물을 형성시켰다 (미국 특허 제6,110,491호). 리포솜 내부에 적어도 하나의 카복실기를 포함하는 약산성 화합물을 로딩하여 보유하기 위한 당업계에 기재된 또 하나의 접근법은 리포솜 내에 양이온을 포함시켜 화합물을 염석하거나 침전시키는 것이다 (미국 특허 제5,939,096호).

미국 특허 제5,380,531호에는 아미노산 또는 펩티드의 C 말단이 아미드 또는 메틸 에스테르 등의 비산성기로 변성되고, 변성된 아미노산 또는 펩티드는 막관통 이온 구배에 대하여 리포솜으로 로딩되는 봉입된 아미노산 또는 펩티드를 갖는 리포솜이 기재되어 있다. 변성된 아미노산 또는 펩티드는 약염기로서 작용하고, 화합물은 낮은 내부 리포솜 pH 및 높은 외부 리포솜 pH 구배에 의해 리포솜으로 드라이브된다. 화합물은 내부 리포솜 공간에 이를 때에 프론화되어, 프로톤화 형태로 보유된다.

치료 화합물을 리포솜으로 로딩하기 위한 이러한 각종 접근법에도 불구하고, 일부 화합물은 리포솜, 특히 임상 효과를 위해 높은 약물/지질 비율로 리포솜으로 로딩하기가 어렵다는 것이다. 이러한 화합물의 하나로는 이전에 PS-341 (Velcade^®, Millennium Pharmaceuticals, Inc, Cambridge, MA)로서 알려진 보르테조밉이다. 보르테조밉은 디펩티드 보론산 유도체로, K_i가 0.6 nmol/L인 고도로 선택적인 강력한 가역성 프로테아솜 저해제이다 (Adams, et al., Semin. Oncol., 28(6): 613-619 (2001)). 내셔널 캔서 인스티튜트 (National Cancer Institute)의 인비트로 스크린 (in vitro screen)으로 관찰한 바, 보르테조밉은 일련의 종양주에 대하여 세포독성을 나타내고 (Adams, Id.), 인간 전립선에서 항종양 활성을 나타내며 (Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6(9): 3719-3728 (2000); DiPaola et al., Hematol. Oncol. Clin. North Am., 15(3): 509-524 (2001)), 폐암 이종 이식 모델을 나타냈다 (Oyaizu et al., Oncol. Rep., 8(4): 825-829 (2001)).

보르테조밉 등의 펩티드 보론산 화합물은 통상 시퀀스의 산성 말단, C 말단에 아미노보론산을 포함하는 짧은 2 내지 4개의 아미노산 펩티드로 된 유도체이다 (참조문헌: Zembower et al., Int. J. Pept. Protein Res., 47(5): 405-413 (1996)). 보론산기와 활성 부위 세린 또는 히스티딘 부분 사이에 안정한 사면체 보레이트 착물을 형성하는 능력으로 인해, 펩티드 보론산은 강력한 세린-프로테아제 저해제이다. 이러한 활성은 종종 증대되며, 펩티드 보론산의 시퀀스를 변화시키고 비천연 아미노산 잔기 및 다른 치환기를 도입함으로써 특정 프로테아제에 대하여 고도의 특이성을 나타낸다. 이 때문에, 강력한 항바이러스 활성 (참조문헌: Priestley, E. S. and Decicco, C. P., Org. Lett., 2(20): 3095-3097 (2000); Bukhtiyarova, M. et al., Antivir. Chem. Chemother., 12(6): 367-73 (2001); Archer, S. J. et al., Chem. Biol., 9(1): 79-92 (2002); Priestley, E. S. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 12(21): 3199-202 (2002)) 및 세포 독성 (Teicher, B. A. et al., Clin. Cancer Res., 5(9): 2638-2645 (1999); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6(9): 3719-3728 (2000); Lightcap, E. S. et al., Clin. Chem., 46(5): 673-683 (2000); Adams, J., Semin. Oncol., 28(6): 613-619 (2001); Cusack, J. C., Jr. et al., Cancer Res., 61(9): 3535-3540 (2001); Shah, S. A. et al., J. Cell Biochem., 82(1): 110-122 (2001); Adams, J., Curr. Opin. Chem. Biol., 6(4): 493-500 (2002); Orlowski, R. Z. and Dees, E. C., Breast Cancer Res., 5(1): 1-7 (2002); Orlowski, R. Z. et al., J. Clin. Oncol., 20(22): 4420-4427 (2002); Schenkein, D., Clin. Lymphoma, 3(1): 49-55 (2002); Ling, Y. H., et al., Clin. Cancer Res., 9(3): 1145-1154 (2003))을 지닌 펩티드 보론산을 선택하게 된다. 이들 유도체는 다른 짧은 펩티드와 동일한 문제, 특히 매우 빠른 클리어런스 및 생체내에서의 타겟 부위의 도달 불능의 문제가 있다.

이러한 펩티드 보론산 화합물을 리포솜 캐리어로 봉입하는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 비교적 비극성인 디펩티드를 효과적으로 로딩하는 것과 관련하여 어려움이 있다. 이의 구조 및 이온화가 용이한 아미노기의 부재로부터 판단하건대, 화합물은 상술한 pH 구배 또는 암모늄 구배법을 통해 리포솜에 축적될 것 같지 않다. 수동적 캡슐화는 옵션이나, 화합물의 비극성 특성을 감안할 때, 지질막을 용이하게 통과하므로, 캡슐화된 약물이 용이하게 통과되어, 캡슐화된 약물이 시간에 따라 희석시에 방출될 것이다.

상술한 종래 기술의 예 및 이와 관련된 제한사항은 예시적이나 배타적인 것은 아니다. 종래 기술의 다른 제한사항은 본 명세서의 해석 및 도면의 조사시에 당업자에게 명백해질 것이다.

따라서, 본 발명의 한 측면에 있어서, 리포솜에 안정하게 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포솜 조성물이 제공된다.

다른 측면에 있어서, 펩티드 보로네이트 에스테르 형태로 리포솜에 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 갖는 리포솜 현탁액이 제공된다.

한 측면에 있어서, 본 명세서에 기재된 발명은 소포 형성 지질로 형성되는 리포솜, 및 리포솜에 봉입되고, 펩티드 보론산 화합물 및 폴리올로 제조되는 보로네이트 에스테르 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일실시형태에 있어서, 펩티드 보론산 화합물은 디펩티딜 보론산 화합물이나, 단 디펩티딜 보론산 화합물은 보르테조밉이 아니다.

또 하나의 실시형태에 있어서, 폴리올은 시스 1,2-디올 또는 1,3-디올 작용기를 갖는 화합물이다. 전형적인 폴리올은 폴리비닐알콜이다. 또 하나의 전형적인 폴리올은 카테콜이다. 다른 전형적인 폴리올은 단당류, 이당류, 올리고당 및 다당류이다. 단당류는 예를 들면, 말토스, 글루코스, 리보스, 프룩토스 또는 소르비톨일 수 있다. 폴리올은 또한 글리세롤 또는 폴리글리세롤, 또는 아미노소르비톨 등의 아미노폴리올일 수 있다. 특히, 비닐알콜과 비닐아민의 공중합체가 고찰된다.

또 하나의 실시형태에 있어서, 리포솜은 추가로 높은 내부/낮은 외부 이온 구배를 포함한다. 이온 구배는 예를 들면, 수소 이온 (pH) 구배일 수 있다. 이온 구배가 pH 구배인 경우에는, 리포솜의 내부 pH는 약 7.5 내지 8.5일 수 있고, 리포솜 외부 환경의 pH는 약 6 내지 7일 수 있다.

또 하나의 실시형태에 있어서, 리포솜은 추가로 친수성 폴리머로 유도체화된 소수성 부분을 약 1 내지 20 몰 퍼센트로 포함한다.

리포솜이 친수성 폴리머에 공유 결합된 소수성 부분을 포함하는 실시형태에 있어서, 바람직한 폴리머는 폴리에틸렌글리콜이다. 바람직한 소수성 부분은 지질, 바람직하게는 소포 형성 지질이다.

또 다른 측면에 있어서, 인간 환자의 치료를 위해 펩티드 보론산 화합물을 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 펩티드 보론산 화합물 및 폴리올로 형성되는 펩티딜 보로네이트 에스테르 화합물을 봉입된 형태로 갖는 수용액 상태의 리포솜 현탁액을 제조하고, 리포솜 현탁액을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

일실시형태에 있어서, 리포솜은 주사로 투여된다.

또 다른 측면에 있어서, 방사선 요법을 받는 암을 가진 대상의 종양 조직을 선택적으로 파괴하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 변성 폴리올에 공유 결합되어, 펩티딜 보로네이트 에스테르 화합물을 형성하는 봉입된 펩티드 보론산 화합물 및 붕소 동위원소를 갖는 리보솜을 암을 가진 대상에게 투여하고; 대상에게 중성자선 요법을 행하는 것을 포함한다.

일실시형태에 있어서, 붕소 동위원소는 ¹⁰B 등의 펩티드 보론산으로 되어 있다.

상술한 전형적인 측면 및 실시형태 이외에도, 추가의 측면 및 실시형태가 도면을 참조하여 하기 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.

정의:

"폴리올"은 하나 이상의 하이드록실 (-OH)기를 갖는 화합물을 의미한다.

"펩티드 보론산 화합물"은 하기 형태의 화합물을 의미한다:

상기식에서, R¹, R² 및 R³는 서로 동일하거나 상이할 수 있는 독립적으로 선택되는 부분이고, n은 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 4이나, 단 화합물은 하기 구조를 갖는 보르테조밉 (Pyz-Phe-boroLeu; Pyz: 2,5-피라진카복실산; PS-341; Velcade^®로도 공지됨)이 아니다:

전형적인 펩티드 보론산 화합물은 도 1a 내지 1p에 주어진다.

"친수성 폴리머"는 실온에서 수 중에서의 소량의 용해도를 갖는 폴리머를 의미한다. 전형적인 친수성 폴리머는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아미드 및 친수성 펩티드 시퀀스를 포함한다. 폴리머는 단독 중합체 또는 블록 또는 랜덤 공중합체로서 사용될 수 있다. 바람직한 친수성 폴리머쇄는 바람직하게는 분자량이 500 내지 10,000 Da, 더욱 바람직하게는 750 내지 10,000 Da, 보다 더 바람직하게는 750 내지 5000 Da인 PEG 쇄로서의 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이다.

"높은 내부/낮은 외부 pH 구배"는 리포솜 내부 (고 pH)와, 리포솜이 현탁되어 있는 외부 매질 (저 pH) 사이의 막관통 pH 구배를 말한다. 전형적으로, 내부 리포솜 pH는 외부 매질 pH 보다 1 이상의 pH 단위, 바람직하게는 2 내지 4 단위 크다.

"리포솜에 봉입된"은 리포솜의 중앙 수용성 컴파트먼트, 리포솜 지질 이중층 사이의 수용성 공간 또는 이중층 자체 내에 격리된 화합물을 의미한다.

II. 리포솜 제제

한 측면에 있어서, 본 발명은 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 갖는 리포솜 조성물을 제공한다. 본 섹션에서 리포솜 조성물 및 이의 제조방법이 설명될 것이다.

A. 리포솜 성분

상술한 바와 같이, 리포솜 제제는 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 함유하는 리포솜으로 구성된다. 펩티드 보론산 화합물은 펩티드 시퀀스의 산성 또는 C 말단에 α-아미노보론산을 포함하는 펩티드이다. 일반적으로, 펩티드 보론산 화합물은 하기 형태로 이루어져 있다:

상기식에서, R¹, R² 및 R³는 서로 동일하거나 상이할 수 있는 독립적으로 선택된 부분이고, n은 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 4이나, 단 R¹은 R²가 S-벤질이고 R³가 R-이소부틸인 경우에 2-피라지닐이 아니다. 측쇄로서 보론산을 갖는 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 포함하는 화합물도 고찰된다.

바람직하게는, R¹, R² 및 R³는 독립적으로 수소, 알킬, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아르알킬, 아르알콕시, 사이클로알킬 또는 복소환 중에서 선택되거나; R¹, R² 및 R³는 펩티드 골격에 인접 질소 원자를 갖는 복소환을 형성할 수 있다. 알콕시, 아르알킬 및 아르알콕시의 알킬 성분을 포함하는 알킬은 바람직하게는 탄소 원자수가 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 탄소 원자수가 1 내지 6이며, 선형 또는 분기형일 수 있다. 아릴옥시, 아르알킬 및 아르알콕시의 아릴 성분을 포함하는 아릴은 바람직하게는 단환 또는 이환 (즉, 2개의 축합환), 더욱 바람직하게는 벤질, 벤질옥시 또는 페닐 등의 단환이다. 아릴은 또한 헤테로아릴, 즉 푸릴, 피롤, 피리딘, 피라진 또는 인돌 등의 환 내에 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 갖는 방향족환이다. 사이클로알킬은 바람직하게는 탄소 원자수가 3 내지 6이다. 복소환은 환 내에 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 갖는 비방향족환, 바람직하게는 탄소 원자수가 3 내지 6인 5원환 내지 7원환을 말한다. 이러한 복소환은 예를 들면, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진 및 모르폴린을 포함한다. 사이클로알킬이나 복소환은 알킬, 예를 들면 사이클로헥실메틸과 결합될 수 있다.

상기 모든 기 (수소 제외)는 할로겐, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로; 하이드록시; 저급 알킬; 메톡시 또는 에톡시 등의 저급 알콕시; 케토; 알데히드; 카복실산, 에스테르, 아미드, 카보네이트 또는 카바메이트; 술폰산 또는 에스테르; 시아노; 일차, 이차 또는 삼차 아미노; 니트로; 아미디노; 및 티오 또는 알킬티오 중에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 기는 이러한 치환기를 기껏해야 2개 포함한다.

전형적인 펩티드 보론산 화합물은 도 1a 내지 1p에 도시되어 있다. 도 1a 내지 1p에 나타낸 R¹, R² 및 R³의 구체예로는 n-부틸 및 네오펜틸 (알킬); 페닐 또는 피라질 (아릴); 4-((t-부톡시카보닐)아미노)부틸, 3-(니트로아미디노)프로필 및 (1-사이클로펜틸-9-시아노)노닐 (치환된 알킬); 나프틸메틸 및 벤질 (아르알킬); 벤질옥시 (아르알콕시); 및 피롤리딘 (R²는 인접 질소 원자와 함께 복소환을 형성한다)을 들 수 있다.

일반적으로, 펩티드 보론산 화합물은 모노펩티드, 디펩티드, 트리펩티드 또는 고차 펩티드 화합물일 수 있다. 다른 전형적인 펩티드 보론산 화합물은 본 명세서에서 참조로 포함되는 미국 특허 제6,083,903호, 제6,297,217호 및 제6,617,317호에 기재되어 있다.

다수의 펩티드 보론산 화합물은 이온화가 용이한 아미노기를 필요로 하거나, 매우 극성이므로, 상술한 통상적인 리모트 로딩 절차를 이용하여 리포솜에 로딩하기가 곤란하다. 따라서, 도 2에 관해 설명되는 바와 같이, 펩티드 보론산 화합물이 펩티드 보로네이트 에스테르의 형태로 리포솜에 봉입되어 있는 리포솜 제제를 제공하도록 펩티드 보론산 화합물의 로딩 방법이 디자인되어 있다.

도 2는 단일 실선 (12)으로 나타내는 지질 이분자막을 갖는 리포솜 (10)을 도시한다. 다중막 리포솜에 있어서, 지질 이분자막이 그 사이에 수용성 공간을 갖는 다수의 지질 이중층으로 구성되어 있는 것을 알 수 있다. 리포솜 (10)은 외부 매질 (14)에 현탁되어 있고, 외부 매질의 pH는 약 7.0 이하이며, 일실시형태에 있어서는 7.0 미만이고, 다른 실시형태에 있어서는 약 5.5 내지 7.0, 보다 통상적으로는 약 6.0 내지 7.0이다. 리포솜 (10)은 지질 이분자막으로 한정되는 내부 수용성 컴파트먼트 (16)를 갖는다. 폴리올 (18)이 내부 수용성 컴파트먼트에 봉입되며, 이의 예는 하기에 주어진다. 내부 수용성 컴파트먼트의 pH는 바람직하게는 약 7.0 이상, 더욱 바람직하게는 약 7.1 내지 9.0, 보다 더 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8.5이다.

도 1b의 화합물로 도 2에 나타내는 펩티드 보론산 화합물, [(1R)-3-메틸-1-[[(2S)-1-옥소-3-(2-나프틸)-2-[피라지닐카보닐)아미노]프로필]아미노]부틸]보론산도 리보솜에 봉입된다. 천연 화합물의 하나 이상의 하이드록실 부분이 폴리올과 공유 결합 반응하여 에스테르 결합을 형성하기 때문에, 보로네이트 에스테르 화합물 형태로 리포솜에 봉입될 때의 펩티드 보론산 화합물은 천연 펩티드 보론산 화합물의 변형 형태임을 알 수 있다. 본 명세서에 사용된 펩티드 보론산 화합물은 천연 형태, 및 폴리올과의 반응 후의 변형 형태의 화합물을 포함한다. 본 명세서에 사용된 하나 이상의 하이드록실 (-OH)기를 갖는 화합물로서의 폴리올은 반응 후에 폴리올이 잔존하는 하이드록실기를 갖지 않거나, 1개의 잔존하는 하이드록실기를 가지거나, 1개 이상의 하이드록실기를 가질 수 있으므로, 펩티드 보론산 화합물과 반응하기 전의 폴리올을 의미한다. 변성 폴리올은 하이드록실기로부터 제거되는 적어도 하나의 수소 원자를 갖는 폴리올을 의미한다. 계속해서 도 2를 참조하면, 전형적인 펩티드 보론산 화합물은 지질 이분자막을 통과하기 전에 외부 수용성 매질에 나타난다. 외부 수용성 매질에 있어서, 화합물은 약간 산성을 띤 매질로 인해, 비전하성을 나타낸다. 이의 비전하성 상태에 있어서, 화합물은 지질 이중층을 통해 자유로이 침투할 수 있다. 보로네이트 에스테르의 생성에 의해 평형 이동이 일어나서, 추가의 화합물이 외부 매질로부터 지질 이중층을 통해 침투하여, 리포솜에 화합물이 축적된다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 외부 현탁액 매질의 pH가 낮고, 리포솜 내의 폴리올과 결합된 리포솜 내부의 pH가 약간 더 높으면, 리포솜의 수용성 내부 컴파트먼트에 약물이 축적된다. 일단 리포솜 내부에서는, 화합물은 폴리올과 반응하여, 보로네이트 에스테르를 형성한다. 보로네이트 에스테르는 본래 리포솜 이중층을 통과할 수 없으므로, 보로네이트 에스테르 형태의 약제 화합물이 리포솜 내부에 축적한다.

리포솜 내부의 폴리올의 농도는 하전기, 예를 들면 하이드록실기의 농도를 보론산 화합물의 농도보다 크게 하는 것이 바람직하다. 최종 약물 농도가 100 mM인 조성물에 있어서, 예를 들면 폴리머 하전기의 내부 화합물 농도는 통상 최대가 적어도 상기 농도일 것이다.

폴리올은 고 내부/저 외부 농도로 존재하고, 즉, 리포솜 지질 이분자막을 통해 폴리올의 농도 구배가 있다. 폴리올이 외부 벌크 상에 상당량으로 존재하는 경우에는, 폴리올은 외부 매질에서 펩티드 보론산 화합물과 반응하여, 화합물이 리포솜 내부에 서서히 축척된다. 따라서, 바람직하게는 리포솜은 후술하는 바와 같이, 조성물이 벌크 상 (외부 수상)에 실질적으로 폴리올을 포함하지 않도록 제조된다.

상술한 바와 같이, 본 명세서에 사용되는 폴리올은 하나 이상의 하이드록실기를 갖는 화합물을 의미한다. 알콜 하이드록실기를 포함하는 단량체 및 고분자 화합물이 고찰된다. 폴리올은 지방족 화합물, 환상 화합물 디올, 폴리페놀 등일 수 있고, 이의 예는 하기에 주어진다.

단량체 폴리올의 비한정적인 예로는 당, 글리세롤, 글리콜, 탄수화물, 아미노당 (특히, 아미노-소르비톨), 당 알콜, 데옥시소르비톨, 글루콘산, 타르타르산, 갈산 등을 들 수 있다. 말토스, 글루코스, 리보스, 프룩토스, 소르비톨 등의 단당은 모두 보로네이트 에스테르를 형성하는 것으로 공지되어 있으며, 기재된 순으로 에스테르 생성 성향이 증가된다 (참조 문헌: Myohanen, T. A., Biochem J., 197(3): 683-688 (1981)). 1-아미노-2-데옥시소르비톨은 보로네이트 에스테르 생성에 대하여 훨씬 더 높은 성향을 나타낸다 (참조 문헌: Shiino, D. et al., Biomaterials, 15: 121-128 (1994)). 기재된 당 중에서의 반응성 차이를 이용하여, 봉입 세기 구배를 갖는 리포솜 제제를 제조할 수 있으므로, 약물 방출 특성을 미조정 (fine-tuning)할 수 있다.

고분자 폴리올의 비한정적인 예로는 비닐알콜과 비닐아민의 공중합체, 폴리에테르, 폴리글리콜, 폴리에스테르, 폴리알콜 등을 들 수 있다. 고분자 폴리올의 구체예로는 올리고당, 다당류, 폴리글리세롤 (참조 문헌: Hebel, A. et al., J. Org. Chem., 67(26): 9452-9455 (2002)), 폴리(비닐알콜) (참조 문헌: Kitano, S. et al., Makromol. Chem. Rapid Commun., 12:227-233 (1991))을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 폴리올 폴리머는 1개 또는 수개의 약물 분자의 결합시에, 용해도 및 이중층 지질막을 통과하는 능력 등의 이의 특성을 변화시키지 않기 때문에, 바람직한 포획제이다.

폴리올로서 폴리페놀이 적합하고, 특히 카테콜 (카테킨, 플라비놀) 등의 오르토 디올을 갖는 것이 적합하다. 일실시형태에 있어서, 단독 또는 병용 혼합되는 그린 티 폴리페놀이 폴리올로서의 사용을 위해 고찰된다. (-)-에피갈로카테킨 3-갈레이트가 풍부한 그린 티 중에, 적어도 약 6개의 카테킨이 발견된다. 레드 와인의 폴리페놀도 적합하다.

바람직한 폴리올 화합물은 다수의 시스 1,2- 및/또는 1,3-디올기를 갖는 것이다.

적절한 폴리올을 동정하기 위해, 선택된 폴리올, 예를 들면 시스 1,2- 및/또는 1,3-디올 작용기를 갖는 것이 적절한 용매, 통상 물에 원하는 농도로, 선택된 pH, 통상 약 6 내지 8에서 가용화된다. 선택된 보론산 화합물은 원하는 리포솜으로 봉입되는 농도에 일치하는 농도로, 가용화된 폴리올에 가해진다. 적절한 인큐베이션 시간 후에, 혼합물에 대하여 침전물 육안 검사 또는 분석 기술에 의해 보로네이트 에스테르 생성을 검사한다. 일실시형태에 있어서, 리포솜 내부의 약산염의 침전물을 제외한 보로네이트 에스테르의 침전물의 생성을 고찰한다. 적절한 폴리올을 동정하는 이러한 방법은 특히 고분자 폴리올의 동정에 적당하다.

조성물 중의 리포솜은 주로 소포 형성 지질로 구성되어 있다. 이러한 소포 형성 지질은 인지질과 같이, 이분자막의 내부 소수성 영역과 접촉하는 이의 소수성 부분 및 막의 외부 극성 표면을 향해 배향되는 이의 헤드 기를 갖는 것으로서, 수 중에서 이중층 소포로 자발적으로 형성될 수 있는 것이다. 콜레스테롤 및 이의 각종 유사체 등의 지질 이중층으로 안정하게 혼입될 수 있는 지질도 리포솜에 사용될 수 있다. 소포 형성 지질은 바람직하게는 2개의 탄화수소쇄, 통상 아실쇄, 및 극성 또는 비극성의 헤드 기를 갖는 지질이다. 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고미엘린 등의 인지질을 포함하는, 각종 합성 소포 형성 지질 및 천연 소포 형성 지질이 존재하며, 2개의 탄화수소쇄는 통상 길이가 약 14 내지 22개의 탄소 원자수로 이루어지고, 다양한 불포화도를 갖는다. 이의 지방족쇄가 다양한 포화도를 갖는 상술한 지질 및 인지질은 시판되거나, 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 다른 적절한 지질로는 당지질, 세레브로시드, 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 들 수 있다.

소포 형성 지질은 특정의 유동도 또는 강성도를 달성하고, 혈청 내의 리포솜의 안정성을 제어하고/하거나 리포솜 내의 봉입제의 방출속도를 제어하도록 선택될 수 있다. 더욱 견고한 지질 이중층 또는 액정 이중층을 갖는 리포솜은 비교적 견고한 지질, 예를 들면 비교적 높은 상전이 온도, 예를 들면 60℃ 이하를 갖는 지질을 혼입함으로써 달성된다. 견고한, 즉, 포화 지질은 지질 이중층의 높은 막 강성에 기여한다. 콜레스테롤 등의 다른 지질 성분도 지질 이중층 구조의 막 강성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 한편, 지질 유동성은 비교적 유동적인 지질, 통상 예를 들면 실온 또는 실온 이하의 온도에서 비교적 낮은 액체-액정 상전이 온도를 갖는 지질상을 갖는 것을 혼입함으로써 달성된다.

리포솜은 친수성 폴리머에 공유 결합된 소포 형성 지질을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들면 미국 특허 제5,013,556호에 기재된 바와 같이, 리포솜 조성물 중의 이러한 폴리머로 유도체화된 지질은 리포솜 주위에 친수성 폴리머쇄의 표면 코팅을 형성한다. 친수성 폴리머쇄의 표면 코팅은 이러한 코팅을 필요로 하는 리포솜과 비교하여, 리포솜의 생체 내 혈액순환 기간을 증가시키는 것이 효과적이다. 메톡시(폴리에틸렌글리콜) (mPEG) 및 포스파티딜에탄올아민 (예를 들면, 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (DSPE) 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민)으로 구성되는 폴리머로 유도체화된 지질은 다양한 mPEG 분자량 (350, 550, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 Da)으로 아반티 폴라 리피드, 인코포레이티드 (Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL)로부터 얻어질 수 있다. mPEG-세라미드의 리포폴리머도 아반티 폴라 리피드, 인코포레이티드로부터 구입할 수 있다. 지질-폴리머 컨쥬게이트의 제법도 문헌에 기재되어 있다 (참조: 미국 특허 제5,631,018호, 제6,586,001호 및 제5,013,556호; Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 8: 111(1997); Zalipsky, S. et al., Meth. Enzymol., 387: 50 (2004)). 이들 리포폴리머는 최소 분자량 분산도를 갖는 특정한 고 순도의 균질 물질로서 제조될 수 있다 (참조 문헌: Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 8: 111 (1997); Wong, J. et al., Science, 275: 820 (1997)). 리포폴리머는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,586,001호에 기재된 폴리머-디스테아로일 컨쥬게이트 등의 "중성" 리포폴리머일 수도 있다.

지질-폴리머 컨쥬게이트가 리포솜에 포함되는 경우에는, 통상 지질-폴리머 컨쥬게이트의 1 내지 20 몰 퍼센트가 전체 지질 혼합물에 혼입된다 (예를 들면, 미국 특허 제5,013,556호 참조).

리포솜은 본 명세서에서 '리포폴리머-리간드 컨쥬게이트'로도 불리우는 지질-폴리머-리간드 컨쥬게이트를 형성하는 리간드를 포함하도록 변성된 리포폴리머를 추가로 포함할 수 있다. 리간드는 약물 또는 생체 내에서 활성을 갖는 생체 분자 등의 치료 분자, 조영제 또는 생체 분자 등의 진단 분자, 또는 결합 파트너, 바람직하게는 세포 표면상의 결합 파트너에 대하여 결합 친화성을 갖는 타겟팅 분자일 수 있다. 바람직한 리간드는 세포 표면에 대한 결합 친화성을 가지며, 내재화를 통해 리포솜을 세포질로의 혼입을 촉진시킨다. 이러한 리포폴리머-리간드를 포함하는 리포솜 내에 존재하는 리간드는 리포솜 표면으로부터 외향으로 배향되어 있으므로, 이의 동종 수용체와의 상호작용에 사용가능하다.

리간드를 리포폴리머에 결합하기 위한 방법은 공지되어 있으며, 폴리머가 선택된 리간드와의 후속 반응을 위해 작용화될 수 있다 (참조 문헌: 미국 특허 제6, 180,134호; Zalipsky, S. et al., FEBS Lett., 353: 71 (1994); Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 4: 296 (1993); Zalipsky, S. et al., J. Control. Rel., 39: 153 (1996); Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 8(2): 111 (1997); Zalipsky, S. et al., Meth. Enzymol., 387: 50 (2004)). 작용화된 폴리머-지질 컨쥬게이트도 말단 작용화된 PEG-지질 컨쥬게이트 (Avanti Polar Lipids, Inc. 제)와 같이 시판될 수 있다. 리간드와 폴리머 사이의 결합은 안정한 공유 결합, 또는 pH 변화 또는 환원제의 존재 등의 자극에 따라 파괴되는 해제가능한 결합일 수 있다.

리간드는 세포 수용체 또는 혈액 중에 순환하는 병원체에 대하여 결합 친화성을 갖는 분자일 수 있다. 리간드는 또한 치료 또는 진단 분자, 특히 유리 형태로 투여될 때에 짧은 혈액 순환 기간을 갖는 분자일 수도 있다. 일실시형태에 있어서, 리간드는 생물학적 리간드, 바람직하게는 세포 수용체에 대하여 결합 친화성을 갖는 것이다. 전형적인 생물학적 리간드는 CD4, 폴산염, 인슐린, LDL, 비타민, 트랜스페린, 아시알로글리코프로테인, E, L 및 P 셀렉틴 등의 셀렉틴, Flk-1,2, FGF, EGF, 인테그린, 특히 α₄β₁, α_vβ₃, α_vβ₁, α_vβ₅, α_vβ₆ 인테그린, HER2, 및 기타에 관한 수용체에 대하여 결합 친화성을 갖는 분자이다. 바람직한 리간드는 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv (중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어지는 단편), 및 scFv (경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 재조합 일본쇄 폴리펩티드 분자) 등의, 항체 및 항체 단편을 포함하는 단백질 및 펩티드를 포함한다. 리간드는 또한 소분자 펩티토미메틱 (peptidomimetic)일 수도 있다. 세포 표면 수용체 또는 이의 단편이 리간드로서 작용할 수 있다는 것을 알 수 있다. 다른 전형적인 타겟팅 리간드는 비타민 분자 (예를 들면, 비오틴, 폴산염, 시아노코발아민), 올리고펩티드, 올리고당을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 다른 전형적인 리간드는 본 명세서에서 참조로 포함되는 미국 특허 제6,214,388호, 제6,316,024호, 제6,056,973호, 제6,043,094호에 기재되어 있다.

B. 리포솜 제제의 제조

펩티드 보론산 화합물은 리포솜에 봉입된 폴리올 상의 하이드록실 작용기와 펩티드 보론산 화합물 사이의 보로네이트 에스테르의 생성에 의해 리포솜 내부에 축적되어 포획된다. 간단히 말하면, 폴리올은 리포솜 내에 배치되고, 펩티드 보론산 화합물은 리포솜 지질 이분자막을 통해 확산되어, 화합물은 봉입된 폴리올과 반응하여 보로네이트 에스테르 화합물을 생성함으로써, 리포솜 내에 화합물 (변형 형태)을 봉입하는 것이다.

일실시형태에 있어서, 프로세스는 폴리올의 존재와 함께, pH에 의해 드라이브되는 바, 리포솜 외부의 낮은 pH (예를 들면, pH 6 내지 7) 및 리포솜 내부의 약간 높은 pH (pH 7.5 내지 8.5)에 의해, 화합물이 축적되어 로딩된다. 본 실시형태에 있어서, 조성물은 폴리올의 높은 내부/낮은 외부 구배를 갖는 리포솜을 제형화함으로써 제조된다. 상술한 바와 같이 선택된 폴리올의 수용액은 상술한 바와 같이 측정된 원하는 농도로 제조된다. 폴리올 용액이 후술하는 지질 수화에 적합한 점도를 갖는 것이 바람직하다. 폴리올 수용액의 pH는 약 7.0 보다 큰 것이 바람직하다.

폴리올 수용액은 소포 형성 지질, 비소포 형성 지질 (예: 콜레스테롤, DOPE 등), 리포폴리머 (예: mPEG-DSPE), 및 다른 원하는 지질 이중층 성분의 원하는 혼합물로 제조된 건조된 지질 박막의 수화에 사용된다. 건조된 지질 박막은 적절한 용매, 통상 휘발성 유기 용매 중에 선택된 지질을 용해시키고, 용매를 증발시켜 건조된 박막을 얻음으로써 제조된다. 지질 박막은 약 7.0 보다 큰 pH로 조정된 폴리올을 함유하는 용액으로 수화시켜 리포솜을 생성한다.

실시예 1은 리피드 에그 포스파티딜콜린 (PC), 콜레스테롤 (CHOL) 및 폴리에틸렌글리콜로 유도체화된 디스테아롤포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE)으로 구성되는 리포솜의 제법을 설명한다. 몰 비가 10:5:1 PC:CHOL:PEG-DSPE인 지질을 클로로포름에 용해시키고, 용매를 증발시켜, 지질 박막을 형성시킨다. 지질 박막은 pH 7.5의 폴리비닐알콜 수용액으로 수화시켜, 내부에 폴리올이 봉입된 리포솜을 생성시킨다.

리포솜 생성 후에, 리포솜은 크기에 따라 분류하여, 실질적으로 균일한 크기 범위, 통상 약 0.01 내지 0.5 마이크론, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.40 마이크론을 갖는 리포솜 군을 얻을 수 있다. REVs 및 MLVs에 대한 하나의 유효 사이징법은 0.03 내지 0.2 마이크론, 통상 0.05, 0.08, 0.1 또는 0.2 마이크론 범위의 선택된 균일한 구멍 크기를 갖는 일련의 폴리카보네이트 막을 통해 리포솜의 수성 현탁액을 압출하는 것을 포함한다. 막의 구멍 크기는 막을 통한 압출, 특히 제제가 동일한 막을 통해 2회 이상 압출됨으로써 얻어진 리포솜의 최대 크기와 대략 일치한다. 호모지나이즈법 (homogenization method)은 또한 리포솜을 100 nm 이하의 크기로 다운사이징하는데 유용하다 (참조 문헌: Martin, F.J., in SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, P. Tyle, Ed., Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)).

사이징 후에, 비캡슐화된 벌크 상 폴리올은 정용 여과, 투석, 원심분리, 사이즈 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 등의 적절한 수법에 의해 제거되어, 내부에 고농도의 폴리올, 바람직하게는 외부에 폴리올이 거의 없거나 전혀 없는 리포솜 현탁액을 얻는다. 또한 리포솜 생성 후에, 리포솜의 외부 상은 적정, 투석 등에 의해 약 7.0 미만의 pH로 조정된다.

그 다음에, 봉입할 펩티드 보론산 화합물은 리포솜으로의 활성 로딩을 위해 리포솜 분산액에 가해진다. 가해진 펩티드 보론산 화합물의 양은 100% 캡슐화 효율, 즉 가해진 모든 화합물이 결국 보로네이트 에스테르 형태의 리포솜으로 로딩되는 것을 가정하여, 캡슐화할 약물의 전체량으로부터 측정될 수 있다.

화합물은 및 리포솜 분산액의 혼합물은 리포솜 내의 침전물의 형성으로도 알 수 있는 바와 같이, 벌크 매질 중의 화합물의 농도의 수 배인 화합물 농도로 리포솜에 의해 화합물을 흡수할 수 있는 조건하에서 인큐베이션된다. 리포솜 내의 침전물 형성은 예를 들면, 표준 전자 현미경법 또는 X선 회절법에 의해 확인될 수 있다. 전형적으로, 인큐베이션은 승온에서, 바람직하게는 리포솜 지질의 주 상전이 온도 T_m 또는 그 이상에서 행해진다. T_m이 55℃인 고 상전이 지질에 관해서는, 예를 들면 인큐베이션은 약 55 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 70℃에서 행해질 수 있다. 인큐베이션 시간은 인큐베이션 온도에 따라, 1 시간 이하 내지 12 시간 이상으로 변화할 수 있다.

이러한 인큐베이션 단계 종료시에, 현탁액은 예를 들면, 봉입된 폴리올을 함유하는 초기 리포솜 분산액으로부터 유리 폴리머를 제거하기 위해 상술한 방법을 이용하여, 추가로 처리하여 유리 (비캡슐화된) 화합물을 제거할 수 있다.

실시예 2는 보론산 화합물 및 폴리올을 보로네이트 에스테르 형태로 포함하는 리포솜을 제조하는 방법을 설명하며, 여기서 폴리올은 소르비톨이다. 이 실시예에 있어서, 에그 PC 및 콜레스테롤로 된 지질 박막이 제조된다. 지질 박막은 소르비톨 용액으로 수화되어, 내부 수용성 컴파트먼트에 봉입된 소르비톨을 갖는 리포솜을 형성한다. 봉입되지 않은 소르비톨은 투석, 원심분리, 사이즈 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 등의 적절한 수법에 의해 제거되어, 내부에 고농도의 폴리올, 바람직하게는 외부에 폴리올이 거의 없거나 전혀 없는 리포솜 현탁액을 얻는다. 그 다음에, 원하는 펩티드 보론산 화합물은 외부 매질에 가해진다. 이의 비이온화 상태의 화합물은 리포솜 지질 이중층을 통해 자유로이 침투할 수 있다. 일단 리포솜 내부에서는, 화합물은 봉입된 폴리올과 반응하여, 보로네이트 에스테르를 형성하여, 더 많은 약물이 지질 이중층을 통과하도록 평형을 이동시킨다. 이렇게 하여, 펩티드 보론산 화합물은 리포솜에 축적되어, 그 내부에 안정하게 봉입된다.

지질-폴리머-리간드 타겟팅 컨쥬게이트를 포함하는 리포솜 제제는 다양한 접근법에 의해 제조될 수 있다. 한 접근법은 말단 작용화된 지질-폴리머 유도체, 즉 유리 폴리머 말단이 반응성을 나타내거나 "활성화"되어 있는 지질-폴리머 컨쥬게이트를 포함하는 지질 소포의 제법을 포함한다 (예를 들면, 미국 특허 제6,326,353호 및 제6,132,763호 참조). 이러한 활성화된 컨쥬게이트는 리포솜 조성물에 포함되며, 활성화된 폴리머 말단은 리포솜 생성 후에 타겟팅 리간드와 반응한다. 또 하나의 접근법에 있어서는, 지질-폴리머-리간드 컨쥬게이트는 리포솜 생성시에 지질 조성물에 포함된다 (예를 들면, 미국 특허 제6,224,903호, 제5,620,689호 참조). 또 다른 접근법에 있어서는, 지질-폴리머-리간드 컨쥬게이트의 미셀 용액이 리포솜 현탁액으로 인큐베이션되고, 지질-폴리머-리간드 컨쥬게이트가 미리 형성된 리포솜으로 삽입된다 (예를 들면, 미국 특허 제6,056,973호, 제6,316,024호 참조).

III. 사용 방법

일실시형태에 있어서, 보로네이트 에스테르 형태로 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 갖는 리포솜 제제가 암을 가진 환자를 치료하기 위해 사용된다. 펩티드 보론산 화합물이 붕소 동위원소를 포함하는 실시형태에 있어서, 리포솜 제제는 붕소 중성자 포획 요법에 사용될 수 있다. 이제부터 이러한 전형적인 용도에 대하여 설명될 것이다.

A. 종양 치료

보론산 화합물은 프로테아솜 저해제로 불리우는 약물군이다. 프로테아솜 저해제는 이들의 능력에 의해 세포 아포토시스를 유도하여, 세포 프로테아솜 활성을 억제한다. 구체적으로는, 진핵 세포에 있어서, 유비키틴-프로테아솜 경로는 세포내 단백질의 단백질 분해에 대한 센트럴 경로이다. 단백질은 초기에 폴리유비키틴 쇄의 결합에 의해 단백질 분해를 타겟으로 한 다음에, 프로테아솜에 의해 작은 펩티드로 빠르게 분해되고, 유비키틴은 방출되어 재순환된다. 이러한 공동 단백질 분해 경로는 유비키틴-컨쥬게이팅 계 및 26S 프로테아솜의 상승 활성에 의존한다. 26S 프로테아솜은 진핵생물의 핵 및 세포질에 존재하는 큰 (1500 내지 2000 kDa) 다중 서브유닛 복합체이다. 2OS 프로테아솜으로도 불리우는 이러한 복합체의 촉매 코어는 α- 및 β-서브유닛을 포함하는 4개의 7량체로 구성되는 원통형 구조를 갖는다. 프로테아솜은 트레오닌 프로테아제이며, β-서브유닛의 N 말단 트레오닌은 타겟 단백질의 펩티드 결합의 카보닐기를 공격하는 친핵체를 제공한다. 적어도 세가지의 상이한 단백질 분해 활성은 프로테아솜과 관련되어 있다: 키모트립신, 트립신 및 펩티딜글루타밀. 폴리유비퀴틴화된 (polyubiquitinated) 기질을 인지하여 결합하는 능력은 19S (PA700) 서브유닛에 의해 부여되며, 19S (PA700) 서브유닛은 20S 프로테아솜의 각 말단에 결합한다. 이러한 액세서리 서브유닛은 결합된 유비키틴 분자를 제거하는 동안에 기질을 언폴드 (unfold)하여, 2OS 촉매 착물로 공급한다. 26S 프로테아솜의 어셈블리 및 단백질 기질의 분해는 ATP 의존성을 나타낸다 (Almond, Leukemia, 16: 433 (2002)).

유비키틴-프로테아솜 계는 단백질의 조직적인 일시적 분해에 의해 많은 세포 과정을 조정한다. 많은 주요 세포 단백질의 레벨을 제어함으로써, 프로테아솜은 세포 증식 및 아포토시스의 조절 인자로서 작용하고, 이의 활성의 붕괴는 세포 주기에 큰 영향을 미친다. 예를 들면, 아포토시스의 결손은 정지 종양 세포의 축적인 B 세포 만성 림프성 백혈병 등의 특정 암을 포함하는 각종 질환의 병인에 관여한다.

화합물의 한 부류로서의 프로테아솜 저해제는 일반적으로 프로테아솜에 의한 단백질 분해를 억제함으로써 작용한다. 이 부류는 펩티드 알데히드, 펩티드 비닐 술폰을 포함하며, 프로테아솜의 20S 코어 내의 활성 부위에 결합하여 직접 이를 저해함으로써 작용한다. 그러나, 펩티드 알데히드 및 펩티드 비닐 술폰은 비가역적인 방법으로 2OS 코어 입자에 결합하여, 단백질 분해 활성은 이들의 제거시에 회복될 수 없다. 대조적으로, 펩티드 보론산 화합물은 프로테아솜을 안정하게 저해하면서도, 프로테아솜으로부터 서서히 해리한다. 펩티드 보론산 화합물은 이들의 펩티드 알데히드 유사체보다 훨씬 더 강력하고, 붕소와 황 사이의 약한 상호작용은 펩티드 보로네이트가 티올 프로테아제를 저해하지 않는 것을 의미한다는 점에서 보다 특이적으로 작용한다 (참조 문헌: Richardson, P. G. et al., Cancer Control., 10(5): 361 (2003)).

각종 종양 유래 세포주를 프로테아솜 저해제에 노출시키면, 세포 주기 조절 단백질, p53, 및 핵 인자 카파 B (NF-κB)를 포함하여, 다수의 경로에 대한 효과의 결과와 유사하게, 아포토시스를 유발시킨다 (참조 문헌: Grimm, L. M. and Osborne, B. A., Results Probl. Cell Differ., 23: 209-228 (1999); Orlowski, R. Z., Cell Death Differ., 6(4): 303-313 (1999)). 프로테아솜 저해제 매개 아포토시스를 입증하는 많은 초기 연구조사는 단아구 (Imajoh-Ohmi, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 217(3): 1070-1077 (1995)), T 세포 및 림프성 백혈병 세포 (Shinohara, K. et al., Biochem. J., 317(Pt 2): 385-388 (1996)), 림프종 세포 (Tanimoto, Y. et al., J Biochem. (Tokyo), 121(3): 542-549 (1997)), 및 전골수성 백혈병 세포 (Drexler, H. C., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94(3): 855-860 (1997))를 비롯한 조혈기관의 세포를 사용하였다. 프로테아솜 저해제의 생체 내 항종양 활성에 대한 제 1 실증에는 인간 림프종 이종 이식 모델을 사용하였다 (Orlowski, R. Z. et al., Cancer Res., 58(19): 4342-4348 (1998)). 또한, 프로테아솜 저해제는 대조 비형질전환 세포의 상대적인 절약과 함께, 환자 유래 림프종 (Orlowski, R. et al., Cancer Res., 58(19): 4342 (1998)) 및 백혈병 세포 (Masdehors, P. et al., Br J Haematol 105(3): 752-757 (1999))의 선택적 아포토시스를 유발하고, 다발성 골수성 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 (Hideshima, T. et al., Cancer Res., 61(7): 3071-3076 (2001)) 것으로 보고되었다. 따라서, 프로테아솜 저해제는 특히 난치성 혈액 악성 종양에 걸린 환자의 치료제로서 유용하다.

일실시형태에 있어서, 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포솜 제제는 암 치료, 특히 암환자의 종양 치료에 사용된다.

다발성 골수종은 미국에서 해마다 약 15,000명에 대하여 진단되는 불치의 악성 종양이다 (Richardson, P. G. et al., Cancer Control. 10(5): 361 (2003)). 통상적으로 골수의 다수의 부위에 클론 플라스마 세포를 축적하는 것을 특징으로 하는 혈액 악성 종양이다. 대부분의 환자는 화학요법 및 방사선을 이용한 초기 치료에 효과를 나타내지만, 대부분은 결국 내성 종양 세포의 증식으로 인해 재발한다. 일실시형태에 있어서, 보로네이트 에스테르 형태로 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포솜 제제를 다발성 골수종을 앓고 있는 대상에게 투여하는, 다발성 골수종을 치료하는 방법이 제공된다.

리포솜 제제는 또한 암 세포가 화학 요법의 작용에 저항하는 일부의 주요 경로를 견뎌내는 것을 도움으로써 유방암 치료에 효과적이다. 예를 들면, NF-κB, 아포토시스 조절인자 및 p44/42 미토겐 활성화 단백질 키나제 경로를 통한 시그널링은 항아포토시스 작용을 나타낼 수 있다. 프로테아솜 저해제가 이들 경로를 방해하기 때문에, 화합물은 아포토시스를 활성화할 수 있다. 따라서, 유방암을 갖는 대상을 치료하기 위한 방법은 보로네이트 에스테르 형태로 리포솜에 봉입된 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포솜을 투여함으로써 제공된다. 또한, 탁산 및 안트라사이클린 등의 화학요법제가 이들 경로 중 하나 또는 양쪽 모두를 활성화시키는 것으로 나타나기 때문에, 프로테아솜 저해제를 종래의 화학요법제와 병용하면, 파클리탁셀 및 독소루비신 등의 약물의 항종양 활성이 향상된다. 따라서, 또 하나의 실시형태에 있어서, 유리 형태 또는 리포솜에 봉입된 형태의 화학요법제가 리포솜에 봉입된 펩티드 보론산 화합물 (변형 형태로 리포솜에 봉입)과 병용하여 투여되는 치료방법이 제공된다.

리포솜 제제의 용량 및 투여 처방은 치료할 암, 암 단계, 환자의 체격 및 건강상태, 및 주치의에 의해 용이하게 발견되는 다른 인자에 따를 것이다. 또한, 프로테아솜 저해제 보르테조밉, Pyz-Phe-boroLeu (PS-341)를 이용한 임상 연구의 결과는 적절한 투여량 및 투여 처방에 관한 충분한 지침을 제공한다. 예를 들면, 주당 1회 또는 2회 정맥내 투여할 때, 고형 암에 걸린 환자의 최대 내량은 1.3 mg/m²이다 (Orlowski, R. Z. et al., Breast Cancer Res., 5: 1-7 (2003)). 또 하나의 연구에 있어서는, 3주간의 주기 중 1, 4, 8 및 11일에 1회 정주로 투여되는 보르테조밉의 최대 내량을 1.56 mg/m²으로 제안하였다 (Vorhees, P. M. et al., Clinical Cancer Res., 9: 6316 (2003)).

리포솜 제제는 통상 비경구적으로 투여되며, 정맥내 투여되는 것이 바람직하다. 제제가 전달을 촉진시키도록 필요하거나 바람직한 의약품 부형제를 포함할 수 있음을 알 수 있다.

B. 붕소 중성자 포획 요법

또 하나의 측면에 있어서, 붕소 중성자 포획 요법 (¹⁰B-NCT)을 위한 붕소-10 동위원소를 종양에 투여하는 방법이 제공된다. 암 치료를 위한 중성자 포획 요법은 하기식에 따라 각각 비교적 무해한 ¹⁰B 동위원소와 열중성자의 상호작용에 기초한다:

¹⁰B + ¹n → ⁷Li + ⁴He + 2.4 MeV

상기 반응은 단일 또는 인접 암세포에 제한되는 강한 전리 방사선을 초래한다. 따라서, 성공적인 치료를 위해, 충분한 양의 붕소-10 동위원소를 종양에 전달하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 기재된 리포솜 제제는 리포솜에 ¹⁰B 동위원소를 갖는 펩티드 보론산 화합물을 봉입하는 수단을 제공한다. ¹⁰B 동위원소를 갖는 펩티드 보론산 화합물은 상술한 바와 같이, 변형 형태로 통상 펩티드 보로네이트로서 리포솜에 봉입된다. 친수성 폴리머쇄의 표면 코팅을 포함하는 리포솜은 이러한 리포솜의 긴 혈액 순환 기간으로 인해, 종양에 선택적으로 축적된다 (미국 특허 제5,013,556호; 제5,213,804호 참조). ¹⁰B 동위원소를 갖는 펩티드 보론산 화합물로 로딩된 리포솜은 2개의 비의존성 메카니즘에 의해 종양을 근절한다: 리포솜은 종양의 약물 저장소로서 작용하여, 서서히 종양에 항종양 화합물을 유리시키며, 리포솜은 상당량의 붕소-10 동위원소를 종양에 축적시키는 역할을 함으로써, 붕소 중성자 포획 요법의 효능을 조장한다.

상술한 내용으로부터, 고찰된 본 발명의 여러 측면 및 특성은 명백하다. 펩티드 보론산 화합물과 결합하여 보로네이트 에스테르를 형성하는 수용성 지질 이중층 불침투성 폴리올 화합물을 포함하는 리포솜에 대하여 설명한다. 리포솜은 예를 들면, 리포솜의 내부 수용성 컴파트먼트에 폴리올을 캡슐화하고, 비캡슐화된 폴리올을 외부 매질로부터 제거하며, 폴리올 상의 하이드록실 부분과 가역적 에스테르 결합을 형성하도록 지질 이분자막을 통과하는 지질 이중층 침투성 보론산 화합물을 가함으로써 제조된다. 이렇게 하여, 통상 지질 이중층을 통해 자유로이 침투할 수 있는 보론산 화합물은 보로네이트 에스테르 화합물 형태로 리포솜에 안정하게 봉입된다. 펩티드 보론산 화합물의 리포솜으로의 축적은 이온 구배의 부재시에 일어나지만, 경우에 따라 이온 구배가 존재할 수 있다.

도 1a 내지 도 1p는 전형적인 펩티드 보론산 화합물의 구조를 나타낸다.

도 2는 리포솜 내부에서의 봉입된 폴리올과의 반응 및 보로네이트 에스테르 화합물의 생성을 위해 높은 내부/낮은 외부 pH 구배에 대하여 전형적인 펩티드 보론산을 리포솜으로 로딩하는 것을 예시한다.

IV. 실시예

하기 실시예는 본 명세서에 기재된 발명을 예시할 뿐, 이의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1:

펩티드 보론산 화합물로 로딩된 리포솜:

폴리비닐알콜 (분자량 2,000; Aldrich Corporation, Milwaukee, WI)을 물에 용해시켜, 농축 폴리비닐알콜 용액으로 pH 7.4로 조정하였다. 몰 비가 10:5:1인 에그 포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE, PEG 분자량 2,000 Da, Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL)의 혼합물을 클로로포름에 용해시켜, 용매를 진공하에 증발시키고, 지질 박막을 폴리비닐알콜 용액에 진탕하면서 인큐베이션하여, 지질 분산액을 구멍 크기가 0.2 ㎛인 2개로 적층된 뉴클리오포어 (Nucleopore)^® (Pleasanton, CA) 막을 통해 압력하에 압출하였다. 외부 완충액을 세파로스 (Sepharose) CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) 상의 겔 크로마토그래피를 이용하여, pH 6.5에서 소듐 하이드록시에틸피페라진-에탄 술포네이트 (HEPES) 5 mM을 함유하는 NaCl 0.14 M으로 교환하고, 동시에 봉입되지 않은 폴리비닐알콜을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 리포 솜에, 도 1b의 디펩티드 보론산 화합물, [(1R)-3-메틸-1-[[(2S)-1-옥소-3-(2-나프틸)-2-[피라지닐카보닐)아미노]프로필]아미노]부틸]보론산을 가하였다. 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여, 다우엑스 (Dowex)^® 50W x 4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 처리하고, NaCl-HEPES 용액으로 평형을 이루어, 비캡슐화된 보르테조밉을 제거하였다. 얻어진 리포솜을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과에 의해 살균하였다.

실시예 2:

펩티드 보론산 화합물로 로딩된 리포솜:

소르비톨을 물에 용해시켜, pH를 7.4로 조정하였다. 몰 비가 10:5:1인 에그 포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE, PEG 분자량 2,000 Da)의 혼합물을 클로로포름에 용해시켜, 용매를 진공하에 증발시켰다. 지질 박막을 소르비톨 용액으로 수화시키고, 진탕하면서 인큐베이션하여, 리포솜을 생성시켰다. 리포솜을 구멍 크기가 0.2 ㎛인 2개로 적층된 뉴클리오포어^®(Pleasanton, CA) 막을 통해 압력하에 압출하였다. 외부 용액을 처리하여, 봉입되지 않은 소르비톨을 제거하였다. 그 다음에, 펩티드 보론산 화합물 Bz-Leu-Leu-boroLeu (피나콜 에스테르)(도 1f의 화합물)을 외부 현탁액 매질에 가해, 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 비캡슐화된 화합물을 제거하였다.

실시예 3:

리포솜에 봉입된 펩티드 보론산 화합물의 시험관 내 활성:

다발성 골수성 세포를 마이크로타이터 플레이트에서 컨플루언스 (confluence)하도록 증식시켰다. 세포를 여러 농도의 펩티드 보론산 화합물로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 리포솜으로 인큐베이션하였다. 24 시간의 인큐베이션 기간 후에, 세포에 대하여 아포토시스를 검사하였다. 리포솜 제제로 처리된 세포가 대조 세포보다 높은 아포토시스 발생률을 나타내는 것을 알아냈다.

실시예 4:

리포솜에 봉입된 펩티드 보론산 화합물의 생체 내 활성:

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 리포솜을 고형 암을 갖는 래트에게 정맥내 주사로 투여하였다. 종양 사이즈를 시간의 함수로서 측정하여, 리포솜 제제로 치료된 동물에 대하여 축소되는 것을 알아냈다.

다수의 전형적인 측면 및 실시형태가 상기에서 검토하였지만, 당업자는 이의 특정한 변경, 변형, 부가 및 서브콤비네이션을 인지할 것이다. 따라서, 하기의 첨부된 청구의 범위 및 이후에 도입되는 청구의 범위가 이러한 모든 변경, 변형, 부가 및 서브콤비네이션을 본 발명의 정신과 범위 내에 포함하는 것으로 해석된다.

Claims

소포 형성 지질로 형성되는 리포솜, 및

리포솜에 봉입되고, 펩티드 보론산 화합물 및 폴리올로 제조되는 보로네이트 에스테르 화합물을 포함하나, 단 펩티드 보론산 화합물이 보르테조밉이 아닌 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩티드 보론산 화합물은 디펩티딜 보론산 화합물인 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리올은 시스 1,2-디올 작용기 또는 1,3-디올 작용기를 갖는 화합물인 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리올은 폴리비닐알콜인 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리올은 단당류, 이당류, 올리고당 또는 다당류인 조성물.
제 5 항에 있어서, 폴리올은 말토스, 글루코스, 리보스, 프룩토스 및 소르비톨 중에서 선택되는 단당류인 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리올은 글리세롤 또는 폴리글리세롤인 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리올은 아미노폴리올인 조성물.
제 8 항에 있어서, 아미노폴리올은 아미노소르비톨인 조성물.
제 8 항에 있어서, 아미노폴리올은 비닐알콜과 비닐아민의 공중합체인 조성물.
제 1 항에 있어서, 리포솜은 추가로 높은 내부/낮은 외부 이온 구배를 포함하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 이온 구배는 수소 이온 구배인 조성물.
제 12 항에 있어서, 수소 이온 구배는 약 7.5 내지 8.5의 내부 pH 및 약 6 내지 7의 외부 pH를 제공하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 리포솜은 추가로 친수성 폴리머로 유도체화된 소수성 부분을 약 1 내지 20 몰 퍼센트로 포함하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 친수성 폴리머로 유도체화된 소수성 부분은 폴리에틸렌글리콜로 유도체화된 소수성 부분인 조성물.
제 15 항에 있어서, 소수성 부분은 지질인 조성물.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 조성물을 갖는 리포솜을 포함하는, 악성 종양을 치료하는데 사용되는 조성물.
제 17 항에 있어서, 악성 종양은 혈액 악성 종양인 조성물.
제 17 항에 있어서, 주사를 통해 투여되는 조성물.
(i) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 조성물 및 (ii) 붕소 동위원소를 갖는 리포솜을 포함하는, 방사선 요법을 받는 암을 가진 대상의 종양 조직을 선택적으로 파괴하는데 사용되는 조성물.
제 20 항에 있어서, 붕소 동위원소는 펩티드 보론산 화합물 상에 있는 조성물.
제 20 항에 있어서, 붕소 동위원소는 ¹⁰B인 조성물.