KR20060066053A - Method and apparatus for recognizing molecular compounds - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 분자 반응을 정성적 및 정량적으로 검출하는 방법 및 장치에 관한 것이다.The present invention relates to methods and apparatus for qualitatively and quantitatively detecting molecular reactions.
종래 기술 및 본 발명을 기술하는데 도움을 주기위해서, 본 명세서에서 사용될 기술 용어의 정리를 제공한다. "프로브(probe)"는 고정되거나 또는 유리 부유될 수 있는 알려져 있는 것을 의미한다. "표적(target)" 또는 "리간드(ligand)"는 특정 프로브와 특이적 상보관계 또는 반응성 관계로 알려져 있는 "미지(unknown)"의 것이다. 프로브-표적 결합체는 "복합체(complexes)" 또는 "쌍(pairs)"이라 할 수 있다.To assist in describing the prior art and the present invention, a summary of the technical terms to be used herein is provided. "Probe" means what is known that can be fixed or glass suspended. "Target" or "ligand" is "unknown" known as a specific complementarity or reactive relationship with a particular probe. Probe-target conjugates may be referred to as "complexes" or "pairs."
"1차 증폭제(primary amplifier)" 또는 "증량 유닛(mass enhancing unit)"은 쌍과의 결합 또는 반응을 갖거나 또는 상기 쌍에 결합하는 연결 인자(linking element)와의 결합 또는 반응을 갖는 "벌키(bulky)"한 것이다. "2차 증폭제(secondary amplifier)"는 1차 증폭제와 반응하거나, 또는 1차 증폭제-프로브-표적 쌍 복합체의 결합체와 반응하여 새로운 결합체를 형성한다. "3차 증폭제(tertiary amplifier)"는 1차 증폭제-프로브-표적 쌍 복합체 또는 증폭제와 반응할 수 있는 연이은 증량제(mass enhancer)이다.A "primary amplifier" or "mass enhancing unit" is a "bulky" having a bond or reaction with a pair or with a linking element that binds to the pair. (bulky) ". A "secondary amplifier" reacts with the primary amplifier or with a combination of primary amplifier-probe-target pair complexes to form new conjugates. A "tertiary amplifier" is a successive mass enhancer capable of reacting with a primary amplifier-probe-target pair complex or amplifying agent.
"부피 인자(bulk factor)"는 프로브-표적 쌍의 분자량에 대한 증폭제의 분자량의 비율이다. 그러나, 부피 또는 질량은 프로브-표적 쌍의 증강 인식에 있어서 항상 1차 파라미터는 아니다. 다른 파라미터들, 예컨대 광학적 성질 또는 전기적 성질은 검출 장치에서 중요할 수 있다.A "bulk factor" is the ratio of the molecular weight of an amplifier to the molecular weight of a probe-target pair. However, volume or mass is not always the primary parameter in augmentation recognition of probe-target pairs. Other parameters, such as optical or electrical properties, may be important in the detection device.
"미지"의 분석물을 동정하기위해 프로브-표적 반응으로 연구하는 연구자들은 "표적" 화합물을 마킹(marking)하거나 또는 태깅(tagging)하여 프로브와 표적 분자 사이의 반응을 검출하고 시그널(signal)을 찾는다. 종래 기술은 형광(fluorescent), 방사성(radioactive), 또는 "착색된(colored)" 태그(tag) 또는 마커(marker)가 결합되거나 또는 부착된 연결 화합물을 사용하는 것을 포함한다. 상기 마커를 검출하고 시그널을 찾는 기술이 개발되었다. 결과적으로 상기 시험들은 항상 태깅 단계나 마킹 단계를 포함하는 추가의 단계를 요구한다.In order to identify “unknown” analytes, researchers studying probe-targeted reactions can mark or tag “target” compounds to detect reactions between probes and target molecules and generate signals. Find. The prior art includes the use of linking compounds in which fluorescent, radioactive, or "colored" tags or markers are bound or attached. Techniques for detecting the markers and finding signals have been developed. As a result, the tests always require an additional step including a tagging step or a marking step.
종래 공동의 양수인의 동시계류중인 출원에서, 전체 내부 반사(total internal reflection, TIR) 표면의 소실성 장(evanescent field)에서 발생하는 분자 반응은 소실성 장에서 변화에 반응하여 구별되는 표시를 제공할 수 있는 편광빔(polarized beam) 및 부가의 광학 소자를 사용하여 검출할 수 있고, CCD 카메라 칩과 같은 광학 검출기에 의해서 인식가능하다. 다른 검출 장치로는 분광계, 중량측정 장치, 크기 배제(size excluding) 장치 및 전하-질량비(charge-mass ratio) 분리 장치를 포함한다.In co-pending applications of conventional common assignees, molecular reactions occurring in the evanescent field of the total internal reflection (TIR) surface may provide distinct indications in response to changes in the evanescent field. Can be detected using a polarized beam and additional optical elements, and recognizable by an optical detector such as a CCD camera chip. Other detection devices include spectrometers, weighing devices, size excluding devices, and charge-mass ratio separation devices.
본원에 통합되는 종래 출원들로는 미국출원 제09/614,503호(2000.07.07일자 출원), 미국출원 제09/838,700호(2001.04.19일자 출원) 및 미국출원 제10/046,620호(2002.12.12일자 출원)를 포함한다.Conventional applications incorporated herein include US Application Ser. No. 09 / 614,503, filed Jul. 7, 2000, US Application Ser. No. 09 / 838,700, filed Apr. 19, 2001, and US application Ser. No. 10 / 046,620, filed Dec. 12, 2002. ).
상기 출원에서, 전체 내부 반사(TIR) 표면의 소실성 장 중의 표면에서 반응이 일어난다. 광의 편광 빔은 표면에 집중되고, 이로부터 전체적으로 반사된다. 소실성 장에서 물질의 존재는 반사된 빔의 편광성을 변형시킨다.In this application, the reaction occurs at the surface in the disappearing field of the entire internal reflection (TIR) surface. The polarizing beam of light is concentrated at the surface and reflected entirely therefrom. The presence of the material in the vanishing field alters the polarization of the reflected beam.
반응 이전에, 반응 중에 및 반응 이후에, 생성된 빔은 검출기, 예컨대 CCD 칩/카메라에 집중되고, 목적하는 전체 표면을 볼 수 있다. 그 후 반응한 영역은 반응하지 않은 영역과는 상이한 특징을 제공한다. 특징의 특정 위치는 특징을 생성하는 반응을 확인한다.Before the reaction, during the reaction and after the reaction, the generated beam is concentrated in a detector such as a CCD chip / camera and the desired entire surface can be seen. The reacted area then provides different characteristics than the unreacted area. The specific location of the feature identifies the response that produces the feature.
특유의 특징을 검출하는 것은 시약, 및 반응한 영역 및 반응하지 않은 영역이 충분히 작아서 최대 감도의 검출 시스템을 필요로 한다면 도전 과제이다. 통상 종래에는 반응을 동정할 수 있는 태깅이나 마킹에 의존하였다. 본 발명의 양수인에게 양도된 출원에서, 마킹이나 태깅 단계는 불필요하다. 그러나 고감도 기술은 반응을 검출하고 반응물을 동정하기위해서 필요하다.Detecting unique features is a challenge if the reagent and the reacted and unreacted regions are small enough to require a detection system of maximum sensitivity. Conventionally, it has relied on tagging or marking which can identify a reaction. In applications assigned to the assignee of the present invention, no marking or tagging step is necessary. However, high sensitivity techniques are needed to detect reactions and identify reactants.
본 발명에 따르면, 반응의 결과물인 복합 생성물(예컨대, 생리활성 물질의 경우에 항체)이 프로브-표적 반응을 개발, 증량 또는 "증폭(amplification)"시키는데 사용되어 수득된 화합물을 감도가 떨어지는 장치로 검출할 수 있거나 또는 감도가 좋은 장치의 검출 한계를 효과적으로 낮춰서 소량의 표적을 검출할 수 있도록 한다.According to the present invention, a complex product (e.g., an antibody in the case of a bioactive substance) that is the result of a reaction is used to develop, augment or "amplify" a probe-targeted reaction, thereby bringing the resulting compound into a less sensitive device. The detection limit of a detectable or sensitive device is effectively lowered to allow detection of small amounts of targets.
예를들면, "프로브(probe)" 분자가 있으며, 상기 프로브 분자는 프로브-표적 쌍을 형성시키는 "표적" 분자에 대해 배타적이거나 또는 특이적 친화도를 갖는 것이다. 또한, "증폭제" 분자 또는 화합물이 있으며, 이는 프로브-표적 쌍에 대해서 또는 프로브-표적 쌍의 부류의 특정 서브세트(subset)에 대한 특이적 반응 또는 친화도를 갖는다. For example, there is a "probe" molecule, which probe molecule is one that has exclusive or specific affinity for the "target" molecule that forms the probe-target pair. In addition, there are “amplifier” molecules or compounds that have a specific response or affinity for a probe-target pair or for a specific subset of the class of probe-target pairs.
핵산 프로브는 상보적 RNA 또는 DNA 서열과 반응하여 하이브리드화(hybridization)되어 이중가닥 서열을 형성한다. 일단 하이브리드화가 일어나면, 이중가닥 핵산 물질의 길이에 특이적인 항체가 첨가되고 배양된다. 통상, 항체는 프로브 및 표적의 분자량 및 부피에 수배를 가질 것이므로 감도가 떨어지는 광학 또는 기타 시스템에 의해서 조차도 더 용이하게 검출될 수 있는 확대되고 증량된 프로브-표적 결합체를 형성한다.Nucleic acid probes react with complementary RNA or DNA sequences to hybridize to form double stranded sequences. Once hybridization occurs, antibodies specific for the length of the double stranded nucleic acid material are added and incubated. Typically, the antibody will have several times the molecular weight and volume of the probe and target and thus form an enlarged and extended probe-target conjugate that can be more easily detected even by insensitive optical or other systems.
카터(Carter et al.)의 특허 제4,508,832호에서, 생물검정(bioassay) 방법과 조합된 엘립소메트리(ellipsometry)를 사용하는 방법이 기술되어 있다. 카터에 의해서 기술된 바와 같이, 생물검정 또는 면역검정은 생리활성 물질(또는 "항원")과, 상기 생리활성 물질과 콘쥬게이트되는 특이적 복합체(또는 "항체")와의 반응에 근거한다. 본 발명은 생물검정 또는 면역검정을 실시하는데 매우 유용한 것으로 사료된다. 또한, 이프라임(Ipraim et al.)의 미국특허 제6,228,578호에서는 하이브리드(hybrid)를 인식하기위한 DNA 프로브/RNA 표적 하이브리드에 대한 특이적 친화도를 갖는 면역글로불린을 사용하는 것이 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고문으로 통합되었다. 프로브-표적-증폭제는 화학발광(chemiluminescence)을 일으키는 추가의 공정에 의해서만 검출되거나 또는 하이브리드-특이적 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 형광 2차 면역글로불린의 사용에 의해서만 검출된다.In Carter et al., Patent 4,508, 832, a method of using ellipsometry in combination with a bioassay method is described. As described by Carter, bioassays or immunoassays are based on the reaction of a bioactive substance (or "antigen") with a specific complex (or "antibody") conjugated with the bioactive substance. The present invention is believed to be very useful for carrying out bioassays or immunoassays. In addition, US Pat. No. 6,228,578 to Ipraim et al. Describes the use of immunoglobulins with specific affinity for DNA probe / RNA target hybrids for hybrid recognition. Hereby incorporated by reference. Probe-target-amplifiers are only detected by additional processes that cause chemiluminescence or only by the use of fluorescent secondary immunoglobulins that specifically bind to hybrid-specific immunoglobulins.
본 발명에서, 검출은 질량 증폭에 의해서 감도를 증가시키면서 하이브리드화 중에 또는 이후에 특정 시점에서 실시될 수 있다. 본 발명의 방법을 입증하기위해 사용된 특정의 실험적 실시양태에서, 단일가닥 DNA(ssDNA)는 프로브이다. 표면은 표면에 고정되는 프로브의 매트릭스로 제조될 수 있으며, 각각은 상이한 서열을 갖는다. 매트릭스에서 x-y 위치는 각 프로브 인자로 알려져 있다. 미지의 표적 화합물이 ssDNA로 제조되며, 프로브 물질과 반응한다. 프로브 및 표적이 상보적 서열을 갖는다면, 상기 부위(site)에서 반응이 있을 것이고 2개의 단일가닥 DNA 시료가 이중가닥 DNA("dsDNA")쇄(chain)로 하이브리드화될 것이다. 특정 x-y 위치에서의 반응은 시험에서 미지 또는 "표적"을 독특하게 동정한다.In the present invention, the detection can be carried out at specific time points during or after hybridization with increased sensitivity by mass amplification. In certain experimental embodiments used to demonstrate the methods of the invention, the single stranded DNA (ssDNA) is a probe. The surface can be made of a matrix of probes that are anchored to the surface, each having a different sequence. The x-y position in the matrix is known for each probe factor. Unknown target compounds are made of ssDNA and react with probe material. If the probe and target have complementary sequences, there will be a reaction at the site and the two single stranded DNA samples will hybridize to the double stranded DNA ("dsDNA") chain. Responses at specific x-y positions uniquely identify unknown or "target" in the test.
1차 증폭 항체(이의 항원은 dsDNA임)가 매트릭스 표면으로 도입된다. 증폭 항체들은 이들의 가변 영역의 구조에 의해서 결정되는 바와 같이 dsDNA에 대한 특이성에 대해서 선택된다. 증폭 항체는 하이브리드화된 쌍에서보다 수배 더 부피가 크다. 특정 부류의 모든 항체들, 예컨대 IgA, IgM, IgG 등은 상이한 분자 구조 및 질량을 가지며, 모두 상대적으로 벌키하다. 하이브리드화가 일어나는 부위에서, 증폭 항체가 dsDNA에 결합할 것이다. 특정 조건하에서, 증폭 항체는 프로브-표적 쌍에 항체가 결합하지마자 응집되거나 또는 집괴되어 괴상의 크기와 부피를 갖는 구조가 된다. 선택적으로 활성 Fab 절편 또는 F(ab')2 절편은 파파인(papain) 또는 펩신(pepsin) 분해에 의해서 면역글로불린으로부터 각각 분리될 수 있으며, 더 작고 입체적이며 카이네틱적으로 바람직한 인식 유닛을 제공한다. 상기 경우에, 항체 절편의 바이오티닐화(biotinylation)가 아비딘 또는 아비딘-함유 벌크 화합물로 연결되도록 제공된다.The primary amplified antibody, whose antigen is dsDNA, is introduced to the matrix surface. Amplifying antibodies are chosen for their specificity for dsDNA as determined by the structure of their variable regions. Amplified antibodies are many times bulkier than in hybridized pairs. All antibodies of a particular class, such as IgA, IgM, IgG, etc., have different molecular structures and masses, all of which are relatively bulky. At the site of hybridization, the amplified antibody will bind to dsDNA. Under certain conditions, the amplified antibody aggregates or agglomerates as soon as the antibody does not bind to the probe-target pair, resulting in a structure having a block size and volume. Alternatively, the active Fab fragment or F (ab ') 2 fragment can be separated from the immunoglobulin by papain or pepsin digestion, respectively, providing a smaller, steric and kinetically desirable recognition unit. In such cases, biotinylation of the antibody fragments is provided to link to avidin or avidin-containing bulk compounds.
선택적으로, 1차 증폭 항체에 특이적인 2차 증폭 항체는 1차 항체와 결합하여 특정 x-y 위치에서 더 큰 물제를 생성하도록 첨가되며, 감도가 떨어지는 장치(예컨대 상대적으로 감도가 떨어지는 광학장치)로 검출가능하게 되어 전체 매트릭스를 볼 수 있는 카메라를 사용함으로써 용이하게 인식할 수 있다. 상기 응집 또는 집괴가 다른 표면 기술들 중에서 원자력 현미경(atomic force microscope)에 의해 검출될 수 있고, 높이 프로필 변화율을 측정할 수 있다.Optionally, a secondary amplified antibody specific for the primary amplified antibody is added to bind to the primary antibody to produce a larger material at a particular xy position and detected by a less sensitive device (eg, a less sensitive optical device). This can be easily recognized by using a camera that can be used to view the entire matrix. The agglomeration or agglomeration can be detected by an atomic force microscope, among other surface technologies, and the height profile change rate can be measured.
선택적 용도에서, 비(非)인간 IgG 및 인간 면역글로불린은 인간 혈청에서 항체를 검출하기위한 수단으로서의 프로브-표적 쌍이고, 이로써 사람이 특정 항원에 노출되었는지의 여부를 결정한다. 비(非)인간 항-인간 면역글로불린 복합체에 대해 특이적이거나 또는 인간 면역글로불린에 대해서만 특이적인 IgM이 1차 증폭 항체로서 사용될 수 있으며, 상기 쌍의 부피가 2½배 증가된다. 다른 프로브-표적 쌍이 상기 쌍들로 사용될 수 있는 증폭 항체로 동정될 수 있다.In selective use, non-human IgG and human immunoglobulins are probe-target pairs as a means for detecting antibodies in human serum, thereby determining whether a human has been exposed to a particular antigen. IgM specific for non-human anti-human immunoglobulin complexes or only for human immunoglobulins can be used as the primary amplifying antibody, with a 2½-fold increase in volume of the pair. Other probe-target pairs can be identified as amplifying antibodies that can be used with the pairs.
추가의 선택적 실시양태에서, 2차 증폭 항체가 마커를 사용하거나 또는 사용하지 않고 사용될 수 있으며, 하이브리드화된 쌍 또는 1차 증폭 항체와 반응하여 질량 미분화에 기초한 분리 기술을 사용하는 기술을 통해서 반응된 쌍의 검출가능성을 증가시킨다.In a further optional embodiment, secondary amplified antibodies can be used with or without markers, and reacted via techniques using separation techniques based on mass differentiation in response to hybridized pairs or primary amplified antibodies. Increase the detectability of the pair.
본 발명은 목적하는 다른 분석물로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전자 또는 종래의 현미경, 열량계, 중량측정 분석, 크로마토그래피 및 분광계로 상기 결과를 관찰할 수 있다. 태그나 마커를 사용하는 것이 바람직하다면, 종래의 다른 기술이 감도가 많이 떨어진 수준에서 사용될 수 있다.The present invention can be used with other analytes of interest. In other embodiments, the results can be observed by electron or conventional microscopes, calorimetry, gravimetric analysis, chromatography and spectrometers. If it is desired to use tags or markers, other conventional techniques may be used at much less sensitive levels.
따라서, 본 발명의 목적은 분석 결과에 있어서 감도가 떨어지는 기술을 사용할 수 있는 더 용이하게 동정할 수 있는 표적-프로브 결합체를 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a more easily identifiable target-probe combination that can employ less sensitive techniques in assay results.
본 발명의 또 다른 목적은 감도가 좋은 검출 장치에 있어서 검출 수준이 낮게 표시될 수 있는 더 용이하게 동정가능한 표적-프로브 결합체를 제공하는데 있다. 또한 본 발명의 목적은 프로브-표적 반응의 결과를 증폭시켜서 감도가 떨어지는 검출 장치를 사용할 수 있도록 한다.Another object of the present invention is to provide a more easily identifiable target-probe combination which can be displayed with a low level of detection in a sensitive device. It is also an object of the present invention to amplify the results of probe-target reactions so that a less sensitive detection device can be used.
본 발명의 또 다른 목적은 프로브-표적 반응의 결과를 증폭시켜서 검출 한계를 낮출 수 있다.Another object of the present invention is to lower the detection limit by amplifying the result of the probe-target response.
본 발명의 또 다른 목적은 분자 프로브-표적 복합체에 대해 특이성을 갖는 화합물을 사용하여 프로브-표적 반응에 대한 시그널 반응을 증폭시킨다.Another object of the present invention is to amplify the signal response to the probe-target response using a compound having specificity for the molecular probe-target complex.
본 발명의 또 다른 목적은 특이적 프로브-표적 반응 또는 이상적으로 프로브-표적-1차 증폭제 복합체에 결합하는 1차 증폭 화합물과 결합할 수 있는 2차 증폭 화합물을 사용한다. Another object of the present invention is to use a secondary amplification compound capable of binding a specific probe-target response or a primary amplification compound that ideally binds to the probe-target-first amplifier complex.
본 발명의 특징인 신규한 특징(구조 및 이의 작업 방법을 포함하면서, 또한 부가되는 목적 및 이의 잇점을 포함함)은 하기의 상세한 설명과 수반된 도면으로부터 이해될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시양태는 예로서 설명된다. 그러나 도면은 발명을 설명 및 기술을 목적으로 제시하는 것이며, 본 발명을 한정하려는데 있지는 않다는 것으로 이해한다.The novel features (including structures and methods of working thereof, as well as the objects and advantages thereof added) which are the features of the present invention can be understood from the following detailed description and the accompanying drawings, which are preferred embodiments of the present invention. Is described by way of example. It is to be understood, however, that the drawings illustrate the invention for purposes of illustration and description, and are not intended to limit the invention.
본 발명의 목적 및 잇점을 부가적으로 이해시키기위해서, 하기의 상세한 설명과 수반된 도면을 참고하며, 이는 일부는 참조 번호를 제공한다:To further understand the objects and advantages of the present invention, reference is made to the following detailed description and the accompanying drawings, in which some provide reference numerals:
도 1은 방사성 또는 형광 표지된 종래 검출 개요의 도식도이며;1 is a schematic of a conventional detection scheme with radioactive or fluorescent labeling;
도 2는 본 발명에 따른 검출 기술의 예의 도식도이고;2 is a schematic diagram of an example of a detection technique in accordance with the present invention;
도 3은 본 발명에 따른 방법 및 장치의 실시양태를 참고하여 다양한 단계와 크기에 상관된 그래프이며;3 is a graph correlated to various steps and sizes with reference to embodiments of the method and apparatus according to the present invention;
도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 방법 및 장치의 실시양태의 측면으로서 전체 내부 반사를 통한 광학적 관찰을 나타내고;4 and 5 show optical observation through total internal reflection as an aspect of an embodiment of the method and apparatus according to the invention;
도 6은 본 발명에 따른 방법 및 장치의 실시양태의 측면으로서 다양한 프로브-표적 쌍과 층 두께와 관련된 그래프이며;6 is a graph relating to various probe-target pairs and layer thicknesses as an aspect of an embodiment of the method and apparatus according to the present invention;
도 7은 본 발명에 따른 방법 및 장치의 실시양태의 측면으로서 다양한 프로브-표적 쌍과 층 두께와 관련된 표이고;7 is a table relating to various probe-target pairs and layer thicknesses as an aspect of an embodiment of the method and apparatus according to the present invention;
도 8은 본 발명에 따른 방법 및 장치를 사용하기위한 예시적 접근법을 요약한 표이다.8 is a table summarizing an exemplary approach for using the method and apparatus according to the present invention.
바람직한 실시양태의 설명Description of the Preferred Embodiments
도 1은 종래의 순서를 나타내며, 표적(11)은 기질(15)에 결합되어 있는 프로브(13)와 하이브리드화되어 확인가능한 프로브-표적 쌍(17)을 형성하여 검출가능하게 한다. 이는 종래 기술에 태그 또는 표지(23)를 갖는 증폭제(21)가 결합된 특정 링커(19)를 첨가하는 일반적인 실시양태이다. 태그나 표지(23)의 존재는 표적상에 연결 리간드의 첨가를 포함하는 개별의 공정 단계의 결과이다. 그러나 태그 또는 표지의 존재는 프로브 표적 쌍(17)을 검출가능하게 한다. 태그 또는 표지(23)에 감도가 있는 장치는 표적을 독특하게 동정할 수 있도록 한다.1 shows a conventional sequence, wherein target 11 hybridizes with
도 2는 본 발명에 따른 방법 및 장치의 실시양태로서 기질(10)에 결합될 수 있는 ssDNA 절편인 프로브 인자(12)를 보여준다. 바람직한 실시양태에서 기질(10)은 유리 슬라이드일 수 있다.2 shows a
도 2에서 일련의 단계들로 프로브 ssDNA(12)와 표적 ssDNA(14)의 결합체가 하이브리드화되어 dsDNA 쌍(16)을 형성한다. 상기 하이브리드화된 dsDNA 쌍(16)에 있어서, 항체 또는 1차 증폭체(30)가 존재할 수 있다. 상기 1차 증폭체(30)는 하이브리드화된 dsDNA 쌍(16)에만 결합하고, ssDNA 프로브(12) 또는 표적 인자(14)에는 결합하지 않는다.In a series of steps in FIG. 2, the combination of
그러므로 프로브-표적 쌍의 부위에서 더 부피가 큰 구조로 응집 또는 집괴되어서, 감도가 떨어지는 장치(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만 광학기술, 전기기술, 위상기술, 중량측정기술, 또는 다른 질량 식별 기술 등)에 의해서 더 용이하게 검출할 수 있는 매트릭스 중의 단일하고 독특하며 집상의 구조를 갖는다.Therefore, agglomerates or agglomerates into a more bulky structure at the site of the probe-target pair, resulting in less sensitive devices (eg, but not limited to optical, electrical, topological, weighing, or other mass identification techniques). Has a single, unique, aggregated structure in the matrix that is more easily detectable by
도 3은 고정된 프로브(12)를 갖는 기질(10)에서 개시된 다양한 수득된 결합 체들의 상대 크기를 나타내는 진행도이다. 범례로서 프로브-표적 쌍(16)이 기질(10)의 표면에서 필름 두께의 나노미터 분율로 측정될 수 있다는 것을 나타낸다. 1차 증폭체(30)에 부가하여, 스케일을 30 나노미터 범위로 증가시켜서 감도가 좋은 시스템으로 가령 원자력 현미경(atomic force microscopes), 또는 공동의 양수인의 동시계류중인 출원에서의 기술에 의해서 검출가능하다. 상기 값에 있어서 다른 "정밀" 검출 시스템, 가령 분광계 또는 중량측정 장치가 프로브-표적 반응의 증거를 발견할 수 있다.3 is a flow chart showing the relative sizes of the various obtained conjugates disclosed in
본 발명의 기술은 특정 증폭제 화합물이 동정될 수 있는 프로브-표적 쌍으로 유용하다. 상기 기술들은 필적하는 크기의 프로브와 반응할 수 있는 분자 단계에서 미지의 물질 또는 표적을 포함하는 상황에 적용될 수 있을 것으로 사료된다. 프로브-표적 결합체에 결합할 수 있는 증폭 물질이 동정될 수 있다.The techniques of the present invention are useful as probe-target pairs in which specific amplifier compounds can be identified. It is contemplated that the techniques can be applied to situations involving unknown substances or targets at the molecular level that can react with probes of comparable size. Amplifying agents capable of binding the probe-target conjugates can be identified.
실시예 1: 올리고뉴클레오티드 프로브 및 표적; IgM 1차 증폭체Example 1: Oligonucleotide Probes and Targets; IgM primary amplifier
본 발명이 유용한 한가지 영역은 알데히드가 유도체화된 유리 기질상에 올리고뉴클레오티드 프로브-표적 쌍의 건조 상태의 표면 스케닝 검출이 있다. 상기 방법은 하기의 단계를 따른다:One area where the present invention is useful is the dry surface scanning detection of oligonucleotide probe-target pairs on glass substrates on which aldehydes are derivatized. The method follows the following steps:
질소 스트림을 사용하여 수퍼알데히드(Superaldehyde, Telechem International제)를 세척하는 단계;Washing superaldehyde (Superaldehyde, manufactured by Telechem International) using a nitrogen stream;
트리스-EDTA-NaCl 완충액("TE-NaCl 완충액")을 사용하여, 프로브로 작용하는 슬라이드 표면에 3' 말단에서 C6 아미노로 변형된 30 mer 올리고뉴클레오티드를 스 포팅(spotting)한다.Tris-EDTA-NaCl buffer (“TE-NaCl buffer”) is used to spot 30 mer oligonucleotides modified with C6 amino at the 3 ′ end on the slide surface serving as the probe.
실온(25 ℃) 및 < 30% 상대 습도에서 상기 프로브를 12시간 동안 건조한다. The probe is dried for 12 hours at room temperature (25 ° C.) and <30% relative humidity.
결합되지 않은 올리고뉴클레오티드(DNA)를 제거하기위해서 0.2% SDS(소듐 도데실 설페이트) 중에서 상기 기질을 거칠게 교반하면서 2번 2분동안 세척한다.Wash the substrate twice for 2 minutes with vigorous stirring in 0.2% SDS (sodium dodecyl sulfate) to remove unbound oligonucleotides (DNA).
재류수(double distilled water, ddH2O) 중에서 상기 기질을 거칠게 교반하면서 1번 2분동안 세척한다.The substrate is washed once in two minutes with coarse stirring in double distilled water (ddH 2 O).
질소 스트림으로 상기 기질을 건조시킨다.Dry the substrate with a nitrogen stream.
450 ㎖의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에 1.5 g의 NaBH4를 용해시킴으로써 수소화붕소나트륨 용액을 준비하고, 133 ㎖의 10% 에탄올을 첨가한다.Sodium borohydride solution is prepared by dissolving 1.5 g of NaBH 4 in 450 ml of phosphate buffered saline (PBS) and 133 ml of 10% ethanol is added.
실온에서 상기 용액으로 상기 기질을 5분 동안 처리하여 유리 알데히드를 환원시킨다.The substrate is treated with the solution for 5 minutes at room temperature to reduce the free aldehyde.
실온에서 0.2% SDS로 상기 기질을 2번 1분 동안 세척한다.Wash the substrate twice for 1 minute with 0.2% SDS at room temperature.
실온에서 ddH2O에서 상기 기질을 1번 1분 동안 세척한다.The substrate is washed once for 1 minute in ddH 2 O at room temperature.
질소 스트림에서 상기 제조된 기질을 건조시킨다.The prepared substrate is dried in a nitrogen stream.
실온에서 TE-NaCl(트리스-EDTA, 1M NaCl) 완충액 중에 상보적 올리고뉴클레오티드 표적으로 상기 기질을 12시간동안 침지시킨다.The substrate is immersed for 12 h as a complementary oligonucleotide target in TE-NaCl (Tris-EDTA, 1M NaCl) buffer at room temperature.
질소 스트림으로 상기 제조된 기질을 건조시킨다.The prepared substrate is dried with a nitrogen stream.
실온에서 PBS 완충액 중에 항-dsDNA 증폭체 용액으로 상기 기질을 1시간동안 침지시킨다.The substrate is immersed for 1 hour with anti-dsDNA amplifier solution in PBS buffer at room temperature.
질소 스트림으로 상기 제조된 기질을 건조시킨다.The prepared substrate is dried with a nitrogen stream.
그 후 상기 제조된 기질은 원자력 현미경으로 "판독"되어서 하이브리드화된 쌍 및 결합된 증폭제를 검출할 것이다.The prepared substrate will then be "read" by atomic force microscopy to detect hybridized pairs and bound amplifiers.
폴리스티렌 마이크로스피어가 25 ㎚ 내지 1000 ㎚ 크기의 유도체 형태로 Bangs Laboratories, Inc.(9025 Technology Drive, Fishers, IN 46038-2886; www.bangslabs.com)에서 수득될 수 있으며, IgG는 소비자에게 공급될 수 있다. 상기 IgG가 Fc 부분을 통해서 부착되어, 가변 영역을 노출시켜서 항원에 결합을 용이하게 한다. 100 ㎚의 스피어가 바람직하다. 프로빙(probing)의 광학 방법이 요구된다면 목적하는 파장을 흡수하도록 마이크로스피어가 건조될 수 있다. 마이크로스피어는 1차 증폭 항체에 대한 2차 증폭제로서 제공되는 염소(goat) 항-마우스-IgM에 결합될 수 있다. 바람직한 방법은 하기와 같다:Polystyrene microspheres can be obtained from Bangs Laboratories, Inc. (9025 Technology Drive, Fishers, IN 46038-2886; www.bangslabs.com) in the form of derivatives ranging in size from 25 nm to 1000 nm, and IgG can be supplied to consumers have. The IgG is attached through the Fc moiety, exposing the variable region to facilitate binding to the antigen. Spheres of 100 nm are preferred. If an optical method of probing is desired, the microspheres can be dried to absorb the desired wavelength. The microspheres can bind to goat anti-mouse-IgM, which serves as a secondary amplifying agent for the primary amplifying antibody. Preferred methods are as follows:
실시예 1에서 제시된 바와 같이 하이브리드화된 표면을 준비하고 IgM을 첨가한다.Prepare the hybridized surface as shown in Example 1 and add IgM.
마이크로스피어 원용액을 PBS에서 10배 희석시킴으로써 희석된 마이크로스피어 용액을 준비한다. The diluted microsphere solution is prepared by diluting the
희석된 용액 10 ㎕를 갖는 표면을 30분동안 배양한다.Incubate the surface with 10 μl of diluted solution for 30 minutes.
PBS로 세척한다.Wash with PBS.
dH20로 세척한다(선택적으로, 건조 판독 방법을 사용한다면).Wash with dH20 (optionally if dry read method is used).
관찰 결과: 10배 이상 시그널이 증강됨.Observation: Signal is enhanced by more than 10 times.
시퀀스 시커(SEQUENCE SEEKER, 상표명)로 시판되는 서열-특이성 폴리아미드 생성물이 이중가닥 프로브-표적 쌍에 결합하는데 사용된다면, 스트렙타비딘-코팅된 폴리스티렌 마이크로스피어가 바람직하다(필요하다면 건조되거나 또는 건조되지 않음)(SEQUENCE SEEKERTM, Prolinx, Inc., Bothell, WA; www.prolinx.com).If a sequence-specific polyamide product sold under the sequence SEQUENCE SEEKER (trade name) is used to bind to the double-stranded probe-target pair, streptavidin-coated polystyrene microspheres are preferred (dry or not dried if necessary). (SEQUENCE SEEKER ™ , Prolinx, Inc., Bothell, WA; www.prolinx.com).
하이브리드화된 표면을 준비한다.Prepare the hybridized surface.
순수한 에탄올의 질량 균등 부피로 건조 시퀀스 시커(상표명)를 희석시킨다.Dilute the dry sequence seeker under the equal mass of pure ethanol.
TE 완충액 중에 시퀀스 시커(상표명)를 0.1% 질량/부피로 희석시킨다. 초음파가 용해에 도움을 준다.Dilute the sequence seeker ™ to 0.1% mass / volume in TE buffer. Ultrasound helps to dissolve
상기 용액 10 ㎕를 갖는 표면을 30분동안 배양한다.The surface with 10 μl of the solution is incubated for 30 minutes.
상기 표면을 TE 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 시퀀스 시커(상표명)를 제거한다.The surface is washed with TE buffer to remove unbound sequence seeker.
마이크로스피어 원용액을 PBS 중에 10배 희석시킴으로써 희석된 마이크로스피어 용액을 준비한다.The diluted microsphere solution is prepared by diluting the
상기 희석된 용액 10 ㎕를 갖는 표면을 30분동안 배양한다.The surface with 10 μl of the diluted solution is incubated for 30 minutes.
TE 완충액을 세척한다.Wash TE buffer.
관찰 결과: 10배 이상 시그널이 증강되었다.Observation: The signal was enhanced by more than 10 times.
(선택적으로 건조 판독 방법이 사용된다면) dH2O로 세척한다.Wash with dH 2 O (optionally if dry read method is used).
항체(하이브리드화되거나 또는 dsDNA에 결합될 수 있음)를 사용할 뿐만아니라, 시퀀스 시커(상표명)(Prolinx, Inc., Bothell, WA; www.prolinx.com)로서 공지되어 있고 바이오틴과 같은 특정 화합물들과 콘쥬게이트될 수 있는 시판용의 폴리 아미드가 있다. 시퀀스 시커(상표명)가 하이브리드화된 DNA의 가닥으로 연신되고, 서열이 5개의 염기쌍의 오른쪽 서열을 포함한다면, 폴리아미드는 dsDNA의 소홈(minor groove)에 결합할 것이다.In addition to using antibodies (which can be hybridized or bound to dsDNA), they are known as sequence seekers (Prolinx, Inc., Bothell, WA; www.prolinx.com) and with specific compounds such as biotin There are commercially available polyamides that can be conjugated. If the sequence seeker ™ is drawn into strands of hybridized DNA and the sequence comprises the right sequence of five base pairs, the polyamide will bind to the minor groove of the dsDNA.
상기 실시예에서, 시퀀스 시커는 증폭제가 아니며, 항체의 가변 영역에서 특정 펩티드 구조와 유사한 "인식 유닛(recognition unit)"으로 제공되며, 특이성이 있다. 바이오틴은 시퀀스 시커에 결합되어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘-결합된 화합물과의 연결 화합물로서 작용하여 질량 증폭제로서 제공될 수 있다. 바람직한 방법은 하기와 같다:In this example, the sequence seeker is not an amplifying agent and is provided as a "recognition unit" similar to the specific peptide structure in the variable region of the antibody and is specific. Biotin may bind to the sequence seeker and act as a linking compound with streptavidin or streptavidin-bound compounds to serve as mass amplification agents. Preferred methods are as follows:
순수한 에탄올의 질량 균등 부피로 건조된 바이오티닐화 시퀀스 시커(상표명)를 희석시킨다.The dried biotinylation sequence seeker (trade name) is diluted with a mass equivalent volume of pure ethanol.
TE 완충액 중에 시퀀스 시커(상표명)를 0.1% 질량/부피로 희석시킨다. 초음파가 용해에 도움을 준다.Dilute the sequence seeker ™ to 0.1% mass / volume in TE buffer. Ultrasound helps to dissolve
상기 용액의 10 ㎕를 갖는 표면을 30분동안 배양한다.The surface with 10 μl of the solution is incubated for 30 minutes.
상기 표면을 TE 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 시퀀스 시커(상표명)를 제거한다.The surface is washed with TE buffer to remove unbound sequence seeker.
증폭제로서 스트렙타비딘을 사용한다면:If you use streptavidin as an amplifying agent:
TE 완충액 중에 100 μM의 스트렙타비딘 용액을 준비한다.Prepare 100 μM of streptavidin solution in TE buffer.
상기 희석된 용액 10 ㎕를 갖는 표면을 10분동안 배양한다.The surface with 10 μl of the diluted solution is incubated for 10 minutes.
TE 완충액으로 세척한다.Wash with TE buffer.
(선택적으로, 건조 판독 방법을 사용한다면) dH2O로 세척한다.Wash with dH 2 O (optionally if dry read method is used).
관찰 결과: 그래프에 명시된 비율로 또는 표면 포화까지 시그널이 증가됨.Observations: The signal is increased at the rate indicated on the graph or until surface saturation.
스트렙타비딘-결합된 마이크로스피어를 사용한다면:If using streptavidin-bound microspheres:
마이크로스피어 원용액을 PBS 중에 10배 희석시킴으로써 희석된 마이크로스피어(스트렙타비딘 마이크로스피어, Bangs Labs제)를 준비한다.Diluted microspheres (streptavidin microspheres, manufactured by Bangs Labs) are prepared by diluting the
10 ㎕의 희석된 용액을 갖는 표면을 30분동안 배양한다.Incubate the surface with 10 μl of diluted solution for 30 minutes.
TE 완충액으로 세척한다.Wash with TE buffer.
(선택적으로, 건조 판독 방법을 사용한다면) dH2O로 세척한다.Wash with dH 2 O (optionally if dry read method is used).
관찰 결과: 시그널이 50배, 마이크로스피어의 표면 포화점까지 증가되었다.Observations: The signal increased by 50 times to the surface saturation point of the microspheres.
몇가지 1차 증폭체(30)가 프로브-표적 쌍과 결합되어지는 1차 증폭체에 결합하거나 또는 응집될 수 있다.Several
다시 도 2 및 도 3을 참고하여, 하이브리드화된 프로브-표적 쌍(16)에 결합하는 1차 증폭체(30)에 결합할 수 있는 2차 증폭체(32)가 있다. 그 후 프로브-표적 반응의 부위에서 더 괴상의 구조로 응집 또는 집괴하여 매트릭스 중에 단일의 독특한 괴상의 구조체가 감도가 떨어지는 검출기(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만 광학기술, 중량측정 기술, 위상기술 또는 기타 질량 식별 기술 등)에 의해서 용이하게 검출될 수 있다. Referring again to FIGS. 2 and 3, there is a
2차 증폭체(32)를 첨가함으로써 약 2.5배 크기가 증가되었다. 바람직한 방법은 하기와 같다:The addition of the
PBS 중에 원 항체 용액을 10배 희석하여 10 ㎕로 만든다.Dilute the original antibody solution 10-fold in PBS to 10 μl.
용액을 갖는 이전에 제조된 프로브-표적-IgM 기질을 30분동안 배양한다.The previously prepared probe-target-IgM substrate with solution is incubated for 30 minutes.
PBS로 세척한다.Wash with PBS.
(선택적으로, 건조 판독 방법을 사용한다면) dH2O로 세척한다.Wash with dH 2 O (optionally if dry read method is used).
관찰 결과: 상기 표면에서 각 IgM에 4개의 IgG가 부착된다면 시그널은 대략 2배가 된다.Observations: The signal is approximately doubled if four IgGs are attached to each IgM on the surface.
스트렙타비딘은 바이오틴(Kassoc=1015)에 대한 친화도를 갖는 단백질이며, 스트렙타비딘의 1개 이상의 분자는 시퀀스 시커(상표명)에 의해서 운반되는 바이오틴에 결합될 수 있다. 스트렙타비딘 자체는 dsDNA 프로브-표적 쌍에서보다 더 부피가 커서(68 킬로달톤), 1차 질량 증폭 효과를 제공한다.Streptavidin is a protein having affinity for biotin (Kassoc = 10 15 ), and one or more molecules of streptavidin may bind to biotin carried by a sequence seeker (tradename). Streptavidin itself is bulkier (68 kilodaltons) than in dsDNA probe-target pairs, providing a first mass amplification effect.
표적으로서 비(非) 면역글로불린 항원의 예로는 영농 산업에서 가공 식품 중에 오염 원인물질(contaminating allergen), GMO가 없다고 입증하는데 중요한 단백질 어레이(array)를 포함할 수 있다. 경찰국 및 국가 보안국에서는 본 발명을 사용하여 TNT와 같은 폭발물을 검출하는데 사용될 수 있는 기존의 어레이를 증량시킬 수 있다. Examples of non-immunoglobulin antigens as targets may include protein arrays important for demonstrating the absence of contaminating allergens, GMOs in processed foods in the agricultural industry. Police and national security offices can use the present invention to increase existing arrays that can be used to detect explosives such as TNT.
바람직하게, 프로브 인자(12)는 프로브(또는 ssDNA 절편)와 상이한 다른 매트릭스의 일부이다. 공지된 매트릭스 배열은 미지의 표적 프로브 또는 ssDNA와의 매칭(matching)을 제공할 수 있으며, 이는 시험에 의해서 밝혀졌다.Preferably, the
상기 실시양태의 절차는 올리고 프로브에 대한 상기 실시예 1에서 인용된 단 계를 포함하지만, 단 멀티웰 플레이트(multi-well plate)(예컨대, 396-웰 플레이트)에 상이한 수많은 프로브가 있다. 상기 플레이트를 스폿팅 로봇(spotting robot)에 넣고, 소프트웨어 및 실험장치(experimenter)에 의해서 결정되는 어레이된 패턴으로 슬라이드 상에 올리고 프로브를 프린트한다.The procedure of this embodiment includes the steps recited in Example 1 above for oligo probes, but there are a number of different probes in a multi-well plate (eg, 396-well plate). The plate is placed in a spotting robot and printed on the slide in an arrayed pattern determined by software and experimenter.
상기 기질은 공동의 양수인의 종래 특허 출원에서 언급한 바와 같이 전체 내부 반사(TIR)를 가질 수 있으며, 소실성 장에 프로브 인자를 넣는다.The substrate may have a total internal reflection (TIR) as mentioned in the prior assignee of the common assignee and put the probe factor in the disappearance field.
도 2 및 도 3을 참고하여, 2차 증폭체(32)에 결합되는 3차 증폭제(34)는 프로브-표적 반응의 부위에서 더 괴상의 결합체를 형성하여, 많은 검출 장치에서 검출 역치를 낮춘다.Referring to FIGS. 2 and 3, the
상기 부위에서 3차 증폭제(34)를 결합시킬 수 있는 능력은 초기 프로브-표적 두께 값으로부터 추가로 크기를 20배 증가시킨다. 추가의 2차 및 3차 증폭체 또는 증폭제는 현미경, 여과 또는 다른 크기 배제 기술 및 질량계 분리 시스템과 같은 "총(gross)" 검출 시스템을 사용하도록 한다.The ability to bind the
스트렙타비딘은 다양한 물질, 가령 폴리스티렌, 폴리아닐린, 또는 금속성 마이크로스피어와 같은 다양한 물질에 용이하게 결합될 수 있으며, 더 부피가 커진다. 또한, 스트렙타비딘은 바이오틴에 대해서 4개의 결합 부위를 가지며, 바이오티닐화 항체 또는 바이오티닐화 마이크로스피어가 부착되도록 하여, 2차 증폭체로서 제공되고, 스트렙타비딘 자체는 항체에 대한 특이적 표적으로 제공되는, 2차 증폭체일 수 있다.Streptavidin can be easily bound to a variety of materials, such as polystyrene, polyaniline, or metallic microspheres, and is bulkier. In addition, streptavidin has four binding sites for biotin and allows biotinylated antibodies or biotinylated microspheres to be attached, serving as secondary amplifiers, and streptavidin itself is a specific target for the antibody. Provided as, may be a secondary amplifier.
도 7은 나노미터(㎚)로 표시되는 상대 높이를 나타내는 막대 그래프이다. 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 나(bare)알데히드 슬라이드 표면은 2.2 ㎚의 높이를 갖는다. 1 μM DNA 프로브의 부착으로 높이가 2.4 ㎚로 증가된다. 1 μM DNA 프로브 및 1 μM DNA 표적의 프로브-표적 쌍의 높이는 3.9 ㎚이다. 1차 증폭제, 0.1 ㎕의 항체를 첨가함으로써, 높이는 7.2 ㎚로 증가된다. 그러나 과량의 항체가 1차 증폭제로서 첨가된다면, 높이는 그 10배인 72 ㎚로 증가된다.7 is a bar graph showing the relative height in nanometers (nm). As can be seen in the graph, the bare aldehyde slide surface has a height of 2.2 nm. Attachment of 1 μM DNA probe increases the height to 2.4 nm. The height of the probe-target pairs of 1 μM DNA probe and 1 μM DNA target is 3.9 nm. By adding a primary amplifying agent, 0.1 μl of antibody, the height is increased to 7.2 nm. However, if excess antibody is added as the primary amplifying agent, the height is increased to 72 nm, 10 times that.
실험을 확인하기위해서, 1 ㎕의 항체를 갖는 1 μM DNA 프로브의 높이는 2.3 ㎚이며, 나(bare)슬라이드상에 항체만의 높이는 2.6 ㎚이다. 상기 그래프로부터, 충분한 1차 증폭 물질의 존재하에 하이브리드화된 프로브-표적 쌍은 용이하게 검출할 수 있는 높이로 크게 변화되는 것이 명확하다.To confirm the experiment, the height of the 1 μM DNA probe with 1 μl of antibody is 2.3 nm and the height of the antibody alone on the bare slide is 2.6 nm. From the graph, it is clear that the probe-target pair hybridized in the presence of sufficient primary amplification material varies greatly to a height that can be easily detected.
표 1의 도표(도 8 참조)에서는 적당한 프로브-표적 결합체, 1차 증폭제, 2차 증폭제, 및 때때로 3차 증폭제(이들은 각 결합체에 적당함)를 나타내고 있다.The table in Table 1 (see FIG. 8) shows suitable probe-target conjugates, primary amplifiers, secondary amplifiers, and sometimes tertiary amplifiers (which are suitable for each binder).
또한 시퀀스 시커(상표명)의 대체예로서 록 핵산("LNATM", Proligo LLC, www.proligo.com; Degussa AG 자회사, www.degussa.com)으로 공지된 핵산 유사체의 형태에 의해서 특정 이중가닥 핵산 서열을 구체적으로 동정할 수 있다.Also as an alternative to the sequence seeker (trade name) certain double-stranded nucleic acids by the form of nucleic acid analogs known as lock nucleic acids (“LNA ™ ”, Proligo LLC, www.proligo.com; a subsidiary of Degussa AG, www.degussa.com). Sequences can be specifically identified.
도 4는 전체 내부 반사(TIR)가 사용되어 증폭 결과를 관찰할 수 있는 본 발명의 실시양태를 나타낸다. 편광 광원 조립체(112)는 광원(126), 빔 형성 부재(128)(광원의 특성은 빔의 형성을 유용하게하거나 또는 필요하게 함), 편광기(130) 및 광학 지연기(132)를 갖는다. 전체 내부 광 반사 조립체(114)는 광학 소자(134)[광학 표면(136)을 가짐]를 갖는다. 광학 표면(136) 상에 시료 슬라이드 (138) 및 이들 사이의 인덱스 매칭 물질(index matching substance, 140)을 갖는다. 인덱스 매칭때문에 전체 내부 반사 표면(TIR 표면)은 시료 슬라이드(138)의 상부 표면(139)으로서 정의된다. 시료(142)는 슬라이드(138)의 TIR 표면(139)상에 있다.4 shows an embodiment of the invention in which total internal reflection (TIR) can be used to observe the amplification results. The polarization
광학 소자(134)는 입사광 빔(120) 및 출사광 빔(122)의 상관관계에서 인덱스 매칭 슬라이드(138)와 함께 배치된 프리즘이며, 여기서 상기 빔은 TIR 표면(139)에서 단일 시간만 반사된 후 프리즘을 나간다. 시료를 광학 표면(136)상에 직접 놓는다면, 광학 표면(136)은 TIR 표면일 수 있다. 시료[예컨대, 바이오칩(biochip)]를 시료 슬라이드(138) 상에서 더 편리하게 제조되어 장치에 넣는 것은 통상의 용도는 아니다.The
그러나, 제조되는 경우에 TIR 표면을 갖는 광학 구조에서 빔은 광학 구조를 들어오고 나가는 사이의 TIR 표면에서 단일 시간만 반사한다. 즉, 시료와 접촉하는 광학 장치내 TIR 표면에서 전체 내부 반사와 조합된 소실성 장은 시료와 반응하며 상기 TIR 표면에서 단일 반사만이 있다.However, in the case of manufacture, in an optical structure having a TIR surface, the beam reflects only a single time at the TIR surface between entering and leaving the optical structure. That is, the disappearance field combined with the total internal reflection at the TIR surface in the optical device in contact with the sample reacts with the sample and there is only a single reflection at the TIR surface.
후반사 검출기 조립체(116)는 편광기(144) 및 2차원 어레이 검출기(146)를 가지며, 바람직하게 CCD 타입 카메라를 갖는다. 프로세서(118)는 특별히 프로그램된 컴퓨터이며, 필름 두께 변화도로 촬상을 프로세싱하는 출력 수단은 촬상된 영역상에 공간적으로 해상된다. 촬상(image)은 전체 내부 반사에 의한 빔의 단면에서 국부 편광 상태에서 공간적으로 분포된 변화를 검출함에 의해서 얻어질 수 있다. 상기 표면 상에 각 분해가능한 포인트에 있어서 기질 표면상에 물질의 어레이의 존 재 및 조성물에 대한 정보를 제공한다. 상이한 편광 상태의 변화는 검출기내 위치에 해당하는 시료 어레이내 위치에서 시료상의 물질의 지표인 반사된 빔의 단면에서 포함한다. 프로세서(118)는 전기적 신호(124)로서 데이터를 받아서, 2차원 어레이에 대해 공간적인 편광 상태의 변화를 특징으로 한다. 프로세서(118)에서, 광 프로세싱 조립체(112)로부터 입사광의 공지된 편광 상태와, 시료 어레이에서 스폿의 공간적으로 분포된 위치를 나타내는 지도를 제공하는 빔내에서 2차원적으로 해상된 반사광(122)의 변화된 편광 상태를 비교함으로써 분석 및 프로세싱을 하나의 실시양태에서 실시하였다. 그 후 편광 전이는 프로세서(118)에 의해서 분석되어 화학적 시료에서 인자의 존재 및 특성의 정보를 제공한다. 다른 공지된 기술, 예컨대 널 프로세싱(null processing) 또는 상 모듈화(phase modulation)가 사용되어 편광 상태의 변화를 측정한다.The back
선택적으로 광원 부재(126)는 광방출 다이오드(LED), 초발광 다이오드(SLD), 백열 광원 또는 레이저일 수 있다. LED 또는 SLD가 사용된다면, 도 4에 개시된 장치가 적당하며, 여기서 빔 형성 부재(128)는 콜리메이터(collimator)이다. 백열 광원이 사용된다면, 광학 필터가 또한 사용된다.Optionally, the
하나의 실시양태에서, 상기 장치의 광원(126)은 중간 대역폭의 준-단색광원(quasi-monochromatic light source)이다. 본 발명에 따르면, 광원(126)은 바람직하게 중간 대역폭의 LED이다. 바람직하게 대역폭은 약 10 ㎚ 내지 50 ㎚, 더 바람직하게는 30 ㎚ 내지 50 ㎚의 반치전폭 파장(full width half maximum wavelength)이다.In one embodiment, the
선택적 실시양태에서 도 4에 개시된 광학 지연기(132)를 참고로, 광학 지연기는 편광기(144) 이전에 출사 빔 경로(122)에서 대신에 놓일 수 있다. 도 5를 참고하여, 선택적 실시양태가 개시되었다. 광원이 레이저(150)인 경우, 이동식 디퓨져(moving diffuser, 152)가 적용되어 레이저에 의한 광반점(speckle) 패턴에서 최소 및 최대 광반점 오프세팅 변동(speckle offsetting fluctuation)을 생성한다. 이동식 디퓨져(152)는 모터 및 광반점 오프세팅 변동을 제공하는 서보장치(servoapparatus)인 기계적 구동기(154)에 부착된다. 그 후 상기 빔(120)은 빔 형성 소자(128), 편광기(130) 및 광학 지연기(132), 유도광원 조립체(120)를 통해서 진행된다.In an optional embodiment, with reference to the
전기화학적 또는 유전율(permittivity) 장치에 의한 검출에 있어서, 인식 유닛에 결합된 금속 나노스피어, 1차 증폭제 또는 2차 증폭제가 사용될 수 있다. 1개의 개발된 방법에서, 스트렙타비딘-결합된 금 나노스피어(콜로이드성 은으로 코팅됨)가 사용되어 바이오티닐화 생분자를 증폭시킨다.In detection by electrochemical or permittivity devices, metal nanospheres, primary amplifiers or secondary amplifiers coupled to the recognition unit can be used. In one developed method, streptavidin-bound gold nanospheres (coated with colloidal silver) are used to amplify biotinylated biomolecules.
바이오티닐화 DNA, RNA 또는 단백질 표적이 사용된다면, 은 콜로이드 증강에 관계없이 스트렙타비딘-금 나노입자로 증강시키며, 엘립소메트리, 반사계, 소실성 기술, 광 현미경, 고해상도 스캐닝, 스캐닝 전기화학 프로브 현미경 및 AFM에 의해서 프로브되는 경우 시그널을 증폭시킬 것이다.If biotinylated DNA, RNA or protein targets are used, they are augmented with streptavidin-gold nanoparticles regardless of silver colloidal enhancement, ellipsometry, reflectometers, disappearance techniques, light microscopy, high resolution scanning, scanning electrochemistry The signal will be amplified when probed by probe microscope and AFM.
당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의한 특정 프로브-표적 시스템에 적용되는 일반적 절차는 하기와 같다:The general procedure applied to a particular probe-targeting system by one of ordinary skill in the art is as follows:
실온에서 1% BSA를 함유하는 PBS중에 1:200 내지 1:500으로 희석된 스트렙타 비딘-나노골드(streptavidin-Nanogold, Nanoprobes, Inc., Yaphank, NY; www.nanoprobes.com)를 갖는 하이브리드화된 어레이를 60분동안 배양한다.Hybridization with streptavidin-Nanogold, Nanoprobes, Inc., Yaphank, NY; www.nanoprobes.com diluted 1: 200 to 1: 500 in PBS containing 1% BSA at room temperature Incubate the prepared array for 60 minutes.
0.1% 피쉬 젤라틴 및 0.1% 트윈(Tween)-20을 함유하는 PBS로 각 5분동안 3번 세척한다.Wash three times for 5 minutes each with PBS containing 0.1% fish gelatin and 0.1% Tween-20.
10분 이상동안 증류수로 반복하여 세척하고, 최종으로 2번 초순수(EM-급)로 세척한다. 용액 A 및 용액 B를 제조한다:Repeated washing with distilled water for at least 10 minutes, and finally twice with ultrapure water (EM-class). Prepare Solution A and Solution B:
용액 A: 40 ㎖의 유리 재류수 중에 80 ㎎의 아세트산은(코드 85140; Fluka, Buchs, Switzerland)을 용해시킨다. (은 아세테이트 결정을 약 15분 내에 연속적으로 교반하면서 용해시킬 수 있다)Solution A: 80 mg of silver acetic acid (code 85140; Fluka, Buchs, Switzerland) is dissolved in 40 ml of free water. (Silver acetate crystals can be dissolved with continuous stirring in about 15 minutes)
용액 B: 40 ㎖의 시트레이트 완충액 중에 200 ㎎의 히드로퀴논을 용해시킨다.Solution B: 200 mg of hydroquinone is dissolved in 40 ml of citrate buffer.
사용 직전에 용액 A와 용액 B를 혼합한다.Mix Solution A and Solution B immediately before use.
증강된 용액으로 금-스트렙타비딘 개량된 어레이를 30분동안 배양한다.The gold-streptavidin improved array is incubated for 30 minutes with the enhanced solution.
증류수로 3번 세척한다.Wash three times with distilled water.
상기 어레이를 바람직한 검출 방법으로 프로브한다. 밀봉된 유세포(flow cell) 장치 및 보정가능한 검출 시스템을 사용하여 계내(系內, in situ) 프로세싱 및 프로빙(probing)하여 하이브리드화 및 프로세싱 중에 프로빙하여 취급 조작(handling artifact)을 감소시키면서 동적 측정을 실시한다.The array is probed with the preferred detection method. In situ processing and probing using a sealed flow cell device and a calibrated detection system to probe during hybridization and processing to reduce dynamics while reducing handling artifacts. Conduct.
그러므로 감도가 비교적 낮은 수준에서 프로브-표적 결합체를 검출하기위한 방법 및 물질을 개시하고 설명하였다. 질량 증폭기가 프로브-표적 쌍(링킹 인자를 포함하거나 또는 포함하지 않음)에 첨가하였다. 질량 증폭기의 존재(다른 공정 단계가 없음)는 프로브-표적 쌍을 검출할 수 있게 한다. 추가의 질량 증폭기, 가령 2차 및 3차 증폭기는 증폭 기회를 발생시켜서 감도가 떨어지는 검출 장치 및/또는 표적 물질의 더 낮은 농도에서도 사용할 수 있도록 한다Therefore, methods and materials for detecting probe-target conjugates at relatively low levels of sensitivity have been disclosed and described. Mass amplifiers were added to the probe-target pairs (with or without linking factor). The presence of a mass amplifier (no other process steps) makes it possible to detect probe-target pairs. Additional mass amplifiers, such as secondary and tertiary amplifiers, create opportunities for amplification so that they can be used at lower concentrations of less sensitive detection devices and / or target materials.
당분야의 전문가는 본 발명의 기술의 다른 적용 분야를 인식할 것이며, 상기 기술을 사용하여 목적하는 다른 분석물에도 상기 개념을 적용시킬 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 하기에 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정되어야 한다.Those skilled in the art will recognize other applications of the technology of the present invention and will be able to apply the concept to other analytes of interest using the technology. Therefore, the invention should be limited only by the claims appended hereto.
Claims (61)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020057022687A KR20060066053A (en) | 2005-11-28 | 2003-05-28 | Method and apparatus for recognizing molecular compounds |
Applications Claiming Priority (1)
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KR1020057022687A KR20060066053A (en) | 2005-11-28 | 2003-05-28 | Method and apparatus for recognizing molecular compounds |
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KR20060066053A true KR20060066053A (en) | 2006-06-15 |
Family
ID=37161022
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KR1020057022687A KR20060066053A (en) | 2005-11-28 | 2003-05-28 | Method and apparatus for recognizing molecular compounds |
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KR (1) | KR20060066053A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109085124A (en) * | 2018-06-25 | 2018-12-25 | 清华大学深圳研究生院 | DNA is denaturalized renaturation detection system and method |
-
2003
- 2003-05-28 KR KR1020057022687A patent/KR20060066053A/en not_active Application Discontinuation
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